TW201630915A - 一類ｔｏｌｌ樣受體７激動劑 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一類新穎的作為TLR7激動劑的吡咯並嘧啶環化合物或其藥學上可接受的鹽，用於過敏性鼻炎和哮喘的預防或治療。具體公開了式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽。 □

Description

一類TOLL樣受體7激動劑
本發明涉及一類作為TLR7激動劑的新穎的吡咯並嘧啶環化合物、其藥學上可接受的鹽、水合物或前藥，用於過敏性鼻炎和哮喘的預防或治療。具體涉及式(I)所示化合物、其藥學上可接受的鹽、水合物或前藥。
Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)在防禦微生物感染的天然免疫中具有重要作用。Toll樣受體的作用主要表現在通過監測到環境中的感染跡象，啟動先天免疫細胞從而調動消除入侵的病原體的防禦機制。這將導致多種細胞反應的發生，包括產生干擾素(IFNs)，介導促炎性細胞因數和效應細胞因數的適應性免疫應答。
小分子化合物能刺激先天免疫反應，其中通過Toll樣受體啟動I型干擾素和其它細胞因數，已成為人類疾病的治療或預防的重要策略。已經有文獻報導TLR7的小分子激動劑能夠在人和動物體內誘導產生干擾素 α。(Annu.Rev.Immunol；2003：21,335-76)不同TLR激動劑的回應情況取決於活化細胞的類型。
TLR7和TLR8高度同源。啟動TLR7能夠在人和動物體內誘導產生干擾素α，可以治療如過敏性哮喘和鼻炎等過敏性疾病和其他炎性病症，而啟動TLR8主要誘導產生腫瘤壞死因數α(TNF-α)和趨化因數等促炎細胞因數，可能導致嚴重的副作用。所以提高TLR7和TLR8之間的選擇性對TLR7激動劑的安全性至關重要。
過敏性疾病，主要由抗原特異性Th2細胞產生的細胞因數分泌失調引起，而Th2對過敏原的免疫應答又與特異性IgE的水準的升高密切相關。其中，通過其對肥大細胞的影響，導致了過敏原的超敏性，從而進一步導致可見症狀發生。健康個體對抗原的免疫應答(Th2/Th1)更加均衡，TLR7配體已經顯示出有減少Th2細胞因數並促進Th1細胞因數釋放的作用，能改善Th2型過敏性肺炎體內模型的炎症反應(J.All.Clin.Immunol.,2006：118,511-517；Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.,2006：290,L987-995；Chin.Med.J.,2006：119,640-648)。因此，TLR7配體擁有改善炎症個體的過敏應答的潛力，能夠對疾病起到治癒的作用。
TLR7激動劑的臨床研究已經多次證明，對同時患有過敏性鼻炎和過敏性哮喘患者的鼻內刺激能持續減少對變應原的回應(Respiratory Research,2012：13,53)。幾個TLR7激動劑已被道，如咪喹莫特，瑞喹莫德等。但具有更好的選擇性，治療效用和安全性的TLR7新穎的激動劑的開發仍然有很大需求。
WO2014/081645報導了一系列用於治療感染性疾病，如過敏 性鼻炎和哮喘的TLR7激動劑，這一系列化合物由式(II)表示： 其中R1選自無取代的C4-6的烷基或C1-2的烷氧基C1-2的烷基-；R2是氫或甲基；R3是氫，鹵素或C1-3的烷基；m代表2至4的整數；n代表0至3的整數；p代表0至2的整數。
GSK-2245035如式(Ⅲ)所示：
R848的結構如式(Ⅳ)所示：
本發明提供了式(I)所示化合物、其藥學上可接受的鹽、水合物或前藥， 其中，R選自任選被取代的C3-8烷基；m選自0、1、2、3或4；W選自任選被取代的：C3-8雜烷基、4~12元環烷基或雜環烷基或氨基酸；上述“雜”代表雜原子或雜原子團，分別獨立地選自O、S、N、C(=O)、S(=O)或S(=O)2；雜原子或雜原子團的數目分別獨立地選自0、1、2、3或4。
本發明的一些方案中，上述C3-8烷基、C3-8雜烷基、4~12元環烷基或雜環烷基的取代基分別獨立的選自F、Cl、Br、I、OH、CN、NH2、NH2C(=O)、C1-4烷基或C1-4雜烷基、4~6元烷基或雜烷基、4~6元雜烷基-C(=O)-，所述4~6元烷基或雜烷基任選被鹵素、NH2、OH、CN或C1-4烷基取代，“雜”如上述所定義。
本發明的一些方案中，上述C3-8烷基、C3-8雜烷基、4~12 元環烷基或雜環烷基的取代基分別獨立的選自F、Cl、Br、I、OH、CN、NH2、NH2C(=O)、Me、Et、、、、、，“雜”如上述所定義。
本發明的一些方案中，取代基的數目獨立地選自0、1、2或3。
本發明的一些方案中，上述的C3-8烷基選自：。
本發明的一些方案中，上述C3-8雜烷基選自：-N(C1-4烷基)(C1-4烷基)。
本發明的一些方案中，上述4~12元環烷基或雜環烷基選自或，D1選自N或C(Ra)，D2-5分別獨立地選自O、S、[C(Ra)(Rb)]1-2或N(Rc)，D3和D4中的1或2個還可以選自單鍵，Ra、Rb或Rc分別獨立地選自H、C1-4烷基、C1-4雜烷基、鹵素、OH、CN、NH2C(=O)，任意兩個Ra和Rb任選地連接到同一個原子上形成一個4~6元環烷基、氧雜4~6環烷基或氮雜4~6環烷基，所述4~6元環烷基任選地被1~3個C1-4烷基所取代。
本發明的一些方案中，上述W選自：
本發明的一些方案中，上述化合物選自：
本發明還提供了式(I)化合物的兩種製備方法，如下：
方法1：
方法2：
其中，SEM代表2-(三甲基矽)乙氧基甲基，是一種氨基保護基。
本發明還提供了上述化合物、其藥學上可接受的鹽、水合物或前藥在製備預防和治療過敏性疾病和其他炎性病症、感染性疾病或癌症的藥物中的應用。
本發明的一些方案中，上述疾病選自過敏性鼻炎。
本發明的一些方案中，上述疾病選自哮喘。
除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。
這裡所採用的術語“治療”或者是其語法等效的詞，當用於治療一個疾病時，表示的減慢或者阻止了這個疾病的進程，或者至少改善了這個疾病的一個症狀，更多的是改善了這個疾病的多個症狀。
這裡所採用的術語“藥學上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應 或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。
術語“藥學上可接受的鹽”是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或堿製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的堿與這類化合物的中性形式接觸的方式獲得堿加成鹽。藥學上可接受的堿加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機氨或鎂鹽或類似的鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物的中性形式接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括無機酸鹽，所述無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氫根，磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機酸鹽，所述有機酸包括如甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括氨基酸(如精氨酸等)的鹽，以及如葡糖醛酸等有機酸的鹽(參見Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977))。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能團，從而可以被轉換成任一堿或酸加成鹽。
本發明的藥學上可接受的鹽可由含有酸根或堿基的母體化合物通過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由游離酸或堿的形式，這些化合物與化學計量的適當的堿或酸反應來製備。一般地，優選醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈等非水介質。
除了鹽的形式，本發明所提供的化合物還存在前藥形式。本文所描述的化合物的前藥容易地在生理條件下發生化學變化從而轉化成本發明的化合物。此外，前體藥物可以在體內環境中通過化學或生化方法被轉換到本發明的化合物。
本發明的某些化合物可以以非溶劑化形式或者溶劑化形式 存在，包括水合物形式。一般而言，溶劑化形式與非溶劑化的形式相當，都包含在本發明的範圍之內。本發明的某些化合物可以以多晶或無定形形式存在。
術語“藥學上可接受的載體”是指能夠遞送本發明有效量活性物質、不干擾活性物質的生物活性並且對宿主或者患者無毒副作用的任何製劑或載體介質代表性的載體包括水、油、蔬菜和礦物質、膏基、洗劑基質、軟膏基質等。這些基質包括懸浮劑、增粘劑、透皮促進劑等。術語“賦形劑”通常是指配製有效的藥物組合物所需要載體、稀釋劑和/或介質。
針對藥物或藥理學活性劑而言，術語“有效量”或“治療有效量”是指無毒的但能達到預期效果的藥物或藥劑的足夠用量。組合物中一種活性物質的“有效量”是指與該組合物中另一種活性物質聯用時為了達到預期效果所需要的用量。有效量的確定因人而異，取決於受體的年齡和一般情況，也取決於具體的活性物質，個案中合適的有效量可以由本領域技術人員根據常規試驗確定。
術語“活性成分”、“治療劑”，“活性物質”或“活性劑”是指一種化學實體，它可以有效地治療目標紊亂、疾病或病症。
術語“被取代的”是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代。術語“任選被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有規定，取代基的種類和數目在化學上可以實現的基礎上可以是任意的。
烷基指的是含有特定數目原子的飽和碳-氫鏈。除特殊情況外，包含直鏈以及支鏈烷烴。比如，C1-6烷基可以是含有1、2、3、4、5或6個碳的飽和直鏈、支鏈的碳氫鏈，如乙基、異丙基；正C3-6烷基則是含有3至6個碳的飽和直鏈碳氫鏈，如正炳基、正丁基。
除非另有規定，術語“雜”表示雜原子或雜原子團(即含有雜原子的原子團)，包括碳(C)和氫(H)以外的原子以及含有這些雜原子的原子團，例如包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硼(B)、-O-、-S-、=O、=S、 -C(=O)O-、-C(=O)-、-C(=S)-、-S(=O)、-S(=O)2-，以及任選被取代的-C(=O)N(H)-、-N(H)-、-C(=NH)-、-S(=O)2N(H)-或-S(=O)N(H)-。
除非另有規定，雜烷基單獨或與其他詞語連用時，表示的是穩定的直鏈、支鏈或環狀的烴基及其組合物，含有所述碳原子數和至少一個雜原子。在其中一個示例方案中，雜原子選自O、N和S，其中N、S原子有可能是其氧化形式，N原子有可能是四級銨鹽形式。O、N和S原子可以處於雜烷基的任何位置或處於烷基與母體之間。
除非另有規定，“環”表示被取代或未被取代的環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、環炔基、雜環炔基、芳基或雜芳基。所謂的環包括單環、聯環、螺環、並環或橋環。環上原子的數目通常被定義為環的元數，例如，“5~11元環”是指環繞排列5、6、、8、9、10或11個原子。除非另有規定，該環任選地包含1、2或3個雜原子。因此，“5~11元環”包括例如苯基吡啶和呱啶基；另一方面，術語“5~11元雜環烷基環”包括吡啶基和呱啶基，但不包括苯基。術語“環”還包括含有至少一個環的環系，其中的每一個“環”均獨立地符合上述定義。
術語“鹵”或“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。
術語“保護基”包括但不限於“氨基保護基”。術語“氨基保護基”是指適合用於阻止氨基氮位上副反應的保護基團。代表性的氨基保護基包括但不限於：甲醯基；醯基，例如鏈烷醯基，如乙醯基基等；烷氧基羰基，如三級丁氧基羰基(Boc)等；芳基甲氧羰基，如苄氧羰基(Cbz)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)等；芳基甲基，如苄基(Bn)等；甲矽烷基，如三甲基甲矽烷基(TMS)和第三丁基二甲基甲矽烷基(TBS)等。
本發明中某些化合物可能包括手性原子和多重鍵，因此可能出現一種或多種立體異構的形式。包括在先前研發中的化合物無論是作為個體還是混合物的立體異構體，其中外消旋體也包括在內。
本發明中某些化合物可能出現所有的互變異構的形式。包括 先前的研究中無論化合物是作為個體還是混合物的所有互變異構體。
多晶是研發的化合物可以存在一種或者多種晶體結構的性質。已開發的化合物可能以各種晶形或者不定形的狀態存在，或者由於使用沉澱、結晶、凍幹、噴霧乾燥、蒸發乾燥等方法以固體塞，粉末，薄膜的形式存在。他們應該單獨的或者與已開發的一個或多個化合物結合的形式存在，抑或與其他一個或者多個藥物結合的形式存在。通常情況下，他們將會以與一個或多個可接受藥物賦形劑結合的形式存在。
本發明的化合物可以通過本領域技術人員所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。
本發明具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，所述的溶劑須適合於本發明的化學變化及其所需的試劑和物料。為了獲得本發明的化合物，有時需要本領域技術人員在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。
本發明所使用的所有溶劑可經市售獲得。
反應一般是在惰性氮氣下、無水溶劑中進行的。質子核磁共振資料記錄在Bruker Avance III 400(400MHz)分光儀上，化學位移以四甲基矽烷低場處的(ppm)表示。質譜是在安捷倫1200系列加6110(&1956A)上測定。LC/MS或Shimadzu MS包含一個DAD：SPD-M20A(LC)和Shimadzu Micromass 2020檢測器。質譜儀配備有一個正或負模式下操作的電噴霧離子源(ESI)。
本發明採用下述縮略詞：aq代表“含水的”；eq表示當量；SEM-Cl代表(2-(氯甲氧基)乙基)三甲基矽烷；SEM代表(2-(氯甲氧基)乙基)三甲基矽基，是胺的一種保護基；i-PrOH代表異丙醇；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DMF代表N,N-二甲基甲醯胺；EtOAc或EA代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；THF代表四氫呋喃； DMSO代表二甲基亞碸；MeCN或ACN代表乙腈；dioxane代表1,4-二氧六環；Boc2O代表二-三級丁基二碳酸酯；BOC代表三級丁氧羰基，是胺的一種保護基；CuI代表碘化亞銅；Pd(OH)2/C代表氫氧化鈀碳；Pd/C代表鈀碳；(NH4)2CO3代表碳酸銨；NaH代表氫化鈉；NH3．H2O代表氨水；Na代表金屬鈉；HATU代表O-(7-氮雜苯並三氮唑-1-YL)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟膦酸鹽；DMAP表示4-二甲氨基吡啶；TFA代表三氟乙酸；TFAA代表三氟乙酸酐；TEA代表三乙胺；DIEA或DIPEA代表二異丙基乙基胺；CO2代表二氧化碳氣體，或固體二氧化碳(即乾冰)；NIS代表N-碘代琥珀醯亞胺；Pd(PPh3P)2Cl2代表雙(三苯基膦)二氯化鈀；Pd(PPh3)4代表四(三苯基膦)鈀；Pd(t-Bu3P)2代表雙(三-三級丁基膦)鈀；LDA代表二異丙基氨基鋰；HCHO代表甲醛；NaBH(AcO)3代表三乙醯氧基硼氫化鈉；HOBt代表1-羥基苯並三氮唑；EDCI代表1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；DMP代表Dess-Martin氧化劑；m.w.或microwave代表微波反應；r.t.代表室溫。
化合物經人工或者ChemDraw®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。
用配有Shimadzu SIL-20A自動進樣器和日本島津DAD：SPD-M20A探測器的島津LC20AB系統進行高效液相色譜分析，採用Xtimate C18(3m填料，規格為2.1 x 300mm)色譜柱。0-60AB_6分鐘的方法：應用線性梯度，以100%A(A為0.0675% TFA的水溶液)開始洗脫，並以60% B(B為0.0625% TFA的MeCN溶液)結束洗脫，整個過程為4.2分鐘，然後以60% B洗脫1分鐘。將色譜柱再平衡0.8分鐘達到100：0，總執行時間為6分鐘。10-80AB_6分鐘的方法：應用線性梯度，以90%A(A為0.0675%TFA的水溶液)開始洗脫，並以80%B(B為0.0625%TFA的乙腈溶液)結束洗脫，整個過程為4.2分鐘，然後以80% B洗脫1分鐘。將色譜柱再平衡0.8分鐘達到90：10，總執行時間為6分鐘。柱溫為50℃，流速為0.8mL/min。二極體陣列檢測器掃描波長為200-400nm。
在Sanpont-group的矽膠GF254上進行薄層色譜分析(TLC)，常用紫外光燈照射檢出斑點，在某些情況下也採用其他方法檢視斑點，在這些情況下，用碘(10g矽膠中加入約1g碘並徹底混合而成)、香草醛(溶解大約1g香草醛於100mL 10% H2SO4中制得)、茚三酮(從Aldrich購得)或特殊顯色劑(徹底混合(NH4)6Mo7O24‧4H2O、5g(NH4)2Ce(IV)(NO3)6、450mL H2O和50mL濃H2SO4而制得)展開薄層板，檢視化合物。採用Still,W.C.；Kahn,M.；and Mitra,M.Journal of Organic Chemistry,1978,43,2923-2925.中所公開技術的類似方法，在Silicycle的40-63μm(230-400目)矽膠上進行快速柱色譜。快速柱色譜或薄層色譜的常用溶劑是二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/甲醇和己烷/乙酸乙酯的混合物。
在Gilson-281 Prep LC 322系統上採用吉爾森UV/VIS-156探測器進行製備色譜分析，所採用的色譜柱是Agella Venusil ASB Prep C18,5m，150 x 21.2mm；Phenomenex Gemini C18，5m，150 x 30mm；Boston Symmetrix C18,5m，150 x 30mm；或者Phenomenex Synergi C18，4m，150 x 30mm。在流速約為25mL/min時，用低梯度的乙腈/水洗脫化合物，洗脫劑如下：1)鹽酸方法：水(含體積比0.05%的鹽酸(鹽酸品質分數w%：33-37.5%))-乙腈體系；2)甲酸方法：水(含體積比0.2255%的甲酸)-乙腈體系；3)三氟乙酸方法：水(含體積比0.075%的三氟乙酸)-乙腈體系；4)鹼性氨水方法：水(含體積比0.05%的氨水(氨水品質分數w%：25-28%))-乙腈體系。
總執行時間為8-15分鐘。
與WO2014/081645相對比，本發明化合物的區別在於：(一) WO2014/081645中的R1是烷基，而本發明的化合物與之對應的是烷氧基。本發明發現，烷氧基替換烷基可以顯著提高藥效，改善藥代性。(二)WO2014/081645中的R2是氫或者甲基，而本發明的化合物與之對應的是氰基。本發明發現，氰基對提高藥效有至關重要的作用；而且兩者之間合成工藝差別很大，挑戰性也更大。
經驗證，本發明化合物具有非常強勁的誘導產生干擾素α的藥效，可用於預防或者治療過敏性鼻炎和哮喘，病毒感染，或者癌症等疾病。
為了更詳細地說明本發明，給出下列實例，但本發明的範圍並非限定於此。
式(I)由下面的通用路線來製備。
通用路線1：
以可購得的2,4-二氯-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶(1-1)為起始原料，首先與SEM-Cl反應，用保護基SEM取代氮上裸露的氫，再與氨水在較高溫度下(90-100℃)反應得到2-氯-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-4-胺(1-2)；由各種不同的醇(用ROH表示)與金屬鈉製備醇鈉，與化合物1-2在相應的醇中(例如與丁醇反應)製備醇取代的化合物1-3；再與NIS發生碘代反應得到化合物1-4；隨後， 該碘代物與各種末端炔烴發生鈀催化下的偶聯反應製備炔基取代的化合物(1-5)；接著在氫氧化鈀碳條件下催化加氫還原，並用Boc保護氨基得到化合物(1-6)；高純度的化合物1-6在-78℃下與LDA反應一段時間，比如1小時，然後用二氧化碳處理並適當酸化，得到由羧基取代的化合物(1-7)；再經由與碳酸銨的酸氨縮合反應而將羧酸轉化為醯胺；在三氟乙酸酐/三乙胺的條件下脫水，得到化合物1-8；經簡單的後處理，最後在三氟乙酸中室溫脫去保護基SEM，得到最終產物(1-9)。
化合物2-1裸露的氨基由Boc保護，簡單的打漿純化後，得 到帶有兩個Boc保護基的化合物2-2；該化合物在低溫下與LDA反應，然後持續通入乾燥的二氧化碳氣體，酸化後得到羧酸取代的化合物2-3；粗品2-3經醯胺化得到化合物2-4，化合物2-4可由多次打漿純化；然後用NIS碘代得到化合物2-5；在低溫下用三乙胺和三氟乙酸酐條件脫水得到氰基化合物2-6；粗品2-6用較稀的三氟乙酸的二氯甲烷溶液處理，脫除保護基Boc後得到中間體2-7；該化合物與氯代的脂肪端炔經由Sonogashira交叉偶聯反應得到化合物2-8；接著催化氫化得到中間體2-9；此中間體與各種氨發生烷基化反應，再用三氟乙酸脫除保護基SEM，經製備HPLC分離純化得到最終產物2-11。
化合物3-1與端基脂肪炔醇發生Sonogashira交叉偶聯反應得到化合物3-2；催化氫化得到相應的飽和醇(3-3)；化合物3-3經DMP氧化得到相應的醛3-4；接著與各種氨發生還原氨化反應得到化合物3-5；該化合物在三氟乙酸條件下脫除保護基SEM，經由製備HPLC分離純化得到最終產物3-6。
通用路線4：
4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(4-1)與端基炔發生交叉偶聯反應得到7-炔基取代化合物(4-2)，然後依次經過催化氫化和脫除保護基團SEM兩個步驟得到最終產物(4-4)。
本領域技術人員應該知道，為了製備本發明化合物，反應路線中反應步驟的順序可以是不同的，這也屬於本發明的範圍。
為清楚起見，發明進一步用實施例來闡述。但是實施例不局限于定義或者指定發明範圍。
實例1-3由通用路線1來製備。
實例1：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(呱啶-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
實例1由以下合成路線製備。
步驟A：2,4-二氯-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶的合成。
2,4-二氯-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶(4.0克，21.39毫莫耳)溶解在30毫升無水四氫呋喃中。在氮氣保護，0攝氏度下，分批加入氫化鈉(60%品質含量，1.03克，25.75毫莫耳)。反應物室溫下攪拌30分鐘，再次冷卻至0攝氏度，滴加(2-(氯甲氧基)乙基)三甲基矽烷(3.9克，23.49毫莫耳)。加完後，反應液在室溫下攪拌2小時，加水120毫升淬滅，並用乙酸乙酯萃取(100毫升×2)。將合併的有機層用飽和碳酸鈉水溶液和鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮。濃縮物通過矽膠柱色譜法(洗脫梯度：乙酸乙酯/石油醚5%至10%)純化，得到黃色固體2,4-二氯-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(5.8克，收率：85.55%)。MS(ESI)m/z：318[M+H+]。
步驟B：2-氯-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-4-胺的合成。
在1000毫升高壓釜中，依次加入2,4-二氯-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(5克，15.77毫莫耳)，15毫升異丙醇和250毫升氨水。反應混合物在100-110攝氏度下攪拌3小時，隨後自然冷卻到室溫，用250毫升水稀釋後過濾，得到2-氯-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-4-胺(4.0克，粗品)。產物為白色固體，直接用於一步反應。MS(ESI)m/z：299[M+H+]。
步驟C：4-氨基-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶的合成。
氮氣保護下，向55毫升無水丁醇中加入金屬鈉(1.24克，53.91毫莫耳)，室溫攪拌至完全溶解後，再加入4-氨基-2-氯-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基吡咯並[3,2-d]嘧啶(4.0克，13.42毫莫耳)。該反應混合物加熱至100攝氏度並持續攪拌8小時。自然冷卻到室溫後，反應混合物緩慢倒入200毫升水中，並用乙酸乙酯萃取(100毫升×3)。將合併的有機相用鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥後過濾，濾液減壓濃縮。殘餘物通過矽膠柱色譜純化(洗脫梯度：乙酸乙酯/石油醚：15%至25%)，得到 4-氨基-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(4.1克，收率：90.91%)，產物為黃色固體。MS(ESI)m/z：337[M+H+]。
步驟D：4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶的合成。
4-氨基-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(40.00克，119.0毫莫耳)溶解在500毫升四氫呋喃中，在零攝氏度氮氣保護下，分三批加入NIS(32.13克，142.8毫莫耳)。加完後，反應液在30攝氏度下攪拌2小時。TLC監測到原料反應完全。將反應液倒入1000毫升飽和硫代硫酸鈉水溶液中並繼續攪拌10分鐘，隨後用乙酸乙酯萃取(300毫升×2)。將合併的有機相用飽和食鹽水洗滌(200毫升×2)，經無水硫酸鈉乾燥、過濾後，濾液減壓濃縮，得到4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(40.00克，收率：72.70%)，產物是黃色固體，直接用於下一步反應。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)：δ7.22(s,1H),5.95(br.s.,2H),5.45-5.37(m,2H),4.48-4.36(m,2H),3.67-3.56(m,2H),1.86-1.75(m,2H),1.53(t,J=7.4Hz,2H),1.06-0.92(m,5H),0.01(s,9H)。
步驟E：4-氨基-2-丁氧基-7-[5-(1-呱啶基)戊-1-炔基]-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶的合成。
氮氣保護下，向三口燒瓶中依次加入4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(4.00克，8.65毫莫耳)，5-(1-呱啶基)-1-戊炔(1.57克，10.38毫莫耳)，二氯雙(三苯基膦)鈀(607毫克，865.00微莫耳)和三乙胺(2.63克，25.95毫莫耳)和60毫升乙腈。該反應體系用氮氣置換3次後，在30攝氏度下攪拌12小時。將反應物過濾，濾液減壓濃縮。殘餘物通過矽膠色譜法純化(柱高度：250毫米，直徑：100毫米，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=3/1，0/1)，得到4-氨基-2-丁氧基-7-[5-(1-呱啶基)戊-1-炔基]-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(2.00克，收率：47.60%)。MS(ESI) m/z：486[M+H+]。
步驟F：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊-1-炔基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(2.10克，4.32毫莫耳)溶解在30毫升甲醇中，氮氣保護下，加入氫氧化鈀碳(品質含量10%，0.20克)。反應體系用氫氣置換5次，然後在30攝氏度，氫氣壓力50psi下攪拌在下48小時。LCMS檢測反應完全。反應物過濾，濾餅用甲醇反復洗滌，濾液合併後減壓濃縮，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(1.80克，收率：85.43%，產品為褐色油狀物，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：490[M+H+]。
步驟G：4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(798.33毫克，1.63毫莫耳)和三乙胺(494.82毫克，4.89毫莫耳)溶於20毫升無水二氯甲烷中，分批加入BOC酸酐(1.07克，4.89毫莫耳)。加完後，反應液在30攝氏度下攪拌12小時。TLC監測反應完全後，將反應液減壓濃縮。殘餘物經矽膠色譜法純化(柱高度：250毫米，直徑：20毫米，100-200目矽膠，二氯甲烷/甲醇=100/1)，得到4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(600.00毫克，收率：53.35%)，產物為黃色油狀物，直接用於下一步反應。
步驟H：4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d] 嘧啶-6-羧酸甲酸鹽的合成。
在氮氣保護下，向三口燒瓶中加入4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(400.00毫克，579.71微莫耳)和10毫升四氫呋喃。將該溶液冷卻至-70攝氏度，緩慢滴加LDA(1M的四氫呋喃溶液，1.74毫升)。反應混合物在-70℃下攪拌1小時後，迅速倒入乾冰中，並用氣球密封。反應混合物繼續攪拌30分鐘並自然升至室溫，混合物用飽和氯化銨水溶液淬滅，隨後用乙酸乙酯萃取(30毫升×3)。將有機相用30毫升飽和食鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥過濾後，減壓濃縮。粗產品經過製備HPLC(甲酸體系)純化，得到4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-羧酸甲酸鹽(100.00毫克，收率：22.11%)。MS(ESI)m/z：734[M+H+]。
步驟I：4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺的合成。
向4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-羧酸(80.00毫克，108.99微莫耳)的DMF(2毫升)溶液中，依次加入碳酸銨(104.73毫克，1.09毫莫耳)，三乙胺(27.57毫克，272.48微莫耳)和HATU(62.16毫克，163.49微莫耳)。反應混合物在氮氣保護下，於30攝氏度攪拌12小時，然後倒入20毫升水中，並用乙酸乙酯萃取(20毫升×3)。將合併的有機相用20毫升飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮。殘餘物經製備TLC純化(DCM/MeOH=5/1)，得到4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺(60毫克，粗品)。MS(ESI)m/z：733[M+H+]。
步驟J：4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
在氮氣保護，向三口燒瓶中依次加入4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺(60.00毫克，81.85微莫耳)、三乙胺(372.72毫克，3.68毫莫耳)和2毫升二氯甲烷。0攝氏度下，逐滴加入三氟乙酸酐(343.83毫克，1.64毫莫耳)。滴加完畢後，反應物於30攝氏度攪拌12小時，然後用20毫升水稀釋並用二氯甲烷萃取(10毫升×3)。將合併的有機相用10毫升飽和食鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮，得到4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(60.00毫克，粗品)。產物為淡黃色固體。MS(ESI)m/z：715[M+H+]。
步驟K：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(60.00毫克，83.91微莫耳，)溶解於2毫升三氟乙酸中，反應物在氮氣保護，30攝氏度下攪拌5小時。隨後，減壓下濃縮除去三氟乙酸。殘餘物用飽和碳酸氫鈉水溶液鹼化至pH=8左右，並用乙酸乙酯萃取(10毫升×3)。有機相經無水硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，剩餘物由製備HPLC(甲酸條件)分離純化，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽(19.00毫克)。產物為白色固體。1H NMR(400MHz,METHANOL-d 4 )：δ8.18(s,1H),4.38(t,J=6.5Hz,2H),3.65-3.42(m,3H),3.12-3.00(m,2H),2.85(t,J=7.3Hz,3H),2.03-1.70(m,12H),1.63-1.37(m,4H),1.01(t,J=7.4Hz,3H)。MS(ESI)m/z：385[M+H+]。
實例：1-(戊-1’-炔基)呱啶的製備。
將5-氯-1-戊炔(4.00克，39.00毫莫耳)和呱啶(16.60克，195.01毫莫耳)在60攝氏度下攪拌12小時。TLC監測顯示反應完成。該反應物緩慢冷卻至室溫後，倒入30毫升水中並攪拌10分鐘，再用乙酸乙酯萃取(30毫升×3)。將合併的有機相用水洗滌(30毫升×3)，經無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮，得到5-(1-呱啶基)-1-戊炔(5.20克，收率：88.15%)，產物為黃色液體。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)：δ2.42-2.29(m,6H),2.19(dt,J=2.6,7.2Hz,2H),1.92(t,J=2.6Hz,1H),1.73-1.66(m,2H),1.58-1.53(m,4H),1.44-1.37(m,2H)。
實例2：4-氨基-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(呱啶-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
步驟A：4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例1的製備中使用的方法，步驟C，D，E，F， G，H，I，J製備。其中將丁醇替換成(S)-1-甲基丁醇。
步驟B：4-氨基-2-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-(雙(三級丁氧基羰基)氨基)-2-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(30.00毫克，54.87微莫耳)溶解於2毫升二氯甲烷中，隨後加入0.5毫升三氟乙酸。反應混合物在室溫下攪拌12小時，LC-MS檢測反應完全後，將之緩慢倒入30毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，並用二氯甲烷萃取(20毫升×3)。將合併的有機相用飽和食鹽水洗滌(5毫升×2)，再經無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮，得到的4-氨基-2-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(30毫克，粗品)，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：529[M+H+]。
步驟C：4-氨基-2-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
將4-氨基-2-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(30.00毫克，56.73微莫耳)溶於2毫升四氫呋喃中，一次性加入四丁基氟化銨(1M的四氫呋喃溶液，0.13毫升)。反應混合物在60攝氏度下攪拌12小時。LC-MS監測反應完全後，將反應混合物自然冷卻至室溫，隨後緩慢倒入10毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，然後用乙酸乙酯萃取(10毫升×3)。合併的有機相用飽和食鹽水洗滌(5毫升×2)，經無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮。殘餘物經製備型HPLC(甲酸體系)純化，得到4-氨基-2-((S)-1-甲基丁氧基)-7-(5-(1-呱啶基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽(3.80毫克，收率：16.81%)。產物為白色固體。 1 H NMR(METHANOL-d4,400MHz)：δ8.56(br.s.,1H),5.23(dd,J=6.3,12.6Hz,1H),2.89-3.22(m,6H), 2.84(t,J=7.3Hz,2H),1.38-1.95(m,16H),1.33(d,J=6.0Hz,3H),0.97(t,J=7.2Hz,3H).MS(ESI)m/z：399[M+H+]。
實例3：4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-1-基)丁基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-1-基)丁基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例1的製備中使用的方法，步驟E，F，G，H，I，J，K製備。其中將5-(1-呱啶基)-1-戊炔替換成4-(1-呱啶基)-1-丁炔。1H NMR(400MHz,METHANOL-d 4 )：δ8.49(brs.,1H),4.34(t,J=6.5Hz,2H),3.32-2.65(m,8H),1.96-1.45(m,14H),1.01(t,J=7.4Hz,3H)。
實例：4-(1-呱啶基)-1-丁炔的製備。
4-溴-1-丁炔(2.00克，15.04毫莫耳)溶解於2毫升丙酮中，冷卻至0攝氏度後，再依次加入呱啶(1.28克，15.04毫莫耳)和碳酸銫(4.90克，15.04毫莫耳)。反應混合物在0攝氏度下攪拌5分鐘後緩慢升至室溫，並繼續攪拌2小時。將混合物倒入20毫升水中，然後用二氯甲烷萃取(20毫升×2)。合併的有機相用水洗滌(30毫升×3)，經無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮後得到4-(1-呱啶基)-1-丁炔(600.00毫克，4.37毫莫耳，收率：29.07%)。產品為棕黑色液體。1H NMR(400MHz, CHLOROFORM-d)：δ2.63-2.56(m,2H),2.49-2.37(m,6H),1.99(t,J=2.7Hz,1H),1.61(m,4H),1.50-1.41(m,2H)。
實例4-19由下面的通用路線2來製備。
實例4：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(嗎啉-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
實例4由以下合成路線製備。
步驟A：4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶的合成。
4-氨基-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(50克，148.59毫莫耳)溶解於300毫升乾燥的四氫呋喃中，隨後在攪拌下依次加入三乙胺(16.54克，163.45毫莫耳)和4-N,N’-二甲氨基吡啶(907.65毫克，7.43毫莫耳)。將Boc2O(113.50克，0.52莫耳)溶解在另外200毫升的乾燥四氫呋喃中，控制溫度在20攝氏度左右，將該溶液緩慢滴加至前述反應液中。滴加完成後，反應液在20攝氏度下持續攪拌16小時。LC-MS監測反應轉化完全。將該反應室溫下液倒500毫升飽和的碳酸氫鈉水溶液中，並用500毫升乙酸乙酯萃取。有機相依次用500毫升飽和氯化銨水溶液和500毫升水洗滌，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾後減壓蒸餾除去溶劑。將餘下的固體置於300毫升正己烷中，強攪拌1小時後過濾。濾餅減壓乾燥後得到白色粉末狀固體4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(67.00克，124.83毫莫耳，收率：84.01%)。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ：7.46(d,J=3.1Hz,1H),6.55(d,J=3.3Hz,1H),5.38(s, 2H),4.38(t,J=6.6Hz,2H),3.34-3.46(m,2H),1.75-1.89(m,2H),1.47-1.58(m,2H),1.41(s,18H),0.97(t,J=7.4Hz,3H),0.88(dd,J=9.0,7.7Hz,2H),0.00(s,9H)。
步驟B：4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-羧酸的合成。
將4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶(87.00克，162.09毫莫耳)在溶解在870毫升乾燥的四氫呋喃中，氮氣保護下冷卻-65攝氏度。隨後控制反應體系內溫度不高於-60攝氏度，緩慢滴加2M的(二異丙基)-胺基鋰(LDA)的正己烷溶液(121.57毫升，243.14毫莫耳)。滴加完成後，控制反應體系溫度在-60攝氏度左右，並持續攪拌1小時。然後，同樣地，反應體系溫度控制在不高於-60攝氏度範圍內，持續有效地攪拌下，將乾燥的二氧化碳氣體緩慢通入反應液中，直至LC-MS監測反應完全(約持續通入氣體2小時)。反應液用800毫升飽和氯化銨水溶液緩慢淬滅，並升至室溫。隨後用800毫升乙酸乙酯萃取。有機相用800毫升氯化銨水溶液洗滌兩次，並用500毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸餾除去溶劑，得到的紅色油狀物為4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-羧酸(94.13克，粗品)，並直接用於下一步反應。MS(m/z)：581[M+H+]。
步驟C：4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺的合成。
將上一步得到的94.13克粗品4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-羧酸溶解在600毫升四氫呋喃中，室溫下依次加入HOBt(21.90克，162.09毫莫耳)和EDCI(31.07克，162.09毫莫耳)。該混合物在30-40攝氏度下攪拌1小時。0攝氏度下，將氨氣通入的四氫呋喃溶液中至飽和，並在30-40攝氏度下，將250毫升該氨溶液緩慢滴加至前述混合物中。滴加完成 後，反應液控制內溫在30-40攝氏度範圍內，持續攪拌16小時，至LC-MS監測反應已經完全。然後用800毫升飽和氯化銨水溶液淬滅反應，並用800毫升乙酸乙酯萃取。有機相用飽和氯化銨水溶液洗滌(800毫升×2)，用500毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，經無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓蒸餾除去溶劑得到褐黃色固體剩餘物。該固體剩餘物置於150毫升體積比正己烷：乙酸乙酯=10：1的混合溶液中，強攪拌1小時後過濾。濾餅經減壓乾燥後得到4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺(55.80克，96.25毫莫耳，兩步收率：59.38%)。產品為黃色固體粉末。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ：6.94(s,1H),5.81(s,2H),4.39(t,J=6.6Hz,2H),3.43-3.56(m,2H),1.79-1.88(m,2H),1.48-1.57(m,2H),1.42(s,18H),0.98(t,J=7.4Hz,3H),0.85-0.92(m,2H),0.00(s,9H)。
步驟D：4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺的合成。
將4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺(55.80克，96.25毫莫耳)溶解於560毫升DMF中，室溫攪拌下分批加入NIS(43.31克，192.50毫莫耳)。加入完成後，該反應混合物升溫至60-70攝氏度，並在該溫度下持續攪拌72小時。LC-MS監測反應完全後，將反應液冷卻至室溫，攪拌下緩慢傾倒入1500毫升飽和的硫代硫酸鈉水溶液中，並用500毫升乙酸乙酯萃取。有機相依次用500毫升0.5M的氫氧化鈉水溶液洗滌兩次，300毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，經無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓蒸餾除去溶劑後得到褐色固體剩餘物。該固體剩餘物置於100毫升體積比正己烷：乙酸乙酯=15：1的混合溶液中，強攪拌1小時後過濾。濾餅經減壓乾燥後得到4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺(51.00克，72.27毫莫耳， 收率：75.09%)。產物未淺黃褐色粉末。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ：6.60(br.s.,1H),6.14(br.s.,1H),5.71(s,2H),4.46(t,J=6.6Hz,2H),3.43-3.54(m,2H),1.78-1.90(m,2H),1.53(d,J=7.5Hz,2H),1.41(s,18H),0.99(t,J=7.3Hz,3H),0.81-0.93(m,2H),0.00(s,9H)。
步驟E：4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
持續攪拌下，將4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-甲醯胺(51.00克，72.27毫莫耳)溶解至500毫升乾燥的二氯甲烷中，並一次性加入三乙胺(36.57克，361.35毫莫耳)。反應體系在氮氣保護下，維持反應體系內溫在0攝氏度，緩慢滴加三氟乙酸酐(37.95克，180.68毫莫耳)，約需滴加半小時。滴加完成後，將反應液緩慢升溫至20攝氏度，並繼續攪拌16小時。LC-MS監測反應完全後，將該反應液用依次500毫升飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次，500毫升飽和氯化銨水溶液洗滌兩次，飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，經無水硫酸鈉乾燥後過濾。減壓蒸餾除去溶劑後得到黃色油狀物為4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(49.70克，粗品)，並直接用於下一步反應。MS(m/z)：688[M+H+]。
步驟F：4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將49.70克4-((雙-三級丁氧羰基)-氨基)-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈粗品溶解於440毫升無水二氯甲烷中，在20-25攝氏度下緩慢加入84.15克三氟乙酸。反應混合物維持在20-25攝氏度下持續攪拌20小時。TLC監測反應完全後，減壓蒸餾除去溶劑。剩餘物溶解在600毫升二氯甲烷中，用飽和碳酸氫鈉水溶液將混合物的pH值調節至8-9。分離有機相，並用300毫升飽和的氯化鈉水溶液洗滌，經無水硫酸鈉乾燥後過濾，減壓蒸餾至乾燥。剩 餘物置於250毫升體積比正己烷：乙酸乙酯=10：1的混合溶液中，強攪拌1小時後過濾。濾餅經減壓乾燥後得到4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(30.80克，58.77毫莫耳，兩步收率：81.31%)。產物為黃色固體。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ：6.08(br.s.,2H),5.64(s,2H),4.39(t,J=6.6Hz,2H),3.67-3.76(m,2H),1.73-1.86(m,2H),1.48-1.56(m,2H),0.95-1.04(m,5H),0.00(m,9H)。
步驟G：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氯-1-戊炔基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
乾燥的三口燒瓶經氮氣反復置換後，依次加入125毫升乾燥的乙腈、4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(10克，20.52毫莫耳)、三乙胺(6.23克，61.56毫莫耳)、碘化亞銅(390.74毫克，2.05毫莫耳)和Pd(PPh3)2Cl2(1.44克，2.05毫莫耳)。反應體系經氮氣置換3次，並在持續的氮氣保護下，室溫(25攝氏度)攪拌16小時。LC-MS監測反應完全後，將反應混合物過濾。濾餅重新溶解在120毫升二氯甲烷中。隨後加入約5克活性炭，室溫下攪拌1小時後過濾。濾餅經二氯甲烷反復洗滌至TLC監測無螢光物。所有濾液合併後用稀氨水洗滌(200毫升×3)。有機相經無水硫酸鈉乾燥後過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑。剩餘物置於80毫升體積比正己烷：乙酸乙酯=20：1的混合溶液中，強攪拌1小時後過濾。濾餅經減壓乾燥後得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氯-1-戊炔基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(8.20克，14.73毫莫耳，收率：71.78%)。產物為灰白色固體。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ：5.59(s,2H),4.38(t,J=6.6Hz,2H),3.81(t,J=6.3Hz,2H),3.64-3.72(m,2H),2.75(t,J=6.8Hz,2H),2.13(t,J=6.5Hz,2H),1.74-1.84(m,2H),1.51(d,J=7.5Hz,2H),0.94-1.04(m,5H),0.00(s,9H)。
步驟H：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氯-1-戊基)-5-((2-(三甲 基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氯-1-戊炔基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(8.00克，17.16毫莫耳)置於400毫升乙醇中，氮氣置換3次後，一次性加入10%的幹鈀碳(6.00克)。然後氫氣置換3次後，該反應混合物在氫氣壓力50psi環境，40攝氏度下持續攪拌16小時。TLC監測反應完全後，反應混合物冷卻至室溫，經矽藻土過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌(200毫升×3)。合併的濾液減壓蒸餾至乾燥，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氯-1-戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(8.00克，17.16毫莫耳)。產物為灰白色固體。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ：5.57(s,2H),4.33(t,J=6.6Hz,2H),3.64-3.71(m,2H),3.54(t,J=6.7Hz,2H),2.85(t,J=7.5Hz,2H),1.74-1.90(m,6H),1.46-1.55(m,4H),0.94-1.03(m,5H),0.00(s,9H)。
步驟I：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(嗎啉-1-基)-戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氯-1-戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(100.00毫克，214.55微莫耳)溶解於5毫升乙腈中，依次加入嗎啡林(56.07毫克，643.65微莫耳)，三乙胺(21.71毫克，214.55微莫耳)和碘化鈉(3.22毫克，21.46微莫耳)。反應混合物升溫至75-85攝氏度，並持續攪拌14小時。反應液冷卻至室溫後，用20毫升水稀釋，並用乙酸乙酯萃取(20毫升×2)。合併的有機相用30毫升飽和食鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮，得到的4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(嗎啉-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(102.00毫克，粗品)，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：517[M+H+]。
步驟J：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-嗎啉基)-戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-嗎啉基)-戊基)-5-((2-(三甲 基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(102毫克，粗品)溶解於2毫升三氟乙酸中。該反應混合物在15-20攝氏度下攪拌14小時。LC-MS監測反應完全後，減壓蒸餾除去溶劑。剩餘物由製備HPLC(甲酸方法)純化，冷凍乾燥後得到47.89毫克4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-嗎啉基)-戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。 1 H NMR(METHANOL-d4,400MHz)：δ8.32(br.s.,2H),4.33(t,J=6.6Hz,2H),3.88(d,J=4.3Hz,4H),3.21(br.s.,4H),3.08-3.02(m,2H),2.82(t,J=7.3Hz,2H),1.83-1.72(m,6H),1.55-1.39(m,4H),0.99(t,J=7.4Hz,3H).MS(ESI)m/z：387[M+H+]。
實例5：7-(5-(2-氧雜-6-氮雜螺[3.3]庚烷-6-基)戊基)-4-氨基-2-丁氧基-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-氧雜-6-氮雜螺[3.3]庚烷-6-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-氧雜-6-氮雜螺[3.3]庚烷-6-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例4的製備中使用的方法，步驟I製備。其中將嗎啡啉替換成2-氧雜-6-氮雜螺[3.3]庚烷。MS(ESI)m/z：529[M+H+]。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-氧雜-6-氮雜螺[3.3]庚烷-6-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
向4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-氧雜-6-氮雜螺[3.3]庚烷-6-基) 戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(49.00毫克，92.67微莫耳)的四氫呋喃(2.00毫升)溶液中加入四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(1M,185.34微升)。反應混合物加熱至60攝氏度，並持續攪拌14小時。冷卻至室溫後，將反應混合物倒入20毫升水中，並用二氯甲烷/甲醇(10/1，20毫升×2)萃取。合併的有機相用30毫升飽和食鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮。剩餘物溶於4毫升甲醇中，並加入70毫克碳酸鉀，在40攝氏度下攪拌1小時，冷卻後過濾；濾液減壓濃縮後，剩餘物經製備HPLC(甲酸條件)分離純化，冷凍乾燥後得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-氧雜-6-氮雜螺[3.3]庚烷-6-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽(15.59毫克，收率37.84%)，產物為白色固體。1H NMR(METHANOL-d4,400MHz)：δ8.33(br.s.,2H),4.78(s,4H),4.46-4.17(m,6H),3.16-3.05(m,2H),2.81(t,J=7.3Hz,2H),1.82-1.69(m,4H),1.63-1.36(m,6H),0.99(t,J=7.4Hz,3H).MS(ESI)m/z：399[M+H+]。
實例6：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-甲基呱嗪-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-甲基呱嗪-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例4的製備中使用的方法，步驟I，J製備。其中將嗎啡啉替換成4-甲基呱嗪。1H NMR(METHANOL-d4,400MHz)：δ8.23(d,J=14.4Hz,2H),4.41-4.26(m,2H),3.29-2.83(m,8H),2.83-2.70(m,4H),2.62(s,3H),1.82-1.70(m,4H),1.70-1.60(m,2H),1.56-1.46(m,2H), 1.45-1.36(m,2H),0.99(t,J=7.4Hz,3H).MS(ESI)m/z：400[M+H+]。
實例7：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(5-甲基-2,5-二氮雜雙環[2,2.1]庚烷-2-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(5-甲基-2,5-二氮雜雙環[2.2.1]庚烷-2-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例4的製備中使用的方法，步驟I，J製備。其中將嗎啡啉替換成5-甲基-2,5-二氮雜雙環[2.2.1]庚烷。 1 H NMR(METHANOL-d4,400MHz)：δ8.26(br.s.,2H),4.34(t,J=6.5Hz,2H),3.88(d,J=18.3Hz,2H),3.22-2.77(m,7H),2.68(s,3H),2.17-2.02(m,2H),1.82-1.71(m,4H),1.70-1.14(m,7H),0.99(t,J=7.4Hz,3H).MS(ESI)m/z：412[M+H+]。
實例8：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(二乙胺基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(二乙胺基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例4的製備中使用的方法，步驟I，J製備。其中將嗎啡啉替換成二乙胺鹽酸鹽，並將三乙胺的用量增加至3當量。 1 H NMR(METHANOL-d4,400MHz)：δ8.37(br.s.,2H),4.32(t,J=6.6Hz,2H),3.20(q,J=7.3Hz,4H),3.14-3.05(m,2H),2.84(t,J=7.3Hz,2H),1.86-1.67(m,6H),1.56-1.39(m,4H),1.29(t,J=7.3Hz,6H),0.99(t,J=7.3Hz,3H).MS(ESI)m/z：373[M+H+]。
實例9：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4,4’-二氟-1-呱啶基)-戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4,4’-二氟-1-呱啶基)-戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例4的製備中使用的方法，步驟I，J製備。其中將嗎啡啉替換成4,4’-二氟呱啶。 1 H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.21(s,1H),4.37(t,J=6.5Hz,2H),3.37(t,J=5.5Hz,4H),3.15-3.07(m,2H),2.82(t,J=7.4Hz,2H),2.31(tt,J=6.1,12.7Hz,4H),1.83-1.72(m,6H),1.55-1.40(m,4H),0.99(t,J=7.4Hz,3H).MS(ESI)m/z：421[M+H+]。
實例10：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-四氫喹啉基)-戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-四氫喹啉基)-戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例4的製備中使用的方法，步驟I，J製備。其中將嗎啡啉替換成四氫喹啉。 1 H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.45(br.s.,1H),6.89-6.97(m,1H),6.84(d,J=7.4Hz,1H),6.53(d,J=8.3Hz,1H),6.46(t,J=7.3Hz,1H),4.33(t,J=6.6Hz,2H),3.18-3.29(m,4H),2.84(t,J=7.3Hz,2H),2.69(t,J=6.3Hz,2H),1.84-1.93(m,2H),1.72-1.83(m,4H),1.64(t,J=7.5Hz,2H),1.47-1.54(m,2H),1.40(t,J=7.5Hz,2H),0.99(t,J=7.4Hz,3H)。MS(ESI)m/z：433[M+H+]。
實例11：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-甲基-2-氧代呱嗪-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
實例11由以下合成路線製備：
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-苄氧羰基-2-氧代-呱嗪-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-苄氧羰基-2-呱嗪酮(190.00毫克，811.97微莫耳)溶解在5毫升無水四氫呋喃中，在氮氣保護下，0攝氏度時一次性加入氫化鈉(60%品質含量，35.73毫克，893.16微莫耳)。反應液在保持在0攝氏度攪拌1小時，隨後加入4-氨基-2-丁氧基-7-[5-(1-氯)戊基]-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(250毫克，537.63微莫耳)。反應液自然升至室溫後持續攪拌24小時，隨後用5毫升飽和氯化銨水溶液淬滅，並加入20毫升水稀釋，然後用乙酸乙酯萃取(20毫升×2)。合併的反應液用飽和食鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮濾液。剩餘物用製備TLC(二氯甲烷：甲醇=15：1)純化，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-苄氧羰基-2-氧代-呱嗪-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(220mg，收率：61.62%)。MS(ESI)m/z： 663[M+H+]。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-氧代呱嗪-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-苄氧羰基-2-氧代-呱嗪-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(200.00毫克，303.10微莫耳)溶於10毫升乙醇和5毫升甲醇的混合溶劑中。氬氣保護下加入幹鈀碳(100毫克)。反應混合物在氫氣壓力50psi，10-15攝氏度下持續攪拌36小時，然後經矽藻土過濾，濾液減壓濃縮後得到的黃色液體為4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-氧代呱嗪-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(130.00mg，粗品)，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：530[M+H+]。
步驟C：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-甲基-2-氧代-呱嗪-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-氧代呱嗪-1-基)戊)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(130.00毫克，245.40微莫耳)溶解在3毫升四氫呋喃中，依次加入甲醛(22.11毫克，736.20微莫耳)，醋酸硼氫化鈉(130.03毫克，613.50微莫耳)和催化量的醋酸。反應混合物在15-20攝氏度下攪拌3小時後，倒入10毫升飽和碳酸氫鈉的水溶液中，並用10毫升乙酸乙酯萃取。有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾減壓濃縮得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-甲基-2-氧代-呱嗪-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(150.00mg，粗品)，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：544[M+H+]。
步驟D：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-甲基-2-氧代-呱嗪-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-甲基-2-氧代-呱嗪-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(150.00 毫克，275.85微莫耳)溶解於1.5毫升三氟乙酸中。該溶液在15-20攝氏度下攪拌12小時後，減壓濃縮除去三氟乙酸後，加入30毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中和，隨後用30毫升乙酸乙酯萃取。有機相經無水硫酸鈉乾燥後，過濾減壓濃縮得到褐色固體。將該固體溶於10毫升甲醇中，隨後加入120毫克碳酸鉀，該混合物在40-50攝氏度下攪拌一小時後，過濾。濾液減壓濃縮，剩餘物經製備HPLC(甲酸方法)純化後得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(4-甲基-2-氧代-呱嗪-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽(23.50毫克，46.74微莫耳，收率：16.94%)。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)：δ8.21(br.s.,1H),4.39(t,J=6.6Hz,2H),3.45-3.36(m,4H),3.14(s,2H),2.87-2.72(m,4H),2.40(s,3H),1.83-1.72(m,4H),1.64-1.51(m,4H),1.38-1.32(m,2H),1.01(t,J=7.4Hz,3H)。MS(ESI)m/z：414[M+H+]。
實例12：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲醯胺基-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲氧羰基-吡咯烷-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氯-1-戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(100毫克，214.55微莫耳)加入至3毫升乙腈中，隨後依次加入2-(S)-脯氨酸甲酯鹽酸鹽(71.07毫克，429.10微莫耳)、碳酸鉀(88.96毫克，644.64微莫耳)和碘化鈉(3.22 毫克，21.46微莫耳)。反應混合物在75-85攝氏度下攪拌14小時後，LC-MS監測氯代物尚未反應完全。另外補加碳酸鉀(88.96毫克，644.64微莫耳)後，反應混合物在75-85攝氏度下繼續攪拌14小時。LC-MS監測氯代物的轉化率達到72%。反應液冷卻至室溫後，倒入20毫升水中，並用乙酸乙酯萃取(20毫升×2)。合併的有機相用30毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌後，經無水硫酸鈉乾燥並過濾。濾液減壓蒸餾除去溶劑，乾燥後得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲氧羰基-吡咯烷-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(115.00毫克，粗品)，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：559[M+H+]。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲氧羰基-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲氧羰基-吡咯烷-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(115.00毫克，粗品)溶解於2毫升三氟乙酸中，在15-20攝氏度下攪拌14小時。LC-MS監測反應完成。減壓蒸餾除去溶劑後，剩餘物倒入30毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，並用二氯甲烷萃取(20毫升×2)。合併的有機相經無水硫酸鈉乾燥並過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑，乾燥後得到88.00毫克4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲氧羰基-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的粗品，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：429[M+H+]。
步驟C：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
室溫下，4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲氧羰基-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(88.00毫克，粗品)溶解於5毫升甲醇中，一次性加入一水合氫氧化鋰(17.25毫克，410.70微莫耳)。反應混合物在室溫下攪拌14小時。LC-MS監測反應完成。反應液倒入20毫升飽和氯化銨水溶液中，並用體積比10/1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液 萃取(20毫升×3)。合併的有機相由無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸餾除去溶劑。剩餘物由製備HPLC純化(甲酸方法)，凍幹後得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(22.07毫克，純度：97%)。產物為白色固體。 1 H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.22(s,1H),4.34(t,J=6.6Hz,2H),3.85(dd,J=6.2,9.2Hz,1H),3.72(ddd,J=3.8,7.1,11.1Hz,1H),3.28-3.19(m,1H),3.15-3.04(m,2H),2.80(t,J=7.4Hz,2H),2.42(qd,J=8.7,13.5Hz,1H),2.17-2.04(m,2H),2.00-1.90(m,1H),1.83-1.69(m,6H),1.55-1.39(m,4H),0.99(t,J=7.4Hz,3H)。
步驟D：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲醯胺基-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
室溫下，4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(50.00毫克，120.63微莫耳)溶解於3毫升DMF中，依次加入碳酸銨(115.91毫克，1.21毫莫耳)、三乙胺(24.41毫克，241.25微莫耳)和HATU(68.76毫克，180.95微莫耳)，隨後密封。反應混合物在40-50攝氏度下攪拌16小時。LC-MS監測反應完成。反應液用20毫升水稀釋，並用乙酸乙酯萃取(20毫升×2)。有機相合併，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後濾液減壓蒸餾除去溶劑。剩餘物經製備HPLC分離純化(甲酸方法)，冷凍乾燥後得到20毫克4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(S)-甲醯胺基-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈，產物為白色固體。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 4.50(t,J=6.5Hz,2H),4.18(dd,J=7.0,9.2Hz,1H),3.77(dd,J=4.0,7.2,11.3Hz,1H),3.29-3.12(m,3H),2.83(t,J=7.4Hz,2H),2.66-2.49(m,1H),2.26-1.96(m,3H),1.87-1.67(m,6H),1.59-1.40(m,4H),1.02(t,J=7.4Hz,3H)。MS(ESI)m/z：414[M+H+]。
實例13：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(R)-甲醯胺基-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(R)-甲醯胺基-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例12的製備方法，步驟A，B，C，D合成。其中將2-(S)-脯氨酸甲酯鹽酸鹽替換成2-(R)-脯氨酸甲酯鹽酸鹽。 1 H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ4.53(t,J=6.53Hz,2H),4.17(dd,J=7.03,9.03Hz,1H),3.72-3.82(m,1H),3.12-3.28(m,3H),2.83(t,J=7.40Hz,2H),2.51-2.63(m,1H),1.97-2.26(m,3H),1.67-1.88(m,6H),1.40-1.59(m,4H),1.02(t,J=7.40Hz,3H)。MS(ESI)m/z：414[M+H+]。
實例14：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(N,N’-二甲基甲醯胺基)-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2--羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H- 吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例12的製備方法，步驟A，B，C合成。其中將2-(S)-脯氨酸甲酯替換成2-(R,S)-脯氨酸甲酯。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(N,N’-二甲基甲醯胺基)-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-(N,N’-二甲基甲醯胺基)-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例12的製備方法，步驟D合成。其中將碳酸銨替換成二甲胺鹽酸鹽。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.41(br.s.,2H),4.59(dd,J=6.6,9.5Hz,1H),4.34(t,J=6.5Hz,2H),3.80-3.78(m,1H),3.25-3.10(m,3H),3.07(s,3H),3.03(s,3H),2.83(t,J=7.3Hz,2H),2.69-2.55(m,1H),2.26-2.14(m,1H),2.04-1.93(m,2H),1.86-1.67(m,6H),1.58-1.38(m,4H),1.01(t,J=7.4Hz,3H).MS(ESI)m/z：442[M+H+]。
實例15：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-((2-(4-甲基呱嗪-1-基羰基))-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2--羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2--羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例12的製備方法，步驟A，B，C合成。其中將2-(S)-脯氨酸甲酯替換成2-(R,S)-脯氨酸甲酯。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-((2-(4-甲基呱嗪-1-基羰 基))-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-((2-(4-甲基呱嗪-1-基羰基))-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例12的製備方法，步驟D合成。其中將碳酸銨替換成4-甲基呱嗪。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.29(br.s.,3H),4.61(dd,J=6.6,9.0Hz,1H),4.35(t,J=6.6Hz,2H),3.87-3.49(m,5H),3.27-3.08(m,3H),2.84(t,J=7.3Hz,2H),2.74-2.54(m,5H),2.46(s,3H),2.28-2.15(m,1H),2.10-1.95(m,2H),1.86-1.68(m,6H),1.59-1.40(m,4H),1.01(t,J=7.4Hz,3H)。MS(ESI)m/z：497[M+H+]。
實例16：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-((2-環丙乙胺基羰基)-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-羧酸-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例12的製備方法，步驟A，B，C合成。其中將2-(S)-脯氨酸甲酯替換成2-(R,S)-脯氨酸甲酯。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-((2-環丙乙胺基羰基)-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-((2-環丙乙胺基羰基)-吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例12的製備方法，步 驟D合成。其中將碳酸銨替換成環丙基甲胺。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.66(br.s.,1H),4.59(t,J=6.5Hz,2H),4.18(br.s.,1H),3.79(br.s.,1H),3.28-3.12(m,5H),2.85-2.72(m,2H),2.63-2.53(m,1H),2.24-2.00(m,3H),1.89-1.68(m,6H),1.59-1.43(m,4H),1.06-0.94(m,4H),0.57-0.51(m,2H),0.28-0.22(m,2H).MS(ESI)m/z：468[M+H+]。
實例17：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-甲醯胺基-呱啶-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈鹽酸鹽。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(2-甲醯胺基-呱啶-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈鹽酸鹽根據實例12的製備方法，步驟A，B，C，D合成。其中將2-(S)-脯氨酸甲酯鹽酸鹽替換成2-(R，S)-呱啶甲酸甲酯鹽酸鹽。並由製備HPLC分離純化(鹽酸方法)，冷凍乾燥後得到產物。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 4.59(t,J=6.5Hz,2H),3.91(dd,J=2.9,12.1Hz,1H),3.72-3.65(m,1H),3.18-3.01(m,3H),2.87-2.80(m,3H),2.21(d,J=14.6Hz,1H),1.95-1.45(m,14H),1.03(t,J=7.4Hz,3H)。MS(ESI)m/z：428[M+H+]。
實例18：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-((1-甲醯胺基-1’-異丙基)-胺基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈鹽酸鹽。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-((1-甲醯胺基-1’-異丙基)-胺基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈鹽酸鹽根據實例12的製備方法，步驟A，B，C，D合成。其中將2-(S)-脯氨酸甲酯鹽酸鹽替換成2-氨基-3-甲基-丁酸甲酯。並由製備HPLC分離純化(鹽酸方法)，冷凍乾燥後得到產物。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 4.56(t,J=6.6Hz,2H),3.74(d,J=5.0Hz,1H),3.05-2.92(m,2H),2.86-2.83(m,2H),2.31-2.22(m,1H),1.88-1.69(m,6H),1.59-1.43(m,4H),1.14(d,J=6.9Hz,3H),1.09(d,J=6.9Hz,3H),1.03(t,J=7.4Hz,3H)。MS(ESI)m/z：416[M+H+]。
實例19：4-氨基-2-丁氧基-7-(6-(四氫吡咯-1-基)己基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(6-氯-1-己基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(6-氯-1-己基)-5-((2-(三甲基甲矽烷 基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例4的製備方法，步驟G，H合成。其中將5-氯-1-戊炔替換成6-氯-1-己炔。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(6-(四氫吡咯-1-基)己基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(6-(四氫吡咯-1-基)己基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例4的製備方法，步驟I，J合成。其中將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氯-1-戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈替換成4-氨基-2-丁氧基-7-(6-氯-1-己基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈，同時將嗎啡啉替換成四氫吡咯。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.40(s,2H),4.34(t,J=6.6Hz,2H),3.33(td,J=1.6,3.3Hz,4H),3.21-3.11(m,2H),2.82(t,J=7.3Hz,2H),2.08(br.s.,4H),1.86-1.67(m,6H),1.59-1.39(m,6H),1.01(t,J=7.3Hz,3H).MS(ESI)m/z：385[M+H+]。
實例20-21由通用路線3製備。
實例20：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(四氫吡咯-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈鹽酸鹽。
實例20由以下合成路線製備。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-羥戊基-1-炔基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(1.5克，3.08毫莫耳)，4-戊炔-1-醇(0.52克，6.15毫莫耳)，二氯雙(三苯基膦)鈀(43.2毫克，61.55微莫耳)，碘化亞銅(58.61毫克，307.75微莫耳)和三乙胺(0.93克，9.23毫莫耳)置於25毫升乙腈中。反應體系用氮氣置換後，在15-20攝氏度下攪拌14小時。將反應混合物倒入50毫升水中，用50毫升乙酸乙酯萃取兩次。合併的有機相用50毫升飽和氯化銨水溶液洗滌一次，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮。殘餘物通過矽膠色譜法純化(柱高度：250毫米，直徑：100毫米， 100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=3/1，1/1)，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-羥戊基-1-炔基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(1.20克，收率：87.83%)。MS(ESI)m/z：444[M+H+]。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-羥基戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-羥戊基-1-炔基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(1.20克，2.71毫莫耳)溶解在40毫升乙醇中，氮氣保護下，一次性加入50毫克10%的幹鈀碳。反應體系用氫氣置換5次，然後在氫氣壓力15psi，15-20攝氏度下攪拌14小時。TLC監測反應完全。反應混合物經矽藻土過濾，濾餅用二氯甲烷反復洗滌5次，濾液合併後減壓濃縮，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-羥基戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(1.10克，收率：90.77%)。產品為黃色固體，直接用於下一步反。MS(ESI)m/z：448[M+H+]。
步驟C：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氧代戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-羥基戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(0.85克，1.90毫莫耳)溶解在50毫升二氯甲烷中，降溫至0~5攝氏度，依次加入飽和碳酸氫鈉(34毫升)，TEMPO(597.19毫克，3.80毫莫耳)，溴化鉀(384.14毫克，3.23毫莫耳)和次氯酸鈉水溶液(1.3M，4.38毫升)。反應混合物在0-5攝氏度下攪拌1小時後，倒入50毫升飽和硫代硫酸鈉水溶液中，並用二氯甲烷萃取(50毫升×2)。合併的有機相依次用50毫升飽和硫代硫酸鈉水溶液洗滌一次，飽和氯化銨水溶液洗滌3次(50毫升×3)，並用75毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氧代戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(600毫克，粗品)。產品為黃色固體，直接用於下 一步反應。MS(ESI)m/z：446[M+H+]。
步驟D：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(吡咯烷-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-氧代戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(130毫克，291.72微莫耳)與吡咯烷(41.49毫克，583.44微莫耳)溶於5毫升四氫呋喃中，依次加入三乙醯氧基硼氫化鈉(154.57毫克，729.30微莫耳)和醋酸(2-3滴)。該反應混合物在15-20攝氏度下攪拌14小時後，倒入30毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，然後用乙酸乙酯萃取(20毫升×2)。合併的有機相用30毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(吡咯烷-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(146毫克，粗品)，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：501[M+H+]。
步驟E：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈鹽酸鹽的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(吡咯烷-1-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(146.00毫克，291.56微莫耳)溶解於2毫升三氟乙酸中，在15-20攝氏度下攪拌14小時後，緩慢倒入30毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，並用乙酸乙酯萃取(20毫升×2)。合併的有機相用30毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌後，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。剩餘物經製備HPLC(鹽酸方法)分離純化，冷凍乾燥後得到的白色固體為4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(吡咯烷-1-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈鹽酸鹽(53.03毫克，收率：49.09%)。1H NMR(METHANOL-d4,400MHz)：δ 4.57(t,J=6.5Hz,2H),3.65(br.s.,2H),3.23-3.16(m,2H),3.08(d,J=7.3Hz,2H),2.82(t,J=7.4Hz,2H),2.19-2.10(m,2H),2.08-1.99(m,2H),1.86-1.69(m,6H),1.50(dt,J=7.7,15.3Hz,4H),1.01(t,J=7.4Hz,3H)。MS(ESI)m/z：371[M+H+]。
實例21：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(8-甲基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-3-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
實例21由以下合成路線製備。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(8-三級丁氧羰基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-3-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(8-三級丁氧羰基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-3-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例20的製備方法，步驟D合成。其中將吡咯烷替換 成8-三級丁氧羰基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛烷。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-3-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(8-三級丁氧基羰基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-3-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(140.00毫克，218.1微莫耳)溶於8毫升二氯甲烷與1毫升三氟乙酸的混合溶劑中，在10-20攝氏度下攪拌14小時後，緩慢倒入30毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，並用二氯甲烷萃取(20毫升×2)。合併的有機相用30毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-3-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(110毫克，粗品)，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：542[M+H+]。
步驟C：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(3-甲基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-8-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-3-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(110毫克，203.03微莫耳)溶於5毫升四氫呋喃中，依次加入三乙醯氧基硼氫化鈉(154.57毫克，729.30微莫耳)，37%甲醛水溶液(12.19毫克，406.06微莫耳)和催化量的醋酸。反應混合物在15-20攝氏度下攪拌14小時後，倒入30毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，然後用乙酸乙酯萃取(25毫升×2)。合併的有機相用30毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(3-甲基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-8-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(110毫克，粗品)，直接用於下一步反應。MS(ESI)m/z：556[M+H+]。
步驟D：4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(3-甲基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-8-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(3-甲基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-8-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(110.00毫克，197.90微莫耳)溶解於2毫升三氟乙酸中。反應混合物在15-20攝氏度下攪拌14小時。反應液減壓濃縮，剩餘物倒入30毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，用體積比10/1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液萃取3次(20毫升×3)。合併的有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮。剩餘物經製備HPLC(甲酸方法)分離純化，冷凍乾燥後得到的黃色固體為4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(3-甲基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-8-基)戊基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽(24.80毫克，收率：26.57%)。1H NMR(METHANOL-d4,400MHz)：δ 8.33(s,2H),4.34(t,J=6.6Hz,2H),3.80(br.s.,2H),2.88-2.78(m,4H),2.76(s,3H),2.48-2.38(m,4H),2.14-1.93(m,4H),1.79-1.70(m,4H),1.55-1.46(m,4H),1.42-1.34(m,2H),0.99(t,J=7.4Hz,3H).MS(ESI)m/z：426[M+H+]。
實例22-25由通用路線4來製備。
實例22：4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-2-基)丁基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(2-(1-三級丁氧羰基)-呱啶基)-丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d] 嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(2-(1-三級丁氧羰基)-呱啶基)-丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例1的合成方法，步驟E，F。其中將4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶替換成4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈，將1-(戊-1’-炔基)呱啶替換成4-(2-(1-三級丁氧羰基)-呱啶基)-1-丁炔。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-2-基)丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(2-(1-三級丁氧羰基)-呱啶基)-丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(900.00毫克，1.50毫莫耳)溶解在2毫升三氟乙酸和20毫升二氯甲烷的混合液中，並在室溫下攪拌12小時。LC-MS監測反應轉化完全。反應液用20毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中和後，用二氯甲烷萃取(30毫升×3)。合併的有機相經無水硫酸鈉乾燥後，過濾。濾液減壓蒸餾除去溶劑，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-2-基)丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(700.00毫克，粗品)。產品為白色固體，直接用於下一步反應。
步驟C：4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-2-基)丁基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-2-基)丁基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例4的合成方法，步驟J。其中將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-嗎啉基)-戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈替換成4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-2-基)丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ8.42(br.s.,1H),4.34(t,J=6.53Hz,2H),3.38(br.s., 1H),2.91-3.14(m,2H),2.84(t,J=7.15Hz,2H),1.34-2.10(m,16H),1.01(t,J=7.40Hz,3H).MS(ESI)m/z：371[M+H+]。
實例：4-(2-(1-三級丁氧羰基)-呱啶基)-1-丁炔的製備。
4-(2-(1-三級丁氧羰基)-呱啶基)-1-丁炔。
將4-(2-(1-三級丁氧羰基)-呱啶基)-1-丁醛(1.70克，7.04毫莫耳)溶解在30毫升無水甲醇中，室溫下加入1-重氮基-1-二甲氧基磷醯基-丙酮(1.35克，7.04毫莫耳)。反應混合物在室溫下攪拌12小時。TLC監測反應完全。反應混合物用30毫升水淬滅，並用的氯甲烷萃取(30毫升×3)。合併的有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後濾液減壓蒸餾除去溶劑，得到4-(2-(1-三級丁氧羰基)-呱啶基)-1-丁炔。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ 4.32(d,J=4.02Hz,1H),4.00(br.s.,1H),3.69(s,1H),2.77(t,J=12.67Hz,1H),2.17(td,J=3.14,7.53Hz,1H),1.94-2.04(m,1H),1.24-1.83(m,17H)。
實例23：4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(1-(1-氮甲基羰基)呱啶-2-基)丁基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(2-(1-氮甲基羰基)-呱啶基)-丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧 啶-6-腈的合成。
氮氣保護下，將4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(呱啶-2-基)丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(200.00毫克，399.40微莫耳)和三乙胺(60.62毫克，599.10微莫耳)溶解於10毫升無水二氯甲烷中，逐滴加入氮甲基甲醯氯(44.82毫克，479.28微莫耳)。滴加完成後，反應混合物在室溫下攪拌1小時。LC-MS監測反應完全。反應混合物用20毫升飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅，並用二氯甲烷萃取(30毫升×3)。合併的有機相用無水硫酸鈉乾燥，並過濾。濾液經減壓蒸餾除去溶劑後，得到4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(2-(1-氮甲基羰基)-呱啶基)-丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(200毫克，粗品)，直接用於下一步反應。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(1-(1-氮甲基羰基)呱啶-2-基)丁基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(1-(1-氮甲基羰基)呱啶-2-基)丁基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例4的合成方法，步驟J。其中將4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(1-嗎啉基)-戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈替換成4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(2-(1-氮甲基羰基)-呱啶基)-丁基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈。1H NMR(300MHz,METHANOL-d4)δ 8.20(s,1H),4.39(t,J=6.53Hz,2H),4.12(br.s.,1H),3.77(d,J=12.80Hz,1H),2.70-2.95(m,6H),1.46-1.88(m,12H),1.19-1.44(m,3H),1.01(t,J=7.40Hz,3H)。MS(ESI)m/z：428[M+H+]。
實例24：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-(1-甲基-4-呱啶)丙基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈根據實例1的合成方法，步驟E，F。其中將4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶替換成4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈，將1-(戊-1’-炔基)呱啶替換成3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)丙炔。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-(1-甲基-4-呱啶)丙基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
4-氨基-2-丁氧基-7-(3-(1-甲基-4-呱啶)丙基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽根據實例21的合成方法，步驟B，C，D。其中4-氨基-2-丁氧基-7-(5-(8-三級丁氧基羰基-3,8-二氮雜雙環[3.2.1]辛-3-基)戊基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈替換成4-氨基-2-丁氧基-7-(3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈。 1 H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.51(br.s.,1H),4.31(t,J=6.5Hz,2H),3.43(d,J=12.3Hz,2H),2.93(t,J=12.2Hz,2H),2.83-2.77(m,5H),1.97(d,J=14.3Hz,2H),1.81-1.34(m,11H),0.99(t,J=7.4Hz,3H).MS m/z：371[M+H+]。
實例：3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)丙炔的製備。
3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)丙炔。
3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)丙炔由下面的合成路線製備。
步驟A：2-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)乙醇的合成。
將2-(4-呱啶基)乙醇(3.00克，23.22毫莫耳)溶解於30毫升二氯甲烷中。15-20攝氏度下，向此溶液中緩慢分批加入(Boc)2O(5.22克，23.92毫莫耳)。加完後，反應混合物在室溫下攪拌20小時。TLC檢測反應完成後，將此反應液緩慢倒入50毫升水中，並用二氯甲烷萃取(50毫升×2)。合併的有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮。殘餘物經矽膠柱層析純化(柱高度：250毫米，直徑：20毫米，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=3/1，1/1)，得到2-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)乙醇(4.89克，產率91.83%)，產物為無色液體。
步驟B：2-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)乙醛的合成。
2-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)乙醇(4.89克，21.32毫莫耳)溶解在50毫升二氯甲烷中，隨後一次性加入Dess-Martin氧化劑(9.95克，23.46毫莫耳)。反應混合物在室溫下攪拌2小時，隨後反應液倒入250毫升10%的硫代硫酸鈉水溶液和150毫升飽和碳酸氫鈉水溶液的混合溶液中，並持續攪拌45分鐘，然後用二氯甲烷萃取(100毫升×3)。合併的有機相依次用150毫升飽和碳酸氫鈉水溶液和150毫升飽和氯化鈉水溶液洗 滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮。得到的2-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)乙醛(4.85克，粗品)，直接用於下一步反應。
步驟C：3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)丙炔的合成。
2-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)乙醛(4.85克，21.34毫莫耳)溶解在50毫升甲醇中，並加入碳酸鉀(5.90克，42.68毫莫耳)。該混合物在室溫下攪拌5分鐘後，逐滴加入(1-重氮基-2-氧代丙基)膦酸二甲酯(4.10克，21.34毫莫耳)。滴加完成後，反應混合物在室溫下持續攪拌17小時，然後倒入250毫升二氯甲烷和50毫升飽和碳酸氫鈉水溶液的混合液中。分離出的有機相經矽藻土墊過濾後濃縮。剩餘物用50毫升乙酸乙酯溶解，溶液通過矽膠墊過濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌(30毫升×3)。合併的濾液減壓濃縮幹後得到3.92克3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)丙炔。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ 4.12(d,J=3.5Hz,2H),2.69(t,J=11.8Hz,2H),2.15(dd,J=2.6,6.7Hz,2H),1.99(t,J=2.6Hz,1H),1.76(d,J=13.3Hz,3H),1.46(s,9H),1.20(dq,J=4.4,12.3Hz,2H)。
實例25：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-(1-甲基-4-呱啶)-3’-羥基-丙基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。
實例24由下面的合成路線製備。
步驟A：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)烯丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將3-(1-三級丁氧羰基-4-羥基-4-呱啶基)-1-丙烯(400.00毫克，1.66毫莫耳)和4-氨基-2-丁氧基-7-碘-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(734.79毫克，1.51毫莫耳)溶於15毫升乾燥二氧六環中，然後一次性加入N，N-二異丙基乙胺(386.17毫克，2.99毫莫耳)和二(三-三級丁基磷)鈀(16.97毫克，33.20微莫耳)。反應體系經氮氣置換3次，並在持續的氮氣保護下，維持體系內溫度為130攝氏度，微波條件下攪拌30分鐘。LCMS監測反應完成後，將反應混合物冷卻至室溫，隨後倒入50毫升飽和碳酸氫鈉水溶液中，並用60毫升乙酸乙酯萃取。有機相經80毫升飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮。剩餘物經製備HPLC(三氟乙酸體系)分離純化，冷凍乾燥後得到的黃色固體為4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)烯丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(160.00毫克，266.30微莫耳，收率：16.04%)。
步驟B：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4- 呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)烯丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(230.0毫克，382.81微莫耳)溶解於25毫升四氫呋喃中，氮氣置換3次後一次性加入10%幹鈀碳(100毫克)。然後體系再用氫氣置換3次，反應混合物在氫氣壓力15psi，10-15攝氏度下持續攪拌14小時。LCMS監測反應完成。反應混合物經矽藻土過濾，濾液減壓蒸餾除去溶劑，得到的黃色固體為4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(190.00毫克，粗品)，並直接用於下一步反應。
步驟C：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-(4-呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(100.00毫克，165.88微莫耳)溶解於500微升三氟乙酸和4毫升二氯甲烷的混合溶劑中。反應液維持在10-15攝氏度下持續攪拌4.5小時。LCMS監測反應完成。將反應液用20毫升飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅，並用15毫升二氯甲烷萃取。有機相減壓濃縮後得到的黃色固體為4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-(4-呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(80.00毫克，粗品)，並直接用於下一步反應。
步驟D：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-(1-甲基-4-呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-(4-呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(80.00毫克，159.13微莫耳)溶解於5毫升四氫呋喃中，依次加入甲醛(14.34毫克，477.39 微莫耳)，乙酸(9.56毫克，159.13微莫耳)和醋酸硼氫化鈉(84.32毫克，397.83微莫耳)。反應液維持在10-15攝氏度下持續攪拌2小時。LCMS監測反應完成。將反應液用15毫升水淬滅，並用20毫升二氯甲烷萃取。有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮後得到的黃色固體為4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-(1-甲基-4-呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(90.00毫克，粗品)，並直接用於下一步反應。
步驟E：4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-(1-甲基-4-呱啶基)丙基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽的合成。
將4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-(1-甲基-4-呱啶基)丙基)-5-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈(90.00毫克，174.17微莫耳)溶解於1.5毫升三氟乙酸中，反應液維持在10-15攝氏度下持續攪拌5小時。LCMS監測反應完成。殘餘物減壓濃縮去除大部分三氟乙酸後，經製備HPLC(甲酸方法)分離純化，冷凍乾燥後得到28.27毫克4-氨基-2-丁氧基-7-(3-羥基-(1-甲基-4-呱啶基)丙基)-5H-吡咯並[3,2-d]嘧啶-6-腈甲酸鹽。 1 H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ 8.24(br.s.,1H),4.36(t,J=6.5Hz,2H),3.33-3.22(m,4H),2.91-2.80(m,5H),1.90-1.72(m,8H),1.64-1.47(m,4H),1.01(t,J=8.0Hz,3H)。MS(ESI)m/z：387[M+H+]。
實例：3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)-1-丙烯的合成。
3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)-1-丙烯。
將1-三級丁氧羰基-4-呱啶酮(2.50克，12.55毫莫耳)溶解於25毫升乾燥四氫呋喃中，反應體系在氮氣保護下，維持反應體系內溫 在0攝氏度，緩慢滴加丙烯基溴化鎂(1M，16.30毫升)，約在1小時左右滴加完。隨後反應混合物在0攝氏度下持續攪拌2小時至TLC板監測反應轉化完全。反應液用80毫升飽和氯化銨水溶液淬滅後自由升至室溫，隨後用100毫升乙酸乙酯萃取。有機相用100毫升飽和食鹽水洗滌一次，經無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓濃縮。剩餘物通過矽膠柱色譜法純化(柱高度：100毫米，直徑：50毫米，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=4/1,2/1)，得到的3-羥基-3-(1-三級丁氧羰基-4-呱啶基)-1-丙烯(750.0毫克，3.11毫莫耳，收率：19.08%)。產物為黃色液體。1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ 5.93-5.83(m,1H),5.27-5.14(m,2H),3.83(br.s.,2H),3.18(br.s.,2H),2.25(d,J=7.5Hz,2H),1.61-1.50(m,4H),1.48(s,9H)。
生物實驗。
實驗1：Toll樣受體7體外受體結合活性篩選方案。
試劑：HEK-blue hTLR7細胞、DMEM培養基、熱滅活胎牛血清、抗支原體試劑Normocin、博來黴素、殺稻瘟菌素。
方案：
1. 96孔化合物板的準備：利用液體工作站POD將化合物從10毫莫耳/升濃度起始，用DMSO做3倍梯度稀釋，共稀釋10個點(從第2列到底11列，每個點2個重複)。在第12列加入1微升5毫莫耳/升的陽性化合物R848作為陽性對照，在第1列加入1微升DMSO作為陰性對照。每孔中含有的DMSO體積都是1微升。
2. 收取細胞培養瓶中的細胞，將細胞密度稀釋成250,000個細胞/毫升。
3. 加入200微升(50,000個細胞/孔)細胞懸液至準備好的化合物板中。每孔中DMSO終濃度為0.5%。
4. 將含有細胞和化合物的培養板放入CO2培養箱中培養24小時，培養條件為37℃，5% CO2濃度。
5. 培養24小時後，從細胞培養板中每孔取出20微升上清液轉移到一塊96孔透明檢測板中。然後往檢測板中每孔加入180微升Quanti-Blue試劑，並置於37度，5% CO2培養箱孵育1小時。
6. 1小時後，用酶標儀OD650讀板檢測20微升上清液中鹼性磷酸酶的含量。
7. 利用Prism軟體分析資料，得出各化合物的EC50。
實驗結果如表1所示。
從上表的實驗結果來看，本發明化合物與GSK-2245035具有同一水準的體外受體結合活性。
實驗2：外周血單個核細胞試驗方案。
本方案的目的在於檢測利用現有化合物物刺激人外周血單核細胞(PBMC)24小時後細胞因數的表達水準。檢測時細胞上清液不稀釋，直接檢測IFN-α和TNF-α的水準。實驗過程中首先將化合物配製成20毫莫耳濃度的DMSO儲存液，用細胞培養基做10倍梯度稀釋，總共稀釋11個點。取其中9個稀釋點的化合物(化合物的最高濃度為200微莫耳/升)加入96孔板中，每孔50微升，然後接種新鮮的人外周血單核細胞，每孔接種150微升體系，其中含有450,000個細胞。將細胞培養板置於37℃和5%的CO2培養箱中培養24小時，培養結束後將培養板以1200rpm的速度 離心5分鐘，隨後收集上層血清，並將其儲存於零下20℃以待檢測。細胞因數的檢測利用BD公司的流式液相多重蛋白定量技術(CBA)，在流式細胞儀上完成檢測。利用上述檢測方法，我們將刺激產生最低檢測限至少3倍以上細胞因數水準的最低藥物濃度，定義為該化合物在該細胞因數刺激實驗上的MEC值。
實驗結果：樣品1和2的IFN-α的值0.001nM；TNF-α的值1nM。
實驗3：鼻腔給藥後小鼠體內干擾素-α(IFN-α)與腫瘤壞死因數-α(TNF-α)的誘導實驗。
將雌性Balb/c小鼠(體重18-20g)用異氟烷麻醉後，將化合物通過鼻腔吸入的方式進行給藥(20微升滴在鼻孔間)，化合物預先溶解在含有0.2%吐溫80的生理鹽水中。2小時後，將小鼠用二氧化碳處死並進行心臟採血。將血樣進行離心然後收取血清。血清樣本進行適當稀釋之後用ELISA進行檢測。檢測具體方法參照試劑盒裡的說明書。在這個模型裡，化合物誘導IFN-α/TNF-α的水準與化合物的給藥量相關，同時給對照溶劑的組別樣品中沒有檢測到IFN-α/TNF-α的水準。
實驗結果如表2所示。
從上表可以看出，本發明的化合物對干擾素IFN-α的誘導能力明顯強於GSK2245035，並且在相對較低的給藥濃度下，這一優勢體現得尤為明顯。

Claims (10)

  1. 式(I)所示化合物、其藥學上可接受的鹽、水合物或前藥， 其中，R選自任選被取代的C3-8烷基；m選自0、1、2、3或4；W選自任選被取代的：C3-8雜烷基、4~12元環烷基、雜環烷基或氨基酸；所述“雜”代表雜原子或雜原子團，分別獨立地選自O、S、N、C(=O)、S(=O)或S(=O)2；以及雜原子或雜原子團的數目分別獨立地選自0、1、2、3或4。
  2. 如專利請求項1所述之化合物，其中所述C3-8烷基、C3-8雜烷基、4~12元環烷基或雜環烷基的取代基分別獨立的選自F、Cl、Br、I、OH、CN、NH2、NH2C(=O)、C1-4烷基或C1-4雜烷基、4~6元烷基或雜烷基、4~6元雜烷基-C(=O)-，所述4~6元烷基或雜烷基任選被鹵素、NH2、OH、CN或C1-4烷基取代；具體地，所述C3-8烷基、C3-8雜烷基、4~12元環烷基或雜環烷基的取代基分別獨立的選自F、Cl、Br、I、OH、CN、NH2、NH2C(=O)、Me、Et、、 “雜”如權利要求1所定義；以及取代基的數目獨立地選自0、1、2或3。
  3. 如專利請求項1或2所述之化合物，其中所述的C3-8烷基選自：
  4. 如專利請求項1或2所述之化合物，其中所述C3-8雜烷基選自：-N(C1-4烷基)(C1-4烷基)。
  5. 如專利請求項1或2所述之化合物，其中所述4~12元環烷基或雜環烷基選自或，D1選自N或C(Ra)，D2-5分別獨立地選自O、S、[C(Ra)(Rb)]1-2或N(Rc)，D3和D4中的1或2個還可以選自單鍵，Ra、Rb或Rc分別獨立地選自H、C1-4烷基、C1-4雜烷基、鹵素、OH、CN、NH2C(=O)，任意兩個Ra和Rb任選地連接到同一個原子上形成一個4~6元環烷基、氧雜4~6環烷基或氮雜4~6環烷基，所述4~6元環烷基任選地被1~3個C1-4烷基所取代。
  6. 如專利請求項1所述之化合物，其中W選自：
  7. 如專利請求項1所述之化合物，其選自：
  8. 如專利請求項1所述之化合物，其製備方法為下列任一者：方法1： ；以及方法2： 其中，所述方法1與方法2中之SEM代表2-(三甲基矽)乙氧基甲基，係一種氨基保護基。
  9. 如專利請求項1~7中之任意一項所述之化合物、其藥學上可接受的鹽、水合物或前藥在製備預防和治療過敏性疾病和其他炎性病症、感染性疾病或癌症的藥物中的應用。
  10. 如專利請求項9所述之應用，其中所述疾病為過敏性鼻炎或哮喘。
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