TW201526910A - 豬胸膜肺炎放線桿菌ＡｐｘＩＩＡ蛋白於流感似病毒顆粒次單位疫苗製備之應用 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種包含ApxIIA佐劑之流感HA似病毒顆粒次單位疫苗，其製備方法及其於抗流感病毒之應用。
Description
本發明係關於包含流感病毒血球凝集素(HA)之流感似病毒顆粒次單位疫苗。更特別地，本發明係關於包含藉由桿狀病毒表現系統在昆蟲細胞株表現而製備得之流感病毒血球凝集素(HA)流感似病毒顆粒與豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIIA佐劑之HA流感似病毒顆粒次單位疫苗組合物。
目前核准可用於人體的流感疫苗有兩種，分別為活性減毒疫苗(live-attenuated influenza)及去活化(inactivated)病毒疫苗。前者以冷適應(cold-adapted)方式使病毒只能在低溫環境(鼻腔)生長，而無法於高溫環境(肺部)複製，然而減毒病毒仍有機會發生突變或是與其他流感病毒重組形成強毒株。後者疫苗則以雞胚蛋進行病毒複製，配合乙醚與福馬林不活化後而得，缺點在於無特定病原(SPF)雞蛋數量有限，無法供應足夠疫苗以應付突然爆發的流感疫情，且疫苗株需經馴化及基因改造減毒後才能以雞胚蛋生產，過程耗時且不一定馴化成功；此外，去活化疫苗對於高齡或免疫功能低下者提供的保護有限，因此研發具有安全、生產速度快並可以提供保護的流感疫苗是必要的。
流感似病毒顆粒為近年來新一代的流感疫苗、不具病毒核酸等特點。流感似病毒顆粒疫苗來自細胞表現流感病毒結構蛋白所組成的顆粒，其結構及形態與流感病毒相似，因此具有類似真實病毒顆粒的外形及抗原性，但不具有病毒核酸、不會產生流感病毒，因此不需將病毒馴化，比起
耗時7-9個月的雞蛋或其他細胞表現系統，桿狀病毒表現系統只需1.5個月就可生產大量流感似病毒顆粒疫苗。在2010年，本案發明人之實驗室已證實，利用昆蟲桿狀病毒表現系統來表現H7亞型之血球凝集素(HA)可以形成似病毒顆粒。因此，藉由探討單獨表現流感病毒的H1亞型HA在Hi-5細胞形成似病毒顆粒的可能性，以及針對似病毒顆粒產量的提升、純化方式及病毒顆粒組成的分析與免疫小鼠等動物試驗，可評估H1亞型HA-VLPs的免疫效果(利用桿狀病毒表現系統製備具免疫原性的H1亞型流感病毒HA似病毒顆粒，中興大學生物科技研究所曾垣賓碩士論文，2012-01-11)。
佐劑是一種具有免疫促進的物質，能夠協助抗原更容易被抗原呈現細胞吞噬，進一步呈現給專一性淋巴細胞辨識，強化免疫反應。疫苗佐劑的發展起源於1923年Glenny和Ramon，並證明除抗原外，配製疫苗時加入的各種成分也是引起免疫反應的重要因素，如金屬鹽類、油脂、澱粉為生素等均能增強人體對白喉類毒素的免疫反應。目前所廣泛應用的鋁鹽(氫氧化鋁，Al(OH)3)則是在2004年由Petrovsky與Aguilar證實其佐劑的功效；由於抗原的類型多樣，所搭配的佐劑效果亦不同，所以目前仍未有能通用於所有抗原的佐劑；因此在疫苗的研發上必須依搭配不同的抗原測試各種佐劑的效果並調整比例，找尋能提供最佳免疫效果之佐劑種類和適當劑量。
豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumonia,APP)之ApxIIA蛋白為一種呼吸道毒素結構蛋白，依據功能及親疏水性的不同，可分為許多功能性區間。本案發明人之實驗室已嘗試參考Seah與Kwang對ApxIIIA蛋白功能性區間定義(Seah與Kwang,Vaccine 22(11-12)：1494-1497,2004)，並利用Genedoc軟體比對其序列相似性，製作含有免疫原性高且低毒性之ApxIIA-N端(N-terminal)部分序列之蛋白質佐劑。先前的研究結果顯示，
ApxIIA-N之佐劑功效可促使小鼠抗體效價達到51200-102400，為僅施打卵白蛋白抗原的8-16倍。此外，施打含有ApxIIA-N佐劑之疫苗並不影響小鼠進食、體重增加等正常生長情形，因此ApxIIA-N確實具有低毒性與高免疫增強力之特性，適合發展為新型佐劑。參見，高雄大學生物科技研究所蔣庭彬碩士論文，2012-02-29。
基於本案發明人上述之研究成果，遂利用桿狀病毒表現系統在昆蟲細胞株表現流感病毒的血球凝集素蛋白(HA)，組裝成流感似病毒顆粒作為次單位疫苗，並搭配ApxIIA蛋白做為佐劑來提升次單位疫苗的免疫原性及疫苗功效，進而完成本發明。
於是，本發明之一方面係關於，一種流感病毒血球凝集素蛋白(HA)似病毒顆粒次單位疫苗，其特徵在於包含豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIIA蛋白做為佐劑。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之流感病毒為A型流感病毒。於本發明之其他具體實施態樣，所述之流感病毒為H1N1亞型流感病毒株。
於本發明之一具體實施態樣，所述之血球凝集素蛋白(HA)似病毒顆粒係使用桿狀病毒表現系統在昆蟲細胞株表現而製備得者。
於本發明之一具體實施態樣，所述之ApxII蛋白為具有ApxIIA的N-端之蛋白片段(ApxIIA-N)。於本發明之另一具體實施態樣，所述之ApxII蛋白為具有ApxIIA的C-端之蛋白片段(ApxIIA-C)。
本發明之另一方面，係關於一種用於防治流感病毒感染之醫藥組成物，其包含流感病毒血球凝集素蛋白(HA)似病毒顆粒、豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIIA蛋白，及醫藥上可
接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之血球凝集素蛋白(HA)似病毒顆粒係使用桿狀病毒表現系統在昆蟲細胞株表現而製備得者。
於本發明之其他具體實施態樣，所述之血球凝集素蛋白(HA)似病毒顆粒係利用桿狀病毒表現系統在Hi-5昆蟲細胞株表現H1N1亞型流感病毒株的血球凝集素蛋白。
於本發明之一具體實施態樣，所述之ApxII蛋白為具有ApxIIA的N-端第1-660個胺基酸之蛋白片段(ApxIIA-N)。於本發明之另一具體實施態樣，所述之ApxII蛋白為具有ApxIIA的C-端第690-956個胺基酸之蛋白片段(ApxIIA-C)。
圖1為以點鼻注射(A)及肌肉注射(B)免疫小鼠後的血清HI抗體力價之變化情形。小鼠分成0.5μg H1-VLPs+50μg、30μg、10μg ApxIIA-N蛋白，0.5μg H1-VLPs+50μg、30μg、10μg ApxIIA-C蛋白與0.5μg H1-VLPs+5μg LT-B及只施打0.5μg H1-VLPs八組，以血液凝集抑制試驗分析不同時間的小鼠血清HI抗體力價，橫虛線為40倍的HI抗體力價。
圖2係顯示於點鼻注射肌肉注射進行免疫之前後，各組小鼠的體重變化情形。在點鼻注射免疫前與每次免疫後7天，秤量並記錄每隻小鼠的體重，共八組(每組5隻)。觀察免疫前後小鼠體重變化情形。(A)為搭配50μg、30μg、10μg ApxIIA-N蛋白，(B)為搭配50μg、30μg、10μg ApxIIA-C蛋白之疫苗組合物進行免疫。只注射H1-VLPs係代表：0.5μg H1-VLPs+PBS，N50μg：0.5μg H1-VLPs+50μg ApxIIA-N蛋白，C50μg：0.5μg H1-VLPs+30μg ApxIIA-C蛋白，N30μg：0.5μg H1-VLPs+30μg ApxIIA-N蛋白，C30μg：
0.5μg H1-VLPs+30μg ApxIIA-C蛋白，N10μg：0.5μg H1-VLPs+30μg ApxIIA-N蛋白，C10μg：0.5μg H1-VLPs+30μg ApxIIA-C蛋白，LT-B：0.5μg H1-VLPs+5μg LT-B蛋白。
圖3係顯示於肌肉注射進行免疫之前後，各組小鼠的體重變化情形。在免疫前與每次免疫後7天，秤量並記錄每隻小鼠的體重，共八組(每組5隻)。觀察免疫前後小鼠體重變化情形。只注射H1-VLPs係代表：0.5μg H1-VLPs+PBS，N30μg：0.5μg H1-VLPs+30μg ApxIIA-N蛋白，C30μg：0.5μg H1-VLPs+30μg ApxIIA-C蛋白，AlPO4：0.5μg H1-VLPs+30μg AlPO4。
圖4係顯示專一性抗原刺激點鼻注射(A)及肌肉注射(B)免疫後小鼠脾臟細胞增生情形。在第二次小鼠點鼻注射免疫後犧牲小鼠，取其脾臟細胞以CCK-8 kit試驗分析小鼠目標抗原H1-VLPs之專一性細胞增生，ConA為陽性對照組。(***p<0.001,**p<0.01,*P<0.05)。刺激指數Stimulation index(SI)=實驗組OD-背景值/陰性對照組OD-背景值圖5係顯示以0.05μg/ml H1-VLPs點鼻注射免疫後小鼠脾臟細胞誘發Th2細胞激素IL-4和IL-6(A，B)及Th1細胞激素IL-12和IFN-γ(C，D)表現。
圖6係顯示以0.05μg/ml H1-VLPs肌肉注射免疫後小鼠脾臟細胞誘發Th2細胞激素IL-4和IL-6(A，B)及Th1細胞激素IL-12和IFN-γ(C，D)表現。
圖7係以點鼻注射(A)及肌肉注射(B)免疫後小鼠糞抗體IgA抗體分析。以未稀釋之之糞抗體樣品進行ELISA檢測分免疫後小鼠IgA抗體效價。(***p<0.001,**p<0.01)圖8係以點鼻注射(A)及肌肉注射(B)免疫後小鼠肺沖洗液中IgA抗體分析。以稀釋100倍之肺沖洗液進行ELISA檢測分析免疫後小鼠IgA抗體效價。(***p<0.001,**p<0.01)
於本說明書中所稱的”ApxIIA蛋白及其片段”係指依據已知RTX家族毒素的不同功能性區域，將ApxIIA基因分為全長(ApxIIA-F)、N端(ApxIIA-N，ApxIIA的N端第1-660個胺基酸)及C端(ApxIIA-C，C端第690-956個胺基酸)片段，進行選殖利用pET101 Directional TOPO Expression Kit(invitrogen,USA)，將純化後的目標蛋白DNA(ApxIIA-F、ApxIIA-N、ApxIIA-C)接合pET101 Directional TOPO Vector上，再經由轉型的方式送入TOP10 Chemically Competent E.coli中，確認質體轉型成功、進行表達與純化，而分別獲得之全長ApxIIA-F蛋白及ApxIIA-N、ApxIIA-C蛋白片段。參見，高雄大學生物科技研究所蔣庭彬碩士論文，2012-02-29。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
利用桿狀病毒表現系統製備具免疫原性的H1亞型流感病毒HA似病毒顆粒
流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(簡稱PR8)HA基因構築於pSP72-PT7-HDVR-TT7[39]質體(簡稱pSP72-H1)，此質體是由中興大學微生物暨公共衛生研究所-徐維莉教授提供。使用桿狀病毒表現系統在Hi-5昆蟲細胞株表現H1N1亞型A/PR/8/34流感病毒株的血球凝集素蛋白(HA)，以pSP72-H1為模板，利用引子H1-BamHI-F及H1-KpnI-R(Table 1)進行PCR放大HA(amino acid 1~565)的全長基因片段，以BamHI及KpnI切割PCR產物並構築於pFastbac-1(pFB-1)質體，形成重組質體pFB-H1。
所使用的Sf-9昆蟲細胞購自新竹食品工業研究所菌種中心。取得之重組桿狀病毒命名為Bac-H1。以病毒感染複數(MOI)最適化試驗，顯示昆蟲細胞以MOI=0.01感染72小時可
獲得最佳的胞外HA產量，約為64 HAU/50μl(1.2μg/ml)。將感染後的培養液，經過超高速離心沉降和不連續蔗糖梯度離心純化。以穿透式電子顯微鏡觀察經蔗糖梯度離心後的浮力密度為1.17g/cm3的第6分層樣本，此分層有含有寬度約40nm、長度約300nm的流感病毒桿狀顆粒，也同時有大小約為200nm的片狀膜結構以及300nm大小左右的桿狀病毒。再進行另一次蔗糖梯度離心，得到了純度較高的流感HA似病毒顆粒。
動物免疫實驗證實BALB/c小鼠在免疫兩次含0.2μg或2μg HA的似病毒顆粒後，皆可產生高力價的血球凝集抑制(HI)抗體(>150倍)。綜合上述結果顯示，利用桿狀病毒表現系統在Hi-5昆蟲細胞株表現H1N1亞型A/PR/8/34流感病毒株的血球凝集素蛋白可以形成具有免疫原性的HA似病毒顆粒(H1-VLPs)。
ApxIIA蛋白及其蛋白片段之製備與純化
將含pET101-ApxIIA(F、N、C)質體菌株抽取其質體，再轉型到E.coli BL21大腸桿菌株，以進行ApxIIA蛋白之誘導。培養500mL的pET101-N及pET101-C/BL21以IPTG誘導4小時後，利用Ni-NTA樹脂進行ApxIIA蛋白之純化，方法詳見高雄大學生物科技研究所蔣庭彬碩士論文，2012-02-29。於純化步驟完成後，將溶析得到之蛋白進行SDS-PAGE分析，結果顯示所純化出之分子量為72kDa及43kDa的蛋白質分別為ApxIIA蛋白之片段ApxIIA-N及ApxIIA-C。
HA似病毒顆粒次單位疫苗之免疫動物試驗
HI抗體力價是用來判斷血清中含有對抗流感病毒的保護性抗體及疫苗效果的重要指標，取得作為抗原的H1-VLPs溶液濃度為12.5μg/ml，再將純化出的ApxIIA蛋白經由蛋白質定量測得ApXIIA-N濃度為1.49mg/ml，ApXIIA-C濃度為1.1mg/ml。搭配引起黏膜免疫反應的ApxIIA蛋白作為佐劑。分別在第1、14天進行小鼠點鼻注射及肌肉
注射。實驗共分為12組(每組5隻小鼠)：(1)1至8組以0.5μg H1-VLPs作為抗原分別搭配50、30、10μg之ApxIIA-N及ApxIIA-C蛋白作為佐劑混合後以點鼻方式免疫，50μg ApXIIA-N取體積34μl搭配H1-VLPs體積40μ(10.5μg H1-VLPs)均勻混合，注射總體積為74μl；30μg ApXIIA-N取體積21μl搭配H1-VLPs體積40μl均勻混合，注射總體積為61μl；10μg ApXIIA-N取體積7μl搭配H1-VLPs體積40μl均勻混合，注射總體積為47μl。而50μg ApXIIA-C取體積46μl搭配H1-VLPs體積40μl均勻混合，注射總體積為86μl；30μg ApXIIA-C取體積28μl搭配H1-VLPs體積40μl均勻混合，注射總體積為68μl；10μg ApXIIA-C取體積9μl搭配H1-VLPs體積40μl均勻混合，注射總體積為49μl；而以LT-B濃度為50μg/ml取體積10μl搭配H1-VLPs體積40μl均勻混合，注射總體積為50μl作為陽性對照組；以PBS體積30μl搭配H1-VLPs體積40μl均勻混合，注射總體積為70μl作為陰性對照組。
(2)9至12組以0.5μg H1-VLPs作為抗原分別搭配30μg之ApxIIA-N及ApxIIA-C蛋白作為佐劑混合後以肌肉注射免疫；而以AlPO4濃度為300μg/ml取體積10μl搭配H1-VLPs體積40μl均勻混合，注射總體積50μl作為陽性對照組。
結果顯示，在免疫後第7天，搭配ApxIIA-N(50μg)、ApxIIA-N(30μg)、ApxIIA-N(10μg)佐劑之疫苗組合物分別誘發5.3、2.6、1.5倍之HI抗體力價，搭配ApxIIA-C(50μg)、ApxIIA-C(30μg)、ApxIIA-C(10μg)佐劑之免疫分別誘發4、2.3、1.7倍的HI抗體力價，LT-B佐劑為5.3倍HI抗體力價，而只施打H1-VLPs(PBS陰性對照組)則為1.3倍HI抗體力價。
於免疫後第28天，搭配ApxIIA-N(50μg)、ApxIIA-N(30μg)、ApxIIA-N(10μg)HI抗體力價分別達到
27、32及12.1倍，ApxIIA-C(50μg)、ApxIIA-C(30μg)、ApxIIA-C(10μg)分別為27.9、16、16倍HI抗體力價，LT-B為27.9倍HI抗體力價，而只施打H1-VLPs為13.9倍HI抗體力價。
於免疫後第35天，搭配ApxIIA-N(50μg)、ApxIIA-N(30μg)、ApxIIA-N(10μg)佐劑之免疫組分別為64、55.7、36.8倍，ApxIIA-C(50μg)、ApxIIA-C(30μg)、ApxIIA-C(10μg)分別為73.5、48.5、42.2倍HI抗體力價，超過了國際標準的40倍抗體力價。LT-B為111.4倍，而只施打H1-VLPs為27.9倍HI抗體力價。
免疫後第42天，搭配ApxIIA-N(50μg)、ApxIIA-N(30μg)、ApxIIA-N(10μg)佐劑之實驗組分別呈現147、97、73.5倍HI抗體力價，超過了國際標準的40倍抗體力價。ApxIIA-C(50μg)、ApxIIA-C(30μg)、ApxIIA-C(10μg)分別為128、111.4、64倍HI抗體力價，LT-B陽性對照組為128倍HI抗體力價，而只施打H1-VLPs之PBS陰性對照組為42.2HI抗體力價。
於免疫後第49天，搭配ApxIIA-N(50μg)、ApxIIA-N(30μg)、ApxIIA-N(10μg)為佐劑之實驗組分別達到了256、388、147倍HI抗體力價，有顯著上升。ApxIIA-C(50μg)、ApxIIA-C(30μg)、ApxIIA-C(10μg)的HI抗體力價分別達到256、222.9、168.9倍，有顯著上升，LT-B為312倍，只施打H1-VLPs為111.4倍。於免疫後第56天，ApxIIA-N(50μg)、ApxIIA-N(30μg)、ApxIIA-N(10μg)的HI抗體力價分別達到147、194、168.9倍。ApxIIA-C(50μg)、ApxIIA-C(30μg)、ApxIIA-C(10μg)的HI抗體力價分別達到147、147、111.4倍，LT-B陽性對照組為111.4倍，而只施打H1-VLPs為64倍(如圖1A所示)。
因此，不論是搭配ApxIIA-N蛋白ApxIIA-C蛋白皆可使小鼠在第42天產生大於40倍的HI抗體力價，尤其以
ApxIIA-N(50、30μg)及ApxIIA-C(50、30μg)作為佐劑誘導產生的效果較好。此和陽性對照組LT-B效果一樣，並且發現在第49天抗體達到最大量，在第56天開始有減少的情形，而在免疫後150天ApxIIA-N(50μg)、ApxIIA-N(30μg)、ApxIIA-C(50μg)、ApxIIA-C(30μg)及LT-B實驗組仍然有超過40倍，具有保護能力。由於小鼠在注射兩劑搭配ApxIIA蛋白的H1-VLPs疫苗後，皆可產生>40倍的血球凝集抑制抗體力價，證實本研究中ApxIIA蛋白確實具有加強小鼠產生保護性抗體的能力。
如圖1B所示，肌肉免疫組Balb/c小鼠在免疫後第7天，N(30μg)為8倍、C(30μg)為9.2倍，AlPO4為13.9倍，只施打H1-VLPs為4.6倍；第14天，N(30μg)為18.4倍，C(30μg)為13.9倍，只施打H1-VLPs為4倍；第28天，N(30μg)達到64倍，C(30μg)達到97，AlPO4達到73.5倍，超過40倍HI抗體力價，只施打H1-VLPs之陰性對照組為16倍。
免疫後第35天，ApxIIA-N(30μg)為194倍HI抗體力價，ApxIIA-C(30μg)為147倍HI抗體力價，AlPO4為194倍，只施打H1-VLPs為64倍HI抗體力價；第49天，ApxIIA-N(30μg)為294.1倍HI抗體力價，ApxIIA-C(30μg)為256倍HI抗體力價，AlPO4為I68.9，只施打H1-VLPs之陰性對照組為84.4倍HI抗體力價；第56天，ApxIIA-N(30μg)為73.5倍HI抗體力價，ApxIIA-C(30μg)為147倍HI抗體力價，AlPO4為97倍HI抗體力價，而只施打H1-VLPs之陰性對照組為58.5倍HI抗體力價。
綜合上述結果，不論是搭配ApxIIA-N蛋白或ApxIIA-C蛋白，皆可使小鼠在第28天產生大於40倍的HI抗體，效果較陽性對照組AlPO4好，在49天抗體達到最大量，在第56天開始有減少的情形，而在免疫後150天，ApxIIA-N(30μg)、ApxIIA-C(30μg)、AlPO4仍然有超過40倍HI抗體，具有保護力，以肌肉注射方式較點鼻注射更快達到抗體的上
升。
此外，亦在免疫前以及第一次免疫、第二次免疫(第14天)和免疫後第28、35、42、49、56天，分為點鼻免疫共8組(每組5隻)，肌肉免疫共4組(每組5隻)分析免疫前後小鼠體重增減情形，並且與添加佐劑的實驗組和添加PBS之陰性對照組小鼠進行比較，分析融合蛋白添加H1-VLPs免疫小鼠，是否會產生影響小鼠之體重。
由免疫小鼠之體重變化分析結果顯示，在點鼻免疫的組別添加佐劑組別與只施打H1-VLPs陰性對照組趨勢相符，除了添加ApxIIA-N10μg組在免疫後7天體重下降趨勢較多以外，免疫後14天體重皆有上升趨勢，因此，可初步判斷，ApxIIA作為佐劑搭配H1-VLPs施打小鼠，不會對小鼠的生長造成影響(圖2A、圖2B)。在肌肉注射免疫的組別，添加佐劑組別與只施打H1-VLPs陰性對照組的體重上升趨勢相符，體重並沒有明顯下降趨勢，與點鼻免液結果相同。故結論，ApxIIA可作為佐劑搭配H1-VLPs製備疫苗組成物施打小鼠，不會對小鼠的體重造成影響(圖3)。
免疫後小鼠血清IgG抗體效價分析
以H1-VLPs(0.5μg H1-VLPs)當作抗原進行小鼠免疫，搭配具有黏膜免疫功能的ApxIIA蛋白，進行佐劑功能測試，分為以點鼻注射免疫及以肌肉注射免疫，實驗組點鼻注射免疫分為(50、30、10)μg ApxIIA-N蛋白、(50、30、10)μg ApxIIA-C蛋白、陽性對照組LT-B、陰性對照組PBS，並取免疫後小鼠血清以ELISA檢測抗體效價。結果如下表1所示。
進行第一次免疫後，小鼠抗體效價以50μg ApxIIA-N最高為1600，其次以ApxIIA-N30μg、ApxIIA-C 50μg、ApxIIA-C 30μg及LT-B免疫所得之小鼠抗體效價為800，而ApxIIA-N10μg、ApxIIA-C10μg及陰性對照組則為400；第二次免疫後28天(第42天)，各組效價明顯被提升，HI抗體力價N50μg、HI抗體力價N30μg、HI抗體力價C50μg上升至51200，N10μg、C30μg為25600，C10μg、LT-B陽性對照組為12800，陰性對照組為3200；第二次免疫後35天(49天)，單獨施打H1-VLPs(PBS陰性對照組)誘發之抗體效價只有12800，施打含有ApxIIA-N50μg、ApxIIA-N30μg、ApxIIA-C50μg之H1-VLP疫苗所誘發之抗體效價為102400，而含有ApxIIA-C30μg佐劑及陽性對照組LT-B所誘發之抗體效價為51200，ApxIIA-N10為25600，ApxIIA-C10μg為12800；結果顯示，與陰性對照組比較，發現在抗原中加入佐劑融合
蛋白的組別，能有效刺激小鼠血清中抗體效價的提升，尤其以ApxIIA-N50μg、ApxIIA-N30μg、ApxIIA-C50μg效果最好，甚至較LT-B陽性對照組更佳。
在肌肉注射組別，分為以含有30μg ApxIIA-N蛋白、30μg ApxIIA-C蛋白、AlPO4(陽性對照組)及PBS(陰性對照組)做為佐劑之H1-VLPs(0.5μg H1-VLPs)疫苗組合物進行免疫。如下表2所列之結果顯示，於第一次免疫後，ApxIIA-N30μg誘發之小鼠血清IgG抗體效價為1600，ApxIIA-C30、AlPO4及陰性對照組為800；第二次免疫後28天(第42天)，ApxIIA-N30μg、ApxIIA-C3μg 0為51200，AlPO4為25600，陰性對照組為6400；第二次免疫後35天(49天)，ApxIIA-N30μg、ApxIIA-C30μg為204800，AlPO4為102400、陰性對照組為12800；結果顯示，與陰性對照組比較，以ApxIIA-N30μg及ApxIIA-C30μg做為佐劑皆能刺激小鼠抗體效價的提升，效果跟陽性對照組相同，而且以肌肉注射方式獲得之血清中抗體效價上升量，較以點鼻注射進行免疫所得的上升量高。
免疫後小鼠之脾臟細胞對H1-VLPs專一性抗原的增生率
在第二次免疫後犧牲小鼠，取其脾臟細胞以CCK-8 kit試驗分析小鼠目標抗原蛋白H1-VLPs隻專一性細胞增生，以Con A做為陽性對照組在點鼻注射組別，如圖4A所示，在H1-VLPs和ConA刺激下皆能增強脾臟細胞的增生，而搭配ApxIIA-N50μg、ApxIIA-N30μg效果則較為顯著，ApxIIA-C50μg、ApxIIA-C30μg、LT-B在Con A刺激下能增強脾臟細胞的增生。由結果顯示ApxIIA-N50μg、ApxIIA-N30μg對H1-VLPs有專一性刺激，能有效增強脾臟細胞的增生，強化免疫反應的程度。
在肌肉注射免疫組別，如圖4B所示，N30μg在H1-VLPs刺激下能有顯著增強脾臟細胞的增生，AlPO4在Con A刺激下有顯著增加，其他實驗組在H1-VLPs刺激下都有高過陰性對照組的增生，由此可以看出ApxIIA可以有效刺激脾臟增殖。
免疫後小鼠之脾臟細胞之細胞激素表現分析
以專一性抗原H1-VLPs刺激免疫後小鼠之脾臟細胞，活化小鼠記憶性免疫，再利用Real-time PCR評估各組免疫小鼠對Th1(代表細胞激素為IL-12、IFN-γ)以及Th2(代表細胞激素為IL-4、IL-6)之細胞激素的表現情況。循環反應完成後，利用StepOnePlusTM Real-Time PCR System軟體分析各細胞激素表現量進行數據化分析。以2-△△C T公式求出相對表現量(參照，Livak K.J.,Schmittgen T.D.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method.Methods,25：402-408)。
在點鼻注射進行免疫之組別，如圖5A-5D所示，ApxIIA-N50μg及ApxIIA-N30μg能有效提升IL-4的表現。ApxIIA-N30μg及ApxIIA-N10μg能有效提升IL-6的表現，但在刺激IL-12、IFN-γ之表現量方面，皆不能產生顯著差異，
陽性對照組LT-B能有效刺激IL-4、IL-12表現。根據以上結果，可以推測ApxIIA-N蛋白具有刺激Th2免疫反應的潛力，而以ApxIIA-N30μg有最佳的刺激效果。
在肌肉注射免疫組別，如圖6A-6D所示，ApxIIA-N30μg有顯著的提升細胞激素IL-4、IL-6之表現，ApxIIA-C30μg能有效提升IL-6表現量，但不能有顯著刺激IL-12、IFN-γ之表現量。根據以上結果，ApxIIA-N蛋白能有效刺激Th2免疫反應。
免疫後小鼠糞便中IgA與肺沖洗液IgA抗體分析
收集兩次點鼻注射或肌肉注射免疫後之新鮮小鼠糞便，裝入1.5ml微量離心管，秤重後，每0.5克糞便加入0.5ml含有50mM EDTA及25μg/ml trypsin inhibitor的緩衝溶液。將糞便溶解搗碎，10,000 x g離心10分鐘，吸取上清液，即為待測冀抗體樣品。以未稀釋之糞抗體樣品進行ELISA檢測分免疫後小鼠IgA抗體效價。
讓小鼠吸入過量之乙醚或CO2使其安樂死。以腋下或心臟採血方式放血，收集血液至1.5ml離心管，待其凝固，離心後製備血清。將小鼠固定在解剖檯上，以75%酒精消毒腹部皮膚，從腹面頸部喉嚨處沿著腹部方向剪開並移除表皮，再用75%酒精消毒。剪開胸部肌肉組織，打開胸腔，移除胸骨、肋骨及其鄰近軟骨。將氣管剪一個開口，勿將其剪斷，移除氣管附近的肌肉及結締組織，並將一段綿線套在氣管外圍。再以接在1ml注射針筒(25G x 1”針頭)的動物插管(Intramedicpolyethylene tubing，PE-50)插入氣管中(約0.5公分)，用綿線綁住氣管及插管，使其固定。將注射針筒內的0.8ml緩衝溶液(PBS包含0.1mg/ml trypsin inhibitor)緩緩推入，使肺泡膨脹，來回沖洗3~5次，再將沖洗液吸出。收集此沖洗液於1.5ml離心管，置於冰上。離心3000rpm，4℃，10分鐘，取上清液即為肺沖洗液。以稀釋100倍之肺沖洗液進行ELISA檢測分析免疫後小鼠IgA抗體效價。
在點鼻注射免疫組別方面，如圖7A及圖8A，由糞IgA抗體分析結果顯示，有添加ApxIIA蛋白的實驗組皆高於陰性對照組，具有顯著差異，尤其以ApxIIA-N蛋白之IgA抗體刺激效果較好；而在肺沖洗液之IgA抗體分析結果顯示，有添加ApxIIA蛋白的實驗組皆高於陰性對照組，具有顯著差異，由結果得知ApxIIA蛋白確實能提升IgA抗體。
在肌肉注射免疫組別方面，如圖7B及圖8B，由糞IgA抗體分析結果顯示，有添加ApxIIA蛋白的實驗組皆高於陰性對照組；而由肺沖洗液之IgA抗體分析結果顯示，有添加ApxIIA蛋白的實驗組皆高於陰性對照組，具有顯著的提升IgA抗體。因此由以上結果得知，肌肉注射ApxIIA蛋白也能夠提升IgA抗體。
綜合上述之研究結果，雖然HA流感類病毒顆粒是以表現IgG2a為主，刺激Th1行細胞免疫的方式將被病毒感染的細胞殺死，但添加具有佐劑功能之ApxIIA蛋白，能有效刺激Th2體液性免疫的表現及IgA的提升，具有抵抗被病毒感染的能力，尤其ApxIIA-N30μg的劑量較好。此外亦發現，以點鼻免疫方式注射劑量比肌肉免疫方式還高，推測是因為小鼠進行點鼻方式注射體積約為20μl，過多的體積可能導致注射不完全，而以肌肉注射的方式可以更快達到免疫反應的刺激。因此，由本發明所述之研究結果已證實，ApxIIA融合蛋白確實具有黏膜佐劑的效果，而且能應用於製備HA流感似病毒顆粒次單位疫苗，在活體內產生高力價的血球凝集抑制(HI)抗體(>150倍)，亟具產業利用性及進步性。
Claims (10)
- 一種流感病毒血球凝集素蛋白(HA)似病毒顆粒次單位疫苗，其特徵在於包含豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIIA蛋白做為佐劑。
- 如請求項1所述之HA流感似病毒顆粒次單位疫苗，其中該流感病毒為A型流感病毒。
- 如請求項2所述之HA流感似病毒顆粒次單位疫苗，其中該流感病毒為H1N1亞型流感病毒株。
- 如請求項1或2所述之HA流感似病毒顆粒次單位疫苗，其中該血球凝集素蛋白(HA)似病毒顆粒係使用桿狀病毒表現系統在昆蟲細胞株表現而製備得。
- 如請求項1所述之HA流感似病毒顆粒次單位疫苗，其中該ApxII蛋白為具有ApxIIA的N-端之蛋白片段(ApxIIA-N)。
- 如請求項1所述之HA流感似病毒顆粒次單位疫苗，其中該ApxII蛋白為具有ApxIIA的C端之蛋白片段(ApxIIA-C)。
- 一種用於防治流感病毒感染之醫藥組成物，其包含流感病毒血球凝集素蛋白(HA)似病毒顆粒、豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIIA蛋白，及醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
- 根據申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中該血球凝集素蛋白(HA)係使用桿狀病毒表現系統在昆蟲細胞株表現而製備得。
- 根據申請專利範圍第5項之醫藥組成物，其中該豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIIA蛋白為具有ApxIIA的N-端之蛋白片段(ApxIIA-N)。
- 根據申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中該該ApxII蛋白為具有ApxIIA的C端之蛋白片段(ApxIIA-C)。
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