WO2015133449A1 - 核酸送達のための組成物 - Google Patents

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WO2015133449A1
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linear
nucleic acid
branched
polymer
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正行 北川
聡裕 関口
菜緒 米木
有宏 戸村
広海 今野
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日本化薬株式会社
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    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid transport composition for delivering a nucleic acid drug into cells in a target affected area, a pharmaceutical composition using the nucleic acid drug, and its use.
  • the present invention relates to a nucleic acid transport composition and a pharmaceutical composition for stably delivering a short-chain nucleic acid drug such as siRNA to a disease target tissue.
  • RNA interference (hereinafter abbreviated as RNAi) has been discovered as one method of gene therapy.
  • RNAi is a major molecule involved in the function-suppressed expression of a disease-causing gene by a short RNA of 30 bases or less. This short RNA is named siRNA (small interfering RNA) (Patent Document 1).
  • RNAi is a physical property that is easily degraded by various enzymes present in the blood, which is a major obstacle to using siRNA as a nucleic acid drug.
  • therapeutic agents that use siRNA as a nucleic acid drug are limited to diseases such as the eyes and respiratory organs that can be treated by local administration of siRNA, and the applicable range of diseases that can be treated is limited.
  • development of the technique of applying the nucleic acid medicine used for gene therapy, such as siRNA, to blood administration, and delivering it stably and efficiently to the diseased part in the body is calculated
  • nucleic acid delivery system In order to administer a nucleic acid drug in the blood and exert a therapeutic effect in the diseased part of the body, (1) ensuring the stability of the nucleic acid drug in the blood, (2) efficiency of the nucleic acid drug to the target tissue It is necessary to overcome the three problems of efficient delivery and (3) introduction of nucleic acid drugs into target tissue cells. Therefore, there is a need for a nucleic acid delivery system that can stably hold a nucleic acid drug and deliver it to target cells.
  • the nucleic acid delivery system retains a nucleic acid drug to ensure blood stability, and after administration in blood, the nucleic acid delivery system has retention in blood so as to reach the target diseased tissue using the blood flow, and the target diseased part A function to suppress non-selective gene transfer into other tissue cells is required.
  • the nucleic acid drug is introduced into the target cell, the nucleic acid drug is further released in the cytoplasm, and the nucleic acid drug acts to suppress the function of the disease-causing gene. The ability to bring about a therapeutic effect is required.
  • the nucleic acid delivery system must have biocompatibility and do not induce biodefense or cell death upon administration.
  • nucleic acid in order to complete a systemically administered nucleic acid delivery system, (i) during the period from administration to reaching the target affected area, the nucleic acid is stably maintained and contact with the blood degrading enzyme is avoided to achieve stability. Ensuring and inhibiting nucleic acid introduction into cells other than the target affected tissue; (ii) after reaching the affected area, entering the cell while retaining the nucleic acid; (iii) after reaching the cytoplasm, It is required to release (siRNA) and (iv) be biocompatible.
  • Patent Document 2 uses a composition for nucleic acid transport composed of a block copolymer composed of PEG and a cationic polymer and a cationic polymer, and has improved the cell uptake ability by making it a complex with a nucleic acid drug.
  • a nucleic acid transport system is proposed.
  • Non-Patent Document 2 a composition for nucleic acid transport consisting of a block-type copolymer consisting of PEG and a hydrophobic polymer, a hydrophobic polymer, and a cationic polymer is used, and this is combined with a nucleic acid drug to produce blood in the blood.
  • nucleic acid drugs that are functionally expressed by administration in blood
  • a nucleic acid transport composition that ensures the stability of the nucleic acid drug, has a high intracellular introduction rate, and allows the functional expression of the nucleic acid drug to be efficiently expressed. It has been.
  • a nucleic acid transport composition that can be applied to short-chain nucleic acid drugs such as siRNA.
  • a bifunctional polymer in which a cationic functional group capable of forming a complex by electrostatic interaction with a nucleic acid drug and a hydrophobic hydrocarbon group
  • An inner core-forming polymer a block-type copolymer (outer shell-forming polymer) comprising a polyethylene glycol segment and a hydrophobic polymer segment, which are self-associating into particles and exhibit a blood retention property
  • a bifunctional polymer A composition for nucleic acid transport containing a fat-soluble additive such as tocopherol to prevent sudden particle disintegration due to weak affinity between both inner core-forming polymer and block-type copolymer (outer shell forming polymer) Ensures the stability of the nucleic acid molecule it contains, delivers it to the target tissue, and then introduces the nucleic acid molecule into the cells of the tissue It found to express functional Te, and completed the present invention.
  • the hydrocarbon group of the bifunctional polymer (a) is a linear or branched (C8 to C40) alkyl group, a linear or branched (C8 to C40) alkenyl.
  • the cationic functional group of the bifunctional polymer (a) is at least one cationic functional group selected from the group consisting of an amino group, a dialkylamino group, a trialkylammonium group, and a guanidyl group.
  • the bifunctional polymer (a) is a polyaspartic acid derivative or a polyglutamic acid derivative, and the polyaspartic acid derivative or the polyglutamic acid derivative is directly or via a bonding group to a side chain carboxy group.
  • a cationic functional group and the hydrocarbon group are introduced, and the introduction rate of the cationic functional group per molecule of the bifunctional polymer is 10 to 100 molar equivalents / polymer molecule,
  • the block copolymer (b) has a repeating unit structure in which the polyethylene glycol segment is an ethyleneoxy unit; (CH 2 CH 2 O) is 5 to 11,500, and the hydrophobic polymer segment is an aspartic acid derivative.
  • a unit or glutamic acid derivative unit is a polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative having a repeating unit structure of 5 to 200, and the hydrophobic group is directly or directly bonded to the side chain carboxy group of the polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative
  • the composition for nucleic acid transport according to [5] above, wherein the aspartic acid derivative unit or glutamic acid derivative unit bonded via the benzene is 3 to 200.
  • the bifunctional polymer (a) is represented by the general formula (1) [Wherein, R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group of (C1 to C10) or an aralkyl group of (C7 to C10), R 2 represents a methylene group or an ethylene group, R 3 represents a hydrogen atom, (C1 to One selected from the group consisting of an acyl group of C6) and an alkoxycarbonyl group of (C1 to C6), wherein R 4 is a linear or branched (C8 to C40) alkyl group, linear Or one or more substituents selected from the group consisting of a branched (C8-C40) alkenyl group and a linear or branched (C8-C40) aralkyl group, and R 5 represents a hydroxyl group Represents one or more substituents selected from the group consisting of an amino acid with a carboxy group protected and —N (R 7 ) CONH (R 8 ), wherein R 7 and
  • the nucleic acid transport composition according to any one of [1] to [6], which is a polyaspartic acid derivative or a polyglutamic acid derivative represented by the formula: [8]
  • R 4 is a linear or branched alkyl group of (C8 to C30), and a linear group of (C8 to C30).
  • hydrocarbon groups selected from the group consisting of a branched alkenyl group and a linear or branched aralkyl group of (C8 to C30), wherein (a + b + c + d + e + f + g) is an integer of 15 to 200 (A + b) is an integer of 10 to 150, (c + d) is an integer of 5 to 100, and (a + b) :( c + d) is 1 to 3: 1.
  • Transportation composition a
  • the block copolymer (b) is represented by the general formula (2) [Wherein R 11 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group of (C1 to C10), R 12 represents a methylene group or an ethylene group, R 13 represents a hydrogen atom, (C1 to C6 ) Is selected from the group consisting of an acyl group of (C1 to C6) and an alkoxycarbonyl group of (C1 to C6), R 14 is a linear or branched alkyl group of (C1 to C30), (C2 to 30) ) Linear or branched alkenyl group, (C7 to C30) linear or branched aralkyl group and one or more groups selected from the group consisting of amino acids in which the carboxy group is protected.
  • R 11 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group of (C1 to C10)
  • R 12 represents a methylene group or an ethylene group
  • R 13 represents a hydrogen
  • R 15 represents a hydroxyl group and / or —N (R 17 ) CONH (R 18 ), wherein R 17 and R 18 may be the same or different, and are linear or branched (C3 to C6).
  • R 16 represents an alkylene group (C1 ⁇ C6)
  • X 11 represents a linking group or bond
  • m, n, o, p and q independently represent an integer of 0 to 200, and is the total number of polymerization of unit constitution of polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative (m + n + o + p + q) is An integer of 5 to 200
  • (m + n) represents an integer of 3 to 200
  • a structural unit to which R 14 is bonded a structural unit to which R 15 is bonded
  • composition for nucleic acid transport according to any one of the above [1] to [8], which is a block copolymer represented by the formula: [10]
  • R 14 is a linear or branched (C8 to C30) alkyl group, linear or branched (C8 to C30). 1 or more selected from the group consisting of a linear or branched (C7 to C20) aralkyl group, (m + n + o + p + q) represents an integer of 6 to 150, and (m + n) is 3
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid transport composition according to any one of [1] to [11], wherein a nucleic acid is contained.
  • the pharmaceutical composition according to [12], wherein the nucleic acid is RNA having an action of suppressing expression of a target gene using RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group of (C1 to C10) or an aralkyl group of (C7 to C10)
  • R 2 represents a methylene group or an ethylene group
  • R 3 represents a hydrogen atom, (C1 to One selected from the group consisting of an acyl group of C6) and an alkoxycarbonyl group of (C1 to C6)
  • R 4 is a linear or branched (C8 to C40) alkyl group, linear Or one or more substituents selected from the group consisting of a branched (C8-C40) alkenyl group and a linear or branched (C8-C40) aralkyl group
  • R 5 represents a hydroxyl group
  • Well (R 7 ) CONH (
  • the present invention forms a cationic functional group that forms a complex by electrostatic interaction with a nucleic acid drug, a bifunctional polymer into which a hydrophobic hydrocarbon group is introduced (an inner core-forming polymer), and the nucleic acid drug.
  • the composite and a block copolymer (shell-forming polymer) in which a polyethylene glycol segment and a hydrophobic polymer segment are linked can interact to form a nanoparticulate aggregate.
  • a nucleic acid transport composition capable of enhancing the associative property of the nanoparticulate aggregate and stably holding a nucleic acid drug.
  • the nucleic acid pharmaceutical composition containing a nucleic acid pharmaceutical is provided using the said composition for nucleic acid transport.
  • the complex of the nucleic acid pharmaceutical and the bifunctional polymer (inner core forming polymer) and the block copolymer (outer shell forming polymer) are associated with each other by a relatively weak hydrophobic interaction.
  • the complex can be released relatively easily.
  • the fat-soluble additive enhances the aggregate-forming ability of the complex and the block copolymer.
  • the present invention using the above-described configuration provides a composition for transporting nucleic acid that achieves both stable retention of nucleic acid drug and ensuring of release.
  • nucleic acid pharmaceutical using the composition for nucleic acid transport of the present invention exhibits resistance to nucleolytic enzymes, it has excellent nucleic acid stability and can be applied to blood administration.
  • the administered nucleic acid drug releases the nucleic acid drug at the target site, allows it to be taken into the target tissue cell, and allows the nucleic acid drug to be released in the cytoplasm for functional expression.
  • the nucleic acid drug has been confirmed to have a nucleic acid release in the cytoplasm and a suppressive action (silencing effect) on target protein expression, which is a measure of nucleic acid function expression.
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • FIG. 5 is a drawing-substituting photograph in which sensitized cells were observed with a confocal laser microscope in a cell uptake test of FAM-labeled siRNA (FAM-siLuc) complex using the nucleic acid transport composition of the present invention.
  • FAM-labeled siRNA FAM-labeled siRNA
  • FIG. 5 is a drawing-substituting photograph in which sensitized cells were observed with a confocal laser microscope in a cell uptake test of FAM-labeled siRNA (FAM-siLuc) complex using the nucleic acid transport composition of the present invention.
  • FIG. 6 shows the results of evaluating luciferase inhibition on a luciferase stably expressing cell line by siRNA (FAM-siLuc or siLuc) complex using the nucleic acid transport composition of the present invention.
  • the present invention relates to a bifunctional polymer (a) having a cationic functional group and a hydrocarbon group introduced therein, a block copolymer (b) in which a polyethylene glycol segment and a hydrophobic polymer segment are linked, a vitamin A derivative, and a vitamin D derivative.
  • a composition for transporting nucleic acid comprising one or more fat-soluble additives (c) selected from vitamin E derivatives, vitamin K derivatives and cholesterol derivatives.
  • the bifunctional polymer (a) into which a cationic functional group and a hydrocarbon group are introduced is that a plurality of cationic functional groups and a plurality of hydrocarbon groups are branched into a single-chain polymer main chain, respectively.
  • the polymer main chain of the bifunctional polymer is preferably a single-chain polymer having a plurality of reactive substituents such as a carboxy group, an amino group, and a hydroxyl group that can be modified with two functional groups, a cationic functional group and a hydrocarbon group.
  • Examples of the single-chain polymer main chain structure include polyamino acids, polyvinyl derivatives, polyesters, polyethers, polyamides, and polyurethanes. These single-chain polymers can react with carboxy groups, amino groups, hydroxyl groups, and the like.
  • a single chain polymer having a plurality of functional substituents is preferred. Among them, preferred is a single chain polymer modified with a plurality of carboxy groups, and a polycarboxylic acid polymer such as polyaspartic acid, polyglutamic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymaleic acid, poly (styrene-maleic acid), etc. Derivatives can be mentioned.
  • these polycarboxy group-modified polymers are used as the main chain, and a plurality of cationic functional groups and a plurality of hydrocarbon groups are introduced into the side chain carboxy groups by ester bonds or amide bonds. It is preferred to use a functional polymer.
  • the molecular weight of the bifunctional polymer is not particularly limited, but since the present invention is directed to administration in blood, it is preferable to use the molecular weight used in an aqueous solution as the composition of the present invention.
  • the bifunctional polymer is preferably a polymer having an average molecular weight of 1,000 to 100,000.
  • the average molecular weight may be a value defined by a molecular weight measured by a conventional polymer molecular weight measuring method such as GPC method.
  • the bifunctional polymer needs to introduce a cationic functional group and a hydrocarbon group
  • a method of calculating the average molecular weight based on the side chain functional group content per unit weight is preferable.
  • the side chain functional group is a carboxy group
  • the carboxy group content is preferably determined by NMR method or titration method. More preferably, it is desired to define the molecular weight of the bifunctional polymer using the carboxy group content by titration.
  • the polymer main chain of the bifunctional polymer (a) is preferably a polyamino acid.
  • a reactive substituent for introducing a cationic functional group and a hydrocarbon group it is preferable to use a polyaspartic acid, polyglutamic acid or poly (aspartic acid-glutamic acid) copolymer having a carboxy group.
  • These polyamino acids having a side chain carboxy group may be an ⁇ -amide bond polymer, a ⁇ or ⁇ -amide bond polymer with a side chain carboxy group, or a mixture thereof.
  • the average molecular weight of the polyamino acid is preferably 1,000 to 100,000, and the polymerization number is preferably in the range of 8 to 800. More preferably, it is a polyamino acid having a polymerization number of 10 to 200.
  • the introduced hydrocarbon group is a functional group that imparts a function to make the complex formed by the bifunctional polymer and the nucleic acid hydrophobic.
  • the hydrocarbon group is a linear or branched (C3 to C60) alkyl group which may have a substituent, or a linear or branched chain which may have a substituent. Examples thereof include (C3 to C60) alkenyl groups and optionally substituted linear or branched (C7 to C60) aralkyl groups.
  • a linear or branched (C8 to C40) alkyl group which may have a substituent a linear or branched (C8 to C40) which may have a substituent.
  • An alkenyl group or a linear or branched (C8 to C40) aralkyl group which may have a substituent Particularly preferably, a linear or branched (C8 to C30) alkyl group which may have a substituent, a linear or branched (C8 to C30) which may have a substituent.
  • a linear or branched (C8 to C30) aralkyl group optionally having an alkenyl group or substituent of C30).
  • Examples of the linear or branched (C8 to C30) alkyl group which may have a substituent include octyl group, decyl group, dodecyl group, tetradecyl group, hexadecyl group and octadecyl group. It is done.
  • Examples of the linear or branched (C8 to C30) alkenyl group which may have a substituent include, for example, 9-hexadecenyl group, cis-9-octadecenyl group, cis, cis-9, 12 -Octadecadienyl group and the like.
  • linear or branched (C8 to C30) aralkyl group which may have a substituent include a 2-phenylethyl group, a 4-phenylbutyl group, and an 8-phenyloctyl group. Can be mentioned.
  • substituent in the hydrocarbon group which may have the substituent, a mercapto group, a hydroxyl group, a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a carbocyclic or heterocyclic aryl group, an alkylthio group, an arylthio group, Alkylsulfinyl group, arylsulfinyl group, alkylsulfonyl group, arylsulfonyl group, sulfamoyl group, alkoxy group, aryloxy group, acyloxy group, alkoxycarbonyloxy group, carbamoyloxy group, substituted or unsubstituted amino group, acylamino group, alkoxycarbonyl Examples thereof include an amino group, a ureido group, a sulfonylamino group, a sulfamoylamino group, a formyl group, an acyl group,
  • Examples of the carbocyclic or heterocyclic aryl group include a phenyl group and a naphthyl group.
  • Examples of the heterocyclic aryl group include pyridyl group, pyrimidinyl group, quinolyl group, quinazolinyl group, naphthyridinyl group, furyl group, pyrrolyl group, indolyl group, imidazolyl group, pyrazolyl group, oxazolyl group, isoxazolyl group, triazolyl group and the like. It is done.
  • alkylthio group examples include (C1 to C8) alkylthio groups, and examples thereof include a methylthio group, an isopropylthio group, and a benzylthio group.
  • arylthio group examples include a phenylthio group, a naphthylthio group, and a pyridylthio group.
  • alkylsulfinyl group examples include (C1 to C8) alkylsulfinyl groups, and examples thereof include a methylsulfinyl group, an isopropylsulfinyl group, a cyclohexylsulfinyl group, and a benzylsulfinyl group.
  • arylsulfinyl group examples include a phenylsulfinyl group, a naphthylsulfinyl group, and a pyridylsulfinyl group.
  • alkylsulfonyl group examples include (C1 to C8) alkylsulfonyl groups, and examples thereof include a methylsulfonyl group, an isopropylsulfonyl group, and a benzylsulfonyl group.
  • arylsulfonyl group examples include a phenylsulfonyl group, a naphthylsulfonyl group, a pyridylsulfonyl group, and the like.
  • sulfamoyl group examples include a dimethylsulfamoyl group and a phenylsulfamoyl group.
  • the alkoxy group represents an alkoxy group of (C1 to C8), for example, a primary alkoxy group such as a methoxy group, an isopropoxy group or a benzyloxy group, a secondary alkoxy group such as an isopropoxy group or a sec-butoxy group, or A tertiary alkoxy group such as a tert-butoxy group can be mentioned.
  • the aryloxy group include a phenoxy group, a naphthyloxy group, and a pyridyloxy group.
  • the acyloxy group include (C1 to C8) acyloxy groups, and examples thereof include an acetoxy group and a benzoyloxy group.
  • alkoxycarbonyloxy group examples include (C1 to C8) alkoxycarbonyloxy groups, and examples thereof include a methoxycarbonyloxy group and a trifluoromethoxycarbonyl group.
  • carbamoyloxy group examples include a dimethylcarbamoyloxy group and a phenylcarbamoyloxy group.
  • Examples of the substituted or unsubstituted amino group include an unsubstituted amino group, an acyclic primary amino group, an acyclic secondary amino group, or a cyclic secondary amino group.
  • the acyclic aliphatic primary amino group is an amino group in which a linear, branched or cyclic alkyl group of (C1 to C10) is N-monosubstituted.
  • a methylamino group, isopropylamino group, neopentylamino group, n-hexylamino group, cyclohexylamino group, n-octylamino group and the like can be mentioned.
  • the acyclic aliphatic secondary amino group may be the same or different, and is an amino in which a linear, branched, or cyclic alkyl group of (C1 to C10) is N, N-disubstituted. It is a group. Examples thereof include a dimethylamino group, a diisopropylamino group, and an N-methyl-N-cyclohexylamino group.
  • Examples of the cyclic aliphatic secondary amino group include a morpholino group, a piperazin-1-yl group, a 4-methylpiperazin-1-yl group, a piperidin-1-yl group, and a pyrrolidin-1-yl group.
  • Examples of the acylamino group include an acetylamino group and a benzoylamino group.
  • Examples of the alkoxycarbonylamino group include a methoxycarbonylamino group, an ethoxycarbonylamino group, and a benzyloxycarbonylamino group.
  • Examples of the ureido group include trimethylureido group and 1-methyl-3-phenyl-ureido group.
  • Examples of the sulfonylamino group include a methanesulfonylamino group and a benzenesulfonylamino group.
  • Examples of the sulfamoylamino group include a dimethylsulfamoylamino group.
  • Examples of the acyl group include an acetyl group, a pivaloyl group, a benzoyl group, and a pyridinecarbonyl group.
  • Examples of the alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group and a benzyloxycarbonyl group.
  • Examples of the carbamoyl group include a dimethylcarbamoyl group and a phenylcarbamoyl group.
  • Examples of the silyl group include a trimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, and a tert-butyldiphenylsilyl group.
  • the hydrocarbon group introduced into the bifunctional polymer (a) may be a hydrocarbon group that can impart a hydrophobic property to the complex formed by the bifunctional polymer (a) and the nucleic acid,
  • the hydrocarbon group which may have a substituent is not particularly limited and can be applied. Particularly preferred are an unsubstituted form, an alkoxy group, an aryloxy group, an acyloxy group, and an alkoxycarbonyloxy group. It is particularly preferable to use an unsubstituted hydrocarbon group.
  • the cationic functional group to be introduced functions to form a complex of the bifunctional polymer and the nucleic acid by electrostatically interacting with the phosphate group of the nucleic acid.
  • the cationic functional group is not particularly limited as long as it can cause an electrostatic interaction with a phosphate group of a nucleic acid.
  • Aminic nitrogen functional groups are preferred, and examples include amino groups, dialkylamino groups, trialkylammonium groups, and guanidyl groups.
  • the dialkylamino group is preferably a (C1 to C8) dialkylamino group, for example, a dimethylamino group, a diethylamino group, a diisopropylamino group, a dibutylamino group, a dipentylamino group, a dicyclohexylamino group, or a dibenzylamino group.
  • Etc. Also included are cyclic secondary amino groups in which two alkyl groups are cyclic, for example, morpholino group, piperazin-1-yl group, 4-methylpiperazin-1-yl group, piperidin-1-yl group, pyrrolidine- Examples include 1-yl group.
  • the trialkylammonium group is preferably a (C1 to C8) trialkylammonium group, such as a trimethylammonium group, a triethylammonium group, a triisopropylammonium group, a tributylammonium group, a tripentylammonium group, or a trihexylammonium group. Groups and the like.
  • the cationic functional group is introduced into the bifunctional polymer (a) as a substituent containing an amino nitrogen functional group such as the amino group, the dialkylamino group, the trialkylammonium group, or the guanidyl group.
  • the substituent containing the aminic nitrogen functional group may be an alkyl group of (C1-10) which may have another substituent substituted by the aminic nitrogen functional group.
  • it may have a substituent — (CH 2 ) h —X group (wherein the X group is the aminic nitrogen functional group, h represents an integer of 1 to 10) or a substituent And — (CH 2 ) i —NH— (CH 2 ) j —X group (wherein the X group is the aminic nitrogen functional group, i and j represent an integer of 1 to 5).
  • the alkyl group of (C1-10) which may have other substituents substituted by the aminic nitrogen functional group is introduced into the bifunctional polymer main chain via a suitable linking group.
  • the linking group is appropriately set according to the type of the substituent-bonding side chain functional group of the bifunctional polymer.
  • examples of the linking group include —NH—, oxygen atom (—O—), and sulfur atom (—S—).
  • Preferred is —NH— or an oxygen atom (—O—).
  • an optionally substituted —NH— (CH 2 ) h —X group (wherein the X group and h are as defined above) or an optionally substituted —NH— (CH 2 ) i —NH— (CH 2 ) j —X group (the X group and i and j are as defined above), or optionally substituted —O— (CH 2 ) h —X A group (the X group and h are as defined above) or an optionally substituted —O— (CH 2 ) i —NH— (CH 2 ) j —X group (the X group and i, j is as defined above).
  • the substituents that may be present include mercapto groups, hydroxyl groups, halogen atoms, nitro groups, cyano groups, alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups, carbocyclic or heterocyclic aryl groups, alkylthio groups, Arylthio group, alkylsulfinyl group, arylsulfinyl group, alkylsulfonyl group, arylsulfonyl group, sulfamoyl group, alkoxy group, aryloxy group, acyloxy group, alkoxycarbonyloxy group, carbamoyloxy group, substituted or unsubstituted amino group, acylamino group , Alkoxycarbonylamino group, ureido group, sulfonylamino group, sulfamoylamino group, formyl group, acyl group, carboxy group, alkoxycarbonyl group, ureid
  • an alkoxycarbonyl group (—CO—ORa; the Ra group represents an alkyl group of (C1 to C10), an aralkyl group of (C7 to C12)) or an N-alkylamide group (—CO—NH -Rb; the Rb group is an alkyl group of (C1 to C10) or (C7 to C12) aralkyl group) is preferred.
  • an alkoxycarbonyl group (—CO—ORa; the Ra group represents an alkyl group of (C1 to C10) or an aralkyl group of (C7 to C12)) or an N-alkylamide group (—CO—NH—Rb A —NH— (CH 2 ) h —X group in which the Rb group is substituted with an alkyl group of (C1 to C10) or an aralkyl group of (C7 to C12), wherein the X group Or h represents an integer of 1 to 10) or an optionally substituted —NH— (CH 2 ) i —NH— (CH 2 ) j —X group (wherein the X group represents the amine) And i and j represent an integer of 1 to 5).
  • an alkoxycarbonyl group (—CO—ORa; the Ra group represents an alkyl group of (C1 to C10) or an (C7 to C12) aralkyl group) or an N-alkylamide group (—CO—NH—Rb; the Rb An —NH— (CH 2 ) h —X group substituted with an alkyl group of (C1 to C10) or (C7 to C12) aralkyl group, wherein the X group is the aminic nitrogen functional group; h is particularly preferably an integer of 1 to 10.
  • an amino acid derivative is particularly preferred, and an amino acid ester derivative or amino acid amide derivative Can be used. That is, lysine derivatives, ornithine derivatives, and arginine derivatives having an amine nitrogen functional group are preferable. More preferred is an arginine derivative. Examples of the arginine derivative include arginine alkyl ester and arginine alkylamide.
  • arginine alkyl ester examples include arginine methyl ester, arginine ethyl ester, arginine isopropyl ester, arginine-tert-butyl ester, arginine benzyl ester and the like.
  • Arginine alkylamides include arginine methylamide, arginine ethylamide, arginine isopropylamide, arginine-tert-butylamide, arginine benzylamide, arginine dimethylamide and the like.
  • the bifunctional polymer (a) of the present invention has both the hydrocarbon group and the cationic functional group in the polymer main chain, and each of the hydrocarbon main group and the cationic functional group in the polymer main chain includes a plurality of the hydrocarbon groups and the cationic functional groups. It is a bifunctional polymer in which the molar equivalent is substituted with a graft type. In other words, by forming a polymer having two types of functional substituents at a plurality of molar equivalents, polycationic property for forming a complex by nucleic acid and electrostatic interaction, and hydrophobicity in the formed complex It is aimed at imparting sex.
  • the bifunctional polymer (a) of the present invention is a bifunctional polymer (a) in which a cationic functional group and a hydrocarbon group are introduced directly or via a bonding group into a side chain carboxy group using polyaspartic acid or polyglutamic acid as the main chain of the polymer. It is preferably a functional polymer.
  • the polyaspartic acid or polyglutamic acid used as the main chain may be an ⁇ -amide bond acid type polymer, a ⁇ -amide bond type or a ⁇ -amide bond type with a side chain carboxy group, or a mixture thereof. It may be.
  • the average molecular weight of the polyamino acid is preferably 1,000 to 100,000, and the polymerization number is preferably in the range of 8 to 800. More preferably, it is a polyamino acid having an average molecular weight of 2,000 to 50,000 and a polymerization number of 20 to 400.
  • the cationic functional group and the hydrocarbon group are directly or directly bonded to the plural side chain carboxy groups of the polyaspartic acid or polyglutamic acid at an appropriate equivalent amount. It is the structure combined through.
  • the details of the cationic functional group and the hydrocarbon group are as defined above.
  • the side chain carboxy group may be directly bonded to the side chain carboxy group via an appropriate binding group. May be combined.
  • the binding group is not particularly limited.
  • one end is a binding functional group with a carbonyl group, and the other end is binding with the cationic functional group and the hydrocarbon group.
  • Examples include a linking group having a functional group.
  • the linking group include an oxygen atom (—O—), —NH—, a sulfur atom (—S—), —NH— (CH 2 ) x — (x represents an integer of 1 to 10), — NH— (CH 2 ) x —O— (x represents an integer of 1 to 10), —NH— (CH 2 ) x —NH— (x represents an integer of 1 to 10), —NH— (CH 2 ) x —S— (x represents an integer of 1 to 10), —O— (CH 2 ) y — (y represents an integer of 1 to 10), —O— (CH 2 ) y —O— (Y represents an integer of 1 to 10), —O— (CH 2 ) y —NH— (y represents an integer of 1 to 10), —O
  • amino acid may be used as the linking group.
  • the amino acid used as the linking group may be either a natural amino acid or a non-natural amino acid, and may be L-form or D-form.
  • an amino acid is used as the linking group, the carbonyl group of polyspartic acid or polyglutamic acid of the bifunctional polymer is bonded to the N-terminal amino group of the amino acid, while the C-terminal carboxy group is bonded to the carboxy group via an ester bond or amide bond.
  • bonds the said cationic functional group and the said hydrocarbon group can be mentioned.
  • amino acids used as the linking group include glycine, alanine, ⁇ -alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, and histidine.
  • the polymer has 15 to 80 molar equivalents of cationic functional groups per molecule of the polymer main chain.
  • the cationic group is less than 10 molar equivalents / polymer molecule, the total of electrostatic interaction with the nucleic acid is small, and the complex formation between the bifunctional polymer (a) and the nucleic acid is weak, which is not preferable.
  • the cationic functional group exceeds 100 molar equivalents / polymer molecule, in order to balance the introduction amount of substituents of the hydrocarbon group, the molecular weight of the main chain polymer used is increased, and the cation in the polymer main chain is increased. It is necessary to increase the number of functional groups and the number of functional groups capable of binding to the hydrocarbon group. Therefore, the molecular weight of the main chain polymer becomes too large, and an aqueous solution having an appropriate concentration cannot be obtained, which is not preferable.
  • the hydrocarbon group is necessary to make the complex with the nucleic acid hydrophobic, and the per-polymer molecule of the bifunctional polymer (a) It is desirable that the cationic functional group has 10 molar equivalents or more.
  • the introduction ratio of the hydrocarbon group to the cationic functional group is preferably a ratio of the molar equivalent of the cationic functional group to the molar equivalent of the hydrocarbon group optionally having the substituent (cationic functional group mole).
  • Equivalent: the hydrocarbon group optionally having the above-mentioned substituent (molar equivalent) is 1 to 5: 1. More preferably, the ratio is 1 to 3: 1.
  • the cationic functional group and the hydrocarbon group are bonded together at a plurality of equivalents as side chain modifying functional groups in the main chain of the bifunctional polymer.
  • the arrangement in which the cationic substituent and the hydrocarbon group are bonded to the polymer main chain is not particularly limited and can be arbitrarily set.
  • the cationic functional group may be a bifunctional polymer having a sequence in which the cationic functional group and the hydrocarbon group are alternately bonded to a plurality of binding side chain functional groups present in the polymer main chain.
  • the bifunctional polymer (a) an embodiment in which the cationic functional group and the hydrocarbon group are bonded to the side chain-binding functional group of the polymer main chain in a random sequence without particular control. Is preferred.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group of (C1 to C10) or an aralkyl group of (C7 to C10)
  • R 2 represents a methylene group or an ethylene group
  • R 3 represents a hydrogen atom, (C1 to One selected from an acyl group of C6) and an alkoxycarbonyl group of (C1 to C6)
  • R 4 is a linear or branched (C8 to C40) alkyl group, linear or branched
  • R 5 represents a hydroxyl group
  • a carboxy group Represents one or more substituents selected from the group consisting of protected amino acids and —N (R 7 ) CONH (R 8 ), and R 7 and
  • the (C1 to C10) alkyl group in R 1 and R 6 represents a linear, branched or cyclic (C1 to C10) alkyl group.
  • Examples of the linear alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-hexyl group, and an n-decyl group.
  • Examples of the branched alkyl group include isopropyl group, tert-butyl group, 1-methyl-propyl group, 2-methyl-propyl group, 2,2-dimethylpropyl group and the like.
  • Examples of the cyclic alkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and an adamantyl group.
  • Examples of the (C7 to C10) aralkyl group in R 1 and R 6 include a benzyl group, a 1-phenylethyl group, a 2-phenylethyl group, and a 4-phenylbutyl group.
  • R 6 may be the same functional group in one molecule or a combination of different substituents. Preferably R 6 uses the same functional group.
  • Examples of the acyl group of (C1 to C6) in R 3 include a formyl group, an acetyl group, a propionyl group, a butyroyl group, a cyclopropylcarbonyl group, and a cyclopentanecarbonyl group.
  • Examples of the (C1 to C6) alkoxycarbonyl group in R 3 include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a tert-butoxycarbonyl group, a cyclohexyloxycarbonyl group, and the like.
  • R 4 corresponds to a hydrocarbon group in the bifunctional polymer (a).
  • Examples of the linear or branched (C8 to C40) alkyl group in R 4 include an octyl group, a decyl group, a dodecyl group, a tetradecyl group, a hexadecyl group, and an octadecyl group.
  • Examples of the linear or branched (C8 to C40) alkenyl group in R 4 include, for example, 9-hexadecenyl group, cis-9-octadecenyl group, cis, cis-9, 12-octadecadienyl group, etc. Is mentioned.
  • Examples of the linear or branched (C8 to C40) aralkyl group in R 4 include a 2-phenylethyl group, a 4-phenylbutyl group, and an 8-phenyloctyl group.
  • the alkyl group of (C8 to C40), the alkenyl group of (C8 to C40) and the aralkyl group of (C8 to C40) of R 4 may have an appropriate substituent.
  • substituents examples include mercapto group, hydroxyl group, halogen atom, nitro group, cyano group, carbocyclic or heterocyclic aryl group, alkylthio group, arylthio group, alkylsulfinyl group, arylsulfinyl group, alkylsulfonyl group, arylsulfonyl group, Sulfamoyl group, alkoxy group, aryloxy group, acyloxy group, alkoxycarbonyloxy group, carbamoyloxy group, substituted or unsubstituted amino group, acylamino group, alkoxycarbonylamino group, ureido group, sulfonylamino group, sulfamoylamino group, A formyl group, an acyl group, a carboxy group, an alkoxycarbonyl group, a carbamoyl group, a silyl group, and the like can be given.
  • R 4 in one molecule may be the same functional group or a combination of different substituents. Preferably, R 4 uses the same functional group.
  • the amino acid in which the carboxy group in R 5 is protected may be a natural amino acid or a non-natural amino acid, and represents a functional group obtained by converting the carboxy group of the amino acid as an ester derivative or an amide derivative.
  • the ester derivative is preferably a linear, branched or cyclic (C1 to C10) alkyl ester. Examples of the linear alkyl ester include methyl ester, ethyl ester, n-propyl ester, n-butyl ester, n-hexyl ester, and n-decyl ester.
  • Examples of the branched alkyl ester include isopropyl ester, tert-butyl ester, 1-methyl-propyl ester, 2-methyl-propyl ester, 2,2-dimethylpropyl ester and the like.
  • Examples of the cyclic alkyl ester include cyclopropyl ester, cyclobutyl ester, cyclopentyl ester, cyclohexyl ester, adamantyl ester and the like.
  • the amide derivative is preferably a linear, branched or cyclic (C1 to C10) alkylamide.
  • linear alkylamide examples include methylamide, ethylamide, n-propylamide, n-butylamide, n-hexylamide, n-decylamide and the like.
  • branched alkylamide examples include isopropylamide, tert-butylamide, 1-methyl-propylamide, 2-methyl-propylamide, 2,2-dimethylpropylamide, and the like.
  • cyclic alkylamide examples include cyclopropylamide, cyclobutylamide, cyclopentylamide, cyclohexylamide, adamantylamide and the like.
  • the linear, branched or cyclic alkyl group of (C3 to C6) in R 7 and R 8 of —N (R 7 ) CONH (R 8 ) includes 1-propyl group, 2-propyl Group, cyclopentyl group, cyclohexyl group and the like.
  • Examples of the (C1 to C5) alkyl group optionally substituted with a tertiary amino group in R 7 and R 8 include a 3-dimethylaminopropyl group, a 5-dimethylaminopentyl group, and the like.
  • R 5 is a hydroxyl group, an amino acid in which a carboxy group is protected or —N (R 7 ) CONH (R 8 ), and is a substituent containing one or more of these in one molecule. is there.
  • a substituent in which a hydroxyl group and —N (R 7 ) CONH (R 8 ) coexist is preferable.
  • X 1 , X 2 and X 3 in the general formula (1) are linking groups for connecting the carbonyl group of the polymer main chain to the arginine derivative, R 4 or R 6 .
  • the linking group in X 1 , X 2, and X 3 is a linking group having a functional group whose one end has a binding property with a carbonyl group.
  • An amino acid may be used as the linking group.
  • the amino acid used as the linking group may be either a natural amino acid or a non-natural amino acid, and may be L-form or D-form.
  • an amino acid is used as a linking group, the side chain carbonyl group of the main chain polymer and the N-terminal amino group of the amino acid are bonded to each other, and the C-terminal carboxy group is bonded to the arginine derivative, R 4 via an ester bond or an amide bond. or it can be exemplified embodiments for coupling the R 6.
  • amino acids used as the linking group include glycine, alanine, ⁇ -alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, and histidine.
  • R 4 or R 6 can be directly bonded and there is no corresponding binding functional group
  • X 1 , X 2 and X 3 represent a bond.
  • the X 1 , X 2 and X 3 may be the same bonding group or a mixture of different bonding groups in one molecule.
  • the main chain of the bifunctional polymer (a) is polyaspartic acid.
  • the structural unit of the main chain of the polyaspartic acid derivative has an ⁇ -amide type polymer, a ⁇ -amide type polymer, and a structural unit in which the side chain carboxy group is an intramolecular cyclization type.
  • R 2 is an ethylene group in the general formula (1)
  • the main chain of the bifunctional polymer (a) is polyglutamic acid.
  • the structural unit of the main chain may have an ⁇ -amide type polymer, a ⁇ -amide type polymer, and a structural unit in which the side chain carboxy group is an intramolecular cyclization type.
  • A, b, c, d, e, f, and g in the general formula (1) are a structural unit in which an arginine derivative is bonded to the polymer main chain, a structural unit in which R 4 is bonded, a structural unit in which R 5 is bonded, and a side
  • the chain carboxy group indicates the content of each of the intramolecular cyclized structural units.
  • A, b, c, d, e, f and g each independently represents an integer of 0 to 200, and represents the total number of polymerizations in the unit constitution of the polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative, and the number of polymerizations in the polymer main chain.
  • (A + b + c + d + e + f + g) may be an integer from 10 to 200.
  • the structural unit to which the arginine derivative is bonded is an essential component, and the total content number (a + b) is an integer of 5 to 200.
  • the structural unit to which R 4 which is a hydrophobic hydrocarbon group is bonded is also an essential component, and the total content number (c + d) is an integer of 5 to 200.
  • the structural unit to which R 5 is bonded and the intramolecular cyclized structural unit of the side chain carboxy group are arbitrary structures.
  • the structural unit to which the arginine derivative is bonded, the structural unit to which R 4 is bonded, the structural unit to which R 5 is bonded, and the side chain carboxy group are The intramolecular cyclization type structural unit may be independently a random sequence. That is, the structural unit in which the arginine derivative is bound to the side chain carboxy group of the polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative, the structural unit in which R 4 is bound, the structural unit in which R 5 is bound, and the side chain carboxy group
  • the constitutional units taking the chemical form may be arranged in any order, or the constitutional units may be localized and localized, and each constitutional unit has regularity. It is a polymer structure composed of no random arrangement.
  • the bifunctional polymer represented by the general formula (1) is a novel polymer having a guanidyl group for forming a complex with a nucleic acid and a hydrocarbon group for making the complex a hydrophobic property. .
  • the bifunctional polymer is useful as a nucleic acid transport polymer for using a nucleic acid as a pharmaceutical product. Therefore, the bifunctional polymer represented by the general formula (1) is also included in the present invention.
  • R 4 is a group consisting of an alkyl group of (C8 to C30), an alkenyl group of (C8 to C30) and an aralkyl group of (C8 to C30). It is preferable that it is 1 or more types of hydrocarbon groups selected from these.
  • the number of polymer main chain polymerizations (a + b + c + d + e + f + g) is preferably an integer of 15 to 200.
  • the total content number (a + b) of the structural unit bonded with the arginine derivative is an integer of 10 to 150
  • the total content number (c + d) of the structural unit bonded with R 4 which is a hydrophobic hydrocarbon group is 5 to It is an integer of 100
  • (a + b) :( c + d) is preferably 1 to 3: 1.
  • This bifunctional polymer (a) is a cationic functional group having an appropriate binding functional group for a single-chain polymer having a plurality of reactive functional groups such as a carboxy group, an amino group, and a hydroxyl group that can be modified with a functional group. It can be prepared by reacting the containing compound with a hydrocarbon group-containing compound having an appropriate binding functional group.
  • a commercially available product may be used as it is, or a polymer synthesized by a polymerization reaction may be used.
  • the reaction mode of the two functional groups can be appropriately set depending on the combination of the reactive functional group of the single-chain polymer and the binding functional groups of the cationic functional group-containing compound and the hydrocarbon group-containing compound.
  • the single-chain polymer uses a polymerized polycarboxylic acid compound in which a reactive functional group is a carboxy group, and each binding functional group of the cationic functional group-containing compound and the hydrocarbon group-containing compound is an amino group. And / or a hydroxyl group and a bifunctional polymer bonded in an amide bond manner and / or an ester bond manner is used.
  • the bifunctional polymer can be synthesized by reacting the polymerized polycarboxylic acid compound with the cationic functional group-containing compound and the hydrocarbon group-containing compound under appropriate condensation conditions.
  • condensation conditions a method that can be used in a normal organic synthesis reaction can be appropriately used.
  • An embodiment of a method for synthesizing polyaspartic acid that is preferably used as the main chain polymer of the bifunctional polymer (a) is disclosed.
  • a suitable primary amine compound or primary alcohol compound is sequentially reacted with N-carbonylaspartic anhydride to synthesize a polyaspartic acid derivative having a primary amine-binding residue or a primary alcohol-binding residue at one end. .
  • N-carbonylaspartic anhydride it is preferable to use an appropriate modified carboxylic acid protecting group such as benzyl ester as the carboxy group of the aspartic acid side chain.
  • the obtained polyaspartic acid derivative can further optionally acylate the other terminal group (N-terminal).
  • a polyaspartic acid that becomes the main chain polymer of the bifunctional polymer (a) can be obtained by subjecting the protecting group of the side chain carboxy group of this polyaspartic acid derivative to a deprotecting group reaction under appropriate conditions.
  • the polyaspartic acid may be reacted with the cationic functional group-containing compound having an amino group and / or a hydroxyl group and the hydrocarbon group-containing compound under a condensation reaction condition such as a carbodiimide dehydrating condensing agent.
  • a condensation reaction condition such as a carbodiimide dehydrating condensing agent.
  • the carbodiimide dehydrating condensing agent dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCI), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC) and the like can be used.
  • a reaction aid such as N, N-dimethylaminopyridine (DMAP) may be used.
  • DMAP N, N-dimethylaminopyridine
  • the introduction amount of the cationic functional group and the hydrocarbon group can be adjusted by appropriately increasing or decreasing the charged amount of each functional group-containing compound in the dehydration condensation reaction.
  • R 7 and R 8 of —N (R 7 ) CONH (R 8 ) are cyclohexyl groups.
  • DIPCI diisopropylcarbodiimide
  • R 7 and R 8 are isopropyl groups.
  • R 7 and R 8 of —N (R 7 ) CONH (R 8 ) are an ethyl group and 3-dimethylaminopropyl It becomes a mixed substitution product.
  • the bifunctional polymer (a) of the present invention can be produced via an optional purification step.
  • a polyglutamic acid that is preferably used is synthesized by using N-carbonylglutamic acid anhydride instead of N-carbonylaspartic acid anhydride in the above synthesis example. If glutamic acid is obtained and then the cationic functional group-containing compound and the hydrocarbon group-containing compound are introduced, the bifunctional polymer (a) whose main chain polymer is polyglutamic acid can be synthesized.
  • Block type copolymer (b) in which polyethylene glycol segment and hydrophobic polymer segment are linked In the present invention, a block copolymer (b) in which a polyethylene glycol segment and a hydrophobic polymer segment are linked is used.
  • the block copolymer (b) is an AB block copolymer in which a polyethylene glycol segment and a hydrophobic polymer segment are bonded with an appropriate linking group.
  • the polyethylene glycol segment refers to a polymer portion containing a polyethylene glycol chain having a degree of polymerization of (CH 2 CH 2 O) unit structure of 5 to 20,000. Preferably, the degree of polymerization is 5 to 11,500.
  • a polymer part containing a polyethylene glycol chain having a degree of polymerization of 40 to 2,500 is particularly preferred.
  • the average molecular weight of the polyethylene glycol fragment corresponding to polyethylene glycol is 500 to 900,000, preferably 500 to 500,000, particularly preferably 2,000 to 100,000.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol segment is a peak top molecular weight measured by a GPC method (Gel Permeation Chromatography) based on a polyethylene glycol standard product.
  • the hydrophobic polymer segment is not particularly limited as long as it is relatively hydrophobic as compared with the polyethylene glycol segment.
  • polyamino acids and polyamino acid derivatives having hydrophobic side chains polyacrylic acid esters or polyacrylic acid amide derivatives, polymethacrylic acid ester derivatives or polymethacrylic acid amide derivatives, polymaleic acid ester derivatives or polymaleic acid amide derivatives, polystyrene, Examples thereof include polycarboxylic acid-containing polymers such as styrene-maleic acid copolymer and styrene-maleic acid ester copolymer or derivatives thereof, polylactic acid, and lactic acid-glycolic acid copolymer.
  • hydrophobic polymer segment a polycarboxylic acid-containing polymer such as polyaspartic acid, polyglutamic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, and polymaleic acid is used because the degree of hydrophobicity can be easily adjusted. It is preferable to use a polycarboxylic acid ester or a polycarboxylic acid amide in which a plurality of hydrophobic substituents are introduced into this carboxy group.
  • a polyaspartic acid ester or polyaspartic acid amide having a hydrophobic functional group bonded to the side chain of polyaspartic acid or a polyglutamic acid ester having a hydrophobic functional group bonded to the side chain of polyglutamic acid or Polyglutamic acid amide.
  • the molecular weight of the hydrophobic polymer segment is a molecular weight based on repeated polymerization to such an extent that it is hydrophobic with respect to the polyethylene glycol segment and the block copolymer (b) can exhibit hydrophilic-hydrophobic amphipathic properties. If there is, it can be used without any particular limitation.
  • the block copolymer (b) when the average molecular weight of the polyethylene glycol segment is 2,000 to 100,000, the structure-corresponding molecular weight of the hydrophobic polymer segment is 1,000 to 100 as the average molecular weight corresponding to the segment. 1,000 structural parts are preferred, with 3,000 to 60,000 being particularly preferred.
  • the hydrophobic polymer segment When a polycarboxylic acid-containing polymer is used as the hydrophobic polymer segment, it is preferable to define the molecular weight of the hydrophobic polymer segment based on the carboxylic acid group equivalent for introducing a hydrophobic group.
  • the carboxylic acid equivalent is preferably 10 to 300 molar equivalents of carboxy groups per hydrophobic polymer segment, more preferably 15 to 100 molar equivalents of carboxy groups. That is, when polyaspartic acid or polyglutamic acid is used, the polymerization number is preferably 10 to 300, more preferably 15 to 100.
  • the polycarboxylic acid-containing polymer is used as a main chain polymer of the hydrophobic polymer segment, it is necessary to bind the hydrophobic functional group to a carboxy group to make the segment hydrophobic.
  • the hydrophobic functional group to be bonded to the carboxy group include a linear or branched alkyl group, alkenyl group or aralkyl group which may have a substituent.
  • a linear or branched (C1 to C30) alkyl group a linear or branched (C2 to C30) alkenyl group, or a linear or branched (C7 to C30) Of the aralkyl group.
  • alkyl group examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-octyl group, n-decyl group, n-dodecyl group, n -Tetradecyl group, n-hexadecyl group, n-octadecyl group and the like.
  • alkenyl group examples include ethenyl group, 1-propenyl group, 1-butenyl group, 1-pentenyl group, 9-hexadecenyl group, cis-9-octadecenyl group, cis, cis-9, 12-octadecadienyl. Groups and the like.
  • aralkyl group examples include benzyl group and 4-phenylbutyl group.
  • the hydrophobic functional group is preferably bonded to the carboxy group of the polycarboxylic acid-containing polymer in an ester type or an amide type. Therefore, an embodiment in which the hydrophobic functional group is introduced into the polycarboxylic acid-containing polymer as an alcohol derivative or amine derivative having a corresponding hydrophobic functional group is preferable.
  • the hydrophobic functional group may be introduced into all carboxy groups of the polycarboxylic acid-containing polymer or may be introduced into some carboxy groups.
  • the carboxy group into which the hydrophobic functional group is not introduced may be introduced with other substituents, whether it is in a carboxylic acid state, an alkali metal salt such as sodium salt or potassium salt, or a carboxylate salt such as ammonium salt.
  • the structure may be different.
  • the hydrophobic functional group constitutes the hydrophobic physical properties of the hydrophobic polymer segment of the block copolymer (b), and the hydrophobic physical properties of the hydrophobic polymer segment depend on the amount and rate of introduction of the hydrophobic functional group. Is determined.
  • the hydrophobic group introduction rate should be determined in consideration of the amphiphilicity of the block copolymer (b).
  • the hydrophobic polymer segment in the block copolymer (b) preferably has a main chain polymer structure of a polyaspartic acid derivative or a polyglutamic acid derivative.
  • the polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative has a segment structure in which a hydrophobic group is bonded to a side chain carboxy group directly or via a bonding group, and the hydrophobic group is Linear or branched (C1 to C30) alkyl group, linear or branched (C2 to C30) alkenyl group, or linear or branched (C7 to C30) aralkyl group It is preferable that it is 1 or more types selected from.
  • the polyethylene glycol segment has a repeating unit structure of ethyleneoxy units; (CH 2 CH 2 O) of 5 to 11,500.
  • the hydrophobic polymer segment is a polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative having a repeating unit structure of 5 to 200 aspartic acid derivative units or glutamic acid derivative units.
  • the hydrophobic group is bonded to the side chain carboxy group directly or via a bonding group, and the hydrophobic group is a linear or branched (C1-C30) alkyl group, linear chain One or more hydrophobic groups selected from a linear or branched (C2 to C30) alkenyl group or a linear or branched (C7 to C30) aralkyl group, to which a hydrophobic group is bonded
  • the block copolymer (b) having 3 to 200 aspartic acid derivative units or glutamic acid derivative units to which a hydrophobic group is bonded.
  • the linking group via the bond between the hydrophobic group and the side chain carboxy group of polyaspartic acid or polyglutamic acid is a binding functional group with one end at the carbonyl group, and the other end with the hydrocarbon group.
  • a linking group having a binding functional group is a binding functional group with one end at the carbonyl group, and the other end with the hydrocarbon group.
  • amino acid may be used as the linking group.
  • the amino acid may be either a natural amino acid or a non-natural amino acid.
  • the amino acid as the linking group has an aspect in which the N-terminal amino group is amide-bonded to the carboxy group of the polymer main chain, and the other C-terminal carboxy group is bonded to the hydrophobic group via an ester bond or an amide bond. Can be mentioned.
  • R 11 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group of (C1 to C10)
  • R 12 represents a methylene group or an ethylene group
  • R 13 represents a hydrogen atom
  • R 14 is a linear or branched alkyl group of (C1-C30), (C2- 30) a linear or branched alkenyl group, (C7-C30) a linear or branched aralkyl group and one or more groups selected from the group consisting of amino acids in which a carboxy group is protected
  • R 15 represents a hydroxyl group and / or —N (R 17 ) CONH (R 18 )
  • the alkyl group of (C1 to C10) in R 11 represents a linear or branched (C1 to C10) alkyl group which may have a substituent.
  • the linear alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-hexyl group, and an n-decyl group.
  • the branched alkyl group include isopropyl group, tert-butyl group, 1-methyl-propyl group, 2-methyl-propyl group, 2,2-dimethylpropyl group and the like.
  • the cyclic alkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and an adamantyl group.
  • t represents the degree of polymerization of the (CH 2 CH 2 O) unit structure and is 5 to 11,500. Preferably, t is 10 to 5,000.
  • the acyl group of (C1 to C6) of R 13 include formyl group, acetyl group, propionyl group, butyroyl group, cyclopropylcarbonyl group, cyclopentanecarbonyl group and the like.
  • the (C1 to C6) alkoxycarbonyl group for R 13 include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a tert-butoxycarbonyl group, a cyclohexyloxycarbonyl group, and the like.
  • the alkyl group of (C1 to C30) of R 14 is a linear or branched (C1 to C30) alkyl group which may have a substituent.
  • methyl group, ethyl group, 1-propyl group, 2-propyl group, 1-hexyl group, 1-octyl group, 1-dodecyl group, 1-tetradecyl group, 1-hexadecyl group, 1-octadecyl group, etc. Can be mentioned.
  • the alkenyl group of (C2 to C30) of R 14 is a linear or branched (C2 to C30) alkenyl group which may have a substituent.
  • Examples thereof include an ethylene group, a propylene group, a 2-butenyl group, a cyclohexenyl group, a 9-hexadecenyl group, a cis-9-octadecenyl group, a cis, cis-9, and a 12-octadecadienyl group.
  • the (C7 to C30) aralkyl group of R 14 is a linear or branched (C7 to C30) aralkyl group which may have a substituent.
  • benzyl group, 1-phenylethyl group, 2-phenylethyl group, 4-phenylbutyl group, 6-phenylhexyl group and the like can be mentioned.
  • the substituents that may be included are mercapto group, hydroxyl group, halogen atom, nitro group, cyano group, carbocyclic or heterocyclic aryl group, alkylthio group, arylthio group, alkylsulfinyl group, arylsulfinyl group.
  • the substitution position on the aromatic ring may be ortho, meta, or para.
  • the definition of this substituent is synonymous with the description matter of the substituent in bifunctional polymer (a).
  • the amino acid in which the carboxyl group of R 14 is protected may be a natural amino acid or a non-natural amino acid, and represents a substituent converted as an ester derivative or an amide derivative in the carboxy group of the amino acid.
  • the ester derivative is preferably a linear, branched or cyclic (C1 to C10) alkyl ester. Examples of the linear alkyl ester include methyl ester, ethyl ester, n-propyl ester, n-butyl ester, n-hexyl ester, and n-decyl ester.
  • Examples of the branched alkyl ester include isopropyl ester, tert-butyl ester, 1-methyl-propyl ester, 2-methyl-propyl ester, 2,2-dimethylpropyl ester and the like.
  • Examples of the cyclic alkyl ester include cyclopropyl ester, cyclobutyl ester, cyclopentyl ester, cyclohexyl ester, adamantyl ester and the like.
  • the amide derivative is preferably a linear, branched or cyclic (C1-C10) alkylamide.
  • linear alkylamide examples include methylamide, ethylamide, n-propylamide, n-butylamide, n-hexylamide, n-decylamide and the like.
  • branched alkylamide examples include isopropylamide, tert-butylamide, 1-methyl-propylamide, 2-methyl-propylamide, 2,2-dimethylpropylamide and the like.
  • Examples of the cyclic alkylamide include cyclopropylamide, cyclobutylamide, cyclopentylamide, cyclohexylamide, adamantylamide and the like.
  • R 15 may be —N (R 17 ) CONH (R 18 ).
  • R 17 and R 18 may be the same or different and may be substituted with a linear, branched or cyclic alkyl group of (C3 to C6), or a tertiary amino group (C1 to C5).
  • Alkyl group examples of the (C3 to C6) linear, branched or cyclic alkyl group include a 1-propyl group, a 2-propyl group, a cyclopentyl group and a cyclohexyl group.
  • Examples of the alkyl group (C1 to C5) optionally substituted with the tertiary amino group include a 3-dimethylaminopropyl group and a 5-dimethylaminopentyl group.
  • R 16 is a linking group for bonding the polyethylene glycol segment to the polyaspartic acid segment or polyglutamic acid segment, and is an alkylene group of (C1-6).
  • C1-6 alkylene group of (C1-6).
  • a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, and a tetramethylene group can be mentioned.
  • X 11 in the general formula (2) is a linking group for connecting the carbonyl group and the R 14 group.
  • the linking group in X 11 is a linking group having a functional group that is bonded to the carbonyl group at one end.
  • X 11 is a case where a carbonyl group and R 14 can be directly bonded, and when there is no corresponding binding functional group, X 11 represents a bond. Furthermore, an amino acid binding residue may be used as X 11 as a linking group.
  • the amino acid used as the linking group may be either a natural amino acid or a non-natural amino acid.
  • X 11 is an amino acid-binding residue and an amino acid is used as the linking group
  • the carbonyl group of the hydrophobic polymer segment is bonded to the N-terminal amino group of the amino acid, while the C-terminal carboxy group is bonded to the ester bond or amide bond.
  • An embodiment in which the R 14 group is bonded via the above can be mentioned. Therefore, when using amino acid coupling residue as X 11, X 11 is a bond group represented by -NH-C (R 20) -COO- (R 20 represents a side chain of an amino acid used).
  • the main chain of the hydrophobic polymer segment of the block copolymer (b) is polyaspartic acid.
  • the structural unit of the polyaspartic acid has an ⁇ -amide type polymer, a ⁇ -amide type polymer, and a structural unit in which the side chain carboxy group is an intramolecular cyclization type.
  • the main chain of the hydrophobic polymer segment in the block copolymer (b) is polyglutamic acid.
  • the structural unit of the main chain may have an ⁇ -amide type polymer, a ⁇ -amide type polymer and a structural unit in which the side chain carboxy group is an intramolecular cyclization type.
  • m, n, o, p, and q are structural units in which R 14 is bonded to the polymer main chain of the hydrophobic polymer segment, structural units in which R 15 is bonded, and side chain carboxy groups in the molecule.
  • each content is shown.
  • M, n, o, p and q each independently represents an integer of 0 to 200, and is a polyaspartic acid derivative which is a hydrophobic polymer segment in terms of the total number of polymerizations of the unit structure of the polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative.
  • the polymerization number of the polymer main chain of the polyglutamic acid derivative (m + n + o + p + q) is an integer of 5 to 200.
  • the structural unit to which R 14 is bonded is an essential component, and the total content number (m + n) is an integer of 3 to 200.
  • the structural unit to which R 15 is bonded and the intramolecular cyclized structural unit having a side chain carboxy group are arbitrary.
  • the structural unit to which R 14 is bonded, the structural unit to which R 15 is bonded, and the side chain carboxy group are present in the molecule.
  • the cyclized building units are each independently a random sequence. That is, a constitutional unit in which R 14 is bonded to a side chain carboxy group of a polyaspartic acid derivative segment or a polyglutamic acid derivative segment, a structural unit in which R 15 is bonded, and a structure in which the side chain carboxy group has an intramolecular cyclized structure.
  • the units may be arranged in an arbitrary order, the constituent units may be localized and localized, and each constituent unit may be a random array having no regularity. It may be a structured polymer structure.
  • R 14 is a linear or branched (C8 to C30) alkyl group, linear or branched (C8 to C30). It is at least one selected from the group consisting of an alkenyl group, a linear or branched (C7 to C20) aralkyl group, and X 11 is an oxygen atom (—O—) or —NH—. preferable.
  • the polymer main chain polymerization number (m + n + o + p + q) of the polyaspartic acid derivative or polyglutamic acid derivative which is a hydrophobic polymer segment is an integer of 6 to 150, and the total content number of structural units to which R 14 groups are bonded ( m + n) is preferably an integer of 3 to 150.
  • the production method of the block copolymer (b) of the present invention is not particularly limited, and may be a method in which a polyethylene glycol segment and a hydrophobic polymer segment respectively prepared in advance are combined.
  • a method may be used in which a block type copolymer is constructed by sequentially polymerizing a segmented monomer body.
  • a method may be used in which an AB block copolymer in which polyethylene glycol and a precursor of a hydrophobic polymer segment are bonded is prepared in advance, and an appropriate hydrophobic functional group is introduced therein.
  • a polycarboxylic acid polymer segment such as polyaspartic acid is used as a precursor of the hydrophobic polymer segment, and an AB block type copolymer in which polyethylene glycol and the polycarboxylic acid polymer segment are bonded is prepared in advance. It can be produced by reacting a hydrophobic functional group under an appropriate condensation condition by an amide bond mode and / or an ester bond mode. As the condensation conditions, a method that can be used in a normal organic synthesis reaction can be appropriately used.
  • an AB block type copolymer in which a polyethylene glycol segment and a polyaspartic acid segment are preferably used is used, and a hydrophobic functional group is introduced to the block type copolymer (b).
  • a polyethylene glycol derivative having an amino group at one end (for example, methoxypolyethyleneglycol-1-propylamine) is reacted sequentially with an appropriate N-carbonylaspartic anhydride protected with a side chain carboxy group such as ⁇ -benzyl ester.
  • an AB block type copolymer skeleton in which the polyethylene glycol segment and the polyaspartic acid segment are linked is constructed by sequential polymerization. Thereafter, an appropriate deprotection reaction is performed to synthesize an AB block copolymer having a plurality of carboxylic acids.
  • the deprotection group reaction can be carried out by hydrolysis under an alkaline condition or hydrogenolysis reaction.
  • the AB block copolymer having a plurality of carboxylic acids may be reacted with a hydrophobic group-containing compound such as a hydrocarbon group having an amino group and / or a hydroxyl group under a condensation reaction condition such as a carbodiimide dehydrating condensing agent. .
  • a hydrophobic group-containing compound such as a hydrocarbon group having an amino group and / or a hydroxyl group under a condensation reaction condition such as a carbodiimide dehydrating condensing agent.
  • a hydrophobic group-containing compound such as a hydrocarbon group having an amino group and / or a hydroxyl group
  • a condensation reaction condition such as a carbodiimide dehydrating condensing agent.
  • the carbodiimide dehydrating condensing agent dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCI), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC) and the like can be used.
  • a reaction aid such as N, N-dimethylaminopyridine (DMAP) may be used.
  • DMAP N, N-dimethylaminopyridine
  • the amount of the hydrophobic functional group such as a hydrocarbon group introduced into the block copolymer (b) can be adjusted by appropriately increasing or decreasing the charged amount of each hydrophobic group-containing compound in the dehydration condensation reaction.
  • R 17 and R 18 of —N (R 17 ) CONH (R 18 ) are cyclohexyl groups.
  • DIPCI diisopropylcarbodiimide
  • R 17 and R 18 are isopropyl groups.
  • R 17 and R 18 of —N (R 17 ) CONH (R 18 ) are an ethyl group and 3-dimethylaminopropyl. It becomes a mixed substitution product.
  • the block copolymer (b) of the present invention can be produced via an optional purification step.
  • N-carbonylglutamic acid anhydride is used instead of N-carbonylaspartic acid anhydride in the above synthesis example. If glutamic acid is obtained and then the hydrocarbon group-containing compound is introduced, the polymer (b) can be synthesized when the hydrophobic polymer segment is a polyglutamic acid block type.
  • Examples of the fat-soluble additive (c) in the present invention include vitamin A and derivatives thereof, vitamin D and derivatives thereof, vitamin E and derivatives thereof, vitamin K and derivatives thereof, cholesterol and derivatives thereof, and the like.
  • vitamin A and derivatives thereof include retinol, retinal, retinoic acid, and a compound represented by the following general formula (3) [Wherein, R 20 represents one selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, and polyethylene glycol. ], A compound represented by the following general formula (4) [Wherein, X 21 represents NH, an oxygen atom, or a sulfur atom, and R 21 represents an alkyl group, an alkenyl group, or the like.
  • R 20 includes an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, and the like, preferably (C1 to C20 ) Alkyl group, (C2 to C20) alkenyl group, (C1 to C20) alkoxy group, (C1 to C20) alkylamino group, (C2 to C20) alkenyloxy group, (C2 to C20) alkenyl Examples include an amino group and polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • X 21 is preferably NH or an oxygen atom.
  • R 21 includes an alkyl group and an alkenyl group, preferably an alkyl group of (C1 to C20) and an alkenyl group of (C2 to C20).
  • R 22 includes an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, and the like, preferably an alkyl group of (C1 to C20), an alkenyl group of (C2 to C20) Group, an alkoxy group of (C1 to C20), an alkylamino group of (C1 to C20), an alkenyloxy group of (C2 to C20), an alkenylamino group of (C2 to C20), or a polyethylene having a molecular weight of 100 to 10,000 Glycol and the like.
  • Examples of the alkyl group in R 20 , R 21 and R 22 include, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-octyl group, n -Decyl group, n-dodecyl group, n-tetradecyl group, n-hexadecyl group, n-octadecyl group and the like.
  • Examples of the alkenyl group in R 20 , R 21 and R 22 include, for example, ethenyl group, 1-propenyl group, 1-butenyl group, 1-pentenyl group, 9-hexadecenyl group, cis-9-octadecenyl group, cis, Examples thereof include cis-9, 12-octadecadienyl group and the like.
  • Examples of the alkoxy group in R 20 include a methoxy group, an ethoxy group, an isopropoxy group, a tert-butoxy group, a benzyloxy group, a dodecanoxy group, and an octadodecanoxy group.
  • Examples of the alkylamino group in R 20 include a methylamino group, an ethylamino group, an isopropylamino group, a tert-butylamino group, a benzylamino group, an n-dodecylamino group, and an n-octadecylamino group. .
  • alkenyloxy group in R 20 examples include ethenyloxy group, 1-propenyloxy group, 1-butenyloxy group, 9-hexadecenyloxy group, cis-9-octadecenyloxy group, cis, cis Examples include a -9,12-octadecadienyloxy group.
  • Examples of the alkenylamino group in R 20 include ethenylamino group, 1-propenylamino group, 1-butenylamino group, 9-hexadecenylamino group, cis-9-octadecenylamino group, cis, cis And a -9,12-octadecadienylamino group.
  • the polyethylene glycol in R 20 is a group containing a repeating structure of (CH 2 CH 2 O) groups, and refers to a segment structure having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • the terminal group of the polyethylene glycol is a hydroxyl group or an alkoxy group of (C1 to C6).
  • the bond side terminal is a bond, an oxygen atom (—O—), —NH—, —OCO— (CH 2 ) n ′ —COO— (n ′ represents an integer of 1 to 4). ), —O— (CH 2 ) n ′ —COO— (n ′ represents an integer of 1 to 4), —O— (CH 2 ) n ′ —O— (n ′ represents an integer of 1 to 4) ) Or the like.
  • examples of vitamin D and its derivatives include ergocalciferol, cholecalciferol, and a compound represented by the following general formula (6) [Wherein R 31 represents an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, or the like. And a compound represented by the following general formula (7) [Wherein R 32 represents an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, or the like. ] Etc. are mentioned.
  • examples of R 31 include an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, and the like, preferably (C1 to C20 ) Alkyl group, (C2 to C20) alkenyl group, (C1 to C20) alkoxy group, (C1 to C20) alkylamino group, (C2 to C20) alkenyloxy group, (C2 to C20) alkenyl Examples include an amino group and polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • R 32 includes an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, and the like, preferably (C1 to C20 ) Alkyl group, (C2 to C20) alkenyl group, (C1 to C20) alkoxy group, (C1 to C20) alkylamino group, (C2 to C20) alkenyloxy group, (C2 to C20) alkenyl Examples thereof include an amino group and polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • Examples of the alkyl group in R 31 and R 32 include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, an n-octyl group, and an n-decyl group. N-dodecyl group, n-tetradecyl group, n-hexadecyl group, n-octadecyl group and the like.
  • Examples of the alkenyl group in R 31 and R 32 include ethenyl group, 1-propenyl group, 1-butenyl group, 1-pentenyl group, 9-hexadecenyl group, cis-9-octadecenyl group, cis, cis-9. , 12-octadecadienyl group and the like.
  • Examples of the alkoxy group in R 31 and R 32 include a methoxy group, an ethoxy group, an isopropoxy group, a t-butoxy group, a benzyloxy group, a dodecanoxy group, and an octadodecanoxy group.
  • Examples of the alkylamino group in R 31 and R 32 include a methylamino group, an ethylamino group, an isopropylamino group, a tert-butylamino group, a benzylamino group, an n-dodecylamino group, and an n-octadecylamino group. Is mentioned.
  • Examples of the alkenyloxy group in R 31 and R 32 include an ethenyloxy group, a 1-propenyloxy group, a 1-butenyloxy group, a 9-hexadecenyloxy group, a cis-9-octadecenyloxy group, and cis, cis-9, 12-octadecadienyloxy group and the like.
  • Examples of the alkenylamino group in R 31 and R 32 include ethenylamino group, 1-propenylamino group, 1-butenylamino group, 9-hexadecenylamino group, cis-9-octadecenylamino group, Examples thereof include cis, cis-9, 12-octadecadienylamino group.
  • the polyethylene glycol in R 31 and R 32 is a group containing a repeating structure of (CH 2 CH 2 O) groups, and refers to a segment structure having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • the terminal group of the polyethylene glycol is a hydroxyl group or an alkoxy group of (C1 to C6).
  • the bond side terminal is a bond, an oxygen atom (—O—), —NH—, —OCO— (CH 2 ) n ′ —COO— (n ′ is 1 to 4). ), —O— (CH 2 ) n ′ —COO— (n ′ represents an integer of 1 to 4), —O— (CH 2 ) n ′ —O— (n ′ represents 1 to 4) Or a linking group such as
  • vitamin E and derivatives thereof include, for example, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ - Tocotrienol and a compound represented by the following general formula (8) [Wherein, R 41 represents an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, or the like. ] Etc. are mentioned.
  • examples of R 41 include an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, and the like, and preferably (C1 to C20 ) Alkyl group, (C2 to C20) alkenyl group, (C1 to C20) alkoxy group, (C1 to C20) alkylamino group, (C2 to C20) alkenyloxy group, (C2 to C20) alkenyl Examples thereof include an amino group or polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • Examples of the alkyl group in R 41 include a methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-octyl group, n-decyl group, n- Examples include dodecyl group, n-tetradecyl group, n-hexadecyl group, n-octadecyl group and the like.
  • Examples of the alkenyl group in R 41 include ethenyl, 1-propenyl, 1-butenyl, 1-pentenyl, 9-hexadecenyl, cis-9-octadecenyl, cis, cis-9, 12- An octadecadienyl group etc. are mentioned.
  • Examples of the alkoxy group in R 41 include a methoxy group, an ethoxy group, an isopropoxy group, a tert-butoxy group, a benzyloxy group, a dodecanoxy group, and an octadodecanoxy group.
  • Examples of the alkylamino group in R 41 include a methylamino group, an ethylamino group, an isopropylamino group, a tert-butylamino group, a benzylamino group, a dodecylamino group, and an octadecylamino group.
  • Examples of the alkenyloxy group in R 41 include ethenyloxy group, 1-propenyloxy group, 1-butenyloxy group, 9-hexadecenyloxy group, cis-9-octadecenyloxy group, cis, cis Examples include a -9,12-octadecadienyloxy group.
  • Examples of the alkenylamino group in R 41 include ethenylamino group, 1-propenylamino group, 1-butenylamino group, 9-hexadecenylamino group, cis-9-octadecenylamino group, cis, cis And a -9,12-octadecadienylamino group.
  • the polyethylene glycol in R 41 is a group containing a repeating structure of (CH 2 CH 2 O) groups, and refers to a segment structure having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • the terminal group of the polyethylene glycol is a hydroxyl group or an alkoxy group of (C1 to C6).
  • the bond-side terminal is a bond, oxygen atom (—O—), —NH—, —OCO— (CH 2 ) n ′ —COO— (n ′ represents an integer of 1 to 4). ), —O— (CH 2 ) n ′ —COO— (n ′ represents an integer of 1 to 4), —O— (CH 2 ) n ′ —O— (n ′ represents an integer of 1 to 4) ) Or the like.
  • the linking group of the tocopherol-polyethylene glycol bond derivative is preferably a succinic acid linking group.
  • ⁇ -tocopherol-polyethylene glycol succinate ⁇ -tocopherol-polyethylene glycol succinate, ⁇ -tocopherol-polyethylene glycol succinate ⁇ -tocopherol-polyethylene glycol succinate and the like can be used.
  • examples of vitamin K and its derivatives include phylloquinone, menaquinone, menadione, menadiol and the like.
  • examples of cholesterols and derivatives thereof include cholesterol, cholestanol, strophanthidine, and a compound represented by the following general formula (9).
  • R 51 represents an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, or the like.
  • Etc. are mentioned.
  • R 51 includes an alkyl group, an alkenyl group, an alkoxy group, an alkylamino group, an alkenyloxy group, an alkenylamino group, polyethylene glycol, and the like, preferably (C1 to C20 ) Alkyl group, (C2 to C20) alkenyl group, (C1 to C20) alkoxy group, (C1 to C20) alkylamino group, (C2 to C20) alkenyloxy group, (C2 to C20) alkenyl Examples include an amino group and polyethylene glycol having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • Examples of the alkyl group in R 51 include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, an n-octyl group, an n-decyl group, and an n-dodecyl group.
  • Examples of the alkenyl group in R 51 include ethenyl group, 1-propenyl group, 1-butenyl group, 1-pentenyl group, 9-hexadecenyl group, cis-9-octadecenyl group, cis, cis-9, 12-octa A decadienyl group etc. are mentioned.
  • Examples of the alkoxy group in R 51 include a methoxy group, an ethoxy group, an isopropoxy group, a tert-butoxy group, a benzyloxy group, a dodecanoxy group, and an octadodecanoxy group.
  • Examples of the alkylamino group in R 51 include a methylamino group, an ethylamino group, an isopropylamino group, a tert-butylamino group, a benzylamino group, a dodecylamino group, and an octadecylamino group.
  • Examples of the alkenyloxy group in R 51 include ethenyloxy group, 1-propenyloxy group, 1-butenyloxy group, 9-hexadecenyloxy group, cis-9-octadecenyloxy group, cis, cis- 9,12-octadecadienyloxy group and the like can be mentioned.
  • alkenylamino group in R 51 examples include ethenylamino group, 1-propenylamino group, 1-butenylamino group, 9-hexadecenylamino group, cis-9-octadecenylamino group, cis, cis- 9,12-octadecadienylamino group and the like can be mentioned.
  • the polyethylene glycol in R 51 is a group containing a repeating structure of (CH 2 CH 2 O) groups, and refers to a segment structure having a molecular weight of 100 to 10,000.
  • the terminal group of the polyethylene glycol is a hydroxyl group or an alkoxy group of (C1 to C6).
  • the bond side terminal is a bond, oxygen atom (—O—), —NH—, —OCO— (CH 2 ) n ′ —COO— (n ′ represents an integer of 1 to 4). ), —O— (CH 2 ) n ′ —COO— (n ′ represents an integer of 1 to 4), —O— (CH 2 ) n ′ —O— (n ′ represents an integer of 1 to 4) ) Or the like.
  • the fat-soluble additive (c) it is preferable to use a vitamin E derivative, vitamin D derivative or cholesterol derivative as the fat-soluble additive (c). These may be used alone or in combination of two or more. It is particularly preferable to use tocopherol and tocopherol-polyethylene bond derivatives which are vitamin E derivatives, ergocalciferol or cholecalciferol which are vitamin D derivatives, cholesterol and cholesterol acyl derivatives which are cholesterol derivatives.
  • the fat-soluble additive (c) used in the present invention a commercially available product may be used as it is, and a commercially available compound may be used as it is.
  • the nucleic acid transport composition of the present invention comprises a bifunctional polymer (a) having a cationic functional group and a hydrocarbon group introduced therein, a block copolymer (b) in which a polyethylene glycol segment and a hydrophobic polymer segment are linked, and a fat-soluble composition. It contains an additive (c).
  • the bifunctional polymer (a): the block copolymer (b): the fat-soluble additive (c) 1: 0.1-5: 0.1-5.
  • the composition for transporting nucleic acids by increasing the addition amount of the block copolymer (b) and the fat-soluble additive (c), a strong interaction occurs in these components, and a strong associative complex is prepared. It is possible to direct retention of the nucleic acid drug firmly and retention in blood during blood administration.
  • by reducing the amount of the block-type copolymer (b) and the fat-soluble additive (c) it is possible to obtain an associative complex by a gradual interaction, aiming at rapid release of nucleic acid pharmaceutical components. can do.
  • the bifunctional polymer (a), the block copolymer (b) and the fat-soluble additive (c) are combined in particular if the components having the structures described above are used. Is not limited, and each component can be arbitrarily selected and used in combination.
  • the nucleic acid transport composition of the present invention is a composition that enhances the release of the nucleic acid component when the purpose is to efficiently release the nucleic acid molecule, which is the transporter, into the cell after biological administration. It is necessary to.
  • the bifunctional polymer (a) and the block copolymer (b) may have structures having different hydrophobic functional groups and polymer main chains. preferable. That is, for example, when the bifunctional polymer (a) has a structure in which polyglutamic acid is used as a polymer main chain and a linear (C8 to C30) alkyl group is bonded as a hydrophobic functional group, the block copolymer ( Examples of b) include a composition in which the polymer main chain of the hydrophobic polymer segment is polyaspartic acid and a structure in which an aralkyl group of (C7 to C30) is bonded as a hydrophobic functional group.
  • the block copolymer ( The composition b) is preferably a composition in which polyglutamic acid is used as the main chain of the hydrophobic polymer segment and is added as a linear (C8 to C30) alkyl group hydrophobic functional group.
  • the hydrophobic interaction generated between the complex formed by the bifunctional polymer (a) with the nucleic acid and the block copolymer (b) becomes relatively weak. Aggregate formation by the body and the block copolymer (b) is based on weak cohesive force.
  • the polymer structures of the bifunctional polymer (a) and the block copolymer (b) of the composition for transporting nucleic acid of the present invention are appropriately designed for the purpose of adjusting the release property of the nucleic acid component. That's fine.
  • the nucleic acid transport composition of the present invention is used for transporting the nucleic acid to a target tissue cell after mixing with the nucleic acid, administering the nucleic acid into a living body, delivering the nucleic acid to the target tissue.
  • the present invention also provides a nucleic acid pharmaceutical composition comprising a nucleic acid transport composition containing the bifunctional polymer (a), the block copolymer (b) and the fat-soluble additive (c). included.
  • the nucleic acid used in the nucleic acid pharmaceutical composition is not limited.
  • examples of the nucleic acid include DNA, RNA, natural or non-natural nucleic acid analogs (for example, peptide nucleic acids), modified nucleic acids, modified nucleic acids, and the like.
  • the nucleic acid may be single-stranded or double-stranded, and the presence or absence of protein coding or the presence or absence of other functions is not limited.
  • the nucleic acid is preferably a functional nucleic acid that can exert some action on a living body, tissue, cell or the like when delivered into the living body.
  • Functional nucleic acids include plasmid DNA, siRNA, miRNA (microRNA), antisense RNA, antisense DNA, decoy nucleic acid, ribozyme, DNA enzyme, various suppressor genes (such as cancer suppressor genes), functional modified nucleic acids / modifications Nucleic acids (for example, nucleic acids in which the phosphate portion of the nucleic acid is modified to phosphorothioate, methylphosphonate, phosphate triester, phosphoramidate, or a nucleic acid to which a hydrophobic functional group such as cholesterol or vitamin E is bound) Can be mentioned. These are selected according to the use of the composition for nucleic acid delivery.
  • RNA interference RNA interference
  • Preferred genes for RNA interference include cancer (tumor) genes, anti-apoptotic genes, cell cycle-related genes, growth signal genes and the like.
  • the base length of siRNA is not limited, but is usually less than 30 bases, preferably 10 to 25 bases.
  • RNA having an action of suppressing expression of a target gene utilizing RNA interference is preferably used, and siRNA, miRNA, and antisense RNA are preferably used. It is particularly preferable to apply siRNA having a base length of 10 to 25 bases.
  • the nucleic acid transport composition of the present invention can be used as a nucleic acid pharmaceutical composition by mixing with nucleic acid to form a complex.
  • the nucleic acid forms a complex with the bifunctional polymer (a) by electrostatic interaction.
  • the application amount of the nucleic acid is set by the application amount with the bifunctional polymer (a), and the ratio of the phosphate group (P) of the nucleic acid to the cationic charge (N) of the bifunctional polymer (a). It is prescribed.
  • the nucleic acid pharmaceutical composition of the present invention comprises a bifunctional polymer (a) into which a cationic functional group and a hydrocarbon group are introduced, a block copolymer (b) in which a polyethylene glycol segment and a hydrophobic polymer segment are linked, and a fat-soluble additive. It is produced by preparing a mixture of a nucleic acid transport composition containing an agent (c) and a nucleic acid. In the nucleic acid pharmaceutical composition, an aggregate is formed by the interaction of all the components including the nucleic acid.
  • the nucleic acid is retained by forming a complex (also referred to as polyion complex or PIC) by electrostatic interaction between the anion charge of the nucleic acid and the cation charge of the bifunctional polymer (a).
  • the complex is hydrophobic because it has a hydrocarbon group derived from the bifunctional polymer (a).
  • the complex is formed into an aggregate by hydrophobic interaction with the block copolymer (b) and the fat-soluble additive (c). Since the aggregate has a clear light scattering intensity observed by analysis by a dynamic light scattering method, it is considered that the aggregate forms nanoparticle aggregates of several nanometers to several hundred nanometers.
  • the method for preparing the aggregate is not particularly limited, but the bifunctional polymer (a) and the block copolymer (b) are dissolved in a solvent containing water, and an aqueous nucleic acid solution is added thereto. It can be prepared by adding an alcohol solution of the soluble additive (c). Alternatively, the bifunctional polymer (a) and the block copolymer (b) are dissolved in a solvent containing water, an alcohol solution of the fat-soluble additive (c) is added thereto, and then an aqueous nucleic acid solution is added. Can be prepared.
  • the nucleic acid pharmaceutical compositions of the invention can be used to deliver nucleic acids to target cells or tissues in vitro or in vivo.
  • a nucleic acid that has been difficult to be delivered stably into a target cell can be easily delivered in a stabilized state.
  • a nucleic acid that suppresses gene expression is used and delivered to a cell or tissue to express the effect, high nucleic acid expression suppression efficiency can be obtained by using the nucleic acid pharmaceutical composition of the present invention. It becomes possible.
  • the nucleic acid pharmaceutical composition may be brought into contact with the target cell or tissue.
  • the target cell or tissue is cultured or cultured in the presence of the nucleic acid pharmaceutical composition of the present invention.
  • the nucleic acid pharmaceutical composition may be added to the product.
  • the nucleic acid pharmaceutical composition of the present invention is treated with the nucleic acid by an administration method commonly used in the art such as gene therapy. May be administered to an individual in need of introduction (or an individual to be treated). Examples of such individuals include, but are not limited to, humans, mice, rats, rabbits, dogs, cats, monkeys, cows, horses, pigs, birds and the like.
  • administration methods include direct introduction or transplantation into or near target cells or tissues, intravenous injection, arterial injection, intramuscular injection, oral administration, transpulmonary administration, and the like.
  • Each condition such as the dose, the number of administrations, and the administration period can be appropriately set according to the type and condition of the test animal.
  • the disease to be treated with the nucleic acid pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a disease caused by inappropriate expression of a gene.
  • cancer lung cancer, pancreatic cancer, brain tumor, Liver cancer, breast cancer, colon cancer, neuroblastoma and bladder cancer, etc.
  • cardiovascular disease motor organ disease, central system disease and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain other additives generally used in pharmaceutical preparations.
  • Other additives include excipients, extenders, fillers, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives, flavoring agents. Examples include flavoring agents, soothing agents, stabilizers and tonicity agents.
  • Such other additives may be used alone or in combinations of two or more in any ratio. The details of the types and amounts of these other components can be appropriately determined by those skilled in the art according to the purpose, application, method of use, etc. of the pharmaceutical composition.
  • the form of the pharmaceutical composition of the present invention is optional, but usually an intravenous injection (including infusion) is adopted, and is provided in the state of a unit dose ampoule or other dose container, for example.
  • the method of using the pharmaceutical composition of the present invention is also arbitrary. Any pharmaceutical composition containing a nucleic acid transport composition can be administered as it is.
  • the present invention will be further described below with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • the siRNA used was siCON (random sequence (molecular weight about 13K), HEPES solution (pH 7) with a siRNA concentration of 100 ⁇ M; manufactured by Hokkaido System Science), siLuc (luciferase code (molecular weight about 13K), HEPES solution with a siRNA concentration of 100 ⁇ M ( pH 7); Hokkaido System Science Co., Ltd.), FAM-siLuc (luciferase-coded fluorescent label (molecular weight about 13K), siRNA concentration 100 ⁇ M HEPES solution (pH 7); Hokkaido System Science Co., Ltd.), siR2B (RRM2 code (about molecular weight) 13K), a HEPES solution (pH 7) having a siRNA concentration of 100 ⁇ M; Cosmo Bio Co., Ltd. was used.
  • the precipitate was collected by filtration and washed with ethanol / diisopropyl ether (1/4 (v / v), 40 mL).
  • the solid (2.6 g) obtained by vacuum drying the precipitate was dissolved in 50 mL of DMF at 50 ° C., 1 mL of acetic anhydride was added at room temperature, and the mixture was stirred overnight at the same temperature.
  • Ethyl acetate 100mL and diisopropyl ether 400mL were added to the reaction liquid, and it stirred at room temperature for 3 hours.
  • the precipitate was collected by filtration and washed with ethyl acetate / diisopropyl ether (1/4 (v / v), 50 mL).
  • the precipitate was collected by filtration and washed with ethyl acetate / diisopropyl ether (1/4 (v / v), 100 mL). did.
  • the solid (2.4 g) obtained by vacuum drying the precipitate was dissolved in 50 mL of DMF at 50 ° C., 1 mL of acetic anhydride was added at room temperature, and the mixture was stirred overnight at the same temperature.
  • 100 mL of ethyl acetate and 400 mL of diisopropyl ether were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • the precipitate was collected by filtration and mixed with ethyl acetate / diisopropyl ether (1/4 (v / v), 50 mL). Washed. The precipitate was vacuum dried to obtain a solid (2.4 g). To 2 g of this precipitated solid, 42 mL of DMF was added and dissolved at 50 ° C., 200 mg of 5% palladium-carbon (manufactured by NE Chemcat) was added at room temperature, and hydrogenolysis was performed overnight at room temperature.
  • the obtained precipitate was suspended in 1 mL of 0.1N hydrochloric acid, 20 mL of acetone was added, and the mixture was stirred for 30 minutes. The precipitate is collected, washed with 5 mL of acetone, dried, dissolved in 40 mL of water, insolubles are filtered off, 100 mL of acetonitrile is added, and an ion exchange resin column (Dow Chemical Dowex 50 (H + ), 5 mL) And eluted with acetonitrile / water (1/1 (v / v), 10 mL). Acetonitrile was distilled off under reduced pressure from the obtained elution fraction, and then freeze-dried to obtain Compound 3 (132 mg).
  • L-arginine methyl ester dihydrochloride prepared in another container ( (Mixed by Kokusan Chemical Co., Ltd.) A mixed solution of 140.4 mg, diisopropylethylamine 187.2 ⁇ L, and DMF 1.4 mL was added, and the mixture was further stirred at 25 ° C. overnight. Ethanol (18 mL) and diisopropyl ether (72 mL) were added to the reaction mixture, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The precipitate was collected by filtration and washed with ethanol / diisopropyl ether (1/4 (v / v), 20 mL).
  • the obtained precipitate was dissolved in dimethylacetamide, and using an dialysis membrane (MWCO 3,500), the external solution was 0.1N hydrochloric acid acetonitrile / water (1/1 (v / v), 500 mL) and water 500 mL. Dialysis was performed using Subsequently, the compound 5 (116.2 mg) was obtained by freeze-drying.
  • the obtained precipitate is dissolved in 1.3 mL of 0.1N hydrochloric acid water, 1.3 mL of acetone is added, and the external solution is dialyzed using 500 mL of water using a dialysis membrane (MWCO 3,500). It was. Subsequently, the compound 7 (161.5 mg) was obtained by freeze-drying.
  • Example 1-1 Preparation of siRNA (siCON) complex with compound 3 (amide conjugate of 55 polymeric acid having 55 polymerization number, stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and D- ⁇ -tocopherol Compound 3 / Compound 8 / Distilled water is mixed to 6 mg / 1.5 mg / 0.2 mL, and while heating to about 40 ° C., osmotic stirring and sonication are repeated using a vortex mixer to obtain a solution. Prepared.
  • the average particle size of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method and found to be 250 nm.
  • Example 1-2 Compound 3 (amide conjugate of polyglutamic acid having a polymerization number of 55 with stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and siRNA (FAM-siLuc) complex with D- ⁇ -tocopherol Preparation
  • Compound 3 / Compound 8 / Distilled water is mixed to 6 mg / 1.5 mg / 0.2 mL and dissolved by repeating osmotic stirring and sonication using a vortex mixer while heating to about 40 ° C. A liquid was prepared.
  • Example 2-1 Preparation of siRNA (siCON) complex with compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid with a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and D- ⁇ -tocopherol Compound 4 / Compound 8 / Distilled water was mixed to 6 mg / 1.5 mg / 0.2 mL, and while heating to about 40 ° C., osmotic stirring and sonication were repeated using a vortex mixer to obtain a solution. Prepared.
  • Example 2-2 Compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid having a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and siRNA (FAM-siLuc) complex with D- ⁇ -tocopherol Preparation
  • Compound 4 / Compound 8 / Distilled water is mixed to 6 mg / 1.5 mg / 0.2 mL, and dissolved by repeating osmotic stirring and sonication using a vortex mixer while heating to about 40 ° C. A liquid was prepared.
  • Example 3-1 Preparation of siRNA (siR2B) complex with compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid having a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and D- ⁇ -tocopherol Compound 4 / Compound 8 / Distilled water was mixed to 6 mg / 6 mg / 0.2 mL, and the solution was prepared by repeating osmotic stirring and sonication using a vortex mixer while heating to about 40 ° C. .
  • Example 3-2 Compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid having a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and siRNA (FAM-siLuc) complex with D- ⁇ -tocopherol Preparation
  • the average particle size of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method, it was 50 nm.
  • Example 3-3 Preparation of siRNA (siCON) complex with compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid having a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and D- ⁇ -tocopherol
  • the average particle diameter of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method, it was a hybrid of 25 nm and 150 nm.
  • Example 3-4 Preparation of siRNA (siLuc) complex with compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid having a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and D- ⁇ -tocopherol
  • the average particle size of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method, it was a hybrid of 58 nm and 305 nm.
  • Example 4-1 Compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid having a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 8 and D- ⁇ -tocopherol-polyethylene glycol 1000 succinic acid ester (TPGS) Preparation of siRNA (siR2B) complex by mixing Compound 4 / Compound 8 / TPGS / Distilled water to 6 mg / 6 mg / 21.1 mg / 1.0 mL and heating to about 40 ° C. with a vortex mixer The solution was prepared by repeating osmotic stirring and ultrasonic treatment.
  • TPGS D- ⁇ -tocopherol-polyethylene glycol 1000 succinic acid ester
  • siRNA HEPES solution siR2B, 50 ⁇ M
  • N the cation group
  • P the phosphate group
  • the mixture was permeated and stirred with a vortex mixer, and the compound 4 bifunctional polymer (a): the block polymer of compound 8
  • Example 5-1 Preparation of siRNA (siR2B) Complex by Compound 4 (Amide Conjugate of Polyglutamic Acid with Polymerization Number 102, Stearylamine and Arginine Methyl Ester), Compound 8 and Cholecalciferol Compound 4 / Compound 8 / distilled water was mixed to 30 mg / 30 mg / 1 mL, and the solution was prepared by repeating osmotic stirring and sonication with a vortex mixer while heating to about 40 ° C.
  • the average particle size of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method and found to be 88 nm.
  • Example 6-1 Preparation of siRNA (siR2B) complex with compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid with a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 9 and D- ⁇ -tocopherol Compound 4 / Compound 9 / Distilled water was mixed to 6 mg / 6 mg / 0.2 mL, and the solution was prepared by repeating osmotic stirring and sonication with a vortex mixer while heating to about 40 ° C.
  • the average particle diameter of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method, it was a hybrid of 20 nm and 116 nm.
  • Example 6-2 Compound 4 (amide conjugate of polyglutamic acid with a polymerization number of 102, stearylamine and arginine methyl ester), compound 9 and siRNA (FAM-siLuc) complex with D- ⁇ -tocopherol Preparation
  • the siRNA used was changed from siR2B to FAM-siLuc, and the other methods were used in the same manner as in Example 6-1.
  • Block type polymer (b): A lipid complex solution of Example 6-2 in which D- ⁇ -tocopherol 1/1/1 was prepared as a fat-soluble additive (c). The average particle size of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method and found to be 85 nm.
  • Example 7-1 Preparation of siRNA (siR2B) Complex with Compound 4 (Amide Conjugate of Polyglutamic Acid with a Polymerization Number of 102, Stearylamine and Arginine Methyl Ester), Compound 10 and D- ⁇ -Tocopherol Compound 4 / Compound 10 / Distilled water was mixed to 6 mg / 6 mg / 0.2 mL, and the solution was prepared by repeating osmotic stirring and sonication with a vortex mixer while heating to about 40 ° C.
  • Example 8-1 Preparation of siRNA (siR2B) Complex with Compound 5 (Amide Conjugate of Glutamic Acid with a Polymerization Number of 102 and Oleylamine and Arginine Methyl Ester), Compound 8 and D- ⁇ -Tocopherol Compound 5 / Compound 8 / distilled water was mixed to 6 mg / 6 mg / 0.2 mL, and the solution was prepared by repeating osmotic stirring and sonication with a vortex mixer while heating to about 40 ° C.
  • the average particle diameter of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method, it was a hybrid of 21 nm and 90 nm.
  • Example 8-2 Preparation of siRNA (FAM-siLuc) complex with Compound 5 (amide conjugate of glutamic acid having a polymerization number of 102, oleylamine and arginine methyl ester), Compound 8 and D- ⁇ -tocopherol
  • the average particle size of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method and found to be 59 nm.
  • Example 8-3 Preparation of siRNA (siCON) complex with Compound 5 (amide conjugate of glutamic acid having a polymerization number of 102, oleylamine and arginine methyl ester), Compound 8 and D- ⁇ -tocopherol
  • the siRNA to be used is changed from siR2B to siCON, and the other methods are used in the same manner as in Example 8-1, so that the bifunctional polymer (a) of compound 5: the block polymer (b) of compound 8 is used.
  • the average particle size of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method, it was a hybrid of 31 nm and 129 nm.
  • Example 8-4 Preparation of siRNA (siLuc) complex with compound 5 (amide conjugate of glutamic acid having a polymerization number of 102, oleylamine and arginine methyl ester), compound 8 and D- ⁇ -tocopherol
  • the siRNA to be used was changed from siR2B to siLuc, and the other methods were used in the same manner as in Example 8-1, so that the bifunctional polymer (a) of compound 5: the block polymer (b) of compound 8 was used.
  • siRNA complex solution of Comparative Example 3 a siRNA complex solution of Comparative Example 3.
  • the average particle size of the siRNA complex was measured by a dynamic scattering method and found to be 354 nm.
  • Comparative Example 3 did not have a function of protecting siRNA and could not be expected to be resistant to degradation against RNase.
  • Examples 1-1 to 8-1 which are siRNA complexes using the nucleic acid transport composition of the present invention, siRNA bands were confirmed even after treatment with RNase for 3 hours, and stability against RNase was confirmed. Was confirmed.
  • Comparative Example 1 where the fat-soluble additive (c) is not present and in Comparative Example 2 which is not a suitable fat-soluble additive (c)
  • no siRNA band was confirmed by the RNase treatment, and the siRNA was degraded by the RNase. (Fig. 1 and Table 1).
  • the fluorescence intensity was weak 2 hours after addition to U87MG cells, and the amount of FAM-siLuc incorporated into cells was low.
  • the increase in fluorescence intensity in the cells was confirmed as time passed, 7 hours after cell contact and 24 hours later. Therefore, it was confirmed that the siRNA complex of the present invention is taken up into cells over time.
  • when Lipofectamine was added to the cells strong fluorescence was confirmed 7 hours after addition, and a decrease in fluorescence intensity was confirmed after 24 hours. From this, it was clarified that the intracellular siRNA uptake by Lipofectamine was taken in from an early time and lost its function relatively quickly.
  • taken FAM-siLuc was not taken up into cells at any time. It was revealed that the siRNA complex of the present invention achieves a higher intracellular uptake of siRNA compared to conventionally used Lipofectamine.
  • Luciferase stably expressing cells were prepared by introducing a gene expression vector into cultured cells and applying a selective pressure with a drug resistance marker to establish a steady expression strain.
  • a drug resistance marker As the drug, Geneticine (manufactured by Invitrogen) was used. A 10 cm petri dish was seeded with 5 ⁇ 10 5 human glioblastoma cells U87MG and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 1 day.
  • a pGL3neo (Promega) vector which is a luciferase expression vector, was introduced into U87MG cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. After culturing at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 2 days, the cells were detached with 0.25% Tripsin (Invitrogen) /0.02% EDTA (Invitrogen), and 10-fold diluted cells were renewed. The culture medium was transferred and cultured overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. After confirming that the cells adhered to the petri dish, the cells were cultured at 37 ° C.
  • RNA interference effect is determined by the luminescence value of luciferase when the siRNA complex containing the corresponding siCON (Examples 1-1, 2-1, 3-3, and 8-3) is added (relative light unit, RLU). )
  • the inhibition rate (%) of luciferase expression of the siRNA complex of the present invention was determined using the following formula, and RNA interference The effect was evaluated. The results are shown in FIG. [Expression]
  • Expression inhibition rate (%) (luminescence value of siCON ⁇ luminescence value of siLUC) / luminescence value of siCON ⁇ 100
  • siRNA complexes of the present invention (Examples 1-2, 2-2, 3-4, and 8-4) exhibited inhibition rates of about 53%, 44%, 61%, and 55%, respectively, at a siRNA concentration of 100 nM. As shown (see FIG. 4). From this, it was clarified that the siRNA complex of the present invention can suppress the target gene function by introducing the included siRNA into the cell, expressing the RNA interference effect by the siRNA.
  • siRNA complexes of the present invention (Examples 1-2, 2-2, 3-4, and 8-4) exhibited 53%, 44%, 61%, and 55% inhibition rates at a siRNA concentration of 100 nM, respectively. (See FIG. 4). From this, it was clarified that the siRNA complex of the present invention can suppress the target gene function by introducing the included siRNA into the cell, expressing the RNA interference effect by the siRNA.
  • the siRNA complex using the composition for nucleic acid transport using the bifunctional polymer (a), the block polymer (b), and the fat-soluble additive (c) of the present invention includes the siRNA included from a nuclease such as RNase. It can be protected (see the result of Test Example 1) and can be applied to blood administration such as intravenous administration. Moreover, the siRNA complex of the present invention can efficiently introduce siRNA into cells and can maintain the presence of siRNA for a long time (see the results of Test Example 2). Furthermore, the siRNA complex of the present invention can exert an RNA interference effect by acting on a cell, and can functionally express the siRNA introduced into the cell (see the results of Test Example 3).
  • a nuclease such as RNase
  • the nucleic acid pharmaceutical complex using the nucleic acid transport composition using the bifunctional polymer (a), the block polymer (b) and the fat-soluble additive (c) of the present invention has been shown to have the function of being applied to blood administration, delivering the nucleic acid drug to a target tissue, introducing it into a target tissue cell, and causing the nucleic acid drug to function in the cell.

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Abstract

【課題】　核酸を血中投与により投与して該核酸機能発現させる核酸医薬において、該核酸医薬の安定性を確保すると共に、細胞内導入率が高く、効率的に該核酸医薬の機能発現をさせることができる核酸輸送用組成物が求められている。特にｓｉＲＮＡのような短鎖核酸医薬にも適用できる核酸輸送用組成物が求められている。 【解決手段】　カチオン性官能基と炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（ａ）、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）並びにビタミンＡ誘導体、ビタミンＤ誘導体、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＫ誘導体及びコレステロール誘導体からなる群から選択される１種以上の脂溶性添加剤（ｃ）、を含有することを特徴とする核酸輸送用組成物。

Description

核酸送達のための組成物
　本発明は、核酸医薬を標的患部の細胞内に送達するための核酸輸送用組成物、及び核酸医薬を用いた医薬組成物とその用途に関する。特にｓｉＲＮＡ等の短鎖核酸医薬を、疾病標的組織へ安定に送達するための核酸輸送用組成物及び医薬組成物に関する。
　遺伝子が原因となる疾患に対し、その原因遺伝子の機能発現を抑制する核酸医薬を用いる遺伝子治療が開発されている。この遺伝子治療は、疾病原因に直接的に作用する治療方法であり、酵素阻害剤などの従来の低分子医薬品では治療効果が得られにくい疾患に対しても、治療効果が期待できる新しい治療技術である。
　近年、遺伝子治療の一つの方法として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下ＲＮＡｉと略す）が発見された。ＲＮＡｉは、３０塩基以下の短鎖ＲＮＡが疾病原因遺伝子の機能抑制発現にかかわる主要分子である。この短鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）と名付けられている（特許文献１）。２００１年に哺乳類細胞におけるＲＮＡｉが報告されて以来（非特許文献１）、ＲＮＡｉをあらゆる疾患治療へ適用することを目指した研究開発が活発に行われている。しかしながら、核酸医薬は一般的に化学的安定性に乏しく、静脈内投与等の全身投与による治療効果を得ることはできない。特にＲＮＡは、血中に存在する様々な酵素により容易に分解される物性であり、ｓｉＲＮＡを核酸医薬として用いることの大きな障害となっている。このためｓｉＲＮＡを核酸医薬として用いる治療剤は、目や呼吸器など、ｓｉＲＮＡの局所投与により治療効果が得られる疾病に限られており、治療できる疾病の適応範囲が限定的である。このため、ｓｉＲＮＡ等の遺伝子治療に用いる核酸医薬を血中投与に適用して、体内の疾病患部に安定かつ効率的に送達する技術の開発が求められている。
　核酸医薬を血中投与して、体内の疾病患部にて治療効果を発揮させるためには、（１）血中における該核酸医薬の安定性の確保、（２）核酸医薬の標的組織への効率的な送達、（３）核酸医薬の標的組織細胞内への導入、の３つの課題を克服する必要がある。このため、核酸医薬を安定に保持し、標的細胞へ送達できる核酸送達システムが必要である。該核酸送達システムは、核酸医薬を保持して血中安定性を確保し、血中投与後は、血流を利用して標的患部組織へ到達するように血中滞留性を有するとともに、標的患部以外の組織細胞への非選択的な遺伝子導入を抑制する機能が要求される。一方で、標的患部組織へ到達した際には、該核酸医薬を標的細胞内に導入させて、更に該核酸医薬を細胞質内にて放出して、核酸医薬を作用させて疾病原因遺伝子の機能抑制をすることにより治療効果をもたらす能力が要求される。加えて、該核酸送達システムは、生体親和性を有し、投与において生体防御反応や細胞死を誘導しないことも必要である。
　以上のように、全身投与型核酸送達システムを完成させるには、（ｉ）投与から標的患部到達までの間、核酸を安定に保持して血中分解酵素との接触を回避して安定性を確保すると共に、標的患部組織以外の細胞への核酸導入を抑制すること、（ｉｉ）患部到達後は、核酸を保持したまま細胞内に侵入すること、（ｉｉｉ）細胞質内に到達後は、核酸（ｓｉＲＮＡ）を放出すること、（ｉｖ）生体親和的であること、が求められる。
　核酸医薬の生体内に対する血中投与を目標にした核酸輸送システムの開発は幾つか知られている。例えば特許文献２では、ＰＥＧとカチオン性ポリマーからなるブロック型コポリマーとカチオン性ポリマーからなる核酸輸送用組成物を用い、これと核酸医薬との複合体とすることで細胞取込能を向上させた核酸輸送システムを提案している。また、非特許文献２では、ＰＥＧと疎水性ポリマーからなるブロック型コポリマー、疎水性ポリマー、カチオン性ポリマーからなる核酸輸送用組成物を用い、これと核酸医薬との複合体とすることで血中安定性の高い核酸輸送システムを提案している。
　しかしながら、特許文献２記載の方法では、カチオンとアニオンとの静電相互作用のみでミセルを形成しているため、プラスミドＤＮＡと比較して電荷密度の低いｓｉＲＮＡ等では静電相互作用が弱く、血中安定性の確保が困難である。また、非特許文献２記載の方法では、粒子安定性が高く優れた血中滞留性を確保できるものの、ｓｉＲＮＡ等を放出するための技術的要素が考慮されていない。
国際公開ＷＯ０１／７５１６４号 国際公開ＷＯ２０１２／００５３７６号
Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．　４１１、ｐ．４９４－４９８、２００１ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｅｄ．Ｒｅｌｅａｓｅ．　２０１３、１６６、ｐ．１０６－１１４
　血中投与により機能発現させる核酸医薬において、該核酸医薬の安定性を確保すると共に、細胞内導入率が高く、効率的に該核酸医薬の機能発現をさせることができる核酸輸送用組成物が求められている。特にｓｉＲＮＡのような短鎖核酸医薬にも適用できる核酸輸送用組成物が求められている。
　本発明者等は前記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、核酸医薬と静電的相互作用により複合体を形成できるカチオン性官能基と疎水性炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（内核形成ポリマー）と、自己会合性を有して粒子化することにより血中滞留性を示すポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントからなるブロック型コポリマー（外殻形成ポリマー）、並びに二官能性ポリマー（内核形成ポリマー）とブロック型コポリマー（外殻形成ポリマー）の双方ポリマー間の弱い親和性によって性急な粒子崩壊が起こることを防ぐため、トコフェロールのような脂溶性添加剤を含有する核酸輸送用組成物が、包含する核酸分子の安定性を確保した上で標的組織へ送達し、その後、核酸分子を該組織の細胞内に導入して機能発現させることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は以下の［１］～［１５］に関する。
［１］　カチオン性官能基と炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（ａ）、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）並びにビタミンＡ誘導体、ビタミンＤ誘導体、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＫ誘導体及びコレステロール誘導体からなる群から選択される１種以上の脂溶性添加剤（ｃ）、を含有することを特徴とする核酸輸送用組成物。
［２］　前記二官能性ポリマー（ａ）の前記炭化水素基が、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基及び直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の炭化水素基である前記［１］に記載の核酸輸送用組成物。
［３］　前記二官能性ポリマー（ａ）の前記カチオン性官能基が、アミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基及びグアニジル基からなる群から選択される１種以上のカチオン性官能基である前記［１］または［２］に記載の核酸輸送用組成物。
［４］　前記二官能性ポリマー（ａ）が、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体であり、該ポリアスパラギン酸誘導体または該ポリグルタミン酸誘導体は、側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して、前記カチオン性官能基及び前記炭化水素基が導入されており、該二官能性ポリマー１分子当りの該カチオン性官能基導入率が１０～１００モル当量／ポリマー分子であり、該カチオン性官能基と該炭化水素基の含有モル当量比率（カチオン性官能基含有モル当量：炭化水素基含有モル当量）が１～５：１である前記［１］～［３］の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
［５］　前記ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）が、該疎水性ポリマーセグメントがポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体であり、該ポリアスパラギン酸誘導体または該ポリグルタミン酸誘導体は、側鎖カルボキシ基に疎水性基が直接または結合基を介して結合したセグメント構造であり、該疎水性基が、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ１～Ｃ３０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ２～Ｃ３０）のアルケニル基または直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ３０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上である前記［１］～［４］の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
［６］　前記ブロック型コポリマー（ｂ）が、ポリエチレングリコールセグメントが、エチレンオキシ単位；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）が５～１１，５００の繰り返し単位構造であり、疎水性ポリマーセグメントが、アスパラギン酸誘導体単位またはグルタミン酸誘導体単位が５～２００の繰り返し単位構造のポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体であり、該ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に、前記疎水性基が直接または結合基を介して結合したアスパラギン酸誘導体単位またはグルタミン酸誘導体単位が３～２００である前記［５］に記載の核酸輸送用組成物。
［７］　前記二官能性ポリマー（ａ）が、一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、Ｒ１は水素原子、（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）のアラルキル基を示し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ３は水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ４は直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基並びに直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、Ｒ５は水酸基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、該Ｒ７及びＲ８は、同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基、若しくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基を示し、Ｒ６は（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基を示し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は結合基又は結合を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇはそれぞれ独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０～２００の整数であり、（ａ＋ｂ）は５～２００の整数であり、（ｃ＋ｄ）は５～２００の整数であり、アルギニン誘導体が結合した構成単位、Ｒ４が結合した構成単位、Ｒ５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示されるポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体である前記［１］～［６］の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
［８］　前記一般式（１）で示される二官能性ポリマー（ａ）において、Ｒ４は（Ｃ８～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基、（Ｃ８～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基及び（Ｃ８～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の炭化水素基を示し、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１５～２００の整数であり、（ａ＋ｂ）は１０～１５０の整数であり、（ｃ＋ｄ）は５～１００の整数であり、（ａ＋ｂ）：（ｃ＋ｄ）が１～３：１である前記［７］に記載の核酸輸送用組成物。
［９］　前記ブロック型コポリマー（ｂ）が、一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 [式中、Ｒ１１は水素原子若しくは（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基を示し、Ｒ１２はメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ１３は水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ１４は（Ｃ１～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基、（Ｃ２～３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基、（Ｃ７～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ１５は水酸基及び／または－Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）を示し、ここでＲ１７及びＲ１８は、同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖、分岐鎖状または環状のアルキル基もしくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基を示し、Ｒ１６は（Ｃ１～Ｃ６）のアルキレン基を示し、Ｘ１１は結合基又は結合を示し、ｔは５～１１５００の整数を示し、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）は５～２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ）は３～２００の整数を示し、Ｒ１４が結合した構成単位、Ｒ１５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示されるブロック型コポリマーである前記［１］～［８］の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
［１０］　前記一般式（２）で示されるブロック型コポリマーにおいて、Ｒ１４が直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルケニル基及び直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ２０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上であり、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）は６～１５０の整数を示し、（ｍ＋ｎ）は３～１５０の整数である前記［９］に記載の核酸輸送用組成物。
［１１］　前記二官能性ポリマー（ａ）、前記ブロック型コポリマー（ｂ）及び前記脂溶性添加剤（ｃ）の含有比率（ｗ／ｗ）が（ａ）：（ｂ）：（ｃ）＝１：０．１～５：０．１～５である前記［１］～［１０］の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
［１２］　前記［１］～［１１］の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物に、核酸を含有させた医薬組成物。
［１３］　前記核酸がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである前記［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］　前記［１２］または［１３］に記載の医薬組成物を含有する遺伝子治療剤。
［１５］　一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｒ１は水素原子、（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）のアラルキル基を示し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ３は水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ４は直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基並びに直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、Ｒ５は水酸基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、該Ｒ７及びＲ８は、同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基、若しくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基を示し、Ｒ６は（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基を示し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は結合基又は結合を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇはそれぞれ独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０～２００の整数であり、（ａ＋ｂ）は５～２００の整数であり、（ｃ＋ｄ）は５～２００の整数であり、アルギニン誘導体が結合した構成単位、Ｒ４が結合した構成単位、Ｒ５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示されるポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体。
　本発明は、核酸医薬と静電的相互作用により複合体を形成するカチオン性官能基と、疎水性の炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（内核形成ポリマー）と核酸医薬とが形成する複合体と、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（外殻形成ポリマー）が相互作用して、ナノ粒子状会合体を形成することができる。これに、更に脂溶性添加剤を添加することにより、前記ナノ粒子状会合体の会合性を高め、核酸医薬を安定に保持できる核酸輸送用組成物を提供する。また、前記核酸輸送用組成物を用いて、核酸医薬を包含する核酸医薬組成物を提供する。
　当該核酸医薬組成物の、核酸医薬と前記二官能性ポリマー（内核形成ポリマー）の複合体と、前記ブロック型コポリマー（外殻形成ポリマー）は、比較的弱い疎水性相互作用による会合体が形成されるため、該複合体は比較的容易に放出され得る。一方、脂溶性添加剤が、該複合体と該ブロック型コポリマーの会合体形成力を高める。以上の構成を用いた本発明は、核酸医薬の安定な保持と放出性の確保を両立する核酸輸送用組成物を提供する。
　本発明の核酸輸送用組成物を用いた核酸医薬は、核酸分解酵素に対する抵抗性を示すことから核酸安定性に優れ、血中投与に適用することができる。また、投与された該核酸医薬は、標的部位において核酸医薬を放出し、標的組織細胞内へ取り込ませ、細胞質内で核酸医薬を放出して機能発現させることを可能とする。該核酸医薬は、細胞質内での核酸放出と、核酸機能発現の目安となる標的タンパク発現の抑制作用（サイレンシング効果）が認められており、本発明は、血中投与にて機能発現させる核酸医薬組成物を提供する。
本発明の核酸輸送用組成物を用いたｓｉＲＮＡ複合体及び比較例ｓｉＲＮＡ複合体の、ＲＮａｓｅに対する安定性を、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した結果を示す図である。 本発明の核酸輸送用組成物を用いたＦＡＭ標識したｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）複合体の細胞取込み試験において、感作細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した図面代用写真である。 本発明の核酸輸送用組成物を用いたＦＡＭ標識したｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）複合体の細胞取込み試験において、感作細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した図面代用写真である。 本発明の核酸輸送用組成物を用いたｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃまたはｓｉＬｕｃ）複合体による、ルシフェラーゼ安定発現細胞株に対するルシフェラーゼ阻害評価結果である。
　本発明は、カチオン性官能基と炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（ａ）、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）、並びにビタミンＡ誘導体、ビタミンＤ誘導体、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＫ誘導体並びにコレステロール誘導体から選択される１種以上の脂溶性添加剤（ｃ）、を含有することを特徴とする核酸輸送用組成物に関する。以下に、その詳細について説明する。
［カチオン性官能基と炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（ａ）について］
　本発明において、カチオン性官能基と炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（ａ）とは、単鎖のポリマー主鎖に、複数のカチオン性官能基と複数の炭化水素基が、それぞれ分岐型に官能基修飾されたポリマー構造体である。
　当該二官能性ポリマーのポリマー主鎖は、カチオン性官能基と炭化水素基の２つの官能基修飾可能なカルボキシ基、アミノ基、水酸基等の反応性置換基を複数有する単鎖ポリマーが好ましい。該単鎖ポリマー主鎖構造としては、ポリアミノ酸、ポリビニル誘導体、ポリエステル類、ポリエーテル類、ポリアミド類、ポリウレタン類を挙げることができ、これらの単鎖ポリマーにカルボキシ基、アミノ基、水酸基等の反応性置換基を複数有する単鎖ポリマーが好ましい。中でも好ましくは、複数のカルボキシ基で修飾された単鎖ポリマーであり、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリ（スチレン－マレイン酸）等のポリカルボン酸高分子誘導体を挙げることができる。すなわち、これらのポリカルボキシ基修飾ポリマーを主鎖として用い、側鎖のカルボキシ基に、複数のカチオン性官能基と複数の炭化水素基をエステル結合またはアミド結合により、それぞれの官能基を導入した二官能性ポリマーを用いることが好ましい。
　該二官能性ポリマーの分子量は特に限定されるものではないが、本発明は血中投与を指向していることから、本発明組成物として水溶液で用いられる分子量を用いることが好ましい。該二官能性ポリマーは、平均分子量として１，０００～１００，０００のポリマーを用いることが好ましい。なお、該平均分子量はＧＰＣ法等の常法のポリマー分子量測定方法により測定される分子量にて規定される値を用いてもよい。しかしながら、該二官能性ポリマーは、カチオン性官能基と炭化水素基を導入する必要があることから、単位重量当たりの側鎖官能基含量にて平均分子量を算出する方法が好ましい。側鎖官能基がカルボキシ基である場合は、ＮＭＲ法または滴定法によりカルボキシ基含量を求めることが好ましい。より好ましくは滴定法によるカルボキシ基含量を用い、該二官能性ポリマーの分子量を規定することが望まれる。
　二官能性ポリマー（ａ）のポリマー主鎖は、好ましくはポリアミノ酸である。カチオン性官能基及び炭化水素基を導入するための反応性置換基として、カルボキシ基を有するポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸またはポリ（アスパラギン酸－グルタミン酸）共重合体を用いることが好ましい。これらの側鎖カルボキシ基を有するポリアミノ酸は、α－アミド結合型重合体であっても、側鎖カルボキシ基とのβまたはγ－アミド結合型重合体であっても、その混合物であってもよい。該ポリアミノ酸の平均分子量としては、１，０００～１００，０００であることが好ましく、重合数としては８～８００の範囲のものを用いることが好ましい。より好ましくは、重合数として１０～２００のポリアミノ酸である。
　前記二官能性ポリマー（ａ）において、導入される炭化水素基とは、該二官能性ポリマーと核酸により形成される複合体が、疎水性となるための機能を付与する官能基である。該炭化水素基とは、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ３～Ｃ６０）のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ３～Ｃ６０）のアルケニル基、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ６０）のアラルキル基を挙げることができる。
　好ましくは、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基である。特に好ましくは、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルキル基、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアラルキル基である。
　前記置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルキル基としては、例えば、オクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基が挙げられる。
　前記置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルケニル基としては、例えば、９－ヘキサデセニル基、ｃｉｓ－９－オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニル基等が挙げられる。
　前記置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアラルキル基としては、例えば、２‐フェニルエチル基、４－フェニルブチル基、８－フェニルオクチル基等が挙げられる。
　なお、前記置換基を有していてもよい炭化水素基における該置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環若しくは複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。芳香環上に置換基を有する場合の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。
　前記炭素環若しくは複素環アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。複素環アリール基としては、例えば、ピリジル基、ピリミジニル基、キノリル基、キナゾリニル基、ナフチリジニル基、フリル基、ピロリル基、インドリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、トリアゾリル基等が挙げられる。
　前記アルキルチオ基としては（Ｃ１～Ｃ８）のアルキルチオ基を示し、例えば、メチルチオ基、イソプロピルチオ基、ベンジルチオ基等が挙げられる。
　前記アリールチオ基としては、例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基、ピリジルチオ基等が挙げられる。
　前記アルキルスルフィニル基としては（Ｃ１～Ｃ８）のアルキルスルフィニル基を示し、例えば、メチルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基、ベンジルスルフィニル基等が挙げられる。
　前記アリールスルフィニル基としては、例えば、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、ピリジルスルフィニル基等が挙げられる。
　前記アルキルスルホニル基としては（Ｃ１～Ｃ８）のアルキルスルホニル基を示し、例えば、メチルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、ベンジルスルホニル基等が挙げられる。
　前記アリールスルホニル基としては、例えば、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、ピリジルスルホニル基等が挙げられる。
　前記スルファモイル基としては、例えば、ジメチルスルファモイル基、フェニルスルファモイル基等が挙げられる。
　前記アルコキシ基としては（Ｃ１～Ｃ８）のアルコキシ基を示し、例えばメトキシ基、イソプロポキシ基、ベンジルオキシ基等の１級アルコキシ基、イソプロポキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基等の２級アルコキシ基、若しくはｔｅｒｔ－ブトキシ基等の３級アルコキシ基が挙げられる。
　前記アリールオキシ基としては、例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基、ピリジルオキシ基等が挙げられる。
　前記アシルオキシ基としては（Ｃ１～Ｃ８）のアシルオキシ基を示し、例えば、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基等が挙げられる。
　前記アルコキシカルボニルオキシ基としては（Ｃ１～Ｃ８）のアルコキシカルボニルオキシ基を示し、例えば、メトキシカルボニルオキシ基、トリフルオロメトキシカルボニル基等が挙げられる。
　前記カルバモイルオキシ基としては、例えば、ジメチルカルバモイルオキシ基、フェニルカルバモイルオキシ基等が挙げられる。
　前記置換または無置換アミノ基としては、例えば無置換アミノ基、非環状の１級アミノ基または非環状の２級アミノ基、若しくは環状の２級アミノ基を示す。該非環状の脂肪族１級アミノ基としては、（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状、分岐鎖状、または環状アルキル基がＮ－モノ置換したアミノ基である。例えば、メチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、ｎ－ヘキシルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ｎ－オクチルアミノ基等が挙げられる。該非環状の脂肪族２級アミノ基としては、同一であっても異なっていてもよく、（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状、分岐鎖状、または環状アルキル基がＮ，Ｎ－ジ置換したアミノ基である。例えばジメチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－シクロヘキシルアミノ基等が挙げられる。該環状の脂肪族２級アミノ基としては、モルホリノ基、ピペラジン－１－イル基、４－メチルピペラジン－１－イル基、ピペリジン－１－イル基、ピロリジン－１－イル基等が挙げられる。
　前記アシルアミノ基としては、例えば、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基等が挙げられる。
　前記アルコキシカルボニルアミノ基としては、例えば、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基、ベンジルオキシカルボニルアミノ基等が挙げられる。
　前記ウレイド基としては、例えば、トリメチルウレイド基、１－メチル－３－フェニル－ウレイド基等が挙げられる。
　前記スルホニルアミノ基としては、例えば、メタンスルホニルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基等が挙げられる。
　前記スルファモイルアミノ基としては、例えば、ジメチルスルファモイルアミノ基等が挙げられる。
　前記アシル基としては、例えば、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ピリジンカルボニル基等が挙げられる。
　前記アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
　前記カルバモイル基としては、例えば、ジメチルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基等が挙げられる。
　前記シリル基としてはトリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。
　前記二官能性ポリマー（ａ）に導入される炭化水素基は、二官能性ポリマー（ａ）と核酸により形成される複合体が、疎水性を示す物性を付与できる炭化水素基であれば良く、置換基を有していてもよい炭化水素基としては、特に限定されるものではなく適用することができる。特に好ましくは無置換体、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基である。無置換体の炭化水素基を用いることが、特に好ましい。
　前記二官能性ポリマー（ａ）において、導入されるカチオン性官能基とは、核酸のリン酸基と静電的相互作用して、該二官能性ポリマーと該核酸との複合体を形成させる機能を担うものである。該カチオン性官能基とは、核酸のリン酸基と静電的相互作用を惹起できるものであれば特に限定されるものではない。好ましくはアミン性窒素官能基であり、例えば、アミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、グアニジル基を挙げることができる。
　前記ジアルキルアミノ基としては、好ましくは（Ｃ１～Ｃ８）のジアルキルアミノ基を示し、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基、ジペンチルアミノ基、ジシクロヘキシルアミノ基、ジベンジルアミノ基等が挙げられる。また、２つのアルキル基が環状である環状２級アミノ基も含まれ、例えば、モルホリノ基、ピペラジン－１－イル基、４－メチルピペラジン－１－イル基、ピペリジン－１－イル基、ピロリジン－１－イル基等が挙げられる。
　前記トリアルキルアンモニウム基としては、好ましくは（Ｃ１～Ｃ８）のトリアルキルアンモニウム基を示し、例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、トリイソプロピルアンモニウム基、トリブチルアンモニウム基、トリペンチルアンモニウム基、トリヘキシルアンモニウム基等が挙げられる。
　カチオン性官能基は、前記アミノ基、前記ジアルキルアミノ基、前記トリアルキルアンモニウム基、前記グアニジル基等のアミン性窒素官能基を含む置換基として前記二官能性ポリマー（ａ）に導入される。
　前記アミン性窒素官能基を含む置換基としては、前記アミン性窒素官能基が置換した他の置換基を有していてもよい（Ｃ１～１０）のアルキル基であってもよい。好ましくは置換基を有していてもよい－（ＣＨ２）ｈ－Ｘ基（該Ｘ基が前記アミン性窒素官能基であり、ｈは１～１０の整数を示す）または置換基を有していてもよい－（ＣＨ２）ｉ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｊ－Ｘ基（該Ｘ基が前記アミン性窒素官能基であり、ｉ及びｊは１～５の整数を示す）である。
　前記アミン性窒素官能基が置換した、他の置換基を有していてもよい（Ｃ１～１０）のアルキル基は、適当な結合基を介して前記二官能性ポリマー主鎖に導入される。該結合基としては、二官能性ポリマーの置換基結合性側鎖官能基の種類に応じて適宜設定されるものである。例えば、二官能性ポリマーの置換基結合性側鎖官能基がカルボキシ基である場合、該結合基としては、－ＮＨ－、酸素原子（－Ｏ－）、硫黄原子（－Ｓ－）が挙げられる。好ましくは、－ＮＨ－または酸素原子（－Ｏ－）である。
　すなわち、置換基を有していてもよい－ＮＨ－（ＣＨ２）ｈ－Ｘ基（該Ｘ基及びｈは前述と同義である）若しくは置換基を有していてもよい－ＮＨ－（ＣＨ２）ｉ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｊ－Ｘ基（該Ｘ基及びｉ、ｊは前述と同義である）、または置換基を有していてもよい－Ｏ－（ＣＨ２）ｈ－Ｘ基（該Ｘ基及びｈは前述と同義である）若しくは置換基を有していてもよい－Ｏ－（ＣＨ２）ｉ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｊ－Ｘ基（該Ｘ基及びｉ、ｊは前述と同義である）が好ましい。
　前記置換基において、有していてもよい置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、炭素環若しくは複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、Ｎ－アルキルアミド基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。
　該置換基として、中でもアルコキシカルボニル基（－ＣＯ－ＯＲａ；該Ｒａ基が（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基、（Ｃ７～Ｃ１２）のアラルキル基を示す）またはＮ－アルキルアミド基（－ＣＯ－ＮＨ－Ｒｂ；該Ｒｂ基が（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基、（Ｃ７～Ｃ１２）アラルキル基を示す）が好ましい。特に好ましくは、アルコキシカルボニル基（－ＣＯ－ＯＲａ；該Ｒａ基が（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１２）のアラルキル基を示す）またはＮ－アルキルアミド基（－ＣＯ－ＮＨ－Ｒｂ；該Ｒｂ基が（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１２）のアラルキル基を示す）が置換された－ＮＨ－（ＣＨ２）ｈ－Ｘ基（該Ｘ基が前記アミン性窒素官能基であり、ｈは１～１０の整数を示す）または置換基を有していてもよい－ＮＨ－（ＣＨ２）ｉ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｊ－Ｘ基（該Ｘ基が前記アミン性窒素官能基であり、ｉ及びｊは１～５の整数を示す）である。
　特に、アルコキシカルボニル基（－ＣＯ－ＯＲａ；該Ｒａ基が（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１２）アラルキル基を示す）またはＮ－アルキルアミド基（－ＣＯ－ＮＨ－Ｒｂ；該Ｒｂ基が（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１２）アラルキル基を示す）が置換された－ＮＨ－（ＣＨ２）ｈ－Ｘ基（該Ｘ基が前記アミン性窒素官能基であり、ｈは１～１０の整数を示す）が殊更好ましい。
　前記－ＮＨ－（ＣＨ２）ｈ－Ｘ基の－ＮＨ－に隣接するメチレン基に、該アルコキシカルボニル基またはＮ－アルキルアミド基を有する場合、アミノ酸誘導体が特に好ましく、アミノ酸エステル誘導体またはアミノ酸アミド誘導体を用いることができる。すなわち、アミン性窒素官能基を有するリジン誘導体、オルニチン誘導体、アルギニン誘導体が好ましい。より好ましくはアルギニン誘導体である。
　前記アルギニン誘導体としては、例えば、アルギニンアルキルエステルまたはアルギニンアルキルアミドを挙げることができる。アルギニンアルキルエステルとしては、例えば、アルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、アルギニンイソプロピルエステル、アルギニン－ｔｅｒｔ－ブチルエステル、アルギニンベンジルエステル等が挙げられる。アルギニンアルキルアミドとしてはアルギニンメチルアミド、アルギニンエチルアミド、アルギニンイソプロピルアミド、アルギニン－ｔｅｒｔ－ブチルアミド、アルギニンベンジルアミド、アルギニンジメチルアミド等が挙げられる。
　本発明の二官能性ポリマー（ａ）は、ポリマー主鎖に前記炭化水素基と前記カチオン性官能基を併せ持つものであり、ポリマー主鎖に該炭化水素基と該カチオン性官能基を、それぞれ複数モル当量をグラフト型に置換させた二官能性ポリマーである。すなわち、２種類の機能性置換基を複数モル当量で具備させたポリマーとすることで、核酸と静電的相互作用による複合体形成するためのポリカチオン性と、形成された該複合体に疎水性を付与させることを指向したものである。
　本発明の二官能性ポリマー（ａ）は、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸を該ポリマーの主鎖として、側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介してカチオン性官能基及び炭化水素基を導入した二官能性ポリマーであることが好ましい。
　主鎖として用いるポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸としては、α－アミド結合酸型重合体であっても、側鎖カルボキシ基とのβ－アミド結合型またはγ－アミド結合型であっても、その混合物であってもよい。該ポリアミノ酸の平均分子量としては、１，０００～１００，０００であることが好ましく、重合数としては８～８００の範囲のものを用いることが好ましい。より好ましくは、平均分子量が２，０００～５０，０００であり、重合数としては２０～４００の範囲のポリアミノ酸である。
　二官能性ポリマーの好ましい態様としては、このポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸の複数の側鎖カルボキシ基に対し、該カチオン性官能基及び該炭化水素基を、それぞれ適当な当量にて直接または結合基を介して結合させた構造である。ここで、該カチオン性官能基及び該炭化水素基の詳細は前述と同義である。
　ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸の側鎖カルボキシ基と、該カチオン性官能基及び該炭化水素基を結合させる態様としては、側鎖カルボキシ基に直接的に結合させてもよく、適当な結合基を介して結合させてもよい。
　該結合基としては特に限定されるものではないが、例えば、片末端がカルボニル基との結合性官能基であり、もう一方の片末端が前記カチオン性官能基及び前記炭化水素基との結合性官能基を有する連結基が挙げられる。
　該結合基としては、例えば、酸素原子（－Ｏ－）、－ＮＨ－、硫黄原子（－Ｓ－）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ－（ｘは１～１０の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ－Ｏ－（ｘは１～１０の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ－ＮＨ－（ｘは１～１０の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ－Ｓ－（ｘは１～１０の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｙ－（ｙは１～１０の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｙ－Ｏ－（ｙは１～１０の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ－（ｙは１～１０の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｙ－Ｓ－（ｙは１～１０の整数を示す）等を挙げることができる。
　また、該結合基としてアミノ酸を用いてもよい。結合基として用いられるアミノ酸は、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでよく、Ｌ体であってもＤ体であってもよい。アミノ酸を結合基として用いる場合は、二官能性ポリマーのポリスパラギン酸またはポリグルタミン酸のカルボニル基と、該アミノ酸のＮ末アミノ基が結合し、他方Ｃ末カルボキシ基とエステル結合またはアミド結合を介して、前記カチオン性官能基及び前記炭化水素基を結合させる態様を挙げることができる。結合基として用いるアミノ酸としては、グリシン、アラニン、β－アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン等を挙げることができる。
　該二官能性ポリマー（ａ）のポリマー主鎖１分子当りに、前記カチオン性官能基が１０～１００モル当量を導入させることが望ましい。好ましくは、ポリマー主鎖１分子当りのカチオン性官能基が、１５～８０モル当量を有するポリマーである。カチオン性基が１０モル当量／ポリマー分子未満の場合、核酸との静電的相互作用の総和が小さく、該二官能性ポリマー（ａ）と核酸との複合体形成が弱くなり好ましくない。一方、カチオン性官能基が１００モル当量／ポリマー分子を超える場合、前記炭化水素基の置換基導入量のバランスをとるために、用いる主鎖ポリマーの分子量を大きくして、ポリマー主鎖における該カチオン性基及び該炭化水素基との結合性官能基数を多くする必要がある。したがって、主鎖ポリマーの分子量が大きくなりすぎて適当な濃度の水性溶液が得られないため好ましくない。
　一方、該二官能性ポリマー（ａ）において、前記炭化水素基は前記核酸との複合体に疎水性を具備させるために必要であり、該二官能性ポリマー（ａ）のポリマー１分子当りに該カチオン性官能基が１０モル当量以上を有することが望ましい。前記炭化水素基と前記カチオン性官能基との導入比率は、好ましくは、カチオン性官能基モル当量と前記置換基を有していてもよい炭化水素基のモル当量の比率（カチオン性官能基モル当量：前記置換基を有していてもよい炭化水素基モル当量）が１～５：１である。より好ましくは該比率が１～３：１である。
　前記カチオン性官能基と前記炭化水素基は、二官能性ポリマーの主鎖において側鎖修飾官能基として、それぞれ複数当量で結合させたものである。該カチオン性置換基と該炭化水素基がポリマー主鎖に結合する配列は特に限定はなく、任意に設定することができる。例えば、ポリマー主鎖に複数存在する結合性側鎖官能基に対し、該カチオン性官能基と該炭化水素基が交互に結合した配列の二官能性ポリマーであってもよく、該カチオン性官能基と該炭化水素基がそれぞれ偏局在した結合配列の二官能性ポリマーでもよく、また該カチオン性官能基と該炭化水素基がランダムな配列で結合した態様であってもよい。該二官能性ポリマー（ａ）としては、該カチオン性官能基と該炭化水素基が、ポリマー主鎖の側鎖結合性官能基に対し、特に制御されておらずランダムな配列でそれぞれ結合した態様が好ましい。
　本発明の二官能性ポリマー（ａ）の好ましい態様として、下記一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、Ｒ１は水素原子、（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）のアラルキル基を示し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ３は水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基から選択される１種を示し、Ｒ４は直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基並びに直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、Ｒ５は水酸基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、該Ｒ７及びＲ８は、同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基、若しくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基を示し、Ｒ６は直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ１０）のアラルキル基を示し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は結合基又は結合を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇはそれぞれ独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０～２００の整数であり、（ａ＋ｂ）は５～２００の整数であり、（ｃ＋ｄ）は５～２００の整数であり、アルギニン誘導体が結合した構成単位、Ｒ４が結合した構成単位、Ｒ５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示されるポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体を挙げることができる。
　前記Ｒ１及びＲ６における（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基としては、直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基を示す。前記直鎖状アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－へキシル基、ｎ－デシル基等を挙げることができる。前記分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、１－メチル－プロピル基、２－メチル－プロピル基、２，２－ジメチルプロピル基等が挙げられる。前記環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等が挙げられる。
　また前記Ｒ１及びＲ６における（Ｃ７～Ｃ１０）のアラルキル基としては、ベンジル基、１－フェニルエチル基、２－フェニルエチル基、４－フェニルブチル基等を挙げることができる。
　一般式（１）において、Ｒ６は、一分子中において同一官能基であっても、異なった置換基の組み合せであってもよい。好ましくは、Ｒ６は同一の官能基を用いることである。
前記Ｒ３における（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、シクロプロピルカルボニル基、シクロペンタンカルボニル基等が挙げられる。
　前記Ｒ３における（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
　前記Ｒ４は、二官能性ポリマー（ａ）における炭化水素基に相当する。該Ｒ４における直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基とは、例えばオクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基等が挙げられる。
　該Ｒ４における直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基とは、例えば９－ヘキサデセニル基、ｃｉｓ－９－オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニル基等が挙げられる。
　該Ｒ４における直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基としては、例えば２－フェニルエチル基、４－フェニルブチル基、８－フェニルオクチル基等が挙げられる。
　これら該Ｒ４の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基及び（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基は、それぞれ適当な置換基を有していてもよい。
　該置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環若しくは複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。該置換基の定義は前述と同義である。
　一般式（１）において、一分子中におけるＲ４は、同一官能基であっても、異なった置換基の組み合せであってもよい。好ましくは、Ｒ４は同一の官能基を用いることである。
　前記Ｒ５におけるカルボキシ基が保護されたアミノ酸とは、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでもよく、該アミノ酸のカルボキシ基がエステル誘導体またはアミド誘導体として変換された官能基を示す。
　エステル誘導体としては、直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキルエステルが好ましい。前記直鎖状アルキルエステルとしては、例えばメチルエステル、エチルエステル、ｎ－プロピルエステル、ｎ－ブチルエステル、ｎ－へキシルエステル、ｎ－デシルエステル等を挙げることができる。前記分岐鎖状アルキルエステルとしては、例えばイソプロピルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル、１－メチル－プロピルエステル、２－メチル－プロピルエステル、２，２－ジメチルプロピルエステル等が挙げられる。前記環状アルキルエステルとしては、例えばシクロプロピルエステル、シクロブチルエステル、シクロペンチルエステル、シクロヘキシルエステル、アダマンチルエステル等が挙げられる。
　前記アミド誘導体としては、直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキルアミドが好ましい。直鎖状アルキルアミドとしては、例えばメチルアミド、エチルアミド、ｎ－プロピルアミド、ｎ－ブチルアミド、ｎ－へキシルアミド、ｎ－デシルアミド等を挙げることができる。前記分岐鎖状アルキルアミドとしては、例えばイソプロピルアミド、ｔｅｒｔ－ブチルアミド、１－メチル－プロピルアミド、２－メチル－プロピルアミド、２，２－ジメチルプロピルアミド等が挙げられる。前記環状アルキルアミドとしては、例えばシクロプロピルアミド、シクロブチルアミド、シクロペンチルアミド、シクロヘキシルアミド、アダマンチルアミド等が挙げられる。
　前記Ｒ５において、－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）の該Ｒ７及び該Ｒ８における（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖、分岐または環状アルキル基としては、１－プロピル基、２－プロピル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基等が挙げられる。
　該Ｒ７及びＲ８における３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基としては、３－ジメチルアミノプロピル基、５－ジメチルアミノペンチル基等が挙げられる。
　一般式（１）において、前記Ｒ５は、水酸基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸または－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）であるが、一分子中においてこれらを１種以上含む置換基である。好ましくは、水酸基と－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）が共存した置換基である。
　一般式（１）におけるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、ポリマー主鎖のカルボニル基と、アルギニン誘導体、Ｒ４またはＲ６を連結するための結合基である。該Ｘ１、Ｘ２及びＸ３における結合基としては、片末端がカルボニル基と結合性を示す官能基を有する連結基である。例えば、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｋ－（ｋは０～６の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｋ－（ｋは０～６の整数を示す）、－Ｓ－（ＣＨ２）ｋ－（ｋは０～６の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｋ－ＮＨ－（ｋは０～６の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｋ－ＮＨ－（ｋは０～６の整数を示す）、－Ｓ－（ＣＨ２）ｋ－ＮＨ－（ｋは０～６の整数を示す）等を挙げることができる。
　また、該結合基としてアミノ酸を用いてもよい。結合基として用いられるアミノ酸は、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでもよく、Ｌ体であってもＤ体であってもよい。アミノ酸を結合基として用いる場合は、主鎖ポリマーの側鎖カルボニル基と、該アミノ酸のＮ末アミノ基が結合し、他方Ｃ末カルボキシ基とエステル結合またはアミド結合を介して、アルギニン誘導体、Ｒ４またはＲ６を結合させる態様を挙げることができる。結合基として用いるアミノ酸としては、グリシン、アラニン、β－アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン等を挙げることができる。
　また、カルボニル基と、アルギニン誘導体、Ｒ４またはＲ６が直接結合できる場合であって、相当する結合性官能基がない場合は、該Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は結合を表す。
　一般式（１）において、該Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は一分子中で同一結合基であってもよく、異なる結合基の混合体であってもよい。
　一般式（１）においてＲ２がメチレン基の場合、二官能性ポリマー（ａ）の主鎖はポリアスパラギン酸である。ポリアスパラギン酸誘導体の主鎖の構成単位は、α－アミド型重合体、β－アミド型重合体及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位を有する。一方、一般式（１）においてＲ２がエチレン基の場合、二官能性ポリマー（ａ）の主鎖がポリグルタミン酸である。ポリグルタミン酸誘導体も同様に、主鎖の構成単位は、α－アミド型重合体、γ－アミド型重合体及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位を有していて良い。
　一般式（１）におけるａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、ポリマー主鎖にアルギニン誘導体が結合した構成単位、Ｒ４が結合した構成単位、Ｒ５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位について、それぞれの含有量を示す。該ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、それぞれ独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数で、ポリマー主鎖の重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０～２００の整数であってよい。
　そのうち、アルギニン誘導体が結合した構成単位は必須構成であり、その総含量数（ａ＋ｂ）は５～２００の整数である。疎水性の炭化水素基であるＲ４が結合した構成単位も必須構成であり、その総含量数（ｃ＋ｄ）は５～２００の整数である。なお、Ｒ５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位は、任意の構成である。
　なお、一般式（１）で表されるポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体において、アルギニン誘導体が結合した構成単位、Ｒ４が結合した構成単位、Ｒ５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列であって良い。すなわち、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に、アルギニン誘導体が結合した構成単位、Ｒ４が結合した構成単位及びＲ５が結合した構成単位、並びに側鎖カルボキシ基が分子内環化型をとる構成単位が、それぞれ任意の順番で配列した態様であってもよく、それぞれの構成単位が局在化して偏局した配列の態様であって良く、それぞれの構成単位に規則性がないランダム配列で構成されたポリマー構造である。
　なお、一般式（１）で示される二官能性ポリマーは、核酸と複合体を形成するためのグアニジル基と、該複合体を疎水的物性とするための炭化水素基を有する新規なポリマーである。該二官能性ポリマーは、核酸を医薬品として用いるための核酸輸送用ポリマーとして有用である。したがって、一般式（１）で表される二官能性ポリマーも、本発明に含まれる。
　前記一般式（１）で示される二官能性ポリマー（ａ）において、Ｒ４は（Ｃ８～Ｃ３０）のアルキル基、（Ｃ８～Ｃ３０）のアルケニル基及び（Ｃ８～Ｃ３０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の炭化水素基であることが好ましい。
　また、ポリマー主鎖の重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１５～２００の整数であることが好ましい。
　更に、アルギニン誘導体が結合した構成単位の総含量数（ａ＋ｂ）は１０～１５０の整数であり、疎水性の炭化水素基であるＲ４が結合した構成単位の総含量数（ｃ＋ｄ）は５～１００の整数であり、（ａ＋ｂ）：（ｃ＋ｄ）が１～３：１であることが好ましい。
　次に本発明の二官能性ポリマー（ａ）の製造方法を開示する。
　本二官能性ポリマー（ａ）は、官能基修飾が可能なカルボキシ基、アミノ基、水酸基等の反応性官能基を複数有する単鎖ポリマーに対し、適当な結合性官能基を有するカチオン性官能基含有化合物と、適当な結合性官能基を有する炭化水素基含有化合物を反応させることで調製することができる。主鎖に用いる単鎖ポリマーは、市販品をそのまま用いてもよく、重合反応により合成したものを用いてもよい。２つの官能基の反応様式は、該単鎖ポリマーの反応性官能基と、該カチオン性官能基含有化合物及び該炭化水素基含有化合物の各結合性官能基の組み合せにより、適宜設定することができる。
　好ましくは、該単鎖ポリマーは反応性官能基がカルボキシ基である高分子化ポリカルボン酸化合物を用い、該カチオン性官能基含有化合物及び該炭化水素基含有化合物の各結合性官能基はアミノ基及び／または水酸基であり、アミド結合様式及び／またはエステル結合様式で結合させた二官能性ポリマーが用いられる。その場合、高分子化ポリカルボン酸化合物と、該カチオン性官能基含有化合物及び該炭化水素基含有化合物を、適当な縮合条件で反応させることで、当該二官能性ポリマーを合成することができる。縮合条件は、通常の有機合成反応で用いることができる方法を適宜使用することができる。
　前記二官能ポリマー（ａ）の主鎖ポリマーとして、好ましく用いられるポリアスパラギン酸の合成方法の一態様を開示する。
　適当な１級アミン化合物または１級アルコール化合物に、Ｎ－カルボニルアスパラギン酸無水物を順次反応させ、片末端に１級アミン結合残基または１級アルコール結合残基を有するポリアスパラギン酸誘導体を合成する。この場合、Ｎ－カルボニルアスパラギン酸無水物において、アスパラギン酸側鎖のカルボキシ基は、ベンジルエステル等の適当なカルボン酸保護基修飾体を用いることが好ましい。得られたポリアスパラギン酸誘導体は、更に任意に、もう一方の末端基（Ｎ末端）をアシル化することもできる。このポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基の保護基を、適当な条件により脱保護基反応を行うことにより、二官能性ポリマー（ａ）の主鎖ポリマーとなるポリアスパラギン酸を得ることができる。
　このポリアスパラギン酸に対し、アミノ基及び／または水酸基を有する該カチオン性官能基含有化合物並びに該炭化水素基含有化合物を、カルボジイミド脱水縮合剤等の縮合反応条件にて反応させればよい。この製造方法によれば、ポリアスパラギン酸に、一般式（１）に係るＲ５に相当する－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）基を同時に導入することができることから、有利な製造方法である。
　該カルボジイミド脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等を用いることができる。該脱水縮合反応の際に、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の反応補助剤を用いてもよい。
　本発明において、カチオン性官能基と炭化水素基の導入量は、脱水縮合反応において、各官能基含有化合物の仕込み量を適宜増減させることで調整することができる。なお、カルボジイミド縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いた場合、－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）のＲ７及びＲ８はシクロへキシル基となる。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）を用いて縮合反応を行った場合、Ｒ７及びＲ８はイソプロピル基となる。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）を用いた場合、－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）のＲ７及びＲ８はエチル基と３－ジメチルアミノプロピルの混合置換体となる。
　前記反応終了後に任意の精製工程を経由して本発明の二官能性ポリマー（ａ）を製造することができる。
　前記二官能性ポリマー（ａ）の主鎖ポリマーとして、好ましく用いられるポリグルタミン酸の合成方法は、前述の合成例におけるＮ－カルボニルアスパラギン酸無水物に代えて、Ｎ－カルボニルグルタミン酸無水物を用いてポリグルタミン酸を得て、その後、該カチオン性官能基含有化合物並びに該炭化水素基含有化合物を導入させれば、主鎖ポリマーがポリグルタミン酸の二官能性ポリマー（ａ）を合成することができる。
［ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）について］
　本発明において、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）が用いられる。該ブロック型コポリマー（ｂ）は、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが適当な連結基にて結合したＡＢブロック型コポリマーである。
　該ポリエチレングリコールセグメントとは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位構造の重合度が５～２０，０００のポリエチレングリコール鎖を含むポリマー部を示す。好ましくは、該重合度が５～１１，５００である。特に好ましくは、該重合度が４０～２，５００のポリエチレングリコール鎖を含むポリマー部である。該ポリエチレングリコールフラグメントのポリエチレングリコール相当の平均分子量は、５００～９００，０００、好ましくは５００～５００,０００であり、特に好ましくは２，０００～１００，０００である。なお、該ポリエチレングリコールセグメントの分子量とは、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法（Ｇｅｌ　Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により測定されるピークトップ分子量である。
　該疎水性ポリマーセグメントとしては、前記ポリエチレングリコールセグメントと比較して、相対的に疎水性を示すものであれば特に限定されずに用いることができる。例えば、疎水性側鎖を有するポリアミノ酸及びポリアミノ酸誘導体、ポリアクリル酸エステルまたはポリアクリル酸アミド誘導体、ポリメタクリル酸エステル誘導体またはポリメタクリル酸アミド誘導体、ポリマレイン酸エステル誘導体またはポリマレイン酸アミド誘導体、ポリスチレン、スチレン－マレイン酸共重合体、スチレン－マレイン酸エステル共重合体等のポリカルボン酸含有ポリマーまたはその誘導体、ポリ乳酸、乳酸－グリコール酸共重合体等が挙げられる。
　該疎水性ポリマーセグメントとしては、疎水性の程度を容易に調整することが可能である理由から、ポリアスパラギン酸やポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸含有ポリマーを用い、このカルボキシ基に複数の疎水性置換基を導入したポリカルボン酸エステルまたはポリカルボン酸アミドを用いることが好ましい。より好ましくは、ポリアスパラギン酸の側鎖に、疎水性官能基を結合させたポリアスパラギン酸エステル若しくはポリアスパラギン酸アミド、またはポリグルタミン酸の側鎖に、疎水性官能基を結合させたポリグルタミン酸エステル若しくはポリグルタミン酸アミドである。
　該疎水性ポリマーセグメントの分子量は、前記ポリエチレングリコールセグメントに対し疎水性を示し、該ブロック型コポリマー（ｂ）が親水性－疎水性の両親媒性を示すことができる程度の繰り返し重合に基づく分子量であれば、特に制限なく用いることができる。該ブロック型コポリマー（ｂ）において、前記ポリエチレングリコールセグメントの平均分子量が２，０００～１００，０００である場合、該疎水性ポリマーセグメントの構造相当分子量は、セグメント相当の平均分子量として１，０００～１００，０００の構造部分が好ましく、特に好ましくは３，０００～６０，０００である。
　該疎水性ポリマーセグメントとしてポリカルボン酸含有ポリマーを用いる場合、疎水基を導入するためのカルボン酸基当量に基づき該疎水性ポリマーセグメントの分子量を規定することが好ましい。該カルボン酸当量は、疎水性ポリマーセグメント当りカルボキシ基が１０モル当量～３００モル当量が好ましく、より好ましくはカルボキシ基が１５モル当量～１００モル当量である。すなわち、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸を用いた場合、その重合数としては１０～３００が好ましく、重合数１５～１００がより好ましい。
　前記ポリカルボン酸含有ポリマーを、該疎水性ポリマーセグメントの主鎖ポリマーに用いる場合、カルボキシ基に疎水性官能基を結合させて該セグメントを疎水性とする必要がある。カルボキシ基に結合させる疎水性官能基としては、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状のアルキル基、アルケニル基またはアラルキル基が挙げられる。好ましくは直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ１～Ｃ３０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ２～Ｃ３０）のアルケニル基、若しくは直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ３０）のアラルキル基が挙げられる。
　該アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、ｎ－デシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－オクタデシル基等が挙げられる。
　該アルケニル基としては、例えば、エテニル基、１－プロペニル基、１－ブテニル基、１－ペンテニル基、９－ヘキサデセニル基、ｃｉｓ－９－オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニル基等が挙げられる。
　該アラルキル基としては、例えば、ベンジル基、４－フェニルブチル基等が挙げられる。
　前記の疎水性官能基は、ポリカルボン酸含有ポリマーのカルボキシ基とエステル型またはアミド型で結合されることが好ましい。したがって、前記疎水性官能基としては、対応する疎水性官能基を有するアルコール誘導体またはアミン誘導体としてポリカルボン酸含有ポリマーに導入される態様が好ましい。
　前記疎水性官能基は、ポリカルボン酸含有ポリマーの全てのカルボキシ基に導入されていてもよく、一部のカルボキシ基に導入されていてもよい。該疎水性官能基が導入されないカルボキシ基は、カルボン酸状態であっても、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩またはアンモニウム塩等のカルボン酸塩であっても、その他の置換基が導入された構造であってもよい。
　前記疎水性官能基は、該ブロック型コポリマー（ｂ）の疎水性ポリマーセグメントの疎水性物性を構成するものであり、該疎水性官能基の導入量及び導入率により疎水性ポリマーセグメントの疎水性物性が決定される。すなわち、該疎水性官能基の導入量が多く、また該疎水性官能基の導入率が高い程、高い疎水性物性となる。疎水基導入率は、ブロック型コポリマー（ｂ）の両親媒性を考慮して決定するべきである。
　ブロック型コポリマー（ｂ）における該疎水性ポリマーセグメントは、主鎖ポリマー構造がポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体であることが好ましい。更に、該疎水性ポリマーセグメントにおいて、該ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体が、側鎖カルボキシ基に疎水性基が直接または結合基を介して結合したセグメント構造を有し、該疎水性基が、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ１～Ｃ３０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ２～Ｃ３０）のアルケニル基または直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ３０）のアラルキル基から選択される１種以上であることが好ましい。
　より好ましくは、ブロック型コポリマー（ｂ）において、ポリエチレングリコールセグメントが、エチレンオキシ単位；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）が５～１１，５００の繰り返し単位構造である。また、疎水性ポリマーセグメントが、アスパラギン酸誘導体単位またはグルタミン酸誘導体単位が５～２００の繰り返し単位構造のポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体である。更には、該疎水性基が側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して結合しており、該疎水性基が、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ１～Ｃ３０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ２～Ｃ３０）のアルケニル基または直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ３０）のアラルキル基から選択される１種以上の疎水性基であり、疎水性基が結合したアスパラギン酸誘導体単位または疎水基が結合したグルタミン酸誘導体単位が３～２００を有するブロック型コポリマー（ｂ）である。
　疎水性基とポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸の側鎖カルボキシ基の結合を介する結合基とは、片末端がカルボニル基との結合性官能基であり、もう一方の片末端が、前記炭化水素基との結合性官能基を有する連結基である。
　例えば、酸素原子（－Ｏ－）、－ＮＨ－、硫黄原子（－Ｓ－）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ’－（ｘ’は１～１０の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ’－Ｏ－（ｘ’は１～１０の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ’－ＮＨ－（ｘ’は１～１０の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ’－Ｓ－（ｘ’は１～１０の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｙ’－（ｙ’は１～１０の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｙ’－Ｏ－（ｙ’は１～１０の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｙ’－ＮＨ－（ｙ’は１～１０の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｙ’－Ｓ－（ｙ’は１～１０の整数を示す）等を挙げることができる。
　また、該結合基としてアミノ酸を用いてもよい。アミノ酸としては、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでも良い。結合基としてのアミノ酸は、Ｎ末端アミノ基がポリマー主鎖のカルボキシ基とアミド結合し、もう一方のＣ末端カルボキシ基が、エステル結合またはアミド結合を介して、前記疎水性基と結合した態様を挙げることができる。
　本発明のポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマーブロック型コポリマー（ｂ）の好ましい態様として、下記一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 [式中、Ｒ１１は水素原子若しくは（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基を示し、Ｒ１２はメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ１３は水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１～Ｃ６）のアルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ１４は（Ｃ１～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基、（Ｃ２～３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基、（Ｃ７～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸からなる群から選択される１種類以上の基を示し、Ｒ１５は水酸基及び／または－Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）を示し、ここでＲ１７及びＲ１８は、同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基もしくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基を示し、Ｒ１６は（Ｃ１～Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｘ１１は結合基又は結合を示し、ｔは５～１１５００の整数を示し、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）は５～２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ）は３～２００の整数を示し、Ｒ１４が結合した構成単位、Ｒ１５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。]で示されるブロック型コポリマーを挙げることができる。
　前記Ｒ１１における（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基としては、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基を示す。直鎖状アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－へキシル基、ｎ－デシル基等を挙げることができる。分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、１－メチル－プロピル基、２－メチル－プロピル基、２，２－ジメチルプロピル基等が挙げられる。環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等が挙げられる。
　一般式（２）において、ｔは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位構造の重合度を示し、５～１１，５００である。好ましくはｔが１０～５，０００である。
　前記Ｒ１３の（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、シクロプロピルカルボニル基、シクロペンタンカルボニル基等が挙げられる。
　前記Ｒ１３における（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
　前記Ｒ１４の（Ｃ１～Ｃ３０）のアルキル基としては、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ１～Ｃ３０）のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、１－プロピル基、２－プロピル基、１－へキシル基、１－オクチル基、１－ドデシル基、１－テトラデシル基、１－ヘキサデシル基、１－オクタデシル基等を挙げることができる。
　前記Ｒ１４の（Ｃ２～Ｃ３０）のアルケニル基としては、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ２～Ｃ３０）のアルケニル基である。例えば、エチレン基、プロピレン基、２－ブテニル基、シクロヘキセニル基、９－ヘキサデセニル基、ｃｉｓ－９－オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニル基等が挙げられる。
　前記Ｒ１４の（Ｃ７～Ｃ３０）アラルキル基としては、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ３０）アラルキル基である。例えば、ベンジル基、１－フェニルエチル基、２－フェニルエチル基、４－フェニルブチル基、６－フェニルへキシル基等を挙げることができる。
　前記置換基において、有していてもよい置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環若しくは複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。該置換基の定義は、二官能性ポリマー（ａ）における置換基の記載事項と同義である。
　前記Ｒ１４の、カルボキシ基が保護されたアミノ酸とは、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでもよく、該アミノ酸のカルボキシ基においてエステル誘導体またはアミド誘導体として変換された置換基を示す。
　該エステル誘導体は直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキルエステルが好ましい。直鎖状アルキルエステルとしては、例えばメチルエステル、エチルエステル、ｎ－プロピルエステル、ｎ－ブチルエステル、ｎ－へキシルエステル、ｎ－デシルエステル等を挙げることができる。分岐鎖状アルキルエステルとしては、例えばイソプロピルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル、１－メチル－プロピルエステル、２－メチル－プロピルエステル、２，２－ジメチルプロピルエステル等が挙げられる。環状アルキルエステルとしては、例えばシクロプロピルエステル、シクロブチルエステル、シクロペンチルエステル、シクロヘキシルエステル、アダマンチルエステル等が挙げられる。
　該アミド誘導体としては、直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１～Ｃ１０）アルキルアミドが好ましい。直鎖状アルキルアミドとしては、例えばメチルアミド、エチルアミド、ｎ－プロピルアミド、ｎ－ブチルアミド、ｎ－へキシルアミド、ｎ－デシルアミド等を挙げることができる。分岐鎖状アルキルアミドとしては、例えばイソプロピルアミド、ｔｅｒｔ－ブチルアミド、１－メチル－プロピルアミド、２－メチル－プロピルアミド、２，２－ジメチルプロピルアミド等が挙げられる。環状アルキルアミドとしては、例えばシクロプロピルアミド、シクロブチルアミド、シクロペンチルアミド、シクロヘキシルアミド、アダマンチルアミド等が挙げられる。
　前記Ｒ１５は、－Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）であってもよい。該Ｒ１７及びＲ１８は、同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基、若しくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基である。該（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基としては、１－プロピル基、２－プロピル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基が挙げられる。該３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基としては、３－ジメチルアミノプロピル基、５－ジメチルアミノペンチル基等が挙げられる。
　前記Ｒ１６は、ポリエチレングリコールセグメントと、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントを結合するための連結基であり、（Ｃ１～６）のアルキレン基である。例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基を挙げられる。
　一般式（２）におけるＸ１１は、カルボニル基とＲ１４基を連結するための結合基である。該Ｘ１１における結合基としては、片末端がカルボニル基と結合性を示す官能基を有する連結基である。例えば、酸素原子（－Ｏ－）、－ＮＨ－、硫黄原子（－Ｓ－）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｓ－（ＣＨ２）ｒ－Ｏ－（ｒは０～６の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｓ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－（ｒは０～６の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｓ－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨＣＯ－（ｒは０～６の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｓ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯＮＨ－（ｒは０～６の整数を示す）、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－Ｏ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－Ｏ－（ｒは０～６の整数を示す）、－Ｓ－（ＣＨ２）ｒ－ＣＯ－Ｏ－（ｒは０～６の整数を示す）等を挙げることができる。
　また、Ｘ１１はカルボニル基とＲ１４が直接結合できる場合であって、相当する結合性官能基がない場合は、該Ｘ１１は結合を表す。
　更に、Ｘ１１としてアミノ酸結合残基を結合基して用いてもよい。結合基として用いられるアミノ酸は、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでもよい。Ｘ１１がアミノ酸結合残基であり、該結合基としてアミノ酸を用いる場合、疎水性ポリマーセグメントのカルボニル基と、該アミノ酸のＮ末アミノ基が結合し、他方Ｃ末カルボキシ基とエステル結合またはアミド結合を介してＲ１４基を結合させる態様を挙げることができる。したがって、Ｘ１１としてアミノ酸結合残基を用いる場合、Ｘ１１は－ＮＨ－Ｃ（Ｒ２０）－ＣＯＯ－（Ｒ２０は用いるアミノ酸の側鎖を示す）で示される結合基である。
　一般式（２）において、Ｒ１２がメチレン基の場合、該ブロック型コポリマー（ｂ）の疎水性ポリマーセグメントの主鎖は、ポリアスパラギン酸となる。該ポリアスパラギン酸の構成単位は、α－アミド型重合体、β－アミド型重合体及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位を有する。一方、一般式（２）においてＲ１２がエチレン基の場合、該ブロック型コポリマー（ｂ）における疎水性ポリマーセグメントの主鎖はポリグルタミン酸となる。該ポリグルタミン酸も同様に、主鎖の構成単位は、α－アミド型重合体、γ－アミド型重合体及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位を有していてもよい。
　一般式（２）における、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは、疎水性ポリマーセグメントのポリマー主鎖にＲ１４が結合した構成単位、Ｒ１５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位において、それぞれの含有量を示す。該ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは、それぞれ独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数で、疎水性ポリマーセグメントであるポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体のポリマー主鎖の重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）は５～２００の整数である。そのうち、Ｒ１４が結合した構成単位は必須構成であり、その総含量数（ｍ＋ｎ）は３～２００の整数である。なお、Ｒ１５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位は、任意の構成である。
　なお、一般式（２）において、疎水性ポリマーセグメントであるポリアスパラギン酸誘導体セグメントまたはポリグルタミン酸誘導体セグメントにおいて、Ｒ１４が結合した構成単位、Ｒ１５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。すなわち、ポリアスパラギン酸誘導体セグメントまたはポリグルタミン酸誘導体セグメントの側鎖カルボキシ基に、Ｒ１４が結合した構成単位及びＲ１５が結合した構成単位、並びに側鎖カルボキシ基が分子内環化型構造をとる構成単位が、それぞれ任意の順番で配列した態様であってもよく、それぞれの構成単位が局在化して偏局した配列の態様であってもよく、それぞれの構成単位に規則性がないランダム配列で構成されたポリマー構造であってもよい。
　前記一般式（２）で示されるブロック型コポリマー（ｂ）において、Ｒ１４が直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）アルケニル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ２０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上であり、Ｘ１１が酸素原子（－Ｏ－）または－ＮＨ－であることが好ましい。
　また、疎水性ポリマーセグメントであるポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体のポリマー主鎖の重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）は６～１５０の整数であり、Ｒ１４基が結合した構成単位の総含量数（ｍ＋ｎ）が３～１５０の整数であることが好ましい。
　次に、本発明のポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントを連結した構造体であるブロック型コポリマー（ｂ）の製造方法について説明する。
　本発明のブロック型コポリマー（ｂ）の製造方法は特に限定されるものではないが、あらかじめそれぞれ調製したポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントを結合する方法でもよく、ポリエチレングリコールセグメントに対し、疎水性ポリマーセグメントの重合性モノマー体を逐次重合反応させてブロック型コポリマーを構築する方法であってもよい。若しくは、ポリエチレングリコールと疎水性ポリマーセグメントの前駆体を結合させたＡＢブロック型コポリマーをあらかじめ調製し、これに適当な疎水性官能基を導入して調製する方法であってもよい。
　好ましくは、疎水性ポリマーセグメントの前駆体として、ポリアスパラギン酸等のポリカルボン酸ポリマーセグメントを用い、ポリエチレングリコールとポリカルボン酸ポリマーセグメントを結合させたＡＢブロック型コポリマーをあらかじめ調製し、これに適当な疎水性官能基をアミド結合様式及び／またはエステル結合様式により、適当な縮合条件で反応させることで製造することができる。縮合条件は、通常の有機合成反応で用いることができる方法を適宜使用することができる。
　前記ブロック型コポリマー（ｂ）の主鎖ポリマーとして、好ましく用いられるポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントが連結したＡＢブロック型コポリマーを用い、これに疎水性官能基を導入して該ブロック型コポリマー（ｂ）を得る製造方法の一態様を説明する。
　一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコール誘導体（例えば、メトキシポリエチレングリコール－１－プロピルアミン）に、β－ベンジルエステル等の適当な側鎖カルボキシ基保護のＮ－カルボニルアスパラギン酸無水物を順次反応させて、逐次重合によりポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントが連結したＡＢブロック型コポリマー骨格を構築する。その後、適当な脱保護反応を施し、複数のカルボン酸を備えるＡＢブロック型コポリマーを合成する。ポリアスパラギン酸側鎖がβ－ベンジルエステルの場合、アルカリ条件下での加水分解や、加水素分解反応により脱保護基反応をすることができる。
　この複数のカルボン酸を備えるＡＢブロック型コポリマーに対し、アミノ基及び／または水酸基を有する炭化水素基等の疎水性基含有化合物を、カルボジイミド脱水縮合剤等の縮合反応条件にて反応させればよい。この製造方法によれば、ＡＢブロック型コポリマーに、一般式（２）に係るＲ１５に相当する－Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）基を同時に導入することができることから、有利な製造方法である。
　該カルボジイミド脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等を用いることができる。該脱水縮合反応の際に、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の反応補助剤を用いてもよい。
　ブロック型コポリマー（ｂ）の炭化水素基等の疎水性官能基の導入量は、脱水縮合反応において、各疎水性基含有化合物の仕込み量を適宜増減させることで調整することができる。なお、カルボジイミド縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いた場合、－Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）のＲ１７及びＲ１８はシクロへキシル基となる。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）を用いて縮合反応を行った場合、Ｒ１７及びＲ１８はイソプロピル基となる。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）を用いた場合、－Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）のＲ１７及びＲ１８はエチル基と３－ジメチルアミノプロピルの混合置換体となる。
　前記反応終了後に、任意の精製工程を経由して本発明のブロック型コポリマー（ｂ）を製造することができる。
　前記ブロック型コポリマー（ｂ）の疎水性ポリマーセグメントとして、好ましく用いられるポリグルタミン酸の合成方法は、前述の合成例におけるＮ－カルボニルアスパラギン酸無水物に代えて、Ｎ－カルボニルグルタミン酸無水物を用いてポリグルタミン酸を得て、その後、該炭化水素基含有化合物を導入させれば、疎水性ポリマーセグメントがポリグルタミン酸のブロック型頃リマー（ｂ）を合成することができる。
［脂溶性添加剤（ｃ）について］
　本発明における脂溶性添加剤（ｃ）としては、例えば、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＤ及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、ビタミンＫ及びその誘導体並びにコレステロール及びその誘導体等が挙げられる。
　ビタミンＡ及びその誘導体としては、例えば、レチノール、レチナール、レチノイン酸、下記一般式（３）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 [式中、Ｒ２０はアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基及びポリエチレングリコールからなる群から選択される１種を示す。]、下記一般式（４）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 [式中、Ｘ２１はＮＨ、酸素原子、硫黄原子を示し、Ｒ２１はアルキル基、アルケニル基等を示す。]、及び下記一般式（５）で表される化合物
［式中、Ｘ２２はＮＨ、酸素原子、硫黄原子を示し、Ｒ２２はアルキル基、アルケニル基、ポリエチレングリコール等を示す。］等が挙げられる。
　一般式（３）で表される化合物中、Ｒ２０としてはアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等が挙げられ、好ましくは（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキル基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニル基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルコキシ基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキルアミノ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルオキシ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルアミノ基及び分子量１００～１０，０００のポリエチレングリコール等が挙げられる。
　一般式（４）で表される化合物中、Ｘ２１はＮＨもしくは酸素原子が好ましい。
　Ｒ２１としてはアルキル基、アルケニル基が挙げられ、好ましくは（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキル基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニル基が挙げられる。
　一般式（５）で表される化合物中、Ｘ２２はＮＨもしくは酸素原子が好ましい。
　Ｒ２２としてはアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等が挙げられ、好ましくは（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキル基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニル基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルコキシ基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキルアミノ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルオキシ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルアミノ基、または分子量１００～１０，０００のポリエチレングリコール等が挙げられる。
　前記Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２における前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、ｎ－デシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－オクタデシル基等が挙げられる。
　前記Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２における前記アルケニル基としては、例えば、エテニル基、１－プロペニル基、１－ブテニル基、１－ペンテニル基、９－ヘキサデセニル基、ｃｉｓ－９－オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニル基等が挙げられる。
　前記Ｒ２０における前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基、ドデカノキシ基、オクタドデカノキシ基等が挙げられる。
　前記Ｒ２０における前記アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｔｅｒｔ－ブチルアミノ基、ベンジルアミノ基、ｎ－ドデシルアミノ基、ｎ－オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
　前記Ｒ２０における前記アルケニルオキシ基としては、例えば、エテニルオキシ基、１－プロペニルオキシ基、１－ブテニルオキシ基、９－ヘキサデセニルオキシ基、ｃｉｓ－９－オクタデセニルオキシ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニルオキシ基等が挙げられる。
　前記Ｒ２０における前記アルケニルアミノ基としては、例えば、エテニルアミノ基、１－プロペニルアミノ基、１－ブテニルアミノ基、９－ヘキサデセニルアミノ基、ｃｉｓ－９－オクタデセニルアミノ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニルアミノ基等が挙げられる。
　前記Ｒ２０における前記ポリエチレングリコールとしては、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）基の繰り返し構造を含む基であり、分子量１００～１０，０００のセグメント構造を指す。該ポリエチレングリコールの末端基としては、水酸基、（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシ基である。また、一般式（３）における結合側末端は、結合、酸素原子（－Ｏ－）、－ＮＨ－、－ＯＣＯ－（ＣＨ２）ｎ’－ＣＯＯ－（ｎ’は１～４の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ’－ＣＯＯ－（ｎ’は１～４の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ’－Ｏ－（ｎ’は１～４の整数を示す）等の結合基であってよい。
　脂溶性添加剤（ｃ）において、ビタミンＤ及びその誘導体としては、例えば、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、下記一般式（６）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、Ｒ３１はアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等を示す。］及び下記一般式（７）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式中、Ｒ３２はアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等を示す。］等が挙げられる。
　一般式（６）で表される化合物中、Ｒ３１としてはアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等が挙げられ、好ましくは（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキル基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニル基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルコキシ基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキルアミノ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルオキシ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルアミノ基及び分子量１００～１０，０００のポリエチレングリコール等が挙げられる。
　一般式（７）で表される化合物中、Ｒ３２としてはアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等が挙げられ、好ましくは（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキル基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニル基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルコキシ基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキルアミノ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルオキシ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルアミノ基、または分子量１００～１０，０００のポリエチレングリコール等が挙げられる。
　前記Ｒ３１、Ｒ３２における前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－ロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、ｎ－デシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－オクタデシル基等が挙げられる。
　前記Ｒ３１、Ｒ３２における前記アルケニル基としては、例えば、エテニル基、１－プロペニル基、１－ブテニル基、１－ペンテニル基、９－ヘキサデセニル基、ｃｉｓ－９－オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニル基等が挙げられる。
　前記Ｒ３１、Ｒ３２における前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基、ドデカノキシ基、オクタドデカノキシ基等が挙げられる。
　前記Ｒ３１、Ｒ３２における前記アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｔｅｒｔ－ブチルアミノ基、ベンジルアミノ基、ｎ－ドデシルアミノ基、ｎ－オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
　前記Ｒ３１、Ｒ３２における前記アルケニルオキシ基としては、例えば、エテニルオキシ基、１－プロペニルオキシ基、１－ブテニルオキシ基、９－ヘキサデセニルオキシ基、ｃｉｓ－９－オクタデセニルオキシ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニルオキシ基等が挙げられる。
　前記Ｒ３１、Ｒ３２における前記アルケニルアミノ基としては、例えば、エテニルアミノ基、１－プロペニルアミノ基、１－ブテニルアミノ基、９－ヘキサデセニルアミノ基、ｃｉｓ－９－オクタデセニルアミノ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニルアミノ基等が挙げられる。
　前記Ｒ３１、Ｒ３２における前記ポリエチレングリコールとしては、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）基の繰り返し構造を含む基であり、分子量１００～１０，０００のセグメント構造を指す。該ポリエチレングリコールの末端基としては、水酸基、（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシ基である。また、一般式（６）及び（７）における結合側末端は、結合、酸素原子（－Ｏ－）、－ＮＨ－、－ＯＣＯ－（ＣＨ２）ｎ’－ＣＯＯ－（ｎ’は１～４の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ’－ＣＯＯ－（ｎ’は１～４の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ’－Ｏ－（ｎ’は１～４の整数を示す）等の結合基であってよい。
　脂溶性添加剤（ｃ）おいて、ビタミンＥ及びその誘導体としては、例えば、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、δ－トコフェロール、α－トコトリエノール、β－トコトリエノール、γ－トコトリエノール、δ－トコトリエノール、及び下記一般式（８）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 ［式中、Ｒ４１はアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等を示す。］等が挙げられる。
　一般式（８）で表される化合物中、Ｒ４１としてはアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等が挙げられ、好ましくは（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキル基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニル基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルコキシ基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキルアミノ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルオキシ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルアミノ基または分子量１００～１０，０００のポリエチレングリコール等が挙げられる。
　前記Ｒ４１における前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、ｎ－デシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－オクタデシル基等が挙げられる。
　前記Ｒ４１における前記アルケニル基としては、例えば、エテニル基、１－プロペニル基、１－ブテニル基、１－ペンテニル基、９－ヘキサデセニル基、ｃｉｓ－９－オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニル基等が挙げられる。
　前記Ｒ４１における前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基、ドデカノキシ基、オクタドデカノキシ基等が挙げられる。
　前記Ｒ４１における前記アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｔｅｒｔ－ブチルアミノ基、ベンジルアミノ基、ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
　前記Ｒ４１における前記アルケニルオキシ基としては、例えば、エテニルオキシ基、１－プロペニルオキシ基、１－ブテニルオキシ基、９－ヘキサデセニルオキシ基、ｃｉｓ－９－オクタデセニルオキシ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニルオキシ基等が挙げられる。
　前記Ｒ４１における前記アルケニルアミノ基としては、例えば、エテニルアミノ基、１－プロペニルアミノ基、１－ブテニルアミノ基、９－ヘキサデセニルアミノ基、ｃｉｓ－９－オクタデセニルアミノ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニルアミノ基等が挙げられる。
　前記Ｒ４１における前記ポリエチレングリコールとしては、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）基の繰り返し構造を含む基であり、分子量１００～１０，０００のセグメント構造を指す。該ポリエチレングリコールの末端基としては、水酸基、（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシ基である。また、一般式（８）における結合側末端は、結合、酸素原子（－Ｏ－）、－ＮＨ－、－ＯＣＯ－（ＣＨ２）ｎ’－ＣＯＯ－（ｎ’は１～４の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ’－ＣＯＯ－（ｎ’は１～４の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ’－Ｏ－（ｎ’は１～４の整数を示す）等の結合基であってよい。トコフェロール－ポリエチレングリコール結合誘導体の結合基としては、コハク酸結合基が好ましく、例えば、α－トコフェロール－ポリエチレングリコールコハク酸エステル、β－トコフェロール－ポリエチレングリコールコハク酸エステル、γ－トコフェロール－ポリエチレングリコールコハク酸エステル、δ－トコフェロール－ポリエチレングリコールコハク酸エステル等を用いることができる。
　脂溶性添加剤（ｃ）において、ビタミンＫ及びその誘導体としては、例えば、フィロキノン、メナキノン、メナジオン、メナジオール等が挙げられる。
　脂溶性添加剤（ｃ）において、コレステロール類及びその誘導体としては、例えば、コレステロール、コレスタノール、ストロファンチジン、及び下記一般式（９）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ［式中、Ｒ５１はアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等を示す。］等が挙げられる。
　一般式（９）で表される化合物中、Ｒ５１としてはアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルケニルオキシ基、アルケニルアミノ基、ポリエチレングリコール等が挙げられ、好ましくは（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキル基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニル基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルコキシ基、（Ｃ１～Ｃ２０）のアルキルアミノ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルオキシ基、（Ｃ２～Ｃ２０）のアルケニルアミノ基及び分子量１００～１０，０００のポリエチレングリコール等が挙げられる。
　Ｒ５１における前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、ｎ－デシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－オクタデシル基等が挙げられる。
　Ｒ５１における前記アルケニル基としては、例えば、エテニル基、１－プロペニル基、１－ブテニル基、１－ペンテニル基、９－ヘキサデセニル基、ｃｉｓ－９－オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニル基等が挙げられる。
　Ｒ５１における前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基、ドデカノキシ基、オクタドデカノキシ基等が挙げられる。
　Ｒ５１における前記アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｔｅｒｔ－ブチルアミノ基、ベンジルアミノ基、ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
　Ｒ５１における前記アルケニルオキシ基としては、例えば、エテニルオキシ基、１－プロペニルオキシ基、１－ブテニルオキシ基、９－ヘキサデセニルオキシ基、ｃｉｓ－９－オクタデセニルオキシ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニルオキシ基等が挙げられる。
　Ｒ５１における前記アルケニルアミノ基としては、例えば、エテニルアミノ基、１－プロペニルアミノ基、１－ブテニルアミノ基、９－ヘキサデセニルアミノ基、ｃｉｓ－９－オクタデセニルアミノ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ－９、１２－オクタデカジエニルアミノ基等が挙げられる。
　前記Ｒ５１における前記ポリエチレングリコールとしては、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）基の繰り返し構造を含む基であり、分子量１００～１０，０００のセグメント構造を指す。該ポリエチレングリコールの末端基としては、水酸基、（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシ基である。また、一般式（９）における結合側末端は、結合、酸素原子（－Ｏ－）、－ＮＨ－、－ＯＣＯ－（ＣＨ２）ｎ’－ＣＯＯ－（ｎ’は１～４の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ’－ＣＯＯ－（ｎ’は１～４の整数を示す）、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ’－Ｏ－（ｎ’は１～４の整数を示す）等の結合基であってよい。
　本発明において、脂溶性添加剤（ｃ）として好ましくは、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＤ誘導体またはコレステロール誘導体を用いることが好ましい。これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。特に好ましくは、ビタミンＥ誘導体であるトコフェロール及びトコフェロール－ポリエチレン結合誘導体、ビタミンＤ誘導体であるエルゴカルシフェロールまたはコレカルシフェロール、コレステロール誘導体であるコレステロール及びコレステロールアシル誘導体を用いることが好ましい。
　本発明で用いる脂溶性添加剤（ｃ）としては、市販品として入手できるものであり、流通している化合物をそのまま用いてよい。
　本発明の核酸輸送用組成物は、カチオン性官能基と炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（ａ）、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）及び脂溶性添加剤（ｃ）を含有するものである。該二官能性ポリマー（ａ）、該ブロック型コポリマー（ｂ）及び該脂溶性添加剤（ｃ）の混合比は特に限定されるものではないが、好ましくは、各成分の質量比で、該二官能性ポリマー（ａ）：該ブロック型コポリマー（ｂ）：該脂溶性添加剤（ｃ）＝１：０．１～１０：０．１～１０である。より好ましくは、該二官能性ポリマー（ａ）：該ブロック型コポリマー（ｂ）：該脂溶性添加剤（ｃ）＝１：０．１～５：０．１～５である。
　該核酸輸送用組成物において、該ブロック型コポリマー（ｂ）及び該脂溶性添加剤（ｃ）の添加量を増やすことにより、これらの成分に強固な相互作用が生じ、強い会合性複合体を調製することができ、核酸医薬の強固な保持と血中投与における血中滞留性を指向することができる。一方、該ブロック型コポリマー（ｂ）及び該脂溶性添加剤（ｃ）の添加量を減量することで、緩やかな相互作用による会合性複合体とすることができ、核酸医薬成分の速い放出を指向することができる。
　本発明の核酸輸送用組成物は、該二官能性ポリマー（ａ）、該ブロック型コポリマー（ｂ）及び脂溶性添加剤（ｃ）は上述したそれぞれの構造の構成成分を用いれば、特にその組み合わせは限定されず、各構成成分を任意に選択して組み合わせて使用することができる。しかしながら、本発明の核酸輸送用組成物は、生体投与後に被輸送体である核酸分子を効率的に細胞内にて放出させることを目的とする場合には、核酸成分の放出性を高める組成物とする必要がある。
　核酸放出性を高めた核酸輸送用組成物とする場合、該二官能性ポリマー（ａ）と該ブロック型コポリマー（ｂ）は、互いの疎水性官能基及びポリマー主鎖が異なる構造とすることが好ましい。すなわち、例えば該二官能性ポリマー（ａ）がポリグルタミン酸をポリマー主鎖とし、疎水性官能基として直鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルキル基を結合させた構造の場合、該ブロック型コポリマー（ｂ）は疎水性ポリマーセグメントのポリマー主鎖をポリアスパラギン酸とし、疎水性官能基として（Ｃ７～Ｃ３０）のアラルキル基を結合させた構造を組み合わせる組成を挙げることができる。またその逆の態様として、ポリアスパラギン酸を主鎖として、疎水性官能基として（Ｃ７～Ｃ３０）のアラルキル基を導入した該二官能性ポリマー（ａ）を用いた場合、組み合わせる該ブロック型コポリマー（ｂ）は、ポリグルタミン酸を疎水性ポリマーセグメントの主鎖とし、直鎖状の（Ｃ８～Ｃ３０）のアルキル基疎水性官能基として付与した組成とすることが好ましい。
　このような組成とすることにより、該二官能性ポリマー（ａ）が核酸と形成する複合体と、該ブロック型コポリマー（ｂ）の間に生じる疎水性相互作用は比較的弱くなるため、該複合体と該ブロック型コポリマー（ｂ）による会合体形成は弱い凝集力に基づくものとなる。したがって、生体内に投与された後に、核酸を包含する該複合体の速やかな解離－放出を促すことができる。このように、本発明の核酸輸送用組成物の二官能性ポリマー（ａ）及びブロック型コポリマー（ｂ）の各ポリマー構造は、核酸成分の放出性を調整することを目的に、適宜、設計すればよい。
　本発明の核酸輸送用組成物は、核酸と混合して該核酸を生体内に投与し、標的組織へ送達させた後、標的組織細胞へ該核酸を輸送することに用いられる。したがって本発明には、前記二官能性ポリマー（ａ）、前記ブロック型コポリマー（ｂ）及び前記脂溶性添加剤（ｃ）を含む核酸輸送用組成物に、核酸を含有させた核酸医薬組成物も含まれる。
　本発明において、核酸医薬組成物に使用される核酸は制限されない。即ち、該核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、天然または非天然の核酸類縁体（例えばペプチド核酸等）、改変核酸、修飾核酸等が挙げられるが、何れであってもよい。また、核酸は一本鎖でも二本鎖でも良く、タンパク質のコード化の有無やその他の機能の有無も制限されない。
　但し、核酸としては、生体内に送達された場合に生体、組織、細胞等に対して何らかの作用を及ぼしうる機能性核酸であることが好ましい。機能性核酸としては、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ核酸、リボザイム、ＤＮＡ酵素、各種抑制遺伝子（癌抑制遺伝子等）、機能性の改変核酸・修飾核酸（例えば、核酸のリン酸部分がホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスフェートトリエステル、ホスホロアミデート等に改変された核酸や、コレステロールやビタミンＥ等の疎水性官能基が結合された核酸）等が挙げられる。これらは核酸送達用組成物の用途に応じて選択される。
　プラスミドＤＮＡとしては、標的細胞・組織において所望の機能を発揮し得るものであればよい。斯かるプラスミドＤＮＡは種々のものが知られており、当業者であれば核酸送達用組成物の用途に応じて所望のプラスミドＤＮＡを選択することが可能である。
　また、ｓｉＲＮＡとしては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用して目的の遺伝子の発現を抑制し得るものであればよい。ＲＮＡ干渉の目的遺伝子としては、癌（腫瘍）遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子等が好ましくあげられる。また、ｓｉＲＮＡの塩基長は限定されないが、通常３０塩基未満、好ましくは１０～２５塩基である。
　本発明において、核酸としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡを用いることが好ましく、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡを用いることが好ましい。特に好ましくは、塩基長が１０～２５塩基であるｓｉＲＮＡを適用することが好ましい。
　本発明の核酸輸送用組成物は、核酸と混合して複合体を形成することにより核酸医薬組成物として用いることができる。該核酸医薬組成物を調製する場合、該核酸は前記二官能性ポリマー（ａ）と静電的相互作用により複合体を形成する。このため、核酸の適用量は、二官能性ポリマー（ａ）との適用量で設定され、核酸のリン酸基（Ｐ）と該二官能性ポリマー（ａ）のカチオン電荷（Ｎ）の比で規定される。核酸と適用量である、核酸のリン酸基（Ｐ）と該二官能性ポリマー（ａ）のカチオン電荷（Ｎ）の比（Ｎ／Ｐ）は特に限定されるものではないが、好ましくはＮ／Ｐ＝０．５～５０であり、より好ましくはＮ／Ｐ＝１～２０である。
　本発明の核酸医薬組成物は、カチオン性官能基と炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（ａ）、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）及び脂溶性添加剤（ｃ）を含む核酸輸送用組成物と、核酸との混合物を調製することにより作製される。該核酸医薬組成物は、核酸を含む全ての構成成分が相互作用することにより、会合体が形成されるものである。すなわち、核酸のアニオン電荷と該二官能性ポリマー（ａ）のカチオン電荷による静電的相互作用による複合体（ポリイオンコンプレックス、ＰＩＣともいう）形成により核酸が保持される。該複合体は、二官能性ポリマー（ａ）に由来する炭化水素基を具備していることから疎水性である。このため該複合体は、ブロック型コポリマー（ｂ）及び脂溶性添加剤（ｃ）との疎水性相互作用により会合体が形成される。該会合体は、動的光散乱法による分析で明確な光散乱強度が観測されることから、数ナノメートル～数百ナノメートル程度のナノ粒子状の会合体を形成していると考えられる。
　当該会合体の調製方法は特に限定されるものではないが、二官能性ポリマー（ａ）、ブロック型コポリマー（ｂ）を、水を含む溶媒に溶解し、これに核酸水溶液を添加した後、脂溶性添加剤（ｃ）のアルコール溶液を添加することにより調製することができる。または、二官能性ポリマー（ａ）、ブロック型コポリマー（ｂ）を、水を含む溶媒に溶解し、これに脂溶性添加剤（ｃ）のアルコール溶液を添加した後、核酸水溶液を添加することにより調製することができる。
　本発明の核酸医薬組成物は、インビトロまたはインビボにおいて、核酸を標的細胞または組織に送達するために使用できる。本発明の核酸医薬組成物によれば、標的細胞内へ安定したまま送達することが困難であった核酸を、容易に安定化した状態で送達することができる。更に、遺伝子の発現を抑制する核酸を用い、これを細胞または組織に送達して効果を発現させる場合には、本発明の核酸医薬組成物を用いることにより、高い遺伝子発現抑制効率を得ることが可能となる。
　本発明の核酸医薬組成物を用いて核酸を標的細胞または組織に送達するには、核酸医薬組成物が標的細胞または組織と接触し得る状態にすればよい。
　インビトロで本発明の核酸医薬組成物と標的細胞または組織との接触を達成するには、本発明の核酸医薬組成物の存在下で、標的細胞または組織を培養するか、標的細胞または組織の培養物中に該核酸医薬組成物を添加すればよい。
　インビボで本発明の核酸医薬組成物と標的細胞または組織との接触を達成するには、遺伝子治療等の当該技術分野で常用されている投与方法により、本発明の核酸医薬組成物を、当該核酸の導入を必要とする個体（または処置すべき個体）に投与すればよい。このような個体としては、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、鳥類等を挙げることができる。投与方法としては、標的細胞または組織の近傍または組織内への直接導入または移植、静脈注入、動脈注入、筋肉注入、経口投与、経肺投与等を挙げることができる。投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態等に合わせて適宜設定することができる。
　本発明の核酸医薬組成物による治療対象となる疾患としては、遺伝子の不適切な機能発現により引き起こされる疾患であれば、特に限定されるものではないが、例えば癌（肺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、大腸癌、神経芽細胞種及び膀胱癌等）、循環器疾患、運動器疾患、中枢系疾患等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、医薬製剤において一般に用いられている、その他の添加剤を含んでいてもよい。その他の添加剤としては、賦形剤、増量剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等が挙げられる。斯かる他の添加剤は１種を単独で用いても、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で用いてもよい。これらの他の成分の種類や使用量等の詳細は、医薬組成物の目的、用途、使用方法等に応じて、当業者であれば適宜決定することが可能である。
　本発明の医薬組成物の形態も任意であるが、通常は静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば単位投与量アンプルまたは他投与量容器の状態等で提供される。
　本発明の医薬組成物の使用方法も任意である。核酸輸送用組成物を含む医薬組成物であればそのまま投与することが可能である。
　以下、本発明を実施例により更に説明する。ただし、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
　なお使用したｓｉＲＮＡは、ｓｉＣＯＮ（ランダム配列（分子量約１３Ｋ）、ｓｉＲＮＡ濃度１００μＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７）；北海道システムサイエンス社製）、ｓｉＬｕｃ（ルシフェラーゼコード（分子量約１３Ｋ）、ｓｉＲＮＡ濃度１００μＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７）；北海道システムサイエンス社製）、ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ（ルシフェラーゼコードの蛍光標識体（分子量約１３Ｋ）、ｓｉＲＮＡ濃度１００μＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７）；北海道システムサイエンス社製）、ｓｉＲ２Ｂ（ＲＲＭ２コード（分子量約１３Ｋ）、ｓｉＲＮＡ濃度１００μＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７）；コスモ・バイオ株式会社製）を用いた。
　また本発明品及び比較例において、水溶液中で構成する会合体の分析平均粒子径は、動的光散乱法（ゼータサイザーナノ－ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ社製）にて測定した。
［合成例１］　化合物１（平均重合数５５のポリグルタミン酸）の合成
　ｎ－ブチルアミン（東京化成製）２３μＬをＤＭＳＯ２０ｍＬに溶解後、γ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸－Ｎ－カルボン酸無水物３ｇを加え、３０℃にて一夜攪拌した。反応液に、エタノール８０ｍＬ及びジイソプロピルエーテル３２０ｍＬを加えて、室温にて３時間攪拌し、沈析物を濾取してエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、４０ｍＬ）で洗浄した。
　沈析物を真空乾燥して得られた固形物（２．６ｇ）を、ＤＭＦ５０ｍＬに５０℃にて溶解後、室温にて無水酢酸１ｍＬを加えて、同温度で一夜攪拌した。反応液に、酢酸エチル１００ｍＬ及びジイソプロピルエーテル４００ｍＬを加えて、室温にて３時間攪拌した。沈析物を濾取して、酢酸エチル／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、５０ｍＬ）で洗浄した。沈析物を真空乾燥して得られた固形物（２．５ｇ）を得た。
　この沈析固形物２ｇに、ＤＭＦ４２ｍＬを添加して５０℃で溶解後、室温にて、５％パラジウム－炭素（ＮＥケムキャット社製）２００ｍｇを加え、室温にて一夜、加水素分解を行った。反応液に活性炭４００ｍｇを加えたのち、濾過を行い、触媒等を濾別した。その後、反応液に酢酸エチル１９２ｍＬ及びジイソプロピルエーテル７６８ｍＬを加えて、室温にて３時間攪拌し、沈析物を濾取して酢酸エチル／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。沈析物を真空乾燥して、化合物１（１．６ｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ｐｐｍ）：０．７０（ｔ、ｎ－ブチルアミン末端ＣＨ３、３Ｈ、積分値３．００）、４．１６（ｄｄ、グルタミン酸αＣＨ、１Ｈ、積分値５４．９３）
　積分値から算出されたモル比から、重合数は５５と算出された。
［合成例２］　化合物２（平均重合数１０２のポリグルタミン酸）の合成
　ｎ－ブチルアミン（東京化成製）１１μＬをＤＭＳＯ４０ｍｌに溶解後、γ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸－Ｎ－カルボン酸無水物３ｇを加え、３０℃にて一夜攪拌した。反応液に、酢酸エチル１６０ｍＬ及びジイソプロピルエーテル６４０ｍＬを加えて、室温にて３時間攪拌し、沈析物を濾取して酢酸エチル／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。
　沈析物を真空乾燥して得られた固形物（２．４ｇ）を、ＤＭＦ５０ｍＬに５０℃にて溶解後、室温にて無水酢酸１ｍＬを加えて、同温度で一夜攪拌した。反応液に、酢酸エチル１００ｍＬ及びジイソプロピルエーテル４００ｍＬを加えて、室温にて３時間攪拌し、沈析物を濾取して、酢酸エチル／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、５０ｍＬ）で洗浄した。沈析物を真空乾燥して、固形物（２．４ｇ）を得た。
　この沈析固形物２ｇに、ＤＭＦ４２ｍＬを添加して５０℃にて溶解後、室温にて５％パラジウム－炭素（ＮＥケムキャット社製）２００ｍｇを加え、室温にて一夜、加水素分解を行った。反応液に活性炭４００ｍｇを加えたのち、濾過を行い、触媒等を濾別後、反応液に酢酸エチル１９２ｍＬ及びジイソプロピルエーテル７６８ｍＬを加えて室温にて３時間攪拌し、沈析物を濾取して酢酸エチル／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。沈析物を真空乾燥して、化合物２（１．５ｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ｐｐｍ）：０．７１（ｔ、ｎ－ブチルアミン末端ＣＨ３、３Ｈ、積分値３．００）、４．１５（ｄｄ、グルタミン酸αＣＨ、１Ｈ、積分値１０１．７３）
　積分値から算出されたモル比から、重合数は１０２と算出された。
［合成例３］　化合物３（重合数が５５のグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）の合成
　合成例１で得られた化合物１（７６ｍｇ）をＤＭＦ２ｍＬに溶解し、２５℃にてステアリルアミン（東京化成製）４８ｍｇ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、ＨＯＢｔと記載）８８ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、ＤＩＰＣＩと記載）１８３μＬを加えて、２５℃にて１時間撹拌後、別容器にて調製したＬ‐アルギニンメチルエステル２塩酸塩（国産化学製）１０８ｍｇ、トリエチルアミン１１５μＬ、ＤＭＦ１．４ｍＬの混合液を投入し、さらに２５℃にて一夜撹拌した。反応液に、エタノール１３ｍＬ及びジイソプロピルエーテル５３ｍＬを加えて、室温にて２時間攪拌し、沈析物を濾取してエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を０．１Ｎ塩酸水１ｍＬに懸濁後、アセトン２０ｍＬを加えて３０分撹拌した。沈析物を集め、アセトン５ｍＬで洗浄し乾燥後、水４０ｍＬに溶解し、不溶物を濾別後、アセトニトリル１００ｍＬを加え、イオン交換樹脂カラム（ダウケミカル製　ダウエックス５０（Ｈ＋）、５ｍＬ）に通塔し、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、１０ｍＬ）にて溶出した。得られた溶出画分から、アセトニトリルを減圧下留去し、次いで、凍結乾燥することにより化合物３（１３２ｍｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ、ｐｐｍ）：１．１～１．３（Ｂｒ、ステアリルＣＨ２＋アルギニンＣＨ２、３４Ｈ、積分値６６．５２）、３．６１（ｓ、アルギニンメチルエステル、３Ｈ、積分値９．４３）、４．２２（Ｂｒ、アルギニンαＣＨ＋グルタミン酸αＣＨ、２Ｈ、積分値８．１７）
　各積分値から、化合物３に結合したステアリルアミンとＬ‐アルギニンメチルエステルの平均個数は、グルタミン酸の重合数が５５個に対して、ステアリルアミンは２０．５個、Ｌ‐アルギニンメチルエステルは３４．３個と算出された。
［合成例４］　化合物４（重合数が１０２のグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）の合成
　合成例２で得られた化合物２（７６ｍｇ）をＤＭＦ２ｍＬに溶解し、２５℃にてステアリルアミン（東京化成製）４８ｍｇ、ＨＯＢｔ８８ｍｇ、ＤＩＰＣＩ１８３μＬを加えて、２５℃にて１時間撹拌後、別容器にて調製したＬ‐アルギニンメチルエステル２塩酸塩（国産化学製）１０８ｍｇ、トリエチルアミン１１５μＬ、ＤＭＦ１．４ｍＬの混合液を投入し、さらに２５℃にて一夜撹拌した。反応液にエタノール１３ｍＬ及びジイソプロピルエーテル５３ｍＬを加えて室温にて２時間攪拌し、沈析物を濾取してエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を０．１Ｎ塩酸水１ｍＬに懸濁後、アセトン２０ｍＬを加えて３０分撹拌した。沈析物を集め、アセトン５ｍＬで洗浄し乾燥後、水４０ｍＬに溶解し不溶物を濾別後、アセトニトリル１００ｍＬを加え、イオン交換樹脂カラム（ダウケミカル製　ダウエックス５０（Ｈ＋）、５ｍＬ）に通塔し、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、１０ｍＬ）にて溶出した。得られた溶出画分からアセトニトリルを減圧下留去し、次いで、凍結乾燥することにより化合物４（１４１ｍｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ、ｐｐｍ）：１．１～１．３（Ｂｒ、ステアリルＣＨ２＋アルギニンＣＨ２、３４Ｈ、積分値７４．３２）、３．６１（ｓ、アルギニンメチルエステル、３Ｈ、積分値１０．１９）、４．２１（Ｂｒ、アルギニンαＣＨ＋グルタミン酸αＣＨ、２Ｈ、積分値９．６５）
　各積分値から、化合物４に結合したステアリルアミンとＬ‐アルギニンメチルエステルの平均個数は、グルタミン酸の重合数が１０２個に対して、ステアリルアミンは３４．３個、Ｌ‐アルギニンメチルエステルは５５．３個と算出された。
［合成例５］　化合物５（重合数が１０２のグルタミン酸と、オレイルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）の合成
　合成例２で得られた化合物２（１００．０ｍｇ）をＤＭＦ３．６ｍＬに溶解し、２５℃にてオレイルアミン（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）６１．６ｍｇ、ＨＯＢｔ１２９．３ｍｇ、ＤＩＰＣＩ１９３．８μＬを加えて、２５℃にて１時間撹拌後、別容器にて調製したＬ‐アルギニンメチルエステル２塩酸塩（国産化学製）１４０．４ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン１８７．２μＬ、ＤＭＦ１．４ｍＬの混合液を投入し、さらに２５℃にて一夜撹拌した。反応液にエタノール１８ｍＬ及びジイソプロピルエーテル７２ｍＬを加えて室温にて１時間攪拌し、沈析物を濾取してエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をジメチルアセトアミドに溶解させ、透析膜（ＭＷＣＯ　３，５００）を用いて、外液を０．１Ｎ塩酸アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、５００ｍＬ）及び水５００ｍＬを用いて、透析を行った。次いで、凍結乾燥することにより化合物５（１１６．２ｍｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ、ｐｐｍ）：３．６１（ｓ、アルギニンメチルエステル、３Ｈ、積分値３．１３）、４．２２（Ｂｒ、アルギニンαＣＨ＋グルタミン酸αＣＨ、２Ｈ、積分値３．１６）、５．３０（Ｂｒ、オレイルアミン、２Ｈ、積分値１．６６）
　各積分値から、化合物５に結合したオレイルアミンとＬ‐アルギニンメチルエステルの平均個数は、グルタミン酸の重合数が１０２個に対して、ステアリルアミンは３９．９個、Ｌ‐アルギニンメチルエステルは５０．１個と算出された。
［合成例６］　化合物６（重合数が１０２のグルタミン酸と、４－フェニルブチルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）の合成
　合成例２で得られた化合物２（７８ｍｇ）をＤＭＦ２ｍＬに溶解し、２５℃にて４－フェニルブチルアミン（東京化成製）２９μＬ、ＨＯＢｔ９０ｍｇ、ＤＩＰＣＩ１８８μＬを加えて、２５℃にて１時間撹拌後、別容器にて調製したＬ‐アルギニンメチルエステル２塩酸塩（国産化学製）１１１ｍｇ、トリエチルアミン１１８μＬ、ＤＭＦ１．４ｍＬの混合液を投入し、さらに２５℃にて一夜撹拌した。反応液にエタノール１３ｍＬ及びジイソプロピルエーテル５３ｍＬを加えて室温にて２時間攪拌し、沈析物を濾取してエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を０．１Ｎ塩酸水１ｍＬに溶解後、アセトン２０ｍＬを加えて３０分撹拌した。沈析物を集めアセトン５ｍＬで洗浄し乾燥後、水４ｍＬに溶解し不溶物を濾別後、アセトニトリル１６ｍＬを加え、イオン交換樹脂カラム（ダウケミカル製　ダウエックス５０（Ｈ＋）、３ｍＬ）に通塔し、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、９ｍＬ）にて溶出した。得られた溶出画分からアセトニトリルを減圧下留去し、次いで、凍結乾燥することにより化合物６（１３１ｍｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ｐｐｍ）：３．５７（Ｂｒｓ、アルギニンメチルエステル、３Ｈ、積分値１５．８１）、４．２１（ｍ、アルギニンαＣＨ＋グルタミン酸αＣＨ、２Ｈ、積分値１５．８１）、６．８３（ｍ、４－フェニルブチルアミンのフェニル、５Ｈ、積分値１７．８８）
　各積分値から、化合物６に結合したステアリルアミンとＬ‐アルギニンメチルエステルの平均個数は、グルタミンの重合数が１０２個に対して、４－フェニルブチルアミンは３４．６個、Ｌ‐アルギニンメチルエステルは５０．９個と算出された。
［合成例７］　化合物７（重合数が１０２のグルタミン酸と、ドデシルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）の合成
　合成例２で得られた化合物２（１００．０ｍｇ）をＤＭＦ３．４ｍＬに溶解し、２５℃にてドデシルアミン（東京化成製）５２．９μＬ、ＨＯＢｔ１２９．３ｍｇ、ＤＩＰＣＩ２３７．８μＬを加えて、２５℃にて１時間撹拌後、別容器にて調製したＬ‐アルギニンメチルエステル２塩酸塩（国産化学製）１４０．４ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン１８７．２μＬ、ＤＭＦ１．６ｍＬの混合液を投入し、さらに２５℃にて一夜撹拌した。反応液に、エタノール１８ｍＬ及びジイソプロピルエーテル７２ｍＬを加えて、室温にて１時間攪拌し、沈析物を濾取してエタノール／ジイソプロピルエーテル（１／４（ｖ／ｖ）、２０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物を、０．１Ｎ塩酸水１．３ｍＬに溶解後、アセトン１．３ｍＬを加え、透析膜（ＭＷＣＯ　３，５００）を用いて、外液を水５００ｍＬを用いて透析を行った。次いで、凍結乾燥することにより化合物７（１６１．５ｍｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ｐｐｍ）：１．１～１．４（Ｂｒ、ドデシルＣＨ２＋アルギニンＣＨ２、２２Ｈ、積分値１１２．２５）、３．６１（ｓ、アルギニンメチルエステル、３Ｈ、積分値２７．４２）、４．２３（Ｂｒ、アルギニンαＣＨ＋グルタミン酸αＣＨ、２Ｈ、積分値２５．４）
　各積分値から、化合物７に結合したドデシルアミンとＬ‐アルギニンメチルエステルの平均個数は、グルタミン酸の重合数が１０２個に対して、ドデシルアミンは２９．４個、Ｌ‐アルギニンメチルエステルは５７．２個と算出された。
［合成例８］　化合物８（分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が４３のポリアスパラギン酸部分からなるブロック共重合体と４－フェニルブチルアミンとの結合体：一般式（２）のＲ１１＝メチル基、Ｒ１６＝トリメチレン基、Ｒ１３＝アセチル基、Ｒ１４＝４－フェニルブチルアミノ基、Ｒ１５＝イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＝４３、ｔ＝２７３）の合成
　特開平６－２０６８１５号公報に記載された方法に基づき調製したメトキシポリエチレングリコール－ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２，０００、ポリアスパラギン酸の重合数４３）５ｇと、４－フェニルブチルアミン（東京化成製）１．２ｍＬを、ＤＭＦ９０ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ１．６ｇ、ＤＩＰＣＩ７．９ｍＬを加え、２３℃にて４７時間撹拌した。
　反応液に、酢酸エチル５４０ｍＬ及びｎ－ヘプタン１，０８０ｍＬを加え、室温にて２時間攪拌した。その後、沈析物を濾取し、酢酸エチル／ｎ－ヘプタン（１／２（ｖ／ｖ）、３００ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（９／１（ｖ／ｖ）、２６５ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂カラム（ダウケミカル社製　ダウエックス５０（Ｈ＋）、２０ｍＬ）に通塔し、アセトニトリル／水（９／１（ｖ／ｖ）、３０ｍＬ）にて溶出した。得られた溶出画分に、水７０ｍＬを加えた後、減圧濃縮を行い、終了後、水にて溶液量を２００ｍＬに調製したうえで凍結乾燥し、化合物８（６．０ｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ、ｐｐｍ）：３．４９（ｍ、ＰＥＧ、２７３×４＝１０９２Ｈ、積分値１７８６）、７．１～７．３（ｍ、フェニル、５Ｈ、積分値２１５）
　各積分値から、化合物８に結合した４－フェニルブチルアミンの平均個数は、アスパラギン酸の重合数が４３個に対して、２６．３個と算出された。
［合成例９］　化合物９（分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が４２のポリアスパラギン酸部分からなるブロック共重合体と４－フェニルブタノールとの結合体：一般式（２）のＲ１１＝メチル基、Ｒ１６＝トリメチレン基、Ｒ１３＝アセチル基、Ｒ１４＝４－フェニルブトキシ基、Ｒ１５＝イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＝４２、ｔ＝２７３）の合成
　特許第４７５７６３３号公報に記載された方法に基づき、化合物９を合成した。
　得られた化合物９を５０ｍｇ量り、アセトニトリル４ｍＬを加えて溶解し、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液４ｍＬを加えて混合し、２０分間静置することで加水分解した。この液に、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２ｍＬを加え、水／アセトニトリル混液（１：１）を加えて正確に５０ｍＬとした。この溶液を、ＨＰＬＣを用いて４－フェニルブタノールを定量分析した。分析値から、化合物９に結合した４－フェニルブチルアルコールの個数が、アスパラギン酸の重合数４２個に対して２１．６個と算出された。
［合成例１０］　化合物１０（分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコール部分と重合数が４３のポリアスパラギン酸部分からなるブロック共重合体とステアリルアミンとの結合体：一般式（２）のＲ１１＝メチル基、Ｒ１６＝トリメチレン基、Ｒ１３＝アセチル基、Ｒ１４＝ステアリルアミノ基、Ｒ１５＝イソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＝４３、ｔ＝２７３）の合成
　特開平６－２０６８１５号公報に記載された方法に基づき調製したメトキシポリエチレングリコール－ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（アスパラギン酸の重合数４３）２００ｍｇと、ステアリルアミン（シグマアルドリッチ製）２７．４ｍｇを、ＤＭＦ４ｍＬに溶解し、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノピリジン（以下、ＤＭＡＰ）６２．１ｍｇ、ＤＩＰＣＩ１５７．４μＬを加え、２５℃にて２７時間撹拌した。
　反応液に、酢酸エチル２６．７ｍＬ及びｎ－ヘプタン５３．３ｍＬを加え、室温にて１時間攪拌した。その後、沈析物を濾取し、酢酸エチル／ｎ－ヘプタン（１／２（ｖ／ｖ）、１０ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（９／１（ｖ／ｖ）、１０ｍＬ）に溶解後、イオン交換樹脂カラム（ダウケミカル社製　ダウエックス５０（Ｈ＋）、２ｍＬ）に通塔し、アセトニトリル／水（９／１（ｖ／ｖ）、５ｍＬ）にて溶出した。得られた溶出画分の減圧濃縮を行いた後に凍結乾燥し、化合物１０（１９９．６ｍｇ）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ、ｐｐｍ）：１．１～１．４（Ｂｒ、ステアリルアミン、３２Ｈ、積分値２１．７３）、３．５１（ｍ、ＰＥＧ、２７３×４＝１０９２Ｈ、積分値１００）
　各積分値から、化合物１０に結合した４－フェニルブチルアミンの平均個数は、アスパラギン酸の重合数が４３個に対して、７．４個と算出された。
［実施例１－１］　化合物３（重合数が５５のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）複合体の調製
　化合物３／化合物８／蒸留水を６ｍｇ／１．５ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーを用いて浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から１７μＬを採取し、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＣＯＮ、１００μＭ）２５μＬを、化合物３のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が１０となるように添加して、ｓｉＲＮＡとの複合粒子を調製した。そのうちの８μＬに、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（６．１ｍｇ／ｍＬ）８μＬを加えて、ボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水１８４μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物３の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／０．２５／０．５となる実施例１－１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ２５０ｎｍであった。
［実施例１－２］　化合物３（重合数が５５のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）複合体の調製
　化合物３／化合物８／蒸留水を６ｍｇ／１．５ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーを用いて浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から３．６μＬを採取し、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ、１００μＭ）５μＬを、化合物３のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が１０となるように添加して複合粒子を調製した。そこに、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（６ｍｇ／ｍＬ）９μＬを加えて、ボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水１８２μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物３の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／０．２５／０．５となる実施例１－２のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
［実施例２－１］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）複合体の調製
　化合物４／化合物８／蒸留水を６ｍｇ／１．５ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーを用いて浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から９μＬを採取し、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＣＯＮ、１００μＭ）２５μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が５となるように添加して複合粒子を調製した。そのうちの６μＬに、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（４．０ｍｇ／ｍＬ）６μＬを加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水１８８μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／０．２５／０．５となる実施例２－１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ２９３ｎｍであった。
［実施例２－２］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）複合体の調製
　化合物４／化合物８／蒸留水を６ｍｇ／１．５ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーを用いて浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から７．２μＬを採取し、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ、１００μＭ）５μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が２０となるように添加して複合粒子を調製した。そこに、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（９ｍｇ／ｍＬ）１２μＬを加えて、ボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水１７６μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／０．２５／０．５となる実施例２－２のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
［実施例３－１］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ）複合体の調製
　化合物４／化合物８／蒸留水を６ｍｇ／６ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーを用いて浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から６．９μＬを採取し、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（１７．１ｍｇ／ｍＬ）１２μＬを加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次いで、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＲ２Ｂ、１００μＭ）５．１μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が２０となるように加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水３１８．８μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例３－１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ４７ｎｍであった。
［実施例３－２］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）複合体の調製
前記実施例３－１において、用いるｓｉＲＮＡをｓｉＲ２ＢからＦＡＭ－ｓｉＬｕｃに変更し、その他を実施例３－１と同様の手法を用いることで化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例３－２のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ５０ｎｍであった。
［実施例３－３］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）複合体の調製
前記実施例３－１において、用いるｓｉＲＮＡをｓｉＲ２ＢからｓｉＣＯＮに変更し、その他を実施例３－１と同様の手法を用いることで化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例３－３のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ、２５ｎｍ及び１５０ｎｍの混成であった。
［実施例３－４］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）複合体の調製
前記実施例３－１において、用いるｓｉＲＮＡをｓｉＲ２ＢからｓｉＬｕｃに変更し、その他を実施例３－１と同様の手法を用いることで化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例３－４のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ、５８ｎｍと３０５ｎｍの混成であった。
［実施例４－１］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロール－ポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル（ＴＰＧＳ）によるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ）複合体の調製
　化合物４／化合物８／ＴＰＧＳ／蒸留水を６ｍｇ／６ｍｇ／２１．１ｍｇ／１．０ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と、超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から２００μＬを採取し、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＲ２Ｂ、５０μＭ）５０μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が２０となるように加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌して化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール－ポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル＝１／１／１となる実施例４－１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ５ｎｍであった。
［実施例５－１］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）と化合物８とコレカルシフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ）複合体の調製
　化合物４／化合物８／蒸留水を３０ｍｇ／３０ｍｇ／１ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から１００μＬを採取し、コレカルシフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（１７．１ｍｇ／ｍＬ）１７５．４μＬを加えて、ボルテックスミキサーで浸透撹拌した。そのうちの１５．７μＬに、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＲ２Ｂ、１００μＭ）４．３μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が２０となるように加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水２６５．７μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてコレカルシフェロール＝１／１／１となる実施例５－１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ８８ｎｍであった。
［実施例６－１］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物９及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ）複合体の調製
　化合物４／化合物９／蒸留水を６ｍｇ／６ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から２４．０μＬを採取し、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（１７．４ｍｇ／ｍＬ）４２．０μＬを加えて、ボルテックスミキサーで浸透撹拌した。そのうちの２２．０μＬに、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＲ２Ｂ、１００μＭ）６．０μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が２０となるように加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水３７２．０μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物９のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例６－１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ、２０ｎｍ及び１１６ｎｍの混成であった。
［実施例６－２］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物９及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）複合体の調製
前記実施例６－１において、用いるｓｉＲＮＡをｓｉＲ２ＢからをＦＡＭ－ｓｉＬｕｃに変更し、その他を実施例６－１と同様の手法を用いることで化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物９のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例６－２のしＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ８５ｎｍであった。
［実施例７－１］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物１０及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ）複合体の調製
　化合物４／化合物１０／蒸留水を６ｍｇ／６ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から２４．０μＬを採取し、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（１７．４ｍｇ／ｍＬ）４２．０μＬを加えて、ボルテックスミキサーで浸透撹拌した。そのうちの２２．０μＬに、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＲ２Ｂ、１００μＭ）６．０μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が２０となるように加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水３７２．０μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物４の二官能性ポリマー（ａ）：化合物１０のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例７－１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ２０ｎｍであった。
［実施例８－１］　化合物５（重合数が１０２のグルタミン酸と、オレイルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ２Ｂ）複合体の調製
　化合物５／化合物８／蒸留水を６ｍｇ／６ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から３０．３μＬを採取し、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（１８．８ｍｇ／ｍＬ）４８．３μＬを加えて、ボルテックスミキサーで浸透撹拌した。そのうちの２６．２μＬに、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＲ２Ｂ、１００μＭ）６．０μＬを、化合物５のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が２０となるように加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水３７３．７μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して化合物５の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例８－１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ２１ｎｍ及び９０ｎｍの混成であった。
［実施例８－２］　化合物５（重合数が１０２のグルタミン酸と、オレイルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）複合体の調製
　前記実施例８－１において、用いるｓｉＲＮＡをｓｉＲ２ＢからＦＡＭ－ｓｉＬｕｃに変更し、その他を実施例８－１と同様の手法を用いることで化合物５の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例８－２のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ５９ｎｍであった。
［実施例８－３］　化合物５（重合数が１０２のグルタミン酸と、オレイルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）複合体の調製
　前記実施例８－１において、用いるｓｉＲＮＡをｓｉＲ２ＢからｓｉＣＯＮに変更し、その他を実施例８－１と同様の手法を用いることで化合物５の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例８－３のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ、３１ｎｍ及び１２９ｎｍの混成であった。
［実施例８－４］　化合物５（重合数が１０２のグルタミン酸と、オレイルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）複合体の調製
　前記実施例８－１において、用いるｓｉＲＮＡをｓｉＲ２ＢからｓｉＬｕｃに変更し、その他を実施例８－１と同様の手法を用いることで化合物５の二官能性ポリマー（ａ）：化合物８のブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）としてＤ－α－トコフェロール＝１／１／１となる実施例８－４のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ、４６ｎｍ及び４３３ｎｍの混成であった。
［比較例１］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）及び化合物８によるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）複合体の調製
　化合物４／化合物８／蒸留水を６ｍｇ／１．５ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から９μＬを採取し、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＣＯＮ、１００μＭ）２５μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が５となるように加えて添加して複合粒子を調製した。そのうちの６μＬに、蒸留水１９４μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して、比較例１のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ、８３ｎｍと３９８ｎｍの混成であった。
［比較例２］　化合物４（重合数が１０２のポリグルタミン酸と、ステアリルアミン及びアルギニンメチルエステルとのアミド結合体）及び化合物８と４－フェニルブタノールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）複合体の調製
　化合物４／化合物８／蒸留水を６ｍｇ／１．５ｍｇ／０．２ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から９μＬを採取し、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＣＯＮ、１００μＭ）２５μＬを、化合物４のカチオン基（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が５となるように添加して複合粒子を調製した。そのうちの６μＬに、４－フェニルブタノール（東京化成製）のエタノール溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）６μＬを加えてボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水１８８μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して、比較例２のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ３２３ｎｍであった。
［比較例３］　ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、化合物８及びＤ－α－トコフェロールによるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）複合体の調製
　ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（東京化成製）／化合物８／蒸留水を３０ｍｇ／１０ｍｇ／１ｍＬになるように混合し、４０℃程度まで加温しながら、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して溶解液を調製した。得られた溶解液から５μＬを採取し、ｓｉＲＮＡのＨＥＰＥＳ溶液（ｓｉＣＯＮ、１００μＭ）２５μＬを、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリドの添加当量（Ｎ）とｓｉＲＮＡのリン酸基（Ｐ）によるＮ／Ｐ比が５となるように添加して、複合粒子を調製した。そのうちの５μＬに、Ｄ－α－トコフェロール（東京化成製）のエタノール溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）５μＬを加えて、ボルテックスミキサーで浸透撹拌した。次に蒸留水１９０μＬを徐々に加え、ボルテックスミキサーでの浸透撹拌と超音波処理を繰り返して比較例３のｓｉＲＮＡ複合体溶液を調製した。
　動的散乱法でｓｉＲＮＡ複合体の平均粒子径を測定したところ３５４ｎｍであった。
［試験例１］　ＲＮａｓｅ中でのｓｉＲＮＡの安定性評価
　本発明の核酸輸送用組成物を構成要素とするｓｉＲＮＡ複合体が、生体内に存在する核酸分解酵素によるｓｉＲＮＡの分解に対して高い抵抗性を示すことを検証するため、ｓｉＲＮＡを含む本発明の核酸複合体の、ＲＮａｓｅ　Ａ（ＱＩＡＧＥＮ社）中での安定性を調べた。
　実施例１－１～８－１及び比較例１、２によるｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ：最終濃度１μＭ）に、ＲＮａｓｅ（終濃度５０μｇ／ｍｌ，ＱＩＡＧＥＮ社）を加え、３７℃で約３時間インキュベートした。その後、終濃度０．０４％になるようにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、ナカライテスク）を加えることで、分解反応を停止させ、該ｓｉＲＮＡ複合体からｓｉＲＮＡを解離させた。
　得られた試験試料を、１５％ポリアクリルアミドゲル（Ｔｒｉｓ－ホウ酸－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ））を用いて、１００ボルト、６０分の条件で電気泳動を行い、ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　ＩＩ (ライフテクノロジーズジャパン社)で染色することで、試験試料に含まれるｓｉＲＮＡを検出した。ゲル中のｓｉＲＮＡのバンドを、モレキュラー・イメージャーＦＸ（ＢｉｏＲａｄ社）で解析し、ｓｉＲＮＡの安定性を評価した。なお、ｓｉＲＮＡのコントロール試料として、Ｌｉｃｉｆｅｒａｓｅ（ＧＬ３）（コスモバイオ社）を用いた。結果を表１及び図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　ＲＮａｓｅ処理前の実施例１－１～８－１は、上記電気泳動にてｓｉＲＮＡのバンドが検出されなかった。したがって、ｓｉＲＮＡと二官能性ポリマー（ａ）：ブロック型ポリマー（ｂ）：脂溶性添加剤（ｃ）による核酸輸送用組成物が複合体を形成して、該ｓｉＲＮＡを保持していることが示された。同様に、比較例１及び２も、電気泳動によりｓｉＲＮＡが検出されなかった。したがって、二官能性ポリマー（ａ）等と複合体形成していることが示唆された。一方、二官能性ポリマー（ａ）を使用せずに、カチオン性低分子化合物（ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド）を用いた比較例３は、電気泳動によりｓｉＲＮＡが検出された。この結果は、ｓｉＲＮＡと該組成物による安定な複合体形成が認められなかった。したがって、比較例３は、ｓｉＲＮＡを保護する機能がなく、ＲＮａｓｅに対する分解耐性は期待できないと考えられた。
　本発明の核酸輸送用組成物を用いたｓｉＲＮＡ複合体である実施例１－１～８－１は、ＲＮａｓｅで３時間処理した後においても、ｓｉＲＮＡのバンドが確認されており、ＲＮａｓｅに対する安定性が確認された。一方、脂溶性添加剤（ｃ）が存在しない比較例１や適当な脂溶性添加剤（ｃ）ではない比較例２は、ＲＮａｓｅ処理によりｓｉＲＮＡのバンドが確認されず、ｓｉＲＮＡがＲＮａｓｅにより分解していることが確認された（図１及び表１）。
［試験例２］　ｓｉＲＮＡ複合体の細胞取り込み能の検証
　本発明の核酸輸送用組成物を構成要素とするｓｉＲＮＡ複合体が、ｓｉＲＮＡを培養条件下において細胞内に取り込ませることができることを検証するため、蛍光標識ｓｉＲＮＡを含む本発明の核酸複合体を用いて、経時的な細胞内取り込み能を調べた。
　１０％　胎児牛血清（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を添加したＥａｇｌｅ‘ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いて、ヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ）を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター下で継代培養維持した。
　ヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧを、１００，０００細胞／ガラスボトムディッシュ(１ｍＬ)になるように播種して、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４日間培養を行った。その後、蛍光標識ｓｉＲＮＡであるＦＡＭ－ｓｉＬｕｃを含有する実施例１－２、２－２、３－２、６－２、８－２を１００ｎＭ（ｓｉＲＮＡ濃度）で培地に添加し、Ｕ８７ＭＧ細胞に接触させた。各ｓｉＲＮＡ複合体添加後、２時間、７時間及び２４時間後に、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）を用いて、試験細胞の画像を採取した。得られた画像写真を図２及び３に示した。
　なお、本試験はｓｉＲＮＡ導入試薬の陽性対照として、市販キャリアであるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　Ｍａｘ（ライフテクノロジー社）を用い、製造者の指示に基づいてＦＡＭ－ｓｉＬｕｃとの複合体を調製して用いた。また，陰性対照として、ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃのみ（ｎａｋｅｄ　ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）を添加した。
　試験細胞の画像を市販の画像処理ソフト（Ｍｅｄｉａ　Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ）によって、１細胞当たりのＦＡＭ蛍光量をｐｉｘｃｅｌ数としてカウントし、各サンプルにおける画像から１０細胞の平均ｐｉｘｃｅｌ数を求めた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　本発明の実施例１－２、２－２、３－２、６－２及び８－２は、Ｕ８７ＭＧ細胞に添加後２時間では蛍光強度が弱く、ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃの細胞内取り込み量が低いものの、細胞接触７時間後、２４時間後と時間が経過するに従い細胞中の蛍光強度の増加が確認された。したがって、本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、時間経過とともに細胞内に取り込まれていくことが確認された。一方、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅは、細胞に添加後７時間で強い蛍光が確認され、２４時間経過すると蛍光強度の低下が確認された。このことから、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅによる細胞内ｓｉＲＮＡ取込みは、早い時間から取り込まれ、比較的速く機能消失することが明らかとなった。一方、ｎａｋｅｄ　ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃは、いずれの時間においても細胞への取り込みは確認されなかった。本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、従来用いられているＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと比較し、ｓｉＲＮＡの高い細胞内取り込みを達成することが明らかとなった。
［試験例３］　ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシングの検討
　本発明の核酸輸送用組成物に、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＬｕｃあるいはＦＡＭ－ｓｉＬｕｃを用いたｓｉＲＮＡ複合体を調製し、これを用いて細胞内のルシフェラーゼ遺伝子の発現が抑制されることを検証するため、ルシフェラーゼ安定発現ヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧを構築し、ルシフェラーゼ阻害活性を評価した。
３－１．ルシフェラーゼ安定発現細胞の作製
　培養細胞に遺伝子発現ベクターを導入し、薬剤耐性マーカーによる選択圧をかけることで定常発現株を樹立する方法により、ルシフェラーゼ安定発現細胞を作製した。薬剤は、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。１０ｃｍシャーレに、５×１０５個のヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧを播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター下で１日間培養した。その後、ルシフェラーゼ発現ベクターであるｐＧＬ３ｎｅｏ（ｐｒｏｍｅｇａ社製）ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、製造者の指示に従いＵ８７ＭＧ細胞に導入した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター下で２日間培養後、０．２５％　Ｔｒｉｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）／０．０２％　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により細胞を剥離し、１０倍希釈した細胞を新たな培養メディウムに移し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター下で１晩培養した。細胞がシャーレに張り付いたことを確認し、３００μｇ／ｍＬ濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含む培養メディウムを用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター下で培養した。１週間ごとにメディウムを交換し、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ耐性コロニーが直径３～５ｍｍになったら、滅菌したクローニングリング（ＩＷＡＫＩ、直径５ｍｍ）を用いて単離することにより、ルシフェラーゼ安定発現ヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧを作製した。
３－２．ルシフェラーゼ活性の評価
　樹立したルシフェラーゼ安定発現ヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧ細胞を、９６ウエルプレートへ９×１０４細胞／ウエル播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター下で１日間培養した。その後、実施例１－２（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）、２－２（ＦＡＭ－ｓｉＬｕｃ）、３－４（ｓｉＬｕｃ）及び８－４（ｓｉＬｕｃ）によるｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ濃度として１００ｎＭ，ｎ＝３）を添加した。添加から、３日後に、該Ｕ８７ＭＧ細胞のルシフェラーゼの発光活性を、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出した。なお、ＲＮＡ干渉効果は、対応するｓｉＣＯＮを含有するｓｉＲＮＡ複合体（実施例１－１、２－１、３－３、８－３）を添加した場合のルシフェラーゼの発光値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｌｉｇｈｔ　Ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）を比較対象として、下記の式を用いて本発明のｓｉＲＮＡ複合体（実施例１－２、２－２、３－４及び８－４）のルシフェラーゼ発現阻害率（％）を求め、ＲＮＡ干渉効果を評価した。結果を図４に示した。
［式］　発現阻害率（％）＝（ｓｉＣＯＮの発光値－ｓｉＬＵＣの発光値）／ｓｉＣＯＮの発光値　×　１００
　本発明のｓｉＲＮＡ複合体（実施例１－２，２－２，３－４及び８－４）は、１００ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度において、それぞれ約５３％、４４％、６１％、５５％の阻害率を示した（図４参照）。このことから、本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、包含するｓｉＲＮＡを細胞内に導入し、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果を発現させ、標的遺伝子機能を抑制できることが明らかとなった。
　本発明のｓｉＲＮＡ複合体（実施例１－２，２－２，３－４及び８－４）は、１００ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度において、それぞれ５３％、４４％、６１％、５５％阻害率を示した（図４参照）。このことから、本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、包含するｓｉＲＮＡを細胞内に導入し、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果を発現させ、標的遺伝子機能を抑制できることが明らかとなった。
　本発明の二官能性ポリマー（ａ）、ブロック型ポリマー（ｂ）、脂溶性添加剤（ｃ）による核酸輸送用組成物を用いたｓｉＲＮＡ複合体は、包含するｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅなどの核酸分解酵素から保護できることが示され（試験例１の結果参照）、静脈内投与等の血中投与に適用できる。また、本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、細胞内にｓｉＲＮＡを効率的に導入できるとともに、長時間、ｓｉＲＮＡの存在を維持することができる（試験例２の結果参照）。更に、本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、細胞に作用させることで、ＲＮＡ干渉効果を発揮させることができ、細胞内に導入させたｓｉＲＮＡを機能発現させることができる（試験例３の結果参照）。
　以上の、試験例１～３の結果から、本発明の二官能性ポリマー（ａ）、ブロック型ポリマー（ｂ）、脂溶性添加剤（ｃ）による核酸輸送用組成物を用いた核酸医薬複合体は、血中投与に適用し、該核酸医薬を標的組織まで送達し、標的組織細胞へ導入して、細胞内にて該核酸医薬を機能発現させる機能を具備することが示された。

Claims (15)

  1. 　カチオン性官能基と炭化水素基が導入された二官能性ポリマー（ａ）、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）並びにビタミンＡ誘導体、ビタミンＤ誘導体、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＫ誘導体及びコレステロール誘導体からなる群から選択される１種以上の脂溶性添加剤（ｃ）、を含有することを特徴とする核酸輸送用組成物。
  2. 　前記二官能性ポリマー（ａ）の前記炭化水素基が、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基及び直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の炭化水素基である請求項１に記載の核酸輸送用組成物。
  3. 　前記二官能性ポリマー（ａ）の前記カチオン性官能基が、アミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基及びグアニジル基からなる群から選択される１種以上のカチオン性官能基である請求項１または２に記載の核酸輸送用組成物。
  4. 　前記二官能性ポリマー（ａ）が、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体であり、該ポリアスパラギン酸誘導体または該ポリグルタミン酸誘導体は、側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して、前記カチオン性官能基及び前記炭化水素基が導入されており、該二官能性ポリマー１分子当りの該カチオン性官能基導入率が１０～１００モル当量／ポリマー分子であり、該カチオン性官能基と該炭化水素基の含有モル当量比率（カチオン性官能基含有モル当量：炭化水素基含有モル当量）が１～５：１である請求項１～３の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
  5. 　前記ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントが連結したブロック型コポリマー（ｂ）が、該疎水性ポリマーセグメントがポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体であり、該ポリアスパラギン酸誘導体または該ポリグルタミン酸誘導体は、側鎖カルボキシ基に疎水性基が直接または結合基を介して結合したセグメント構造であり、該疎水性基が、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ１～Ｃ３０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ２～Ｃ３０）のアルケニル基または直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７～Ｃ３０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上である請求項１～４の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
  6. 　前記ブロック型コポリマー（ｂ）が、ポリエチレングリコールセグメントが、エチレンオキシ単位；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）が５～１１，５００の繰り返し単位構造であり、疎水性ポリマーセグメントが、アスパラギン酸誘導体単位またはグルタミン酸誘導体単位が５～２００の繰り返し単位構造のポリアスパラギン酸誘導体セグメントまたはポリグルタミン酸誘導体セグメントであり、該ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に、前記疎水性基が直接または結合基を介して結合したアスパラギン酸誘導体単位または疎水基が結合したグルタミン酸誘導体単位が３～２００である請求項５に記載の核酸輸送用組成物。
  7. 　前記二官能性ポリマー（ａ）が、一般式（１）
    ［式中、Ｒ１は水素原子、（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）のアラルキル基を示し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ３は水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ４は直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基並びに直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、Ｒ５は水酸基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、該Ｒ７及びＲ８は、同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基、若しくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基を示し、Ｒ６は（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基を示し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は結合基又は結合を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇはそれぞれ独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０～２００の整数であり、（ａ＋ｂ）は５～２００の整数であり、（ｃ＋ｄ）は５～２００の整数であり、アルギニン誘導体が結合した構成単位、Ｒ４が結合した構成単位、Ｒ５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示されるポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体である請求項１～６の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
  8. 　前記一般式（１）で示される二官能性ポリマー（ａ）において、Ｒ４は（Ｃ８～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基、（Ｃ８～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基及び（Ｃ８～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の炭化水素基を示し、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１５～２００の整数であり、（ａ＋ｂ）は１０～１５０の整数であり、（ｃ＋ｄ）は５～１００の整数であり、（ａ＋ｂ）：（ｃ＋ｄ）が１～３：１である請求項７に記載の核酸輸送用組成物。
  9. 　前記ブロック型コポリマー（ｂ）が、一般式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     [式中、Ｒ１１は水素原子若しくは（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基を示し、Ｒ１２はメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ１３は水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ１４は（Ｃ１～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基、（Ｃ２～３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基、（Ｃ７～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ１５は水酸基及び／または－Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）を示し、ここでＲ１７及びＲ１８は同一でも異なっていてもよく（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖、分岐鎖状または環状のアルキル基もしくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基を示し、Ｒ１６は（Ｃ１～Ｃ６）のアルキレン基を示し、Ｘ１１は結合基又は結合を示し、ｔは５～１１５００の整数を示し、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）は５～２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ）は３～２００の整数を示し、Ｒ１４が結合した構成単位、Ｒ１５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示されるブロック型コポリマーである請求項１～８の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
  10. 　前記一般式（２）で示されるブロック型コポリマーにおいて、Ｒ１４が（Ｃ８～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基、（Ｃ８～Ｃ３０）の直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基及び（Ｃ７～Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上であり、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）は６～１５０の整数を示し、（ｍ＋ｎ）は３～１５０の整数である請求項９に記載の核酸輸送用組成物。
  11. 　前記二官能性ポリマー（ａ）、前記ブロック型コポリマー（ｂ）及び前記脂溶性添加剤（ｃ）の含有比率（ｗ／ｗ）が（ａ）：（ｂ）：（ｃ）＝１：０．１～５：０．１～５である請求項１～１０の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物。
  12. 　前記請求項１～１１の何れか一項に記載の核酸輸送用組成物に、核酸を含有させた医薬組成物。
  13. 　前記核酸がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 　前記請求項１２または１３に記載の医薬組成物を含有する遺伝子治療剤。
  15. 　一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ１は水素原子、（Ｃ１～Ｃ１０）のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）のアラルキル基を示し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ３は水素原子、（Ｃ１～Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１～Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ４は直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルキル基、直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアルケニル基並びに直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ８～Ｃ４０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、Ｒ５は水酸基、カルボキシ基が保護されたアミノ酸及び－Ｎ（Ｒ７）ＣＯＮＨ（Ｒ８）からなる群から選択される１種以上の置換基を示し、該Ｒ７及びＲ８は、同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３～Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキル基、若しくは３級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ５）のアルキル基を示し、Ｒ６は（Ｃ１～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基または（Ｃ７～Ｃ１０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基を示し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は結合基又は結合を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇはそれぞれ独立に０～２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０～２００の整数であり、（ａ＋ｂ）は５～２００の整数であり、（ｃ＋ｄ）は５～２００の整数であり、アルギニン誘導体が結合した構成単位、Ｒ４が結合した構成単位、Ｒ５が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示されるポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体。
     
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