TW201703778A - 作為腸道菌群的基礎益生菌的雙歧桿菌 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種新型益生菌-雙歧桿菌菌種，具體地，關於一種假小鏈雙歧桿菌菌株及其作為益生菌、食品、飼料、飲食添加劑、和藥物配方組分的用途。該細菌適用於治療肥胖、糖尿病(特別是2型糖尿病)以及其它相關疾病。

Description

作為腸道菌群的基礎益生菌的雙歧桿菌

本發明關於一種多株新型雙歧桿菌以及它們的應用，關於添加該菌株的食品、飼料、膳食添加物和藥物配方，並且關於製作和使用這些複合物的方法。

益生菌通常是指以足夠數量攝入宿主體內後發揮健康效應的“活性微生物”。目前，益生菌已被廣泛應用於預防和治療多種疾病，並且，它們的效力在一些臨床實驗中已被強有力地證實。例如，WO 2007/043933描述了添加了益生菌的食品、飼料、膳食添加物用於控制體重、預防肥胖、增加飽感、延長飽腹感、降低攝食量、降低脂肪積累、提高能量代謝、增強胰島素敏感性、治療肥胖和治療胰島素抵抗的用途。

WO 2009/024429描述了使用藥物配方中的益生菌組合物可以減少消化道中變形菌門的數量，尤其是腸桿菌及/或脫鐵桿菌，達到治療或預防代謝失調症，以支持及/或幫助管理體重。

WO 2009/004076描述了使用益生菌可以使血漿葡萄糖濃度正常化、提高胰島素敏感性、減少妊娠危險和防止 妊娠糖尿病。

WO 2009/021824描述了使用益生菌，尤其是鼠李糖乳桿菌可以治療肥胖、代謝失調症以及幫助減重及/或維持體重。

WO 2008/016214描述了格氏乳桿菌株BNR17的益生乳酸菌以及其在抑制體重上升中的用途。

WO 02/38165描述了菌株乳酸菌(尤其是胚芽乳酸桿菌)的菌株可以降低代謝失調症中的危險因數。

US 2002/0037577描述了使用微生物(例如乳酸菌)治療或預防肥胖或糖尿病，主要通過減少吸收進體內的單醣或雙糖數量，也就是把此類化合物轉化為不能被腸道吸收的高分子材料。

Lee等(J.Appl.Microbiol.2007,103,1140-1146)描述了小鼠體內的胚芽乳酸桿菌菌株PL62產生的反-10，順12共軛亞油酸(CLA)具有抗肥胖活性。

Li等(Hepatology,2003,37(2),343-350)描述了在小鼠模型中使用益生菌和抗-TNF抗體治療非酒精型脂肪肝。

US2014/0369965公開了從健康母乳飼餵的小鼠糞便內分離出來的一種假小鏈雙歧桿菌菌株。同樣的文件進一步公開使用該菌株和其細胞組分、代謝物、分泌物以及其他微生物的混合物可以預防及/或治療肥胖、超重、高血糖症和糖尿病、肝脂肪變性或者脂肪肝、血脂異常症、代謝綜合症、與肥胖和超重相關的免疫系統異常，還包括與肥胖和超重相關的腸道菌群組成失衡。然而，此菌株並非來 源於人類。

換句話說，目前存在的益生菌具有很多局限性，迫切需要開發一種新的益生菌菌株。

根據本發明的一方面，本發明揭露一種雙歧桿菌屬細菌或其混合物在製造用於治療哺乳動物肥胖、控制體重增加及/或減少體重損失的食物、膳食添加劑或藥物中的用途。

根據本發明的另一方面，本發明揭露一種一種組合物，包括(1)寄存號為BCRC 910746的假小鏈雙歧桿菌C95菌株，將C95菌株的基因組設計為參照基因組；(2)高度相似的菌株，其中該高度相似的菌株包括被設計為查詢基因組(query genome)的基因組，其中當比對時，查詢基因組覆蓋參照基因組的至少86%，在比對區域中，查詢基因組與參照基因組具有至少98.7%的序列一致性；或者(3)由其衍生的一種菌株；(4)藥學上可接受的載體或膳食載體。

根據本發明的另一方面，本發明揭露一種用於製備本發明的上述組合物的方法，包括：將假小鏈雙歧桿菌C95菌株或者該高度相似的菌株配製成合適的組合物。

根據本發明的另一方面，本發明揭露一種用於預防及/或治療疾病的方法，該疾病選自超重、肥胖、高血糖症、糖尿病、脂肪肝、血脂異常、代謝綜合症、與肥胖或超重相關的感染及/或脂肪細胞肥大，該方法包括將本發明的所述組合物投與至所需患者。

根據本發明的另一方面，本發明揭露一種減少所需患者中單純性或遺傳性肥胖、減輕代謝惡化、或減少炎症和脂肪堆積的方法，該方法包括將本發明的所述組合物投與至所需患者。

根據本發明的另一方面，本發明揭露一種用於建立基礎菌種的方法，該基礎菌種限定健康腸道生態系統的結構，使得腸道環境不利於病原菌和有害細菌生長，與空白對照組相比，降低腸內容物中腸桿菌的濃度，該方法包括將本發明的所述組合物投與至所需患者。

根據本發明的另一方面，本發明揭露一種用於治療所需患者中糖尿病的方法，該方法包括將本發明的所述組合物投與至所需患者。

圖1A示出了經過30天的干預後，SO組人群的平均體重較其初始體重下降9.5±0.4%(平均值±S.E.M)，並且PWS組人群平均體重較初始體重下降7.6±0.6%。

圖1B示出了血液中天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和穀丙轉氨酶(ALT)水平降低，說明肝臟疾病改善。

圖1C示出了糖代謝改善，表明更好的胰島素敏感性。

圖1D示出了血液中總膽固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)的水平下降。

圖1E示出了膳食干預30天後，在PWS和SO組人群中，幾個全身性炎症的指標也改善了，包括C反應蛋白(CRP)、血清澱粉樣蛋白A(SAA)、α-酸性糖蛋白(AGP)及 白細胞計數(WBC)。

圖2A示出了小鼠在移植後的4天保持體重，然後恢復正常生長。

圖2B示出了接受干預前微生物菌群的小鼠的脂肪量占體重的百分比明顯較高。

圖2C示出了接受干預後微生物菌群的小鼠的脂肪細胞不隨時間變化。

圖2D至圖2F示出了肝臟、迴腸和結腸中的TNFα、IL6和TLR4基因表達的RT-qPCR。

圖3A和圖3B示出了對兩類人群干預30天後，基於BRAY-CURTIS相異性，對376個細菌CAG進行主成分分析表明，兩組的腸道菌群的組成顯示顯著變化(PCoA，多變數方差分析(MANOVA)檢驗，P=2.17E-6)。

圖3C示出了WARD聚類演算法和PERMUTATIONAL MANOVA(9999排列，P<0.001)基於引導程式斯皮爾曼相關係數把這些細菌CAG分到18個共同豐度菌種/菌株(CAS)組。

圖3D示出了在菌株水平與CAS水平，普魯克分析與宿主生物臨床變數的一致性。

圖3E示出了6個CAS，包括含有最主要的菌種Prevotellacopri的CAS13，在干預後不改變其豐度(資料未顯示)。CAS1、CAS3和CAS4在干預後豐度顯著增加；而CAS7、CAS8、CAS11、CAS12、CAS14、CAS15、CAS16、CAS17和CAS18在干預後豐度下降。

圖4A和圖4B示出了所有的KO的PCA得分圖，這些圖示出了干預後的顯著變化。

圖4C示出糞懸液的代謝分析，表明干預後腸道中從脂肪和蛋白質發酵到碳水化合物發酵代謝變化與鑒定的KEGG通路的變化一致。

圖5示出干預後腸道菌群的基因豐富度減少。調整至2800萬的基因計數變化映射PWS和SO患者中的每一樣本的讀數。數據為平均值±S.E.M。威氏配對符號秩次檢驗法(雙尾)用於PWS或SO兒童中的每一成對比較。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

圖6示出了腸道菌群的結構變化與改善的生物醫學參數顯著相關。普魯克分析將376個細菌CAG的PCoA(具有實體符號的線端)與出現在圖1中的生物臨床變數PCA(不具有實體符號的線端)結合起來(基於佈雷-柯帝士距離)。對於PWS組，n=17，在第0、30、60和90天；對於SO，n=21，在第0天和n=20，在第30天。

圖7示出了在飲食干預後，總的糞便細菌減少。qPCR用於測量糞便細菌的16S rRNA基因中V3區的拷貝數。數據為平均值±S.E.M。威氏配對符號秩次檢驗法(雙尾)用於分析PWS或SO兒童中每兩個時間點之間的變化。曼-惠特尼U檢驗(雙尾)用於分析在基線或干預後30天時PWS和SO兒童之間的變化。*P<0.05,**P<0.01。對於PWS，n=17；對於SO，n=21。

圖8示出了與干預前相比，隨著干預的進行，帶HA1、 HA7和HA12顯著富集，並且在105天時成為主條帶。

本發明發現了假小鏈雙歧桿菌菌株可以減少哺乳動物單純或遺傳性肥胖、減輕代謝惡化、以及減少炎症和的脂肪堆積。本發明的假小鏈雙歧桿菌單獨或與其它益生菌微生物聯用時，在腸道中作為基礎菌種發揮功能，該基礎菌種例如通過使得腸道環境不利於病原菌和有害細菌生長，可能地通過增加醋酸產量來限定健康腸道生態系統的結構。

如下文中更詳細地描述，本發明的假小鏈雙歧桿菌分離於接受了醫院干預的患者，這些患者以先前公開的基於全菌株、傳統的中國藥膳和益生菌的飲食(WTP飲食)干預105天(肖水明等，A gut microbiota-targeted dietary intervention for amelioration of chronic inflammation underlying metabolic syndrome.FEMS Microbiol Ecol87,357(2月，2014))。這些患者，經過30天的膳食干預後，遺傳和簡單性肥胖兒童代謝惡化以及遺傳和單純性肥胖均得到了顯著減輕。

如下面的實例所述，本發明人結合傳統的微生物分離方法、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、ERIC-PCR、16S rRNA基因測序，和全基因組等技術，成功地獲得了大量的本發明的基礎菌株，經鑒定為假小鏈雙歧桿菌。分離出的一種代表性菌株C95於2015年2月9日存放在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，登記號CGMCC10549。

在一個實施例中，本發明所有益生菌菌株的基因組中包括，與C95基因組相比，至少81%、較佳地至少88%，更佳地至少88.5%的覆蓋率。此外，匹配序列具有至少98.5%的序列一致性，較佳地至少99%的序列一致性。

本發明的益生菌菌株可以被培養、保存和繁殖，使用本領域普通技術人員公知的已建立的方法，其中一些方法在下面舉例說明。

本發明中用的微生物為假小鏈雙歧桿菌菌株或與其他微生物的其混合物。較佳地，在本發明中使用的雙歧桿菌菌株是假小鏈雙歧桿菌C95菌株。

該微生物可以以任何本文所描述的能夠發揮功能的形式被利用，較佳地，該微生物是活性菌。

細菌可以指整個細菌或者也可以是細菌組分。例如，這樣的組分包括細菌細胞壁組分(如肽聚糖)、細菌的核酸(如DNA和RNA)、細菌細胞膜組分和細菌的結構組分(如蛋白質、碳水化合物、脂類和它們的組合，如脂蛋白、糖脂和糖蛋白。

細菌也可包括或被替代為細菌代謝物。在本說明書中，術語“細菌代謝物”包括細菌在生長、存活、持久生存、運輸或存在過程中、在益生菌產品生產和儲存過程中以及在哺乳動物的胃腸傳輸過程中由細菌(益生菌)生產或修飾的、作為細菌代謝的結果的所有分子。細菌代謝物的實例包括各種有機酸、無機酸、鹼、蛋白質和多肽、酶和輔酶、氨基酸和核酸、碳水化合物、脂類、糖蛋白、脂蛋白、糖 脂、維生素，所有的生物活性化合物，含有無機成分的代謝產物，和所有的小分子，例如氮分子或含有亞硫磺的分子。較佳地，該細菌包括整個細菌，更佳地，包括整個活菌。

較佳地，根據本發明使用的雙歧桿菌適用於人類及/或動物利用吸收。在本發明中，使用的雙歧桿菌可以是同一類型的菌種和菌株或可以包括多種菌種及/和菌株的混合物。

合適的雙歧桿菌選自菌種乳酸雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、假小鏈雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和角形雙歧桿菌以及它們的混合物。

如下面的例子所述，黏膜乳桿菌，尤其是那些與黏膜乳桿菌高度相似的32號菌株，在膳食干預後顯著上升。因此，與本發明的假小鏈雙歧桿菌菌株組合使用的一個較佳菌是黏膜乳桿菌，尤其是32號菌株。

在一個實施例中，本發明所使用的細菌是一種益生菌。在本說明書中，術語“益生菌”被定義為當以足夠量的被宿主活性攝入後產生健康效應的任意非致病細菌。這些益生菌菌株一般能夠在消化道的上部運輸中存活下來。他們是非致病性、無毒，並且對健康發揮它們的益生效應的方式之一是通過與消化道中的常駐菌進行生態相互作用，另一方式是通過“GALT”(腸道相關淋巴組織)以積極的方式通過它們的能力來影響免疫系統。根據益生菌的定義， 這些細菌，當給予足夠的數量，有能力通過腸道並保持活性，然而，它們不能穿過腸屏障，其主要作用於胃腸道腔及/或胃腸道壁。然後，它們在攝入期間逐漸形成腸道菌群常駐菌種的部分。這種定植(或短暫的定植)使益生菌發揮有益的作用，如抑制存在於菌群中的潛在的致病微生物和與腸道中的免疫系統相互作用。

在一些實例中，在本發明中，將雙歧桿菌與乳桿菌屬細菌聯用。根據本發明，雙歧桿菌及乳酸桿菌的組合在某些實例中表現出協同效應(亦即，效應大於單獨使用時細菌的累加效應)。例如，該組合，除了具有作為單一組分對哺乳動物的效果外，還可以具有對組合的其他組分的有益效果，例如，通過生成代謝物，該代謝物進而被該組合的其他組分用作能量源或通過保持有利於其他組分的生理條件。

通常情況下，乳桿菌屬細菌選自菌種嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、開菲爾乳桿菌、雙歧乳桿菌、短乳桿菌、瑞士乳桿菌、副乾酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌，唾液乳桿菌、彎曲乳桿菌、保加利亞乳桿菌、清酒乳酸桿菌、羅伊氏乳桿菌、發酵乳桿菌、香腸乳桿菌、乳酸桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、類植物乳酸桿菌、捲曲乳桿菌、格氏乳桿菌、約氏乳桿菌、詹氏乳桿菌和它們的任意組合。

在較佳的實施例中，在本發明中所使用的乳桿菌屬細菌是一種益生菌。較佳地，在本發明中使用的乳桿菌屬細菌是菌種嗜酸乳桿菌。

用量和食用

益生菌可以通過任何有可能將微生物引入消化道的方式來攝入體內。該細菌可以與載體混合，並且應用於液體或固體飼料或應用於飲用水。載體材料應是對細菌和動物都無毒的。較佳地，該載體含有一種在儲存期間促進細菌的活性的成分。細菌也可以配製成膏狀菌劑以便直接注射至動物口腔。該製劑可以包括添加成分以改善風味、提高儲存壽命，賦予營養功效等。如果有可重複的和測量的劑量要求，細菌可以通過瘤胃插管飼餵。被攝入的益生菌的數量受影響療效的因素支配。當以飼料或飲用水的形式攝入益生菌時，劑量可以在一段時間內或者甚至數周內持續。連續數日的較低劑量注射的累積效應可以大於單個更大的劑量。通過監測攝入優勢益生菌前期、中期、後期的糞便中引起人類沙門氏菌病的沙門氏菌的數量，本領域技術人員可以很容易地確定減少引起人類沙門氏菌病的沙門氏菌菌株所需的益生菌用量水平，其中，沙門氏菌病由動物攜帶。一種或多種優勢益生菌的菌株可以一起攝入。多種菌株的組合可能是有利的，因為個別動物可能會包含不同的菌株，這是最持久的攝入方式。

根據本發明使用的假小鏈雙歧桿菌濃度可以包括從10⁶ 到10¹² 細菌CFU/g載體，尤其是從10⁸ 到10¹² 細菌CFU/g載體，對於凍乾形式較佳地10⁹ 至10¹² CFU/g。

假小鏈雙歧桿菌的最適攝入劑量為從約10⁶ 到約10¹² CFU的微生物/劑量，較佳地，從約10⁸ 至約10¹² CFU 的微生物/劑量。術語“每劑量”一詞意味著這一量的微生物被提供給一個宿主，無論是每天或每次，最好是每天。例如，如果微生物是以食品形式攝取(例如，以優酪乳形式)，然後優酪乳較佳地含有從約10⁸ 至10¹² CFU的微生物。另外，常常這種微生物數量可以被分成多次攝入，每次攝入由較小量的微生物負荷組成，只要在任何特定時間(例如每24小時)宿主接受的微生物總量是從約10⁶ 到約10¹² CFU的微生物即可，較佳地，從10⁸ 到約10¹² CFU的微生物。

根據本發明，至少一種微生物菌株的有效量可以是至少10⁶ CFU的微生物/劑量，較佳為從約10⁶ 到約10¹² CFU的微生物/劑量，較佳約10⁸ 至約10¹² CFU的微生物/劑量。

在一個實施例中，對假小鏈雙歧桿菌菌株的攝入劑量從約10⁶ 至約10¹² CFU的微生物/天，較佳地，約10⁸ 至約10¹² 個CFU/天。因此，在本實施例中的有效量可從10⁶ 到10¹² 個CFU/天，最好為10⁸ 至約10¹² 個CFU/天。

CFU指“菌落形成單位”。“載體”是指食物產品、膳食補充劑或藥學上可接受的載體。

當將本發明中的雙歧桿菌與其他益生菌聯用時，細菌可能以任意能夠達到此處描述的本發明的預期效果的比例存在。

患者/藥物指標

假小鏈雙歧桿菌菌株給予哺乳動物，例如，包括牲畜(包括牛、馬、豬、雞和羊)和人類。在本發明的一些方面 中，哺乳動物是可以是伴侶動物(包括寵物)，例如狗或貓。在本發明的一些方面中，受試者可以是人。

假小鏈雙歧桿菌菌株可能適合於治療哺乳動物(特別是人)的一些疾病或症狀。在說明書中，術語“治療”是指本發明的假小鏈雙歧桿菌的任何攝入可以(1)防止哺乳動物中特定疾病的發生，該特定疾病可能是疾病的易感人群，但是還沒有經歷或顯示病理或症狀(包括一個或多個的與疾病相關的危險因素的預防)；(2)抑制哺乳動物中正在經歷或顯示疾病病變或症狀的疾病或(3)改善哺乳動物中正在經歷或顯示疾病病變或症狀的疾病。

本發明的假小鏈雙歧桿菌菌株適用於給予同時患有糖尿病和肥胖的哺乳動物。它們也適用於患有糖尿病和非肥胖的哺乳動物以及擁有糖尿病風險因數但不是糖尿病狀態的肥胖哺乳動物。這方面在下面更詳細地討論。

如更詳細的以下實例描述，本發明的假小鏈雙歧桿菌菌株具有多種生物學活性。特別是，在本發明中使用的雙歧桿菌可使哺乳動物中胰島素的敏感性正常化、增加聯儲胰島素的分泌、降低空腹胰島素分泌、改善糖耐量。這些影響賦予假小鏈雙歧桿菌菌株用於治療糖尿病和糖尿病相關的症狀(特別是2型糖尿病和糖耐量受損)的潛力。

此外，在本發明中使用的假小鏈雙歧桿菌菌株能誘導減肥和降低身體脂肪含量(尤其是腸系膜脂肪)。這些影響賦予假小鏈雙歧桿菌菌株用於治療哺乳動物肥胖和控制體重增加及/或誘導減肥的潛力。

特別是，如在以下實例中更詳細地描述的，根據本發明通過將乳酸菌(尤其是嗜酸乳桿菌細菌)與雙歧桿菌聯用能夠誘導減肥和降低身體脂肪含量(尤其是腸系膜脂肪)。這些影響賦予其用於治療哺乳動物的肥胖和控制體重增加及/或誘導減肥的潛力。

在本說明書中，肥胖與體重指數相關(BMI)。體重指數(BMI)(體重公斤數除以身高米數平方得出)是最常被接受的超重及/或肥胖的測量方法。BMI超過25被認為是超重；肥胖被定義為體重指數為30或更多；BMI為35或更多的被認為是嚴重的肥胖合併症；以及和BMI為40或以上被認為是病態肥胖。

如上文所指出的，如本文中所使用的“肥胖”一詞包括肥胖、肥胖合併症和病態肥胖。因此，在這裡使用的術語“肥胖”可能被定義為具有BMI超過或等於30的患者。在一些實例中，合適的肥胖患者可具有大於或等於30、合適地35、合適地40的體重指數。

雖然本發明的組合物特別適合於糖尿病和肥胖患者，但是該組合物也適用於那些患有糖尿病但不肥胖的患者。它還可以適用於擁有糖尿病風險因數但是並非糖尿病狀態的肥胖患者，可以預期的是，肥胖的人(但無糖尿病)，該組合物可能會限制他的肥胖對代謝的影響，亦即，限制糖尿病或至少胰島素抗性發展。

此外，在本發明中使用的雙歧桿菌可用於治療哺乳動物中的代謝綜合症。代謝綜合症是一種組合的醫療失調 症，伴隨著增加患心血管疾病和糖尿病的風險。代謝綜合症也被稱為代謝綜合症X、X綜合症、胰島素抵抗綜合症、Reaven綜合症或CHAOS(澳大利亞)。

遺傳性肥胖

在進一步的實例中，在本發明中使用的雙歧桿菌(以及，如果存在的話，乳酸桿菌)可用於降低哺乳動物組織炎症(特別是，但不僅僅是，肝組織炎症、肌肉組織炎症及/或脂肪組織炎症)。

根據本發明，通過使用雙歧桿菌(以及，如果存在的話，乳酸桿菌)可治療的心血管疾病的實例包括動脈瘤、心絞痛、動脈粥樣硬化、腦血管意外(中風)、腦血管疾病、充血性心力衰竭(CHF)、冠心病、心肌梗塞(心臟病發作)和外周血管疾病。

在本發明的範圍內，任意實例可以結合在本發明，包括在本發明的任何特徵組合中。特別是，它的設想是在任何領域，本細菌的治療作用可能伴隨產生。

組合物

根據本發明，單獨食用發明中的假小鏈雙歧桿菌(亦即沒有任何載體、稀釋劑或賦形劑)時，本發明的假小鏈雙歧桿菌菌株通常和較佳地作為產品的部分在載體上或在載體中的形式給予，特別是作為食物產品、膳食補充劑或藥物製劑的組分。這些產品通常含有本領域普通技術人員公知的附加組分。

任意受益於該組分的產品可被用於該發明。這些包括但不限於食品(特別是水果蜜餞、乳製品和乳製品的衍生產品)以及醫藥產品。本發明的假小鏈雙歧桿菌菌株在本文中可以稱為該“本發明的該組合物”或“該組合物”。

食品

在一個實例中，本發明的假小鏈雙歧桿菌應用於食品中，如食物添加劑、飲料或牛奶粉。在這裡，術語“食物”用於廣泛意義中，並且包括為用於人類食用的食物以及用於動物的食物(亦即，飼料)。在較佳的方面中，該食物是用於人類消費的。

食品以溶液或固體的形式出現，取決於用途及/或應用模式。使用時，或在食品的製備時，如功能性食品，本發明的組合物可與以下列舉的一種或多種結合使用：營養可接受的載體，營養可接受的稀釋劑、營養可接受的賦形劑、營養可接受的輔料、營養活性成分。

例如，本發明的組合物可以作為軟飲料、果汁或含有乳清蛋白的飲料、保健茶、可可飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、優酪乳、飲用優酪乳、乳酪、霜淇淋、刨冰、甜點、糖果蛋糕、餅乾蛋糕和蛋糕粉、休閒食品、均衡的食物和飲料，水果餡料、保健釉、巧克力麵包餡、芝士蛋糕味夾心餅餡、水果味蛋糕餡、蛋糕和炸圈餅結冰、即時麵包填充膏、曲奇餅餡料、隨時可用的麵包餡、減少熱量的餡、成人營養飲料、酸化大豆/果汁飲料、無菌/殺菌巧克力飲 料、酒吧調拌料、飲料粉末、鈣強化的大豆/平原巧克力牛奶、鈣強化咖啡飲料的組分。

該組合物還可以用作食品的成分，食品如美國乳酪醬、磨碎和切碎乳酪的防結塊劑、薯條醬、奶油乾酪、乾混合植脂奶油無脂優酪乳、冷凍/解凍乳製品奶油、凍融穩定劑、低脂肪和自然乾酪、低脂瑞士風格的優酪乳、充氣冷凍甜品、硬盒霜淇淋、標籤友好、改進的經濟型與嗜好型的硬包裝霜淇淋、低脂霜淇淋、燒烤醬、乳酪蘸醬、乳酪醬、乾拌阿爾弗雷多醬、混合乳酪醬、乾拌番茄醬以及其他食品。

如本文中使用的術語“乳製品”意在包括動物及/或蔬菜來源的乳製品。作為動物來源的乳製品，可以源自奶牛、綿羊、山羊或水牛的奶。作為植物來源的乳製品，可以來源於蔬菜的根據本發明可以使用的任何可發酵的物質，特別是從大豆、大米或穀物而來的。

在某些方面，較佳地，本發明可用於與優酪乳生產相關，如發酵優酪乳飲料、優酪乳、飲用優酪乳、乳酪、發酵乳、牛奶基甜點和其他。

適當地，該組合物可作為一種成分用於一種或多種乳酪應用中、肉類應用中，或用於包含保護性培養物的應用中。

本發明還提供一種製備食品或食品成分的方法，該方法包括將根據本發明的組合物與另一食品配料成分混合。

有利的是，本發明關於已經接觸了本發明的組合物(以及任選地添加了其他組分/成分)的產品，其中本發明組分在其中的用量能提高產品的營養及/或健康效果。

如本文中使用的術語“接觸”是指本發明的組合物間接或直接應用於產品中。可以使用的應用方法的實例，包括但不限於，包括以該組合物的材料處理產品、通過將該組合物與產品混合來直接應用、將組合物噴塗到產品表面或將該產品浸到該組合物的製劑中。

本發明的產品是一種食品，本發明的組合物是優先混合於產品中的。另外，該組合物可包括在食品的乳液或原料成分中。在進一步的替代物研究中，該組合物可作為調味品、釉、著色劑混合物等來應用。

本發明的組合物可以可控量的微生物用於點綴、塗覆及/或浸漬產品。

較佳地，該組合物用於發酵奶或蔗糖強化牛奶或具有蔗糖及/或麥芽糖的乳酸媒介，其中，這些媒介包含組合物的所有組分，亦即，根據本發明的該微生物，可以作為一種成分以適宜濃度(例如，以在最終產品中提供每日劑量10⁶ -10¹⁰ CFU的濃度)添加到優酪乳牛奶中。根據本發明的微生物可以在優酪乳發酵之前或者之後使用。

對於某些方面，根據本發明的微生物被用作或者用於製備動物飼料(例如家畜飼料，特別是家禽(如雞)飼料)或寵物食品。

有利的是，如果產品是食品產品，那麼本發明的假小鏈雙歧桿菌菌株應該通過正常的“出售”或“保質期”內由零售商銷售的為有效產品。較佳地，有效時間應該延伸到正常的新鮮時期結束時食品變質變得明顯時。理想的時間和正常的保質期的長度根據不同的食品而會有所不同，並且本領域普通技術人員將會意識到取決於食品類型、食品大小、儲存溫度、加工條件、包裝材料和包裝設備而會有差異。

食品成分、食品補充劑和功能性食品

本發明的組合物可作為食品成分及/或飼料成分。如本文中所使用的術語“食物成分”或“飼料成分”包括是或者可以作為營養補充劑添加到功能性食品或食品中的配方。食物成分可能是以溶液的形式或是固體的形式，取決於用途及和/或應用模式及/或攝入模式。

本發明的組合物可以是，或可以添加到食品補充劑(也被稱為膳食補充劑)中。

本發明的組合物可以為，或可以添加到功能性食品中。如本文中所使用的，術語“功能性食品”指的是食品不僅能夠提供營養作用，而且還能夠為消費者提供進一步的有益效果。

因此，功能性食品是一種普通的食物，它們具有組分或原料(如本文描述的這些)納入它們，從而賦予食物特定的功能，例如，醫療或生理益處，而不是一個純粹的營養作用。一些功能性食品是保健品。在這裡，術語“保健品” 是指能夠不僅能提供營養作用及/或口味滿意，也能對消費者提供治療(或其他有益的)的影響。保健品橫跨食品和藥品之間的傳統分界線。

藥劑

如本文中使用的術語“藥劑”涵蓋人和獸醫學上人和動物使用的藥劑。此外，如本文中使用的術語“藥劑”指的是提供了一種治療及/或有益的效果的任何物質。如本文中使用的術語“藥劑”不局限於需要市場認可的物質，但可能包括可用於化妝品、保健品、食品(例如包括飼料和飲料)、益生菌培養物和自然療法的物質。此外，如本文中使用的“藥劑”包括設計為摻入在動物飼料中的一種產品，例如家畜飼料及/或寵物食品。

藥物

本發明的組合物可用於製備或製備藥物。在這裡，術語“藥物”用於廣泛的意義上，並且涵蓋了用於人類的藥物和用於動物的藥物(亦即獸醫應用)。在較佳的方面中，該藥物是用於人類使用及/或畜牧業。該藥物可用於治療目的，這可能在本質上是治療劑或緩解劑或預防劑。該藥物甚至可以用於診斷目的。

藥物上可接受的載體可以是例如壓縮片、片劑、膠囊、藥膏、栓劑或可飲用液體的形式的載體。其他合適的形式在下文中提供。

當作為或者製備藥物時，本發明的組合物可與以下物質中的一種或多種聯用：藥學上可接受的載體、藥學上可 接受的稀釋劑、藥學上可接受的賦形劑、藥學上可接受的輔料、藥物活性成分。藥物的形式可能是溶液或是固體形式，取決於用途及/或應用模式及/或攝入模式。

製備這些形式的營養可接受的載體的實例包括：例如，水、鹽溶液、酒精、矽、蠟、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂質體、糖、明膠、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、滑石粉、表面活性劑、矽酸、黏性蠟、香料油、脂肪酸單甘酯和甘油二酯、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。

作為水性懸浮液及/或酏劑，本發明的組合物可結合各種甜味劑或調味劑、色素或染料、可結合乳化劑及/或懸浮劑以及結合稀釋劑，如水、丙二醇、甘油及其組合。形式也可以包括明膠膠囊、纖維膠囊、纖維片等形式，或者甚至纖維飲料和酒水。進一步的形式的實例包括霜。對於一些方面，在本發明中所使用的微生物，可用於藥物及/或化妝品的藥膏，如防曬霜及/或防曬修復。

益生元聯用

本發明的組合物還可以額外地包含一種或多種益生元。益生元是一類功能性食品，定義為不易消化的食物成分，通過選擇性地刺激結腸內細菌的生長及/或活性或者限制結腸內細菌的數量而對宿主產生益生作用，從而提高宿主健康。通常，益生元是碳水化合物(如低聚糖)，但該限定不排除非碳水化合物。益生元最普遍的形式是營養性可 溶性纖維。在某種程度上，許多形式的膳食纖維表現出一定程度的益生作用。

在一個實例中，益生元是一種選擇性發酵成分，該成分允許胃腸道菌群結構的組成及/或活性的特定變化，對宿主健康產生有益作用。

適宜得，根據本發明的益生元可以按照0.01至100克/天的用量使用，較佳是0.1到50克/天，更佳為0.5至20克/天。在一個實施例中，根據本發明，益生元可以以1到100克/天的量使用，較佳是2到9克/天，更佳是3至8克/天。在另一個實施例中，根據本發明，益生元可以以5至50克/天的用量使用，較佳是10到25克/天。

益生元的膳食來源的實例包括大豆、糖源(如菊芋、豆薯、和菊苣根)、粗燕麥、未純化大麥、未純化小麥和雪蓮果。合適的益生元的實例包括藻酸鹽、黃原膠、果膠、刺槐豆膠(LBG)、菊糖、瓜爾豆膠、低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、聚葡萄糖(亦即利體素.RTM.)、乳糖、低聚乳果糖、大豆低聚糖、異麥芽酮糖(帕拉金糖.TM.)、異麥芽低聚糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、甘露寡糖、β-葡聚糖、纖維二糖、棉子糖、龍膽二糖，蜜二糖、木二糖、環糊精、異麥芽糖、海藻糖、水蘇糖、潘糖，普魯蘭多糖，毛蕊花糖、半乳甘露聚糖和一切形式的抗性澱粉。一個特別較佳的益生元的實例是聚葡萄糖。

在一些實例中，本發明的假小鏈雙歧桿菌菌株與益生元的組合在某些應用中表現出協同效應(亦即，效應大於單獨使用時的細菌的累加效應)。

實例

實例1膳食改善單純性和遺傳性肥胖

1. 飲食干預緩解遺傳和單純性肥胖、改善單純性或遺傳性肥胖患者的臨床指標

WTP膳食(14)用於對具有PWS或SO的病態肥胖兒童實施的醫院干預研究。兩個人群(SO單純性肥胖組，n=21，平均年齡10.52歲(在3~16歲範圍內)；PWS組，N=17，平均年齡9.26歲(在5~16歲範圍內))年齡間無顯著差異(未示出資料)。所有人群接受醫院干預30天。由於患者需求，PWS人群繼續干預另外60天。一個志願者(GD02)在醫院285天。在膳食干預期間，在兩個人群中兒童膳食攝入總熱量與干預前的膳食相比，減少約30%；攝入的蛋白維持在所消耗的總千卡的13~14%。PWS組攝入的碳水化合物的總卡路里數從52%上升到62%；SO組碳水化合物的總卡路里數從57%上升到62%。碳水化合物的形式從起初的水稻和小麥全粉變成全穀物。在PWS組攝入的脂肪的總卡路里數從34%下降到20%和SO組攝入的脂肪的總卡路里數從30%下降到20%。最實質的變化是PWS組每天攝入的總膳食纖維從6g上升到49g；SO組每天攝入的總膳食纖維從9g上升到51g(資料未顯示)。人體測量和血液代謝面板測試被用來跟蹤變化。

所有相關生物臨床指標顯示，經過30天飲食干預後，遺傳和單純性肥胖兒童代謝惡化顯著緩解(圖1)。經過30天的干預，SO組人群平均體重較初始體重下降9.5±0.4%(平均值±SEM)；PWS組人群平均體重較初始體重下降7.6±0.6%(圖1A)。PWS和SO組兒童的代謝健康指標顯著改善(資料未顯示)。天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、穀丙轉氨酶(ALT)在血液中的水平降低，說明肝臟情況改善(圖1B)。糖代謝改善，顯示更好的胰島素敏感性(圖1C)。血液中總膽固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)的水平下降(圖1D)。PWS組經過兩個多月的WTP的飲食干預後，他們一共損失了18.3±1%的初始體重，一些代謝指標持續改善(圖1A-D)。此外，PWS組顯示整體攝食過量行為得到了適度的改善(資料未顯示)。GD02在醫院285天後，體重從140.1公斤減小降低到83.6公斤。然後他繼續在家進行430天的膳食干預並且減少到73kg。他的所有代謝參數都是正常範圍(資料未顯示)。因此，這個延長的膳食干預可明顯減輕人類遺傳性肥胖中的代謝惡化，其中飲食引起的體重減輕可以媲美胃旁路手術可達到的效果(18)。

膳食干預後30天，幾個全身性炎症的生物指標也改善了，包括C反應蛋白(CRP)、血清澱粉樣蛋白A(SAA)，α-酸性糖蛋白(AGP)及白細胞計數(WBC)(圖1E)。脂聯素水平和抗炎脂肪因數增加、瘦素下降表明高危型症狀的緩解(19)。脂多糖結合蛋白(LBP)是血液中的細菌內毒素的替代標記(20)，也下降(圖1E)。由於內毒素和其產生菌已經完 全與肥胖和胰島素抵抗的發展機械聯繫在一起(15，21)，在PWS和SO組兒童中減少的內毒素負荷和炎症說明干預後兩組人群具有更健康的腸道菌群，其產生了更低的促炎症因數，比如內毒素。

2. 移植干預後腸道菌群誘導的小鼠炎症減輕和脂肪沉積減少

比較干預之前和之後腸道菌群誘導代謝惡化的能力， 我們把來自同一個PWS志願者(GD58)干預前(0天)和干預後(90天)的腸道菌群移植到無菌野生型C57BL/6J小鼠。老鼠接受了干預前的人類糞便菌群，移植後的頭兩個星期期間顯示體重明顯減少，暗示移植的毒性，然後在接下來的兩個星期恢復失去的體重。接受干預後人類糞便菌群的小鼠沒有減少體重。相反，他們移植後的4天保持體重，然後恢復正常生長(圖2A)。有趣的是，儘管在試驗結束時接受干預前的微生物菌群的小鼠的總體重仍明顯低於接受干預後移植的的小鼠的總體重，移植干預前微生物菌群小鼠的脂肪量占體重的百分比卻明顯高於後者(圖2B)。附睾脂肪墊的組織學檢查發現，移植後2周，接受了干預前的腸道微生物菌群的小鼠的脂肪細胞的平均細胞面積顯著小於干預後腸道菌群接受者的脂肪細胞的平均細胞面積，對微生物菌群的毒性一致，但在試驗結束時顯著增加。接受干預後微生物菌群的小鼠脂肪細胞不隨時間變化(圖2C)。通過RT-qPCR測量移植後2周的小鼠肝臟、迴腸和結腸的TNFα、IL6和TLR4基因表達發現，在移植干預前腸道菌 群的接受者的初始重量損失與更高的炎症反應高度相關(圖2D-F)。這些資料表明，PWS患者干預前的腸道菌群確實比干預後的腸道菌群具有更大的引起小鼠炎症及脂肪沉積的能力。

飲食干預有助於假小鏈雙歧桿菌成為腸道菌群的基礎益生菌

幾種腸道菌群的結構模式與肥胖有關，如高的厚壁菌門/擬桿菌門比例和低基因豐度，但腸道菌群的具體相關成員以及它們與肥胖發展和相關代謝惡化相關的功能的相互作用需要進一步鑒定(17，22-25)。

為了確定腸道菌群的整體結構在飲食干預過程中如何調製，我們對兩類人群的糞便樣品進行了鳥槍宏基因組測序，使用最近開發的“華蓋”演算法進行資料分析。在複雜的巨集基因組樣本資料中，基於在整個複雜的宏基因組樣品中由相同的基因組DNA分子編碼的兩種基因的豐度會彼此高度相關的事實，這將個體基因分為不同的共豐度基因(CAG)組(26)。在具有足夠的測序深度的情況下，讀取一個CAG可以組裝成一個基因組草圖，這使得我們能夠實施膳食干預引起的微生物菌群變化的特定基因分析和菌株水平分析。

使用Illuminahiseq 2000平臺，我們的110個糞便樣本(21個SO患者0天和30天的樣本；17個PWS患者0、30、60、90天的樣本)進行鳥槍巨集基因組測序。從每個樣本中獲得平均76.0±18.0百萬(均值±標準差)的高品質、末端 配對序列，用來從頭組裝和基因預測(資料未顯示)。2077766條微生物基因的非冗餘基因目錄被構建。使用對於相關係數(>0.9)具有高截止以使得CAG的基因來自相同的基因組的幾率最大化的“華蓋”演算法(canopy-based algorithm)，將這兩百萬條基因劃分到28072個CAG(26)。各自具有大於700條基因的376個CAG被認為是不同菌株的細菌基因組，占所識別基因的36.4%(775515)。在376個CAG中，我們集中於對其中161個CAG進行後續分析，161個CAG被至少20%的樣本所公有。161個代表性CAG組裝成基因組草圖，和118個組裝基因組滿足用於標準參照基因組的人類微生物組計畫的六項品質標準中的至少5個。(資料未顯示)。其中50個組裝基因組與已知的參照基因組比對覆蓋率為80%以上和解析度為95%以上(資料不顯示)。10個菌種具有不止一個組裝基因組草圖，例如，柔嫩梭菌群具有9個組裝基因組，並且挑剔真桿菌具有5個組裝基因組，從而顯示出這些菌種中的菌株水平多樣性。

對兩類人群干預30天後，基於Bray-Curtis相異性，對376個細菌CAG進行主成分分析表明，兩組的腸道菌群的組成顯示顯著變化(PCoA，多變數方差分析(MANOVA)檢驗，P=2.17e-6)(圖3A和圖3B)。PWS和SO的腸道菌群在干預前(P=0.99)和干預後(P=0.8)無顯著性差異，這表明PWS和SO組在干預前都有相似的生態失調並且這種干預對PWS和SO組具有同樣的效果(圖3B)。分析其他β多樣性矩陣和16S rRNA基因的V1-V3區域的焦磷酸 測序證實了類似的發現(資料未顯示)。另一方面，干預後腸道菌群的基因豐富度明顯減少(圖5)。更重要的是，將生物臨床變數PCA與376個細菌CAG(圖3A)的PCoA結合起來的普魯克分析(資料未示出)表明，基於細菌CAG的豐度的腸道菌群的結構變化與PWS和SO人群的生物臨床參數的變化顯著相關，所以暗示在細菌菌株水平上的整體結構變化深度與宿主的代謝健康的改善顯著相關(M² =0.891，蒙特卡洛P值<0.0001)(圖6)

當菌種在其他生態系統如熱帶雨林，人類腸道中的細菌種群可以生存、適應並回應於環境擾動而功能組下降(27-29)。為了識別腸道生態系統中菌種/菌株根據分組對膳食干預的應答(30)，我們針對所有個體和時間點，基於161種代表細菌CAG，構建了一個共豐度網路圖。Ward聚類演算法和Permutational MANOVA(9999排列，P<0.001)基於引導程式斯皮爾曼相關係數把這些細菌CAG分到18個共同豐度菌種/菌株(CAS)組(圖3)。有趣的是，相同物種的不同菌株如普拉梭菌基因組被分為不同的CAS組，這表明同一物種的不同菌株可能佔據腸道生態系統中的不同的代謝環境。與分成不同CAS組的相同物種的菌株相比，同一個CAS組中的相同物種的菌株的基因組序列彼此更加相似，表明不同CAS組中的相同菌種的菌株的功能上可能是不同的(資料未顯示)。普魯克分析表明，分離在干預前和干預後基於CAS組豐度或基於宿主生物臨床變數，沿著PWS或SO組的資料集的第一軸被共分離，這表明各種 CAS豐度變化與宿主的代謝健康的改善顯著相關(M² =0.898，蒙特卡洛P值<0.0001)(圖3D)。在菌株水平與CAS水平，普魯克分析與宿主生物臨床變數的一致性(圖3D)表明，將人腸道菌群的代表菌株組織成共豐度組的這種策略，為瞭解其相互之間以及與宿主的功能作用提供了一個潛在的有用的框架。

組水平豐度分析表明6個CASs，包括含有最主要的菌種Prevotella copri 的CAS13，干預後不改變其豐度(資料未顯示)。CAS1、CAS3和CAS4在干預後豐度顯著增加；而CAS7、CAS8、CAS11、CAS12、CAS14、CAS15、CAS16、CAS17和CAS18在干預後豐度下降(圖3E)。CAS3與CAS8、CAS15、CAS16與CAS18呈現負相關(r>0.45，FDR<0.01=(圖3C)。膳食干預後CAS3成為最豐富的組。值得注意的是，在CAS3中的主要基因組是雙歧桿菌屬。雙歧桿菌利用許多各種不同的碳水化合物，其中有許多是來自植物的低聚糖和多糖。對於組裝CAG00184，干預後最豐富的基因，覆蓋參照基因組假小鏈雙歧桿菌DSM 20438的81.2%並且有98.6%的一致性(資料未顯示)。CAG00184基因組含有單糖、雙糖、寡糖、多糖的發酵途徑，以產生乙酸和乳酸(資料未顯示)。在WTP飲食中不消化的碳水化合物量大，因此可以提供良好的營養條件供CAG00184增殖。糖發酵物種如假小鏈雙歧桿菌A作為“基礎菌種”，通過使腸道環境不利於病原菌和有害細菌或通過醋酸生產的 增加來限定了不起的健康的腸道生態系統結構(28，31-33)。

從干預後患者糞便用PCR-DGGE技術指導分離假小鏈雙歧桿菌

基於全穀物，中國傳統藥膳和益生元，對17名PWS肥胖兒童進行飲食干預[10]。在干預過程中，17名兒童體重穩步下降，各種生理指標如空腹血糖、空腹胰島素水平也有顯著的改善。在干預過程中，來自17名PWS兒童的腸道菌群的組成呈現明顯的改變。腸道菌群的巨集基因組分析顯示，在飲食干預後，腸道內的雙歧桿菌顯著增加並成為優勢菌，且表現出與多種生理指標的改善呈正相關。本研究中的一名PWS肥胖兒童(GD02)接受了為期3個月的飲食干預後，體重大幅降低，血糖、血脂代謝相關的指標顯著改善。取該名PWS兒童干預過程中不同時間點的糞便細菌進行16S rRNA基因V3區PCR-DGGE指紋分析，以便為了觀察該名兒童腸道菌群組成的變化。在圖8中，與干預前相比，隨著干預的進行，帶HA1、HA7和HA12顯著富集，並且在105天時成為主條帶。在干預後的第二天，帶HA12已經成為主條帶之一(圖8)。測序結果顯示，以上三個主條帶的割膠測序結果分別為乳桿菌和雙歧桿菌(表1)。總之，在飲食干預過程中，隨著膳食的給予，乳桿菌和雙歧桿菌顯著增加並且逐漸變成該名PWS兒童腸道內的優勢菌。基於巨集基因測序數據的共豐度網路分析結果顯示，雙岐桿菌的豐度變化與多種其他菌種的豐度變化 呈負相關，指示雙岐桿菌可能是宿主健康狀況改善的關鍵菌種。

分離方法切取0.6g該名PWS兒童營養干預105天的糞便樣品，盛放於已添加了30ml Ringer工作液(0.1% L-半胱氨酸)的50ml無菌離心管。樣品於厭氧培養箱中渦旋震盪至充分混勻。200g離心5min，上清即為糞懸液。取1ml製備好的糞懸液，用Ringer(0.1% L-Cysteine)工作液進行梯度稀釋。製備好10-1-10--5的稀釋樣品，吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5這5個稀釋梯度的稀釋液各200μl分別塗布於MRS(de man,Rogosa,Sharpe)瓊脂平板。每個梯度重複塗布3塊，37℃厭氧條件下倒置培養18h。隨機挑取200個單菌落並且通過劃線成平板上的單個菌落而獲得純分離物。

168個分離物和親代糞便樣品的16S rRNA V3區PCR-DGGE分析。73個分離物的16S rRNA V3區的帶被遷 移到與原始糞便樣品中的帶HA12相同的位置，暗示我們已經從干預後糞便樣品中分離出了雙歧桿菌屬細菌。

雙歧桿菌屬菌株的ERIR-PCR指紋圖譜分型結果根據ERIR-PCR指紋圖譜，73個分離菌株屬於5種類型。(表2)。

單菌分離物16S rRNA基因序列的分析結果5個ERIC類型代表菌株的16S rRNA基因序列與Genbank中的序列比對發現，雙歧桿菌條帶對應的74個分離物均屬於雙歧桿菌屬。E7-E11類型的分離物與最近鄰居假小鏈雙歧桿菌B1279菌株的同源性均在99.6%以上。

假小鏈雙歧桿菌C95的全基因組序列資訊

背景： 21例SO(單純性肥胖)兒童在醫院接受一個月的膳食干預；17例PWS(普拉德-威利綜合症)兒童在醫院接受3個月的膳食干預。我們收集了單純性肥胖兒童第0天和第30天的糞便樣本。我們還收集了PWS兒童在以下時間點的糞便樣本：第0天、第30天、第60天和第90天。從這些糞便樣品中提取總DNA進行宏基因組測序。通過生物資訊學分析，我們完成了在單個菌株水平的基因組拼接並獲得25株假小鏈雙歧桿菌的高品質基因組草圖。每一個兒童在不同時間點都有其自己的具有豐度資訊的基因組草圖。此外，我們從GD02兒童的糞便樣品中分離了一株名為假小鏈雙歧桿菌C95的特定菌株，並完成了其全基因組測序。

通過使用MUMMER3.0，比較了來自GD02的高品質假小鏈雙歧桿菌基因組草圖與假小鏈雙歧桿菌C95基因組，我們發現它們的一致性和覆蓋率如下：99.93%和99.39%，這表明假小鏈雙歧桿菌基因組草圖非常有可能是假小鏈雙歧桿菌菌株C95。其他24個基因組草圖也與假小鏈雙歧桿菌菌株C95有較高的相似性，其中最低的一致性和覆蓋率也分別至少為98.63%和86.26%。(注意，假小鏈雙歧桿菌菌株C95的基因組是完整的全基因組，而其假小鏈雙歧桿菌基因組草圖是直接由糞便樣本的巨集基因組測序序列拼接而成。因此，當以假小鏈雙歧桿菌菌株C95的全基因組作為參照基因組時，在部分區域，基因無法被覆蓋，使得參照覆蓋率範圍為80.75%-88.54%。)表4中列出詳細的比對結果。表4顯示了將由來自25個個體的糞便樣本的巨集基因組資料集拼接而成的25個高品質的假小鏈雙歧桿菌的基因組草圖與假小鏈雙歧桿菌菌株C95的全基因組以及它們在干預期間的豐度變化進行比對。這也表明，在假小鏈雙歧桿菌的25個基因組草圖中，有23個在干預後豐度增加。

注：CECT7765資訊基於美國專利US20140369965中的資訊。ID：個體id。

對照：在基因組比較時，將MUMMER3.0用作參照基因組。

參照_覆蓋率：參照基因組的比對覆蓋率。

查詢_覆蓋率：查詢基因組的比對覆蓋率。

一致性(1到1)：一致性百分比(包括1到1地將參照映射到查詢的比對塊的數量。這是M到M映射的子集，去除重複的)。

SO：接受了30天醫院干預的單純性肥胖兒童，因此在第0 天和第30天具有豐度。

PWS：接受了90天醫院干預的PWS(普拉德-威利綜合症)兒童，因此在第0天、第30天、第60天和第90天具有豐度。

假小鏈雙歧桿菌菌株C95已經完成全基因組測序。與C95的全基因組序列相比，假小鏈雙歧桿菌B1279與假小鏈雙歧桿菌菌株C95全基因組相比對有98.16%的一致性和86.3%的覆蓋率。

基礎菌株的建立可以減少代謝惡化

為了研究腸道菌群的種群結構變化對代謝潛力的影響，我們使用HUMAnN來分析巨集基因組資料，來識別和量化與代謝途徑相關的基因(34)。我們總共確認並定量了5234個KEGG同源組(KOs)。所有的KOs的PCA得分圖示出干預後這些KOs發生了顯著變化(MANOVA檢驗，P=2.00e-7，圖4A和B)，這說明腸道菌群調節代謝的能力與飲食誘導產生的菌群結構變化一致。PWS和單純性肥胖兩組在干預之前或之後均無顯著性差異(MANOVAP=0.712和P=0.291，圖4B)。因此，PWS和單純性肥胖兒童的腸道菌群在干預前後，共享相似的結構和功能特點。

利用線性判別分析(LDA)影響範圍(LEFSe)方法(35)，67個KEGG資料庫代謝通路被認為與飲食干預顯著相關(P<0.05)(資料未顯示)。其中，41個途徑在干預後顯著降低而26個代謝途徑在干預後顯著上調。並且，值得注意的是，上調的通路是與碳水化合物的分解代謝相關，包括澱粉和蔗糖代謝(ko00500)、氨基糖和核苷酸糖代謝 (ko00520)。值得注意的是，下調的通路是與脂肪和蛋白質的代謝相關，包括脂肪酸的生物合成(ko00061)、苯丙氨酸代謝(ko00360)，和色氨酸的代謝(ko00380)。此外，脂多糖生物合成通路(ko00540)、肽聚糖的生物合成通路(ko00550)和鞭毛組裝(ko02040)通路均表達下降，這說明與細菌抗原合成相關通路在干預後被下調。外來物質的生物降解途徑(ko00627，ko00633和ko00930)和DNA修復相關的途徑(ko03410，ko03430和ko03440)也下降，這或許反映了在干預後腸道菌群環境中的毒素量和誘變應力下降。

因此，在干預後，腸道菌群的代謝潛力，由其基因組成確定，發生了顯著變化，這與由腸道菌群移植試驗所示的誘導代謝惡化的能力下降一致。

基礎菌種的建立使腸道菌群結構變得更健康

干預用膳食中大大增加了不可消化的碳水化合物。這些不可消化的碳水化合物可以進入結腸並潛在地改變腸道菌群的發酵代謝。SO人群在0天和30天以及PWS人群在0天、30、60、90天的糞懸液樣品的基於NMR的代謝組學分析資料的PCA得分圖和正交投影潛結構判別分析(OPLS-DA)示出，干預後的代謝產物組成發生顯著變化(資料未顯示)。OPLS-DA係數圖顯示，干預後的不可消化碳水化合物顯著增加(資料未顯示)。19位SO人群和18個PWS人群的糞便代謝物在干預後明顯減少(資料未顯示)。在這些顯著減少的代謝物中，其中許多是細菌產物。經過qPCR測定，發現腸道中顯著減少的這些代謝物伴隨著總腸道細菌量的顯著減少(圖7)。儘管細菌的代謝物減少，但 是短鏈脂肪酸中(SCFAs)的醋酸(有益代謝產物(36，37))的相對含量增加，而異丁酸和異戊酸均下降(資料未顯示)。醋酸是由碳水化合物發酵產生的，而異丁酸和異戊酸是由氨基酸發酵生產的(38，39)。三甲胺(TMA)是一種有毒的代謝產物，它來源於腸道細菌發酵源自膳食脂肪的膽鹼(40)。在干預後，糞懸液內的TMA減少(資料未顯示)。因此，糞懸液的代謝分析表明干預後腸道中從脂肪和蛋白質發酵到碳水化合物發酵代謝變化與鑒定的KEGG通路的變化一致(圖4C)。SO和PWS人群干預後的糞懸液樣品所培養的Caco-2細胞的毒性均明顯降低，表明干預後腸道中的微生物菌群可能產生更少的有毒的代謝物(資料未顯示)。

為了進一步研究飲食干預如何改變腸道微生物菌群的碳水化合物代謝，我們在下載的dbCAN資料庫中搜索了所有的2077766個非冗餘基因，鑒定碳水化合物活性酶(CAZy)基因(31，41)。84549個基因被分配到299個碳水化合物活性酶簇。PCA得分圖顯示299個酶簇在干預前、後的樣品顯著分開，表明腸道微生物組中用於碳水化合物代謝的基因發生重大轉變(資料未顯示)。用於澱粉、菊糖和纖維素的降解的基因顯著上升，而用於動物源糖化物如黏蛋白等的降解的基因在干預後顯著下降(資料未顯示)(41)。甲酸四氫葉酸連接酶的基因(參與醋酸合成)在干預後明顯表達上升(17，29)，這與糞便SCFAs中醋酸的相對濃度增加一致(資料未顯示)。這些變化反映了結腸內植物碳水化合物可用率增加，這些有利於腸道細菌如雙歧桿菌等含有碳水化合物發酵基因的細菌增殖並產生有益的代 謝產物，如乙酸(39)。一個最近的結腸癌患者的腸道微生物宏基因組分析也發現：結腸病人與健康人相比，蛋白質、脂肪發酵上升而碳水化合物發酵降低(42)，這表明通過增加腸道中碳水化合物來轉變腸道微生物菌群代謝可能有助於不同程度上緩解多種慢性疾病的代謝惡化。

總之，腸道微生物菌群的宏基因組分析和糞懸液樣品的代謝物分析表明，膳食干預改變兩種人群的腸道微生物菌群組成，使其變成由碳水化合物發酵菌為優勢菌的健康的結構，無論人群的遺傳背景如何，這種菌群結構可以明顯減少有毒代謝產物。換句話說，基礎菌種的建立將腸道微生物菌群改變成碳水化合物發酵菌為優勢菌的更健康的結構，同時明顯減少有毒代謝產物的生產。

本說明書中提及的所有出版物均為參考。對於本發明所描述的方法和體系，一些修改和變化，本領域工作者明顯可以理解其並未脫離本發明的範圍和宗旨。雖然本發明與特定的實例有關，但是聲明其並不過分限制於這樣的具體實施。事實上，描述的各種使用本發明的不同模式，對生物化學和生物技術相關領域專家來說，均在要求範圍內。

引用文獻

14. S. Xiaoet al. , A gut microbiota-targeted dietary intervention for amelioration of chronic inflammation underlying metabolic syndrome.FEMS Microbiol Ecol 87 , 357 (Feb, 2014).

15. N. Fei, L. Zhao, An opportunistic pathogen isolated from the gut of an obese human causes obesity in germfree mice. ISME J 7 , 880 (Apr, 2013).

17. P. J. Turnbaughet al. , An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.Nature 444 , 1027 (Dec 21, 2006).

18. S. T. Papavramidis, E. V. Kotidis, O. Gamvros, Prader-Willi syndrome-associated obesity treated by biliopancreatic diversion with duodenal switch. Case report and literature review.J Pediatr Surg 41 , 1153 (Jun, 2006).

19. G. Labrunaet al. , High leptin/adiponectin ratio and serum triglycerides are associated with an "at-risk" phenotype in young severely obese patients.Obesity 19 , 1492 (Jul, 2011).

20. J. Zweigner, R. R. Schumann, J. R. Weber, The role of lipopolysaccharide-binding protein in modulating the innate immune response.Microbes Infect 8 , 946 (Mar, 2006).

21. P. D. Caniet al. , Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance.Diabetes 56 , 1761 (Jul, 2007).

22. R. E. Leyet al. , Obesity alters gut microbial ecology.Proc Natl Acad Sci U S A 102 , 11070 (Aug 2, 2005).

23. P. J. Turnbaughet al. , A core gut microbiome in obese and lean twins.Nature 457 , 480 (Jan 22, 2009).

24. A. Cotillardet al. , Dietary intervention impact on gut microbial gene richness.Nature 500 , 585 (Aug 29, 2013).

25. E. Le Chatelieret al. , Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers.Nature 500 , 541 (Aug 29, 2013).

26. H. B. Nielsenet al. , Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes.Nature biotechnology 32 , 822 (Aug, 2014).

27. Y. Zhouet al. , Biogeography of the ecosystems of the healthy human body.Genome Biol 14 , R1 (Jan 14, 2013).

28. A. M. Ellisonet al. , Loss of foundation species: consequences for the structure and dynamics of forested ecosystems.Frontiers in Ecology and the Environment 3 , 479 (Nov, 2005).

29. M. J. Claessonet al. , Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly.Nature 488 , 178 (Aug 9, 2012).

30. L. A. Davidet al. , Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome.Nature 505 , 559 (Jan 23, 2014).

31 P. Scott, S. W. Gratz, P. O. Sheridan, H. J. Flint, S. H. Duncan, The influence of diet on the gut microbiota.Pharmacol Res 69 , 52 (Mar, 2013).

32. S. Fukudaet al. , Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate.Nature 469 , 543 (Jan 27, 2011).

33. G. R. Gibson, X. Wang, Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria.J Appl Bacteriol 77 , 412 (Oct, 1994).

34. S. Abubuckeret al. , Metabolic reconstruction for metagenomic data and its application to the human microbiome.PLoS Comput Biol 8 , e1002358 (2012).

35. N. Segataet al. , Metagenomic biomarker discovery and explanation.Genome Biol 12 , R60 (2011).

36. K. M. Maslowskiet al. , Regulation of inflammatory responses by gut microbiota and chemoattractant receptor GPR43.Nature 461 , 1282 (Oct 29, 2009).

37. V. Tremaroli, F. Backhed, Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism.Nature 489 , 242 (Sep 13, 2012).

38. W. R. Russellet al. , High-protein, reduced-carbohydrate weight-loss diets promote metabolite profiles likely to be detrimental to colonic health.American Journal of Clinical Nutrition 93 , 1062 (May, 2011).

39. H. J. Flint, K. P. Scott, S. H. Duncan, P. Louis, E. Forano, Microbial degradation of complex carbohydrates in the gut.Gut Microbes 3 , 289 (Jul-Aug, 2012).

40. Z. Wanget al. , Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease.Nature 472 , 57 (Apr 7, 2011).

41. B. L. Cantarel, V. Lombard, B. Henrissat, Complex carbohydrate utilization by the healthy human microbiome.PLoS One 7 , e28742 (2012).

42. G. Zelleret al. , Potential of fecal microbiota for early-stage detection of colorectal cancer.Mol Syst Biol 10 , 766 (2014).

【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

1.財團法人食品工業發展研究所、2016.09.20、BCRC 910746

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1.中國、中國普通微生物菌種保藏管理中心、2015.02.09 CGMCC10549

<110> 完美(中國)有限公司

<120> 作為腸道菌群的基礎益生菌的雙歧桿菌

<140> 105120709

<141> 2016-06-30

<150> PCT/CN2015/082887

<151> 2015-06-30

<160> 1

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 2349745

<212> DNA

<213> 假小鏈雙歧桿菌

<400> 1

Claims (21)

1. 一種組合物，包括：(1)假小鏈雙歧桿菌C95菌株，寄存編號為BCRC 910746，該假小鏈雙歧桿菌C95菌株的基因組被設計為參照基因組；(2)高度相似菌株，該高度相似菌株包括被設計為查詢基因組的基因組，當進行比對時，-該查詢基因組覆蓋該參照基因組的至少86%，-在比對區域中，該查詢基因組與該參照基因組具有至少98.7%的序列一致性；或者(3)由其衍生的菌株；以及(4)藥學上可接受的載體或膳食載體。
2. 如請求項1所記載之組合物，其中該參照基因組覆蓋該查詢基因組的至少87%。
3. 如請求項1所記載之組合物，其中該查詢基因組覆蓋該參照基因組的至少93%，該參照基因組覆蓋該查詢基因組的至少87%，並且在比對區域，該查詢基因組和該參照基因組具有至少98.7%的序列一致性。
4. 如請求項1所記載之組合物，其中該組合物包括C95菌株。
5. 如請求項1所記載之組合物，其中該組合物為藥物組合物。
6. 如請求項1所記載之組合物，其中該組合物是營養補 充劑或營養性組合物。
7. 如請求項1所記載之組合物，其中每克或每毫克的該組合物包括至少10³ 至10¹⁴ 個C95菌株或者該高度相似菌株的菌落形成單位。
8. 如請求項5所記載之組合物，其中該組合物進一步包括黏膜乳桿菌菌株。
9. 如請求項1所記載之組合物，其中該組合物包括菌株C95或者該高度相似菌株的細胞組分、代謝物、分泌的分子或者它們的任意組合。
10. 一種方法，係用於製備如請求項1所記載之組合物的方法，包括：將假小鏈雙歧桿菌C95菌株或者高度相似菌株配製成合適的組合物。
11. 如請求項10所記載之方法，其中該組合物包括假小鏈雙歧桿菌C95菌株和黏膜乳桿菌菌株。
12. 一種預防及/或治療疾病的方法，該疾病選自超重、肥胖、高血糖症、糖尿病、脂肪肝、血脂異常、代謝綜合症、與肥胖或超重相關的感染及/或脂肪細胞肥大，該預防及/或治療疾病的方法包括將如請求項1所記載之組合物投與至所需患者。
13. 如請求項12所記載之預防及/或治療疾病的方法，其中該組合物包括C95菌株和黏膜乳桿菌菌株。
14. 一種方法，係用於減少所需患者中單純性或遺傳性肥胖、減輕代謝惡化、或減少炎症和脂肪堆積的方法，該方法包括將如請求項1所記載之組合物投與至所 需患者。
15. 如請求項14所記載之方法，其中該組合物包括C95菌株和黏膜乳桿菌菌株。
16. 一種建立基礎菌種的方法，該基礎菌種限定健康腸道生態系統的結構，使得腸道環境不利於病原菌和有害細菌生長，相對於空白對照降低腸內容物中腸桿菌的濃度，該建立基礎菌種的方法包括將如請求項1所記載之組合物投與至所需患者。
17. 如請求項16所記載之建立基礎菌種的方法，其中該組合物包括C95菌株和黏膜乳桿菌菌株。
18. 一種方法，係用於治療所需患者糖尿病的方法，包括將如請求項1所記載之組合物投與至所需患者。
19. 如請求項18所記載之方法，其中該糖尿病為II型糖尿病。
20. 如請求項14所記載之方法，其中該肥胖為單純性肥胖。
21. 如請求項14所記載之方法，其中該患者患有普拉德-威利綜合症。