TW201636421A - 多潛能幹細胞之懸浮培養 - Google Patents

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Abstract

本發明提供使用懸浮團簇(suspension clustering)，將多潛能細胞分化為β細胞之方法。本發明方法利用控制pH、細胞濃度、及類視色素濃度中之一或多者，藉由抑制早熟NGN3表現及促進NKX6.1表現來產製PDX1/NKX6.1共表現細胞之幾乎均質族群。又，PDX1/NKX6.1共表現細胞之幾乎均質族群可進一步活體外分化以形成共表現PDX1、NKX6.1、胰島素及MAFA之胰腺內分泌細胞族群。

Description

多潛能幹細胞之懸浮培養 【相關申請案之交互參照】
本申請案主張於2014年12月19日申請之美國臨時專利申請案第62/094,509號之優先權，為了所有目的，其以引用方式完整併入本文中。
本發明係關於多潛能細胞分化為胰腺內分泌前驅細胞及胰腺內分泌細胞。具體言之，本發明係關於利用控制分化過程中之pH、細胞濃度及類視色素濃度來促進生產NKX6.1及PDX1共表現胰腺內分泌前驅細胞之均質族群之方法，該等前驅細胞在活體外進一步分化時，產生與習知分化方法相比更成熟之共表現PDX1、NKX6.1、胰島素及MAFA之胰腺內分泌細胞族群。
用於第I型糖尿病之細胞替代療法的進展以及缺乏可移植蘭氏(Langerhans)小島，已使得關注著重於開發適合移植的胰島素生產細胞或β細胞之來源。一種方法係由諸如胚胎幹細胞之多潛能幹細胞產生功能性β細胞。
在脊椎動物胚胎發育中，多潛能細胞在稱作原腸胚形成(gastrulation)之過程中產生一組包含三個胚層(外胚層、中胚層、及內胚層)之細胞。諸如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸及肝之組織將自內胚層經由中間階段發育。此過程中之中間階段為定形內胚層之形成。
在原腸胚形成結束時，內胚層分配至前域-後域中，該等域可藉由獨特標示內胚層之前、中及後區域的一組因子之表現識別。例如，HHEX及SOX2識別內胚層之前區域，而CDX1、2及4識別後區域。
內胚層組織之遷移使內胚層緊密靠近有助於腸管區域化之不同的中胚層組織。此舉藉由過多的分泌因子實現，該等分泌因子諸如纖維母細胞生長因子(「FGF」)、無翅型MMTV整合位點(「WNTS」)、轉形生長因子β(「TGF-β」)、視黃酸(「RA」)及骨形態發生蛋白(「BMP」)配體及其拮抗劑。例如，據報告FGF4及BMP促進預定後腸內胚層中之CDX2表現且抑制前區域基因HHEX及SOX2之表現(2000 Development,127：1563-1567)。WNT傳訊亦已顯示與FGF傳訊共同作用，以促進後腸發育且抑制前腸命運(2007 Development,134：2207-2217)。最後，由間葉細胞分泌之視黃酸調節前腸-後腸邊界(2002 Curr Biol,12：1215-1220)。
特異性轉錄因子之表現水準可用於指定組織之身份。在定形內胚層轉化為原腸管期間，腸管變得區域化成為廣泛的域(broad domains)，該等域可藉由限制基因表現模式在分子層面上觀察。例如，腸管中之區域化胰腺域顯示極高的PDX1表現及極低的CDX2及SOX2表現。PDX1、NKX6.1、胰腺轉錄因子1次單位α(「PTF1A」)及NKX2.2在胰腺組織中高度表現；並且CDX2在腸組織中高度表現。
胰腺之形成來自定形內胚層分化為胰腺內胚層。背側及腹側胰腺域係來自前腸上皮。前腸亦產生食道、氣管、肺、甲狀腺、胃、肝、胰腺及膽管系統。
胰腺內胚層之細胞表現胰腺-十二指腸同源盒基因PDX1。在PDX1不存在下，胰腺在形成腹側及背側芽之後不再發育。因此，PDX1表現代表胰腺器官發生中之關鍵步驟。成熟胰腺含有來自胰腺內胚層分化之外分泌組織及內分泌組織兩者。
D’Amour等人描述了在高濃度活化素及低血清存在下，人類胚胎幹細胞衍生定形內胚層之富集培養物的產生(Nature Biotechnol 2005,23：1534-1541；美國專利第7,704,738號)。將此等細胞移植至小鼠之腎囊下據報告導致分化為具有內胚層組織特徵的更成熟細胞(美國 專利第7,704,738號)。人類胚胎幹細胞衍生定形內胚層細胞可在添加FGF10及視黃酸後進一步分化為PDX1陽性細胞(美國專利申請公開案第2005/0266554A1號)。後續將此等胰腺前體細胞移植至免疫不全小鼠之脂肪墊中導致在3至4個月的成熟期之後形成功能性胰腺內分泌細胞(美國專利第7,993,920號及美國專利第7,534,608號)。
Fisk等人報告了一種用於自人類胚胎幹細胞生產胰島細胞之系統(美國專利第7,033,831號)。小分子抑制劑亦已用於誘導胰腺內分泌前體細胞。例如，TGF-β受體及BMP受體之小分子抑制劑(Development 2011,138：861-871；Diabetes 2011,60：239-247)已用於顯著提高胰腺內分泌細胞之數目。另外，小分子活化劑亦已用於產生定形內胚層細胞或胰腺前體細胞(Curr Opin Cell Biol 2009,21：727-732；Nature Chem Biol 2009,5：258-265)。
已在改良用於培養諸如多潛能幹細胞之前驅細胞的方案方面取得大幅進展。PCT公開案第WO2007/026353號(Amit等人)揭示了在二維培養系統中維持人類胚胎幹細胞呈未分化狀態。Ludwig等人，2006(Nature Biotechnology,24：185-7)揭示了用於在基質上培養人類胚胎幹細胞之TeSR1限定培養基。美國專利申請公開案第2007/0155013號(Akaikeet等人)揭示了一種在懸浮液中使用黏附於多潛能幹細胞之載體(carrier)以生長該等多潛能幹細胞之方法，並且美國專利申請公開案第2009/0029462號(Beardsley等人)揭示了在懸浮液中使用微載體(microcarrier)或細胞囊封以擴增多潛能幹細胞之方法。PCT公開案第WO2008/015682號(Amit等人)揭示了一種在缺乏基質黏附之培養條件下在懸浮培養物中擴增且維持人類胚胎幹細胞之方法。美國專利申請公開案第2008/0159994號(Mantalaris等人)揭示了一種在三維培養系統中培養經囊封於海藻酸鹽珠粒內的人類胚胎幹細胞之方法。
所屬技術領域，包括Rezania等人(Nature Biotechnology,32：1121-1133(2014))、Pagliuca等人(Cell,159：428-439(2014))及美國專利第8,859,286號(Agulnick)教示了需要添加組分以調節TGF-β或BMP傳訊，該調節係經由：使用組分諸如BMP結合劑(例如Noggin)或BMP受體抑制劑(諸如(6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯 基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶鹽酸鹽)來直接阻斷BMP，或替代地添加TGF-β家族成員以佔據受體並且間接地阻斷BMP傳訊。最後，其教示了在第3階段中使用諸如SANT-1或環巴胺之音蝟抑制劑為有利的，因為音蝟傳訊之抑制可允許PDX1及胰島素表現(Hebrok等人，Genes & Development,12：1705-1713(1998))。
儘管有此等進展，但仍需要改良方法以在三維培養系統中培養多潛能幹細胞，使其分化為功能性內分泌細胞。
本發明係關於製備在聚集細胞團簇(aggregated cell cluster)中維持多潛能性之胚胎幹細胞及其他多潛能細胞，以分化為內分泌前驅細胞及胰腺內分泌細胞。本發明之發現在於藉由控制pH、細胞濃度及類視色素濃度中之一或多者，尤其在生產PDX1及PDX1/NKX6.1共表現細胞之分化階段期間，吾人可藉由抑制早熟NGN3表現且促進NKX6.1表現來產生幾乎均質之(意謂80%、較佳90%之細胞族群為)PDX1/NKX6.1共表現細胞族群。當PDX1/NKX6.1共表現細胞之幾乎均質族群進一步於活體外分化時，其成熟以形成共表現PDX1、NKX6.1、胰島素及MAFA之胰腺內分泌細胞族群。
本發明之額外發現在於，在一或多個分化階段期間使用低於pH 7.4恆定水準之pH至約7.2或更低水準、較佳約7.2至約7.0、更佳約7.0，同時亦使用等於或大於約1.5百萬個細胞/mL至約3.0百萬個細胞/mL、較佳約1.8百萬個細胞/mL至約3.0百萬個細胞/mL、更佳約2.0百萬個細胞/mL至約3.0百萬個細胞/mL之細胞密度，可消除添加組分以抑制、阻斷、活化或促效TGF-β或BMP傳訊及使用音蝟抑制劑之需要。
在本發明方法中，前腸內胚層細胞可分化為不表現PTF1A或NGN3之胰腺內胚層細胞。咸信使用低pH(意謂等於或小於約7.2至約7.0)阻斷NGN3之表現。PTF1A或NGN3陰性細胞可在後續階段中進一步富集為胰腺內胚層細胞族群，該細胞族群具有高水準之PDX1及NKX6.1(等於或大於96%陽性)並且表現一些PTF1A，但 仍不具有NGN3表現。細胞可直接自不表現PTF1A或NGN3之胰腺內胚層階段進入下一階段，其中具有高NGN3表現之胰腺內分泌前體細胞在該階段結束前轉變為胰腺內分泌細胞。此外，當不表現PTF1A或NGN3n之胰腺內胚層細胞一進入此一形成胰腺內分泌細胞之階段中，該等細胞立即開始顯示MAFA表現(藉由PCR測定)，且此表現在該階段結束前可偵測為蛋白。
適用於本發明之幹細胞為未分化之細胞，其係以單一細胞層面上具有自我更新及分化之能力來定義。幹細胞可生產後裔細胞，包括自我更新前驅細胞、非更新前驅細胞、及最終分化細胞。幹細胞之特徵亦在於其具有體外分化為多個胚層(內胚層、中胚層與外胚層)之各種細胞譜系之功能性細胞的能力。幹細胞在移植後亦形成多個胚層之組織，並且能夠在注入胚胞後實質上促成大多數(若非所有)組織形成。
幹細胞依據其發展潛能分類。「細胞培養物(cell culture)」或「培養(culturing)」通常係指取自活體生物並且在受控制條件下生長(「在培養物中(in culture)」或「經培養(cultured)」)的細胞。「初代細胞培養物(primary cell culture)」為直接取自生物且在第一次亞培養前之細胞、組織或器官的培養物。當細胞置於生長培養基中並處於有利細胞生長及分裂其中之一或二者的條件下時，其在培養物中擴增從而導致更大的細胞群。當細胞在培養物中擴增時，細胞增生之速率有時係以細胞數目倍增所需的時間量來量測(稱為「倍增時間」)。
如本文所用之「擴增(Expanding)」係指多潛能幹細胞之數目藉由培養增加的過程，諸如增加至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、75%、90%、100%、200%、500%、1000%或更高、及在此等百分比內之水準。應瞭解可自單一多潛能幹細胞獲得之多潛能幹細胞的數目取決於多潛能幹細胞之增生能力。多潛能幹細胞之增生能力可藉由細胞之倍增時間(亦即細胞在培養物中經歷有絲分裂所需之時間)及多潛能幹細胞可維持未分化狀態之時期(其等於繼代數目乘以各繼代間的天數)計算。
分化(Differentiation)為未特化(「未定向(uncommitted)」)或特化較低之細胞藉以獲得特化細胞(諸如神經細胞或肌肉細胞)特徵的過程。已分化細胞或分化誘導細胞為佔據細胞譜系內較高特化(「定向(committed)」)位置之細胞。用語「定向(committed)」當應用於分化過程時，係指細胞在分化路徑中已進行達到一點，在正常環境下達到該點之細胞將會持續分化為特定細胞型或細胞型亞群，並且在正常環境下無法分化為不同細胞型或回復為較低分化之細胞型。「去分化(De-differentiation)」係指細胞藉以回復至細胞譜系內較低特化(或定向)位置的過程。如本文中所使用，細胞之譜系(lineage)定義細胞之遺傳，即細胞係來自哪些細胞以及細胞可形成哪些細胞。細胞之譜系將細胞放置於發育及分化之遺傳方案(hereditary scheme)內。譜系特異性標記係指與受關注譜系之細胞表型特異性相關之特徵並且可用於分析未定向細胞至受關注譜系之分化。
如本文所用之「標記(Marker)」為在受關注細胞中差異表現之核酸或多肽分子。在這方面，差異表現意謂如與未分化細胞相比，陽性標記之水準增加且陰性標記之水準降低。與其他細胞相比，標記核酸或多肽之可偵測水準在受關注細胞中足夠較高或較低，使得受關注細胞可使用所屬技術領域中已知之多種方法中的任一者進行鑑定並且與其他細胞區別。
如本文所用，當特異性標記足以在細胞中被偵測時，細胞為該特異性標記「陽性」或「呈陽性」。同樣，當特異性標記不足以在細胞中被偵測時，細胞為該特異性標記「陰性」或「呈陰性」。具體言之，FACS陽性通常為大於2%，然而FACS之陰性臨限值通常小於1%。使用OpenArray® PCR系統時，PCR陽性通常為小於30個週期(Ct)，陰性通常為30個或更多週期。使用TaqMan® PCR分析時，PCR陽性通常為小於34個週期(Ct)，PCR陰性通常為大於34.5個週期。
如本文所用，「細胞密度(cell density)」及「接種密度(seeding density)」可互換使用，係指每單位面積之固體或半固體平面或彎曲基材所接種之細胞數目。
「細胞濃度(Cell concentration)」用於指稱每給定單位體積中之細胞數目。
如本文所用，「懸浮培養物(suspension culture)」係指懸浮於培養基中而非黏附於表面之細胞、單一細胞、團簇或單一細胞與團簇之混合物的培養物。
如本文所用，「無血清(serum free)」係指缺乏人類或動物血清。因此，無血清培養基不包含血清或血清部分。
在試圖複製細胞培養物中多潛能幹細胞至功能性胰腺內分泌細胞之分化時，該分化過程通常被視為經由多個連續階段前進。如本文所用，各個階段藉由本文中所包括之實例中陳述的培養時間及試劑定義。
如本文所用，「定形內胚層(Definitive endoderm)」係指具有在原腸胚形成期間由上胚層形成之細胞的特徵並且形成胃腸道及其衍生物之細胞。定形內胚層細胞表現以下標記中之至少一者：FOXA2(亦稱為肝細胞核因子3-β(HNF3β))、GATA4、GATA6、MNX1、SOX17、CXCR4、Cerberus、OTX2、短尾突變型(brachyury)、goosecoid、C-Kit、CD99、及MIXL1。定形內胚層細胞所特有之標記包括CXCR4、FOXA2及SOX17。因此，定形內胚層細胞可藉由其CXCR4、FOXA2、及SOX17表現來表徵。另外，取決於細胞得以保持於分化第一階段之持續時間，可觀察到HNF4α增加。
如本文所用之「前腸內胚層細胞(Foregut endoderm cell)」係指形成食道、肺、胃、肝、胰腺、膽囊、及十二指腸之一部分的內胚層細胞。前腸內胚層細胞表現以下標記中之至少一者：PDX1、FOXA2、CDX2、SOX2、及HNF4α。前腸內胚層細胞可藉由相較於腸管細胞具有增加之PDX1表現來表徵。
如本文所用之「胰腺前腸前體細胞(Pancreatic foregut precursor cell)」係指表現以下標記中之至少一者的細胞：PDX1、NKX6.1、HNF6、NGN3、SOX9、PAX4、PAX6、ISL1、胃泌素、FOXA2、PTF1A、PROX1及HNF4α。胰腺前腸前體細胞可藉由PDX1、NKX6.1、及SOX9之表現陽性來表徵。
如本文所用之「胰腺內胚層細胞(Pancreatic endoderm cell)」係指表現以下標記中之至少一者的細胞：PDX1、NKX6.1、HNF1 β、PTF1A、HNF6、HNF4α、SOX9、NGN3；胃泌素；HB9、或PROX1。胰腺內胚層細胞可藉由其實質上不表現CDX2或SOX2來表徵。
如本文所用之「胰腺內分泌前體細胞(Pancreatic endocrine precursor cell)」係指能夠變為胰腺激素表現細胞之胰腺內胚層細胞。胰腺內分泌前體細胞表現以下標記中之至少一者：NGN3；NKX2.2；NeuroD1；ISL1；PAX4；PAX6；或ARX。胰腺內分泌前體細胞可藉由其NKX2.2及NEUROD1表現來表徵。
如本文所用之「胰腺內分泌細胞(Pancreatic endocrine cell)」係指能夠表現以下激素中之至少一者的細胞：胰島素、升糖素、生長抑素、飢餓肽、及胰腺多肽。除此等激素以外，胰腺內分泌細胞所特有之標記亦包括NGN3、NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、ARX、NKX2.2、及PAX6中之一或多者。表現β細胞所特有之標記的胰腺內分泌細胞可藉由其胰島素及以下轉錄因子中之至少一者的表現來表徵：PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD1、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4、及PAX6。
「類視色素(retinoid)」意謂視黃酸(retinoic acid)或作為視黃酸受體促效劑之化合物。
以下用語在本文中可互換使用：「d1」、「d 1」、及「第1天」；「d2」、「d 2」、及「第2天」；「d3」、「d 3」、及「第3天」等。此等數字-字母組合係指在本申請案之逐步分化方案中的不同階段中的特定培養天數。
「葡萄糖(Glucose)」及「D-葡萄糖(D-Glucose)」在本文中可互換使用並且係指右旋糖(dextrose)(自然界中常見之一種糖)。
多潛能幹細胞可表現指定TRA-1-60及TRA-1-81抗體中之一或多者(Thomson等人.1998,Science 282：1145-1147)。活體外多潛能幹細胞之分化導致TRA-1-60及TRA-1-81表現之損失。未分化多潛能幹細胞一般具有鹼性磷酸酶活性，該活性可藉由用4%多聚甲醛固定細胞，接著用作為受質之Vector® Red顯影來偵測，如製造商所述(Vector LaboratorieS,Inc.,Burlingame,CA)。未分化多潛能幹細胞一般亦表現OCT4及TERT，如藉由RT-PCR所偵測。
經增殖的多潛能幹細胞之另一所需表型為有潛能分化為所有三個胚層之細胞：內胚層、中胚層、及外胚層組織。幹細胞之多潛能性可例如藉由將細胞注射至嚴重複合型免疫不全(「SCID」)小鼠中，使用4%多聚甲醛固定所形成之畸胎瘤，並且接著以組織學檢查來自此三個胚層之細胞類型的證據來確認。或者，多潛能性可藉由產生胚樣體(embryoid bodies)並且分析胚樣體中與三個胚層相關之標記的存在來測定。
經增殖的多潛能幹細胞系可使用標準G帶技術進行核型(karyotype)分析，並且與相對應靈長動物物種之公開核型進行比較。所需的是獲得具有「正常核型(normal karyotype)」之細胞，其意謂該等細胞為整倍體(euploid)，其中所有人類染色體均存在且未經顯著改變。多潛能細胞可容易地使用各種滋養層(feeder layer)或藉由使用基質蛋白塗布容器在培養物中擴增。或者，化學限定表面與限定培養基諸如mTeSR®1培養基(StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada)之組合可用於細胞之常規擴增。
根據本發明之一些實施例之方法在懸浮培養物中培養係藉由以促進細胞存活及增生但限制分化之細胞濃度接種多潛能幹細胞於培養容器中來實現。一般而言，使用足以維持細胞呈多潛能、未分化狀態之接種密度。應瞭解儘管可接種幹細胞之單一細胞懸浮液，但細胞之小團簇亦可為有利的。
為了在懸浮培養物中向多潛能幹細胞提供營養物及生長因子之充分且恆定的供應，培養基可每日或以預定時程(諸如每1至5天)更換或補充。多潛能幹細胞之大團簇可引起細胞分化，因此可採取措施來避免大的多潛能幹細胞聚集體。根據本發明之一些實施例，所形成之多潛能幹細胞團簇例如每2至7天經解離，並且單一細胞或細胞的小結塊(clump)被分裝至額外培養容器中(亦即，繼代)或保留於相同培養容器中且用更換或額外培養基處理。
大的多潛能幹細胞結塊(包括離心形成之多潛能幹細胞團塊)可經受酶消化及機械解離中之一或兩者。多潛能幹細胞結塊之酶消化可藉由使該結塊經受酶，諸如IV型膠原蛋白酶、Dispase®或Accutase®來執行。大的多潛能幹細胞結塊之機械解離可使用經設計以使該等結塊破碎至預定尺寸之裝置執行。另外或替代地，機械解離可使用針頭或吸移管手動執行。
用於根據本發明之一些實施例之方法在懸浮液中培養多潛能幹細胞的培養容器可為具有內表面之任何組織培養容器(例如，具有適用於培養多潛能幹細胞之純度級)，該內表面經設計使得其中培養之多潛能幹細胞無法黏附或附接於該表面(例如非組織培養物處理容器，以防止附接或黏附於該表面)。較佳地，為了獲得可規模化培養，根據本發明之一些實施例之培養使用控制培養系統(較佳地電腦控制培養系統)實現，其中諸如溫度、攪動、pH、及氧之培養參數使用適合裝置自動地監測並且控制。一旦決定所需培養參數，該系統可設定為視需要自動調節培養參數，以增強多潛能幹細胞擴增及分化。
多潛能幹細胞可在動態條件下(亦即，在其中多潛能幹細胞在懸浮培養物中經受恆定移動之條件下，例如攪拌之懸浮培養系統)或在非動態條件下(亦即，靜態培養物)培養，同時在多個繼代內保留其增生、多潛能能力及核型穩定性。
關於多潛能幹細胞之非動態培養，多潛能幹細胞可在經塗布或未經塗布之培養皿、T燒瓶、HyperFlasks®(Corning Incorporated,Corning,NY)、CellStacks®(Corning Incorporated,Corning,NY)或Cell Factories(NUNCTM Cell FactoryTM Systems(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Pittsburgh,PA))中培養。關於多潛能幹細胞之動態培養，多潛能幹細胞可在適合容器，諸如旋轉燒瓶或錐形瓶、不銹鋼、玻璃或單次使用塑膠震盪器或攪拌槽容器中培養。培養容器可連接至控制單元並且因此提供控制培養系統。培養容器(例如旋轉燒瓶或錐形瓶)可持續地或間歇地攪動。較佳地，培養容器充分攪動以維持多潛能幹細胞呈懸浮狀態。
多潛能幹細胞可在提供充足營養物及環境刺激物以促進生長及擴增之任何培養基中培養。適合培養基包括E8TM、IH3及mTeSR®1或mTeSR®2。培養基可定期更換以補充營養物供應並且移除細胞副產物。根據本發明之一些實施例，培養基每日更換。
任何多潛能幹細胞均可用於本發明方法中。可使用之多潛能幹細胞的例示性類型包括衍生自妊娠後形成組織之已建立多潛能細胞系，包括在妊娠期間任何時間取得之胚胎前組織(諸如舉例來說胚胞)、胚胎組織、或胎兒組織，該時間一般但不必要在大致10至12週妊娠之前。非限制性實例為已建立之人類胚胎幹細胞系(「hESC」)或人類胚胎生殖細胞系，諸如舉例來說人類胚胎幹細胞系H1、H7、及H9(WiCell Research Institute,Madison,WI,USA)。由已經在滋養細胞不存在下培養之多潛能幹細胞族群取得之細胞亦為適合的。
可使用數種多潛能相關轉錄因子諸如OCT4、Nanog、SOX2、KLF4、及ZFP42(Annu Rev Genomics Hum Genet 2011,12：165-185)之強制表現以自成體體細胞衍生之誘導性多潛能細胞(「IPS」)或重新編程多潛能細胞亦為適合的。用於本發明方法之人類胚胎幹細胞亦可如以下所述來製備：Thomson等人(美國專利第5,843,780號；Science,1998,282：1145-1147；Curr Top Dev Biol 1998,38：133-165；Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995,92：7844-7848)。突變型人類胚胎幹細胞系諸如BG01v(BresaGen,Athens,Ga.)或衍生自成人體細胞之細胞諸如Takahashi等人，Cell 131：1-12(2007)所揭示之細胞亦為適合的。適用於本發明之多潛能幹細胞可根據以下所述之方法衍生：Li等人(Cell Stem Cell 4：16-19,2009)；Maherali等人(Cell Stem Cell 1：55-70,2007)；Stadtfeld等人(Cell Stem Cell 2：230-240)；Nakagawa等人(Nature Biotechnology 26：101-106,2008)；Takahashi等人(Cell 131：861-872,2007)；及美國專利申請公開案第2011-0104805號。多潛能幹細胞之其他來源包括誘導性多潛能細胞(IPS,Cell,126(4)：663-676)。適用於本發明方法之其他細胞來源包括人類臍帶組織衍生細胞、人類羊水衍生細胞、人類胎盤衍生細胞、及人類單性生殖單倍體(parthenote)。在一個實施例中，臍帶組織衍生細胞可使用美國專利第 7,510,873號之方法獲得，該專利之揭示內容以全文引用方式併入本文中，因其係關於細胞之分離及表徵。在另一實施例中，胎盤組織衍生細胞可使用美國申請公開案第2005/0058631號之方法獲得，該案之揭示內容以全文引用方式併入本文中，因其係關於細胞之分離及表徵。在另一實施例中，羊水衍生細胞可使用美國申請公開案第2007/0122903號之方法獲得，該案之揭示內容以全文引用方式併入本文中，因其係關於細胞之分離及表徵。
多潛能幹細胞之特徵為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，並且多潛能幹細胞之額外特徵仍在繼續識別中。多潛能幹細胞標記包括例如以下一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14者或全部)之表現：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。在一個實施例中，適用於本發明方法之多潛能幹細胞表現CD9、SSEA4、TRA-1-60、及TRA-1-81中之一或多者(例如1、2、3者或全部)，且不表現分化標記CXCR4(亦稱為CD184)，如藉由流動式細胞測量術所偵測。在另一實施例中，適用於本發明方法之多潛能幹細胞表現CD9、NANOG及POU5F1/OCT4中之一或多者(例如1、2者或全部)，如藉由RT-PCR所偵測。
例示性多潛能幹細胞包括人類胚胎幹細胞系H9(NIH代碼：WA09)、人類胚胎幹細胞系H1(NIH代碼：WA01)、人類胚胎幹細胞系H7(NIH代碼：WA07)、及人類胚胎幹細胞系SA002(Cellartis,Sweden)。在一個實施例中，多潛能幹細胞為人類胚胎幹細胞，例如H1 hES細胞。在替代實施例中，使用非胚胎起源之多潛能幹細胞。
在如下文所述之一些實施例中，本發明係關於分離及培養幹細胞，特別是培養幹細胞團簇，其在動態懸浮培養系統中保留多潛能性。多潛能細胞團簇可分化以產生功能性β細胞。
用於本發明方法之多潛能幹細胞較佳地在針對所需終點分化之前在動態懸浮培養物中擴增。有利的是，已發現多潛能幹細胞可在適合 培養基中懸浮培養並且擴增為細胞團簇而不損失多潛能性。該培養可在動態懸浮培養系統中發生，其中細胞或細胞團簇保持充分地移動以防止多潛能性損失。適用之動態懸浮培養系統包括配備有攪動培養物內含物之手段的系統，諸如經由攪拌、震盪、再循環或氣體鼓泡通過培養基。該攪動可為間歇的或持續的，只要維持細胞團簇之充分移動以促進擴增並且防止過早分化。較佳地，攪動包含持續攪拌，諸如經由以特定速率旋轉之葉輪。葉輪可具有圓形或平坦底部。葉輪之攪拌速率應使得團簇維持懸浮狀態並且沉降減至最少。此外，可調節葉輪片之角度以輔助細胞及團簇之向上移動以避免沉降。另外，葉輪類型、角度及旋轉速率均可互相配合，使得細胞及團簇顯現為均勻膠態懸浮液。
多潛能幹細胞團簇之懸浮培養及擴增可藉由將靜態培養之幹細胞轉移至適當動態培養系統中來實現，該動態培養系統諸如拋棄式塑膠、可再用塑膠、不銹鋼或玻璃容器(例如旋轉燒瓶或錐形瓶)。例如，在黏附靜態環境(亦即，板或皿表面)中培養之幹細胞可首先藉由用螯合劑或酶處理而自該表面移除。適合之酶包括(但不限於)I型膠原蛋白酶、Dispase®(Sigma Aldrich LLC,St.Louis,MO)或以商標名Accutase®銷售之市售配方(Sigma Aldrich LLC,St.Louis,MO)。Accutase®為包含溶膠原性及蛋白水解性之酶(分離自甲殼動物)的細胞脫離溶液，並且不含哺乳動物或細菌衍生產物。因此，在一個實施例中，該酶為溶膠原性酶或蛋白水解性酶或包含溶膠原性及蛋白水解性酶之細胞脫離溶液。適合之螯合劑包括(但不限於)乙二胺四乙酸(「EDTA」)。在一些實施例中，多潛能幹細胞培養物與該酶或螯合劑一起培養，較佳地培養至群落邊緣開始捲曲並且翹起，但群落尚未自培養表面完全脫離之前。在一個實施例中，該等細胞培養物在室溫下培養。在一個實施例中，該等細胞在超過20℃、超過25℃、超過30℃或超過35℃之溫度下培養，例如在約20℃與約40℃之間、在約25℃與約40℃之間、在約30℃與約40℃之間(例如約37℃)之溫度下培養。在一個實施例中，該等細胞培養至少約1分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約15分鐘、至少約20分鐘，例如約1分鐘 與約30分鐘之間、約5分鐘與約30分鐘之間、約10分鐘與約25分鐘之間、約15分鐘與約25分鐘之間(例如約20分鐘)。在一個實施例中，該方法涉及在處理後自細胞培養物移除該酶或螯合劑之步驟。在一個實施例中，該細胞培養物在移除該酶或螯合劑之後洗滌一次或兩次或更多次。在一個實施例中，該細胞培養物用諸如mTeSR®1(Stem Cell Technologies,Vancouver,BC,Canada)之適當培養基洗滌。在一個實施例中，Rho激酶抑制劑(例如Y-27632,Axxora目錄號ALX-270-333,San Diego,CA)。該Rho激酶抑制劑之濃度可為約1至約100μM、約1至90μM、約1至約80μM、約1至約70μM、約1至約60μM、約1至約50μM、約1至約40μM、約1至約30μM、約1至約20μM、約1至約15μM、約1至約10μM、或約10μM。在一個實施例中，添加至少1μM、至少5μM或至少10μM之Rho激酶抑制劑。該等細胞可用刮勺或橡膠澱帚(rubber policeman)自該靜態培養系統之表面脫附。培養基及細胞可使用玻璃吸移管或其他適合手段轉移至動態培養系統。在一較佳實施例中，該動態培養系統中之培養基每日更換。
本發明在一個實施例中提供在三維懸浮培養物中培養及擴增多潛能幹細胞之方法。具體言之，該等方法提供藉由形成多潛能幹細胞之聚集細胞團簇來培養及擴增此等多潛能幹細胞。該等細胞團簇可由於在培養細胞之前用酶(例如中性蛋白酶，例如Dispase®)或螯合劑處理多潛能幹細胞培養物而形成。該等細胞可較佳地在攪拌或震盪懸浮培養系統中培養。在一個實施例中，本發明進一步提供自多潛能幹細胞之該等團簇形成表現胰腺內胚層譜系所特有之標記的細胞。
較佳地，該等細胞團簇為聚集之多潛能幹細胞。該等聚集之幹細胞表現一或多種多潛能性標記，例如標記CD9、SSEA4、TRA-1-60、及TRA-1-81中之一或多者(例如1、2、3者或全部)，並且不表現一或多種分化標記，例如不表現CXCR4。在一個實施例中，該等聚集之幹細胞表現多潛能性標記CD9、SSEA4、TRA-1-60、及TRA-1-81，並且不表現分化標記CXCR4。
一個實施例為一種在懸浮培養物中將多潛能幹細胞培養為細胞團簇之方法。該等細胞團簇為在動態攪拌或震盪懸浮培養系統中培養之聚集的多潛能幹細胞。該等細胞團簇可使用諸如中性蛋白酶(例如Dispase)之酶作為細胞脫壁劑自平面黏附培養物轉移至攪拌或震盪懸浮培養系統中。例示性適合酶包括(但不限於)IV型膠原蛋白酶、Dispase®或Accutase®。該等細胞在攪拌或震盪懸浮培養系統、特別是攪拌懸浮培養系統中維持多潛能性。
本發明之另一實施例為一種在懸浮培養物中將多潛能幹細胞培養為細胞團簇之方法，其中該等細胞團簇為使用螯合劑(例如EDTA)自平面黏附培養物轉移並且在攪拌或震盪懸浮培養系統中培養之聚集的多潛能幹細胞。該等細胞團簇在攪拌或震盪懸浮培養系統、特別是攪拌(動態攪動)懸浮培養系統中維持多潛能性。
本發明之另一實施例為一種在懸浮培養物中將多潛能幹細胞培養為細胞團簇之方法，其中該等細胞團簇為使用酶Accutase®自平面黏附培養物轉移並且在攪拌或震盪懸浮培養系統中培養之聚集的多潛能幹細胞。該等細胞團簇在動態攪動懸浮培養系統中維持多潛能性。
本發明之細胞團簇可分化為中胚層細胞，諸如心臟細胞、外胚層細胞(諸如神經細胞)、單一激素陽性細胞或胰腺內胚層細胞。該方法可進一步包括分化，例如胰腺內胚層細胞分化為胰腺前體細胞及胰腺激素表現細胞。在另一實施例中，胰腺前體細胞藉由β細胞轉錄因子PDX1及NKX6.1之表現來表徵。
在一個實施例中，分化步驟係在懸浮培養系統中至少12小時、至少24小時、至少36小時、至少48小時、至少72小時、至少96小時、至少120小時、至少144小時、至少168小時、至少196小時或更久、較佳地約48小時至約72小時之後進行。分化可使用培養基組分之階段式進展(stage-wise progression)來進行，諸如以下實例或表A中所述。
在一個實施例中，三維細胞團簇之生產係藉由：使多潛能幹細胞在平面黏附培養物中生長；使該等多潛能幹細胞擴增為聚集之細胞團簇；以及使用酶或螯合劑將該等多潛能幹細胞團簇自該平面黏附培養 物轉移至動態懸浮培養物中。進一步實施例為一種在動態攪動懸浮培養系統中擴增及分化多潛能幹細胞之方法，其藉由：使多潛能幹細胞在平面黏附培養物中生長；使該等多潛能幹細胞擴增為聚集之細胞團簇；以及使用酶或螯合劑將該等多潛能幹細胞團簇自該平面黏附培養物轉移至動態懸浮培養物中；以及使該等多潛能細胞團簇在動態攪動懸浮培養系統中分化以產生胰腺前體細胞族群。
另一實施例為一種可移植幹細胞衍生細胞產物，其包含自分化為胰腺前體細胞之經擴增多潛能幹細胞團簇的懸浮液製備之分化幹細胞。更具體而言，可移植幹細胞衍生產物之生產係藉由：使多潛能幹細胞在平面黏附培養物中生長；使該等多潛能幹細胞擴增為聚集之細胞團簇；以及使用酶或螯合劑將該等多潛能幹細胞團簇自該平面黏附培養物轉移至動態懸浮培養物中；以及使該等多潛能細胞團簇在動態攪動懸浮培養系統中分化。可移植幹細胞衍生細胞產物較佳係用於治療糖尿病。
在另一實施例中，該方法包括：移植至糖尿病動物中以進一步活體內成熟為功能性胰腺內分泌細胞。
另一實施例為一種在懸浮培養系統中擴增及分化多潛能幹細胞之方法，其包含：使多潛能幹細胞在平面黏附培養物中生長；使用酶自平面黏附培養物移除該等多潛能幹細胞；將該等多潛能幹細胞黏附於靜態培養物中之微載體；使該等多潛能細胞在動態攪動懸浮培養系統中擴增；以及使該等多潛能細胞在動態攪動懸浮培養系統中分化以產生胰腺前體細胞族群。
該等微載體可具有所屬技術領域中用於黏附細胞已知之任何形式，具體而言該等微載體可為珠粒。該微載體可包含天然或合成衍生之材料。實例包括基於膠原蛋白之微載體、基於葡聚糖之微載體、或基於纖維素之微載體。例如，微載體珠粒可為具有附接於表面之陽離子三甲銨以向微載體提供帶正電表面之經修飾聚苯乙烯珠粒。珠粒直徑可介於約90至約200μm、或者約100至約190μm、或者約110至約180μm、或者約125至約175μm直徑範圍內。微載體珠粒亦可為化學偶合於交聯葡聚糖基質之變性膠原蛋白薄層。微載體珠粒可為玻璃、 陶瓷、聚合物(諸如聚苯乙烯)或金屬。此外，微載體可未經塗布或經諸如矽或蛋白(諸如膠原蛋白)塗布。在一進一步態樣中，該微載體可由下列構成或經下列塗覆：增強該細胞與該微載體之結合以及增強該細胞自該微載體釋出之化合物，包括但不限於玻尿酸鈉(sodium hyaluronate)、聚(單硬脂醯甘油酯共-琥珀酸)(poly(monostearoylglyceride co-succinic acid))、聚-D,L-乳酸交酯-共-乙交酯、纖連蛋白素(fibronectin)、層黏蛋白(laminin)、彈性蛋白、離胺酸、正異丙基丙烯醯胺、玻璃連接蛋白(vitronectin)與膠原蛋白。實例進一步包括帶有微電流(microcurrent)之微載體，例如帶有粒狀之鋅與銅伽凡尼電偶(galvanic couple)的微載體，其會產生低度生物相關電流；或具有順磁性的微載體，例如順磁性鈣-藻酸鹽微載體。
在一些實施例中，胰腺內胚層細胞族群藉由多潛能細胞團簇之逐步分化獲得。在一些實施例中，多潛能細胞為人類胚胎多潛能幹細胞。在本發明之一態樣中，表現定形內胚層譜系所特有之標記的細胞為原條前體細胞。在替代態樣中，表現定形內胚層譜系所特有之標記的細胞為中內胚層細胞。
在一些實施例中，本發明係關於分化多潛能細胞之逐步方法，其包含在動態懸浮培養物中培養第3至5階段之細胞。在一些實施例中，所產生之胰腺內胚層族群係經移植至糖尿病動物中以進一步活體內成熟為功能性胰腺內分泌細胞。本發明亦提供用於本發明方法之系統或套組。
本發明亦提供可藉由本發明方法獲得之細胞或細胞族群。本發明亦提供藉由本發明方法獲得之細胞或細胞族群。
本發明提供治療方法。具體言之，本發明提供用於治療罹患糖尿病或具有罹患糖尿病風險的患者之方法。
本發明亦提供可藉由或藉由本發明方法獲得之細胞或細胞族群，該細胞或細胞族群可用於治療之方法。具體言之，本發明提供可藉由或藉由本發明方法獲得之細胞或細胞族群，該細胞或細胞族群可用於治療罹患糖尿病或具有罹患糖尿病風險的患者之方法。糖尿病可為1型或2型糖尿病。
在一個實施例中，該治療方法包含將藉由或可藉由本發明方法獲得之細胞植入患者中。
在一個實施例中，該治療方法包含：於活體外使多潛能幹細胞分化為第1階段、第2階段、第3階段、第4階段、第5階段或第6階段細胞(例如如本文所述)，以及將分化細胞植入患者中。
在一個實施例中，該方法進一步包含在分化多潛能幹細胞之步驟之前，培養多潛能幹細胞之步驟(例如如本文所述)。
在一個實施例中，該方法進一步包含在植入步驟之後，於活體內分化細胞之步驟。
在一個實施例中，該患者為哺乳動物，較佳為人類。
在一個實施例中，該等細胞可作為分散細胞植入或形成為團簇，該等團簇可植入或替代地輸注至肝門靜脈中。或者，細胞可提供在生物相容性可降解聚合支撐物、多孔不可降解裝置中或經囊封以避免宿主免疫反應。該等細胞可植入接受者的任何適當位點中。植入位點包括例如肝、天然胰腺、腎囊下空間、網膜、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、或皮下小袋。
為了增強活體內植入細胞之進一步分化、存活或活性，可在該等細胞之投予之前、同時或之後投予諸如生長因子、抗氧化劑或消炎劑之額外因子。此等因子可藉由內源細胞分泌並且原位暴露於所投予之細胞。植入細胞可藉由所屬技術領域中已知之內源生長因子與所屬技術領域中已知之外源投予生長因子之任何組合誘導分化。
用於植入之細胞的量取決於數種不同因素，包括患者之病狀及對治療之反應，並且可由所屬技術領域中具有通常知識者決定。
在一個實施例中，該治療方法進一步包含在植入之前，將細胞併入至三維支撐物中。細胞可在植入至患者之前，活體外維持於此支撐物上。或者，含有細胞之支撐物可直接植入患者而無需額外活體外培養。該支撐物可選地併入有至少一種促進植入細胞之存活及功能之醫藥劑。
在本發明之某些實施例中，表A中所列之一或多種組分可用於本發明方法中：
如本文所用，「MCX化合物(MCX compound)」為14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮雜四環[19.3.1.1~2,6-~.1~8,12.~]二十七-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬-烯-16-酮，其具有下式(式1)：
其他環狀苯胺-吡啶并三亦可替代上述MCX化合物使用。該等化合物包括(但不限於)14-甲基-3,5,7,14,18,24,28-七氮雜四環[20.3.1.1~2,6~.-1~8,12~]二十八-1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24-壬烯-17-酮及5-氯-1,8,10,12,16,22,26,32-八氮雜五環[24.2.2.1~3,7~-1~9,13~.1~14,18~]三十三-3(33),4,6,9(32),10-,12,14(31),15,17-壬烯-23-酮。此等化合物如下所示(式2及式3)：
例示性適合化合物揭示於美國專利申請公開案第2010/0015711號中，該案之揭示內容全文併入，其係關於該等MCX化合物、相關環狀苯胺-吡啶并三及其合成。
此文件中所引用之出版物藉此以全文引用方式併入本文中。
圖1A為在實例1之分化方案的過程中來自每日培養基樣本之氧分壓隨時間(分化天數)變動所繪製的圖。
圖1B為在實例1之分化方案的過程中來自每日培養基樣本之葡萄糖水準隨時間(分化天數)變動所繪製的圖。
圖1C為在實例1之分化方案的過程中來自每日培養基樣本之乳酸鹽水準隨時間(分化天數)變動所繪製的圖。
圖1D為在實例1之分化方案的過程中來自每日培養基樣本之pH水準隨時間(分化天數)變動所繪製的圖。
圖2A為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5.1階段第1天關於PDX1表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2B為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於NKX6.1表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2C為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於PAX4表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2D為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於PAX6表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2E為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於NEUROG3(NGN3)表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2F為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於ABCC8表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2G為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於染色顆粒素A(CHGA)表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2H為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於G6PC2表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2I為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於IAPP表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2J為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於胰島素表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2K為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於GC6表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2L為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於PTF1A表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖2M為在實例1之分化方案的過程中自第1階段至第5階段第1天關於NEUROD1表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3A為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於PDX1表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3B為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於NKX6.1表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3C為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於PAX6表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3D為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於NEUROD1表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3E為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於NEUROG3(NGN3)表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3F為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於SLC2A1表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3G為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於PAX4表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3H為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於PCSK2表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3I為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於染色顆粒素A(CHGA)表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3J為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於染色顆粒素B(CHGB)表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3K為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段的第7天關於胰腺多肽表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3L為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段的第7天關於PCSK1表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3M為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段的第7天關於G6PC2表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖3N為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段第7天關於升糖素表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖30為在實例1之分化方案的過程中自第5階段第3天至第6階段的第7天關於胰島素表現之即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖4為根據實例1之方案分化並且針對以下各者染色之第1階段細胞的FACS分析圖：CD9(X軸)與CD184/CXCR4(Y軸)共染色；及CD99(X軸)與CD184/CXCR4(Y軸)共染色。
圖5A為根據實例1之方案分化並且針對以下各者染色之第4階段細胞的FACS分析圖：染色顆粒素A(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及PDX1(X軸)與Ki67(Y軸)共染色。
圖5B為根據實例1之方案分化並且針對以下各者染色之第4階段細胞的FACS分析圖：染色顆粒素A(X軸)與NKX2.2(Y軸)共染色；及NEUROD1(X軸)與APC-A(Y軸)共染色。
圖6A為根據實例1條件A之方案分化並且針對以下各者染色之第5階段細胞的FACS分析圖：染色顆粒素A(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；染色顆粒素A(X軸)與NKX.2(Y軸)共染色；C肽(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及胰島素(X軸)與升糖素(Y軸)共染色。
圖6B為根據實例1條件A之方案分化並且針對以下各者染色之第5階段細胞的FACS分析圖：PDX1(X軸)與Ki67(Y軸)共染色；PAX6(X軸)與OCT4(Y軸)共染色；NEUROD1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及PDX1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色。
圖7A為根據實例1條件B之方案分化並且針對以下各者染色之第5階段細胞的FACS分析圖：染色顆粒素A(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；染色顆粒素A(X軸)與NKX2.2(Y軸)共染色；C肽(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及胰島素(X軸)與升糖素(Y軸)共染色。
圖7B為根據實例1條件B之方案分化並且針對以下各者染色之第5階段細胞的FACS分析圖：PDX1(X軸)與Ki67(Y軸)共染色；PAX6(X軸)與OCT4(Y軸)共染色；NEUROD1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及PDX1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色。
圖8A為根據實例1條件C之方案分化並且針對以下各者染色之第5階段細胞的FACS分析圖：染色顆粒素A(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；染色顆粒素A(X軸)與NKX2.2(Y軸)共染色；C肽(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及胰島素(X軸)與升糖素(Y軸)共染色。
圖8B為根據實例1條件C之方案分化並且針對以下各者染色之第5階段細胞的FACS分析圖：PDX1(X軸)與Ki67(Y軸)共染 色；PAX6(X軸)與OCT4(Y軸)共染色；NEUROD1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及PDX1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色。
圖9A為根據實例1條件A之方案分化並且針對以下各者染色之第6階段細胞的FACS分析圖：染色顆粒素A(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；染色顆粒素A(X軸)與NKX2.2(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與升糖素(Y軸)共染色；C肽(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及C肽(X軸)與胰島素(Y軸)共染色。
圖9B為根據實例1條件A之方案分化並且針對以下各者染色之第6階段細胞的FACS分析圖：PDX1(X軸)與Ki67(Y軸)共染色；PAX6(X軸)與OCT4(Y軸)共染色；NEUROD1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及PDX1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色。
圖10A為根據實例1條件B之方案分化並且針對以下各者染色之第6階段細胞的FACS分析圖：染色顆粒素A(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；染色顆粒素A(X軸)與NKX.2(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與升糖素(Y軸)共染色；C肽(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及C肽(X軸)與胰島素(Y軸)共染色。
圖10B為根據實例1條件B之方案分化並且針對以下各者染色之第6階段細胞的FACS分析圖：PDX1(X軸)與Ki67(Y軸)共染色；PAX6(X軸)與OCT4(Y軸)共染色；NEUROD1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及PDX1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色。
圖11A為根據實例1條件C之方案分化並且針對以下各者染色之第6階段細胞的FACS分析圖：染色顆粒素A(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；染色顆粒素A(X軸)與NKX.2(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與升糖素(Y軸)共染色；C肽(X軸)與 NKX6.1(Y軸)共染色；及C肽(X軸)與胰島素(Y軸)共染色。
圖11B為根據實例1條件C之方案分化並且針對以下各者染色之第6階段細胞的FACS分析圖：PDX1(X軸)與Ki67(Y軸)共染色；PAX6(X軸)與OCT4(Y軸)共染色；NEUROD1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；胰島素(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色；及PDX1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色。
圖12為關於根據實例1之方案分化的第4階段細胞(第15天)、第5階段細胞(第19天及第22天)及第6階段細胞(第25天及第29天)之MAFA表現之定量逆轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)結果的圖。
圖13為第6階段第7天之細胞的MAFA表現之顯微照片。
圖14為實例2之第3階段至第4階段的pH、溶解氧及細胞濃度設定點流程圖。
圖15A描繪兩個圖，該等圖顯示根據實例2進行之分化自第3階段起始至第4階段第3天的pH連續監測期間之pH水準。
圖15B描繪兩個圖，該等圖顯示根據實例2進行之分化自第3階段起始至第4階段第3天的DO連續監測期間之溶解氧水準。
圖16A為根據實例2進行之分化自第3階段起始至第4階段第3天的每日培養基樣本之葡萄糖水準隨時間變動繪製之圖。
圖16B為根據實例2進行之分化自第3階段起始至第4階段第3天的每日培養基樣本之乳酸鹽水準隨時間變動繪製之圖。
圖17為根據實例2進行之分化自第3階段起始至第4階段第3天的每日培養基樣本之細胞計數隨時間變動繪製之圖。
圖18A為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於PDX1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18B為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於NKX6.1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18C為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於PAX4表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18D為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於PAX6表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18E為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於NEUROG3(NGN3)表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18F為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於ABCC8表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18G為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於染色顆粒素A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18H為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於染色顆粒素B表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18I為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於ARX表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18J為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於飢餓肽表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18K為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於IAPP表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18L為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於PTF1A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18M為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於NEUROD1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖18N為在實例2之分化方案的過程中自第3階段第1天至第4階段第2天關於NKX2.2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖19描繪根據實例2之方案在第3階段pH設定點7.0和7.4分化並且針對以下各者染色之第3階段細胞的FACS分析圖：NEUROD1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色。
圖20描繪根據實例2之方案在第3階段pH設定點7.0和7.4分化並且針對以下各者染色之第4階段細胞的FACS分析圖：NEUROD1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色。
圖21A為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於NEUROG3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21B為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於NEUROD1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21C為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於NKX2.2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21D為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於ARX表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21E為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於染色顆粒素A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21F為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於PCSK2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21G為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於ABCC8表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21H為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於G6PC2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21I為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於胰島素表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21J為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於ISL1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21K為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於SLC2A1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21L為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於SLC30A8表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21M為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於NKX6.1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21N為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於UCN3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21O為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於MAFA表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21P為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於PPY表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21Q為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於飢餓肽表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21R為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於GCG表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖21S為在實例2之分化方案的過程中自第4階段第2天至第5階段第7天關於SST表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖22描繪第6階段第7天細胞中胰島素及MAFA之表現的顯微照片。
圖23描繪根據實例2之方案分化並且針對以下各者染色之第5階段第6天細胞的FACS分析圖：NKX6.1(X軸)與NEUROD1(Y軸)共染色；NKX6.1(X軸)隨細胞計數(Y軸)之變動；及NEUROD1(X軸)隨細胞計數(Y軸)之變動。頂部圖係關於條件A且底部圖係關於條件C。
圖24A描繪根據實例3在反應器B、C、及D中進行之分化自第3階段起始至第5階段的pH連續監測期間之pH水準之圖。
圖24B描繪顯示根據實例3在反應器B、C、及D中進行之分化自第3階段起始至第5階段的DO連續監測期間之溶解氧水準之圖。
圖25為根據實例3在反應器B、C、及D中進行之分化自第3階段起始至第5階段的每日培養基樣本之細胞計數隨時間變動繪製之圖。
圖26A為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於PDX1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26B為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於NKX6.1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26C為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於PAX4表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26D為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於PAX6表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26E為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於NEUROG3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26F為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於ABCC8表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26G為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於染色顆粒素A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26H為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於染色顆粒素B表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26I為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於ARX表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26J為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於飢餓肽表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26K為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於IAPP表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26L為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於PFT1A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26M為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於NEUROD1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖26N為在實例3之分化方案的過程中在反應器B、C、及D中自第3階段第1天至第5階段第1天關於NKX2.2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27A為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於NEUROG3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27B為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於NEUROD1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27C為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於染色顆粒素A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27D為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於染色顆粒素B表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27E為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於GCG表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27F為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於IAPP表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27G為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於ISL1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27H為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於MAFB表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27I為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於胰腺多肽表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27J為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於生長抑素表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27K為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於胰島素表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27L為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於G6PC2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27M為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於PCSK1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27N為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於PCSK2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖270為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於SLC30A8表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27P為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於NKX6.1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27Q為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於NKX2.2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27R為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於MNX1(HB9)表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖27S為在實例4之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第7天關於UCN3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28A為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於NEUROG3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28B為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於NEUROD1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28C為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於NKX6.1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28D為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於染色顆粒素A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28E為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於染色顆粒素B表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28F為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於GCG表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28G為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於IAPP表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28H為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於MAFB表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28I為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於PAX6表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28J為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於生長抑素表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28K為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於胰島素表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28L為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於G6PC2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28M為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於PCSK1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28N為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於SLC30A8表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖280為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於MNX1(HB9)表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖28P為在實例5之分化方案的過程中自第5階段第1天至第6階段第4天關於UCN3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖29為經移植至NSG小鼠腎囊下之實例5第6階段第1天細胞對腹膜內葡萄糖注射之c肽反應之圖。
圖30A為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於ABCC8表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30B為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於ALB表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30C為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於ARX表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30D為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於CDX2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30E為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於染色顆粒素A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30F為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於染色顆粒素B表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30G為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於G6PC2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30H為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於GCG表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30I為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於飢餓肽表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30J為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於IAPP表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30K為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於胰島素表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30L為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於ISL1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30M為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於MAFB表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30N為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於MNX1(HB9)表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖300為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於NEUROD1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30P為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於NEUROG3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30Q為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於NKX2.2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30R為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於NKX6.1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30S為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於PAX4表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30T為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於PAX6表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30U為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於PCSK1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30V為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於PCSK2表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30W為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於PDX1表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30X為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於胰腺多肽表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30Y為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於PTF1A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30Z為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於SLC30A8表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30A'為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於SST表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30B'為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於UCN3表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖30C'為在實例6之分化方案的過程中自第3階段第1天至分化方案結束，關於WNT4A表現之即時qRT-PCR結果的圖。
圖31為實例5細胞(標準N=7及略4，N=7)在分化之第5階段第7天經移植至NSG小鼠腎囊下，對腹膜內葡萄糖注射之平均c肽反應之圖(+/-標準差)。
圖32為根據實例7之方案分化並且針對NKX6.1(X軸)與NEUROD1(Y軸)共染色的第5階段第7天細胞之FACS分析圖。
圖33為根據實例7之方案分化並且針對PDX1(X軸)與NKX6.1(Y軸)共染色的第5階段第7天細胞之FACS分析圖。
圖34為根據實例7之方案分化並且針對NKX6.1(X軸)與胰島素(X軸)共染色的第5階段第7天細胞之FACS分析圖。
圖35為經移植至NSG小鼠(N=7)腎囊下之實例7的第5階段第8天細胞在移植後6週在腹膜內葡萄糖注射之前及之後的c肽反應圖。
圖36為經移植至NSG小鼠(N=7)腎囊下之實例7的第5階段第8天細胞在移植後12週在腹膜內葡萄糖注射之前及之後的c肽反應圖。
圖37A及37B為實例8之旋轉燒瓶內的培養基之pH特性圖。
圖38為實例8之細胞的乳酸鹽產量圖。
圖39描繪實例8之細胞的活/死(LIVE/DEAD)螢光成像。
實例
本發明進一步藉由以下非限制性實例說明。
實例1
此實例示範使用0.5公升旋轉燒瓶在攪拌懸浮培養系統中形成胰島素表現細胞。培養基及氣體經由可移除側臂蓋交換。胰島素陽性細胞在逐步製程中形成，其中細胞首先表現PDX1並且接著亦共表現NKX6.1，其為胰腺β細胞形成及功能所需之一種蛋白轉錄因子。除了PDX1及NKX6.1之外，此等共表現細胞在懸浮培養物中接著獲得胰島素表現及稍後MAFA的表現。當此細胞族群移植至免疫功能不全小鼠之腎囊中時，移植物在植入四週內生產可偵測血液水準之人類C肽。
人類胚胎幹細胞系H1之細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在補充有0.5%重量/體積(「w/v」)無脂肪酸牛血清白蛋白(「FAF-BSA」)(Proliant,Inc.,Boone,Idaho；目錄號68700)之Essential 8TM(「E8TM」)培養基(Life Technologies Incorporated,Carlsbad,California；目錄號A15169-01)中，在動態懸浮下呈圓形聚集團簇形式生長4個繼代。該等團簇接著根據以下方法以單一細胞及2至10個細胞之團簇形式冷凍。將約600至1000百萬個呈聚集團簇形式之細胞轉移至離心管中，並且使用100mL不含鈣或鎂之1X Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水(「DPS -/-」)(Life Technologies；目錄號14190-144)洗滌。在洗滌之後，接著藉由向鬆動之細胞聚集體團塊添加30mL 50體積% StemPro®Accutase®酶 (Life Technologies，目錄號A11105-01)及50體積% DPBS -/-之溶液，以經酶促解聚細胞聚集體。將細胞團簇上下吸移1至3次並且接著在室溫下間歇地渦旋約4分鐘，接著在80至200rcf下離心5min。接著盡可能完全地抽吸Accutase®上清液而不擾亂細胞團塊。接著在硬表面上輕敲離心管約4分鐘，以將團簇解聚為單一細胞及包含2至10個細胞之團簇。4分鐘之後，細胞再懸浮於補充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,NY；目錄號ALX-270-333)及0.5% w/v FAF-BSA之100mL E8TM培養基中，並且在80至200rcf下離心5至12分鐘。接著抽吸上清液並且逐滴添加冷(4℃)Cryostor®細胞保存培養基CS10(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO；目錄號C2874-100mL)以達到每mL 100至150百萬個細胞之最終濃度。此細胞溶液保持於冰浴中，同時等分至2mL冷凍小瓶(Corning Incorporated,Corning,NY；目錄號430488)中，之後使用控制速率冷凍器(CryoMedTM 34L控制速率冷凍器，Thermo Fischer Scientific,Inc.,Buffalo,NY；目錄號7452)如下所述冷凍細胞。腔室冷卻至4℃並且保持該溫度直至樣本小瓶溫度達到6℃，且接著腔室溫度每分鐘降低2℃直至樣本達到-7℃，此時腔室以20℃/min冷卻直至腔室達到-45℃。接著使腔室溫度短暫地以10℃/min上升直至溫度達到-25℃，並且接著腔室以0.8℃/min進一步冷卻直至樣本小瓶達到-40℃。腔室溫度接著以10℃/min冷卻直至腔室達到-100℃，此時腔室接著以35℃/min冷卻直至腔室達到-160℃。腔室溫度接著在-160℃下保持至少10分鐘，之後將小瓶轉移至氣相液氮儲存。此等冷凍保存之高濃度單一細胞接著用作中間/過程中種子材料(「ISM」)。
自液氮儲存移出ISM小瓶，解凍，並且用於接種3公升玻璃、攪拌懸浮槽生物反應器(DASGIP Information and Process Technology GMBH,Juelich,Germany)。該等小瓶自液氮儲存移出並且快速轉移至37℃水浴中持續120秒以解凍。該等小瓶接著移至生物安全櫃(「BSC」)中並且經解凍之內含物經由2mL玻璃吸移管轉移至50mL錐形管中。接著補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Rho激酶抑制劑Y-27632之10mL E8TM培養基以逐滴方式添加至該管中。細胞在80 至200rcf下離心5min。抽吸該管之上清液並且添加補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之10mL新鮮E8TM培養基，且將含有細胞之體積吸移至含有補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之450mL E8TM培養基的培養基轉移瓶(Cap2V8®,Sanisure,Inc.,Moorpark,California)中。瓶內含物接著使用蠕動泵經由無菌、C-Flex®管焊縫(tubing weld)直接泵送至生物反應器中。該生物反應器用預溫至37℃、在70rpm下攪拌之補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632的1000mL E8TM培養基製備，其中溶解氧設定點為30%(空氣O2，且N2經調節)，且控制CO2分壓為5%。該反應器經接種以給出0.225×106個細胞/mL之靶濃度(濃度範圍：0.2至0.5×106個細胞/mL)。
一旦反應器經接種，細胞即在攪拌反應器中形成圓形聚集團簇。在培養物中24小時之後，培養基係經部分交換，即超過80%之初始體積經移除並且添加回補充有0.5% w/v FAF-BSA之1.5L E8TM培養基(新鮮培養基)。此培養基交換過程在接種後48小時重複。當細胞呈圓形聚集團簇在懸浮培養物中三天之後，將細胞自生物反應器泵出，並且轉移至三個0.5L拋棄式旋轉燒瓶(Corning；目錄號3153)中進行分化。所有旋轉燒瓶均維持於補充有5% CO2之37℃加濕培養箱中，並且恆定攪拌速度為60RPM(55至65RPM)。分化方案在下文中描述為條件A、B及C。
在整個分化過程中，旋轉燒瓶係自培養箱中之動態攪動移動至BSC以進行培養基交換。該等旋轉燒瓶在無攪動下保持6分鐘，從而使大多數細胞團簇沉降至容器之底部。6分鐘之後，使旋轉燒瓶側臂蓋脫離並且經由抽吸移除90%或更多之用過培養基。一旦用過培養基經移除，300mL新鮮培養基即經由打開之側臂添加回旋轉燒瓶中。接著更換旋轉燒瓶蓋並且恢復在先前所述條件下在培養箱中之動態懸浮。
第1階段(3天)：
關於條件A，使用MCDB-131培養基製備基礎培養基(「第1階段基礎培養基」)，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉(Life Technologies；目錄號10372-019)；補充有額外2.4g/L碳酸氫銨(Sigma Aldrich；目錄號S3187)、先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM(Life Technologies；目錄號35050-079)；2.5mM葡萄糖(45%於水中；Sigma Aldrich；目錄號G8769)；及胰島素-運鐵蛋白-硒-乙醇胺(「ITS-X」)之1：50,000稀釋液(Life Technologies；目錄號51500056)。細胞在300mL之第1階段基礎培養基中培養一天，該培養基補充有100ng/ml生長/分化因子8(「GDF8」)(Peprotech,Inc.,Rocky Hill,New Jersey；目錄號120-00)；及2μM 14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮雜四環[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]二十七-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬烯-16-酮(「MCX化合物」)。24小時之後，如上文所述完成培養基交換，並且將補充有100ng/mL GDF8但無MCX化合物之新鮮300mL第1階段基礎培養基添加至燒瓶中。細胞維持48小時而無進一步培養基交換。
在條件B中，細胞如條件A所述進行培養，除了3μM MCX化合物用於第一天。
在條件C中，細胞如條件A所述進行培養，除了使用100ng/mL活化素A來代替GDF8並且使用30μM肝醣合成酶激酶3β抑制劑(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2嘧啶基]胺基]乙基]胺基]-3-吡啶甲腈(「CHIR99021」)(Stemgent Inc,Cambridge Massachusetts，目錄號04004-10)來代替MCX化合物。
第2階段(3天)：
關於條件A，使用MCDB-131培養基製備基礎培養基(「第2階段基礎培養基」)，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉且補充有額外1.2g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：50,000稀釋液。在第1階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第1階段培養基並且用補充有50ng/mL纖維母細胞生長因子7(「FGF7」)(R&D Systems,Minneapolis,Minnesota；目錄 號251-KG)之300mL第2階段基礎培養基更換。在培養基交換之後四十八小時，再次移除用過培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之300mL新鮮第2階段基礎培養基更換。
在條件B中，細胞如條件A所述進行培養。
在條件C中，細胞如條件A及B所述進行培養，且進一步添加250μL 1M抗壞血酸(Sigma Aldrich；目錄號A4544，在水中重構)至1L第2階段基礎培養基中。
第3階段(條件A及B為3天，條件C為2天)：
關於條件A，使用MCDB-131培養基製備基礎培養基(「第3至4階段基礎培養基」)，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉且補充有額外1.2g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。在第2階段完成之後，完成培養基交換以用補充有下列之300mL第3至4階段基礎培養基更換用過培養基：50ng/mL FGF-7；100nM骨形態發生(「BMP」)受體抑制劑((6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶鹽酸鹽))(「LDN-193189」，Shanghai ChemPartner Co Ltd.,Shanghai,China)；2μM視黃酸(「RA」)(Sigma Aldrich；目錄號R2625)；0.25μM N-[(3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)亞甲基]-4-(苯基甲基)-1-哌胺(「SANT-1」)(Sigma Aldrich；目錄號S4572)；及400nM PKC活化劑((2S,5S-(E,E)-8-(5-(4-三氟甲基)苯基-2,4-戊二烯醯基胺基)苯并內醯胺(「TPB」)(Shanghai ChemPartner Co Ltd.,Shanghai,China)。培養基交換後二十四小時，再次用含有除LDN-193189外之以上補充物的300mL新鮮第3至4階段基礎培養基更換用過培養基。細胞在培養基中培養48小時。
在條件B中，細胞如條件A所述進行培養。
在條件C中，細胞如條件A及B所述進行培養，且進一步添加250μL/L 1M抗壞血酸溶液至第3至4階段基礎培養基中。此外，第3階段起始後48小時，細胞移至如下文所述之第4階段培養基中。
第4階段(條件A及B為3天，條件C為4天)：
關於條件A，在第3階段完成之後，移除用過培養基並且用補充有0.25μM SANT-1及400nM TPB之300mL第3至4階段基礎培養基更換。在第4階段起始之後四十八小時，3.2mL/L 45%葡萄糖溶液(8mM葡萄糖單劑)添加至燒瓶中並且細胞在培養基中再培養24小時。
在條件B中，細胞如條件A所述進行培養。
在條件C中，細胞如條件A及B進行培養，除了第3至4階段基礎培養基進一步補充有0.1μM RA、50ng/mL FGF7、及250μL/L 1M抗壞血酸溶液。四十八小時後，用過培養基使用相同新鮮培養基(具有條件C培養基補充物)交換並且細胞再培養48小時。
第5階段(7天)：
關於條件A、B及C，使用MCDB-131培養基基礎製備基礎培養基(「第5+階段基礎培養基」)，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉且補充有額外1.75g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；10mg/L肝素(Sigma Aldrich；目錄號H3149-100KU)。在第4階段完成之後，用補充有1μM呈3,3',5-三碘-L-甲狀腺胺酸鈉鹽形式之T3(「T3」)(Sigma Aldrich；目錄號T6397)、10μM 2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(「ALK5抑制劑II」)(Enzo Life Sciences,Inc.；目錄號ALX-270-445)、100nM γ分泌酶抑制劑XX(EMD Millipore Corporation,Gibbstown,NJ，目錄號565789)；20ng/mL β細胞素(R&D Systems，目錄號261-CE-050)；0.25μM SANT-1；及100nM RA之300mL第5+階段基礎培養基完成培養基交換。在第5階段起始之後四十八小時，移除用過培養基並且用300mL相同培養基及補充物更換。四十八小時之後，移除培養基並且用補充有1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、20ng/mL β細胞素、及100nM RA之第5+階段 基礎培養基更換。四十八小時之後，再次交換培養基並且用補充有1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、20ng/mL β細胞素、及100nM RA之第5+階段基礎培養基更換。
第6階段(7天)：
在最後第5階段培養基交換之後二十四小時，條件A、B及C之培養基用補充有1μM T3及10μM ALK5抑制劑II之第5+階段基礎培養基交換。在第6階段之第2、4及6天結束時用此經補充培養基進行培養基交換。
在整個分化過程中，每日均自懸浮培養物收集樣本。每日細胞樣本係經分離以進行mRNA分析(qRT-PCR)並且收集用過培養基以進行代謝分析。在所選階段結束時，經由流動式細胞測量術或螢光免疫-組織化學量測蛋白表現。使用NOVA® BioProfile® FLEX生物分析儀(Nova Biomedical Corporation,Waltham,MA)分析用過培養基。
圖1A至D描繪在分化之每日結束時由用過培養基樣本獲得之來自NOVA® BioProfile FLEX分析儀之數據(圖1A-pO2/氧分壓；圖1B-葡萄糖濃度；圖1C-乳酸鹽濃度；圖1D-培養基pH)。此等數據證明關於分化第1階段之最初3天，與分化之稍後階段相比，細胞為最具氧消耗性。第1階段中之細胞使pO2水準自140+ mm Hg之飽和水準降至低於100mm Hg，如藉由NOVA®分析儀所偵測(圖1A)。此外，第1階段細胞消耗培養基中之幾乎所有葡萄糖(圖1B)並且在該過程之最初三天產生每公升超過1公克乳酸鹽(圖1C)。
當細胞移至分化之第2及3階段時，如與第1階段相比，其氧及葡萄糖消耗及乳酸鹽產生均改變。在第1階段中用GDF8及MCX化合物(條件A或B)處理之細胞，相較於在第1階段中用活化素A及CHIR99021(條件C)處理之細胞，在第2階段中更具氧消耗性(圖1A)。當比較條件A或B與條件C時，此增加之氧消耗的觀察結果與用過培養基中之較低pH(圖1D及表1)、增加之乳酸鹽產生(圖1C)、及較高之葡萄糖消耗(圖1B)相關。
當細胞進展至第4階段(條件A及B為第10、11及12天；條件C為第9、10、11及12天)時，與用條件C處理之細胞(圖1B及表1)相比，用條件A及B處理之細胞保留增加的葡萄糖消耗水準及降低之培養基pH。然而，自第14天(第5階段之第2天)至第19天(第5階段結束)，觀察到葡萄糖水準在所有處理條件下均未降至低於每公升3公克。一旦第6階段開始，在所有三種條件下(圖1B，第20天開始)，用過培養基葡萄糖水準傾向於低於每公升2.4公克。此葡萄糖消耗增加未伴隨超過每公升0.5公克之總乳酸鹽產量增加(圖1C)，亦未伴隨用過培養基之酸化(圖1D)，表明細胞轉化為更低醣解並且更成熟的代謝，與胰島內分泌激素細胞族群一致。
除了經由每日取樣監測用過培養基之代謝型態，亦在整個分化過程中獲得細胞之代表性樣本，並且經由Applied Biosystems® OpenArray®(Life Technologies)測試一組基因之mRNA表現並且計算相較於自實驗開始後培養24小時之多潛能ISM細胞之表現倍數差異。圖2A至M描繪以下基因在直到分化至第5階段第一天的細胞中之表現數據：PDX1(圖2A)；NKX6.1(圖2B)；PAX4(圖2C)；PAX6(圖2D)；NEUROG3(NGN3)(圖2E)；ABCC8(圖2F)；染色顆粒素-A(「CHGA」)(圖2G)；G6PC2(圖2H)；IAPP(圖2I)；胰島素(「INS」)(圖2J)；升糖素(「GCG」)(圖2K)；PTF1a(圖2L)；及NEUROD1(圖2M)。
如圖2A中所示，在所有三種分化條件下，至第2階段第3天(「S2D3」)結束時，細胞開始表現PDX1並且採用胰腺命運。當細胞進入第3階段時，細胞開始表現指示內分泌胰腺規格之基因(NGN3、NEUROD1、及CHGA；圖2E、2M、及2G)，並且至第3階段結束及第4階段開始時，其開始表現β細胞形成所需之基因(PAX4、PAX6、及NKX6.1；圖2C、2D、及2B)。至第5階段開始時，細胞開始表現胰島及β細胞形成及功能所需之標記(GCG、INS、IAPP、G6PC2、及ABCC8；圖2K、2J、2I、2H、及2F)。
亦在第5及6階段收集樣本並且藉由OpenArray®即時PCR分析來分析以下基因之表現：PDX1(圖3A)；NKX6.1(圖3B)； PAX6(圖3C)；NEUROD1(圖3D)；NEUROG3(NGN3)(圖3E)；SLC2A1(圖3F)；PAX4(圖3G)；PCSK2(圖3H)；染色顆粒素-A(圖3I)；染色顆粒素-B(圖3J)；PPY(圖3K)；PCSK1(圖3L)；G6PC2(圖3M)；升糖素(圖3N)；及胰島素(圖3O)。如圖3A至3D中所示，觀察到PDX1、NKX6.1、PAX6、及NEUROD1表現水準自第5階段第3天(「S5D3」)至第6階段第7天(S6D7)結束時為穩定。當細胞暴露於γ分泌酶抑制劑時(第5階段第1天至第4天)，NGN3、SLC2A1及PAX4之mRNA表現水準為最高，並且在移除γ分泌酶抑制劑之後表現水準下降(圖3E至3G)。基因PCSK2、CHGA及CHGB顯示在第5階段結束時表現增加(圖3M至3O)，而基因PPY、PCSK1、G6PC2、GCG及INS自第5階段開始直至第6階段結束持續上升(圖3K、3L、3M、3N、3O)。
關於各個階段之額外表徵，在第1、4、5及6階段結束時採集細胞並且藉由流動式細胞測量術進行分析。簡言之，細胞聚集體在37℃下使用TrypLETM Express(Life Technologies；目錄號12604)3至5分鐘以解離為單一細胞。關於表面染色，經釋放之單一細胞以2百萬個細胞/mL之最終濃度再懸浮於以1：4稀釋於染色緩衝液中之0.5%人類γ球蛋白中。直接共軛之初級抗體以1：20之最終稀釋添加至細胞中，隨後在4℃下培養30分鐘。經染色之細胞在染色緩衝液中洗滌兩次，隨後再懸浮於300μL染色緩衝液中並且接著在10μL 7-AAD中培養以進行活/死區分，接著在BD FACSCantoTM II上進行流動式細胞測量術分析。關於細胞內抗體染色，單一細胞首先用紫色螢光活/死細胞染料(Life Technologies，目錄號L34955)在4℃下培養20至30分鐘，隨後在冷PBS-/-中進行單次洗滌。經洗滌之細胞接著在4℃下在280μL Cytofix/CytopermTM固定及滲透溶液(BD目錄號554722)中固定30分鐘。該等細胞接著在1x滲透/洗滌緩衝液(BD目錄號51-2091 KZ)中洗滌2次，接著以2百萬個細胞/mL之最終濃度再懸浮。經固定之細胞懸浮液接著在室溫下使用20%正常山羊血清阻斷10至15分鐘。細胞在4℃下用憑經驗預先決定稀釋倍數之初級抗體培養30分鐘，隨後在滲透/洗滌緩衝液中進行兩次洗滌。細胞接著在4℃下用適當抗體培 養30分鐘並且接著洗滌兩次，隨後在BD FACSCantoTM II上進行分析。所用抗體之濃度顯示於表II中。使用人類胰島或未分化H1細胞作為陽性對照物，測試用於胰腺標記之抗體的特異性。關於二級抗體，添加以下各物並且在4℃下培養30分鐘：1：4,000之抗小鼠Alexa Fluor® 647(Life Technologies，目錄號A21235)或1：100、1：200、或1：800之山羊抗兔PE(Life Technologies，目錄號A10542)，隨後在滲透/洗滌緩衝液中進行最終洗滌，並且使用BD FACSDivaTM軟體在BD FACSCantoTM II上進行分析，其中獲得至少30,000個事件。
圖4描繪來自第1階段結束時之活細胞的流動式細胞測量術點狀圖，其中針對下列表面標記共染色：CD184及CD9；或CD184及CD99(概述於表IIIA中)。圖5描繪來自第4階段結束時之經固定及滲透細胞的流動式細胞測量術點狀圖，其中針對下列細胞內標記對共染色：NKX6.1及染色顆粒素-A；Ki67及PDX1；及NKX2.2及PDX1(概述於表IIIA中)。圖6A及B(條件A)、7A及B(條件B)及8A及B(條件C)顯示來自第5階段結束時之經固定及滲透細胞的流動式細胞測量術點狀圖，其中針對下列細胞內標記對共染色：NKX6.1及染色顆粒素-A；NKX2.2及染色顆粒素-A；NKX6.1及C肽；升糖素及胰島素；Ki67及PDX1；OCT4及PAX6；NKX6.1及NEUROD1；NKX6.1及胰島素；及NKX6.1及PDX1。圖9A及B(條件A)、10A及B(條件B)及11A及B(條件C)描繪藉由流動式細胞測量術量測之來自第6階段結束時之經固定及滲透細胞，其中針對下列細胞內標記對共染色：NKX6.1及染色顆粒素-A；NKX2.2及染色顆粒素-A；升糖素及胰島素；NKX6.1及C肽；胰島素及C肽；Ki67及PDX1；OCT4及PAX6；NKX6.1及NEUROD1；NKX6.1及胰島素；及NKX6.1及PDX1。
在第5階段結束時，如圖6A、7A、及8A中所示並且如表IIIB中所概述，用條件A、B、或C分化之細胞中，分別有17%、12%、或10%共表現胰島素及NKX6.1。在第6階段完成時，觀察到NKX6.1及胰島素共表現細胞之數目增加(條件A 31%；條件B 15%；條件C 14%)。此外，注意到在第6階段結束時，大多數細胞皆表現β細胞 前體標記NKX6.1、內分泌前體標記NKX2.2、及內分泌前體標記NEUROD1(條件A-74% NKX6.1、82% NKX2.2、74% NEUROD1；條件B-75% NKX6.1、76% NKX2.2、67% NEUROD1；條件C-60% NKX6.1、64% NKX2.2、53% NEUROD1)。
除了增加β細胞成熟及功能所需之標記的表現以外，亦觀察到如藉由PDX1及Ki-67之共表現所量測在活性細胞週期中PDX1陽性細胞之百分比自第5階段下降至第6階段(條件A，26%下降至9%；條件B，22%下降至10%；條件C，43%下降至19%)。此外，當藉由流動式細胞測量術所量測之Ki-67的表現在所有3種測試條件下在第5及6階段之過程中下降時，吾人藉由TaqMan® qRT-PCR偵測β細胞特異性轉錄因子MAFA之水準增加。在第6階段結束時之MAFA表現比未分化多潛能幹細胞高出40+倍並且達到在人類胰島組織中所觀察到的表現之大約25%之水準(圖12)。MAFA之蛋白表現係藉由免疫-螢光細胞化學確認，如圖13中所示，該圖為藉由20x物鏡獲得的免疫-螢光核MAFA染色、免疫-螢光細胞質胰島素染色、及泛核染色(「DAPI」)之顯微照片。
上文所述之此等結果指示，自第5階段移至第6階段之細胞自增生性胰腺內分泌前驅細胞轉化為內分泌細胞。此等內分泌組織及特定言之胰島素陽性細胞表現與功能性β細胞有關並且為功能性β細胞所需之關鍵標記。與條件C相比，條件A及B(其中細胞在第3及4階段係於顯著低於條件C之pH下培養)至六階段分化過程結束時產生更多染色顆粒素陽性、C肽/NKX6.1共陽性細胞及NEUROD1/NKX6.1共陽性細胞。條件C為所屬技術領域中已知之方法並且揭示於Cell,159：428-439(2014)中。
將在條件A及C下分化至第6階段之細胞自50mL錐形管中之培養基中分離，接著用補充有額外1.2g/L碳酸氫鈉及0.2% w/v FAF-BSA之含有1.18g/L碳酸氫鈉的MCDB-131培養基洗滌2次。該等細胞接著再懸浮於洗滌培養基中並且在室溫下保持約5小時，接著植入NSG小鼠(N=7)之腎囊下。在移植後4、8、10及14週，監測動物之血糖及C肽水準。動物禁食隔夜，給予葡萄糖腹膜內注射，並且在 IP葡萄糖單劑注射之後(「後」)60分鐘經由後眼眶放血抽取血液(表III)。在最早量測時間點(移植後4週)，移植物之功能係藉由可偵測水準之C肽之分泌所量測(表IV)。此外，C肽水準自第4週至第14週呈現上升。
在移植後10週，各動物在葡萄糖單劑注射之前(「前」)及之後(「後」)立即放血。作為參考，高於「前」C肽水準之「後」水準將指示葡萄糖刺激胰島素分泌。吾人注意到，用條件C分化之移植物處理的7隻動物中有6隻顯示較高之「後」C肽水準，並且用條件A分化之移植物處理的7隻動物中有3隻具有較高之「後」C肽水準。
表IV
實例2
此實例示範在攪拌槽閉合回路中由表現PDX1之細胞族群形成胰島素表現細胞，該攪拌槽閉合回路允許經由反應器中之反饋pH及DO感測器，直接電腦控制培養基之pH及溶解氧濃度。由此製程產生之胰島素陽性細胞保留PDX1表現及共表現NKX6.1。該等胰島素陽性細胞係由在第3階段至第5階段中暴露於四種不同條件(A、B、C、及D)之細胞產生(表V)。觀察到當根據條件C(在第3階段開始時pH 7.0且細胞濃度為2百萬個/mL)分化之細胞移植至免疫功能不全小鼠之腎囊中時，移植物在植入四週內生產可偵測血液水準之人類C肽。
人類胚胎幹細胞系H1之細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在補充有0.5% w/v FAF-BSA之E8TM中，在動態懸浮下呈圓形聚集團簇形式生長4個繼代。該等團簇接著根據以下方法以單一細胞及2至10個細胞之團簇形式冷凍。將約600至1000百萬個呈聚集團簇形式之細胞轉移至離心管中，並且使用100mL 1X DPS -/-洗滌。在洗滌之後，接著藉由向鬆動之細胞聚集體團塊添加30mL 50體積% StemPro®Accutase®酶及50體積% DPBS -/-之溶液，以經酶促解聚細胞聚集體。將細胞團簇上下吸移1至3次並且接著在室溫下間歇地渦旋約4分鐘，接著在80至200rcf下離心5min。接著盡可能完全地抽吸Accutase®上清液而不擾亂細胞團塊。接著在硬表面上輕敲離心管約4分鐘，以將團簇解聚為單一細胞及包含2至10個細胞之團簇。4分鐘之後，細胞再懸浮於補充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,NY；目錄號ALX-270-333)及0.5% w/v FAF-BSA之100mL E8TM培養基中，並且在80至200rcf下離心5至12分鐘。接著抽吸上清液並且逐滴添加冷(4℃) Cryostor®細胞保存培養基CS10以達到每mL 100至150百萬個細胞之最終濃度。此細胞溶液保留於冰浴中，同時等分至2mL冷凍小瓶中，之後使用控制速率冷凍器(CryoMedTM 34L控制速率冷凍器)如下所述冷凍細胞。腔室冷卻至4℃並且保持該溫度直至樣本小瓶溫度達到6℃，且接著腔室溫度每分鐘降低2℃直至樣本達到-7℃，此時腔室以20℃/min冷卻直至腔室達到-45℃。接著使腔室溫度短暫地以10℃/min上升直至溫度達到-25℃，並且接著腔室以0.8℃/min進一步冷卻直至樣本小瓶達到-40℃。腔室溫度接著以10℃/min冷卻直至腔室達到-100℃，此時腔室接著以35℃/min冷卻直至腔室達到-160℃。腔室溫度接著在-160℃下保持至少10分鐘，之後將小瓶轉移至氣相液氮儲存。此等冷凍保存之高濃度單一細胞接著用作中間/過程中種子材料ISM。
自液氮儲存移出ISM之小瓶，解凍，並且用於接種3公升玻璃、攪拌懸浮槽DASGIP生物反應器。該等小瓶自液氮儲存移出並且快速轉移至37℃水浴中持續120秒以解凍。該等小瓶接著移至BSC中並且經解凍之內含物經由2mL玻璃吸移管轉移至50mL錐形管中。接著補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Rho激酶抑制劑Y-27632之10mL E8TM培養基以逐滴方式添加至該管中。細胞在80至200rcf下離心5min。抽吸該管之上清液並且添加補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之10mL新鮮E8TM培養基，且將含有細胞之體積吸移至含有補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之450mL E8TM培養基的培養基轉移瓶(Cap2V8)中。瓶內含物接著使用蠕動泵經由無菌、C-Flex®管焊縫(tubing weld)直接泵送至生物反應器中。該生物反應器用預溫至37℃、在70rpm下攪拌之補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632的1000mL E8TM培養基製備，其中溶解氧設定點為30%(空氣O2，且N2經調節)，且控制CO2分壓為5%。該反應器經接種以給出0.225×106個細胞/mL之靶濃度(濃度範圍：0.2至0.5×106個細胞/mL)。
一旦反應器經接種，細胞即在攪拌反應器中形成圓形聚集團簇。在培養物中24小時之後，培養基係經部分交換，即超過80%之初始 體積經移除並且添加回補充有0.5%w/v FAF-BSA之1.5L E8TM培養基(新鮮培養基)。此培養基交換過程在接種後48小時重複。當細胞呈圓形聚集團簇在懸浮培養物中三天之後，開始進行定向分化。為了起始分化，移除用過培養基並且將分化培養基泵送至生物反應器中並且在該製程之過程中使用如下文所述之培養基交換及分化方案進行交換。
第1階段(3天)：
使用MCDB-131培養基製備基礎培養基，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉；補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉、先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45%於水中)；及ITS-X之1：50,000稀釋液。細胞在補充有100ng/ml GDF8及3μM MCX化合物之1.5L基礎培養基中培養一天。24小時之後，移除用過培養基並且將補充有100ng/mL GDF8之新鮮1.5L基礎培養基添加至反應器中。細胞維持48小時而無進一步培養基交換。
第2階段(3天)：
使用MCDB-131培養基製備基礎培養基，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉且補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：50,000稀釋液。在第1階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第1階段培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之1.5L第2階段基礎培養基更換。在培養基交換之後四十八小時，再次移除用過培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之1.5L新鮮第2階段基礎培養基更換。
第3階段(3天)：
在第2階段完成且在立即要交換培養基之前，將900百萬個細胞經由無菌焊縫及蠕動泵自3公升反應器移出。3公升反應器中之培養 基接著如先前所述進行交換並且用以下第3階段培養基更換：含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該第3階段培養基補充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；及400nM TPB。移出之細胞接著在無菌錐形管中離心，移除用過之培養基，並且該等細胞再懸浮於該第3階段培養基及補充物中。此等細胞接著經由無菌焊縫及蠕動泵轉移至四個分開之來自DASGIPTM的0.2公升玻璃攪拌懸浮槽生物反應器(反應器A、B、C、及D)中。該等0.2公升生物反應器及3公升對照生物反應器中之細胞係暴露於不同的細胞濃度及培養基pH之組合，如圖14及表V中之第3階段至第5階段所示。培養基交換後二十四小時，再次用含有除LDN-193189外之以上補充物的300mL新鮮第3階段培養基更換對照及反應器A至D中之各者中的用過培養基。細胞在培養基中培養48小時。
第4階段(3天)：
在第3階段完成之後，移除用過培養基並且用150mL以下第4階段培養基更換：150mL含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該培養基補充有0.25μM SANT-1及400nM TPB。在第4階段起始之後四十八小時，3.2mL/L 45%葡萄糖溶液(8mM葡萄糖單劑)添加至該等生物反應器中之每一者中並且細胞在培養基中再培養24小時。
第5階段(7天)：
使用150mL含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基基礎為各生物反應器製備第5階段基礎培養基，補充有額外1.754g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；及10mg/L肝素(Sigma Aldrich；目錄號H3149-100KU)。在第4階段完成之後，各生物反應器中之用過培養基與補充有下列之150mL第5階段基礎培養基交換：1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、1μM γ分泌酶抑制劑XXI(EMD Millipore；目錄號565790)；20ng/mL β細胞素；0.25μM SANT-1；及100nM RA。在第5階段起始之後四十八小時，移除用過培養基並且用150mL相同新鮮培養基及補充物更換。四十八小時之後，移除培養基並且用補充有1μM T3、10μM Alk5抑制劑II、20ng/ml β細胞素及100nM RA之第5階段基礎培養基更換。四十八小時之後，培養基再次交換並且用相同新鮮培養基及補充物更換。二十四小時之後標示第5階段之結束並且所產生之細胞經處理用於表徵及分析。
在整個分化過程中，除即時持續監測pH及溶解氧(「DO」)之外，亦每日自反應器收集培養基樣本。在每日結束時之用過培養基藉由NOVA生物分析儀分析。亦分析樣本之細胞數目(Nucleocounter 100)、 mRNA表現(qRT-PCR)、及蛋白表現(流動式細胞測量術及螢光免疫-組織化學)。
圖15A及B描繪在第3及4階段之過程中反應器1、A、B、C、及D之培養基中的pH(圖15A)及溶解氧水準(圖15B)之持續監測圖。圖16A及B描繪在第3及4階段中分化之每日結束時由用過培養基樣本獲得之來自NOVA® BioProfile FLEX分析儀之數據(圖16A-葡萄糖濃度；圖16B-乳酸鹽濃度)。圖17描繪不同反應器及條件A、B、C、及D下之細胞計數趨勢線(亦列為BxA、BxB、BxC、及BxD)。此等數據證明在設定為pH 7.0之反應器中，在第3階段之過程中會出現細胞損失，此與低pH(生物反應器C及D)設定點有關。然而，以每mL 2×106個細胞接種之反應器C至第4階段結束時恢復細胞族群，而具有pH 7.0但細胞接種為每mL 1.0×106個細胞之反應器D並未恢復。同樣地，反應器A及B(pH 7.4及分別以每mL2×106個細胞及1.0×106個細胞接種)也在第4階段中展現顯著細胞損失，雖然兩者在第3階段均維持細胞濃度(圖17)。此等數據指示與在第3階段中維持在pH 7.4下之細胞相比，在第3階段使用pH設定點7.0與等於或大於每mL約1.5×106個細胞、較佳地等於或大於每mL約2.0×106個細胞之組合促進後續分化階段中之較高細胞濃度。
細胞濃度之作用係藉由每日用過培養基中葡萄糖及乳酸鹽之水準反映。反應器C及D兩者在每日結束時皆具有相較於其分別濃度配對pH 7.4對照物A及B而言更多殘餘葡萄糖及更少乳酸鹽。此等結果指示反應器C及D在第3階段期間具有較低代謝活性。然而，當反應器C進展至第4階段時，殘餘葡萄糖水準在第4階段之第一天及第二天結束時可與反應器A中之彼等水準相當，不過乳酸鹽水準保持在反應器C中較低。自此等數據，吾人可推斷反應器C中之細胞已開始採用與反應器A中之細胞相比更加分化、成熟、及更低醣解之表型。
在第3階段完成時，觀察到幾乎所有以1×106(反應器D)或2×106(反應器C)個細胞/mL之起始濃度維持於pH 7.0下之細胞均表現內胚層轉錄因子(FOXA2)及胰腺特異性轉錄因子(PDX1)，以1M(反應器B)或2M(反應器A)之起始密度保持在pH 7.4下之細胞 亦如此，指示低pH處理細胞保留胰腺內胚層規格。此外，在所有五種測試條件下，表現NKX6.1之細胞的百分比在第3階段結束時同樣為低(範圍：5.4至13.6%)。維持在pH 7.4下之細胞(反應器A及B，及對照反應器「1」)在第3階段結束時開始表現NEUROD1，而保持在pH 7.0下之細胞(反應器C及D)顯示降低NEUROD1表現水準，如藉由流動式細胞測量術所量測(表Vi)。在第4階段起始時，反應器C及D之pH設定點恢復至7.4(圖14及15A)。三天後，在第4階段結束時，來自各反應器之樣本藉由流動式細胞測量術分析NKX6.l、NEUROD1、PDX1、FOXA2、CDX2、及Ki67之表現。觀察到在第3階段中維持在pH 7.0下之細胞(反應器C及D)相較於維持在設定為pH 7.4之反應器(生物反應器1、A、及B)中之細胞，在第4階段結束時如藉由細胞內流動式細胞測量術所偵測具有實質上更多之NKX6.1陽性細胞及活性細胞週期細胞(Ki67陽性)，如表VI中所概述。
除藉由流動式細胞測量術測定細胞蛋白表現以外，亦使用OpenArray® qRT-PCR測試分化過程第3及4階段的樣本中之一組基因之mRNA表現。圖18A至N描繪以下基因在分化至第4階段第二天的人類胚胎幹細胞系H1細胞中之即時PCR分析數據：PDX1(圖18A)；NKX6.1(圖18B)；PAX4(圖18C)；PAX6(圖18D)；NeuroG3(NGN3)(圖18E)；ABCC8(圖18F)；染色顆粒素-A(圖18G)；染色顆粒素-B(圖18H)；ARX(圖18I)；飢餓肽(圖18J)；IAPP(圖18K)；PTF1a(圖18L)；NEUROD1(圖18M)；及NKX2.2(圖18N)。
如圖18A中所示，在低(7.0)或標準(7.4)兩種pH分化條件下，細胞在第3階段中表現類似PDX1水準，因為細胞採用胰腺命運。當來自pH 7.4反應器之細胞在NKX6.1表現相對不存在下(圖18B)進展經過第3階段時(反應器BX A及BX B)，其開始表現早期內分泌胰腺細胞發育所需及所特有之多種基因：PAX4、PAX6、NGN3、NEUROD1、NKX2.2、ARX、飢餓肽、CHGA及CHGB，如圖18C、18D、18E、18M、18N、18I、18J、18G、及18H中所示。此基因表 現模式與低NKX6.1表現之組合指示一些早熟(非β細胞)內分泌胰腺規格。
相反地，來自反應器C及D(第3階段pH 7.0)之第3階段細胞藉由OpenArray® qRT-PCR量測，表現相較於反應器A及B顯著較低之內分泌發育所需之轉錄因子(PAX4、PAX6、NGN3、NEUROD1、NKX2.2、及ARX)水準(圖18C、18D、18E、18M、18N、及18I)。此外，觀察到來自反應器C及D之細胞在第4階段第一天具有增加之NKX6.1(β細胞形成所需之轉錄因子)，隨後在第4階段第二天具有PAX6、NEUROD1、及NKX2.2之表現增加(圖18D、18M、18N、及18B)。此等qRT-PCR數據與流動式細胞測量術結果相關，該等流動式細胞測量術結果證明對於在第3階段中維持於pH 7.0下之細胞而言，在第3及4階段結束時表現NEUROD1之細胞百分比降低及表現NKX6.1之細胞數目增加(表VI、圖19、及圖20)。此等數據表明在第3階段中之低pH(7.0)會抑制早熟(非β細胞)內分泌胰腺規格並且促進形成β細胞所需之轉錄因子表現序列。
經由在第3階段中降低培養基之pH，延遲或降低與非β細胞內分泌胰腺規格有關之基因表現的作用持續至分化之第5階段。NGN3基因表現為胰腺發育中適當內分泌激素細胞發育所需，並且在條件A(在第3階段中pH 7.4)及C(pH 7.0)下，NGN3之表現係回應於用含有γ分泌酶抑制劑之第5階段培養基處理細胞而經誘導。然而，關於根據條件C細胞分化之細胞，注意到峰值NGN3表現有一天之延遲(圖21A)。此外，藉由NGN3表現誘導或調節之多種基因亦在條件C(第3階段pH 7.0)分化細胞中延遲。諸如NEUROD1(圖21B)、NKX2.2(圖21C)、ARX(圖21D)、染色顆粒素A/CHGA(圖21E)、及PCSK2(圖21F)之內分泌特異性基因均顯示類似NGN3之表現遲滯。然而，與β細胞特異性相關之基因-ABCC8(圖21G)、G6CP2/葡萄糖6磷酸酯酶(圖21H)、胰島素/INS(圖21I)、胰島1/ISL1(圖21J)、葡萄糖轉運蛋白1/SLC2A1(圖21K)、鋅轉運蛋白/SLC30A8(圖21L)、及NKX6.1(圖21M)在來自條件A及C之細胞中同時並且以相同量值出現。此外，如圖 21N中所示，相較於維持於pH 7.4(反應器A)下之細胞，在反應器C(第3階段pH 7.0)中分化之細胞中與功能性β細胞之適當成熟相關之基因UCN3的表現在整個第5階段中增加，指示在第3階段中暴露於pH 7.0促進此過程中β細胞之後期階段成熟。
除UCN3表現增加以外，亦藉由qRT-PCR觀察到β細胞特異性轉錄因子MAFA之表現增加。MAFA表現最初在第5階段第1天(圖21O)添加γ分泌酶抑制劑之後的所有三種測試條件(A、B及C)下均可藉由單一引子-探針qRT-PCR分析偵測。自第4階段第3天至第5階段第5天，在條件C下之MAFA可偵測mRNA表現高於在條件A或B下。MAFA之蛋白表現在第6階段結束時藉由免疫-螢光細胞化學確認。如圖22中所示，藉由20x物鏡獲得之顯微照片描繪關於核MAFA及細胞質胰島素之免疫-螢光染色。
此等基因表現模式表明在β細胞特異性轉錄因子之表現之前，經由在第3階段暴露於低pH抑制早期內分泌規格，可藉由減少早期非β細胞命運採用而促進稍後分化為β細胞樣命運。流動式細胞測量術結果支持此假設，因為當與條件A細胞(20.3%，表VI)相比時，在反應器C中分化之細胞具有增加百分比之胰島素陽性細胞(27.3%，表VI)，以及增加之NKX6.1/胰島素共陽性細胞(條件C 21.3%對條件A 15.6%)。
有趣的是，在第3階段中之低pH及稍後分化為β細胞樣命運並未抑制其他胰腺內分泌命運所特有之基因表現。在第5階段結束時藉由qRT-PCR觀察分析樣本中關於內分泌激素胰腺多肽(「PPY」)、飢餓肽、升糖素(「GCG」)、及生長抑素(「SST」)之基因表現(圖21P-PPY、21Q-飢餓肽、21R-GCG、及21S-SST)。此觀察結果進一步受到流動式細胞測量術數據支持，該等數據顯示分化細胞為泛內分泌轉錄因子NEUROD1陽性(關於條件C為63.1% NEUROD1陽性及56.1%細胞NEUROD1/NKX6.1共陽性；關於條件A為51.6% NEUROD1陽性及43% NEUROD1/NKX6.1共陽性)；如表VII及圖23中所示。
在第5階段之第七天結束時，5×106個在第3階段中用設定點pH7.0分.化之細胞(條件C)係自50mL錐形管中之培養基中分離，接著用含有總計2.4g/L碳酸氫鈉及0.2% w/v FAF-BSA之MCDB-1313培養基洗滌2次。該等細胞再懸浮於洗滌培養基中並且在室溫下保持約5小時，接著移植至NSG小鼠之腎囊下。在最早量測之時間點，即移植後4週，在隔夜禁食、腹膜內葡萄糖注射及在IP葡萄糖單劑之後60分鐘自後眼眶抽取血液，觀察到0.3ng/mL之平均人類C肽血液水準(N=7隻動物)。
實例3
此實例示範在攪拌槽、無菌閉合生物反應器中由表現PDX1之細胞族群形成胰島素表現細胞。胰島素陽性細胞係由在第3階段期間暴露於三種條件之一的細胞產生。三種條件：反應器B-整個第3階段中 pH 7.0(用視黃酸處理)；反應器C-在第3階段之第一天中pH 7.4，接著在第3階段之第2及3天中pH 7.0；或反應器D-整個第3階段中pH 7.4。觀察到在第3階段中較長期暴露於pH 7.0會在稍後分化過程中降低Ki67表現並且增加NEUROD1、NEUROD1與NKX6.1共陽性、PAX6、胰島1、及PDX1/NKX6.1-蛋白之表現。
人類胚胎幹細胞系H1之細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在補充有0.5% w/v無脂肪酸牛血清白蛋白之Essential 8TM培養基中，在動態懸浮下呈圓形聚集團簇形式生長4個繼代。該等團簇接著根據以下方法以單一細胞及2至10個細胞之團簇形式冷凍。將約600至1000百萬個呈聚集團簇形式之細胞轉移至離心管中，並且使用100mL 1X DPS -/-洗滌。在洗滌之後，接著藉由向鬆動之細胞聚集體團塊添加30mL 50體積% StemPro®Accutase®酶及50體積% DPBS -/-之溶液，以經酶促解聚細胞聚集體。將細胞團簇上下吸移1至3次並且接著在室溫下間歇地渦旋約4分鐘，接著在80至200rcf下離心5min。接著盡可能完全地抽吸Accutase®上清液而不擾亂細胞團塊。接著在硬表面上輕敲離心管約4分鐘，以將團簇解聚為單一細胞及包含2至10個細胞之團簇。4分鐘之後，細胞再懸浮於補充有10μM Y-27632及0.5% w/v FAF-BSA之100mL E8TM培養基中，並且在80至200rcf下離心5至12分鐘。接著抽吸上清液並且逐滴添加冷(4℃)Cryostor®細胞保存培養基CS10以達到每mL 100至150百萬個細胞之最終濃度。此細胞溶液保留於冰浴中，同時等分至2mL冷凍小瓶(Corning)中，之後使用控制速率CryoMedTM 34L冷凍器如下所述冷凍細胞。腔室冷卻至4℃並且保持該溫度直至樣本小瓶溫度達到6℃，且接著腔室溫度每分鐘降低2℃直至樣本達到-7℃，此時腔室以20℃/min冷卻直至腔室達到-45℃。接著使腔室溫度短暫地以10℃/min上升直至溫度達到-25℃，並且接著腔室以0.8℃/min進一步冷卻直至樣本小瓶達到-40℃。腔室溫度接著以10℃/min冷卻直至腔室達到-100℃，此時腔室接著以35℃/min冷卻直至腔室達到-160℃。腔室溫度接著在-160℃下保持至 少10分鐘，之後將小瓶轉移至氣相液氮儲存。此等冷凍保存之高濃度單一細胞接著用作ISM。
自液氮儲存移出ISM小瓶，解凍，並且用於以每mL 0.295百萬個活細胞之接種濃度接種3公升玻璃、攪拌懸浮槽生物反應器(DASGIP)。該等小瓶自液氮儲存移出並且快速轉移至37℃水浴中持續120秒以解凍。該等小瓶接著移至BSC中並且經解凍之內含物經由2mL玻璃吸移管轉移至50mL錐形管中。接著補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Rho激酶抑制劑Y-27632之10mL E8TM培養基以逐滴方式添加至該管中。細胞在80至200rcf下離心5min。抽吸該管之上清液並且添加補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之10mL新鮮E8TM培養基，且將含有細胞之體積吸移至含有補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之450mL E8TM培養基的培養基轉移瓶(Cap2V8®)中。瓶內含物接著使用蠕動泵經由無菌、C-Flex®管焊縫(tubing weld)直接泵送至生物反應器中。該生物反應器用預溫至37℃、在70rpm下攪拌之補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632的1000mL E8TM培養基製備，其中溶解氧設定點為30%(空氣O2，且N2經調節)，且控制CO2分壓為5%。該反應器經接種以給出0.225×106個細胞/mL之靶濃度(濃度範圍：0.2至0.5×106個細胞/mL)。
一旦反應器經接種，細胞即在攪拌反應器中形成圓形聚集團簇。在培養物中24小時之後，培養基係經部分交換，即超過80%之初始體積經移除並且添加回補充有0.5% w/v FAF-BSA之1.5L E8TM培養基(新鮮培養基)。此培養基交換過程在接種後48小時重複。當細胞呈圓形聚集團簇在懸浮培養物中三天之後，藉由移除用過E8TM培養基並且添加分化培養基來起始3公升反應器中之分化。分化方案描述如下。
第1階段(3天)：
反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為10%之溶解氧設定點(空氣、氧氣及氮氣經調節)並且 pH經由CO2調節設定為7.4。使用1.5L MCDB-131培養基製備基礎培養基，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉；補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉、先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45%於水中)；及ITS-X之1：50,000稀釋液。細胞在1.5L基礎培養基中培養一天，該基礎培養基補充有100ng/ml GDF8；及3μM MCX化合物。24小時之後，如上文所述完成培養基交換，並且將補充有100ng/mL GDF8之新鮮1.5L基礎培養基添加至反應器中。細胞維持48小時而無進一步培養基交換。
第2階段(3天)：
反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為30%之溶解氧設定點(空氣、氧氣及氮氣經調節)並且pH經由CO2調節設定為7.4。使用1.5L MCDB-131培養基製備基礎培養基，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉且補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：50,000稀釋液。在第1階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第1階段培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之1.5L第2階段基礎培養基更換。在培養基交換之後四十八小時，再次移除用過培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之1.5L新鮮第2階段基礎培養基更換。
第3階段(3天)：
在第2階段完成且在立即要交換培養基之前，將所有細胞經由無菌焊縫及蠕動泵自3公升反應器移出。對細胞計數，使其重力沉降並且以2.0百萬個細胞/mL之正規化分布再懸浮於以下第3階段培養基中：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。 該第3階段培養基補充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；及400nM TPB。該等細胞經由無菌焊縫及蠕動泵以2.0百萬個細胞/mL之正規化分布細胞濃度接種至三個0.2公升玻璃、攪拌懸浮槽DASGIPTM生物反應器B、C及D(亦稱為BxB、BxC、及BxD)中。反應器設定至37℃之溫度並且在55rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為30%之溶解氧設定點(空氣、氧氣及氮氣經調節)並且第3階段之pH設定為如表VIII中所列之三種不同培養基pH變數。培養基交換後二十四小時，再次用含有除LDN-193189外之以上補充物的150mL新鮮第3階段培養基更換反應器B至D中之各者中的用過培養基。細胞之後在培養基中培養48小時直至第3階段結束。
第4階段(3天)：
在第3階段完成時，移除用過培養基並且在各生物反應器中用150mL以下第4階段培養基更換：150mL含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該培養基補充有0.25μM SANT-1及400nM TPB。反應器維持於37℃下並且在55rpm下持續攪拌。氣體及pH控制經調節至30%之溶解氧設定點(空氣、氧氣及氮氣經調節)並且經由CO2調節至pH設定點7.4。在第4階段起始之後四十八小時，3.2mL/L 45%葡萄糖溶液(8mM葡萄糖單劑)添加至各生物反應器中並且細胞在培養基中再培養24小時。
第5階段(7天)：
使用150mL含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基基礎為各生物反應器製備第5階段基礎培養基，補充有額外1.754g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；及10mg/L肝素(Sigma Aldrich；目錄號H3149-100KU)。在第4階段完成之後，各生物反應器中之用過培養基用補充有下列之150mL第5階段培養基更換：1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、1μM γ分泌酶抑制劑XXI；20ng/mL β細胞素；0.25μM SANT-1；及100nM RA。在第5階段起始之後四十八小時，移除用過培養基並且用相同新鮮基礎培養基及補充物更換。四十八小時之後，培養基再次交換並且用相同新鮮培養基及補充物更換，除了排除γ分泌酶XXI及SANT。四十八小時之後，培養基再次交換並且用相同新鮮培養基及補充物更換，並且細胞再培養24小時至第5階段結束。在整個第5階段中，維持30% DO及pH 7.4。
在整個分化過程中，除即時持續監測pH及DO之外，亦每日自反應器收集培養基樣本。分析樣本之細胞數目、mRNA表現、及蛋白表現。
圖24A及B描繪在第3、4及5階段之過程中反應器B、C、及D之培養基中的pH(圖24A)及溶解氧水準(圖24B)之持續監測圖。此等數據證明在整個第3階段中設定為pH 7.0之反應器B中之細胞與反應器C及D相比，顯示在第4及5階段中之氧消耗增加，如藉由較低水準之溶解氧所量測(圖24B)。此外，由於反應器B、C、及D中之細胞濃度在第5階段中相當(圖25及表VIII)，氧消耗之差異並非歸因於細胞密度之顯著差異。這表明在第3階段期間用pH 7.0處理之反應器B中的細胞至第4階段結束時已開始採用比來自反應器C或D(在第3階段期間分別暴露於pH 7.4一或三天)之細胞更成熟並且更具氧消耗性之表型。
在第3階段完成時並且又在三天後在第4階段結束時，藉由流動式細胞測量術分析來自各反應器之樣本的蛋白表現。表IX中顯示證明NKX6.1、NEUROD1、PDX1、及CDX2表現之數據。藉由細胞內流動式細胞測量術觀察到在整個第3階段或在第3階段之最後兩天維持於pH 7.0下之細胞(分別為反應器B及C)相較於維持於反應器D(在第3階段中設定為pH 7.4)中之細胞，在第4階段結束時具有按比例更多NKX6.1陽性細胞及更少NEUROD1陽性細胞。此等數據指示在第3階段即使部分暴露於pH 7.0即足以抑制NEUROD1表現。
除藉由流動式細胞測量術測定細胞蛋白表現以外，吾人亦使用OpenArray® qRT-PCR測試分化過程第3及4階段的樣本中之一組基因之mRNA表現。圖26A至N描繪以下基因在分化至第5階段第一天的人類胚胎幹細胞系H1細胞中之即時PCR分析數據：PDX1(圖26A)；NKX6.1(圖26B)；PAX4(圖26C)；PAX6(圖26D)；NeuroG3(NGN3)(圖26E)；ABCC8(圖26F)；染色顆粒素-A(圖26G)；染色顆粒素-B(圖26H)；ARX(圖26I)；飢餓肽(圖26J)；IAPP(圖26K)；PTF1a(圖26L)；NEUROD1(圖26M)；及NKX2.2(圖26N)。
如圖26A中所示，在低第3階段pH(7.0)或標準第3階段pH(7.4)兩種分化條件下，細胞在第3階段中表現類似PDX1水準，指示細胞採用胰腺命運。然而，當來自反應器B及C(暴露於pH 7.0)之細胞進入第4階段時，與一致地維持於pH 7.4(反應器D)下之細胞相比，PDX1表現增加。此PDX表現增加與NKX6.1表現之誘導匹配(圖26B)。有趣的是，來自反應器D之細胞在第3及4階段中開始表現早期內分泌胰腺細胞發育所需並且所特有之多種基因：PAX4、PAX6、NGN3、NEUROD1、NKX2.2、ARX、飢餓肽、CHGA及HGB，如圖26C、26D、26E、26M、26N、26I、26J、26G、及26H中所示。與反應器B及C相比，此基因表現模式與相對較低NKX6.1表現之組合指示反應器D中之增加的早熟(非β細胞)內分泌胰腺規格。
相反地，來自反應器B及C之第3階段細胞藉由qRT-PCR量測，表現相較於反應器D顯著較低之早熟內分泌發育所特有之轉錄因子水 準(PAX4、PAX6、NGN3、NEUROD1、NKX2.2、及ARX)(圖26C、26D、26E、26M、26N、及26I)。此外，吾人觀察到來自反應器B及C之細胞在第4階段第一天具有增加之NKX6.1訊息(圖26B)，其為β細胞形成所需之轉錄因子，隨後在第4階段第二天具有PAX6、NEUROD1、及NKX2.2之mRNA表現增加(圖26D、26M、及26N)。此等OpenArray® qRT-PCR數據與流動式細胞測量術結果相關，該等流動式細胞測量術結果證明在第3階段中維持於pH 7.0下持續兩天或三天之細胞在第3及4階段結束時不太可能表現NEUROD1並且較可能表現NKX6.1(表XI)。此等結果指示在第3階段全部或甚至一些部分中暴露於低pH(7.0)會抑制早熟(非β細胞)內分泌胰腺規格並且促進形成β細胞所需之轉錄因子表現序列。
經由在第3階段中降低培養基之pH，延遲或降低與非β細胞內分泌胰腺規格有關之基因表現的作用持續至分化之第5階段結束。當與反應器D細胞(19.5%，表XIV)相比時，在反應器B中分化之細胞(在全部第3階段中pH 7.0)具有增加百分比之胰島素陽性細胞(25.4%，表XIV)，以及增加之NKX6.1/胰島素共陽性細胞(條件B 17.9%對條件D 14%)。此等結果藉由適當內分泌胰島形成所需之標記諸如PAX6及胰島1的表現增加反映(表XIV)，因為相較於反應器D產生44.9% PAX6及24.7%胰島1陽性細胞而言，反應器B產生53.8% PAX6及31%胰島1陽性細胞。與來自反應器D之細胞相比，第3階段中用pH 7.0處理之細胞的增生量度(Ki67表現)亦降低(表XIV)，指示由正在生長並且較少分化之族群轉變為更末期分化組織。
有趣的是，儘管在第3階段中之低pH會抑制早熟內分泌分化，但來自反應器B及C之細胞在第4及5階段中保留泛胰腺轉錄因子PDX1之高表現。此外，儘管反應器B及C細胞相較於反應器D在第3及4階段中具有低NEUROD1表現(泛內分泌轉錄因子)(表XI)，但其等在第5階段結束時顯示較高百分比之NEUROD1及NEUROD1/NKX6.1共陽性細胞(表X)。此等結果指示在第3階段中之低pH會抑制早熟早期分化為內分泌命運；稍後促進適當β細胞 規格所需之轉錄因子共表現增加；以及增加第5階段結束時胰島組織及β細胞所特有之標記及轉錄因子的總體表現。
實例4
此實例示範在3公升攪拌槽、無菌閉合生物反應器中由表現PDX1之細胞族群形成胰島素表現細胞。由此製程產生之胰島素陽性細胞保留PDX1表現及共表現NKX6.1。在第5階段結束時，胰島素陽性細胞轉移至在55RPM下攪拌之500mL旋轉燒瓶中並且在第6階段期間保持於5% CO2加濕37℃培養箱中之含高葡萄糖(25.5mM)或低葡萄糖(5.5mM)之培養基中。大多數在第6階段中使用任一葡萄糖濃度之細胞為PDX1、NKX6.1或NEUROD1陽性，並且反應器中所有細胞之幾乎一半為NKX6.1/PDX1/胰島素共陽性。
人類胚胎幹細胞系H1之細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在補充有0.5% w/v FAF-BSA之E8TM培養基中，在動態懸浮下呈圓形聚集團簇形式生長4個繼代。該等團簇接著根據以下方法以單一細胞及2至10個細胞之團簇形式冷凍。將約600至1000百萬個呈團簇形式之聚集細胞轉移至離心管中，並且使 用100mL 1X DPS -/-洗滌。在洗滌之後，接著藉由向鬆動之細胞聚集體團塊添加30mL 50體積% StemPro®Accutase®酶及50體積% DPBS -/-之溶液，以經酶促解聚細胞聚集體。將細胞團簇上下吸移1至3次並且接著在室溫下間歇地渦旋約4分鐘，接著在80至200rcf下離心5min。接著盡可能完全地抽吸Accutase®上清液而不擾亂細胞團塊。接著在硬表面上輕敲離心管約4分鐘，以將團簇解聚為單一細胞及包含2至10個細胞之團簇。4分鐘之後，細胞再懸浮於補充有10μM Y-27632及0.5% w/v FAF-BSA之100mL E8TM培養基中，並且在80至200rcf下離心5至12分鐘。接著抽吸上清液並且逐滴添加冷(4℃)Cryostor®細胞保存培養基CS10以達到每mL 100至150百萬個細胞之最終濃度。此細胞溶液保留於冰浴中，同時等分至2mL冷凍小瓶中，之後使用控制速率冷凍器CryoMedTM 34L控制速率冷凍器如下冷凍細胞。腔室冷卻至4℃並且保持該溫度直至樣本小瓶溫度達到6℃，且接著腔室溫度每分鐘降低2℃直至樣本達到-7℃，此時腔室以20℃/min冷卻直至腔室達到-45℃。接著使腔室溫度短暫地以10℃/min上升直至溫度達到-25℃，並且接著腔室以0.8℃/min進一步冷卻直至樣本小瓶達到-40℃。腔室溫度接著以10℃/min冷卻直至腔室達到-100℃，此時腔室接著以35℃/min冷卻直至腔室達到-160℃。腔室溫度接著在-160℃下保持至少10分鐘，之後將小瓶轉移至氣相液氮儲存。此等冷凍保存之高密度單一細胞接著用作ISM。
自液氮儲存移出ISM小瓶，解凍，並且用於以每mL 0.295百萬個活細胞之接種濃度接種3公升玻璃、攪拌懸浮槽生物反應器(DASGIP)。該等小瓶自液氮儲存移出並且快速轉移至37℃水浴中持續120秒以解凍。該等小瓶接著移至BSC中並且經解凍之內含物經由2mL玻璃吸移管轉移至50mL錐形管中。接著補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Rho激酶抑制劑Y-27632之10mL E8TM培養基以逐滴方式添加至該管中。細胞在80至200rcf下離心5min。抽吸該管之上清液並且添加補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之10mL新鮮E8TM培養基，且將含有細胞之體積吸移至含有補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之450mL E8TM培養基的Cap2V8® 培養基轉移瓶中。瓶內含物接著使用蠕動泵經由無菌、C-Flex®管焊縫(tubing weld)直接泵送至生物反應器中。該生物反應器用預溫至37℃、在70rpm下攪拌之補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632的1000mL E8TM培養基製備，其中溶解氧設定點為30%(空氣O2，且N2經調節)，且控制CO2分壓為5%。該反應器經接種以給出0.225×106個細胞/mL之靶濃度(濃度範圍：0.2至0.5×106個細胞/mL)。
一旦反應器經接種，細胞即在攪拌反應器中形成圓形聚集團簇。在培養物中24小時之後，培養基係經部分交換，即超過80%之初始體積經移除並且添加回補充有0.5% w/v FAF-BSA之1.5L E8TM培養基(新鮮培養基)。此培養基交換過程在接種後48小時重複。當細胞呈圓形聚集團簇在懸浮培養物中三天之後，停止葉輪及加熱套5至20分鐘以允許該等團簇沉降，移除培養基，並且藉由蠕動泵經由使用TerurnoTM管焊縫連接至C-Flex®管以維持閉合系統之液浸管更換培養基。一旦添加充足培養基以浸沒葉輪，葉輪及加熱套即經再賦能。分化方案描述如下。
第1階段(3天)：
使用900mL MCDB-131培養基製備第1階段基礎培養基，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉且補充有額外3.6g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之100mL 2% w/v FAF-BSA；10mL 1X濃度之GlutaMAXTM；1mL 2.5mM葡萄糖(45%於水中)；及ITS-X之1：50,000稀釋液。細胞在補充有100ng/ml GDF8及3μM MCX化合物之基礎培養基中培養一天。24小時之後，如上文所述完成培養基交換，並且將補充有100ng/mL GDF8之新鮮基礎培養基添加至燒瓶中。細胞維持48小時而無進一步培養基交換。在整個第1階段中，溶解氧含量維持於10%且pH維持於7.4。
第2階段(3天)：
在第1階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第1階段培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之第1階段基礎培養基更換。在培養基交換之後四十八小時，再次移除用過培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之新鮮基礎培養基更換。在整個第2階段中，DO維持於30% DO且pH維持於7.4。
第3階段(3天)：
在第2階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第2階段培養基並且用以下基礎培養基更換：900mL含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外3.6g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之100mL 2% w/v FAF-BSA；10mL 1X濃度之GlutaMAXTM；1mL 2.5mM葡萄糖(45%於水中)；及ITS-X之1：200稀釋液。該第3階段基礎培養基補充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；及400nM TPB。培養基交換後二十四小時，再次用含有除LDN-193189外之以上補充物的新鮮培養基更換用過培養基。細胞在培養基中培養48小時。在整個第3階段中，維持30% DO及pH 7.0。
第4階段(3天)：
在第3階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第3階段培養基並且用如第3階段中所用但補充有0.25μM SANT-1及400nM TPB之相同基礎培養基更換。在第4階段起始之後四十八小時，3.2mL/L 45%葡萄糖溶液(8mM葡萄糖單劑)添加至各生物反應器中並且細胞在培養基中再培養24小時。在整個第4階段中，維持30% DO及pH 7.4。
第5階段(7天)：
在第4階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第4階段培養基並且用以下第5階段基礎培養基更換：900mL含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基基礎，補充有額外1.754 g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之100mL 2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；8mL/L 45%葡萄糖溶液；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；及1mL 10mg/L肝素溶液。該第5階段基礎培養基補充有1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、1μM γ分泌酶抑制劑XXI；20ng/mL β細胞素；0.25μM SANT-1；及100nM RA。在第5階段起始之後四十八小時，移除用過培養基並且用相同新鮮基礎培養基及補充物更換。四十八小時之後，培養基再次交換並且用相同新鮮培養基及補充物更換。四十八小時之後，培養基再次交換並且用相同新鮮培養基及補充物更換，除了排除γ分泌酶抑制劑XXI及SANT。四十八小時之後，移除用過培養基並且用相同新鮮培養基及補充物更換。細胞再培養24小時至第5階段結束。在整個第5階段中，維持30% DO及pH 7.4。
第6階段(7天)：
在第5階段結束時(分化之第19天)，將細胞經由無菌焊縫及蠕動泵自3公升反應器移出。接著對細胞計數，使其重力沉降並且以0.5百萬個細胞/mL之正規化分布再懸浮於第6階段培養基(下文詳述)中並且添加至兩個在55RPM下攪拌的0.5公升拋棄式旋轉燒瓶(Corning)中並且在漂移條件下在5% CO2加濕37℃培養箱中之含高葡萄糖(25.5mM)或低葡萄糖(5.5mM)之培養基中維持7天。一個燒瓶含有以下培養基及補充物：300mL含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基基礎，補充有額外1.754g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之100mL 2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；8mL/L 45%葡萄糖溶液(25.5mM最終葡萄糖濃度)；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；及1mL 10mg/L肝素；及10μM ALK5抑制劑II。第二個燒瓶含有以下培養基及補充物：300mL含有1.18g/L碳酸氫鈉及基礎葡萄糖濃度5.5mM之MCDB-131培養基基礎，補充有額外1.754g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之100mL 2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；及1mL 10mg/L肝素；及10μM ALK5抑制劑II。在第5階段起始之後四十八小時、九十六小時及一百二十小時，移除用過培養基並且用相同新鮮基礎培養基及補充物更換。第6階段在起始之後144小時(分化第26天)終止。
在整個分化過程中，自反應器收集樣本並且如表X中所示分析總細胞數目及如圖27中所示分析mRNA表現(OpenArray® qRT-PCR)。在第3、4、5、及6階段結束時，使用流動式細胞測量術分析樣本之蛋白表現(表XII)。
在第3階段完成時，觀察到幾乎所有細胞均表現內胚層轉錄因子(FOXA2)及胰腺特異性轉錄因子(PDX1)。藉由流動式細胞測量術偵測到少數表現NKX6.1之細胞(約20%)並且幾乎未偵測到NEUROD1表現細胞(表XII)。在第4階段結束時，樣本再次藉由流動式細胞測量術分析NKX6.1、NEUROD1、PDX1、FOXA2、CDX2、及Ki67之表現(表XII)。有趣的是，自第3階段結束至第4階段結束，NKX6.1表現族群增加至超過91%之細胞並且此等細胞保留內胚層及胰腺規格(>99% PDX1及FOXA2表現細胞)。然而，僅有限族群之細胞(<8%)表現內分泌激素細胞所特有之標記(胰島1、CHGA、NEUROD1、及NKX2.2)。在第5階段完成時，內分泌激素細胞所特有之標記呈陽性之細胞的百分比實質上增加，自第4階段結束時少於10%上升至76%的NEUROD1陽性細胞及57%的胰島素陽性細胞。此外，細胞之總族群維持主要NKX6.1(81%)及PDX1(>97%)表現。如藉由Ki67陽性細胞百分比所量測之增生水準約為18%並且如藉由CDX2(內胚層腸細胞標記)陽性細胞百分比所量測之增生水準極低為<3.0%。此等數據指示胰島樣並且特定言之β細胞樣族群正在反應器中形成。
在第5階段完成時，細胞自3公升攪拌槽反應器中移出並且分裝至維持於5% CO2、37℃加濕培養箱中之500mL旋轉燒瓶中。該等旋轉燒瓶在類似條件下處理，不同處為基礎培養基葡萄糖濃度。所測試之兩種葡萄糖條件為：低葡萄糖5.5mM起始基礎葡萄糖濃度(「LG」)，或高葡萄糖25.5mM起始基礎葡萄糖濃度(「HG」)(表XIV)。在第6階段中在任一條件下處理七天之細胞顯示內分泌激素 細胞尤其是胰腺β胰島細胞所特有之標記的實質增加。在第6階段第七天結束時，幾乎一半之細胞呈現PAX6陽性，而60%呈現NEUROD1及NKX6.1或胰島素及NKX6.1共陽性(表XIII)。另外，在此系統中產生之細胞保留高水準之PDX1(>81%)並且顯示降低水準之增生，如藉由Ki67陽性細胞百分比所量測(約12%，根據表XIV)。
此等結果受到OpenArray®qRT-PCR數據支持，該等數據顯示當細胞進入第5階段時，存在NGN3之顯著並且短暫之誘導(圖27A)。在此之後為持續誘導NEUROD1表現(圖27B)及與胰島形成及內分泌激素細胞有關之其他基因，該等基因諸如染色顆粒素A(CHGA)、染色顆粒素B(CHGB)、升糖素(GCG)、胰島相關多肽(IAPP)、胰島1(ISL1)、MAFB、PAX6及生長抑素(SST)，分別如圖27C至J中所示。除了胰島特異性基因之誘導外，β細胞特異性基因亦在第5階段中誘導並且持續至第6階段，如所觀察到之胰島素(INS；圖27K)、葡萄糖6磷酸酯酶2(G6PC2；圖27L)、PCSK1及2(圖27M及N)、鋅轉運蛋白(SLC30A8；圖270)，由β細胞形成及功能所需之轉錄因子亦如此，諸如NKX6.1、NKX2.2、MNX1/HB9、及UCN3(分別為圖27P至S)。指示替代命運形成之基因諸如CDX2及ZIC1之表現接近或低於qRT-PCR之偵測極限(數據未示)。
實例5
此實例示範在攪拌槽、無菌閉合生物反應器中由表現轉錄因子PDX1之細胞族群形成胰島素表現細胞。由此製程產生之胰島素陽性細胞保留PDX1表現及共表現NKX6.1。當此細胞族群移植至免疫功能不全小鼠之腎囊中時，移植物在植入四週內生產可偵測血液水準之人類C肽。
人類胚胎幹細胞系H1之細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在補充有0.5% w/v FAF-BSA之E8TM培養基中，在動態懸浮下呈圓形聚集團簇形式生長4個繼代。該等團簇接著根據以下方法以單一細胞及2至10個細胞之團簇形式冷凍。將 約600至1000百萬個呈團簇形式之聚集細胞轉移至離心管中，並且使用100mL 1X DPS -/-洗滌。在洗滌之後，接著藉由向鬆動之細胞聚集體團塊添加30mL 50體積% StemPro®Accutase®酶及50體積% DPBS -/-之溶液，以經酶促解聚細胞聚集體。將細胞團簇上下吸移1至3次並且接著在室溫下間歇地渦旋約4分鐘，接著在80至200rcf下離心5min。接著盡可能完全地抽吸Accutase®上清液而不擾亂細胞團塊。接著在硬表面上輕敲離心管約4分鐘，以將團簇解聚為單一細胞及包含2至10個細胞之團簇。4分鐘之後，細胞再懸浮於補充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences)及0.5% w/v FAF-BSA之100mL E8TM培養基中，並且在80至200rcf下離心5至12分鐘。接著抽吸上清液並且逐滴添加冷(4℃)Cryostor®細胞保存培養基CS10以達到每mL 100至150百萬個細胞之最終濃度。此細胞溶液保留於冰浴中，同時等分至2mL冷凍小瓶(Corning)中，之後使用控制速率CryoMedTM 34L冷凍器如下冷凍細胞。腔室冷卻至4℃並且保持該溫度直至樣本小瓶溫度達到6℃，且接著腔室溫度每分鐘降低2℃直至樣本達到-7℃，此時腔室以20℃/min冷卻直至腔室達到-45℃。接著使腔室溫度短暫地以10℃/min上升直至溫度達到-25℃，並且接著腔室以0.8℃/min進一步冷卻直至樣本小瓶達到-40℃。腔室溫度接著以10℃/min冷卻直至腔室達到-100℃，此時腔室接著以35℃/min冷卻直至腔室達到-160℃。腔室溫度接著在-160℃下保持至少10分鐘，之後將小瓶轉移至氣相液氮儲存。此等冷凍保存之高密度單一細胞接著用作ISM。
自液氮儲存移出ISM小瓶，解凍，並且用於以每mL 0.295百萬個活細胞之接種濃度接種3公升玻璃、攪拌懸浮槽生物反應器(DASGIP)。該等小瓶自液氮儲存移出並且快速轉移至37℃水浴中持續120秒以解凍。該等小瓶接著移至BSC中並且經解凍之內含物經由2mL玻璃吸移管轉移至50mL錐形管中。接著補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Rho激酶抑制劑Y-27632之10mL E8TM培養基以逐滴方式添加至該管中。細胞在80至200rcf下離心5min。抽吸該管之上清液並且添加補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之10 mL新鮮E8TM培養基，且將含有細胞之體積吸移至含有補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之450mL E8TM培養基的培養基轉移瓶(Cap2V8®,Sanisure,Inc)中。瓶內含物接著使用蠕動泵經由無菌、C-Flex®管焊縫(tubing weld)直接泵送至生物反應器中。該生物反應器用預溫至37℃、在70rpm下攪拌之補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632的1000mL E8TM培養基製備，其中溶解氧設定點為30%(空氣O2，且N2經調節)，且控制CO2分壓為5%。該反應器經接種以給出0.225×106個細胞/mL之靶濃度(濃度範圍：0.2至0.5×106個細胞/mL)。
一旦反應器經接種，細胞即在攪拌反應器中形成圓形聚集團簇。在培養物中24小時之後，培養基係經部分交換，即超過80%之初始體積經移除並且添加回補充有0.5% w/v FAF-BSA之1.5L E8TM培養基(新鮮培養基)。此培養基交換過程在接種後48小時重複。當細胞呈圓形聚集團簇在懸浮培養物中三天之後，藉由移除用過E8TM培養基並且添加分化培養基來起始3公升反應器中之分化。分化方案描述如下。
第1階段(3天)：
反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為10%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且pH經由CO2調節設定為7.4。使用1.5L MCDB-131培養基製備第1階段基礎培養基，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉；補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉、先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45%於水中)；及ITS-X之1：50,000稀釋液。細胞在1.5L基礎培養基中培養一天，該基礎培養基補充有100ng/ml GDF8；及3μM MCX化合物。24小時之後，如上文所述完成培養基交換，並且將補充有100ng/mL GDF8之新鮮1.5L基礎培養基添加至反應器中。細胞維持48小時而無進一步培養基交換。
第2階段(3天)：
反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且pH經由CO2調節設定為7.4。在第1階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第1階段培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之1.5L相同培養基更換。在培養基交換之後四十八小時，再次移除用過培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之300mL新鮮第2階段基礎培養基更換。
第3階段(3天)：
在第2階段完成且立即要交換培養基之前，對細胞計數，使其重力沉降並且以2.0百萬個細胞/mL之正規化分布再懸浮於1.5公升以下第3階段基礎培養基中：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該第3階段基礎培養基補充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；及400nM TPB。反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且經由CO2調節設定為pH 7.0。培養基交換後二十四小時，再次用含有除LDN-193189外之以上補充物的1.5L新鮮第3階段培養基更換用過培養基。細胞之後在培養基中培養48小時直至第3階段結束。
第4階段(3天)：
在第3階段完成時，移除用過培養基並且在各生物反應器中用1.5L由.以下構成之第4階段基礎培養基更換：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該第4階段基礎培養基補充0.25μM SANT-1及400nM TPB。反應器維持於37℃下並且在70 rpm下攪拌。氣體及pH經調節至30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且經由CO2調節至pH設定點7.4。在第4階段起始之後四十八小時，3.2mL/L 45%葡萄糖溶液(8mM葡萄糖單劑)添加至生物反應器中並且細胞在培養基中再培養24小時。
第5及6階段：
在第4階段之第三天結束時，圓形聚集團簇自生物反應器泵出，並且轉移至兩個在55RPM下攪拌之獨立0.5公升Corning拋棄式旋轉燒瓶中並且維持於補充有5% CO2之37℃加濕培養箱中。其後，各容器中之細胞維持於300mL工作體積之由以下構成之第5階段基礎培養基中：300mL含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外1.75g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；10mg/L肝素；1μM呈3,3',5-三碘-L-甲狀腺胺酸鈉鹽形式之T3及10μM ALK5抑制劑II。
所用之第5階段基礎培養基根據如下兩種不同條件A或B進行補充：
a.關於條件A，藉由施加補充有100nM LDN、100nM SANT、及10μM硫酸鋅之第5+階段基礎培養基來起始第5階段。此培養基在開始階段之後24及48小時進行交換。在開始第5階段之後72小時，藉由移除用過培養基並且用補充有100nM XX γ分泌酶抑制劑、100nM LDN、及10μM硫酸鋅之第5階段基礎培養基處理細胞來起始第6階段。此培養基其後每24小時更換持續十一天，除了在第8、9、及11天開始時。
b.關於條件B，藉由施加第5階段基礎培養基來起始第5階段，該培養基補充有100nM γ分泌酶抑制劑XX；20ng/mL β細胞素；0.25μM SANT-1；及100nM RA。在第5階段起始之後四十八小時，移除用過培養基並且用300mL相同培養基及補充物更換。四十八小時之後，移除培養 基並且用補充有20ng/mL β細胞素、及100nM RA之第5階段基礎培養基更換。四十八小時之後，培養基再次交換並且用相同培養基更換。
在整個分化過程中，自懸浮培養物收集細胞樣本用於分析。分析樣本之mRNA表現(OpenArray®qRT-PCR)及蛋白表現(流動式細胞測量術及螢光免疫-組織化學)。
在第4階段結束之後六天(條件A-第6階段第3天；條件B-第5階段第6天)，觀察到來自兩種處理之細胞均表現可藉由流動式細胞測量術偵測之一組蛋白，與內分泌胰腺及β細胞之形成一致(表XV)。兩種處理均產生高百分比之PDX1(>91%)表現細胞並且細胞開始共表現胰島素及NKX6.1(未示)。有趣的是，觀察到根據條件A處理之細胞具有降低之增生水準，在A中15.5%之細胞及在B中27.3%之細胞表現Ki67(表XV)。此外，用條件A處理之細胞具有比條件B更多之NKX6.1表現、NEUROD1表現、及NKX6.1/NEUROD1共表現細胞(表XV)，指示用條件A處理會產生較大之表現內分泌胰腺所特有之基因並且能夠形成β細胞的細胞族群。
此等流動式細胞測量術數據受到OpenArrayqRT-PCR數據支持，該等數據顯示當細胞進入第5階段時，在兩種與NEUROD1表現之持續誘導相關的條件下(圖28B)存在NGN3之誘導(圖28A)。在條件A下，在第5階段中NGN3之初始誘導之後，在第6階段開始時存在NGN3的二次誘導，其對應於用γ分泌酶抑制劑XX處理。條件A之此NGN3表現的雙重峰與NKX6.1之持續表現聯合發生(圖28C)，並且與多種與胰島形成及內分泌激素細胞有關之基因的表現相關，該等基因諸如染色顆粒素A(CHGA)、染色顆粒素B(CHGB)、升糖素(GCG)、胰島相關多肽(IAPP)、MAFB、PAX6、及生長抑素(SST)(分別為圖28D至J)。此外，β細胞功能所需之基因亦在第5階段中誘導並且持續至第6階段，如所觀察到之胰島素(INS；圖28K)、葡萄糖6磷酸酯酶2(G6PC2；圖28L)、PCSK1(圖27M)、及鋅 轉運蛋白(SLC30A8；圖28N)，由β細胞形成、成熟、及功能所需之MNX1/HB9、及UCN3轉錄因子亦如此(分別為圖28O及P)。
在第六階段之第十一天結束時，5×107個在條件A下分化之細胞係自50mL錐形管中之培養基中分離，接著用含有1.18g/L碳酸氫鈉及0.2% w/v FAF-BSA之MCDB-1313培養基洗滌2次。該等細胞再懸浮於洗滌培養基中並且在室溫下保持約5小時，接著移植至NSG小鼠之腎囊下。各動物接受5×106個細胞之劑量。在移植之前，此等細胞表現與內分泌胰腺及β細胞一致之蛋白(表XVI)，並且在最早量測之時間點(移植後4週)及該研究之整個18週過程中，人類C肽係回應於隔夜禁食之後的腹膜內葡萄糖注射，在IP葡萄糖單劑之後60分鐘於後眼眶抽取血液中偵測到(N=7隻動物，圖29)。
實例6
此實例示範在攪拌槽、無菌閉合生物反應器中由表現PDX1之細胞族群形成胰島素表現細胞。由此製程產生之胰島素陽性細胞保留PDX1表現及共表現NKX6.1。當此細胞族群移植至免疫功能不全小鼠之腎囊中時，移植物在植入二週內生產可偵測血液水準之人類C肽。
人類胚胎幹細胞系H1之細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在補充有0.5% w/v FAF-BSA之E8TM 培養基中，在動態懸浮下呈圓形聚集團簇形式生長4個繼代。該等團簇接著根據以下方法以單一細胞及2至10個細胞之團簇形式冷凍。將約600至1000百萬個呈團簇形式之聚集細胞轉移至離心管中，並且使用100mL 1X DPS -/-洗滌。在洗滌之後，接著藉由向鬆動之細胞聚集體團塊添加30mL 50體積% StemPro®Accutase®酶及50體積% DPBS -/-之溶液，以經酶促解聚細胞聚集體。將細胞團簇上下吸移1至3次並且接著在室溫下間歇地渦旋約4分鐘，接著在80至200rcf下離心5min。接著盡可能完全地抽吸Accutase®上清液而不擾亂細胞團塊。接著在硬表面上輕敲離心管約4分鐘，以將團簇解聚為單一細胞及包含2至10個細胞之團簇。4分鐘之後，細胞再懸浮於補充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences)及0.5% w/v FAF-BSA之100mL E8TM培養基中，並且在80至200rcf下離心5至12分鐘。接著抽吸上清液並且逐滴添加冷(4℃)Cryostor®細胞保存培養基CS10以達到每mL 100至150百萬個細胞之最終濃度。此細胞溶液保留於冰浴中，同時等分至2mL冷凍小瓶(Corning)中，之後使用控制速率CryoMedTM 34L冷凍器如下冷凍細胞。腔室冷卻至4℃並且保持該溫度直至樣本小瓶溫度達到6℃，且接著腔室溫度每分鐘降低2℃直至樣本達到-7℃，此時腔室以20℃/min冷卻直至腔室達到-45℃。接著使腔室溫度短暫地以10℃/min上升直至溫度達到-25℃，並且接著腔室以0.8℃/min進一步冷卻直至樣本小瓶達到-40℃。腔室溫度接著以10℃/min冷卻直至腔室達到-100℃，此時腔室接著以35℃/min冷卻直至腔室達到-160℃。腔室溫度接著在-160℃下保持至少10分鐘，之後將小瓶轉移至氣相液氮儲存。此等冷凍保存之高密度單一細胞接著用作ISM。
自液氮儲存移出ISM小瓶，解凍，並且用於以每mL 0.295百萬個活細胞之接種濃度接種3公升玻璃、攪拌懸浮槽生物反應器(DASGIP)。該等小瓶自液氮儲存移出並且快速轉移至37℃水浴中持續120秒以解凍。該等小瓶接著移至BSC中並且經解凍之內含物經由2mL玻璃吸移管轉移至50mL錐形管中。接著補充有0.5%w/v FAF-BSA及10μM Rho激酶抑制劑Y-27632之10mL E8TM培養基以 逐滴方式添加至該管中。細胞在80至200rcf下離心5min。抽吸該管之上清液並且添加補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之10mL新鮮E8TM培養基，且將含有細胞之體積吸移至含有補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之450mL E8TM培養基的培養基轉移瓶(Cap2V8®,Sanisure,Inc)中。瓶內含物接著使用蠕動泵經由無菌、C-Flex®管焊縫(tubing weld)直接泵送至生物反應器中。該生物反應器用預溫至37℃、在70rpm下攪拌之補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632的1000mL E8TM培養基製備，其中溶解氧設定點為30%(空氣O2，且N2經調節)，且控制CO2分壓為5%。該反應器經接種以給出0.225×106個細胞/mL之靶濃度(濃度範圍：0.2至0.5×106個細胞/mL)。
一旦反應器經接種，細胞即在攪拌反應器中形成圓形聚集團簇。在培養物中24小時之後，培養基係經部分交換，即超過80%之初始體積經移除並且添加回補充有0.5% w/v FAF-BSA之1.5L E8TM培養基(新鮮培養基)。此培養基交換過程在接種後48小時重複。當細胞呈圓形聚集團簇在懸浮培養物中三天之後，藉由移除用過E8TM培養基並且添加分化培養基來起始3公升反應器中之分化。分化方案描述如下。
第1階段(3天)：
反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為10%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且pH經由CO2調節設定為7.4。使用1.5L MCDB-131培養基製備第1階段基礎培養基，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉；補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉、先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45%於水中)；及ITS-X之1：50,000稀釋液。細胞在補充有100ng/ml GDF8及3μM MCX化合物之1.5L基礎培養基中培養一天。24小時之後，如上文所述完成培養基交換，並且將補充有100ng/mL GDF8之新鮮1.5L基礎培養基添加至反應器中。細胞維持48小時而無進一步培養基交換。
第2階段(3天)：
反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且pH經由CO2調節設定為7.4。在第1階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第1階段培養基並且用作為第1階段基礎培養基但補充有50ng/mL FGF7之1.5L相同培養基更換。在培養基交換之後四十八小時，再次移除用過培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之300mL新鮮基礎培養基更換。
第3階段(3天)：
在第2階段完成且立即要交換培養基之前，對細胞計數，使其重力沉降並且以2.0百萬個細胞/mL之正規化濃度再懸浮於1.5公升以下第3階段基礎培養基中：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該第3階段基礎培養基補充有50ng/mL FGF-7；100nM LDN-193189；2μM RA；0.25μM SANT-1；及400nM TPB。反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且經由CO2調節設定為pH 7.0。培養基交換後二十四小時，再次用含有除LDN-193189外之以上補充物的1.5L新鮮第3階段基礎培養基更換用過培養基。細胞之後在培養基中培養48小時直至第3階段結束。
在該階段完成時，自親代3公升反應器移出150mL細胞(1.05×106個活細胞/mL)並且無菌轉移至0.2L反應器中。剩餘1.35L反應器體積進一步根據下文所述之第4階段分化並且此過程及細胞在下文中稱作「標準過程」及「標準細胞」。然而，轉移至0.2L反應器中之細胞並未根據以下第4階段分化，而是進一步根據如下文所述之第5階段分化並且此過程及細胞在下文中稱作「略4過程」及「略4細胞」。關於略4過程，聚集細胞團簇在第3階段之後使用無 菌焊縫及蠕動泵移出至0.2L生物反應器(標示為「略4」)中以在1.05×106個細胞/mL下開始第5階段培養基暴露。
第4階段(3天)：
在第3階段完成時，移除用過培養基並且在各生物反應器中用1.5L由以下構成之第4階段基礎培養基更換：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該第4階段基礎培養基補充0.25μM SANT-1及400nM TPB。反應器維持於37℃下並且在70rpm下攪拌。氣體及pH經調節至30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且經由CO2調節至pH設定點7.4。在第4階段起始之後四十八小時，3.2mL/L 45%葡萄糖溶液(8mM葡萄糖單劑)添加至生物反應器中並且細胞在培養基中再培養24小時。
聚集細胞團簇(150mL，0.9×106個活細胞/mL)在標準過程之第4階段第三天結束時使用無菌焊縫及蠕動泵移出並且轉移至0.2L生物反應器(標示為「標準」)中以開始第5階段培養基暴露。另外，一些第4階段第3天細胞(45×106個細胞/mL)係自50mL錐形管中之培養基中分離，接著用含有1.18g/L碳酸氫鈉及0.2% w/v FAF-BSA之MCDB-1313培養基洗滌2次。細胞再懸浮於洗滌培養基中並且在室溫下保持約5小時，且接著以每隻動物5×106個細胞移植至NSG小鼠之腎囊下，以便使用人類C肽偵測進行活體內功能分析，該人類C肽係回應於隔夜禁食之後的腹膜內葡萄糖注射，在IP葡萄糖單劑之後60分鐘於後眼眶抽取血液中偵測到(N=7隻動物)。
第5階段(7天)：
在將細胞接種至標準及略4 0.2L生物反應器中之後，移除用過培養基並且用150mL第5+階段基礎培養基更換，該第5+階段基礎培養基包含含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外1.75g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃 度之GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；10mg/L肝素(Sigma Aldrich；目錄號H3149-100KU)。此第5階段基礎培養基補充有1μM T3、10μM 2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(「ALK5抑制劑II」)、1μMγ分泌酶抑制劑XXI；20ng/mL β細胞素(R&D Systems，目錄號261-CE-050)；0.25μM SANT-1；及100nM RA。在第5階段起始之後四十八小時，移除用過培養基並且用150mL相同培養基及補充物更換。四十八小時之後，移除培養基並且用補充有1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、20ng/mL β細胞素、及100nM RA之第5+階段基礎培養基更換。四十八小時之後，再次交換培養基並且用補充有1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、20ng/mL β細胞素、及100nM RA之第5+階段基礎培養基更換，並且培養24小時至第5階段結束。在第5階段之7天結束時，來自標準及略4過程中之每一者之細胞係經移植至NSG小鼠之腎囊中以藉由上文所述之方法進行活體內功能分析。
在整個分化過程中，自懸浮培養物收集細胞樣本用於分析。藉由OpenArray®qRT-PCR分析樣本之mRNA表現並且藉由流動式細胞測量術分析蛋白表現。觀察到使分化直接自第3階段培養基移至第5階段培養基(略4過程)導致與根據標準過程分化之細胞相比，與胰島細胞、內分泌激素表現細胞及β細胞相關之基因的表現增加。使用略4過程，與替代腸命運相關之基因顯示較低表現(ALB及CDX2；圖30B及D)，然而內分泌激素細胞形成及功能所需之基因則具有比標準過程更多之表現(ABCC8、ARX、CHGA、CHGB、G6PC2、GCG、IAPP、MAFB、NEUROD1、NKX2.2、PAX4、PAX6、PPY及SST，如圖30A、C、E、F、G、H、J、M、O、Q、S、T、X、及A’中所示)。此外，β細胞形成所需之基因(NKX6.1及PDX1；圖30R及W)截至第5階段第6天為止在略4及標準過程細胞兩者中以類似水準表現。β細胞功能及維持所需之基因(IAPP、INS、ISL1、HB9、PCSK1、PCSK2、SLC30A8、及UNC3；圖30J、K、L、M、U、V、Z、及B’)或β細胞增生(WNT4A，圖30C’)所需之基因在用第5階段培養基處理之略4細胞中以類似或較高水準表現。
此等數據與略4細胞在較早時間點顯示較高水準並且持續較長時期之NGN3誘導(內分泌規格所需)，然而PTF1A表現(外分泌胰腺所需)峰值僅為藉由標準過程產生之水準的1/20之數據相關。此等結果指示在略4反應器中之細胞在無甚至短暫之PTF1A誘導存在下強烈地經指定為內分泌胰腺命運，表明PTF1A並非活體外形成β細胞所需。此觀察結果為顯著的，因為其不同於所屬技術領域所見之在進一步分化之前PTF1A在第4階段表現的結果，或美國專利公開案第2014/0271566 A1號中所述之假定發育模型，其中第4階段細胞係藉由第4階段之PDX1/NKX6.1/PTF1A簽名表徵並且接著進一步活體外發育為β樣細胞。
在第4階段第3天存在之PTF1A表現(圖30Y)細胞族群具有幾乎均質之PDX1/NKX6.1共表現族群及極少NEUROD1陽性細胞(藉由流動式細胞測量術，96.2% KX6.1、99.6% PDX1及2.4% NEUROD1)。將該等細胞插入至NSG小鼠之腎囊中(5百萬個細胞/動物；N=7)並且歷經16週時期，未偵測到血液樣本中之人類c肽(數據未示)。未預期此結果，因為所屬技術領域中先前已證明在四階段分化過程中衍生之富集NXK6.1/PDX1/PTF1A表現細胞族群可能在移植3個月內逆轉糖尿病。
當第4階段第3天(PTF1A表現)細胞根據標準過程進一步分化至第5階段時，移植物在移植後2週分泌可偵測血液水準之人類c肽(圖31)並且在12週達到>0.5ng/mL之人類c肽，類似於略4過程(低/無PTF1A)之細胞。此等數據指示PTF1A表現既非必需的，亦不足以確保進一步成熟為功能性β細胞。相反地，PTF1A表現之升高有可能指示替代細胞族群之出現，該族群可藉由略過標準第4階段並且將細胞自含有0.5μM視黃酸、FGF7、及PKC促效劑(TPPB)之培養基直接轉換至含有γ分泌酶抑制劑、甲狀腺激素(T3)並且具有或不具有ALK5抑制劑之培養基來加以避免。
此等結果證明在第3階段調節pH至7.2可抑制NGN3表現達至少80%(參見圖26E：BxB及BxC對BxD)並且促進PDX1/NKX6.1共陽性、PTF1A陰性細胞，該細胞可進一步直接分化為含有 PDX1/NKX6.1/胰島素陽性β樣細胞之胰島樣細胞族群，無需繼代經過PTF1A陽性第4階段細胞族群。
實例7
此實例示範在攪拌槽、無菌閉合生物反應器中使用低培養基pH(<7.2)、FGF7、視黃酸、及PKC拮抗劑(TPPB)經由五階段分化過程形成胰島素表現細胞。發現在第3階段使用低pH會消除在第3階段使用任何音蝟抑制劑(諸如SANT01或環巴胺)或TGF-β/BMP傳訊抑制劑或活化劑之需要，並且在第4階段結束時產生PDX1(94%)及NKX6.1(87%)表現細胞族群。由此等細胞產生之第5階段反應器族群具有高百分比之NEUROD1/NKX6.1共陽性細胞及具有PDX1及NKX6.1共表現之胰島素陽性細胞，且此三個基因(NEUROD1、PDX1、NKX6,1)必須與胰島素共表現以得到適當胰腺β細胞功能。因此，當此第5階段細胞族群經冷凍保存，解凍並且移植至免疫功能不全小鼠之腎囊中時，移植物在植入兩週內生產可偵測血液水準之人類C肽並且移植四週後平均生產>1ng/mL之C肽。
人類胚胎幹細胞系H1之細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在補充有0.5% w/v FAF-BSA之E8TM培養基中，在動態懸浮下呈圓形聚集團簇形式生長4個繼代。該等團簇接著根據以下方法以單一細胞及2至10個細胞之團簇形式冷凍。將約600至1000百萬個呈團簇形式之聚集細胞轉移至離心管中，並且使用100mL 1X DPS-/-洗滌。在洗滌之後，接著藉由向鬆動之細胞聚集體團塊添加30mL 50體積% StemPro®Accutase®酶及50體積% DPBS -/-之溶液，以經酶促解聚細胞聚集體。將細胞團簇上下吸移1至3次並且接著在室溫下間歇地渦旋約4分鐘，接著在80至200rcf下離心5min。接著盡可能完全地抽吸Accutase®上清液而不擾亂細胞團塊。接著在硬表面上輕敲離心管約4分鐘，以將團簇解聚為單一細胞及包含2至10個細胞之團簇。4分鐘之後，細胞再懸浮於補充有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences)及0.5% w/v FAF-BSA之100mL E8TM培養基中，並且在80至200rcf下離心5至12分鐘。接著抽吸 上清液並且逐滴添加冷(4℃)Cryostor®細胞保存培養基CS10以達到每mL 100至150百萬個細胞之最終濃度。此細胞溶液保留於冰浴中，同時等分至2mL冷凍小瓶(Corning)中，之後使用控制速率CryoMedTM 34L冷凍器如下冷凍細胞。腔室冷卻至4℃並且保持該溫度直至樣本小瓶溫度達到6℃，且接著腔室溫度每分鐘降低2℃直至樣本達到-7℃，此時腔室以20℃/min冷卻直至腔室達到-45℃。接著使腔室溫度短暫地以10℃/min上升直至溫度達到-25℃，並且接著腔室以0.8℃/min進一步冷卻直至樣本小瓶達到-40℃。腔室溫度接著以10℃/min冷卻直至腔室達到-100℃，此時腔室接著以35℃/min冷卻直至腔室達到-160℃。腔室溫度接著在-160℃下保持至少10分鐘，之後將小瓶轉移至氣相液氮儲存。此等冷凍保存之高密度單一細胞接著用作ISM。
自液氮儲存移出ISM小瓶，解凍，並且用於以每mL 0.295百萬個活細胞之接種濃度接種3公升玻璃、攪拌懸浮槽生物反應器(DASGIP)。該等小瓶自液氮儲存移出並且快速轉移至37℃水浴中持續120秒以解凍。該等小瓶接著移至BSC中並且經解凍之內含物經由2mL玻璃吸移管轉移至50mL錐形管中。接著補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Rho激酶抑制劑Y-27632之10mL E8TM培養基以逐滴方式添加至該管中。細胞在80至200rcf下離心5min。抽吸該管之上清液並且添加補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之10mL新鮮E8TM培養基，且將含有細胞之體積吸移至含有補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632之450mL E8TM培養基的培養基轉移瓶(Cap2V8®,Sanisure,Inc)中。瓶內含物接著使用蠕動泵經由無菌、C-Flex®管焊縫(tubing weld)直接泵送至生物反應器中。該生物反應器用預溫至37℃、在70rpm下攪拌之補充有0.5% w/v FAF-BSA及10μM Y-27632的1000mL E8TM培養基製備，其中溶解氧設定點為30%(空氣O2，且N2經調節)，且控制CO2分壓為5%。該反應器經接種以給出0.225×106個細胞/mL之靶濃度(濃度範圍：0.2至0.5×106個細胞/mL)。
一旦反應器經接種，細胞即在攪拌反應器中形成圓形聚集團簇。在培養物中24小時之後，培養基係經部分交換，即超過80%之初始體積經移除並且添加回補充有0.5% w/v FAF-BSA之1.5L E8TM培養基(新鮮培養基)。此培養基交換過程在接種後48小時重複。當細胞呈圓形聚集團簇在懸浮培養物中三天之後，藉由移除用過E8TM培養基並且添加分化培養基來起始3公升反應器中之分化。分化方案描述如下。
第1階段(3天)：
反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為10%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且pH經由CO2調節設定為7.4。使用1.5L MCDB-131培養基製備第1階段基礎培養基，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉；補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉、先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45%於水中)；及ITS-X之1：50,000稀釋液。細胞在補充有100ng/ml GDF8及2μM MCX化合物之1.5L第1階段基礎培養基中培養一天。24小時之後，如上文所述完成培養基交換，並且將補充有100ng/mL GDF8之新鮮1.5L基礎培養基添加至反應器中。細胞維持48小時而無進一步培養基交換。
第2階段(3天)：
反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且pH經由CO2調節設定為7.4。在第1階段完成之後，如上文所述完成培養基交換，藉此移除用過的第1階段培養基並且用作為第1階段基礎培養基但補充有50ng/mL FGF7之1.5L相同培養基更換。在培養基交換之後四十八小時，再次移除用過培養基並且用補充有50ng/mL FGF7之1.5L新鮮基礎培養基更換。
第3階段(3天)：
在第2階段完成且立即要交換培養基之前，對細胞計數，使其重力沉降並且以2.0百萬個細胞/mL之正規化濃度再懸浮於1.5公升以下第3階段基礎培養基中：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該第3階段基礎培養基補充有50ng/mL FGF-7；1μM RA；及400nM TPB。反應器設定至37℃之溫度並且在70rpm下持續攪拌。氣體及pH控制設定為30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且經由CO2調節設定為pH 7.0。培養基交換後二十四小時，再次用含有以上補充物的1.5L新鮮第3階段基礎培養基更換用過培養基。細胞之後在培養基中培養48小時直至第3階段結束。
第4階段(3天)：
在第3階段完成時，移除用過培養基並且在各生物反應器中用1.5L由以下構成之第4階段基礎培養基更換：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：100稀釋液。該第4階段基礎培養基補充0.25μM SANT-1及400nM TPB。反應器維持於37℃下並且在70rpm下攪拌。氣體及pH經調節至30%之溶解氧設定點(空氣、O2及N2經調節)並且經由CO2調節至pH設定點7.4。在第4階段起始之後四十八小時，3.2mL/L 45%葡萄糖溶液(8mM葡萄糖單劑)添加至生物反應器中並且細胞在培養基中再培養24小時。
第5階段(8天)：
在第4階段之第三天完成時，移除用過培養基並且用由以下構成之1.5L第5階段基礎培養基更換：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外1.75g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB- 131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；10mg/L肝素。關於第一次饋料，該第5階段基礎培養基補充有1μM呈3,3',5-三碘-L-甲狀腺胺酸鈉鹽形式之T3、10μM ALK5抑制劑II、1μM γ分泌酶抑制劑XXI；20ng/mL β細胞素；0.25μM SANT-1；及100nM RA。在第5階段開始之後48小時，移除用過培養基並且用1.5L相同新鮮培養基及補充物更換。四十八小時之後，移除培養基並且用補充有1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、20ng/mL β細胞素、及100nM RA之第5階段基礎培養基更換。四十八小時之後，再次交換培養基並且用補充有1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、20ng/mL β細胞素、及100nM RA之第5階段基礎培養基更換，並且培養48小時至第5階段結束。
在第5階段之第八天結束時(最後一次饋料之後48小時)，將聚集細胞團簇經由無菌焊縫及蠕動泵自反應器中移出並且離心成團塊。為了冷凍保存該等細胞，將其轉移至包含57.5% MCDB131且具有2.43g/L碳酸氫鈉、30%無Xeno KSR、10% DMSO、及2.5% HEPES(最終濃度25mM)之冷凍保存培養基中。一旦該等細胞團簇在環境溫度下懸浮於冷凍保存培養基中，即在15分鐘內移動冷凍小瓶至控制速率冷凍器(CRF)。腔室溫度接著降低至4℃持續45min，並且進一步以2.00℃/min降低至-7.0℃(樣本)。樣本接著快速冷凍，從而使腔室溫度以25.0℃/min之速率降低至-45.0℃。接著藉由以10.0℃/min增加腔室溫度至-25.0℃(腔室)來提供補償增加。樣本接著以0.2℃/min冷卻，直至溫度達到-40.0℃。腔室接著以35.0℃/min之速率冷卻至-160℃並且在彼溫度下保持15分鐘。樣本在CRF運行終止時移動至氣相液氮儲存容器中。
在細胞已經儲存於氣相液氮中之後，將細胞自儲存移出並且轉移至37℃水浴中來使細胞解凍。小瓶在水浴中輕輕地渦旋不到2分鐘直至小冰晶保留於小瓶中。小瓶內含物接著轉移至50ml錐形管中並且使用具有2.43g/L碳酸氫鈉及2% BSA之MCDB131培養基在兩分鐘內逐滴稀釋至總計20ml總體積。接著藉由Nucleocounter®測定總細 胞數目。細胞接著自50ml錐形管中之培養基中分離，移除上清液並且使細胞再懸浮於具有2.43g/L碳酸氫鈉及2% BSA之新鮮MCDB131培養基中，並且轉移至125mL Corning®旋轉燒瓶中，該燒瓶以每mL 1百萬個細胞之細胞濃度經填充至75mL體積。細胞在以55RPM攪拌之5% CO2加濕培養箱中維持隔夜，次日藉由流動式細胞測量術分析細胞。在三次重複測定中，細胞在解凍之後為大於50% NKX6.1/NEUROD1共陽性(圖32)、大於80% NKX6.1/NEUROD1共陽性(圖33)及至少35% NKX6.1/胰島素共陽性(圖34)。此外，當此等細胞移植至NSG小鼠之腎囊下時(每劑5百萬個細胞；N=7)，所有動物均具有可偵測水準之C肽並且其在移植4週內分泌平均>1ng/mL之C肽。在移植後6週，7隻經移植動物中之5隻顯示高於未刺激水準之葡萄糖反應性胰島素(人類C肽)分泌(圖35)，並且至12週時，所有7隻動物均顯示葡萄糖反應性胰島素(人類C肽)分泌(圖36)。
此等數據指示NKX6.1/胰島素共表現細胞可在第3階段使用pH及溶解氧調節來產生，以消除在第4階段使用蛋白或小分子阻斷TGF-β/BMP或音蝟傳訊之需要，同時亦最大化NKX6.1/PDX1陽性細胞在第4階段之產率，該等陽性細胞可在攪拌槽反應器中經由第五階段進一步分化為NEUORD1/NKX6.1/PDX1/胰島素共表現。該等細胞可經冷凍保存、解凍及移植，且將在活體內起作用，如藉由在移植4週內所量測之葡萄糖誘導胰島素分泌(>1ng/mLC肽)，並且在移植後12週顯示具有葡萄糖反應性。
實例8
此實例示範使用3L拋棄式旋轉燒瓶在攪拌懸浮培養物中形成胰島素表現細胞。培養基及氣體經由可移除、通風側臂蓋交換。胰島素陽性細胞在逐步製程中形成，其中細胞首先表現PDX1並且接著亦共表現NKX6.1。除了PDX1及NKX6.1之外，此等共表現細胞在懸浮培養物中接著獲得胰島素表現及稍後MAFA的表現。
人類胚胎幹細胞系H1之細胞(WA01細胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在使用MatrigelTM作為附著基質之mTeSR1TM培養基中，在黏附培養條件下生長4個繼代，持續地擴增至較大容器中。該等細胞在第4繼代接種於多個5層細胞堆疊(「CS5」)中。在繼代後72小時，各CS5中之細胞長滿達到70至80%。移除用過培養基並且用PBS洗滌細胞。預溫至37℃之300mL VerseneTM接著添加至細胞中並且該等細胞接著在37℃(5% CO2)下培養8.5分鐘。在該培養時間之後，小心地自燒瓶中移除EDTA，在燒瓶中留下大約50mL殘餘VerseneTM。接著使細胞層繼續用殘餘VerseneTM培養3分鐘，同時對容器進行間歇輕敲以使細胞團簇脫壁(dislodge)。在3分鐘之此殘餘培養後，250mL含有10μM Y-27632(Enzo Life Sciences)之mTeSR1TM添加至燒瓶中以淬滅細胞解離過程並且收集經脫壁之細胞團簇。洗滌培養基接著轉移至圓形瓶中並且用額外150mL含有150μM Y-27632之mTeSR1TM洗滌CS5，並且與第一次洗滌液匯集。200百萬個細胞接著轉移至未經塗布但經組織培養物處理之CS1中，並且補充額外培養基以獲得200mL最終體積，且具有每mL 1百萬個細胞之細胞密度。
含有經脫壁細胞之CS1在37℃下培養2小時。使用具有附接於2個CELI堆疊埠之間的泵管之閉合回路C-flex管，藉由蠕動泵在75rpm下研製細胞懸浮液5分鐘以均質化聚集體。泵管總成接著用0.2μM通風帽更換並且返回37℃培養箱以進行12與22小時之間之隔夜培養。在培養之後，細胞形成多潛能細胞之圓形、球形聚集團簇。
三個含有新近形成團簇之600mL CS1容器各自接著轉移至具有額外1200mL含有10μM Y-27632之新鮮預溫mTeSR1TM的3L拋棄式旋轉燒瓶中，所得細胞密度為每mL約0.3百萬個細胞。該等旋轉燒瓶接著在37℃及40rpm之攪動速率下培養。在24小時培養之後，使細胞自攪動移開並且使團簇沉降至燒瓶之底部持續8分鐘，之後自頂部抽吸1.5L用過培養基，從而避免位於容器底部之團簇。1.5mL新鮮mTeSR1TM培養基添加至細胞中，並且將其放回培養箱中在40 rpm下額外生長24小時。在72小時結束時，多潛能團簇轉換至分化培養基。分化方案描述如下。
第1階段(3天)：
4個旋轉燒瓶中之每一者係自動態懸浮轉移至BSC中無攪動之培養箱中。執行如下文所述之完全培養基交換，以確保僅殘餘之用過培養基經攜帶至新培養基。為了執行完全培養基交換，使團簇沉降至燒瓶之底部持續8分鐘。接著使用真空抽吸，自液體頂部開始移除用過培養基，直至僅剩餘300mL。該剩餘細胞體積經轉移至150mL錐形管中並且在800rpm下離心3分鐘。使用真空抽吸系統，移除剩餘之用過培養基而不破壞細胞團簇團塊。該等團塊接著再懸浮於含有1.5L MCDB-131培養基之1.8L基礎培養基中，該MCDB-131培養基含有1.18g/L碳酸氫鈉；補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉、先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖(45%於水中)；及ITS-X之1：50,000稀釋液。細胞在補充有1.8ml GDF8及540μL MCX化合物之1.8L第1階段基礎培養基中培養一天。取得細胞計數以確認在分化開始時每mL 0.5百萬個細胞之開始密度。燒瓶接著放回培養箱中根據如下表XVII中所示之條件的2種速度下之旋轉板上。旋轉燒瓶培養隔夜。
在約24小時之後，完成培養基交換以移除約90%用過培養基並且用補充有1.8mL GDF8之新鮮1.8L基礎培養基更換。為了執行培養基交換，使團簇沉降至燒瓶底部持續8分鐘並且使用真空抽吸移除用過培養基直至僅剩餘300mL。剩餘細胞經轉移至250mL圓形瓶中並 且使團簇沉降6分鐘，之後使用吸移管移除培養基以確保僅留下180mL含細胞之培養基，從而確保不超過10%之殘餘用過培養基經轉移至下一饋料。剩餘細胞及培養基接著返回具有1.8L新鮮培養基之旋轉燒瓶中並且使其培養48小時。
第2階段(3天)：
執行如上文所述之完全培養基交換以移除所有第1階段用過培養基，並且將細胞轉移至用作第1階段基礎培養基但補充有1.8mL FGF7之1.8L相同培養基中。燒瓶接著返回至培養箱中並且使其在動態攪動下保持48小時而無培養基交換，之後再次移除用過培養基，留下180mL用過培養基並且添加1.8L補充有1.8mL FGF7之新鮮基礎培養基。細胞接著培養24小時。
第3階段(3天)：
在第2階段完成時，執行完全培養基交換以移除所有第2階段培養基並且將細胞轉移至1.5L培養基：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該第3階段基礎培養基補充有1.5mL FGF-7；75μL RA；及120uL TPB。該培養基在「暗條件」下製備。燒瓶之總體積自1.8至2.0L降低至1.5至1.65L，以達每mL約1.5至2百萬個細胞之目標細胞密度。燒瓶培養24小時，之後執行培養基交換，留下150mL用過培養基並且添加1.5L含有以上補充物之新鮮第3階段基礎培養基。細胞之後在培養基中培養48小時直至第3階段結束。
第4階段(3天)：
在第3階段完成時，執行完全培養基交換並且將細胞轉移至1.5L由以下構成之第4階段基礎培養基中：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外2.4g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB- 131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；2.5mM葡萄糖；及ITS-X之1：200稀釋液。該第4階段基礎培養基補充有150μL SANT-1及120μL TPB。燒瓶接著返回至培養箱中並且使其在動態攪動下保持48小時而無培養基交換。在48小時結束時，5.28mL 45% D-葡萄糖溶液添加至旋轉器中並且燒瓶恢復培養另外24小時。
第5階段(3天)：
在第4階段之第三天完成時，移除用過培養基並且用由以下構成之1.5L第5階段基礎培養基更換：1.5L含有1.18g/L碳酸氫鈉之MCDB-131培養基，補充有額外1.75g/L碳酸氫鈉；先前在MCDB-131中重構之2% w/v FAF-BSA；1X濃度之GlutaMAXTM；20mM葡萄糖；ITS-X之1：200稀釋液；250μL/L 1M抗壞血酸；10mg/L肝素。該第5階段基礎培養基補充有1μM呈3,3',5-三碘-L-甲狀腺胺酸鈉鹽形式之T3、10μM ALK5抑制劑II、1μM γ分泌酶抑制劑XXI；20ng/mL β細胞素；0.25μM SANT-1；及100nM RA。在第5階段開始之後48小時，移除用過培養基並且用1.5L相同新鮮培養基及補充物更換。48小時之後，移除培養基並且用補充有1μM T3、10μM ALK5抑制劑II、20ng/mL β細胞素、及100nM RA之第5階段基礎培養基更換，並且繼續分化48小時直至第5階段結束。
在第5階段結束時，使聚集細胞團簇沉降至燒瓶底部持續8分鐘並且使用真空抽吸移除培養基直至剩餘約300mL液體。該剩餘細胞體積經轉移至150mL錐形管中並且在800rpm下離心3分鐘，隨後移除剩餘之用過培養基。細胞團塊再懸浮於洗滌培養基基礎MCDB1313中。細胞再次在800rpm下離心5分鐘。為了冷凍保存該等細胞，將其轉移至包含57.5% MCDB131且具有2.43g/L碳酸氫鈉、20%無Xeno KSR、10% DMSO、及2.5% HEPES(最終濃度25mM)之冷凍保存培養基中。一旦該等細胞團簇在環境溫度下懸浮於冷凍保存培養基中，即在15分鐘內移動冷凍小瓶至控制速率冷凍器(CRF)。腔室溫度接著降低至4℃持續45min，並且進一步以2.00℃/min降低至-7.0℃(樣本)。樣本接著快速冷凍，從而使腔室溫度以 25.0℃/min之速率降低至-45.0℃。接著藉由以10.0℃/min增加腔室溫度至-25.0℃(腔室)來提供補償增加。樣本接著以0.2℃/min冷卻，直至溫度達到-40.0℃。腔室接著以35.0℃/min之速率冷卻至-160℃並且在彼溫度下保持15分鐘。樣本在CRF運行終止時移動至氣相液氮儲存容器中。
在細胞已經儲存於氣相液氮中之後，將三個小瓶之細胞自儲存移出並且轉移至37℃水浴中來使細胞解凍。小瓶在水浴中輕輕地渦旋不到2分鐘直至小冰晶保留於小瓶中。小瓶內含物接著轉移至旋轉燒瓶中，並且逐滴添加10mL解凍培養基同時持續手動混合旋轉燒瓶，使用經補充以獲得1.6g/L碳酸氫鈉、8mM葡萄糖、1x ITS-X、及2% BSA之最終濃度的MCDB131培養基。在所有三個小瓶均解凍之後，添加額外解凍培養基以達到約80mL之靶體積。旋轉燒瓶接著在具有5% CO2之加濕培養箱中，以38至40rpm之輕輕攪動下培養隔夜(16至24小時)。次日，如下洗滌細胞。使旋轉燒瓶在櫃中沉降6分鐘並且抽吸約75mL用過培養基，同時使用10mL玻璃吸移管將剩餘之細胞懸浮液轉移至50mL錐形管中且隨後在600rpm下離心3分鐘。抽吸上清液並且使細胞團塊再懸浮於10mL洗滌培養基中，之後使細胞在600rpm下再離心3分鐘。在抽吸並且使細胞團塊再懸浮於10mL洗滌培養基中之後，將團塊轉移回其中添加有60mL洗滌培養基之旋轉燒瓶中。接著將燒瓶置放於BSC中之旋轉板上並且自充分均質混合旋轉燒瓶中收集樣本以獲得細胞回收同時收集細胞用於分析及運輸。
圖37A及37B描繪在旋轉燒瓶內之培養基的pH特性。培養基之pH藉由培養箱中之CO2(設定點5%)及代謝活性(特定言之圖38中描繪之細胞的乳酸鹽產量)來調節。顯示具有最低pH環境(特定言之條件A)之培養物亦具有最高乳酸鹽濃度。如圖37A及B中可見，所有旋轉燒瓶之pH在第2階段期間介於約6.8與7.2之間，並且在第3階段中介於約7.0與7.2之間。在第3階段完成後，觀察到幾乎所有細胞均表現內胚層轉錄因子FOXA2及胰腺特異性轉錄因子PDX1。亦偵測到至少50%表現NKX6.1，其中一小族群為NEUOD1陽性。在第3階段之後另外48小時，即第4階段第2天完成時，NKX6.1族群增 加至最初用Accutase(條件C及D)脫壁之約65%之族群，以及最初用EDTA脫壁之約70至75%之細胞族群，如表XVIII所示。
在第5階段之6天完成時，再次藉由流動式細胞測量術分析細胞，接著冷凍保存。
藉由流動式細胞測量術評估解凍之細胞以與新鮮(冷凍保存前)分析進行比較，如表XX中所示。藉由比較最終細胞族群與在解凍時之初始族群(t=0)來分析細胞回收。經由活/死螢光成像來定量分析細胞存活性，如圖39中所示並且與t=0比較。
雖然本文中已藉由提及各種特定材料、程序與實例來描述並說明本發明，但會理解到本發明不限於針對此目的所選用的特定材料與程序組合。此類細節的許多變化型式可為默示者並且將為熟悉該項技術領域者所理解。所意欲者為僅將說明書與實例視為例示性，並且本發明之真正範疇與精神係由下列申請專利範圍所指示。所有本說明書中所參照之參考文獻、專利與專利申請案皆以引用方式全文併入於本說明書中。

Claims (7)

  1. 一種用於分化人類多潛能細胞之方法，其包含以下步驟：藉由在pH約7.2至約7.0下之動態懸浮培養物中培養前腸內胚層細胞持續至少約24小時，使該等前腸內胚層細胞分化為胰腺內胚層細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含在具有等於或大於約1.5百萬個細胞/mL之細胞濃度的培養物中培養該等前腸內胚層細胞。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含在具有大於或等於約2.0百萬個細胞/mL之細胞濃度的培養物中培養該等前腸內胚層細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該等胰腺內胚層細胞之PTF1A及NGN3的表現實質上呈陰性。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其進一步包含將該等PTF1A及NGN3之表現實質上呈陰性的胰腺內胚層細胞富集為具有大於或等於約96%的細胞為PDX1及NKX6.1之共表現呈陽性且PTF1A之表現呈陽性之胰腺內胚層細胞族群。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其進一步包含在其中產生PTF1A之表現呈陽性的細胞之分化階段不存在下，使該等PTF1A及NGN3之表現實質上呈陰性的胰腺內胚層細胞分化為胰腺內分泌。
  7. 一種用於分化人類多潛能細胞之方法，其包含以下步驟：藉由在pH約7.2至約7.0下之動態懸浮培養物中、在等於或大於約1.5百萬個細胞/mL之細胞濃度下、及在約0.5至約1.0μM之類視色素濃度下培養前腸內胚層細胞持續至少約24小時，使該等前腸內胚層細胞分化為胰腺內胚層細胞，其中該培養係於用以抑制、阻斷、活化或促效TGF-β傳訊及BMP傳訊中之一或多者的組分及音蝟傳訊路徑抑制劑不存在下進行。
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