TW201544511A - 針對基質金屬蛋白酶９之抗體及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供涉及結合至基質金屬蛋白酶-9(MMP9)蛋白質(MMP9亦稱為明膠酶B)之結合蛋白(例如抗體及彼等之抗原結合片段)的組成物和使用方法，諸如其中該結合蛋白包含免疫球蛋白(Ig)重鏈(或其功能片段)及Ig輕鏈(或其功能片段)。

Description

針對基質金屬蛋白酶9之抗體及其使用方法 相關申請案之交叉參考資料

不適用。

受聯邦政府資助所做研究之發明的權利聲明

不適用。

本發明係在胞外酶、胞外基質酶、蛋白酶及免疫學之領域內。

基質金屬蛋白酶(MMP)屬於涉及形成和重塑胞外基質之胞外酶一族。這些酶含有保守之催化性結構域，其中鋅原子係由三個組胺酸殘基配位。此族之已知成員超過20種，它們被組織成若干組，包括膠原蛋白酶、明膠酶、基質溶解素(stromelysin)、基質裂解蛋白(matrilysin)、釉質溶解素(enamelysin)及膜MMP。

MMP2及MMP9屬於基質金屬蛋白酶之明膠酶組。除了含有信號肽、前肽外，大多數MMP共通擁有催 化性、鋅結合和血紅素結合蛋白(hemopexin)樣結構域，明膠酶亦含有多個纖連蛋白(fibronectin)樣結構域及O-糖基化結構域。MMP涉及許多疾病。MMP抑制劑尚未完全令人滿意，部分與特異性和效力有關。因此，對於特異性且有效之MMP抑制劑是有需要的。

儘管活性藥物發展已有數十年，且FDA在2011年核准新的用於慢性阻塞性肺病(COPD)的治療類別(磷酸二酯酶-4抑制劑羅氟司特(roflumilast))，當藉由症狀、病情加重、住院和死亡率測量時，在COPD中仍持續存在未得到滿足的需求。沒有藥物療法已顯示出能改變疾病進展或死亡率。用於COPD之具有非支氣管擴張劑(nonbronchodilator)機制的積極發展計劃有許多；然而，具有改變炎症和疾病進展之潛力及可接受之安全性的很少。因此，對於能有效治療該類疾病，尤其是用於其中可用之療法已無效的個體，是有需要的。

本文提供用於治療或預防個體中慢性阻塞性肺病(COPD)的方法，其包含投予個體有效量之包含免疫球蛋白重鏈多肽或其功能性片段，及免疫球蛋白輕鏈多肽或其功能性片段的基質金屬蛋白酶9(MMP9)結合蛋白，其中該MMP9結合蛋白特異結合至MMP9。於一些實施態樣中，該MMP9結合蛋白為結合至基質金屬蛋白酶-9(MMP9)蛋白(亦稱為明膠酶B)之抗體或其抗原結合 片段。結合至MMP9之抗體或其片段(例如抗原結合片段)通常含有免疫球蛋白(Ig)重鏈(或其功能性片段)及Ig輕鏈(或其功能性片段)。該重鏈通常為IgG，諸如IgG1或IgG4，或其經修改之變體。該輕鏈通常為κ鏈。

於一些實施態樣中，MMP9結合蛋白(例如抗體)為那些特異結合至MMP9，但不結合至其他、相關之基質金屬蛋白酶者。這類MMP9結合蛋白可用於其中需要或期望達成特定調節(例如抑制)MMP9(例如不直接影響其他基質金屬蛋白酶之活性)的應用中。因此，於本發明之某些實施態樣中，抗MMP9抗體或其抗原結合片段為MMP9之活性的特定抑制劑。於一些態樣中，本文所揭示之MMP9結合蛋白將可用於抑制MMP9，同時允許其他、相關之基質金屬蛋白酶的正常功能。

於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段特異結合至MMP9之表位，其中該表位在MMP9之區域中包含胺基酸殘基，該區域包含SEQ ID NO：27之殘基104-119、殘基159-166或殘基191-202。於某些實施態樣中，該區域係由SEQ ID NO：27之殘基104-119、殘基159-166或殘基191-202所組成。於一態樣中，該表位包含SEQ ID NO：27之E111、D113、R162、或I198。例如，該表位可包含SEQ ID NO：27之殘基R162。於某些實施態樣中，該抗體為人化、嵌合型或人抗體。

抗體及片段可參考彼等之胺基酸序列或其部 分，及/或各種功能進行描述，諸如對MMP9或其特殊表位之結合特異性、或與特殊抗體競爭結合的能力及/或活性，諸如抑制MMP9(例如非競爭性地)之能力。

於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段包含含有一CDR之VH區，該CDR具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之：SEQ ID NO：13、14和15；及含有一CDR之VL區，該CDR具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之CDR：SEQ ID NO：16、17和18。於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段包含含有三個CDR之VH區，該CDR包含SEQ ID NO：13、14和15之胺基酸序列；及含有三個CDR之VL區，該CDR包含SEQ ID NO：16、17和18之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該VH區具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：3、5、6、7和8；而該VL區具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：4、9、10、11和12。

於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：7中所列之胺基酸序列的VH區及含有SEQ ID NO：12中所列之胺基酸序列的VL區。

於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體包含含有SEQ ID NO：49中所列之胺基酸序列，但無該信號肽的重鏈及含有SEQ ID NO：50中所列之胺基酸序 列，但無該信號肽的輕鏈。於一些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體包含含有SEQ ID NO：56中所列之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：57中所列之胺基酸序列的輕鏈。

於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：47中所列之胺基酸序列的VH區及含有SEQ ID NO：48中所列之胺基酸序列的VL區。

於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體包含含有SEQ ID NO：45中所列之胺基酸序列，但無該信號肽之輕鏈及含有SEQ ID NO：46中所列之胺基酸序列，但無該信號肽之重鏈。於一些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體包含含有SEQ ID NO：58中所列之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：59中所列之胺基酸序列的輕鏈。

於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段為本文中所描述之任何抗體或其抗原結合片段。於一實施態樣中，該用於治療或預防個體中之COPD的方法包含投予該個體有效量之抗MMP9抗體或其抗原結合片段。於一些實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段可結合至MMP9之表位，其中該表位包含SEQ ID NO：27之胺基酸殘基104-119、殘基159-166或殘基191-202；或SEQ ID NO：27之胺基酸殘基E111、D113、R162或I198。於某些實施態樣中，該抗MMP9抗 體或其抗原結合片段可與蛋白質或抗體競爭結合至MMP9，其中該蛋白質或抗體可結合至SEQ ID NO：27之胺基酸殘基104-119、殘基159-166或殘基191-202；或SEQ ID NO：27之胺基酸殘基E111、D113、R162或I198。於某些其他實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段可與蛋白質或抗體競爭結合至MMP9，其中該蛋白質或抗體與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列具有約95%、96%、97%、98%、99%或更高之同一性：SEQ ID NO：7、12、13、14、15、16、17和18。於進一步之實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段可包含含有一互補決定區(CDR)的重鏈可變(VH)區，該互補決定區(CDR)具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：13、14及15；含有一CDR之輕鏈可變(VL)區，該CDR具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：16、17及18；含有三個CDR(即，CDR1-3)之VH區，該CDR包含SEQ ID NO：13、14及15中所列之胺基酸序列；或含有三個CDR(即，CDR1-3)之VL區，該CDR包含SEQ ID NO：16、17及18中所列之胺基酸序列。於一些進一步之實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段可包含含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VH區：SEQ ID NO：3、5、6、7和8；含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VL區：4、9、10、11和12；包含SEQ ID NO：56或58中所列出之胺基酸序列的重鏈；或包含SEQ ID NO：57或59中所列出之胺基酸序列的輕鏈。於某些進一步之實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：7中所列出之胺基酸序列的VH區及含有SEQ ID NO：12中所列出之胺基酸序列的VL區。

於一些實施態樣中，該MMP9結合蛋白，例如結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段係在醫藥組成物中。

於某些實施態樣中，該MMP9結合蛋白抑制MMP9之酶活性。於某些實施態樣中，該酶活性之抑制作用為非競爭性的。

於某些實施態樣中，該投予個體之結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段、或其醫藥組成物的劑量為約25mg至約800g。於一些實例中，該投予個體之結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段、或其醫藥組成物的劑量為在一週、兩週或三週之期間內，或每週、每兩週或每三週投予一次約200mg、約300mg、或約400mg。於某些實施態樣中，該投予個體之結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段的劑量為每兩週約400毫克。於某些實施態樣中，該投予個體之結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段的劑量為每兩週約200mg。於一些實施態樣中，該投予個體之結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段係在二步驟程序中投予個體：第一步驟，裝載劑量階段(更頻繁地給藥以涵蓋與該疾病相關之MMP9的“目標擊沈裝藥量”或高基線濃度，其中該給藥範圍為在一、二或三週之期間內每週 投予個體約200mg、約300毫克、或約400mg之劑量，或更頻繁地給藥以涵蓋與該疾病相關之MMP9的“目標擊沈裝藥量”或高基線濃度)及第二步驟，在裝載劑量階段後一旦已建立可預測之pK值後，則降低每週劑量，諸如150、125、100或50mg/週。於一些實施態樣中，該較低之每週劑量可在每週之基礎上(例如150、125、100或50mg/週)降低。於一些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段之投予劑量為約100mg、150mg、200mg、300mg或400mg。

於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段、或其醫藥組成物係在一週、兩週或三週之期間內投予，或每週、每兩週或每三週投予一次。於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段、或其醫藥組成物係經由靜脈內、皮內或皮下途徑投予。於一實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、或其組成物或醫藥調製劑係經由皮下途徑投予。於其他實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、或其組成物或醫藥調製劑係經由靜脈內途徑投予。

某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段、或其醫藥組成物係以單一療法之形式單獨投予。於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段、或其醫藥組成物係與一或多種用於治療COPD之其他治療劑組合，以該組合療法之一部分的形式投予。該用於治療COPD之治療劑包括，但不限於：1) 短效β 2促效劑(諸如，例如沙丁胺醇(salbutamol)(舒喘寧(albuterol))、左沙丁胺醇(levalbuterol)、非諾特羅(fenoterol)、特布他林(terbuta1ine))，2)短效抗膽鹼能劑(諸如，例如異丙托溴銨(ipratropium bromide)、氧托溴銨(oxitropium bromide))，3)長效β 2促效劑(諸如，例如福莫特羅(formoterol)、阿福莫特羅(arfomoterol)、茚達特羅(indacaterol)、沙美特羅(salmeterol)、妥洛特羅(tulobuterol))，4)長效抗膽鹼能劑(諸如，例如阿地溴銨(aclidinium brormide)、格隆溴銨(glycopyrronium bromide)、噻托溴銨(tiotropium))，5)組合短效β 2促效劑加抗膽鹼能劑(諸如，例如非諾特羅/異丙托、沙丁胺醇/異丙托銨，6)吸入型皮質類固醇(諸如，例如倍氯米松(beclomethasone)、布地奈德(budesonide)、氟替卡松(fluticasone)，7)組合長效β 2促效劑加皮質類固醇(諸如，例如福莫特羅/布地奈德、福莫特羅/莫米松(mometasone)、沙美特羅/氟替卡松)，8)甲基黃嘌呤(諸如，例如胺茶鹼(aminophylline)、茶鹼(theophylline))，9)磷酸二酯酶-4抑制劑(諸如，例如羅氟司特(roflumilast))，10)系統性皮質類固醇(諸如，例如強的松(prednisone)、甲基強的松龍(methylprednisolone))。該一或多種其他治療劑可與該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段同時或依序投予。於一實施態樣中，該MMP9抗體或其抗原結合片段可與選 自由下列所組成之群組的治療劑組合：短效β 2促效劑、短效抗膽鹼能劑、長效β 2促效劑、長效抗膽鹼能劑及彼等之組合。抗MMP9抗體或其抗原結合片段與該一或多種治療劑之任何組合均可與β 2促效劑、抗膽鹼能劑、吸入型皮質類固醇、系統性皮質類固醇、甲基黃嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制劑，或彼等之組合進一步組合。

於某些實施態樣中，該個體具有慢性支氣管炎、肺氣腫、或此二者。於某些實施態樣中，該個體已被診斷罹患COPD。於某些實施態樣中，該個體已經由全球慢性阻塞性肺病倡議組織(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease)(GOLD)指導方針被診斷罹患COPD至少6個月。於一些實施態樣中，該個體在吸入支氣管擴張劑後之第1秒的用力吐氣量(FEV₁)≧40%預測值。於一些實施態樣中，該個體在吸入支氣管擴張劑後之第1秒的用力吐氣量(FEV₁)≧40%和≦80%預測值。於一些實施態樣中，該個體在30天之內的COPD用藥沒有改變。於其他實施態樣中，該個體被診斷患有慢性支氣管炎、肺氣腫、或慢性阻塞性肺病在一年中病情加重一次、二次或更多次。於一實施態樣中，該個體在施用本申請案之治療前被診斷出COPD在一年內病情加重二次或更多次且肺功能降低。

於某些實施態樣中，該個體不具有臨床上顯著之活躍感染。於某些實施態樣中，該個體不具有陽性QuantiFERON-TB GOLD測試結果。於某些實施態樣中， 該個體不具有任何嚴重之心臟事件，諸如心肌梗塞、不穩定或危及生命之心律不整、在6個月內因心臟衰竭住院或任何明顯或新的心電圖(ECG)發現。於某些實施態樣中，該個體在前6個月內未曾因呼吸事件住院，例如，但不限於COPD、肺炎、支氣管炎。於某些實施態樣中，該個體不具有除了COPD外之慢性肺病(諸如：哮喘、囊性纖維化或纖維化疾病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、間質性肺病、肺血栓栓塞性疾病或支氣管擴張)。於某些實施態樣中，該個體在90天之內未表現出長期使用系統性皮質類固醇及/或因COPD急性發作(AECOPD)事件或其他不需要住院之醫療狀況以系統性皮質類固醇治療。於某些實施態樣中，該個體未曾在隨機化之90天內因AECOPD事件或其他不需要住院之醫療狀況以抗生素治療，或在14天內未曾以抗生素治療甚至不需要住院的任何輕微的醫療事件。於某些實施態樣中，該個體在任何銷售或研究之生物分子的5個半衰期內，或者若不知道，在90天內，未曾以任何銷售或研究之生物分子治療。於某些實施態樣中，該個體目前在90天內未接受非生物免疫調節劑藥物(諸如：硫唑嘌呤(azathioprine)、環孢黴素(cyclosporine)、羥氯喹(hydroxychloroquine)、來氟米特(leflunomide)、甲胺蝶呤(methotrexate)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、托法替尼(tofacitinib))。

應理解的是，本文所描述之各種實施態樣的 一、一些或所有特性均可組合以形成本發明之其他實施態樣。本發明之這些及其他態樣對熟習本技術之人士將變得顯而易知。本發明之這些及其他實施態樣藉由下列詳細描述進一步說明。

第1圖顯示經比對之老鼠單株抗MMP9抗體(AB0041)之重鏈可變區的胺基酸序列及重鏈之人化變體(VH1-VH4)的胺基酸序列，以顯示由人化造成之框構胺基酸序列中的差異。CDR以斜體字顯示，而下方劃線的為與母小鼠單株抗體相比較，在人化變體中不同的胺基酸。

第2圖顯示經比對之老鼠單株抗MMP9抗體(AB0041)之輕鏈可變區的胺基酸序列及此輕鏈之人化變體(VH1-VH4)的胺基酸序列，以顯示由人化造成之框構胺基酸序列中的差異。CDR以斜體字顯示，而下方劃線的為與母小鼠單株抗體相比較，在人化變體中不同的胺基酸。

第3圖顯示MMP9蛋白之示意圖。

第4圖顯示命名為AB0041、M4和M12之抗體的重鏈和輕鏈之胺基酸序列之間的比較。

除非另有說明，本發明之實行係採用細胞生 物學、毒理學、分子生物學、生物化學、細胞培養、免疫學、腫瘤學、重組DNA之領域及本技術之技術的相關領域內的標準方法及習知技術。這類技術描述於文獻中，從而可被熟習本技術之人士所用。參見，例如Alberts,B.et al.,“Molecular Biology of the Cell”第5版，Garland Science,New York,NY,2008；Voet,D.et al.“Fundamentals of Biochemistry：Life at the Molecular Level”第3版，John Wiley & Sons,Hoboken,NJ,2008；Sambrook,J.et al.,“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001；Ausubel,F.et al.,“Current Protocols in Molecular Biology,”John Wiley & Sons,New York,1987及定期更新版本；Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique”第4版，John Wiley & Sons,Somerset,NJ,2000；及“Methods in Enzymology”系列，Academic Press,San Diego,CA。亦參見，例如“Current Protocols in Immunology”(R.Coico，系列編輯)，Wiley，上次更新2010年8月。

某些MMP之異常活性在腫瘤生長、轉移、發炎、自身免疫及血管疾病中具有作用。參見，例如Hu et al.(2007)Nature Reviews：Drug Discovery 6：480-498。於某些治療設置中，抑制一或多種MMP之活性可能是理想的。然而，某些其他MMP，例如MMP2之活性對正常功能及/或防止疾病而言常有需要。由於大多數MMP抑制 劑係針對保守之催化性結構域，因此，使用現有之MMP抑制劑抑制許多不同MMP時，由於對必要、非致病上相關之MMP的抑制，因而已引起副作用。這些副作用亦可能係由於由許多這些抑制劑所引起之普遍的鋅螯合作用，包括更廣泛地抑制需要鋅的酶。

與發展特異於特定MMP或選定之MMP的抑制劑相關的挑戰係與經由基質競爭機制來抑制酶活性通常需要將該抑制劑瞄準催化性結構域的事實有關。MMP催化性結構域中之同源性可引起抑制劑與多於一種之MMP反應。所提供之實施態樣中有作用劑，包括治療劑，諸如特異抑制單一MMP或選定之多種MMP(諸如MMP9)的催化活性且不會與某些其他MMP或任何其他MMP反應或抑制彼等之抗體及其抗原結合片段。所提供之實施態樣中亦有用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)之方法及彼等之用途。於某些實施態樣中，本發明之MMP9結合蛋白結合至一般大催化性結構域，但並不在受質袋中結合且似乎係經由其他，變構(allosteric)機制作用(例如，本發明之MMP9結合蛋白不與受質競爭結合，且獨立地抑制受質的存在或受質濃度)。

本文提供用於治療或預防個體中之慢性阻塞性肺病(COPD)的方法，其包含投予個體有效量之包含免疫球蛋白重鏈多肽或其功能性片段，及免疫球蛋白輕鏈多肽或其功能性片段的基質金屬蛋白酶9(MMP9)結合蛋白，其中該MMP9結合蛋白特異結合至MMP9。本文亦 提供用於治療或預防COPD之組成物，其中該組成物包含含有免疫球蛋白重鏈多肽或其功能性片段，及免疫球蛋白輕鏈多肽或其功能性片段的基質金屬蛋白酶9(MMP9)結合蛋白，其中該MMP9結合蛋白特異結合至MMP9。本發明亦提供基質金屬蛋白酶9(MMP9)結合蛋白於製造用於治療或預防COPD之藥物的用途，其中該MMP9蛋白包含免疫球蛋白重鏈多肽或其功能性片段，及免疫球蛋白輕鏈多肽或其功能性片段，且其中該MMP9結合蛋白特異結合至MMP9。本文所描述之任何MMP9結合蛋白(例如結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段)可用於本文所描述之方法中。

除非另外指明，如本文所使用之單數形式“一(a、an)”及“該(the)”包括複數引用。

本文之數值或參數引用“約”時係指本技術領域中之技術熟習人士很容易知道之相應值的通常誤差範圍。本文中之數值或參數引用“約”時包括(及描述)針對該數值或參數本身的態樣。例如，引用“約X”之描述包括“X”之描述。於某些實施態樣中，術語“約”包括該指定之量±1%至10%。於其他實施態樣中，術語“約”包括指定之量±5%。於某些其他實施態樣中，術語“約”包括指定之量±1%。於某些其他實施態樣中，術語“約”包括指定之量±10%。

可理解的是，本文所描述之本發明的態樣和實施態樣包括“包含”、“由...組成”及“基本上由...組成”態 樣和實施態樣。

本文所引用之所有參考文獻(包括專利申請案和出版物)之全部內容以引用方式納入本文。

MMP9結合蛋白

MMP9降解基底膜膠原蛋白及其他胞外基質(ECM)組分。Kessenbrock K,et al.,“Matrix metalloproteinases：regulators of the tumor microenvironment.”Cell 2010；141(1)：52-67。基質降解促成多種疾病，包括關節炎、癌症及潰瘍性結腸炎之病理學。RoyR,et al.,“Matrix metalloproteinases as novel biomarkers and potential therapeutic targets in human cancer.”J Clin Oncol 2009；27(31)：5287-97。廣譜基質金屬蛋白酶抑制劑，諸如馬立馬司他(Marimastat)在炎症及癌症之動物模型中有效(Watson SA,et al.,“Inhibition of tumour growth by marimastat in a human xenograft model of gastric cancer：relationship with levels of circulating CEA.” Br J Cancer 1999；81(1)：19-23；Sykes AP,et al.,“The effect of an inhibitor of matrix metalloproteinases on colonic inflammation in a trinitrobenzenesulphonic acid rat model of inflammatory bowel disease.”Aliment Pharmacol Ther 1999；13(11)：1535-42)。然而，該類泛抑制劑可以引起肌肉骨骼副作用，包括手、臂和肩膀之關節僵硬、發炎及疼痛，統稱為 肌肉骨骼症候群(MSS)，通常係在或接近馬立馬司他在人體中之有效劑量水準。Peterson JT.“The importance of estimating the therapeutic index in the development of matrix metalloproteinase inhibitors.”Cardiovasc Res 2006；69(3)：677-87； Tierney GM,et al.“A pilot study of the safety and effects of the matrix metalloproteinase inhibitor marimastat in gastric cancer.”Eur J Cancer 1999；35(4)：563-8；Wojtowicz-Praga S,et al.“Phase I trial of Marimastat,a novel matrix metalloproteinase inhibitor,administered orally to patients with advanced lung cancer.”J Clin Oncol 1998；16(6)：2150-6。該症狀為劑量和時間依賴性，且在停止以泛MMP抑制劑治療後不久可逆轉。Wojtowicz-Praga S,1998；Nemunaitis J,et al.,“Combined analysis of studies of the effects of the matrix metalloproteinase inhibitor marimastat on serum tumor markers in advanced cancer：selection of a biologically active and tolerable dose for longer-term studies.”Clin Cancer Res 1998；4(5)：1101-9；Hutchinson JW et al.,“Dupuytren’s disease and frozen shoulder induced by treatment with a matrix metalloproteinase inhibitor.”The Journal of bone and joint surgery.British volume 1998；80(5)：907-8。馬立馬司他及其他同類別之泛MMP抑制劑為鋅螯合劑。Peterson JT,2006。純合子型MMP9基因剔除小鼠顯示出無MSS樣症狀或MSS樣組織變化。Vu TH,et al.,“MMP-9/gelatinase B is a key regulator of growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes.” Cell 1998；93(3)：411-22。

本發明提供結合蛋白，例如結合至基質金屬蛋白酶-9(MMP9)蛋白(MMP9亦稱為明膠酶B)，例如人MMP9(諸如具有如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28中所列之胺基酸序列的人MMP9)之抗體及其片段(例如抗原結合片段)。本發明之結合蛋白通常包含免疫球蛋白(Ig)重鏈(或其功能片段)及Ig輕鏈(或其功能片段)。

本發明進一步提供特異結合至MMP9，而不結合其他基質金屬蛋白酶，諸如MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12及MMP13之MMP9結合蛋白。因此，這類特定之MMP9結合蛋白通常不會顯著或可檢測地與非MMP9基質金屬蛋白酶交叉反應。特異結合至MMP9之MMP9結合蛋白可用於其中需要或期望特異調節(例如抑制)MMP9的應用中，例如不直接影響其他基質金屬蛋白酶之活性。

於本發明之某些實施態樣中，抗MMP9抗體為MMP9活性之抑制劑，且可為MMP9之特異抑制劑。尤其是，本文所揭示之MMP9結合蛋白將可用於抑制MMP，同時允許其他相關基質金屬蛋白酶之正常功能。“MMP9之抑制劑”或“MMP9活性之抑制劑”可為直接或間接抑制MMP9之活性的抗體或其抗原結合片段，包括，但 不限於酶性加工、抑制MMP9在其受質上之作用(例如經由抑制受質結合、受質裂解，等)及類似作用。

於一些實施態樣中，如本文之實施例中所證明者，鑑於以泛MMP抑制劑，諸如小分子泛抑制劑(諸如馬立馬司他)治療會導致肌肉骨骼疾病之症狀，諸如肌肉骨骼症候群(MSS)，包括對步態、姿勢和移動意願的實質影響，及對關節之深刻的組織學損傷，特異抑制MMP9，諸如本申請案中之抗體或其抗原結合片段，不會引起這類症狀，且不誘導MSS。

本發明亦提供特異結合非小鼠MMP9(諸如人MMP9、食蟹猴MMP9及大鼠MMP9)之MMP9結合蛋白。

本發明亦提供作為非競爭性抑制劑之MMP9結合蛋白(例如抗MMP9抗體及其功能片段)。“非競爭性抑制劑”係指結合至遠離酶之受質結合部位的部位，因而可結合至酶且無論該酶是否與其受質結合均可使抑制活性生效之抑制劑。這類非競爭性抑制劑可，例如提供可實質上無關於受質濃度之抑制水準。

本發明之MMP9結合蛋白(例如抗體及其功能片段)包括那些結合至MMP9(尤其是人MMP9)且其重鏈多肽(或其功能性片段)與本文所揭示之重鏈多肽具有至少約80%、85%、90%、95%或更高之胺基酸序列同一性的MMP9結合蛋白。於一些實例中，本發明之MMP9結合蛋白(例如抗體及其功能片段)包括那些結合至 MMP9(尤其是人MMP9)且其重鏈多肽(或其功能性片段)與本文所揭示之重鏈多肽具有至少約90%、95%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的MMP9結合蛋白。

本發明之MMP9結合蛋白(例如抗體及其功能片段)包括那些結合至MMP9(尤其是人MMP9)且其輕鏈多肽(或其功能性片段)與本文所揭示之重鏈多肽具有至少約80%、85%、90%、95%或更高之胺基酸序列同一性的MMP9結合蛋白。本發明之MMP9結合蛋白包括那些結合至MMP9(尤其是人MMP9)且其輕鏈多肽(或其功能性片段)與本文所揭示之輕鏈多肽具有至少約80%、85%、90%、95%或更高之胺基酸序列同一性的MMP9結合蛋白。於一些實例中，本發明之MMP9結合蛋白包括那些結合至MMP9(尤其是人MMP9)且其輕鏈多肽(或其功能性片段)與本文所揭示之輕鏈多肽具有至少約90%、95%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的MMP9結合蛋白。

本發明之MMP9結合蛋白(例如抗體及其功能性片段)包括那些結合至MMP9(尤其是人MMP9)且具有之重鏈多肽(或其功能性片段)具有如本文所揭示之重鏈多肽的互補決定區(“CDR”)並具有如本文所揭示之輕鏈多肽(或其功能性片段)的CDR之MMP9結合蛋白。

在核酸及多肽之背景下，本文所使用之“同源 性”或“同一性”或“相似性”係指兩種多肽或兩種核酸分子之間基於胺基酸序列或核酸序列比對之關係。同源性及同一性可各自藉由比較各序列中可用於比較目的而進行比對之位置來測定。當被比較之序列中的等效位置被相同鹼基或胺基酸佔據時，則該分子在該位置上是完全相同的；當該等效部位被相同或類似之胺基酸殘基(例如空間及/或電子性質類似)佔據時，則該等分子在該位置處可稱為同源(類似)。以同源性/相似性或同一性之百分比表示係指在相比較之序列所共有的位置處之完全相同或相似胺基酸數目之函數。在比較兩種序列時，殘基(胺基酸或核酸)不存在或出現額外之殘基亦降低同一性和同源性/相似性。

如本文所使用之“同一性”係指當比對序列以將序列匹配最大化(即，考慮間隙和插入)時，在二或多個序列之對應位置上之完全相同的核苷酸或胺基酸殘基的百分比。序列通常係在一個指定的區域(例如長度為至少約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更多個胺基酸或核苷酸的區域且可高達該參考胺基酸或核苷酸之全長)內比對最大對應性。在序列比較方面，通常將一個序列作為參考序列，將測試序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入電腦程式，若需要時，指定序列坐標並指定序列算法程式參數。然後，該序列比較算法根據指定之程式參數計算該測試序列相對於參考序列之序列同一性百分比。

適合用於測定序列同一性百分比之算法的實例有BLAST及BLAST 2.0算法，其分別描述於Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中。用於執行BLAST分析之軟體可透過國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov)公開取得。進一步之示例性算法包括ClustalW(Higgins D.,et al.(1994)Nucleic Acids Res 22：4673-4680)，其可在www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html取得。

不完全相同之殘基位置可以因保守性胺基酸取代而有不同。保守性胺基酸取代係指具有相似側鏈之殘基的可互換性。例如，具有脂族側鏈之胺基酸群組為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸和異自胺酸；具有脂族-羥基側鏈之胺基酸群組為絲胺酸和蘇胺酸；具有含有醯胺之側鏈的胺基酸群組為天門冬醯胺及麩胺醯胺；具有芳香族側鏈之胺基酸群組為苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸；具有鹼性側鏈之胺基酸群組為賴胺酸、精胺酸及組胺酸；而具有含硫側鏈之胺基酸群組為半胱胺酸和甲硫胺酸。

兩個核酸之間的序列同一性亦可就兩個分子在嚴格條件下彼此雜交來描述。該雜交條件係依照本技術之標準方法選擇(參見，例如Sambrook,et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)。嚴格雜交條件之實例為在50 ℃或更高之溫度及0.1×SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)雜交。嚴格雜交條件之另一實例為在42℃及溶液：50%甲醯胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚醣及20mg/ml變性、剪切之鮭魚精子DNA中培育過夜，接著在約65℃，在0.1×SSC中清洗該過濾器。嚴格雜交條件為至少與上述代表性條件一樣嚴格之雜交條件，其中之條件被認為至少約80%，通常為至少90%，與上述之特殊嚴格條件一樣嚴格。

因此，本發明提供，例如抗體或其抗原結合片段，其包含與本文所描述之重鏈可變區之胺基酸序列(例如SEQ ID NO：1或5-8)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的重鏈可變區多肽，及與本文所列出之輕鏈多肽的胺基酸序列(例如SEQ ID NO：2或9-12)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的可變輕鏈多肽。於一實施態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：7中所列出之重鏈可變區之胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的重鏈可變區多肽，及與SEQ ID NO：12中所列出之輕鏈多肽的胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的可變輕鏈多肽。於進一步之實例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：32、40或47中所列出之重鏈可變區之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的重鏈可變區多肽，及與SEQ ID NO：33、41或48中所列出之輕鏈多肽的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的可變輕鏈多肽。於一些實施態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：32、40或47中所列出之重鏈可變區之胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的重鏈可變區多肽，及與SEQ ID NO：33、41或48中所列出之輕鏈多肽的胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高之胺基酸序列同一性的可變輕鏈多肽。於進一步之實施態樣中，本申請案提供可競爭結合至蛋白質或抗體之抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：7、12、13、14、15、16、17或18中所列出之胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高之同一性的胺基酸序列。

本發明之抗MMP9抗體的實例更詳細地描述於下文中。

抗體

MMP9結合蛋白包括抗體及其功能片段，諸如那些特異結合至MMP9者。如本文所使用之術語“抗體”意指包含特異結合至抗原性表位之肽序列(例如可變區序 列)的經分離或重組之多肽結合劑。該術語係以其最廣泛的含義使用且具體涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、人抗體、人化抗體、嵌合型抗體、奈米抗體、雙鏈抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，包括，但不限於Fv、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)₂及Fab₂，只要其展現出期望之生物學活性。術語“人抗體”係指除了可能有非人CDR區之外，含有人來源之序列的抗體，且並不意味存有免疫球蛋白分子之全部結構，惟該抗體在人體中具有最低之致免疫效果(即，不會誘導針對其本身的抗體製造)。

“抗體片段”包含全長抗體之一部分，例如全長抗體之抗原結合或可變區。這類抗體片段在本文中亦可稱為“功能性片段”或“抗原結合片段”。抗體片段之實例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂及Fv片段；雙鏈抗體；線性抗體(Zapata et al.(1995)Protein Eng. 8(10)：1057-1062)；單鏈抗體分子；及從抗體片段形成之多特異性抗體。木瓜蛋白酶分解抗體可產生兩個完全相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，其各自具有單一抗原結合部位及殘基“Fc”片段，此命名反映其易於結晶化之能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合部位且仍能夠交聯抗原之F(ab’)₂片段。

“Fv”為含有完整抗原識別及抗原結合部位之最小抗體片段。此區係由緊密，非共價結合之一個重鏈可變結構域及一個輕鏈可變結構域的二聚體所組成。此構形 中，各可變結構域之三個互補決定區(CDR)相互作用以在V_H-V_L二聚體表面上界定抗原結合部位。總結來說，該六個CDR賦予該抗體抗原結合特異性。然而，即使是單一可變結構域(或僅包含該特異於一抗原的六個CDR中之三個CDR的經分離之V_H或V_L區)為具有識別及結合抗原的能力，儘管一般來說係以較該整個F_v片段低之親和力結合。

除了重鏈和輕鏈可變區外，該“F_ab”片段亦含有輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH₁)。Fab片段最初係在以木瓜蛋白酶分解抗體之後觀察到。Fab’片段與Fab片段之不同處在於F(ab’)片段之重鏈CH₁結構域的羧基端含有數個額外的殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。F(ab’)₂片段在鉸鏈區附近含有二個藉由二硫鍵連接的Fab片段，且最初係在木瓜蛋白酶分解抗體之後觀察到。Fab’-SH在本文中為其中該恆定結構域之半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基之Fab片段的命名。其他抗體片段之化學偶聯亦為已知。

來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據其恆定結構域之胺基酸序列被分配到兩種完全不同的類型(稱為κ和λ)的其中之一。根據其重鏈恆定結構域之胺基酸序列，免疫球蛋白可被分配成五種主要的類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，這些中有幾種可進一步被分成子類別(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

“單鏈Fv”或“sFv”或“scFv”抗體片段包含抗體之V_H和V_L結構域，其中這些結構域係存在於單一多肽鏈中。於一些實施態樣中，該F_v多肽在V_H和V_L結構域之間進一步包含多肽連接子，其使sFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。對於sFv之綜述，參見Pluckthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113(Rosenburg and Moore eds.)Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中。

術語“雙鏈抗體”係指具有兩個抗原結合部位之小抗體片段，該片段包含連接至同一多肽鏈(V_H-V_L)中之輕鏈可變結構域(V_L)的重鏈可變結構域(V_H)。經由使用太短而無法容許在相同鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，該結構域被迫與另一條鏈之互補結構域配對，從而創建兩個抗原結合部位。雙鏈抗體另外描述在，例如EP 404,097；WO 93/11161及Hollinger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中。

“經分離的”抗體為已經鑑定且自其天然環境之組分中分離及/或回收之抗體。其天然環境之組分可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性之溶質。於一些實施態樣中，經分離之抗體係經純化至(1)當藉由Lowry法測定時純化百分比超過抗體之95重量%，例如超過99重量%，(2)純化程度足以取得N-端或內部胺基酸序列之至少15個殘基，例如經由使用旋轉杯式測序儀測定，或(3)藉由考馬斯藍或銀染色檢測時，在還原或非還原 條件下藉由凝膠電泳(例如SDS-PAGE)時達到同質。術語“經分離之抗體”包括在重組細胞內之原位抗體，因為該抗體之天然環境將有至少一種組分不存在。於某些實施態樣中，經分離之抗體係藉由至少一個純化步驟來製備。

如本文所使用之“免疫反應性”係指特異於胺基酸殘基之序列(“結合部位”或“表位”)的抗體或其片段，但若可與其他肽/蛋白質交叉反應時，彼等在被配製成用於投予人類使用的水準下不具有毒性。“表位”係指能與抗體或其抗原結合片段形成結合交互作用的抗原部分。表位可為線性肽序列(即“連續的”)，或可由非連續胺基酸序列所組成(即，“構型的”或“不連續”)所組成。術語“優先結合”意指該結合劑結合至該結合部位之親合力大於其結合至不相關之胺基酸序列的親合力。

抗MMP9抗體可就該重鏈和輕鏈之CDR來說明。如本文所使用之術語“CDR”或“互補決定區”意指在重鏈和輕鏈多肽二者之可變區中所發現的非連續抗原結合部位。這些特殊區已描述在Kabat et al.,J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；及MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262：732-745(1996)中，其中該定義包括當相互比較時重疊之胺基酸殘基或胺基酸殘基子集。然而，應用任一定義來指稱抗體或接枝抗體或其變體之CDR係意圖包含 在如本文所定義及使用之術語的範圍內。包含由上述引用之參考文獻所各自定義之CDR的胺基酸殘基列於下列表1A中以作為比較。

當參考抗體可變區使用時，如本文所使用之術語“框構”意指在抗體可變區中之CDR區外的所有胺基酸殘基。可變區框構通常為長度在約100至120個胺基酸的不連續胺基酸序列，但僅意圖指那些在CDR外之胺基酸。如本文所使用之術語“框構區”意指藉由CDR分開之各框構結構域。

於一些實施態樣中，抗體為人化抗體或人抗體。人化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自該受體之互補決定區(CDR)之殘基被具有所需特異性、親和力和能力之來自非人物種(供體抗體)，諸如小鼠、大鼠或兔的CDR之殘基所取代。因此，非人(例如鼠)抗體之人化形式為含有源自非人免疫球蛋白之最小序列的 嵌合型免疫球蛋白。該非人序列主要位於可變區，尤其是互補決定區(CDR)中。於一些實施態樣中，人免疫球蛋白之Fv框構殘基被對應之非人殘基所取代。人化抗體亦可包含既未存在於受體抗體中，亦不存在於引入之CDR或框構序列中的殘基。於某些實施態樣中，人化抗體基本上包含至少一個，通常兩個可變結構域的全部，其中所有或基本上所有CDR對應於非人免疫球蛋白之CDR且全部或基本上全部之框構區為人免疫球蛋白共有序列之框構區。在本發明之目的方面，人化抗體亦可包含免疫球蛋白片段，諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或抗體之其他抗原結合子序列。

人化抗體亦可包含至少一部分之免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常為人免疫球蛋白之Fc。參見，例如Jones et al.(1986)Nature 321：522-525；Riechmann et al.(1988)Nature 332：323-329；及Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

用於人化非人抗體之方法為本技術所已知。一般而言，人化抗體具有來自非人來源之被導入其中的一或多個胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常常被稱為“輸入”或“供體”殘基，其通常自“輸入”或“供體”可變結構域取得。例如，人化可基本上根據Winter及同事之方法，以囓齒類CDR或CDR序列取代人抗體之對應序列來進行。參見，例如Jones等人，同上；Riechmann等人，同上；及Verhoeyen et al.(1988)Science 239：1534-1536。因此， 這類“人化”抗體包括嵌合型抗體(美國專利案第4,816,567號)，其中基本上少於一個完整的人類可變區被來自非人物種之對應序列所取代。於某些實施態樣中，人化抗體為其中一些CDR殘基及可選擇地，一些框構區殘基被來自囓齒動物抗體(例如鼠單株抗體)中類似部位之殘基所取代。

人抗體亦可，例如經由使用噬菌體顯示庫來製造。Hoogenboom et al.(1991)J.Mol.Biol,227：381；Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222：581。其他用於製備人單株抗體之方法描述於Cole et al.(1985)“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,”Alan R.Liss,p.77及Boerner et al.(1991)J.Immunol.147：86-95中。

人抗體可經由將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物(例如小鼠)中來製造，在該轉基因動物中之內源性免疫球蛋白基因已被部分或完全去活化。在免疫挑戰時，觀察到人抗體產生，這在所有方面都非常類似於在人體中所發現者，包括基因重排、組裝及全套抗體。此方法描述於，例如美國專利案號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5661016，及下列科學出版物中：Marks et al.(1992)Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.(1994)Nature 368：856-859；Morrison(1994)Nature 368：812-813；Fishwald et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；Neuberger(1996)Nature Biotechnology 14：826；及Lonberg et al. (1995)Intern.Rev.Immunol. 13：65-93。

使用如上述之已知的選擇及/或誘變方法可使抗體為親和力成熟。於一些實施態樣中，親和力成熟之抗體的親和力為用於製備該成熟抗體之起始抗體(一般為小鼠、兔，雞、人化或人抗體)之親和力的5倍或更高、10倍或更高、20倍或更高、或30倍或更高。

抗體亦可為雙特異性抗體。雙特異性抗體為單株抗體，且可為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之人或人化抗體。在本情況下，該兩種不同的結合特異性可針對兩種不同MMP或在單一MMP(例如MMP9)上之兩個不同的表位。

本文所揭示之抗體亦可為免疫軛合物(immunoconjugate)。此類免疫軛合物包含與第二種分子(諸如報告子)共軛結合之抗體(例如針對MMP9之抗體)。免疫軛合物亦可包含與細胞毒性劑，諸如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射活性同位素(即，放射軛合物)共軛結合之抗體。

“特異結合”或為“特異於”特定多肽或表位之抗體係指該抗體選擇性結合標靶抗原或表位；這些術語及用於測定特異性結合之方法為本技術所熟知。若抗體以較與其他物質結合之更強的親和力、活動性、更容易及/或更長的持續時間與標靶抗原或表位結合，則該抗體表現出“特異結合”該特定之標靶抗原或表位。於一些實施態樣 中，該特異結合多肽或表位之抗體為結合特定之多肽或表位，而基本上不會結合任何其他多肽或多肽表位之抗體。於一些實施態樣中，所提供之抗體以等於或低於100nM(可選擇地低於10nM、可選擇地低於1nM、可選擇地低於0.5nM、可選擇地低於0.1nM、可選擇地低於0.01nM、可選擇地低於0.005nM)之解離常數(K_d)特異結合人MMP9，於某些實例中，在約4℃、25℃、37℃或42℃的溫度下測量時，為單株抗體、scFv、Fab之形式，或其他形式之抗體係以介於0.1和0.2nM之間或介於0.1和10pM之間(例如介於0.4和9pM之間，諸如介於0.4和8.8pM之間)的解離常數特異結合。

於某些實施態樣中，本發明之抗體結合至MMP9中之一或多個加工部位(例如蛋白水解裂解部位)，從而有效地阻斷酶原或前酶原被處理成催化活性酶，因此可降低該MMP9之蛋白水解活性。

於某些實施態樣中，根據本發明之抗體以高於對另一MMP之結合親和力至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、或至少1000倍的結合親和力結合至MMP9。結合親和力可藉由本技術中已知之任何方法進行測量，並可以，例如結合加速速率、解離速率、解離常數(K_d)、平衡常數(K_eq)或本技術中任何術語表示。

於某些實施態樣中，根據本發明之抗體為抑制MMP9之酶(即，催化)活性的抗體，諸如MMP9之 催化活性的非競爭性抑制劑。於某些實施態樣中，根據本發明之抗體係結合至MMP9之催化結構域內部。於另外之實施態樣中，根據本發明之抗體係結合至MMP9之催化結構域外部。

本發明亦提供與本文中所描述之任何一或多種抗MMP9抗體或其抗原結合片段競爭結合至MMP9的抗體或其抗原結合片段。因此，本發明構想與，例如具有SEQ ID NO：1或5-8之任一序列的重鏈多肽、SEQ ID NO：2或9-12之任一序列的輕鏈多肽或彼等之組合的抗體競爭結合的抗MMP9抗體及其功能片段。於一實施態樣中，該抗MMP9抗體或其功能性片段與本文所描述之抗體，如AB0041競爭結合至人MMP9。於一些實施態樣中，該抗MMP9抗體或其功能性片段與本文所描述之抗體，如AB0045競爭至結合人MMP9。於某些實施態樣中，該抗MMP9抗體或其功能性片段與本文所描述之抗體，如AB0046競爭至結合人MMP9。於另外之實施態樣中，該抗MMP9抗體或其功能性片段與本文所描述之抗體，如M4競爭至結合人MMP9。於其他實施態樣中，該抗MMP9抗體或其功能性片段競爭與本文所描述之抗體，如M12競爭至結合人MMP9。

本發明亦提供結合至與本文中所描述之任何一或多種抗體所結合者相同之表位，例如MMP 9表位的抗體或片段。本發明亦提供特異結合至MMP9之表位的抗體和片段，其中該MMP9之表位包括在MMP9之特定區 域內或MMP9之多個區域內的胺基酸殘基。本發明進一步提供競爭結合至與本文中所描述之表位或區域結合之蛋白質或抗體的抗MMP9抗體或其抗原結合片段。這類區域可包括，例如MMP9之結構環及/或其他結構域，諸如那些顯示出對與本文所描述之示例性抗體結合很重要者。通常，該區域係根據全長MMP9序列，例如SEQ ID NO：27上之胺基酸殘基位置定義。於一些實例中，該表位含有SEQ ID NO：27之胺基酸殘基104-202。於一實例中，該表位含有在SEQ ID NO：27之殘基104-119、殘基159-166、殘基191-202之區域內的胺基酸殘基(即，一或多個胺基酸殘基)。於一些態樣中，該表位包括在SEQ ID NO：27之殘基104-119的MMP9之區域內的胺基酸殘基(即，一或多個胺基酸殘基)、在SEQ ID NO：27之殘基159-166的MMP9之區域內的胺基酸殘基、在SEQ ID NO：27之殘基191-202的MMP9之區域內的胺基酸殘基。於一些情況中，該表位包括SEQ ID NO：27之E111、D113、R162或I198。於一些情況中，其包括SEQ ID NO：27之R162。於一些情況中，其包括SEQ ID NO：27之E111、D113、R162及I198。

MMP9序列

人MMP9蛋白之胺基酸序列如下： (SEQ ID NO：27)

蛋白質結構域顯示於第3圖中之示意圖中並指明於下文中：

成熟之全長人MMP9的胺基酸序列(其為無信號肽之SEQ ID NO：27的前導多肽之胺基酸序列) 為： (SEQ ID NO：28)

該信號肽之胺基酸序列為MSLWQPLVLVLLVLGCCFA(SEQ ID NO：29)。

本發明亦提供MMP9多肽，包括突變MMP9多肽。這類肽可用於，例如生成及選擇如本文所提供之抗體和片段。示例性多肽包括那些具有包含SEQ ID NO：27之殘基111-198的胺基酸序列之多肽，及那些在SEQ ID NO：27之殘基111、113、162、或198處具有胺基酸取代，或在所有這類殘基處具有胺基酸取代之具有包含SEQ ID NO：27的殘基111-198之胺基酸序列的多肽。這類多肽可用於，例如選擇可結合至含有這類殘基之表位的抗體及/或這類MMP9之殘基對彼等之結合作用而言很重要之抗體(諸如本文所描述者)。

本發明構思結合至MMP9(例如人MMP9)之任何部分的MMP9結合蛋白，相對於其他特別令人感興趣之MMP，該MMP9結合蛋白優先結合至MMP9。

抗MMP9抗體及其功能片段可根據本技術中所周知之方法產生。示例性抗MMP9抗體提供於下文中。

小鼠單株抗MMP9抗體

同樣取得對抗人MMP9之小鼠單株抗體。此抗體含有小鼠IgG2b重鏈及小鼠κ輕鏈，並表示為AB0041。

AB0041重鏈之胺基酸序列如下： (SEQ ID NO：1)

該信號序列之下方有劃線，且該IgG2b恆定區之序列以斜體呈現。無信號肽，該AB0041抗體之重鏈具有如SEQ ID NO：58中所列之序列

該AB0041輕鏈之胺基酸序列如下： (SEQ ID NO：2)

該信號序列之下方有劃線，且該κ恆定區之序列以斜體呈現。無信號肽，該AB0041抗體之輕鏈具有如SEQ ID NO：59中所列之序列

下列胺基酸序列包含AB0041之IgG2b重鏈可變區的框構區及互補決定區(CDR)(其CDR下方劃線)： (SEQ ID NO：3)

下列胺基酸序列包含AB0041之κ輕鏈可變區的框構區及互補決定區(CDR)(其CDR下方劃線)： (SEQ ID NO：4)

其他示例性小鼠抗人MMP9抗體(例如M4和M12)描述於本文中。示例性抗小鼠MMP9抗體(AB0046)描述於本文中。於一些實施態樣中係提供這類抗小鼠抗體作為用於測試及評估該MMP9抑制方法(例如本文所提供之治療方法)中之替代抗體的用途。

重鏈變體

AB0041重鏈和輕鏈可變區之胺基酸序列分別經由改變重鏈和輕鏈可變區中之框構區序列來改變。這些序列改變之作用為耗盡人類T細胞表位之抗體，從而降低或取消其在人體中之免疫原性(Antitope，英國Babraham)。

在含有穩定該鉸鏈結構域之S241P胺基酸變化的人IgG4重鏈背景下構建4種重鏈變體(Angal et al.(1993)Molec.Immunol.30：105-108)，並指示為VH1、VH2、VH3及VH4。其框構區及CDR之胺基酸序列如下：

VH1

(SEQ ID NO：5)

VH2

(SEQ ID NO：6)

VH3

(SEQ ID NO：7)

VH4

(SEQ ID NO：8)

第1圖顯示該人化重鏈可變區之胺基酸序列 的比對，且指出在該四種變體之框構區中的胺基酸序列之間的差別。

輕鏈變體

在人κ鏈背景下構建4種輕鏈變體，並表示為Vk1、Vk2、Vk3和Vk4。其框構區及CDR之胺基酸序列如下：

Vk1

(SEQ ID NO：9)

Vk2

(SEQ ID NO：10)

Vk3

(SEQ ID NO：11)

Vk4

(SEQ ID NO：12)

第2圖顯示該人化輕鏈可變區之胺基酸序列的比對，且指出在該四種變體之框構區中的胺基酸序列之間的差別。

以所有可能之成對組合將人化之重鏈和輕鏈組合，以產生多種官能性人化抗MMP9抗體。例如，提供其重鏈可變(VH)區具有SEQ ID NO：3、5、6、7和8 之任一序列中所列之胺基酸序列的抗體；提供其輕鏈可變(VL)區具有SEQ ID NO：4、9、10、11和12之任一序列中所列之胺基酸序列的抗體；和提供其重鏈可變(VH)區具有SEQ ID NO：3、5、6、7和8之任一序列中所列之胺基酸序列且其輕鏈可變(VL)區具有SEQ ID NO：4、9、10、11和12之任一序列中所列之胺基酸序列的抗體，及與這類抗體競爭結合至MMP9之抗體，和與這類抗體具有至少或約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性的抗體。於一實例中，該抗體之一VH區具有與SEQ ID NO：7具有至少或約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性的胺基酸序列，且該抗體之一VL區具有與SEQ ID NO：12具有至少或約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性的胺基酸序列，或者該抗體具有SEQ ID NO：7之VH區及SEQ ID NO：12之VL區。於另外之實例中，該抗體之一VH區具有與SEQ ID NO：7具有至少或約95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性的胺基酸序列。於進一步之實例中，該抗體之一VL區具有與SEQ ID NO：12具有至少或約95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性的胺基酸序列。於一些實例中，該抗體具有SEQ ID NO：7之VH區及SEQ ID NO：12之VL區。

本發明亦提供與本文所揭示之重鏈可變區序列具有75%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、或99%或更高之同源性的另外的重鏈可變區胺基酸序列。此外，本發明亦提供與本文所揭示之輕鏈可變區序列具有75%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、或99%或更高之同源性的另外的輕鏈可變區胺基酸序列。

本發明亦提供與本文所揭示之重鏈可變區序列具有75%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、或99%或更高之序列同一性的另外的重鏈可變區胺基酸序列。此外，本發明亦提供與本文所揭示之輕鏈可變區序列具有75%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高、或99%或更高之序列同一性的另外的輕鏈可變區胺基酸序列。

互補決定區(CDR)

於一些實施態樣中，如本文所揭示之本發明提供的示例性抗MMP9抗體之重鏈的CDR具有下列胺基酸序列：

CDR1：(SEQ ID NO：13)

CDR2：(SEQ ID NO：14)

CDR3：(SEQ ID NO：15)

因此，所提供之抗MMP9抗體為其重鏈CDR1區具有如SEQ ID NO：13中所列出之胺基酸序列的抗體、其重鏈CDR2區具有如SEQ ID NO：14中所列出之 胺基酸序列的抗體，和其重鏈CDR3區具有如SEQ ID NO：15中所列出之胺基酸序列的抗體，及與這類抗體競爭結合或結合至MMP9上之相同表位的抗體。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：15中所列出之序列的VH CDR。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：13和14中所列出之序列的VH CDR。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：13和15中所列出之序列的VH CDR。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：14和15中所列出之序列的VH CDR。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：13、14和15中所列出之序列的VH CDR。

於一些實施態樣中，本文所揭示之示例性抗MMP9抗體之輕鏈的CDR具有下列胺基酸序列：

CDR1：(SEQ ID NO：16)

CDR2：(SEQ ID NO：17)

CDR3：(SEQ ID NO：18)

因此，所提供之抗MMP9抗體為其輕鏈CDR1區具有如SEQ ID NO：16中所列出之胺基酸序列的抗體、其輕鏈CDR2區具有如SEQ ID NO：17中所列出之胺基酸序列的抗體，和其輕鏈CDR3區具有如SEQ ID NO：18中所列出之胺基酸序列的抗體，及與這類抗體競爭結合或結合至MMP9上之相同表位的抗體。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：18中所列出之序列的VL CDR。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：16和17中所列出之序列的VL CDR。於一些情況中，該 抗體含有具有SEQ ID NO：16和18中所列出之序列的VL CDR。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：17和18中所列出之序列的VL CDR。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：17和18中所列出之序列的VL CDR。於一些情況中，該抗體含有具有SEQ ID NO：16、17和18中所列出之序列的VL CDR。

示例性之人化變體抗MMP9抗體，AB0045(人化的，經改質之IgG4(S241P))含有人化之AB0041重鏈變體VH3(具有如SEQ ID NO：7中所列之序列 及人化之AB0041輕鏈變體VH4(具有Vk4中所列 之輕鏈序列(具有如SEQ ID NO：12中所列之序列

該AB0045抗體之長度中含有1312個胺基酸，其係由兩個重鏈和兩個輕鏈所組成，且具有約7.90之理論等電點，在280nm處，1g/L之消光係數為約1.50AU/cm，分子量為約144kDa且在配製緩衝液中(50-100mg/mL產品濃度)的密度為約1g/mL。

AB0045抗體之重鏈具有如SEQ ID NO：49中所列之序列 (信號序列 下方有劃線；恆定區之序列以斜體呈現))；該AB0045抗體之輕鏈具有如SEQ ID NO：50中所列之序列 (信號序列下方有劃線；恆定區之序列以斜體呈現))。無信號肽，該AB0045抗體之重鏈具有如SEQ ID NO：56中所列之序列 ；且AB0045抗體之輕鏈具有如 SEQ ID NO：57中所列之序列 (恆定區以斜體字顯 示)。

該抗體進一步包括那些由命名為M4之雜交瘤所產生者，即，該抗體含有重鏈(IgG2b)序列： (SEQ ID NO：30)(信號肽以下方劃線之文本列出，可變區以純文本顯示且恆定區以斜體列出)及輕鏈(κ)序列： (信號肽以下方劃線之文本列出，可變區以純文本顯示且恆定區以斜體列出)(SEQ ID NO：31)。該M4抗體具有一可變重鏈，此可變重鏈具有下列胺基酸序列： (CDR 1、2及3(分別為SEQ ID NO：34、35及36)下方有劃線)(SEQ ID NO：32)，且該M4抗體具有一可變輕鏈，此可變輕鏈具有下列胺基酸序列： (CDR1、2及3(分別為SEQ ID NO：37、38及39)下方有劃線)(SEQ ID NO：33)。

該抗體進一步包括那些由命名為M12之雜交瘤所產生者，即，僅有κ鏈者，其具有下列序列： (信號肽以下方劃線之文本列出，可變區以純文本顯示且恆定區以斜體列出)(SEQ ID NO：40)。該M12抗體之一可變輕鏈具有胺基酸序列 (CDR1、2及3(分別為SEQ ID NO：42、43及44)下方有劃線)(SEQ ID NO：41)。命名為M4、AB0041及M12之抗體的重鏈部分(分別為SEQ ID NO：51、52及53)及命名為M4及AB0041之抗體的輕鏈部分(分別為SEQ ID NO：54及55)之序列比較顯示於第4圖中。該M4之部分輕鏈的胺基酸序列(即，具有截斷恆定區之輕鏈)為 (SEQ ID NO：51)； 該AB0041之部分輕鏈(即，具有截斷恆定區之輕鏈)為 (SEQ ID NO：52)； M12之部分輕鏈(即，具有截斷恆定區之輕鏈)為 (SEQ ID NO：53)；M4 之部分重鏈(即，具有截斷恆定區之重鏈)為 (SEQ ID NO：54)；且AB0041之部分重鏈 (即，具有截斷恆定區之重鏈)為 (SEQ ID NO：55)。

該抗體進一步包括命名為AB0046之小鼠抗體，其具有一κ輕鏈，此κ輕鏈具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：45)(信號肽以下方劃線之文本列出，可變區以純文本顯示且恆定區以斜體列出)及一帶有如下之胺基酸序列的IgG1重鏈 (SEQ ID NO：46)根據上述(信號肽以下方劃線之文本列出，可變區以純文本顯示且恆定區以斜體列出)。

下列胺基酸序列包含AB0046之IgG1重鏈的可變區之框構區及互補決定區(CDR)(其CDR下方劃線)： (SEQ ID NO：47)。

下列胺基酸序列包含AB0046之κ輕鏈的可變區之框構區及互補決定區(CDR)(其CDR下方劃線)： (SEQ ID NO：48)。

該用於本發明提供之方法、組成物及組合物之抗體可包括本文所描述之任何抗體，包括抗體及抗體片段，包括那些含有各種示例性重鏈和輕鏈、重鏈和輕鏈可變區和CDR之任何組合者。舉例而言，本發明提供之方法、組成物及組合物包含含有下列任一胺基酸序列之抗體 或其抗原結合片段：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50。一些實施態樣提供包含該含有SEQ ID NO：7和12之胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段之方法、組成物及組合物。某些實施態樣提供包含含有SEQ ID NO：13、14、15、16、17、和18之胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段之方法、組成物及組合物。

編碼抗MMP9抗體之核酸

本發明提供編碼抗MMP9抗體及其功能性片段之核酸。因此，本發明提供編碼如本文所描述之抗體或抗原結合片段的經分離之多核苷酸(核酸)、含有這類多核苷酸之載體及用於將這類多核苷酸轉錄及轉譯成多肽之宿王細胞和表現系統。

本發明亦構想為質粒、載體、轉錄或表現盒形式之構建體，其包含至少一種如上述之多核苷酸。

本發明亦提供重組宿主細胞，其包含一或多種如上述之構建體，以及製造本文所描述之抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含在重組宿主細胞中表現該編碼重鏈多肽及輕鏈多肽之核酸(在相同或相異之宿主細胞中，且來自相同或不同的構建體)。表現可經由在適當條件下培養該含有核酸之重組宿主細胞來實現。在藉由表現 製造之後，抗體或抗原結合片段可使用任何合適之技術分離及/或純化，再視情況使用。

用於在多種不同之宿主細胞中選殖及表現多肽的系統為人所熟知。合適之宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、酵母及桿狀病毒系統。本技術中可用來表現異源多肽之哺乳動物細胞株包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞及許多其他種細胞。常見之細菌宿主為大腸桿菌。

可選擇或構建含有合適之調節序列的合適載體，該合適之調節序列包括以可操作之方式連接的啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因及/或其他適當之序列。載體可為質粒、病毒，例如視情況為噬菌體或噬菌粒。進一步之細節參見，例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition,Sambrook et al.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。許多用於操作核酸之已知的技術和方案，例如用於製備核酸構建體、誘變、測序、將DNA引入細胞中和表現基因，及蛋白質分析的技術和方案詳細地描述於Short Protocols in Molecular Biology,Second Edition,Ausubel et al.eds.,John Wiley & Sons,1992中。Sambrook等人及Ausubel等人之全部揭示內容以引用方式併入本文。

編碼所欲多肽之核酸被整合在宿主細胞之基因組中或可以穩定或瞬態游離體元件之形式維持。

多種表現控制序列-控制可操作地連接至其上之DNA序列的表現之序列-中之任一者均可用於這些載體中以表現該DNA序列。例如，編碼所欲多肽之核酸可以可操作之方式連接到啟動子，並提供在表現構建體中，以用於製造重組MMP9蛋白或其部分之方法中。

本技術之技術熟習人士知道編碼本文所揭示之抗體鏈的核酸可使用分子生物學中之標準知識及方法來合成。

編碼本文所揭示之重和輕鏈胺基酸序列之核苷酸序列的實例如下： VH1： (SEQ ID NO：19)

VH2： (SEQ ID NO：20)

VH3： (SEQ ID NO：21)

VH4： (SEQ ID NO：22)

Vk1： (SEQ ID NO：23)

Vk2： (SEQ ID NO：24)

Vk3： (SEQ ID NO：25)

Vk4： (SEQ ID NO：26)

由於抗體之結構(括CDR及框構區在可變區中並列、框構區之結構及重鏈和輕鏈恆定區之結構)為本技術所周知；本技術之技術能充分取得編碼抗MMP-9抗體之相關核酸。因此，本發明亦提供包含與本文所揭示之任一核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%及至少99%之同源性的核酸序列之多核苷酸。因此，本發明亦提供包含與本文所揭示之任一核苷酸序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%及至少99%之同一性的核酸序列之多核苷酸。於一實例中，該多核苷酸與SEQ ID NO：21具有至少或約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性或包括或為SEQ ID NO：21及/或與SEQ ID NO：26具有至少或約75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列同一性或包括或為SEQ ID NO：26。

醫藥組成物

MMP9結合蛋白，及編碼MMP9結合蛋白之核酸(例如DNA或RNA)可以醫藥組成物之形式提供，例如與醫藥上可接受之載體或賦形劑組合。這類醫藥組成物可用於，例如體內或體外投予個體，及以MMP9結合蛋白診斷及/或治療個體，諸如用於本文所提供之任何治療或診斷方法中。

醫藥上可接受之載體或賦形劑對接受投予之患者而言為生理上可接受的，並保留與其一起投予之抗體或肽的治療性質。醫藥上可接受之載體或賦形劑及其調製劑描述於且通常描述於，例如Remington’ pharmaceutical Sciences(18th Edition,ed.A.Gennaro,Mack Publishing Co.,Easton,PA 1990)中。一種示例性醫藥載體為生理鹽水。各載體或賦形劑為“醫藥上可接受的”，意為與該調製劑之其他成分相容且基本上對該患者無害。

醫藥組成物可配製成與特定之投予途徑(系統性或局部)相容。因此，醫藥組成物包括適合藉由各種途徑投予之載體、稀釋劑或賦形劑。

醫藥組成物可以包括醫藥上可接受之添加劑。添加劑之實例包括，但不限於糖，諸如甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳 糖、葡聚醣、右旋糖、果糖、乳糖及彼等之混合物。醫藥上可接受之添加劑可與醫藥上可接受之載體及/或賦形劑合併，諸如右旋糖。添加劑亦包括表面活性劑，諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。

配製及投遞方法通常會根據欲治療之部位和疾病進行調整。示例性調製劑包括，但不限於那些適合用於腸胃道外投予者，例如經由靜脈內、動脈內、肌肉內或皮下投予、或口服投予。於一實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、該組成物或其調製劑係經由靜脈內投予(其可稱為靜脈輸注)來遞送。於一些實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、該組成物或其調製劑係經由皮下投予(其可稱為皮下注射)來遞送。

用於胃腸道外遞送之醫藥組成物包括，例如水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝之生理鹽水、Hank氏液、林格氏液、右旋糖/生理鹽水及葡萄糖溶液。該調製劑可含有輔助物質以接近生理條件，諸如緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑、清潔劑，等。添加劑亦可包括另外之活性成分，諸如殺細菌劑或穩定劑。例如，該溶液可含有醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨醇酐單月桂酸酯或油酸三乙醇胺。另外之胃腸道外調製劑及方法描述於Bai(1997)J.Neuroimmunol.80：65 75；Warren(1997)J.Neurol.Sci.152：31 38；及Tonegawa(1997)J.Exp.Med.186：507 515中。胃腸道外調製劑可封裝在安瓿、拋棄式注射器或由玻璃或塑料製成之多劑量小瓶中。

用於靜脈內、皮內或皮下投予之醫藥組成物可包括無菌稀釋劑，諸如水、生理鹽水溶液、固定之油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸、麩胱甘肽或硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，及用於調節張力之作用劑，諸如氯化鈉或右旋糖。

用於注射之醫藥組成物包括水溶液(其中為水溶性的)或用於無菌注射溶液或分散劑之即時製劑的分散劑和無菌粉末。在靜脈內投予方面，合適之載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，紐澤西州Parsippany)或磷酸鹽緩衝之生理鹽水(PBS)。該載體可為溶劑或包含，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液態聚乙二醇，等)及彼等之合適混合物的分散介質。流動性可，例如在分散劑的情況下，經由使用塗層(諸如卵磷脂)，藉著維持所需之顆粒大小及使用表面活性劑來維持。抗細菌劑及抗真菌劑包括，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸及硫柳汞。組成物中可包含等滲劑，例如糖、多元醇，諸如甘露醇、山梨醇及氯化鈉。所產生之溶液可包裝後以原樣使用，或經凍乾；該凍乾製劑可稍後在投予前與無菌溶液組合。

醫藥上可接受之載體可含有用於穩定、增加或延遲吸收或清除之化合物。這類化合物包括，例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖或葡聚醣；低分子量蛋白質； 減少肽之清除或水解的組成物；或賦形劑或其他穩定劑及/或緩衝劑。延遲吸收之作用劑包括，例如單硬脂酸鋁和明膠。亦可使用清洗劑來穩定、或增加、或減少醫藥組成物，包括脂質體載體之吸收。為了保護該化合物不被消化，可將該化合物與組成物複合以使其對酸性和酶水解具有抗性，或者可將該化合物在適當之具有抗性的載體(諸如脂質體)中複合。保護化合物不被消化之手段為本技術所已知(參見，例如Fix(1996)Pharm Res.13：1760 1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48：119 135；及美國專利案第5,391,377號，其描述用於口服遞送治療劑之脂質組成物)。

本發明之組成物可與其他治療性部分或如本文所提供之成像/診斷部分組合。治療性部分及/或成像部分可以單獨的組成物提供，或為存在於MMP9結合蛋白上之共軛結合的部分。

用於體內投予之調製劑通常是無菌的。於一實施態樣中，該醫藥組成物被配製成不含熱原，從而使其可被接受用於投予人類患者。

本技術之技術熟習人士鑑於本揭示內容將可知各種其他醫藥組成物及用於製備彼等之技術和彼等之用途。合適之藥理學組成物及相關之投予技術的詳細列表可參考本文之詳細教示內容，其可進一步透過文本，諸如Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(Lippincott,Williams & Wilkins 2003)補充。

醫藥組成物可根據需要治療之患者/個體的生理特性、投予途徑，等來配製。該類醫藥組成物可包裝在具有適當標籤之合適藥物包中以供分發到醫院和診所，其中該標籤係用於指示治療個體中如本文所描述之病症。藥物可包裝成一或多個單位之形式。用於本發明之醫藥組成物的劑量和投予的說明可與如下文描述之藥物包和套組包含在一起。

使用方法

本發明之MMP9結合蛋白，包括抗MMP9抗體及其片段，可用於，例如治療及診斷方法中，諸如檢測樣本中之MMP9的方法、治療方法(例如，諸如抑制血管生成之方法)及診斷和預後的方法。因此，本發明提供診斷和治療方法以及該抗MMP9抗體之用途。使用方法之實例描述於下。

治療方法

本文提供慢性阻塞性肺病(COPD)之治療及/或預防方法。

如本文所使用之術語“治療”係指經設計以在COPD的臨床病理過程中改變接受治療之個人或細胞之自然過程的臨床干預(諸如，例如投予本文所描述之MMP9結合蛋白)。治療之期望效果包括降低疾病進展或死亡的速率、改善或減輕該疾病狀態，及緩解或改善預後。於一 些實施態樣中，該治療改善COPD症狀、降低COPD病情加重之頻率或嚴重性、改善肺功能、患者報告之COPD症狀(諸如運動耐受性和生活品質)。當患者經歷疾病部分或完全減輕、或徵兆或症狀減少，且具體地包括，但不限於存活期延長及生活品質提升時即是得到反應。例如，與COPD相關之一或多種症狀若被減輕或消除，則個體被成功地“治療”。

如本文所使用之“與...結合”係指除了另一治療模式外，另投予一種治療模式。如此，“與...結合”係指在投予個體其他治療模式之前、期間或之後，投予一種治療模式(例如本文所描述之MMP9結合蛋白)。

如本文所使用之術語“預防”包括提供關於個體中COPD之發生或復發的預防。個體可能易罹患COPD、對COPD具感受性或處於發展出COPD之風險中，但尚未被診斷出患有該病症。於一些實施態樣中，本文中所描述之MMP9結合蛋白可用於延遲COPD之發展。於一些實施態樣中，本文所描述之MMP9結合蛋白防止COPD惡化及/或肺功能下降或肺組織破壞。

如本文所使用之“處於發展COPD之風險”中的個體在本文中所描述的治療方法之前可能或可能未顯示可檢測之疾病或疾病症狀。“處於風險”表示該個體具有一或多種風險因素，如本技術所已知，其為與COPD之發展相關之可測量的參數。具有一或多種這些風險因素之個體發展出COPD之機率較無一或多種這些風險因素之個體來 得高。

“有效量”係指在必需的劑量和時間週期中為了有效取得期望或指明之效果，包括治療或預防效果的最少量。有效量可在一或多次投予中提供。

“治療有效量”為至少使特定病症達到可測得之改善所需之最低濃度。本文中之治療有效量可根據，諸如患者之疾病狀態、年齡、性別和體重，以及該抗體在個體中引發期望反應的能力等因素而有變化。治療有效量亦為其中治療有益效果勝過抗體之任何毒性或有害作用的量。

因此，當投予(無論是單獨投予或與另一種治療劑組合，依可能具體指明者)個體時，該作用劑之有效量可有效預防或改善該疾病狀況或疾病之進展，或導致症狀改善，例如治療、治癒、預防或改善相關醫學狀況、或增加這類病況之治療、治癒、預防或改善速度。當應用於單獨投予之個別活性成分時，治療有效劑量係指該單獨之成分。當應用於組合時，治療有效劑量係指導致治療效果之活性成分的組合量，無論是組合、連續或同時投予。

“預防有效量”係指在必需之劑量和時間週期中為了有效取得所需之預防結果的量。通常，但非必然，由於預防劑量係在疾病之前或早期階段用於個體，該預防有效量可少於治療有效量。

一般而言，MMP9結合蛋白係以治療有效量投予，例如能有效抑制MMP9活性、或治療COPD之量。

於某些實施態樣中，本文所描述之MMP9結 合蛋白(例如，結合至MMP9之抗體或其功能片段)係間隔一、二、三週投予、或每週、每兩週、每三週投予一次。於某些實施態樣中，本文所描述之MMP9結合蛋白(例如結合至MMP9之抗體或其功能片段)可每天投予或以較每日投予低的頻率投予，例如一週6次、一週5次、一週4次、一週三次、一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每個月一次、每二個月一次、每三個月一次、或每6個月一次。於一些實施態樣中，該治療包括至少至少一次、至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、或至少十次之投予。該組成物亦可在持續釋出調製劑中投予，諸如在植入物中，其逐漸釋出組成物以供一段時間使用，此可允許較不頻繁地投予該組成物，諸如一個月一次、每2至6個月一次、每年一次，或甚至單次投予。此外，該治療是連續的。於一實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、該組成物或其調製劑係一週投予一次。於某些實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、該組成物或其調製劑係每兩週投予一次。

該MMP9結合蛋白可經由任何途徑投予個體，包括，但不限於靜脈內(例如經由輸注泵)、腹膜內、動脈內、肺內、口服、吸入、囊內、肌肉內、氣管內、皮下、鞘內、經皮、經胸膜、局部、吸入(例如以噴霧之薄霧形式)、黏膜(諸如經由鼻黏膜)、皮下、經皮、胃腸道、關節內、腦池內、或腦室內。於一些實施態 樣中，該組成物係經由系統性途徑投予(例如經由靜脈內注射)。於一些實施態樣中，該MMP9結合蛋白係經由局部途徑投予(例如經由動脈內途徑投予或注射)。於一些實施態樣中，該MMP9結合蛋白係經由皮下途徑投予。於一些實施態樣中，該MMP9結合蛋白係經由皮內途徑投予。於一些實施態樣中，該MMP9結合蛋白係經由吸入投予。於一些實施態樣中，該MMP9結合蛋白係經黏膜投予。於一實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、其組成物或調製劑係每兩週經由靜脈內途徑(即，靜脈內輸注)投予二次。於某些實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、其組成物或調製劑係每週經由皮下途徑投遞一次。

於一些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段之投予劑量為每一個體約25mg至每一個體約800mg。於一些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段之投予劑量為每一個體約50mg、約100mg、約200mg、約300mg、約400mg、約500mg、約600mg、約700mg、或約800mg，包括在這些數值之間的任何範圍。於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體(即，抗MMP9抗體)或其抗原結合片段之投予劑量為每一個體約150mg、約250mg、約350mg、約450mg、約550mg、約650mg、或約750mg，包括在這些數值之間的任何範圍。於一些實施態樣中，上述劑量之抗體或其抗原結合片段為一週投予一次、每兩週投予一次、每三週投予 一次、每月投予一次、每兩個月投予一次、每三個月投予一次、或每6個月投予一次。於一些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段之投予劑量為兩週約400mg。於某些實施態樣中，該投予個體之結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段的劑量為每兩週約200mg。於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段係一週投予一次約150mg。於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段係一週投予一次約300mg。於某些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段係在二步驟程序中投予個體：第一步驟，裝載劑量階段(更頻繁地給藥以涵蓋與該疾病相關之MMP9的“目標擊沈裝藥量”/“組織和血清擊沈裝藥量”或高基線濃度，其中該給藥範圍係以每週約200mg、約300毫克、或約400mg之劑量在一、二或三週之期間內投予個體，或更頻繁地給藥以涵蓋與該疾病相關之MMP9的“目標擊沈裝藥量”或高基線濃度)及第二步驟，一旦在裝載劑量階段後已建立可預測之pK值，則投予較低之每週劑量，諸如150、125、100或50mg/週。於一些實施態樣中，該較低之每週劑量可在每週之基礎上降低，例如150、125、100或50mg/週。於一實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、其組成物或調製劑係每兩週經由靜脈內途徑投予(即，靜脈內輸注)約400mg。於一實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、其組成物或調製劑係每兩週經由靜脈內途徑投予約200mg。於一實施態樣中， 該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、其組成物或調製劑係每週經由皮下途徑(即，皮下注射)投予一次約150mg。於一實施態樣中，該抗MMP9抗體或其抗原結合片段、其組成物或調製劑係每兩週經由皮下途徑投予約300mg。

所選擇之劑量方案將取決於多種因素，包括該MMP9結合蛋白之活性、投予途徑、投予時間、所使用之特定化合物的排泄速率、治療之持續時間、與所採用之特定組成物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、該接受治療之患者的年齡、性別、體重、病況、一般健康及先前之醫療史，等在醫學技術中眾所周知之因素。

於一些實施態樣中，該劑量係根據用於顯示由標靶介導之處置的抗體之藥代動力學模型來測定。與所觀察到之針對可溶性受體標靶之抗體的相對線性藥物動力學相反，針對以組織為基礎之標靶受體的抗體經常顯示出非線性藥物動力學。Mager,D.E.(2006),Adv Drug Deliv Rev 58(12-13)：1326-1356。非線性處置之基礎與抗體對標靶之高親和力結合及結合的程度(相對於劑量)有關，因而該相互作用反映在抗體之藥代動力學特性中。Mager,D.E.and W.J.Jusko(2001),J Pharmacokinet Pharmacodyn 28(6)：507-532。由受體介導之抗體-受體複合物的內吞作用(內化)包含在由標靶介導之藥物處置內。Wang,W.,E.Q.Wang,et al.(2008),Clin Pharmacol Ther 84(5)：548-558。

於具有由標靶介導之處置的抗體之藥代動力 學模型中，當無藥物(抗體)存在時，該標靶受體係以固定速率合成並藉由一階過程排除。結果，該標靶受體在無藥物(抗體)存在時以穩態濃度存在。當藥物被加入身體時其可在雙分子反應中與標靶受體相互作用，分配入灌注較不完善之組織中，或經由一階過程排除。在低藥物濃度下，由於高親和力結合，該主要的藥物運動係在受體上。當進入體內之藥物量變得足以結合可用之受體質量時，該藥物分配進入和離開組織，並被排除。當藥物濃度下降且組織中藥物達到平衡時，這提供一個額外的貯庫以結合新合成之受體。

本技術中一般技術的臨床醫生可以很容易地測定並開立所需之醫藥組成物的有效量(ED50)。例如，醫師或獸醫在醫藥組成物中所採用之本發明化合物的劑量可從較取得期望之治療效果所需為低之水準開始，並逐步增加劑量，直至取得期望之效果。

於一些情況中，該治療方法包括腸胃道外投予，例如靜脈內、動脈內、皮內、肌肉內、或皮下投予、或口服投予該作用劑(例如抗MMP9抗體或含彼之組成物)。

如本文所使用之術語“個體”意指哺乳動物個體。示例性個體包括，但不限於人、猴、狗、貓、小鼠、大鼠、牛、馬、山羊和綿羊。於一些實施態樣中，該個體具有COPD，並且可以如下述之本發明作用劑進行治療。於某些實施態樣中，該個體為被診斷或懷疑患有COPD的 患者。若需要時，用於治療之方法可進一步包括另外之療法，諸如下列者。其他抗COPD劑或治療之投予可與本文所揭示之組成物之投予同時或依序進行。此外，患有COPD之個體可能已接受或可能未曾接受任何先前之COPD治療。

於一些實施態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段係以單一療法之形式單獨投予。於其他實施態樣中，該抗體係作為組合療法之一部分，以與一或多種其他用於治療COPD之治療劑一起投予。該治療劑包括，但不限於：1)短效β 2促效劑(諸如，例如沙丁胺醇(舒喘寧)、左沙丁胺醇、非諾特羅、特布他林)，2)短效抗膽鹼能劑(諸如，例如異丙托溴銨、氧托溴銨)，3)長效β 2促效劑(諸如，例如福莫特羅、阿福莫特羅、茚達特羅、沙美特羅、妥洛特羅)，4)長效抗膽鹼能劑(諸如，例如阿地溴銨、格隆溴銨、噻托溴銨)，5)組合短效β 2促效劑加抗膽鹼能劑(諸如，例如非諾特羅/異丙托、沙丁胺醇/異丙托銨)，6)吸入性皮質類固醇(諸如，例如倍氯米松、布地奈德、氟替卡松)，7)組合長效β 2促效劑加皮質類固醇(諸如，例如福莫特羅/布地奈德、福莫特羅/莫米松、沙美特羅/氟替卡松)，8)甲基黃嘌呤(諸如，例如胺茶鹼、茶鹼)，9)磷酸二酯酶-4抑制劑(諸如羅氟司特)，10)系統性皮質類固醇(諸如，例如強的松、甲基強的松龍)。在組合療法中，本申請案之抗體可作為治療有此需要之患者的 主要或第一線作用劑或第二線或額外之作用劑。於一些實施態樣中，本申請案之抗體可作為治療有此需要之患者的第二線或額外之作用劑。於一實施態樣中，該MMP9抗體或其抗原結合片段可與選自由下列所組成之群組的治療劑組合：短效β 2促效劑、短效抗膽鹼能劑、長效β 2促效劑和長效抗膽鹼能劑；及抗MMP9抗體或其抗原結合片段之任何組合且該一或多種治療劑可進一步與β 2促效劑、抗膽鹼能劑、吸入性皮質類固醇、系統性皮質類固醇、甲基黃嘌呤咸磷酸二酯酶-4抑制劑組合。舉例而言，該MMP9抗體或其抗原結合片段可與β 2促效劑(無論是長效或短效)和甲基黃嘌呤組合。

於一些態樣中，該結合至MMP9之抗體或其抗原結合片段之劑量可經過調整並以約133、約267、約400、約600或約1200mg/Kg體重(包括在這些值之間的任何範圍)之劑量投予。各治療週期後，監測患者之MMP9抗體、MMP9或其他合適之生物標記的水準。

組合療法中之作用劑可經由如上述之合適途徑以任何順序同時(在同一組成物中或分開)或依序投予。

於一些實施態樣中，該治療方法包括用於監測治療之步驟，包括用於監測效力或活性，諸如藥效活性。於一些實例中，這類方法包括檢測或測量從使用該方法和組成物治療之個體中取得之生物測試樣本中是否存有、不存有標記物、標記物之量及/或表現，該標記物 為，諸如指示治療效力之細胞因子及其他炎性標記物，此外，標記物可作為直接經由裂解釋入血清中或藉由MMP9活性從胞外基質之儲存庫釋入血清中之MMP9的受質。該樣本通常為血液樣本或血清樣本，但可包括如本文中所描述之其他生物樣本。於一實施態樣中，該生物測試樣本為從使用本申請案之方法被診斷或懷疑患有COPD之個體取得的痰。這類方法中所使用之標記物為金屬蛋白酶1之組織抑制劑(TIMP-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、巨噬細胞炎性蛋白-2(MIP-2)、介白素-17A(IL-17A)、CXCL10、淋巴細胞趨化因子、巨噬細胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、制瘤素-M(Oncostatin-M)(OSM)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、單核細胞趨化蛋白3(MCP-3)、血管內皮生長因子A(VEGF-A)、單核細胞趨化蛋白5(MCP-5)、介白素-1α(IL-1α)、巨噬細胞集落刺激因子-1(M-CSF-1)、髓過氧化物酶(MPO)、生長調控之α蛋白(KC/GRO)、介白素-7(IL-7)、白血病抑制因子(LIF)、載脂蛋白A-I(Apo A-I)、C反應蛋白(CRP)、粒細胞趨化蛋白-2(GCP-2)、白介素-11(IL-11)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、von Willebrand因子(vWF)、RANK配體、CCL-5及幹細胞因子(SCF)基因產物。這類方法中所使用之其他標記物可包括鎖鏈素(desmosine)、彈性蛋白及藉由MMP9活性產生之膠原蛋白片段。這些標記物反映由該疾病過程引起之局部組織破壞。這類局部組織破壞之產品最 終可能在血清中且可在血清中檢測到。

於一些實施態樣中，在每個治療週期之後，監測患者之MMP9抗體、MMP9或其他合適之生物標記物的量。

與現有之治療和治療方案及/或治療COPD之持續的長期效力相比較，所提供之方法可提供改善之安全性變化形廓。

慢性阻塞性肺病(COPD)

本文所描述之MMP9結合蛋白，諸如結合至MMP9之抗體及其片段可用於治療或預防慢性阻塞性肺病(COPD)，例如經由抑制患有COPD之個體的MMP9。

COPD，亦稱為慢性阻塞性肺部疾病(COLD)或慢性阻塞性氣道疾病(COAD)係指特徵在於空氣流動不良(空氣流動受限)和無法充分呼吸(空氣陷閉)的一組進行性阻塞性肺病(例如肺氣腫和慢性支氣管炎)。不良的空氣流動為肺部結締組織破壞的結果，此促成不良之空氣流動及不良之呼吸氣體吸收和釋出。COPD之徵兆和症狀包括，但不限於，例如呼吸急促，特別是在身體活動時、喘息、胸悶、肺中黏液過量、產生痰之慢性咳嗽，該痰可為透明、白色、黃色或綠色、發紺(即，嘴唇和指甲床呈藍色)、頻繁的呼吸道感染、疲勞，及在稍後階段時無預期之體重減輕。患有COPD之患者可經歷被稱為病情加重之發作，在此期間，患者的症狀變得更糟，並持續數 天或更長的時間。經歷頻繁之病情加重的個體之肺功能惡化得更快。

COPD發展為對吸入之刺激物的顯著且慢性之炎症反應。COPD之已知原因包括吸煙、空氣污染(例如置身於通風不良之烹飪火，往往以煤或生質燃料，諸如木材或動物糞便作為燃料、城市空氣污染、廢氣)及職業暴露(例如，諸如長時間暴露在工作場所粉塵、化學品和煙中)。遺傳學可能在COPD的發展中具有作用。目前，唯一之遺傳風險因子為α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症。病情加重(即，症狀突然惡化)通常係由感染、環境污染物或不當使用藥物觸發。

COPD通常係使用肺活量測定(即，測量肺功能之肺功能試驗，具體地說可吸入及呼出之空氣的量和/或速度)診斷。所測量之用於作出診斷的肺活量測定組分為：a)1秒內之用力吐氣量(FEV₁)，其為可在呼吸之第一秒內被呼出之最大空氣體積；b)用力肺活量(FVC)，其為可在單次大呼吸中被呼出之最大空氣體積。在具有COPD之症狀的個人中FEV₁/FVC比小於70%確定該個人具有該疾病。在老年人中，診斷標準還需要FEV₁小於預測值之80%。

使用其他測試來評估個體中之COPD的嚴重性。例如，改良之英國醫學研究委員會問卷(modified British Medical Research Council questionnaire)(mMRC)或慢性阻塞性肺病評估試驗(COPD assessment test)(CAT)為可用來測定症狀之嚴重性的簡單問卷。CAT之分數在0-40範圍內時分數越高，疾病越嚴重。肺活量測定可協助測定氣體流動受限的嚴重程度。此通常係根據該以個人年齡、性別、身高和體重預測之“正常”值的百分比表示一之FEV₁。體重減輕和肌肉無力，及其他存在之疾病亦應考慮在內。用於評估個體內COPD之嚴重性的另外標準描述於Vestbo(2013)“Diagnosis and Assessment.”Global Strategy for the Diagnosis,Management,and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease.Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease.pp.9-17中。

通常進行胸部X光和/或胸部CT掃描及動脈血氣試驗，以排除診斷時之其他狀況。X光上之特色徵兆為肺部過度擴張、橫隔膜扁平、胸骨空域增加及肺大泡(肺中充滿流體之囊)。使用動脈血氣分析來測定氧氣之需求且通常係在其FEV₁小於預測值之35%的個體、其外週氧飽和度小於92%之個體及具有充血性心臟衰竭症狀之個體中進行。在α-1抗胰蛋白酶缺乏症常見的世界地區中，考慮對患有COPD的人們(尤其是年齡小於45歲且患有影響肺之下半部的肺氣腫(emphysema)者)進行測試。

於一些實施態樣中，欲以本文所描述之MMP9結合蛋白治療之個體可具有以下任何一或多種症狀：呼吸急促，尤其是在身體活動期間、喘息、胸悶、肺 中黏液過量、產生可能為透明、白色、黃色或綠色之痰的長期咳嗽、發紺(即，嘴唇和指甲床呈藍色)、頻繁之呼吸道感染、疲勞及無預期之體重減輕。於一些實施態樣中，該待治療之個體具有COPD病情加重。於一些實施態樣中，該個體之FEV₁≧預測值之40%且小於80%。於一些實施態樣中，該個體之FEV₁/FVC比小於70%。於一些實施態樣中，該個體根據改良之英國醫學研究委員會問卷(mMRC)的結果被診斷為COPD。於一些實施態樣中，該個體根據COPD評估試驗(CAT)已被診斷為具有COPD。於一些實施態樣中，該個體根據全球慢性阻塞性肺病倡議組織(GOLD)指導方針已被確診為COPD。於一些實施態樣中，該個體根據以下之一或多項被診斷為COPD：胸部X光、胸部CT掃描及動脈血氣分析。於一實施態樣中，該個體被診斷為患有COPD，其在本申請案之治療之前一年具有二或更多次病情加重。於一些實施態樣中，該個體被診斷為患有COPD，其在治療之前一年具有二或更多次病情加重及肺功能降低。降低之肺功能可藉由本文所描述之臨床指徵來確定。於一些實施態樣中，降低之肺功能可藉由小於80%之FEV₁確定。該被診斷為患有COPD之個體在一年內具有二或更多次病情加重造成大多數的發病、死亡，以及與病情加重有關之住院相關花費。不受任何假設束縛，與健康個體或具有一或更少次病情加重之COPD個體的氣道中之MMP9水準或活性相比較，該等患者之氣道中的MMP9水準或活性可能增加。氣 道中之MMP9水準或活性可由本技術之技術熟習人士使用常用之方法測定。於一些實施態樣中，氣道中之MMP9水準或活性可使用免疫分析及生物測試樣本來測定。於某些實施態樣中，氣道中之MMP9水準或活性可使用ELISA測定來自個體之痰樣本。於一實施態樣中，該個體被診斷為患有COPD，其在一年內具有二或更多次病情加重、肺功能降低且氣道中之MMP9水準或活性增加。

於一些實施態樣中，該個體現在或過去為長期的吸煙者。於一些實施態樣中，該個體曾暴露於二手煙。於一些實施態樣中，該個體正在或曾暴露於工作場所的化學氣體、灰塵及/或蒸氣。於一些實施態樣中，該個體正在或曾暴露於空氣污染。於一些實施態樣中，該個體具有COPD的家族史。

MMP9之檢測方法

本發明亦構想檢測個體中之MMP9的方法，例如檢測與COPD有關之組織或流體或其他生物樣本。因此，提供診斷、監測、分期或檢測來自患有COPD之患者的樣本中之MMP9活性的方法。

來自個體(例如懷疑具有或已知具有COPD之個人)的樣本(例如測試生物樣本)可用來分析MMP9之存在、不存在、表現及/或水準。同樣的，來自懷疑患有COPD之個體的樣本可用來分析MMP9之存在、不存在、表現及/或水準。例如，可收集該等樣本並經由檢測 MMP9結合蛋白(諸如本文所描述之抗體或片段)與樣本中之物質(例如蛋白質)是否有或無發生結合之情況來分析。於一些實例中，該方法進一步包括將檢測到之結合量與結合至對照樣本的結合量相比較，或將檢測到之MMP9的水準與對照組之MMP9水準相比較。於一些情況中，該方法表明如本文所描述之疾病或病況是否存在、不存在或嚴重性。

此分析可在使用如本文所描述之MMP9結合蛋白開始治療之前進行，或可作為監測COPD治療進展之一部分。於一些實施態樣中，本發明提供治療方法，其係經由執行檢測分析並開始、修改或中斷個體之治療(例如根據該診斷分析之結果)來進行。該等診斷分析可使用任何樣本，包括，但不限於組織、從該等組織中分離之細胞，等執行。於一些情況中，該方法係在液體樣本，諸如，例如血液、血漿、血清、全血、唾液、尿液或精液上進行。組織樣本包括，例如經福馬林固定或冷凍之組織切片。

任何合適之用於檢測及分析MMP9的方法均可使用。本技術中已知之各種診斷分析技術可經修改以適合，諸如競爭性結合分析、直接或間接之夾心式分析(sandwich assay)及在異質或同質相中進行之免疫沉澱分析這類目的。

用於檢測方法之MMP9結合蛋白可以可檢測之部分來標記。該可檢測之部分直接或間接產生可檢測之 信號。例如，該可檢測之部分可為本文所描述之任一者，諸如，例如放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I、螢光或化學發光化合物，諸如異硫氰酸螢光素(FITC)、Texas red、花色素苷(cyanin)、photocyan、羅丹明(rhodamine)、或螢光素、或酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。

檢測可經由在適合MMP9結合蛋白結合至MMP9之條件下令樣本接觸MMP9結合蛋白，並評估MMP9結合蛋白-MMP9是否存在(例如水準)或不存在。將樣本中之MMP9的水準與參考樣本中之水準相比較可指明是否存在該具有MMP9活性之與COPD相關的組織。該參考樣本可為在較早時點從該個體採取的樣本或來自另一個體之樣本。

於一些態樣中，MMP9 mRNA係藉由，諸如雜交(諸如經由顯色原位雜交(CISH))檢測。於一些態樣中，當藉由其他檢測方法，例如IHC檢測時，在所需之細胞類型中具有高水準之由炎性細胞衍生的MMP9含糊信號時則吏用這類檢測方法。

本發明之各種態樣進一步描述並藉由下列幾個實例說明，這些實例中並無任一實例意圖用來限制本發明之範圍。

[實施例] 實施例1：在第一階段研究中評估AB0045

此研究為第一階段雙盲、隨機化安慰劑對照之多中心研究。此研究之主要目的係在患有慢性阻塞性肺病(COPD)之個體中藉由不良事件(AE)和從基線至第29天加30天之實驗室異常來評估AB0045(即，結合至MMP9之抗體)的安全性、耐受性及藥代動力學(PK)。主要結果測量為不良事件之發生率、實驗室測試中從篩選開始之變化及生命徵象和給藥後致免疫性之發展。此種複合終點係測量AB0045之安全性和耐受性。次要結果測量值為藉由AUC測量之AB0045之PK參數、隨著時間推移比較血漿濃度來測量身體所吸收之藥物總量和從基線到第29天之Cmax(最大藥物濃度)。測量AB0045之下列PK參數：從基線到第29天之Tmax(即，Cmax之時間)、Clast(即，最後觀察到之藥物濃度)、Tlast(即，Clast之時間)，Ctau(即，在給藥期結束時所觀察到之藥物濃度)、λ z(即，終端排除速率常數)、CL(即，靜脈內投藥後之全身清除率)和Vz(即，靜脈內投藥後之分配表觀體積)。

該研究具有一個實驗臂，其中每個參與者在第1、15和29天每兩週接受400mg之AB0045，共輸注三次。此研究包括安慰劑臂，其中參加者在第1、15和29天每兩週接受安慰劑共輸注三次，以配合AB0045。400mg之AB0045係經由靜脈內途徑投予。欲配合AB0045之安慰劑亦經由靜脈內途徑投予。

參加者均介於40至75歲。男性或非妊娠、 非哺乳期之女性有資格參與這項研究。從事異性性交之男性個體及具生育能力之女性個體必須同意使用協議規定之避孕方法。男性個體必須在最後一次輸注研究藥物後90天避免捐精。納入標準包括：a)篩選時體重≧45kg至<120kg；b)在篩選前至少6個月經由全球慢性阻塞性肺病倡議組織(GOLD)指導方針診斷出COPD(參見Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease(GOLD).Global Strategy for the Diagnosis,Management,and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease。2013年更新。其可在-goldcopd.org/guidelines-global-strategy-for-diagnosis-management.html全球網頁上取得)，並預計在研究期間維持在穩定療法；c)吸入支氣管擴張劑後一秒鐘之用力呼氣量(FEV₁)≧40%預測值(且，於一些實施態樣中，≦80%預測值)；d)在隨機化前30天內未改變COPD的用藥；e)肝臟功能檢查[天門冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、總膽紅素、直接膽紅素、鹼性磷酸酶、乳酸脫氫酶(LDH)]≦正常範圍上限(ULN)的2倍；f)血清肌酐≦2.0；g)血紅素≧8.5g/dL(男性和女性均如此)；h)中性粒細胞絕對計數(ANC)≧1.5×10 ^ 9/L(1,500mm ^3)；及i)血小板≧100×10 ^ 9/L。

排除標準包括：a)在篩選期間由研究者判斷臨床顯著之活躍感染；b)在篩選期間已知HIV、B型肝炎或C型肝炎病史(為B型肝炎表面抗原陽性之個體， 但接受一系列成功之B型肝炎疫苗且從未患有該疾病之個體仍有資格)；c)在篩選期間QuantiFERON-TB GOLD測試陽性；d)在5年內有惡性腫瘤之病史，曾接受非黑色素瘤皮膚癌或某些原位癌之局部治療的患者除外；e)在隨機化前6個月內有任何嚴重之心臟事件，諸如心肌梗塞、不穩定或危及生命之心律不整、心臟衰竭住院或在第1次訪視時由研究者判斷有任何明顯或新的心電圖(ECG)發現；f)在隨機化前6個月內因呼吸事件住院，例如，但不限於COPD、肺炎、支氣管炎；g)除COPD以外之慢性肺病，諸如哮喘、囊性纖維化或纖維化疾病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、間質性肺病、肺血栓栓塞性疾病或支氣管擴張；h)長期使用系統性皮質類固醇及/或在隨機化90天內以系統性皮質類固醇治療COPD之急性惡化(AECOPD)事件，或其他不需要住院之醫療狀況；i)在隨機化之90天內以抗生素治療AECOPD事件，或其他不需要住院之醫療狀況，或在隨機化14天內以抗生素治療任何不需要住院之小醫療事件；j)在任何銷售或研究之生物分子的5個半衰期內，或者若不知道，在篩選之90天內接受任何銷售或研究之生物分子的治療；及k)在隨機化90天之內，目前接受非生物免疫調節劑藥物之個體，諸如：硫唑嘌呤、環孢黴素、羥氯喹、來氟米特、甲胺蝶呤、黴酚酸酯、柳氮磺吡啶、托法替尼。

<110> Gossage, David L. Smith, Victoria Vaysberg, Maria Lin, Joseph Haw-Ling

<120> 針對基質金屬蛋白酶9之抗體及其使用方法

<130> 1076.PF

<160> 59

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠單株抗MMP9抗體-AB0041重鏈

<400> 1

<210> 2

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠單株抗MMP9抗體-AB0041輕鏈

<400> 2

<210> 3

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之IgG2b重鏈的可變區

<400> 3

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之κ輕鏈的可變區

<400> 4

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之重鏈變體VH1

<400> 5

<210> 6

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之重鏈變體VH2

<400> 6

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之重鏈變體VH3

<400> 7

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之重鏈變體VH4

<400> 8

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之輕鏈變體Vk1

<400> 9

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之輕鏈變體Vk2

<400> 10

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之輕鏈變體Vk3

<400> 11

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0041之輕鏈變體Vk4

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗MMP9抗體之示例性重鏈CDR1區

<400> 13

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗MMP9抗體之示例性重鏈CDR2區

<400> 14

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗MMP9抗體之示例性重鏈CDR3區

<400> 15

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗MMP9抗體之示例性輕鏈CDR1區

<400> 16

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗MMP9抗體之示例性輕鏈CDR2區

<400> 17

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗MMP9抗體之示例性輕鏈CDR3區

<400> 18

<210> 19

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼AB0041之重鏈變體VH1之多核苷酸

<400> 19

<210> 20

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼AB0041之重鏈變體VH2之多核苷酸

<400> 20

<210> 21

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼AB0041之重鏈變體VH3之多核苷酸

<400> 21

<210> 22

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼AB0041之重鏈變體VH4之多核苷酸

<400> 22

<210> 23

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼AB0041之輕鏈變體Vk1之多核苷酸

<400> 23

<210> 24

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼AB0041之輕鏈變體Vk2之多核苷酸

<400> 24

<210> 25

<211> 321

<22> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼AB0041之輕鏈變體Vk3之多核苷酸

<400> 25

<20> 26

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼AB0041之輕鏈變體Vk4之多核苷酸

<400> 26

<210> 27

<211> 707

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 27

<210> 28

<211> 688

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 28

<210> 29

<211> 19

<212> PRT

<213> 現代人

<400> 29

<210> 30

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之抗體重鏈(IgG2b)

<400> 30

<210> 31

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之抗體重鏈(κ)

<400> 31

<210> 32

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之抗體可變重鏈

<400> 32

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之抗體可變輕鏈

<400> 33

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之可變重鏈CDR1

<400> 34

<210> 35

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之可變重鏈CDR2

<400> 35

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之可變重鏈CDR3

<400> 36

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之可變輕鏈CDR1

<400> 37

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之可變輕鏈CDR2

<400> 38

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之可變輕鏈CDR3

<400> 39

<210> 40

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M12雜交瘤製造之抗體輕鏈(κ)

<400> 40

<210> 41

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M12雜交瘤製造之抗體可變輕鏈

<400> 41

<210> 42

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M12雜交瘤製造之可變輕鏈CDR1

<400> 42

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M12雜交瘤製造之可變輕鏈CDR2

<400> 43

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M12雜交瘤製造之可變輕鏈CDR3

<400> 44

<210> 45

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠抗體輕鏈(κ)AB0046

<400> 45

<210> 46

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠抗體IgG1重鏈AB0046

<400> 46

<210> 47

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠抗體IgG1重鏈AB0046之可變區

<400> 47

<210> 48

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠抗體κ輕鏈AB0046可變區

<400> 48

<210> 49 <211> 461 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> AB0045抗體之重鏈<400> 49

<210> 50

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0045抗體之輕鏈

<400> 50

<210> 51

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之抗體輕鏈(κ)

<400> 51

<210> 52

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠單株抗MMP9抗體-AB0041輕鏈

<400> 52

<210> 53

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M12雜交瘤製造之抗體輕鏈(κ)

<400> 53

<210> 54

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由M4雜交瘤製造之抗體重鏈(IgG2b)

<400> 54

<210> 55

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠單株抗MMP9抗體-AB0041重鏈

<400> 55

<210> 56

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0045抗體之重鏈

<400> 56

<210> 57

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB0045抗體之輕鏈

<400> 57

<210> 58

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠單株抗MMP9抗體-AB0041重鏈

<400> 58

<210> 59

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 老鼠單株抗MMP9抗體-AB0041輕鏈

<400> 59

Claims (20)

1. 一種抗基質金屬蛋白酶9(MMP9)抗體或其抗原結合片段用於製造供治療或預防個體中之慢性阻塞性肺病(COPD)的藥物之用途。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段結合至MMP9之表位，其中該表位包含SEQ ID NO：27之胺基酸殘基104-119、殘基159-166或殘基191-202。
3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該表位包含SEQ ID NO：27之E111、D113、R162或I198。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中抗MMP9抗體或其抗原結合片段與蛋白質競爭結合至MMP9，其中該蛋白質結合至SEQ ID NO：27之胺基酸殘基104-119、殘基159-166或殘基191-202。
5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該蛋白質為與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高之同一性的抗體：SEQ ID NO：7、12、13、14、15、16、17及18。
6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段包含含有互補性決定區(CDR)之重鏈可變(VH)區，該互補性決定區(CDR)具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：13、14及15。
7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其 中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段包含含有CDR之輕鏈可變(VL)區，該CDR具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：16、17及18。
8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段包含含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VH區：SEQ ID NO：3、5、6、7及8。
9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段包含含有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列之VL區：SEQ ID NO：4、9、10、11及12。
10. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：7中所列之胺基酸序列的VH區及含有SEQ ID NO：12中所列之胺基酸序列的VL區。
11. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO：56中所列之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：57中所列之胺基酸序列的輕鏈。
12. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段為人化的、嵌合型或人的。
13. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段抑制MMP9之酶活 性。
14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該抑制為非競爭性的。
15. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段之投予劑量為約100mg、150mg、200mg、300mg或400mg。
16. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段係每週投予一次、每兩週投予一次或每三週投予一次。
17. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗MMP9抗體或其抗原結合片段係經由靜脈內、皮內或皮下途徑投予。
18. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中係將該抗MMP9抗體或其抗原結合片段與用於治療COPD之一或多種治療劑同時或依序投予。
19. 如申請專利範圍第18項之用途，其中該一或多種用於治療COPD之治療劑係選自由下列所組成之群組：短效β 2促效劑、短效抗膽鹼能劑、長效β 2促效劑、長效抗膽鹼能劑及彼等之組合。
20. 如申請專利範圍第19項之用途，其進一步包含β 2促效劑、抗膽鹼能劑(anticholinergics)、吸入性皮質類固醇、系統性皮質類固醇、甲基黃嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制劑或彼等之組合。