TW201609816A - 抗凝血劑解毒劑 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於對抗抗凝血劑(特定言之達比加群(dabigatran))之抗體分子,及其作為該等抗凝血劑之解毒劑之用途。
Description
本發明係關於醫藥領域,特定言之關於抗凝血劑治療領域。
抗凝血劑係防止凝血之物質;換言之,其等停止血液凝結。抗凝血劑廣泛地在人類治療中用作用於血栓性疾病之藥療,例如於易患病者中一級及二級預防深靜脈血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞及中風。
口服抗凝血劑之一種重要類別係以拮抗維生素K之效應方式起作用,例如包括華法林(warfarin)之香豆素。第二類別之化合物藉由諸如抗凝血素III或肝素輔因子II之輔因子間接地抑制凝血。此包括若干種催化藉由抗凝血素III抑制主要的因子Xa(且達成較小凝血酶含量)之低分子量肝素產品(貝米肝素(bemiparin)、捨托肝素(certoparin)、達肝素(dalteparin)、依諾肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin))。較小鏈寡糖(磺達肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux))僅藉由抗凝血素III抑制因子Xa。類肝素(達那肝素(danaparoid)、舒洛地特(偉素)(sulodexide)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate))係藉由兩種輔因子起作用並抑制因子Xa及凝血酶。第三類別代表凝血之直接抑制劑。直接因子Xa抑制劑包括艾吡沙班(apixaban)、依度沙班(edoxaban)、奧米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban),及直接凝血酶抑制劑包括二價水蛭素(比伐盧定(bivalirudin)、來匹盧定(lepirudin)、地西盧定
(desirudin))、及單價化合物阿加曲班(argatroban)及達比加群。
由於血液凝結為阻止出血之生物學機制,故抗凝血劑治療之副作用可係非所欲出血事件。因此,可期望提供一種可阻止該等與抗凝血劑相關之出血事件(在其等發生之情況下)之解毒劑(Zikria及Ansell,Current Opinion in Hematology 2009,16(5):347-356)。達成此點之一種方法係藉由中和在投與後存於患者中之抗凝血劑化合物之活性。
當前可用抗凝血劑解毒劑為魚精蛋白(用於中和肝素)及用於中和維生素K拮抗劑(例如華法林)之維生素K。新鮮冷凍血漿及重組因子VIIa亦已用作用於接受低分子量肝素治療、罹患嚴重創傷或嚴重出血之患者中之非特異性解毒劑(Lauritzen,B.等人,Blood,2005,607A-608A)。亦報告用作肝素或低分子量肝素解毒劑之魚精蛋白片段(美國專利第6,624,141號)及小合成肽(美國專利第6,200,955號);及用作凝血酶抑制劑之解毒劑之凝血酶突變蛋白質(美國專利第6,060,300號)。已報告凝血酶原中間物及衍生物作為水蛭素及合成凝血酶抑制劑之解毒劑(美國專利第5,817,309號及第6,086,871號)。對於直接因子Xa抑制劑而言,已提出非活性因子Xa類似物作為解毒劑(WO2009042962)。另外,重組因子VIIa已用於逆轉諸如磺達肝素及艾卓肝素之間接抗凝血素III依賴性因子Xa抑制劑之效應(Bijsterveld,NR等人,Circulation,2002,106:2550-2554;Bijsterveld,NR等人,British J.of Haematology,2004(124):653-658)。關於抗凝血劑逆轉之方法之評論提供於Schulman及Bijsterveld,Transfusion Medicine Reviews 2007,21(1):37-48中。
國際專利申請案WO 2011/089183及WO2012/130834揭示可結合並中和達比加群之活性之抗體分子。
需要提供用於抗凝血劑治療的經改良之解毒劑,及特定言之提
供用於例如迄今尚未揭示其特異性解毒劑之達比加群之直接凝血酶抑制劑的解毒劑。
於一個態樣中,本發明係關於一種可中和抗凝血劑之活性之抗體分子。
於另一個態樣中,該抗體分子對該抗凝血劑具有結合特異性。
於另一個態樣中,該抗凝血劑為直接凝血酶抑制劑。
於另一個態樣中,該抗凝血劑為達比加群。
於另一個態樣中,本發明係關於一種對抗達比加群、達比加群酯、及/或達比加群之O-醯基葡萄糖醛酸之抗體分子。
於另一個態樣中,本發明係關於一種對抗達比加群、達比加群酯、及/或達比加群之O-醯基葡萄糖醛酸之在人類中具有低免疫原性之抗體分子。
於另一個態樣中,本發明係關於一種對抗達比加群、達比加群酯、及/或達比加群之O-醯基葡萄糖醛酸之具有經改良之物理化學性質(特定言之經改良之在水性溶劑中之溶解度)之抗體分子。
於另一個態樣中,本發明係關於一種對抗達比加群、達比加群酯、及/或達比加群之O-醯基葡萄糖醛酸之具有經改良之在宿主細胞中之生產力(特定言之獲得經改良之生產率)之抗體分子。
於另一個態樣中,該抗體分子為多株抗體、單株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、抗體之片段(特別是Fab、Fab'、或F(ab')2片段)、單鏈抗體(特別是單鏈可變片段(scFv))、域抗體、奈米抗體、雙抗體、或DARPin。
於另一個態樣中,本發明係關於一種如上所述用於藥物之抗體分子。
於另一個態樣中,本發明係關於一種如上所述用於治療或預防
抗凝血劑治療之副作用之抗體分子。
於另一個態樣中,該副作用為出血事件。
於另一個態樣中,本發明係關於一種治療或預防抗凝血劑治療之副作用的方法,該方法包括對有此需要的患者投與有效量之如上所述抗體分子。
於另一個態樣中,本發明係關於一種套組,其包括如上所述之抗體分子、及容器及標籤。
圖1:重鏈5C之可變域(SEQ ID NO:8)及重鏈FAB6之可變域之間的序列比對。
圖2:達比加群-Fab結合曲線。將恆定濃度之Fab與漸增濃度之達比加群一起培養。接著藉由捕捉未結合之Fab於在偶聯至中性鏈親和素珠粒之達比加群-生物素結合物上來確定游離Fab之濃度。
圖3:結構資料:達比加群與FAB5C/18/FAB5C/21複合之一系列以實驗方式確定之結合模式顯示達比加群以其苄脒部分緊密結合於疏水性凹口(hydrophobic pocket)(上圖左下側)中,而苯并咪唑、羧醯胺、吡啶及羧基部分顯示略為不同地定向在不同結晶系統及結晶學上獨立原體中,此指示在達比加群以與Fab複合方式結合時該等基團之定位之某種程度的可變性。苯并咪唑、羧醯胺、吡啶及羧基以上述定向右移越遠,則達比加群對Fab互補位之右側部分之契合度變的越佳(例如,Tyr33對右側苯并咪唑之n-堆疊相互作用及吡啶部分在Tyr33與Arg54之間之凹口中之更深穿透),而在左側,對Tyr103之邊面相互作用損失或Tyr33必須破壞其OH基與Asp33L(未顯示Asp33L)之氫鍵。Tyr103顯示於左上側。藉由Tyr103替代Trp103會導致由於苯并咪唑部分兩側上之芳族邊面(Trp103)或面面(Tyr33)相互作用而使達比加群更緊密契合在結合位置中。
圖4:結構數據:該表面圖像顯示FAB6(右圖)相對FAB5C/18(左圖)中達比加群之經改良之位置佔據。
圖5:FAB6在經連續輸注達比加群預處理之大鼠中靜脈內投與後對達比加群抗凝血劑活性之中和作用。抗凝血劑活性係使用3U/ml凝血酶以凝血酶時間形式測定。數據以平均值±SE表示,n=4至8。
於一個態樣中,本發明係關於一種可中和達比加群之活性之抗體分子。
WO 2012/130834揭示中和性抗達比加群抗體分子VH5c/Vk18及VH5c/Vk21(本文中分別稱為FAB 5C/18及FAB 5C/21),其等具有比蛋白質資料庫中已知抗體之平均值小之溶劑暴露疏水表面。此意味著該等化合物具有在水性介質中之極佳溶解度及低聚集傾向,使得其等特別適用於具有高抗體濃度之穩定藥物調配物。另外,該等分子可以極高生產效價製得。
本發明接著提供相較於前述抗體共用的重鏈可變域5C在重鏈之CDR3中具有單胺基酸取代之抗達比加群抗體分子。藉由該單點突變(在重鏈之位置103由酪胺酸改為色胺酸殘基替代),結合親和力可增強10倍,而經改變之分子仍具有其親本分子之有益物理化學性質(溶解性、不聚集)。
於下文中,提及SEQ ID NO.意指表1之序列及為本申請案之一部分之序列表之序列,除非另有指示。
於本發明之一個態樣中,該抗體分子具有針對達比加群之結合特異性及包含具有SEQ ID NO:1之CDR1、SEQ ID NO:2之CDR2、及SEQ ID NO:4之CDR3之重鏈可變域、及具有SEQ ID NO:5之CDR1、SEQ ID NO:6之CDR2、及SEQ ID NO:7之CDR3之輕鏈可變域。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子包含SEQ ID NO:9之重鏈
可變域、及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子包含SEQ ID NO:9之重鏈可變域、及SEQ ID NO:11之輕鏈可變域。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子包含SEQ ID NO:13之重鏈、及SEQ ID NO:14之輕鏈。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子包含SEQ ID NO:13之重鏈、及SEQ ID NO:15之輕鏈。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子係由SEQ ID NO:13之重鏈、及SEQ ID NO:14之輕鏈組成。
抗體(亦稱為免疫球蛋白,簡寫為Ig)為可存於脊椎動物之血液或其他體液中之γ球蛋白,及係被免疫系統用於識別並中和諸如細菌及病毒之外來物。其等通常係由各自具有兩條大重鏈及兩條小輕鏈之基本結構單元構成,以形成(例如)具有一個單元之單體、具有兩個單元之二聚物或具有五個單元之五聚物。抗體可經非共價相互作用結合至稱作抗原之其他分子或結構。該結合在抗體將僅以高親和力結合至特異性結構之意義上係特異性。抗原之由抗體識別之獨特部分稱為抗原決定部位或抗原決定子。抗體之結合至抗原決定部位之部分有時稱為互補位且常駐於所謂的抗體之可變域或可變區(Fv)中。可變域包含三個所謂的由框架區(FR)間隔開的互補決定區(CDR)。
於本發明上下文中,所提及之CDR係基於Chothia(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.1987,196:901-917)、及Kabat(E.A.Kabat,T.T.Wu,H.Bilofsky,M.Reid-Miller及H.Perry,Sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda(1983))之定義。
本技藝已進一步開發抗體及使其成為藥物及科技中之多功能工具。因此,於本發明上下文中,術語「抗體分子」或「抗體」(在本文中
可同義使用)不僅包括如其等可在自然中發現之包含例如兩條輕鏈及兩條重鏈、或如在駱駝科物種中正好兩條重鏈之抗體,而且可另外涵蓋包含至少一個對抗原具有結合特異性及與免疫球蛋白之可變域具有結構相似性之互補位的所有分子。
因此,根據本發明之抗體分子可為多株抗體、單株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、抗體之片段(特別是Fv、Fab、Fab'、或F(ab')2片段)、單鏈抗體(特別是單鏈可變片段(scFv))、小模塊免疫藥物(SMIP)、域抗體、奈米抗體、雙抗體。
多株抗體代表具有不同胺基酸序列之抗體分子的總稱及可從依本技藝中熟知的方法在經抗原免疫後之脊椎動物之血液獲得。
單株抗體(mAb或moAb)為胺基酸序列相同的單特異性抗體。其等可藉由融合瘤技術自代表產生特異性抗體之B細胞與骨髓瘤(B細胞癌)細胞融合之純系之雜交細胞系(稱為融合瘤)獲得(Kohler G,Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature 1975;256:495-7)。或者,單株抗體可藉由在宿主細胞中之重組表現獲得(Norderhaug L,Olafsen T,Michaelsen TE,Sandlie I.(1997年5月)."Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.".J Immunol Methods 204(1):77-87;亦可參見下文)。
對於在人類中之應用而言,通常需要減低原始衍生自其他物種(例如小鼠)之抗體之免疫原性。此可藉由構築嵌合抗體、或藉由稱為「人類化」之方法來進行。於本文中,「嵌合抗體」應理解為包含衍生自一個物種(例如小鼠)之序列部分(例如可變域)與衍生自一不同物種(例如人類)之序列部分(例如恆定域)之融合之抗體。「人類化抗體」為包含原始衍生自非人類物種之可變域之抗體,其中特定胺基酸已經過突變以使該可變域之總序列更接近於人類可變域之序列。抗體之嵌合化及
人類化之方法係本技藝中所熟知的(Billetta R,Lobuglio AF.“Chimeric antibodies”.Int Rev Immunol.1993;10(2-3):165-76;Riechmann L,Clark M,Waldmann H,Winter G(1988)."Reshaping human antibodies for therapy".Nature:332:323.)。
另外,已開發(例如)藉由噬菌體呈現或使用轉基因動物來建立基於衍生自人類基因組之序列之抗體之技術(WO 90/05144;D.Marks,H.R.Hoogenboom,T.P.Bonnert,J.McCafferty,A.D.Griffiths及G.Winter(1991)"By-passing immunisation.Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage."J.Mol.Biol.,222,581-597;Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000;S.Carmen及L.Jermutus,"Concepts in antibody phage display".Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203;Lonberg N,Huszar D."Human antibodies from transgenic mice".Int Rev Immunol.1995;13(1):65-93.;Brüggemann M,Taussig MJ."Production of human antibody repertoires in transgenic mice”.Curr Opin Biotechnol.1997年8月;8(4):455-8.)。於本發明上下文中,該等抗體為「人類抗體」。
根據本發明之抗體分子亦包括免疫球蛋白之保有抗原結合性質之片段,例如,Fab、Fab'、或F(ab')2片段。該等片段可藉由免疫球蛋白之片段化(例如藉由蛋白質消解作用)或藉由重組表現該等片段來獲得。例如,免疫球蛋白消解可藉由例行技術,例如,使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶(WO 94/29348)、或內切蛋白酶Lys-C(Kleemann等人,Anal.Chem.80,2001-2009,2008)來達成。抗體之木瓜蛋白酶或Lys-C消解通常產生兩個相同的各具有單一抗原結合部位之抗原結合片段(所謂Fab片段)、及殘餘Fc片段。胃蛋白酶處理產生F(ab')2。藉由在宿主細胞中之重組表現來製造Fab分子之方法於下文更詳細地加以概述。
已開發多種用於將免疫球蛋白之可變域或衍生自該等可變域之分子置入一不同分子背景中之技術。其等亦應視作根據本發明之「抗體分子」。一般而言,該等抗體分子相較於免疫球蛋白而言其尺寸更小,及可包含單胺基酸鏈或係由若干條胺基酸鏈組成。例如,單鏈可變片段(scFv)為免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之可變區經短連接子(通常係絲胺酸(S)或甘胺酸(G))聯結在一起之融合物(WO 88/01649;WO 91/17271;Huston等人;International Reviews of Immunology,第10卷,1993,195-217)。「單域抗體」或「奈米抗體」在單個類Ig域中具有抗原結合部位(WO 94/04678;WO 03/050531,Ward等人,Nature.1989年10月12;341(6242):544-6;Revets等人,Expert Opin Biol Ther.5(1):111-24,2005)。可將一或多個對相同或不同抗原具有結合特異性之單域抗體聯結在一起。雙抗體為由兩條胺基酸鏈組成之包含兩個可變域之二價抗體分子(WO 94/13804,Holliger等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1993年7月15日;90(14):6444-8)。類抗體分子之其他實例為免疫球蛋白超家族抗體(IgSF;Srinivasan及Roeske,Current Protein Pept.Sci.2005,6(2):185-96)。一種不同的概念產生所謂的小模塊免疫藥物(SMIP),其包含聯結至單鏈絞鏈之Fv域及不含恆定域CH1之效應子域(WO 02/056910)。
該抗體分子可融合(呈融合蛋白質形式)或以其他方式聯結(經共價鍵或非共價鍵)至對該抗體分子之性質具有期望之影響之其他分子實體。例如,可期望改良抗體分子之藥物動力學性質、例如在諸如血液之體液中之穩定性,尤其就單鏈抗體或域抗體而言。關於此方面已開發多種技術,特定言之以延長該等抗體分子在循環中之半衰期,諸如聚乙二醇化(WO 98/25971;WO 98/48837;WO 2004081026)、使抗體分子融合或以其他方式共價連接至對血清蛋白例如白蛋白具有親和力之另一抗體分子(WO 2004041865;WO 2004003019)、或將抗體分
子表現為具有全部或部分血清蛋白(例如白蛋白或運鐵蛋白)之融合蛋白(WO 01/79258)。
於另一個態樣中,該抗體分子對抗凝血劑具有結合特異性。「結合特異性」意指該抗體分子對該抗凝血劑相較於對結構上無相關性之分子具有明顯更高的結合親和力。
親和力為抗體分子上之單一抗原結合部位與單一抗原決定部位之間之相互作用。親和力以結合常數KA=k結合/k解離、或解離常數KD=k解離/k結合表示。
於本發明之一個態樣中,該抗體係以如(例如)藉由表面電漿共振分析(Malmqvist M.,"Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.",Curr Opin Immunol.1993年4月;5(2):282-6.)所測得之具有在0.1pM至100μM(較佳1pM至100μM,較佳1pM至1μM範圍)之KD值之親和力結合至抗凝血劑。抗體親和力亦可利用動力學排斥試驗(KinExA)技術(Darling、R.J.、及Brault P-A.,“Kinetic exclusion assay technology:Characterization of Molecular Interactions.”ASSAY and Drug Development Technologies.2004年12月2(6):647-657)來測定。
抗體分子之結合親和力可藉由稱作親和力成熟之方法來增強(Marks等人,1992,Biotechnology 10:779-783;Barbas等人,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813;Shier等人,1995,Gene 169:147-155)。親和力成熟抗體因此亦包含於本發明中。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子可中和抗凝血劑之活性。換言之,於結合至該抗體分子後,該抗凝血劑無法再發揮其抗凝血劑活性,或以明顯減小的數量級發揮該活性。較佳地,於抗體結合後,該抗凝血劑活性減低至少2倍、5倍、10倍、或100倍,如在適用於所論述抗凝血劑之活性試驗、特定言之對凝血酶敏感之凝結試驗諸
如蛇靜脈酶凝結時間法或凝血酶凝結時間法(H.Bounameaux,Marbet GA,Lammle B,等人.“Monitoring of heparin treatment.Comparison of thrombin time,activated partial thromboplastin time,and plasma heparin concentration,and analysis of the behaviour of antithrombin III”.American Journal of Clinical Pathology 1980 74(1):68-72)中測得。
對於製造本發明之抗體分子而言,熟習此項技藝者可從多種本技藝所熟知方法選擇(Norderhaug等人,J Immunol Methods 1997,204(1):77-87;Kipriyanow及Le Gall,Molecular Biotechnology 26:39-60,2004;Shukla等人,2007,J.Chromatography B,848(1):28-39)。
本發明上下文中之一種較佳抗凝血劑為達比加群(CAS 211914-51-1,N-[2-(4-甲脒基苯基胺基甲基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基羰基]-N-(2-吡啶基)-β-丙胺酸),其具有化學式(II):
從WO 98/37075已知達比加群,該案揭示具有凝血酶抑制效應及延長凝血酶時間之效應之化合物,其名稱為1-甲基-2-[N-(4-甲脒基苯基)-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羥基羰基乙基)-醯胺。亦可參見Hauel等人J Med Chem 2002,45(9):1757-66。
達比加群係作為式(III)之前藥使用:
式III之化合物(稱為達比加群酯,CAS 211915-06-9;3-[(2-{[4-(己氧羰基胺基-亞胺基-甲基)-苯基胺基]-甲基}-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基)-吡啶-2-基-胺基]-丙酸乙酯)在進入人體後轉化為活性化合物(II)。達比加群酯之一種較佳多晶型物為甲磺酸達比加群酯。
達比加群之主要適應症為深靜脈栓塞之術後預防、已確定的深靜脈栓塞之治療及罹患心房震顫之患者之中風之預防(Eriksson等人,Lancet 2007,370(9591):949-56;Schulman S等人,N Engl J Med 2009,361(24):2342-52;Connolly S等人,N Engl J Med 2009,361(12):1139-51;Wallentin等人,Lancet 2010,376(9745):975-983)。
在人體中,羧酸酯部分之葡萄糖醛酸化為達比加群之主要人體代謝路徑(Ebner等人,Drug Metab.Dispos.2010,38(9):1567-75)。此致使形成1-O-醯基葡萄糖醛酸(β變旋異構體)。1-O-醯基葡萄糖醛酸除少量水解為糖苷配基外可在水溶液中發生非酶促醯基轉移,從而致使形成2-O-、3-O-、及4-O-醯基葡萄糖醛酸。利用經純化1-O-醯基葡萄糖醛酸及其異構重排產物之實驗顯示相較於達比加群而言活化部分凝血酶原時間等效地延長。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子結合至達比加群及達比加群酯二者。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子結合至達比加群及達比加群之O-醯基葡萄糖醛酸(特別是達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸)二者。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子另外結合至達比加群之2-O-、3-O-、及4-O-醯基葡萄糖醛酸。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子可中和達比加群及達比加群之O-醯基葡萄糖醛酸(特別是達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸)之活性。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子為多株抗體、單株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、抗體之片段(特別是Fab、Fab'、或F(ab')2片段)、單鏈抗體(特別是單鏈可變片段(scFv))、小模塊免疫藥物(SMIP)、域抗體、奈米抗體、雙抗體、或經設計之錨蛋白重複序列蛋白(DARPin)。
於本發明之另一個態樣中,如本文所述之抗體分子係用於藥物。
於本發明之另一個態樣中,如本文所述之抗體分子係用於治療或預防抗凝血劑治療之副作用,及/或用於逆轉抗凝血劑藥物過量。於一個態樣中,該副作用為出血事件。
於另一個態樣中,本發明係關於一種治療或預防抗凝血劑治療之副作用、或抗凝血劑治療中之藥物過量事件之方法,該方法包括對有此需要的患者投與有效量之如前述技術方案中任一項之抗體分子。
於另一個態樣中,本發明係關於一種製造如本文所述抗體分子之方法,該方法包括提供包含一或多種與表現控制序列功能性締合之編碼該抗體分子之核酸之宿主細胞,培養該宿主細胞,及從細胞培養回收抗體分子。
於另一個態樣中,本發明係關於一種包含所述之抗體分子、或其醫藥組合物之套組。
於另一個態樣中,本發明係關於一種套組,其包括:所述之抗體分子、或其醫藥組合物;容器;及標籤。
於另一個態樣中,本發明係關於一種套組,其包含所述之抗體分子、及達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽。
於另一個態樣中,本發明係關於一種中和或部分中和藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之方法,該方法包括投與本文所述之抗體分子、或其醫藥組合物。
於另一個態樣中,本發明係關於一種中和或部分中和患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之方法,該方法包括:(a)證實患者正藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽治療,及患者所攝取的量;(b)在進行凝結或凝血測試或試驗之前利用如本文所述之抗體分子來中和達比加群或1-O-醯基葡萄糖醛酸,其中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸將干擾測試或試驗結果之準確讀數;(c)於自患者取得之樣本上進行凝結或凝血測試或試驗以確定不存在達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸下凝血形成之程度;及(d)調整投與給患者之達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽的量以達成患者中凝血形成及降解之間之適宜平衡。
於另一個態樣中,本發明係關於一種減低藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者血漿中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之濃度之方法,該方法包括對該患者投與如本文所述之抗體分子之步驟。
於另一個態樣中,本發明係關於一種逆轉藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者中達比加群
或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之抗凝血劑效應之方法,其中該患者具有視為威脅生命或導致血液動力功能不全之嚴重出血,或其中該患者需要緊急醫療程序,該方法包括對該患者投與如本文所述之抗體分子之步驟。
本發明之另一個態樣為如先前所述的用於藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者之抗體分子,其中該患者具有視為威脅生命或導致血液動力功能不全之嚴重出血,或其中該患者需要緊急醫療程序。
於某些態樣中,本發明係關於具有在水性介質中之高溶解度及低聚集傾向之對抗達比加群之抗體。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子為scFv分子。於該形式中,揭示於本文中之可變域可以適宜連接子肽彼此融合。該構築體可包括其等從N端至C端順序之成員,(重鏈可變域)-(連接子肽)-(輕鏈可變域)、或(輕鏈可變域)-(連接子肽)-(重鏈可變域)。
本技藝中已知容許重組表現編碼宿主細胞(例如大腸桿菌、畢氏酵母菌(Pichia pastoris)、或哺乳動物細胞系(例如CHO或NS0))中之sFv構築體之核酸從而獲得官能性scFv分子之方法(參見:例如,Rippmann等人,Applied and Environmental Microbiology 1998,64(12):4862-4869;Yamawaki等人,J.Biosci.Bioeng.2007,104(5):403-407;Sonoda等人,Protein Expr.Purif.2010,70(2):248-253)。
特定言之,可如下製得本發明之scFv抗體分子。該等構築體可在例如W3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294之不同大腸桿菌株中於可誘導啟動子之控制下得以表現。該啟動子可選自lacUV5、tac、T7、trp、trc、T5、araB。培養介質較佳係依照Wilms等人,2001(Wilms等人,Biotechnology and Bioengineering 2001,73(2):95-103),DeLisa等人,1999(DeLisa等人,
Biotechnology and Bioengineering 1999,65(1):54-64)或等效物全面地定義。然而,以諸如異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸之胺基酸或諸如大豆蛋白腖或酵母提取物之複合介質組分補充批料介質及/或進料介質可能有益。發酵之方法係以分批進料模式進行。條件:溫度20至40℃,pH 5.5至7.5,DO維持高於20%。在消耗最初碳源之後,對該培養基饋入上述進料介質(或等效物)。當在發酵桶中達到40至100g/L之細胞乾重時,利用對應於所用啟動子系統之適宜誘發劑(例如IPTG、乳糖、阿拉伯糖)來誘發培養。該誘發可以脈衝完全誘發方式或以部分誘發方式藉由在經延長之時間將個別誘發劑饋入發酵桶中或其組合來進行。生成期應至少持續4小時。藉由在碗式離心機、管碗式離心機或盤堆疊式離心機中離心來回收細胞,棄置培養上清液。
將大腸桿菌細胞塊再懸浮於4至8倍量的溶胞緩衝液(磷酸鹽或Tris緩衝液,pH 7至8.5)中。細胞溶解較佳係藉由高壓均質化接著藉由在碗式、管碗式或盤堆疊式離心機中離心回收集結粒來進行。以20mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA、2M脲、0.5% Triton X-100(pH 8.0)洗滌包含scFv包涵體之集結粒2至3次,接著是兩個使用20mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA(pH 8.0)之洗滌步驟。最後藉由在碗式、管碗式或盤堆疊式離心機中離心來回收scFv包涵體。可在含有諸如6M胍-HCl或8至10mM脲之離液劑之100mM甘胺酸/NaOH、5mM EDTA、20mM二硫蘇糖醇(pH 9.5至10.5)中進行scFv包涵體之溶解。在培養30至60分鐘後,將溶液離心及回收含標靶蛋白質之上清液以用於隨後之再摺疊。再摺疊較佳係以分批進料模式藉由在再摺疊緩衝液中將蛋白質溶液1:10至1:50稀釋至0.1至0.5mg/ml之最終蛋白質濃度來進行。再摺疊緩衝液可包含50至100mM Tris及/或50至100mM甘胺酸、50至150mM NaCl、1至3M脲、0.5至1M精胺酸、2至6mM之諸
如(例如)半胱胺酸/胱胺酸或經氧化/還原之穀胱甘肽(pH 9.5至10.5)之氧化還原系統。於4℃下培養24至72h後,可視需要使用0.22μm過濾器過濾再摺疊溶液,稀釋並調整pH至pH 7.0至8.0。藉由結合模式的陽離子交換層析(例如Toyopearl GigaCap S-650M,SP Sepharose FF或S HyperCelTM)於pH 7.0至8.5下分離出蛋白質。以線性漸增NaCl梯度方式進行洗脫。將包含標靶蛋白質之部分組併在一起及於隨後在非結合模式的陰離子交換柱(例如Toyopearl GigaCap Q-650M、Q-Sepharose FF、Q HyperCelTM)上接著進行陽離子交換拋光步驟(例如SP Sepharose HP)進行分離。將包含90%純度最小值之標靶蛋白質之部分組併在一起及藉由透析過濾或尺寸篩除層析在PBS中調配。藉由其中scFv可在一個約26kDa之主帶中偵測到之非還原性SDS-PAGE來分析製得的scFv分子之同一性及產物品質。定性scFv之其他試驗包括質譜法、RP-HPLC及SE-HPLC。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子為Fab分子。於該形式中,上文所揭示之可變域可各自融合至較佳源自人類之免疫球蛋白恆定域。因此,重鏈可變域可融合至CH1域(所謂的Fd片段),及輕鏈可變域可融合至CL域。
編碼Fab構築體之核酸可用於在例如大腸桿菌、畢氏酵母菌、或哺乳動物細胞系(例如CHO、或NS0)之宿主細胞中表現該等重鏈及輕鏈。本技藝中已知容許該等鏈之適當摺疊、結合、及二硫鍵鍵合至包含Fd片段及輕鏈之官能性Fab分子中之方法(Burtet等人,J.Biochem.2007,142(6),665-669;Ning等人,Biochem.Mol.Biol.2005,38:204-299;Quintero-Hernandez等人,Mol.Immunol.2007,44:1307-1315;Willems等人J.Chromatogr.B.Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.2003;786:161-176.)。
特定言之,可如下在CHO細胞中獲得本發明之Fab分子。使用
LipofectamineTM及PlusTM試劑(Invitrogen)依照製造商使用說明以編碼Fab分子之重鏈及輕鏈之表現構築體轉染懸浮生長於無血清培養基中之CHO-DG44細胞(Urlaub,G.、Kas,E.、Carothers,A.M.、及Chasin,L.A.(1983).Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells.Cell 33,405-412.)。於48小時後,使該等細胞在包含200μg/mL抗生素G418但不含次黃嘌呤及胸苷之培養基中經歷篩選以獲得穩定轉染之細胞群體。於隨後藉由以漸增濃度(至多100或400nM)添加甲胺喋呤(MTX)至該培養基中使該等穩定轉染物經歷基因擴增。在該等細胞已適應時,以10至11天時間使其等經歷分批進料發酵以獲得Fab蛋白質物質。
將CHO-DG44細胞及其穩定轉染物之懸浮培養物培養在化學界定式無血清培養基中。每2至3天接種儲備培養物分別以3×105至2×105個細胞/mL之接種密度子培養。在5% CO2、37℃及120rpm下之Multitron HT培養箱(Infors)中,使細胞在搖瓶中生長。對於分批進料實驗而言,細胞以3×105個細胞/mL接種於搖瓶中之不含抗生素或MTX之BI專用生成培養基中。於120rpm下在37℃及5% CO2(因細胞數增加而在稍後減低至2%)中搖動該等培養物。每天測定培養參數,包括細胞計數、存活率、pH、葡萄糖及乳酸鹽濃度,及若需要則使用碳酸鹽將pH調整至pH 7.0。每24h添加BI專用進料溶液。在不同時間點自上清液採集樣本,藉由ELISA以測定Fab產物濃度。於10至11天後,藉由離心收集細胞培養流體並傳送至純化實驗室。
藉由層析及過濾自分批進料培養物之上清液純化Fab分子。就主要捕捉步驟而言,使用親和層析(例如蛋白質G或蛋白質L。或者,就低結合親和力及能力而言,藉由利用分子之pI之陽離子交換層析(CEX)來捕捉Fab。藉由額外正交純化步驟移除宿主細胞蛋白質及污染物例如DNA或病毒。
藉由Fab可以一個約50kDa之主帶偵測到之電泳方法(例如SDS-PAGE)來分析製得的Fab分子之同一性及產品品質。定性Fab產物之其他分析法包括質譜法、等電聚集法及尺寸篩除層析法。於結合活性之後是BIAcore分析。
細胞培養物之上清液中Fab或全長IgG分子之定量係藉由夾層式酶聯免疫吸附分析法(ELISA)來進行。可使用針對人-Fc片段(Jackson Immuno Research Laboratories)及人κ輕鏈(過氧化物酶結合,Sigma)之抗體來偵測全長IgG。藉由山羊多株抗人IgG(H及L,Novus)固定Fab片段及藉由針對人IgG(過氧化物酶結合,為結合部位)之羊多株抗體來偵測。
亦可自全長抗體分子經酵素裂解獲得Fab分子。該方法的優點係,用於穩健且有效發酵及純化之平臺製程係可行,其等可在期望產物品質下擴大規模且具有高產率。對於使用重組蛋白質A之純化親和層析而言,可使用樹脂作為通常可獲得高純度之主要捕捉步驟。
為達此目的,將重鏈編碼Fab序列融合至人IgG抗體分子之Fc區。接著利用脂質體轉染將所得表現構築體轉染至懸浮生長於無血清培養基中之CHO-DG44細胞中。於48小時後,使該等細胞在包含200μg/mL抗生素G418但不含次黃嘌呤及胸甘之培養基中經歷篩選以獲得穩定轉染之細胞群體。於隨後藉由以漸增濃度(至多100或400nM)添加甲胺喋呤(MTX)至該培養基中使該等穩定轉染物經歷基因擴增。在該等細胞已適應時,以10至11天時間使其等經歷分批進料發酵以獲得IgG蛋白質物質。
藉由利用重組蛋白質A-親和層析自培養物上清液純化IgG蛋白質。為獲得期望之中和Fab片段,全長IgG接著在絞鏈區內裂解IgG之木瓜蛋白酶的存在下培養,因而釋離兩個Fab片段及Fc-部分。
藉由例如蛋白質G或蛋白質L之親和層析法分離Fab分子。或者,
就低結合親和力及能力而言,藉由利用分子之pI之陽離子交換層析(CEX)捕捉Fab。藉由額外正交純化步驟移除宿主細胞蛋白質及污染物例如木瓜蛋白酶、DNA或病毒。
於本發明之另一個態樣中,該抗體分子為如本文所述之抗體分子之胺基酸序列變體。
抗體之胺基酸序列變體可藉由引入適宜之核苷酸變換至抗體DNA中、或藉由肽合成製得。該等變體包括(例如)自本文實例之抗體之胺基酸序列內殘基之缺失、及/或插入及/或代換。進行缺失、插入、及代換之任何組合以達成最終構築體,限制條件為最終構築體具有期望之特徵。胺基酸變換亦可改變人類化或變體抗體之轉譯後加工,諸如,改變糖基化部位的數量或位置。
一種用於識別抗體之為用於突變之較佳部位之特定殘基或區域之有用方法稱為「丙胺酸掃描突變」,如Cunningham及Wells(Science,244:1081-1085(1989))描述。本文中,識別殘基或標靶殘基之群(例如,帶電荷之殘基,諸如,arg、asp、his、lys、及glu)及改由中性或帶負電荷之胺基酸(通常係丙胺酸)代換以影響胺基酸與抗原之相互作用。證實對代換功能敏感之其等胺基酸位置接著藉由在或針對於代換部位引入進一步或其他變體精製化。因此,雖然用於引入胺基酸序列變體之部位係經預定,但突變之性質本身係不需要預定。例如,為分析特定部位處突變之表現,在標靶密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機突變並基於期望之活性來篩選經表現之抗體變體。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至包含一百個或更多個殘基之多肽範圍之胺基-及/或羧基末端融合、及單一或多個胺基酸殘基之序列內部插入。末端插入之實例包括融合至抗原決定部位標籤之抗體。抗體分子之其他插入變體包括增加抗體之血清半衰期之酵素或多肽與該抗體之N-或C端融合之融合物。
變體之另一種類型為胺基酸代換變體。該等變體具有該抗體分子中之至少一個胺基酸殘基被移去及一個不同殘基插於其位置中。用於代換突變之受最大關注的部位包括超變區,但亦包括FR改變。守恆代換以標題「較佳代換」顯示於下表中。假若該等代換致使生物活性改變,則可引入更多的稱為「例示性代換」、或如下文提及胺基酸類別時進一步論述之代換改變及篩選該等產物。
於蛋白質化學中,一般為吾人所接受的是,抗體之生物性質可藉由選擇其於維持(a)代換區域中多肽主鏈之結構,例如,係呈片狀或螺旋構形,(b)分子之標靶部位之電荷或疏水性,或(c)側鏈之體積上影響明顯不同的代換來達成。自然生成之殘基基於常見側鏈性質分為以下各組:(1)疏水性:正亮胺酸、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;(3)酸性:asp、glu;(4)鹼性:asn、gin、his、lys、arg;(5)影響鏈定向之殘基:gly、pro;及(6)芳族性:trp、tyr、phe。
非保守性代換將必需交換該等類別中之一者之成員為另一種類別。
不涉及維持人類化或變體抗體之適當構形之任何半胱胺酸殘基亦可經取代(一般經絲胺酸取代),以增進該分子之氧化穩定性、防止異常性交聯、或提供已經確立的結合至細胞毒性或細胞生長抑制化合物之結合點。反之,可對抗體添加半胱胺酸鍵以增進其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段之情況下)。
代換變體之一種類型關於代換一或多個親本抗體(例如,人類化或人類抗體)之超變區殘基。一般而言,基於進一步開發而選擇的所得變體相對產生其等的親本抗體將具有改良之生物性質。一種產生該等代換變體之簡便方法為利用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之,使若干個超變區部位(例如,6至7個部位)突變以在各部位產生所有可能的胺基代換。如此產生的抗體變體以單價方式自絲狀噬菌體微粒呈融合至封裝於各微粒中之M13之基因III產物之融合物呈現。噬菌體呈現變體接著基於其生物活性(例如,結合親和力)進行篩選。為了確定供修飾用之候選超變區部位,可進行丙胺酸掃描突變以確定明顯貢獻抗原結合之超變區殘基。或者或另外,分析抗原-抗體複合物之結晶體結構以確定抗體與人類達比加群之間之接觸點可具有有益效果。該等接觸殘基及鄰近殘基為根據詳述於本文中之技術進行代換之候選者。在獲得該等變體時,該變體組係如本文所述進行篩選及可選擇在一或多種相關試驗中具有優異性質之抗體用於進一步的開發。
抗體之胺基酸變體之另一種類型係改變抗體之原始糖基化模式。所謂「改變」意指缺失一或多個存在於抗體中之碳水化合物部分,且/或新增一或多個不存在於抗體中之糖基化部位。
於一些實施例中,可希望修飾本發明之抗體以新增糖基化部位。抗體之糖基化通常係N-聯結或O-聯結。N-聯結係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為用於催化碳水化合物部分連接至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此,多肽中任一該等三肽序列之存在會產生可能的糖基化部位。O-聯結糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、或木糖中之一者連接至羥基胺基酸(最常見地,絲胺酸或蘇胺酸),然而,亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。因此,為了使所給定的蛋白質(例如,抗體)糖基化,該蛋白質之胺基酸序列可經工程改造以包含一或多個上述三肽序列(就N-聯結糖基化部位而言)。該改變亦可藉由對該初始抗體之序列新增一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基、或初始抗體之序列經一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基代換來進行(就O-聯結糖基化部位而言)。
可藉由本技藝中已知的多種方法製備編碼抗體之胺基酸序列變體之核酸分子。該等方法包括(但不限於)自天然源分離(就自然生成之胺基酸序列變體而言)或藉由如本文所述之抗體分子之事先製得之變體或非變體變型之寡核苷酸介導(或定點)突變、PCR突變、及序列盒突變來製造。如上所述,本發明之抗體分子之抗原為抗凝血劑。抗原係用於產生抗體分子,藉由使動物免疫、或如同噬菌體呈現方法,藉由從序列庫選擇抗體序列。用於動物之免疫方案為本技藝中熟知。為達成適當的免疫反應,可能需要將抗原與佐劑例如磷酸鋁、氫氧化鋁、角鯊烯、或弗氏完全(Freund's complete)/非完全佐劑組合。本發明上下文中之抗原(例如達比加群)為基本上相當小的有機分子,其有
時在投與給動物後並不刺激抗體形成。因此,可能需要將抗原呈附著素的方式連接至大分子。
於另一個態樣中,本發明係關於一種包含如前面所述之抗體分子及醫藥載劑之醫藥組合物。
為使其用於治療,該抗體分子係包含於適宜之醫藥組合物中以促進投與給動物或人。抗體分子之典型調配物可藉由將抗體分子與生理可接受載劑、賦形劑或穩定劑混合呈凍乾或乾燥調配物或水溶液或水性或非水性懸浮液形式製得。載劑、賦形劑、改質劑或穩定劑在所使用的劑量及濃度下係無毒。其等包括緩衝系統,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及其他無機或有機酸及其鹽;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑,諸如氯化十八烷基二甲基苄銨;氯化六甲雙銨;氯化苄二甲烴銨、氯化苄乙氧銨;苯酚、丁醇或苄醇;對羥基苯甲酸烷酯,諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;及間甲酚);蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮或聚乙二醇(PEG);胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、或離胺酸;單醣、二醣、寡醣或多醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或葡聚糖;螯合劑,諸如EDTA;糖醇,諸如甘露醇或山梨醇;鹽形成抗衡離子,諸如鈉;金屬錯合物(例如,Zn-蛋白質錯合物);及/或離子或非離子表面活性劑,諸如TWEENTM(聚山梨醇酯)、PLURONICSTM或脂肪酸酯、脂肪酸醚或糖酯。亦可於抗體調配物中包含諸如乙醇或異丙醇之有機溶劑。賦形劑亦可具有釋放增進或吸收增進功能。
於一個態樣中,該醫藥組合物包含以10至20mg/ml之濃度含於水性緩衝溶液中之抗體分子、或由該溶液製成之冷凍乾燥物。
較佳的施用模式為非經腸,藉由輸注或注射(靜脈內、肌肉內、
皮下、腹膜內、皮內),但諸如藉由吸入、經皮、鼻內、口頰、口服之其他施用模式亦可適用。
於一個較佳的實施例中,如本文所述之對抗達比加群之抗體分子係用於中和達比加群、達比加群酯、及/或1-O-醯基葡萄糖醛酸之抗凝血活性。
較佳地,血漿中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之濃度係大於0nM但小於1000μM,且其中用於中和達比加群或1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性之逆轉劑係以達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸對逆轉劑的化學計量存在。
於另一個態樣中,血漿中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之濃度係大於0nM但小於1000μM,且其中用於中和達比加群或1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性之逆轉劑係以達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸對逆轉劑之1:1與1:100之間之莫耳比存在。
於另一個態樣中,血漿中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之濃度係介於30nM與1000μM之間,且其中用於中和達比加群或1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性之逆轉劑係以達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸對逆轉劑之30nM與1000μM之比例存在。
於另一個態樣中,本發明係關於一種逆轉或減低罹患出血或處在由於受損凝血能力或創傷所致之出血風險之患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性的方法,該方法包括以下步驟:(a)確定患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之存在量;(b)投與有效量之如本文所述之抗體以逆轉或減低於患者中測得之達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性;及(c)監測患者之凝血酶凝結時間或類似凝結測試以確保已達成達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性之逆轉或減低。
於一個較佳的態樣中,該達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性之逆轉率為100%。於另一個較佳的態樣中,該達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性之減低率係在患者中介於達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之10與99%之間。
欲投與之抗體之「治療有效量」為預防、改良、或治療抗凝血劑治療之副作用所必需之最小量,特別是可有效阻止出血之最小量。此可藉由抗體分子之化學計量來達成。
達比加群(例如)在以推薦劑量給藥時可達成200nM量值之血漿濃度。在使用具有約50kD分子量之單價抗體分子時,可在經靜脈內以快速注射方式給藥時(例如)以約1mg/kg劑量達成中和。於另一個實施例中,施用至人類患者之Fab分子之劑量可為每次施用50至1000mg,例如,100、200、500、750、或1000mg。根據情況,例如,在已投與給患者過劑量達比加群時,可適當地施用甚至更高的劑量,例如,每次施用1250、1500、1750或2000mg。適宜之劑量可不同,此取決於所投與的抗凝血劑之類型及劑量、自該投藥開始實耗的時間、抗原分子之性質、患者的病況、及及其他因素。熟習本技藝者已知確定不僅治療有效且安全之劑量的方法。
於另一個態樣中,本發明係關於一種如本文所述之對達比加群及/或達比加群酯具有結合親和力之抗體分子。較佳地,該抗體分子係以如(例如)藉由表面電漿共振分析(Malmqvist M.,"Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics."Curr Opin Immunol.1993年4月;5(2):282-6.)或動力學排斥試驗(KinExA)技術(Darling、R.J.、及Brault P-A.,“Kinetic exclusion assay technology:Characterization of Molecular Interactions.”ASSAY and Drug Development Technologies.2004年12月2(6):647-657)所測得之具有在0.1pM至100μM(較佳1pM至100μM,
更佳1pM至1μM範圍)之KD值之親和力結合至達比加群及/或達比加群酯。
本發明之抗體分子亦可用於分析及診斷程序,例如,用於確定諸如血漿、血清、或其他體液之樣本中之抗原濃度。例如,像述於實例中之其等,抗原分子可用於酶聯免疫吸附分析法(ELISA)。因此,於另一個態樣中,本發明係關於包含如本文所述之抗體分子之分析及診斷套組,及關於各別的分析及診斷方法。
本發明進一步提供一種包含可用於中和口服抗凝血劑(特定言之直接凝血酶抑制劑)之物質之製品及套組。該製品包括貼有標籤之容器。適宜之容器包括(例如)瓶、小瓶、及試管。該等容器可由諸如玻璃、金屬、塑膠或其組合之多種材料形成。該容器裝納包含本文所述抗體或達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽之組合物。該醫藥組合物中之活性劑為特定之抗體或達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽。抗體之容器上的標籤指示該醫藥組合物係用於活體內中和或部分中和達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽。
本發明之套組包括一或多個上述容器。其可進一步包括其他從商業及使用者觀點而言期望之材料,包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、針筒、及具有使用說明之包裝插頁。
於本發明之一個實施例中,該套組包括任何一種本文所述抗體之抗體或其醫藥組合物。例如,該套組可包括(1)任何一種本文所述抗體或其醫藥組合物、(2)容器及(3)標籤。
於另一個實施例中,該套組包括任何一種本文所述抗體之抗體或其醫藥組合物、及達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽。達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽之形式可呈固體、液體或凝膠之形式。於一個較佳的實施例中,
達比加群酯之醫藥可接受鹽為甲磺酸鹽。在又一較佳的實施例中,以每天一次(QD)或每天兩次(BID)給藥的達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽之每劑量單位的強度係介於約50mg與約400mg、約75mg與約300mg、約75mg與150mg、或約110mg與約150mg之間。例如,該套組可包括(1)任何一種本文所述抗體或其醫藥組合物、(2)達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽之醫藥組合物、(3)容器及(4)標籤。
於一個替代的實施例中,該套組包括(1)包含達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽之第一醫藥組合物、(2)包含任何一種本文所述抗體或其組合之第二醫藥組合物、(3)用於分開投與該第一醫藥組合物及該第二醫藥組合物給患者之使用說明,其中該第一醫藥組合物及該第二醫藥組合物裝納在獨立容器中且該第二醫藥組合物係投與給需要中和或部分中和達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之患者。
本發明亦提供一種中和或部分中和藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之診斷方法,該方法包括投與任何一種本文所述之抗體、其組合或其醫藥組合物。具體言之,本發明提供一種中和或部分中和患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之方法,該方法包括以下步驟:(a)證實患者正藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽治療,及患者所攝取的量;(b)在進行凝結或凝血測試或試驗之前利用任何一種本文所述抗體或其組合來中和達比加群或1-O-醯基葡萄糖醛酸,其中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸將干擾該等測試或試驗結果之準確讀數;(c)於自患者取得之樣本上進行凝結或凝血測試或試驗以確定不存在達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸下凝血形成之程度;
及(d)調整投與給患者之達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽的量以達成患者中凝血形成與降解之間之適宜平衡。抗體對達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之莫耳比係介於0.1與100、較佳介於0.1與10之間之莫耳比。該測試或試驗結果之準確讀數可為纖維蛋白原含量、活化蛋白質C抗性或相關測試之準確讀數。
表1包括該等實例中所用之本發明代表性化合物及參考化合物之序列。可依標準方法製得所有化合物。
Fab化合物FAB 5C/18包含作為重鏈之HCVH5C(SEQ ID NO:12)及作為輕鏈之LCVK18(SEQ ID NO:14)。該結構之化合物已揭示於國際專利申請案WO 2012/130834中(在其中稱為VH5c/Vk18)及可如其中所述製得。
Fab化合物FAB 5C/21包含作為重鏈之HCVH5C(SEQ ID NO:12)及作為輕鏈之LCVK21(SEQ ID NO:15)。該結構之化合物已揭示於國際專利申請案WO 2012/130834中(在其中稱為VH5c/Vk21)及可如其中所述製得。
Fab化合物FAB6包含重鏈互補決定區(CDR),分別為SEQ ID NO:1之CDR1、SEQ ID NO:2之CDR2、及SEQ ID NO:4之CDR3。FAB6包含輕鏈互補決定區(CDR),分別為SEQ ID NO:5之CDR1、SEQ ID NO:6之CDR2、及SEQ ID NO:7之CDR3。Fab化合物FAB6包含作為重鏈可變區之VHFAB6(SEQ ID NO:9)及作為輕鏈可變區之VK18(SEQ ID NO:10)。Fab化合物FAB6包含作為重鏈之HCFAB6(SEQ ID NO:13)及作為輕鏈之LCVK18(SEQ ID NO:14)。
Fab化合物ENG 15/18包含作為重鏈之ENGVH15(SEQ ID NO:16)
及作為輕鏈之ENGVK18(SEQ ID NO:17)。該結構之化合物已描述在國際專利申請案WO 2011/089183及可如其中所述製得。
於表1中,字母「CDR」表示互補決定區,「VH」表示重鏈之可變區,「VK」表示κ輕鏈之可變區,「LC」表示抗體分子之輕鏈,及「HC」表示抗體分子之重鏈。例如,「VHCDR1 5C」表示稱為5C之重鏈之可變域之第一CDR(CDR1),及「VH5C」表示稱為5C之重鏈之可變區。
簡言之,人類血漿係藉由將全血加入3.13%檸檬酸鈉中獲得。接著將該人類血漿離心以獲得無血小板血漿且傳送至獨立管並冷凍直到在試驗當天需求。在進行試驗當天於37℃下解凍血漿。
可如下進行凝血酶凝結時間測定。首先,在提供的緩衝液(Dade Behring測試套組)中稀釋凝血酶達製造商規格(3IU/mL凝血酶)及預熱至37℃。在製得後2h內使用該凝血酶。所有試驗均在市售CL4凝血機器(Behnk Electronics,德國諾德斯泰特)上進行。吸移50μL血漿至提供的具有磁攪拌器之比色皿中及讓其在CL4機器中之預熱至37℃之孔中攪拌2min。在此時間點,添加100μL凝血酶溶液及由CL4自動記錄血漿樣本凝結所需要的時間。在添加凝血酶及開始測量之前,達比加群係於提供的比色皿中之血漿中預先培養5min。假若亦測試抗體(多為50μL儲備溶液),則在開始凝血之前於37℃下再培養5分鐘(換言之,與達比加群培養總計10min,與抗體培養總計5min且接著藉由凝血酶引發凝血)。
表2:凝血酶時間試驗,IC50值。數據以重複四次測量之平均值表
利用KinExA®技術測定Fab及小鼠-人類嵌合抗體之親和力。將恆定濃度之Fab或嵌合抗體與不同濃度之達比加群一起培養直到達成平衡。於該培養之後,藉由捕捉抗體於與與生物素結合之達比加群類似物耦合的中性鏈親和素珠粒上來確定游離抗體之濃度。所捕捉的Fab係藉由經FITC標記之抗人IgG(Fab特異性)F(ab')2片段來偵測。所捕捉的嵌合抗體係藉由與Cy5結合之抗人IgG來偵測。使用1:1結合模型計算解離常數(KD)。
利用動力學直接法,以藉由KinExA®儀器測量速率常數(k結合及k解離)。於該方法中,在溶液中混合結合搭配物,及隨時間探測游離活性結合部位之濃度,此乃因活性結合部位係因為形成複合物而耗乏。以特定時間間隔收集數據點及分析訊號。依此方式可直接測得k結合及解離速率k解離係計算為k解離=KD×k結合。
將Fab濃縮至10mg/ml,與2莫耳過量之達比加群混合及於4℃下培養。將複合物及結晶溶液以1:1混合。複合物在25% PEG 1500、0.1M SPG緩衝液(pH7)中結晶。
於保羅謝爾研究所(Paul Scherrer Institut)的瑞士光源束線PXI-X06SA上收集所有結晶體之資料集。利用autoPROC套裝處理所有資料集(Vonrhein,C.,Flensburg,C.,Keller,P.,Sharff,A.,Smart,O.,Paciorek,W.,Womack,T.& Bricogne,G.(2011).Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.Acta Cryst.D67,293-302.)。
Fab FAB 5C/21:達比加群結晶體以單位晶胞尺寸a=59.97Å、b=78.39Å、c=87,67Å生長在空間基團P212121中及繞射至2.2Å解析度。藉由分子置換及程序移相器(Collaborative Computational Project,number 4.1994."The CCP4 Suite:Programs for Protein Crystallography".Acta Cryst.D50,760-763.Phaser crystallographic software.McCoy AJ,Grosse-Kunstleve RW,Adams PD,Winn MD,Storoni LC,Read RJ.J.Appl.Cryst.(2007).40,658-674.),使用同源Fab結構(PDB-ID 1C1E)作為起始研究模型,來解析複合物結構。電子密度圖譜之分析顯示達比加群之清晰的電子密度。完全結構係以多輪利用Coot之模型建構及利用autoBUSTER之精修加以改進(Coot:用於分子圖形之模型建構工具EmsleyP,Cowtan K Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 60:2126-2132部分12 Sp.Iss.1 DEC 2004.Bricogne G.,Blanc E.,Brandl M.,Flensburg C.,Keller P.,Paciorek W.,Roversi P,Sharff A.,Smart O.S.,Vonrhein C.,Womack T.O.(2011).BUSTER 2.11.2版.英國劍橋市:Global Phasing Ltd)。
Fab FAB 5C/18:達比加群結晶體分別生長在空間基團P21及P212121中。就空間基團P21而言之結晶體顯示a=51.81Å、b=128.92
Å、c=60.26Å之單位晶胞尺寸及繞射至1.9Å解析度。就空間基團P212121而言之結晶體顯示a=48.20Å、b=59.74Å、c=127.69Å之單位晶胞尺寸及繞射至2.2Å解析度。兩種複合物結構係藉由分子置換及程序移相器使用Fab VH5C/VK21之結構作為起始研究模型來解析。電子密度圖譜之分析顯示達比加群之清晰的電子密度。完全結構係以多輪利用Coot之模型建構及利用autoBUSTER之精修加以改進。
各原子及各殘基之空間聚集傾向(SAP)係如(Chennamsetty等人,Proc Natl Acad Sci;2009,106(29),第11937-11942頁)中所述計算,但不包括殘基疏水性參數係取自(Cowan及Whittaker,Pept Res;1990,3(2),第75-80頁)。Fv SAP係計算為抗體之可變域中所有正殘基SAP值之總和。CDR SAP係計算為抗體之互補決定區中所有正殘基SAP值之總和。已計算850種選自蛋白質資料庫(PDB)之不同抗體結構之Fv SAP及CDR SAP,針對於這兩種性質獲得平均值(μFv及μCDR)及標準偏差值(σFv及σCDR)。
接著根據以下計算抗體之Fv SAP及CDR SAP之Z-得分值:Z-得分值(Fv SAP)=(Fv SAP-μFv)/σFv及Z-得分值(CDR SAP)=(CDR SAP-μCDR)/σCDR
結果(圖11):人類化Fab 18/15:Z-得分值(Fv SAP)=1.06
Z-得分值(CDR SAP)=1.00
人類化Fab VH5C/VK18:Z-得分值(Fv SAP)=-0.61
Z-得分值(CDR SAP)=-0.84
人類化Fab VH5C/VK21:
Z-得分值(Fv SAP)=-0.61
Z-得分值(CDR SAP)=-0.78
<110> 凡 萊恩 瓊安
利茲柏格 托比亞斯
納爾 赫伯特
史利格 丹尼爾
史屈勒 菲力斯
<120> 抗凝血劑解毒劑
<130> 01-2960-PV
<140>
<141>
<160> 17
<170> PatentIn 3.5版
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Claims (19)
- 一種對抗達比加群(dabigatran)之抗體分子,其包含具有SEQ ID NO:1之CDR1、SEQ ID NO:2之CDR2、及SEQ ID NO:4之CDR3之重鏈可變域、及具有SEQ ID NO:5之CDR1、SEQ ID NO:6之CDR2、及SEQ ID NO:7之CDR3之輕鏈可變域。
- 如請求項1之抗體分子,其包含SEQ ID NO:9之重鏈可變域及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域,或包含SEQ ID NO:9之重鏈可變域及SEQ ID NO:11之輕鏈可變域。
- 如請求項1之抗體分子,其包含SEQ ID NO:13之重鏈及SEQ ID NO:14之輕鏈,或包含SEQ ID NO:13之重鏈及SEQ ID NO:15之輕鏈。
- 如請求項3之抗體分子,其係由SEQ ID NO:13之重鏈及SEQ ID NO:14之輕鏈組成,或係由SEQ ID NO:13之重鏈及SEQ ID NO:15之輕鏈組成。
- 如請求項1至4中任一項之抗體分子,其為多株抗體、單株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、抗體之片段(特別是Fab、Fab'、或F(ab')2片段)、單鏈抗體(特別是單鏈可變片段(scFv))、小模塊免疫藥物(SMIP)、域抗體、奈米抗體、雙抗體、或經設計之錨蛋白重複序列蛋白(DARPin)。
- 如請求項1至4中任一項之抗體分子,其係用於藥物。
- 如請求項1至4中任一項之抗體分子,其係用於治療或預防抗凝血劑治療之副作用,且/或用於逆轉抗凝血劑之藥物過量。
- 如請求項7之抗體分子,其中該副作用為出血事件。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體分子於製造適於治療或預防抗凝血劑治療之副作用、或抗凝血劑治療中之藥物過量事件的 藥物之用途。
- 一種製造如請求項1至8中任一項之抗體分子之方法,該方法包括:(a)提供包含一或多種與表現控制序列功能性締合之編碼該抗體分子的核酸之宿主細胞,(b)培養該宿主細胞,及(c)自細胞培養回收抗體分子。
- 一種套組,其包含如請求項1至8中任一項之抗體分子、或其醫藥組合物。
- 一種套組,其包括:(a)如請求項1至8中任一項之抗體分子、或其醫藥組合物;(b)容器;及(c)標籤。
- 一種套組,其包括如請求項1至8中任一項之抗體分子、及達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體分子、或其醫藥組合物於製造適於中和或部分中和藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸的藥物之用途。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體分子於製造適於中和或部分中和患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸的藥物之用途,其中該治療包括:(a)證實患者正藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽治療,及患者所攝取的量;(b)在進行凝結或凝血測試或試驗之前利用該藥物來中和達比加群或1-O-醯基葡萄糖醛酸,其中達比加群或達比加群之1-O-醯 基葡萄糖醛酸將干擾該等測試或試驗結果之準確讀數;(c)於自該患者取得之樣本上進行凝結或凝血測試或試驗以確定不存在達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸下凝血形成之程度;及(d)調整投與給該患者之達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽的量以達成患者中凝血形成與降解之間之適宜平衡。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體分子於製造適於減低藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者血漿中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之濃度的藥物之用途。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體分子於製造適於逆轉藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之抗凝血作用的藥物之用途,其中該患者具有視為威脅生命或導致血液動力功能不全之嚴重出血,或其中該患者需要緊急醫療程序。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體分子於製造適於逆轉或減低經歷出血或處在由於受損凝血能力或創傷所致之出血之風險之患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性的藥物之用途,其中該治療包括:(a)確定患者中達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之存在量;(b)投與有效量之該藥物以逆轉或減低於患者中測得之達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸的活性;及(c)監測該患者凝血酶凝結時間以確保已達成逆轉或減低達比加群或達比加群之1-O-醯基葡萄糖醛酸之活性。
- 如請求項1至4中任一項之抗體分子,其係用於藉由達比加群、達比加群酯、達比加群之前藥或其醫藥可接受鹽所治療的患者中,其中該患者具有視為威脅生命或導致血液動力功能不全之嚴重出血,或其中該患者需要緊急醫療程序。
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