CN106062001A - 基质金属蛋白酶9的抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了涉及结合蛋白的组合物以及使用方法，如结合至基质金属蛋白酶‑9(MMP9)蛋白(MMP9也被称为明胶酶‑B)的抗体及其抗原结合片段，如其中所述结合蛋白包含免疫球蛋白(Ig)重链(或其功能性片段)以及Ig轻链(或其功能性片段)。

Description

基质金属蛋白酶9的抗体及其使用方法

相关申请

无。

技术领域

本发明属于胞外酶、胞外基质酶、蛋白酶和免疫学领域。

发明背景

基质金属蛋白酶(MMP)属于胞外酶家族，其涉及细胞外基质的形成和重塑。这些酶含有保守的催化结构域，其中锌原子与三个组氨酸残基配位。该家族的超过20个成员为已知的，其被分为多个组，包括胶原蛋白酶、明胶酶、间质溶解素、基质溶解因子、釉质溶解蛋白和膜MMP。

MMP2和MMP9属于基质金属蛋白酶的明胶酶组。除了含有多数MMP常见的信号肽、前肽、催化结构域、锌-结合结构域和血红素结合蛋白样(heamopexin)结构域，明胶酶还含有多个纤维连接蛋白样结构域和O-糖基化结构域。MMP牵涉在一系列疾病中。还没有完全令人满意的MMP抑制剂，这部分是由于特异性和效力。因此，仍需要特异性且有效的MMP抑制剂。

尽管活性药物已开发了数十年，且FDA在2011年批准了COPD的新型治疗类别(磷酸二酯酶-4抑制剂罗氟司特)，COPD中仍持续存在未满足的需求，如通过症状、恶化、住院治疗以及死亡率所测量。还没有显示任何改变疾病进程或死亡率的药理学治疗。存在许多关于COPD的非支气管扩张机理的活跃的开发项目；然而，很少具有改变炎症和疾病进程两者、同时具有可接受的安全性的能力。因此，存在对有效治疗该疾病的治疗的需要，尤其是对于目前的疗法已对其显示无效的受试者。

发明内容

此处提供的是用于在受试者中治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)的方法，包括向受试者给药有效量的基质金属蛋白酶9(MMP9)结合蛋白，其包含免疫球蛋白重链多肽或其功能性片段以及免疫球蛋白轻链多肽或其功能性片段，其中该MMP9结合蛋白特异性结合MMP9。在一些实施方案中，该MMP9结合蛋白为与基质金属蛋白酶-9(MMP9)蛋白(也称为明胶酶-B)结合的抗体或其抗原结合片段。结合MMP9的抗体或其片段(如抗原结合片段)通常含有免疫球蛋白(Ig)重链(或其功能性片段)以及Ig轻链(或其功能性片段)。重链通常为IgG，如IgG1或IgG4或其经修饰版本。轻链通常为κ链。

在一些实施方案中，MMP9结合蛋白(如抗体)是那些与MMP9特异性结合而不与其它相关的基质金属蛋白酶特异性结合的蛋白。该MMP9结合蛋白在这样的应用中有用，即其中有必要或期望获得对MMP9的特异性调节(如抑制)，如不会直接影响其它基质金属蛋白酶的活性。因而，在本发明的某些实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段为MMP9活性的特异性抑制剂。在一些方面，此处公开的MMP9结合蛋白可用于抑制MMP9，同时允许其它相关的基质金属蛋白酶的正常功能。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其特异性结合至MMP9的表位的抗原结合片段，其中该表位包含MMP9区域内的氨基酸残基，该区域包含SEQ ID NO:27的残基104-119、残基159-166或残基191-202。在某些实施方案中，该区域由SEQ ID NO:27的残基104-119、残基159-166或残基191-202组成。在一方面，该表位包含SEQ ID NO:27的E111、D113、R162或I198。例如，该表位可包含SEQ ID NO:27的残基R162。在某些实施方案中，该抗体为人源化抗体、嵌合抗体或人类抗体。

可根据其氨基酸序列或其部分、和/或不同功能(如与MMP9或其特定表位的结合特异性、或竞争结合特定抗体的能力)、和/或活性(如抑制MMP9的能力，如非竞争性抑制)来描述抗体和片段。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段包含VH区，该区域包含具有选自SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列的CDR；和VL区，该区域具有其氨基酸序列选自SEQ ID NO:16、17和18的CDR。在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段包含VH区，该区域包含三个CDR，其包含SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列；和VL区，该区域包含三个CDR，其包含SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH区具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、5、6、7和8；且VL区具有选自以下的氨基酸序列：SEQID NO:4、9、10、11和12。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段包含VH区和VL区，VH区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列且VL区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体包含：重链，其包含SEQ ID NO:49所示的无信号肽的氨基酸序列；和轻链，其包含SEQ ID NO:50所示的无信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合至MMP9的抗体包含：重链，其包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列；和轻链，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段包含：VH区，其包含SEQID NO:47所示的氨基酸序列；和VL区，其包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体包含：轻链，其包含SEQ ID NO:45所示的无信号肽的氨基酸序列；和重链，其包含SEQ ID NO:46所示的无信号肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合至MMP9的抗体包含：重链，其包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列；和轻链，其包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段为此处所述的任何抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，用于在受试者中治疗或预防COPD的方法包括向受试者给药有效量的抗-MMP9抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段可结合至MMP9的表位，其中该表位包含SEQ ID NO:27的氨基酸残基104-119、残基159-166或残基191-202；或SEQ ID NO:27的氨基酸残基E111、D113、R162或I198。在某些实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段可与蛋白或抗体竞争结合MMP9，其中所述蛋白或抗体可结合至SEQ ID NO:27的氨基酸残基104-119、残基159-166或残基191-202；或SEQ ID NO:27的氨基酸残基E111、D113、R162或I198。在某些其它实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段可与蛋白或抗体竞争结合至MMP9，其中所述蛋白或抗体与选自SEQ IDNO:7、12、13、14、15、16、17和18的氨基酸序列具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的同一性。在其它实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变(VH)区，其包含具有选自以下的氨基酸序列的互补性决定区(CDR)：SEQ ID NO:13、14和15；轻链可变(VL)区，其具有选自以下的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO:16、17和18；VH区，其包含三个CDR(即CDR 1-3)，其包含以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、14和15；或VL区，其包含三个CDR(即CDR 1-3)，其包含以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:16、17和18。在一些其它实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段可包含：VH区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、5、6、7和8；VL区，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、9、10、11和12；重链，其包含以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:56或58；或轻链，其包含以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:57或59。在某些其它实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段包含：VH区，其包含以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:7；和VL区，其包含以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12。

在一些实施方案中，MMP9结合蛋白，如结合MMP9的抗体或其抗原结合片段，是在药物组合物中。

在某些实施方案中，MMP9结合蛋白抑制MMP9的酶活性。在某些实施方案中，对酶活性的抑制为非竞争性的。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以约25mg至约800g的剂量给药至受试者。在一些实例中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以约200mg、约300mg或约400mg的剂量以一周、两周或三周的间隔或每一周一次、每两周一次或每三周一次给药至受试者。在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段以约400mg的剂量每两周一次给药至受试者。在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段以约200mg的剂量每两周一次给药至受试者。在一些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段以两步法给药至受试者：首先，负荷剂量阶段(更频繁的给药，以覆盖“靶标库(target sink)”或与疾病相关的MMP9的高基线浓度，其中给药范围为以每周约200mg、约300mg或约400mg的剂量向受试者给药，间隔为一周、两周或三周或更频繁地给药，从而覆盖“靶标库”或与疾病相关的MMP9的高基线浓度)；和第二，一旦在负荷剂量阶段后建立了可预测的pK，给药更低的每周剂量，如150mg/周、125mg/周、100mg/周或50mg/周。在一些实施方案中，更低的每周剂量可为在每周的基础上更低，如150mg/周、125mg/周、100mg/周或50mg/周。在一些实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段以约100mg、约150mg、约200mg、约300mg或400mg的剂量给药。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物以一周、两周或三周的间隔或每周一次、每两周一次或每三周一次给药。在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物通过静脉内、皮内或皮下给药。在一个实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段或它们的组合物或药物制剂通过皮下给药。在其它实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段或它们的组合物或药物制剂通过静脉内给药。

在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物作为单一疗法单独给药。在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物作为组合疗法的一部分与一种或多种其它用于治疗COPD的治疗剂一起给药。用于治疗COPD的治疗剂包括但不限于：

1)短效β2激动剂(例如，柳丁氨醇(salbutamol，沙丁胺醇(albuterol))、左旋沙丁胺醇、非诺特罗、特布他林)；2)短效抗胆碱能类药物(例如，异丙托溴铵、氧托溴铵)；3)长效β-2激动剂(例如，福莫特罗、阿福特罗、茚达特罗、沙美特罗、妥布特罗)；4)长效抗胆碱能类药物(例如，阿地溴铵、格隆溴铵、噻托溴铵)；5)短效β-2激动剂与抗胆碱能类药物的组合(例如，非诺特罗/异丙托铵、柳丁氨醇/异丙托铵；6)吸入性皮质激素(例如，倍氯米松、布地奈德、氟替卡松；7)长效β-2激动剂与皮质激素的组合(例如，福莫特罗/布地奈德、福莫特罗/莫米松、沙美特罗/氟替卡松)；8)甲基黄嘌呤(例如，氨茶碱、茶碱)；9)磷酸二酯酶-4抑制剂(例如，罗氟司特)；10)全身性皮质激素(例如，泼尼松、甲基泼尼松龙)。所述一种或多种治疗剂可与结合MMP9的抗体或其抗原结合片段同时给药或依次给药。在一个实施方案中，MMP9抗体或其抗原结合片段可与选自以下的治疗剂结合：短效β-2激动剂、短效抗胆碱能药、长效β-2激动剂、长效抗胆碱能药及它们的组合。抗-MMP9抗体或其抗原结合片段与所述一种或多种治疗剂的任意组合可与β-2激动剂、抗胆碱能药、吸入性皮质激素、全身性皮质激素、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂或它们的组合进一步组合。

在某些实施方案中，受试者患有慢性支气管炎、肺气肿或两者兼有。在某些实施方案中，受试者被诊断患有COPD。在某些实施方案中，根据慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)的指南，受试者被诊断患有COPD达至少六个月。在一些实施方案中，受试者在服用支气管扩张剂后的一秒用力呼吸量(FEV₁)为≥预期的40％。在一些实施方案中，受试者在服用支气管扩张剂后的一秒用力呼吸量(FEV₁)为≥预期的40％且<预期的80％。在一些实施方案中，在30天内不改变受试者的COPD药物。在其它实施方案中，受试者被诊断为慢性支气管炎、肺气肿或COPD，在一年内具有一次、两次或更多次恶化。在一个实施方案中，受试者被诊断为COPD，在一年内具有两次或更多次恶化，且在本申请的治疗之前具有衰退的肺功能。

在某些实施方案中，受试者不具有临床显著的活动性感染。在某些实施方案中，受试者没有进行阳性QuantiFERON-TB GOLD测试。在某些实施方案中，受试者不具有任何严重的心脏疾病，如心肌梗塞、不稳定或危及生命的心律不齐、在6个月内因心力衰竭而住院或任何显著或新的心电图(ECG)发现。在某些实施方案中，受试者没有在此前6个月内因呼吸疾病而住院，如(但不限于)：COPD、肺炎、细支气管炎。在某些实施方案中，受试者不患有除COPD外的慢性肺病(如：哮喘、囊性纤维化或纤维变性疾病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、间质性肺病、肺动脉血栓栓塞疾病或支气管扩张)。在某些实施方案中，受试者没有呈现出长期使用全身性皮质激素和/或在90天内用于COPD的急性恶化(AECOPD)事件或其它不需住院的医学状况的全身性皮质激素的治疗。在某些实施方案中，受试者在随机90天内没有因AECOPD或其它不需要住院的医学状况而接受抗生素的治疗，或在14天内没有因任何不需要住院的轻微医学事件而接受抗生素的治疗。在某些实施方案中，在该分子的5个半衰期内(或者如果未知半衰期则在90天内)受试者没有接受任何市售或处于研究中的生物学治疗。在某些实施方案中，受试者目前在90天内没有服用非生物的免疫调节药物(如：硫唑嘌呤、环孢霉素、羟氯喹、来氟米特、甲氨喋呤、麦考酚酸吗乙酯、柳氮磺胺吡啶、托法替尼)。

应理解，此处所述的各种实施方案的一种、一些或所有性质可以结合已形成本发明的其它实施方案。本发明的这些方面和其它方面将对本领域技术人员变得明显。通过以下详细说明进一步描述本发明的这些和其它实施方案。

附图简述

图1显示了小鼠的单克隆抗-MMP9抗体(AB0041)的重链可变区的氨基酸序列，以及重链的人源化变体(VH1-VH4)的氨基酸序列，将其比对以显示人源化导致的框架氨基酸序列的差异。以斜体显示CDR，以及人源化变体中与母体小鼠单克隆抗体不同的氨基酸以下划线显示。

图2显示了小鼠的单克隆抗-MMP9抗体(AB0041)的轻链可变区的氨基酸序列，以及该轻链人源化变体(VH1-VH4)的氨基酸序列，将其比对以显示人源化导致的框架氨基酸序列的差异。以斜体显示CDR，以及人源化变体中与母体小鼠单克隆抗体不同的氨基酸以下划线显示。

图3显示了MMP9蛋白的示意图。

图4显示了标记为AB0041、M4和M12的抗体的重链和轻链的氨基酸序列之间的比较。

发明详述

除非另外指明，本发明的实践利用了细胞生物学领域、毒理学领域、分子生物学领域、生物化学领域、细胞培养领域、免疫学领域、肿瘤学领域、重组DNA领域和本领域技术内的相关领域的标准方法和常规技术。这些技术描述于文献中，并从而是对本领域技术人员可得的。例如参见，Alberts,B.等人，“Molecular Biology of the Cell,”第5版,GarlandScience,New York,NY,2008；Voet,D.等人，“Fundamentals of Biochemistry：Life atthe Molecular Level,”，第3版,John Wiley&Sons,Hoboken,NJ,2008；Sambrook,J.等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual,”，第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001；Ausubel,F.等人，“Current Protocols in Molecular Biology,”JohnWiley&Sons,New York,1987and periodic updates；Freshney,R.I.,“Culture of AnimalCells：A Manual of Basic Technique,”，第4版,John Wiley&Sons,Somerset,NJ,2000；以及系列“Methods in Enzymology,”Academic Press,San Diego,CA。还参见例如“CurrentProtocols in Immunology,”(R.Coico,系列编辑),Wiley，2010年8月最后更新。

某些MMP的异常活性在肿瘤生长、转移、炎症、自身免疫和血管疾病中起作用。参见例如，Hu等人，(2007)Nature Reviews：Drug Discovery6:480-498。可以预期在某些治疗环境中抑制一种或多种MMP的活性。然而，某些其它MMP(如MMP2)的活性对于正常功能和/或提供对疾病的保护方面是必需的。由于多数MMP抑制剂靶向保守的催化结构域，并因此抑制了多种不同MMP，可用的MMP抑制剂的使用已产生由于抑制了重要的、非致病相关的MMP而造成了副作用。这些副作用也可能是由于很多这些抑制剂造成的一般性的锌螯合，更广泛的，包括抑制需要锌的酶。

与开发对特定的MMP或选定的MMP具有特异性的抑制剂相关的挑战在于，通过底物竞争型机制抑制酶活性通常要求该抑制剂靶向催化结构域。MMP催化结构域中的同源性可导致抑制剂与超过一种MMP反应。实施方案中提供了试剂，包括治疗剂(如抗体及其抗原结合片段)，其特异性地抑制单一MMP或所选择的多种MMP(如MMP9)的催化活性，而不与某些其它MMP或任何其它MMP反应或抑制某些其它MMP或任何其它MMP反应。而且，实施方案中提供了该试剂用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)的方法和用途。在某些实施方案中，本公开的一种或多种MMP9结合蛋白结合普遍较大的催化结构域，但在底物口袋(substrate pocket)中不结合，且显示通过其它变构机制起作用(如，本发明的MMP9结合蛋白不与底物竞争结合，且独立于底物的存在或底物浓度产生抑制)。

此处提供了用于在受试者中治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)的方法，包括向受试者给药有效量的基质金属蛋白酶9(MMP9)结合蛋白，其包含免疫球蛋白重链多肽或其功能性片段和免疫球蛋白轻链多肽或其功能性片段，其中该MMP9结合蛋白特异性结合MMP9。还提供了用于治疗或预防COPD的组合物，其中该组合物包含基质金属蛋白酶9(MMP9)结合蛋白，该结合蛋白包含免疫球蛋白重链多肽或其功能性片段和免疫球蛋白轻链多肽或其功能性片段，其中该MMP9结合蛋白特异性结合MMP9。还提供了基质金属蛋白酶9(MMP9)结合蛋白在制备用于治疗或预防COPD的药物中的用途，其中该MMP9蛋白包含免疫球蛋白重链多肽或其功能性片段和免疫球蛋白轻链多肽或其功能性片段，且其中该MMP9结合蛋白特异性结合MMP9。此处所述的任何MMP9结合蛋白(如结合MMP9的抗体或其抗原结合片段)可用于此处所述的方法中。

如此处所用，除非另外指明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数形式。

此处提到的“约”某数值或参数是指，该技术领域中的技术人员容易知道的关于各数值的常规误差范围。此处提到的“约”某数值或参数包括(且描述了)涉及该数值或参数本身的方面。例如，提到“约X”的描述包括“X”的描述。在某些实施方案中，术语“约”包括所指示的量±1％至10％。在其它实施方案中，术语“约”包括所指示的量±5％。在某些其它实施方案中，术语“约”包括所指示的量±1％。在某些其它实施方案中，术语“约”包括所指示的量±10％。

应理解此处所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”该方面和实施方案、“由该方面和实施方案组成”以及“基本由该方面和实施方案组成”。

此处所述的所有参考文件，包括专利申请和出版物，在此以整体引入以作为参考。

MMP9结合蛋白

MMP9降解基膜胶原和其它细胞外基质(ECM)组分。Kessenbrock K,等人，“Matrixmetalloproteinases：regulators of the tumor microenvironment.”Cell2010；141(1):52-67。基质降解与多种疾病中的病理有关，包括关节炎、癌症和溃疡性结肠炎。Roy R,等人，“Matrix Metalloproteinase as novel biomarkers and potential therapeutictargets in human cancer.”J Clin Oncol 2009；27(31):5287-97。广谱基质金属蛋白酶抑制剂如马马司他，在炎症和癌症的动物模型中有效(Watson SA,等人，“Inhibition oftumour growth by marimastat in a human xenograft model of gastric cancer:relationship with levels of circulating CEA.”Br J Cancer 1999；81(1):19-23；Sykes AP,等人，“The effect of an inhibitor of matrix metalloproteinase oncolonic inflammation in a trinitrobenzenesulphonic acid rat model ofinflammatory bowel disease.”Aliment Pharmacol Ther 1999；13(11):1535-42.)。然而，这种泛抑制剂(pan inhibitor)会造成肌肉骨骼的副作用，包括关节僵硬；炎症；手、臂和肩膀疼痛，其共同被称为肌肉骨骼综合征(MSS)，在人类中，这种副作用通常在马马司他的有效剂量水平或接近有效剂量水平处发生。Peterson JT.“The importance ofestimating the therapeutic index in the development of matrixmetalloproteinase inhibitor.”Cardiovasc Res 2006；69(3):677-87；Tierney GM,等人，“A pilot study of the safety and effects of the matrix metalloproteinaseinhibitor marimastat in gastric cancer.”Eur J Cancer1999；35(4):563-8；Wojtowicz-Praga S,等人，“Phase I trial of Marimastat,a novel matrixmetalloproteinase inhibitor,administered orally to patients with advancedlung cancer.”J Clin Oncol 1998；16(6):2150-6。该症状为剂量依赖和时间依赖的，且在停止泛MMP抑制剂的治疗后很快恢复。Wojtowicz-Praga S,1998；Nemunaitis J,等人，“Combined analysis of studies of the effects of the matrix metalloproteinaseinhibitor marimastat on serum tumor markers in advanced cancer：selection of abiologically active and tolerable dose for longer-term studies.”Clin CancerRes 1998；4(5):1101-9；Hutchinson JW等人，“Dupuytren's disease and frozenshoulder induced by treatment with a matrix metalloproteinase inhibitor.”TheJournal of bone and joint surgery.British volume 1998；80(5):907-8。马马司他和其它相同类型的泛MMP抑制剂为锌螯合剂。Peterson JT,2006。敲除了MMP9的纯合型小鼠没有显示类似MSS的症状或类似MSS的组织变化。Vu TH,等人，“MMP-9/gelatinase B is akey regulator of growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophicchondrocytes.”Cell 1998；93(3):411-22。

本发明提供了结合蛋白，如抗体及其片段(如抗原结合片段)，其与基质金属蛋白酶-9(MMP9)蛋白(MMP9也已知为明胶酶-B)结合，如人MMP9，如具有SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列的人MMP9。本发明的结合蛋白一般包含免疫球蛋白(Ig)重链(或其功能性片段)和Ig轻链(或其功能性片段)。

本发明进一步提供了与MMP9特异性结合而不与其它基质金属蛋白酶如MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12和MMP13结合的MMP9结合蛋白。该特异性MMP9结合蛋白因此通常不与非-MMP9基质金属蛋白酶发生显著或可检测的交叉反应。特异性结合MMP9的MMP9结合蛋白可用于以下应用中，其中必需或期望获得对MMP9的特异性调控(如抑制)，如不会直接影响其它基质金属蛋白酶的活性。

在本发明的某些技术方案中，抗-MMP9抗体为MMP9活性的抑制剂，且可为MMP9的特异性抑制剂。特别地，此处公开的MMP9结合蛋白将有效用于抑制MMP9同时允许其它相关的基质金属蛋白酶的正常功能。“MMP9的抑制剂”或“MMP9活性的抑制剂”可为抗体或其抗原结合片段，其直接或间接地抑制MMP9的活性(包括但不限于酶法处理)、抑制MMP9对其底物的作用(如通过抑制底物结合和底物剪切等)等。

在一些实施方案中，如在此处实施例中所示，与用泛MMP抑制剂的治疗(如小分子泛抑制剂，如马马司他)导致肌肉骨骼疾病的症状(如肌肉骨骼综合征(MSS)，包括对步态、姿势、移动意向的显著影响以及对关节的严重的组织学损伤)相反，对MMP9的特异性抑制，如本申请中的抗体或其抗原结合片段不会造成这些症状且不会导致MSS。

本发明还提供了特异性结合至非小鼠MMP9的MMP9结合蛋白，如人MMP9、食蟹猴MMP9和大鼠MMP9。

本发明还提供了起到非竞争性抑制剂作用的MMP9结合蛋白(如抗-MMP9抗体及其功能性片段)。“非竞争性抑制剂”是指在远离酶的底物结合位点的位点处结合并因而无论该酶是否与其底物结合都可与该酶结合并产生抑制活性的抑制剂。该非竞争性抑制剂可以，例如，提供能够基本上独立于底物浓度的抑制水平。

本发明的MMP9结合蛋白(如抗体及其功能性片段)包括与MMP9(尤其是人MMP9)结合且具有与此处公开的重链多肽具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或更大氨基酸序列同一性的重链多肽(或其功能性片段)的那些。在一些实例中，本发明的MMP9结合蛋白(如抗体及其功能性片段)包括与MMP9(尤其是人MMP9)结合且具有与此处公开的重链多肽具有至少约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或更大的氨基酸序列同一性的重链多肽(或其功能性片段)的那些。

本发明的MMP9结合蛋白(如抗体及其功能性片段)包括与MMP9(尤其是人MMP9)结合且具有与此处公开的重链多肽具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或更大的氨基酸序列同一性的轻多肽(或其功能性片段)的那些。本发明的MMP9结合蛋白包括与MMP9(尤其是人MMP9)结合且具有与此处公开的轻链多肽具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或更大的氨基酸序列同一性的轻链多肽(或其功能性片段)的那些。在一些实例中，本发明的MMP9结合蛋白包括与MMP9(尤其是人MMP9)结合且具有与此处公开的轻链多肽至少约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或更大的氨基酸序列同一性的轻链多肽(或其功能性片段)的那些。

本发明的MMP9结合蛋白(如抗体及其功能性片段)包括与MMP9(尤其是人MMP9)结合且具有重链多肽(或其功能性片段)的那些，所述重链多肽或其功能性片段具有此处公开的重链多肽的互补性决定区(“CDR”)和轻链多肽(或其功能性片段)的CDR。

此处在核酸和多肽的语境下使用的“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两种多肽或两种核酸分子之间的关系，其分别基于氨基酸序列或核酸序列的比对。同源性和同一性可以各自通过比较在各序列中的位置而决定，该序列可为了比较的目的进行排列。当在所比较的序列中等效位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则该分子在该位置具有同一性；当等效位点被相同或相似的氨基酸残基占据时(如在立体化学和/或电子性质方面相似)，则该分子可被认为在该位置处同源(相似)。同源性/相似性或同一性的百分比表达是指在所对比的序列共享的位置处同一或相似的氨基酸的数量的函数。在比较两个序列时，缺少残基(氨基酸或核酸)或额外存在残基均降低同一性和同源性/相似性。

如此处所用，“同一性”是指，当将序列比对以使序列匹配最大时(即考虑到缺口和插入)，在两个或多个序列中相应位置处相同的核苷酸或氨基酸的百分比。通常将序列比对以在指定区域内获得最大一致性，例如，长度为至少约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65或更多个氨基酸或核苷酸且至多可为对照氨基酸或核苷酸全长的区域。为了进行序列比较，通常将一个序列用作对照序列，将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和对照序列输入计算机系统中，如果必要的话，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后该序列比较算法基于所指定的程序参数计算测试序列相对于对照序列的序列同一性百分比。

适合确定序列同一性百分比的算法的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等人，(1977)Nucleic acidsRes.25：3389-3402中描述。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)为公众可得。进一步的示例性算法包括ClustalW(Higgins D.,等人，(1994)Nucleic acids Res 22：4673-4680)，可获自www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html。

不同一的残基位置的差异可为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。

也可依据两个分子在严苛条件下彼此的杂交来描述两个核酸之间的序列同一性。杂交条件选自以下本领域中的标准方法(例如参见，Sambrook,等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual,Second Edition,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)。严苛杂交条件的一个实例为在50℃或更高的温度和0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)杂交。严苛杂交条件的另一实例为在以下溶液中在42℃过夜培育：50％甲酰胺,5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH7.6),5×Denhardt’s溶液,10％硫酸葡聚糖和20mg/ml的变性剪切的鲑鱼精DNA，随后在约65℃在0.1×SSC中清洗滤器。严苛杂交条件为至少与上述代表性的条件一样严苛的条件，其中如果该条件的严苛性为上述具体的严苛条件的至少约80％、通常至少约90％，则认为该条件至少是严苛的。

因此，本发明提供了，例如，抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区多肽，其与此处所述的重链可变区的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1或5-8)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性；和可变轻链多肽，其具有与此处所示的轻链多肽的氨基酸序列(如SEQ ID NO:2或9-12)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区多肽，其具有与SEQ ID NO:7中所示的重链可变区氨基酸序列至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的氨基酸序列同一性；和可变轻链多肽，其具有与SEQ ID NO:12所示的轻链多肽的氨基酸序列至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的氨基酸序列同一性。在其它实例中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区多肽，其具有与SEQ ID NO:32、40或47所示的重链可变区的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性；和可变轻链多肽，其具有与SEQ ID NO:33、41或48中所示的轻链多肽的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区多肽，其具有与SEQ IDNO:32、40或47中所示的重链可变区的氨基酸序列至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的氨基酸序列同一性；和可变轻链多肽，其具有与SEQ ID NO:33、41或48中所示的轻链多肽的氨基酸序列至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，本申请提供了抗体或其抗原结合片段，其可竞争结合蛋白或抗体，该蛋白或抗体包含与SEQ ID NO:7、12、13、14、15、16、17或18中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的同一性的氨基酸序列。

将更详细地描述本发明的抗-MMP9抗体的实例。

抗体

MMP9结合蛋白包括抗体及其功能性片段，如特异性结合MMP9的那些。如此处所用，术语“抗体”是指分离的或重组的多肽结合试剂，其包含特异性结合至抗原表位的肽序列(如可变区序列)。该术语以其最广泛的意义使用，且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人类抗体、人源化的抗体、嵌合抗体、纳米抗体、双价抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，包括但不限于Fv、scFv、Fab、Fab'F(ab')₂和Fab₂，只要它们呈现所期望的生物活性。术语“人类抗体”是指包含来自人类的序列的抗体，除了可能的非人类CDR区，且不意味着存在免疫球蛋白分子的完整结构，仅为在人类中具有最小的免疫原性效果的抗体(即，其自身不诱导产生抗体)。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，例如，全长抗体的抗原结合区或可变区。该抗体片段在这里也可称作“功能型片段”或“抗原结合片段”。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双价抗体；线性抗体(Zapata等人，(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点和残留的“Fc”片段，该称呼反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶的处理产生F(ab')₂片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够与抗原交联。

“Fv”是包含完整的抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗原片段。该区域由非共价紧密相连的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中，各可变结构域的三个互补性决定区(CDR)相互作用以在V_H-V_L二聚体表面上限定抗原结合位点。这六个CDR结合在一起为抗体带来抗原结合特异性。然而，即使单个的可变结构域(或仅包含六个对抗原具有特异性的CDR中的三个的分离的V_H或VL区)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力通常低于完整的F_v片段。

除了重链可变区和轻链可变区外，“F_ab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH₁)。最初在用木瓜蛋白酶消化抗体后观察到Fab片段。Fab'片段与Fab片段的不同在于F(ab')片段在重链CH₁结构域的羧基端具有几个额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')₂片段包含在铰链区附近通过双硫键相连的两个Fab片段，且最初在用胃蛋白酶消化抗体后观察到该F(ab')₂片段。这里，Fab'-SH为其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'片段的名称。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。

来自任何脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于它们恒定结构域的氨基酸序列被归为两种明确不同的类型中的一种，这两种类型被称作κ和λ。根据它们重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被归为五种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几种可被进一步分为亚类(同工型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2.

“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域位于单个多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步在V_H和V_L结构域之间包含多肽连接基，其使得sFv能够形成抗原结合所需要的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113(Rosenburg and Moore eds.)Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。

术语“双价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体，该片段包含在相同多肽链(V_H-V_L)中与轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)。通过使用过短而无法在相同链中允许两个结构域配对的连接基，该结构域只能与另一条链中的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双价抗体例如在EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448中也被描述。

“分离的”抗体为从其天然环境的组分中被鉴定、分离和/或复原的抗体。其天然环境的组分可包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白的溶质。在一些实施方案中，分离的抗体被纯化为(1)达到超过抗体的95wt％(通过Lowry法确定)，例如，超过99wt％；(2)达到足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，如通过使用转杯式测序仪；或(3)通过在还原或非还原条件下的凝胶电泳(如SDS-PAGE)达到同质性，其中使用考马斯蓝或银染色来检测。由于抗体的天然环境中的至少一种组分会不存在，因此术语“分离的抗体”包括在重组细胞内的原位抗体。在某些实施方案中，分离的抗体通过至少一个纯化步骤制备。

如此处所用，“免疫活性”是指对氨基酸残基的序列(“结合位点”或“表位”)具有特异性的抗体或其片段，而如果其对其它肽/蛋白具有交叉活性，则在其被配制为用于人类使用的给药的水平上是无毒性的。“表位”是指抗原能够与抗体或其抗原结合片段形成结合相互作用的部分。表位可为线性肽序列(即“连续的”)或可由非连续的氨基酸序列组成(即“构象的”或“不连续的”)。术语“优先结合”是指结合剂以比其结合至不相关的氨基酸序列更大的亲和力结合至结合位点。

抗-MMP9抗体可通过重链和轻链的CDR来描述。如此处所用，术语“CDR”或“互补性决定区”旨在表示在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定的区域在以下被描述：Kabat等人，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人，美国卫生及公共服务部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；和MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，其中该定义包括当彼此比较时重叠的氨基酸残基或氨基酸残基的子集。然而，表示抗体或接枝抗体或其变体的CDR的任一定义的应用都旨在落入此处限定并使用的术语的范围内。以上各参考文献所定义的涵盖CDR的氨基酸残基作为比较示于以下表1A中。

表1A：CDR定义

¹残基编号是根据以上Kabat等人的命名

²残基编号是根据以上Chothia等人的命名

³残基编号是根据以上MacCallum等人的命名

如此处所用，当用来指代抗体可变区时，术语“框架”旨在表示在抗体的可变区内CDR区外的所有氨基酸残基。可变区框架通常是长度为约100-120个氨基酸之间的的不连续氨基酸序列，但也旨在指代仅在CDR外的那些氨基酸。如此处所用，术语“框架区”旨在表示通过CDR分开的框架的各个结构域。

在一些实施方案中，抗体为人源化的抗体或人类抗体。人源化的抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补性决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(如小鼠、大鼠或兔子)的具有期望的特异性、亲和性和能力的CDR(供体受体)的残基替代。因而，非人类(如鼠类)抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白，其含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列。非人类序列主要位于可变区中，尤其是在互补性决定区(CDR)中。在一些实施方案中，人类免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人类残基替代。人源化抗体也可包含在受体抗体和输入的CDR或框架序列中均没有发现的残基。在某些实施方案中，人源化抗体包含几乎全部的至少一个、且通常为两个的可变结构域，其中所有或几乎所有的CDR均对应于非人类免疫球蛋白的CDR且所有或几乎所有的框架区为人类免疫球蛋白共有序列的那些框架区。为了本发明的目的，人源化的抗体也可包括免疫球蛋白片段，如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其它抗原结合亚序列。

人源化的抗体也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人类免疫球蛋白恒定区的一部分。例如参见，Jones等人，(1986)Nature321:522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332:323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。

人源化非人类抗体的方法为本领域已知。通常，人源化的抗体具有一个或多个从非人类来源被引入其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”或“供体”残基，其通常获自“输入”或“供体”可变结构域。例如，人源化可主要根据Winter和同事的方法通过用啮齿类CDR或CDR序列代替相应的人类抗体序列来进行。例如参见，以上Jones等人；以上Riechmann等人和Verhoeyen等人，(1988)Science 239:1534-1536。因此，该“人源化的”抗体包括嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本少于完整的人类可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代。在某些实施方案中，人源化的抗体为其中一些CDR残基和任选的一些框架区残基被来自啮齿类抗体(如鼠类单克隆抗体)中的类似位点的残基取代。

人类抗体也可通过例如使用噬菌体展示库来产生。Hoogenboom等人，(1991)J.Mol.Biol,227:381；Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.222:581。用于制备人类单克隆抗体的其它方法在以下中描述：Cole等人，(1985)“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,”Alan R.Liss,p.77和Boerner等人，(1991)J.Immunol.147:86-95。

人类抗体可通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物中(如小鼠)而制备，其中在该小鼠中，内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。在免疫挑战下观察到了人类抗体的产生，其在各方面与在人类中所观察到的非常相似，包括基因重排、整合和抗体谱。该方法例如在以下描述：美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科学出版物中：Marks等人，(1992)Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人，(1994)Nature 368：856-859；Morrison(1994)Nature 368:812-813；Fishwald等人，(1996)Nature Biotechnology 14:845-851；Neuberger(1996)NatureBiotechnology 14:826；and Lonberg等人，(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93。

可使用上述已知的选择和/或诱变方法使抗体亲和力成熟。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体具有的亲和力为作为该成熟抗体制备来源的起始抗体(通常为鼠类、兔、鸡、人源化的或人类抗体)亲和力的五倍以上、十倍以上、二十倍以上或三十倍以上。

抗体也可为双特异性抗体。双特异性抗体为单克隆的，且可为人抗体或人源化抗体，其对至少两种不同的抗原具有结合特异性。在本发明中，所述两种不同的结合特异性可以是涉及两种不同的MMP或一种MMP(如MMP9)上的两个不同表位。

此处所述的抗体也可为免疫交联物。该免疫交联物包含与第二分子连接的抗体(如MMP9的抗体)，如报道子(reporter)。免疫交联物也可包含与细胞毒素剂连接的抗体，如化疗剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性交联物)。

“特异性结合至”特定的多肽或表位或对特定的多肽或表位“具有特异性”的抗体是指该抗体对靶标抗原或表位的特异性结合；这些术语和用来确定特异性结合的方法为本领域已知。如果相比于对其它物质，抗体与特定靶标抗原或表位结合的亲和力更大、亲合力(avidity)更大、更容易和/或持续时间更长，则该抗体对特定的靶标抗原或表位呈现“特异性结合”。在一些实施方案中，特异性结合至多肽或表位的抗体为仅结合至特定的多肽或表位而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的抗体。在一些实施方案中，所提供的抗体以等于或低于100nM、任选低于10nM、任选低于1nM、任选低于0.5nM、任选低于0.1nM、任选低于0.01nM或任选低于0.005nM、在某些实例中介于0.1和0.2nM或介于0.1和10pM、如介于0.4和9pM、如介于0.4和8.8pM的解离常数(K_d)以单克隆抗体、scFv、Fab或其它抗体形式特异性结合至人类MMP9，其是在约4℃、约25℃、约37℃或约42℃的温度测量的。

在某些实施方案中，本发明的抗体结合至MMP9中的一个或多个处理位点(如溶蛋白性裂解的位点)，从而有效阻断了酶原或前酶原转化为催化活性酶，且从而降低了MMP9的蛋白水解活性。

在某些实施方案中，本发明的抗体结合至MMP9，亲和力为其与另一种MMP结合的亲和力的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。结合亲和力可通过本领域已知的任意方法测量，且可被表达为例如结合速率、解离速率、解离常数(K_d)、平衡常数(K_eq)或本领域中的任何术语。

在某些实施方案中，根据本发明的抗体为抑制MMP9的酶活性(即催化活性)的抗体，如MMP9的催化活性的非竞争性抑制剂。在某些实施方案中，本发明的抗体在MMP9的催化结构域中结合。在其它的实施方案中，本发明的抗体在MMP9的催化结构域外结合。

还提供了与此处所述的任一抗-MMP9抗体或其抗原结合片段竞争结合MMP9的抗体或其抗原结合片段。因此，本发明涉及抗-MMP9抗体及其功能型片段，其与例如具有SEQ IDNO:1或5-8中任一个的重链多肽、SEQ ID NO:2或9-12中的任一个的轻链多肽或它们的组合的抗体竞争结合。在一个实施方案中，该抗-MMP9抗体或其功能性片段与此处所述为AB0041的抗体竞争结合至人MMP9。在一些实施方案中，该抗-MMP9抗体或其功能性片段与此处所述为AB0045的抗体竞争结合至人MMP9。在某个实施方案中，该抗-MMP9抗体或其功能性片段与此处所述为AB0046的抗体竞争结合至人MMP9。在其它实施方案中，该抗-MMP9抗体或其功能性片段与此处所述为M4的抗体竞争结合至人MMP9。在其它实施方案中，该抗-MMP9抗体或其功能性片段与此处所述为M12的抗体竞争结合至人MMP9。

还提供了与此处所述的任意一种或多种抗体结合至相同表位(如MMP9表位)的抗体及其片段。还提供了特异性结合至MMP9表位的抗体和片段，其中该表位包括在MMP9的特定区域内或MMP9的多个区域内的氨基酸残基。进一步提供了竞争结合至蛋白的抗-MMP9抗体或其抗原结合片段，或提供结合至此处所述的表位或区域的抗体。该区域可包括，例如MMP9的结构环和/或其它结构域，如经证明对于结合至此处所述的示例性抗体极为重要的那些。通常，根据在全长MMP9序列(如SEQ ID NO：27)上的氨基酸残基位置来限定该区域。在一些实例中，该表位包含SEQ ID NO：27的氨基酸残基104-202。在一个实例中，该表位包含SEQ ID NO：27的残基104-119、残基159-166或残基191-202区域内的氨基酸残基(即一个或多个氨基酸残基)。在一些方面，该表位包含在MMP9的区域即SEQ ID NO：27的残基104-119内的氨基酸残基(即一个或多个氨基酸残基)、在MMP9的区域即SEQ ID NO：27的残基159-166内的氨基酸残基(即一个或多个氨基酸残基)和在MMP9的区域即SEQ ID NO：27的残基191-202内的氨基酸残基(即一个或多个氨基酸残基)。在一些情况中，该表位包含SEQ IDNO：27的E111、D113、R162或1198。在一些情况中，其包含SEQ ID NO：27的R162。在一些情况中，其包含SEQ ID NO：27的E111、D113、R162和I198.

MMP9序列

人类MMP9蛋白的氨基酸序列如下：

MSLWQPLVLV LLVLGCCFAA PRQRQSTLVL FPGDLRTNLT DRQLAEEYLY 50

RYGYTRVAEM RGESKSLGPA LLLLQKQLSL PETGELDSAT LKAMRTPRCG 100

VPDLGRFQTF EGDLKWHHHN ITYWIQNYSE DLPRAVIDDA FARAFALWSA 150

VTPLTFTRVY SRDADIVIQF GVAEHGDGYP FDGKDGLLAH AFPPGPGIQG 200

DAHFDDDELW SLGKGVVVPT RFGNADGAAC HFPFIFEGRS YSACTTDGRS 250

DGLPWCSTTA NYDTDDRFGF CPSERLYTRD GNADGKPCQF PFIFQGQSYS 300

ACTTDGRSDG YRWCATTANY DRDKLFGFCP TRADSTVMGG NSAGELCVFP 350

FTFLGKEYST CTSEGRGDGR LWCATTSNFD SDKKWGFCPD QGYSLFLVAA 400

HEFGHALGLD HSSVPEALMY PMYRFTEGPP LHKDDVNGIR HLYGPRPEPE 450

PRPPTTTTPQ PTAPPTVCPT GPPTVHPSER PTAGPTGPPS AGPTGPPTAG 500

PSTATTVPLS PVDDACNVNI FDAIAEIGNQ LYLFKDGKYW RFSEGRGSRP 550

QGPFLIADKW PALPRKLDSV FEEPLSKKLF FFSGRQVWVY TGASVLGPRR 600

LDKLGLGADV AQVTGALRSG RGKMLLFSGR RLWRFDVKAQ MVDPRSASEV 650

DRMFPGVPLD THDVFQYREK AYPCQDRFYW RVSSRSELNQ VDQVGYVTYD700

ILQCPED(SEQ ID NO:27)

蛋白结构域图示于图3中，且如下所示：

成熟的全长人类MMP9的氨基酸序列(其为无信号肽的SEQ ID NO：27的前肽的氨基酸序列)为：

APRQRQSTLVL FPGDLRTNLT DRQLAEEYLY RYGYTRVAEM RGESKSLGPA LLLLQKQLSLPETGELDSAT LKAMRTPRCG VPDLGRFQTF EGDLKWHHH ITYWIQNYSE DLPRAVIDDA FARAFALWSAVTPLTFTRVY SRDADIVIQF GVAEHGDGYP FDGKDGLLAH AFPPGPGIQG DAHFDDDELW SLGKGVVVPTRFGNADGAAC HFPFIFEGRS YSACTTDGRS DGLPWCSTTA NYDTDDRFGF CPSERLYTRD GNADGKPCQFPFIFQGQSYS ACTTDGRSDG YRWCATTANY DRDKLFGFCP TRADSTVMGG NSAGELCVFP FTFLGKEYSTCTSEGRGDGR LWCATTSNFD SDKKWGFCPD QGYSLFLVAA HEFGHALGLD HSSVPEALMY PMYRFTEGPPLHKDDVNGIR HLYGPRPEPE PRPPTTTTPQ PTAPPTVCPT GPPTVHPSER PTAGPTGPPS AGPTGPPTAGPSTATTVPLS PVDDACNVNI FDAIAEIGNQ LYLFKDGKYW RFSEGRGSRP QGPFLIADKW PALPRKLDSVFEEPLSKKLF FFSGRQVWVY TGASVLGPRR LDKLGLGADV AQVTGALRSG RGKMLLFSGR RLWRFDVKAQMVDPRSASEV DRMFPGVPLD THDVFQYREK AYFCQDRFYW RVSSRSELNQ VDQVGYVTYD ILQCPED(SEQID NO:28)

信号肽的氨基酸序列为MSLWQPLVLVLLVLGCCFA(SEQ ID NO：29)。

还提供了MMP9多肽，包括MMP9多肽变体。该肽能够，例如，产生并选择此处提供的抗体和片段。示例性的多肽包括具有包含SEQ ID NO：27的残基111-198的氨基酸序列的那些以及具有包含SEQ ID NO：27的残基111-198的氨基酸序列并且其中在SEQ ID NO 27的残基111、113、162或198处有氨基酸取代或在所有这些残基处有氨基酸取代的那些。该多肽例如能够用于选择结合至包含该残基的表位的抗体和/或选择那些对于结合来说MMP9的这些残基是重要的抗体，例如此处所述的那些。

本发明涉及结合至MMP9的任何部分的MMP9结合蛋白，如人类MMP9，其中相对于其它尤其感兴趣的MMP，该MMP9结合蛋白优先结合MMP9。

抗-MMP9抗体及其功能性片段可根据本领域已知方法产生。以下提供示例性的抗-MMP9抗体。

小鼠单克隆抗-MMP9抗体

获得抗人类MMP9的小鼠单克隆抗体。该抗体包含小鼠IgG2b重链和小鼠κ轻链且被称为AB0041。

AB0041重链的氨基酸序列如下所示：

用下划线表示信号序列，且IgG2b恒定区的序列以斜体表示。没有信号肽，AB0041抗体的重链具有SEQ ID NO：58中所示的序列。

AB0041轻链的氨基酸序列如下所示：

信号序列以下划线表示，且κ恒定区的序列以斜体表示。没有信号肽，AB0041抗体的轻链具有SEQ ID NO：59中所示的序列。

以下氨基酸序列包含框架区和AB0041的IgG2b重链可变区的互补性决定区(CDR)(CDR以下划线表示)：

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:3)

以下氨基酸序列包含框架区和AB0041的κ轻链可变区的互补性决定区(CDR)(CDR以下划线表示)：

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVRNTVAWYQQKTGQSPKLLIYSSSYRNTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQHYITPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:4)

其它示例性的小鼠抗-人类MMP9抗体(如M4和M12)如此处所述。示例性的抗-小鼠MMP9抗体(AB0046)如此处所述。在一些实施方案中，提供了该抗-小鼠抗体作为用于测试和评估此处提供的MMP9抑制方法(如治疗方法)的替代抗体的用途。

重链变体

分别通过改变重链和轻链可变区内的框架区序列来修改AB0041重链和轻链的可变区的氨基酸序列。这些序列改变的效果是使人T-细胞表位缺失，从而减少或消除其在人类中的免疫原性(Antitope，Babraham，UK)。

在包含使铰链结构域稳定的S241P氨基酸改变的人类IgG4重链背景中构建了四个重链变体(Angal等人，(1993)Molec.Immunol.30：105-108)，且命名为VH1、VH2、VH3和VH4。它们的框架区和CDR的氨基酸序列如下所述：

VH1

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRLTISKDDSKSTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:5)

VH2

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRLTISKDDSKNTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)

VH3

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)

VH4

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTLYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)

图1显示了人源化的重链可变区的氨基酸序列的比对，并表明在四种变体的框架区内氨基酸序列的不同。

轻链变体

在人类κ链背景中构建了四个轻链变体且命名为Vk1、Vk2、Vk3和Vk4。它们的框架区和CDR的氨基酸序列如下所述：

Vk1

DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKTGKAPKLLIYSSSYRNTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:9)

Vk2

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSYRNTGVPDRPTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:10)

Vk3

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSYRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:11)

Vk4

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSYRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYITPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)

图2显示了人源化的轻链可变区的氨基酸序列的比对并表明在四种变体的框架区内氨基酸序列的不同。

人源化的重链和轻链以所有可能的配对组合结合，以产生多种功能型人源化抗-MMP9抗体。例如，提供了具有任意SEQ ID NO：3、5、6、7和8中所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区的抗体；具有任意SEQ ID NO：4、9、10、11和12中所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区的抗体；具有任意SEQ ID NO：3、5、6、7和8中所示的氨基酸序列的重链可变(VH)区和任意SEQ ID NO：4、9、10、11和12中所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)区的抗体，以及同这些抗体以及与这些抗体具有至少或约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％以上的序列同一性的抗体竞争结合至MMP9的抗体。在一个实例中，该抗体具有与SEQ ID NO：7具有至少约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％以上的序列同一性的氨基酸序列的VH区和与SEQ ID NO：12具有至少或约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％以上的序列同一性的氨基酸序列的VL区，或具有SEQ ID NO：7的VH区和SEQ ID NO：12的VL区。在其它实例中，该抗体具有与SEQ ID NO：7具有至少或约95％、约96％、约97％、约98％、约99％以上的序列同一性的氨基酸序列的VH区。在其它实例中，该抗体具有与SEQ ID NO：12具有至少或约95％、约96％、约97％、约98％、约99％以上的序列同一性的氨基酸序列的VL区。在一些实例中，该抗体具有SEQ ID NO：7的VH区和SEQ ID NO：12的VL区。

还提供了与此处公开的重链可变区序列具有75％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上同源性的其它重链可变区氨基酸序列。此外，还提供了与此处公开的轻链可变区序列具有75％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上同源性的其它轻链可变区氨基酸序列。

还提供了与此处公开的重链可变区序列具有75％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上的序列同一性的其它重链可变区氨基酸序列。此外，还提供了与此处公开的轻链可变区序列具有75％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上的序列同一性的其它轻链可变区氨基酸序列。

互补性决定区(CDR)

在一些实施方案中，此处公开的示例性提供的抗-MMP9抗体的重链CDR具有以下氨基酸序列：

CDR1:GFSLLSYGVH(SEQ ID NO:13)

CDR2:VIWTGGTTNYNSALMS(SEQ ID NO:14)

CDR3:YYYGMDY(SEQ ID NO:15)

因此，在提供的抗-MMP9抗体中包括具有SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列的重链CDR1区的抗体、具有SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列的重链CDR2区的抗体和具有SEQID NO：15中所示的氨基酸序列的重链CDR3区的抗体和与这些抗体竞争结合或结合至与这些抗体相同的MMP9表位的抗体。在一些情况中，该抗体包含具有SEQ ID NO：15中所示的序列的VH CDR。在一些情况中，该抗体包含具有SEQ ID NO：13和14中所示的序列的VH CDR。在一些情况中，该抗体包含具有SEQ ID NO：13和15中所示的序列的VH CDR。在一些情况中，该抗体包含具有SEQ ID NO：14和15中所示序列的VH CDR。在一些情况中，该抗体包含具有SEQID NO：13、14和15中所示序列的VH CDR。

在一些实施方案中，此处公开的示例性抗-MMP9抗体的轻链的CDR具有以下氨基酸序列：

CDR1:KASQDVRNTVA(SEQ ID NO:16)

CDR2:SSSYRNT(SEQ ID NO:17)

CDR3:QQHYITPYT(SEQ ID NO:18)

因此，在提供的抗-MMP9抗体中包括具有SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列的轻链CDR1区的抗体、具有SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列的轻链CDR2区的抗体和具有SEQID NO：18中所示的氨基酸序列的轻链CDR3区的抗体和与这些抗体竞争结合或结合至与这些抗体相同的MMP9表位的抗体。在一些情况中，抗体包含具有SEQ ID NO：18中所示的序列的VL CDR。在一些情况中，抗体包含具有SEQ ID NO：16和17中所示的序列的VL CDR。在一些情况中，抗体包含具有SEQ ID NO：16和18中所示的序列的VL CDR。在一些情况中，抗体包含具有SEQ ID NO：17和18中所示的序列的VL CDR。在一些情况中，抗体包含具有SEQ ID NO：16、17和18中所示的序列的VL CDR。

示例性的人源化抗-MMP9抗体变体，AB0045(人源化经修饰的IgG4(S241P))包含人源化AB0041重链变体VH3(具有SEQ ID NO：7中所示的序列

(QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTLVTVSS)和人源化的AB0041轻链变体VH4(具有Vk4中所示的轻链序列(具有SEQ ID NO：12中所示的序列

(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPK上LIYSSSYRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYITPYTFGGGTKVEIK))。

AB0045抗体包含1312个氨基酸的长度，其由两个重链和两个轻链组成，并具有约7.90的理论pI，对于1g/L在280nm约1.50AU/cm的消光系数，约144kDa的分子量和在制剂缓冲液中(50-100mg/mL产物浓度)约1g/mL的密度。

AB0045抗体的重链具有SEQ ID NO：49中所示的序列

(信号序列为下划线；恒定区的序列以斜体表示))；AB0045抗体的轻链具有SEQ ID NO：50中所示的序列

(信号序列为下划线；恒定区的序列以斜体表示)。没有信号肽，AB0045抗体的重链具有SEQ ID NO：56所示的序列

且AB0045抗体的轻链具有SEQ ID NO：57中所示的序列

(恒定区以斜体表示)。

抗体进一步包括通过被称为M4的杂交瘤而产生的那些，即该抗体包含重链(IgG2b)序列：

(信号肽显示为下划线文本，可变区显示为无格式文本且恒定区显示为斜体)；和轻链(κ)序列：

(信号肽显示为下划线文本，可变区显示为无格式文本且恒定区显示为斜体)(SEQ ID NO：31)。M4抗体具有：可变重链，其氨基酸序列为：

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGSTNYNSALMSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARYYYAMDYWGQGTSVTVSS(CDR1、2和3(分别为SEQ ID NO：34、35和36，)，以下划线表示)(SEQ ID NO：32)；和可变轻链，其氨基酸序列为：

DIVMTQSHKFMFTSVGDRVSITCKASQDVRNTVAWYQQKTGQSPKLLIYSASYRNTGVPDRFTGSISGTDFTFTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPYTFGGGTKLEVK(CDR 1、2和3(分别为SEQ ID NO：37、38和39)，以下划线表示)(SEQ ID NO：33)。

抗体进一步包括通过被称为M12的杂交瘤而产生的那些，即仅具有一条κ链的抗体，具有以下序列：

(信号肽显示为下划线文本，可变区显示为无格式文本且恒定区显示为斜体)(SEQ ID NO：40)。M12抗体具有可变轻链，其氨基酸序列为

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRFSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIK(CDR1、2和3(分别为SEQ ID NO：42、43和44)，以下划线表示)(SEQ ID NO：41)。图4中显示了被称为M4、AB0041和M12的抗体的重链部分的序列比较(分别为SEQ ID NO：51、52和53)和被称为M4和AB0041的抗体的轻链部分的序列比较(分别为SEQ ID NO：54和55)。M4的部分轻链(即具有经截短的恒定区的轻链)的氨基酸序列为

MESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMFTSVGDRVSITCKASQDVRNTVAWYQQKTGQSPKLLIYSASYRNTGVPDRFTGSISGTDFTFTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPYTFGGGTKLEVKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSG(SEQID NO：51)；AB0041的部分轻链(即具有经截短的恒定区的轻链)为

MESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVRNTVAWYQQKTGQSPKLLIYSSSYRNTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQHYITPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSG(SEQID NO：52)；M12的部分轻链(即具有经截短的恒定区的轻链)为

QVFVYMLLWLSGVDGDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRFSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSG(SEQ ID NO：53)；M4的部分重链(即具有经截短的恒定区的重链)为

MAVLVLFLCLVAFPSCVLSQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGSTNYNSALMSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARYYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSL(SEQ ID NO：54)；且AB0041的部分重链(即具有经截短的恒定区的重链)为

MAVLVLFLCLVAFPSCVLSQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSL(SEQ ID NO：55)。

抗体进一步包括被称为AB0046的小鼠抗体，其具有如下氨基酸序列的κ轻链

(信号肽显示为下划线文本，可变区显示为无格式文本且恒定区显示为斜体)；和如下氨基酸序列的IgG1重链

(信号肽显示为下划线文本，可变区显示为无格式文本且恒定区显示为斜体)。

以下氨基酸序列包含AB0046的IgG1重链可变区的框架区和互补性决定区(CDR)(CDR以下划线表示)：

QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCTASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGEIYPISGRTNYNEKFKVKATLTVDTSSSTAYMDLNSLTSEDSAVYYCARSRANWDDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：47)。

以下氨基酸序列包含AB0046的κ轻链可变区的框架区和互补性决定区(CDR)(CDR以下划线表示)：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTFKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYGWLPRTFGGGTK上EIK(SEQ ID NO：48)。

用于本发明所提供的方法、组合物和组合的抗体可包括任何此处所述的抗体，包括抗体和抗体片段，包括含有各种示例性的重链和轻链、重链和轻链可变区和CDR的任何组合的那些。通过举例的方式，本发明提供的方法、组合物和组合包含抗体或其抗原结合片段，其包含以下任一氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。一些实施方案提供了方法、组合物和组合，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7和12的氨基酸序列。某些实施方案提供了方法、组合物和组合，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18的氨基酸序列。

编码抗-MMP9抗体的核酸

本发明提供了编码抗-MMP9抗体的核酸及其功能性片段。因此，本发明提供了编码此处所述的抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸(核酸)、包含该多核苷酸的载体和用于将该多核苷酸转录和翻译成多肽的宿主细胞和表达系统。

本发明还涉及质粒、载体、转录子或表达盒形式的构建体，其包含至少一种上述多核苷酸。

本发明还提供包含一种或多种上述构建体的重组宿主细胞，以及产生此处所述的抗体其抗原结合片段的方法，其中该方法包括在重组宿主细胞中表达编码重链多肽和轻链多肽的核酸(在相同或不同的宿主细胞中并来自相同或不同的构建体)。表达可以通过在适合的条件下培养包含该核酸的重组宿主细胞而实现。在表达产生后，可使用任何合适的技术分离和/或纯化抗体或抗原结合片段，然后视需要使用。

用于在各种不同宿主细胞中克隆并表达多肽的系统是已知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可用的用来表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼地鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞和许多其它细胞。常用的细菌宿主为大肠杆菌(E.coli)。

可选择或构建合适的载体，其包含合适的调节序列，包括人工连接的启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和/或其它合适的序列。载体可视需要为合适的质粒、病毒，如噬菌体或噬菌粒。关于进一步的细节，参见例如MolecularCloning：a Laboratory Manual：第2版，Sambrook等人，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press。在以下详细描述了很多已知的用来处理核酸的技术和方案，例如制备-核酸构建体，诱变，测序，将DNA引入细胞中并进行基因表达以及分析蛋白：ShortProtocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等人，eds.，John Wiley&Sons，1992。Sambrook等人和Ausubel等人的公开全部合并于此以用于参考。

编码感兴趣的多肽的核酸被整合进入宿主细胞的染色体，或可作为稳定或不稳定的游离体元素保留下来。

多种表达控制序列(控制被人工与其连接的DNA序列的表达的序列)中的任一种可被用于这些载体中以表达DNA序列。例如，编码感兴趣的多肽的核酸可与启动子人工相连并在表达构建体中提供，以用于产生重组MMP9蛋白或其部分的方法中。

本领域技术人员知晓，可使用分子生物学领域的标准常识和方法来合成编码此处公开的抗体链的核酸。

编码此处公开的重链和轻链氨基酸序列的核苷酸序列的实例如下：

VH1:CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC ACTGTCCCTGACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGGAAGGGCCTGGAATG GCTGGGCGTG ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA TGTCCCGGCTGACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGTCCAC CGTGTACCTG AAGATGAACT CCCTGAAAAC CGAGGACACCGCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCTCC GTGACCGTGTCCTCA(SEQ ID NO：19)

VH2:CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC ACTGTCCCTGACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAGGCCTGGAATG GCTGGGCGTG ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA TGTCCCGGCTGACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CGTGTACCTGAAGATGAACT CCCTGAAAAC CGAGGACACCGCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCTG GTCACCGTGTCCTCA(SEQ ID NO：20)

VH3:CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC ACTGTCCCTGACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAGGCCTGGAATG GCTGGGCGTG ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA TGTCCCGGTTCACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CGTGTACCTG AAGATGAACT CCCTGAAAAC CGAGGACACCGCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCTG GTCACCGTGTCCTCA(SEQ ID NO:21)

VH4:CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC ACTGTCCCTGACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAGGCCTGGAATG GCTGGGCGTG ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGATGTCCCGGTTCACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CCTGTACCTG AAGATGAACT CCCTGAAAAC CGAGGACACCGCCATCTACT ACTGCGCCCGGTACTACTAC GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCTG GTCACCGTGTCCTCA(SEQ ID NO:22)

Vk1:GACATCGTGA TGACCCAGTC CCCCAGCTTC CTGTCCGCCT CCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG CCTGGTATCA GCAGAAAACC GGCAAGGCCCCCAAGCTGCT GATCTACTCC TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTTACCG GCTCTGGCTCCGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG CCGTGTACTT CTGCCAGCAGCACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA GGCACCAAGG TGGAAATAAA A(SEQ ID NO:23)

Vk2:GACATCGTGA TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCCCCAAGCTGCT GATCTACTCC TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTTACCG GCTCTGGCTCCGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG CCGTGTACTT CTGCCAGCAGCACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA GGCACCAAGG TGGAAATAAA A(SEQ ID NO:24)

Vk3:GACATCCAGA TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACATGCA AGGCCTCCCA GGACGTGCGG AACACCGTGG CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCCCCAAGCTGCT GATCTACTCC TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTCTCTG GCTCTGGAAGCGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG CCGTGTACTT CTGCCAGCAGCACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA GGCACCAAGG TGGAAATAAA A(SEQ ID NO:25)

Vk4:GACATCCAGA TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCCCCAAGCTGCT GATCTACTCC TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTCTCTG GCTCTGGAAGCGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG CCGTGTACTA CTGCCAGCAGCACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA GGCACCAAGG TGGAAATAAA A(SEQ ID NO:26)

由于抗体的结构(包括可变区内CDR和框架区的并置、框架区的结构以及重链和轻链恒定区的结构)在本领域已知；获得编码抗-MMP-9抗体的相关核酸也属于本领域技术人员已知的范围内。因此，还提供了多核苷酸，其包含与此处所公开的任何核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％和至少99％的同源性的核酸序列。因此还提供了多核苷酸，其包含与此处所公开的任何核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％和至少99％同一性的核酸序列。在一个实例中，该多核苷酸包含与SEQ ID NO：21至少或约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的序列同一性，或包含SEQ ID NO：21或为SEQ ID NO：21，和/或包含与SEQ ID NO：26至少或约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的序列同一性，或包含SEQ ID NO：26或为SEQ ID NO：26。

药物组合物

MMP9结合蛋白以及编码MMP9结合蛋白的核酸(如DNA或RNA)可作为药物组合物提供，如与可药用的载剂或赋形剂组合。该药物组合物例如能用于体内或离体给药至受试者，并用于在任何此处提供的任意治疗或诊断方法中用MMP9结合蛋白诊断和/或治疗受试者。

可药用的载剂或赋形剂对被给药的患者是生理可接受的，且保留与其一起进行给药的抗体或肽的治疗性质。可药用的载剂或赋形剂以及它们的制剂在例如以下被一般性地描述：Remington’pharmaceutical Sciences(第18版，ed.A.Gennaro,Mack PublishingCo.,Easton,PA 1990)。一个示例性地药物载剂为生理盐水。各载剂或赋形剂从与制剂的其它成分可相容以及基本对患者无害的意义上来说为“可药用的”。

药物组合物可被配制为与具体的给药途径(全身或局部)可相容。因而，药物组合物包含适合以多种途径给药的载剂、稀释剂或赋形剂。

药物组合物可包含可药用添加剂。添加剂的实例包括但不限于：糖，如甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、葡聚糖、右旋糖、果糖、乳糖及其混合物。可药用的添加剂可与可药用的载剂和/或赋形剂如右旋糖组合。添加剂还可包括表面活性剂，如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。

制剂和递送方法通常根据位点和需要治疗的疾病进行调节。示例性的制剂包括但不限于：适合胃肠外给药的那些，如静脉内、动脉内、肌内或皮下给药或口服给药。在一个实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂通过静脉内给药而递送(其可被称作静脉内输注)。在一些实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂通过皮下给药递送(其可被称作皮下注射)。

用于胃肠外递送的药物组合物包含例如：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、汉克氏溶液、林格氏溶液、右旋糖/盐水和葡萄糖溶液。制剂可含有助剂物质以接近生理条件，所述助剂物质如缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、清洁剂(detergent)等。添加剂还可包括其它活性成分，如杀细菌剂或稳定剂。例如，溶液可含有醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯或油酸三乙醇胺。其它胃肠外制剂和方法描述于以下中：Bai(1997)J.Neuroimmunol.80:65 75；Warren(1997)J.Neurol.Sci.152:31 38；and Tonegawa(1997)J.Exp.Med.186:507 515。胃肠外制剂可封入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

用于静脉内、皮内或皮下给药的药物组合物可包含：无菌稀释液，如水、盐水溶液、不挥发性油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸、谷胱甘肽或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。

用于注射的药物组合物包括水溶液(在为水溶性的情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF、Parsippany、N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载剂可为溶剂或分散性介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。可例如通过使用例如卵磷脂的涂层、通过在分散液情况下维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持流动性。抗细菌剂和抗真菌剂包括例如：对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞(thimerosal)。组合物中可包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)和氯化钠。所得溶液可经包装原样使用或冻干；冻干制剂可稍后在递送之前与无菌溶液合并。

可药用的载剂可含有稳定、增加或延迟吸收或清除的化合物。所述化合物包括例如：碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；低分子量蛋白质；减少肽的清除或水解的组合物；或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。延迟吸收的试剂包括例如：单硬脂酸铝和明胶。清洁剂液可用于使药物组合物(包括脂质体载剂)稳定或使其吸收增大或减小。为了防止消化，化合物可与组合物复合以使得其耐酸水解和耐酶促水解，或者化合物可复合于适当耐受性的载剂(如脂质体)中。保护化合物免于消化的方式为本领域已知(参见，如Fix(1996)Pharm Res.13:1760 1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48:119 135；和美国专利5,391,377，描述了用于口服递送治疗剂的脂质组合物)。

本发明的组合物可与此处提供的其它治疗部分或成像/诊断部分组合。治疗部分和/或成像部分可作为独立组合物或作为存在于MMP9结合蛋白上的结合部分提供。

用于体内给药的制剂通常是无菌的。在一个实施方案中，药物组合物被配制为不含热源，使得其对于给药至人类患者而言是可接受的。

本领域技术人员根据本发明将获知各种其它药物组合物以及其制备和使用的技术。对于适合的药理学组合物和相关给药技术的详情清单，可参考本文中的详细教导，所述教导可由以下教科书进一步补充：如Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版(Lippincott,Williams&Wilkins2003)。

药物组合物可基于需要治疗的患者/受试者的身体特征、给药途径等配制。所述药物组合物可包装于具有适当标签的适合药物包装中以用于向医院和诊所分配，其中所述标签是指示用于治疗受试者中如此处所述的疾病。药物可以单个或多个单元形式包装。本发明的药物组合物的剂量和给药说明书可包括在如下所述的药物包装和试剂盒内。

使用方法

本发明的MMP9结合蛋白(包括抗-MMP9抗体及其片段)可用于例如治疗和诊断方法中，如检测样品中MMP9的方法、治疗方法(如抑制血管生成的方法)和诊断和预后方法。因而，提供了抗-MMP9抗体的诊断和治疗的方法及用途。使用方法的实例描述如下。

治疗方法

本申请提供了治疗和/或预防慢性阻塞性肺病(COPD)的方法。

如此处所用，术语“治疗”是指被设计为在COPD的临床病理过程中改变所治疗的个体或细胞的天然进程的临床干预(如给药此处所述的MMP9结合蛋白)。期望的治疗效果包括降低疾病发展的速度或死亡率、改善或缓解疾病状态和缓和或改进预后。在一些实施方案中，该治疗改进了COPD症状、降低COPD恶化的频率或严重程度、改善肺功能、患者报告的COPD症状(如运动耐量和生存质量)。当患者经历以下时则实现了响应：疾病征兆或症状的部分或全部的缓和或减轻，具体包括但不限于：延长生存并改善命质量。例如，如果与COPD相关的一种或多种症状被缓和或消除，则认为患者被成功“治疗”。

如此处所用，“与……结合”是指除了一种治疗模式外还给药另一种治疗模式。由此，“与……结合”是指在向个体给药其它治疗模式之前、其间或之后给药一种治疗模式(如此处所述的MMP9结合蛋白)。

如此处所用，术语“防止”包括根据个体中COPD的发生或复发提供预防。个体可以易感染COPD、对COPD敏感或具有发展COPD的风险，但还没有被诊断患有该疾病。在一些实施方案中，此处所述的MMP9结合蛋白被用于延缓COPD的发展。在一些实施方案中，此处所述的MMP9结合蛋白防止COPD恶化和/或防止肺功能衰退或肺组织故障。

如此处所用，具有发展COPD“风险”的个体在用此处所述的治疗方法治疗前可以具有或可以不具有可检测的疾病或疾病的症状，且可以显示或可以不显示可检测的疾病或疾病的症状。“具有风险”是指个体具有本领域已知的一个或多个风险因素，其为与COPD的发展有关的可测量参数。相比于不具有一个或多个这些风险因素的个体，具有这些风险因素中的一个或多个的个体具有更高的发展成COPD的可能性。

“有效量”是指在剂量处以及在必要的一段时间内至少有效实现期望的或指定的效果(包括治疗结果或预防结果)的量。有效量可在一次或多次给药中提供。

“治疗有效量”至少为实现对具体疾病的可测量的改善所需的最低浓度。此处的治疗有效量可根据多种因素而改变，如疾病状态、患者的年龄、性别和体重以及抗体在个体内引发期望的响应的能力。此外，在治疗有效量下，治疗有益效果超出抗体的任何毒性或有害效果。

因而，当给药至受试者时(无论是单独给药或与其它治疗剂组合，以下会详细说明)，治疗剂的治疗有效量能够有效防止或减轻疾病状况或疾病的发展，或导致症状减轻，例如对相关医学状况的治疗、治愈、预防或减缓，或增加对该状况的治疗、治愈、预防或减缓的速率。当向个体单独给药活性成分时，治疗有效剂量仅指该成分。当组合给药时，治疗有效剂量是指产生疗效的活性成分的组合量，不管是组合给药、连续给药或同时给药。

“预防有效量”是指在剂量处以及在必要的一段时间内有效实现期望的预防效果的量。通常但不是必需地，由于在疾病之前或疾病早期在受试者中使用该预防剂量，因此预防有效量可低于治疗有效量。

通常，MMP9结合蛋白以治疗有效量给药，如以引起抑制MMP9活性或治疗COPD的量给药。

在某些实施方案中，此处所述的MMP9结合蛋白(如结合MMP9的抗体或其功能性片段)以一周、两周或三周的间隔或每周一次、每两周一次或每三周一次给药。在某些实施方案中，此处所述的MMP9结合蛋白(如结合MMP9的抗体或其功能性片段)可每天给药或以低于每天的频率给药，例如，每周六次、每周五次、每周四次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。在一些实施方案中，该治疗包括至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次给药。该组合物也可在持续释放制剂中给药，如在一段时间内逐渐释放组合物以加以使用并允许该组合物以更低的频率给药(如每月一次、每2-6月一次、每年一次或甚至仅一次给药)的植入物中。而且，该治疗为连续的。在一个实施方案中，所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂每周给药一次。在某个实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂每两周给药一次。

MMP9结合蛋白可通过任何途径向个体给药，包括但不限于：静脉内(如通过输液泵)、腹膜内、动脉内、肺内、口服、吸入、囊内、肌内、气管内、皮下、鞘内、经皮、经胸膜、局部、吸入性(如作为喷雾)、粘膜(如通过鼻粘膜)、皮下、经皮、胃肠、关节内、脑池内或心室内。在一些实施方案中，该组合物被全身性给药(例如通过静脉内注射)。在一些实施方案中，MMP9结合蛋白被局部给药(例如通过动脉内或注射)。在一些实施方案中，MMP9结合蛋白被皮下给药。在一些实施方案中，MMP9结合蛋白被皮内给药。在一些实施方案中，MMP9结合蛋白通过吸入给药。在一些实施方案中，MMP9结合蛋白经粘膜给药。在一个实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂通过每两周两次的静脉内给药(即静脉内输注)而递送。在某个实施方案中，抗-MMP9或其抗原结合片段、其组合物或制剂通过每周一次的皮下给药递送。

在一些实施方案中，结合MMP9的抗体或其抗原结合片段以每个受试者约25mg至每个受试者约800mg给药。在一些实施方案中，结合MMP9的抗体或其抗原结合片段以每个受试者约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg或约800mg(包括介于这些值之间的任何范围)给药。在某些实施方案中，结合MMP9的抗体(即抗-MMP9抗体)或其抗原结合片段以每个受试者约150mg、约250mg、约350mg、约450mg、约550mg、约650mg或约750mg(包括介于这些值之间的任何范围)给药。在一些实施方案中，上述剂量的抗体或其抗原结合片段每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次、每月给药一次、每两个月给药一次、每三个月给药一次或每六个月给药一次。在一些实施方案中，结合MMP9的抗体或其抗原结合片段以每两周约400mg给药一次。在某些实施方案中，结合MMP9的抗体或其抗原结合片段以每两周约200mg向受试者给药一次。在某个实施方案中，结合MMP9的抗体或其抗原结合片段以每周约150mg向受试者给药一次。在某个实施方案中，结合MMP9的抗体或其抗原结合片段以每周约300mg向受试者给药一次。在某些实施方案中，结合至MMP9的抗体或其抗原结合片段以两步法向受试者给药：首先，负荷剂量阶段(更频繁地给药，以覆盖“靶标库”/“组织和血清库(sink)”或与疾病相关的MMP9的高基线浓度，其中给药范围为以每周约200mg、约300mg或约400mg的剂量向受试者给药，间隔为一周、两周或三周或更频繁地给药，从而覆盖“靶标库”或与疾病相关的MMP9的高基线浓度)；和第二，一旦在负荷剂量阶段后建立了可预测的pK，则给予较低的每周剂量，如150mg/周、125mg/周、100mg/周或50mg/周。在一些实施方案中，较低的每周剂量可以是在一周的基础上更低，如150mg/周、125mg/周、100mg/周或50mg/周。在一个实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂以每两周约400mg静脉内给药一次(即静脉内输注)。在一个实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂以每两周约200mg静脉内给药一次。在一个实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂以每周约150mg皮下给药一次(即皮下注射)。在一个实施方案中，抗-MMP9抗体或其抗原结合片段、其组合物或制剂以每两周约300mg皮下给药一次。

所选择的剂量方案取决于多种因素，包括MMP9结合蛋白的活性、给药途径、给药时间、所使用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的具体组合物一起使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和药物前史等医药领域已知的因素。

在一些实施方案中，根据显示出靶标介导的处置(disposition)的抗体的药代动力学模型确定剂量。与对于针对可溶性受体靶标的抗体所观察到的相对线性的药代动力学相反，针对基于组织的靶标受体的抗体通常显示非线性药代动力学。Mager,D.E.(2006),Adv Drug Deliv Rev 58(12-13)：1326-1356。非线性处置的基础与抗体对靶标的高亲和力结合以及(相对于剂量)结合的程度有关，由此该相互作用反映在抗体的药代动力学特性中。Mager,D.E.and W.J.Jusko(2001),J Pharmacokinet Pharmacodyn 28(6)：507-532。靶标介导的药物处置中包括受体介导的抗体-受体复合物的内吞作用(内化)。Wang,W.,E.Q.Wang,等人，(2008),Clin Pharmacol Ther 84(5)：548-558。

在有关具有靶标介导的处置的抗体的药代动力学模型中，当不存在药物(抗体)时，靶标受体以恒定速率合成并且通过一级过程消除。因此，靶标受体在不存在药物(抗体)的情况下是以稳态浓度存在的。当将药物添加至体内时，其可与靶标受体通过双分子反应相互作用，分配到灌注不太好的组织中，获经由一级过程消除。在较低的药物浓度下，药物因高亲和力结合而主要移动到受体上。由于进入体内的药物量变得足以结合可用质量的受体，故药物分配到组织中和组织外并且被消除。当药物浓度降低并且组织中的药物达到平衡时，其提供另外的储集器以结合新合成的受体。

具有所属领域普通技术的临床医生能够容易地确定所需药物组合物的有效量(ED50)并开具处方。例如，医师或兽医可以比实现期望的治疗效果所需的水平更低的水平开始给药在药物组合物中使用的本发明的化合物并逐步增加剂量，直到实现期望的效果。

在一些情况中，治疗方法包括试剂，如抗-MMP9抗体或含有其的组合物的胃肠外给药，如静脉内、动脉内、皮内、肌内或皮下给药或口服给药。

如此处所用，术语“受试者”是指哺乳动物个体。示例性的受试者包括但不限于：人类、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、山羊和绵羊。在一些实施方案中，受试者患有COPD，并且可用以下所述的本发明的试剂治疗。在某个实施方案中，受试者为被诊断患有或怀疑患有COPD的患者。必要时，为进行治疗，方法可进一步包括其它疗法，如以下所列的那些。其它抗-COPD试剂或治疗的给药可与此处公开的组合物的给药同时或依次进行。而且，患有COPD的受试者此前可以接受或未接受任何COPD治疗。

在一些实施方案中，结合MMP9的抗体或其抗原结合片段作为单一疗法单独给药。在其它实施方案中，该抗体作为与一种或多种其它用于治疗COPD的治疗剂的组合疗法的一部分给药。治疗剂包括但不限于：1)短效β2激动剂(例如，柳丁氨醇(沙丁胺醇)、左旋沙丁胺醇、非诺特罗、特布他林)；2)短效抗胆碱能类药物(例如，异丙托溴铵、氧托溴铵)；3)长效β-2激动剂(例如，福莫特罗、阿福特罗、茚达特罗、沙美特罗、妥布特罗)；4)长效抗胆碱能类药物(例如，阿地溴铵、格隆溴铵、噻托溴铵)；5)短效β-2激动剂与抗胆碱能类药物的组合(例如，非诺特罗/异丙托铵、柳丁氨醇/异丙托铵)；6)吸入性皮质激素(例如，倍氯米松、布地奈德、氟替卡松)；7)长效β-2激动剂与皮质激素的组合(例如，福莫特罗/布地奈德、福莫特罗/莫米松、沙美特罗/氟替卡松)；8)甲基黄嘌呤(例如，氨茶碱、茶碱)；9)磷酸二酯酶-4抑制剂(如罗氟司特)；10)全身性皮质激素(例如，泼尼松、甲基泼尼松龙)。在组合疗法中，本申请的抗体在治疗有此需要的患者中可被用作主要或一线试剂或者被用作第二或额外试剂。在一些实施方案中，本申请的抗体在治疗有此需要的患者中可被用作第二或额外试剂。在一个实施方案中，MMP9抗体或其抗原结合片段可与选自以下的治疗剂组合：短效β-2激动剂、短效抗胆碱能药、长效β-2激动剂和长效抗胆碱能药；并且抗-MMP9抗体或其抗原结合片段与所述一种或多种治疗剂的任意组合可进一步与以下组合：β-2激动剂、抗胆碱能药、吸入性皮质激素、全身性皮质激素、甲基黄嘌呤或磷酸二酯酶-4抑制剂。通过举例的方式，MMP9抗体或其抗原结合片段可与β-2激动剂(长效或短效)和甲基黄嘌呤组合。

在一些方面中，结合MMP9或其抗原结合片段的抗体的剂量可被调整并以约133mg/Kg体重、约267mg/Kg体重、约400mg/Kg体重、约600mg/Kg体重或约1200mg/Kg体重给药(包括介于这些值之间的任意范围)。在每次治疗周期后，监控患者的MMP9抗体、MMP9或其它合适的生物标记物的水平。

组合疗法中的试剂可经由上述适合的途径同时(在同一组合物中或分开地)或以任何次序依次给药。

在一些实施方案中，治疗方法包括用于监控治疗的步骤，包括监控功效或活性(如药效学活性)。在一些实例中，该方法包括检测或测量从用所述方法和组合物治疗的受试者获得的生物测试样品中标记物(如细胞因子和指示治疗功效并且可作用为直接通过剪切被释放到血清中或由于MMP9活性而储存在细胞外基质中的MMP9底物的其它炎性标记物)的存在、不存在、水平和/或表达。该样品通常为血液样品或血清样品，但还可包括如此处所述的其它生物样品。在一个实施方案中，生物测试样品为获自使用本申请的方法被诊断患有或怀疑患有COPD的受试者的痰。用于该方法中的标记物包括：金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)、白细胞介素-17A(IL-17A)、CXCL10、淋巴细胞趋化蛋白、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、抑瘤素-M(OSM)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、单核细胞趋化蛋白-5(MCP-5)、白细胞介素-1α(IL-1α)、巨噬细胞集落刺激因子-1(M-CSF-1)、髓过氧化物酶(MPO)、生长调控α蛋白(KC/GRO)、白细胞介素-7(IL-7)、白血病抑制因子(LIF)、载脂蛋白A-I(Apo A-I)、C反应蛋白(CRP)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、白细胞介素-11(IL-11)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、温韦伯氏因子(vWF)、RANK配体、CCL-5和干细胞因子(SCF)基因产物。在该方法中使用的其它标记物可包括由MMP9活性产生的锁链素、弹力蛋白和胶原蛋白片段。这些标记物反映了由疾病进程造成的局部组织损伤。这些局部组织损伤的产物可最终进入血清并可在血清中检测。

在一些实施方案中，在每个治疗周期之后，监控患者的MMP9抗体、MMP9或其它合适的生物标记物的水平。

所提供的方法中包括相比于可用的治疗和治疗方案在治疗COPD中提供了改善的安全性和/或持续的长期功效的方法。

慢性阻塞性肺病(COPD)

此处所述的MMP9结合蛋白，如结合MMP9的抗体及其片段，被用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)，如通过在患有COPD的患者中抑制MMP9。

COPD，也被称为慢性阻塞性肺部疾病(COLD)或慢性阻塞性气道疾病(COAD)，是指一组进行性阻塞性肺病(例如肺气肿和慢性支气管炎)其特征为较差的气流(气流限制)以及无法完全呼气(空气滞留)。较差的气流是肺部结缔组织损伤的结果，这接着导致较差的气流以及呼吸道气体较差的吸收和释放。COPD的标志和症状包括但不限于，如呼吸短促(尤其是在体力活动后)、喘息、胸闷、肺中粘液过多、带痰的慢性咳嗽(该痰可为清痰、白痰、黄痰或绿痰)、发绀(即嘴唇和指甲床发青)、频繁的呼吸道感染、疲劳以及在晚期阶段非故意的体重减少。患有COPD的患者可经历被称为恶化的发作，期间他们的症状变差且持续几天或更久。频繁经历恶化的患者其肺功能更快衰竭。

COPD发展为对吸入的刺激物的严重的慢性炎症反应。COPD的已知原因包括：吸烟、空气污染(如暴露在通风较差的厨房火焰下、经常以煤或生物体燃料(如木头或动物粪便)作为燃料、城市空气污染、排气)和职业暴露(如长期暴露在工作场所的粉尘、化学品或烟雾中)。遗传学在COPD的发展中可起到作用。目前，唯一的遗传风险为α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏。恶化(即症状突然变差)通常由感染、环境污染物或药物的不当使用诱发。

通常使用肺活量测定法(即测量肺部功能的肺功能测试，具体测量可被吸入和呼出的空气的量和速度)诊断COPD。被测量以进行诊断的肺活量成份为：a)一秒钟用力呼气量(FEV₁)，其为在一次呼吸的头一秒钟可被呼出的空气的最大体积；b)用力肺活量(FVC)，其为在一次深呼吸中可被呼出的空气的最大体积。在具有COPD的症状的一些人中，低于70％的FEV₁/FVC比例定义该个体具有该疾病。在老年人中，诊断标准通常要求低于预期80％的FEV₁。

使用其它测试在受试者中评估COPD的严重性。例如，修订版英国医学研究委员会问卷(mMRC)或COPD评估测试(CAT)是可用来确定疾病的严重程度的简单问卷。CAT的评分在0-40的范围内，分数越高疾病越严重。肺活量测定法可帮助确定气流限制的严重性。这通常是基于FEV₁，其表达为对于个体的年龄、性别、身高和体重所预测的“正常值”的百分比。也应考虑到体重减轻和肌无力，以及存在其它疾病。在受试者中评价COPD严重程度的其它标准在以下描述：Vestbo(2013)“Diagnosis and Assessment.”Global Strategy for theDiagnosis,Management和Prevention of chronic obstructive pulmonarydisease.Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease.pp.9–17。

通常进行胸部X-射线和/或胸部CT扫描以及动脉血气测试来在诊断时排除其它疾病。X-射线上的标志性特征为：肺过度扩张、扁平隔膜、增加的胸后骨空隙和大泡(肺部中充填液体的泡囊)。使用动脉血气分析来确定对氧气的需求，且该测试通常在以下受试者中进行：FEV₁低于预期的35％的受试者、外周氧饱和低于92％的受试者和具有充血性心力衰竭症状的受试者。在世界上α-1抗胰蛋白酶缺乏较为常见的地区，考虑对患有COPD的人们(特别是45岁以下且患有影响肺下部的肺气肿的那些人)进行测试。

在一些实事方案中，用此处所述的MMP9结合蛋白进行治疗的受试者具有以下特征中的任一种或多种：呼吸短促(特别是在体力活动期间)、喘息、胸闷、肺中粘液过多、带痰的慢性咳嗽(该痰可为清痰、白痰、黄痰或绿痰)、发绀(即嘴唇和指甲床发青)、频繁的呼吸道感染、疲劳以及非故意的体重减少。在一些实施方案中，将被治疗的受试者具有COPD恶化。在一些实施方案中，受试者具有≥40％且低于预期80％的FEV₁。在一些实施方案中，受试者具有低于70％的FEV₁/FVC比例。在一些实施方案中，基于修订版英国医学研究委员会问卷(mMRC)的结果已将受试者诊断为患有COPD。在一些实施方案中，基于COPD评估测试(CAT)的结果已将受试者诊断为患有COPD。在一些实施方案中，基于慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)的指南已将受试者诊断为患有COPD。在一些实施方案中，基于以下一种或多种已将受试者诊断为患有COPD：胸部X-射线、胸部CT扫描和分析动脉血气。在一个实施方案中，在本申请的治疗之前，受试者被诊断患有COPD，且在一年内具有两次或多次恶化。在一些实施方案中，受试者在治疗之前被诊断患有COPD且在一年内具有两次或多次恶化并具有肺功能衰退。可通过此处所述的临床适应症来确定肺功能衰退。在一些实施方案中，可通过低于80％的FEV₁确定肺功能衰退。被诊断患有COPD且在一年内具有两次或多次恶化的患者占据死亡率、发病率以及与恶化相关的住院导致的花费的大部分。不受任何假设束缚，与健康受试者或具有一次以下恶化的COPD受试者相比，该患者在气道中可具有增加的MMP9水平或活性。气道中的MMP9水平或活性可通过本领域技术人员使用常用方法确定。在一些实施方案中，气道中的MMP9水平或活性可使用免疫测定和生物测试样品确定。在某个实施方案中，气道中的MMP9水平或活性可使用来自受试者的痰样品中的ELISA确定。在一个实施方案中，受试者被诊断患有COPD，在一年内具有两次或多次恶化、肺功能减退且气道中的MMP水平或活性增加。

在一些实施方案中，受试者是或曾经是长期吸烟者。在一些实施方案中，受试者已被暴露于二手烟中。在一些实施方案中，受试者被暴露或已被暴露于工作场所的化学烟雾、粉尘和/或蒸汽中。在一些实施方案中，受试者被暴露或已被暴露于空气污染中。在一些实施方案中，受试者具有COPD家族史。

确定MMP9的方法

本发明还涉及在受试者中确定MMP9的方法MMP9，如检测与COPD相关的组织或液体或其它生物样品。因而，提供了用于在来自患有COPD的患者的样品中诊断、监控、分期或检测MMP9活性的方法。

来自患者(怀疑患有或已知患有COPD的个体)的样品(如生物测试样品)可用来分析MMP9的存在、不存在、表达和/或水平。还可对来自怀疑患有COPD的受试者的样品分析MMP9的存在、不存在、表达和/或水平。例如，可收集该样品，并通过检测MMP9结合蛋白(如此处所述的抗体或片段)是否与样品中的物质(如蛋白质)结合来分析。在一些实例中，该方法进一步包括比较所检测到的结合量与对照样品的结合量，或比较所检测到的MMP9水平与对照的MMP9水平。在一些情况下，该方法指示此处所述的疾病或病症的存在、不存在或严重程度。

该分析可在使用此处所述的MMP9结合蛋白治疗开始之前进行，或可作为监控COPD治疗进程的一部分来进行。在一些实施方案中，提供了治疗方法，其通过进行检测测试并例如根据检测测试的结果来开始、改变或停止对患者的治疗。该诊断分析可使用任何样品进行，包括但不限于：组织、由该组织分离出的细胞等。在一些情况下，该方法在液体样品上进行，如血液、血浆、血清、全血、唾液、尿液或精液。组织样品包括但不限于福尔马林固定或冷冻的组织切片。

可使用任何合适的用于检测和分析MMP9的方法。为了该目的可使用本领域已知的各种诊断测试技术，如在非均质相或均质相中进行的竞争性结合测试、直接或间接的夹心测试和免疫沉淀测试。

用于检测方法中的MMP9结合蛋白可被可检测部分标记。该可检测部分直接或间接地产生可检测的信号。例如，该可检测部分可以为任何此处所述的那些，例如，放射性同位素(如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I)、荧光或化学发光化合物(如异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红、花青苷、照片青(photocyan)、若丹明或荧光素)或酶(如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)。

检测可通过在适合MMP9结合蛋白结合至MMP9的条件下接触样品并评估MMP9结合蛋白-MMP9复合物的存在(如水平)或不存在而进行。样品中MMP9的水平与对照样品中的水平的比较可以表明是否存在具有MMP9活性的COPD相关的组织。对照样品可以是早先取自受试者中的样品或来自其它个体的样品。

在一些方面，检测MMP9mRNA，如通过杂交，如通过显色原位杂交(CISH)。在一些方面，当通过其它检测方法(如通过IHC)在期望的细胞类型中观察到高水平的衍生自炎性细胞的MMP9的模糊信号时，使用该方法。

通过以下几个实施例进一步描述并阐明本发明的各个方面，该实施例不旨在限制本发明的范围。

实施例

实施例1：在I期研究中评估AB0045

该研究为I期双盲、随机的安慰剂对照的多中心研究。该研究的首要目的是评估AB0045(即结合至MMP9的抗体)在患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者中的安全性、耐受性和药代动力学(PK)，其通过由基线至第29天加30天的不良事件(AE)以及实验室异常而评估。首要的结果测量为给药后出现不良事件、自实验室测试中筛选的变化、致命迹象以及发展出免疫原性。该复合终点测量AB0045的安全性和耐受性。第二个结果测量为AB0045的PK参数，其是通过从基线至第29天的AUC(通过比较随时间的血浆浓度而获得的身体吸收的药物总量)和C_max(药物最大浓度)测量的。测量了AB0045的以下PK参数：从基线至第29天的：T_max(即C_max的时间)、C_last(即药物的最后可观察浓度)、T_last(即C_last的时间)、C_tau(即在给药间期结束时观察到的药物浓度)、λz(即终点消除速率常数)、C_L(即静脉内给药后的全身性清除)和Vz(即静脉内给药后表观分布体积)。

该研究具有实验用药组，其中各参与者每两周接受一次400mg的AB0045，总共在第1天、第15天和第29天接受三次输注。该研究包括安慰剂组，其中参与者每两周接受一次与AB0045匹配的安慰剂，总共在第1天、第15天和第29天接受三次输注。400mg AB0045通过静脉内给药。匹配AB0045的安慰剂也是通过静脉内给药。

参与者为介于40岁和75岁之间。男性或未怀孕不哺乳的女性适合该研究。正在进行异性交往、有育儿可能的男性受试者和女性受试者必须同意使用协议规定的避孕方法。男性在最后一次输注该研究药物后90天内必须避免捐精。输注标准包括：a)筛选时体重为≥45kg至<120kg；b)在筛选前至少六个月内根据慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)的指南被诊断患有COPD(参见慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)，Global Strategy for theDiagnosis,Management and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，2013年更新，在互联网上可获自-goldcopd.org/guidelines-global-strategy-for-diagnosis-management.html)并预期在研究期间保持稳定治疗；c)支气管扩张剂后一秒钟用力呼气量(FEV₁)≥预期的40％(并且在一些实施方案中，≤预期的80％)；d)在随机抽样前30天内不改变COPD药物；e)肝功能[天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶(LDH)]≤正常范围上限(ULN)的2倍；f)血清肌酸酐≤2.0；g)血红蛋白≥8.5g/dL(男性和女性均如此)；h)绝对中性粒细胞数(ANC)≥1.5x10^9/L(1,500mm^3)；和i)血小板≥100x 10^9/L。

排除标准包括：a)在筛查期间由研究者判断的临床上显著的活跃性感染；b)在筛查期间已知HIV、乙型肝炎或丙型肝炎病史(为乙型肝炎表面抗原阳性，但其接受了成功的一系列乙型肝炎免疫并从未患有该疾病的受试者是合格的)；c)在筛查期间QuantiFERON-TB GOLD测试为阳性；d)在过去五年中有恶性肿瘤病史，接受过非黑素瘤皮肤癌症局部治疗或其它特定原位癌症治疗的患者除外；e)任何严重的心脏事件，如心肌梗塞、不稳定或危及生命的心律不齐、在随机抽样前六个月内因心力衰竭而住院或在第一次随访时任何明显或新的心电图(ECG)发现，由研究者判断；f)在随机抽样前六个月内因呼吸道事件而住院，例如但不限于：COPD、肺炎、细支气管炎；g)除了COPD以外的慢性肺病，如哮喘、囊性纤维化或纤维变性疾病、α-1抗胰蛋白酶缺乏、间质性肺病、肺动脉血栓栓塞疾病或支气管扩张；g)长期使用全身性皮质激素和/或在随机抽样的90天内用全身性皮质激素治疗COPD的急性恶化事件(AECOPD)或其它不需要住院的医疗状况；h)在随机抽样的90天内使用抗生素治疗AECOPD事件或其它不需要住院的医疗状况，或在随机抽样的14天内任何不需要住院的轻微医疗事件；i)在该分子的5个半衰期内(如果未知则为筛查的90天内)使用任何市售或经研究的生物制剂进行治疗；和j)受试者目前服用非生物的免疫调节药物，如：在随机抽样的90天内服用硫唑嘌呤、环孢霉素、羟氯喹、来氟米特、甲氨喋呤、麦考酚酸吗乙酯、柳氮磺胺吡啶、托法替尼。

Claims (20)

1.用于在受试者中治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)的方法，包括向受试者给药有效量的抗-基质金属蛋白酶9(MMP9)抗体或其抗原结合片段。

2.权利要求1的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段结合至MMP9的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:27的氨基酸残基104-119、残基159-166或残基191-202。

3.权利要求2的方法，其中所述表位包含SEQ ID NO:27的E111、D113、R162或I198。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中抗-MMP9抗体或其抗原结合片段与蛋白质竞争结合至MMP9，其中该蛋白结合至SEQ ID NO:27的氨基酸残基104-119、残基159-166或残基191-202。

5.权利要求4的方法，其中该蛋白为与选自SEQ ID NO:7、12、13、14、15、16、17和18的氨基酸序列至少具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大的同一性的抗体。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段包含重链可变(VH)区，该区包含具有选自SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列的互补性决定区(CDR)。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，该区包含具有选自SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的CDR。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段包含VH区，该区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、5、6、7和8。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段包含VL区，该区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、9、10、11和12。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段包含：VH区，该区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和VL区，该区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段包含：重链，其包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列；和轻链，其包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段为人源化抗体、嵌合抗体或人类抗体。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段抑制MMP9的酶活性。

14.权利要求13的方法，其中所述抑制为非竞争性的。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段以约100mg、约150mg、约200mg、约300mg或约400mg的剂量给药。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段每周给药一次、每两周给药一次或每三周给药一次。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段为静脉内给药、皮内给药或皮下给药。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述抗-MMP9抗体或其抗原结合片段与一种或多种用于治疗COPD的治疗剂同时给药或依次给药。

19.权利要求18的方法，其中所述一种或多种用于治疗COPD的治疗剂选自：短效β2激动剂、短效抗胆碱能药、长效β-2激动剂、长效抗胆碱能药和它们的组合。

20.权利要求19的方法，进一步包括β-2激动剂、抗胆碱能药、吸入性皮质激素、全身性皮质激素、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂或它们的组合。