TW201617084A - 包含β－環糊精之抗腫瘤劑 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含β-環糊精及其衍生物之抗腫瘤劑。又，本發明係關於以與其他抗腫瘤劑併用為特徴之β-環糊精、包含該β-環糊精之抗腫瘤劑、β-環糊精與其他抗腫瘤劑在癌等之治療上的併用療法等。

Description

包含β-環糊精之抗腫瘤劑
本發明主要係關於包含β-環糊精(bCD)及其衍生物(以下，包含衍生物，有時亦簡稱為「β-環糊精」或「bCD」)之抗腫瘤劑。又，本發明係關於以與其他抗腫瘤劑併用為特徴之β-環糊精、包含該組合之抗腫瘤劑、bCD與其他抗腫瘤劑在癌等之治療上的併用療法等。
在外科手術及/或化學療法後殘存1個癌細胞是可能成為癌再發的原因。因此，癌化學療法之目標為務必完全除去癌細胞。但是，若腫瘤中之癌細胞被賦予異種性，則藉由以特定之基因產物為標的之單一藥劑要完全除去癌細胞相當困難。
所以，吾等開發出2-去氧葡萄糖-ABT-263(2DG-ABT)併用療法，該法係將使Bcl-2、Bcl-xL類之抗細胞凋亡蛋白質鈍化而誘導細胞凋亡的ABT-263(Navitoclax、以下有時亦簡稱為「ABT」)與阻礙癌細胞內之葡萄糖之糖分解系統的2-去氧葡萄糖(2DG)加以組合；藉由組合該二劑，發現可相乘性地誘導細胞凋亡(非專利文獻1)。
但是，2DG-ABT之併用效果會隨著細胞株 而變化。其效果變化的原因之一被認為係由於存在於癌細胞中之磷酸肌醇3-激酶-AKT(PI3K-AKT)促存活信號有各種強度。又，PI3K-AKT之路徑，由於存在於多個正常組織中，所以在細胞凋亡誘導所中介之癌療法中，以該路徑為標的亦有成為多種副作用之原因的問題。
又，由於上皮增殖因子受體(EGFR)、類胰島素增殖因子1型受體(IGF1R)等受體酪胺酸激酶(RTK)在特定類型之癌中亦時常被活化，而引起PI3K-AKT之活化，所以使用對於此等引起PI3K-AKT活化之受體或酵素的特定阻礙劑，以特定RTK等作為標的，亦可成為在幾乎無副作用下，使癌細胞之促存活信號減少的有用方法，實際上已開發出以此等作為標靶的癌治療劑，有些在實際臨床醫療中正被使用。但是，實際的腫瘤集合體恐怕非來自一個細胞株之癌細胞，由於在腫瘤中有些細胞會表現IGF1R，另一方面，同一腫瘤的其他細胞可表現EGFR或胰島素受體等，所以標的無法決定，而且由於其中之一可生成所有PI3K-AKT促存活信號，因而例如藉由僅是以所謂IGF1R或EGFR、或兩者之阻礙作為目標時，將被認為不夠充分。
如此，就癌治療之有效方法而言，阻礙促進細胞凋亡誘導之PI3K及AKT之信號傳達的藥劑，雖然有些為已知，但其效果不足，而且在副作用等方面亦有問題。
β-環糊精(bCD)為連接7條糖鏈而成之圓錐形分子構造，內部具有所謂空洞之獨特分子構造，又， 由於親水性之羥基位於分子之外側，疏水性基位於分子之內側，適用於相間移動觸媒等之合成化學；又，在利用其內部可攝取其他分子之性質的活體中亦適用(非專利文獻2)。
又，bCD在其內部可攝取膽固醇的性質廣為人知(非專利文獻3)。另一方面，膽固醇在原生質膜中，具有將從外部傳入之多個信號傳達至細胞內的重要任務，又，由於所謂血中膽固醇值高的患者群癌發生率低的報告從1980年左右經常出現(非專利文獻4)，所以至目前為止以膽固醇為標靶而用bCD治療癌之嘗試未曾有過，或者縱使有也極為稀少。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Yamaguchi R, at al., PloS one 2011, 6(9):e24102.
[非專利文獻2]Curr. Top Med. Chem. 2014 14(3), 330-339
[非專利文獻3]Journal of Lipid Research Vol. 38, 1997, 2264
[非專利文獻4]QJM 2012, 105: 383-388
本發明之課題係發現更有效率的阻礙PI3K 及AKT之信號傳達，促進細胞凋亡誘導的藥劑，以作為癌等之治療之有效方法。
本發明人等為解決上述課題，進行各種檢討時，意外地發現由於攝入膽固醇而未曾用於癌治療等之試驗的β-環糊精(bCD)，可使PI3K-AKT之促存活信號弱化，誘導細胞凋亡，而具有抗腫瘤作用。
又，藉由將bCD與2-去氧葡萄糖(2DG)併用，發現bCD將AKT惰性化，於其間2DG可使細胞凋亡促進蛋白質Bak從抗細胞凋亡蛋白質Mcl-1解離；再者，藉由與為Bcl-2拮抗劑之ABT-263等併用，發現Bak亦從抗細胞凋亡蛋白質Bcl-xL解離，Bak從Mcl-1及Bcl-xL兩種蛋白質完全解放後，可實行細胞凋亡。再者，將TNF相關性細胞凋亡誘導配體(TRAIL)(為Bcl-2拮抗劑以外之細胞凋亡誘導因子)等與bCD-2DG併用，亦可有效實行細胞凋亡。
如以上方式，藉由在各種抗腫瘤劑中併用β-環糊精而投與，亦發現可使該抗腫瘤劑之效果進一步增強，於是完成本發明。
本發明係提供下述各種態樣之發明。
[第1項]
一種抗腫瘤劑，其包含β-環糊精或其衍生物。
其中β-環糊精或其衍生物之作用，係作為阻礙PI3K與AKT間之信號傳達的阻礙劑。
[第2項]
一種β-環糊精或其衍生物，其特徵為與1種或2種以上之其他抗腫瘤劑併用。
[第3項]
如第2項所述之β-環糊精或其衍生物，其中其他抗腫瘤劑係包含2-去氧葡萄糖者。
[第4項]
如第2項所述之β-環糊精或其衍生物，其中其他抗腫瘤劑係包含具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑者。
[第5項]
如第2項所述之β-環糊精或其衍生物，其中其他抗腫瘤劑係包含2-去氧葡萄糖及具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑者。
[第6項]
如第2至5項中任一項所述之β-環糊精或其衍生物，其係在投與其他抗腫瘤劑之同時、之前或之後，投與β環糊精或其衍生物。
[第7項]
一種抗腫瘤劑，其包含第2至6項中任一項所述之β-環糊精或其衍生物。
[第8項]
一種腫瘤之治療方法，其特徵為將治療上有效量之β-環糊精或其衍生物投與至需要治療的患者。
[第9項]
如第8項所述之治療方法，其中β-環糊精或其衍生物係阻礙PI3K與AKT之信號傳達，而誘導細胞凋亡。
[第10項]
如第8或9項所述之治療方法，其特徵為與1種或2種以上之其他抗腫瘤劑併用。
[第11項]
如第10項所述之治療方法，其中其他抗腫瘤劑係包含2-去氧葡萄糖者。
[第12項]
如第10項所述之治療方法，其中其他抗腫瘤劑係包含具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑者。
[第13項]
如第10項所述之治療方法，其中其他抗腫瘤劑係包含2-去氧葡萄糖及具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑者。
[第14項]
一種β-環糊精或其衍生物，其係使用於腫瘤之治療。
[第15項]
如第14項所述之β-環糊精或其衍生物，其特徵為與1種或2種以上之其他抗腫瘤劑併用。
又，在上述第1至15項中，將β-環糊精以2-羥基丙基-γ-環糊精(HPGCD)置換之各種態樣亦包含於本發明中。
本發明中，發現使用bCD標定(targeting)膽固醇，可阻礙PI3K與AKT間之信號傳達，使AKT促存活信號減弱。而且，進一步確認在試管中及活體中，藉由使此等信號減弱，2-去氧葡萄糖(2DG)或其他具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑可藉由促進粒線體內之細胞凋亡誘導因子Bak的游離，並從粒線體釋出細胞色素c，而誘導細胞凋亡。
一般，從副作用之觀點而言，期望抗腫瘤劑僅侷限於癌等腫瘤細胞，不會被輸送至其他健康細胞。然而，以細胞凋亡誘導為目標之抗腫瘤劑，係以體內所有細胞內之粒線體為目標部位，難以使抗腫瘤劑只侷限在腫瘤細胞內之粒線體中，作用過強之抗腫瘤劑，若考慮其對 健康細胞之影響，實用化甚為困難。
另一方面，在本發明之複數種藥劑的併用療法中，具有「就各個單獨藥劑而言，係以考慮對健康細胞之影響少之程度作用，然而就複數種藥劑在相同細胞內之作用而言，其作用係相乘性地飛升」的特徴。
2DG係偽葡萄糖，具有只經由葡萄糖代謝高之細胞的葡萄糖轉運體攝取至細胞內的性質。其中體內之葡萄糖代謝旺盛細胞雖為發生炎症之組織的細胞、包含過度運動後之心臟的肌肉細胞、癌等腫瘤細胞、及腦細胞，但當藉由本發明之併用療法進行腫瘤之治療時，若抑制患者之炎症，控制過度運動，則2DG可約略局限在腫瘤細胞及腦細胞中。
另一方面，由於bCD無法通過血腦障壁，在體內係存在於腦以外之組織。因此，兩劑可同時存在之細胞，幾乎可限定於腫瘤細胞，在bCD與2DG之併用療法中，可期待發揮對健康細胞之影響少，而對腫瘤細胞有效的細胞凋亡誘導作用。
又，在本發明之bCD單獨療法、或2DG以外之抗腫瘤劑與bCD之併用療法中，由於bCD不移行至腦內，亦可完全避免bCD單獨之效果及併用時之效果對腦細胞的不良影響。
bCD對於PI3K與AKT間之信號傳達的阻礙，僅限於投與後數小時期間，可於短時間回復至原始狀態。利用此性質，在與他劑併用時，由於即使他劑為副作 用少且作用比較弱之抗腫瘤劑，只要在與bCD併存期間，將可呈現強力細胞凋亡誘導作用，且bCD之阻礙作用消失以後將可抑制副作用，所以藉由量測併用之時段，可建立有效的治療計畫，另一方面，對正常細胞中PI3K-AKT之途徑的影響可壓抑至最小限度，而減輕副作用。
第1圖展示實施例1之結果，A至C分別表示方法A至方法C之結果。
第2圖A展示實施例2之結果，B及C展示實施例3之結果，D展示實施例4之結果，E展示實施例5之結果。
第3圖展示3劑投與時之實驗規程。
第4圖展示將實施例5中第2E圖之1μMABT濃度之結果整理、計算的結果。
第5圖A至C展示實施例6之結果。
第6圖A至E展示實施例7之結果。
第7圖A及B展示實施例8之結果。
第8圖A及B展示實施例9之結果。
第9圖A及B展示實施例10之結果。
[用於實施發明之態樣]
β-環糊精(bCD)為將7個糖鏈連接而成之圓錐形分子構造，在本發明中，β-環糊精意指包含β-環糊精本身以及其衍生物。其中，其衍生物，可列舉在β- 環糊精具有各種取代基者，如甲基-β-環糊精(MBCD)、(2-羥基丙基)-β-環糊精(HPBCD)、羧基甲基-β-環糊精、羧基甲基-乙基-β-環糊精、二乙基-β-環糊精、二甲基-β-環糊精、葡萄糖基-β-環糊精、羥基丁烯基-β-環糊精、羥基乙基-β-環糊精、麥芽糖基-β-環糊精、無規甲基-β-環糊精、磺酸基丁基醚-β-環糊精、2-硒架橋-β-環糊精、2-碲架橋-β-環糊精。就較佳的β-環糊精而言，可列舉：甲基-β-環糊精(MBCD)、(2-羥基丙基)-β-環糊精(HPBCD)、羥基丁烯基-β-環糊精、羥基乙基-β-環糊精、無規甲基-β-環糊精、磺酸基丁基醚-β-環糊精；就更佳的β-環糊精而言，可列舉β-環糊精、甲基-β-環糊精(MBCD)、(2-羥基丙基)-β-環糊精(HPBCD)。又，不僅bCD，2-羥基丙基-γ-環糊精(HPGCD)在包含膽固醇之點上亦優良，可於本發明中使用。
本發明中所用之bCD及其衍生物，可藉由經口或者注射或點滴等非經口方式投與。
bCD之投與量，只要對患者不會造成重大不良影響，並為可阻礙PI3K與AKT間之信號傳達的治療有效量，即無特別限制，不過每1次之治療以2至5000mg之用量，較佳以2至100mg之用量投與。
在本發明中，就與bCD併用之抗腫瘤劑而言，除2DG之外，可列舉具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑，例如，具有可從抗細胞凋亡蛋白質Mcl-1或Bcl-xL解離出Bak之作用的藥劑，惟非限定於此；具體而言，可列 舉：A-385358、ABT-199、ABT-263(利妥昔(navitoclax))、ABT-737、AT-101、GX15-070(奧巴克拉(obatoclax))、HA14-1、奧利默森(oblimersen)等。其他，則可列舉Fas關連性細胞凋亡誘導配體、TNF關連性細胞凋亡誘導配體(TRAIL)等，具體而言，可列舉TRAIL及其衍生物(AMG951等)、或可將TRAIL受體活化之抗體(mapatumumab、lexatumumab等)等。
再者，基於內質網與粒線體間所產生之信號，可推想藉由與2DG-bCD併用而能誘導細胞凋亡之藥劑，具體而言，可列舉HSP90之阻礙劑(佳美翠尼(gamitrinibs)、PU24FC1、PU-H58、PU-H71、薛佛汀(shepherdin)等)、內質網應激劑、毒胡蘿蔔素(thapsigargin)及其衍生物(G-202)等。
本發明中所用之2DG，可藉由經口或注射或點滴等非經口方式投與。
2DG之投與量，只要對患者不造成重大不良影響，即無特別限制，然而每1次之治療係以100至5000mg之用量，較佳為以500至2000mg之用量投與。
關於其他具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑，雖可藉由經口或注射或點滴等非經口方式投與，然而以依照各個藥劑所設定之投與途徑進行投與為較佳。
關於投與量，亦以依照各種藥劑所設定之用量投與為較佳，又從抑制具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑本身之副作用的觀點而言，亦可適宜減量。
又，在投與2DG時，可與葡萄糖合併使用，其量以與 2DG約略同量為較佳。
再者，由於bCD可抑制PI3K-AKT之促存活信號的時間只有數小時，故在與其他抗腫瘤劑之併用療法中，必須量測在AKT為惰性之時間帶中，其他抗腫瘤劑亦可發揮作用之投與時機。通常在與投與後迅速表現作用之抗腫瘤劑併用時，以與bCD投與同時至經過約2小時後投與抗腫瘤劑為較佳。相反地，在投與後表現活性需要時間的情況，以先投與抗腫瘤劑後再投與bCD為較佳。例如，在與2DG併用時，由於發揮2DG之效果需要1至2小時，而bCD可在30分鐘以內作用，兩劑併用時，以先投與2DG，經過1至2小時再投與bCD為較佳。
就本發明中所用之劑型而言，在經口劑方面，可列舉：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液劑、糖漿劑、懸浮劑等；在非經口劑方面，可列舉注射劑、栓劑等。此等製劑可依照常法調製。亦即，如錠劑、膠囊劑、經口液劑之製劑可依照常法製造。錠劑可藉由將活性成分與如明膠、澱粉、乳糖、硬脂酸鎂、滑石、阿拉伯膠等常用醫藥載劑混合而製造。膠囊劑可與醫藥上惰性之充填劑或稀釋劑混合，再充填於硬明膠膠囊或軟膠囊而製造。如糖漿劑或酏劑之經口液劑，係將活性成分與甜味料(例如，蔗糖)、保存劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、著色料、及香料等混合而製造。又，非經口投與用製劑可依照常法，例如，將本發明之活性成分溶解於無菌水性載劑(較佳為水或生理食鹽水)而調製。錠劑及顆粒劑可 依照周知之方法被覆。再者，此等製劑可含有治療上有價值之其他成分。相對於製劑之組成物，有效成分可含有0.1至70重量%。
本發明中之腫瘤，意指如癌之惡性腫瘤、良性腫瘤、或腫瘤性疾患，能夠藉由本發明之細胞凋亡誘導成為可治療的過形成(hyperplasia)，亦包含於本發明之腫瘤之領域中。關於為本發明之對象的腫瘤疾患，只要藉由細胞凋亡誘導而可治療之腦外的腫瘤疾患即可，無特別限制，可列舉例如(但不以此為限定)纖維肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索腫瘤、血管肉瘤、內皮腫瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮腫瘤、滑膜腫瘤、中皮腫瘤、尤因氏(Ewing’s)肉瘤、平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、胃癌、食道癌、直腸癌、胰臟癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、扁平上皮癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭狀腺癌、嚢胞腺癌、髓樣癌、支氣管原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、威爾姆氏(Wilms’)腫瘤、子宮頸癌、睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、星狀細胞腫瘤、髓母細胞腫瘤、頭蓋咽頭腫瘤、室管膜腫瘤、松果體腫瘤、血管母細胞腫瘤、聽神經腫瘤、乏突起神經膠質腫瘤、髓膜腫瘤、黑色素瘤、視網膜母細胞腫瘤、白血病、淋巴腫瘤、卡波西氏(Kaposi’s)肉瘤、子宮內膜增殖症、局限性結成性過形成肝、前列腺肥大、原性醛固酮增多症等。
[實施例]
以下之實施例中所用之試藥、試驗方法等，如以下說明。
試藥
β-環糊精(bCD)在試管內試驗中，係使用甲基-β環糊精(MBCD)，在活體內試驗中，係使用(2-羥基丙基)-β環糊精(HPBCD)。
抗p-PI3K抗體係從Santa Cruz(sc-12929)購入，寡株抗PI3K抗體(6HCLC)係從Pierce購入，抗PI3K型II抗體(D3Q5B)係從CST購入，抗細胞色素c抗體係從BD Pharmingen(Cat.556433 for blots and Cat.556432 for microscopy)購入，其他所有一次抗體係從Cell Signaling購入。
與HRP結合之二次抗體係從GE Healthcare購入，AlexaFluor結合二次抗體係從Life Technologies取得。
IGF1、EGF、胰島素、碘化丙啶(propidium iodide)及β環糊精係從Wako購入。
ABT-263係從Chemietek購入。
2-去氧-D-葡萄糖、MBCD及HPBCD係從Sigma購入。
泛半胱天冬酶阻礙劑z-VAD係從Promega購入。
細胞株及細胞培養
以空載體RCC4或編碼VHL之載體安定地轉染的腎細胞癌細胞株，係接受來自Harada Laboratory(Kyoto University Hospital,Dept.of Anesthesia)之提供，以細胞株UOK121及VHL表現載體進行安定轉染而得之UOK121+VHL係接受來自Dr.Marston Linehan(Center for Cancer Research,Urologic Oncology Branch,NCI)之提供。
Panc-1胰臟癌細胞及A431類表皮癌細胞，係在以10%血清補充之高葡萄糖DMEM中培養。
Panc-1細胞係接受來自Dr.Koji Yamada(Dept.of Bioscience and Biochemistry,Faculty of Agriculture,Kyusyu University,Japan)之提供，A431細胞係接受來自Dr.Masaya Imoto(Dept.of Bioscience and Informatics,Faculty of Science and Technology,Keio University,Japan)之提供。
此等細胞及HeLa細胞係在以10%FBS補充之高葡萄糖DMEM(4.5g/ml)中培養。
血清係從GE Health,Cosmo Bisocience等幾個不同來源取得。
西方墨點(Western blot)法及免疫沉澱法
以每行20μg之蛋白質實施西方墨點法。依照西方墨點法所檢測出之蛋白質的大小，用8%、10%、12.5%、及15%凝膠實施。在2種蛋白質為相同大小之情況，於各分別使凝膠流動，並分別將其進行西方墨點法分析。免疫沉澱係將來自被溶裂細胞的200μg蛋白質及預結合有免疫沉澱抗體之Protein-G瓊脂糖或Protein-A瓊脂糖(Sigma P3296/P9242)投入免疫沉澱用緩衝液中，將加有該液之試 管於4℃緩慢旋轉整夜。免疫沉澱緩衝液包含20mMTrispH7.5、1%Triton-X100、150mMNaCl、磷酸酶阻礙劑混合物(Cell Signaling(#58709S))、及10%甘油。次日早晨將試管內之內容物藉由離心而分離，將沉澱物以相同緩衝液洗淨2次後，溶解於SDS緩衝液中，使用15%SDS-PAGE、或12.5%SDS-PAGE，以西方墨點法分離、確認沉澱物。
FACS分析
以化學方式誘導細胞凋亡後，將細胞於PBS中洗淨，於通常之培養基中再培育，培育整夜。使用碘化丙啶攝取檢定法，於次日早晨實施細胞死亡檢定。以BDFACSCantoII或FACS Calibur II分析細胞。將結果使用FlowJo解析。此等實驗進行3次，誤差線(error bar)表示標準偏差。
活細胞數
死活細胞係以台盼藍(trypan blue)色素排除試驗計算。此等實驗進行3次，誤差線表示標準偏差。
細胞色素c釋出檢定
首先將於蓋玻片上成長、處置之RCC4細胞用3.7%甲醛/PBS固定10分鐘。繼而，將蓋玻片快速地接觸保存於-20℃冷凍庫中之100%甲醇。將蓋玻片以10%血清/PBS培育，繼而用小鼠抗細胞色素c抗體染色整夜。次日早晨， 將蓋玻片洗淨，用10%血清/PBS遮斷30分鐘。繼而，使蓋玻片接觸與AF488結合之二次抗小鼠抗體30分鐘。將蓋玻片再度洗淨，並與碘化丙啶(1μg/mL PBS中)接觸15分鐘，使核內之DNA染色，繼而洗淨，安裝於載玻片上。觀察係以顯微鏡(Keyence BZ9000)，使用100倍之物鏡進行。
小鼠異種移植
將5×106之UOK121細胞混合在0.2ml之50%基質膠(matrigel)(Falcon 356234)中，並移植於20週齡NSG小鼠(JAXTM Mice strain NOD.Cg-Prkdcscid 12rgtm1Wj1/SzJ，得自日本Charles River公司)之左右任一側腹部之皮下。將具有腫瘤之小鼠分為4個或5個處置群，在第1實驗及第2實驗中，每1群有3隻小鼠。對於小鼠，經口投與2mg之2DG及2mg之葡萄糖/0.2ml PBS、或2mg HPBCD/0.2ml PBS。最初經口投與ABT-263(2mg/kg ABT-263/10%乙醇、30%聚乙二醇400(Wako)、及60% Cremphore EL(Sigma))。再者，最初投與2DG/葡萄糖混合物，繼而於2小時半後投與HPBCD，30分鐘後投與ABT。對幾隻小鼠投與所有此等試藥，對其他小鼠則投與其一部分，或全部不投與。第1週處置小鼠2次。接下來3週，每週處置小鼠3次。腫瘤之大小，係使用電子游標卡尺(volume=(length×width2)/2)每週測定3至4次。3隻小鼠1群，每群以各處置條件處置，次日記錄腫瘤之大小。圖中之誤差線表示標準偏差。未進 行UOK121異種移植之NSG小鼠，以3種藥物組合處置，並記錄體重。使用來自尾靜脈之血液，以Horiba Hematology Analyzer LC-152測定血液中之白血球、紅血球、血小板的數目，並以MediSafe Mini(Terumo,Japan)測定血中葡萄糖濃度。
實施例1. bCD之效果(試管內)
使用表現EGFR及IGF1R兩者之HeLa細胞，就EGF活化及IGF1活化之降低，評價bCD之效果。再者，就bCD而言，使用MBCD。
(方法)
(實驗A)將HeLa細胞用濃度為0、1.75、3.5、及7.0mM的bCD在無血清培養基中培養30分鐘，每種濃度分別為2份。將各濃度之一份培養基以20ng/ml之IGF1刺激20分鐘，另一份培養基作為對照群。收集細胞，以AKT之磷酸化作為AKT活化的指標，對於磷絲胺酸AKT及AKT，以西方墨點法進行分析。
(實驗B及實驗C)將HeLa細胞用10mM之bCD，於無血清培養基中培養30分鐘，調製成未經處置(Untreated)之對照群培養基。繼而將此等細胞，於實驗B中，以100ng/mL之EGF刺激0、2.5、及5.0分鐘，於實驗C中以10ng/ml IGF1刺激0、5、及10分鐘。收集細胞，對於EGFR、IGF1R、ERK、PI3K、及AKT、以及各磷酸化體，以西方墨點法分析。關於PI3K之檢測，係使用抗PI3K型II抗體。
(結果)
將結果示於第1圖之A至C。
在實驗A中，藉由7mM bCD，完全遮斷IGF1對AKT生成之信號(第1圖之A)。
繼而，在實驗B及實驗C中，未以bCD處置之HeLa細胞，任一項均明顯被活化。在以bCD處置之細胞中，EGFR、IGF1R、PI3K之任一項均被活化，然而AKT活化顯著減少(第1圖之B及第1圖之C各下段之行)。
如此，研判bCD能妨礙從PI3K至AKT之信號傳達。
(考察)
‧幾乎所有RTK均活化下述2種不同信號傳達串聯(cascade)：RTK-Ras-ERK增殖途徑及RTK-PI3K-AKT促存活途徑。
‧同時，RTK-Ras-ERK信號不會受到影響(第1圖之B及第1圖之C之第2方塊)。
‧如此，破壞PI3K與AKT之間之信號傳達，使藉由此等RTK所生成之PI3K-AKT促存活信號減少，另一方面不損及Ras-ERK增殖信號。
實施例2.bCD與2DG之相乘效果(1)
VHL缺損性腎臟癌細胞(例如RCC4細胞)，由於表現IGF1R，所以對2DG-ABT之感受性低。其中與bCD組合之2DG-ABT，當確認bCD是否使其效果增加時，亦必須考慮2DG於多數癌細胞株中會刺激AKT磷酸化。所以，使用 bCD之2DG組合治療，首先要試驗在RCC4細胞中之AKT磷酸化是增加，或是減少。
一般而言，要見到2DG之效果需耗費1至2小時，由於依據實施例1之結果，bCD於30分鐘以內作用，故使用不含血清之培養基，先以2DG處理RCC4細胞2小時，在最後之30分鐘以內，亦用bCD處理細胞。再者，使用MBCD作為bCD。
(方法A)
將RCC4細胞在中添加或不添加10mM 2DG之無血清培養基培養2小時。終了1小時前，在各培養基之細胞分劃部分中添加10mM bCD。繼而，添加0ng/ml至30ng/ml之IGF1，繼續培養5分鐘後，收集細胞，並以西方墨點法分析。
(結果A)
將結果示於第2A圖。就以2DG進行前處置之群而言，對IGF1顯示感受性，在經2DG處置之細胞中AKT的磷酸化增加。然而，在與bCD組合之處置群，AKT磷酸化完全被遮斷(第2A圖)。此等結果顯示即使2DG使IGF1R活性提高，但於bCD存在下，來自IGF1R之信號未傳達至AKT。
實施例3.bCD與2DG相乘效果(2)
在上述之實施例2中，為了試驗bCD對於特定RTK的效果，於未含血清之培養基中培育細胞，繼而，以特定之成長因子刺激。然而，由於血清通常含有多種成長因子、 以及可將此等細胞所表現之多種RTK活化的胰島素，所以為了確認bCD本身在接受血清持續刺激下是否可控制PI3K-AKT信號，將RCC4細胞分別以bCD、2DG、及其組合處置，並測試AKT之磷酸化狀態。再者，使用MBCD作為bCD。
(方法B)
在RCC4細胞中，於存在10%血清而添加或不添加10mM 2DG下，培養2小時。在終了30分鐘前，於各培養基之細胞分劃部分(fraction)中添加10mM bCD，繼而，收集細胞並分析。
(方法C)
將HeLa細胞於10%血清存在下，以10mM bCD培養1小時，繼而，將細胞洗淨，於含有10%血清之培養基中再培養所示之時間(約120分鐘)。
(結果)
將方法B之結果示於第2圖之B中，方法C之結果示於第2C圖中。AKT之磷酸化，在以bCD處置及以2DG與bCD共同處置之情況，幾乎完全被遮斷(第2圖之B)。
然而，在將細胞重回無bCD而含10%血清之培養基中培養的情況，在回復AKT活性上未花費時間(第2圖之C)。
實施例4.bCD對IGF1所引起之血糖值降低的效果(活體內)
已經有數個研究(J.Inheri.t Metab.Dis.2013,36(3)：491-498；Toxicol.Pathol.2008,36(1)：30-42)顯示將為bCD 衍生物之一的羥基丙基-β-環糊精(HPBCD)注入小鼠，4小時後被維持在血液循環中的量為約50%。因此，在用於癌療法時，要利用藉由bCD之誘導而使促存活信號消滅的優點，必須盡快適時誘導細胞凋亡。
為了知道bCD是否對於動物中之PI3K-AKT途徑有影響，進行以下之實驗。再者，使用HPBCD作為bCD。
(方法D)
將絕食5小時之小鼠以40μgbCD進行30分鐘前處置，或未進行前處理。於此等中注入100ng IGF1。再者，30分鐘後從小鼠尾部採血，測定血中葡萄糖濃度。實驗進行3次，誤差係以標準偏差表示。小鼠全部為約20g。
(結果)
將結果示於第2圖之D。
bCD明顯地減弱IGF1所誘導之低血糖，暗示bCD部分遮斷動物體內之IGF1R與AKT間的信號傳達。
實施例5.bCD及2DG在提高ABT所誘導之細胞凋亡上的相乘效果
將bCD與2DG-ABT組合，確認是否促進細胞凋亡誘導。
(方法E)
將RCC4細胞之分劃部分於10%血清存在下，將1個分劃部分用10mM 2DG前培養2小時，另一分劃部分用10mM bCD前培養30分鐘，將再一分劃部分以兩者處置， 亦製作無任何處置之對照組(untreated)。添加第2圖E中所示之量的ABT-263，經1小時後，將全部細胞用PBS洗淨，在含10%血清之通常培養基中，進行整夜再培養。收集細胞，分析藉由FACS之PI攝取。規程示於第3圖。再者，使用MBCD作為bCD。
(結果)
將結果示於第2圖E之曲線圖中。
使用1μMABT-263，2DG-bCD-ABT之組合可誘導約95%之RCC4細胞發生細胞凋亡。
使用第2圖E中ABT濃度為1μM時之數據，假設bCD及2DG係獨立作用，計算出細胞死亡率之期待結果應為72%，然而實測值為97%。將其結果示於第4圖。在獨立性卡方(chi-square)檢定中，顯示p值小於0.0001。如此，可知bCD及2DG對於ABT所誘導之細胞凋亡具有相乘作用。
實施例6.2DG-bCD-ABT之3併用的涵蓋癌細胞廣域圖譜的效果
首先，於實驗A中試驗bCD對於各種癌細胞株上之AKT促存活信號的效果；對於A431類表皮癌細胞，用實驗B以西方墨點法分析EGF、ERK1/2、PI3K、以及各磷酸化體。繼而於實驗C中，確認在與ABT組合之情況的細胞凋亡效果。再者，使用MBCD作為bCD。
(方法)
(實驗A)將HeLa子宮頸部癌細胞、UOK121腎臟癌細胞、Panc-1胰臟癌細胞、及A431扁平上皮癌細胞之各細胞，在培養基內，於25mM葡萄糖存在下，進行下述處置：無處置、以10mM 2DG進行前處置、於最後30分鐘與10mM bCD共培育、及以此兩者處置，收集細胞，進行西方墨點法分析。
(實驗B)分析與(實驗A)中A431細胞溶菌液相同之樣本中之EGFR活化、ERK1/2活化、及PI3K活化。有關A431細胞中之PI3K檢測，係使用抗PI3Kp85寡株抗體(6HCLC)。
(實驗C)調製與(實驗A)同樣處置之無處置細胞、以2DG及bCD處置之細胞、以1μMABT培育2小時之細胞、及進行2DG及bCD處置且進行ABT處置之經全部藥劑處置之細胞。收集細胞，藉由台盼藍染色排除檢定計數活細胞。誤差線係表示來自3樣本之標準偏差。
(結果)
如期待，bCD減弱HeLa頸部癌細胞、UOK121腎臟癌細胞、Panc-1胰臟癌細胞、及A431類表皮癌細胞中之AKT磷酸化，在所有試驗中，bCD均減弱AKT促存活信號(第5圖A)。
實驗B係使用在實驗A中所用之癌細胞中，已知會過剩表現EGFR之A431類表皮癌細胞，來確認用bCD及2DG處置之效果，從其結果可知EGFR、ERK1/2、PI3K之任一者均被活化(第5圖B)。
然而，由於在實驗C之結果中，藉由含ABT之3劑的 組合，全部細胞株均非常有效地誘導細胞凋亡，若考慮實驗A及實驗B之結果，暗示藉由減弱AKT促存活信號，可提高ABT之細胞凋亡誘導活性。
再者，藉由實驗C之結果，在Panc-1細胞中，以2DG及bCD之2劑處置之結果與以含ABT之3劑之結果無顯著之差異，研判此係因Panc-1細胞無法將ABT攝取至細胞內之故。
實施例7. 2DG-bCD-ABT3劑併用之細胞凋亡誘導機構的解析
2DG與bCD之相乘效果，雖然從上述結果觀之，可說有非常高之準確率，不過為了以分子生物學方式確立該結果，以及為了檢索實際上以何種分子方式可見此相乘效果，建立以下之實驗。首先收集與Bak共沉澱的蛋白質，並以西方墨點法，鑑定於哪個時點Mcl-1及Bcl-xL從Bak結合體失去，又藉由光學顯微鏡觀察，於哪個時點細胞色素c從粒線體釋出。
(方法)
(A及B)將RCC4細胞，以與實施例6同樣之方法，用2DG、bCD、2DG+bCD處置、或無處置。以西方墨點法分析約20μg之全細胞溶菌液(WCL)。將Bak與Bcl-xL結合而成之蛋白質從約200μg之細胞溶菌液免疫沉降，並以西方墨點法分析。
(C)將含或不含20μM泛胱天蛋白酶阻礙劑z-VAD的3 μMABT，加入以2DG及bCD之組合前處置2小時的細胞中，以西方墨點法分析胱天蛋白酶(caspase)9。將切斷之胱天蛋白酶9以cC9表示。
(D)使用來自最後2個樣本之200μg，使Bak結合蛋白質沉澱，以墨點法分析BcL-xL及Bak。
(E)將以2DG-bCD處置之RCC4細胞(左格)、以2DG-bCD-ABT處置之RCC4細胞(中央格)、及20μM泛胱天蛋白酶阻礙劑z-VAD存在下以2DG-bCD-ABT處置之RCC4細胞(右格)，使用抗細胞色素c抗體及GFP抱合抗小鼠抗體進行免疫染色。將核以碘化丙啶染為紅色。
在以2DG及β CD兩者處置之細胞中出現的點狀綠色斑點(左格)表示局部存在於粒線體之細胞色素c，排除中央格及右格兩者之染色，表示從粒線體釋出之細胞色素c。
註：細胞色素c只在ABT被添加後產生。本件及其他實驗之規程的詳細圖式在第3圖中。
(結果)
將結果示於第6圖A至第6圖E。
Mcl-1-Bak之關係消失(第6圖A)。
與此相對照地，ABT與Bcl-xL直接結合，成為Bak-Bcl-xL複合體之解離的原因(第6圖D)。只有此種情況，胱天蛋白酶9被活化(第6圖C)。
如此，細胞色素c之釋出只在ABT之添加後發生，即使胱天蛋白酶阻礙劑存在下，亦即，胱天蛋白酶鈍化之狀況，亦會發生(第6圖D及第6圖E)。接續於細胞色素c 之釋出，胱天蛋白酶9被活化。
細胞色素c的完全釋出，及胱天蛋白酶9完全活化兩者，均在ABT添加後2小時以內被觀察到，我等注意到從最初投入2DG算起4小時以內進入細胞凋亡之最終階段。
從此等之結果，可知如欲細胞凋亡抑制因子之一，即Mcl-1與Bak分離，使細胞對細胞死亡變得敏感，需要2DG及bCD兩者。亦即藉由2DG及bCD之相乘作用，Mcl-1從Bak結合體解放。再者，亦可知若加上ABT，Bcl-xL與ABT結合，而從Bak結合體分離；從所有抑制因子解放之Bak活化，於是從粒線體釋出細胞色素c，而啟動細胞死亡(參照第3圖C)。
實施例8.在活體內2DG-bCD-ABT所引起之腫瘤消退效果 (方法)
(A)將為來自人類之癌細胞UOK121細胞移植至小鼠，於第7日依照第3圖之活體內的規程開始治療。治療群包括無處置，以2DG-ABT處置、以HPBCD處置、及以2DG-HPBCD-ABT處置。再進行2次處置，記錄腫瘤之大小。誤差線係表示標準偏差。再者，只有以2DG-HPBCD-ABT治療之小鼠，於第50日進行第4度之治療。
(B)就(A)之高次評價而言，對於與(A)同樣之試驗，將小鼠分為5個治療群：無處置、分別以2DG-ABT、HPBCD、HPBCD-ABT、及2DG-HPBCD-ABT處置，從第10日至第30日期間進行8次處置。
(結果)
只在以3劑組合處置之群，觀察到腫瘤消退(第7圖A)。其他所有小鼠，由於腫瘤成長至600mm3以上，進行宰殺處理。在最初2星期以3劑之組合處置之群，腫瘤維持原樣小(小於60mm3)。小鼠在隨後之數週未處置而放置時，該期間腫瘤緩慢成長，最後於第50日達到400mm3。
再者，在就高次評價而言所進行之結果，與第7圖A之評價相同地，只有以3劑之組合所處置的小鼠對治療有回應，腫瘤維持原樣小(第7圖B)。其他治療群所有小鼠之腫瘤均成長，腫瘤至第6週為600-1200mm3之範圍。與此相對照地，3劑之組合群中的小鼠，腫瘤緩慢地成長。
實施例9.在胰臟癌細胞中2DG-bCD-TRAIL之細胞凋亡誘導效果
吾等建立所謂「2DG-bCD，在有效率的癌治療上，可與Bcl-2拮抗劑以外的細胞凋亡誘導因子如Fas或TNF相關性細胞凋亡誘導配體(TRAIL)等組合」之假說。有報告暗示bCD單獨或與2DG一起，為了誘導細胞色素c釋出，明顯使粒線體具感受性，同時bCD不妨礙胱天蛋白酶8之死亡受體(death receptor)活化(Molecular and cellular biology 2002,22(1)：207-220)。因此，第II型細胞中，細胞凋亡之外因及內因兩途徑可被活化，TRAIL在使粒線體具感受上有效。為了確認上述事項，進行以下之實驗。
(方法)
(A)將Panc-1細胞以標準之2DG-bCD-TRAIL規程(第3圖)處置。藉由台盼藍色素排除檢定區別活細胞與死細胞，計算活細胞數目，並作圖。實驗係以3劑之組合進行，誤差線係表示標準偏差。
(B)Panc-1細胞之西方墨點法，係以無處置、TRAIL處置、2DG-bCD之組合處置、及第3圖所示之2DG-bCD-TRAIL之組合處置進行。將細胞於處置6小時後收集。實驗係重覆3次，得到同樣之結果。
(結果)
將結果示於第8圖。TRAIL在10ng/ml之濃度下，於Panc-1細胞中實質上無效果。然而，在將此等細胞以2DG-bCD前處理之情況，TRAIL在相同濃度(10ng/ml)下，在90%之細胞中可充分誘導細胞凋亡。由此可知，2DG-bCD可使得Panc-1細胞對於TRAIL所介導之細胞凋亡明確具有感受性，此暗示2DG-bCD-TRAIL可有效治療胰臟癌。
實施例10.因環糊精之種類而造成的效果差異
使用來自腎臟之UOK121細胞並施加α-、β-、及γ-環糊精，然後確認AKT活化及2DG-ABT之細胞凋亡誘導效果。
(方法)
(實驗A)在UOK121細胞中，於10%血清存在下，分別加入濃度為5及10mM之α-、β-、及γ-環糊精並培養45分鐘。未添加環糊精之對照組亦以同樣方式培養。收集細 胞，以AKT及ERK1/2之磷酸化作為AKT及ERK1/2活化之指標，以西方墨點法進行分析。
(實驗B)將UOK121細胞在培養基內，於25mM葡萄糖存在下，加入10mM 2DG並培育1.5小時，分別加入10mM之α-、β-、及γ-環糊精並培育30分鐘，之後，加入0.3μM之ABT-263，然後培育2小時。另外，製備未添加2DG及ABT-263二者而只添加α-、β-、及γ-環糊精的對照組，以及完全無添加之對照組。將全部細胞於添加環糊精2.5小時後(添加ABT-2632小時後)，用培養基回洗2次，翌日，用台盼藍染色排除檢定測定活細胞之數目。
(結果)
將結果示於第9圖A及第9圖B中。
在實驗A中，只有藉由β-環糊精處理的細胞，使AKT之活化降低(第9圖A)。在實驗B中，雖然對於β-環糊精處置的UOK121細胞，與DG-ABT併用時效果顯然上升，但對於用α-及γ-環糊精處置的UOK121細胞，幾乎未觀察到該併用所產生之改善效果(第9圖B)。
由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。
故本案無指定代表圖。

Claims (7)

  1. 一種抗腫瘤劑，其包含β-環糊精或其衍生物。
  2. 一種β-環糊精或其衍生物，其特徵為與1種或2種以上之其他抗腫瘤劑併用。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之β-環糊精或其衍生物，其中其他抗腫瘤劑包含2-去氧葡萄糖。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之β-環糊精或其衍生物，其中其他抗腫瘤劑係包含具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑者。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之β-環糊精或其衍生物，其中其他抗腫瘤劑係包含2-去氧葡萄糖及具有細胞凋亡誘導作用之抗腫瘤劑者。
  6. 如申請專利範圍第2至5項中任一項所述之β-環糊精或其衍生物，其中在投與其他抗腫瘤劑之同時、之前或之後，投與β-環糊精或其衍生物。
  7. 一種抗腫瘤劑，其包含申請專利範圍第2至6項中任一項所述之β-環糊精或其衍生物。
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