TW201444885A - 從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一種從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法包含以下之步驟：提供一菌泥，包含細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌及培養基，其中，該培養基包括氯化鈉；加入一溶液至該菌泥中，使該菌泥中的細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌的細胞破碎，形成一懸浮液；施予一加壓噴霧處理，使該懸浮液霧化，以獲得一乾燥粉末；接著，施予一離心分離處理，即可獲得聚羥基烷基酸酯系聚合物。本發明的方法不需使用溶劑可減少對環境的破壞、不需考量溶劑回收的問題，以及不受溶劑對聚羥基烷基酸酯系聚合物的溶解能力的限制。
Description
本發明是有關於一種從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，特別是指一種利用降低氯化鈉濃度及改變壓力使細胞破碎，並搭配加壓噴霧處理及離心分離處理的從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法。
聚羥基烷基酸酯為一具有生物相容性及生物降解性的聚合物。其可應用在醫學工程(如軟骨組織或心臟瓣膜組織工程)或塑膠製品等。
目前聚羥基烷基酸酯的製備方法有兩種方式，分別為：微生物合成法及化學合成法，其中，相較於化學合成法，微生物合成法因環保且原料成本低，而廣泛被研究。一般微生物合成法為將菌株培養於一包括氮源和碳源的培養基中，接著，該菌株會將碳源轉換成聚羥基烷基酸酯而儲存於細胞內，之後，再使用鹵素溶劑(如三氯甲烷)進行細胞破碎處理，同時進行萃取處理，接著，獲得萃取液並對萃取液進行乾燥處理，即可從菌株中提取出聚羥基烷基酸酯。然，鹵素溶劑對環境及人體有害，不符合環保概念。
台灣專利公開號200626728與台灣專利公告號363094分別揭示一種從菌株中提取聚羥基烷基酸酯的方法。該等方法是以酯類、酮類或芳香烴類做為溶劑，進行細胞破碎處理及萃取處理，以從菌株中提取聚羥基烷基酸酯。該等方法所使用的溶劑仍會對環境造成破壞，且需考量溶劑回收的問題，以及易受溶劑對聚羥基烷基酸酯的溶解能力的限制，且該方法僅能批次式進行聚羥基烷基酸酯的提取。
經上述說明可知，改良提取方式以為聚羥基烷基酸酯提供一不需使用溶劑可減少對環境的破壞、不需考量溶劑回收的問題，以及不受溶劑對聚羥基烷基酸酯的溶解能力的限制，是此技術領域相關技術人員可再突破的課題。
因此，本發明之目的，即在提供一種從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法。
於是本發明從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，包含以下之步驟：提供一菌泥，包含細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物(polyhydroxyalkanoates-based polymer)的嗜鹽菌(halophilic bacteria)及培養基，其中，該培養基包括氯化鈉；加入一溶液至該菌泥中，使該菌泥中的細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌的細胞破碎(cell
disruption)，形成一懸浮液；施予一加壓噴霧處理，使該懸浮液霧化，以獲得一乾燥粉末；接著，施予一離心分離處理，即可獲得聚羥基烷基酸酯系聚合物。
本發明之功效在於：相較於傳統使用溶劑的方式，本發明從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法不需使用溶劑具環保概念，且也不會衍生溶劑回收的問題，所以成本低。再者，使用溶劑的方式會受設備的限制(如反應槽的容量及數目)，以至於僅能批次式製備，而本發明方法可連續式地從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物。
本發明從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，包含以下之步驟：提供一菌泥，包含細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌及培養基，其中，該培養基包括氯化鈉；加入一溶液至該菌泥中，使該菌泥中的細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌的細胞破碎，形成一懸浮液；施予一加壓噴霧處理，使該懸浮液霧化，以獲得一乾燥粉末；接著，
施予一離心分離處理，即可獲得聚羥基烷基酸酯系聚合物。
該溶液並無特別的限制，只要能使該菌泥中氯化鈉的濃度降低，並使該細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌處於低氯化鈉濃度的環境中，以至於該溶液可流入細胞內，繼而使細胞被溶液撐大而破碎。該溶液的添加量可依據不同種類的嗜鹽菌來調整，以使氯化鈉濃度降低至可使其細胞破碎的狀態，例如，使用極端嗜鹽菌，加入的溶液需使氯化鈉濃度差異至少3%以上，又例如，使用中度嗜鹽菌，加入的溶液需使氯化鈉濃度差異至少10%以上。較佳地，基於該菌泥的總量為1重量份計，該溶液的使用量範圍為10重量份以上。較佳地，該溶液包括至少一由下列群組所組成的試劑：酒精及水。該懸浮液包括氯化鈉、嗜鹽菌的細胞殘骸、溶液及聚羥基烷基酸酯系聚合物。
該加壓噴霧處理的目的在於使細胞破碎的更完全，同時，使該懸浮液噴灑成霧狀並分散在空氣中，該懸浮液中所含有的液體可被蒸發，而所含有的固體可較均勻的分散且均勻的被乾燥，除此之外，加壓噴霧處理可使固體產生移動速度，對於進入離心分離處理時，可有效地提高分離的效果。該移動速度指的是加壓噴霧所產生的慣性速度。該加壓噴霧處理的壓力並無特別限制，可依據不同菌株的嗜鹽菌、培養基及聚羥基烷基酸酯系聚合物進行調整。較佳地，該加壓噴霧處理的壓力範圍為70 atm至200
atm。該加壓噴霧處理的裝置並無特別限制，只要能達成上述加壓噴霧處理的目的即可。該加壓噴霧處理的裝置例如但不限於噴霧乾燥器。於該噴霧乾燥器的入口溫度需控制在小於100℃，避免噴霧前蛋白質變性凝聚。
該乾燥粉末包括氯化鈉、嗜鹽菌的細胞殘骸及聚羥基烷基酸酯系聚合物。
該離心分離處理透過該乾燥粉末中的各物質具有不同沉降係數，達到分離效果。該嗜鹽菌的細胞殘骸經加壓噴霧處理後會變得更鬆散，且形成較小的顆粒，繼而沉降係數較低，同時，所產生的慣性速度較小，進入離心分離處理時，容易沉降於底部，而聚羥基烷基酸酯系聚合物經加壓噴霧處理後會變得更緻密，且形成較大的顆粒，繼而沉降係數較高，同時，所產生的慣性速度較大，進入離心分離處理時，容易被帶至頂部，因而達到將嗜鹽菌的細胞殘骸及聚羥基烷基酸酯系聚合物分離的效果。該離心分離處理的設備例如但不限於離心機或旋風分離機。該離心分離處理的轉速並無特別限制，可依據該乾燥粉末中的各物質進行調整。較佳地，該離心分離處理的設備為旋風分離機。該旋風分離機可提供額外的氣體，該氣體由底部進入，因該嗜鹽菌的細胞殘骸的沉降係數低，氣體會將該嗜鹽菌的細胞殘骸帶至頂部，而聚羥基烷基酸酯系聚合物的沉降係數高，會滯留在底部，透過該氣體流量的調整可使嗜鹽菌的細胞殘骸及聚羥基烷基酸酯系聚合物具有更佳的分離效果。
該加壓噴霧處理與離心分離處理可使用一同時具有加壓噴霧及離心分離的設備來進行，例如但不限於Buchi Switzerland製型號為Mini Spray Dryer B-290的設備、Buchi Switzerland製型號Nano Spray Dryer B-90的設備，或YAMATO製型號GB210-A的設備。
較佳地，該細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌是擇自於中度嗜鹽菌或極度嗜鹽菌。
該中度嗜鹽菌例如但不限於鹽田鹽單胞菌(Halomonas salina)菌株。較佳地，該鹽田鹽單胞菌菌株是選自於由下列所構成的群組：鹽田鹽單胞菌CG1、鹽田鹽單胞菌(Valderrama et al.1991)Dobson and Franzmann 1996,comb.nov.，或此等一組合。該鹽田鹽單胞菌CG1以寄存編號BCRC 910446被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)。該鹽田鹽單胞菌(Valderrama et al.1991)Dobson and Franzmann 1996,comb.nov.以寄存編號DSM 5928被寄存於德國微生物與細胞培養物保存中心(DSMZ)、以寄存編號BCRC 17875被寄存於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存保存及研究中心，以及以寄存編號ATCC 49509被寄存於美國類型培養物收集中心。
該極度嗜鹽菌例如但不限於寄存於美國類型培養物收集中心且寄存編號ATCC 33500的Haloferax mediterranei或寄存於美國類型培養物收集中心且寄存編
號ATCC 700922的Halobacterium salinarum NRC-1。
該培養基還包括有一適於細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌的碳源(carbon source)。依據本發明，適用於配製該培養基的碳源例如但不限於甘油、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、氨基酸、澱粉、甘露糖、海藻糖、糖蜜、玉米澱粉、胜肽，或麥芽萃取物等。該培養基還包括有一適於細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的噬鹽菌的氮源(nitrogen source)。依據本發明，適用於配製該培養基的氮源例如但不限於(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、胺基酸或胜肽等。
依據本發明，適用的培養基還包括例如但不限於酪蛋白胺基酸(casamino acid)、尿素(urea)、蛋白腖(peptone)、胰化腖(tryptone)、蛋白水解物、肉類萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeast extract)，或酵母粉(yeast powder)等。
該聚羥基烷基酸酯系聚合物的重量平均分子量並無特別限制，可依據不同菌株的嗜鹽菌、培養基及培養溫度及時間進行調整。較佳地，該聚羥基烷基酸酯系聚合物的重量平均分子量範圍6.0×105至7.9×105。
較佳地，該聚羥基烷基酸酯系聚合物是擇自於聚羥基烷酸酯、聚羥基烷酸酯的衍生物，或此等一組合。該聚羥基烷酸酯例如但不限於聚(3-羥基丁酸酯)[poly(3-hydroxybutyrate)，簡稱PHB]、聚(3-羥基戊酸酯)[poly(3-hydroxyvalerate)，簡稱PHV)]，或聚(3-羥基辛
酸酯)[poly(3-hydroxyoctanoate)，簡稱PHO]等。該聚羥基烷酸酯的衍生物例如但不限於聚(3-羥基丁酸酯-3-羥基戊酸酯)[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，簡稱PHBV]、聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物，或，聚(3-羥基戊酸酯)與聚(3-羥基辛酸酯)的共聚物等。本發明的具體例中，該聚羥基烷基酸酯系聚合物為聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物。
<實施例>
<實施例1>
將鹽田鹽單胞菌CG1置於1,000毫升的培養基中，並於30℃下經過8小時的培養，其中，該培養基包含10克的甘油、10克的蛋白水解物及100克的氯化鈉，且該培養基為一均勻的混合溶液。
待8小時的培養後，停止攪拌並靜置，取出13克的沉澱菌泥，其中，該菌泥包括細胞內具有聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的鹽田鹽單胞菌CG1及少量培養基，且該聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的重量平均分子量為6.0×105。接著，加入130克的水，激烈混合，該細胞內具有聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的鹽田鹽單胞菌CG1的細胞因處於低氯化鈉濃度的環境而破碎，形成一懸浮液。
將該懸浮液導入一具有噴霧乾燥器及旋風分離機(cyclone)的設備(Buchi Switzerland製；型號：Mini Spray Dryer B-290)。該懸浮液以流速為10kg/h進入噴霧乾燥器
且該噴霧乾燥器的入口溫度控制在80℃，以及出口溫度控制在65℃，接著，使該懸浮液噴出並霧化，以獲得一乾燥粉末，同時該細胞內具有聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的鹽田鹽單胞菌CG1的細胞因壓力差異而破碎的更完全。
之後，該乾燥粉末經旋風分離機進行分離與收集處理，因嗜鹽菌的細胞殘骸的沉降係數低，於頂部收集，而聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的沉降係數高，於底部收集。
<實施例2>
將鹽田鹽單胞菌CG1置於1,000毫升的培養基中，並於30℃下經過72小時的培養，其中，該培養基包含10克的甘油、10克的蛋白水解物及100克的氯化鈉，且該培養基為一均勻的混合溶液。
待72小時的培養後，停止攪拌並靜置，取出13克的沉澱菌泥，其中，該菌泥包括細胞內具有聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的鹽田鹽單胞菌CG1及少量培養基，且該聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的重量平均分子量為7.9×105。接著，加入130克的水，激烈混合，該細胞內具有聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的鹽田鹽單胞菌CG1的細胞因處於低氯化鈉濃度的環境而破碎，形成一懸浮液。
將該懸浮液導入一具有噴霧乾燥器及旋風分離機(cyclone)的設備(Buchi Switzerland製；型號：Mini Spray
Dryer B-290)。該懸浮液以流速為10kg/h進入噴霧乾燥器且該噴霧乾燥器的入口溫度控制在80℃，以及出口溫度控制在65℃，接著，使該懸浮液噴出並霧化，以獲得一乾燥粉末，同時該細胞內具有聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的鹽田鹽單胞菌CG1的細胞因壓力差異而破碎的更完全。
之後，該乾燥粉末經旋風分離機進行分離與收集處理，因嗜鹽菌的細胞殘骸的沉降係數低，於頂部收集，而聚(3-羥基丁酸酯)與聚乙二醇的共聚物的沉降係數高，於底部收集。
綜上所述，相較於傳統使用溶劑的方式，本發明從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法不需使用溶劑具環保概念，且也不會衍生溶劑回收的問題，所以成本低。再者，使用溶劑的方式會受設備的限制(如反應槽的容量及數目)，以至於僅能批次式製備，而本發明方法可連續式地從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物，故確實能達成本發明之目的。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
Claims (7)
- 一種從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，包含以下之步驟：提供一菌泥，包含細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌及培養基，其中，該培養基包括氯化鈉；加入一溶液至該菌泥中，使該菌泥中的細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌的細胞破碎，形成一懸浮液；施予一加壓噴霧處理，使該懸浮液霧化，以獲得一乾燥粉末；接著，施予一離心分離處理，即可獲得聚羥基烷基酸酯系聚合物。
- 如請求項1所述的從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，其中，該加壓噴霧處理的壓力範圍為70 atm至200 atm。
- 如請求項1所述的從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，其中，基於該菌泥的總量為1重量份計，該溶液的使用量範圍為10重量份以上。
- 如請求項1所述的從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，其中，該溶液包括至少一由下列群組所組成的試劑：酒精及水。
- 如請求項1所述的從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，其中，該細胞內具有聚羥基烷基酸酯系聚合物的嗜鹽菌是擇自於中度嗜鹽菌或極度嗜鹽菌。
- 如請求項1所述的從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，其中，該聚羥基烷基酸酯系聚合物的重量平均分子量範圍為6.0×105至7.9×105。
- 如請求項1所述的從嗜鹽菌中提取聚羥基烷基酸酯系聚合物的方法，其中，該聚羥基烷基酸酯系聚合物是擇自於聚羥基烷酸酯、聚羥基烷酸酯的衍生物，或此等一組合。
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