TW201722444A

TW201722444A - 重組李斯特菌疫苗菌株及在癌症免疫治療中使用該菌株之方法

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Publication number: TW201722444A
Application number: TW105133303A
Authority: TW
Inventors: 羅伯特佩提; 凱爾派瑞
Original assignee: 艾法西斯公司
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2017-07-01
Also published as: JP2018530588A; WO2017066706A8; MA43124A; AU2016340148A1; KR20180056782A; CN108368513A; US20180280487A1; SG11201802913VA; WO2017066706A1; EP3368675A1; IL258563A; CA3001702A1; MX2018004598A

Abstract

本發明提供了針對人類乳突狀瘤病毒相關的腫瘤或癌症之治療、預防及誘發免疫反應的方法，其包括對一個體投與一重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株係表現一包括有至少一人類乳突狀瘤病毒抗原的構築體。

Description

重組李斯特菌疫苗菌株及在癌症免疫治療中使用該菌株之方法

本發明提供了針對人類乳突狀瘤病毒相關的腫瘤或癌症之治療、預防及誘發免疫反應的方法，其包括對一個體投與一重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株係表現一包括有至少一人類乳突狀瘤病毒抗原的構築體。

人類乳突狀瘤病毒(HPV)相關的口咽癌(HPVOPC)在美國的流行率正在增加(從1988年到2004年為225%)。HPVOPC患者趨向於更年輕且具有良好的預後，與HPV陰性患者相比，死亡風險降低了69%。然而，目前大多數的晚期HPVOPC患者，及標準的放化療方案係與顯著的毒性相關。因此具有良好預後的患者矛盾地處在與治療相關之生活品質結果長期不佳的較大風險中。免疫治療具有通過放化療方案的減緩而降低毒性的潛力，且可能增強長期的疾病控制。

HR-HPV E6及E7蛋白係持續表現在非典型增生及惡性腫瘤中，分別破壞細胞週期調節蛋白p53及pRb。由非典型增生及侵襲性惡性病變所強制表現的E6及E7，以及這些蛋白質的病毒來源，使其成為極好的HPV治療性疫苗的靶標。

單核球增多性李斯特菌(Lm)係為一種經由食物傳染的革蘭氏陽性細菌，其有時可在人類中造成疾病，特別是老年人、新生兒、孕婦及免疫力低下的個體。除了會強烈活化先天性免疫及誘發細胞素反應以增強抗原表現細胞(APC)功能外，Lm具有在從吞噬溶酶體逃逸後於APC的胞質液中複製的能力，這主要係通過李斯特菌溶解素O(LLO)蛋白的作用。這種獨特的細胞內生命週期讓由Lm分泌的抗原可被處理並呈現為MHC I及II類分子二者的主體，導致強力的細胞毒性CD8⁺及Th1型CD4⁺ T細胞介導的免疫反應。

本發明藉由提供一種包括若干HPV抗原之基於單核球增多性李斯特菌的免疫療法，以及其用於預防及治療HPV相關的癌症之用途，來解決在患有人類乳突狀瘤病毒(HPV)相關癌症的患者中改善治療方式的需求。

於一態樣中，本發明係有關一種包括了一包括有一重組核酸之重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，該重組核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到至少一異源抗原或其片段之LLO蛋白N端片段，其中該重組核酸更包括一編碼一代謝酶之第二開放讀碼框架。於另一態樣中，該重組李斯特菌包括內源性dal、dat及actA基因的突變、缺失或不活化。

於另一個態樣中，本發明係有關一種包括了一包括有一重組核酸之重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，該重組核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到四個異源抗原或其片段的LLO蛋白N端片段，其中該重組核酸更包括一編碼一代謝酶之第二開放讀碼框架，且其中該四個異源抗原係選自由HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18 E6及HPV18 E7抗原所組成之群組。於另一態樣中，該重組李斯特菌包括內源性dal、dat及actA基因的突變、缺失或不活化。

本發明之其他特徵及優點將自以下詳細描述實例及圖式而變得顯而易見。然而，應瞭解在指示本發明之較佳實施例時，詳細描述及特定實例僅以說明的方式給出，此係因為熟習此項技術者根據此詳細描述將易於清楚在本發明之精神及範疇內的各種改變及修改。。

以下圖式形成本說明書的一部分且被包含在內以進一步展示本發明之特定態樣，其中本發明可以藉由結合本文中呈現之特定實施例的詳細描述並參考此等圖式中之一或多者而可以更好地理解。本專利或申請案文件含有至少一張彩色繪製之圖式。在請求並且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。

圖1. Lm-E7及Lm-LLO-E7使用不同表現系統來表現並分泌E7。Lm-E7係藉由將基因卡匣引入單核球增多性李斯特菌基因體之orfZ結構域中而產生(圖A)。hly啟動子驅動hly信息序列及LLO的前五個胺基酸(AA)繼而HPV-16 E7之表現。(圖B)，Lm-LLO-E7係藉由用質體pGG-55轉型prfA-菌株XFL-7而產生。pGG-55具有驅動LLO-E7之非溶血性融合體表現的hly啟動子。pGG-55亦含有prfA基因以在活體內選擇由XFL-7保留的質體。

圖2. Lm-E7及Lm-LLO-E7分泌E7。Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)及10403S(泳道6)係在Luria-Bertoni培養液中在37℃下隔夜生長。將相等數目的細菌(例如藉由OD在600nm下的吸光度所測定)沈澱成粒，並使18ml的各個上清液經TCA沈澱。E7的表現係利用西方墨點法分析。墨點係依序用抗E7 mAb及HRP接合之抗小鼠(Amersham)進行探針探查，接著使用ECL偵測試劑顯影。

圖3. LLO-E7融合體之腫瘤免疫治療功效。其顯示在腫瘤接種後7、14、21、28及56天時小鼠中的腫瘤大小(以毫米為單位)。未處理小鼠：空心圓形；Lm-LLO-E7：實心圓形；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；及Lm-LLO-NP：實心三角形。

圖4. 圖4係顯示來自於經Lm-LLO-E7免疫接種之小鼠的脾細胞在暴露於TC-1細胞時增殖。C57BL/6小鼠係經以Lm-LLO-E7、Lm-E7或對照rLm菌株免疫接種並加強。脾細胞在加強後6天收集且以所示比率與經輻射照射的TC-1細胞一起塗盤。細胞係以³H胸苷脈衝處理並收集。Cpm係以(實驗組cpm)-(無TC-1對照)來定義。

圖5. A.在投與TC-1腫瘤細胞且隨後投與Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7或無疫苗(未處理)的小鼠中，脾臟中之E7特異性分泌IFN-γ的CD8⁺ T細胞之誘發以及滲入腫瘤的數目。B.針對圖A所述之小鼠的脾臟及腫瘤中E7特異性CD8⁺細胞之誘發及滲入。

圖6. 含有PEST區之李斯特菌構築體在腫瘤內誘發較高百分比的E7特異性淋巴細胞。A.來自1次實驗之代表性資料。B.來自全部3次實驗之資料的平均值及SF。

圖7A. 重組李斯特菌疫苗載體在細菌負荷(毒力)方面的繼代效果。上圖：Lm-Gag。下圖：Lm-LLO-E7。圖7B. 重組Lm-E7於脾臟中在細菌負荷方面的繼代效果。其描繪來自4隻小鼠的脾臟均質物中之每毫升的活細菌平均CFU。

圖8係顯示於投與經繼代的Lm-Gag後相對於投與未經繼代的Lm-Gag之針對HIV-Gag及LLO誘發抗原特異性CD8⁺ T細胞的結果。小鼠係經以10³(A、B、E、F)或10⁵(C、D、G、H)CFU的經繼代李斯特菌疫苗載體免疫接種，並分析抗原特異性T細胞。B、D、F、H：未經繼代的李斯特菌疫苗載體。A-D：對MHC I類HIV-Gag肽的免疫反應。E-H：對LLO肽的免疫反應。I：來自以10⁵CFU的經繼代Lm-Gag免疫接種之小鼠的脾細胞係以來自HPV E7的對照肽刺激。

圖9A係顯示在LB穩定性研究中的質體分離情形。圖9B係顯示在TB穩定性研究中的質體分離情形。圖9C係顯示TB穩定性的定量分析。

圖10係顯示來自生長在LB中的細菌之可耐受氯黴素(CAP)及CAP敏感型活細菌的菌落形成單位(CFU)數目。深色長條區域：CAP⁺；白色長條區域：CAP^-。每一時間點的兩個深色長條區域及兩個白色長條區域係表示二重複的樣本。

圖11係顯示來自生長在TB中的細菌之可耐受CAP及CAP敏感型活細菌之CFU數目。深色長條區域：CAP⁺；白色長條區域：CAP-。每一時間點的兩個深色長條區域及兩個白色長條區域係表示二重複的樣本。

圖12. 顯示D133V突變區域(箭頭處)之實際色譜圖。混合物比例係顯示於括號中。

圖13. ADV451、452與453引子的位置以及在反應中prfA基因擴增的區段。

圖14. 使用引子ADV451及ADV453的PCR反應特異性。

圖15. 使用引子ADV452及ADV453的PCR反應特異性。

圖16. 使用引子ADV452及1ng(毫微克)做為DNA起始數量以偵測野生型prfA序列之PCR反應靈敏度。

圖17. 使用引子ADV452及5ng做為DNA起始數量以偵測野生型prfA序列之PCR反應靈敏度。

圖18. 描述於圖16中的PCR之吸光帶平均密度。

圖19. 描述於圖17中的PCR之吸光帶平均密度。

圖20. 使用引子ADV452以偵測野生型prfA序列之PCR反應核驗。

圖21. 描述於圖16中的PCR之吸光帶平均密度。

圖22. Lm-LLO-E7中的D133V PrfA突變分析結果。A：用於密度測定的原始影像；B：影像係經數位強化以促進低密度吸光帶的顯像。

圖23. (A)Lmdd-143及LmddA-143於klk3整合及actA缺失之後的染色體區域示意圖；(B)klk3基因整合到Lmdd及LmddA染色體中時的示意圖。以PCR使用klk3特異性引子從每一個構築體製備的染色體DNA擴增一對應於klk3基因的714bp吸光帶，且其缺失野生型蛋白質的分泌信息序列。

圖24. (A)pADV134質體的圖譜。(B)使來自於LmddA-134培養物上清液的蛋白質沉澱，在SDS-PAGE中分離，並以西方墨點法使用抗E7單株抗體來偵測LLO-E7蛋白。抗原表現卡匣係由hly啟動子、截短的LLO之ORF、及人類PSA基因(klk3)所組成。(C)pADV142質體的圖譜。(D)西方墨點法顯示在使用抗-PSA及抗LLO抗體時之LLO-PSA融合蛋白表現。

圖25. 以表現HPV 16 E6&E7之TC1腫瘤接種的小鼠中所量測到的腫瘤體積；其係經下列處理：(A)劑量遞減的Lmdda-HPVQuad或LmddA274，(B)1×10⁸ Lmdda-HPVQuad,1×10⁷ Lmdda-HPVQuad或LmddA274，(C)1×10⁸ Lmdda-HPVQuad,2.5×10⁷ Lmdda-HPVQuad或LmddA274，(D)1×10⁸ Lmdda-HPVQuad,5×10⁷ Lmdda-HPVQuad或LmddA274。

圖26. (A)以表現HPV 16 E6&E7之TC1腫瘤接種的小鼠中所量測到的腫瘤體積；其經以劑量遞減的AXAL/Lm-E7處理或以空的Lm-tLLO載體處理。(B)以表現HPV 16 E6&E7之TC1腫瘤接種的小鼠中所量測到的腫瘤體積；其經以劑量遞減的Lmdda-HPVQuad處理或以空的Lm-tLLO載體處理。N=每組5-10隻動物。

應理解為了使圖式簡單清晰，圖中顯示的元件不一定是按比例繪製的。例如，為了清晰起見，一些元件的尺寸相對於其他元件被放大。此外，在考慮合適的地方，附圖標記可以在圖中重複使用，以指明對應的或類似的元件。

本發明提供了包括有重組李斯特菌菌株之組合物，所述重組李斯特菌菌株係表現一包括有李斯特菌溶解素O(LLO)片段及至少一抗原或其與疾病相關聯的片段之重組多肽，並提供了針對疾病之治療、預防及誘發免疫反應之方法，所述方法包括施與該包括有重組李斯特菌菌株之組合物的步驟。

於一實施例中，本文中所揭露的核酸分子係包括異源抗原或其片段。於另一實施例中，該重組多肽進一步包括一融合至該異源多肽的N端LLO。於另一實施例中，本文中所揭露的核酸分子進一步包括一編碼代謝酶之第二開放讀碼框架。於另一實施例中，該代謝酶係與該重組李斯特菌菌株之染色體中所缺乏的一內源性基因互補。於另一實施例中，由該第二開放讀碼框架編碼之代謝酶為丙胺酸消旋酶基因(dal)。於另一實施例中，由該第二開放讀碼框架編碼之代謝酶為D-胺基酸轉移酶(dat)。於另一實施例中，本文中所揭露的李斯特菌菌株包括基因體dal、dat或actA基因的突變、缺失或不活化。於另一實施例中，本文中所揭露的李斯特菌菌株包括基因體dal、dat及actA基因的突變、缺失或不活化。於另一實施例中，該李斯特菌缺失基因體dal、dat或actA基因。於另一實施例中，該李斯特菌缺失基因體dal、dat及actA基因。

於一實施例中，本文中所揭露的是一種編碼一包括有下列元件之重組多肽的核酸構築體：一融合至一第一異源抗原胺基酸序列之N端截斷LLO(tLLO)，其中該第一異源抗原胺基酸序列係可操作地連接一第二異源抗原胺基酸序列，其中該第二異源抗原胺基酸序列係可操作地連接至少一額外的異源抗原胺基酸序列。於另一實施例中，該等元件係經配置或可操作地從N端連接至C端。於另一實施例中，該核酸序列包括一或多個併入於至少一第一異源抗原與至少一第二異源抗原之間的連接序列。於另一實施例中，該核酸序列包括至少二個併入於至少一第一異源抗原及至少一第二異源抗原到至少一第三異源抗原之間的不同連接序列。於另一實施例中，一或多個連接子為4個甘胺酸的連接子。

於另一實施例中，本文中所揭露的重組李斯特菌菌株包括了一包括有編碼重組多肽之第一開放讀碼框架的重組核酸構築體，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到至少一異源抗原或其片段之LLO蛋白N端片段。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括了一包括有編碼重組多肽之第一開放讀碼框架的重組核酸構築體，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到一個以上的異源抗原或其片段之LLO蛋白N端片段。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括了一包括有編碼重組多肽之第一開放讀碼框架的重組核酸構築體，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到二個異源抗原或其功能性片段之LLO蛋白N端片段。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括了一包括有編碼重組多肽之第一開放讀碼框架的重組核酸構築體，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到二至四個異源抗原或其功能性片段之LLO蛋白N端片段。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括了一包括有編碼重組多肽之第一開放讀碼框架的重組核酸構築體，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到四個異源抗原或其功能性片段之LLO蛋白N端片段。於一實施例中，二至四個異源抗原係可操作地串聯連接且於最N端的異源抗原之N端處融合至LLO蛋白N端片段。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括了一包括有編碼重組多肽之第一開放讀碼框架的重組核酸構築體，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到四個以上的異源抗原或其功能性片段之LLO蛋白N端片段。

該N端LLO蛋白片段及異源性抗原於另一實施例中係直接彼此融合。於另一實施例中，該等編碼該N端LLO蛋白片段及該異源抗原的基因係直接彼此融合。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段及該異源抗原係通過一連接肽而附接。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段及該異源抗原係通過一異源肽而附接。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段為該異源抗原的N端。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段為該融合蛋白的N端大部分。

於一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一四價游離型表現載體，該載體包括第一、第二、第三及第四核酸分子，各核酸分子編碼一異源抗原性多肽或其一功能性片段，其中該第一至第四核酸分子每一者係於一具有N端、截斷或去毒性的李斯特菌溶解素O蛋白(LLO)之開放讀碼框架中編碼該異源抗原性多肽或其功能性片段。於另一實施例中，該含有PEST的多肽為N端或截斷的ActA蛋白。於另一實施例中，該含有PEST的多肽為PEST胺基酸序列。

於一實施例中，該由四價表現載體所表現的異源抗原為HPV16 E6與E7，以及HPV18 E6與E7。

於一實施例中，本發明提供一種在人類個體中誘發抗腫瘤或抗癌免疫反應的方法，該方法包括對該個體投與一包括了一包括有重組核酸之重組李斯特菌菌株的組合物之步驟，該重組核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括融合至一異源抗原或其片段的LLO蛋白N端片段，其中該重組核酸更包括一編碼突變型prfA基因或代謝酶之第二開放讀碼框架，藉以針對腫瘤或癌症誘發免疫反應。於另一實施例中，該免疫反應降低了該個體接受化學治療或放射治療的需要。於另一實施例中，該免疫反應消除了該個體接受化學治療或放射治療的需要。於另一實施例中，該免疫反應藉由讓患者可用較低劑量的化學治療或放射治療治療來被治療而降低與對該個體施用化學治療或放射治療相關聯的副作用嚴重性。

於另一實施例中，本發明提供一種在人類個體中誘發抗腫瘤或抗癌免疫反應的方法，該方法包括對該個體投與一包括了一包括有重組核酸之重組李斯特菌菌株的組合物之步驟，該重組核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括融合至一異源抗原或其片段的LLO蛋白N端片段，其中該免疫反應降低了該個體接受化學治療或放射治療的需要，藉以針對腫瘤或癌症誘發免疫反應。於另一實施例中，該李斯特菌包括內源性dal/dat與actA基因的突變。

熟習此項技術者應瞭解到，本文中所提供之包括重組李斯特菌的組合物係可與其他治療方式(包含但不限於化學治療、放射治療及/或檢查點抑制劑結合施用。於另一實施例中，施與本文中所揭露的李斯特菌或本文中所揭露之基於李斯特菌的免疫治療係能夠降低具有腫瘤或癌症的患者接受化學治療或放射治療的需要。於另一實施例中，施與本文中所揭露的李斯特菌或本文中所揭露之基於李斯特菌的免疫治療係能夠消除具有腫瘤或癌症的患者接受化學治療或放射治療的需要。於另一實施例中，施與本文中所揭露的李斯特菌或本文中所揭露之基於李斯特菌的免疫治療係能夠在具有腫瘤或癌症的個體中降低與放射治療或化學治療相關聯的副作用嚴重性。

於一實施例中，本發明亦提供用以在人類個體中誘發對抗疾病的細胞毒性T細胞(CTL)反應，以及治療病症及與該疾病相關的症狀之方法，該等方法包括投與該重組李斯特菌菌株。

於一實施例中，本文中所揭露的是一種重組李斯特菌菌株，該重組李斯特菌菌株包括一重組核酸，該重組核酸包括一編碼重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括融合至一異源抗原或其片段的LLO蛋白N端片段，且其中該重組核酸進一步包括一編碼突變型prfA基因之第二開放讀碼框架。於一實施例中，該突變型prfA基因係為一種編碼從胺基酸D(其也稱為「Asp」、「天門冬胺酸鹽」或「天門冬胺酸」)到胺基酸V(其也稱為「Val」或「纈胺酸」)之胺基酸位置133處的點突變之基因。於一實施例中，本文中所揭露的重組李斯特菌菌株包括內源性prfA基因的突變或缺失。於另一實施例中，於本文中所揭露的李斯特菌中之prfA基因染色體突變或缺失係經由一包括編碼突變型prfA基因之核酸序列的質體而互補，該突變型prfA基因係編碼一包括D133V胺基酸取代之突變型PrfA蛋白。於另一實施例中，包括D133V胺基酸取代之突變型PrfA蛋白係與本文中所揭露的李斯特菌中的內源性prfA突變互補。

於另一實施例中，該重組李斯特菌為一種經減毒的李斯特菌。將可以理解的是，術語「減毒」及「經減毒的」係可涵蓋經修飾以減少對宿主的毒性之細菌、病毒、寄生菌、傳染性生物體、普里昂蛋白、腫瘤細胞、該傳染性生物體內的基因及其類似物。宿主可以是人類或動物，或者是器官、組織或細胞。列舉一非限定性實例，細菌可經減毒的以減少對宿主細胞的結合、減少自一宿主細胞向另一宿主細胞的傳播、減少細胞外生長或減少於宿主細胞內之細胞內生長。於一實施例中，減毒可藉由量測(例如)毒性指標(indicum或indicia)、LD₅₀、自器官清除的速率或競爭指數來評定(參見，例如Auerbuch等人，(2001)Infect.Immunity 69：5953-5957)。一般而言，減毒導致LD₅₀的增加及/或清除速率增加至少25%；更一般地至少50%；最一般地至少100%(2倍)；普遍地至少5倍；更普遍地至少10倍；最普遍地至少50倍；經常為至少100倍；更經常為至少500倍；且最經常為至少1000倍；通常至少5000倍；更通常至少10,000倍；且最通常至少50,000倍；且最經常至少100,000倍。於另一實施例中，減毒導致LD₅₀的增加及/或清除速率增加至少25%。於另一實施例中，減毒導致LD₅₀的增加及/或清除速率增加3-5倍。於另一實施例中，減毒導致LD₅₀的增加及/或清除速率增加5-10倍、11-20倍、21-30倍、31-40倍、41-50倍、51-100倍、101-500倍、501-1,000倍、1001-10,000倍或10,001-100,000倍。

熟習此項技術者將充分瞭解到，術語「經減毒的基因」可涵蓋介導了對宿主的毒性、病變或毒力、在宿主體內的生長或在宿主體內的存活之基因，其中該基因以減輕、降低或消除毒性、病變或毒力的方式突變。所述降低或消除可藉由將突變的基因所介導之毒力或毒性與未突變(或親代)基因所介導之毒力或毒性相比較來評定。「突變的基因」係涵蓋該基因的調節區域、該基因的編碼區域、該基因的非編碼區域或其任何組合中的缺失、點突變、反轉、截斷及讀框轉移突變。

於一實施例中，本文中所揭露的是一種用以在人類個體中針對腫瘤或癌症誘發免疫反應之方法，該方法包括對該個體投與一包括有重組核酸之重組李斯特菌菌株的步驟，該重組核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括一融合到一異源抗原或其片段的LLO蛋白N端片段，其中該重組核酸更包括一編碼一突變型PrfA蛋白之第二開放讀碼框架，藉以針對腫瘤或癌症誘發免疫反應。於一實施例中，本發明提供一種在人類個體中治療癌症的方法，該方法包括對該個體投與本文中所揭露的重組李斯特菌菌株的步驟。於另一實施例中，本發明提供一種保護人類個體預防子宮頸癌的方法，該方法包括對該個體投與本文中所揭露的重組李斯特菌菌株的步驟。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。於另一實施例中，該方法進一步包括以本發明的重組李斯特菌菌株增強人類個體的步驟。於另一實施例中，該方法更包括以一包括本文中所揭露的異源抗原或其片段之免疫原性組合物增強該人類個體的步驟。於另一實施例中，該方法更包括以一包括引導該個體的細胞表現該異源抗原之免疫原性組合物來增強該人類個體的步驟。於另一實施例中，該細胞為腫瘤細胞。於另一實施例中，該方法更包括以本發明的疫苗增強該人類個體的步驟。

於一實施例中，本文中所揭露之LLO蛋白及ActA蛋白的主體中的片段係指一包括有該LLO或ActA蛋白之至少5個相連胺基酸殘基之胺基酸序列的肽或多肽。於另一實施例中，該術語係指包括有LLO或ActA蛋白或多肽之至少10個相連胺基酸殘基、至少15個相連胺基酸殘基、至少20個相連胺基酸殘基、至少25個相連胺基酸殘基、至少40個相連胺基酸殘基、至少50個相連胺基酸殘基、至少60個相連胺基酸殘基、至少70個相連胺基酸殘基、至少80個相連胺基酸殘基、至少90個相連胺基酸殘基、至少100個相連胺基酸殘基、至少125個相連胺基酸殘基、至少150個相連胺基酸殘基、至少175個相連胺基酸殘基、至少200個相連胺基酸殘基、至少250個相連胺基酸殘基、至少300個相連胺基酸殘基、至少350個相連胺基酸殘基、至少400個相連胺基酸殘基或至少450個相連胺基酸殘基之胺基酸序列的肽或多肽。

於另一實施例中，該片段係為一種如本發明預期運作(例如，當呈現為N端LLO/異源抗原融合蛋白或N末端ActA/異源抗原融合蛋白的形式時，針對一與疾病相關聯的抗原引發免疫反應)的功能性片段。於另一實施例中，該片段在呈現為非融合形式時係有功能性的。於另一實施例中，該片段為一種免疫原性片段。

本發明於某些實施例中提供了與李斯特菌異源的核酸密碼子最佳化，或李斯特菌內源性的核酸密碼子最佳化。單核球增多性李斯特菌對於每一胺基酸所用的最佳密碼子係顯示於美國專利公開案第2007/0207170號中，其係以引用方式併入本文中。若核酸中的至少一密碼子係經以單核球增多性李斯特菌對於該胺基酸比在原本序列中的密碼子更為頻繁使用的密碼子替代，該核酸係經密碼子最佳化。

如本文中所揭露，表現LLO-抗原融合體的重組李斯特菌菌株係誘發抗腫瘤免疫性(實例1)，引發抗原特異性T細胞增殖(實例2)，產生抗原特異性及腫瘤浸潤性T細胞(實例3)。

於另一實施例中，本發明提供一種在人類個體中治療子宮頸癌之方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有LLO蛋白N端片段與HPV E7抗原之重組多肽，藉此該重組李斯特菌菌株針對E7抗原誘發免疫反應，藉以在人類個體中治療子宮頸癌。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

於一實施例中，本發明提供一種保護人類個體預防HPV相關癌症的方法。於另一實施例中，本發明提供一種保護人類個體預防子宮頸癌的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有LLO蛋白N端片段及至少一HPV抗原之重組多肽，藉此該重組李斯特菌菌株針對該HPV抗原誘發免疫反應，藉以保護人類個體預防子宮頸癌。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

於一實施例中，本發明提供一種針對HPV相關癌症誘發免疫反應的方法。於另一實施例中，本發明提供一種在人類個體中針對子宮頸癌誘發免疫反應的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有LLO蛋白N端片段及至少一HPV抗原之重組多肽，藉以在人類個體中針對子宮頸癌誘發免疫反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

於一實施例中，本發明提供一種治療HPV相關癌症的方法。於另一實施例中，本發明提供一種在人類個體中治療子宮頸癌的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有LLO蛋白N端片段及至少一HPV抗原之重組多肽，藉此該重組李斯特菌菌株針對該異源抗原誘發免疫反應，藉以在人類個體中治療子宮頸癌。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

於一實施例中，本發明提供一種保護人類個體預防HPV相關癌症的方法。於另一實施例中，本發明提供一種保護人類個體預防子宮頸癌的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有ActA蛋白N端片段及至少一HPV抗原之重組多肽，藉此該重組李斯特菌菌株針對該異源抗原誘發免疫反應，藉以保護人類個體預防子宮頸癌。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

於一實施例中，本發明提供一種針對HPV相關癌症誘發免疫反應的方法。於另一實施例中，本發明提供一種在人類個體中針對子宮頸癌誘發免疫反應的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有ActA蛋白N端片段及至少一異源抗原之重組多肽，藉以在人類個體中針對子宮頸癌誘發免疫反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。於一實施例中，本發明提供一種針對HPV相關癌症治療免疫反應的方法。於另一實施例中，本發明提供一種在人類個體中針對子宮頸癌誘發免疫反應的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有ActA蛋白N端片段及至少一異源抗原之重組多肽，藉以在人類個體中針對子宮頸癌治療免疫反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

於一實施例中，本發明提供一種保護人類個體預防HPV相關癌症的方法。於另一實施例中，本發明提供一種保護人類個體預防子宮頸癌的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有PEST序列及至少一HPV抗原之重組多肽，藉此該重組李斯特菌菌株針對該異源抗原誘發免疫反應，藉以保護人類個體預防子宮頸癌。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

於一實施例中，本發明提供一種針對HPV相關癌症誘發免疫反應的方法。於另一實施例中，本發明提供一種在人類個體中針對子宮頸癌誘發免疫反應的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有PEST序列及至少一異源抗原之重組多肽，藉以在人類個體中針對子宮頸癌誘發免疫反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。於一實施例中，本發明提供一種針對HPV相關癌症治療免疫反應的方法。於另一實施例中，本發明提供一種在人類個體中針對子宮頸癌誘發免疫反應的方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有PEST序列及至少一異源抗原之重組多肽，藉以在人類個體中針對子宮頸癌治療免疫反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

該N端LLO蛋白片段及至少一異源抗原於另一實施例中係直接彼此融合。於另一實施例中，編碼該N端LLO蛋白片段及至少一異源抗原的該等基因係直接彼此融合。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段及至少一異源抗原係通過一連接肽而附接。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段及至少一異源抗原係通過一異源肽而附接。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段為該至少一異源抗原的N端。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段為全部異源抗原的N端。於另一實施例中，該N端LLO蛋白片段為該融合蛋白的N端大部分。

該N端ActA蛋白片段及至少一異源抗原於另一實施例中係直接彼此融合。於另一實施例中，編碼該N端ActA蛋白片段及至少一異源抗原的該等基因係直接彼此融合。於另一實施例中，該N端ActA蛋白片段及至少一異源抗原係通過一連接肽而附接。於另一實施例中，該N端ActA蛋白片段及至少一異源抗原係通過一異源肽而附接。於另一實施例中，該N端ActA蛋白片段為該至少一異源抗原之N端。於另一實施例中，該N端ActA蛋白片段為全部異源抗原的N端。於另一實施例中，該N端ActA蛋白片段為該融合蛋白的N端大部分。

該PEST序列及至少一異源抗原於另一實施例中係直接彼此融合。於另一實施例中，編碼該PEST序列及至少一異源抗原的該等基因係直接彼此融合。於另一實施例中，該PEST序列及至少一異源抗原係通過一連接肽而附接。於另一實施例中，該PEST序列及至少一異源抗原係通過一異源肽而附接。於另一實施例中，該PEST序列為該至少一異源抗原的N端。於另一實施例中，該PEST序列為全部異源抗原的N端。於另一實施例中，該PEST序列為該融合蛋白的N端大部分。

於另一實施例中，本發明提供一種用以針對HPV疫苗接種人類個體的方法，該方法包括對該個體投與本發明所揭露的重組李斯特菌菌株之步驟，其中該李斯特菌表現HPV E7抗原且其中該李斯特菌表現突變型PrfA蛋白。於另一實施例中，該突變型prfA基因編碼PrfA蛋白中的D133V突變。於另一實施例中，該突變型prfA基因係在該重組李斯特菌中的質體中。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。

於一實施例中，二到四個異源抗原或其在本文中所揭露的功能性片段中之至少一者係由該李斯特菌中的染色體外質體所表現，而二到四個異源抗原或其在本文中所揭露的功能性片段中之至少一者係由該李斯特菌的基因體所表現。

於一實施例中，本文中所使用的術語「可操作地連接」係表示轉錄及轉譯調節核酸係以啟動轉錄的方式相對任何編碼序列定位。一般而言，這將表示啟動子及轉錄啟動或起始序列係位於編碼區域的5'端。於另一實施例中，本文中所使用的術語「可操作地連接」係表示七個開放讀碼框架係以形成單一連續讀碼框架的方式融合，導致一個結合了連續排列的原始蛋白質序列之蛋白的表現。

於一實施例中，「融合」係指藉由共價鍵而可操作連接。於一實施例中，該術語包含重組融合(核酸序列或其開放讀碼框架)。於另一實施例中，該術語包含化學結合。

於一實施例中，該包括了一編碼一包括有可操作地連接或融合至多個異源抗原或其片段的LLO蛋白N端片段的重組多肽之第一開放讀碼框架的重組核酸係進一步可操作地連接至一標籤序列。於一實施例中該標籤係設置在該第一開放讀碼框架的胺基端。於另一實施例中該標籤係設置在該第一開放讀碼框架的羧基端且可操作地連接至最後的異源抗原序列。於另一實施例中，各核酸構築體係包括至少一在該標籤序列後面的終止密碼子。於另一實施例中，各核酸構築體係包括二個在該標籤序列後面的終止密碼子。

於一實施例中該標籤序列係包括C端SIINFEKL及6個His胺基酸。於另一實施例中，該標籤序列為一種使融合多肽可容易偵測之胺基酸或核酸序列。於另一實施例中，該標籤序列為一種有利於確認本文中所揭露的融合多肽的分泌之胺基酸或核酸序列。熟習此項技術者應瞭解到，該等標籤的序列係可併入到質體或噬菌體載體上的融合肽序列中。這些標籤可被表現且所呈現出之抗原性抗原決定區係使臨床醫生可藉由依循對於這些「標籤」序列肽的免疫反應而跟蹤被分泌的肽的免疫原性。這類免疫反應可使用許多試劑來監測，包含(但不限於)對這些標籤具特異性的單株抗體及DNA或RNA探針。

於一實施例中，本文中所揭露的重組多肽係藉由本文中所揭露的重組李斯特菌所表現及分泌。於另一實施例中，本文中所揭露的抗原或多肽(融合體或嵌合物)的分泌係使用一特異性地結合到聚組胺酸(His)標籤之蛋白質、分子或抗體(或其片段)來偵測。於另一實施例中，本文中所揭露的融合多肽係藉由本文中所揭露的重組李斯特菌所表現及分泌。於另一實施例中，本文中所揭露的抗原或重組多肽的分泌係使用一結合到SIINFEKL-S-6xHIS標籤之抗體、蛋白質或分子來偵測。於另一實施例中，本文中所揭露的重組多肽係包括本領域中已知的任何其他標籤，包含(但不限於)幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、硫醇氧化還原蛋白(TRX)及聚(NANP)。

於另一實施例中，由該重組核酸的第一開放讀碼框架所編碼之四個可操作地連接的異源抗原係包括HPV16 E6與E7，以及HPV18 E6與E7。於另一實施例中，由本文中所揭露的第一開放讀碼框架所表現且由本文中所揭露的重組李斯特菌所分泌之重組多肽係包括下列結構：N-terminal LLO-HPV16 E7-HPV16 E6-HPV18 E7-HPV18 E6-SIINFEKL-S-6xHIS tag。於另一實施例中，本文中所揭露的重組多肽係包括SEQ ID NO：33。於另一實施例中，本文中所揭露的重組多肽係由SEQ ID NO：32所編碼。於另一實施例中，該四個可操作地連接的異源抗原係以任何其他順序排列。於另一實施例中，HPV E6序列(SEQ ID No：15與SEQ ID No：16)及HPV E7序列(SEQ ID No：13與SEQ ID No：14)係可操作地連接，藉以編碼四價異源抗原序列。於另一實施例中，該四價抗原序列係進一步於N端或C端處可操作地連接至截斷的LLO。於另一實施例中，該四價抗原序列係可操作地連接至截斷的LLO及一肽標籤序列。

於一實施例中，本文中所揭露的重組多肽從N端到C端係包括下列結構：抗原1-抗原2-抗原3-抗原4。於一實施例中，本文中所揭露的重組多肽從N端到C端係包括下列結構：N端LLO-抗原1-抗原2-抗原3-抗原 4。於一實施例中，本文中所揭露的重組多肽從N端到C端係包括下列結構：N端LLO-抗原1-抗原2-抗原3-抗原4-SIINFEKL-S-6xHIS標籤。於一實施例中，本文中所揭露的重組多肽從N端到C端係包括下列結構：N端LLO-HPV16 E7-HPV16 E6-HPV18 E7-HPV18 E6-SIINFEKL-S-6xHIS標籤。於一實施例中，本文中所揭露的重組多肽係由一包括SEQ ID NO：31的核酸序列所編碼。於一實施例中，該編碼四個可操作地連接至標籤序列之異源抗原序列的重組多肽係包括SEQ ID NO：31中陳述的序列。

於一實施例中，一編碼包括有四個於N端處可操作地連接至截斷的LLO及於C端處可操作地連接至肽標籤序列的異源抗原序列之重組多肽的核酸構築體係包括SEQ ID NO：32。

於另一實施例中，該核酸構築體係為SEQ ID NO：32的變異體。於另一實施例中，該核酸構築體係為SEQ ID NO：32的同源物。

於另一實施例中，由本文中所揭露的核酸構築體所編碼之重組多肽的核酸序列tLLO-HPV16E7-HPV16E6-HPV18E7-HPV16E6 SIINFEKL-S-6xHIS標籤係包括SEQ ID NO：33。

(SEQ ID NO：33)。於另一實施例中，該核酸構築體為SEQ ID NO：33的變異體。於另一實施例中，該核酸構築體為SEQ ID NO：33的類質同形體。於另一實施例中，該核酸構築體為SEQ ID NO：33的同源物。

於一實施例中，本文中所揭露的是一種表現二個、三個或四個異源抗原之二價、三價或四價重組李斯特菌菌株，所述異源抗原係融合至本文中所揭露之N端或截斷的或去毒性的李斯特菌溶解素O蛋白(LLO)、截斷的ActA蛋白、或PEST胺基酸序列。

於一實施例中，本文中所揭露的是一種表現三個異源抗原之三價或四價重組李斯特菌菌株，所述異源抗原係融合至本文中所揭露之N端或截斷的或去毒性的李斯特菌溶解素O蛋白、截斷的ActA蛋白、或PEST胺基酸序列。

於一實施例中，本文中所揭露的是一種表現四個異源抗原之四價重組李斯特菌菌株，所述異源抗原係融合至N端或截斷的或去毒性的李斯特菌溶解素O蛋白(LLO)。於另一實施例中，該含有PEST的多肽係為本文中所揭露的N端、截斷的ActA蛋白、或PEST胺基酸序列。於另一實施例中，該等異源抗原係單獨融合至LLO、截斷的ActA或PEST序列之N端或C端上的N端或截斷的LLO或截斷的ActA或PEST序列。於另一實施例中，本文中所揭露的該等異源抗原中之每一者係單獨融合至LLO、截斷的ActA或PEST序列之N端或C端上的N端或截斷的LLO或截斷的ActA或PEST序列。

於一實施例中，本文中所揭露的二價、三價或四價重組李斯特菌菌株係表現至少一來自於一染色體外質體或附加體中的開放讀碼框架之異源抗原。於另一實施例中，本文中所揭露的二價、三價或四價重組李斯特菌菌株係表現至少一來自於至少一染色體外質體或附加體之開放讀碼框架的異源抗原。於另一實施例中，本文中所揭露的二價重組李斯特菌菌株係表現兩種異源抗原，各異源抗原係來自於兩種染色體外質體或附加體的開放讀碼框架。於另一實施例中，本文中所揭露的三價重組李斯特菌菌株係表現三種異源抗原，各異源抗原係來自於三種染色體外質體或附加體的開放讀碼框架。於另一實施例中，本文中所揭露的四價重組李斯特菌菌株係表現四種異源抗原，各異源抗原係來自於四種染色體外質體或附加體的開放讀碼框架。

於另一實施例中，本文中所揭露的二價、三價或四價重組李斯特菌菌株係表現至少一來自於李斯特菌基因體中的開放讀碼框架之異源抗原。於另一實施例中，本文中所揭露的二價、三價或四價重組李斯特菌菌株係表現至少一來自於染色體外質體或附加體、以及來自於本文中所揭露的李斯特菌基因體二者的異源抗原。於另一實施例中，各異源抗原係表現在一具有N端或截斷的或去毒性的李斯特菌溶解素O蛋白(LLO)的融合蛋白之中。於另一實施例中，該含有PEST的多肽係為N端或截斷的ActA蛋白。於另一實施例中，該含有PEST的多肽係為本文中所揭露的PEST胺基酸序列。

於一實施例中，本發明所涵蓋的二價或多價重組李斯特菌包含美國第2011/0129499號專利公開案中及美國第2012/0135033號專利公開案中所描述者，該二專利公開案的全文係以引用方式併入本文中。

於另一實施例中，該個體係處於發生HPV所介導之癌症發生(例如子宮頸癌)風險中。於另一實施例中，該個體係呈HPV陽性。於另一實施例中，該個體係表現出子宮頸上皮內腫瘤。於另一實施例中，該個體係表現出鱗狀上皮內病變。於另一實施例中，該個體係表現出在子宮頸內的發育異常。

於一實施例中，該異源抗原係為本領域中已知且在本文中所揭露的任一種腫瘤相關抗原。於另一實施例中，該異源抗原係為自體免疫抗原。於另一實施例中，該異源抗原係為傳染性疾病抗原。於另一實施例中，該異源抗原係為HPV相關抗原。

做為本發明該等方法之靶標的HPV於另一實施例中為HPV 16。於另一實施例中，所述HPV為HPV-18。於另一實施例中，所述HPV係選自HPV-16及HPV-18。於另一實施例中，所述HPV為HPV-31。於另一實施例中，所述HPV為HPV-35。於另一實施例中，所述HPV為HPV-39。於另一實施例中，所述HPV為HPV-45。於另一實施例中，所述HPV為HPV-51。於另一實施例中，所述HPV為HPV-52。於另一實施例中，所述HPV為HPV-58。於另一實施例中，所述HPV為高風險型HPV。於另一實施例中，所述HPV為黏膜型HPV。

於另一實施例中，本發明提供一種針對異源抗原來疫苗接種人類個體之方法，該方法包括以靜脈注射方式對該人類個體投與一包括或表現該異源抗原之重組李斯特菌菌株的步驟，其中第一個肽係選自(a)LLO蛋白N端片段；(b)ActA蛋白或其N端片段；以及(c)含有PEST胺基酸序列的肽，藉以針對異源抗原來疫苗接種人類個體。

於另一實施例中，本發明提供一種針對異源抗原來疫苗接種人類個體之方法，該方法包括以靜脈注射方式對該人類個體投與一免疫原性組合物的步驟，該免疫原性組合物包括一由一第一個肽結合至該異源抗原所組成的融合體，其中所述第一個肽係選自(a)LLO蛋白N端片段；(b)ActA蛋白或其N端片段；以及(c)含有PEST胺基酸序列的肽，藉以針對異源抗原來疫苗接種人類個體。

於另一實施例中，本發明提供一種針對異源抗原來疫苗接種人類個體之方法，該方法包括以靜脈注射方式對該人類個體投與一包括有重組多肽之重組李斯特菌菌株的步驟，該重組多肽包括一融合至該異源抗源的第一個肽，其中所述第一個肽係選自(a)LLO蛋白N端片段；(b)ActA蛋白或其N端片段；以及(c)含有PEST胺基酸序列的肽，藉以針對異源抗原來疫苗接種人類個體。

於另一實施例中，本發明提供一種針對異源抗原在人類個體中誘發CTL反應的方法，該方法包括對該人類個體投與一包括或表現該異源抗原之重組李斯特菌菌株的步驟，藉以針對異源抗原在人類個體中誘發CTL反應。於另一實施例中，該投與步驟為靜脈注射。

如本文中所揭露的，表現LLO-抗原融合體的重組李斯特菌菌株係誘發抗腫瘤免疫性(實例1)，引發抗原特異性T細胞增殖(實例2)，產生抗原特異性及腫瘤浸潤性T細胞(實例3)。因此，本發明的疫苗係有效針對E7及E6誘發免疫反應。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中誘發癌症的消退之方法，該方法包括對該個體投與本文中所揭露的重組李斯特菌菌株之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中降低癌症的復發發生率之方法，該方法包括對該個體投與本文中所揭露的重組李斯特菌菌株之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中抑制腫瘤的形成之方法，該方法包括對該個體投與本文中所揭露的重組李斯特菌菌株之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中誘發癌症的緩解之方法，該方法包括對該個體投與本文中所揭露的重組李斯特菌菌株之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中阻礙腫瘤的生長之方法，該方法包括對該個體投與本文中所揭露的重組李斯特菌菌株之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中減小腫瘤的大小之方法，該方法包括對該個體投與本文中所揭露的重組李斯特菌菌株之步驟。

於一實施例中，所述疾病為傳染性疾病、自體免疫疾病、呼吸系統疾病、癌前期病狀或癌症。

熟習此項技術者將充分瞭解，術語「癌前期病狀」涵蓋非典型增生、腫瘤前節結；大再生節結(MRN)；低度發育不良節結(LG-DN)；高度發育不良節結(HG-DN)；膽上皮發育不良；變異肝細胞之變異區(FAH)；變異肝細胞之節結(NAH)；染色體不平衡；端粒酶之異常活化；端粒酶之催化次單元之再表現；諸如CD31、CD34及BNH9之內皮細胞標記的表現(參見，例如Terracciano及Tomillo(2003)Pathologica 95：71-82；Su及Bannasch(2003)Toxicol.Pathol.31：126-133；Rocken及Carl-McGrath(2001)Dig.Dis.19：269-278；Kotoula等人，(2002)Liver 22：57-69；Frachon等人，(2001)J.Hepatol.34：850-857；Shimonishi等人，(2000)J. Hepatobiliary Pancreat.Surg.7：542-550；Nakanuma等人，(2003)J.Hepatobiliary Pancreat.Surg.10：265-281)。用於診斷癌症及非典型增生之方法係已揭露(參見，例如，Riegler(1996)Semin.Gastrointest.Dis.7：74-87；Benvegnu等人，(1992)Liver 12：80-83；Giannini等人，(1987)Hepatogastroenterol.34：95-97；Anthony(1976)Cancer Res.36：2579-2583)。

於一實施例中，感染性疾病為由(但不限於)以下病原體中之任一者引起的感染性疾病：BCG/結核病、瘧疾、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、間日瘧原蟲、輪狀病毒、霍亂、白喉-破傷風、百日咳、流感嗜血桿菌、B型肝炎、人類乳突狀瘤病毒、季節性流感、大流行性A型流感(H1N1)、麻疹及風疹、流行性腮腺炎、腦膜炎雙球菌A+C、口服脊髓灰質炎疫苗(單價、二價及三價)、肺炎球菌、狂犬病、破傷風類毒素、黃熱病、炭疽桿菌(炭疽)、肉毒桿菌毒素(肉毒症)、鼠疫耶爾森氏菌(鼠疫)、重型天花(天花)及其他相關痘瘡病毒、野兔熱弗朗西斯氏菌(野免熱)、病毒性出血熱、沙粒病毒(LCM、胡寧病毒、馬秋波病毒、瓜納里托病毒、賴薩熱)、布尼亞病毒(漢坦病毒、裂谷熱)、黃病毒(登革熱)、絲狀病毒(埃博拉病毒、馬爾堡病毒)、類鼻疽伯克霍爾德菌、貝納特氏立克次體(Q熱)、布氏桿菌種(布氏桿菌症)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(鼻疽)、鸚鵡熱衣原體(鸚鵡熱)、菌麻毒素(來自蓖麻)、產氣莢膜梭菌之ε毒素、葡萄球菌腸毒素B、斑疹傷寒(普氏立克次氏體)、其他立克次氏體、食物及水媒病原體、細菌(致瀉性大腸桿菌、病原性弧菌、志賀菌種、沙門氏菌BCG、空腸彎曲桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌)、病毒(杯狀病毒、A型肝炎、西尼羅河病毒、拉克羅斯病毒、加利福尼亞腦炎、VEE、EEE、WEE、日本腦炎病毒、科薩努爾森林病毒、尼帕病毒、漢坦病毒、蜱傳出血熱病毒、切昆貢亞熱病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、蜱傳腦炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、疱疹單純型病毒(HSV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、人類乳突狀瘤病毒(HPV))、原蟲(小球隱孢子蟲、卡晏環孢子球蟲、腸蘭伯式鞭毛蟲、痢疾內阿米巴、弓形蟲)、真菌(小孢子蟲目)、黃熱病、結核病(包括耐藥性TB)、狂犬病、朊病毒、重度急性呼吸性症候群相關之冠狀病毒(SARS-CoV)、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌、細菌性陰道病、沙眼衣原體、細胞巨大病毒、性病性肉芽腫、杜氏嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌、蒼白密螺旋體、陰道毛滴蟲或在本文中未列出之本領域中已知之任何其他感染性疾病。

於另一實施例中，該傳染性疾病為家畜傳染性疾病。於另一實施例中，家畜疾病可傳染給人且稱作「人畜共通疾病」。於另一實施例中，此等疾病包含(但不限於)口蹄疫、西尼羅河病毒、狂犬病、犬小病毒、貓白血病毒、馬流感病毒、牛傳染性鼻氣管炎(IBR)、假性狂犬病、經典豬瘟(CSF)、由牛之牛疱疹病毒1型(BHV-1) 感染引起之IBR、以及豬的假性狂犬病(假性狂犬病)、弓蟲病、炭疽、水泡性口炎病毒、馬紅球菌、野免熱、鼠疫(鼠疫耶氏桿菌)、毛滴蟲。

於另一實施例中，本文中所揭露的疾病係為呼吸性或發炎性疾病。於另一實施例中，該呼吸性或發炎性疾病為慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)。於另一實施例中，該疾病為哮喘。

於一實施例中，活減毒李斯特菌菌株能夠在不共同投與其他治療劑(諸如抗發炎劑或支氣管擴張劑)之情況下減輕哮喘症狀。於另一實施例中，本文中所揭露的方法進一步包括對該個體共同投與該活減毒李斯特菌菌株及一或多種治療劑之步驟。於另一實施例中，所述治療劑為抗哮喘劑。於另一實施例中，所述藥劑為抗發炎劑、非類固醇抗發炎劑、抗生素、抗膽鹼激導性劑、支氣管擴張劑、皮質類固醇、短效β促效劑、長效β促效劑、組合吸入劑、抗組織胺劑或其組合。

於一實施例中，本文中所揭露的疾病為癌症或腫瘤。於一實施例中，所述腫瘤為癌性的。於另一實施例中，所述癌症為乳癌。於另一實施例中，所述癌症為子宮頸癌。於另一實施例中，所述癌症為含Her2之癌症。於另一實施例中，所述癌症為黑色素瘤。於另一實施例中，所述癌症為胰臟癌。於另一實施例中，所述癌症為卵巢癌。於另一實施例中，所述癌症為胃癌。於另一實施例中，所述癌症為胰臟之癌性病變。於另一實施例中，所述癌症為肺腺癌。於另一實施例中，其為多形性膠質母細胞瘤。於另一實施例中，所述癌症為結腸直腸腺癌。於另一實施例中，所述癌症為肺鱗腺癌。於另一實施例中，所述癌症為胃腺癌。於另一實施例中，所述癌症為卵巢表面上皮細胞癌(例如其良性、增生性或惡性變種)。於另一實施例中，所述癌症為口腔鱗狀細胞癌。於另一實施例中，所述癌症為非小細胞肺癌。於另一實施例中，所述癌症為子宮內膜癌。於另一實施例中，所述癌症為膀胱癌。於另一實施例中，所述癌症為頭頸癌。於另一實施例中，所述癌症為前列腺癌。於另一實施例中，所述癌症為口咽癌。於另一實施例中，所述癌症為肺癌。於另一實施例中，所述癌症為肛門癌。於另一實施例中，所述癌症為肺癌。於另一實施例中，所述癌症為陰道癌。於另一實施例中，癌症為結腸直腸癌。於另一實施例中，所述癌症為食道癌。本發明該等方法所做為標靶的子宮頸瘤於另一實施例中係為鱗狀細胞癌。於另一實施例中，所述子宮頸瘤為腺癌。於另一實施例中，所述子宮頸瘤為腺鱗癌。於另一實施例中，所述子宮頸瘤為小細胞癌。於另一實施例中，所述子宮頸瘤為在本領域中已知的任何其它類型子宮頸瘤。

於另一實施例中，本文中所揭露的組合物係有利於在個體中針對、預防或治療肛門細胞內腫瘤形成而誘發免疫反應。於另一實施例中，本文中所揭露的組合物係有利於在個體中針對、預防或治療陰道細胞內腫瘤形成而誘發免疫反應。

本發明該等方法所做為標靶的子宮頸瘤於另一實施例中係為鱗狀細胞癌。於另一實施例中，所述子宮頸瘤為腺癌。於另一實施例中，所述子宮頸瘤為腺鱗癌。於另一實施例中，所述子宮頸瘤為小細胞癌。於另一實施例中，所述子宮頸瘤為在本領域中已知的任何其它類型子宮頸瘤。

於一實施例中，抗原可以是外來的，即其對於宿主是異源的且在本文中被稱為「異源抗原」。於另一實施例中，所述抗原為自體抗原，其為一種存在於宿主內但宿主因免疫耐受性而未對其引發免疫反應之自體抗原。熟習此項技術者將瞭解，異源抗原以及自體抗原可涵蓋腫瘤抗原、腫瘤相關抗原、血管生成抗原或傳染性疾病抗原。此外，異源抗原可涵蓋傳染性疾病抗原。

於一實施例中，本文中所揭露的抗原為一種異源腫瘤抗原，其在本文中亦稱為「腫瘤抗原」、「抗原性多肽」或「外來抗原」。於另一實施例中，本文中所揭露的抗原為自體抗原。

熟習此項技術者應瞭解到，術語「異源」係涵蓋源自與參考物種不同之物種的核酸、胺基酸、肽、多肽或蛋白質。因此，例如，表現異源多肽之李斯特菌菌株於一實施例中會表現並非李斯特菌菌株原生或內源性的多肽，或於另一實施例中該李斯特菌菌株通常不表現的多肽，或於另一實施例中來自於除該李斯特菌菌株以外的來源之多肽。於另一實施例中，異源可用於描述某物源自於其相同物種中的不同生物體。於另一實施例中，該異源抗原係由李斯特菌的重組菌株所表現，且當藉由該重組菌株感染哺乳動物細胞時被處理且呈現為細胞毒性T細胞。於另一實施例中，由李斯特菌菌種所表現的異源抗原不需要精確地匹配腫瘤細胞或感染物中之相應未經修飾的抗原或蛋白質，只要其產生一個可識別該哺乳動物中天然表現之未經修飾的抗原或蛋白質的T細胞反應。術語「異源抗原」在本文中係可指「抗原性多肽」、「異源蛋白質」、「蛋白質抗原」、「抗原」等等。

於一實施例中，所述抗原為人類乳突狀瘤病毒-E7(HPV-E7)抗原，其於一實施例中係來自HPV16(於一實施例中，GenBank寄存編號AAD33253)，且於另一實施例中係來自HPV18(於一實施例中，GenBank寄存編號P06788)。於另一實施例中，所述抗原多肽為HPV-E6，其於一實施例中係來自HPV16(於一實施例中，GenBank寄存編號AAD33252、AAM51854、AAM51853或AAB67615)，且於另一實施例中係來自HPV18(於一實施例中，GenBank寄存編號P06463)。於另一實施例中，所述抗原多肽為Her/2-neu抗原。於另一實施例中，所述抗原多肽為前列腺特異性抗原(PSA)(於一實施例中，GenBank寄存編號CAD30844、CAD54617、AAA58802或NP_001639)。於另一實施例中，所述抗原多肽為角質層胰蛋白酶(SCCE)抗原(於一實施例中，GenBank寄存編號AAK69652、AAK69624、AAG33360、 AAF01139或AAC37551)。於另一實施例中，所述抗原多肽為腎母細胞瘤抗原1，其於另一實施例中為WT-1端粒酶(GenBank寄存編號P49952、P22561、NP_659032、CAC39220.2或EAW68222.1)。於另一實施例中，所述抗原多肽為hTERT或端粒酶(GenBank寄存編號NM003219(變異型1)、NM198255(變異型2)、NM 198253(變異型3)或NM 198254(變異型4))。於另一實施例中，所述抗原多肽為蛋白酶3(於一實施例中，GenBank寄存編號M29142、M75154、M96839、X55668、NM 00277、M96628或X56606)。於另一實施例中，所述抗原多肽為酪胺酸酶相關蛋白2(TRP2)(於一實施例中，GenBank寄存編號NP_001913、ABI73976、AAP33051或Q95119)。於另一實施例中，所述抗原多肽為高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)(於一實施例中，GenBank寄存編號NP_001888、AAI28111或AAQ62842)。於另一實施例中，所述抗原多肽為睪蛋白(於一實施例中，GenBank寄存編號AAF79020、AAF79019、AAG02255、AAK29360、AAD41588或NP_659206)。於另一實施例中，所述抗原多肽為NY-ESO-1抗原(於一實施例中，GenBank寄存編號CAA05908、P78358、AAB49693或NP_640343)。於另一實施例中，所述抗原多肽為PSCA(於一實施例中，GenBank寄存編號AAH65183、NP_005663、NP_082492、O43653或CAB97347)。於另一實施例中，所述抗原多肽為介白素(IL)13受體α(於一實施例中，GenBank寄存編號NP_000631、NP_001551、NP_032382、NP_598751、NP_001003075或NP_999506)。於另一實施例中，所述抗原多肽為碳酸酐酶IX(CAIX)(於一實施例中，GenBank寄存編號CAI13455、CAI10985、EAW58359、NP_001207、NP_647466或NP_001101426)。於另一實施例中，所述抗原多肽為癌胚抗原(CEA)(於一實施例中，GenBank寄存編號AAA66186、CAA79884、CAA66955、AAA51966、AAD15250或AAA51970)。於另一實施例中，所述抗原多肽為MAGE-A(於一實施例中，GenBank寄存編號NP_786885、NP_786884、NP_005352、NP_004979、NP_005358或NP_005353)。於另一實施例中，所述抗原多肽為細胞凋亡抑制蛋白(於一實施例中，GenBank寄存編號AAC51660、AAY15202、ABF60110、NP_001003019或NP_001082350)。於另一實施例中，所述抗原多肽為GP100(於一實施例中，GenBank寄存編號AAC60634、YP_655861或AAB31176)。於另一實施例中，所述抗原多肽為本領域中已知的任何其他抗原多肽。於另一實施例中，本發明該等組合物及方法中的抗原多肽係包括所述抗原多肽的免疫原性部分。

於另一實施例中，所述抗原為HPV-E6。於另一實施例中，所述抗原為端粒酶(TERT)。於另一實施例中，所述抗原為LMP-1。於另一實施例中，所述抗原為 p53。於另一實施例中，所述抗原為間皮素。於另一實施例中，所述抗原為EGFRVIII。於另一實施例中，所述抗原為碳酸酐酶IX.(CAIX)。於另一實施例中，所述抗原為PSMA。於另一實施例中，所述抗原為HMW-MAA。於另一實施例中，所述抗原為HIV-1 Gag。於另一實施例中，所述抗原為酪胺酸酶相關蛋白2。於另一實施例中，所述抗原係選自HPV-E7、HPV-E6、Her-2、HIV-1 Gag、LMP-1、p53、PSMA、癌胚抗原(CEA)、LMP-1、血管舒緩素相關肽酶3(KLK3)、KLK9、Muc、酪胺酸酶相關蛋白2、Muc1、FAP、IL-13R α2、PSA(前列腺特異性抗原)、gp-100、熱休克蛋白70(HSP-70)、β-HCG、EGFR-III、顆粒白血球群落刺激因子(G-CSF)、血管生成素、血管生成素-1、Del-1、纖維母細胞生長因子：酸性(aFGF)或鹼性(bFGF)、抑濾泡素、顆粒白血球群落刺激因子(G-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)/分散因子(SF)、介白素-8(IL-8)、瘦體素、中期因子(Midkine)、胎盤生長因子、血小板衍生的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、多效蛋白(PTN)、前顆粒蛋白(Progranulin)、增生蛋白(Proliferin)、轉型生長因子-α(TGF-α)、轉型生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)/血管滲透因子(VPF)、VEGFR、VEGFR2(KDR/FLK-1)或其片段、FLK-1或其抗原決定區、FLK-E1、FLK-E2、FLK-I1、內皮糖蛋白或其片段、神經菌毛蛋白1(NRP-1)、血管生成素1 (Ang1)、Tie2、血小板衍生生長因子(PDGF)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、轉型生長因子-β(TGF-β)、內皮糖蛋白、TGF-β受體、單核球趨化蛋白-1(MCP-1)、VE-鈣黏素(VE-cadherin)、CD31、蝶素(ephrin)、TGF-β受體、單核球趨化蛋白-1(MCP-1)、VE-cadherin、CD31、ephrin、ICAM-1、V-CAM-1、VAP-1、E-選滯蛋白、血纖維蛋白溶酶原活化因子、血纖維蛋白溶酶原活化抑制因子-1、一氧化氮合成酶(NOS)、COX-2、AC133，或Id1/Id3、血管生成素3、血管生成素4、血管生成素6、CD105、EDG、HHT1、ORW、ORW1或TGF-β輔受體，或其組合。於另一實施例中，所述抗原為嵌合Her2/neu抗原，如在美國第2011/0142791號專利申請公開案中所揭露，其全文係以引用方式併入本文中。本文中所揭露的抗原片段的使用係亦為本發明所涵蓋。

於另一實施例中，本文中所揭露的異源腫瘤抗原為腫瘤相關抗原，其於一實施例中為以下腫瘤抗原中之一者：MAGE(黑色素瘤相關抗原E)蛋白，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、酪胺酸酶；突變型ras蛋白；突變型p53蛋白；p97黑色素瘤抗原、與晚期癌症相關之ras肽或p53肽；與子宮頸癌相關之HPV 16/18抗原、與乳癌相關之KLH抗原、與結腸直腸癌相關之CEA(癌胚抗原)、與黑色素瘤相關之MART1抗原或與前列腺癌相關之PSA抗原。於另一實施例中，用於本文中所揭露的組合物及方法之抗原為黑色素瘤相關抗原，其於一實施例中為TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪胺酸酶、HSP-70、β-HCG或其組合。應瞭解，熟習此項技術者將能夠使用本文中未提及但在本領域中已知之任何異源抗原以用於本文所揭露的方法及組合物。亦應理解本發明提供(但不因此限於)一包括有一編碼本文中所揭露抗原中之至少一者的核酸之減毒李斯特菌。本發明涵蓋了編碼該等已揭示抗原之突變體、突變蛋白、剪接變異體、片段、截斷之變異體、可溶性變異體、細胞外結構域、細胞內結構域、成熟序列以及其類似物的核酸。本文中所揭露的是編碼該等抗原之抗原決定基、寡肽及多肽的核酸。本文也揭露了密碼子最優化之實施例，也就是說，最優化在李斯特菌中的表現。所引用之參考文獻、GenBank寄存編號及本文中所揭露的核酸、肽及多肽全部係以引用方式併入本文中。於另一實施例中，所選定的核酸序列係可編碼一全長基因或一截斷的基因、一融合基因或標記基因，並可為cDNA、基因體DNA或DNA片段(較佳為cDNA)。其係可經突變或依需要而以其他方式修飾。這些修飾包含密碼子最優化以在選定的宿主細胞或細菌(即李斯特菌)中最優化密碼子的使用。經選定的序列亦可編碼一分泌型、胞質型、細胞核型、細胞膜結合型或細胞表面型多肽。

於一實施例中，血管內皮生長因子(VEGF)為一個與血小管生成(胚胎循環系統的重新形成)及血管生成(來自原有血管結構的血管之生長)二者有關之重要信息傳導蛋白。於一實施例中，VEGF活性係主要限制於血管內皮細胞，僅管其確實在少數的其他類型細胞(例如，刺激單核白血球細胞/巨噬細胞的遷移)上具有效果。在體外，已顯示VEGF可刺激內皮細胞發生有絲分裂及細胞遷移。VEGF也增強了微血管滲透性且有時被稱為血管滲透因子。

於一實施例中，VEGF家族的所有成員係通過結合到細胞表面上的酪氨酸激酶受體(VEGFRs)來刺激細胞的反應，使其二聚化並通過磷酸轉移化而變成活性的。VEGF受體具有一由7個免疫球蛋白樣結構域組成的胞外部分、單個跨膜的橫跨區域以及一含有分裂酪氨酸激酶結構域的胞內部分。

於一實施例中，VEGF-A為VEGFR-2(KDR/Flk-1)配位體以及VEGFR-1(Flt-1)配位體。於一實施例中，VEGFR-2介導幾乎全部已知對VEGF的細胞反應。VEGFR-1功能尚未明確，儘管其被認為會調節VEGFR-2的信息傳導，其於一實施例中通過螯合VEGF而防止與VEGFR-2的結合，而於一實施例中係在胚胎內的血管生成期間特別重要。於一實施例中，VEGF-C及VEGF-D為VEGFR-3受體的配位體，其於一實施例中介導淋巴血管生成。

於一實施例中，本發明之組合物包括VEGF受體或其片段，而於一實施例中其為VEGFR-2，且於另一實施例中為VEGFR-1，並於另一實施例中為VEGFR- 3。

於一實施例中，血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)係在經活化的內皮細胞(ECs)上有高度表現並參與新血管的形成。於一實施例中，VEGFR2結合VEGF所有的5種同型異構物。於一實施例中，在ECs上通過VEGFR2的VEGF信息傳導係誘發了增殖、遷移及最終的分化。於一實施例中，VEGFR2的小鼠同源物為胎肝激酶基因-1(Flk-1)，其為一強力的治療靶標，且在腫瘤的生成、入侵及轉移中有重要的角色。於一實施例中，VEGFR2亦稱為激酶插入區域受體(一種第三型的受體酪胺酸激酶)(KDR)、分化群309(CD309)、FLK1、Ly73、Krd-1、VEGFR、VEGFR-2或6130401C07。

於其他實施例中，該抗原係源自真菌病原體、細菌、寄生蟲、蠕蟲或病毒。於其他實施例中，該抗原係選自破傷風類毒素、來自流感病毒的血凝素分子、白喉類毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰島素肽B、馬鈴薯粉狀瘡痂病菌抗原、弧菌抗原、沙門氏菌抗原、肺炎雙球菌抗原、呼吸道融合病毒抗原、流感嗜血桿菌外膜蛋白、幽門螺桿菌脲酶、腦膜炎雙球菌線毛蛋白、淋病雙球菌線毛蛋白、黑色素瘤相關抗原(TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GP-100、酪胺酸酶、MART-1、HSP-70、β-HCG)、來自HPV-16、-18、-31、-33、-35或-45型之人類乳突狀瘤病毒的人類乳突狀瘤病毒抗原E1及E2、腫瘤抗原CEA、Ras蛋白(經突變的或其他性質的)、 p53蛋白(經突變的或其他性質的)、Muc1或PSA。

於其他實施例中，所述抗原係與下列疾病中之一者有關：霍亂、白喉、嗜血桿菌屬、A型肝炎、B型肝炎、流行性感冒、麻疹、腦膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌性肺炎、脊髓灰質炎、狂犬病、風疹、破傷風、肺結核、傷寒、水痘-帶狀皰疹、百日咳及黃熱病、來自Addison氏病的免疫原及抗原、過敏、重度過敏、Bruton氏症候群、癌症，包括實體性及血源性的腫瘤、濕疹、橋本甲狀腺炎、多肌炎、皮肌炎、第1型糖尿病、後天性免疫缺失症候群、移植排斥(諸如腎臟、心臟、胰腺、肺、骨骼、及肝臟移植)、Grave氏病、多內分泌自體免疫疾病、肝炎、微觀多動脈炎、結節性多動脈炎、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、惡性貧血、腹部疾病、抗體介導的腎炎、腎小球腎炎、風濕性疾病、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、血清陰性脊柱關節病、鼻炎、Sjogren氏症候群、全身性硬化症、硬化性膽管炎、Wegener氏肉芽腫病、皰疹樣皮炎、牛皮癬、白癜風、多發性硬化、腦脊髓炎、Guillain-Barre二氏症候群、重症肌無力、Lambert-Eaton二氏症候群、鞏膜、鞏膜外層、眼色素層炎、慢性皮膚黏膜念珠菌病、蕁麻疹、嬰兒期暫時性低丙種球蛋白血症、骨髓瘤、X性聯遺傳過度IgM症候群、Wiskott-Aldrich二氏綜合症、運動失調性毛細血管擴張症、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少症、自體免疫白血球低下症、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、澱粉樣變性病、慢性淋巴細胞性白血病、非Hodgkin氏淋巴瘤、瘧疾環子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自體抗原及李斯特菌病。

於另一實施例中，HPV E6抗原在本發明之方法中係用來代替E7抗原或除了E7抗原外使用HPV E6抗原來針對子宮頸癌進行治療、預防或誘發免疫反應。

於另一實施例中，ActA蛋白片段在本發明之方法中係用來代替LLO片段或除了LLO片段外並使用ActA蛋白片段來針對子宮頸癌進行治療、預防或誘發免疫反應。

於另一實施例中，含PEST胺基酸序列的蛋白片段在本發明之方法中係用來代替LLO片段或除了LLO片段外並使用含PEST胺基酸序列的蛋白片段針對子宮頸癌進行治療、預防或誘發免疫反應。

於另一實施例中，本發明提供一種包括有本發明之重組李斯特菌的免疫性組合物。於另一實施例中，本發明之方法及組合物之免疫原性組合物係包括本發明之重組疫苗載體。於另一實施例中，該免疫原性組合物係包括本發明之質體。於另一實施例中，該免疫原性組合物係包括佐劑。於另一實施例中，本發明之載體係可做為部分的疫苗組合物來施用。

於另一實施例中，本發明之疫苗係與佐劑一起傳遞。於一實施例中，該佐劑係促成一主要由Th1介導的免疫反應。於另一實施例中，該佐劑係促成一Th1類型免疫反應。於另一實施例中，該佐劑係促成一由Th1介導的免疫反應。於另一實施例中，相比於抗體介導的反應該佐劑係促成一由細胞介導的免疫反應。於另一實施例中，該佐劑為本領域中已知的任何其他類型佐劑。於另一實施例中，該免疫原性組合物係誘發針對標靶蛋白之T細胞免疫反應的形成。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一人類個體中誘發一抗E7細胞毒性T細胞(CTL)反應之方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株的步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有LLO蛋白N端片段及HPV E7抗原之重組多肽，藉以在人類個體中誘發抗E7 CTL反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽的質體。於另一實施例中，該方法更包括以本發明之重組李斯特菌菌株增強該個體的步驟。於另一實施例中，該方法更包括以一包括E7抗原的免疫原性組合物增強該個體的步驟。於另一實施例中，該方法更包括以一引導該個體的細胞表現E7抗原之免疫原性組合物增強該個體的步驟。於另一實施例中，所述CTL反應能夠對HPV所介導的疾病、病症或症狀有治療功效。於另一實施例中，所述CTL反應能夠對HPV所介導的疾病、病症或症狀有預防效果。

於另一實施例中，本發明提供一種在個體中治療或改善HPV所介導的疾病、病症或症狀之方法，該方法包括對該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一包括有LLO蛋白N端片段及HPV E7抗原之重組多肽，藉此該重組李斯特菌菌株針對E7抗原誘發免疫反應，藉以在個體中治療或改善HPV所介導的疾病、病症或症狀。於另一實施例中，該個體為人類個體。於另一實施例中，該個體為非人類個體。於另一實施例中，該個體為本技術領域中已知的任何其他類型個體。

所述造成疾病、病症或症狀的HPV於另一實施例中為HPV 16。於另一實施例中，所述HPV為HPV-18。於另一實施例中，所述HPV為HPV-31。於另一實施例中，所述HPV為HPV-35。於另一實施例中，所述HPV為HPV-39。於另一實施例中，所述HPV為HPV-45。於另一實施例中，所述HPV為HPV-51。於另一實施例中，所述HPV為HPV-52。於另一實施例中，所述HPV為HPV-58。於另一實施例中，所述HPV為高風險型HPV。於另一實施例中，所述HPV為黏膜型HPV。

於另一實施例中，所述HPV所介導的疾病、病症或症狀為生殖器疣。於另一實施例中，所述HPV所介導的疾病、病症或症狀為非生殖器疣。於另一實施例中，所述HPV所介導的疾病、病症或症狀為呼吸道乳頭狀瘤。於另一實施例中，所述HPV所介導的疾病、病症或症狀為本領域中已知的任何其他HPV所介導的疾病、病症或症狀。

於另一實施例中，HPV E6抗原係用於代替本發明之方法中的E7抗原，或除了本發明之方法中的E7抗原外並使用HPV E6抗原來治療或改善HPV介導的疾病、病症或症狀。

於另一實施例中，ActA蛋白片段係用於代替本發明之方法中的LLO片段，或除了本發明之方法中的LLO片段外並使用ActA蛋白片段來治療或改善HPV介導的疾病、病症或症狀。

於另一實施例中，含PEST胺基酸序列的蛋白片段係用於代替本發明之方法中的LLO片段，或除了本發明之方法中的LLO片段外並使用含PEST胺基酸序列的蛋白片段來治療或改善HPV介導的疾病、病症或症狀。

本發明之該等方法及組合物之抗原於另一實施例中為HPV E7蛋白。於另一實施例中，所述抗原為HPV E6蛋白。於另一實施例中，所述抗原為本領域中已知的任何其他HPV蛋白。

「E7抗原」於另一實施例中係指E7蛋白。於另一實施例中，該術語係指E7片段。於另一實施例中，該術語係指E7肽。於另一實施例中，該術語係指本領域中已知的任何其他類型E7抗原。

本發明之該等方法及組合物的E7蛋白於另一實施例中為HPV 16 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7 蛋白為HPV-18 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為HPV-31 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為HPV-35 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為HPV-39 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為HPV-45 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為HPV-51 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為HPV-52 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為HPV-58 E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為高風險型HPV E7蛋白。於另一實施例中，所述E7蛋白為黏膜型HPV E7蛋白。

「E6抗原」於另一實施例中係指E6蛋白。於另一實施例中，該術語係指E6片段。於另一實施例中，該術語係指E6肽。於另一實施例中，該術語係指本領域中已知的任何其他類型E6抗原。

本發明之該等方法及組合物的E6蛋白於另一實施例中為HPV 16 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為HPV-18 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為HPV-31 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為HPV-35 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為HPV-39 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為HPV-45 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為HPV-51 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為HPV-52 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為HPV-58 E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為高風險型HPV E6蛋白。於另一實施例中，所述E6蛋白為黏膜型HPV E6蛋白。

本發明之該等方法及組合物所誘發的免疫反應於另一實施例中為T細胞反應。於另一實施例中，該免疫反應包括T細胞反應。於另一實施例中，所述反應為CD8⁺ T細胞反應。於另一實施例中，所述反應包括CD8⁺ T細胞反應。

於一實施例中，本發明之組合物誘發干擾素-γ的強先天性刺激，其於一實施例中係具有抗血管生成特性。於一實施例中，本發明之李斯特菌誘發干擾素-γ的強先天性刺激，其於一實施例中係具有抗血管生成特性(Dominiecki等人，Cancer Immunol Immunother.2005年五月；54(5)：477-88.Epub 2004年10月6日，其以全文引用的方式併入本文中；Beatty and Paterson,J Immunol.2001年2月15日；166(4)：2276-82，其以全文引用的方式併入本文中)。於另一實施例中，本發明的方法提高了產生干擾素-γ的細胞的含量。於另一實施例中，李斯特菌的抗血管生成特性係由CD4⁺ T細胞介導(Beatty及Paterson,2001)。於另一實施例中，李斯特菌的抗血管生成特性係由CD8⁺ T細胞介導。於另一實施例中，李斯特菌疫苗接種引起的IFN-γ分泌係由NK細胞、NKT細胞、Th1 CD4⁺ T細胞、TC1 CD8⁺ T細胞或其組合所介導。

於另一實施例中，本發明之組合物係誘發一或多種抗血管生成蛋白或因子的產生。於一實施例中，所述抗血管生成蛋白為IFN-γ。於另一實施例中，所述抗血管生成蛋白為色素上皮細胞源因子(PEDF)；血管生長抑素；內皮生長抑素；類fms酪胺酸激酶(sFlt)-1；或可溶性內皮因子(sEng)。於一實施例中，本發明之李斯特菌係涉及抗血管生成因子的釋放，且因而於一實施例中除了其做為將抗原引入一個體的載體角色之外，其具有治療性作用。各種李斯特菌菌株及其類型代表本發明的各別實施例。

於另一實施例中，由本發明之方法及組合物所誘發的免疫反應為抑制標靶腫瘤細胞中的程式性細胞死亡受體-1配體1(PD-L1)表現。於另一實施例中，所述免疫反應包括在腫瘤內之表現程式性細胞死亡受體-1(PD-1)的免疫細胞的數量增加。於另一實施例中，所述免疫反應包括PD-1表現數量相對於PD-L1表現數量的比例增加。於另一實施例中，所述免疫反應包括抑制腫瘤的PD-L1所介導免疫抑制作用。

於另一實施例中，本發明之組合物的施用係誘發穩健的全身性抗原特異性免疫力。於另一實施例中，本發明之組合物的施用係誘發抗原決定區的擴散。於另一實施例中，本發明之組合物的施用係誘發對於自衍生腫瘤抗原之包含廣泛的反應。於另一實施例中，本發明之方法及組合物所誘發的免疫反應係包括改善腫瘤微環境(TME)中之抑制免疫細胞及作用免疫細胞的整體平衡。於另一實施例中，本發明之方法及組合物所誘發的免疫反應係包括改善抑制免疫細胞與作用免疫細胞的系統平衡。

於一實施例中，如本文中所揭露的組合物及其使用方法係產生能夠浸潤腫瘤、破壞腫瘤細胞並根除疾病的效應T細胞。於另一實施例中，本發明之使用方法提高T效應細胞之腫瘤浸潤。於另一實施例中，T效應細胞包括CD8⁺ T細胞。於另一實施例中，T效應細胞包括CD4⁺ T細胞。

於一實施例中，腫瘤浸潤淋巴球(TILs)於若干腫瘤(諸如結腸瘤、卵巢瘤及黑色素瘤)中係與較佳的預後有關。在結腸癌中，沒有微轉移徵象的腫瘤係具有免疫細胞浸潤及Th1表現圖譜的增加，且其與患者的存活率改善相關。再者，T細胞對腫瘤的浸潤係與在臨床前試驗及人體試驗二者中之免疫治療方法的成功相關。於一實施例中，淋巴細胞浸潤到腫瘤內的位置係取決於腫瘤脈管系統的內皮細胞中之黏附分子的向上調控，其通常是受到促發炎細胞激素(諸如IFN-γ、TNF-α及IL-1)的調控。若干黏附分子係涉及淋巴細胞浸潤到腫瘤內的過程之中，包含細胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管內皮細胞黏附分子1(V-CAM-1)、血管黏附蛋白1(VAP-1)及E-選擇蛋白。然而，這些細胞黏附分子於腫瘤脈管系統中一般係向下調控。因此，於一實施例中，如本文中所揭露的癌症疫苗係增加了TILs，向上調控黏附分子(於一實施例中為ICAM-1、V-CAM-1、VAP-1、E-選擇蛋白或其組合)，向上調控促發炎細胞激素(於一實施例中為IFN-γ、TNF-α、IL-1或其組合)，或其組合。

本發明之該等方法及組合物的N端LLO蛋白片段於另一實施例中係包括SEQ ID No：2。於另一實施例中，該片段包括LLO信息肽。於另一實施例中，該片段包括SEQ ID No：2。於另一實施例中，該片段近乎由SEQ ID No：2組成。於另一實施例中，該片段基本上係由SEQ ID No：2組成。於另一實施例中，該片段係對應SEQ ID No：2。於另一實施例中，該片段係與SEQ ID No：2同源。於另一實施例中，該片段係與SEQ ID No：2的一片段同源。使用於一些實例中之△LLO的長度為416個胺基酸(不包括信息序列)，而自胺基端之包含含有胱胺酸484的活化結構域在內的88個殘基係經截斷。本領域技術人員將明白，任何不具有該活化結構域(特別是不具有胱胺酸484)的△LLO係適用於本發明之該等方法及組合物中。於另一實施例中，E7或E6抗原與任何包含PEST胺基酸AA序列SEQ ID NO：1的△LLO之融合體增強了該抗原之細胞介導的抗腫瘤免疫性。

以構築本發明該等疫苗之LLO蛋白於另一實施例中係具有以下序列：(GenBank寄存編號P13128；SEQ ID NO：3；核酸序列係陳述於GenBank寄存編號X15127中)。對應於此序列的前蛋白的前25個胺基酸為信息序列且在其被細菌分泌時自LLO裂解。因此，於此實施例中，全長活性LLO蛋白長度為504個殘基。於另一實施例中，上述LLO片段係做為併入本發明之疫苗中的LLO片段來源使用。

於另一實施例中，使用於本發明該等組合物及方法之LLO蛋白N端片段係具有以下序列：(SEQ ID NO：2)。

於另一實施例中，所述LLO片段係對應於本文中所用之LLO蛋白的約第20-442個胺基酸。

於另一實施例中，所述LLO片段具有以下序列：(SEQ ID NO：4)。

於另一實施例中，「截短的LLO」或「△LLO」係指包括PEST胺基酸結構域之LLO片段。於另一實施例中，該等術語係指一包括PEST序列的LLO片段。

於另一實施例中，該等術語係指在羧基端不含活化結構域且並不包含胱胺酸484之LLO片段。於另一實施例中，該等術語係指一非為溶血性的LLO片段。於另一實施例中，該LLO片段係通過該活化結構域的缺失或突變而變為非溶血性。於另一實施例中，該LLO片段係通過胱胺酸484的缺失或突變而變為非溶血性。於另一實施例中，該LLO片段係通過另一位置的缺失或突變而變為非溶血性。

於另一實施例中，所述LLO片段係由該LLO蛋白的約前441個胺基酸組成。於另一實施例中，該LLO片段係由LLO的約前420個胺基酸組成。於另一實施例中，LLO片段為LLO蛋白之非溶血性形式。

於另一實施例中，所述LLO片段係包含一對應上述該等胺基酸範圍中之一者的同源LLO蛋白的殘基。殘基數量於一實施例中並不需要完全與上面列舉的殘基數量相符合；例如，若該同源LLO蛋白相對於本文中所用LLO蛋白係具有插入或缺失，那麼殘基數量係可相應地調整。

於另一實施例中，所述LLO片段係為本領域中已知的任何其他LLO片段。

於另一實施例中，所述重組李斯特菌菌株係以1×10⁹-3.31×10¹⁰CFU之劑量投與至人類個體。於另一實施例中，所述劑量為5-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為7-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為10-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為20-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為30-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為50-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為70-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為100-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為150-500×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為5-300×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為5-200×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為5-150×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為5-100×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為5-70×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為5-50×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為5-30×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為5-20×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為1- 30×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為1-20×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為2-30×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為1-10×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為2-10×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為3-10×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為2-7×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為2-5×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為3-5×10⁹CFU。於另一實施例中，所述重組李斯特菌菌株係以自約1×10⁶CFU至約3.31×10¹⁰CFU之劑量投與至人類個體。於另一實施例中，所述劑量為自約1×10⁶CFU至約1×10¹⁰CFU。於另一實施例中，所述劑量為自約1×10⁶CFU至約1×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為自約1×10⁶CFU至約1×10⁷CFU。於另一實施例中，所述劑量為自約1×10⁶CFU至約1×10⁸CFU。於另一實施例中，所述劑量為自約1×10⁷CFU至約1×10⁹CFU。於另一實施例中，所述劑量為自約1×10⁸CFU至約1×10⁹CFU。

於另一實施例中，所述劑量為1×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為1.5×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為2×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為3×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為4×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為5×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為6×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為7×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為8×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為10×10⁹個有機體。於另一實施例中，所述劑量為1.5×10¹⁰個有機體。於另一實施例中，所述劑量為2×10¹⁰個有機體。於另一實施例中，所述劑量為2.5×10¹⁰個有機體。於另一實施例中，所述劑量為3×10¹⁰個有機體。於另一實施例中，所述劑量為3.3×10¹⁰個有機體。於另一實施例中，所述劑量為4×10¹⁰個有機體。於另一實施例中，所述劑量為5×10¹⁰個有機體。

於另一實施例中，本發明該等方法的重組多肽係由重組李斯特菌菌株所表現。於另一實施例中，其表現係經由該重組李斯特菌菌株攜載的核苷酸分子所介導。

於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係藉由一編碼該重組多肽之質體而表現該重組多肽。於另一實施例中，所述質體包括編碼細菌轉錄因子之基因。於另一實施例中，所述質體係編碼一李斯特菌轉錄因子。於另一實施例中，所述轉錄因子為PrfA。於另一實施例中，所述PrfA為突變型PrfA。於另一實施例中，所述PrfA含有D133V胺基酸突變。於另一實施例中，所述轉錄因子為本領域中已知的任何其他轉錄因子。

於另一實施例中，該質體包括一編碼代謝酶的基因。於另一實施例中，所述代謝酶為細菌代謝酶。於另一實施例中，所述代謝酶為李斯特菌代謝酶。於另一實施例中，所述代謝酶為胺基酸代謝酶。於另一實施例中，所述胺基酸代謝基因係涉及細胞壁合成路徑。於另一實施例中，所述代謝酶為D-胺基酸胺基轉移酶基因(dat)的產物。於另一實施例中，所述代謝酶為丙胺酸消旋酶基因(dal)的產物。於另一實施例中，所述代謝酶為本領域中已知的任何其他代謝酶。

於另一實施例中，本發明之方法進一步包括以本發明的重組李斯特菌菌株增強人類個體的步驟。於另一實施例中，該使用於增強接種中的重組李斯特菌菌株係與使用在初始的「促發」接種中之菌株相同。於另一實施例中，所述增強菌株係與促發菌株不同。於另一實施例中，其係於該促發及增強接種中使用相同的劑量。於另一實施例中，其係於增強中使用較大的劑量。於另一實施例中，其係於增強中使用較小的劑量。

於另一實施例中，本發明之方法進一步包括以一包括該E7抗原的免疫原性組合物對該人類個體進行接種之步驟。於另一實施例中，所述免疫原性組合物包括重組E7蛋白或其片段。於另一實施例中，所述免疫原性組合物包括一表現重組E7蛋白或其片段之核苷酸分子。於另一實施例中，其係於接種李斯特菌之後施與非李斯特菌的接種。於另一實施例中，其係於接種李斯特菌之前施與非李斯特菌的接種。

「增強」係指於另一實施例中對一個體施與額外的疫苗劑量。於本發明之方法之另一實施例中，係施與兩次(或總共接種三次)增強。於另一實施例中，係施與三次增強。於另一實施例中，係施與四次增強。於另一實施例中，係施與五次增強。於另一實施例中，係施與六次增強。於另一實施例中，係施與超過六次增強。

本發明該等方法及組合物的重組李斯特菌菌株於另一實施例中係為重組單核球增多性李斯特菌菌株。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株係為重組斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)菌株。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株係為重組格氏李斯特菌(Listeria grayi)菌株。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株係為重組伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株係為重組穆氏李斯特菌(Listeria murrayi)菌株。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株係為重組魏氏李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株係為本領域中已知的任何其他李斯特菌菌種的重組菌株。

本發明提供了一些李斯特菌菌種及菌株，用以製造或基因工程化本發明的減毒李斯特菌。於一實施例中，所述李斯特菌菌株為野生型單核球增多性李斯特菌10403S(見Bishop及Hinrichs，(1987)J.Immunol.139：2005-2009；Lauer等人，(2002)J.Bact.184：4177-4186)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為(經噬菌體處置)單核球增多性李斯特菌DP-L4056(見Lauer等人，(2002)J.Bact.184：4177-4186)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4027，其係經噬菌體處置並缺失hly基因(見Lauer等人，(2002)J.Bact.184：4177-4186；Jones及Portnoy，(1994)Infect. Immunity 65：5608-5613)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4029，其係經噬菌體處置，並缺失ActA基因(見Lauer等人，(2002)J.Bact.184：4177-4186；Skoble等人，(2000)J.Cell Biol.150：527-538)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4042(△PEST)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4097(LLO-S44A)見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4364(△lplA；硫辛酸蛋白連接酶)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4405(△inlA)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4406(△inlB)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌CS-L0001(△ActA-△inlB)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多 性李斯特菌CS-L0002(△ActA-△lplA)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌CS-L0003(L461T-△lplA)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4038(△ActA-LLO L461T)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4384(S44A-LLO L461T)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌。其硫辛酸蛋白突變(見O'Riordan等人，(2003)Science 302：462-464)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DP-L4017(10403S hly(L461T)，在溶血素基因中具有一個點突變)(見2003年7月24日申請之美國臨時專利申請案第60/490,089號)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌EGD(見GenBank寄存編號AL591824)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌EGD-e(見GenBank寄存編號NC_003210；寄存編號BAA-679)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為缺失uvrAB之單核球增多性李斯特菌DP-L4029(見2004年 2月2日申請之美國第60/541,515號臨時專利申請案、2003年7月24日申請之美國第60/490,080號臨時專利申請案)於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌ActA-/inlB-雙重突變體(見ATCC寄存編號PTA-5562)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌lplA突變體或hly突變體(見Portnoy等人提出之美國第20040013690號專利申請案)。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌DAL/DAT雙重突變體。(見Frankel及Portnoy提出之美國第20050048081號專利申請案)。本發明涵蓋了包括有上述李斯特菌菌株之試劑及方法，且其包括有(例如)經質體及/或經基因體整合的修飾之菌株，以含有一編碼以下基因中之一者或其任意組合之核酸：hly(LLO；李斯特菌溶素)、iap(p60)、inlA、inlB、inlC、dal(丙胺酸消旋酶)、dat(D-胺基酸轉胺酶)、plcA、plcB、actA；或含有任何介導生長、傳播、單壁微脂粒的分解、雙壁微脂粒的分解、結合至宿主細胞、被宿主細胞吸收之核酸。本發明並不受限於以上所揭露的特定菌珠。

於另一實施例中，本發明之重組李斯特菌菌株係已通過一動物宿主繼代。於另一實施例中，所述繼代使菌株做為疫苗載體之功效最大化。於另一實施例中，所述繼代穩定了李斯特菌菌株之免疫原性穩定。於另一實施例中，所述繼代穩定了李斯特菌菌株的毒力。於另一實施例中，所述繼代增加了李斯特菌菌株的免疫原性。於另一實施例中，所述繼代增加了李斯特菌菌株的毒力。於另一實施例中；所述繼代移除了李斯特菌菌株的不穩定子菌株。於另一實施例中，所述繼代減少了李斯特菌菌株之不穩定子菌株的流行率。於另一實施例中，所述李斯特菌菌株含有一編碼該含有抗原的重組肽之基因的基因體插入。於另一實施例中，李斯特菌菌株係攜載一包括有編碼該含有抗原的重組肽之基因的質體。於另一實施例中，所述繼代係以本文中所述方式(例如，在實例12中)進行。於另一實施例中，所述繼代係以本領域中已知的任何其他方法來進行。

於另一實施例中，使用在本發明該等方法中的重組李斯特菌菌株係已儲存在一冷凍細胞庫。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係已儲存在一冷凍乾燥細胞庫中。

於另一實施例中，本發明該等方法及組合物之細胞庫係為一個種源細胞庫。於另一實施例中，所述細胞庫為一個工作細胞庫。於另一實施例中，所述細胞庫為優良製造規範(GMP)細胞庫。於另一實施例中，所述細胞庫係意欲用於臨床等級材料的生產。於另一實施例中，所述細胞庫係符合供人類使用管制措施的規定。於另一實施例中，所述細胞庫為本領域中已知的任何其他類型資料庫。

「優良製造規範」於另一實施例中係由美國聯邦法規(21 CFR 210-211)所定義。於另一實施例中，「優良製造規範」係由其他用於臨床等級材料的生產或用於人體消耗的標準所定義，例如除美國外之國家的標準。

於另一實施例中，使用於本發明該等方法中的重組李斯特菌菌株係來自一批次的疫苗劑量。

於另一實施例中，使用於本發明該等方法中的重組李斯特菌菌株係來自於美國專利案第8,114,414號中所揭露方法所生產之冷凍或冷凍乾燥儲備料，其係以引用方式併入本文中。

於另一實施例中，本發明的肽為一種融合肽。於另一實施例中，「融合蛋白」係指一包括有二或多個藉由肽鍵或其他化學鍵而連接一起的蛋白質之肽或多肽。於另一實施例中，該等蛋白質係直接藉由一個肽或他化學鍵而連接一起。於另一實施例中，該等蛋白質係以一或多個位於所述二或多個蛋白質之間的胺基酸(例如一間隔體)而連接一起。

於另一實施例中，本發明之疫苗進一步包括一佐劑。本發明之方法及組合物中所用之佐劑於另一實施例中為顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白。於另一實施例中，所述佐劑包括GM-CSF蛋白。於另一實施例中，所述佐劑為編碼GM-CSF的核苷酸分子。於另一實施例中，所述佐劑包括一編碼GM-CSF的核苷酸分子。於另一實施例中，所述佐劑為皂素QS21。於另一實施例中，所述佐劑包括皂素QS21。於另一實施例中，所述佐劑為單磷醯基脂質A。於另一實施例中，所述佐劑包括單磷醯基脂質A。於另一實施例中，所述佐劑為SBAS2。於另一實施例中，所述佐劑包括SBAS2。於另一實施例中，所述佐劑為含有未甲基化CpG的寡核苷酸。於另一實施例中，所述佐劑包括一含有未甲基化CpG的寡核苷酸。於另一實施例中，所述佐劑為免疫刺激性細胞激素。於另一實施例中，所述佐劑包括免疫刺激性細胞激素。於另一實施例中，所述佐劑為編碼免疫刺激性細胞激素之核苷酸分子。於另一實施例中，所述佐劑包括編碼免疫刺激性細胞激素之核苷酸分子。於另一實施例中，所述佐劑係為羽莖糖苷或其包括羽莖糖苷。於另一實施例中，所述佐劑係為細菌有絲分裂原或其包括細菌有絲分裂原。於另一實施例中，所述佐劑係為細菌毒素或其包括細菌毒素。於另一實施例中，所述佐劑係為本領域中已知的任何其他佐劑或其包括本領域中已知的任何其他佐劑。

於另一實施例中，本發明之核苷酸係可操作地連接至一驅動李斯特菌菌株中之經編碼的肽的表現之啟動子/調節序列。有利於驅動基因的構成表現之啟動子/調節序列係在本領域中所熟知且包含(但不限於)，例如，李斯特菌的P_hlyA、P_ActA及P60啟動子、鏈球菌bac啟動子、鏈黴菌sgiA啟動子及蘇雲金芽孢桿菌phaZ啟動子。於另一實施例中，編碼本發明的肽的核酸之誘發型及組織特異性表現係藉由在一誘發型或組織特異性啟動子/調節序列的控制下置放編碼該肽的核酸來實現。有利於其目的之組織特異性或誘發型啟動子/調節序列實例包含(但不限於)MMTV LTR誘發型啟動子，以及SV40晚期強化子/啟動子。於另一實施例中，其使用一響應於誘發劑(諸如金屬、醣皮質素等)而誘發之啟動子。因此，應理解本發明包含了任何已知或未知的啟動子/調節序列之使用，且能夠驅動該可操作地與其連接之期望蛋白質的表現。

本發明之方法及組合物中所用之ActA蛋白的N端片段於另一實施例中係具有SEQ ID NO：5中陳述的序列：於另一實施例中，所述ActA片段包括SEQ ID NO：5中陳述之序列。於另一實施例中，所述ActA片段為本領域中已知之任何其他ActA片段。

於另一實施例中，編碼ActA蛋白之片段的重組核苷酸係包括SEQ ID NO：6中陳述的序列：於另一實施例中，所述重組核苷酸具有SEQ ID NO：6中陳述之序列。於另一實施例中，所述重組核苷酸包括編碼ActA蛋白片段之任何其他序列。

於本發明該等方法及組合物的另一實施例中，PEST胺基酸AA序列係融合至E7或E6抗原。如本文中所揭露的，表現PEST胺基酸序列-抗原融合體的重組李斯特菌菌株係誘發抗腫瘤免疫性(實例3)，並產生抗原特異性及腫瘤浸潤性T細胞(實例4)。再者，包括有抗原及含PEST胺基酸AA序列KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO：1)的LLO之融合蛋白展現了增強的細胞介導免疫性。

因此，抗原融合至其他LM PEST胺基酸序列及源自其他原核生物體之PEST胺基酸AA序列亦將增強該抗原的免疫原性。所述PEST胺基酸AA序列於另一實施例中係具有一選自SEQ ID NO：7-12的序列。於另一實施例中，所述PEST胺基酸序列係為一來自LM ActA蛋白之PEST胺基酸序列。於另一實施例中，所述PEST胺基酸序列為KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO：7)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO：8)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO：9)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO：10)。於另一實施例中，所述PEST胺基酸序列係來自鏈球菌屬之鏈球菌溶血素O蛋白。於另一實施例中，所述PEST胺基酸序列係來自化膿鏈球菌的鏈球菌溶血素O，例如在胺基酸35-51處之KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：11)。於另一實施例中，所述PEST胺基酸序列係來自類馬鏈球菌的鏈球菌溶血素O，例如在胺基酸38-54處之KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：12)。於另一實施例中，所述PEST胺基酸序列為源自一原核生物體的另一個PEST胺基酸AA序列。於另一實施例中，所述PEST胺基酸序列為本領域中已知的任何其他PEST胺基酸序列。

其他原核生物體之PEST胺基酸序列係可根據諸如由(例如)Rechsteiner及Rogers(1996,Trends Biochem.Sci.21：267-271)針對LM描述之方法鑑別。或者，來自其他原核生物體之PEST胺基酸AA序列亦可基於此方法鑑別。其他預期具有PEST胺基酸AA序列之原核生物體包含(但不限於)其他的李斯特菌種。於另一實施例中，該PEST胺基酸序列係嵌入該抗原蛋白內。因此，於另一實施例中，「融合體」係指一包括該抗原以及該連接於該抗原的一端或嵌入該抗原內的PEST胺基酸胺基酸序列二者之抗原蛋白。

於另一實施例中，PEST胺基酸序列係使用本領域中已知的任何其他方法或演算法鑑別，例如CaSPredictor(Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE.Bioinformatics.2005年6月；21冊，增刊1：i169-76)。於另一實施例中，係使用下列方法：EST指數係藉由將值1分配給胺基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln來針對每一30-35個胺基酸的序列段計算。PEST殘基中之每一者的係數值(CV)為1且其他胺基酸(非PEST)中之每一者的係數值為0。

於另一實施例中，本發明之LLO蛋白、ActA蛋白或其片段不需完全為本文中所陳述該等序列中所陳述者，而可做出保有融合至本文中其他處所陳述抗原的LLO或ActA蛋白的功能特性之其他變更、修飾或改變。於另一實施例中，本發明利用了LLO蛋白、ActA蛋白或其片段之類似物。類似物於另一實施例中與自然發生的蛋白質或肽不同之處在於保守的胺基酸序列差異或不影響序列的修飾，或其二者。

於另一實施例中，完整的E7蛋白或其片段係融合至LLO蛋白、ActA蛋白或含有PEST胺基酸序列的肽，以產生本發明方法的重組肽。於另一實施例中，所使用的E7蛋白(完整的或做為該等片段的來源)係具有序列MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID No：13)。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：13之同源物。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：13之變異體。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：13之異構體。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：13之片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：13之同源物片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：13之變異體片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：13之異構體片段。

於另一實施例中，E7蛋白的序列為：(SEQ ID No：14)。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：14之同源物。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：14之變異體。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：14之異構體。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：14之片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：14之同源物片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：14之變異體片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為SEQ ID No：14之異構體片段。

於另一實施例中，所述E7蛋白具有下列GenBank登錄號中之一者所陳述之序列：M24215、NC_004500、V01116、X62843或M14119。於另一實施例中，所述E7蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的同源物。於另一實施例中，所述E7蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的變異體。於另一實施例中，所述E7蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的異構體。於另一實施例中，所述E7蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的同源物片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的變異體片段。於另一實施例中，所述E7蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的異構體片段。

於另一實施例中，完整的E6蛋白或其片段係融合至LLO蛋白、ActA蛋白或含有PEST胺基酸序列的肽，以產生本發明方法的重組肽。於另一實施例中，所使用的E6蛋白(完整的或做為該等片段的來源)係具有序列 (SEQ ID No：15)。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：15之同源物。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：15之變異體。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：15之異構體。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：15之片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：15之同源物片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：15之變異體片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：15之異構體片段。

於另一實施例中，E6蛋白的序列為：(SEQ ID No：16)。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：16之同源物。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：16之變異體。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：16之異構體。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：16之片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：16之同源物片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：16之變異體片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為SEQ ID No：16之異構體片段。

於另一實施例中，所述E6蛋白具有下列GenBank登錄號中之一者所陳述之序列：M24215、M14119、NC_004500、V01116、X62843或M14119。於另一實施例中，所述E6蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的同源物。於另一實施例中，所述E6蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的變異體。於另一實施例中，所述E6蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的異構體。於另一實施例中，所述E6蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的同源物片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的變異體片段。於另一實施例中，所述E6蛋白為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的異構體片段。

於另一實施例中，「同源性」係指與LLO序列(例如SEQ ID NO：2-4中之一者)之一致性大於70%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於64%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於68%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於72%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於75%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於78%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於80%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於82%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於83%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO： 2-4中之一者之一致性大於85%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於87%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於88%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於90%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於92%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於93%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於95%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於96%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於97%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於98%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於99%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性為100%。

於另一實施例中，「同源性」係指與E7序列(例如SEQ ID NO：13-14中之一者)之一致性大於70%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於62%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於64%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於68%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於72%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於75%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於78%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於80%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於82%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於83%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於85%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於87%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於88%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於90%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於92%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於93%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於95%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於96%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於97%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於98%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於99%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性為100%。

於另一實施例中，「同源性」係指與E6序列(例如SEQ ID NO：15-16中之一者)之一致性大於70%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於64%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於68%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於72%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於75%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於78%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於80%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於82%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於83%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於85%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於87%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於88%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於90%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於92%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於93%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於95%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於96%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於97%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於98%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於99%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性為100%。

於另一實施例中，「同源性」係指與PEST胺基酸序列(例如SEQ ID NO：1及7-12中之一者)或與ActA序列(例如SEQ ID NO：5-6中之一者)之一致性大於70%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於60%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於64%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於68%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於 72%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於75%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於78%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於80%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於82%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於83%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於85%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於87%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於88%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於90%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於92%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NQ：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於93%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於 95%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於96%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於97%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於98%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於99%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性為100%。

於一實施例中，本文中所列之任何胺基酸序列之蛋白質及/或肽同源性係藉由本領域中已充分描述的方法而進行測定，所述方法包含免疫墨點分析，或經由電腦演算法分析胺基酸序列，利用一些可獲得的軟體套件中之任一者而經由已建立的方法來測定。這些套件中的一些係包含FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps套件，且於其他實施例中採用史密斯(Smith)及沃特曼(Waterman)演算法，及/或整體/局部或BLOCKS比對以用於分析。

於另一實施例中，本發明之LLO蛋白、ActA蛋白或其片段係藉由化學結合作用而附接於該抗原。於另一實施例中，戊二醛係用於該結合作用。於另一實施例中，該結合作用係使用本領域中已知的任何適宜方法來進行。

於另一實施例中，本發明之融合蛋白係藉由任何適宜方法來製備，包含(例如)藉由下述方法選殖並限制性分解合適宜序列或直接化學合成。於另一實施例中，可選殖子序列且可使用合適的限制酶切剪合適的子序列。該等片段於另一實施例中接著被接合以產生期望的DNA序列。於另一實施例中，編碼該融合蛋白的DNA係使用DNA擴增法產生，例如聚合酶鏈反應(PCR)。首先，分別擴增天然DNA任一側新末端上之區段。經擴增序列之5'端編碼該肽連接子，同時另一經擴增序列之3'端亦編碼該肽連接子。由於第一片段之5'端與第二片段之3'端互補，該二片段(例如在LMP瓊脂糖上部分純化後)係可做為一個第三PCR反應中之重疊模板。經擴增序列將含有密碼子、開放位點之羧基側上的區段(現正形成胺基序列)、連接子及開放位點之胺基側上的序列(現正形成羧基序列)。接著將插入子接合至質體內。

於另一實施例中，LLO蛋白、ActA蛋白(或其片段)以及該抗原(或其片段)係通過本領域技術人員已知的手段而接合。於另一實施例中，該抗原或其片段係直接或通過一連接子(間隔體)而接合該ActA蛋白或LLO蛋白。於另一實施例中，該嵌合分子係以一單鏈融合蛋白質形式重組表現。

於另一實施例中，本發明的融合肽係使用標準的化學肽合成技術而合成。於另一實施例中，該嵌合分子係合成為一單鏈相連多肽。於另一實施例中，LLO蛋白、ActA蛋白(或其片段)，以及該抗原(或其片段) 係單獨合成，並接著藉由一分子之胺基末端與另一分子之羧基末端的縮合而融合，藉以形成一肽鍵。於另一實施例中，該ActA蛋白或LLO蛋白以及抗原係各自以一肽間隔體分子的一端而縮合，藉以形成一相連的融合蛋白。

於另一實施例中，本發明之肽及蛋白質係通過固相肽合成(SPPS)而製備，如Stewart等人於Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，1984,Pierce Chemical Company,Rockford,I11.中所述；或如Bodanszky及Bodanszky(The Practice of Peptide Synthesis,1984,Springer-Verlag,New York)所述。於另一實施例中，經適當保護的胺基酸殘基經由其羧基黏附至一經衍生化且不溶的聚合載體上，如交叉鏈結之聚苯乙烯或聚醯胺樹脂。「經適當保護的」係指在胺基酸之α-胺基及任何側鏈官能基二者上存在有保護基。側鏈保護基通常對溶劑、試劑及合成中所用的反應條件係穩定的，且在不影響最終肽產物之條件下是可移去的。寡肽的逐步合成係藉由從初始胺基酸移除N-保護基而進行，並與所期望的肽的序列中之下一個胺基酸的羧基末端結合。此胺基酸也經過適當的保護。納入之胺基酸之羧基可予以活化，以藉由形成為一反應性基團(諸如形成為碳化二亞胺、對稱酸酐或諸如羥基苯並三唑或五氟苯基酯之「活性酯」基)而可與所支撐結合的胺基酸之N-末端反應。

於另一實施例中，本發明提供了一包括本發明疫苗、施用器以及描述本發明該等方法的使用的教學材料之試劑組。儘管典型的試劑組係在下文中描述，鑒於本發明揭示內容其他有用試劑組的內容物對於熟習此項技術者而言將變得顯而易見。這些試劑組中之每一者代表本發明的一獨立實施例。

如本文中所使用的術語「約」係表示在數量上加上或減去5%，或於另一實施例中加上或減去10%，或於另一實施例中加上或減去15%，或於另一實施例中加上或減去20%。

術語「個體」於一實施例中係指一包含人類之哺乳動物，其需要治療病況或其後遺症或易罹患該病況或其後遺症。該個體可包含狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠、寵物鼠及人類)。該個體亦可包含牲畜。於一實施例中，術語「個體」並不排除在各方面健康、且沒有或未顯示出疾病或病症的徵狀之個體。

具體的實施例包含：

1.一種免疫原性組合物，其包括一包括有一重組核酸之重組李斯特菌菌株，所述核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括一可操作地連接或融合到至少一異源抗原或其片段之LLO蛋白N端片段，其中所述重組核酸進一步包括一編碼一代謝酶之第二開放讀碼框架。

2.如實施例1之免疫原性組合物，其中該LLO蛋白N端片段包括SEQ ID NO：2。

3.如實施例1至2之免疫原性組合物，其中該重組 李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌菌株。

4.如實施例1至3之免疫原性組合物，其中該重組多肽係由該重組李斯特菌菌株表現。

5.如實施例1至4之免疫原性組合物，其中該核酸係位於該重組李斯特菌菌株的染色體外質體中。

6.如實施例1至5之免疫原性組合物，其中該質體係穩定維持在所述重組李斯特菌菌株中。

7.如實施例1至6之免疫原性組合物，其中該李斯特菌菌株係包括基因體dal、dat及actA基因的突變、缺失或不活化。

8.如實施例1至7之免疫原性組合物，其中該代謝酶係與所述突變、缺失或不活化互補。

9.如實施例1至8之免疫原性組合物，其中該第一開放讀碼框架係編碼二至四個可操作地串聯連接的異源抗原或功能性片段，其中最N端的異源抗原或其片段係於N端處可操作地連接或融合至N端LLO蛋白片段。

10.如實施例1至9之免疫原性組合物，其中該第一開放讀碼框架係編碼一包括有四個可操作地串聯連接的異源抗原或功能性片段之重組多肽，其中該等可操作地連接的異源抗原係於最N端的異源抗原之N端處融合至N端LLO蛋白。

11.如實施例10之免疫原性組合物，其中由該第一開放讀碼框架編碼的重組多肽的結構包括N端LLO-抗原1-抗原2-抗原3-抗原4。

12.如實施例10至11中任一項之免疫原性組合物，其中所述二至四個異源抗原或所述四個異源抗原係選自由HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18 E6、HPV18 E7抗原所組成之群。

13.如實施例10至12中任一項之免疫原性組合物，其中該抗原1為HPV16 E6，抗原2為HPV16 E7，抗原3為HPV18 E6，且抗原4為HPV18 E7。

14.如實施例10至13中任一項之免疫原性組合物，其中該第一開放讀碼框架進一步編碼一可操作地連接至最後一個異源抗原之C端處的蛋白標籤序列。

15.如實施例14之免疫原性組合物，其中該蛋白標籤序列為SIINFEKL-6xHIS序列。

16.如實施例14至15中任一項之免疫原性組合物，其中該第一開放讀碼框架包括SEQ ID NO：32。

17.如實施例14至15中任一項之免疫原性組合物，其中該第一開放讀碼框架係編碼一包括有SEQ ID NO：33的蛋白。

18.如實施例1至17中任一項之免疫原性組合物，其中該重組李斯特菌菌株係已通過一動物宿主繼代。

19.如實施例1至18中任一項之免疫原性組合物，其進一步包括一佐劑。

20.如實施例19之免疫原性組合物，其中該佐劑係選自包括有GM-CSF蛋白、皂素QS21、單磷醯基脂質A、SBAS2、未甲基化CpG之寡核苷酸、免疫刺激性細胞激素、羽莖糖苷、細菌毒素及細菌有絲分裂原之清單。

21.如實施例1至20中任一項之免疫原性組合物，其中該重組李斯特菌菌株係已儲存在一冷凍或冷凍乾燥細胞庫中。

22.一種在個體中治療腫瘤或癌症的方法，該方法包括對該個體投與如實施例1至21之免疫原性組合物的步驟。

23.一種保護人類個體預防腫瘤或癌症的方法，其包括對該個體投與如實施例1至21之組合物的步驟。

24.一種在人類個體中誘發抗腫瘤細胞毒性T細胞反應的方法，其包括對該個體投與一包括有如實施例1至21之重組李斯特菌菌株的組合物之步驟。

以下實例係為了更充分說明本發明之較佳實施例而呈現。然而，其不應以任何方式被解釋為限制本發明範圍的廣度。

實驗細節部分 實例1：LLO-抗原融合體誘發抗腫瘤免疫性 材料及實驗方法(實例1-2) 細胞株

C57BL/6同系基因TC-1腫瘤係以HPV-16 E6及E7永生化並以c-Ha-ras致癌基因轉型。T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore, MD)所揭露的TC-1為一種表現低含量的HPV-16 E6及E7並經以c-Ha-ras致癌基因轉型之高度致瘤性肺上皮細胞。TC-1在37℃、10% CO₂下生長於含有10% FCS、2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、50微莫耳(mcM)2-ME、400微克(mcg)/毫升G418及10%國家標準菌種保存中心109培養液的RPMI 1640中。C3為來自經HPV 16之完整基因體永生化且經pEJ-ras轉型之C57BL/6小鼠的小鼠胚胎細胞。EL-4/E7為經E7以反轉錄病毒方式轉導之胸腺瘤EL-4。

單核球增多性李斯特菌菌株及增殖

所用李斯特菌菌株為Lm-LLO-E7(游離型表現系統中之hly-E7融合基因；圖1A)、Lm-E7(整合於李斯特菌基因體中之單複本E7基因卡匣)、Lm-LLO-NP(「DP-L2028」；游離型表現系統中之hly-NP融合基因)及Lm-Gag(「ZY-18」；整合於染色體中之單複本HIV-1 Gag基因卡匣)。E7係藉由PCR使用引子5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID No：17；XhoI位點加下劃線)及5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID No：18；SpeI位點加下劃線)擴增且接合至pCR2.1(Invitrogen,San Diego,CA)。E7藉由XhoI/SpeI分解而由pCR2.1切除並接合至pGG-55。將hly-E7融合基因及多潛能轉錄因子PrfA選殖至pAM401(一種多複本穿梭質體(Wirth R等人，J Bacteriol,165：831,1986))中，產生pGG-55。hly啟動子驅動hly基因產物的前441個胺基酸的表現(其缺乏溶血性C端，下文稱為「△LLO」)，且利用XhoI位點連接至E7基因，產生以LLO-E7形式轉錄及分泌之hly-E7融合基因。李斯特菌之prfA陰性菌株XFL-7(由Dr.Hao Shen,University of Pennsylvania所揭露)經以pGG-55轉型，針對在活體內質體之保留進行選擇(圖1A-B)。hly啟動子及基因片段係使用引子5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQ ID No：19；NheI位點加下劃線)及5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQ ID No：20；XhoI位點加下劃線)產生。prfA基因係使用引子5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAAATCCGTTT-3'(SEQ ID No：27；XbaI位點加下劃線)及5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SEQ ID No：21；SalI位點加下劃線)進行PCR擴增。Lm-E7藉由將含有驅動E7表現及分泌之hly啟動子及信息序列的表現卡匣引入LM基因體之orfZ結構域中而產生。E7藉由PCR使用引子5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(SEQ ID No：22；BamHI位點加下劃線)及5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(SEQ ID No：23；XbaI位點加下劃線)進行擴增。E7接著接合至pZY-21穿梭載體中。LM菌株10403S經所得質體pZY-21-E7轉型，該質體包含插入對應於LM基因體之orfX、Y、Z結構域之 1.6-kb序列中間的表現卡匣。同源性結構域允許E7基因卡匣藉由同源重組插入orfZ結構域。篩選E7基因卡匣整合至orfZ結構域中之殖株。細菌生長於具有(Lm-LLO-E7及Lm-LLO-NP)或不具有(Lm-E7及ZY-18)氯黴素(20μg/ml)之腦心浸液培養基中。細菌以等分試樣形式冷凍在-80℃下。其表現係利用西方墨點法驗證(圖2)。

西方墨點法

李斯特菌菌株在37℃下生長於Luria-Bertoni培養基中，且在相同的600nm量測光密度下收集。上清液經TCA沈澱且再懸浮於補充有0.1N NaOH之1倍樣本緩衝液中。將相同量之各細胞沈澱物或各經TCA沈澱之上清液裝載於4-20% Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝膠(NOVEX,San Diego,CA)上。將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯上，且用抗E7單株抗體(mAb)(Zymed Laboratories,South San Francisco,CA)進行探針探查，接著與HRP接合之抗小鼠二級抗體(Amersham Pharmacia Biotech,Little Chalfont,U.K.)一起培養，用Amersham ECL偵測試劑顯影，並曝光於Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)上。

腫瘤生長之量測

腫瘤每隔一天用測徑規跨越最短及最長表面直徑量測。這兩個量測值之平均值係以平均腫瘤直徑(以毫米為單位)對各時間點之形式作圖。小鼠在腫瘤直徑達至20mm時犧牲。僅顯示存活小鼠之各時間點之腫瘤量測值。

李斯特菌重組體對已建立的腫瘤生長之效用

6至8週大的C57BL/6小鼠(Charles River)在左側腹皮下接受2×10⁵個TC-1細胞。腫瘤接種後一週，腫瘤直徑已達至4-5mm之可觸知的大小。八隻一組的小鼠接著在第7天及第14天以0.1 LD₅₀ Lm-LLO-E7(10⁷個CFU)、Lm-E7(10⁶個CFU)、Lm-LLO-NP(10⁷個CFU)或Lm-Gag(5×10⁵個CFU)腹膜內處理。

⁵¹ Cr釋放測定

C57BL/6小鼠(6-8週大)係以0.1 LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜內免疫接種。免疫接種十天後，採集脾臟。脾細胞與做為餵養細胞之經輻射照射的TC-1細胞(100：1，脾細胞：TC-1)係建立成培養細胞；在活體外刺激5天，接著用於標準⁵¹Cr釋放分析，使用以下靶標：EL-4、EL-4/E7或以E7 H-2b肽(RAHYNIVTF)脈衝處理之EL-4。E：T細胞比率(以三重複進行)為80：1、40：1、20：1、10：1、5：1及2.5：1。在37℃下培育4小時後，細胞係經沈澱成粒，且自各孔移除50μl上清液。以Wallac 1450閃爍計數器(Gaithersburg,MD)分析樣本。特異性溶解百分比係以[(實驗性每分鐘計數(cpm)-自發性cpm)/(總cpm-自發性 cpm)]×100形式測定。

TC-1特異性增殖

C57BL/6小鼠係以0.1 LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag免疫接種且藉由20天後以1 LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜內注射來加強。加強後六天，自經免疫接種小鼠及未處理小鼠採集脾臟。在每孔具有2.5×10⁴、1.25×10⁴、6×10³或3×10³個經輻射照射的TC-1細胞做為E7 Ag來源之情況下，或在無TC-1細胞情況下或在10μg/ml Con A情況下，脾細胞係在平底96孔盤中以每孔5×10⁵個細胞建立培養細胞。細胞於45小時後每孔係以0.5μCi[³H]胸苷/孔脈衝處理。孔盤於18小時後係使用Tomtec收集器96(Orange,CT)收集，且以Wallac 1450閃爍計數器評估增殖。cpm之變化係計算為實驗性cpm-無Ag cpm。

流動細胞計數分析

C57BL/6小鼠係以0.1 LD₅₀ Lm-LLO-E7或Lm-E7靜脈內(i.v)免疫接種且30天後增強。針對CD8(53-6.7，經PE接合)、CD62配位體(CD62L；MEL-14，經APC接合)及E7 H-2Db四聚體之三色流動細胞分析係使用具有CellQuest®軟體之FACSCalibur®流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA)進行。增強5天後收集之脾細胞在室溫下用加載有E7肽(RAHYNIVTF)或對照(HIV-Gag)肽之H-2Db四聚體染色。四聚體以1/200稀釋度使用且由Dr.Larry R.Pease(Mayo Clinic,Rochester,MN)及由NIAID Tetramer Core Facility及NIH AIDS研究及參考試劑計劃所揭露。分析四聚體⁺、CD8⁺、CD62L^低細胞。

B16F0-Ova實驗

24隻C57BL/6小鼠係以5×10⁵個B16F0-Ova細胞接種。在第3天、第10天及第17天，八隻一組的小鼠係以0.1 LD₅₀ Lm-OVA(10⁶個cfu)、Lm-LLO-OVA(10⁸個cfu)免疫接種，且八隻動物保持未經處理。

統計

針對腫瘤直徑的比較，測定各組之腫瘤大小之平均值及SD，且利用史都登氏t試驗法(Student's t test)確定統計顯著性。p0.05視為顯著。

結果

比較Lm-E7及Lm-LLO-E7影響TC-1生長之能力。皮下腫瘤建立在C57BL/6小鼠之左側腹。七天後，腫瘤已達至可觸知的大小(4-5mm)。小鼠在第7天及第14天用0.1 LD₅₀ Lm-E7、Lm-LLO-E7或做為對照的Lm-Gag及Lm-LLO-NP進行疫苗接種。Lm-LLO-E7誘發75%所建立之TC-1腫瘤之完全消退，同時該組中的另2隻小鼠中之腫瘤生長得到控制(圖3)。相形之下，用Lm-E7及Lm-Gag免疫接種並不誘發腫瘤消退。此實驗多次重複，結果總是極其相似。另外，在不同免疫接種實驗方案下針對Lm-LLO-E7獲得相似結果。於另一實驗中，單次免疫接種能夠治癒小鼠之所建立之5mm TC-1腫瘤。

在其他實驗中，可在其他兩種表現E7之腫瘤細胞株的情況中獲得相似的結果：C3及EL-4/E7。為了證實用Lm-LLO-E7疫苗接種之功效，分別在第60天或第40天用TC-1或EL-4/E7腫瘤細胞再攻擊腫瘤已消除之動物。用Lm-LLO-E7免疫接種之動物保持無腫瘤直至實驗結束(在TC-1情況下為第124天而對於EL-4/E7為第54天)。

因此，抗原以帶有△LLO之融合蛋白形式表現係增強了抗原之免疫原性。

實例2：LM-LLO-E7處理引發TC-1特異性脾細胞增殖

為了量測Lm-E7與Lm-LLO-E7對T細胞的誘發，在經免疫接種之小鼠中量測TC-1特異性增殖反應(一種抗原特異性免疫活性的測量)。來自經Lm-LLO-E7免疫接種之小鼠之脾細胞在暴露於做為E7來源之經輻射照射TC-1細胞時，在20：1、40：1、80：1及160：1之脾細胞：TC-1比率下增殖(圖4)。相反地，來自經Lm-E7及rLm對照免疫接種之小鼠之脾細胞僅展示出背景程度之增殖。

實例3：E7與LLO、ActA或PEST序列之融合體增強E7特異性免疫且產生腫瘤浸潤性E7特異性CD8 ⁺ 細胞

將包括有100mcl(微升)含2×10⁵個TC-1腫瘤細胞之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)加400mcl的MATRIGEL®之500mcl MATRIGEL®(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.)皮下植入12隻C57BL/6小鼠之左側腹(n=3)。小鼠在第7天、第14天及第21天腹膜內免疫接種，且在第28天收集脾臟及腫瘤。腫瘤MATRIGEL自小鼠中移除且在4℃下在含有2毫升(ml)RP 10培養液之試管中在冰上培育隔夜。用鑷子切碎腫瘤，切成2mm塊狀物，且在37℃下與3ml酶混合物(0.2mg/ml膠原酶-P、1mg/ml DNAse-1於PBS中)一起培育1小時。組織懸浮液經由耐綸篩過濾且用含5%胎牛血清+0.05% NaN₃之PBS洗滌以用於四聚體及IFN-γ染色。

將脾細胞及腫瘤細胞以10⁷個細胞/毫升在布雷菲德菌素A(brefeldin A)存在下與1微莫耳(mcm)E7肽一起培育5小時。細胞經洗滌兩次且在4℃下在50mcl抗小鼠Fc受體上清液(2.4 G2)中培育1小時或隔夜。細胞針對表面分子CD8及CD62L染色、透化、使用透化試劑組Golgi-stop®或Golgi-Plug®(Pharmingen,San Diego,Calif.)固定，且針對IFN-γ染色。使用雙雷射流式細胞儀FACSCalibur獲得了500,000個事件並使用Cellquest軟體(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)分析。計算經活化 (CD62L^低)CD8⁺ T細胞內分泌IFN-γ之細胞之百分比。

針對四聚體染色，H-2D^b四聚體裝載有藻紅素(PE)接合之E7肽(RAHYNIVTF，SEQ ID NO：24)，在室溫下染色1小時，且在4℃下用抗別藻藍蛋白(APC)接合之MEL-14(CD62L)及FITC接合之CD8+染色30分鐘。分析細胞，比較脾臟及腫瘤中四聚體⁺ CD8⁺ CD62L^低細胞。

結果

為了分析Lm-ActA-E7增強抗原特異性免疫之能力，小鼠用TC-1腫瘤細胞植入且用Lm-LLO-E7(1×10⁷個CFU)、Lm-E7(1×10⁶個CFU)或Lm-ActA-E7(2×10⁸個CFU)免疫接種，或未經處理的(未處理小鼠)。來自Lm-LLO-E7及Lm-ActA-E7組之小鼠的腫瘤與Lm-E7或未處理小鼠中相比含有較高百分比之分泌IFN-γ之CD8⁺ T細胞(圖5A)及四聚體特異性CD8⁺細胞(圖5B)。

於另一實驗中，腫瘤負載小鼠經投與Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7或Lm-E7epi，且量測腫瘤內E7特異性淋巴細胞之含量。腫瘤之小鼠投與Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7或Lm-E7epi，且量測腫瘤內E7特異性淋巴細胞之含量。小鼠在第7天及第14天用0.1 LD₅₀之4種疫苗處理。腫瘤在第21天收集且用CD62L、CD8之抗體及用E7/Db四聚體染色。在用Lm-LLO-E7及Lm-PEST-E7疫苗接種之小鼠中看到腫瘤內四聚體陽性淋巴細胞之百分比增加(圖6A)。此結果在三次實驗中為可再現的(圖6B)。

因此，Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7及Lm-PEST-E7各自有效誘發腫瘤浸潤性CD8⁺ T細胞及腫瘤消退。

實例4：通過小鼠繼代李斯特菌疫苗載體引發對異源性及內源性抗原的免疫反應增加 材料及實驗方法 細菌菌株

血清型1之單核球增多性李斯特菌菌株10403S(ATCC,Manassas,Va.)為使用在這些研究中的野生型生物體以及以下所述構築體之親代菌株。菌株10403S於腹膜內注入BALB/c小鼠時係具有約5×10⁴個CFU的LD₅₀。「Lm-Gag」為一含有使用經修飾穿梭載體pKSV7而穩定整合至李斯特菌基因體中之HIV-1菌株HXB(帶有形成合胞體的表現型之亞型B實驗室菌株)gag基因的重組LM菌株。Gag蛋白係通過該菌株表現並分泌，如通過西方墨點法所判定。所有的菌株係長在腦心浸液(BHI)培養液或瓊脂盤(Difco Labs,Detroit,Mich)中。

細菌培養

來自於表現繼代抗原及/或融合蛋白之單一殖株的細菌係經選殖並隔夜培養在BHI培養液中。此培養物的等分試樣係以無任何添加劑的狀態下冷凍在-70℃下。由此儲備料，培養物係生長至O.D.600nm的值為0.1至0.2，且其等分試樣係再以無任何添加劑的狀態下冷凍在-70℃下。上述步驟係為製備經選殖的細菌庫而使用，但在每次繼代之後一些細菌殖株係經選殖並檢查靶標抗原的表現情況，如本文中所述。經確定表現外來抗原的殖株係使用於下次的繼代中。

小鼠中的細菌繼代

6至8週大的雌性BALB/c(H-2d)小鼠係購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Me)並保持在無病原體的微隔離器環境中。於冷凍儲存於-70℃下的儲備培養物之等分試樣中的活菌效價係藉由在使用前解凍並塗在BHI瓊脂盤上而判定。總之，5×10⁵個細菌係以腹膜內注入BALB/c小鼠。於3天後，脾臟係經收集及均質化，且脾臟均質物的連續稀釋物係隔夜培養在BHI培養液並塗在BHI瓊脂盤上。為進一步的繼代，係再讓等分試樣生長至0.1至0.2 O.D.，冷凍於-70℃下，並再通過連續稀釋來判定細菌效價。於初始的繼代(繼代0)之後，此序列重複總共4次。

胞內細胞素IFN-γ染色

淋巴細胞係以1微莫耳之濃度培養在補充有50U/ml人類重組IL-2及1μl/ml布雷菲德菌素A (brefeldin A(Golgistop^TM；PharMingen,San Diego,CA))的完全RPMI-10培養液之中，且所述培養液係存有或不存有HIV-GAG的細胞毒性T細胞(CTL)抗原決定區(AMQMLKETI；SEQ ID No：25)、李斯特菌LLO(GYKDGNEYI；SEQ ID No：26)或HPV病毒基因E7(RAHYNIVTF；SEQ ID No：24)。細胞首先進行表面染色，接著洗滌並使用Cytofix/Cytoperm試劑組根據製造商建議(PharMingen,San Diego,CA)接受胞內細胞素染色。對於胞內IFN-γ染色，係使用與FITC接合的大鼠抗小鼠型IFN-γ單株抗體(殖株XMG 1.2)以及其同型對照抗體(大鼠IgG1；皆來自PharMingen)。總之，10⁶個細胞係在4℃下於含有1%牛血清蛋白及0.02%疊氮化鈉(FACS緩衝液)的PBS中染色30分鐘，隨後在FACS緩衝液中洗滌3次。樣本資料係於FACScan^TM流式細胞儀或FACSCalibur^TM儀器(Becton Dickinson,San Jose,CA)上獲得。針對CD8(PERCP接合，大鼠抗小鼠型，殖株53-6.7，Pharmingen，San Diego，Calif.)、CD62L(APC接合，大鼠抗小鼠型，殖株MEL-14)及胞內IFN-γ之三色流動細胞分析係使用FACSCalibur^TM流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA)進行，且進一步以CELLQuest軟體(Becton Dickinson,Mountain View,CA)分析資料。於針對CD8⁺及胞內IFN-γ染色分析之前，細胞係圈選為CD8高及CD62L^低。

結果 在小鼠中的繼代增加了重組單核球增多性李斯特菌的毒力

使用三種不同的構築體來判定繼代對重組李斯特菌疫苗載體的衝擊。這些構築體中之二者攜載了該繼代抗原中的基因體插入：第一種包括HIV gag基因(Lm-Gag)，而第二種包括HPV E7基因(Lm-E7)。第三種(Lm-LLO-E7)包括一具有該繼代抗原(HPV E7)所需的融合基因之質體，該繼代抗原係與一截短型式的LLO及一編碼PrfA的基因融合，PrfA為控制李斯特菌毒力因子的正調節因子。此質體係用以補充prfA陰性突變體，藉以在一活宿主中，選擇壓力會有利於保存該質體，因為沒有該質體時細菌是無毒力的。三種構築體全部在體外廣泛地增殖許多細菌世代。

如通過脾臟中存活的細菌數量所量測，繼代細菌在前兩次的每次繼代中會造成細菌毒力的增加。對於Lm-Gag及Lm-LLO-E7，每次繼代的毒力增加直到第二次繼代(圖7A)。該含有質體的構築體Lm-LLO-E7顯示了最急劇的毒力增加。於繼代之前，初始的Lm-LLO-E7免疫接種劑量必須增加至10⁷個細菌且脾臟必須在第2天收集以回收細菌(而對於Lm-Gag係在第3天收集其初始劑量10⁵個細菌)。於初次繼代後，Lm-LLO-E7的標準劑量係足以在第3天收集。對於Lm-E7，在未經繼代的細菌中毒力係增加1.5個數量級(圖7B)。

因此，通過小鼠繼代會增加李斯特菌疫苗菌株的毒力。

繼代增加了單核球增多性李斯特菌誘發CD8 ⁺ T細胞的能力

接著，繼代對於誘發抗原特異性CD8⁺ T細胞的功效係藉由具有對MHC I類特異的免疫顯性肽之胞內細胞素染色法，使用HIV-Gag肽AMQMLKETI(SEQ ID No：25)及LLO 91-99(GYKDGNEYI；SEQ ID No：26)而判定。10³個CFU的繼代細菌(Lm-Gag)注入小鼠內引發了顯著數量的HIV-Gag特異性CD8⁺ T細胞，而相同劑量的未經繼代Lm-Gag未誘發出可偵測到的Gag特異性CD8⁺ T細胞。縱然增加未經繼代的細菌劑量100倍，其並未補償其相對的無毒力；事實上，甚至在較高劑量下並未有可偵測到的Gag特異性CD8⁺ T細胞被引發。隨著經繼代的細菌之相同劑量增加係增加了50%的Gag特異性T細胞誘發(圖8)。在LLO特異性CD8⁺ T細胞上觀察到相同的抗原特異性CD8⁺ T細胞誘發模式，顯示這些結果並未由繼代抗原的特性所造成，因為其在LLO(內源性李斯特菌抗原)上可觀察到。

因此，通過小鼠繼代會增加李斯特菌疫苗菌株的免疫原性。

實例5：在沒有抗生素下含有PrfA的質體在具有PrfA缺失的LM菌株中係穩定的 材料及實驗方法 細菌

單核球增多性李斯特菌菌株XFL7係在prfA基因中含有300個鹼基對缺失。XFL7攜載可部分恢復毒力並授予CAP耐受性的pGG55，且已在美國專利申請公開案第200500118184號中描述。

自李斯特菌萃取質體的實驗方案開發

1mL的單核球增多性李斯特菌Lm-LLO-E7研究工作細胞庫小管係接種至27mL含有34μg/mL CAP的BH1培養基中並在37℃及200rpm下生長24小時。

七個該培養物的2.5mL樣本係沉澱成粒(以15000rpm進行5分鐘)，且沉澱物係以50μl溶菌酶溶液在37℃下培養不同的時間量(自0至60分鐘)。

溶菌酶溶液：

- 29μl 1M磷酸氫二鉀

- 21μl 1M磷酸二氫鉀

- 500μl 40%蔗糖(已通過0.45/μm的濾膜進行過濾滅菌)

- 450μl水

- 60μl溶菌酶(50mg/mL)

於與溶菌酶一起培養之後，其懸浮液係依前述方法離心並丟棄上清液。各沉澱物係接著藉由一改良版QIAprep Spin Miniprep Kit®(Qiagen,Germantown, Maryland)實驗方案而接受質體萃取。對於該實驗方案的改變如下：

1.緩衝液PI、P2及N3的體積係全部增加3倍以讓增加的生物體完全裂解。

2.於加入P2之前將2mg/mL溶菌酶加入再懸浮細胞中。裂解溶液係接著於中和之前在37℃下培養15分鐘。

3.質體DNA係再懸浮成30μL而非50μL，以增加濃度。

於其他實驗中，細胞係在P1緩衝液及溶菌酶中培養15分鐘，接著在室溫下與P2(裂解緩衝液)及P3(中和緩衝液)一起培養。

來自於各繼代培養物的等體積分離質體DNA係在0.8%瓊脂糖凝膠上跑膠並以溴化乙菲錠染色及顯影任一結構或分離不穩定性的跡象。

這些結果顯示了由單核球增多性李斯特菌Lm-LLO-E7所萃取的質體提高了隨溶菌酶培養時間增加的功效，且在約培養50分鐘時達至最佳程度。

這些結果提供了由李斯特菌疫苗菌株萃取質體的有效方法。

複印培養

原培養物的稀釋物係於塗在存有或未存有34μg/mL CAP之含有LB或TB瓊脂的培養皿上。選擇性瓊脂或非選擇性瓊脂上的菌落數差異係用以判定該質體是否有任何顯見的分離不穩定性。

結果

pGG55質體於沒有抗生素下在單核球增多性李斯特菌菌株XFL7中的基因穩定性(即在缺少選擇壓力下該質體被細菌保留或保持穩定與該細菌相關聯的程度；例如，抗生素選擇壓力)係藉由在Luria-Bertani培養基(LB：5g/L NaCl、10g/ml大豆蛋白腖、5g/L酵母菌萃取物)及Terrific Broth培養基(TB：10g/L葡萄糖、11.8g/L大豆蛋白腖、23.6g/L酵母菌萃取物、2.2g/L KH₂PO₄、9.4g/L K₂HPO₄)二者中以二重複培養方式的連續繼代培養而評估。裝在250mL擋板搖瓶中的50mL新鮮培養液係以固定數量的細胞(1 OD mL)接種，接著以24小時的間隔繼代培養。培養物係在37℃下以200rpm於一軌道振盪器中進行接種。於每次繼代培養時係測量其OD₆₀₀值以用於計算經過的細胞倍增時間(或其世代)，直至在LB培養液中達到30個世代或在TB培養液中達到42個世代。在每一繼代培養階段(約每4個世代)中係藉由離心將已知數量的細胞(15 OD mL)沉澱成粒，且質體DNA係使用上述Qiagen QIAprep Spin Miniprep®實驗方案進行萃取。於純化後，質體DNA係接受瓊脂糖凝膠電泳，接著進行溴化乙菲錠染色。儘管於該等樣本之間在製備中的質體數量有輕微的變化，關於細菌的世代數量其整體趨勢為一恆定數量的質體(圖9A-B)。因此，pGG55表現出在菌株XFL7中的穩定性，即使在沒有抗生素的情況下。

在瓊脂培養皿上利用複印培養對各階段繼代培養的穩定性研究中亦監測了質體的穩定性。與瓊脂糖凝膠電泳的結果一致，在整個LB或TB液體培養(分別為圖10及11)的研究中含有質體的細胞數量整體上並沒有變化。

這些發現展示出編碼PrfA的質體在沒有抗生素下表現了其在含有prfA突變的李斯特菌菌株中的穩定性。

材料與方法(實例6-10)

PCR試劑：該等用以擴增prfA基因及鑑別D133V突變之引子係顯示於表1之中。該等引子ADV451、452及453之儲備液係藉由稀釋TE緩衝液中的引子至400μM而製備。儲備液的等分試樣係進一步以水(PCR等級)稀釋至20μM以製備工作溶液。該等引子係儲存在-20℃下。使用於PCR中的試劑係顯示於表2之中。

質體DNA的製備

具有(pGG55 D133V)或不具有(pGG55 WT) prfA突變的pGG55質體係使用PureLink^TM HiPure Plasmid Midiprep Kit(Invitrogen,K2100-05)根據製造商的說明藉由大腸桿菌或單核球增多性李斯特菌的小量製備進行萃取及純化。對於來自李斯特菌的質體純化，攜載pGG55 D133V或野生型質體的細菌菌株係由冷凍的儲備料劃線塗在含有氯黴素(25μg/ml)的BHI瓊脂培養皿中。取自各菌株的單一菌落係在5ml選擇性培養基中(具有25μg/ml氯黴素的BHI培養液)以劇烈搖晃方式在37℃下生長6小時，以1：500比例下接種於100ml選擇性培養基之中並在近似的條件下隔夜生長。取自隔夜培養物的細菌係藉由在4,000 x g下離心10分鐘而收集，並再懸浮於含有2mg/ml溶菌酶(Sigma,L7001)的緩衝液R3(再懸浮緩衝液)之中。細菌懸浮物於進行常規的實驗方案之前係在37℃下培養至少1小時。溶出質體之濃度及純度係在分光光度計中以260nm及280nm量測。為製備模板DNA，pGG55 D133V及WT質體係由該小量製備儲備液再懸浮於水中，最終濃度為1ng/μl。對於pGG55 WT質體，係由該1ng/μl溶液製備連續10倍稀釋液，其係對應10^-1至10^-7的稀釋度。

測試臨床等級材料之prfA特異性PCR實驗方案

反應混合物係含有1倍PCR緩衝液、1.5mM MgCl₂、0.8mM dNTPs、各為0.4μM的引子、0.05U/μl的Taq DNA聚合酶以及0.04ng/μl的pGG55 D133V模板質體。每一試驗中，係需要10個小管且各管中的25μl反應溶液之關鍵組分係顯示於表3之中。在PCR反應中，係以足夠用於11個反應的試劑製備主要混合液(如在表4中所示)，且此PCR混合液中的24μl係加入至各小管內。隨後，總量為1μl的連續稀釋pGG55 WT質體係加入至對應的小管中：管3中為1ng；管4中為100pg；管5中為10pg；管6中為1pg；管7中為100fg；管8中為10fg；管9中為1fg；管10中為0.1fg。此連續稀釋度係用以計算出標準曲線以判定該方法的靈敏度。此外，0.5μl的水及0.5μl的引子ADV451(20μM儲備液)係加入管1，且1μl的水係加入管2中，而完成25μl的最終體積。每小管中用於25μl的反應的之各試劑數量係顯示於表5中。使用在該反應中的PCR循環條件係顯示於表6中。

於PCR反應結束後，5μl的注膠緩衝液(6倍，具有溴酚藍)係加入至各樣本中且其10μl係通過在TBE緩衝液中的1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析。凝膠尺寸為7公分×7公分×1公分且具有15個樣本槽(1毫米×2毫米)的梳齒。此凝膠係在100V下跑膠~30分鐘，直至溴酚藍染劑達到凝膠的中間。此凝膠係以溴化乙菲錠(0.5μg/ml)染色20分鐘，在水中去染10分鐘。此凝膠係照以UV光以顯影及攝像。其影像係使用吸光帶密度測定軟體分析(Quantity One version 4.5.1,BioRad)。

^a pGG55 WT(管3中為1ng；管4中為100pg；管5中為10pg；管6中為1pg；管7中為100fg；管8中為10fg；管9中為1fg；管10中為0.1fg)。^b 在管1中加入0.5μl的水及0.5μl的引子ADV451(20μM儲備液)；在管2加入1μl的水。

定序：

該等質體的定序係使用雙脫氧定序法而完成。質體pGG55 D133V及pGG55 WT係以不同比例(1：1、1：10、1；100、1：1,000及1：10,000)混合。質體於混合物中的總量係維持恆定(500μg)，且該含有野生型序列的質體係以相對於該D133V質體的10倍連續稀釋而判定該方法的靈敏度。

結果 實施例6：定序並非是靈敏的D133V突變復原偵測方法。

為評估定序在偵測野生型prfA序列時的靈敏度，pGG55 D133V及WT質體係以不同的比例混合並定序。其結果係顯示於圖12中，並顯示出定序在鑑別prfA D133V突變時有高度的特異性(圖12)。另一方面，其靈敏度低且在序列中具有可偵測的波峰之野生型prfA pGG55質體最大稀釋度為1/10(圖12)。總而言之，儘管定序是非常有特異性的，但該方法的靈敏度低且不適合用來篩選稀有事件的存在，諸如在Lm-LLO-E7樣本中的prfA D133V突變之反突變體。

實例7：偵測D133V突變復原之高特異性及靈敏性PCR方法之開發。

鑒於定序對偵測稀有事件的低靈敏性，有必要開發具有相似特異性之更靈敏方法以偵測D133V突變復原成野生型。為達此目標，我們設計了一種基於PCR的方法，其特別擴增野生型序列且有足夠的靈敏度在D133V突變序列的10,000,000個複本中偵測至少一prfA 的野生型複本。我們設計了3種引子用於此方法中：ADV451、ADV452及ADV453(表1)。ADV451及ADV452二者為正向引子且其在3’位置的最後一個核苷酸不同，以鑑別在prfA基因的398位置處之A→T(D133V)突變。ADV453引子為位於ADV451及ADV452引子黏合位置下游約300個鹼基處之反向引子(表13)。期望以引子ADV451或ADV452及ADV453獲得的PCR吸光帶為326個鹼基。在嚴格條件下，ADV451引子應只擴增pGG55 D133V質體，而ADV452會對野生型prfA基因有特異性。

實例8：PCR方法的特異性。

使用引子ADV451的反應係非常有特異性且擴增經突變的D133V prfA序列(泳道1至3)，而非該野生型序列(泳道4至6)。然而，當使用5ng的模板DNA時，在泳道4中可偵測到非常微弱的吸光帶，但以1ng則無法偵測到(圖14)。

如在圖15中所示，使用ADV452引子的反應只擴增野生型prfA序列(泳道4、5、6)，且當使用攜載D133V PrfA突變之pGG55做為模板時係無法偵測到吸光帶(泳道1、2、3)，甚至在反應中使用5ng的質體時(圖16)。總而言之，該等使用引子ADV451及ADV452的PCR反應係非常有特異性且能夠鑑別出pGG55質體中在prfA基因398位置處的AT(D133V)突變。根據這些結果，我們選出1ng的用量做為模板DNA在反應中所使用的標準用量。

實例9：PCR方法的靈敏度。

反應的靈敏度係使用1ng的模板DNA來測試。對於攜載野生型prfA序列的質體，用量漸少的DNA(對應10^-1至10^-7的10倍稀釋度)係包含在反應中以評估靈敏度。於這些反應中僅有引子ADV452及ADV453被使用。於有30個循環的PCR反應中(10個循環使用黏合溫度53℃，另外的20個循環使用黏合溫度50℃)，該方法的靈敏度為1/100,000(資料未顯示)。如圖5中所示，對於D133V反突變體的偵測將PCR的循環數增至37個循環會改善該方法的視覺靈敏度至10^-6，且沒有顯著損害其特異性。當使用1ng的質體做為DNA初始用量時，於10^-6稀釋物中可見到一明顯的吸光帶，其對應了在一百萬個D133V突變體中一個野生型序列複本的偵測程度。於長時間曝光後只有在泳道1及9中見到非常微弱的吸光帶，再度確保該方法穩健的特異性。另一方面，當在一開始使用5ng的DNA時，可在10^-7稀釋物中輕易偵測到吸光帶而增加PCR的靈敏度。然而，相似強度的吸光帶亦可使用pGG55 D133V質體而偵測到，顯示出該方法的特異性極限(圖17)。使用pGG55 D133V質體所觀察到的吸光帶可能是因使用引子ADV452的D133V突變的非特異性擴增而產生，其可隨著循環數的增加而顯著累積。這些結果指出此方法在沒有顯著損害特異性下的靈敏度極限係位於1：1,000,000至1：10,000,000之間。

實例10：表現具有LLO於E7上(LM-LLO-E7)之融合蛋白的重組李斯特菌

此菌株係比野生型親代菌株10403S減毒約4至5 logs，並分泌融合蛋白tLLO-E7。此免疫療法係基於通過毒力基因轉錄活化子prfA的不可逆缺失而由10403S衍生之XFL7架構。PrfA係調節若干毒力基因的轉錄，諸如李斯特菌溶解素O(LLO)、ActA、PlcA(磷脂酶A)、PlcB(磷脂酶B)等，該等基因係單核球增多性李斯特菌在體內之胞內生長及存活所需。在體外質體pGG55係由Lm-LLO-E7通過以氯黴素選擇的手段而保留。然而在體內由Lm-LLO-E7所保留的質體係攜載經突變的prfA(D133V)的複本，其在DNA的結合與該等毒力基因的轉錄活化上已表現出比野生型PrfA的活性較低。我們已觀察到當與野生型菌株10403S相比時，使用經突變的PrfA補充會導致Lm-LLO-E7所分泌的LLO量降低約40倍。這意味著菌株Lm-LLO-E7可能表現出由PrfA所調節的毒力基因(諸如actA、inlA、inlB、inlC、plcB等)的表現降低。於Lm-LLO-E7中，使用經突變的prfA複本補充可能造成由PrfA所調節的不同毒力基因的表現降低，導致了約4至5 logs的全面衰減。

實例11：建構經減毒的李斯特菌菌株-Lmdd△actA。

分泌融合至tLLO之PSA的重組Lm(Lm-LLO-PSA)係經開發，其引發了前列腺癌小鼠模式中之與腫瘤消退相關聯的強力PSA特異性免疫反應，其中tLLO-PSA的表現係源自一基於pGG55的質體(表7)，而pGG55授予了載體抗生素耐受性。一用於該基於pADV142質體的PSA疫苗之菌株亦經開發。此菌株沒有抗生素耐受性標記，且稱為LmddA-142(表7)。此新菌株係比Lm-LLO-PSA減弱10倍。此外，LmddA-142比 Lm-LLO-PSA略微更具免疫原性且顯著更有效使表現PSA的腫瘤消退。

質體pAdv142(6523bp)的序列如下：(SEQ ID NO：34)。此質體係於2-20-08時在Genewiz設備上由大腸桿菌菌株定序。

實例12：以同讀碼框架方式將人類klk3基因插人Lmdd及Lmdda菌株中的hly基因。

菌株Lm dal dat(Lmdd)係藉由毒力因子ActA的不可逆缺失而減毒。建構Lmdaldat(Lmdd)背景中的actA同讀碼框架缺失以避免對下游基因表現的任何極性作用。該Lm dal dat△actA在N端含有前19個胺基酸且在C端含有28個胺基酸殘基，且缺失591個ActA胺基酸。

藉由擴增對應於actA之上游(657bp-寡Adv 271/272)及下游(625bp-寡Adv 273/274)部分的染色體區域且籍由PCR接合而產生actA缺失突變體。用於此擴增之引子序列係於表8中給出。actA之上游及下游DNA區域係於EcoRI/PstI限制位點處選殖至pNEB193中並來自於此質體，所述EcoRI/PstI限制位點進一步被選殖至溫度敏感型質體pKSV7中，產生△actA/pKSV7(pAdv120)。

使用在外部結合至actA缺失區域的引子來驗證基因從其染色體位置缺失，該等引子在圖23中顯示為引子3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc,SEQ ID NO：39)及引子4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg；SEQ ID NO：40)。對自Lmdd及Lmdd△actA分離之染色體DNA進行PCR分析。在Lmdd染色體DNA中以兩個不同組的引子對1/2與3/4擴增之後的DNA片段大小係預期為3.0Kb及3.4Kb。另一方面，使用該等引子對1/2及3/4於Lmdd△actA中之PCR的預期尺寸為1.2Kb及1.6Kb。因此，圖23中的PCR分析確認了LmddactA菌株中缺失△actA的1.8kb區域。亦對PCR產物進行DNA定序以確認菌株LmddactA中之含有△actA的區域的缺失。

實例13：建構與抗生素無關的游離型表現系統以用於通過Lm載體之抗原傳遞。

用於通過Lm載體的抗原傳遞之與抗生素無關的游離型表現系統(pAdv142)為無抗生素之質體pTV3的下一代(Verch等人，Infect Immun,2004.72(11)：6418-25，其係已引用方式併入本文中)。用於毒力基因轉錄活化因子之基因prfA係從pTV3缺失，因為李斯特菌菌株Lmdd在染色體中含有prfA基因的複本。此外，於NheI/PacI限制位點處之p60-李斯特菌dal卡匣係置換為p60-枯草芽孢桿菌dal，產生質體pAdv134(圖24A)。李斯特菌及芽孢桿菌dal基因的相似性為約30%，實際上消除質體與Lmdd染色體中之dal基因的剩餘片段之間重組的機會。質體pAdv134含有抗原表現卡匣tLLO-E7。LmddA菌株係以pADV134質體轉型且藉由西方墨點法確認來自於所選擇殖株之LLO-E7蛋白的表現(圖24B)。源自10403S野生型菌株之Lmdd系統缺少抗生素耐受性標記，但具有Lmdd鏈黴素耐受性。

再者，pAdv134係以XhoI/XmaI限制於人類PSA殖株klk3，產生質體pAdv142。新的質體pAdv142(圖24C，表7)含有受到李斯特菌p60啟動子控制的芽孢桿菌dal(B-Dal)。在沒有外源性D-丙胺酸的存在下該穿梭質體pAdv142補足了大腸桿菌ala drx MB2159以及單核球增多性李斯特菌菌株Lmdd的生長。質體pAdv142中的抗原表現卡匣係由hly啟動子及LLO-PSA融合蛋白所組成(圖24C)。

質體pAdv142係轉型為李斯特菌背景菌株Lmdd actA而產生Lm-ddA-LLO-PSA。由該菌株Lm-ddA-LLO-PSA所表現及分泌的LLO-PSA融合蛋白係藉由西方墨點法使用抗LLO及抗PSA抗體確認(圖24D)。在兩次活體內繼代之後，菌株Lm-ddA-LLO-PSA穩定表現及分泌LLO-PSA融合蛋白。

實例12：以不同劑量濃度的LMDDAHPVQUAD-TAG免疫接種後之TC1腫瘤控制

使用TC-1肺上皮細胞在C57BL/6雌性小鼠中進行腫瘤消退研究，以評估Lm-HPVQuad的處理中之下列不同劑量(CFU)的治療功效：1×10⁸、1×10⁷、2.5×10⁷及5×10⁷。

腫瘤接種：使用於此研究中的腫瘤模式為TC-1腫瘤模式。TC-1係培養在完全培養液之中。植入腫瘤細胞到小鼠內的前兩天，TC-1細胞將在完全培養液之中繼代培養。在實驗的當天(第0天)，將細胞以胰蛋白酶處理並以培養液洗滌兩次。計數細胞並以1×10⁵個細胞/200ul PBS/小鼠的濃度重新懸浮以用於注射。腫瘤細胞將皮下注射在每隻小鼠的右側腹。第一次的劑量將以IP/200uL/小鼠的方式在第8天及此後每週一次共3劑施用。腫瘤將每週測量兩次，直到它們達到直徑12mm的尺寸。一旦腫瘤滿足犧牲標準，將根據Advaxis的動物安樂死協定將小鼠安樂死，且切除並測量腫瘤。

培養實驗方案：在植入的前兩天，將TC1細胞繼代培養至1：10比例。在植入當天，將TC1細胞以胰蛋白酶處理，並以c-RPMI洗滌。計數細胞(1×10^6/ml， 97%存活，共20ml)，並在RPMI中再次洗滌。接著將細胞重新懸浮在冰冷的PBS中，並通過70um過濾器，並再次計數(於10ml中為2×10^6/ml，97%存活)。將4ml的細胞與12ml冰冷的PBS混合而共在16ml中產生5×10^5/ml。足以用於80隻給予1×10^5/200ul劑量的動物之中。

TC-1細胞用的完全培養液：450ml RPMI 1640,50ml 10%FBS,5ml NEAA(100uM),5ml L-經醯胺(2uM),5mL Pen/strep(100U/mL青黴素+100ug/mL鏈黴素)G418(400ug/mL)(於分裝時加至細胞)。

疫苗製備：1.對於每個構築體在37℃水浴中從-80℃解凍1小瓶。2.以14,000rpm旋轉2分鐘並丟棄上清液。3.以1ml的PBS洗滌2次並丟棄。4.重新懸浮於PBS中至適當濃度。

以表現HPV16 E6&E7的TC1腫瘤接種之小鼠中的腫瘤體積係經測量；其係經以劑量遞減的Lmdda-HPVQuad或空的LmddA274(不含HPV抗原的李斯特菌)處理(圖25A-D)。

結果顯示在小鼠中HPVquad可以以低於1×10⁸的最佳劑量高達10倍之劑量(1×10⁷)給予，且仍然維持對表現HPV16 E6 & E7的腫瘤同樣有效的腫瘤控制。

實例13：以不同劑量濃度的AXAL或LMDDA-HPVQUAD免疫接種後之TC1腫瘤控制

使用TC-1肺上皮細胞(其表現HPV16：E6&E7)在C57BL/6雌性小鼠中進行腫瘤消退研究，以評估AXAL(Lm-E7)或Lm-HPVQuad的處理中之下列不同劑量(CFU)的治療功效：1×10⁸,1×10⁷,2.5×10⁷及5×10⁷。N=每組5-10隻動物。

以表現HPV16 E6&E7的TC1腫瘤接種之小鼠中的腫瘤體積係經測量；其係經以劑量遞減的AXAL/Lm-E7或空的載體Lm-tLLO處理(圖26A)。以表現HPV16 E6&E7的TC1腫瘤接種之小鼠中的腫瘤體積係經測量；其係經以劑量遞減的Lmdda-HPVQuad或空的載體Lm-tLLO處理(圖26B)。

結果顯示只表現HPV16 E7抗原的AXAL在1×10⁸的標準劑量下是有效的。然而，表現HPV16 E6 & E7二者的HPVQuad在低於標準劑量10倍下可有效控制腫瘤的生長。

在已參照附圖描述本發明的情況下，應理解到本發明並不限於確切的實施例，且熟習此項技術者可在不偏離本發明所附申請專利範圍所界定之範疇或精神的情況下在其中進行各種改變和修改。

<110> 艾法西斯公司

<120> 重組李斯特菌疫苗菌株及在癌症免疫治療中使用該菌株之方法

<140> 105133303

<141> 2016-10-14

<150> US 62/241,712

<151> 2015-10-14

<160> 42

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 1

<210> 2

<211> 441

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 2

<210> 3

<211> 529

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 3

<210> 4

<211> 416

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 4

<210> 5

<211> 390

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 5

<210> 6

<211> 1170

<212> DNA

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 6

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 7

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 9

<210> 10

<211> 33

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 化膿鏈球菌

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 類馬鏈球菌

<400> 12

<210> 13

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7蛋白

<400> 13

<210> 14

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7蛋白

<400> 14

<210> 15

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E6蛋白

<400> 15

<210> 16

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E6蛋白

<400> 16

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 17

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 18

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 19

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 20

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 21

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7肽

<400> 24

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 細胞毒性T細胞(CTL)對於HIV-GAG的抗原決定區

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 細胞毒性T細胞(CTL)對於李斯特菌LLO的抗原決定區

<400> 26

<210> 27

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 27

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 28

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 29

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 30

<210> 31

<211> 1614

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼四個異源抗原的重組核苷酸可操作地連接至標記序列之序列

<400> 31

<210> 32

<211> 2943

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包括四個異源抗原的重組多肽於N端可操作地連接至截短的LLO之序列以及於C端的肽標記序列

<400> 32

<210> 33

<211> 979

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> -重組多肽tLLO-HPV16E7-HPV16E6-HPV18E7-HPV16E6 SIINFEKL-S-6xHIS標記

<400> 33

<210> 34

<211> 6523

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pAdv142

<400> 34

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 35

<210> 36

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 36

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 37

<210> 38

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 38

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 39

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 40

<210> 41

<211> 364

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lovaxin_C_pGG55

<400> 41

<210> 42

<211> 364

<212> DNA

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 42

Claims

一種免疫原性組合物，其包括一包括有一重組核酸之重組李斯特菌菌株，所述核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括四個可操作地串聯連接的異源HPV抗原或其功能性片段，其中所述可操作地連接的異源HPV抗原或其功能性片段係於最N端的異源抗原之N端處融合至一LLO蛋白N端片段，其中所述重組核酸進一步包括一編碼一代謝酶之第二開放讀碼框架。
如請求項1之免疫原性組合物，其中該LLO蛋白N端片段包括SEQ ID NO：2。
如請求項1至2中任一項之免疫原性組合物，其中該重組李斯特菌菌株為單核球增多性李斯特菌菌株。
如請求項1至3中任一項之免疫原性組合物，其中該重組多肽係由該重組李斯特菌菌株表現。
如請求項1至4中任一項之免疫原性組合物，其中該核酸係位於該重組李斯特菌菌株的染色體外質體中。
如請求項1至5中任一項之免疫原性組合物，其中該質體係穩定維持在所述重組李斯特菌菌株中。
如請求項1至6中任一項之免疫原性組合物，其中該李斯特菌菌株係包括基因體dal、dat及actA基因的突變、缺失或不活化。
如請求項1至7中任一項之免疫原性組合物，其中該代謝酶係與所述突變、缺失或不活化互補。
如請求項1之免疫原性組合物，其中由該第一開放讀碼框架編碼的重組多肽的結構包括N端LLO-抗原1-抗原2-抗原3-抗原4。
如請求項1至9中任一項之免疫原性組合物，其中該四個異源HPV抗原或其功能性片段係選自由HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18 E6、HPV18 E7抗原及其片段所組成之群。
如請求項9之免疫原性組合物，其中該抗原1為HPV16 E6，抗原2為HPV16 E7，抗原3為HPV18 E6，且抗原4為HPV18 E7。
如請求項1至11中任一項之免疫原性組合物，其中該第一開放讀碼框架進一步編碼一可操作地連接至最後一個異源抗原之C端處的蛋白標籤序列。
如請求項12之免疫原性組合物，其中該蛋白標籤序列為SIINFEKL-6xHIS序列。
如請求項12至13中任一項之免疫原性組合物，其中該第一開放讀碼框架包括SEQ ID NO：32。
如請求項12至13中任一項之免疫原性組合物，其中該第一開放讀碼框架係編碼一包括有SEQ ID NO：33的蛋白。
如請求項1至15中任一項之免疫原性組合物，其中該重組李斯特菌菌株係已通過一動物宿主繼代。
如請求項1至16中任一項之免疫原性組合物，其進一步包括一佐劑。
如請求項17之免疫原性組合物，其中該佐劑係選自包括有GM-CSF蛋白、皂素QS21、單磷醯基脂質A、SBAS2、未甲基化CpG之寡核苷酸、免疫刺激性細胞激素、羽莖糖苷、細菌毒素及細菌有絲分裂原之清單。
如請求項1至18中任一項之免疫原性組合物，其中該重組李斯特菌菌株係已儲存在一冷凍或冷凍乾燥細胞庫中。
一種在個體中治療腫瘤或癌症的方法，該方法包括對該個體投與如請求項1至19中任一項之免疫原性組合物的步驟。
一種保護人類個體預防腫瘤或癌症的方法，其包括對該個體投與如請求項1至19中任一項之組合物的步驟。
一種在人類個體中誘發抗腫瘤細胞毒性T細胞反應的方法，其包括對該個體投與一包括有如請求項1至19中任一項之重組李斯特菌菌株的組合物之步驟。
如請求項20至22中任一項之方法，其中該組合物係以約1×10⁶CFU至約1×10⁹CFU的劑量施用。
如請求項23之方法，其中該組合物係以約1×10⁶CFU至約1×10⁸CFU的劑量施用。
如請求項23之方法，其中該組合物係以約1×10⁶CFU至約1×10⁷CFU的劑量施用。
如請求項23之方法，其中該組合物係以約1×10⁷CFU至約1×10⁹CFU的劑量施用。