TW201632553A - Ｉｌ－１３結合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供新穎的抗IL-13抗原結合蛋白質，諸如抗體及其抗原結合片段。本發明亦提供使用該等蛋白質以降低IL-13活性及治療IL-13相關疾病及病狀之方法。

Description

IL-13結合蛋白及其用途 對以電子方式提交之序列表之參考
與本申請案一起遞交的以電子方式提交之ASCII文本文件中之序列表(IL13NG-100TW1_SL.txt；大小：216,525位元組；及創建日期：2015年11月24日)之內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於IL-13，特定言之人類IL-13之抗原結合蛋白質，且詳言之，抗IL-13抗體分子及其抗原結合片段，例如中和IL-13活性之抗體分子及其抗原結合片段。其亦係關於使用抗IL-13抗體分子及其抗原結合片段診斷或治療IL-13相關疾病或病狀的方法，該等疾病或病狀包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺部纖維化(IPF)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、休格連氏症候群(Sjögren's Syndrome)及霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)。
本發明之抗原結合蛋白質藉由輕鏈隨機化自BAK1183H4抗體獲得且因此具有BAK1183H4譜系。然而，其與BAK1183H4相比具有改良之針對人類IL-13之親和力，同時由於其輕鏈互補決定區(LCDR)及/或構架區中之突變仍保持低聚集及高穩定性。
本發明之其他態樣提供含有本發明之抗原結合蛋白質的組合物，及其在抑制或中和IL-13之方法中的用途，包括藉由療法治療人類或動物身體之方法。
本發明提供抗體分子及其抗原結合片段，其結合及中和IL-13，其因此用於多種治療性處理中之任一者中，如由本文中所含之實驗指示及由支持技術文獻進一步指示。
介白素(IL)-13為114胺基酸型細胞激素，其未經修飾之分子量為約12kDa[1，2]。IL-13在序列方面與IL-4最緊密相關，其與IL-4在胺基酸含量方面共有30%序列相似性。人類IL-13基因位於與IL-4基因相鄰的染色體5q31上[1][2]。染色體5q之此區域含有其他Th2淋巴細胞衍生之細胞激素之基因序列，包括GM-CSF及IL-5，已證實其與IL-4之含量與氣喘患者及過敏性炎症之嚙齒動物模型中之疾病嚴重程度相關[3][4][5][6][7][8]。
儘管最初鑑別為Th2 CD4+淋巴細胞衍生之細胞激素，IL-13亦由Th1 CD4+ T細胞、CD8+ T淋巴球NK細胞及非T細胞群體(諸如肥大細胞、嗜鹼細胞、嗜伊紅血球、巨噬細胞、單核細胞及呼吸道平滑肌細胞)產生。
報導IL-13可經由受體系統介導其作用，該受體系統包括IL-4受體α鏈(IL-4Rα)，其本身可結合IL-4而非IL-13，及至少兩種其他細胞表面蛋白質，IL-13Rα1及IL-13Rα2[9][10]。IL-13Rα1可以低親和力結合IL-13，接著募集IL-4Rα以形成進行信號傳導之高親和力功能性受體[11][12]。Genbank資料庫列舉IL-13Rα1之胺基酸序列及核酸序列分別為NP_001551及Y10659。在STAT6(信號轉導與轉錄活化因子6)缺失型小鼠中之研究顯示IL-13以與IL-4類似的方式，藉由利用JAK-STAT6路徑來進行信號傳導[13][14]。IL-13Rα2與IL-13Rα1在胺基酸含量方面共有37%序列一致性且以高親和力結合IL-13[15][16]。然而，IL-13Rα2具有較短的細胞質尾區，其不具有已知的信號傳導主結構。表現IL-13Rα2之細胞即使在IL-4Rα存在下仍不回應於IL-13[17]。 因此，假設IL-13Rα2充當調節IL-13而非IL-4功能的誘餌受體。此由IL-13Rα2缺失型小鼠中之研究支持，該小鼠之表現型與對IL-13之反應增加一致[18][19]。Genbank資料庫列舉IL-13Rα2之胺基酸序列及該核酸序列分別為NP_000631及Y08768。
信號傳導IL-13Rα1/IL-4Rα受體複合物表現於人類B細胞、肥大細胞、單核球/巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜伊紅血球、嗜鹼細胞、纖維母細胞、內皮細胞、呼吸道上皮細胞及呼吸道平滑肌細胞上。
支氣管哮喘為一種肺部之常見持續性發炎性疾病，其特徵為氣管過度反應、黏液過度產生、纖維化及血清IgE含量升高。氣管過度反應(AHR)為呼吸道因諸如冷空氣之非特異性刺激誇大收縮。認為AHR及黏液過度產生可引起不同呼吸道堵塞，其引起呼吸短促(哮喘發作(惡化)之特徵)且引起與此疾病相關之死亡率(在英國約2000例死亡/年；全世界約250,000例死亡/年。參見Clinical Respiratory Medicine.Richard K.Albert,Stephen G.Spiro,James R.Jett.編ElsevierHealth Sciences,2008第554頁)。
哮喘及其他過敏性疾病之發病率近年來顯著增加[20][21]。舉例而言，當前，在英國(UK)約10%人群已診斷患有哮喘。
英國胸科協會(Current British Thoracic Society；BTS)及全球哮喘防治創議(Global Initiative for Asthma；GINA)指南提出用於治療哮喘之逐步型方法[22、23]。輕度至中度哮喘一般可藉由使用吸入之皮質類固醇與β-促效劑或白三烯抑制劑之組合來控制。然而，由於所記錄之皮質類固醇之副作用，患者傾向於不符合可降低治療效用之治療方案[24-26]。
顯然需要用於患有更嚴重疾病之個體的新穎治療，該等個體通常自較高劑量之由哮喘指南建議之吸入或經口皮質類固醇獲得極有限的益處。長期用經口皮質類固醇治療與副作用相關，諸如骨質疏鬆、 兒童生長速率減緩、糖尿病及口腔念珠菌病[66]。由於皮質類固醇之有利及副作用皆經由相同受體介導，因此治療為安全性與功效之間的平衡。這些患者(其代表約6%的英國哮喘人群)由於嚴重惡化而住院占哮喘對衛生保健機構造成之重大經濟負擔之大部分[67]。
咸信哮喘之病理學係由進行中的Th2淋巴細胞介導之炎症引起，該炎症由免疫系統對無害抗原之不當反應引起。已存在暗示IL-13而非經典的Th2衍生之細胞激素IL-4作為確定的呼吸道疾病之發病機制中之關鍵介體的證據。
向原生非致敏化嚙齒動物之呼吸道投與重組型IL-13可引起哮喘表現型之多種態樣，包括呼吸道炎症、黏液產生及AHR增加[27][28][29][30]。在IL-13於肺中特異性過表現之轉殖基因小鼠中觀測到類似表現型。在此模型中，對IL-13之更長期暴露亦引起纖維化[31]。
此外，在過敏性疾病之嚙齒動物模型中，哮喘表現型之多種態樣與IL-13相關。已證實可溶性鼠類IL-13Rα2(一種強效IL-13中和劑)可抑制AHR、黏液分泌過多及發炎性細胞之流入(其為此嚙齒動物模型之特徵)[27][28][30]。在互補研究中，缺失IL-13基因之小鼠未能發展過敏原誘導之AHR。可藉由投與重組型IL-13使此等IL-13缺失型小鼠中之AHR恢復。相比之下，此模型中之IL-4缺失型小鼠發展呼吸道疾病[32][33]。
使用較長期過敏原誘導之肺炎症模型，Taube等人證明可溶性鼠類IL-13Rα2針對確定的呼吸道疾病之功效[34]。可溶性鼠類IL-13Rα2抑制AHR、黏液過度產生且以較小程度抑制呼吸道炎症。相比之下，在此系統中，可溶性IL-4Rα，其結合及拮抗IL-4，對AHR或呼吸道炎症具有極小作用[35]。此等發現由研究哮喘之慢性真菌模型之Blease等人支持，其中針對IL-13而非IL-4之多株抗體能夠減少黏液過度產 生、AHR及上皮下纖維化[36]。
IL-13基因中之許多基因多形現象亦與過敏性疾病有關。特定言之，IL-13基因之變異體(其中胺基酸130處之精胺酸殘基經麩醯胺酸取代(Q130R))與支氣管哮喘、異位性皮膚炎及血清IgE含量升高相關[37][38][39][40]。一些自胺基酸計數排除20個胺基酸信號序列之團體亦將此特定IL-13變異體稱為Q110R變異體(胺基酸110處之精胺酸殘基經麩醯胺酸取代)。Arima等人，[41]報導此變異體與血清中IL-13之含量升高相關。WO 01/62933中論述IL-13變異體(Q130R)及針對此變異體之抗體。IL-13啟動子多形現象(其改變IL-13產生)亦與過敏性哮喘相關[42]。
亦在患有哮喘、特應性鼻炎(枯草熱)、過敏性皮炎(濕疹)及慢性鼻竇炎之人類個體中量測到升高之IL-13含量。舉例而言，與對照個體相比，發現來自氣喘患者之支氣管活檢體、痰及支氣管肺泡灌洗(BAL)細胞中之IL-13含量較高[43][44][45][46]。此外，當用過敏原攻擊時，哮喘個體中之BAL樣品中之IL-13含量增加[47][48]。進一步證實CD4(+)T細胞之IL-13生產能力適用於新生兒中過敏性疾病之後續發展之風險標記物[49]。
Li等人[75]報導哮喘之慢性小鼠模型中中和抗小鼠IL-13抗體之作用。在OVA致敏化小鼠中誘導慢性哮喘類反應(諸如AHR、嚴重呼吸道炎症、黏液過度產生)。Li等人報導在各OVA攻擊抑制AHR、嗜伊紅血球浸潤、血清IgE含量、促炎性細胞激素/趨化細胞素含量及呼吸道重塑時投與IL-13抗體[14]。
IL-13可在發炎性腸病之發病機制中起一定作用。Heller等人[78]報導在人類潰瘍性結腸炎之鼠類模型中，藉由投與可溶性IL-13Rα2來中和IL-13可改善結腸炎症[78]。相應地，當與對照物相比時，來自潰瘍性結腸炎患者之直腸活檢樣品中之IL-13表現較高[77]。
除哮喘以外，IL-13與其他纖維化病狀相關。已在全身性硬化症患者之血清[50]及來自受肺纖維化之其他形式影響之患者的BAL樣品[51]中量測到增加之IL-13含量，達到比IL-4高1000倍。相應地，小鼠肺中IL-13而非IL-4之過表現引起顯著纖維化[52][53]。已在寄生蟲誘導之肝纖維化之小鼠模型中廣泛研究IL-13對除肺以外的組織中之纖維化的貢獻。藉由投與可溶性IL-13Rα2或IL-13基因破壞進行IL-13之特異性抑制，但不消除IL-4產生，可防止肝中之纖維發生[54][55][56]。
慢性阻塞性肺病(COPD)包括具有不同程度慢性支氣管炎、小氣管疾病及肺氣腫之患者群體且藉由進行性不可逆肺功能衰退對當前基於哮喘之療法回應不良來表徵[68]。
COPD之發病率近年來顯著上升，變成全世界第四大死亡主要原因(世界衛生組織(World Health Organisation))。因此，COPD代表巨大的未滿足的醫學需求。
COPD之潛在病因仍未充分瞭解。「荷蘭假說(Dutch hypothesis)」提出存在對COPD及哮喘之共同敏感性且因此，類似機制可有助於兩種病症之發病機制[57]。
Zheng等人[58]證明小鼠肺中之IL-13過表現可引起肺氣腫、黏液產生升高及炎症，反映人類COPD之態樣。此外，已證實AHR(過敏性炎症之鼠類模型中之IL-13依賴性反應)可預示吸菸者中之肺功能降低[59]。亦確定IL-13啟動子多形現象與發展COPD之敏感性之間的相關性[60]。
因此，標誌為IL-13在COPD之發病機制，特定言之在具有哮喘類特徵(包括AHR及嗜伊紅血球增多)之患者中起重要作用。當與來自未報導肺病之個體之肺樣品相比時，已證實來自具有COPD病史之個體之屍檢組織樣品中之IL-13之mRNA含量較高(J.Elias,Oral communication at American Thoracic Society Annual Meeting 2002)。在另一研究中，由來自COPD患者之周邊肺切片中之免疫組織化學證明IL-13含量升高[69]。
霍奇金氏病(Hodgkin's disease)為常見類型之淋巴瘤，其在美國每年有約7,500名病例。霍奇金氏病在惡性病中之不同之處在於贅生性里德-斯德伯格氏細胞(neoplastic Reed-Sternberg cell)，其通常來源於B細胞，僅占臨床可偵測塊狀物之小比例。霍奇金氏病衍生之細胞株及原發性里德-斯德伯格氏細胞頻繁表現IL-13及其受體[61]。由於IL-13促進正常B細胞中之細胞存活及增殖，提出IL-13可充當里德-斯德伯格氏細胞之生長因子。Skinnider等人證明針對IL-13之中和抗體可活體外抑制霍奇金氏病衍生之細胞株之生長[62]。此發現結果表明里德-斯德伯格氏細胞可藉由IL-13自分泌及旁分泌細胞激素循環來增強其自身存活率。與此假說一致，當與正常對照物相比時，已在一些霍奇金氏病患者之血清中偵測到IL-13含量升高[63]。因此，IL-13抑制劑可藉由抑制惡性里德-斯德伯格氏細胞之增殖來阻止疾病進程。
許多人類癌細胞表現免疫原性腫瘤特異性抗原。然而，儘管許多腫瘤自發地消退，但一定數目的腫瘤藉由抑制T細胞介導之免疫性來躲避免疫系統(免疫監視)。Terabe等人[64]證明IL-13在小鼠模型中之免疫抑制中之作用，其中腫瘤在初始生長之後自發地消退且接著復發。IL-13之特異性抑制(藉由可溶性IL-13Rd2)保護此等小鼠免於腫瘤復發。Terabe等人[64]證明IL-13抑制可介導抗腫瘤免疫反應之腫瘤特異性CD8+細胞毒性淋巴球之分化。
因此，IL-13抑制劑可在治療學上用於防止腫瘤復發或轉移。已證實抑制IL-13可增強動物模型中之抗病毒疫苗且對HIV及其他感染性疾病之治療有益[65]。
應注意，除以其他方式指定情形外，本文中對介白素-13或IL-13 之參考通常為對人類IL-13之參考。此亦在某些地方稱為「抗原」。
結合人類IL-13之抗體分子描述於WO 2005/007699及美國專利第7,829,090號(各自以全文引用的方式併入本文中)中，包括BAK1183H4抗體(由其衍生本發明之抗原結合蛋白質)。然而，仍然需要改良之抗IL-13抗體，其具有較高親和力及增加之血清持久性或半衰期以增加功效及降低投藥頻率及提高患者順應性。
本發明提供藉由輕鏈隨機化自BAK1183H4抗體獲得之抗原結合蛋白質，其由於其輕鏈CDR(LCDR)序列中之取代及/或構架區中之視情況存在之一或多種其他取代而與BAK1183H4相比以更高的親和力結合於人類IL-13。如在此項技術中良好理解，提高抗IL-13抗原結合蛋白質之親和力有時引起高聚集率，其可降低功效或熱穩定性。然而，本發明之最佳化抗原結合蛋白質與BAK1183H4相比具有增加之親和力，且聚集作用與BAK1183H4類似。
IgG結構域之不穩定性可與不利化學方法、製造及對照(CMC)特性相關，諸如熱穩定性及可溶性降低、聚集或片段化增加(最終引起純度損失增加)、調配/傳遞選擇方案受限及其他可發展性挑戰。當IgG1恆定域經工程改造以降低效應功能及/或延長血清半衰期時，有時觀測到免疫球蛋白之熱不穩定性。參見例如2013年4月17日申請之作為WO2013165690公開之PCT/US2013/036872，其以全文引用的方式併入本文中。
舉例而言，Dall'Acqua等人(2006,J.Biol.Chem.；281：23514-24)描述一種IgG1抗體，其Fc區在位置252、254及256處突變(M252Y/S254T/T256E EU編號，(Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesman,K.S.及Foeller.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Public Health Service,National Institutes of Health,Washington,D.C.，下文中稱為「YTE」)。與野生型IgG1相比，此等突變使pH 6.0下與人類FcRn之結合增加約10倍，同時實現pH 7.4下之有效釋放，顯著延長食蟹獼猴中之血清半衰期。參見Dall'Acqua等人，2002,J Immunol.；169：5171-80。
當將含有突變之YTE集合之IgG1恆定域併入本發明之抗原結合蛋白質時，本發明之抗原結合蛋白質之熱穩定性意外地與BAK1183H4類似。因此，本發明之抗原結合蛋白質由於其輕鏈CDR(LCDR)序列中之取代及/或構架區中視情況存在之一或多種其他取代，不僅在低聚集下具有增加之針對IL-13之親和力，且亦具有與BAK1183H4親本類似的熱穩定性。
本發明提供經分離抗原結合蛋白質或其抗原結合片段，其結合人類IL-13，其包含由可變重鏈(VH)結構域及可變輕鏈(VL)結構域組成之抗原結合位點，其中VH域包含HCDR1、HCDR2及HCDR3且VL域包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，且其中：HCDR1包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；LCDR1包含具有下式之胺基酸序列：G G N LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 L V H
其中LX1係選自由L及M組成之群，LX2係選自由以下組成之群：L、I及V，LX3係選自由G及A組成之群，LX4係選自由S及A組成之群，及LX5係選自由R及Y組成之群；(SEQ ID NO：251)
LCDR2包含具有下式之胺基酸序列：D D LX6 D R P S
其中LX6係選自由以下組成之群：G、I、E、M及Q；(SEQ ID NO：252)及LCDR3包含具有下式之胺基酸序列：Q V W D T G S LX7 P V V
其中LX7係選自由以下組成之群：D、R、L及S(SEQ ID NO：253)。
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質包含CDR之集合：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，如以下表3-6中之任一者中所示。
本發明亦提供經分離抗原結合蛋白質或其抗原結合片段，其結合人類IL-13，其包含由可變重鏈(VH)結構域及可變輕鏈(VL)結構域組成之抗原結合位點，該可變重鏈結構域及可變輕鏈結構域包含CDR之集合：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，其中CDR之集合係選自由以下組成之群：(a)HCDR1包含展示為SEQ ID NO：13之胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：14之胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：15之胺基酸序列，LCDR1包含展示為SEQ ID NO：18之胺基酸序列，LCDR2包含展示為SEQ ID NO：19之胺基酸序列且LCDR3包含展示為SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HCDR1包含展示為SEQ ID NO：23之胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：24之胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：25之胺基酸序列，LCDR1包含展示為SEQ ID NO：28之胺基酸序列，LCDR2包含展示為SEQ ID NO：29之胺基酸序列且LCDR3包含展示為SEQ ID NO：30之胺基酸序列；及(c)HCDR1包含展示為SEQ ID NO：33之胺基酸序列，HCDR2包含展示為SEQ ID NO：34之胺基酸序列，HCDR3包含展示為SEQ ID NO：35之胺基酸序列，LCDR1包含展示為SEQ ID NO：38之胺基酸序列，LCDR2包含展示為SEQ ID NO：38之胺基酸序列且LCDR3包含展示為SEQ ID NO：40之胺基酸序列。
本發明亦提供經分離抗原結合蛋白質或其抗原結合片段，其結合人類IL-13，其包含選自由以下組成之群的VH域及VL域：(a)包含SEQ ID NO：12之VH域及包含SEQ ID NO：17之VL域(13NG0083)；(b)包含SEQ ID NO：22之VH域及包含SEQ ID NO：27之VL域(13NG0073)；(c)包含SEQ ID NO：32之VH域及包含SEQ ID NO：37之VL域(13NG0074)；(d)包含SEQ ID NO：112之VH域及包含SEQ ID NO：117之VL域(13NG0071)；(e)包含SEQ ID NO：42之VH域及包含SEQ ID NO：47之VL域(13NG0068)；(f)包含SEQ ID NO：52之VH域及包含SEQ ID NO：57之VL域(13NG0067)；(g)包含SEQ ID NO：62之VH域及包含SEQ ID NO：67之VL域(13NG0069)；(h)包含SEQ ID NO：72之VH域及包含SEQ ID NO：77之VL域(13NG0076)；(i)包含SEQ ID NO：82之VH域及包含SEQ ID NO：87之VL域(13NG0070)；(j)包含SEQ ID NO：92之VH域及包含SEQ ID NO：97之VL域(13NG0075)；(k)包含SEQ ID NO：102之VH域及包含SEQ ID NO：107之VL域 (13NG0077)；(l)包含SEQ ID NO：122之VH域及包含SEQ ID NO：127之VL域(13NG0072)；(m)包含SEQ ID NO：242之VH域及包含SEQ ID NO：247之VL域(13NG0025)；(n)包含SEQ ID NO：222之VH域及包含SEQ ID NO：227之VL域(13NG0078)；(o)包含SEQ ID NO：142之VH域及包含SEQ ID NO：147之VL域(13NG0079)；(p)包含SEQ ID NO：152之VH域及包含SEQ ID NO：157之VL域(13NG0080)；(q)包含SEQ ID NO：132之VH域及包含SEQ ID NO：137之VL域(13NG0081)；(r)包含SEQ ID NO：192之VH域及包含SEQ ID NO：197之VL域(13NG0082)；(s)包含SEQ ID NO：182之VH域及包含SEQ ID NO：187之VL域(13NG0084)；(t)包含SEQ ID NO：212之VH域及包含SEQ ID NO：217之VL域(13NG0085)；(u)包含SEQ ID NO：162之VH域及包含SEQ ID NO：167之VL域(13NG0086)；(v)包含SEQ ID NO：202之VH域及包含SEQ ID NO：207之VL域(13NG0087)；及(w)包含SEQ ID NO：172之VH域及包含SEQ ID NO：177之VL域(13NG0088)。
在一個實施例中，本發明之抗原結合蛋白質或其抗原結合片段 包含CDR之集合：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中：HCDR1包含展示為SEQ ID NO：233之胺基酸序列，HCDR2包含展示為SEQ ID NO：234之胺基酸序列，HCDR3包含展示為SEQ ID NO：235之胺基酸序列，LCDR1包含展示為SEQ ID NO：238之胺基酸序列，LCDR2包含展示為SEQ ID NO：239之胺基酸序列且LCDR3包含展示為SEQ ID NO：240之胺基酸序列(亦即純系13NG0027)。
在一個實施例中，本發明之抗原結合蛋白質或其片段包含有包含SEQ ID NO：232之VH域及包含SEQ ID NO：237之VL域(亦即純系13NG0027)。
本發明之抗原結合蛋白質可具有選自由以下組成之群的一或多種特性：(a)與BAK1183H4抗體競爭結合於IL-13，其中BAK1183H4抗體包含有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VL域；(b)以優於BAK1183H4抗體之親和力結合人類IL-13，其中BAK1183H4抗體包含有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VL域；及(c)以小於約80pM、小於約50pM、小於約20pM或小於約10pM之KD值結合人類IL-13。
在其他實施例中，本發明之抗原結合蛋白質包含人類IgG1恆定域及人類λ恆定域。
本發明之抗原結合蛋白質亦可包含含有M252Y、S254T及T256E之突變的IgG1 Fc結構域，其中位置編號係根據EU索引，如Kabat中。
本發明亦提供本發明之抗原結合蛋白質，其用於治療選自由以下組成之群的疾病或病狀的方法：哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、 特發性肺部纖維化(IPF)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、休格連氏症候群及霍奇金氏淋巴瘤。
本發明亦提供包含圖1-4中所提供之VH、VL及CDR序列的抗原結合蛋白質及具有實例1-11及圖5-19中說明之特徵的抗原結合蛋白質。
此等抗原結合蛋白質及本發明之其他態樣更詳細地描述於下文中。
圖1展示生物化學分析中鑑別為成功結果之來自微型再結合文庫之22種變異體之VL序列。CDR區域在方塊中。胺基酸序列與親本(BAK1183H04)相比之差異以灰色突出顯示。在序列比對之頂部，微調殘基(Vernier residue)用黑色條柱表示。圖1A展示在生物化學分析中篩選之來自微型文庫之經純化之scFv之第一面之VL序列(按出現之次序分別為SEQ ID NO：300-335)。圖1B展示在生物化學分析中篩選之來自微型文庫之經純化之scFv的第二面之VL序列比對(按出現之次序分別為SEQ ID NO：336-371)。所有變異體與親本相比在IC50方面展示3-7倍改良(圖1A及1B中之表格)。
圖2展示自微型再結合文庫鑑別之純系之序列比對。胺基酸序列與親本(BAK1183H04)相比之差異以灰色突出顯示。在序列比對之頂部，微調殘基用黑色條柱表示。圖2A展示重鏈序列比對(按出現之次序分別為SEQ ID NO：372-396)，且圖2B展示輕鏈序列比對(按出現之次序分別為SEQ ID NO：397-421)。
圖3展示由微型文庫再結合策略鑑別之三個純系13NG0073、13NG0074及13NG0083之序列比對，其接著用於進一步表徵。胺基酸序列與親本(1183H04)相比之差異以灰色突出顯示。在序列比對之頂 部，微調殘基用黑色條柱表示。圖3按出現之次序分別揭示SEQ ID NO：422-429。
圖4展示來自再結合前選擇之兩種變異體之序列比對。當與在VL CDR3中之位置95a處具有D至S之單胺基酸取代的最終變異體再組合時，純系13NG0025及13NG0027之VL CDR1及VL CDR2分別產生純系13NG0083之VL序列。胺基酸序列與親本(BAK1183H04)相比之差異以灰色突出顯示。在序列比對之頂部，微調殘基用黑色條柱表示。所觀測之此等兩個純系之個別倍數改良為適中的；但將其重新組合(與VL CDR3中之其他突變)引起親和力之未預期的5.2倍改良。圖4按出現之次序分別揭示SEQ ID NO：430-433。
圖5展示TF1增殖分析中13NG0083純系之效能。正方形表示同型對照之結果，且圓形表示13NG0083之結果(在Fc區中具有YTE突變之IgG格式)。13NG0083有效力地抑制TF1增殖(平均IC50=165pM(95%置信區間=26-1052pM))。CPM：計數/分鐘。展示代表性實驗；資料為重複值之算術平均值±SEM。
圖6展示來源於受體-配位體競爭分析之13NG0083變異體之IC50值。資料展示為幾何平均值±95%信賴區間。包括親本IgG1-YTE(1183H4_VH_VL_nonGL IgG1-YTE)及人類IL-13 Receptorα2用於參考。13NG0083變異體展示與親本相比之平均效能之顯著改良(1183H4_VH_VL_nonGL IgG1-YTE；IC50=1.34nM)，幾乎未發現改變IgG格式之作用(13NG0083 IgG1-YTE；IC50=423pM；對比13NG0083 ngl-2 IgG4-P-YTE；IC50=496pM)，亦不改變生殖系(13NG0083 fgl人類IgG1-YTE；IC50=734pM；對比13NG0083 fgl人類IgG4-P-YTE；IC50=622pM)。符號表示個別實驗重複。IgG4-P：IgG4 S241P。
圖7展示IL-13NG純系、13NG0073(「73」)(KD為4.6pM)、13NG0074(「74」)(KD為4.0pM)及13NG0083(「83」)(KD為6.0pM) 之親和力(KD)及95%信賴區間(C.I.)。
圖8展示TF1增殖分析中R130(圓形)、Q130(正方形)及Q105(三角形)人類IL-13變異體之活體外測試之結果。展示代表性實驗，且資料為重複值之算術平均值±SEM。CPM：計數/分鐘。
圖9展示TF1效能分析中由13NG0083進行之IL-13變異體Q105之抑制。正方形表示同型對照之結果，且圓形表示完全生殖系化(FGL)13NG0083(在Fc區中具有YTE突變之IgG格式)之結果。13NG0083(「IL13NG_FGL IgG1 YTE」)抑制IL-13 Q105變異體。CPM：計數/分鐘。展示代表性實驗，且資料為重複值之算術平均值±SEM。
圖10展示在使用IL-13之變異形式之受體-配位體競爭分析中13NG0083變異體(包括13NG0083人類IgG1+YTE(「hIgG1-YTE」)及13NG0083人類IgG4-P(IgG4 S241P)+YTE(「IgG4-P-YTE」或「hIgG4-P-YTE」)；完全生殖系化(「fgl」)或非生殖系化(「ngl2」))之IC50值：Q105(圖10A)、Q130R(圖10B)及食蟹獼猴IL-13(圖10C)。圖10A及圖10B中包括常見IL-13變異體R130作為標準。
圖11展示13NG0083與人類(圖11A)、食蟹獼猴(圖11B)及小鼠(圖11C)IL-13之功能性物種交叉反應性。正方形表示同型對照之結果，且圓形表示完全生殖系化(FGL)13NG0083(在Fc區中具有YTE突變之IgG格式)之結果。人類及食蟹獼猴IL-13皆由13NG0083抑制。小鼠IL-13支持TF1增殖；然而，除在最高抗體濃度下之小幅降低以外，未觀測到13NG0083之抑制作用。CPM：計數/分鐘。展示代表性實驗，且資料為重複值之算術平均值±SEM。
圖12展示人類及食蟹獼猴FcRn與13NG0083之結合。表格展示13NG0083(在Fc區中具有YTE突變之呈IgG1格式之「IL13NG_83」)或NIP228(同型對照)對人類或食蟹獼猴FcRn之結合親和力(KD/nM)， 如藉由表面電漿子共振(Biacore)所量測。兩種抗體在pH 7.4下對各FcRn物種之結合親和力亦表示為pH 6下之結合親和力之百分比(「pH 7.6/pH 6」)。13NG0083-IgG1-YTE以高親和力(KD分別為153及205)結合人類及獼猴FcRns。
圖13展示在人類全血中培育之13NG0073(正方形；「IL13NG0073」)及13NG0083(圓形；「IL13NG0083」)之穩定性。抗體IL13NG0083及I1130073在人類全血中培育0(圖13A)或24小時(圖13B)且接著在TF1增殖分析中滴定。13NG0073及13NG0083皆在血清中培育24小時之後穩定，如各自有效地抑制TF1細胞增殖。
圖14展示CHO細胞中表現之13NG0083重鏈(Hc)及輕鏈(Lc)之多種組合之相關表現效價。用來自不同抗體之其他輕鏈取代13NG0083輕鏈可改良表現。Mg/L=毫克/公升。
圖15展示與未經修飾之13NG0083輕鏈(「Lc」)或對照抗體(「Hc&Lc3」)相比，CHO細胞中表現之九種13NG0083輕鏈突變體之相關表現效價。與未經修飾之13NG0083相比，兩種突變體M27I及E52G顯示表現之恆定改良。Mg/L=毫克/公升。
圖16展示13NG0083輕鏈結構模型。使用此結構模型之輕鏈序列/結構之評估鑑別CDR2之端部上強親水性及帶負電荷之區域(50-DDED-53(SEQ ID NO：286))。pdb資料庫中可獲得的約1045種抗體結構之綜述(至2013年)證實從未觀測到此序列主結構(4個連續陰性胺基酸(「----」)，而報導pdb資料庫中可獲得的抗體結構中若干其他胺基酸主結構之相關豐度。圖16按出現之次序分別揭示SEQ ID NO：290-297、288、298及299。
圖17展示與未經修飾之13NG0083輕鏈(「Lc」)及對照抗體(「Hc&Lc3」或「對照物Ab 6」)相比，CHO細胞中表現之13NG0083突變體之相關表現效價。當組合M27I+E52G或組合M27I+E52N時，觀 測到與未經修飾之13NG0083相比，表現之顯著改良。所有增壓回復突變體(D51N(DNED(SEQ ID NO：287))；E52N(DDND(SEQ ID NO：288))；及D53N(DDEN(SEQ ID NO：289)))與未經修飾之13NG0083相比展示改良之表現。Mg/L=毫克/公升。
圖18A及18B展示用於評估圖15及17中所描述之13NG0083輕鏈突變體與IL-13之結合的ELISA分析之結果。應注意，突變體(DNED(SEQ ID NO：287))未結合於IL-13。「WT Ph2」表示野生型13NG0083。
圖19A及19B展示與對照抗體(「Hc&Lc3」或「對照物Ab6」)相比，TF1效能分析中由圖15及17中所描述之多種13NG0083輕鏈突變體進行之抑制。突變體DNED(SEQ ID NO：287)不抑制TF-1細胞之增殖。然而，所有測試之突變體，包括突變體DDEN(SEQ ID NO：289)，以與未經修飾之13NG0083(「WT」)類似的效能結合且抑制IL-13誘導之TF-1細胞之增殖。圖19B揭示「DDND」作為SEQ ID NO：288。
圖20展示自每次個別分子動力學模擬獲得之13NG0083(左側)及13NG0083輕鏈50-DDEN-53(SEQ ID NO：289)突變體(右側)之經擴增之輕鏈CDR2結構模型。此等兩個系統之間的比較表明D53N取代可有效地緩解局部電荷壓力，且允許N53之側鏈與其相鄰殘基形成氫鍵以改良CDR2穩定性。圖20揭示「DDED」作為SEQ ID NO：286。
在本發明之多種態樣及實施例中，提供下文所描述之標的物。本文中所描述之任何態樣或實施例可與本文中所描述之實施例之任何其他態樣組合。
定義
除非上下文另外明確規定，否則術語「一」及「該」包括複數 個參考物。舉例而言，「抗原結合蛋白質」理解為表示一或多種抗原結合蛋白質。術語「一(a)」(或「一(an)」)以及術語「一或多個/種」及「至少一個/種」在本文中可互換使用。此外，本文所用之「及/或」應視為兩種指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之特定揭示內容。因此，諸如本文中「A及/或B」之短語中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。類似地，諸如「A、B及/或C」之短語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
術語「包含」通常以包括之含義使用，亦即允許存在一或多種特徵或組分。當態樣在本文中使用措辭「包含」描述時，亦提供以術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」之其他類似態樣。
貫穿說明書及申請專利範圍的與數值結合使用之術語「約」表示熟習此項技術者熟悉及可接受的精確度區間。通常，此類精確度區間為±10%。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999,Academic Press；及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，向此項技術者提供本發明中所用之許多術語的通用辭典。
單位、前綴及符號以其國際單位體系(Système International de Unites(SI))接受之形式表示。數值範圍包括界定該範圍之數字。除非另外指示，否則胺基酸序列以胺基至羧基取向自左向右書寫。本文提供之標題並非本發明之各種態樣或態樣的限制，其可作為整體由說明 書提及。因此，下文緊接著定義之術語參考整個說明書來更完全地定義。
如本文中所使用，術語「抗體」(或其片段、變異體或衍生物)係指抗體之至少能夠結合於抗原之最小部分，例如在由B細胞產生之典型抗體之情形下，至少重鏈(VH)之可變域及輕鏈(VL)之可變域。脊椎動物系統中的基本抗體結構相對充分理解。參見例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)。
抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物包括(但不限於)多株、單株、人類、人類化或嵌合抗體、單鏈抗體、抗原決定基結合片段(例如Fab、Fab'及F(ab')2)、Fd、Fv、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵聯之Fv(sdFv)、包含VL或VH結構域之片段、Fab表現文庫產生之片段。ScFv分子為此項技術中已知的且描述於例如美國專利5,892,019中。本發明涵蓋之免疫球蛋白或抗體分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類別。
術語「抗體分子」描述天然或部分或完全以合成方式產生之免疫球蛋白。術語亦覆蓋任何包含抗體結合結構域之多肽或蛋白質。包含抗原結合域之抗體片段為諸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd及雙功能抗體之分子。
可獲得單株及其他抗體且使用重組型DNA技術之技術以產生其他保留原始抗體之特異性的抗體或嵌合分子。此類技術可涉及將編碼抗體之免疫球蛋白可變區或互補決定區(CDR)之DNA引入不同免疫球蛋白之恆定區，或恆定區加構架區。參見例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，及許多後續文獻。融合瘤或其他製備抗體之細胞可經歷基因突變或其他變化，其可或可不改變所產生之抗體之 結合特異性。
因為可以多種方式修飾抗體，術語「抗體分子」應視為涵蓋任何具有抗體抗原結合域之抗原結合蛋白質或物質，該抗體抗原結合域具有所需特異性。因此，此術語覆蓋抗體片段及衍生物，包括任何包含免疫球蛋白結合結構域之多肽(無論天然或完全或部分合成)。因此包括與另一多肽融合之包含免疫球蛋白結合結構域之嵌合分子或等效物。嵌合抗體之選殖及表現描述於EP-A-0120694及EP-A-0125023以及許多後續文獻中。
抗體工程改造技術領域中可用的其他技術使得可分離人類及人類化抗體。舉例而言，可如Kontermann等人[70]所描述製備人類融合瘤。噬菌體呈現，另一種認可的用於產生抗原結合蛋白質之技術，已詳細地描述於許多公開案中，諸如Kontermann等人[70]及WO92/01047(下文中進一步論述)。轉殖基因小鼠(其中小鼠抗體基因不活化且功能上用人類抗體基因置換，同時保留小鼠免疫系統之完整的其他組分)可用於分離人類抗體與人類抗原[71]。
合成抗體分子可藉由自借助於適合的表現載體內合成及組裝之寡核苷酸產生之基因的表現來產生，例如由Knappik等人J.Mol.Biol.(2000)296,57-86或Krebs等人Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84所描述。
已證實完全抗體之片段可執行結合抗原之功能。結合片段之實例為(i)由VL、VH、CL及CH1結構域組成之Fab片段；(ii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iii)由單一抗體之VL及VH域組成之Fv片段；(iv)dAb片段(Ward,E.S.等人，Nature 341,544-546(1989)，McCafferty等人(1990)Nature,348,552-554)，其由VH域組成；(v)經分離CDR區域；(vi)F(ab')2片段，包含兩個連接之Fab片段之二價片段，(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域及VL域由肽連接子連接，該肽連接子允 許兩個結構域結合以形成抗原結合位點(Bird等人，Science,242,423-426,1988；Huston等人，PNAS USA,85,5879-5883,1988)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)及(ix)「雙功能抗體」，由基因融合構築之多價或多特異性片段(WO94/13804；P.Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,1993)。可藉由併入連接VH及VL域之二硫橋鍵來使Fv、scFv或雙功能抗體分子穩定化(Y.Reiter等人，Nature Biotech,14,1239-1245,1996)。亦可製備包含接合至CH3結構域之scFv的微型抗體(S.Hu等人，Cancer Res.,56,3055-3061,1996)。
當使用雙特異性抗體時，此等抗體可為習知雙特異性抗體，其可以多種方式製造(Holliger,P.及Winter G.Current Opinion Biotechnol.4,446-449(1993))，例如以化學方式製備或自雜交融合瘤製備，或可為上述雙特異性抗體片段中之任一者。雙特異性抗體之實例包括BiTETM技術之雙特異性抗體，其中可使用具有不同特異性之兩個抗體之結合結構域且經由短可撓性肽直接連接。此在短單一多肽鏈上組合兩個抗體。可僅使用可變結構域，在無Fc區之情況下構築雙功能抗體及scFv，潛在地降低抗個體基因型反應之作用。
與雙特異性完全抗體相反，雙特異性雙功能抗體亦可尤其適用，因為其可容易地構築及在大腸桿菌(E.coli)中表現。可使用噬菌體呈現(WO94/13804)自文庫容易地選擇具有適合的結合特異性之雙功能抗體(及許多其他多肽，諸如抗體片段)。若雙功能抗體之一個臂保持恆定，例如具有針對IL-13之特異性，則可製備其中另一個臂變化之文庫且選擇具有適合的特異性之抗體。可藉由結進孔(knobs-into-holes)工程改造來製備雙特異性完全抗體(J.B.B.Ridgeway等人，Protein Eng.,9,616-621,1996)。
術語「特異性」可用於指其中特異性結合對中之一個成員將不展示與除其特異性結合搭配物以外的分子之任何顯著結合的情形。術 語亦可適用於例如抗原結合域對由許多抗原攜帶之特定抗原決定基具有特異性之情形，在此情況下，攜帶抗原結合域之抗原結合蛋白質將能夠結合於多種攜帶抗原決定基之抗原。
「特異性結合」通常意謂包括抗體或抗原結合片段之抗原結合蛋白質、其變異體或衍生物經由其抗原結合域結合於抗原決定基，及結合需要抗原結合域與抗原決定基之間的一些互補性。根據此定義，當抗體經由其抗原結合域結合於抗原決定基比其結合於隨機、不相關抗原決定基更容易時，則抗體稱為「特異性結合」於抗原決定基。
「親和力」為配位體結合反應之內源性結合強度之量測值。舉例而言，經由結合親和力量測抗體(Ab)至抗原(Ag)相互相用之強度之量測值，其可藉由解離常數kd定量。解離常數為結合親和力常數且藉由以下給出：
親和力可例如使用BIAcore®及/或KinExA親和力分析量測。
「效能」為化合物之藥理學活性之量測值，其根據產生既定強度之作用所需的化合物之量來表示。其係指實現既定生物作用所需的化合物量；所需劑量越小，則藥物越強效。結合IL-13之抗原結合蛋白質之效能可例如使用TF1增殖分析測定，如本文中所描述。
若包括抗體或抗原結合片段之抗原結合蛋白質、其變異體或衍生物在一定程度上阻斷參考抗體或抗原結合片段與抗原決定基之結合，則稱其競爭性抑制參考抗體或其抗原結合片段與既定抗原決定基之結合或與參考抗體或抗原結合片段「競爭」。競爭性抑制可藉由此項技術中已知之任何方法測定，例如競爭ELISA分析。結合分子可稱為競爭性抑制參考抗體或抗原結合片段與既定抗原決定基之結合或與參考抗體或其抗原結合片段競爭達至少90%、至少80%、至少70%、 至少60%或至少50%。
當用於抗原結合蛋白質(例如中和抗原結合蛋白質或中和抗體)之情形中時，術語「競爭」意謂抗原結合蛋白質之間的競爭，如藉由其中所測試之抗原結合蛋白質(例如抗體或其免疫功能片段)阻止或抑制參考抗原結合蛋白質(例如配位體或參考抗體)與共同抗原(例如IL-13蛋白質或其片段)之特異性結合的分析所測定。可使用許多類型之競爭性結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見例如Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 92：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Kirkland等人，1986,J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見例如Harlow及Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記之固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，1988,Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Cheung等人，1990,Virology 176：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，此類分析涉及使用與攜帶此等未經標記之測試抗原結合蛋白質及經標記之參考抗原結合蛋白質之任一者的固體表面或細胞結合的經純化之抗原。
藉由測定在測試抗原結合蛋白質存在下結合於固體表面或細胞之標記的量來量測競爭性抑制。通常，測試抗原結合蛋白質過量存在。藉由競爭分析鑑別之抗原結合蛋白質(競爭抗原結合蛋白質)包括與參考抗原結合蛋白質結合於同一個抗原決定基的抗原結合蛋白質，及由於存在位阻而結合於足夠靠近由參考抗原結合蛋白質結合之抗原決定基的相鄰抗原決定基的抗原結合蛋白質。通常，當競爭性抗原結合蛋白質過量存在時，其將抑制參考抗原結合蛋白質與共同抗原之特異性結合達至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。 在一些實例中，抑制結合達至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
可根據抗原之抗原決定基或部分來描述或指定本文中所揭示之抗原結合蛋白質、抗體或其抗原結合片段、變異體或衍生物，例如其識別或特異性結合之目標多肽。舉例而言，IL-13之與本文中所揭示之抗原結合多肽或其片段之抗原結合域特異性相互作用的部分為「抗原決定基」。抗原決定基可由鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸形成，此等胺基酸因蛋白質之三級摺疊而毗鄰。由鄰接胺基酸形成的抗原決定基在暴露於變性溶劑後通常保留，而藉由三級摺疊形成的抗原決定基在變性溶劑處理後通常消失。抗原決定基決定子可包括分子之化學活性表面基團(chemically active surface grouping)，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特異性三維結構特徵及/或荷質比特徵。抗原決定基典型地在獨特空間構形中包括至少3、4、5、6、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35個胺基酸。可使用此項技術中已知的方法測定抗原決定基。
胺基酸在本文中可由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名法委員會(Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之單字母符號來提及。核苷酸同樣由其通常接受之單字母代碼來提及。
如本文所用，術語「多肽」係指一種分子，其由藉由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)組成。術語「多肽」係指兩個或兩個以上胺基酸之任何鏈，且與產物之特定長度無關。如本文所使用，術語「蛋白質」意欲涵蓋包含一或多個多肽之分子，該一或多個多肽在一些情況下可由除醯胺鍵以外的鍵結合。另一方面，蛋白質亦可為單一多肽鏈。在此後一種情況下，單一多肽鏈可在一些情況下包含兩 個或兩個以上多肽子單元，其融合在一起以形成蛋白質。術語「多肽」及「蛋白質」亦指表現後修飾之產物，該等修飾包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團進行之衍生作用、蛋白水解分裂或藉由非天然產生之胺基酸進行之修飾。多肽或蛋白質可來源於天然生物來源或藉由重組技術產生，但未必自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括化學合成。
術語「經分離」係指其中本發明之抗原結合蛋白質或編碼此類結合蛋白質之核酸根據本發明將通常所處之狀態。經分離蛋白質及經分離核酸將不含或實質上不含其天然結合之物質，諸如在其天然環境或其製備(當此類製備係藉由重組型DNA技術活體外或活體內實施時)環境(例如細胞培養物)中與其一起發現之其他多肽或核酸。蛋白質及核酸可與稀釋劑或佐劑一起調配且仍分離用於實際目的，舉例而言，蛋白質將通常與明膠或其他載劑(若使用)混合以塗佈微量滴定盤以用於免疫分析，或當用於診斷或療法中時，將與醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑混合。抗原結合蛋白質可經糖基化(天然或藉由異源真核細胞(例如CHO或NS0(ECACC 85110503)細胞)之系統進行)，或其可(例如若藉由原核細胞中之表現產生)未經糖基化。
「經分離」之多肽、抗原結合蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為多肽、抗原結合蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物，其呈未在自然界中發現之形式。經分離多肽、抗原結合蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物包括經純化達到其不再呈其在自然界中發現之形式之程度的以上各者。在一些態樣中，經分離抗原結合蛋白質、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為實質上純的。
「重組型」多肽、蛋白質或抗體係指經由重組型DNA技術產生之多肽或蛋白質或抗體。出於本發明之目的，以重組方式產生之在宿 主細胞中表現的多肽、蛋白質及抗體視為分離，與已分離、部分分離或部分或實質上藉由任何適合之技術純化之原生或重組型多肽一樣。
本發明亦包括多肽之片段、變異體或衍生物，及其任何組合。當參考本發明之多肽及蛋白質時，術語「片段」包括任何保留參考多肽或蛋白質之至少一些特性的多肽或蛋白質。多肽之片段包括蛋白分解片段，以及缺失片段。
如本文所使用，術語「變異體」係指由於至少一個胺基酸修飾而與親本抗體或多肽序列不同的抗體或多肽序列。本發明之抗體或多肽之變異體包括片段，以及由於胺基酸取代、缺失或插入而具有改變之胺基酸序列的抗體或多肽。變異體可為天然或非天然存在。非天然存在之變異體可使用此項技術中已知的突變誘發技術產生。變異體多肽可包含保守性或非保守性胺基酸取代、缺失或添加。
如用於抗體或多肽之術語「衍生物」係指已改變以便呈現未在原生多肽或蛋白質上發現之其他特徵的抗體或多肽。「衍生」抗體之實例為具有第二多肽或另一分子(例如聚合物(諸如PEG)、發色團或螢光團)或原子(例如放射性同位素)之融合物或結合物。
如本文所使用，術語「聚核苷酸」或「核苷酸」意欲涵蓋單個核酸以及複數個核酸，且係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。在某些態樣中，聚核苷酸包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如在肽核酸(PNA)中所發現)。
術語「核酸」係指聚核苷酸中之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。當用於核酸或聚核苷酸時，術語「經分離」係指核酸分子、DNA或RNA，其已自其原生環境移出，例如出於本發明之目的，載體中所含編碼抗原結合蛋白質之重組型聚核苷酸視為經分離。經分離聚核苷酸之其他實例包括異源宿主細胞中所維持的重組型聚核 苷酸或溶液中經純化(部分或實質上)之其他聚核苷酸。經分離RNA分子包括本發明之聚核苷酸之活體內或活體外RNA轉錄物。本發明之經分離聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此類分子。此外，聚核苷酸或核酸可包括調節元件，諸如啟動子、強化子、核糖體結合位點或轉錄終止信號。
如本文中所使用，術語「宿主細胞」係指具有或能夠具有重組型核酸之細胞或細胞群體。宿主細胞可為原核細胞(例如大腸桿菌)，或宿主細胞可為真核細胞，例如真菌細胞(例如酵母細胞，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerivisiae)、甲醇酵母(Pichia pastoris)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))，及多種動物細胞，諸如昆蟲細胞(例如Sf-9)或哺乳動物細胞(例如HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3、NS0鼠類骨髓瘤細胞、PER.C6®人類細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或融合瘤)。
術語兩個聚核苷酸或多肽序列之間的「序列一致性百分比」或「一致性百分比」係指由比較窗口上之序列共有的一致匹配位置之數目，考慮由於兩個序列之最佳比對而必須引入的添加或缺失(亦即間隙)。匹配位置為在目標及參考序列中呈現一致核苷酸或胺基酸的任何位置。目標序列中呈現之間隙不計數，因為間隙不為核苷酸或胺基酸。類似地，參考序列中呈現之間隙不計數，因為目標序列核苷酸或胺基酸計數，不為來自參考序列之核苷酸或胺基酸。藉由測定兩個序列中存在之一致胺基酸殘基或核酸鹼基的位置數獲得匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100獲得序列一致性百分比來計算百分比。序列之比較及兩個序列之間序列一致性百分比之測定可使用易於獲得之軟體程式實現。適合之軟體程式可自各種來源獲得，且用於比對蛋白質與核苷酸序列。一種測定序列一致性百分比之適合程式為bl2seq，其為可自美國政府國家生物技術資訊中心 (U.S.government's National Center for Biotechnology Information)BLAST網點(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得之BLAST套件之一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP演算法進行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他適合之程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher(生物信息學程式之EMBOSS套件之一部分)且亦可自European Bioinformatics Institute(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa獲得。
「特異性結合成員」描述一對彼此具有結合特異性之分子之成員。特異性結合對之成員可為天然衍生或完全或部分以合成方式產生。分子對之一個成員在其表面上具有特異性結合於該分子對之另一成員之特定空間及極性組織且因此與其互補的區域或凹穴。因此，該配對之成員具有彼此特異性結合之性質。特異性結合對之類型之實例為抗原-抗體、生物素-抗生素蛋白、荷爾蒙-荷爾蒙受體、受體-配位體、酶-受質。本發明係關於抗原-抗體型反應。
如本文中所用之術語「IgG」係指屬於實質上藉由經識別之免疫球蛋白γ基因編碼之抗體類的多肽。在人類中，此類別包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，在小鼠中，此類別包含IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。
術語「抗原結合域」描述抗體分子之一部分，其包含特異性結合於一部分或全部抗原且與其互補之區域。當抗原較大時，抗體可僅結合於抗原之特定部分，該部分稱為抗原決定基。抗原結合域可由一或多個抗體可變域(例如，所謂的由VH域組成的Fd抗體片段)提供。抗原結合域可包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
術語「抗原結合蛋白質片段」或「抗體片段」係指完整抗原結合蛋白質或抗體之一部分且係指完整抗原結合蛋白質或抗體之抗原決定可變區。此項技術中已知抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片 段進行。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「單株抗體」係指涉及單一抗原決定子或抗原決定基之高度特異性識別及結合的均質抗體。此與多株抗體形成對比，多株抗體典型地包括針對不同抗原決定子之不同抗體。術語「單株抗體」涵蓋完整與全長單株抗體以及抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分之融合蛋白質，及包含抗原識別位點之任何其他經修飾之免疫球蛋白分子。此外，「單株抗體」係指以多種方式產生的此類抗體，包括(但不限於)藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現及轉殖基因動物。
術語「人類抗體」係指由人類產生的抗體，或利用技藝中所熟知的任何技術所製造具有與人類產生抗體相應胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義包括完整或全長抗體、其片段，及/或包含至少一種人類重鏈及/或輕鏈多肽的抗體，例如包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。術語「人類化抗體」係指來源於非人類(例如鼠類)免疫球蛋白之抗體，其經工程改造以含有最小非人類(例如鼠類)序列。
術語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列源自於兩種或兩種以上物種的抗體。通常，輕鏈與重鏈之可變區對應於來源於具有所需特異性、親和力及能力之一種哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)之抗體的可變區，而恆定區與來源於另一物種(通常為人類)之抗體中之序列同源以避免在該物種中引發免疫反應。
術語「如在Kabat中之EU索引」係指Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中所描述之人類IgG1 EU抗體之編號系統。本申請案中參考之所有胺基酸位置係指EU索引位置。舉例而言，根據如Kabat中所闡述之EU索引，「L234」及「EU L234」 係指位置234處之胺基酸白胺酸。
如本文所使用，術語「Fc域」、「Fc區」及「IgG Fc域」係指免疫球蛋白(例如IgG分子)之一部分，其與藉由IgG分子之番木瓜蛋白酶消化獲得之可結晶片段相關。Fc區包含IgG分子之兩個重鏈之C端半部，其由二硫鍵連接。其不具有抗原結合活性，但含有碳水化合物部分及用於補體及Fc受體(包括FcRn受體)之結合位點。舉例而言，Fc域含有完全第二恆定域CH2(人類IgG1之EU位置231-340處的殘基)及第三恆定域CH3(人類IgG1之EU位置341-447處的殘基)。
Fc可指分離之此區域或在抗體、抗體片段或Fc融合蛋白質之情形下的此區域。已在Fc域中之許多位置處觀測到多形現象，包括(但不限於)EU位置270、272、312、315、356及358。因此，「野生型IgG Fc域」或「WT IgG Fc域」係指任何天然存在之IgG Fc區(亦即任何對偶基因)。多種Fc突變體、Fc片段、Fc變異體及Fc衍生物描述於例如美國專利第5,624,821號；第5,885,573號；第5,677,425號；第6,165,745號；第6,277,375號；第5,869,046號；第6,121,022號；第5,624,821號；第5,648,260號；第6,528,624號；第6,194,551號；第6,737,056號；第7,122,637號；第7,183,387號；第7,332,581號；第7,335,742號；第7,371,826號；第6,821,505號；第6,180,377號；第7,317,091號；第7,355,008號；美國專利公開案2004/0002587；及PCT公開案第WO 99/058572號、第WO 2011/069164號及第WO 2012/006635號中。
人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之重鏈之序列可見於許多序列資料庫中，例如分別以寄存編號P01857(IGHG1_HUMAN)、P01859(IGHG2_HUMAN)、P01860(IGHG3_HUMAN)及P01861(IGHG1_HUMAN)在Uniprot資料庫中。
術語「YTE」或「YTE突變體」係指IgG1 Fc域中之一組突變， 其引起與人類FcRn之結合增加且改良具有突變之抗體之血清半衰期。YTE突變體包含引入IgG之重鏈中之三個「YTE突變」之組合：M252Y、S254T及T256E，其中編號係根據如Kabat中之EU索引。參見美國專利第7,658,921號，其以引用之方式併入本文中。已證實與相同抗體之野生型版本相比，YTE突變體可增加抗體之血清半衰期。參見例如Dall'Acqua等人，J.Biol.Chem.281：23514-24(2006)及美國專利第7,083,784號，其以全文引用的方式併入本文中。「Y」突變體僅包含M256Y突變；類似地，「YT」突變僅包含M252Y及S254T；且「YE」突變僅包含M252Y及T256E。尤其預期EU位置252及/或256處可存在其他突變。在某些態樣中，EU位置252處之突變可為M252F、M252S、M252W或M252T，及/或EU位置256處之突變可為T256S、T256R、T256Q或T256D。
術語「天然存在之IL-13」通常係指其中可存在IL-13蛋白質或其片段的狀態。天然存在之IL-13意謂在未使用重組型技術預先引入編碼核酸之情況下，由細胞天然產生之IL-13蛋白質。因此，天然存在之IL-13可由例如CD4+ T細胞天然產生及/或自哺乳動物(例如人類、非人類靈長類動物、嚙齒動物，諸如大鼠或小鼠)分離。
術語「重組型IL-13」係指其中可存在IL-13蛋白質或其片段之狀態。重組型IL-13意謂由重組型DNA產生之IL-13蛋白質或其片段，例如在異源宿主中。重組型IL-13可藉由糖基化而與天然存在之IL-13不同。
表現於原核細菌表現系統中之重組型蛋白質未糖基化，而表現於真核系統(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中之重組型蛋白質糖基化。然而，表現於昆蟲細胞中之蛋白質在糖基化方面與表現於哺乳動物細胞中之蛋白質不同。
如本文所使用，術語「半衰期」或「活體內半衰期」係指本發 明之特定類型之抗體、抗原結合蛋白質或多肽在既定動物之循環中之生物半衰期，且由一半投與動物之數量自動物中之循環及/或其他組織清除所需之時間表示。
如本文所使用，術語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物)，包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、嚙齒動物、羊、狗、貓、馬、牛、熊、雞、兩棲動物、爬蟲及其類似物，其為特定治療之受體。如本文所使用，術語「個體」及「患者」係指任何個體，特定言之哺乳動物個體，其需要IL-13介導之疾病或病狀的診斷、預後或療法。如本文所用，諸如「患有IL-13介導之疾病或病狀的患者」之短語包括將受益於投與療法、成像或其他診斷程序，及/或預防性治療IL-13介導之疾病或病狀的個體，諸如哺乳動物個體。
如本文所使用，術語「醫藥組合物」係指呈諸如允許活性成分之生物活性有效之形式的製劑，且其不含有對接受組合物投藥之個體具有不可接受的毒性的其他組分。此類組合物可為無菌的。
如本文中所揭示之多肽(例如包括抗體之抗原結合蛋白質)之「有效量」為足以實現特定陳述之目的的量。「有效量」可憑經驗且以與所述目的相關的常規方式確定。如本文所使用，術語「治療有效量」係指多肽(例如包括抗體之抗原結合蛋白質)或其他可有效地「治療」個體或哺乳動物中之疾病或病狀且對患有IL-13介導之疾病或病狀之個體提供一些改良或益處的量。因此，「治療學有效」量為提供IL-13介導之疾病或病狀之至少一種臨床症狀之一些緩解、緩解及/或降低的量。可藉由本發明之方法及系統治療的與IL-13介導之疾病或病狀相關之臨床症狀為熟習此項技術者所熟知。此外，熟習此項技術者將瞭解療法作用無需為完成或治癒性的，只要向個體提供一些益處即可。在一些態樣中，術語「治療學有效」係指能夠降低有需要患者中之IL-13活性的治療劑之量。所投與的實際量以及投藥速率及時程將 視治療性質及嚴重度而定。治療之處方(例如劑量等之決定)在一般醫師及其他醫療醫生之職責內。抗體及其抗原結合片段之適合的劑量為此項技術中所熟知；參見Ledermann J.A.等人(1991)Int.J.Cancer 47：659-664；Bagshawe K.D.等人(1991)Antibody,Immunoconjugatcs and Radiopharmaceuticals 4：915-922。
如本文中所使用，「足夠的量」或在患有IL-13介導之疾病或病狀之患者中「足以實現特定結果之量」係指可有效地產生所需作用(亦即藉由投與治療有效量)之治療劑(例如本文中所揭示之包括抗體之抗原結合蛋白質)之量，該所需作用為視情況選用之治療作用。在一些態樣中，此類特定結果為有需要患者中之IL-13活性降低。
當在本文中使用時，術語「標記」係指可偵測化合物或組合物，其與多肽(例如包括抗體之抗原結合蛋白質)直接或間接結合以產生「經標記」之多肽或抗體。標記本身可偵測(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記之情況下，可催化受質化合物或組合物發生可偵測的化學變化。
諸如「治療」或「待治療」或「緩解」或「待緩解」或「改善」或「待改善」之術語係指治癒、減緩、減輕所診斷之病理性病狀或病症之症狀及/或停止所診斷之病理性病狀或病症之進程的治療手段。諸如「預防」之術語係指預防及/或減緩木目標病理性病狀或病症之發展的預防性或防治性手段。因此，需要治療之個體包括已患有疾病或病狀之個體。需要預防之個體包括易於罹患疾病或病狀之個體及應預防疾病或病狀之個體。舉例而言，片語「治療患有IL-13介導之疾病或病狀之患者」係指使IL-13介導之疾病或病狀之嚴重度，較佳達到個體不再遭受不適及/或由其改變功能之程度(例如與未經治療之患者相比，哮喘惡化之相關降低)。片語「預防IL-13介導之疾病或病狀」係指降低IL-13介導之疾病或病狀之可能性及/或減少IL-13介導 之疾病或病狀的發生。
術語「載體」意謂構築體，其能夠在宿主細胞中傳遞且在一些態樣中，表現一或多種相關基因或序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體；裸DNA或RNA表現載體；質體、黏質體或噬菌體載體；與陽離子縮合劑結合之DNA或RNA表現載體；囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體；及某些真核細胞，諸如生產細胞。
除非另外指明，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及論述之各種一般及更特定文獻中所描述來進行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，其皆以全文引用的方式併入本文中。
如本文中所使用，術語「IL-13介導之疾病或病狀」係指患有疾病或病狀之個體中任何由IL-13之異常含量引起(單獨或與其他介體結合)、由其加劇、與其相關或由其延長之病理學。IL-13介導之疾病或病狀之非限制性實例包括哮喘、特發性肺部纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、潰瘍性結腸炎(UC)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、慢性鼻竇炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、休格連氏症候群或霍奇金氏淋巴瘤。
術語「哮喘」係指可能與潛在發炎有關或無關之可逆氣流堵塞及/或支氣管高反應性形式存在的疾病。哮喘之實例包括過敏性哮喘、異位性哮喘、未經皮質類固醇治療之哮喘、慢性哮喘、耐皮質類固醇哮喘、皮質類固醇難治性哮喘、抽菸引起之哮喘、皮質類固醇不 能控制之哮喘及例如以全文引用之方式併入本文中的Expert Panel Report 3：Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma,National Asthma Education and Prevention Program(2007)(「NAEPP Guidelines」)中所提及之其他哮喘。
如本文所用之術語「COPD」係指慢性阻塞性肺病。術語「COPD」包括兩種主要病狀：肺氣腫及慢性阻塞性支氣管炎。
術語「特發性肺纖維化」(IPF)係指特徵為肺之進行性結疤或纖維化之疾病。其為肺泡逐漸替換為纖維化組織的特定類型之間質性肺病。關於IPF，進行性結疤使正常薄且柔韌組織變稠及變硬，使肺難以擴張，防止氧氣容易進入血流。參見例如Am.J.Respir.Crit. Care Med.2000.161：646-664。
術語「BAK1183H4抗體」、「BAK1183H4」、「1183H4」、「1183H04」或「BAK1183H4純系」係指WO 2005/007699及美國專利第7,829,090號中所描述之抗IL-13抗體，其各自以引用的方式併入本文中。BAK1183H4抗體包含VH域(SEQ ID NO：2)及VL域(SEQ ID NO：7)，其含有CDR HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3之集合，其中HCDR1包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列。
該CDR之集合在本文中稱為「CDR之BAK1183H4集合」，其中HCDR1具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列，HCDR3具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列，LCDR1具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列，LCDR2具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列，且LCDR3具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列。CDR之BAK1183H4集合內之HCDR1、HCDR2及HCDR3稱為「HCDR之BAK1183H4集 合」且CDR之BAK1183H4集合內之LCDR1、LCDR2及LCDR3稱為「LCDR之BAK1183H4集合」。具有CDR之BAK1183H4集合、HCDR之BAK1183H4集合或LCDR之BAK1183H4集合，或各CDR內之一個或兩個取代的CDR集合稱為具有BAK1183H4譜系。
「實質上如所闡述」意謂相關CDR或VH或VL域將與本文中闡述之序列之指定區域一致或高度類似。「高度類似」涵蓋CDR及/或VH或VL域中可包括1至5個，例如1至4個，諸如1至3個或1個或2個，或3個或4個胺基酸取代。
用於攜帶CDR或CDR集合之結構將通常具有抗體重鏈或輕鏈序列或其實質性部分，其中CDR或CDR集合位於與由重排免疫球蛋白基因編碼之天然存在之VH及VL抗體可變結構域之CDR或CDR集合對應的位置。可參考Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第4版US Department of Health and Human Services.1987及其現可在網際網路上獲得之更新版本(immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎搜索「Kabat」)來測定免疫球蛋白可變結構域之結構及位置，其以引用的方式併入本文中。
CDR亦可由其他骨架攜帶，諸如纖維結合蛋白或細胞色素B[76、77]。
實質上如本文中闡述之CDR胺基酸序列可作為人類可變域或其實質性部分中之CDR攜帶。實質上如本文中闡述之HCDR3序列表示本發明之實施例且此等序列中之每一者可作為人類重鏈可變域或其實質性部分中之HCDR3攜帶。
本發明中使用之可變結構域可自任何生殖系或重排人類可變域獲得，或可為基於已知人類可變結構域之共同序列的合成可變域。可使用重組型DNA技術將CDR序列(例如CDR3)引入不含CDR(例如CDR3)之可變結構域之基因譜中。
舉例而言，Marks等人(Bio/Technology,1992,10：779-783；其以引用之方式併入本文中)提供製備抗體可變結構域之譜系的方法，其中在可變域區域之5'端處或其附近引導之共同引子與針對人類VH基因之第三構架區之共同引子結合使用，以提供不含CDR3之VH可變結構域之基因譜。Marks等人進一步描述此基因譜如何可與特定抗體之CDR3組合。使用類似技術，可用不含CDR3之VH或VL域之譜系改組本發明之CDR3衍生之序列，且經改組之完全VH或VL域與同源VL或VH域組合以提供抗原結合蛋白質。可接著在適合的宿主系統中呈現基因譜，諸如WO92/01047或後續大型文獻中之任一者之噬菌體呈現系統，包括Kay,B.K.,Winter,J.及McCafferty,J.(1996)Phage Display of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual,San Diego：Academic Press，使得可選擇適合的抗原結合蛋白質。基因譜可由來自超過104個個別成員之任何物質組成，例如106至108個或1010個成員。其他適合的宿主系統包括酵母呈現、細菌呈現、T7呈現、核糖體呈現等。關於核糖體呈現之綜述，參見Lowe D及Jermutus L,2004,Curr.Pharm,Biotech,517-27以及WO92/01047，其以引用的方式併入本文中。
類似改組或組合技術亦由Stemmer(Nature,1994,370：389-391，其以引用的方式併入本文中)，其描述與β-內醯胺酶基因相關之技術，但發現該方法可用於產生抗體。
另一種替代方法為使用一或多種所選擇的VH及/或VL基因之隨機突變誘發以在整個可變域內產生突變來產生本發明之新穎的攜帶CDR衍生之序列的VH或VL區域。此類技術由Gram等人(1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 89：3576-3580)描述，其使用易錯PCR。在一些實施例中，在HCDR及/或LCDR之集合內進行一個或兩個胺基酸取代。
另一種可使用之方法為VH或VL基因直接突變誘發至CDR區域。該等技術由Barbas等人，(1994,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 91：3809- 3813)及Schier等人(1996,J.Mol.Biol. 263：551-567)揭示。
熟習此項技術者將能夠使用上述此類技術，使用此項技術中之常規方法提供本發明之抗原結合蛋白質。
IL-13抗原結合蛋白質
如本文所使用，「抗原結合蛋白質」意謂特異性結合指定目標抗原之蛋白質；如本文中提供之抗原為IL-13，尤其人類IL-13，包括原生人類IL-13。抗原結合蛋白質可影響IL-13與其受體相互作用之能力，例如藉由影響與受體之結合。特定言之，此類抗原結合蛋白質完全或部分降低、抑制、干擾或調節IL-13之一或多種生物活性。與在不存在抗原結合蛋白質之情況下的反應相比，此類抑制或中和干擾在抗原結合蛋白質存在下之生物反應，且可使用本領域中已知及本文中所描述之分析測定。舉例而言，本文中提供之IL-13結合蛋白質抑制或降低TF1細胞增殖，如在TF1細胞增殖分析中所量測(如例如實例2中所描述)。生物活性可降低約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
每當其存在時，本文中對「抗體結合蛋白質」之參考包括「其抗原結合片段」。
本發明之例示性經分離抗原結合蛋白質包括抗體(例如單株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體)，或其抗體片段(例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子(scFv))。
本發明提供抗原結合蛋白質或其片段，其競爭結合於IL-13及/或競爭性抑制BAK1183H4抗體，且其以優於BAK1183H4抗體之親和力結合於人類IL-13。在一些實施例中，抗原結合蛋白質為抗體分子，無論完全抗體(例如IgG，諸如IgG1)或抗體片段(例如抗體之抗原結合 部分，包括scFv、Fab或dAbs)、抗體衍生物或抗體類似物。
抗原結合蛋白質可包含結合於抗原之部分及視情況存在之骨架或構架部分，其允許抗原結合部分採用可促進抗原結合蛋白質與抗原之結合的構形。抗原結合蛋白質可包含具有移植之CDR或CDR衍生物的替代性蛋白質骨架或人工骨架。
抗原結合位點可包含抗體VH域及/或VL域、基本上由其組成或由其組成。可借助於在非抗體蛋白質骨架(諸如纖維結合蛋白或細胞色素B等)上排列CDR來提供抗原結合位點[76、77]。用於工程改造蛋白質中之新穎結合位點的骨架已由Nygren等人[77]詳細評述。用於抗體模擬物之蛋白質骨架揭示於WO 00/34784中，其中提供包括III型纖維結合蛋白結構域之蛋白質(抗體模擬物)中，該III型纖維結合蛋白結構域具有至少一個隨機環。移植一或多個CDR(例如HCDR集合)之適合的骨架可由免疫球蛋白基因超家族之任何結構域成員提供。
本發明之一些實施例屬於本文中所謂的「BAK1183H4譜系」。此係參考如下BAK1183H4之一組六個CDR序列定義：HCDR1(SEQ ID NO：3)、HCDR2(SEQ ID NO：4)、HCDR3(SEQ ID NO：5)、LCDR1(SEQ ID NO：8)、LCDR2(SEQ ID NO：9)及LCDR3(SEQ ID NO：10)。已藉由BAK1183H4抗體之輕鏈隨機化產生由本發明提供之BAK1183H4譜系之抗原結合蛋白質。因此，其保留BAK1183H4可變重鏈(VH)結構域序列，但在其可變輕鏈(VL)結構域序列中具有一或多個突變。
在一個態樣中，本發明提供經分離抗原結合蛋白質或其片段，其結合人類IL-13，其中該抗原結合蛋白質包含抗原結合位點，其由可變重鏈(VH)結構域及可變輕鏈(VL)結構域組成，且該抗體抗原結合位點包含一組互補決定區(CDR)，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中VH域包含HCDR1、HCDR2及 HCDR3且VL域包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，且其中：HCDR1包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；LCDR1包含具有下式之胺基酸序列：G G N LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 L V H
其中LX1係選自由L及M組成之群，LX2係選自由以下組成之群：L、I及V，LX3係選自由G及A組成之群，LX4係選自由S及A組成之群，及LX5係選自由R及Y組成之群(SEQ ID NO：251)；LCDR2包含具有下式之胺基酸序列：D D LX6 D R P S
其中LX6係選自由以下組成之群：G、I、E、M及Q(SEQ ID NO：252)；及LCDR3包含具有下式之胺基酸序列：Q V W D T G S L X7 P V V
其中LX7係選自由以下組成之群：D、R、L及S(SEQ ID NO：253)。
在一些實施例中，LX1係選自由以下組成之群：L或M，LX2係選自由以下組成之群：L、I及V，LX3為G，LX4為A，LX5係選自由以下組成之群：R及Y，LX6係選自由以下組成之群：G、I、E、M及Q，及LX7係選自由以下組成之群：D、R、L及S。
在一些實施例中，LX1係選自由以下組成之群：L或M，LX2係選自由以下組成之群：L、I及V，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6係選自由以下組成之群：G、I、E及Q，且LX7係選自由以下組成之群：D、R、L及S。
在一些實施例中，LX1係選自由以下組成之群：L或M，LX2係選自由以下組成之群：I或V，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6係選自由以下組成之群：I、Q及E，且LX7係選自由以下組成之群：R、L及S。
在一些實施例中，(i)LX1為M，LX2為V，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6為E，且LX7為S；(ii)LX1為L，LX2為I，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6為I，且LX7為R；(iii)LX1為L，LX2為I，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6為Q，且LX7為L。
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質具有關於表3中之個別純系展示之一組6個CDR。
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質具有關於表4中之個別純系展示之一組6個CDR。
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質具有關於表5中之個別純系展示之一組6個CDR。
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質具有關於表6中之個別純系展示之一組6個CDR。
在一個實施例中，本發明之抗原結合蛋白質具有展示為SEQ ID NO：13之HCDR1序列、展示為SEQ ID NO：14之HCDR2序列、展示為SEQ ID NO：15之HCDR3序列、展示為SEQ ID NO：18之LCDR1序列、展示為SEQ ID NO：19之LCDR2序列及展示為SEQ ID NO：20之LCDR3序列。
在一個實施例中，本發明之抗原結合蛋白質具有展示為SEQ ID NO：233之HCDR1序列、展示為SEQ ID NO：234之HCDR2序列、展示為SEQ ID NO：235之HCDR3序列、展示為SEQ ID NO：238之LCDR1序列、展示為SEQ ID NO：239之LCDR2序列及展示為SEQ ID NO：240之LCDR3序列(亦即純系13NG0027)。
本發明人發現BAK1183H4譜系可提供具有顯著改良之親和力的針對IL-13之人類抗體抗原結合域(參見圖1及7)。在該譜系內，發現13NG0083、13NG0073及13NG0074純系與BAK1183H4親本抗體相比具有顯著親和力改良(參見例如圖1及7)。CDR的13NG0083、13NG0073、及13NG0074集合闡述於以下表3-6。
本發明亦涵蓋抗原結合蛋白質或多肽，其包含一或多個保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自相同側鏈家族之另一胺基酸置換，則取代視為保守性。在另一態樣中，一串胺基酸可經側鏈家族成員之順序及/或組成不同之結構上類似之一串保守置換。
在抗體構架區或其他蛋白質骨架(例如纖維結合蛋白或細胞色素B)內提供相關CDR集合[76、77]。例示性抗體構架區包括：生殖系構架區，諸如重鏈之抗體構架區之DP14及輕鏈之抗體構架區之λ3-3H，及/或熟習此項技術者熟知的任何適合的構架區。
本發明之經分離抗原結合蛋白質可包含與SEQ ID NO：12、22或 32具有至少90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的重鏈可變區(VH)，及與SEQ ID NO：17、27或37具有至少90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的輕鏈可變區(VL)。
本發明之經分離抗原結合蛋白質可包含選自由以下組成之群的VH域及VL域：(a)包含SEQ ID NO：12之VH域及包含SEQ ID NO：17之VL域(13NG0083)；(b)包含SEQ ID NO：22之VH域及包含SEQ ID NO：27之VL域(13NG0073)；(c)包含SEQ ID NO：32之VH域及包含SEQ ID NO：37之VL域(13NG0074)；(d)包含SEQ ID NO：112之VH域及包含SEQ ID NO：117之VL域(13NG0071)；(e)包含SEQ ID NO：42之VH域及包含SEQ ID NO：47之VL域(13NG0068)；(f)包含SEQ ID NO：52之VH域及包含SEQ ID NO：57之VL域(13NG0067)；(g)包含SEQ ID NO：62之VH域及包含SEQ ID NO：67之VL域(13NG0069)；(h)包含SEQ ID NO：72之VH域及包含SEQ ID NO：77之VL域(13NG0076)；(i)包含SEQ ID NO：82之VH域及包含SEQ ID NO：87之VL域(13NG0070)；(j)包含SEQ ID NO：92之VH域及包含SEQ ID NO：97之VL域(13NG0075)；(k)包含SEQ ID NO：102之VH域及包含SEQ ID NO：107之VL域 (13NG0077)；及(l)包含SEQ ID NO：122之VH域及包含SEQ ID NO：127之VL域(13NG0072)；(m)包含SEQ ID NO：242之VH域及包含SEQ ID NO：247之VL域(13NG0025)；(n)包含SEQ ID NO：222之VH域及包含SEQ ID NO：227之VL域(13NG0078)；(o)包含SEQ ID NO：142之VH域及包含SEQ ID NO：147之VL域(13NG0079)；(p)包含SEQ ID NO：152之VH域及包含SEQ ID NO：157之VL域(13NG0080)；(q)包含SEQ ID NO：131之VH域及包含SEQ ID NO：137之VL域(13NG0081)；(r)包含SEQ ID NO：192之VH域及包含SEQ ID NO：197之VL域(13NG0082)；(s)包含SEQ ID NO：182之VH域及包含SEQ ID NO：187之VL域(13NG0084)；(t)包含SEQ ID NO：212之VH域及包含SEQ ID NO：217之VL域(13NG0085)；(u)包含SEQ ID NO：162之VH域及包含SEQ ID NO：167之VL域(13NG0086)；(v)包含SEQ ID NO：202之VH域及包含SEQ ID NO：207之VL域(13NG0087)；及(w)包含SEQ ID NO：172之VH域及包含SEQ ID NO：177之VL域(13NG0088)。
在一個實施例中，抗原結合蛋白質具有選自以下之純系的VH域 及VL域：13NG0083(VH SEQ ID NO：12、VL SEQ ID NO：17)，13NG0073(VH SEQ ID NO：22、VL SEQ ID NO：27)，及13NG0074(VH SEQ ID NO：32、VL SEQ ID NO：37)。
在另一實施例中，本發明提供IgG1抗體分子，其包含13NG0083VH域(SEQ ID NO：12)及13NG0083VL域(SEQ ID NO：17)。此在本文中稱為「13NG0083 IgG1」。
在一個實施例中，抗原結合蛋白質具有包含SEQ ID NO：232之VH域及包含SEQ ID NO：237之VL域(純系13NG0027)。
本發明亦提供其他IgG1抗體分子，例如其包含抗體VH域內之HCDR之13NG0083集合(SEQ ID NO：13-15)，及/或抗體VL域內之LCDR之13NG0083集合(SEQ ID NO：18-20)。
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質包含一組CDR，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該組CDR係選自由以下組成之群：(a)HCDR1包含展示為SEQ ID NO：13之胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：14之胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：15之胺基酸序列，LCDR1包含展示為SEQ ID NO：18之胺基酸序列，LCDR2包含展示為SEQ ID NO：19之胺基酸序列且LCDR3包含展示為SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HCDR1包含展示為SEQ ID NO：23之胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：24之胺基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：25之胺基酸序列，LCDR1包含展示為SEQ ID NO：28之胺基酸序列，LCDR2包含展示為SEQ ID NO：29之胺基酸序列且LCDR3包含展示為SEQ ID NO：30之胺基酸序列；及(c)HCDR1包含展示為SEQ ID NO：33之胺基酸序列，HCDR2包含 展示為SEQ ID NO：34之胺基酸序列，HCDR3包含展示為SEQ ID NO：35之胺基酸序列，LCDR1包含展示為SEQ ID NO：38之胺基酸序列，LCDR2包含展示為SEQ ID NO：39之胺基酸序列且LCDR3包含展示為SEQ ID NO：40之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質包含選自由以下組成之群的VH域及VL域：(a)包含SEQ ID NO：12之VH域及包含SEQ ID NO：17之VL域(13NG0083)；(b)包含SEQ ID NO：22之VH域及包含SEQ ID NO：27之VL域(13NG0073)；及(c)包含SEQ ID NO：32之VH域及包含SEQ ID NO：37之VL域(13NG0074)。
如所述，本發明提供抗原結合蛋白質或其片段，其結合人類IL-13且其包含13NG0083 VH域(SEQ ID NO：12)及/或13NG0083 VL域(SEQ ID NO：17)。
通常，VH域與VL域配對以提供抗體抗原結合位點，但如下文進一步論述，一個VH域可單獨用於結合抗原。在一個實施例中，13NG0083 VH域(SEQ ID NO：12)與13NG0083 VL域(SEQ ID NO：17)配對，使得形成包含13NG0083 VH及VL域之抗體抗原結合位點。
類似地，可在單獨用作抗原結合蛋白質或與VL域組合之VH域中提供BAK1183H4譜系之HCDR之任何集合。VH域可具有BAK1183H4譜系抗體之HCDR之集合，例如表3中所示，且若此類VH域與VL域配對，則VL域可具有BAK1183H4譜系抗體之LCDR之集合，例如表3中所示。HCDR之集合與LCDR之集合之配對可如表3中所示，提供如表3中所示之包含CDR之集合的抗體抗原結合位點。VH及/或VL域之構架區可為生殖系構架。重鏈結構域之構架區可選自VH-1家族，且 VH-1構架為DP-14構架。輕鏈之構架區可選自λ3家族，且此類構架為λ3 3H。
可自13NG0083 VH或VL域獲得一或多個CDR且併入適合的構架中。此進一步論述於本文中。13NG0083 HCDR 1、2及3分別展示於SEQ ID NO：13-15中。BAK502G9 LCDR1、2及3分別展示於SEQ ID NO：18-20中。
同樣適用於如表3-6中所示之其他BAK1183H4譜系CDR及CDR集合。
在本發明之抗原結合蛋白質或其抗原結合片段中，HCDR1、HCDR2及HCDR3可例如位於包含構架區HFW1、HFW2、HFW3及HFW4之集合的生殖系構架內，其中：HFW1包含具有下式之胺基酸序列：Q FX1 Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T，其中FX1係選自V或A(SEQ ID NO：254)；HFW2包含具有下式之胺基酸序列：W V R Q A P G Q G L E W FX2 G，其中FX2係選自M及V(SEQ ID NO：255)；HFW3包含具有下式之胺基酸序列：R V T M T T D T S T FX3 T A Y M E L R FX4 L R S D D T A V Y Y C A R，其中FX3係選自S及G且FX4係選自S及G(SEQ ID NO：256)；及HFW4包含具有下式之胺基酸序列：W G R G T L V T V S S(SEQ ID NO：257)。
在本發明之抗原結合蛋白質或其片段中，LCDR1、LCDR2及LCDR3可例如位於包含構架區LFW1、LFW2、LFW3及LFW4之集合 的生殖系構架內，其中：LFW1包含具有下式之胺基酸序列：S Y V L T Q P P FX5 V S V A P G K T A R I P C，其中FX5係選自S及L(SEQ ID NO：258)；LFW2包含具有下式之胺基酸序列：W Y Q Q K P G Q A P V L FX6 FX7 FX8，其中FX6係選自I及V，FX7係選自I、M及V，且FX8係選自F、Y及M(SEQ ID NO：259)；LFW3包含具有下式之胺基酸序列：G I P E R F S G S N S G N T A T L T I S R V E FX9 G D E A D Y Y C，其中FX9係選自A或T(SEQ ID NO：260)；及LFW4包含具有下式之胺基酸序列：F G G G T K L T V L(SEQ ID NO：261)。
在一些實施例中，HFW1包含具有下式之胺基酸序列：Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T(SEQ ID NO：262)；HFW2包含具有下式之胺基酸序列：W V R Q A P G Q G L E W M G(SEQ ID NO：263)；HFW3包含具有下式之胺基酸序列：R V T M T T D T S T S T A Y M E L R S L R S D D T A V Y Y C A R(SEQ ID NO：264)；HFW4包含具有下式之胺基酸序列：W G R G T L V T V S S(SEQ ID NO：257)；LFW1包含具有下式之胺基酸序列：S Y V L T Q P P S V S V A P G K T A R I P C(SEQ ID NO：265)； LFW2包含具有下式之胺基酸序列：W Y Q Q K P G Q A P V L I V F(SEQ ID NO：266)，W Y Q Q K P G Q A P V L I I M(SEQ ID NO：267)，W Y Q Q K P G Q A P V L I M F(SEQ ID NO：268)，W Y Q Q K P G Q A P V L V I M(SEQ ID NO：269)，W Y Q Q K P G Q A P V L I V Y(SEQ ID NO：270)，或W Y Q Q K P G Q A P V L V I Y(SEQ ID NO：271)，LFW3包含具有下式之胺基酸序列：G I P E R F S G S N S G N T A T L T I S R V E A G D E A D Y Y C(SEQ ID NO：272)；及LFW4包含具有下式之胺基酸序列：F G G G T K L T V L(SEQ ID NO：261)。
在一些實施例中，LFW2包含具有下式之胺基酸序列：W Y Q Q K P G Q A P V L I V F(SEQ ID NO：266；純系13NG0083)，W Y Q Q K P G Q A P V L I I M(SEQ ID NO：267；純系13NG0073)，或W Y Q Q K P G Q A P V L I M F(SEQ ID NO：268；純系13NG0074)。
本發明之VH及VL域及CDR之變異體(包括用於本文中闡述之胺基酸序列及IL-13之抗原結合蛋白質中可使用之VH及VL域及CDR之變異體)可借助於序列變化或突變及篩選之方法獲得。
可如本文中所論述使用序列在本文中特定揭示之VH及VL域中之任一者之可變域胺基酸序列變異體。特定變異體可包括一或多個胺基酸序列變化(胺基酸殘基之添加、缺失、取代及/或插入)，可小於約20個變化、小於約15個變化、小於約10個變化或小於約5個變化、4個、 3個、2個或1個。變化可在一或多個構架區及/或一或多個CDR中進行。
為了獲得一或多種能夠結合抗原之抗原結合蛋白質，可使抗原結合蛋白質之文庫與該抗原接觸，且選擇該文庫中之能夠結合該抗原之一或多種抗原結合蛋白質。
可在噬菌體粒子之表面上呈現文庫，各粒子含有在其表面上呈現之編碼抗體VH可變域之核酸，且視情況亦含有所呈現之VL域(若存在)。
在選擇能夠結合抗原之抗原結合蛋白質且在噬菌體粒子上呈現之後，可自呈現該所選擇之抗原結合蛋白質的噬菌體粒子獲得核酸。此類核酸隨後可用於藉由自核酸表現來製備抗原結合蛋白質或抗體VH可變域(視情況存在抗體VL可變域)，其中該核酸具有自呈現該所選擇之抗原結合蛋白質之噬菌體粒子獲得之核酸序列。
具有該所選擇之抗原結合蛋白質之抗體VH可變域之胺基酸序列的抗體VH可變域可以經分離之形式提供，如可包含此類VH域之抗原結合蛋白質。
可進一步測試結合IL-13之能力，以及與BAK1183H4(例如呈scFv格式及/或IgG格式，例如IgG1或IgG4)競爭結合於IL-13或競爭性抑制BAK1183H4(例如呈scFv格式及/或IgG格式，例如IgG1或IgG4)與IL-13之結合的能力。可測試中和IL-13之能力，如下文進一步論述。
本文中提供之經分離抗原結合可具有選自由以下組成之群的一或多種特性：(a)與BAK1183H4抗體競爭結合於IL-13，其中BAK1183H4抗體包含有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VL域；(b)以優於BAK1183H4抗體之親和力結合人類IL-13，其中 BAK1183H4抗體包含有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VL域；及(c)以小於約80pM、小於約50pM、小於約20pM或小於約10pM之KD值結合人類IL-13。
本發明之抗原結合蛋白質以BAK1183H4抗體之親和力結合於人類IL-13，抗原結合蛋白質之親和力及BAK1183H4抗體係在相同條件下測定。在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以小於50pM、小於40pM、小於30pM、小於20pM或小於10pM之KD值結合於人類IL-3。
本發明之抗原結合蛋白質可以優於BAK1183H4抗體分子(例如scFv、IgG1或IgG4)之效能中和人類IL-13。
本發明之一個實施例包含以等於或優於IL-13抗原結合位點之效能中和天然存在之IL-13的抗體，該抗體由BAK1183H4 VH域(SEQ ID NO：2)及BAK1183H4 VL域(SEQ ID NO：7)形成。
可在適合的條件下比較不同抗原結合蛋白質之結合親和力及中和效能。較佳地，在相同條件下量測各抗原結合蛋白質(例如抗體)之結合親和力及中和效能中之每一者。
當本發明之抗原結合蛋白質為抗體或其抗原結合片段，其可進一步包含選自由以下組成之群的重鏈免疫球蛋白恆定域：
(a)IgA恆定域
(b)IgD恆定域；
(c)IgE恆定域；
(d)IgG1恆定域；
(e)IgG2恆定域；
(f)IgG3恆定域；
(g)IgG4恆定域；及
(h)IgM恆定域。
本發明之抗原結合蛋白質可進一步包含選自由以下組成之群的輕鏈免疫球蛋白恆定域：(a)Ig κ恆定域；及(b)Ig λ恆定域。
本發明之抗原結合蛋白質可進一步包含人類IgG1恆定域及人類λ恆定域。
本發明之抗原結合蛋白質可包含含有位置252、254及256處之突變的IgG Fc域，其中位置編號係根據如Kabat中之EU索引。舉例而言，IgG1 Fc域可含有M252Y、S254T及T256E之突變，其中位置編號係根據如Kabat中之EU索引。
本發明之抗原結合蛋白質可結合其中位置130之精胺酸由麩醯胺酸置換的人類IL-13變異體，或其中位置105之精胺酸由麩醯胺酸置換的人類IL-13變異體。因此，本發明之抗原結合蛋白質，例如抗體可識別與哮喘有關之人類IL-13變異體Q130R，及/或人類IL-13變異體Q105R。與變異體IL-13之交叉反應性使本發明之抗體及其抗原結合片段及包含本發明之抗體及其抗原結合片段的組合物可用於治療具有野生型及變異型IL-13的患者。
本發明之抗原結合蛋白質可結合非人類靈長類動物IL-13，包括恆河猴(rhesus)及食蟹獼猴(cynomolgus)IL-13。測定抗體或其抗原結合片段在非人類靈長類動物中之功效及安全性概況極其有價值，因為其提供預測抗體或片段在人類中之安全性、藥物動力學及藥效學概況的手段。
本發明之抗原結合蛋白質或其片段可使包含位置106之抗原決定基與人類IL-13蛋白質之位置132處的C端天冬醯胺(DTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN；SEQ ID NO：273)結合。在 一個實施例中，抗原結合蛋白質或其片段使包含位置99處之苯丙胺酸的抗原決定基與人類IL-13蛋白質之位置132處的C端天冬醯胺(FSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN；SEQ ID NO：274)結合。
本發明亦係關於本發明之抗原結合蛋白質之經分離VH域及/或本發明之抗原結合蛋白質之經分離VL域。
除抗體序列以外，本發明之抗原結合蛋白質可包含其他胺基酸，例如形成肽或多肽，諸如摺疊結構域，或賦予分子除結合抗原之能力以外的另一種功能性特徵。本發明之抗原結合蛋白質可具有可偵測標記，或可與毒素或靶向部分或酶結合(例如經由肽鍵或連接子)。
本發明之另一態樣提供用於獲得對人類IL-13抗原具有特異性之抗體或抗原結合域的方法，該方法包含借助於本文中闡述之VH域之胺基酸序列中之一或多個胺基酸之添加、缺失、取代或插入來提供VH域，其為VH域之胺基酸序列變異體，視情況與VH域組合，因此具有一或多個VL域，且測試VH域或VH/VL組合以鑑別對IL-13抗原具有特異性且視情況具有中和IL-13活性之能力的抗原結合蛋白質或抗體抗原結合域。該VL域可具有實質上如本文中闡述之胺基酸序列。
可使用類似方法，其中本文中所揭示之VL域之一或多種序列變異體與一或多種VH域組合。
在一個實施例中，BAK1183H4 VH域(SEQ ID NO：2)及/或BAK1183H4 VL域(SEQ ID NO：7)可經歷突變以提供一或多種VH域及/或VL域胺基酸序列變異體。
本發明之另一態樣提供製備對IL-13抗原具有特異性之抗原結合蛋白質的方法，該方法包含：(a)提供編碼本文中所揭示之VL域的核酸之起始基因譜，其包括待置換之CDR3或不具有CDR3編碼區域； (b)組合該基因譜與實質上如本文中關於VL CDR3闡述之編碼胺基酸序列之供體核酸，使得該供體核酸插入基因譜中之CDR3區域中，以便提供編碼VH域之核酸的產物基因譜；(c)表現該產物基因譜之核酸；(d)選擇對IL-13具有特異性且與BAK1183H4抗體競爭結合於IL-13之抗原結合蛋白質；(e)選擇針對IL-13之抗原結合蛋白質，其以優於BAK1183H4抗體之親和力結合於人類IL-13，抗原結合蛋白質及BAK1183H4抗體之親和力係在相同條件下測定；及(e)回收該抗原結合蛋白質或編碼其之核酸。
又，可使用類似方法，其中本發明之VH CDR3與編碼VH域(其包括待置換之CDR3或不具有CDR3編碼區域)之核酸之基因譜組合。
類似地，可將一或多個或全部三個CDR移植至VH或VL域之基因譜中，接著關於對IL-13具有特異性之抗原結合蛋白質或抗原結合蛋白質、與BAK1183H4抗體競爭結合於IL-13及以優於BAK1183H4抗體之親和力結合於人類IL-13對其進行篩選，抗原結合蛋白質及BAK1183H4抗體之親和力係在相同條件下測定。
在一個實施例中，可使用13NG0083 HCDR1(SEQ ID NO：13)、HCDR2(SEQ ID NO：14)及HCDR3(SEQ ID NO：15)或HCDR之13NG0083集合中之一或多者，及/或13NG0083 LCDR1(SEQ ID NO：18)、LCDR2(SEQ ID NO：19)及LCDR3(SEQ ID NO：20)或LCDR之13NG0083集合中之一或多者。
免疫球蛋白可變域之實質性部分將包含至少三個CDR區域以及其介入構架區。該部分亦可包括至少約50%的第一及第四構架區中之任一者或其兩者，50%為第一構架區之C端50%及第四構架區之N端50%。可變域之實質性部分之N端或C端處的其他殘基可為通常不與 天然存在之可變域區域相關的殘基。舉例而言，藉由重組型DNA技術製得之本發明之抗原結合蛋白質之建構可引起所引入之由連接子編碼之N或C端殘基的引入以促進選殖或其他操作步驟。其他操作步驟包括引入連接子以使本發明之可變結構域與其他包括免疫球蛋白重鏈、其他可變結構域(例如在雙功能抗體之製備中)或蛋白質標記物的其他蛋白質序列接合，如本文中其他地方更詳細論述。
儘管在本發明之一個態樣中，設想包含VH及VL域之配對的抗原結合蛋白質，但基於VH或VL域序列之單一結合結構域形成本發明之其他態樣。已知單一免疫球蛋白結構域，尤其VH域能夠以特異性方式結合目標抗原。
在任一單一特異性結合結構域之情況下，此等結構域可用於篩檢能夠形成能夠結合IL-13之兩結構域型抗原結合蛋白質的互補結構域。
此可使用如WO92/01047中所揭示之所謂的分級雙重組合方法藉由噬菌體呈現篩選方法獲得，其中使用含有H或L鏈純系之個別群落感染編碼另一個鏈(L或H)之純系的完全文庫，且根據諸如參考文獻中所描述之噬菌體呈現技術選擇所得雙鏈抗原結合蛋白質。此技術亦揭示於Marks等人，同上中。
本發明之抗原結合蛋白質可進一步包含抗體恆定區或其部分。舉例而言，VL域可在其C端連接至包括人類Cκ或Cλ鏈之抗體輕鏈恆定域。類似地，基於VH域之抗原結合蛋白質可在其C端連接至來源於任何抗體同型(例如IgG、IgA、IgE及IgM以及同型子類中之任一者，特定言之IgG1及IgG4)之免疫球蛋白重鏈之全部或一部分(例如CH1結構域)。舉例而言，免疫球蛋白重鏈可來源於抗體同型子類IgG1。亦預期任何具有此等特性且使可變區穩定的合成或其他恆定區變異體用於本發明之實施例中。抗體恆定區可為具有YTE突變之Fc區，使得Fc 區包含以下胺基酸取代：M252Y/S254T/T256E。此殘基編號係基於Kabat編號。Fc區中之YTE突變增加抗原結合蛋白質之血清持久性(參見Dall'Acqua,W.F.等人(2006)The Journal of Biological Chemistry,281,23514-23524)。
本發明之抗原結合蛋白質可用可偵測或功能性標記來標記。可偵測標記物包括放射性同位素標記，諸如131I或99Tc，其可使用抗體成像技術中已知的習知化學方法連接至本發明之抗體。標記物亦包括酶標記物，諸如辣根過氧化酶。標記物進一步包括化學部分，諸如生物素，其可經由結合於特異性同源可偵測部分(例如經標記之抗生素蛋白)來偵測。
如所述，在各種態樣及實施例中，本發明擴展至抗原結合蛋白質或其抗原結合片段，其與本文所定義之任何抗原結合蛋白質(例如BAK1183H4)競爭結合於IL-13。可活體外簡單地分析結合蛋白質之間的競爭，例如藉由標記針對一種結合蛋白質(其可在其他未標記之結合蛋白質存在下偵測)之特異性報導子分子，以使得能夠鑑別結合相同抗原決定基或重疊抗原決定基之抗原結合蛋白質。
可例如使用ELISA測定競爭，其中IL-13固定至盤，且將第一經標記之結合成員以及一或多種其他未標記之結合成員添加至盤。藉由由經標記之結合成員發出之信號降低來觀測與經標記之結合成員競爭之未標記之結合成員之存在。
在競爭測試中，可使用抗原之肽片段，尤其包括相關抗原決定基之肽。可使用具有抗原決定基序列加任一端處之一或多個胺基酸的肽。此類肽可稱為「基本上由指定序列組成」。本發明之抗原結合蛋白質可使得其與抗原之結合由具有或包括既定序列之肽抑制。在與此有關之測試中，可使用任一序列加一或多種胺基酸之肽。
可例如藉由用肽淘選自噬菌體呈現文庫分離結合特異性肽之抗 原結合蛋白質。
本發明之抗原結合蛋白質能夠結合人類IL-13蛋白質之位置106處之天冬胺酸至位置132處之C端天冬醯胺(DTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN；SEQ ID NO：273)之人類IL-13序列內的抗原決定基。本發明之抗原結合蛋白質能夠結合具有人類IL-13蛋白質之位置99處之苯丙胺酸至位置132處之C端天冬醯胺(FSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN；SEQ ID NO：274)之人類IL-13序列的抗原決定基。
本發明提供一種方法，其包含引起或允許如本文中提供之抗原結合蛋白質與IL-13結合。如所述，此類結合可活體內進行，例如在投與抗原結合蛋白質或編碼抗原結合蛋白質之核酸後，或其可活體外進行，例如在ELISA、西方墨點法、免疫細胞化學、免疫沈澱、親和層析或基於細胞之分析(諸如TF-1分析)中。
可測定抗原結合蛋白質與IL-13之結合量。可關於診斷相關之測試樣品中抗原之量進行定量。
治療方法
本發明之抗原結合蛋白質經設計以用於人類或動物個體中之診斷或治療方法中。
因此，本發明之其他態樣提供治療方法，其包含投與如所提供之抗原結合蛋白質，包含此類抗原結合蛋白質之組合物(例如醫藥組合物)，及此類抗原結合蛋白質在製造用於投藥之藥劑中的用途，例如用於製造藥劑或醫藥組合物之方法中，該方法包含將抗原結合蛋白質與醫藥學上可接受之賦形劑一起調配。
本發明之其他態樣提供本發明之抗原結合蛋白質，其用於治療有需要之個體之方法中，其中該方法包含投與該個體該抗原結合蛋白質。
抗IL-13抗體可用於提供治療效益之臨床適應症包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺部纖維化(IPF)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、休格連氏症候群及霍奇金氏淋巴瘤。如已說明，抗IL-13治療對所有此等疾病有效。
本發明之抗原結合蛋白質可用於治療或診斷人類或動物身體之方法中，諸如治療(其可包括預防性治療)人類患者中之疾病或病狀之方法，其包含投與該患者有效量之本發明之抗原結合蛋白質。可根據本發明處理之疾病或病狀包括其中IL-13起作用之任何疾病或病狀，尤其為哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺部纖維化(IPF)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、休格連氏症候群及霍奇金氏淋巴瘤。此外，本發明之抗體或其抗原結合片段亦可用於治療腫瘤及病毒感染，因為此等抗體及片段將抑制IL-13介導之免疫抑制[64、65]。
抗IL-13治療可經口、藉由注射(例如皮下、靜脈內、腹膜內或肌肉內)、藉由吸入或局部(例如眼內、鼻內、經直腸、進入傷口、皮膚上)投與。投藥途徑可藉由治療之物理化學特徵、特定疾病考慮因素或最佳化功效或最小化副作用之需求來測定。
預期抗IL-13治療將不限於臨床用途。因此，亦預期使用無針裝置之皮下注射。
可使用組合治療以提供顯著協同作用，尤其抗IL-13抗原結合蛋白質與一或多種其他藥物之組合。本發明之抗原結合蛋白質可以與以下之組合或加合物形式提供：短效或長效β促效劑、皮質類固醇、色甘酸鹽、白三烯(受體)拮抗劑、甲基黃嘌呤及其衍生物、IL-4抑制劑、蕈毒鹼受體拮抗劑、IgE抑制劑、組胺抑制劑、IL-5抑制劑、嗜 酸性粒細胞趨化因子/CCR3抑制劑、PDE4抑制劑、TGF-β拮抗劑、干擾素γ、吡非尼酮(perfenidone)、化學治療劑及免疫治療劑。
與一或多種短效或長效β促效劑、皮質類固醇、色甘酸鹽、白三烯(受體)拮抗劑、黃嘌呤、IgE抑制劑、IL-4抑制劑、IL-5抑制劑、嗜酸性粒細胞趨化因子/CCR3抑制劑、PDE4抑制劑之組合治療可用於治療哮喘。本發明之抗體及抗原結合片段亦可與皮質類固醇、抗代謝劑、TGF-β及其下游信號傳導路徑之拮抗劑組合用於治療纖維化。此等抗體與PDE4抑制劑、黃嘌呤及其衍生物、蕈毒鹼受體拮抗劑、短效及長效β拮抗劑之組合療法可適用於治療慢性阻塞性肺病。類似組合考慮因素適用於抗IL-13治療異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺部纖維化(IPF)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、休格連氏症候群及霍奇金氏淋巴瘤之用途。
根據本發明，治療、預防及/或改善患者中與IL-13相關之疾病或病狀的方法可包含投與如本文中提供之抗IL-13抗體或抗原結合片段(例如表3-6或圖1-4、15或17中所描述之抗IL-13抗體或抗原結合片段)及投與抗IL-5R抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗IL-5R抗體或其抗原結合片段為美國專利申請案第2010/0291073 A1號及/或美國專利第6,018,032號中所描述之抗IL-5R抗體或其抗原結合片段，其中每一者以全文引用之方式併入本文中。在其他實施例中，抗IL-5R抗體或其抗原結合片段為苯納珠單抗(benralizumab)或其抗原結合片段。關於用於本文所提供之方法中之苯納珠單抗(或其片段)之資訊可見於美國專利申請公開案第2010/0291073號，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。在其他實施例中，抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：280-282之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及SEQ ID NO：283-285之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。在其他實施例中，抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之序列的VH域或包含SEQ ID NO：276之序列的VL域。在其他實施例中，抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之序列的VH域及包含SEQ ID NO：276之序列的VL域。在一些實施例中，抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：279之序列的重鏈、包含SEQ ID NO：277之序列的輕鏈，或包含SEQ ID NO：279之序列的重鏈及包含SEQ ID NO：277之序列的輕鏈。
根據本發明，治療、預防及/或改善患者中與IL-13相關之疾病或病狀的方法包含投與抗IL-13抗體或其抗原結合片段及投與抗IL-5R抗體或其抗原結合片段，其中(i)抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：13-15之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：18-20之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域，及(ii)抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：280-282之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：283-285之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域。在一些實施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：12之序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：17之序列的可變輕鏈結構域；及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：280-282之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：283-285之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域。在其他實施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：13-15之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：18-20之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域，及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之序列的重鏈及包含SEQ ID NO：276之序列的輕鏈。在其他實 施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：12之序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：17之序列的可變輕鏈結構域，及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之序列的重鏈及包含SEQ ID NO：276之序列的輕鏈。
根據本發明，治療、預防及/或改善患者中與IL-13相關之疾病或病狀的方法可包含投與抗IL-13抗體或其抗原結合片段及投與抗IL-5R抗體或其抗原結合片段，其中(i)抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：23-25之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：28-30之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域，及(ii)抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：280-282之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：283-285之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域。在一些實施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：22之序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：27之序列的可變輕鏈結構域；及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：280-282之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：283-285之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域。在其他實施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：23-25之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：28-30之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域，及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之序列的重鏈及包含SEQ ID NO：276之序列的輕鏈。在其他實施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：22之序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：27之序列的可變輕鏈結構域，及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之序列的重鏈及包含SEQ ID NO：276之序列的輕鏈。
根據本發明，治療、預防及/或改善患者中與IL-13相關之疾病或病狀的方法可包含投與抗IL-13抗體或其抗原結合片段及投與抗IL-5R抗體或其抗原結合片段，其中(i)抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：33-35之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：38-40之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域，及(ii)抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：280-282之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：283-285之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域。在一些實施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：32之序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：37之序列的可變輕鏈結構域；及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：280-282之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：283-285之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域。在其他實施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：33-35之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：38-40之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列的可變輕鏈結構域，及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之序列的重鏈及包含SEQ ID NO：276之序列的輕鏈。在其他實施例中，抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：32之序列的可變重鏈結構域及包含SEQ ID NO：37之序列的可變輕鏈結構域，及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之序列的重鏈及包含SEQ ID NO：276之序列的輕鏈。
根據本發明，治療、預防及/或改善患者中與IL-13相關之疾病或病狀的方法包含投與本文中提供之抗IL-13抗體或其抗原結合片段(例如表3-6或圖1-4、15或17中所描述之抗IL-13抗體或抗原結合片段)及投與本文中提供之抗IL-5R抗體或其抗原結合片段，其中抗IL-13抗體 或其抗原結合片段及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段係同時(例如作為相同組合物之一部分或單獨的組合物)或依序投與。
根據本發明，所提供之組合物可投與個體。如上文所定義，投藥係以「治療有效量」進行。
精確劑量將使許多因素而定，包括抗體或其抗原結合片段是否用於診斷或用於治療、所治療之區域之尺寸及位置、抗體之確切性質(例如完全抗體、片段或雙功能抗體)及連接至抗體之任何可偵測標記或其他分子之性質。典型劑量將在100μg至1gm(全身施用)及1μg至1mg(局部施用)範圍內。典型地，抗體將為完全抗體，例如IgG4同型之完全抗體。此為用於成年人患者之單次治療之劑量，其可按比例調節以用於兒童及嬰兒，且亦可針對其他抗體格式與分子量成比例地調節。由醫師酌情處理，治療可以每天、每週兩次、每週一次或每月一次間隔重複。在本發明之一些實施例中，治療為週期性，且各投藥之間的週期為約兩週或兩週以上、約三週或三週以上、約四週或四週以上，或約一月一次。
本發明之抗原結合蛋白質將通常以醫藥組合物形式投與，其可包含至少一種除抗原結合蛋白質以外的組分。
因此，本發明之醫藥組合物及關於根據本發明之用途，除活性成分以外可包含醫藥學上可接受之賦形劑、媒劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者熟知的其他材料。此類材料應為無毒的且不應干擾活性成分之功效。載劑或其他材料之確切性質將視投藥途徑(其可經口或藉由注射(例如靜脈內)進行)而定。
因此，本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之賦形劑。
用於口服投藥之醫藥組合物可呈錠劑、膠囊、散劑或液體形式。錠劑可包含固體載劑，諸如明膠或佐劑。液體醫藥組合物通常包 含液體載劑，諸如水、石油、動物油或植物油、礦物油或合成油。可包括生理食鹽水溶液，右旋糖或其他醣溶液或二醇(諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。
對於靜脈內注射或在病痛位點注射，活性成分將呈非經腸可接受水溶液形式，其為無熱原質且具有適合的pH值、等滲性及穩定性。具有此項技術之相關技能者能夠很好地使用例如等滲媒劑(諸如氯化鈉注射劑、林格氏注射劑(Ringer's Injection)、乳酸化林格氏注射劑)來製備適合之溶液。視需要可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。
組合物可單獨或與其他治療同時或視所治療之病狀依序組合投與。舉例而言，包含本文中提供之抗IL-13抗體或抗原結合片段(例如表3-6或圖1-4、15或17中所描述之抗IL-13抗體或抗原結合片段)之組合物可單獨或與抗IL-5R抗體或抗原結合片段(例如苯納珠單抗或其抗原結合片段)同時(並行)或依序組合投與。
視分子之物理化學特性及遞送途徑而定，本發明之抗原結合蛋白質可以液體或固體形成調配。調配物可包括賦形劑，或賦形劑之組合，例如：糖、胺基酸及界面活性劑。液體調配物可包括多種抗體濃度及pH值。固體調配物可例如藉由凍乾、噴霧乾燥、或藉由超臨界流體技術進行之乾燥來產生。抗IL-13之調配物將視所欲遞送途徑而定：舉例而言，用於肺部遞送之調配物可由具有確保在吸入時滲透至肺部深處之物理特性的粒子組成；局部調配物可包括黏度調節劑，其延長藥物駐留在作用位點處的時間。
本發明之醫藥組合物可進一步包含標記基團或效應子基團。舉例而言，標記基團可選自由以下組成之群：同位素標記、磁性標記、氧化還原活性部分、光學染料、生物素化基團及由第二報導子(諸如GFP或生物素)識別之多肽抗原決定基。效應子基團可例如選自由以 下組成之群：放射性同位素、放射性核種、毒素、治療劑及化學治療劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含本文中提供之抗IL-13抗體或其抗原結合片段(例如表3-6或圖1-4、15或17中所描述之抗IL-13抗體或抗原結合片段)及本文中提供之抗IL-5R抗體或其抗原結合片段(例如苯納珠單抗或其抗原結合片段或美國專利申請公開案第2010/0291073號中所描述之抗IL-5R抗體或其片段，其以全文引用的方式併入本文中)。
在本發明之一些態樣中，個體為未經治療之個體。未經治療之個體為未投與例如治療劑之療法的個體。在一些態樣中，未經治療之個體在診斷為患有IL-13介導之疾病或病狀(例如哮喘、IFP、COPD、異位性皮膚炎或UC)之前未用治療劑治療。在另一態樣中，個體在診斷為患有IL-13介導之疾病或病狀之前接受療法及/或一或多種劑量之治療劑(例如能夠調節與IL-13介導之疾病或病狀、肺疾病或病狀、慢性發炎性皮膚病狀或發炎性腸疾病或病狀相關之發炎反應的治療劑)。在一個態樣中，治療劑為小分子藥物。在一個特定態樣中，藥劑為皮質類固醇。在另一態樣中，藥劑可為白三烯改質劑，諸如孟魯司特(montelukast)、紮魯司特(zafirlukast)或齊留通(zileuton)。在另一態樣中，治療劑可為甲基黃嘌呤(例如茶鹼)或色烯(例如色甘酸鈉及奈多羅米(nedocromil))。在另一態樣中，治療劑可為長效β-2促效劑，諸如沙美特羅(salmeterol)、福莫特羅(fomoterol)或茚達特羅(indacaterol)。在另一態樣中，藥劑可為甲胺喋呤或環孢靈。
在某些態樣中，治療劑可為用於預防、治療、管理或改善哮喘之試劑。用於哮喘之療法的非限制性實例包括抗膽鹼激導性劑(例如異丙托溴銨(ipratropium bromide)及氧托溴銨(oxitropium bromide))、β-2拮抗劑(例如沙丁胺醇(PROVENTIL®或VENTOLIN®)、比托特羅 (bitolterol)(TOMALATE®)、非諾特羅(fenoterol)、福莫特羅、異他林(isoetharine)、間羥異丙腎上腺素(metaproterenol)、吡布特羅(pibuterol)(MAXAIR®)、羥甲異丁腎上腺素(salbutamol)、羥甲異丁腎上腺素特布他林(salbutamol terbutaline)及沙美特羅(salmeterol)、特布他林(BRETHAIRE®))、皮質類固醇(例如潑尼松、倍氯米松二丙酸酯(VANCERIL®或BECLOVENT®)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)(AZMACORF®)、氟尼縮松(flunisolide)(AEROBID®)及丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)(FLOVENT®))、白三烯拮抗劑(例如孟魯司特、紮魯司特及齊留通)、茶鹼(THEO-DUR®、UNIDUR®錠劑及SLO-BID® Gyrocaps)及沙美特羅(SEREVENT®)、色甘酸及內多克米(nedorchromil)(INTAL®及TILADE®))、IgE拮抗劑、IL-4拮抗劑(包括抗體)、IL-5拮抗劑(包括抗體)、PDE4抑制劑、NF-κ-B抑制劑、IL-13拮抗劑(包括抗體)、CpG、CD23拮抗劑、選擇素拮抗劑(例如TBC 1269)、肥大細胞蛋白酶抑制劑(例如類胰蛋白酶激酶抑制劑(例如GW-45、GW-58及染料木黃酮)、磷脂醯肌醇-3'(PI3)-激酶抑制劑(例如鈣磷酸蛋白C)及其他激酶抑制劑(例如星形孢菌素(staurosporine))、C2a受體拮抗劑(包括抗體)及支持性呼吸道療法，諸如補充及機械換氣。
在一些態樣中，個體接受至少一種治療有效劑量之經口或吸入皮質類固醇。在一些態樣中，個體接受多種治療學上有效劑量之經口或吸入皮質類固醇。在一些態樣中，個體為慢性經口皮質類固醇(OCS)使用者。
在某些態樣中，個體已接受長效β2腎上腺素促效劑，例如羥萘甲酸沙美特羅。在一些態樣中，個體已接受合成糖皮質激素，例如丙酸氟替卡松。在某些態樣中，個體已接受羥萘甲酸沙美特羅與丙酸氟替卡松(ADVAIR®)之組合。在某些態樣中，個體已接受β2-腎上腺素支氣管擴張劑，例如硫酸沙丁胺醇。
套組
亦提供包含根據本發明之任何態樣或實施例之經分離抗原結合蛋白質(例如抗體分子或其抗原結合片段)之套組作為本發明之態樣。在一個套組中，抗原結合蛋白質或抗體分子可經標記以實現其在待測定樣品中之反應性，例如下文中進一步描述。套組之組分通常為無菌且在密封小瓶或其他容器中。套組可用於診斷分析或抗體分子適用之其他方法中。套組可含有用於方法中之組分之使用說明書，例如根據本發明之方法。本發明之套組內可包括幫助或使得能夠進行此類方法之輔助材料。
可藉由任何適合的手段測定樣品中抗體之反應性。放射免疫分析(RIA)為一種可能方法。放射性標記抗原與未經標記之抗原(測試樣品)混合且使其能夠結合於抗體。以物理方式分離結合抗原與未結合之抗原且測定結合於抗體之放射性抗原之量。測試樣品中存在之抗原越多，則結合於抗體之放射性抗原越少。亦可使用非放射性抗原進行競爭性結合分析，使用連接至報導子分子之抗原或類似物。報導子分子可為具有光譜分離吸收或發射特徵之螢光染料、磷光體或雷射染料。適合的螢光染料包括螢光素、若丹明(rhodamine)、藻紅素及德克薩斯紅(Texas Red)。適合的發色染料包括二胺基聯苯胺。
其他報導子包括大分子膠態粒子或粒狀材料，諸如有色乳膠珠粒、磁性或順磁及生物或化學活性劑，其可直接或間接引起目視觀測、電子偵測或以其他方式記錄之可偵測信號。此等分子可為酶，其催化例如可發展或改變顏料或引起電特性變化之反應。其可以分子方式激發，使得能態之間的電子躍遷引起特徵光譜吸收或發射。其可包括與生物感測器結合使用之化學實體。可使用生物素/抗生素蛋白或生物素/抗生蛋白鏈菌素及鹼性磷酸酶偵測系統。
可使用由個別抗體-報導子結合物產生之信號以導出樣品中結合 之相關抗體之可定量絕對或相關資料(一般及測試)。
本發明亦提供上述抗原結合蛋白質之用途，其係用於量測競爭分析中之抗原含量，亦即在競爭分析藉由使用如本發明提供之抗原結合蛋白質量測樣品中之抗原含量的方法。此可在無需物理分離結合抗原與未結合之抗原的情況下實現。將報導子分子連接至抗原結合蛋白質使得對結合產生生理或光學變化為一種可能。報導子分子可直接或間接產生可偵測及較佳可量測信號。報導子分子可直接或間接、共價(例如經由肽鍵)或非共價鍵聯。經由肽鍵來鍵聯可為編碼抗體及報導子分子之基因融合物之重組型表現之結果。
本發明亦提供藉由使用本發明之抗原結合蛋白質直接量測抗原之含量，例如在生物感測器系統中。
測定結合之模式不為本發明之特徵，且熟習此項技術者能夠根據其偏好及常識選擇適合的模式。
聚核苷酸及宿主細胞
在其他態樣中，本發明提供經分離核酸，其包含編碼本發明之抗原結合蛋白質、VH域及/或VL域之序列，及製備本發明之抗原結合蛋白質、VH域及/或VL域之方法，其包含在引起產生該抗原結合蛋白質、VH域及/或VL域之條件下表現該核酸，及將其回收。
核酸包括DNA及/或RNA。在一個態樣中，核酸為cDNA。在一個態樣中，本發明提供核酸，其編碼如上文所定義之本發明之CDR或CDR集合或VH域或VL域或抗體抗原結合位點或抗體分子，例如scFv或IgG1。
本發明之一個態樣提供核酸，其通常經分離，視情況為cDNA，其編碼本文中所揭示之VH CDR或VL CDR序列，尤其選自SEQ ID NO：13-15之VH CDR或選自SEQ ID NO：18-20之VL CDR。亦提供編碼CDR之13NG0083集合的核酸、編碼HCDR之13NG0083集合的核酸及 編碼LCDR之13NG0083集合的核酸，如編碼個別CDR、HCDR、LCDR及BAK1183H4譜系之CDR、HCDR、LCDR之集合的核酸。
本發明提供足以用作雜交探針、PCR引子或測序引子之經分離聚核苷酸或cDNA分子，其為本文中所揭示之核酸分子之片段或其補體。核酸分子可例如可操作地連接至控制序列。
本發明亦提供呈質體、載體、轉錄或表現卡匣形式之構築體，其包含至少一種上述聚核苷酸。
本發明亦提供重組型宿主細胞，其包含一或多種上述構築體。編碼任何CDR或CDR集合或VH域或VL域或抗體抗原結合位點或抗體分子(如所提供之scFv或IgG1)之核酸本身形成本發明之一個態樣，製備經編碼之產物之方法亦如此，該方法包含由其對應的編碼核酸表現。表現可便利地藉由在適合的條件下培養含有核酸之重組型宿主細胞來實現。在藉由表現產生後，可使用任何適合的技術分離及/或純化VH或VL域或抗原結合蛋白質，接著視需要使用。
宿主細胞可為哺乳動物宿主細胞，諸如NS0鼠類骨髓瘤細胞、PER.C6®人類細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
抗原結合蛋白質、VH及/或VL域及編碼核酸分子及載體可例如自其天然環境以實質上純或均質形式分離及/或純化，或在核酸之情況下，以不含或實質上不含核酸或除編碼具有必需功能之多肽之序列以外的基因來源的形式分離及/或純化。本發明之核酸可包含DNA或RNA且可為完全或部分合成。除非上下文有其他需要，否則對本文中闡述之核苷酸序列之參考涵蓋具有指定序列之DNA分子，且涵蓋具有其中U取代T之指定序列的RNA分子。
多種不同宿主細胞中用於多肽之選殖及表現之系統為吾人所熟知。適合的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及桿狀病毒系統以及轉殖基因植物及動物。此項技術中可用於異源多肽之 表現的哺乳動物細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NS0小鼠黑素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人胚腎細胞、人類胚胎視網膜細胞及許多其他細胞株。常見細菌宿主為大腸桿菌。
抗體及抗體片段在諸如大腸桿菌之原核細胞中之表現已在此項技術中良好認可。關於綜述，參見例如Plüickthun,A.Bio/Technology 9：545-551(1991)。熟習此項技術者亦可使用培養物中真核細胞中之表現作為用於製備抗原結合蛋白質之選擇方案，例如Chadd HE及Chamow SM(2001)110 Current Opinion in Biotechnology 12：188-194，Andersen DC及Krummen L(2002)Current Opinion in Biotechnology 13：117，Larrick JW及Thomas DW(2001)Current opinion in Biotechnology 12：411-418。
可選擇或構築含有適合的調節序列(包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、強化子序列、標記基因及視需要選用之其他序列)之適合的載體。載體可視需要為質體、病毒(例如噬菌體)或噬菌粒。關於其他細節，參見例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第3版，Sambrook及Russell,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press。許多用於核酸之操作(例如用於製備核酸構築體、突變誘發、測序、將DNA引入細胞及基因表現以及蛋白質分析)之已知技術及方案詳細地描述於Current Protocols in Molecular Biology,第二版，Ausubel等人編，John Wiley & Sons,1988，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編，John Wiley & Sons，第4版1999中。Sambrook等人及Ausubel等人(兩者)之揭示內容以引用之方式併入本文中。
因此，本發明之另一態樣提供含有如本文中所揭示之核酸之宿 主細胞。舉例而言，本發明提供經核酸轉型的宿主細胞，該核酸包含編碼本發明之抗原結合蛋白質或本發明之抗原結合蛋白質之抗體VH或VL域之核苷酸序列。
此類宿主細胞可在活體外且可在培養物中。此類宿主細胞可為經分離宿主細胞。此類宿主細胞可在活體內。活體內存在宿主細胞可允許本發明之抗原結合蛋白質之細胞內表現為「胞內抗體」或細胞內抗體。胞內抗體可用於基因療法[74]。
另一態樣提供一種方法，其包含將此類核酸引入宿主細胞。該引入可使用任何可用的技術。對於真核細胞，適合的技術可包括磷酸鈣轉染、DEAE-聚葡萄糖、電致孔、使用反轉錄病毒或其他病毒(例如牛痘，或對於昆蟲細胞，桿狀病毒)進行之脂質體介導之轉染及轉導。可使用病毒或基於質體之系統將核酸引入宿主細胞，特定言之真核細胞。質體系統可以游離方式維持或可併入宿主細胞或人工染色體中[72、73]。併入可藉由單個或多個基因座處一或多個複本之隨機或靶向整合來進行。對於細菌細胞，適合的技術可包括氯化鈣轉型、電致孔及使用噬菌體進行之轉染。
引入之後可接著引起或實現自核酸之表現，例如藉由在用於基因表現之條件下培養宿主細胞。
在一個實施例中，本發明之核酸整合至宿主細胞之基因體(例如染色體)中。根據標準技術，整合可藉由包含可促進與基因體再結合之序列來促進。
本發明亦提供一種方法，其包含在表現系統中使用如上所述之構築體以表現上述抗原結合蛋白質或多肽。
在另一態樣中，本發明提供產生本發明之抗原結合蛋白質的融合瘤。
本發明之另一態樣提供製備本發明之抗體結合蛋白質之方法， 該方法包括引起自編碼核酸之表現。此類方法可包含在適用於產生該抗原結合蛋白質之條件下培養宿主細胞。
提供用於產生VH及VL可變域之類似方法作為本發明之其他態樣。
製備方法可包含自宿主細胞或融合瘤分離及/或純化產物之步驟。
製備方法可包含將產物調配成包括至少一種其他組分(諸如醫藥學上可接受之賦形劑)的組合物。
現將參考以下實驗藉由實例說明本發明之態樣及實施例。
實例 實例1 產生以優於BAK1183H4抗體之親和力結合人類IL-13之抗體純系
當前正在研究多種抗IL-13抗體作為療法以用於治療患有IL-13相關疾病或病狀(諸如中度至重度哮喘)之患者。此等抗體包括：雷布瑞奇單抗(Lebrikizumab)(MILR1444A/RG3637，Roche/Genentech)、ABT-308(Abbott)、GSK679586(GlaxoSmithKline)、QAX576(Novartis)及塔羅金單抗(Tralokinumab)(CAT-354，MedImmune/AstraZeneca)。儘管此等治療劑之效用令人鼓舞，但仍然需要具有較高親和力及延長之血清持久性或半衰期之經改良的抗IL-13抗體以增加功效及降低投藥頻率。
當前臨床研究中之一些抗IL-13對人類IL-13之親和力為約100-200pM。模型化指示KD小於10pM(亦即較高親和力)以及延長之血清持久性可提供顯著臨床益處。
在親和力成熟操作中產生抗人類IL-13抗體純系1183H04(在本文中亦稱為「1183H4」或「BAK1183H4」)，其涉及先前描述之噬菌體呈現及核糖體呈現(參見例如Thom等人，2006；PNAS 103第7619-7624 頁；WO 2005/007699及美國專利第7,829,090號)。藉由BIAcore量測針對人類IL-13之1183H04親和力為81pM。
就靶向突變誘發之CDR環來說，用於產生純系1183H04之最佳化操作為廣泛的。因此，留下用於探索進一步親和力增加之序列空間為有限的。因此，此第二親和力成熟策略主要涉及在至多6個胺基酸之嵌段中用NNS密碼子突變誘發一次性靶向輕鏈可變區，且亦包括所謂的微調殘基(參考：Foote及Winter(1992)J.Mol.Biol.224第487-499頁)以希望實現其他親和力改良。靶向之殘基之概述展示於表1中。
此外，靶向FW1 27-30中之VH CDR1殘基30-35及微調殘基作為隨機化策略之一部分。
先前藉由丙胺酸掃描證實對結合為關鍵之殘基在其存在於嵌段內時不隨機化。
寡聚引導之突變誘發進行胺基酸隨機化，且製備噬菌體呈現文庫以用於根據序列QC進行選擇(使用此突變誘發策略，所產生之所有文庫>1e9，其足夠高以涵蓋6個胺基酸之嵌段之理論多樣性)。
在遞減濃度(10-0.1nM)之生物素化重組型IL-13下使用噬菌體呈現進行溶液相選擇(3-4輪)(IL-13(Peprotech)在內部生物素化)。篩選個別scFv作為生物化學受體-配位體抑制分析中之粗上清液，尋找抑製程度大於親本1183H04 scFv之scFv(「成功結果」)。接著篩選成功結果且在生物化學分析及/或生物TF-1分析中分級為經純化之scFv或 IgG。
序列多樣性僅限於各靶向嵌段內之少數殘基(至多3-4個)。此表明所靶向之序列區域相對耐變化。
有趣的是，VL CDR3僅耐受六個隨機殘基內之單一突變。此位於位置95a處，且僅發現3個可能胺基酸(R、S或L)代替親本(D)殘基。原始文庫皆在所有隨機位置展示良好多樣性。
在2-3輪噬菌體呈現選擇之後，選擇產物以用於製備再結合文庫，以選擇可提供加成或協同改良之突變組合。藉由組合H1與L1B1、L2、L3及其所有組合來構築文庫以產生總共6個噬菌體呈現再結合文庫(所有文庫在轉型後尺寸>1e9)。
再一次用遞減濃度之Bio-IL-13(1-0.01nM)進行噬菌體呈現溶液相選擇，且使用過量之非生物素化IL-13進行R3競爭性選擇。再結合後，在受體配位體抑制分析中自R1-R4篩選產物作為粗scFv。製備成功結果作為經純化之scFv或IgG材料且在生物分析中測試。
再一次，在分析中產生適當數目之與親本相比具有改良之IC50的成功結果。以上表2展示在最佳化過程期間篩選之純系數目及其篩選格式。儘管篩選許多變異體作為粗scFv，但相對極少數(小於0.8%或74/9439)與親本相比展示改良且收集作為經純化之scFv或IgG用於進一步表徵。
在整個最佳化過程中，在使用生物化學及生物分析分級經改良之變異體時存在一些困難，因為序列差異為相對保守性且難以區分IC50之改良。
對有限子集使用Biacore親和力分析且接著Kinexa而獲得之親和力資料有助於變異體之分級且在整個最佳化過程中用於監測親和力改良。
藉由組合VL CDR1及VL CDR3 VL CDR2與VL CDR3來觀測自再結合文庫之最大親和力改良。為了研究能否進一步改良親和力，構築『微型文庫』以重組VL CDR1、CDR2及CDR3中之突變。使用PCR藉由重疊引子將此等突變改組。此階段所評估之多樣性為約288種可能組合，因此不進行進一步選擇，自微型文庫轉型培養盤直接收集約1000個群落之群體且在生物化學分析中直接篩選。
約1000個經分析之scFv中之242個scFv在競爭分析中與1183H04相比展示更大的效能。對此等scFv進行測序且展示VLCDR 1、2及3之再結合。基於序列多樣性選擇33種獨特變異體，在生物化學及生物分析中經篩選作為經純化之scFv。選擇生物化學分析中22個最強效的成功結果製備成IgG，以供在生物學分析中分級(參見圖1A、1B、2A及2B)。在Biacore親和力分析中分級來自生物分析之頂部4-5個IgG。選擇Biacore親和力分析中之頂部3個純系，包括13NG0073、13NG0074及13NG0083(圖3)用於使用Kinexa分析親和力增加。
微型文庫亦經歷易錯PCR及若干輪核糖體呈現，但此未產生效能之任何進一步改良。
1183H04之最佳化為具有挑戰性的方法，尤其因為此變異體為廣泛最佳化操作之產物。參見例如美國專利第7,829,090號。尚不明確在此當前最佳化過程期間是否實現所需親和力目標。來自再結合前及再結合後選擇之變異體中之序列變化較小且僅產生中度的親和力改良。 圖4展示來自再結合前選擇之兩種變異體，其在生物化學及生物分析中篩選(13NG0025及13NG0027)。個別純系與分析中之親本相比僅具有中度改良。意外的是，組合來自此等變異體之變化與VLCDR3中位置95a處之另一突變可產生未預期的5.2倍親和力改良，使得Kd為6pM(13NG0083)。
實例2 TF1增殖分析中純系13NG0083之效能
在TF1細胞增殖分析中測試純系13NG0083效能。簡言之，將TF1細胞(R&D Systems)洗滌且再懸浮於分析培養基中達到2×105個/毫升之最終濃度[分析培養基：RPMI-1640(Gibco)、5%胎牛血清、1×青黴素/鏈黴素(Gibco)]。將一百微升細胞分配於96孔平底分析盤(Costar)中。稀釋至40ng/mL之濃度的人類介白素13(Peprotech)分配於單獨的分析盤中。在單獨的分析盤中以四倍最終濃度製備某一滴定範圍之13NG0083(在Fc區中具有YTE突變之IgG1格式)或同型對照。接著混合相等體積之抗體及IL-13且在室溫下培育30分鐘。在分析培養基中製得細胞、配位體及抗體之所有稀釋物。接著將一百微升抗體/IL-13組合添加至TF1細胞中。分別使用僅具有培養基或僅具有IL-13之細胞作為陰性或陽性對照。細胞在37℃、5%CO2下培養3天。在培養週期之後，細胞用20微升/孔之[3H]-胸苷(Perkin-Elmer)脈衝處理。細胞在37℃、5%CO2下培育四小時，且接著收集至玻璃纖維過濾器板(Perkin-Elmer)上且在50℃下乾燥1小時。添加五十微升/孔之Microscint(Perkin-Elmer)，密封盤且在閃爍計數器上讀取。結果表示為計數/分鐘(C.P.M.)。
進行三次實驗以評估抗體13NG0083(在Fc區中具有YTE突變之IgG1格式)之效能。圖5展示代表性單次實驗，其展示13NG0083(在Fc區中具有YTE突變之IgG格式)有效力地抑制TF1增殖。資料標繪為 C.P.M.對比抗體之log(10)濃度且針對S形劑量反應模型(可變斜率)Y=底部+(頂部+底部)/(1+10((LogEC50-X)×希爾斜率(HillSlope)))擬合，其中X為濃度之對數。Y為反應；Y在底部起始且以S型形狀到達頂部。此為「四參數對數方程式」。使用Microsoft Excel及Graphpad Prism軟體進行資料分析。自三個非依賴性實驗獲得IC50值，其得出幾何平均IC50值為165pM(幾何平均值之95%CI；26-1052pM)。
實例3 13NG0083在使用IL-13之R130變異體之受體配位體競爭分析中之效能
使用均質時差式螢光(HTRF)測試13NG0083變異體抑制IL-13結合於IL-13受體α2之能力。簡言之，研究HTRF分析法，藉此在經FLAG標記之人類IL-13(用經銪標記之抗FLAG抗體(CisBio)偵測)結合於先前用Dylight650(Thermo Scientific)直接標記之人類IL-13受體α2(R&D systems)時發現FRET信號。最終分析條件如下：將抗旗標銪穴狀化合物(433pM)、經FLAG標記之人類IL-13(312.5pM)及人類IL-13受體α2(10nM)添加至黑色淺384孔盤(Costar)中，密封，加蓋且在室溫下培育4小時。接著使用320nm激發過濾器以及590nm及665nm發射過濾器，使用Envision微板讀取器(PerkinElmer)讀取培養盤。使用以下方程式計算665nm及620nm下觀測之發射值之比率：(665/620)×10,000。使用以下方程式計算最終DeltaF值：((測試孔比率-非特異性背景比率)/非特異性背景比率)×100。非特異性背景定義為在對照孔(通常包含孔I23至P24)中發現的HRTF信號，其中省略添加經FLAG標記之人類IL-13且用分析緩衝液代替。
為了測定13NG0083變異體抑制人類IL-13與IL-13受體α2之相互相用的效能，用各種濃度之變異體一式兩份地進行11點劑量反應實驗。將此等滴定物添加至上述HTRF競爭分析中且針對S形劑量反應模型(可變斜率)Y=底部+(頂部-底部)/(1+10((LogEC50-X)×希爾斜率))擬合資料， 其中X為濃度之對數。Y為反應；Y在底部起始且以S型形狀到達頂部。此為「四參數對數方程式」。使用Microsoft Excel及Graphpad Prism軟體進行資料分析。
此等實驗之結果展示於圖6中且展示自親本純系(IC50=1.34nM)至最佳化變異體之幾何平均效能之顯著改良，其中發現13NG0083純系之格式自IgG1(13NG0083 IgG1 IC50=423pM)變成IgG4-P(13NG0083 IgG4-P IC50=496pM)具有極小作用，且在變成生殖系(13NG0083 IgG1_FGL IC50=734pM及13NG0083 IgG4-P IC50=622pM)時具有極小作用。IgG4-P：IgG4 S241P。
實例4 13NG0073、13NG0074及13NG0083純系之親和力 方法 材料/試劑/化學物質
吖內酯珠粒來自(Thermo)，杜貝克氏PBS(Dulbecco's PBS)。
蛋白質
IgG皆具有適用於活體內使用之品質。
人類IL-13來自PeproTech。
37℃下基於KinExA之量測結果。
用KinExA 3200(Sapidyne Instruments,Boise,Idaho,USA)儀器進行動力學排除分析(KinExA)量測，其中控制儀器且使用所提供的KinExA Pro軟體版本3.2.6處理所得資料。在基於補充有1mg/mL牛血清白蛋白(低IgG低內毒素，Sigma A2058)及0.02%疊氮化鈉之杜貝克氏PBS(D-PBS)之樣品緩衝液中製備受體配位體混合物。流動緩衝液為在無白蛋白情況下製備之相同緩衝液。歸因於在37℃下之長平衡時間，KinExA實驗中使用之所有緩衝液經0.2μm過濾器滅菌。所使用之螢光第二偵測劑為由Jackson Immunoresearch(Newmarket,UK)提供 之經DyLight649標記之小鼠抗人類重鏈及輕鏈特異性抗體。對於取樣珠粒管柱，200mg UltraLink Biosupport吖內酯珠粒(Thermo/Pierce 53110)與100μg人類IL-13在2.5mL 50mM碳酸氫鈉pH 8.4中，在室溫下，在恆定攪拌下混合90分鐘。用含10mg/mL BSA之1M Tris pH 8.7進行沖洗及阻斷。在使用之前，再懸浮珠粒在D-PBS+0.02%疊氮化鈉中稀釋。
滴定至IgG溶液中之人類IL-13在100或4pM IgG濃度下固定以分別提供由受體及KD控制之連續稀釋物。使此等溶液在37℃下達到平衡保持12-13天。接著用樣品及位於37℃溫度控制室(Series 3 HTCL 750 Temperature Applied Sciences Ltd.Goring-by-sea,West Sussex,BN12 4HF,UK)中之完整KinExA 3200儀器進行此等經平衡之樣品之KinExA分析。
在取樣期間，KinExA 3200儀器自動將IL-13結合之吖內酯微珠粒封裝至新管柱中。含有抗體、抗原及Ab/抗原複合物之經預先平衡之樣品快速流動(0.25mL/min)通過管柱以保持樣品與抗原-珠粒之接觸時間較短。使用經螢光染料標記之小鼠抗人類重鏈及輕鏈特異性抗體偵測結合於抗原-珠粒之自由抗體。藉由在特定固定濃度之IgG下量測多種不同濃度之IL-13下自由抗體結合位點之部分，使用所提供之KinExA Pro 3.2.6.軟體(Sapidyne Instruments,Idaho)內之1：1可逆雙分子相互相用模型，藉由全局最小二乘法(n-曲線)擬合來評估KD值。
結果-動力學排除分析(KinExA)
對於此等親和力量測，由於人類IL-13之測試IgG之相互相用之極高(單數位pM)親和力(KD，解離常數)，使用藉由使用KinExATM技術(Sapidyne Instruments,Darling及Brault,2004；參考文獻79)進行之動力學排除分析。此外，使用基於37℃之量測系統以1)增強在IgG變異體之間的區別及2)在生理學相關性更高之溫度下獲得親和力評估。
KinExA為基於流動螢光分析法之方法，其可用於定量高親和力相互作用，包括次皮莫耳範圍內之相互作用(Rathanaswami等人，2005；參考文獻80)。因此，使用此技術獲得抗體KD值之親和力之更絕對量測值。
經平衡之受體及KD控制之連續稀釋物結果之整體評估提供具有所計算之95%信賴區間之KD值，如圖7中所示。
實例5 IL-13變異體之活體外測試
在TF1細胞增殖分析中測試IL-13變異體(R130、Q130及Q105)之效能。使用桿狀病毒/Sf21系統表現IL-13變異體R130及Q130蛋白質，而在CHO系統中表現Q105變異體。
簡言之，洗滌TF1細胞(R&D Systems)且再懸浮於分析培養基中達到2×105個/毫升之最終濃度。將一百微升細胞分配於96孔平底分析盤(Costar)中。稀釋滴定範圍之人類IL-13變異體且分配於單獨的分析盤中。在分析培養基中製備細胞及IL-13變異體之所有稀釋物：RPMI-1640(Gibco)、5%胎牛血清、1×青黴素/鏈黴素(Gibco)。將一百微升IL-13變異體滴定物添加至TF1細胞中。僅具有培養基之細胞用作陰性。接著，細胞在37℃、5%CO2下培養3天。在培養週期之後，細胞用20微升/孔之[3H]-胸苷(Perkin-Elmer)脈衝處理。細胞在37℃、5%CO2下培育四小時。接著在玻璃纖維過濾器板(Perkin-Elmer)上收集細胞，接著培養盤在50℃下乾燥1小時。接著添加50微升/孔之Microscint(Perkin-Elmer)，密封培養盤且在閃爍計數器上讀取。結果展示於圖8中且表示為計數/分鐘(C.P.M.)。
資料標繪為C.P.M.對比抗體之10g(10)濃度且針對S形劑量反應模型(可變斜率)Y=底部+(頂部+底部)/(1+10((LogEC50-X)×希爾斜率))擬合，其中X為濃度之對數。Y為反應；Y在底部起始且以S型形狀到達頂部。此 為「四參數對數方程式」。使用Microsoft Excel及Graphpad Prism軟體進行資料分析。
實例6 藉由13IL0083抑制IL-13變異體Q105
在TF1細胞增殖分析中測試純系13NG0083效能。簡言之，洗滌TF1細胞(R&D Systems)且再懸浮於分析培養基中達到2×105個/毫升之最終濃度。將一百微升細胞分配於96孔平底分析盤(Costar)中。人類介白素13變異體Q105稀釋至40ng/mL之濃度，分配於單獨的分析盤中。在單獨的分析盤中，在四倍最終濃度下製備某一滴定範圍之13NG0083或同型對照。接著混合相等體積之抗體及IL-13且在室溫下培育30分鐘。在分析培養基中製備細胞、配位體及抗體之所有稀釋物：分析培養基：RPMI-1640(Gibco)、5%胎牛血清、1×青黴素/鏈黴素(Gibco)。接著將一百微升抗體/IL-13組合添加至TF1細胞中。分別使用僅具有培養基或僅具有IL-13之細胞作為陰性或陽性對照。接著，細胞在37℃、5%CO2下培養3天。在培養週期之後，細胞用20微升/孔之[3H]-胸苷(Perkin-Elmer)脈衝處理。細胞在37℃、5%CO2下培育四小時。接著在玻璃纖維過濾器板(Perkin-Elmer)上收集細胞，接著在50℃下乾燥培養盤1小時。接著添加50微升/孔之Microscint(Perkin-Elmer)，密封盤且在閃爍計數器上讀取。結果表示為計數/分鐘(C.P.M.)。
進行三次實驗以評估抗體13NG0083之效能。如圖9(代表性單次實驗)中所示，在TF1細胞增殖分析中，完全生殖系化(FGL)13NG0083(在Fc區中具有YTE突變之IgG格式)抑制IL-13 Q105變異體。資料標繪為C.P.M.對比抗體之log(10)濃度且針對S形劑量反應模型(可變斜率)Y=底部+(頂部+底部)/(1+10((LogEC50-X)×希爾斜率))擬合，其中X為濃度之對數。Y為反應；Y在底部起始且以S型形狀到達頂部。此為「四參數 對數方程式」。使用Microsoft Excel及Graphpad Prism軟體進行資料分析。
實例7 配位體受體競爭分析中之IL-13人類變異體及食蟹獼猴IL-13
為了研究13NG0083變異體抑制IL-13之不同形式之能力，重複以上配位體-受體分析中使用之實驗方法，用相同濃度(312.5pM)之人類Q130R IL-13(圖10B)、人類Q105 IL-13(圖10A)或食蟹獼猴IL-13(圖10C)取代R130 IL-13。證實所有變異體(包括13NG0083人類IgG1+YTE(「hIgG1-YTE」)及13NG0083人類IgG4-P(IgG4 S241P)+YTE(「IgG4-P-YTE」或「hIgG4-P-YTE」)；完全生殖系化(「fgl」)或非生殖系化(「ngl2」))抑制IL-13變異體與人類IL-13受體α2之間的相互作用。參見圖10。當與IL-13之共同變異體R130相比時，發現IL-13之Q105或Q130R變異體之效能變化極小。證實所有純系(包括13NG0083人類IgG1+YTE(「IgG1-YTE」)及13NG0083人類IgG4-P(IgG4 S241P)+YTE(「IgG4-P-YTE」)；完全生殖系化(「fgl」)或非生殖系化(「ngl2」))抑制食蟹獼猴IL-13與人類IL-13受體α2之結合。參見圖10。
實例8 13NG0083與小鼠及食蟹獼猴IL-13之功能性物種交叉反應性
為了研究13NG0083物種交叉反應性，重複實例2中之TF1分析中所描述之實驗方法，比較人類(A)、食蟹獼猴(B)或小鼠IL-13(C)。結果展示於圖11中。人類及食蟹獼猴IL-13皆由IL-13NG0083抑制。小鼠IL-13支持TF1增殖，然而除最高濃度抗體下之小幅降低以外，在IL13NG0083下未觀測到抑制。
實例9 人類及食蟹獼猴FcRn與13NG0083之結合
用BIAcore 3000儀器量測IL13NG0083及同型對照IgG與人類FcRn蛋白質(huFcRn)及食蟹獼猴(cynoFcRn)之結合之親和力(KD)。簡言之，IL13NG0083及同型對照IgG在10mM乙酸鈉緩衝液，pH 4中稀釋至約250nM(37.5μg/mL)之濃度，接著用於根據儀器製造商提供之方案在CM5感測器晶片上製備高密度(在約2300-約2600RU範圍內)IgG表面。亦使用相同固定方案，在減去蛋白質情況下，在感測器晶片上製備參考流動細胞表面。如Dall'Acqua等人，2002(參考文獻第81號)及Dall'Acqua等人，2006(參考文獻第82號)中所描述製備FcRn蛋白質。在儀器緩衝液(50mM磷酸鈉緩衝液，pH6，含有150mM NaCl及0.05%(v/v)Tween 20[T20])中以3000nM製備huFcRn及cynoFcRn蛋白質之儲備溶液，接著在相同緩衝液中連續稀釋(3：1)至4.11nM。將各濃度之FcRn以5微升/分鐘之流動速率個別地注射至IL13NG0083、同型對照IgG及參考細胞表面，且經50分鐘週期記錄結合資料。最終，藉由注射50mM磷酸鈉緩衝劑，pH 7.4(含有150mM NaCl及0.05%(v/v)T20)之10次連續60秒脈衝自感測器晶片表面移除結合之FcRn。在整個一系列注射中亦穿插若干次緩衝液注射。隨後，使用此等緩衝液注射中之一者與參考細胞資料以經由通常稱為「雙重參考」之技術校正注射偽影(例如非特異性結合)之原始資料集合。在收集所有結合資料之後，在各濃度(C)之FcRn下之穩定結合(Req)期間獲得個別資料集合之平均值，且接著使用供應商之BIAevaluation軟體v.1.1針對1：1結合模型(Req對比C曲線)擬合以測定KD。結果展示於圖12中。
實例10 人類全血中13NG0073及13NG0083之穩定性
為了評估13NG0073及13NG0083之活體內穩定性，抗體在肝素化人類血液中培育零或24小時。將抗體添加至1mL人類血液中達到10微克/毫升之最終濃度。在培育期之後，血液經微量離心以移除細胞 且移除血漿。接著在TF1增殖分析中，在33nM之抗體之所評估之起始濃度下滴定血漿/抗體。如先前在實例2中所描述進行TF1分析。如圖13中所示，13NG0073及13NG0083在血清中培育24小時之後穩定，如由TF1細胞增殖之有效抑制所證實。
實例11 IL13NG0083表現工程改造 材料及方法 使用寡聚引導之突變誘發產生回復突變體
在突變誘發之第一階段中，九個負股寡核苷酸經設計以使組成13NG0083之最佳化輕鏈序列的9個胺基酸突變恢復成未最佳化親本序列。使用孔克爾突變誘發(Kunkel mutagenesis)(先前描述於Kunkel TA.(1985).Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.「Proceedings of the National Academy of Sciences U S A.」82(2)：488-92以及Sidhu SS及Weiss GA：Constructing Phage Display Libraries by Oligonucleotide-Directed Mutagenesis.Phage Display：A Practical Approach,Clackson T及Lowman HB編1990，第2：27-41章中)製備個別回復突變體。簡言之，自例如M13噬菌體純化編碼噬菌粒載體(例如pEU)中之VL之含有尿嘧啶的ssDNA(dU-ssDNA)，該M13噬菌體自稱為CJ236之大腸桿菌dut-/ung-菌株獲得。一個或若干個編碼所需突變之寡核苷酸黏接至dU-ssDNA模板，擴增且接合以形成共價閉合環形DNA(ccc-DNA)。ccc-DNA可高效轉型大腸桿菌菌株，諸如TG1及DH5α。新宿主破壞親本dU-ssDNA股且使用突變股作為模板合成置換股。將來自轉型作用之群落收集至96孔盤之個別孔中，生長及經歷PCR，接著測序以檢驗用於正確/所需突變。製備所得dsDNA突變噬菌粒作為dsDNA且用於任何其他目的。
在突變誘發之第二階段中，設計其他寡核苷酸。在一些情況 下，至多2個寡核苷酸用於相同反應以組合突變，該等突變與突變誘發之第一階段相比具有既定改良之表現。
純化質體用於表現評估
經輕鏈及重鏈之載體轉型之大腸桿菌之單獨的培養物生長隔夜且使用質體提取套組(plasmid plus maxi kits)(Qiagen)純化所得質體。DNA接著用酚：氯仿、氯仿且接著用鎖相凝膠提取。接著使用乙酸鈉使DNA在乙醇內沈澱以純化去除鹽及蛋白質，隨後與組織培養級水一起無菌再懸浮於層流箱中。
CHO細胞中之表現評估
在轉型當天，CHO細胞以某一比容積及細胞密度接種於所需數目之24深孔板中。藉由在聚伸乙基亞胺(PEI)及氯化鈉存在下負載特定濃度來製備DNA且在培育達到複合之後分佈於24孔板之各孔中。接著在轉染後至少4小時之後，向板供應單一定量進料。在7天後獲得收集上清液且藉由八位型PrA定量。
結果
觀測13NG0083於CHO細胞中之穩定表現。然而，不斷地用許多其他輕鏈取代13NG0083輕鏈引起改良之表現(效價)。參見圖14。
為了改良13NG0083之穩定表現，使用孔克爾突變誘發產生一板九(9)個突變體以研究當與13NG0083重鏈共表現時，哪些變化(若存在)可增加穩定表現。兩種突變體M27I及E52G顯示穩定表現之持續改良(圖15)。當組合時，此等突變進一改良的表現(圖17)。
使用計算同源性模型化及結構生物資訊評估序列/結構，在表現概況方面發現三個其他突變體降低13NG0083之VL CDR2之頂端上罕見強的親水性及帶負電荷區域(50-DDED-53(SEQ ID NO：286))。pdb資料庫(至2013)中可獲得之約1045種抗體結構之綜述證實從未觀測到此序列主結構(圖16)。結構分析、PDB生物資訊及分子動力學模擬預 示移除此環上之負電荷可增加局部結構穩定性及潛在地改良表現。參見圖20。
當與13NG0083重鏈共表現時，13NG0083之所有輕鏈突變體M27I+E52G、M27I+E52N及輕鏈結構突變體(50-)DNED(SEQ ID NO：287)、DDND(SEQ ID NO：288)或DDEN(SEQ ID NO：289)(-53)與未經修飾之13NG0083相比引起改良之表現。結構輕鏈突變體50至DDEN-53(SEQ ID NO：289)與13NG0083相比展示顯著的270%表現改良(圖17)。
為了測定引起改良之13NG0083表現之輕鏈中之變化是否對13NG0083對IL13之結合及效能具有影響，進行許多生物分析。在ELISA分析中，發現所測試之所有13NG0083輕鏈突變體(除外突變體DNED(SEQ ID NO：287)以外)皆結合於IL-13(圖18)。此外，所測試之所有13NG0083輕鏈突變體(除突變體DNED(SEQ ID NO：287)以外)皆以與未經修飾之13NG0083類似效能之結合IL-13且抑制由其誘導之TF-1細胞之增殖，包括突變體DDEN(SEQ ID NO：289)(圖19)。因此，所有引起改良之13NG0083表現之輕鏈突變體(除突變體DNED(SEQ ID NO：287)以外)對13NG0083對IL-13之結合及效能不具有影響。
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對特定實施例之前述描述將因此充分地揭示本發明之一般性質：在不偏離本發明之一般概念的情況下，其他人可藉由應用熟習此項技術者所瞭解之知識針對各種應用而容易地修改及/或調適此等特定實施例，而無需進行不當實驗。因此，基於本文中所呈現之教示及 導引，此等調適及修改意欲在所揭示實施例之等效物的意義及範圍內。應理解，本文中之措辭或術語係出於例如描述而非限制之目的，使得本說明書之術語或措辭待由熟習此項技術者按照該等教示及該指導進行解譯。
本發明之廣度及範圍不應由上述例示性實施例中之任一者限制，而應僅根據以下申請專利範圍及其等效者進行界定。
本申請案中引用的所有公開案、專利、專利申請案及/或其他文獻均出於所有目的以全文引用的方式併入本文中，引用的程度就如同個別地指示將各個別公開案、專利、專利申請案及/或其他文獻以引用的方式併入以用於所有目的一樣。
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<213> 智人
<400> 250
<210> 251
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LCDR1肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Leu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Leu、Ile或Val
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Ser或Ala
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Arg或Tyr
<400> 251
<210> 252
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LCDR2肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Gly、Ile、Glu、Met或Gln
<400> 252
<210> 253
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LCDR3肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Asp、Arg、Leu或Ser
<400> 253
<210> 254
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成HFW1多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Val或Ala
<400> 254
<210> 255
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成HFW2肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Met或Val
<400> 255
<210> 256
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成HFW3多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ser或Gly
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Ser或Gly
<400> 256
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成HFW4肽
<400> 257
<210> 258
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW1肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ser或Leu
<400> 258
<210> 259
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW2肽
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Ile、Met或Val
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Phe、Tyr或Met
<400> 259
<210> 260
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW3多肽
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Ala或Thr
<400> 260
<210> 261
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW4肽
<400> 261
<210> 262
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成HFW1多肽
<400> 262
<210> 263
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成HFW2肽
<400> 263
<210> 264
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成HFW3多肽
<400> 264
<210> 265
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW1肽
<400> 265
<210> 266
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW2肽
<400> 266
<210> 267
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW2肽
<400> 267
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW2肽
<400> 268
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW2肽
<400> 269
<210> 270
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW2肽
<400> 270
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW2肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LFW2多肽
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類IL-蛋白質抗原決定基序列
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<211> 34
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類IL-蛋白質抗原決定基序列
<400> 274
<210> 275
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成LCDR1肽
<400> 275
<210> 276
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成可變輕鏈多肽
<400> 276
<210> 277
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成輕鏈多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成可變重鏈多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成重鏈多肽
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成VH CDR1肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成VH CDR2肽
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成VH CDR3肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成VL CDR1肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成VL CDR2肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：抗IL5R之合成VL CDR3肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<220>
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<220>
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 347
<210> 348
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 348
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成肽
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 391
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<400> 400
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 405
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 406
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 407
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 408
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 410
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 411
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 412
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<210> 415
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 415
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 416
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 422
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<213> 人工序列
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<400> 432
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 433

Claims (81)

  1. 一種結合人類IL-13之經分離抗原結合蛋白或其片段，其包含可變重鏈(VH)結構域及可變輕鏈(VL)結構域，其中該VH域包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL域包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，且其中：HCDR1包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；LCDR1包含具有下式之胺基酸序列：G G N LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 L V H其中LX1係選自由L及M組成之群，LX2係選自由以下組成之群：L、I及V，LX3係選自由G及A組成之群，LX4係選自由S及A組成之群，及LX5係選自由R及Y組成之群(SEQ ID NO：251)；LCDR2包含具有下式之胺基酸序列：D D LX6 D R P S其中LX6係選自由以下組成之群：G、I、E、M及Q(SEQ ID NO：252)；及LCDR3包含具有下式之胺基酸序列：Q V W D T G S LX7 P V V其中LX7係選自由以下組成之群：D、R、L及S(SEQ ID NO：253)。
  2. 如請求項1之抗原結合蛋白質或其片段，其包含一組CDR，即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，如表3 中所示。
  3. 如請求項1或2之抗原結合蛋白質或其片段，其中：LX1係選自由L及M組成之群，LX2係選自由以下組成之群：L、I及V，LX3為G，LX4為A，LX5係選自由以下組成之群：R及Y，LX6係選自由以下組成之群：G、I、E、M及Q，及LX7係選自由以下組成之群：D、R、L及S。
  4. 如請求項3之抗原結合蛋白質或其片段，其包含一組CDR，即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，如表4中所示。
  5. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其中：LX1係選自由L及M組成之群，LX2係選自由以下組成之群：L、I及V，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6係選自由以下組成之群：G、I、E及Q，及LX7係選自由以下組成之群：D、R、L及S。
  6. 如請求項5之抗原結合蛋白質或其片段，其包含一組CDR，即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，如表5中所示。
  7. 如請求項5或6之抗原結合蛋白質或其片段，其中：LX1係選自由L及M組成之群，LX2係選自由以下組成之群：I及V， LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6係選自由以下組成之群：I、Q及E，及LX7係選自由以下組成之群：R、L及S。
  8. 如請求項7之抗原結合蛋白質或其片段，其包含一組CDR，即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，如表6中所示。
  9. 如請求項7或8之抗原結合蛋白質或其片段，其中：LX1為M，LX2為V，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6為E，及LX7為S。
  10. 如請求項7或8之抗原結合蛋白質或其片段，其中：LX1為L，LX2為I，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6為I，及LX7為R。
  11. 如請求項7或8之抗原結合蛋白質或其片段，其中：LX1為L， LX2為I，LX3為G，LX4為A，LX5為R，LX6為Q，及LX7為L。
  12. 一種結合人類IL-13之經分離抗原結合蛋白質或其片段，其包含可變重鏈(VH)結構域及可變輕鏈(VL)結構域，該可變重鏈結構域及可變輕鏈結構域包含一組CDR，即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該組CDR係選自由以下組成之群：(a)包含如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列的HCDR1、包含如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列的HCDR2、包含如SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列的HCDR3、包含如SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列的LCDR1、包含如SEQ ID NO：19所示之胺基酸序列的LCDR2及包含如SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列的LCDR3；(b)包含如SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列的HCDR1、包含如SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列的HCDR2、包含如SEQ ID NO：25所示之胺基酸序列的HCDR3、包含如SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列的LCDR1、包含如SEQ ID NO：29所示之胺基酸序列的LCDR2及包含如SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列的LCDR3；及(c)包含如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列的HCDR1、包含如SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列的HCDR2、包含如SEQ ID NO：35所示之胺基酸序列的HCDR3、包含如SEQ ID NO：38所示 之胺基酸序列的LCDR1、包含如SEQ ID NO：39所示之胺基酸序列的LCDR2及包含如SEQ ID NO：40所示之胺基酸序列的LCDR3。
  13. 一種結合IL-13之經分離抗原結合蛋白質或其片段，其包含與SEQ ID NO：12具有至少90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的重鏈可變區(VH)及與SEQ ID NO：17、27或37具有至少90%、95%、97%、98%或99%序列一致性的輕鏈可變區(VL)。
  14. 一種結合人類IL-13之經分離抗原結合蛋白質或其片段，其包含選自由以下組成之群的VH域及VL域：a)包含SEQ ID NO：12之VH域及包含SEQ ID NO：17之VL域(13NG0083)；(b)包含SEQ ID NO：22之VH域及包含SEQ ID NO：27之VL域(13NG0073)；(c)包含SEQ ID NO：32之VH域及包含SEQ ID NO：37之VL域(13NG0074)；(d)包含SEQ ID NO：112之VH域及包含SEQ ID NO：117之VL域(13NG0071)；(e)包含SEQ ID NO：42之VH域及包含SEQ ID NO：47之VL域(13NG0068)；(f)包含SEQ ID NO：52之VH域及包含SEQ ID NO：57之VL域(13NG0067)；(g)包含SEQ ID NO：62之VH域及包含SEQ ID NO：67之VL域(13NG0069)；(h)包含SEQ ID NO：72之VH域及包含SEQ ID NO：77之VL域(13NG0076)；(i)包含SEQ ID NO：82之VH域及包含SEQ ID NO：87之VL域 (13NG0070)；(j)包含SEQ ID NO：92之VH域及包含SEQ ID NO：97之VL域(13NG0075)；(k)包含SEQ ID NO：102之VH域及包含SEQ ID NO：107之VL域(13NG0077)；及(l)包含SEQ ID NO：122之VH域及包含SEQ ID NO：127之VL域(13NG0072)；(m)包含SEQ ID NO：242之VH域及包含SEQ ID NO：247之VL域(13NG0025)；(n)包含SEQ ID NO：222之VH域及包含SEQ ID NO：227之VL域(13NG0078)；(o)包含SEQ ID NO：142之VH域及包含SEQ ID NO：147之VL域(13NG0079)；(p)包含SEQ ID NO：152之VH域及包含SEQ ID NO：157之VL域(13NG0080)；(q)包含SEQ ID NO：131之VH域及包含SEQ ID NO：137之VL域(13NG0081)；(r)包含SEQ ID NO：192之VH域及包含SEQ ID NO：197之VL域(13NG0082)；(s)包含SEQ ID NO：182之VH域及包含SEQ ID NO：187之VL域(13NG0084)；(t)包含SEQ ID NO：212之VH域及包含SEQ ID NO：217之VL域(13NG0085)；(u)包含SEQ ID NO：162之VH域及包含SEQ ID NO：167之VL域(13NG0086)；(v)包含SEQ ID NO：202之VH域及包含SEQ ID NO：207之VL域 (13NG0087)；及(w)包含SEQ ID NO：172之VH域及包含SEQ ID NO：177之VL域(13NG0088)。
  15. 如請求項14之抗原結合蛋白質或其片段，其包含選自由以下組成之群的VH域及VL域：(a)包含SEQ ID NO：12之VH域及包含SEQ ID NO：17之VL域(13NG0083)；(b)包含SEQ ID NO：22之VH域及包含SEQ ID NO：27之VL域(13NG0073)；及(c)包含SEQ ID NO：32之VH域及包含SEQ ID NO：37之VL域(13NG0074)。
  16. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其中該HCDR1、HCDR2及HCDR3位於生殖系構架內及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3位於生殖系構架內。
  17. 如請求項16之抗原結合蛋白質或其片段，其中該HCDR1、HCDR2及HCDR3位於生殖系構架內，該生殖系構架包含構架區HFW1、HFW2、HFW3及HFW4之集合，其中：HFW1包含具有下式之胺基酸序列：Q FX1 Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T，其中FX1係選自V或A(SEQ ID NO：254)；HFW2包含具有下式之胺基酸序列：W V R Q A P G Q G L E W FX2 G，其中FX2係選自M及V(SEQ ID NO：255)；HFW3包含具有下式之胺基酸序列：R V T M T T D T S T FX3 T A Y M E L R FX4 L R S D D T A V Y Y C A R，其中FX3係選自S及G且FX4係選自S及G(SEQ ID NO：256)；及HFW4包含具有下式之胺基酸序列：W G R G T L V T V S S(SEQ ID NO：257)。
  18. 如請求項16或17之抗原結合蛋白質或其片段，其中該LCDR1、LCDR2及LCDR3位於生殖系構架內，該生殖系構架包含構架區LFW1、LFW2、LFW3及LFW4之集合，其中：LFW1包含具有下式之胺基酸序列：S Y V L T Q P P FX5 V S V A P G K T A R I P C，其中FX5係選自S及L(SEQ ID NO：258)；LFW2包含具有下式之胺基酸序列：W Y Q Q K P G Q A P V L FX6 FX7 FX8，其中FX6係選自I及V，FX7係選自I、M及V，及FX8係選自F、Y及M(SEQ ID NO：259)；LFW3包含具有下式之胺基酸序列：G I P E R F S G S N S G N T A T L T I S R V E FX9 G D E A D Y Y C，其中FX9係選自A或T(SEQ ID NO：260)；及LFW4包含具有下式之胺基酸序列：F G G G T K L T V L(SEQ ID NO：261)。
  19. 如請求項18之抗原結合蛋白質或其片段，其中：HFW1包含具有下式之胺基酸序列：Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T(SEQ ID NO：262)；HFW2包含具有下式之胺基酸序列： W V R Q A P G Q G L E W M G(SEQ ID NO：263)；HFW3包含具有下式之胺基酸序列：R V T M T T D T S T S T A Y M E L R S L R S D D T A V Y Y C A R(SEQ ID NO：264)；HFW4包含具有下式之胺基酸序列：W G R G T L V T V S S(SEQ ID NO：257)；LFW1包含具有下式之胺基酸序列：S Y V L T Q P P S V S V A P G K T A R I P C(SEQ ID NO：265)；LFW2包含具有下式之胺基酸序列：W Y Q Q K P G Q A P V L I V F(SEQ ID NO：266)，W Y Q Q K P G Q A P V L I I M(SEQ ID NO：267)，W Y Q Q K P G Q A P V L I M F(SEQ ID NO：268)，W Y Q Q K P G Q A P V L V I M(SEQ ID NO：269)，W Y Q Q K P G Q A P V L I V Y(SEQ ID NO：270)，或W Y Q Q K P G Q A P V L V I Y(SEQ ID NO：271)，LFW3包含具有下式之胺基酸序列：G I P E R F S G S N S G N T A T L T I S R V E A G D E A D Y Y C(SEQ ID NO：272)；及LFW4包含具有下式之胺基酸序列：F G G G T K L T V L(SEQ ID NO：261)。
  20. 如請求項19之抗原結合蛋白質或其片段，其中：LFW2包含具有下式之胺基酸序列：W Y Q Q K P G Q A P V L I V F(SEQ ID NO：266；純系13NG0083)，W Y Q Q K P G Q A P V L I I M(SEQ ID NO：267；純系 13NG0073)，或W Y Q Q K P G Q A P V L I M F(SEQ ID NO：268；純系13NG0074)。
  21. 如請求項16至20中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其中該HCDR1、HCDR2及HCDR3位於生殖系構架VH1 DP14內。
  22. 如請求項16至21中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其中該LCDR1、LCDR2及LCDR3位於生殖系構架VL γ3 3H內。
  23. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質、抗體或其抗原結合片段，其包含：(1)包含SEQ ID NO：17之VL域，其含有選自由以下組成之群的取代中之一或多者：(a)M27I，(b)V28I，(c)A30S，(d)R31K，(e)I47V，(f)V48I，(g)F49Y，(h)E52G，(i)S95A，(j)D51N，(k)E52N，(l)D53N，(m)M27I及E52N，以及(n)M27I及E52G；及(2)包含SEQ ID NO：12之VH域；或包含HCDR之集合，即HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH域，其中：HCDR1包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；及HCDR3包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
  24. 如前述請求項中任一項之經分離抗原結合蛋白質或其片段，其中該抗原結合蛋白質或其片段具有一或多種選自由以下組成之群的特性：(a)與BAK1183H4抗體競爭結合於IL-13，其中該BAK1183H4抗體包含有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VL域； (b)以優於該BAK1183H4抗體之親和力結合人類IL-13，其中該BAK1183H4抗體包含有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VL域；及(c)以小於約80pM、小於約50pM、小於約20pM或小於約10pM之KD值結合人類IL-13。
  25. 如前述請求項中任一項之經分離抗原結合蛋白質或其片段，其中該抗原結合蛋白質為抗體。
  26. 如請求項25之經分離抗原結合蛋白質或其片段，其中該抗體為單株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體或其抗體片段。
  27. 如請求項26之經分離抗原結合蛋白質或其片段，其中該抗體片段為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子(scFv)。
  28. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其進一步包含選自由以下組成之群的重鏈免疫球蛋白恆定域：(a)IgA恆定域；(b)IgD恆定域；(c)IgE恆定域；(d)IgG1恆定域；(e)IgG2恆定域；(f)IgG3恆定域；(g)IgG4恆定域；及(h)IgM恆定域。
  29. 如請求項28之抗原結合蛋白質或其片段，其進一步包含選自由以下組成之群的輕鏈免疫球蛋白恆定域：(a)Ig κ恆定域；及 (b)Ig λ恆定域。
  30. 如請求項29之抗原結合蛋白質或其片段，其包含人類IgG1恆定域及人類λ恆定域。
  31. 如請求項28至30中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其中該抗體包含含有位置252、254及256處之突變的IgG1 Fc域，其中該位置編號係根據如Kabat中之EU索引。
  32. 如請求項31之抗原結合蛋白質或其片段，其中該IgG1 Fc域含有M252Y、S254T及T256E之突變，其中該位置編號係根據如Kabat中之EU索引。
  33. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其中該抗原結合蛋白質或其片段結合其中位置130處之精胺酸由麩醯胺酸置換之人類IL-13變異體。
  34. 如請求項1至31中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其中該抗原結合蛋白質或其片段結合其中位置105處之精胺酸由麩醯胺酸置換之人類IL-13變異體。
  35. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其結合非人類靈長類動物IL-13。
  36. 如請求項35之抗原結合蛋白質或其片段，其中該非人類靈長類動物IL-13為恆河猴(rhesus)或食蟹獼猴(cynomolgus)。
  37. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其結合包含人類IL-13蛋白質之位置106至位置132處之C端天冬醯胺的抗原決定基(DTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ ID NO：273))。
  38. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質或其片段，其結合包含人類IL-13蛋白質之位置99處之苯丙胺酸至位置132處之C端天冬醯胺的抗原決定基 (FSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ ID NO：274))。
  39. 一種如請求項1至38中任一項之抗原結合蛋白質或其片段之經分離抗體VH域。
  40. 一種如請求項1至38中任一項之抗原結合蛋白質或其片段之經分離抗體VL域。
  41. 一種組合物，其包含如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白質或其片段、抗體VH域或抗體VL域及至少一種其他組分。
  42. 如請求項41之組合物，其包含醫藥學上可接受之賦形劑、媒劑或載劑。
  43. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至40中任一項之抗原結合蛋白質或其片段或抗體VH或VL域。
  44. 一種足以用作雜交探針、PCR引子或測序引子之經分離聚核苷酸或cDNA分子，其為如請求項43之核酸分子之片段或其補體。
  45. 如請求項43之核酸分子，其中該核酸分子可操作地連接至控制序列。
  46. 一種載體，其包含如請求項45之核酸分子。
  47. 一種宿主細胞，其經如請求項43或45之核酸或如請求項46之載體活體外轉型。
  48. 如請求項47之宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
  49. 如請求項48之哺乳動物宿主細胞，其中該宿主細胞為NS0鼠類骨髓瘤細胞、PER.C6®人類細胞或中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)細胞。
  50. 一種融合瘤，其產生如請求項1至38中任一項之抗原結合蛋白質或其片段。
  51. 一種製造如請求項1至38中任一項之抗原結合蛋白質或其片段的方法，其包含在適用於製備抗原結合蛋白質或其片段的條件下培養如請求項47至49之宿主細胞或如請求項50之融合瘤。
  52. 如請求項51之方法，其進一步包含分離由該宿主細胞或融合瘤分泌之抗原結合蛋白質或其片段。
  53. 一種抗原結合蛋白質或其片段，其係使用如請求項52之方法產生。
  54. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至38或53中任一項之抗原結合蛋白質或其片段及醫藥學上可接受之賦形劑。
  55. 如請求項54之醫藥組合物，其係用作藥劑。
  56. 一種如請求項55之醫藥組合物之用途，其係用於治療與IL-13相關之疾病或病狀。
  57. 如請求項56之用途，其中該疾病或病狀為哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease；COPD)、特發性肺部纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis；IPF)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、休格連氏症候群(Sjögren's Syndrome)及霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)。
  58. 如請求項1至38或53中任一項之抗原結合蛋白質或其片段或如請求項54之醫藥組合物，其係用於治療選自由以下組成之群的疾病或病狀的方法中：哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺部纖維化(IPF)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、休格連氏症候群及霍奇金氏淋巴瘤。
  59. 如請求項54之醫藥組合物，其進一步包含標記基團或效應子基團。
  60. 如請求項59之醫藥組合物，其中該標記基團係選自由以下組成之群：同位素標記、磁性標記、氧化還原活性部分、光學染料、生物素化基團及可被諸如GFP或生物素之第二報導子識別之多肽抗原決定基。
  61. 如請求項59之醫藥組合物，其中該效應子基團係選自由以下組成之群：放射性同位素、放射性核種、毒素、治療劑及化學治療劑。
  62. 一種治療、預防及/或改善患者中與IL-13相關之疾病或病狀的方法，其包含投與有需要之患者有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含如請求項1至38或53中任一項之抗原結合蛋白質或其片段。
  63. 如請求項62之方法，其中該疾病或病狀係選自由以下組成之群：哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺部纖維化(IPF)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、纖維化、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、肝纖維化、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、休格連氏症候群及霍奇金氏淋巴瘤。
  64. 如請求項63之方法，其中該經分離抗原結合蛋白質或其片段係單獨或以組合療法形式投與。
  65. 一種降低個體中IL-13活性之方法，其包含投與有效量之如請求項1至38或53中任一項之抗原結合蛋白質或其片段或如請求項54之醫藥組合物。
  66. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至38或53中任一項之抗原結合蛋白質或其片段及抗IL-5R抗體或其抗原結合片段。
  67. 如請求項66之醫藥組合物，其中該抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH域及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL域，且其中 HCDR1包含SEQ ID NO：280之胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：281之胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：282之胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：283之胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：284之胺基酸序列；及LCDR3包含SEQ ID NO：285之胺基酸序列。
  68. 如請求項66或67之醫藥組合物，其中抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之胺基酸序列的VH域。
  69. 如請求項66至67中任一項之醫藥組合物，其中該抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列的VL域。
  70. 如請求項66至69中任一項之醫藥組合物，其中該抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列的VL域。
  71. 如請求項66至70中任一項之醫藥組合物，其中該抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含HCDR1、HDR2及HCDR3之VH域及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL域，其中a)HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含SEQ ID NO：13-15，且LCDR1、LCDR2及LCDR3分別包含SEQ ID NO：18-20；b)HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含SEQ ID NO：23-25，且LCDR1、LCDR2及LCDR3分別包含SEQ ID NO：28-30；或c)HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含SEQ ID NO：33-35，且LCDR1、LCDR2及LCDR3分別包含SEQ ID NO：38-40。
  72. 如請求項66至71中任一項之醫藥組合物，其中該抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含a)包含SEQ ID NO：12之VH域及包含SEQ ID NO：17之VL域； b)包含SEQ ID NO：22之VH域及包含SEQ ID NO：27之VL域；或c)包含SEQ ID NO：32之VH域及包含SEQ ID NO：37之VL域。
  73. 如請求項62至65中任一項之方法，其進一步包含投與患者抗IL-5R抗體或其抗原結合片段。
  74. 如請求項73之方法，其中該抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH域及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL域，且其中HCDR1包含SEQ ID NO：280之胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：281之胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：282之胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：283之胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：284之胺基酸序列；及LCDR3包含SEQ ID NO：285之胺基酸序列。
  75. 如請求項73或74之方法，其中抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之胺基酸序列的VH域。
  76. 如請求項73至75中任一項之方法，其中該抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列的VL域。
  77. 如請求項73至76中任一項之方法，其中該抗IL-5R抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：278之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列的VL域。
  78. 如請求項73至77中任一項之方法，其中該抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含有包含HCDR1、HDR2及HCDR3之VH域及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL域，其中a)HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含SEQ ID NO：13-15，且LCDR1、LCDR2及LCDR3分別包含SEQ ID NO：18-20；b)HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含SEQ ID NO：23-25，且 LCDR1、LCDR2及LCDR3分別包含SEQ ID NO：28-30；或c)HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含SEQ ID NO：33-35，且LCDR1、LCDR2及LCDR3分別包含SEQ ID NO：38-40。
  79. 如請求項73至78中任一項之方法，其中該抗IL-13抗體或其抗原結合片段包含a)包含SEQ ID NO：12之VH域及包含SEQ ID NO：17之VL域；b)包含SEQ ID NO：22之VH域及包含SEQ ID NO：27之VL域；或c)包含SEQ ID NO：32之VH域及包含SEQ ID NO：37之VL域。
  80. 如請求項73至79中任一項之方法，其中該抗IL-13抗體或其抗原結合片段及該抗IL-5R抗體或其抗原結合片段係同時投與。
  81. 如請求項73至79中任一項之方法，其中該抗IL-13抗體或其抗原結合片段及該抗IL-5R抗體或其抗原結合片段係依序投與。
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