TW201637658A - 用於抑制病毒蛋白質轉譯的小rna分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種經分離的小RNA分子。該小RNA分子具有抑制腸病毒的病毒蛋白質轉譯以及生長之效用。因此,本發明亦揭示該小RNA分子供應用於製備一用來治療一腸病毒感染之醫藥品的用途。
Description
本發明是有關於一種經分離的小RNA分子。該小RNA分子具有抑制腸病毒的病毒蛋白質轉譯以及生長之效用。因此,本發明亦有關於該小RNA分子供應用於製備一用來治療一腸病毒感染之醫藥品的用途。
腸病毒屬物種(Enterovirus
spp.)是一群小核醣核酸病毒科(Picornaviridae
)的RNA病毒(RNA virus),它們主要生長於人體與動物的腸道中。腸病毒屬主要包含腸病毒A、B、C、D、E、F、G、H與J型(Enterovirus A, B, C, D, E, F, G, H, and J
)以及鼻病毒A、B與C型(Rhinovirus A, B, and C
)這12種物種(species)。腸病毒屬物種可依據抗原的差異而被區分為不同的血清型(serotype),例如,屬於腸病毒A型的腸病毒71型(enterovirus 71, EV71)、屬於腸病毒B型的伊科病毒25型(echovirus 25, ECV25)與克沙奇病毒B2型(coxsackievirus B2, CVB2)、屬於腸病毒C型的脊髓灰白質炎病毒1型(poliovirus 1, PV1),以及屬於鼻病毒B型的人類鼻病毒B14型(human rhinovirus B14, HRVB14)。
腸病毒屬物種具有高傳染性,可經由胃腸道(gastrointestinal tract)或呼吸道(respiratory tract)來感染宿主。在感染的過程中,在腸病毒屬物種的mRNA上守恆的內部核醣體進入位址(internal ribosome entry site, IRES)會與宿主細胞中的核醣體結合來開啟病毒的基因轉譯[亦即IRES-依賴型轉譯(IRES-dependent translation)],同時抑制宿主的基因轉譯[亦即帽-依賴型轉譯(cap-dependent translation)],進而引起各種不同的疾病。例如,手足口症(hand-foot-mouth disease, HFMD)、皰疹性咽峽炎(herpangina)、無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)、腦炎(encephalitis)、心肌炎(myocarditis)、脊髓灰白質炎(poliomyelitis)以及神經性心肺衰竭(neurogenic cardiopulmonary failure)等。
目前臨床上對於腸病毒感染的治療大多是以支持性療法(supportive therapy)為主,亦即以補充水分以及營養等方式來協助患者恢復體力或增強免疫力。然而,支持性療法所能達至的功效會受限於患者自身的免疫力,因此,當今醫藥界有需要去發展出可以快速且有效地治療腸病毒感染的藥物。
目前已有研究是有關於利用抑制腸病毒的IRES-依賴型轉譯來達到治療腸病毒感染的效用。例如,在Stone J.K.et al.
(2008),Antimicrob. Agents Chemother.
, 52:1970-1981中,Stone J.K.等人合成出標靶高度守恆的IRES序列之胜肽-綴合的磷醯二胺嗎福啉並寡聚物(peptide-conjugated phosphorodiamidate morpholino oligomer, PPMO) EnteroX,並且藉由螢光酵素分析(luciferase assay)而證實EnteroX能夠有效地抑制病毒轉譯。Stone J.K.等人將EnteroX拿來處理分別被感染以HRVB14、CVB2以及PV1的人類子宮頸上皮癌細胞株(human cervical epithelioid carcinoma cell line) HeLa,並且藉由溶菌斑分析來測量病毒效價。而實驗結果發現,EnteroX能夠有效地對抗HRVB14、CVB2以及PV1。接著,EnteroX進一步被投藥給PV1-感染的小鼠,並且觀察小鼠的存活情形以及測量在小鼠器官中的病毒效價。而實驗結果發現,EnteroX能夠有效地提高小鼠的存活率並且抑制PV1在小鼠體內的複製。因此,EnteroX被預期可供應用於腸病毒感染的治療。
在Wang J.et al.
(2013),PLoS One
, 8: e52954.中,Wang J.等人將一被報導可抑制脊髓灰白質炎病毒的IRES-依賴型轉譯的藥物奎納克林(quinacrine)拿來處理分別被感染以EV71、ECV25、CVA10、CVA16以及CVB5的人類橫紋肌肉瘤細胞株(human rhabdomyosarcoma cell line) RD,並且測量在RD細胞中所產生的病毒粒子(virion)。而實驗結果發現,奎納克林能夠有效地抑制EV71、ECV25、CVA10、CVA16以及CVB5的複製。Wang J.等人進一步使用siRNA來抑制在RD細胞中的多聚嘧啶通道結合蛋白(polypyrimidine-tract binding protein, PTB)(它對於腸病毒的IRES-依賴型轉譯是重要的)的表現,並據此探討奎納克林的作用機制。而實驗結果發現,奎納克林能夠阻止PTB與IRES的交互作用。Wang J.等人據此而認為:奎納克林可以被用來作為用於治療腸病毒感染的藥物。
小RNA分子是一種大小落在20至30 nt之間的非編碼的RNA (non-coding RNA),細胞可生成不同的小RNA分子來自我調節基因的表現以及改變基因體,進而微調細胞的生物學功能。在被病毒感染的宿主細胞中,病毒能夠利用宿主細胞的小RNA生成途徑來產生它們自己的小RNA,亦即病毒-衍生的小RNA (virus-derived small RNA, vsRNA)。有許多的vsRNA被發現能夠在宿主細胞中調控病毒複製(viral replication)或抑制宿主的抗病毒機制。例如,在Perez J.T.et al
. (2010),Proc. Natl. Acad. Sci.
, 107:11525-11530中,Perez J.T.等人在被感染以流感病毒A型(influenza A virus)的人類肺腺癌細胞株(human lung adenocarcinoma cell line) A549中發現8個大小分別為25或27 nt的vsRNA,而該等vsRNA進一步被發現能夠藉由與RNA-依賴型RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)作用來調控病毒的基因體RNA的合成。
另一方面,被病毒感染的植物與昆蟲細胞被發現可以將一些vsRNA用來作為抗病毒的防禦機制(Aliyari R. and Ding S.W. (2009),Immunol. Rev.
, 227:176-188)。然而,在被病毒感染的哺乳動物的細胞中是否存在類似的機制尚未被研究清楚。
經研究,申請人意外地發現一在被EV71感染的人類神經膠質母細胞瘤細胞株(human glioblastoma cell line) SF268中所生成的vsRNA (它被申請人命名為EV71-vsRNA)能夠有效地抑制EV71的生長,並且能夠抑制EV71與PV1的IRES-依賴型轉譯。因此,EV71-vsRNA被預期可供用於治療腸病毒感染。
發明概要
於是,在第一個方面,本發明提供一種經分離的小RNA分子,其具有一如序列辨識編號:1所示的核苷酸序列。
在第二個方面,本發明提供一種用於抑制一腸病毒的IRES-依賴型轉譯的藥學組成物,其包含有一如上所述的經分離的小RNA分子。
在第三個方面,本發明提供一種用於治療一腸病毒感染的藥學組成物,其包含有一如上所述的經分離的小RNA分子。
在第四個方面,本發明提供一如上所述的經分離的小RNA分子供應用於製備一用來抑制一腸病毒的IRES-依賴型轉譯之醫藥品的用途。
在第五個方面,本發明提供一如上所述的經分離的小RNA分子供應用於製備一用來治療一腸病毒感染之醫藥品的用途。
在第六個方面,本發明提供一種用於抑制在一個體中之一腸病毒的IRES-依賴型轉譯的方法,其包括對該個體投藥以一如上所述的經分離的小RNA分子。
在第七個方面,本發明提供一種用於治療一具有或被懷疑具有一腸病毒感染的個體的方法,其包括對該個體投藥以一如上所述的經分離的小RNA分子。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點,在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後,將變得明顯。 發明的詳細說明
為了這本說明書之目的,將被清楚地瞭解的是:文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”,以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
要被瞭解的是:若有任何一件前案刊物在此被引述,該前案刊物不構成一個下述承認:在台灣或任何其他國家之中,該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
除非另外有所定義,在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料,它們可被用於實施本發明。當然,本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚,下面的界定被使用於本文中。
如本文中所用的,“多肽”、“胜肽”和“蛋白質”等術語可被相互交換使用,且意指一種由胺基酸殘基所構成的聚合物,其中一或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸(naturally occurring amino acids)或人造化學仿效物(artificial chemical mimics)。而“重組型(recombinant)多肽或蛋白質”意指藉由重組DNA技術所生成的多肽或蛋白質,亦即從藉由一編碼所欲的多肽或蛋白質之外源性DNA建構物(exogenous DNA construct)而被轉形的細胞中所生成者。
如本文中所用的,“核酸”、“核酸序列”或“核酸片段”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列,且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物。如本文中所用的,“核酸”此術語可與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。
如本文中所用的,術語“核酸片段”與“DNA片段”可被互換地使用,並且意指一種DNA聚合物(DNA polymer),該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分(component),其可以是衍生自經分離的DNA (isolated DNA)或是藉由本技術領域中所熟知的方法而被化學地或酵素地合成。
如本文中所用的,術語“經分離的核酸序列(isolated nucleic acid sequence)”意指一具有一限定的核酸序列的聚核苷酸分子(polynucleotide molecule),它已經被分離或被純化出而呈一適於在遺傳工程之蛋白質生成系統(genetically engineered protein production systems)內使用的形式。該經分離的核酸序列可以是那些分離自它的天然環境並且包括cDNA與基因組選殖株(genomic clones)者,以及衍生自DNA置換實驗(DNA shuffling experiments)或位址-指引的突變發生實驗(site-directed mutagenesis experiments)的聚核苷酸或者核酸序列。如本文中所用的,“經分離的核酸序列”此術語可與“經分離的聚核苷酸”、“經分離的DNA序列”、“經選殖的聚核苷酸”、“經選殖的核酸序列”和“經選殖的DNA序列”交換使用。
除非另有指明,一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外,亦涵蓋其互補序列(complementary sequences),以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。例如具有簡併性密碼子取代(degenerative codon substitution)以及守恆性刪除(deletion)、插入(insertion)、取代(substitution)或加入(addition)的同源性序列(homologous sequences)。特別地,簡併性密碼子取代可以經由,例如,在一核酸序列中的一或多個被選定的密碼子的第3位置處替換以其他的核苷酸殘基而被產生。
如本文中所用的,術語“轉錄方向(transcription direction)”意指核苷酸由5’端到3’端加入至新生之RNA轉錄本(nascent RNA transcripts)的方向。
如本文中所用的,術語“編碼區域(coding region)”意指核苷酸序列,它編碼由於一mRNA分子的轉譯而在新生多肽(nascent polypeptide)中被發現到的胺基酸序列。
如本文中所用的,術語“5’端非轉譯區(5’ untranslated region, 5’ UTR)”與“5’端非編碼區域(5’ non-coding region)”可被交替地使用,並且意指在任何編碼區域的上游處之不會被轉譯成胺基酸的核苷酸序列。
如本文中所用的,術語“啟動子序列(promoter sequence)”意指一DNA序列,它通常是位在一DNA聚合物內所存在的一個基因的上游處,而且它提供一用於起始該基因的轉錄以生成mRNA的位址(site for initiation of the transcription of said gene into mRNA)。適用於本發明的實施的啟動子序列可以是衍生自病毒(viruses)、噬菌體(bacteriophages)、原核細胞或真核細胞,而且可為一組成性啟動子(constitutive promoter)或是一誘導性啟動子(inducible promoter)。
如本文中所用的,術語“上游(upstream)”以及“下游(downstream)”意指核苷酸序列的一要素的位置。“上游”表示一個要比參考要素(reference element)更加5’端的要素。“下游”表示一個要比參考要素更加3’端的要素。
如本文中所用的,術語“重組型載體(recombinant vector)”以及“表現載體(expression vector)”可被交換地使用並且意指任一種重組型表現系統,它可於活體外(in vitro
)或活體內(in vivo
),在任一種勝任的宿主細胞(competent host cell)內組成地(constitutively)或誘導地(inducibly)表現一被選定的核酸序列。該重組型載體可為一線性或環形表現系統,且涵蓋保持游離基因(episomal)形式或是被整合至宿主細胞的基因組內的表現系統。該重組型表現系統可具有或不具有自我複製的能力,它可能只會驅使宿主細胞的短暫表現。
如本文中所用的,術語“轉形(transformation)”可與術語“轉染(transfection)”交替地使用,並且泛指將一核酸分子引入一選定的宿主細胞內的方式。依據本技藝中已知的技術,一核酸分子(例如,一重組型DNA建構物或一重組型載體)可藉由多種技術而被引入至一選定的宿主細胞內,例如磷酸鈣或氯化鈣媒介的轉染作用(transfection)、電穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞擊法(particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用(liposome-mediated transfection)、利用細菌噬菌體的轉染作用或其他方法。
如本文中所用的,“細胞”、“宿主細胞(host cell)”、“轉形宿主細胞(transformed host cell)”與“重組型宿主細胞(recombinant host cell)”等術語可被互換使用,而且不僅指特定的個體細胞(individual cells)還包括繼代培養的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。子代細胞可能在後續世代中因為突變作用或環境影響而發生特定的遺傳修飾(genetic modification),而致使子代細胞事實上可能與母細胞並不相一致,但子代細胞仍被涵蓋在本文中所用的術語的範疇內。
在開發可用於治療腸病毒感染的藥物上,申請人意外地發現到:在被EV71感染的人類神經膠質母細胞瘤細胞株(human glioblastoma cell line) SF268中所生成的一小RNA分子具有抑制腸病毒的蛋白質轉譯以及生長的效用。
於是,本發明提供一種經分離的小RNA分子,其具有一如序列辨識編號:1所示的核苷酸序列。
依據本發明,該經分離的小RNA分子可被化學地、酵素地或重組地合成,或者可以衍生自一天然來源。在本發明的一個較佳具體例中,該經分離的小RNA分子是被化學地合成。
依據本發明之經分離的小RNA分子已經由實驗而被證實可以有效地抑制EV71與PV1的IRES活性以及病毒蛋白質合成,並且能夠有效地抑制EV71的生長。因此,依據本發明之經分離的小RNA分子被預期具有治療腸病毒感染的效用,因而可供應用於製備一用來治療一腸病毒感染之醫藥品的用途。
於是,本發明提供一種用於治療一腸病毒感染的藥學組成物,其包含有一如上所述的經分離的小RNA分子。
如本文中所用的,“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指預防(preventing)、減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)、或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign),以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。
依據本發明,該腸病毒是選自於下列所構成的群組:腸病毒A、B、C、D、E、F、G、H與J型,以及鼻病毒A、B與C型。較佳地,該腸病毒是腸病毒A型或腸病毒C型。在本發明的一個較佳具體例中,該腸病毒是EV71。在本發明的另一個較佳具體例中,該腸病毒是PV1。
依據本發明,該腸病毒感染包括,但不限於:手足口症(hand-foot-mouth disease, HFMD)、皰疹性咽峽炎(herpangina)、無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)、腦炎(encephalitis)、心肌炎(myocarditis)、脊髓灰白質炎(poliomyelitis)以及神經性心肺衰竭(neurogenic cardiopulmonary failure)。
依據本發明的藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投藥的劑型,這包括,但不限於:注射品(injection)[例如,無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。
依據本發明的藥學組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥:腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。較佳地,該藥學組成物被製成適於以腹膜內注射而被投藥的劑型。
依據本發明的藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如,該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑:溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明,該藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑:水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol),以及它們的組合。
本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有一腸病毒感染的個體的方法,其包括對該個體投藥以一如上所述的經分離的小RNA分子。
依據本發明,該經分離的小RNA分子的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化:要被治療的疾病之嚴重性,投藥途徑,以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言,依據本發明的藥學組成物的每日投藥劑量通常是0.1 mg/kg體重至100 mg/kg體重,呈單一劑量或是分成數個劑量的形式,且可被口服地、非經腸道地或局部地投藥。
基於一如上所述的經分離的小RNA分子在抑制EV71與PV1的IRES活性以及病毒蛋白質合成上的效用,本發明亦預期該經分離的小RNA分子供應用於製備一用來抑制一腸病毒的IRES-依賴型轉譯之醫藥品的用途。
於是,本發明提供一種用於抑制一腸病毒的IRES-依賴型轉譯的藥學組成物,其包含有一如上所述的經分離的小RNA分子。
依據本發明,該藥學組成物的投藥劑型、投藥途徑以及可供使用之藥學上可接受的載劑是如上面所述者。
本發明亦提供一種用於抑制在一個體中之一腸病毒的IRES-依賴型轉譯的方法,其包括對該個體投藥以一如上所述的經分離的小RNA分子。
依據本發明,該經分離的小RNA分子的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化:投藥途徑,以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言,依據本發明的藥學組成物的每日投藥劑量通常是0.1 mg/kg體重至100 mg/kg體重,呈單一劑量或是分成數個劑量的形式,且可被口服地、非經腸道地或局部地投藥。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明,但應瞭解的是,該等實施例僅是供例示說明用,而不應被解釋為本發明的實施上的限制。實施例 一般實驗材料:
1. 細胞株的來源與培養:
在下面實施例中所使用的人類神經膠質母細胞瘤細胞株(human glioblastoma) SF268 (COSMIC id 905986)以及人類橫紋肌肉瘤細胞株(human rhabdomyosarcoma) RD (ATCC CCL-136)皆是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC)。
這2種細胞分別被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(GIBCO, CA, USA)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、100 U/mL盤尼西林(penicillin)、100 µg/mL鏈黴素(streptomycin)以及0.25 µg/mL兩性黴素B (amphotericin B)]的培養皿(petri dish)中,接著在培養條件被設定為37℃與5% CO2
的培養箱中進行培養。之後,大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約90%匯聚時,移除培養基並以生理食鹽水來洗滌細胞共計2次,接著加入胰蛋白酶(trypsin)-EDTA以使細胞自培養皿的底部脫離。之後,加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管反覆地吸沖培養基以充分打散細胞,然後將所形成的細胞懸浮液(cell suspension)分配到新的培養皿中,並在培養條件被設定為37℃與5% CO2
的培養箱中進行培養。 2. EV71-IRES-FLuc報導子RNA的製備:
首先,申請人參照J.Y. Linet al
. (2009),Nucleic Acids Res
., 37:47-59當中所述方法來製備重組型載體pRHF-EV71-5’ UTR,該重組型載體pRHF-EV71-5’ UTR包含一腸病毒71型5’ UTR-螢火蟲螢光酵素基因(Enterovirus 71 5’ UTR-Fluc
, EV71-5’ UTR-Fluc
)片段。
接著,申請人針對該EV71-5’ UTR-Fluc
基因片段而設計出一組具有下面所示核苷酸序列的引子對EV71前向引子F1與Fluc反向引子R1。 EV71前向引子F1 5’-gccggtaatacgactcactatagggaga
ttaaaacagcctgtgggt-3’ T7啟動子 (序列辨識編號:2) Fluc反向引子R1 5’-ggtgctcgag
ttacacggcgatctttccgc-3’ (序列辨識編號:3)Xho
I
之後,以該重組型載體pRHF-EV71-5’ UTR作為模版,並使用該引子對EV71前向引子F1與Fluc反向引子R1來進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR),藉此而擴增出一個帶有T7啟動子-EV71-5’ UTR-Fluc
基因片段的PCR產物(2200 bp)。於完成PCR之後,藉由1%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來確認有否得到一大小約為2200 bp的PCR產物。該經確認的PCR產物是藉由使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)而從瓊脂糖凝膠中被純化與回收。之後,該經純化的PCR產物被併入至載體pCRII_TOPO (購自於Invitrogen)中以進行TA選殖(TA cloning),藉此而得到一重組型載體pCRII-TOPO-EV71-5’ UTR-Fluc (6100 bp)。
然後,以限制酶Xho
I/Xba
I而從上面所得到的重組型載體pCRII-TOPO-EV71-5’ UTR-Fluc中切出該T7啟動子-EV71-5’ UTR-Fluc
基因片段,並將之併入至載體pGL3 (購自於Promega)中,藉此而得到一重組型載體pGL3-EV71-5’ UTR-Fluc (5522 bp,其架構如圖1所示)。
之後,使用限制酶Xho
I來對該重組型載體pGL3-EV71-5’ UTR-Fluc進行線性化,接著以該經線性化的重組型載體作為模版,並使用MEGAscript T7套組來進行活體外轉錄,繼而使用RNeasy Protect Mini套組來進行純化,藉此而得到EV71-IRES-FLuc報導子RNA。 3. PV1-IRES-FLuc報導子RNA的製備:
首先,申請人針對脊髓灰白質炎病毒1型(Poliovirus 1, PV1)的5’ UTR的完整序列(NCBI登錄編號KT353719.1)而設計出一組具有下面所示核苷酸序列的引子對PV1前向引子F1與PV1反向引子R1,以及針對Fluc
基因的完整序列(NCBI登錄編號JN542721.1)而設計出一組具有下面所示核苷酸序列的引子對Fluc前向引子F1與Fluc反向引子R2。 PV1前向引子F1 5’-ccgctcgagtaatacgactcactataggg
agattaaaacagctctggggttg-3’ T7啟動子 (序列辨識編號:4) PV1反向引子R1 5’-atgtttttggcgtcttccattatgatacaattgtctgatt-3’ (序列辨識編號:5) Fluc前向引子F1 5’-aatcagacaattgtatcataatggaagacgccaaaaacat-3’ (序列辨識編號:6) Fluc反向引子R2 5’-ggtgctcgag
ttacacggcgatctttccgc-3’ (序列辨識編號:7)Xho
I
之後,以PV1的複製子(replicon)(得自於長庚大學新興病毒感染研究中心)作為模版,並且以該引子對PV1前向引子F1與PV1反向引子R1來進行PCR,藉此而擴增出一個帶有T7啟動子-PV1-5’ UTR片段的PCR產物(700 bp)。於完成PCR之後,藉由1%瓊脂糖凝膠電泳來確認有否得到一大小約為700 bp的PCR產物。該經確認的PCR產物是藉由使用QIAquick Gel Extraction Kit而從瓊脂糖凝膠中被純化與回收。
另外,以重組型載體pRHF-EV71-5’ UTR作為模版,並且以該引子對Fluc前向引子F1與Fluc反向引子R2來進行PCR,藉此而擴增出一個帶有Fluc
基因的PCR產物(1500 bp)。於完成PCR之後,藉由1%瓊脂糖凝膠電泳來確認有否得到一大小約為1500 bp的PCR產物。該經確認的PCR產物是藉由使用QIAquick Gel Extraction Kit而從瓊脂糖凝膠中被純化與回收。
接著,將經純化之帶有T7啟動子-PV1-5’ UTR片段的PCR產物與帶有Fluc
基因的PCR產物混合,並且以上面所示的PV1前向引子F1與Fluc反向引子R2來進行PCR,藉此而得到一個帶有T7啟動子-PV1-5’ UTR-Fluc
基因片段的PCR產物(2200 bp)。於完成PCR之後,藉由1%瓊脂糖凝膠電泳來確認有否得到一大小約為2200 bp的PCR產物。該經確認的PCR產物是藉由使用QIAquick Gel Extraction Kit而從瓊脂糖凝膠中被純化與回收。之後,該經純化的PCR產物被併入至載體pCRII_TOPO中以進行TA選殖,藉此而得到一重組型載體pCRII-TOPO-PV1-5’ UTR-Fluc (5900 bp)。
然後,以限制酶Mlu
I/Xho
I而從上面所得到的重組型載體pCRII-TOPO-PV1-5’ UTR-Fluc中切出一T7啟動子-PV1-5’ UTR-Fluc
基因片段,並將之併入至載體pGL3中,藉此而得到一重組型載體pGL3-PV1-5’ UTR-Fluc (5511 bp,其架構如圖2所示)。
之後,使用限制酶Xho
I來對該重組型載體pGL3-PV1-5’ UTR-Fluc進行線性化,接著以該經線性化的重組型載體作為模版,並使用MEGAscript T7套組來進行活體外轉錄,繼而使用RNeasy Protect Mini套組來進行純化,藉此而得到PV1-IRES-FLuc報導子RNA。 4. 野生型EV71複製子的製備:
首先,將在上面第2項當中所得到的T7啟動子-EV71-5’ UTR-Fluc
基因片段選殖至載體yT&A (Yeastern Biotech)中,而得到一重組型載體pyT&A-EV71-5’ UTR-Fluc。接著,將一EV71/台南/4643/MP4病毒分離株的全長基因組cDNA選殖株(由國立成功大學醫學檢驗生物技術學系王貞仁教授提供)中的P2/P3非-結構性蛋白基因區域(P2/P3 non-structural protein gene region)選殖至在該重組型載體pyT&A-EV71-5’ UTR-Fluc中之Fluc
基因的下游,藉此而得到一用來表現EV71複製子的重組型載體pyT&A-EV71-5’ UTR-Fluc-P2P3 (9625 bp,其架構如圖3所示)。
之後,使用限制酶Sal
I來對該重組型載體pyT&A-EV71-5’ UTR-Fluc-P2P3進行線性化,接著以該經線性化的重組型載體作為模版,並使用MEGAscript T7套組來進行活體外轉錄,繼而使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)來進行純化,藉此而得到野生型EV71複製子。 5. 突變型(Δ105-133) EV71複製子的製備:
首先,以在上面第4項當中所得到的重組型載體pyT&A-EV71-5’ UTR-Fluc-P2P3作為模版,並使用一組具有下面所示核苷酸序列的引子對EV71前向引子F2與EV71反向引子R1來進行PCR,藉此而擴增出一個帶有經刪除突變的EV71複製子的PCR產物(716 bp)。特別地,與野生型EV71複製子的EV71-5’ UTR相較之下,該經刪除突變的EV71複製子的EV71-5’ UTR缺少29個核苷酸殘基(亦即核苷酸殘基位置105至133處)。 EV71前向引子F2 5’-ttcgggggaaggggagtaaa-3’ (序列辨識編號:8) EV71反向引子R1 5’-tagcaggtgtggcacaccag-3’ (序列辨識編號:9)
之後,使用限制酶Dpn
I來切割在上面所得到的PCR產物,接著以T4 DNA接合酶(T4 DNA ligase)(New England BioLabs)來進行接合,藉此而得到一用來表現該經刪除突變的EV71複製子的重組型載體pyT&A-EV71-Δ5’ UTR-Fluc-P2P3 (9597 bp,其架構如圖4所示)。
之後,使用限制酶Sal
I來對該重組型載體pyT&A-EV71-Δ5’ UTR-Fluc-P2P3進行線性化,接著以該經線性化的重組型載體作為模版,並使用MEGAscript T7套組來進行活體外轉錄,繼而使用RNeasy Mini Kit來進行純化,藉此而得到突變型(Δ105-133) EV71複製子。 6. 在下面實施例中所使用的一具有一如序列辨識編號:1所示序列之EV71-衍生的小RNA (EV71-vsRNA)以及一具有一如序列辨識編號:10所示序列之經亂序的vsRNA是由Invitrogen所合成。 7. 在下面實施例中所使用的EV71/台南/4643/MP4病毒分離株是由國立成功大學醫學檢驗生物技術學系王貞仁教授所提供。 一般實驗方法:
1. vsRNA樣品的製備與分析:
在下面的實施例中,vsRNA樣品是使用一mirVana RNA分離套組(Ambion)並依照製造商的操作指南而從細胞培養物中被獲得。接著,所得到的vsRNA樣品是採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分析與北方墨點分析(Northern blotting),而所使用的儀器與試劑分別如下所述: (1) 聚丙烯醯胺凝膠電泳分析是使用垂直式電泳槽(BioRad)來進行。 (2) RNA轉印(RNA transfer)是使用RNA轉印套組(Wet/Tank Blotting Systems, BioRad)以及GeneScreen Plus尼龍膜(PerkinElmer)來進行,並且以紫外線交聯(UV cross-linked)予以固定(fixation)。 (3) 在北方墨點分析中所使用的探針(probe)被顯示於下面表1中,並且該等探針是藉由使用T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)(Promega)而使得它們的5’端處被標記以α-32
P-ATP。 表1. 用於進行北方墨點分析的探針
(4) 使用自動放射顯影術(autoradiography)(GE Healthcare, Cat. No. 95212)來偵測訊號。 2. 統計學分析(statistical analysis):
在下面的實施例中,所有的實驗數據是以“平均值±標準偏差(standard deviation, S.D.)”來表示。統計學分析是使用雙尾史徒登氏t
-試驗(two-tailed Student¢st
-test)而被執行。除非另有指明,具有一小於0.05之p
-數值的差異被認為是有統計學顯著性(statistical significance)(p
<0.05)。實施例 1. EV71- 衍生的小 RNA (EV71-vsRNA) 的篩選與鑑定 A、 病毒 - 衍生的小 RNA 的篩選與鑑定:
將EV71/台南/4643/MP4病毒分離株以一為40的病毒感染劑量(MOI)來感染SF268細胞。在感染之後的第6小時,收取細胞並依據製造商的操作指南使用一TRIzol試劑(Invitrogen)來進行總RNA的萃取,然後使用一Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies)來評估總RNA的完整性以及品質。接著,總RNA是委託北京華大基因研究中心(Beijing Genomics Institute, BGI)來進行Solexa/Illumina定序(Solexa/Illumina sequencing),俾以分析病毒-衍生的小RNAs (vsRNAs)在EV71 5’ UTR中的分布情形。
所得到的結果被顯示於圖5中。從圖5可見,有4個主要波峰被偵測到,這表示可能有4種vsRNA存在於被EV71感染的SF268細胞中。第1個主要波峰所對應的vsRNA的核苷酸序列(序列辨識編號:1)是相同於EV71 5’ UTR的核苷酸殘基位置105至133處,它被申請人命名為EV71-vsRNA。B、 EV71-vsRNA 的偵測:
為了確認該EV71-vsRNA是否存在於EV71-感染的細胞中,下面的實驗被進行。首先,將SF268細胞分成2組,其中包括1個對照組(control)以及1個實驗組,接著將EV71/台南/4643/MP4病毒分離株以一為40的病毒感染劑量來感染實驗組的細胞並且在37℃下培育歷時1小時以供病毒進行吸附作用,至於對照組的細胞則不作任何處理。在感染之後的第6小時,收取各組的細胞培養物,繼而依據上面“一般實驗方法”的第1項「vsRNA樣品的製備與分析」當中所述的方法來進行EV71-vsRNA的分析,並且選用U6 snRNA作為一內部對照組(internal control)。
所得到的結果被顯示於圖6中。從圖6可見,在實驗組的細胞中有偵測到EV71-vsRNA,而在對照組的細胞中無法偵測到EV71-vsRNA。這個實驗結果顯示:EV71-vsRNA存在於EV71-感染的細胞中。C、 EV71 5’ UTR 的突變對於 EV71-vsRNA 的生成之影響:
為了進一步確認該EV71-vsRNA是否衍生自EV71 5’ UTR的核苷酸殘基位置105至133處,下面的實驗被進行。首先,將SF268細胞分成2組,其中包括1個對照組以及1個實驗組,接著,將依據上面“一般實驗材料”的第4項當中所得到的野生型EV71複製子轉染至對照組的細胞中,以及將依據上面“一般實驗材料”的第5項當中所得到的突變型(Δ105-133) EV71複製子轉染至實驗組的細胞中。在轉染歷時24小時之後,收取各組的細胞培養物,繼而依據上面“一般實驗方法”的第1項「vsRNA樣品的製備與分析」當中所述的方法來進行EV71-vsRNA的分析,並且選用U6 snRNA作為一內部對照組。
所得到的結果被顯示於圖7中。從圖7可見,在對照組的細胞中有偵測到EV71-vsRNA,而在實驗組的細胞中無法偵測到EV71-vsRNA。這個實驗結果顯示:EV71-vsRNA是衍生自EV71 5’ UTR的核苷酸殘基位置105至133處。實施例 2. EV71-vsRNA 在抗 EV71 上的 效用評估 A、 EV71-vsRNA 對於 病毒生長 (viral growth) 的影響:
SF268細胞以一為2.5×105
細胞/井的數量而被接種於12-井培養盤的各井中並且被培育歷時24小時,接著將EV71/4642/MP4病毒分離株以一為10的病毒感染劑量來感染該等細胞,並且在37℃下培育歷時1小時以供病毒進行吸附作用。之後,將經感染的細胞分為1個對照組以及1個實驗組,其中對照組的細胞被轉染以160 pmol的如上面“一般實驗材料”的第6項當中所述之經亂序的vsRNA (序列辨識編號:10),而實驗組的細胞被轉染以160 pmol的如上面“一般實驗材料”的第6項當中所述之EV71-vsRNA (序列辨識編號:1)。在轉染之後的第4、8、12以及24小時,藉由一溶菌斑分析來測定各組細胞的病毒效價。有關溶菌斑分析是參照P.N. Huanget al
. (2011),Nucleic Acids Res
., 39:9633-9648當中所述方法來進行。
所得到的結果被顯示於圖8中。從圖8可見,在轉染之後的第24小時,實驗組的病毒效價是顯著地低於對照組所具者。這個實驗結果顯示:EV71-vsRNA可以有效地降低病毒生長。B、 EV71-vsRNA 對於病毒蛋白質合成的影響 :
由於天然的EV71-vsRNA是從含有IRES的EV71 5’ UTR中被生成,申請人推測:EV71-vsRNA分子可能會影響病毒轉譯。因此,為了探討EV71-vsRNA對於病毒蛋白質合成的影響,下面的實驗是利用35
S-甲硫胺/半胱胺酸標記(35
S-methionine/cysteine labeling)來監測在被轉染以EV71-vsRNA的細胞中新合成的蛋白質。
首先,RD細胞以一為2.5×105
細胞/井的數量而被接種於12-井培養盤的各井中並且被培育歷時24小時,接著將RD細胞分成4組,其中包括對照組1、2以及實驗組1、2。將EV71/4642/MP4病毒分離株以一為10的病毒感染劑量來感染對照組2以及實驗組2的細胞,並且在37℃下培育歷時1小時以供病毒進行吸附作用,至於對照組1以及實驗組1的細胞則不作任何處理。之後,對照組1以及2的細胞被轉染以160 pmol的如上面“一般實驗材料”的第6項當中所述之經亂序的vsRNA,而實驗組1以及2的細胞被轉染以160 pmol的如上面“一般實驗材料”的第6項當中所述之EV71-vsRNA。在轉染之後的第3小時,各組的培養基被替換以無甲硫胺以及半胱胺酸的DMEM並且於37℃下進行培育歷時1小時。接著,各組的培養基被替換以含有50 mCi/mL的35
S-Met標記的培養基並且於37℃下進行培育歷時1小時。之後,各組的細胞單層(cell monolayers)以PBS予以清洗並且以一溶解緩衝液予以溶解。在4℃下以12,000 g來進行離心歷時10分鐘之後,收集上澄液並且使用垂直式電泳槽(BioRad)來進行SDS-PAGE分析,繼而使用蛋白質轉印套組(Wet/Tank Blotting Systems, BioRad)以及聚二氟乙烯(PVDF)膜[polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane](PerkinElmer)來進行蛋白質轉印(protein transfer),接著藉由自動放射顯影術來進行訊號偵測。
所得到的結果被顯示於圖9中。從圖9可見,實驗組2以及對照組2的細胞皆會表現3種病毒蛋白質(virus protein, VP),其中包括3CD蛋白質(分子量約為77 KDa)、VP1蛋白質(分子量約為36 KDa)以及VP3蛋白質(分子量約為28 KDa)。特別地,實驗組2的細胞在這3種病毒蛋白質的表現位準上皆明顯地低於對照組2的細胞所具者。另外,對照組1以及實驗組1的細胞在蛋白質表現上沒有顯著的差異性。這個實驗結果顯示:EV71-vsRNA能夠抑制在EV71-感染的細胞中的病毒轉譯,但是不會影響正常細胞的轉譯。實施例 3. EV71-vsRNA 在抑制腸病毒的 IRES 活性上的效用評估 A、 EV71-vsRN A 在細胞外對於 EV71 與 PV1 的 IRES 活性的影響:
首先,將SF268細胞以PBS予以清洗,繼而將之刮落,然後將該等細胞再懸浮於一低張緩衝液(hypotonic buffer)(含有10 mM HEPES pH 7.9、1.5 mM MgCl2
、10 mM KCl以及0.5 mM DTT)中,並且利用一個25G的注射針而被均質化。接著,經均質化的細胞被混合以等體積的作用緩衝液(working buffer)(含有40 mM HEPES、40%甘油、200 mM KCl、0.4 mM EDTA以及1 mM DTT,pH 7.4)並且被震盪歷時30秒。之後,將所得到的細胞溶胞產物以25,000 g進行離心,繼而收集上澄液。
接著,將該上澄液分為1個對照組以及1個實驗組(每組分別為50 μg),其中對照組的上澄液被添加以0.5 μg的如上面“一般實驗材料”的第2項當中所述之EV71-IRES-FLuc報導子RNA、60 pmol的如上面“一般實驗材料”的第6項當中所述之經亂序的vsRNA、4U的RNaseOUT重組型核醣核酸酶抑制劑(Invitrogen)以及20%兔子網狀紅血球溶胞產物(rabbit reticulocyte lysate, RRL)(Promega),而實驗組的上澄液被添加以0.5 μg的如上面“一般實驗材料”的第2項當中所述之EV71-IRES-FLuc報導子RNA、60 pmol的如上面“一般實驗材料”的第6項當中所述之EV71-vsRNA、4U的RNaseOUT重組型核醣核酸酶抑制劑以及20%兔子網狀紅血球溶胞產物。各組的混合物在30℃下被培育歷時90分鐘,並且依照兔子網狀紅血球溶胞產物系統(Promega)的操作程序來進行活體外轉譯(in vitro
translation),繼而使用一螢光酵素分析系統(Luciferase assay system)(Promega)並依照製造商的操作指南來進行螢火蟲螢光酵素活性(Firefly luciferase activity)的分析。各組細胞的IRES活性百分比(%)是藉由將所測得的螢光酵素活性代入下列公式(1)而被計算出:公式 (1) : A=( B/C) ×100
其中:A=IRES活性百分比(%) B=各組所測得的螢光酵素活性 C=對照組所測得的螢光酵素活性
所得到的實驗數據是依據上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來進行分析。
此外,有關EV71-vsRNA對於PV1的IRES活性的影響大體上是參照上面所描述的方式來進行分析,不同之處在於:以如上面“一般實驗材料”的第3項當中所述之PV1-IRES-FLuc報導子RNA來代替EV71-IRES-FLuc報導子RNA。
所得到的結果被顯示於下面表2中。從表2可見,在細胞外IRES活性分析中,無論是針對EV71或PV1,實驗組的IRES活性皆顯著地低於對照組所具者。這個實驗結果顯示:EV71-vsRNA能夠在細胞外抑制EV71以及PV1的IRES-依賴型轉譯。 表2. 各組的IRES活性百分比 *
:當與對照組作比較,p
<0.05。B、 EV71-vsRNA 在細胞內對於 EV71 與 PV1 的 IRES 活性的影響:
首先,將SF268細胞分為1個對照組以及1個實驗組,將各組細胞分別以一為2.5×105
細胞/井的數量而接種於12-井培養盤的各井中並且培育歷時24小時。接著,對照組的細胞被共轉染以160 pmol的如上面“一般實驗材料”的第6項當中所述之經亂序的vsRNA以及160 pmol的如上面“一般實驗材料”的第2項當中所述之EV71-IRES-Fluc報導子RNA,而實驗組的細胞被共轉染以160 pmol的如上面“一般實驗材料”的第6項當中所述之EV71-vsRNA以及160 pmol的如上面“一般實驗材料”的第2項當中所述之EV71-IRES-Fluc報導子RNA。在轉染之後的第6小時,使用細胞培養物溶解試劑(Cell Culture Lysis Reagent)(Promega)來製備各組的細胞溶胞產物,並且參照上面第A項「EV71-vsRNA在細胞外抑制IRES活性上的效用評估」當中所述的方法來進行螢火蟲螢光酵素活性的分析。各組細胞的IRES活性百分比(%)是參照上面第A項當中所述的公式(1)而被計算出。
所得到的實驗數據是依據上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來進行分析。
此外,為瞭解EV71-vsRNA對於PV1的IRES活性的影響,將SF268細胞分為1個對照組以及1個實驗組,並參照上面所描述的方式來進行實驗,不同之處在於:以如上面“一般實驗材料”的第3項當中所述之PV1-IRES-FLuc報導子RNA來代替EV71-IRES-FLuc報導子RNA。
所得到的結果被顯示於下面表3中。從表3可見,無論是針對EV71或PV1,實驗組的IRES活性皆顯著地低於對照組所具者。 表3. 各組的IRES活性百分比 *
:當與對照組作比較,p
<0.05。
上面的實驗結果證實:EV71-vsRNA能夠有效地在細胞內抑制EV71以及PV1的IRES-依賴型轉譯。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時,本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述,明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是,本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明之其他的特徵及功效,將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現,其中: 圖1是重組型載體pGL3-EV71-5’ UTR-Fluc的一架構圖,其中代碼Xho
I與Xba
I分別意指各個限制酶的切割位址; 圖2是重組型載體pGL3-PV1-5’ UTR-Fluc的一架構圖,其中代碼Mlu
I與Xho
I分別意指各個限制酶的切割位址; 圖3是重組型載體pyT&A-EV71-5’ UTR-Fluc-P2P3的一架構圖,其中代碼Sal
I意指限制酶的切割位址; 圖4是重組型載體pyT&A-EV71-Δ5’ UTR-Fluc-P2P3的一架構圖,其中代碼Sal
I意指限制酶的切割位址; 圖5顯示病毒-衍生的小RNAs (vsRNAs)在EV71 5’ UTR中的分布情形,其中波峰1至4表示4個主要的vsRNA; 圖6是一北方墨點分析圖,其顯示SF268細胞在被感染以EV71後所測得的EV71-vsRNA的存在情形,其中對照組表示未被感染以EV71的SF268細胞;實驗組表示被感染以EV71的SF268細胞;以及U6 snRNA被用來作為一內部對照組(internal control); 圖7是一北方墨點分析圖,其顯示SF268細胞在被轉染以EV71複製子後所測得的EV71-vsRNA的存在情形,其中對照組表示被轉染以野生型EV71複製子的SF268細胞;實驗組表示被轉染以突變型(Δ105-133) EV71複製子的SF268細胞;以及U6 snRNA被用來作為一內部對照組; 圖8顯示EV71-感染的SF268細胞以EV71-vsRNA予以處理後藉由溶菌斑分析所測得之EV71的病毒效價隨著時間的變化,其中對照組表示被處理以經亂序的vsRNA之EV71-感染的SF268細胞;實驗組表示被處理以EV71-vsRNA之EV71-感染的SF268細胞;以及“*”表示p
<0.05;以及 圖9是一蛋白質電泳圖,其顯示EV71-感染的RD細胞以EV71-vsRNA予以處理後藉由35
S-甲硫胺/半胱胺酸標記(35
S-methionine/cysteine labeling)所測得的病毒蛋白質的表現情形,其中對照組1表示被處裡以經亂序的vsRNA的RD細胞;對照組2表示被處裡以經亂序的vsRNA的EV71-感染的RD細胞;實驗組1表示被處裡以EV71-vsRNA的RD細胞;以及實驗組2表示被處裡以EV71-vsRNA的EV71-感染的RD細胞。
<110> 長庚大學 <120> 用於抑制病毒蛋白質轉譯的小RNA分子及其用途 <130> EV71-vsRNA <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> RNA <213> 腸病毒71型 <400> 1 guaacuuaga agcuguaaau caacgauca 29 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於擴增EV71-5' UTR-Fluc基因片段的前向引子 <400> 2 gccggtaata cgactcacta tagggagatt aaaacagcct gtgggt 46 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於擴增EV71-5' UTR-Fluc基因片段的反向引子 <400> 3 ggtgctcgag ttacacggcg atctttccgc 30 <210> 4 <211> 52 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於擴增脊髓灰白質炎病毒1型的5'-UTR的前向引子 <400> 4 ccgctcgagt aatacgactc actataggga gattaaaaca gctctggggt tg 52 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於擴增脊髓灰白質炎病毒1型的5'-UTR的反向引子 <400> 5 atgtttttgg cgtcttccat tatgatacaa ttgtctgatt 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於擴增Fluc基因的前向引子 <400> 6 aatcagacaa ttgtatcata atggaagacg ccaaaaacat 40 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於擴增Fluc基因的反向引子 <400> 7 ggtgctcgag ttacacggcg atctttccgc 30 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於擴增經刪除突變的EV71複製子的前向引子 <400> 8 ttcgggggaa ggggagtaaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於擴增經刪除突變的EV71複製子的反向引子 <400> 9 tagcaggtgt ggcacaccag 20 <210> 10 <211> 29 <212> RNA <213> 人工的序列 <220> <223> 作為對照組之經亂序的vsRNA <400> 10 aaugcuauga gacuaaugau accaagacu 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於偵測EV71-vsRNA的探針 <400> 11 tgatcgttga tttacagctt ctaagttac 29 <210> 12 <211> 107 <212> DNA <213> 人工的序列 <220> <223> 用於偵測U6 snRNA的探針 <400> 12 gttcttgctt cggcagaaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60 ccctgcgcaa ggatgacacg caaaatcgtg aagcgttcca cattttt 107
Claims (21)
- 一種經分離的小RNA分子,其具有一如序列辨識編號:1所示的核苷酸序列。
- 一種用於抑制一腸病毒的IRES-依賴型轉譯的藥學組成物,其包含有一如請求項1的經分離的小RNA分子。
- 一種用於治療一腸病毒感染的藥學組成物,其包含有一如請求項1的經分離的小RNA分子。
- 如請求項2或3的藥學組成物,其中該腸病毒是選自於下列所構成的群組:腸病毒A、B、C、D、E、F、G、H與J型,以及鼻病毒A、B與C型。
- 如請求項4的藥學組成物,其中該腸病毒是腸病毒A型。
- 如請求項5的藥學組成物,其中該腸病毒是腸病毒71型。
- 如請求項4的藥學組成物,其中該腸病毒是腸病毒C型。
- 如請求項7的藥學組成物,其中該腸病毒是脊髓灰白質炎病毒1型。
- 如請求項2或3的藥學組成物,它是呈一供口服投藥的劑型。
- 如請求項2或3的藥學組成物,它是呈一供非經腸道投藥的劑型。
- 如請求項2或3的藥學組成物,它是呈一供局部投藥的劑型。
- 一種如請求項1的經分離的小RNA分子供應用於製備一用來抑制一腸病毒的IRES-依賴型轉譯之醫藥品的用途。
- 一種如請求項1的經分離的小RNA分子供應用於製備一用來治療一腸病毒感染之醫藥品的用途。
- 如請求項12或13的用途,其中該腸病毒是選自於下列所構成的群組:腸病毒A、B、C、D、E、F、G、H與J型,以及鼻病毒A、B與C型。
- 如請求項14的用途,其中該腸病毒是腸病毒A型。
- 如請求項15的用途,其中該腸病毒是腸病毒71型。
- 如請求項14的用途,其中該腸病毒是腸病毒C型。
- 如請求項17的用途,其中該腸病毒是脊髓灰白質炎病毒1型。
- 如請求項12或13的用途,其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。
- 如請求項12或13的用途,其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
- 如請求項12或13的用途,其中該醫藥品是呈一供局部投藥的劑型。
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