TW201722471A - 包括類病毒顆粒及新型佐劑之禽流感疫苗組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露一種疫苗組合物。該疫苗組合物包含：(a)治療有效量的流感病毒之類病毒顆粒(virus-like particle，VLP)，其包含：流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(HA)，以及流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白；(b)口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)VP3殼蛋白、FMDV重組VP3殼蛋白(rVP3)、VP3殼蛋白胜肽或SUMO VP3殼蛋白；以及(c)鋁膠。本發明還揭露了根據本發明之疫苗組合物來製備於有需要誘導免疫原性反應的受試者產生有效反應的疫苗之用途。

Description

包括類病毒顆粒及新型佐劑之禽流感疫苗組合物
本發明一般涉及疫苗，更具體而言涉及禽流感疫苗。
禽流感是一種家禽的主要疾病。該疾病係由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)所引起的。高致病性禽流感病毒如H5N1和H5N2病毒株造成數億鳥類，包括家禽的死亡。目前針對高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)的市售疫苗係由去活化病毒所製成。這種疫苗可能對新突變的高致病性病毒株無效。此外，以去活化病毒疫苗接種的鳥類所產生的抗體無法與被感染的鳥類區分，這可能導致難以監測該疾病流行的情況。因此，需要開發針對禽流感病毒(AIV)的新穎且有效的疫苗，以控制高致病性禽流感病毒(HPAIV)的疫情擴散。針對這些問題，次單位疫苗相對於全病毒疫苗而言是較佳的設計。表現全病毒的結構以及抗原組成的類病毒顆粒(Virus-like particle,VLP)是一種有效的疫苗抗原，而且沒有病毒生長的風險。
於一態樣，本發明係關於一種疫苗組合物，包含：(a)有效劑量的一流感病毒類病毒顆粒(VLP)，包含： 流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)，以及流感病毒神經胺酸酶(neuraminidase，NA)蛋白；(b)一口蹄疫病毒的重組VP3殼蛋白(rVP3)；以及(c)鋁膠。
於另一方面，本發明係關於一種疫苗組合物，其包含：(a)有效劑量的一流感類病毒顆粒(VLP)，包含：流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(HA)，以及流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白；(b)口蹄疫病毒(FMDV)VP3殼蛋白、口蹄疫病毒重組VP3殼蛋白(rVP3)、VP3殼蛋白胜肽或SUMO VP3殼蛋白；以及(c)鋁膠。
於本發明之一具體實施例中，該流感病毒血凝素(HA)和該流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白為禽流感病毒血凝素(HA)和禽流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白。
在另一具體實施例中，該禽流感病毒血凝素(HA)和該禽流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白係選自由H5N2、H5N1以及H5N8所組成之群組。
於另一態樣，本發明涉及配製本發明之疫苗組合物的方法，其中該方法包含將該有效劑量的流感病毒類病毒顆粒(VLP)加入該VP3殼蛋白、rVP3殼蛋白、VP3殼蛋白胜肽或SUMO VP3殼蛋白，以及鋁膠中。
另外，於再一態樣，本發明還關於利用本發明之疫苗組合物 來製備於有需要誘導免疫原性反應的受試者產生有效反應的疫苗之用途。
本發明還關於一個疫苗組合物，用於在有需要的受試者誘導免疫原性的反應。或者，本發明係關於在有需要的受試者中誘導免疫原性反應的方法，包含對有需要的受試者施用本發明之疫苗組合物以誘導免疫原性反應。
該受試者可以是哺乳類動物以及禽類動物的至少一種。
另外，於又一態樣，本發明涉及包含流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(HA)，以及流感神經胺酸酶(NA)蛋白的流感病毒類病毒顆粒(VLP)。
或者，本發明係關於流感類病毒顆粒(VLP)，其包含：(a)可以自我組裝成一VLP核心的一流感病毒M1核心蛋白；以及(b)在該VLP表面上表現的流感病毒血凝素(HA)和流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白；其中該VLP為非複製性且非感染性的，而且不含有完整的病毒核酸。該流感VLP可以進一步包含在該流感VLP的表面上表現流感病毒M2蛋白。
另外，於另一方面，本發明係關於包含生產本發明之流感病毒VLP的宿主細胞。
於一具體實施例中，該宿主細胞為Vero細胞或293T細胞。
依照以下說明結合附圖將對具體實施做更好的描述，在不脫離本發明的新穎概念的精神和範圍的情況下，明顯地可以在其中採取一些變化和修改。
附圖說明了本發明之一個或多個具體實施例，並且與書面描 述一起用於解釋本發明之原理。盡可能地，在整個附圖中使用相同的元件符號以指示具體實施例中的相同或相似之元件。
第一圖所示為由Vero E6細胞產生的H5N2-VLP的特徵分析。(A)血球凝集作用的效價。(B)以西方墨點分析法定量分析H5N2-VLP所含之HA蛋白量。(C)以穿透式電子顯微鏡觀察H5N2-VLP的形態。
第二圖所示為rVP3蛋白具有顯著刺激雞的B細胞(A，左圖)以及CD8+ T細胞(A，右圖)增殖的功效，並誘導雞的這些免疫細胞產生IFN-γ(B)。
第三圖(A)所示為在以rVP3與鋁膠作為佐劑之VLP免疫的雞隻經過攻毒後完全存活，這比以rVP3與鋁膠作為佐劑之去活化病毒免疫的雞在攻毒實驗中所產生的結果還更好。(B)病毒脫落量測試顯示經以rVP3與鋁膠作為佐劑之VLP免疫的雞隻病毒脫落量比用去活化病毒免疫的雞病毒脫落量還少。(C)IFN-γ測試發現經以rVP3與鋁膠作為佐劑之VLP免疫的雞比用去活化病毒免疫的雞產生更高量的IFN-γ。
在以下實施例中更具體地描述本發明，這些實施例僅僅是說明性的，對於本領域技術人員而言，可以在其中採取多種修改和變化是清楚明白的。現在詳細描述本發明的各種具體實施例。參考附圖，如整個圖中所示，相同的元件符號表示相同的組成部分。除非上下文另有明確說明，否則在本文的描述以及之後的申請專利範圍中使用的「一」、「一個」以及「該」的含義包括複數形式。此外，如本文的描述以及之後的申請專利範 圍中所使用的，除非上下文另有明確指示，否則「在...之中」的含義包括「在...之中」以及「在...之上」。此外，為了讀者的方便，可以在說明書中使用標題或副標題，其不會影響本發明的範圍。另外，本說明書中使用的一些術語在下面有更具體地定義。
定義
在本說明書中使用的術語，在本發明的上下文中以及在使用每個術語的特定上下文中，通常具有它們在本領域中的普通含義。用於描述本發明的某些術語在下文或說明書中的其他地方討論，以向實踐者提供關於本發明之描述的附加指導。為了方便，可以突出顯示某些術語，例如使用斜體及/或引號。使用突出顯示對術語的範圍和含義沒有影響；在相同的上下文中，無論是否被突出顯示，術語的範圍和含義是相同的。應當理解的是，相同的事物可以以多於一種方式來闡述。因此，替代語言和同義詞可用於本文所討論的任何一個或多個術語，不會因本文是否詳細描述或討論術語而施加任何特別的重要性。某些術語的同義詞也被提供於本發明中。一個或多個同義詞的表述不會排除使用其他的同義詞。在本說明書中的任何地方使用實施例，包括本文討論的任何術語的示例僅是說明性的，並且絕不限制本發明或任何示例性術語的範圍和含義。同樣，本發明不限於本說明書中給出的各種具體實施例。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術與科學術語具有與本發明所屬領域的通常知識者通常理解的相同的含義。在衝突的情況下，本文件，包括定義將控制該含義。
如本文所用，「約」、「大約」或「近似」通常表示在所給定 的數值或範圍的20%內，較佳在10%內，更佳在5%內。本文給出的數量是近似的，意味著如果沒有明確說明，術語「約」、「大約」或「近似」是可以推斷。
VP3為口蹄疫病毒(FMDV)的殼蛋白之一。口蹄疫病毒(FMDV)的殼蛋白係由四種結構蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4，所組成。
rVP3為一種衍生自重組DNA之VP3類蛋白，其自大腸桿菌表現及純化。T7標籤以及His標籤分別連接到VP3蛋白的N端及C端。
VP3胜肽為一種由口蹄疫病毒(FMDV)VP3蛋白第91~150個殘基所組成的多胜肽。
SUMO VP3為一種VP3融合蛋白，其中VP3係融合到六組胺酸標記的酵母SUMO(小泛素相關修飾物，small ubiquitin-related modifier)蛋白上。
開發新穎且有效的疫苗以保護人類及動物免受流感病毒的感染，並且控制流感病毒的傳播，是全世界的重要任務。抗原製備物和佐劑都是疫苗的重要組成分。代表整個病毒的結構和抗原組成的類病毒顆粒(VLP)是有效的疫苗抗原，而且不具有病毒生長的風險。我們發現VLP與rVP3以及鋁膠作為抗禽流感病毒疫苗的組合產生了最好的保護。以含有rVP3與鋁膠作為佐劑的H5N2-VLP疫苗免疫的雞隻，以H5N2病毒攻毒後保護率達100%，造成比以含有rVP3與鋁膠作為佐劑的去活化病毒疫苗免疫的雞隻具有更少的病毒釋出。我們的數據顯示含有rVP3及鋁膠作為佐劑的VLP可作為對抗流感病毒的新型疫苗。
實施例
在不意圖限制本發明之範圍的情況下，以下提供根據本發明之具體實施例的示例性儀器、裝置、方法及其相關結果。注意，為了讀者的方便，可以在實施例中使用標題或副標題，其應當不以任何方式限制本發明之範圍。此外，本文提出並揭露了某些理論；然而，不管它們是對還是錯，都不應限制本發明之範圍，只要根據本發明實施該發明而不考慮任何特定的理論或作用方案。
VP3與VLP係根據美國專利號8,980,281與8,795,678所製備，其全部內容係通過引用方式併入本文。
FMDV VP3蛋白係從大腸桿菌中表現及純化而來。簡言之，將編碼FMDV VP3的基因選殖到pET-24a表現載體(Novagen公司，麥迪遜，威斯康辛州，美國)中，並轉型到BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株(Stratagene公司，加州，美國)中。在TEN緩衝液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，100mM NaCl)中以微流化器(M-110Y細胞破碎)將表現重組VP3蛋白的大腸桿菌破碎。將細菌裂解物離心，將沉澱物以含有0.05%去氧膽酸鹽的TEN緩衝液、含有25%蔗糖的TEN緩衝液，以及TEN緩衝液依次清洗。沉澱物最後以結合緩衝液(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，8M尿素)溶解，且以具有咪唑階躍梯度(step gradient)的鈷親和管柱純化VP3。將含有VP3蛋白的分段匯集在一起，然後以10倍體積的重新折疊緩衝液(20mM Tris，5μM β-巰基乙醇)以滴加的方式稀釋，並在4℃下作用1小時。將重新折疊的VP3在4℃下以10倍體積的透析緩衝液(20mM Tris，100mM NaCl，2μM β-巰基乙醇)透析整夜。
rVP3蛋白序列(SEQ ID NO：1)，具有241個胺基酸：
VP3蛋白序列(SEQ ID NO：2)，具有220個胺基酸：
VP3肽序列(SEQ ID NO：3)，具有60個胺基酸：
SUMO VP3蛋白序列(SEQ ID NO：4)，具有342個胺基酸：
M1序列(SEQ ID NO：5)，具有252個胺基酸
M2序列(SEQ ID NO：6)，具有97個胺基酸
H5序列(SEQ ID NO：7)，具有564個胺基酸
N2序列(SEQ ID NO：8)，具有449個胺基酸
實施例1
自Vero細胞進行流感病毒類病毒顆粒(VLPs)的表現及純化。根據美國專利號8,980,281建立產生流感病毒VLP的Vero細胞系統。
基於美國專利號8,980,281中公開之已建立的平台，透過將pCI6/TO-M1-M2和pCI4/TO-HA-NA質體分兩步驟穩定轉染到293T細胞中，我們成功地產生了生產H5N2-VLP的細胞選殖株。我們還使用Vero E6細胞在Vero細胞中生產流感病毒H5N2-VLP。簡言之，我們構築了含有兩個表現匣的質體，用四環黴素誘導方式表現禽流感病毒的H5蛋白和N2蛋白。透過在起始細胞株中穩定轉染表現質體，隨後分離選殖株，我們篩選並鑑定了產生H5N2-VLP的細胞株。在微載體懸浮培養系統以去氧羥四環素誘導，以使VLP自生產細胞表現和分泌。將條件培養基用超高速離心純化後，對分泌VLPs的顆粒形態(第一圖C)、平均大小和血凝反應能力進行特徵分析，並且透過總蛋白量和血凝素(HA)蛋白量來定量VLP成分。我們發現，以這種方式進行的Vero細胞比293T細胞成為更好的VLP生產者。它們含有更多的 血凝素(HA)蛋白，且可多達9%的總VLP蛋白(第一圖A和第一圖B)。此外，Vero E6細胞產生的VLP的血球凝集作用效價比293T細胞產生的血球凝集作用效價高4倍。因此，將在Vero E6細胞中產生的H5N2-VLP作為禽流感病毒疫苗的抗原。
抗原製劑和佐劑都是疫苗的重要組分。為了尋找更好的佐劑，我們選殖了口蹄疫病毒殼蛋白的VP3基因。含有VP3基因的質體在大腸桿菌中過度表現、純化並重新折疊以具有佐劑活性。然後我們研究了rVP3是否可以活化雞免疫細胞中的免疫反應。我們發現rVP3刺激了雞的B細胞和CD8+ T細胞的增殖(第二圖A)。rVP3也誘導這些雞免疫細胞產生IFN-γ(第二圖B)。這些結果顯示，rVP3在體外誘導雞免疫細胞的細胞免疫反應。
為了檢查H5N2-VLP和rVP3的疫苗功效，我們首先以H5N2-VLP單獨免疫雞隻，發現它沒有引起足夠的抗體效價，表示H5N2-VLP需要佐劑的輔助以誘導完全免疫反應。與以含有rVP3和鋁膠作為佐劑之相同劑量的H5N2-VLP疫苗免疫的雞隻，或與以含有鋁膠的相同劑量的去活化病毒疫苗免疫的雞隻相較，以含有鋁膠作為佐劑之低劑量的H5N2-VLP疫苗免疫的雞隻在攻毒後10天病情較為嚴重。以含有rVP3和鋁膠作為佐劑之較高劑量的H5N2-VLP疫苗初次免疫並加強免疫的雞隻，會引起較高的血球凝集抑制作用(hemagglutination inhibition，HI)抗體以及血清中和(serum neutralization，SN)抗體效價，類似於以含有rVP3和鋁膠作為佐劑的去活化病毒疫苗免疫的作用及抗體效價。此外，以含有rVP3和鋁膠作為佐劑的H5N2-VLP疫苗免疫的雞隻，經過H5N2病毒攻毒後完全存活(第三圖A)，具有較少的病毒釋出，甚至優於以含有rVP3和鋁膠作為佐劑的去活化病毒 疫苗免疫的結果(第三圖B)。與我們的雞免疫細胞體外研究結果一致，以含有rVP3和鋁膠作為佐劑的H5N2-VLP疫苗免疫的雞隻，誘導產生的IFN-γ和IL18高於以含有rVP3和鋁膠作為佐劑的去活化病毒疫苗所誘導產生的IFN-γ和IL18(第三圖C)。
實施例2
使用如上述之類似方法，透過將pCI6/TO-M1-M2和pCI4/TO-HA-NA質體分兩步驟連續穩定地轉染到293T細胞中，我們製造出產生H5N1-VLP的細胞選殖株。我們還使用Vero E6細胞在Vero細胞中產生流感病毒H5N1-VLP。簡言之，我們構築了含有兩個表現匣的質體，以允許四環黴素誘導表現禽流感病毒的H5蛋白和N1蛋白。透過在創始細胞株中穩定轉染表現質體，隨後分離選殖株，我們篩選並鑑定了產生H5N1-VLP的細胞株。在微載體懸浮培養系統中以去氧羥四環素誘導，以使VLP自生產細胞表現和分泌。在條件培養基的離心純化後，對分泌VLPs的顆粒形態、平均大小和血凝反應能力進行特徵分析，並且透過總蛋白量定量VLP成分。以在Vero E6細胞中產生的H5N1-VLP作為禽流感病毒疫苗的抗原。
實施例3
使用如上述之類似方法，透過將pCI6/TO-M1-M2和pCI4/TO-HA-NA質體分兩步驟連續穩定地轉染到293T細胞中，我們製造出產生H5N8-VLP的細胞選殖株。我們還使用Vero E6細胞在Vero細胞中產生流感病毒H5N8-VLP。簡言之，我們構築了含有兩個表現匣的質體，用四環黴素誘導方式表現禽流感病毒的H5蛋白和N8蛋白。透過在創始細胞株中穩定轉染表現質體，隨後分離選殖株，我們篩選並鑑定了產生H5N8-VLP的細胞 株。在微載體懸浮培養系統中以去氧羥四環素誘導，以使VLP自生產細胞表現和分泌。將條件培養基利用超高速離心純化後，對分泌VLPs的顆粒形態、平均大小和血凝反應能力進行特徵分析，並且透過總蛋白量定量VLP成分。以在Vero E6細胞中產生的H5N8-VLP作為禽流感病毒疫苗的抗原。
總之，我們已經發現了針對高致病性禽流感病毒的新疫苗。這種新的禽流感病毒疫苗由禽流感病毒類病毒顆粒(VLP)作為抗原以及以rVP3和鋁膠作為佐劑所組成。該疫苗可以在免疫的雞隻中誘導高效價的中和抗體以及細胞調節的免疫反應。它保護雞隻抵抗高致病性禽類病毒的攻毒以及具有較少的病毒釋出。該疫苗可作為抗禽流感病毒的疫苗，以保護家禽產業、家禽蛋產業，以及人類免於禽流感病毒流行病疫情的爆發。
本發明之示例性實施例的上述描述僅出於說明及描述的目的而呈現，並且並非意圖窮舉或將本發明限於所公開的精確形式。鑑於上述教示，許多修改及變化是可能的。
選擇和描述實施例和示例以便解釋本發明的原理及其實際應用，以便使本領域的通常知識者能夠利用本發明和各種實施例，以及進行各種修改以適合於預期的特定用途。在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，替代實施例對於本發明所屬領域的通常知識者將變得清楚明瞭。因此，本發明的範圍係由所附之申請專利範圍限定，而非由上述描述與其中所述之示例性實施例限定。
在本發明的描述中引用和討論了一些參考文獻，其可以包括專利、專利申請案以及各種出版物。提供這種參考文獻的引用及/或討論僅僅是為了澄清本發明之描述，而非承認任何這樣的參考文獻為本發明之「現 有技術」。在本說明書中引用和討論的所有參考文獻係透過引用方式整體併入本文，並且與每個參考文獻單獨地透過引用而併入本文一樣。
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Claims (15)

  1. 一種疫苗組合物，包含：(a)有效劑量的一流感病毒類病毒顆粒(virus-like particle，VLP)，包含：流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)，以及流感病毒神經胺酸酶(neuraminidase，NA)蛋白；(b)一口蹄疫病毒的重組VP3殼蛋白(rVP3)；以及(c)鋁膠。
  2. 一種疫苗組合物，包含：(a)有效劑量的一流感病毒類病毒顆粒(VLP)，包含：流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(HA)，以及流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白；(b)口蹄疫病毒(FMDV)VP3殼蛋白、口蹄疫病毒重組VP3殼蛋白(rVP3)、VP3殼蛋白胜肽或SUMO VP3殼蛋白；以及(c)鋁膠。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物，其中該流感病毒血凝素(HA)和該流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白為禽流感病毒血凝素(HA)和禽流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白。
  4. 如申請專利範圍第3項之疫苗組合物，其中該禽流感病毒血凝素(HA)和該禽流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白係選自由H5N2、H5N1以及H5N8所組成之群組。
  5. 一種配製如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物的方法，包含：將有效劑量的該流感病毒類病毒顆粒(VLP)加入該VP3殼蛋白、rVP3殼蛋白、VP3殼蛋白胜肽或SUMO VP3殼蛋白，以及鋁膠中。
  6. 一種如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物在製備於有需要誘導免疫原性反應的受試者產生有效反應的疫苗之用途。
  7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該受試者係選自由哺乳類動物以及禽類動物所組成之群組中的至少一種。
  8. 一種如申請專利範圍第3項之疫苗組合物在製備於有需要誘導免疫原性反應的受試者產生有效反應的疫苗之用途。
  9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該受試者係選自由哺乳類動物以及禽類動物所組成之群組中的至少一種。
  10. 一種如申請專利範圍第4項之疫苗組合物在製備於有需要誘導免疫原性反應的受試者產生有效反應的疫苗之用途。
  11. 一種流感病毒類病毒顆粒(VLP)，包含：流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(HA)，以及流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白。
  12. 一種流感病毒類病毒顆粒(VLP)，包含：(a)可以自我組裝成一VLP核心的一流感病毒M1核心蛋白；以及(b)在該VLP表面上表現的流感病毒血凝素(HA)和流感病毒神經胺酸酶(NA)蛋白；其中該VLP為非複製性且非感染性的，而且不含有完整的病毒核酸。
  13. 如申請專利範圍第12項之流感病毒類病毒顆粒(VLP)，進一步包含在該流感病毒VLP的表面上表現之流感病毒M2蛋白。
  14. 一種宿主細胞，包含如申請專利範圍第11、12以及13項中任一項之流感病毒類病毒顆粒(VLP)。
  15. 如申請專利範圍第14項之宿主細胞，其中該宿主細胞為Vero細胞或293T細胞。
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