TW201615227A - 用於核酸遞送之組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明謀求一種核酸輸送用組合物，其於藉由血中投予來投予核酸而表現出該核酸功能之核酸醫藥中，確保該核酸醫藥之穩定性，並且細胞內導入率較高，可有效地表現出該核酸醫藥之功能。尤其是謀求一種亦可適用於如siRNA之短鏈核酸醫藥之核酸輸送用組合物。 一種核酸輸送用組合物，其特徵在於含有：導入有陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物(a)；聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)；及選自由維生素A衍生物、維生素D衍生物、維生素E衍生物、維生素K衍生物及膽固醇衍生物所組成之群中之1種以上之脂溶性添加劑(c)。

Description

用於核酸遞送之組合物
本發明係關於一種用於將核酸醫藥遞送至目標患部之細胞內之核酸輸送用組合物及使用核酸醫藥之醫藥組合物及其用途。尤其是關於一種用於將siRNA等短鏈核酸醫藥穩定地遞送至疾病目標組織之核酸輸送用組合物及醫藥組合物。
對於由基因所引起之疾病，業界開發有使用抑制其致病基因之功能表現的核酸醫藥之基因治療。該基因治療係直接作用於疾病原因之治療方法，且係對於酶抑制劑等先前之低分子醫藥品難以獲得治療效果之疾病，亦可期待治療效果之新穎治療技術。
近年來，作為基因治療之一種方法，發現了RNA干擾(RNA interference，以下簡稱為RNAi)。關於RNAi，30個鹼基以下之短鏈RNA為與疾病致病基因之功能抑制表現相關之主要分子。將該短鏈RNA命名為siRNA(small interfering RNA，小干擾RNA)(專利文獻1)。自2001年報告哺乳類細胞中之RNAi以來(非專利文獻1)，為了將RNAi用於所有疾病治療而進行了活躍地研究開發。然而，核酸醫藥通常缺乏化學穩定性，無法獲得因靜脈內投予等全身投予方式所產生之治療效果。尤其是RNA具有容易被存在於血中之各種酶分解之物性，成為將siRNA用作核酸醫藥時之較大障礙。因此，使用siRNA作為核酸醫藥之治療劑限於眼睛或呼吸器官等藉由siRNA之局部投予而獲得治療效果之疾病，可治療之疾病之適用範圍受到限制。因此，業界謀求開 發出將siRNA等用於基因治療之核酸醫藥應用於血中投予，而穩定且有效地遞送至體內之疾病患部的技術。
為了血中投予核酸醫藥並於體內之疾病患部使之發揮出治療效果，必須克服以下3個問題：(1)確保血中之該核酸醫藥之穩定性、(2)將核酸醫藥有效地遞送至目標組織、(3)將核酸醫藥導入至目標組織細胞內。因此，需要使核酸醫藥保持穩定並可遞送至目標細胞之核酸遞送系統。對於該核酸遞送系統，要求如下功能：保持核酸醫藥而確保血中穩定性，血中投予後，以利用血液流動到達目標患部組織之方式具有血中滯留性，並且抑制向除目標患部以外之組織細胞的非選擇性基因導入。另一方面，要求如下能力：於到達目標患部組織時，將該核酸醫藥導入至目標細胞內，進而於細胞質內釋出該核酸醫藥，使核酸醫藥發揮作用而抑制疾病致病基因之功能，藉此帶來治療效果。另外，該核酸遞送系統亦必須具有活體親和性而於投予時不會誘導活體防禦反應或細胞死亡。
如此，為了完成全身投予型核酸遞送系統，要求(i)自投予開始至到達目標患部期間，使核酸保持穩定並避免與血中分解酶之接觸而確保穩定性，並且抑制核酸向除目標患部組織以外之細胞之導入；(ii)到達患部後，在保持核酸之情況下直接侵入至細胞內；(iii)到達細胞質內後，釋出核酸(siRNA)；(iv)具有活體親和性。
已知有以核酸醫藥對活體內之血中投予為目標之核酸輸送系統之若干開發。例如專利文獻2中提出有使用包含含有PEG(Polyethylene glycol，聚乙二醇)及陽離子性聚合物之嵌段型共聚物、與陽離子性聚合物之核酸輸送用組合物，製成其與核酸醫藥之複合體，藉此提昇細胞取入能力之核酸輸送系統。又，非專利文獻2中提出有使用包含含有PEG及疏水性聚合物之嵌段型共聚物、疏水性聚合物、陽離子性聚合物之核酸輸送用組合物，製成其與核酸醫藥之複合體，藉此使血中 穩定性較高之核酸輸送系統。
然而，於專利文獻2所記載之方法中，僅藉由陽離子與陰離子之靜電相互作用而形成微胞，因此與質體DNA相比電荷密度較低之siRNA等於靜電相互作用方面較弱，難以確保血中穩定性。又，於非專利文獻2所記載之方法中，雖然粒子穩定性較高，可確保優異之血中滯留性，但未考慮用於釋出siRNA等之技術要素。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開WO01/75164號
[專利文獻2]國際公開WO2012/005376號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Nature、vol.411、p.494-498、2001
[非專利文獻2]J.Controled.Release. 2013、166、p.106-114
於以血中投予方式表現功能之核酸醫藥中，需要確保該核酸醫藥之穩定性，並且細胞內導入率較高，可有效地表現出該核酸醫藥之功能的核酸輸送用組合物。尤其是需要亦可適用於siRNA之類的短鏈核酸醫藥之核酸輸送用組合物。
本發明者等為了解決上述問題而潛心努力，結果發現：含有可藉由靜電相互作用而與核酸醫藥形成複合體之導入有陽離子性官能基及疏水性烴基之二官能性聚合物(內核形成聚合物)、藉由具有自我締合性並粒子化而顯示血中滯留性的包含聚乙二醇鏈段及疏水性聚合物鏈段之嵌段型共聚物(外殻形成聚合物)、及用於防止因二官能性聚合物(內核形成聚合物)與嵌段型共聚物(外殻形成聚合物)兩聚合物間之 較弱之親和性而引起急性粒子崩解之如生育酚之脂溶性添加劑的核酸輸送用組合物於確保所包含之核酸分子之穩定性後遞送至目標組織，其後，將核酸分子導入至該組織之細胞內而表現功能；從而完成本發明。
本發明係關於以下之[1]~[15]。
[1]一種核酸輸送用組合物，其特徵在於含有：導入有陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物(a)；聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)；及選自由維生素A衍生物、維生素D衍生物、維生素E衍生物、維生素K衍生物及膽固醇衍生物所組成之群中之1種以上之脂溶性添加劑(c)。
[2]如上述[1]之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)之上述烴基為選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基及直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基所組成之群中之1種以上之烴基。
[3]如上述[1]或[2]之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)之上述陽離子性官能基為選自由胺基、二烷基胺基、三烷基銨基及胍基所組成之群中之1種以上之陽離子性官能基。
[4]如上述[1]至[3]中任一項之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)為聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物，該聚天冬胺酸衍生物或該聚麩胺酸衍生物於側鏈羧基上直接或經由鍵結基而導入有上述陽離子性官能基及上述烴基，該二官能性聚合物平均每1分子之該陽離子性官能基導入率為10~100莫耳當量/聚合物分子，該陽離子性官能基與該烴基之含有莫耳當量比率(陽離子性官能基含有莫耳當量：烴基含有莫耳當量)為1~5：1。
[5]如上述[1]至[4]中任一項之核酸輸送用組合物，其中關於上述聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)，該 疏水性聚合物鏈段為聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物，該聚天冬胺酸衍生物或該聚麩胺酸衍生物係疏水性基直接或經由鍵結基而鍵結於側鏈羧基上之片段結構，該疏水性基為選自由直鏈狀或支鏈狀之(C1~C30)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C2~C30)之烯基或直鏈狀或支鏈狀之(C7~C30)之芳烷基所組成之群中之1種以上。
[6]如上述[5]之核酸輸送用組合物，其中關於上述嵌段型共聚物(b)，聚乙二醇鏈段係伸乙基氧基單元：(CH2CH2O)為5~11,500之重複單元結構，疏水性聚合物鏈段係天冬胺酸衍生物單元或麩胺酸衍生物單元為5~200之重複單元結構之聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物，上述疏水性基直接或經由鍵結基而鍵結於該聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之側鏈羧基上的天冬胺酸衍生物單元或麩胺酸衍生物單元為3~200。
[7]如上述[1]至[6]中任一項之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)為通式(1)
[式中，R1表示氫原子、(C1~C10)之烷基或(C7~C10)之芳烷基，R2表示亞甲基或伸乙基，R3表示選自由氫原子、(C1~C6)之醯基及(C1~C6)之烷氧基羰基所組成之群中之1種，R4表示選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基及直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基所組成群中之1種以上之取代基，R5表示選自由羥基、羧基經保護之胺基酸及-N(R7)CONH(R8)所組成群中之1種以上之取代基，該R7及R8可相同亦可不同，表示(C3~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基、或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，R6表示(C1~C10)之直鏈狀或支鏈狀之烷基或(C7~C10)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基，X1、X2及X3表示鍵結基或鍵，a、b、c、d、e、f及g分別獨立地表示0~200之整數，聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數即(a+b+c+d+e+f+g)為10~200之整數，(a+b)為5~200之整數，(c+d)為5~200之整數，鍵結有精胺酸衍生物之構成單元、鍵結有R4之構成單元、鍵結有R5之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元分別獨立為無規排列]所表示之聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物。
[8]如上述[7]之核酸輸送用組合物，其中於上述通式(1)所表示之二官能性聚合物(a)中，R4表示選自由(C8~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烷基、(C8~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烯基及(C8~C30)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基所組成之群中之1種以上之烴基，(a+b+c+d+e+f+g)為15~200之整數，(a+b)為10~150之整數，(c+d)為5~100之整數，(a+b)：(c+d)為1~3：1。
[9]如上述[1]至[8]中任一項之核酸輸送用組合物，其中上述嵌段型共聚物(b)為通式(2) [化2]
[式中，R11表示氫原子或(C1~C10)之直鏈狀或支鏈狀之烷基，R12表示亞甲基或伸乙基，R13表示選自由氫原子、(C1~C6)之醯基及(C1~C6)之烷氧基羰基所組成之群中之1種，R14表示選自由(C1~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烷基、(C2~30)之直鏈狀或支鏈狀之烯基、(C7~C30)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基及羧基經保護之胺基酸所組成之群中之1種以上之基，R15表示羥基及/或-N(R17)CONH(R18)，此處，R17及R18可相同亦可不同，表示(C3~C6)之直鏈、支鏈狀或環狀之烷基或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，R16表示(C1~C6)之伸烷基，X11表示鍵結基或鍵，t表示5~11500之整數，m、n、o、p及q獨立地表示0~200之整數，聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數即(m+n+o+p+q)表示5~200之整數，(m+n)表示3~200之整數，鍵結有R14之構成單元、鍵結有R15之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元分別獨立為無規排列]所表示之嵌段型共聚物。
[10]如上述[9]之核酸輸送用組合物，其中於上述通式(2)所表示之嵌段型共聚物中，R14表示選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之烯基及直鏈狀或支鏈狀之(C7~ C20)之芳烷基所組成之群中之1種以上，(m+n+o+p+q)表示6~150之整數，(m+n)表示3~150之整數。
[11]如上述[1]至[10]中任一項之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)、上述嵌段型共聚物(b)及上述脂溶性添加劑(c)之含有比率(w/w)為(a)：(b)：(c)=1：0.1~5：0.1~5。
[12]一種醫藥組合物，其係於如上述[1]至[11]中任一項之核酸輸送用組合物中含有核酸而成。
[13]如上述[12]之醫藥組合物，其中上述核酸為具有利用RNA干擾(RNAi)之目標基因之表現抑制作用的RNA。
[14]一種基因治療劑，其含有如上述[12]或[13]之醫藥組合物。
[15]一種聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物，其係以通式(1)
[式中，R1表示氫原子、(C1~C10)之烷基或(C7~C10)之芳烷基，R2表示亞甲基或伸乙基，R3表示選自由氫原子、(C1~C6)之醯基 及(C1~C6)之烷氧基羰基所組成之群中之1種，R4表示選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基及直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基所組成群中之1種以上之取代基，R5表示選自由羥基、羧基經保護之胺基酸及-N(R7)CONH(R8)所組成群中之1種以上之取代基，該R7及R8可相同亦可不同，表示(C3~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基、或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，R6表示(C1~C10)之直鏈狀或支鏈狀之烷基或(C7~C10)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基，X1、X2及X3表示鍵結基或鍵，a、b、c、d、e、f及g分別獨立地表示0~200之整數，聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數即(a+b+c+d+e+f+g)為10~200之整數，(a+b)為5~200之整數，(c+d)為5~200之整數，鍵結有精胺酸衍生物之構成單元、鍵結有R4之構成單元、鍵結有R5之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元分別獨立為無規排列]表示。
本發明可使藉由靜電相互作用而與核酸醫藥形成複合體之導入有陽離子性官能基及疏水性烴基之二官能性聚合物(內核形成聚合物)與核酸醫藥所形成之複合體與聚乙二醇鏈段及疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(外殻形成聚合物)相互作用，而形成奈米粒子狀締合體。藉由於其中進而添加脂溶性添加劑而提供一種可提高上述奈米粒子狀締合體之締合性並使核酸醫藥保持穩定之核酸輸送用組合物。又，使用上述核酸輸送用組合物而提供一種包含核酸醫藥之核酸醫藥組合物。
該核酸醫藥組合物之核酸醫藥與上述二官能性聚合物(內核形成聚合物)之複合體與上述嵌段型共聚物(外殻形成聚合物)藉由相對較弱之疏水性相互作用而形成締合體，故而可相對容易地釋出該複合體。另一方面，脂溶性添加劑提高該複合體與該嵌段型共聚物之締合體形 成力。使用以上構成之本發明提供一種保持核酸醫藥之穩定並且確保釋出性之核酸輸送用組合物。
使用本發明之核酸輸送用組合物之核酸醫藥顯示對於核酸分解酶之阻抗性，因此核酸穩定性優異，可適用於血中投予。又，所投予之該核酸醫藥可於目標部位釋出核酸醫藥並進入至目標組織細胞內，於細胞質內釋出核酸醫藥而表現功能。關於該核酸醫藥，確認細胞質內之核酸釋出及成為核酸功能表現之標準的目標蛋白質表現之抑制作用(沉默效果)，本發明提供一種以血中投予之方式表現功能之核酸醫藥組合物。
圖1係表示藉由15%聚丙烯醯胺凝膠電泳對使用本發明之核酸輸送用組合物之siRNA複合體及比較例siRNA複合體對於RNase(核糖核酸)之穩定性進行評價之結果的圖。
圖2係表示於使用本發明之核酸輸送用組合物之經FAM標記之siRNA(FAM-siLuc)複合體之細胞取入試驗中利用共聚焦雷射顯微鏡對致敏細胞進行觀察之圖式代用照片。
圖3係表示於使用本發明之核酸輸送用組合物之經FAM標記之siRNA(FAM-siLuc)複合體之細胞取入試驗中利用共聚焦雷射顯微鏡對致敏細胞進行觀察之圖式代用照片。
圖4係表示利用使用本發明之核酸輸送用組合物之siRNA(FAM-siLuc或siLuc)複合體所進行之對螢光素酶穩定表現細胞株之螢光素酶抑制評價結果。
本發明係關於一種核酸輸送用組合物，其特徵在於含有：導入有陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物(a)；聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)；及選自維生素A衍生 物、維生素D衍生物、維生素E衍生物、維生素K衍生物及膽固醇衍生物中之1種以上之脂溶性添加劑(c)。以下，對其詳細情況進行說明。
[關於導入有陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物(a)]
於本發明中，所謂導入有陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物(a)，係指於單鏈之聚合物主鏈上以分支型分別官能基修飾有複數個陽離子性官能基及複數個烴基之聚合物結構體。
該二官能性聚合物之聚合物主鏈較佳為具有複數個可對陽離子性官能基及烴基之二者進行官能基修飾之羧基、胺基、羥基等反應性取代基的單鏈聚合物。作為該單鏈聚合物主鏈結構，可列舉聚胺基酸、聚乙烯基衍生物、聚酯類、聚醚類、聚醯胺類、聚胺基甲酸酯類，較佳為於該等單鏈聚合物中具有複數個羧基、胺基、羥基等反應性取代基之單鏈聚合物。其中，較佳為經複數個羧基修飾之單鏈聚合物，可列舉：聚天冬胺酸、聚麩胺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚順丁烯二酸、聚(苯乙烯-順丁烯二酸)等聚羧酸高分子衍生物。即，較佳為使用二官能性聚合物，該二官能性聚合物係利用該等聚羧基修飾聚合物作為主鏈，對側鏈之羧基以酯鍵或醯胺鍵之形式導入複數個陽離子性官能基及複數個烴基之各官能基的二官能性聚合物。
該二官能性聚合物之分子量並無特別限定，本發明係指向血中投予，因此本發明組合物較佳為使用水溶液中所使用之分子量。該二官能性聚合物較佳為使用平均分子量為1,000~100,000之聚合物。再者，該平均分子量亦可使用根據利用GPC法(Gel Permeation Chromatography，凝膠滲透層析法)等常規方法之聚合物分子量測定方法所測定之分子量而規定之值。然而，該二官能性聚合物必須導入陽離子性官能基及烴基，因此較佳為根據平均每單位重量之側鏈官能基含量而算出平均分子量之方法。於側鏈官能基為羧基之情形時，較佳為藉由NMR(核磁共振，Nuclear Magnetic Resonance)法或滴定法而 求出羧基含量。更佳為使用利用滴定法所獲得之羧基含量，期待規定該二官能性聚合物之分子量。
二官能性聚合物(a)之聚合物主鏈較佳為聚胺基酸。作為用於導入陽離子性官能基及烴基之反應性取代基，較佳為使用具有羧基之聚天冬胺酸、聚麩胺酸或聚(天冬胺酸-麩胺酸)共聚物。具有該等側鏈羧基之聚胺基酸可為α-醯胺鍵型聚合物，亦可為與側鏈羧基之β或γ-醯胺鍵型聚合物，亦可為其混合物。作為該聚胺基酸之平均分子量，較佳為1,000~100,000，較佳為使用聚合數為8~800之範圍者。更佳為聚合數為10~200之聚胺基酸。
於上述二官能性聚合物(a)中，所謂導入之烴基，係指對於由該二官能性聚合物及核酸所形成之複合體賦予成為疏水性之功能之官能基。所謂該烴基，可列舉：可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C3~C60)之烷基、可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C3~C60)之烯基、可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C7~C60)之芳烷基。
較佳為可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基、可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基或可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基。尤佳為可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之烷基、可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之烯基或可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之芳烷基。
作為上述可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之烷基，例如可列舉辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基。
作為上述可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之烯基，例如可列舉9-十六烯基、順-9-十八烯基、順、順-9、12-十八碳二烯基等。
作為上述可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之芳烷基，例如可列舉2-苯乙基、4-苯丁基、8-苯辛基等。
再者，作為上述可具有取代基之烴基中之該取代基，可列舉：巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧羰氧基、胺甲醯氧基、經取代或未經取代之胺基、醯胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧基羰基、胺甲醯基或矽烷基等。於芳香環上具有取代基之情形時之取代位置可為鄰位，亦可為間位，亦可為對位。
作為上述碳環或雜環芳基，例如可列舉苯基、萘基等。作為雜環芳基，例如可列舉：吡啶基、嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、萘啶基、呋喃基、吡咯基、吲哚基、咪唑基、吡唑基、唑基、異唑基、三唑基等。
作為上述烷硫基，表示(C1~C8)之烷硫基，例如可列舉甲硫基、異丙硫基、苄硫基等。
作為上述芳硫基，例如可列舉苯硫基、萘硫基、吡啶硫基等。
作為上述烷基亞磺醯基，表示(C1~C8)之烷基亞磺醯基，例如可列舉甲基亞磺醯基、異丙基亞磺醯基、環己基亞磺醯基、苄基亞磺醯基等。
作為上述芳基亞磺醯基，例如可列舉苯基亞磺醯基、萘基亞磺醯基、吡啶基亞磺醯基等。
作為上述烷基磺醯基，表示(C1~C8)之烷基磺醯基，例如可列舉甲基磺醯基、異丙基磺醯基、苄基磺醯基等。
作為上述芳基磺醯基，例如可列舉苯基磺醯基、萘基磺醯基、吡啶基磺醯基等。
作為上述胺磺醯基，例如可列舉二甲基胺磺醯基、苯基胺磺醯基等。
作為上述烷氧基，表示(C1~C8)之烷氧基，例如可列舉：甲氧基、異丙氧基、苄氧基等一級烷氧基、異丙氧基、第二丁氧基等二級烷氧基、或第三丁氧基等三級烷氧基。
作為上述芳氧基，例如可列舉苯氧基、萘氧基、吡啶氧基等。
作為上述醯氧基，表示(C1~C8)之醯氧基，例如可列舉乙醯氧基、苯甲醯氧基等。
作為上述烷氧羰氧基，表示(C1~C8)之烷氧羰氧基，例如可列舉甲氧基羰氧基、三氟甲氧基羰基等。
作為上述胺甲醯氧基，例如可列舉二甲基胺甲醯氧基、苯基胺甲醯氧基等。
作為上述經取代或未經取代之胺基，例如表示未經取代之胺基、非環狀一級胺基或非環狀二級胺基或環狀二級胺基。作為該非環狀脂肪族一級胺基，(C1~C10)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基經N-單取代之胺基。例如可列舉：甲胺基、異丙胺基、新戊胺基、正己基胺基、環己基胺基、正辛胺基等。作為該非環狀脂肪族二級胺基，可相同，亦可不同，(C1~C10)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基為經N,N-雙取代之胺基。例如可列舉：二甲胺基、二異丙胺基、N-甲基-N-環己基胺基等。作為該環狀脂肪族二級胺基，可列舉：嗎啉基、哌-1-基、4-甲基哌-1-基、哌啶-1-基、吡咯啶-1-基等。
作為上述醯胺基，例如可列舉乙醯胺基、苯甲醯基胺基等。
作為上述烷氧基羰基胺基，例如可列舉甲氧基羰基胺基、乙氧基羰基胺基、苄氧基羰基胺基等。
作為上述脲基，例如可列舉三甲基脲基、1-甲基-3-苯基-脲基等。
作為上述磺醯胺基，例如可列舉甲磺醯胺基、苯磺醯胺基等。
作為上述胺磺醯胺基，例如可列舉二甲基胺磺醯胺基等。
作為上述醯基，例如可列舉乙醯基、特戊醯基、苯甲醯基、吡啶羰基等。
作為上述烷氧基羰基，例如可列舉甲氧基羰基、苄氧基羰基等。
作為上述胺甲醯基，例如可列舉二甲基胺甲醯基、苯基胺甲醯基等。
作為上述矽烷基，可列舉三甲基矽烷基、三異丙基矽烷基、第三丁基二甲基矽烷基、第三丁基二苯基矽烷基等。
導入至上述二官能性聚合物(a)中之烴基只要為可對由二官能性聚合物(a)及核酸所形成之複合體賦予顯示疏水性的物性之烴基即可，作為可具有取代基之烴基，可無特別限定地使用。尤佳為未經取代者、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧羰氧基。尤佳為使用未經取代之烴基。
上述二官能性聚合物(a)中，所謂導入之陽離子性官能基，係指承擔與核酸之磷酸基發揮靜電相互作用而形成該二官能性聚合物與該核酸的複合體之功能者。所謂該陽離子性官能基，只要為可與核酸之磷酸基引起靜電相互作用者，則並無特別限定。較佳為胺性氮官能基，例如可列舉：胺基、二烷基胺基、三烷基銨基、胍基。
作為上述二烷基胺基，較佳為表示(C1~C8)之二烷基胺基，例如可列舉：二甲胺基、二乙胺基、二異丙胺基、二丁胺基、二戊胺基、二環己基胺基、二苄胺基等。又，亦包含2個烷基為環狀之環狀二級胺基，例如可列舉：嗎啉基、哌-1-基、4-甲基哌-1-基、哌啶-1-基、吡咯啶-1-基等。
作為上述三烷基銨基，較佳為表示(C1~C8)之三烷基銨基，例 如可列舉：三甲銨基、三乙銨基、三異丙銨基、三丁銨基、三戊銨基、三己銨基等。
陽離子性官能基係作為包含上述胺基、上述二烷基胺基、上述三烷基銨基、上述胍基等胺性氮官能基之取代基而導入至上述二官能性聚合物(a)。
作為包含上述胺性氮官能基之取代基，亦可為上述胺性氮官能基所取代之可具有其他取代基之(C1~10)之烷基。較佳為可具有取代基之-(CH2)h-X基(該X基為上述胺性氮官能基，h表示1~10之整數)或可具有取代基之-(CH2)i-NH-(CH2)j-X基(該X基為上述胺性氮官能基，i及j表示1~5之整數)。
上述胺性氮官能基所取代之可具有其他取代基之(C1~10)之烷基係經由適當之鍵結基而導入至上述二官能性聚合物主鏈。作為該鍵結基，係根據二官能性聚合物之取代基鍵結性側鏈官能基之種類而適當設定者。例如於二官能性聚合物之取代基鍵結性側鏈官能基為羧基之情形時，作為該鍵結基，可列舉-NH-、氧原子(-O-)、硫原子(-S-)。較佳為-NH-或氧原子(-O-)。
即，較佳為可具有取代基之-NH-(CH2)h-X基(該X基及h與上述同義)或可具有取代基之-NH-(CH2)i-NH-(CH2)j-X基(該X基及i、j與上述同義)、或可具有取代基之-O-(CH2)h-X基(該X基及h與上述同義)或可具有取代基之-O-(CH2)i-NH-(CH2)j-X基(該X基及i、j與上述同義)。
於上述取代基中，作為可具有之取代基，可列舉：巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、烷基、烯基、炔基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧羰氧基、胺甲醯氧基、經取代或未經取代之胺基、醯胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧基羰基、N- 烷基醯胺基、胺甲醯基或矽烷基等。
作為該取代基，其中，較佳為烷氧基羰基(-CO-ORa；該Ra基表示(C1~C10)之烷基、(C7~C12)之芳烷基)或N-烷基醯胺基(-CO-NH-Rb；該Rb基表示(C1~C10)之烷基、(C7~C12)芳烷基)。尤佳為取代烷氧基羰基(-CO-ORa；該Ra基表示(C1~C10)之烷基或(C7~C12)之芳烷基)或N-烷基醯胺基(-CO-NH-Rb；該Rb基表示(C1~C10)之烷基或(C7~C12)之芳烷基)之-NH-(CH2)h-X基(該X基為上述胺性氮官能基，h表示1~10之整數)或可具有取代基之-NH-(CH2)i-NH-(CH2)j-X基(該X基為上述胺性氮官能基，i及j表示1~5之整數)。
尤其是，進而較佳為取代烷氧基羰基(-CO-ORa；該Ra基表示(C1~C10)之烷基或(C7~C12)芳烷基)或N-烷基醯胺基(-CO-NH-Rb；該Rb基表示(C1~C10)之烷基或(C7~C12)芳烷基)之-NH-(CH2)h-X基(該X基為上述胺性氮官能基，h表示1~10之整數)。
於上述-NH-(CH2)h-X基之鄰接於-NH-之亞甲基上具有該烷氧基羰基或N-烷基醯胺基之情形時，尤佳為胺基酸衍生物，可使用胺基酸酯衍生物或胺基酸醯胺衍生物。即，較佳為具有胺性氮官能基之離胺酸衍生物、鳥胺酸衍生物、精胺酸衍生物。更佳為精胺酸衍生物。
作為上述精胺酸衍生物，例如可列舉精胺酸烷基酯或精胺酸烷基醯胺。作為精胺酸烷基酯，例如可列舉：精胺酸甲酯、精胺酸乙酯、精胺酸異丙酯、精胺酸-第三丁酯、精胺酸苄酯等。作為精胺酸烷基醯胺，可列舉：精胺酸甲基醯胺、精胺酸乙基醯胺、精胺酸異丙基醯胺、精胺酸-第三丁基醯胺、精胺酸苄基醯胺、精胺酸二甲基醯胺等。
本發明之二官能性聚合物(a)係於聚合物主鏈上同時具有上述烴基及上述陽離子性官能基者，係於聚合物主鏈上對該烴基及該陽離子性官能基分別以複數莫耳當量進行接枝型取代之二官能性聚合物。 即，藉由製成以複數莫耳當量具備2種功能性取代基之聚合物，而指向用於以靜電相互作用與核酸形成複合體之聚陽離子性、及對所形成之該複合體賦予疏水性之情形。
本發明之二官能性聚合物(a)較佳為以聚天冬胺酸或聚麩胺酸作為該聚合物之主鏈並於側鏈羧基上直接或經由鍵結基而導入陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物。
作為用作主鏈之聚天冬胺酸或聚麩胺酸，可為α-醯胺鍵酸型聚合物，亦可為與側鏈羧基之β-醯胺鍵型或γ-醯胺鍵型，亦可為其混合物。作為該聚胺基酸之平均分子量，較佳為1,000~100,000，較佳為使用聚合數為8~800之範圍者。更佳為平均分子量為2,000~50,000，聚合數為20~400之範圍之聚胺基酸。
作為二官能性聚合物之較佳之態樣，係對於該聚天冬胺酸或聚麩胺酸之複數之側鏈羧基，分別以適當之當量直接或經由鍵結基而鍵結該陽離子性官能基及該烴基之結構。此處，該陽離子性官能基及該烴基之詳細情況與上述同義。
作為使聚天冬胺酸或聚麩胺酸之側鏈羧基與該陽離子性官能基及該烴基鍵結之態樣，可直接鍵結於側鏈羧基上，亦可經由適當之鍵結基而鍵結。
作為該鍵結基，並無特別限定，例如可列舉：一末端為與羰基之鍵結性官能基，另一末端為與上述陽離子性官能基及上述烴基具有鍵結性官能基之連結基。
作為該鍵結基，例如可列舉：氧原子(-O-)、-NH-、硫原子(-S-)、-NH-(CH2)x-(x表示1~10之整數)、-NH-(CH2)x-O-(x表示1~10之整數)、-NH-(CH2)x-NH-(x表示1~10之整數)、-NH-(CH2)x-S-(x表示1~10之整數)、-O-(CH2)y-(y表示1~10之整數)、-O-(CH2)y-O-(y表示1~10之整數)、-O-(CH2)y-NH-(y表示1~10之整數)、-O-(CH2)y-S-(y表示1 ~10之整數)等。
又，作為該鍵結基，亦可使用胺基酸。用作鍵結基之胺基酸可為天然型胺基酸、非天然型胺基酸之任一者，可為L體，亦可為D體。於使用胺基酸作為鍵結基之情形時，可列舉：二官能性聚合物之聚天冬胺酸或聚麩胺酸之羰基與該胺基酸之N末胺基鍵結，經由酯鍵或醯胺鍵而使上述陽離子性官能基及上述烴基與其他C末羧基鍵結之態樣。作為用作鍵結基之胺基酸，可列舉：甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸等。
較理想為對該二官能性聚合物(a)之聚合物主鏈平均每1分子導入上述陽離子性官能基10~100莫耳當量。較佳為具有聚合物主鏈平均每1分子之陽離子性官能基15~80莫耳當量之聚合物。於陽離子性基未達10莫耳當量/聚合物分子之情形時，與核酸之靜電相互作用之總和較小，該二官能性聚合物(a)與核酸之複合體形成變弱，故而欠佳。另一方面，於陽離子性官能基超過100莫耳當量/聚合物分子之情形時，為了取得上述烴基之取代基導入量之平衡，必須增大所使用之主鏈聚合物之分子量，增加與聚合物主鏈中之該陽離子性基及該烴基之鍵結性官能基數。因此，若主鏈聚合物之分子量變得過大，則無法獲得適當濃度之水性溶液，故而欠佳。
另一方面，於該二官能性聚合物(a)中，為了使其與上述核酸之複合體具備疏水性而需要上述烴基，較理想為於該二官能性聚合物(a)之聚合物平均每1分子中具有該陽離子性官能基10莫耳當量以上。上述烴基與上述陽離子性官能基之導入比率較佳為陽離子性官能基莫耳當量與上述可具有取代基之烴基之莫耳當量之比率(陽離子性官能基莫耳當量：上述可具有取代基之烴基莫耳當量)為1~5：1。更佳為該比率為1~3：1。
上述陽離子性官能基與上述烴基係於二官能性聚合物之主鏈上，作為側鏈修飾官能基而分別以複數當量鍵結者。該陽離子性取代基及該烴基鍵結於聚合物主鏈上之排列並無特別限定，可任意地設定。例如對於存在於聚合物主鏈上之複數個鍵結性側鏈官能基，可為該陽離子性官能基與該烴基交替鍵結之排列之二官能性聚合物，亦可為該陽離子性官能基與該烴基分別偏靠於局部之鍵結排列之二官能性聚合物，又，亦可為該陽離子性官能基與該烴基以無規排列之方式鍵結之態樣。作為該二官能性聚合物(a)，較佳為該陽離子性官能基與該烴基對於聚合物主鏈之側鏈鍵結性官能基無特別控制地以無規排列之方式分別鍵結之態樣。
作為本發明之二官能性聚合物(a)之較佳之態樣，可列舉：下述通式(1)
[式中，R1表示氫原子、(C1~C10)之烷基或(C7~C10)之芳烷 基，R2表示亞甲基或伸乙基，R3表示選自氫原子、(C1~C6)之醯基及(C1~C6)之烷氧基羰基中之1種，R4表示選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基及直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基所組成群中之1種以上之取代基，R5表示選自由羥基、羧基經保護之胺基酸及-N(R7)CONH(R8)所組成群中之1種以上之取代基，該R7及R8可相同亦可不同，表示(C3~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基、或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，R6表示直鏈狀或支鏈狀之(C1~C10)之烷基或直鏈狀或支鏈狀之(C7~C10)之芳烷基，X1、X2及X3表示鍵結基或鍵，a、b、c、d、e、f及g分別獨立地表示0~200之整數，聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數即(a+b+c+d+e+f+g)為10~200之整數，(a+b)為5~200之整數，(c+d)為5~200之整數，鍵結有精胺酸衍生物之構成單元、鍵結有R4之構成單元、鍵結有R5之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元分別獨立為無規排列]所表示之聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物。
作為上述R1及R6中之(C1~C10)之烷基，表示直鏈狀、支鏈狀或環狀之(C1~C10)之烷基。作為上述直鏈狀烷基，例如可列舉甲基、乙基、正丙基、正丁基、正己基、正癸基等。作為上述支鏈狀烷基，例如可列舉異丙基、第三丁基、1-甲基-丙基、2-甲基-丙基、2,2-二甲基丙基等。作為上述環狀烷基，例如可列舉環丙基、環丁基、環戊基、環己基、金剛烷基等。
又，作為上述R1及R6中之(C7~C10)之芳烷基，可列舉苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、4-苯丁基等。
通式(1)中，R6可於一分子中為同一官能基，亦可為不同取代基之組合。較佳為R6使用同一官能基。
作為上述R3中之(C1~C6)之醯基，可列舉甲醯基、乙醯基、丙醯 基、丁醯基、環丙基羰基、環戊羰基等。
作為上述R3中之(C1~C6)之烷氧基羰基，可列舉甲氧基羰基、乙氧基羰基、第三丁氧基羰基、環己氧基羰基等。
上述R4相當於二官能性聚合物(a)中之烴基。所謂該R4中之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基，例如可列舉辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基等。
所謂該R4中之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基，例如可列舉9-十六烯基、順-9-十八烯基、順、順-9、12-十八碳二烯基等。
作為該R4中之直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基，例如可列舉2-苯乙基、4-苯丁基、8-苯辛基等。
該等該R4之(C8~C40)之烷基、(C8~C40)之烯基及(C8~C40)之芳烷基亦可分別具有適當之取代基。
作為該取代基，可列舉：巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧羰氧基、胺甲醯氧基、經取代或未經取代之胺基、醯胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧基羰基、胺甲醯基或矽烷基等。芳香環上之取代位置可為鄰位，亦可為間位，亦可為對位。該取代基之定義與上述同義。
通式(1)中，一分子中之R4可為同一官能基，亦可為不同取代基之組合。較佳為R4使用同一官能基。
所謂上述R5中之羧基經保護之胺基酸，可為天然型胺基酸、非天然型胺基酸中之任一者，係指將該胺基酸之羧基轉變為酯衍生物或醯胺衍生物之官能基。
作為酯衍生物，較佳為直鏈狀、支鏈狀或環狀之(C1~C10)之烷基酯。作為上述直鏈狀烷基酯，例如可列舉甲酯、乙酯、正丙酯、正 丁酯、正己酯、正癸酯等。作為上述支鏈狀烷基酯，例如可列舉異丙酯、第三丁酯、1-甲基-丙酯、2-甲基-丙酯、2,2-二甲基丙酯等。作為上述環狀烷基酯，例如可列舉環丙酯、環丁酯、環戊基酯、環己酯、金剛烷基酯等。
作為上述醯胺衍生物，較佳為直鏈狀、支鏈狀或環狀之(C1~C10)之烷基醯胺。作為直鏈狀烷基醯胺，例如可列舉甲基醯胺、乙基醯胺、正丙基醯胺、正丁基醯胺、正己基醯胺、正癸基醯胺等。作為上述支鏈狀烷基醯胺，例如可列舉：異丙基醯胺、第三丁基醯胺、1-甲基-丙基醯胺、2-甲基-丙基醯胺、2,2-二甲基丙基醯胺等。作為上述環狀烷基醯胺，例如可列舉環丙基醯胺、環丁基醯胺、環戊基醯胺、環己基醯胺、金剛烷基醯胺等。
上述R5中，作為-N(R7)CONH(R8)之該R7及該R8中之(C3~C6)之直鏈、分支或環狀烷基，可列舉1-丙基、2-丙基、環戊基、環己基等。
作為該R7及R8中之可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，可列舉3-二甲胺基丙基、5-二甲胺基戊基等。
通式(1)中，上述R5為羥基、羧基經保護之胺基酸或-N(R7)CONH(R8)，為於一分子中包含該等之1種以上之取代基。較佳為羥基與-N(R7)CONH(R8)共存之取代基。
通式(1)中之X1、X2及X3係用於連結聚合物主鏈之羰基與精胺酸衍生物、R4或R6之鍵結基。作為該X1、X2及X3中之鍵結基，為一末端具有與羰基顯示鍵結性之官能基的連結基。例如可列舉：-NH-(CH2)k-(k表示0~6之整數)、-O-(CH2)k-(k表示0~6之整數)、-S-(CH2)k-(k表示0~6之整數)、-NH-(CH2)k-NH-(k表示0~6之整數)、-O-(CH2)k-NH-(k表示0~6之整數)、-S-(CH2)k-NH-(k表示0~6之整數)等。
又，作為該鍵結基，亦可使用胺基酸。用作鍵結基之胺基酸可為天然型胺基酸、非天然型胺基酸中之任一者，可為L體，亦可為D體。於使用胺基酸作為鍵結基之情形時，可列舉：主鏈聚合物之側鏈羰基與該胺基酸之N末胺基鍵結，經由酯鍵或醯胺鍵而使精胺酸衍生物、R4或R6與其他C末羧基鍵結之態樣。作為用作鍵結基之胺基酸，可列舉：甘胺酸、丙胺酸、β-丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸等。
又，於羰基與精胺酸衍生物、R4或R6可直接鍵結之情形時，即，無相當之鍵結性官能基之情形時，該X1、X2及X3表示鍵。
通式(1)中，該X1、X2及X3可於一分子中為同一鍵結基，亦可為不同鍵結基之混合體。
於通式(1)中R2為亞甲基之情形時，二官能性聚合物(a)之主鏈為聚天冬胺酸。聚天冬胺酸衍生物之主鏈之構成單元具有α-醯胺型聚合物、β-醯胺型聚合物及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元。另一方面，於通式(1)中R2為伸乙基之情形時，二官能性聚合物(a)之主鏈為聚麩胺酸。聚麩胺酸衍生物亦同樣，主鏈之構成單元亦可具有α-醯胺型聚合物、γ-醯胺型聚合物及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元。
通式(1)中之a、b、c、d、e、f及g表示於聚合物主鏈上鍵結有精胺酸衍生物之構成單元、鍵結有R4之構成單元、鍵結有R5之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型構成單元各自之含量。該a、b、c、d、e、f及g分別獨立地表示0~200之整數，就聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數而言，聚合物主鏈之聚合數即(a+b+c+d+e+f+g)亦可為10~200之整數。
其中，鍵結有精胺酸衍生物之構成單元為必須構成，其總含量數(a+b)為5~200之整數。作為疏水性烴基之鍵結有R4之構成單元亦為必須構成，其總含量數(c+d)為5~200之整數。再者，鍵結有R5之 構成單元及側鏈羧基為分子內環化型構成單元為任意之構成。
再者，於通式(1)所表示之聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物中，鍵結有精胺酸衍生物之構成單元、鍵結有R4之構成單元、鍵結有R5之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型構成單元亦可分別獨立為無規排列。即，於聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之側鏈羧基上，鍵結有精胺酸衍生物之構成單元、鍵結有R4之構成單元及鍵結有R5之構成單元、及側鏈羧基具有分子內環化型之構成單元可分別為以任意順序排列之態樣，亦可為使各構成單元局在化而偏局之排列之態樣，係以各構成單元無規則性之無規排列構成之聚合物結構。
再者，通式(1)所表示之二官能性聚合物為具有用於與核酸形成複合體之胍基及用於使該複合體成為疏水性物性之烴基的新穎之聚合物。該二官能性聚合物作為用於將核酸用作醫藥品之核酸輸送用聚合物而較為有用。因此，本發明亦包含通式(1)所表示之二官能性聚合物。
於上述通式(1)所表示之二官能性聚合物(a)中，較佳為R4為選自由(C8~C30)之烷基、(C8~C30)之烯基及(C8~C30)之芳烷基所組成之群中之1種以上之烴基。
又，較佳為聚合物主鏈之聚合數即(a+b+c+d+e+f+g)為15~200之整數。
進而，較佳為鍵結有精胺酸衍生物之構成單元之總含量數(a+b)為10~150之整數，作為疏水性烴基之鍵結有R4之構成單元之總含量數(c+d)為5~100之整數，(a+b)：(c+d)為1~3：1。
其此，揭示本發明之二官能性聚合物(a)之製造方法。
本二官能性聚合物(a)係藉由具有複數個相對於可進行官能基修飾之羧基、胺基、羥基等反應性官能基之單鏈聚合物，使具有適當之鍵結性官能基的含陽離子性官能基之化合物與具有適當之鍵結性官能 基之含烴基之化合物反應而製備。用於主鏈之單鏈聚合物可直接使用市售品，亦可使用由聚合反應所合成者。2個官能基之反應樣式可根據該單鏈聚合物之反應性官能基與該含陽離子性官能基之化合物及該含羥基之化合物的各鍵結性官能基之組合而適當設定。
較佳為使用：該單鏈聚合物使用反應性官能基為羧基之高分子化聚羧酸化合物，該含陽離子性官能基之化合物及該含烴基之化合物之各鍵結性官能基為胺基及/或羥基，以醯胺鍵樣式及/或酯鍵樣式鍵結之二官能性聚合物。於該情形時，使高分子化聚羧酸化合物與該含陽離子性官能基之化合物及該含烴基之化合物於適當之縮合條件下反應，藉此可合成該二官能性聚合物。縮合條件可適當使用可用於通常之有機合成反應之方法。
作為上述二官能聚合物(a)之主鏈聚合物，揭示可較佳地使用之聚天冬胺酸之合成方法之一態樣。
使N-羰基天冬胺酸酐於與適當之一級胺化合物或一級醇化合物中依序反應而合成於一末端具有一級胺鍵結殘基或一級醇鍵結殘基之聚天冬胺酸衍生物。於該情形時，在N-羰基天冬胺酸酐中，天冬胺酸側鏈之羧基較佳為使用苄酯等適當之羧酸保護基修飾體。所獲得之聚天冬胺酸衍生物亦可進而任意地使另一末端基(N末端)醯化。藉由於適當條件下對該聚天冬胺酸衍生物之側鏈羧基之保護基進行脫保護基反應，可獲得成為二官能性聚合物(a)之主鏈聚合物的聚天冬胺酸。
相對於該聚天冬胺酸，只要使具有胺基及/或羥基之該含陽離子性官能基之化合物及該含烴基之化合物於碳二醯亞胺脫水縮合劑等縮合反應條件下反應即可。根據該製造方法，可於聚天冬胺酸中同時導入相當於通式(1)之R5的-N(R7)CONH(R8)基，因此為有利之製造方法。
作為該碳二醯亞胺脫水縮合劑，可使用二環己基碳二醯亞胺 (DCC)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSC)等。於該脫水縮合反應時，亦可使用N,N-二甲胺基吡啶(DMAP)等反應輔助劑。
本發明中，陽離子性官能基與烴基之導入量可藉由於脫水縮合反應中適當增減各含官能基之化合物的饋入量而進行調整。再者，於使用二環己基碳二醯亞胺(DCC)作為碳二醯亞胺縮合劑之情形時，-N(R7)CONH(R8)之R7及R8成為環己基。於使用二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI)進行縮合反應之情形時，R7及R8成為異丙基。於使用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSC)之情形時，-N(R7)CONH(R8)之R7及R8成為乙基與3-二甲胺基丙基之混合取代體。
上述反應結束後，可經由任意之純化步驟而製造本發明之二官能性聚合物(a)。
作為上述二官能性聚合物(a)之主鏈聚合物，可較佳地使用之聚麩胺酸之合成方法係代替上述合成例中之N-羰基天冬胺酸酐而使用N-羰基麩胺酸酐獲得聚麩胺酸，其後，若導入該含陽離子性官能基之化合物及該含烴基之化合物，則可合成主鏈聚合物為聚麩胺酸之二官能性聚合物(a)。
[關於聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)]
本發明中，使用聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)。該嵌段型共聚物(b)係聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段以適當之連結基鍵結而成之AB嵌段型共聚物。
所謂該聚乙二醇鏈段，係指包含(CH2CH2O)單元結構之聚合度為5~20,000之聚乙二醇鏈之聚合物部。較佳為該聚合度為5~11,500。尤佳為包含該聚合度為40~2,500之聚乙二醇鏈之聚合物部。該聚乙二醇鏈段之聚乙二醇相當之平均分子量為500~900,000，較佳為500 ~500,000，尤佳為2,000~100,000。再者，所謂該聚乙二醇鏈段之分子量，係指藉由以聚乙二醇標準品作為基準之GPC法(Gel Permeation Chromatography，凝膠滲透層析法)而測定之峰頂分子量。
作為該疏水性聚合物鏈段，只要為與上述聚乙二醇鏈段相比顯示相對疏水性者，則可無特別限定地使用。例如可列舉：具有疏水性側鏈之聚胺基酸及聚胺基酸衍生物、聚丙烯酸酯或聚丙烯酸醯胺衍生物、聚甲基丙烯酸酯衍生物或聚甲基丙烯酸醯胺衍生物、聚順丁烯二酸酯衍生物或聚順丁烯二酸醯胺衍生物、聚苯乙烯、苯乙烯-順丁烯二酸共聚物、苯乙烯-順丁烯二酸酯共聚物等含聚羧酸之聚合物或其衍生物、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物等。
作為該疏水性聚合物鏈段，就可容易地調整疏水性之程度之理由而言，使用聚天冬胺酸、聚麩胺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚順丁烯二酸等含聚羧酸之聚合物，較佳為使用於該羧基中導入複數個疏水性取代基之聚羧酸酯或聚羧酸醯胺。更佳為使疏水性官能基鍵結於聚天冬胺酸之側鏈上之聚天冬胺酸酯或聚天冬胺酸醯胺、或使疏水性官能基鍵結於聚麩胺酸之側鏈上之聚麩胺酸酯或聚麩胺酸醯胺。
該疏水性聚合物鏈段之分子量只要為基於對於上述聚乙二醇鏈段顯示疏水性且該嵌段型共聚物(b)可顯示親水性-疏水性之兩親媒性之程度的重複聚合之分子量，則可無特別限定地使用。於該嵌段型共聚物(b)中，上述聚乙二醇鏈段之平均分子量為2,000~100,000之情形時，該疏水性聚合物鏈段之結構等效分子量以片段相當之平均分子量計較佳為1,000~100,000之結構部分，尤佳為3,000~60,000。
於使用含聚羧酸之聚合物作為該疏水性聚合物鏈段之情形時，較佳為基於用於導入疏水基之羧酸基當量而規定該疏水性聚合物鏈段之分子量。該羧酸當量較佳為平均每疏水性聚合物鏈段之羧基為10莫耳當量~300莫耳當量，更佳為羧基為15莫耳當量~100莫耳當量。 即，於使用聚天冬胺酸或聚麩胺酸之情形時，其聚合數，較佳為10~300，聚合數更佳為15~100。
於將上述含聚羧酸之聚合物用於該疏水性聚合物鏈段之主鏈聚合物之情形時，必須使疏水性官能基鍵結於羧基上而使該片段成為疏水性。作為鍵結於羧基上之疏水性官能基，可列舉可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之烷基、烯基或芳烷基。較佳為可列舉：直鏈狀或支鏈狀之(C1~C30)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C2~C30)之烯基、或直鏈狀或支鏈狀之(C7~C30)之芳烷基。
作為該烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基等。
作為該烯基，例如可列舉：乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基、9-十六烯基、順-9-十八烯基、順、順-9、12-十八碳二烯基等。
作為該芳烷基，例如可列舉苄基、4-苯丁基等。
上述疏水性官能基較佳為以酯型或醯胺型與含聚羧酸之聚合物之羧基鍵結。因此，作為上述疏水性官能基，較佳為作為具有對應之疏水性官能基之醇衍生物或胺衍生物而導入至含聚羧酸之聚合物中之態樣。
上述疏水性官能基可導入至含聚羧酸之聚合物之全部羧基中，亦可導入至一部分羧基中。未導入該疏水性官能基之羧基可為羧酸狀態，亦可為鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽或銨鹽等羧酸鹽，亦可為導入其他取代基之結構。
上述疏水性官能基係構成該嵌段型共聚物(b)之疏水性聚合物鏈段之疏水性物性者，根據該疏水性官能基之導入量及導入率而決定疏水性聚合物鏈段之疏水性物性。即，該疏水性官能基之導入量越多， 且該疏水性官能基之導入率越高，則成為較高之疏水性物性。疏水基導入率應考慮嵌段型共聚物(b)之兩親媒性而決定。
嵌段型共聚物(b)中之該疏水性聚合物鏈段較佳為主鏈聚合物結構為聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物。進而，較佳為於該疏水性聚合物鏈段中，該聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物具有疏水性基直接或經由鍵結基而鍵結於側鏈羧基上之片段結構，該疏水性基較佳為選自直鏈狀或支鏈狀之(C1~C30)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C2~C30)之烯基或直鏈狀或支鏈狀之(C7~C30)之芳烷基中之1種以上。
更佳為於嵌段型共聚物(b)中，聚乙二醇鏈段為伸乙基氧基單元：(CH2CH2O)為5~11,500之重複單元結構。又，疏水性聚合物鏈段為天冬胺酸衍生物單元或麩胺酸衍生物單元為5~200之重複單元結構之聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物。進而，該嵌段型共聚物(b)係該疏水性基直接或經由鍵結基而鍵結於側鏈羧基上，該疏水性基為選自直鏈狀或支鏈狀之(C1~C30)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C2~C30)之烯基或直鏈狀或支鏈狀之(C7~C30)之芳烷基中之1種以上之疏水性基，鍵結有疏水性基之天冬胺酸衍生物單元或鍵結有疏水基之麩胺酸衍生物單元具有3~200個。
所謂實現疏水性基與聚天冬胺酸或聚麩胺酸之側鏈羧基之鍵結之鍵結基，係一末端為與羰基之鍵結性官能基，另一末端具有與上述烴基之鍵結性官能基的連結基。
例如可列舉：氧原子(-O-)、-NH-、硫原子(-S-)、-NH-(CH2)x'-(x'表示1~10之整數)、-NH-(CH2)x'-O-(x'表示1~10之整數)、-NH-(CH2)x'-NH-(x'表示1~10之整數)、-NH-(CH2)x'-S-(x'表示1~10之整數)、-O-(CH2)y'-(y'表示1~10之整數)、-O-(CH2)y'-O-(y'表示1~10之整數)、-O-(CH2)y'-NH-(y'表示1~10之整數)、-O-(CH2)y'-S-(y'表示1~10之整數)等。
又，作為該鍵結基，可使用胺基酸。作為胺基酸，可為天然型胺基酸、非天然型胺基酸之任一者。關於作為鍵結基之胺基酸，可列舉：N末端胺基與聚合物主鏈之羧基進行醯胺鍵結，另一C末端羧基經由酯鍵或醯胺鍵而與上述疏水性基鍵結之態樣。
作為本發明之聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物嵌段型共聚物(b)之較佳之態樣，可列舉：下述通式(2)
[式中，R11表示氫原子或(C1~C10)之直鏈狀或支鏈狀之烷基，R12表示亞甲基或伸乙基，R13表示選自由氫原子、(C1~C6)之醯基及(C1~C6)之烷氧基羰基所組成之群中之1種，R14表示選自由(C1~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烷基、(C2~30)之直鏈狀或支鏈狀之烯基、(C7~C30)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基及羧基經保護之胺基酸所組成之群中之1種類以上之基，R15表示羥基及/或-N(R17)CONH(R18)，此處，R17及R18可相同亦可不同，表示(C3~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，R16表示(C1~C6)伸烷基，X11表示鍵結基或鍵，t表示5~11500之整數，m、n、o、p及q 獨立地表示0~200之整數，聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數即(m+n+o+p+q)表示5~200之整數，(m+n)表示3~200之整數，鍵結有R14之構成單元、鍵結有R15之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型構成單元分別獨立為無規排列]所表示之嵌段型共聚物。
作為上述R11中之(C1~C10)之烷基，表示可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C1~C10)之烷基。作為直鏈狀烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正己基、正癸基等。作為支鏈狀烷基，例如可列舉異丙基、第三丁基、1-甲基-丙基、2-甲基-丙基、2,2-二甲基丙基等。作為環狀烷基，例如可列舉環丙基、環丁基、環戊基、環己基、金剛烷基等。
通式(2)中，t表示(CH2CH2O)單元結構之聚合度，為5~11,500。較佳為t為10~5,000。
作為上述R13之(C1~C6)之醯基，可列舉甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、環丙基羰基、環戊羰基等。
作為上述R13中之(C1~C6)之烷氧基羰基，可列舉甲氧基羰基、乙氧基羰基、第三丁氧基羰基、環己氧基羰基等。
作為上述R14之(C1~C30)之烷基，為可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C1~C30)之烷基。例如可列舉：甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-己基、1-辛基、1-十二烷基、1-十四烷基、1-十六烷基、1-十八烷基等。
作為上述R14之(C2~C30)之烯基，為可具有取代基之直鏈狀或支鏈狀之(C2~C30)之烯基。例如可列舉：伸乙基、伸丙基、2-丁烯基、環己烯基、9-十六烯基、順-9-十八烯基、順、順-9、12-十八碳二烯基等。
作為上述R14之(C7~C30)芳烷基，為可具有取代基之直鏈狀或支 鏈狀之(C7~C30)芳烷基。例如可列舉：苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、4-苯丁基、6-苯己基等。
上述取代基中，作為可具有之取代基，可列舉：巰基、羥基、鹵素原子、硝基、氰基、碳環或雜環芳基、烷硫基、芳硫基、烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、胺磺醯基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、烷氧羰氧基、胺甲醯氧基、經取代或未經取代之胺基、醯胺基、烷氧基羰基胺基、脲基、磺醯基胺基、胺磺醯基胺基、甲醯基、醯基、羧基、烷氧基羰基、胺甲醯基或矽烷基等。芳香環上之取代位置可為鄰位，亦可為間位，亦可為對位。該取代基之定義係與二官能性聚合物(a)中之取代基之記載事項同義。
所謂上述R14之羧基經保護之胺基酸，為天然型胺基酸、非天然型胺基酸之任一者，係指將該胺基酸之羧基轉變為酯衍生物或醯胺衍生物之取代基。
該酯衍生物較佳為直鏈狀、支鏈狀或環狀之(C1~C10)之烷基酯。作為直鏈狀烷基酯，例如可列舉：甲酯、乙酯、正丙酯、正丁酯、正己酯、正癸酯等。作為支鏈狀烷基酯，例如可列舉：異丙酯、第三丁酯、1-甲基-丙酯、2-甲基-丙酯、2,2-二甲基丙酯等。作為環狀烷基酯，例如可列舉：環丙酯、環丁酯、環戊基酯、環己酯、金剛烷基酯等。
作為該醯胺衍生物，較佳為直鏈狀、支鏈狀或環狀之(C1~C10)烷基醯胺。作為直鏈狀烷基醯胺，例如可列舉：甲基醯胺、乙基醯胺、正丙基醯胺、正丁基醯胺、正己基醯胺、正癸基醯胺等。作為支鏈狀烷基醯胺，例如可列舉：異丙基醯胺、第三丁基醯胺、1-甲基-丙基醯胺、2-甲基-丙基醯胺、2,2-二甲基丙基醯胺等。作為環狀烷基醯胺，例如可列舉：環丙基醯胺、環丁基醯胺、環戊基醯胺、環己基醯胺、金剛烷基醯胺等。
上述R15亦可為-N(R17)CONH(R18)。該R17及R18可相同亦可不同，為(C3~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基、或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基。作為該(C3~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基，可列舉1-丙基、2-丙基、環戊基、環己基。作為該可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，可列舉3-二甲胺基丙基、5-二甲胺基戊基等。
上述R16係用於將聚乙二醇鏈段與聚天冬胺酸片段或聚麩胺酸片段鍵結之連結基，為(C1~6)之伸烷基。例如可列舉亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基。
通式(2)中之X11係用於將羰基與R14基連結之鍵結基。作為該X11中之鍵結基，係一末端具有與羰基顯示鍵結性之官能基之連結基。例如可列舉：氧原子(-O-)、-NH-、硫原子(-S-)、-NH-(CH2)r-O-(r表示0~6之整數)、-O-(CH2)r-O-(r表示0~6之整數)、-S-(CH2)r-O-(r表示0~6之整數)、-NH-(CH2)r-NH-(r表示0~6之整數)、-O-(CH2)r-NH-(r表示0~6之整數)、-S-(CH2)r-NH-(r表示0~6之整數)、-NH-(CH2)r-NHCO-(r表示0~6之整數)、-O-(CH2)r-NHCO-(r表示0~6之整數)、-S-(CH2)r-NHCO-(r表示0~6之整數)、-NH-(CH2)r-CONH-(r表示0~6之整數)、-O-(CH2)r-CONH-(r表示0~6之整數)、-S-(CH2)r-CONH-(r表示0~6之整數)、-NH-(CH2)r-CO-O-(r表示0~6之整數)、-O-(CH2)r-CO-O-(r表示0~6之整數)、-S-(CH2)r-CO-O-(r表示0~6之整數)等。
又，關於X11，於羰基與R14可直接鍵結之情形時，即，不存在相當之鍵結性官能基之情形時，該X11表示鍵。
進而，關於X11，亦可使用胺基酸鍵結殘基作為鍵結基。用作鍵結基之胺基酸可為天然型胺基酸、非天然型胺基酸之任一者。於X11為胺基酸鍵結殘基，使用胺基酸作為該鍵結基之情形時，可列舉：疏水性聚合物鏈段之羰基與該胺基酸之N末胺基鍵結，經由酯鍵或醯胺鍵而使R14基與另一C末羧基鍵結之態樣。因此，於使用胺基酸鍵結殘 基作為X11之情形時，X11為-NH-C(R20)-COO-(R20表示所使用之胺基酸之側鏈)所表示之鍵結基。
於通式(2)中，R12為亞甲基之情形時，該嵌段型共聚物(b)之疏水性聚合物鏈段之主鏈成為聚天冬胺酸。該聚天冬胺酸之構成單元具有α-醯胺型聚合物、β-醯胺型聚合物及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元。另一方面，於通式(2)中，R12為伸乙基之情形時，該嵌段型共聚物(b)中之疏水性聚合物鏈段之主鏈成為聚麩胺酸。該聚麩胺酸亦同樣，主鏈之構成單元亦可具有α-醯胺型聚合物、γ-醯胺型聚合物及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元。
通式(2)中之m、n、o、p及q表示於疏水性聚合物鏈段之聚合物主鏈上鍵結有R14之構成單元、鍵結有R15之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型構成單元各自之含量。該m、n、o、p及q分別獨立地表示0~200之整數，就聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數而言，作為疏水性聚合物鏈段之聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之聚合物主鏈之聚合數即(m+n+o+p+q)為5~200之整數。其中，鍵結有R14之構成單元為必須構成，其總含量數(m+n)為3~200之整數。再者，鍵結有R15之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型構成單元為任意之構成。
再者，通式(2)中，於作為疏水性聚合物鏈段之聚天冬胺酸衍生物鏈段或聚麩胺酸衍生物鏈段上，鍵結有R14之構成單元、鍵結有R15之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型構成單元分別獨立為無規排列。即，於聚天冬胺酸衍生物鏈段或聚麩胺酸衍生物鏈段之側鏈羧基上，鍵結有R14之構成單元及鍵結有R15之構成單元以及側鏈羧基具有分子內環化型結構之構成單元可為分別以任意之順序排列之態樣，亦可為各構成單元局在化而偏局之排列之態樣，亦可為以各構成單元無規則性之無規排列構成之聚合物結構。
於上述通式(2)所表示之嵌段型共聚物(b)中，較佳為R14為選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C30)烯基、直鏈狀或支鏈狀之(C7~C20)之芳烷基所組成之群中之1種以上，X11為氧原子(-O-)或-NH-。
又，較佳為作為疏水性聚合物鏈段之聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之聚合物主鏈之聚合數即(m+n+o+p+q)為6~150之整數，鍵結有R14基之構成單元之總含量數(m+n)為3~150之整數。
其次，對將本發明之聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之結構體即嵌段型共聚物(b)之製造方法進行說明。
本發明之嵌段型共聚物(b)之製造方法並無特別限定，可為將預先分別製備之聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段鍵結之方法，亦可為相對於聚乙二醇鏈段而使疏水性聚合物鏈段之聚合性單體逐次聚合反應而形成嵌段型共聚物之方法。或者，亦可為預先製備使聚乙二醇與疏水性聚合物鏈段之前驅物鍵結而成之AB嵌段型共聚物，於其中導入適當之疏水性官能基而進行製備之方法。
較佳為以如下方式製造：使用聚天冬胺酸等聚羧酸聚合物鏈段作為疏水性聚合物鏈段之前驅物，預先製備使聚乙二醇與聚羧酸聚合物鏈段鍵結而成之AB嵌段型共聚物，於其中，以醯胺鍵樣式及/或酯鍵樣式並於適當之縮合條件下使適當之疏水性官能基反應。縮合條件可適當使用可用於通常之有機合成反應中之方法。
作為上述嵌段型共聚物(b)之主鏈聚合物，對使用可較佳地使用之聚乙二醇鏈段與聚天冬胺酸片段連結而成之AB嵌段型共聚物於其中導入疏水性官能基而獲得該嵌段型共聚物(b)的製造方法之一態樣進行說明。
於一末端為胺基之聚乙二醇衍生物(例如甲氧基聚乙二醇-1-丙基胺)中，使β-苄酯等適當之側鏈羧基保護之N-羰基天冬胺酸酐依序反 應，藉由逐次聚合而構建聚乙二醇鏈段與聚天冬胺酸片段連結之AB嵌段型共聚物骨格。其後，實施適當之脫保護反應而合成具備複數之羧酸之AB嵌段型共聚物。於聚天冬胺酸側鏈為β-苄酯之情形時，可藉由鹼條件下之水解或氫化分解反應而進行脫保護基反應。
只要相對於具備該複數之羧酸之AB嵌段型共聚物而使具有胺基及/或羥基之含烴基等疏水性基之化合物於碳二醯亞胺脫水縮合劑等縮合反應條件下反應即可。根據該製造方法，可於AB嵌段型共聚物中同時導入相當於通式(2)之R15的-N(R17)CONH(R18)基，因此為有利之製造方法。
作為該碳二醯亞胺脫水縮合劑，可使用二環己基碳二醯亞胺(DCC)、二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSC)等。於該脫水縮合反應時，亦可使用N,N-二甲胺基吡啶(DMAP)等反應輔助劑。
嵌段型共聚物(b)之烴基等疏水性官能基之導入量可藉由於脫水縮合反應中適當增減各含疏水性基之化合物之饋入量而進行調整。再者，於使用二環己基碳二醯亞胺(DCC)作為碳二醯亞胺縮合劑之情形時，-N(R17)CONH(R18)之R17及R18成為環己基。於使用二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI)進行縮合反應之情形時，R17及R18成為異丙基。於使用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSC)之情形時，-N(R17)CONH(R18)之R17及R18成為乙基與3-二甲胺基丙基之混合取代體。
於上述反應結束後，可經由任意之純化步驟而製造本發明之嵌段型共聚物(b)。
作為上述嵌段型共聚物(b)之疏水性聚合物鏈段，可較佳地使用之聚麩胺酸之合成方法可代替上述合成例中之N-羰基天冬胺酸酐而使用N-羰基麩胺酸酐獲得聚麩胺酸，其後，若導入該含烴基之化合物， 則可合成疏水性聚合物鏈段為聚麩胺酸之嵌段型聚合物(b)。
[關於脂溶性添加劑(c)]
作為本發明中之脂溶性添加劑(c)，例如可列舉：維生素A及其衍生物、維生素D及其衍生物、維生素E及其衍生物、維生素K及其衍生物及膽固醇及其衍生物等。
作為維生素A及其衍生物，例如可列舉：視黃醇、視網醛、視黃酸、下述通式(3)所表示之化合物
[式中，R20表示選自由烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基及聚乙二醇所組成之群中之1種]、下述通式(4)所表示之化合物
[式中，X21表示NH、氧原子、硫原子，R21表示烷基、烯基等]、及下述通式(5)所表示之化合物 [化8]
[式中，X22表示NH、氧原子、硫原子，R22表示烷基、烯基、聚乙二醇等]等。
通式(3)所表示之化合物中，作為R20，可列舉烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等，較佳為可列舉(C1~C20)之烷基、(C2~C20)之烯基、(C1~C20)之烷氧基、(C1~C20)之烷基胺基、(C2~C20)之烯氧基、(C2~C20)之烯基胺基及分子量100~10,000之聚乙二醇等。
通式(4)所表示之化合物中，X21較佳為NH或氧原子。
作為R21，可列舉烷基、烯基，較佳為可列舉(C1~C20)之烷基、(C2~C20)之烯基。
通式(5)所表示之化合物中，X22較佳為NH或氧原子。
作為R22，可列舉烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等，較佳為可列舉：(C1~C20)之烷基、(C2~C20)之烯基、(C1~C20)之烷氧基、(C1~C20)之烷基胺基、(C2~C20)之烯氧基、(C2~C20)之烯基胺基、或分子量100~10,000之聚乙二醇等。
作為上述R20、R21、R22中之上述烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基等。
作為上述R20、R21、R22中之上述烯基，例如可列舉：乙烯基、1- 丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基、9-十六烯基、順-9-十八烯基、順、順-9、12-十八碳二烯基等。
作為上述R20中之上述烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、異丙氧基、第三丁氧基、苄氧基、十二烷氧基、辛十二烷氧基等。
作為上述R20中之上述烷基胺基，例如可列舉：甲胺基、乙基胺基、異丙基胺基、第三丁基胺基、苄基胺基、正十二烷基胺基、正十八烷基胺基等。
作為上述R20中之上述烯氧基，例如可列舉：乙烯氧基、1-丙烯氧基、1-丁烯氧基、9-十六烯氧基、順-9-十八烯氧基、順、順-9、12-十八碳二烯氧基等。
作為上述R20中之上述烯基胺基，例如可列舉：乙烯基胺基、1-丙烯基胺基、1-丁烯基胺基、9-十六烯基胺基、順-9-十八烯基胺基、順、順-9、12-十八碳二烯基胺基等。
作為上述R20中之上述聚乙二醇，為包含(CH2CH2O)基之重複結構之基，係指分子量100~10,000之片段結構。作為該聚乙二醇之末端基，為羥基、(C1~C6)之烷氧基。又，通式(3)中之鍵結側末端亦可為鍵結、氧原子(-O-)、-NH-、-OCO-(CH2)n'-COO-(n'表示1~4之整數)、-O-(CH2)n'-COO-(n'表示1~4之整數)、-O-(CH2)n'-O-(n'表示1~4之整數)等鍵結基。
脂溶性添加劑(c)中，作為維生素D及其衍生物，例如可列舉：麥角鈣化醇、膽鈣化醇、下述通式(6)所表示之化合物 [化9]
[式中，R31表示烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等]及下述通式(7)所表示之化合物
[式中，R32表示烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等]等。
通式(6)所表示之化合物中，作為R31，可列舉烷基、烯基、烷氧 基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等，較佳為可列舉：(C1~C20)之烷基、(C2~C20)之烯基、(C1~C20)之烷氧基、(C1~C20)之烷基胺基、(C2~C20)之烯氧基、(C2~C20)之烯基胺基及分子量100~10,000之聚乙二醇等。
通式(7)所表示之化合物中，作為R32，可列舉烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等，較佳為可列舉：(C1~C20)之烷基、(C2~C20)之烯基、(C1~C20)之烷氧基、(C1~C20)之烷基胺基、(C2~C20)之烯氧基、(C2~C20)之烯基胺基、或分子量100~10,000之聚乙二醇等。
作為上述R31、R32中之上述烷基，例如可：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基等。
作為上述R31、R32中之上述烯基，例如可列舉：乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基、9-十六烯基、順-9-十八烯基、順、順-9、12-十八碳二烯基等。
作為上述R31、R32中之上述烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、異丙氧基、t-丁氧基、苄氧基、十二烷氧基、辛十二烷氧基等。
作為上述R31、R32中之上述烷基胺基，例如可列舉：甲胺基、乙基胺基、異丙基胺基、第三丁基胺基、苄基胺基、正十二烷基胺基、正十八烷基胺基等。
作為上述R31、R32中之上述烯氧基，例如可列舉：乙烯氧基、1-丙烯氧基、1-丁烯氧基、9-十六烯氧基、順-9-十八烯氧基、順、順-9、12-十八碳二烯氧基等。
作為上述R31、R32中之上述烯基胺基，例如可列舉：乙烯基胺基、1-丙烯基胺基、1-丁烯基胺基、9-十六烯基胺基、順-9-十八烯基胺基、順、順-9、12-十八碳二烯基胺基等。
作為上述R31、R32中之上述聚乙二醇，為包含(CH2CH2O)基之重複結構之基，係指分子量100~10,000之片段結構。作為該聚乙二醇之末端基，為羥基、(C1~C6)之烷氧基。又，通式(6)及(7)中之鍵結側末端亦可為鍵結、氧原子(-O-)、-NH-、-OCO-(CH2)n'-COO-(n'表示1~4之整數)、-O-(CH2)n'-COO-(n'表示1~4之整數)、-O-(CH2)n'-O-(n'表示1~4之整數)等鍵結基。
於脂溶性添加劑(c)中，作為維生素E及其衍生物，例如可列舉：α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、及下述通式(8)所表示之化合物
[式中，R41表示烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等]等。
通式(8)所表示之化合物中，作為R41，可列舉烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等，較佳為可列舉：(C1~C20)之烷基、(C2~C20)之烯基、(C1~C20)之烷氧基、(C1~C20)之烷基胺基、(C2~C20)之烯氧基、(C2~C20)之烯基胺基或分子量100~10,000之聚乙二醇等。
作為上述R41中之上述烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基等。
作為上述R41中之上述烯基，例如可列舉：乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基、9-十六烯基、順-9-十八烯基、順、順-9、12-十八碳二烯基等。
作為上述R41中之上述烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、異丙氧基、第三丁氧基、苄氧基、十二烷氧基、辛十二烷氧基等。
作為上述R41中之上述烷基胺基，例如可列舉：甲胺基、乙基胺基、異丙基胺基、第三丁基胺基、苄基胺基、十二烷基胺基、十八烷基胺基等。
作為上述R41中之上述烯氧基，例如可列舉：乙烯氧基、1-丙烯氧基、1-丁烯氧基、9-十六烯氧基、順-9-十八烯氧基、順、順-9、12-十八碳二烯氧基等。
作為上述R41中之上述烯基胺基，例如可列舉：乙烯基胺基、1-丙烯基胺基、1-丁烯基胺基、9-十六烯基胺基、順-9-十八烯基胺基、順、順-9、12-十八碳二烯基胺基等。
作為上述R41中之上述聚乙二醇，為包含(CH2CH2O)基之重複結構之基，係指分子量100~10,000之片段結構。作為該聚乙二醇之末端基，為羥基、(C1~C6)之烷氧基。又，通式(8)中之鍵結側末端亦可為鍵結、氧原子(-O-)、-NH-、-OCO-(CH2)n'-COO-(n'表示1~4之整數)、-O-(CH2)n'-COO-(n'表示1~4之整數)、-O-(CH2)n'-O-(n'表示1~4之整數)等鍵結基。作為生育酚-聚乙二醇鍵結衍生物之鍵結基，較佳為琥珀酸鍵結基，例如可使用α-生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯、β-生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯、γ-生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯、δ-生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯等。
於脂溶性添加劑(c)中，作為維生素K及其衍生物，例如可列舉：葉綠醌、甲萘醌類、甲萘醌、甲萘氫醌等。
於脂溶性添加劑(c)中，作為膽固醇類及其衍生物，例如可列 舉：膽固醇、二氫膽固醇、毒毛旋花子苷元(Strophanthidine)、及下述通式(9)所表示之化合物
[式中，R51表示烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等]等。
通式(9)所表示之化合物中，作為R51，可列舉烷基、烯基、烷氧基、烷基胺基、烯氧基、烯基胺基、聚乙二醇等，較佳為可列舉：(C1~C20)之烷基、(C2~C20)之烯基、(C1~C20)之烷氧基、(C1~C20)之烷基胺基、(C2~C20)之烯氧基、(C2~C20)之烯基胺基及分子量100~10,000之聚乙二醇等。
作為R51中之上述烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正辛基、正癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基等。
作為R51中之上述烯基，例如可列舉：乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基、9-十六烯基、順-9-十八烯基、順、順-9、12-十八碳二烯基等。
作為R51中之上述烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、異丙氧基、第三丁氧基、苄氧基、十二烷氧基、辛十二烷氧基等。
作為R51中之上述烷基胺基，例如可列舉：甲胺基、乙基胺基、 異丙基胺基、第三丁基胺基、苄基胺基、十二烷基胺基、十八烷基胺基等。
作為R51中之上述烯氧基，例如可列舉：乙烯氧基、1-丙烯氧基、1-丁烯氧基、9-十六烯氧基、順-9-十八烯氧基、順、順-9、12-十八碳二烯氧基等。
作為R51中之上述烯基胺基，例如可列舉：乙烯基胺基、1-丙烯基胺基、1-丁烯基胺基、9-十六烯基胺基、順-9-十八烯基胺基、順、順-9、12-十八碳二烯基胺基等。
作為上述R51中之上述聚乙二醇，為包含(CH2CH2O)基之重複結構之基，係指分子量100~10,000之片段結構。作為該聚乙二醇之末端基，為羥基、(C1~C6)之烷氧基。又，通式(9)中之鍵結側末端亦可為鍵結、氧原子(-O-)、-NH-、-OCO-(CH2)n'-COO-(n'表示1~4之整數)、-O-(CH2)n'-COO-(n'表示1~4之整數)、-O-(CH2)n'-O-(n'表示1~4之整數)等鍵結基。
本發明中，作為脂溶性添加劑(c)，較佳為使用維生素E衍生物、維生素D衍生物或膽固醇衍生物。該等可單獨使用1種，亦可混合2種以上而使用。尤佳為使用作為維生素E衍生物之生育酚及生育酚-聚乙烯鍵結衍生物、作為維生素D衍生物之麥角鈣化醇或膽鈣化醇、作為膽固醇衍生物之膽固醇及膽固醇醯基衍生物。
作為本發明中所使用之脂溶性添加劑(c)，為可作為市售品獲得者，亦可直接使用流通之化合物。
本發明之核酸輸送用組合物係含有導入有陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物(a)、聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)及脂溶性添加劑(c)者。該二官能性聚合物(a)、該嵌段型共聚物(b)及該脂溶性添加劑(c)之混合比並無特別限定，較佳為以各成分之質量比計，該二官能性聚合物(a)：該嵌段型共聚物 (b)：該脂溶性添加劑(c)=1：0.1~10：0.1~10。更佳為該二官能性聚合物(a)：該嵌段型共聚物(b)：該脂溶性添加劑(c)=1：0.1~5：0.1~5。
於該核酸輸送用組合物中，增加該嵌段型共聚物(b)及該脂溶性添加劑(c)之添加量，借此該等成分產生強固之相互作用，可製備較強之締合性複合體，可指向核酸醫藥之強固之保持及血中投予中之血中滯留性。另一方面，藉由減少該嵌段型共聚物(b)及該脂溶性添加劑(c)之添加量，可製成利用緩和之相互作用的締合性複合體，可指向核酸醫藥成分之快速釋出。
關於本發明之核酸輸送用組合物，若該二官能性聚合物(a)、該嵌段型共聚物(b)及脂溶性添加劑(c)使用上述各結構之構成成分，則其組合並無特別限定，可任意選擇並組合各構成成分而使用。然而，於活體投予後，以在細胞內有效地釋出作為被輸送體之核酸分子之情形為目的之情形時，本發明之核酸輸送用組合物必須設為提高核酸成分之釋出性之組合物。
於製作提高核酸釋出性之核酸輸送用組合物之情形時，該二官能性聚合物(a)及該嵌段型共聚物(b)較佳為設為相互之疏水性官能基及聚合物主鏈不同之結構。即，例如於為該二官能性聚合物(a)以聚麩胺酸作為聚合物主鏈並作為疏水性官能基而鍵結直鏈狀(C8~C30)之烷基的結構之情形時，可列舉組合如下結構之組成：該嵌段型共聚物(b)將疏水性聚合物鏈段之聚合物主鏈設為聚天冬胺酸並作為疏水性官能基而鍵結(C7~C30)之芳烷基的結構。又，作為其相反之態樣，於使用以聚天冬胺酸作為主鏈並作為疏水性官能基而導入(C7~C30)之芳烷基的該二官能性聚合物(a)之情形時，組合之該嵌段型共聚物(b)較佳為設為以聚麩胺酸作為疏水性聚合物鏈段之主鏈並賦予直鏈狀之(C8~C30)之烷基疏水性官能基的組成。
藉由設為上述組成，該二官能性聚合物(a)與核酸所形成之複合體與該嵌段型共聚物(b)之間所產生的疏水性相互作用變得相對較弱，故而利用該複合體及該嵌段型共聚物(b)之締合體形成成為基於較弱之凝集力者。因此，於活體內投予後，可促進包含核酸之該複合體之快速的解離-釋出。如此，本發明之核酸輸送用組合物之二官能性聚合物(a)及嵌段型共聚物(b)之各聚合物結構只要以核酸成分之釋出性的調整為目的而適當設計即可。
本發明之核酸輸送用組合物係用於如下情形：與核酸混合並將該核酸投予至活體內，遞送至目標組織後，將該核酸輸送至目標組織細胞。因此，本發明亦含有於包含上述二官能性聚合物(a)、上述嵌段型共聚物(b)及上述脂溶性添加劑(c)之核酸輸送用組合物中含有核酸之核酸醫藥組合物。
本發明中，核酸醫藥組合物中所使用之核酸並無限制。即，作為該核酸，可列舉DNA、RNA、天然或非天然之核酸相關物(例如肽核酸等)、改型核酸、修飾核酸等，亦可為任一者。又，核酸可為一條鏈，亦可為二條鏈，蛋白質之編碼之有無或其他功能之有無亦無限制。
其中，作為核酸，較佳為於遞送至活體內之情形時，可對活體、組織、細胞等發揮某些作用之功能性核酸。作為功能性核酸，可列舉：質體DNA、siRNA、miRNA(微RNA)、反義RNA、反義DNA、誘餌核酸、核酶、DNA酶、各種抑制基因(癌抑制基因等)、功能性改型核酸‧修飾核酸(例如核酸之磷酸部分改型為硫代磷酸酯、亞膦酸二甲酯、磷酸三酯、亞磷醯胺等之核酸、或者膽固醇或維生素E等鍵結疏水性官能基之核酸)等。該等係根據核酸遞送用組合物之用途而選擇。
作為質體DNA，只要為可於目標細胞‧組織中發揮所需之功能 者即可。關於該質體DNA，已知有多種，業者可根據核酸遞送用組合物之用途而選擇所需之質體DNA。
又，作為siRNA，只要為可利用RNA干擾(RNAi)抑制目標基因之表現者即可。作為RNA干擾之目標基因，可較佳地列舉：癌(腫瘤)基因、抗細胞凋亡基因、細胞週期關連基因、增殖訊號基因等。又，siRNA之鹼基長度並無限定，通常未達30個鹼基，較佳為10~25個鹼基。
本發明中，作為核酸，較佳為使用具有利用RNA干擾(RNAi)之目標基因之表現抑制作用的RNA，較佳為使用siRNA、miRNA、反義RNA。尤佳為使用鹼基長度為10~25個鹼基之siRNA。
本發明之核酸輸送用組合物可藉由與核酸混合並形成複合體而用作核酸醫藥組合物。於製備該核酸醫藥組合物之情形時，該核酸係藉由靜電相互作用而與上述二官能性聚合物(a)形成複合體。因此，核酸之適量係根據與二官能性聚合物(a)之適量而設定，根據核酸之磷酸基(P)與該二官能性聚合物(a)之陽離子電荷(N)之比而規定。核酸為適量之核酸之磷酸基(P)與該二官能性聚合物(a)之陽離子電荷(N)之比(N/P)並無特別限定，較佳為N/P=0.5~50，更佳為N/P=1~20。
本發明之核酸醫藥組合物係藉由製備包含導入有陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物(a)、聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)及脂溶性添加劑(c)的核酸輸送用組合物、與核酸之混合物而製作。該核酸醫藥組合物係藉由包含核酸之全部構成成分發生相互作用而形成締合體者。即，藉由利用因核酸之陰離子電荷與該二官能性聚合物(a)之陽離子電荷所引起之靜電相互作用而形成複合體(聚離子錯合物，亦稱為PIC)，藉此保持核酸。該複合體具備來自二官能性聚合物(a)之烴基，因此為疏水性。因此，該複合體係藉由與嵌段型共聚物(b)及脂溶性添加劑(c)之疏水性相互作 用而形成締合體。該締合體係藉由利用動態光散射法所進行之分析而觀測到明確之光散射強度，因此可認為形成數奈米~數百奈米左右之奈米粒子狀締合體。
該締合體之製備方法並無特別限定，可藉由如下方式製備：將二官能性聚合物(a)、嵌段型共聚物(b)溶解於包含水之溶劑中，向其中添加核酸水溶液後，添加脂溶性添加劑(c)之醇溶液。或者，可藉由如下方式二製備：使二官能性聚合物(a)、嵌段型共聚物(b)溶解於包含水之溶劑中，向其中添加脂溶性添加劑(c)之醇溶液後，添加核酸水溶液。
本發明之核酸醫藥組合物可用於在活體外或活體內將核酸遞送至目標細胞或組織。根據本發明之核酸醫藥組合物，可於穩定之狀態下容易地遞送難以穩定地向目標細胞內遞送之核酸。進而，於使用抑制基因表現之核酸，將其遞送至細胞或組織並使之表現效果之情形時，藉由使用本發明之核酸醫藥組合物，可獲得較高之基因表現抑制效率。
於使用本發明之核酸醫藥組合物將核酸遞送至目標細胞或組織時，只要為核酸醫藥組合物可與目標細胞或組織接觸之狀態即可。
於活體外達成本發明之核酸醫藥組合物與目標細胞或組織之接觸時，只要於本發明之核酸醫藥組合物之存在下培養目標細胞或組織或於目標細胞或組織之培養物中添加該核酸醫藥組合物即可。
於體內達成本發明之核酸醫藥組合物與目標細胞或組織之接觸時，只要藉由基因治療等該技術領域中通常使用之投予方法而將本發明之核酸醫藥組合物投予至需要該核酸之導入的個體(或應處置之個體)即可。作為上述個體，並無限定，可列舉：人類、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、猴、牛、馬、豬、鳥類等。作為投予方法，可列舉：向目標細胞或組織之附近或組織內之直接導入或移植、靜脈注入、動脈 注入、肌肉注入、經口投予、經肺投予等。投予量、投予次數及投予期間等各條件可根據被試驗動物之種類及狀態等而適當設定。
作為成為利用本發明之核酸醫藥組合物之治療對象之疾病，只要為由基因之不適當之功能表現所引起的疾病，則並無特別限定，例如可列舉：癌(肺癌、胰腺癌、腦腫瘤、肝癌、乳癌、大腸癌、神經芽細胞種及膀胱癌等)、循環器官疾病、運動器官疾病、中樞系統疾病等。
本發明之醫藥組合物亦可包含通常用於醫藥製劑之其他添加劑。作為其他添加劑，可列舉：賦形劑、增量劑、填充劑、鍵結劑、濕潤劑、崩解劑、潤滑劑、界面活性劑、分散劑、緩衝劑、保存劑、溶解輔助劑、防腐劑、矯味矯臭劑、無痛化劑、穩定劑及等張劑等。該等其他添加劑可單獨使用1種，亦可以任意之組合及比率使用2種以上。關於該等其他成分之種類或使用量等之詳細情況，業者可根據醫藥組合物之目的、用途、使用方法等而適當決定。
本發明之醫藥組合物之形態亦為任意，通常採用靜脈內注射劑(包含點滴)，例如以單位投予量安瓿或其他投予量容器之狀態等提供。
本發明之醫藥組合物之使用方法亦為任意。若為包含核酸輸送用組合物之醫藥組合物，則可直接投予。
[實施例]
以下，藉由實施例進一步說明本發明。但是，本發明並不限定於該等實施例。
再者，所使用之siRNA係使用siCON(無規排列(分子量約13K)、siRNA濃度100μM之HEPES溶液(pH值7)；北海道系統科學(Hokkaido System Science)公司製造)、siLuc(螢光素酶編碼(分子量約13K)、siRNA濃度100μM之HEPES溶液(pH值7)；北海道系統科學(Hokkaido System Science)公司製造)、FAM-siLuc(螢光素酶編碼之螢光標記體(分子量約13K)、siRNA濃度100μM之HEPES溶液(pH值7)；北海道系統科學(Hokkaido System Science)公司製造)、siR2B(RRM2編碼(分子量約13K)、siRNA濃度100μM之HEPES溶液(pH值7)；Cosmo Bio股份有限公司製造)。
又，於本發明品及比較例中，水溶液中所構成之締合體之分析平均粒徑係藉由動態光散射法(Zetasizer Nano-ZS、Malvern公司製造)而進行測定。
[合成例1]化合物1(平均聚合數55之聚麩胺酸)之合成
將正丁基胺(東京化成製造)23μL溶解於DMSO(二甲亞碸，Dimethyl sulfoxide)20mL中之後，添加γ-苄基-L-麩胺酸-N-羧酸酐3g並於30℃下攪拌一晚。於反應液中添加乙醇80mL及二異丙醚320mL並於室溫下攪拌3小時，過濾取得沈析物並利用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v)、40mL)進行洗淨。
將對沈析物進行真空乾燥而獲得之固形物(2.6g)於50℃下溶解於DMF(二甲基甲醯胺，Dimethylformamide)50mL中之後，於室溫下添加乙酸酐1mL並於該溫度下攪拌一晚。於反應液中添加乙酸乙酯100mL及二異丙醚400mL並於室溫下攪拌3小時。過濾取得沈析物並利用乙酸乙酯/二異丙醚(1/4(v/v)、50mL)進行洗淨。對沈析物進行真空乾燥而獲得固形物(2.5g)。
於該沈析固形物2g中添加DMF 42mL並於50℃下溶解後，於室溫下添加5%鈀-碳(NE ChemCat公司製造)200mg，於室溫下氫化分解一夜。於反應液中添加活性碳400mg後，立即進行過濾而過濾分離觸媒等。其後，於反應液中添加乙酸乙酯192mL及二異丙醚768mL並於室溫下攪拌3小時，過濾取得沈析物並利用乙酸乙酯/二異丙醚(1/4(v/v)、100mL)進行洗淨。對沈析物進行真空乾燥而獲得化合物 1(1.6g)。
1H-NMR(400MHz、D2O、ppm)：0.70(t、正丁基胺末端CH3、3H、積分值3.00)、4.16(dd、麩胺酸αCH、1H、積分值54.93)
根據自積分值算出之莫耳比而算出聚合數為55。
[合成例2]化合物2(平均聚合數102之聚麩胺酸)之合成
將正丁基胺(東京化成製造)11μL溶解於DMSO 40ml中之後，添加γ-苄基-L-麩胺酸-N-羧酸酐3g並於30℃下攪拌一晚。於反應液中添加乙酸乙酯160mL及二異丙醚640mL並於室溫下攪拌3小時，過濾取得沈析物並利用乙酸乙酯/二異丙醚(1/4(v/v)、100mL)進行洗淨。
將對沈析物進行真空乾燥而獲得之固形物(2.4g)於50℃下溶解於DMF 50mL中之後，於室溫下添加乙酸酐1mL並於該溫度下攪拌一晚。於反應液中添加乙酸乙酯100mL及二異丙醚400mL並於室溫下攪拌3小時，過濾取得沈析物並利用乙酸乙酯/二異丙醚(1/4(v/v)、50mL)進行洗淨。對沈析物進行真空乾燥而獲得固形物(2.4g)。
於該沈析固形物2g中添加DMF 42mL並於50℃下溶解後，於室溫下添加5%鈀-碳(NE ChemCat公司製造)200mg，於室溫下氫化分解一夜。於反應液中添加活性碳400mg後，立即進行過濾而過濾分離觸媒等，其後，於反應液中添加乙酸乙酯192mL及二異丙醚768mL並於室溫下攪拌3小時，過濾取得沈析物並利用乙酸乙酯/二異丙醚(1/4(v/v)、100mL)進行洗淨。對沈析物進行真空乾燥而獲得化合物2(1.5g)。
1H-NMR(400MHz、D2O、ppm)：0.71(t、正丁基胺末端CH3、3H、積分值3.00)、4.15(dd、麩胺酸αCH、1H、積分值101.73)
根據自積分值算出之莫耳比而算出聚合數為102。
[合成例3]化合物3(聚合數為55之麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)之合成
將合成例1中所獲得之化合物1(76mg)溶解於DMF 2mL中並於25℃下添加硬脂胺(東京化成製造)48mg、1-羥基苯并三唑(以下，記作HOBt)88mg、二異丙基碳二醯亞胺(以下，記作DIPCI)183μL，於25℃下攪拌1小時後投入在另一容器中製備之L-精胺酸甲酯2鹽酸鹽(國產化學製造)108mg、三乙基胺115μL、DMF 1.4mL之混合溶液，進而於25℃下攪拌一晚。於反應液中添加乙醇13mL及二異丙醚53mL並於室溫下攪拌2小時，過濾取得沈析物並利用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v)、20mL)進行洗淨。使所獲得之沈析物懸濁於0.1N鹽酸水1mL中之後，添加丙酮20mL並攪拌30分鐘。收集沈析物，利用丙酮5mL進行洗淨並乾燥後，溶解於水40mL中並過濾分離不溶物，其後，添加乙腈100mL並通過離子交換樹脂管柱(Dow Chemical製Dowex 50(H+)、5mL)，利用乙腈/水(1/1(v/v)、10mL)進行溶出。於減壓下自所獲得之溶出組分中餾去乙腈，其次，進行凍結乾燥，藉此獲得化合物3(132mg)。
1H-NMR(400MHz、DMSO、ppm)：1.1~1.3(Br、硬脂基CH2+精胺酸CH2、34H、積分值66.52)、3.61(s、精胺酸甲酯、3H、積分值9.43)、4.22(Br、精胺酸αCH+麩胺酸αCH、2H、積分值8.17)
根據各積分值而算出，相對於麩胺酸之聚合數55個，鍵結於化合物3上之硬脂胺與L-精胺酸甲酯之平均個數係硬脂胺為20.5個，L-精胺酸甲酯為34.3個。
[合成例4]利用化合物4(聚合數為102之麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)之合成
將合成例2中所獲得之化合物2(76mg)溶解於DMF 2mL中並於25℃下添加硬脂胺(東京化成製造)48mg、HOBt 88mg、DIPCI 183μL，於25℃下攪拌1小時後投入在另一容器中製備之L-精胺酸甲酯2鹽酸鹽(國產化學製造)108mg、三乙基胺115μL、DMF 1.4mL之混合溶 液，進而於25℃下攪拌一晚。於反應液中添加乙醇13mL及二異丙醚53mL並於室溫下攪拌2小時，過濾取得沈析物並利用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v)、20mL)進行洗淨。使所獲得之沈析物懸濁於0.1N鹽酸水1mL中之後，添加丙酮20mL並攪拌30分鐘。收集沈析物，利用丙酮5mL進行洗淨並乾燥後，溶解於水40mL中並過濾分離不溶物，其後，添加乙腈100mL並通過離子交換樹脂管柱(Dow Chemical製Dowex 50(H+)、5mL)，利用乙腈/水(1/1(v/v)、10mL)進行溶出。於減壓下自所獲得之溶出組分中餾去乙腈，其次，進行凍結乾燥，藉此獲得化合物4(141mg)。
1H-NMR(400MHz、DMSO、ppm)：1.1~1.3(Br、硬脂基CH2+精胺酸CH2、34H、積分值74.32)、3.61(s、精胺酸甲酯、3H、積分值10.19)、4.21(Br、精胺酸αCH+麩胺酸αCH、2H、積分值9.65)
根據各積分值而算出，相對於麩胺酸之聚合數102個，鍵結於化合物4上之硬脂胺與L-精胺酸甲酯之平均個數係硬脂胺為34.3個，L-精胺酸甲酯為55.3個。
[合成例5]化合物5(聚合數為102之麩胺酸與油胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)之合成
將合成例2中所獲得之化合物2(100.0mg)溶解於DMF3.6mL中並於25℃下添加油胺(Sigma Aldrich製造)61.6mg、HOBt 129.3mg、DIPCI 193.8μL，於25℃下攪拌1小時後投入在另一容器中製備之L-精胺酸甲酯2鹽酸鹽(國產化學製造)140.4mg、二異丙基乙基胺187.2μL、DMF 1.4mL之混合溶液，進而於25℃下攪拌一晚。於反應液中添加乙醇18mL及二異丙醚72mL並於室溫下攪拌1小時，過濾取得沈析物並利用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v)、20mL)進行洗淨。使所獲得之沈析物溶解於二甲基乙醯胺中，使用透析膜(MWCO 3,500)並利用作為外液之0.1N鹽酸乙腈/水(1/1(v/v)、500mL)及水500mL進行透析。其 次，進行凍結乾燥，藉此獲得化合物5(116.2mg)。
1H-NMR(400MHz、DMSO、ppm)：3.61(s、精胺酸甲酯、3H、積分值3.13)、4.22(Br、精胺酸αCH+麩胺酸αCH、2H、積分值3.16)、5.30(Br、油胺、2H、積分值1.66)
根據各積分值而算出，相對於麩胺酸之聚合數102個，鍵結於化合物5上之油胺與L-精胺酸甲酯之平均個數係硬脂胺為39.9個，L-精胺酸甲酯為50.1個。
[合成例6]化合物6(聚合數為102之麩胺酸與4-苯基丁基胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)之合成
將合成例2中所獲得之化合物2(78mg)溶解於DMF 2mL中並於25℃下添加4-苯基丁基胺(東京化成製造)29μL、HOBt 90mg、DIPCI 188μL，於25℃下攪拌1小時後投入在另一容器中製備之L-精胺酸甲酯2鹽酸鹽(國產化學製造)111mg、三乙基胺118μL、DMF 1.4mL之混合溶液，進而於25℃下攪拌一晚。於反應液中添加乙醇13mL及二異丙醚53mL並於室溫下攪拌2小時，過濾取得沈析物並利用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v)、20mL)進行洗淨。將所獲得之沈析物溶解於0.1N鹽酸水1mL中之後，添加丙酮20mL並攪拌30分鐘。收集沈析物，利用丙酮5mL進行洗淨並乾燥後，溶解於水4mL中並過濾分離不溶物，其後，添加乙腈16mL並通過離子交換樹脂管柱(Dow Chemical製Dowex 50(H+)、3mL)，利用乙腈/水(1/1(v/v)、9mL)進行溶出。於減壓下自所獲得之溶出組分中餾去乙腈，其次，進行凍結乾燥，藉此獲得化合物6(131mg)。
1H-NMR(400MHz、D2O、ppm)：3.57(Brs、精胺酸甲酯、3H、積分值15.81)、4.21(m、精胺酸αCH+麩胺酸αCH、2H、積分值15.81)、6.83(m、4-苯基丁基胺之苯基、5H、積分值17.88)
根據各積分值而算出，相對於麩醯胺之聚合數102個，鍵結於化 合物6上之硬脂胺與L-精胺酸甲酯之平均個數係4-苯基丁基胺為34.6個，L-精胺酸甲酯為50.9個。
[合成例7]化合物7(聚合數為102之麩胺酸與十二烷基胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)之合成
將合成例2中所獲得之化合物2(100.0mg)溶解於DMF 3.4mL中並於25℃下添加十二烷基胺(東京化成製造)52.9μL、HOBt 129.3mg、DIPCI 237.8μL，於25℃下攪拌1小時後投入在另一容器中製備之L-精胺酸甲酯2鹽酸鹽(國產化學製造)140.4mg、二異丙基乙基胺187.2μL、DMF 1.6mL之混合溶液，進而於25℃下攪拌一晚。於反應液中添加乙醇18mL及二異丙醚72mL並於室溫下攪拌1小時，過濾取得沈析物並利用乙醇/二異丙醚(1/4(v/v)、20mL)進行洗淨。將所獲得之沈析物溶解於0.1N鹽酸水1.3mL中之後添加丙酮1.3mL，使用透析膜(MWCO 3，500)並利用作為外液之水500mL進行透析。其次，進行凍結乾燥，藉此獲得化合物7(161.5mg)。
1H-NMR(400MHz、D2O、ppm)：1.1~1.4(Br、十二烷基CH2+精胺酸CH2、22H、積分值112.25)、3.61(s、精胺酸甲酯、3H、積分值27.42)、4.23(Br、精胺酸αCH+麩胺酸αCH、2H、積分值25.4)
根據各積分值而算出，相對於麩胺酸之聚合數102個，鍵結於化合物7上之十二烷基胺與L-精胺酸甲酯之平均個數係十二烷基胺為29.4個，L-精胺酸甲酯為57.2個。
[合成例8]化合物8(包含分子量12,000之甲氧基聚乙二醇部分及聚合數為43之聚天冬胺酸部分之嵌段共聚物與4-苯基丁基胺之鍵結體：通式(2)之R11=甲基、R16=三亞甲基、R13=乙醯基、R14=4-苯基丁基胺基、R15=異丙基胺基羰基異丙基胺基、m+n+o+p+q=43、t=273)之合成
將基於日本專利特開平6-206815號公報中所記載之方法而製備之 甲氧基聚乙二醇-聚天冬胺酸嵌段共聚物(聚乙二醇分子量12,000、聚天冬胺酸之聚合數43)5g及4-苯基丁基胺(東京化成製造)1.2mL溶解於DMF 90mL中，添加DMAP 1.6g、DIPCI 7.9mL並於23℃下攪拌47小時。
於反應液中添加乙酸乙酯540mL及正庚烷1,080mL並於室溫下攪拌2小時。其後，過濾取得沈析物並利用乙酸乙酯/正庚烷(1/2(v/v)、300mL)進行洗淨。將所獲得之沈析物溶解於乙腈/水(9/1(v/v)、265mL)中之後，通過離子交換樹脂管柱(Dow Chemical公司製造Dowex 50(H+)、20mL)並利用乙腈/水(9/1(v/v)、30mL)進行溶出。於所獲得之溶出組分中添加水70mL後進行減壓濃縮，結束後利用水將溶液量製備成200mL，其後進行凍結乾燥而獲得化合物8(6.0g)。
1H-NMR(400MHz、DMSO、ppm)：3.49(m、PEG、273×4=1092H、積分值1786)、7.1~7.3(m、苯基、5H、積分值215)
根據各積分值而算出，相對於天冬胺酸之聚合數43個，鍵結於化合物8上之4-苯基丁基胺之平均個數為26.3個。
[合成例9]化合物9(包含分子量12,000之甲氧基聚乙二醇部分及聚合數為42之聚天冬胺酸部分之嵌段共聚物與4-苯基丁醇之鍵結體：通式(2)之R11=甲基、R16=三亞甲基、R13=乙醯基、R14=4-苯基丁氧基、R15=異丙基胺基羰基異丙基胺基、m+n+o+p+q=42、t=273)之合成
基於日本專利第4757633號公報中所記載之方法而合成化合物9。
稱量50mg所獲得之化合物9，添加乙腈4mL而進行溶解，添加0.5mol/L氫氧化鈉水溶液4mL並混合，靜置20分鐘，藉此進行水解。於該溶液中添加1mol/L鹽酸2mL，添加水/乙腈混液(1：1)而準 確地製成50mL。於該溶液中，使用HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析法)對4-苯基丁醇進行定量分析。根據分析值而算出，相對於天冬胺酸之聚合數42個，鍵結於化合物9上之4-苯基丁基醇之個數為21.6個。
[合成例10]化合物10(包含分子量12,000之甲氧基聚乙二醇部分及聚合數為43之聚天冬胺酸部分的嵌段共聚物與硬脂胺之鍵結體：通式(2)之R11=甲基、R16=三亞甲基、R13=乙醯基、R14=硬脂胺基、R15=異丙基胺基羰基異丙基胺基、m+n+o+p+q=43、t=273)之合成
將基於日本專利特開平6-206815號公報中所記載之方法而製備之甲氧基聚乙二醇-聚天冬胺酸嵌段共聚物(天冬胺酸之聚合數43)200mg及硬脂胺(Sigma-Aldrich製造)27.4mg溶解於DMF 4mL中，添加N,N'-二甲胺基吡啶(以下，DMAP)62.1mg、DIPCI 157.4μL並於25℃下攪拌27小時。
於反應液中添加乙酸乙酯26.7mL及正庚烷53.3mL並於室溫下攪拌1小時。其後，過濾取得沈析物並利用乙酸乙酯/正庚烷(1/2(v/v)、10mL)進行洗淨。將所獲得之沈析物溶解於乙腈/水(9/1(v/v)、10mL)中之後，通過離子交換樹脂管柱(Dow Chemical公司製造Dowex 50(H+)、2mL)並利用乙腈/水(9/1(v/v)、5mL)進行溶出。進行所獲得之溶出組分之減壓濃縮後，進行凍結乾燥而獲得化合物10(199.6mg)。
1H-NMR(400MHz、DMSO、ppm)：1.1~1.4(Br、硬脂胺、32H、積分值21.73)、3.51(m、PEG、273×4=1092H、積分值100)
根據各積分值而算出，相對於天冬胺酸之聚合數為43個，鍵結於化合物10上之4-苯基丁基胺之平均個數為7.4個。
[實施例1-1]利用化合物3(聚合數為55之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(siCON)複合體 之製備
將化合物3/化合物8/蒸餾水以成為6mg/1.5mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且使用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取17μL，以由化合物3之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為10之方式添加siRNA之HEPES溶液(siCON、100μM)25μL而製備與siRNA之複合粒子。於其中之8μL中添加D-α-生育酚(東京化成製造)之乙醇溶液(6.1mg/mL)8μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水184μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備以化合物3之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/0.25/0.5的實施例1-1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為250nm。
[實施例1-2]利用化合物3(聚合數為55之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(FAM-siLuc)複合體之製備
將化合物3/化合物8/蒸餾水以成為6mg/1.5mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且使用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取3.6μL，以由化合物3之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為10之方式添加siRNA之HEPES溶液(FAM-siLuc、100μM)5μL而製備複合粒子。於其中添加D-α-生育酚(東京化成製造)之乙醇溶液(6mg/mL)9μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水182μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備以化合物3之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/0.25/0.5的實施例1-2之siRNA複合體溶液。
[實施例2-1]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(siCON)複合體之製備
將化合物4/化合物8/蒸餾水以成為6mg/1.5mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且使用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取9μL，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為5之方式添加siRNA之HEPES溶液(siCON、100μM)25μL而製備複合粒子。於其中之6μL中添加D-α-生育酚(東京化成製造)之乙醇溶液(4.0mg/mL)6μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水188μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/0.25/0.5的實施例2-1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為293nm。
[實施例2-2]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(FAM-siLuc)複合體之製備
將化合物4/化合物8/蒸餾水以成為6mg/1.5mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且使用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取7.2μL，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為20之方式添加siRNA之HEPES溶液(FAM-siLuc、100μM)5μL而製備複合粒子。於其中添加D-α-生育酚(東京化成製造)之乙醇溶液(9mg/mL)12μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水176μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為 D-α-生育酚=1/0.25/0.5的實施例2-2之siRNA複合體溶液。
[實施例3-1]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(siR2B)複合體之製備
將化合物4/化合物8/蒸餾水以成為6mg/6mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且使用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取6.9μL，添加D-α-生育酚(東京化成製造)之乙醇溶液(17.1mg/mL)12μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為20之方式添加siRNA之HEPES溶液(siR2B、100μM)5.1μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水318.8μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例3-1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為47nm。
[實施例3-2]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(FAM-siLuc)複合體之製備
於上述實施例3-1中，將所使用之siRNA自siR2B變更為FAM-siLuc，除此以外，利用與實施例3-1相同之方法，藉此製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例3-2之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為50nm。
[實施例3-3]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(siCON)複合 體之製備
於上述實施例3-1中，將所使用之siRNA自siR2B變更為siCON，除此以外，利用與實施例3-1相同之方法，藉此製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例3-3之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為25nm及150nm之混合組成。
[實施例3-4]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(siLuc)複合體之製備
於上述實施例3-1中，將所使用之siRNA自siR2B變更為siLuc，除此以外，利用與實施例3-1相同之方法，藉此製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例3-4之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為58nm與305nm之混合組成。
[實施例4-1]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚-聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)的siRNA(siR2B)複合體之製備
將化合物4/化合物8/TPGS/蒸餾水以成為6mg/6mg/21.1mg/1.0mL之方式混合，加熱至40℃左右並且利用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取200μL，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為20之方式添加siRNA之HEPES溶液(siR2B、50μM)50μL，利用旋渦混合器進行浸透攪拌而製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚-聚乙二醇 1000琥珀酸酯=1/1/1的實施例4-1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為5nm。
[實施例5-1]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及膽鈣化醇的siRNA(siR2B)複合體之製備
將化合物4/化合物8/蒸餾水以成為30mg/30mg/1mL之方式混合，加熱至40℃左右並且利用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取100μL，添加膽鈣化醇(東京化成製造)之乙醇溶液(17.1mg/mL)175.4μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。於其中之15.7μL中，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為20之方式添加siRNA之HEPES溶液(siR2B、100μM)4.3μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水265.7μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為膽鈣化醇=1/1/1的實施例5-1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為88nm。
[實施例6-1]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物9及D-α-生育酚的siRNA(siR2B)複合體之製備
將化合物4/化合物9/蒸餾水以成為6mg/6mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且利用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取24.0μL，添加D-α-生育酚(東京化成製造)之乙醇溶液(17.4mg/mL)42.0μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。於其中之22.0μL中，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為20之方式添加siRNA之HEPES 溶液(siR2B、100μM)6.0μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水372.0μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物9之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例6-1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為20nm與116nm之混合組成。
[實施例6-2]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物9及D-α-生育酚的siRNA(FAM-siLuc)複合體之製備
於上述實施例6-1中，將所使用之siRNA自siR2B變更為FAM-siLuc，除此以外，利用與實施例6-1相同之方法，藉此製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物9之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例6-2之RNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為85nm。
[實施例7-1]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物10及D-α-生育酚的siRNA(siR2B)複合體之製備
將化合物4/化合物10/蒸餾水以成為6mg/6mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且利用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取24.0μL，添加D-α-生育酚(東京化成製造)之乙醇溶液(17.4mg/mL)42.0μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。於其中之22.0μL中，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為20之方式添加siRNA之HEPES溶液(siR2B、100μM)6.0μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水372.0μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超 音波處理而製備以化合物4之二官能性聚合物(a)：化合物10之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例7-1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為20nm。
[實施例8-1]利用化合物5(聚合數為102之麩胺酸與油胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(siR2B)複合體之製備
化合物5/化合物8/蒸餾水以成為6mg/6mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且利用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取30.3μL，添加D-α-生育酚(東京化成製造)之乙醇溶液(18.8mg/mL)48.3μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。於其中之26.2μL中，以由化合物5之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為20之方式添加siRNA之HEPES溶液(siR2B、100μM)6.0μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水373.7μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備以化合物5之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例8-1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為21nm及90nm之混合組成。
[實施例8-2]利用化合物5(聚合數為102之麩胺酸與油胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(FAM-siLuc)複合體之製備
於上述實施例8-1中，將所使用之siRNA自siR2B變更為FAM-siLuc，除此以外，利用與實施例8-1相同之方法，藉此製備以化合物5之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c) 計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例8-2之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為59nm。
[實施例8-3]利用化合物5(聚合數為102之麩胺酸與油胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(siCON)複合體之製備
於上述實施例8-1中，將所使用之siRNA自siR2B變更為siCON，除此以外，利用與實施例8-1相同之方法，藉此製備以化合物5之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例8-3之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為31nm與129nm之混合組成。
[實施例8-4]利用化合物5(聚合數為102之麩胺酸與油胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及D-α-生育酚的siRNA(siLuc)複合體之製備
於上述實施例8-1中，將所使用之siRNA自siR2B變更為siLuc，除此以外，利用與實施例8-1相同之方法，藉此製備以化合物5之二官能性聚合物(a)：化合物8之嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)計成為D-α-生育酚=1/1/1的實施例8-4之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為46nm及433nm之混合組成。
[比較例1]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)及化合物8的siRNA(siCON)複合體之製備
將化合物4/化合物8/蒸餾水以成為6mg/1.5mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且利用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取9μL，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為5之方式添加 siRNA之HEPES溶液(siCON、100μM)25μL而製備複合粒子。於其中之6μL中緩緩添加蒸餾水194μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備比較例1之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為83nm與398nm之混合組成。
[比較例2]利用化合物4(聚合數為102之聚麩胺酸與硬脂胺及精胺酸甲酯之醯胺鍵結體)、化合物8及4-苯基丁醇的siRNA(siCON)複合體之製備
將化合物4/化合物8/蒸餾水以成為6mg/1.5mg/0.2mL之方式混合，加熱至40℃左右並且利用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取9μL，以由化合物4之陽離子基(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得之N/P比成為5之方式添加siRNA之HEPES溶液(siCON、100μM)25μL而製備複合粒子。於其中之6μL中添加4-苯基丁醇(東京化成製造)之乙醇溶液(40mg/mL)6μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水188μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備比較例2之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為323nm。
[比較例3]利用氯化十二烷基三甲基銨、化合物8及D-α-生育酚之siRNA(siCON)複合體之製備
將氯化十二烷基三甲基銨(東京化成製造)/化合物8/蒸餾水以成為30mg/10mg/1mL之方式混合，加熱至40℃左右並且利用旋渦混合器反覆進行浸透攪拌及超音波處理而製備溶解液。自所獲得之溶解液中採取5μL，以由氯化十二烷基三甲基銨之添加當量(N)及siRNA之磷酸基(P)所獲得的N/P比成為5之方式添加siRNA之HEPES溶液(siCON、100μM)25μL而製備複合粒子。於其中之5μL中添加D-α-生育酚(東京 化成製造)之乙醇溶液(2.5mg/mL)5μL並利用旋渦混合器進行浸透攪拌。其次，緩緩添加蒸餾水190μL，反覆進行利用旋渦混合器之浸透攪拌及超音波處理而製備比較例3之siRNA複合體溶液。
利用動態散射法測定siRNA複合體之平均粒徑，結果為354nm。
[試驗例1]RNase中之siRNA之穩定性評價
為了驗證以本發明之核酸輸送用組合物作為構成要素之siRNA複合體對於利用存在於活體內之核酸分解酶的siRNA之分解顯示較高之阻抗性，調查包含siRNA之本發明之核酸複合體於RNase A(QIAGEN公司)中之穩定性。
於利用實施例1-1~8-1及比較例1、2之siRNA複合體(siRNA：最終濃度1μM)中添加RNase(最終濃度50μg/ml，QIAGEN公司)並於37℃下保溫約3小時。其後，以最終濃度成為0.04%之方式添加月桂基硫酸鈉(SDS、Nacalai Tesque)，藉此停止分解反應，使siRNA自該siRNA複合體解離。
使用15%聚丙烯醯胺凝膠(三-硼酸-EDTA(Ethylene diamine tetra acetic acid，四乙酸乙二胺)(TBE))，於100螺、60分鐘之條件下對所獲得之試驗試樣進行電泳，利用SYBR GREEN II(Life Technologies Japan公司)進行染色，藉此檢測出試驗試樣中所含之siRNA。利用Molecular Imager FX(BioRad公司)對凝膠中之siRNA帶進行解析而評價siRNA之穩定性。再者，作為siRNA之對照試樣，使用Liciferase(GL3)(Cosmo Bio公司)。將結果示於表1及圖1。
關於RNase處理前之實施例1-1~8-1，並未利用上述電泳檢測出siRNA帶。因此，顯示siRNA及二官能性聚合物(a)：嵌段型聚合物(b)：脂溶性添加劑(c)之核酸輸送用組合物形成複合體而保持該siRNA。同樣，比較例1及2亦未利用電泳檢測出siRNA。因此，暗示與二官能性聚合物(a)等形成複合體。另一方面，不使用二官能性聚合物(a)而使用陽離子性低分子化合物(氯化十二烷基三甲基銨)之比較例3利用電泳檢測出siRNA。其結果未確認到利用siRNA及該組合物之穩定之複合體形成。因此，可認為比較例3無保護siRNA之功能，無法期待對於RNase之分解耐性。
關於作為使用本發明之核酸輸送用組合物之siRNA複合體的實施例1-1~8-1，即便利用RNase處理3小時後，亦確認到siRNA帶，確認到對於RNase之穩定性。另一方面，關於不存在脂溶性添加劑(c)之比較例1或並非適當之脂溶性添加劑(c)的比較例2，並未利用RNase處理確認到siRNA帶，確認到siRNA因RNase而分解(圖1及表1)。
[試驗例2]siRNA複合體之細胞取入能力之驗證
為了驗證以本發明之核酸輸送用組合物作為構成要素之siRNA複合體可於培養條件下使siRNA取入至細胞內之情形，而使用包含螢光標記siRNA的本發明之核酸複合體調查經時性細胞內取入能力。
使用添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals公司製造)之伊格爾最低必需培養基(Eagle's Medium Essential Medium)(Corning公 司)於37℃、5%CO2培養箱中對人類膠芽種細胞U87MG(ATCC)進行繼代培養維持。
以成為100,000細胞/玻璃底培養皿(1mL)之方式接種人類膠芽種細胞U87MG，於37℃之CO2培養箱中進行4天培養。其後，將含有作為螢光標記siRNA之FAM-siLuc之實施例1-2、2-2、3-2、6-2、8-2以100nM(siRNA濃度)添加於培養基中而使其與U87MG細胞接觸。添加各siRNA複合體後，於2小時、7小時及24小時後，使用共聚焦顯微鏡(Leica公司)採取試驗細胞之圖像。將所獲得之圖像照片示於圖2及3。
再者，本試驗係使用作為市售載體之Lipofectamine RNAi Max(Life Technologies公司)作為siRNA導入試劑之陽性對照，根據製造者之指示製備與FAM-siLuc之複合體而使用。又，作為陰性對照，僅添加FAM-siLuc(裸FAM-siLuc)。
於試驗細胞之圖像上，利用市售之圖像處理軟體(Media Cybernetics公司、Image-Pro Plus)，計數像素數作為每1細胞之FAM螢光量，根據各樣品中之圖像而求出10細胞之平均像素數。將結果示於表2。
關於本發明之實施例1-2、2-2、3-2、6-2及8-2，雖然於添加至 U87MG細胞後2小時，螢光強度較弱，FAM-siLuc之細胞內取入量較低，但細胞接觸7小時後、24小時後，隨著時間經過而確認到細胞中之螢光強度之增加。因此，確認本發明之siRNA複合體隨著時間經過而取入至細胞內。另一方面，Lipofectamine係於添加至細胞後7小時確認到較強之螢光，若經過24小時，則確認到螢光強度之下降。因此，明確利用Lipofectamine之細胞內siRNA取入係自較早之時間取入，功能相對較快地消失。另一方面，裸FAM-siLuc係於任一時間均未確認到向細胞內之取入。關於本發明之siRNA複合體，明確與先前使用之Lipofectamine相比，達成siRNA較高之細胞內取入。
[試驗例3]siRNA複合體之基因沉默之研究
製備於本發明之核酸輸送用組合物中使用以螢光素酶為目標之siLuc或FAM-siLuc的siRNA複合體，為了對使用其抑制細胞內之螢光素酶基因的表現之情況進行驗證，而構建螢光素酶穩定表現人類膠芽種細胞U87MG並評價螢光素酶抑制活性。
3-1.螢光素酶穩定表現細胞之製作
藉由如下方法而製作螢光素酶穩定表現細胞，該方法係於培養細胞中導入基因表現載體，施加利用藥劑耐性標記之選擇壓力，藉此樹立常規表現株。藥劑係使用遺傳黴素(Geneticine)(Invitrogen公司製造)。於10cm培養皿中接種5×105個人類膠芽種細胞U87MG，於37℃、5%CO2培養箱中培養1天。其後，使用Lipofectarnine 2000(Invitrogen公司製造)並按照製造者之指示而將作為螢光素酶表現載體之pGL3neo(promega公司製造)載體導入至U87MG細胞。於37℃、5%CO2培養箱中培養2天後，利用0.25%胰蛋白酶(Tripsin)(Invitrogen公司製造)/0.02% EDTA(Invitrogen公司製造)剝離細胞，將稀釋10倍之細胞轉移至新的培養培養基中，於37℃、5%CO2培養箱中培養1晚。確認細胞黏附於培養皿上，使用包含300μg/mL濃 度之遺傳黴素(Invitrogen公司製造)之培養培養基於37℃、5%CO2培養箱中進行培養。每週更換培養基，若遺傳黴素耐性菌落成為直徑3~5mm，則使用經殺菌之選殖環(IWAKI、直徑5mm)進行單離，藉此製作螢光素酶穩定表現人類膠芽種細胞U87MG。
3-2.螢光素酶活性之評價
將樹立之螢光素酶穩定表現人類膠芽種細胞U87MG細胞以9×104細胞/孔接種至96孔培養盤中，於37℃、5%CO2培養箱中培養1天。其後，添加利用實施例1-2(FAM-siLuc)、2-2(FAM-siLuc)、3-4(siLuc)及8-4(siLuc)所獲得之siRNA複合體(siRNA濃度為100nM，n=3)。自添加開始3天後，使用Steady-Glo Luciferase Assay System(Promega)對該U87MG細胞之螢光素酶之發光活性進行檢測。再者，RNA干擾效果係以添加含有對應之siCON之siRNA複合體(實施例1-1、2-1、3-3、8-3)之情形時的螢光素酶之發光值(Relative Light Unit、RLU)作為比較對象，使用下式求出本發明之siRNA複合體(實施例1-2、2-2、3-4及8-4)之螢光素酶表現抑制率(%)，評價RNA干擾效果。將結果示於圖4。
[式]表現抑制率(%)=(siCON之發光值-siLUC之發光值)/siCON之發光值×100
本發明之siRNA複合體(實施例1-2、2-2、3-4及8-4)係於100nM之siRNA濃度下分別顯示約53%、44%、61%、55%之抑制率(參照圖4)。因此，明確本發明之siRNA複合體係將所包含之siRNA導入至細胞內，表現由siRNA所產生之RNA干擾效果，可抑制目標基因功能。
本發明之siRNA複合體(實施例1-2、2-2、3-4及8-4)係於100nM之siRNA濃度下分別顯示53%、44%、61%、55%抑制率(參照圖4)。因此，明確本發明之siRNA複合體係將所包含之siRNA導入至細胞內，表現由siRNA所產生之RNA干擾效果，可抑制目標基因功能。
關於使用由本發明之二官能性聚合物(a)、嵌段型聚合物(b)、脂 溶性添加劑(c)所獲得之核酸輸送用組合物的siRNA複合體，顯示可自RNase等核酸分解酶保護所包含之siRNA(參照試驗例1之結果)，可適用於靜脈內投予等血中投予。又，本發明之siRNA複合體可將siRNA有效地導入至細胞內，並且可長時間維持siRNA之存在(參照試驗例2之結果)。進而，本發明之siRNA複合體可藉由作用於細胞而發揮RNA干擾效果，可使導入至細胞內之siRNA表現功能(參照試驗例3之結果)。
根據以上之試驗例1~3之結果，顯示使用由本發明之二官能性聚合物(a)、嵌段型聚合物(b)、脂溶性添加劑(c)所獲得之核酸輸送用組合物的核酸醫藥複合體具備如下功能：適用於血中投予，將該核酸醫藥遞送至目標組織，導入至目標組織細胞並使該核酸醫藥於細胞內表現功能。

Claims (15)

  1. 一種核酸輸送用組合物，其特徵在於含有：導入有陽離子性官能基及烴基之二官能性聚合物(a)；聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)；及選自由維生素A衍生物、維生素D衍生物、維生素E衍生物、維生素K衍生物及膽固醇衍生物所組成之群中之1種以上之脂溶性添加劑(c)。
  2. 如請求項1之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)之上述烴基為選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基及直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基所組成之群中之1種以上之烴基。
  3. 如請求項1或2之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)之上述陽離子性官能基為選自由胺基、二烷基胺基、三烷基銨基及胍基所組成之群中之1種以上之陽離子性官能基。
  4. 如請求項1至3中任一項之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)為聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物，該聚天冬胺酸衍生物或該聚麩胺酸衍生物於側鏈羧基上直接或經由鍵結基而導入有上述陽離子性官能基及上述烴基，該二官能性聚合物每1分子之該陽離子性官能基導入率為10~100莫耳當量/聚合物分子，該陽離子性官能基與該烴基之含有莫耳當量比率(陽離子性官能基含有莫耳當量：烴基含有莫耳當量)為1~5：1。
  5. 如請求項1至4中任一項之核酸輸送用組合物，其中關於上述聚乙二醇鏈段與疏水性聚合物鏈段連結而成之嵌段型共聚物(b)，該疏水性聚合物鏈段為聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物，該聚天冬胺酸衍生物或該聚麩胺酸衍生物係疏水性基直接或經由鍵結基而鍵結於側鏈羧基上之片段結構，該疏水性基為選自 由直鏈狀或支鏈狀之(C1~C30)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C2~C30)之烯基或直鏈狀或支鏈狀之(C7~C30)之芳烷基所組成之群中之1種以上。
  6. 如請求項5之核酸輸送用組合物，其中關於上述嵌段型共聚物(b)，聚乙二醇鏈段係伸乙基氧基單元：(CH2CH2O)為5~11,500之重複單元結構，疏水性聚合物鏈段係天冬胺酸衍生物單元或麩胺酸衍生物單元為5~200之重複單元結構之聚天冬胺酸衍生物鏈段或聚麩胺酸衍生物鏈段，上述疏水性基直接或經由鍵結基而鍵結於該聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之側鏈羧基上的天冬胺酸衍生物單元或鍵結有疏水基之麩胺酸衍生物單元為3~200。
  7. 如請求項1至6中任一項之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)為通式(1)所表示之聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物， [式中，R1表示氫原子、(C1~C10)之烷基或(C7~C10)之芳烷基，R2表示亞甲基或伸乙基，R3表示選自由氫原子、(C1~C6)之醯基及(C1~C6)之烷氧基羰基所組成之群中之1種，R4表示選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基及直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基所組成群中之1種以上之取代基，R5表示選自由羥基、羧基經保護之胺基酸及-N(R7)CONH(R8)所組成群中之1種以上之取代基，該R7及R8可相同亦可不同，表示(C3~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基、或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，R6表示(C1~C10)之直鏈狀或支鏈狀之烷基或(C7~C10)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基，X1、X2及X3表示鍵結基或鍵，a、b、c、d、e、f及g分別獨立地表示0~200之整數，聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數即(a+b+c+d+e+f+g)為10~200之整數，(a+b)為5~200之整數，(c+d)為5~200之整數，鍵結有精胺酸衍生物之構成單元、鍵結有R4之構成單元、鍵結有R5之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元分別獨立為無規排列]。
  8. 如請求項7之核酸輸送用組合物，其中於上述通式(1)所表示之二官能性聚合物(a)中，R4表示選自由(C8~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烷基、(C8~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烯基及(C8~C30)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基所組成之群中之1種以上之烴基，(a+b+c+d+e+f+g)為15~200之整數，(a+b)為10~150之整數，(c+d)為5~100之整數，(a+b)：(c+d)為1~3：1。
  9. 如請求項1至8中任一項之核酸輸送用組合物，其中上述嵌段型共聚物(b)為通式(2)所表示之嵌段型共聚物， [式中，R11表示氫原子或(C1~C10)之直鏈狀或支鏈狀之烷基，R12表示亞甲基或伸乙基，R13表示選自由氫原子、(C1~C6)之醯基及(C1~C6)之烷氧基羰基所組成之群中之1種，R14表示選自由(C1~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烷基、(C2~30)之直鏈狀或支鏈狀之烯基、(C7~C30)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基及羧基經保護之胺基酸所組成之群中之1種以上之基，R15表示羥基及/或-N(R17)CONH(R18)，此處，R17及R18可相同亦可不同，表示(C3~C6)之直鏈、支鏈狀或環狀之烷基或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，R16表示(C1~C6)之伸烷基，X11表示鍵結基或鍵，t表示5~11500之整數，m、n、o、p及q獨立地表示0~200之整數，聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數即(m+n+o+p+q)表示5~200之整數，(m+n)表示3~200之整數，鍵結有R14之構成單元、鍵結有R15之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元分別獨立為無規排列]。
  10. 如請求項9之核酸輸送用組合物，其中於上述通式(2)所表示之嵌段型共聚物中，R14為選自由(C8~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烷 基、(C8~C30)之直鏈狀或支鏈狀之烯基及(C7~C20)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基所組成之群中之1種以上，(m+n+o+p+q)表示6~150之整數，(m+n)表示3~150之整數。
  11. 如請求項1至10中任一項之核酸輸送用組合物，其中上述二官能性聚合物(a)、上述嵌段型共聚物(b)及上述脂溶性添加劑(c)之含有比率(w/w)為(a)：(b)：(c)=1：0.1~5：0.1~5。
  12. 一種醫藥組合物，其係於如上述請求項1至11中任一項之核酸輸送用組合物中含有核酸。
  13. 如請求項12之醫藥組合物，其中上述核酸為具有利用RNA干擾(RNAi)之目標基因之表現抑制作用的RNA。
  14. 一種基因治療劑，其係含有如上述請求項12或13之醫藥組合物。
  15. 一種聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物，其以通式(1)表示， [式中，R1表示氫原子、(C1~C10)之烷基或(C7~C10)之芳烷基，R2表示亞甲基或伸乙基，R3表示選自由氫原子、(C1~C6)之醯基及(C1~C6)之烷氧基羰基所組成之群中之1種，R4表示選自由直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烷基、直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之烯基及直鏈狀或支鏈狀之(C8~C40)之芳烷基所組成群中之1種以上之取代基，R5表示選自由羥基、羧基經保護之胺基酸及-N(R7)CONH(R8)所組成群中之1種以上之取代基，該R7及R8可相同亦可不同，表示(C3~C6)之直鏈狀、支鏈狀或環狀烷基、或可經三級胺基取代之(C1~C5)之烷基，R6表示(C1~C10)之直鏈狀或支鏈狀之烷基或(C7~C10)之直鏈狀或支鏈狀之芳烷基，X1、X2及X3表示鍵結基或鍵，a、b、c、d、e、f及g分別獨立地表示0~200之整數，聚天冬胺酸衍生物或聚麩胺酸衍生物之單元構成之總聚合數即(a+b+c+d+e+f+g)為10~200之整數，(a+b)為5~200之整數，(c+d)為5~200之整數，鍵結有精胺酸衍生物之構成單元、鍵結有R4之構成單元、鍵結有R5之構成單元及側鏈羧基為分子內環化型之構成單元分別獨立為無規排列]。
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