TW201343910A - 藉由連續發酵之化學品之製造方法及連續發酵裝置 - Google Patents

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Satoko Kanamori
Takashi Mimitsuka
Ken Morita
Norihiro Takeuchi
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Abstract

本發明提供一種化學品之製造方法及化學品製造裝置，該方法係藉由連續發酵法製造穩定且低成本的化學品。本發明之化學品之製造裝置，其特徵為：包含下列步驟：在不具備攪拌機構之發酵槽內培養細胞，使原料發酵，產生化學品之化學品產生步驟；將含有化學品之培養液供給於分離膜模組之培養液供給步驟；過濾該培養液，分離透過液之過濾步驟；將未過濾的濃縮液回流至該發酵槽內之回流步驟；及將氣體供給於該分離膜模組或配管之氣體供給步驟；並且，該培養液之攪拌係藉由如下進行：在該培養液供給步驟、該過濾步驟及該回流步驟中利用泵來進行該培養液之強制循環，以及在該氣體供給步驟中之氣體供給。

Description

藉由連續發酵之化學品之製造方法及連續發酵裝置
本發明係關於藉由連續發酵之化學品之製造方法及連續發酵裝置。更詳言之，係關於以連續發酵製造化學品之方法、及連續發酵裝置，其具備循環機構，該循環機構具備發酵槽與連接於該發酵槽之分離膜模組，並使用在發酵槽中不具備攪拌機構之製造裝置。
屬於伴隨微生物或細胞培養之物質生產方法的發酵法，大致分類為(1)分批發酵法(Batch發酵法)及饋料分批發酵法(Fed-Batch或Semi-Batch發酵法)與(2)連續發酵法(Continuous發酵法)。上述(1)之分批發酵法及饋料分批發酵法，設備上簡化，在短時間完成培養，又，在純菌培養所致生產物發酵，會有產生培養菌以外之雜菌所致污、染之可能性低的優點。但是，隨著時間經過，培養液中生產物濃度變高，因生產物阻礙或滲透壓上升等之影響，使得生產性及產率降低。因此，難以長時間穩定地維持高產率且高生產性。
另一方面，連續發酵法，係藉由在發酵槽內迴避目的物質之積蓄之事項，而相較於上述分批及饋料 分批發酵法，經長時間可維持高產率且高生產性。先前之連續培養，係藉由以一定速度供給新鮮培養基於發酵槽，將與此同量之培養液排出至槽外，而將發酵槽內之液量經常保持於一定的培養法。在分批培養若初始基質濃度被消耗則完成培養，不過連續培養在理論上可無限地持續培養。
關於連續培養，在最近，有提案一種使用有機高分子.分離膜的連續培養裝置(例如參照專利文獻1、2)。
先行技術文獻 專利文獻
專利文獻1 國際公開第2007/097260號
專利文獻2 日本特開2008-212138號公報
但是，在先前之連續培養，於長期間之培養，為了將發酵槽內之培養液作成均質，有必要以磁鐵(magnet)式、或馬達式之攪拌機進行長時間攪拌，其動力成本經常成為課題。又，設置於發酵槽之攪拌機，要自滑動面存在之該結構完全避免污染有困難，在培養時間變長的連續培養，作為污染之發生原因為極大顧慮點之一。又，適合於培養的氧供給量因細胞而不同，不過在氧供給量大的情形，因攪拌而發泡，恐有液漏(liquid spill)或污染發生之虞。
本發明係鑒於上述而完成者，其目的在於提供一種藉由連續發酵之化學品之製造方法及連續發酵裝置，在連續發酵法，可實現動力能量之削減及減低污染之發生，可穩定的且低成本地製造化學品。
為了解決上述課題，並達成目的，本發明之化學品之製造方法，其特徵為包含下述步驟：化學品產生步驟，其係藉由在不具備攪拌機構的發酵槽內培養細胞，使原料發酵而產生化學品；培養液供給步驟，其係將包含在該化學品產生步驟所產生的化學品之培養液供給至分離膜模組；過濾步驟，其係過濾在該培養液供給步驟所供給的培養液，並分離含該化學品之透過液；回流步驟，其係將該過濾步驟中未被過濾之濃縮液回流至該發酵槽內；及供給氣體於該分離膜模組或配管之步驟；該培養液之攪拌，係藉由下述來進行：在該培養液供給步驟、該過濾步驟及該回流步驟之進行的循環管路中藉由泵所致該培養液之強制循環，與在該氣體供給步驟之氣體供給。
1‧‧‧發酵槽
1a‧‧‧底壁
2‧‧‧分離膜模組
3‧‧‧溫度控制部
4‧‧‧旋轉攪拌葉片
5‧‧‧pH控制部
6‧‧‧等級控制部
7‧‧‧差壓控制部
8‧‧‧循環泵
9‧‧‧培養基供給泵
10‧‧‧中和劑供給泵
11‧‧‧過濾泵
12‧‧‧過濾閥
13‧‧‧洗淨泵
14‧‧‧洗淨閥
15‧‧‧模組氣體供給控制閥
16‧‧‧模組氣體供給裝置
17‧‧‧配管氣體供給控制閥
18‧‧‧配管氣體供給裝置
19‧‧‧泵前配管氣體供給控制閥
20‧‧‧泵前配管氣體供給裝置
21‧‧‧發酵槽氣體供給裝置
22‧‧‧發酵槽壓力調整閥
23‧‧‧發酵槽壓力計
28‧‧‧控制裝置
51‧‧‧pH偵測器
61‧‧‧等級偵測器
81‧‧‧配管
82‧‧‧配管
83‧‧‧配管
84‧‧‧配管
86‧‧‧配管
87‧‧‧配管
88‧‧‧配管
89‧‧‧底壁前端部
91‧‧‧流量計
92‧‧‧流量計
93‧‧‧流量計
100、200、300‧‧‧連續發酵裝置
第1圖表示本發明實施形態所使用之連續發酵裝置一例之概要圖。
第2圖表示第1圖之連續發酵裝置所使用發酵槽之形狀一例之概要圖。
第3圖表示在發酵槽中具有旋轉式攪拌葉片之連續發酵裝置一例之概要圖。
第4圖表示比較例1、2及實施例1至4之膜間差壓變化圖。
第5圖表示比較例3、4及實施例5、6之膜間差壓變化圖。
第6圖表示比較例5、6及實施例7、8之膜間差壓變化圖。
第7圖表示無循環泵之連續發酵裝置一例之概要圖。
第8圖表示比較例7及實施例9、10、11之膜間差壓變化圖。
第9圖表示比較例7及實施例9、11、12、13、14、15之膜間差壓變化圖。
用以實施發明之形態
茲就本發明之實施形態中此等化學品之製造方法及連續發酵裝置根據圖面加以詳細說明。此外，由本實施之形態並無限定本發明之物。
1.連續發酵裝置
茲就連續發酵裝置之一例，參照第1圖加以說明。第1圖表示本發明實施形態中此等連續發酵裝置之概要圖。
如第1圖所示，連續發酵裝置100具備：發酵槽1、分離膜模組2、及連接發酵槽1與分離膜模組2 之配管81及82。發酵槽1與分離膜模組2係指經由配管81及82而連接，而形成循環系統。
發酵槽1係構成為在其內部可以放入培養液。具體言之，發酵槽1係以耐壓性、耐熱性及耐污性優異的材質製作。在發酵槽1，可適用圓筒型、多角筒型等各式各樣形狀。發酵槽1可注入發酵原料、細胞、其他發酵所需固體、液體或氣體，可依照需要滅菌，進一步具備可予密閉的形狀。發酵槽1內，為了防止雜菌自發酵槽1外部進入發酵槽1內部而增殖，較佳為維持於加壓狀態。為了管理發酵槽1內之氣壓，可設置後述發酵槽壓力計23等之機構。
又，發酵槽1亦可為如第2圖所示之形狀。發酵槽1之底壁1a係如第2圖所示，成為朝下凸型，在該凸型底壁之凸部前端89亦可具有將培養液送液至分離膜模組2的配管81之連接部。底壁1a較佳為錐面狀或球面狀，更佳為凸部前端之頂角為120度以下之錐面狀底壁。
分離膜模組2具備多數之中空纖維膜或平膜等之分離膜。就分離膜模組2之詳細係如後述。
連續發酵裝置100亦可具備控制裝置28。控制裝置28可進行各種之演算。又控制裝置28根據各種偵測器之偵測結果、使用者之輸入、及各種設定，可控制連續發酵裝置100內各部之動作。
連續發酵裝置100進一步在發酵步驟中，具備發酵槽壓力調整閥22、發酵槽壓力計23、溫度控制部3、pH控制部5、等級控制部6，作為主要參與機構。
又，亦可具備發酵槽氣體供給裝置21，此係在發酵槽1內供給氣體。所供給之氣體可被回收，再次以發酵槽氣體供給裝置21而供給至發酵槽1內。
發酵槽壓力調整閥22，係根據控制裝置28 之控制，在檢測發酵槽壓力計23的發酵槽1內氣壓達到上限時，則發酵槽1內之空氣釋放於外部。如此，發酵槽1內之壓力被適切地保持。此外，為了抑制雜菌混入，發酵槽1內之壓力較佳為保持較外氣壓更高。
溫度控制部3具備溫度偵測器及溫度調整部。溫度偵測器偵測發酵槽1內培養液之溫度。接受控制裝置28之控制，並使溫度調整部動作，以使溫度偵測器之偵測結果表示一定範圍。如此，藉由使發酵槽1內溫度維持於一定，而可維持適於發酵或細胞之增殖的溫度環境。溫度調整部可具有加熱及冷卻之一者或兩者之功能。
pH控制部5具備pH偵測器51及中和劑供給泵10。pH偵測器51偵測發酵槽1內培養液之pH。中和劑供給泵10係配置於連接中和劑槽與發酵槽1的配管上，添加中和劑於發酵槽1內。中和劑供給泵10，係根據控制裝置28之控制，進行動作，以使pH偵測器51之偵測結果表示預定範圍。此外，以中和劑而言可使用酸及/或鹼。
等級控制部6，具備等級偵測器61及培養基供給泵9。培養基供給泵9係配置於連接培養基槽與發酵槽1之配管上。根據控制裝置28之控制，以等級偵測 器61之偵測結果表示發酵槽1內培養液量低於預定之下限時，則使培養基供給泵9運轉，以能供給培養基於發酵槽1，而表示培養液量達到上限時，則使培養基供給泵9之動作停止。如此，發酵槽1內之培養液量可適切地保持。
連續發酵裝置100具備循環系統，該循環系統係在發酵槽1與分離膜模組2之間使培養液循環。具體言之，連續發酵裝置100具備：配管81，其連通發酵槽1與分離膜模組2之1次側；及配管82，其將未透過分離膜模組2之分離膜的濃縮液回至發酵槽1。此外，在本發明實施形態，配管81係連接於分離膜模組2之下部，故在分離膜模組2係自下部供給培養液。在自發酵槽1供給培養液於分離膜模組2的配管81上，配置有循環泵8。循環泵8係以使培養液自發酵槽1朝向分離膜模組2輸送之方式運作。
以循環泵8而言，若為具有不影響培養之細胞之育成的剪斷應力之泵，則泵之種類並無特別限定，雖可使用漩渦泵、齒輪泵等之離心泵；柱塞泵、隔膜泵、旋轉泵、管泵等一般的泵，不過特佳為漩渦泵。又，以剪斷應力而言，較佳為2000Pa以下，更佳為1000Pa以下之泵。
又，連續發酵裝置100具備連接於分離膜模組2並將濾液(亦即透過液)排出至裝置外之配管83。在該配管83上，設置用以進行過濾之賦予驅動力的機構。例如有設置過濾泵11，同時也有設置過濾閥12。
連續發酵裝置100，亦可具備將分離膜模組2予以逆壓洗淨之構成。逆壓洗淨係指將洗淨用液體(以下有稱為「洗淨液」)自分離膜之2次側通過1次側而洗淨分離膜。連續發酵裝置100具備：洗淨液槽，其容置洗淨液；配管84，其將洗淨液槽與分離膜模組2之2次側加以連接；洗淨泵13，其設置於配管84上；及洗淨閥14。藉由洗淨泵13，而使洗淨液朝向分離膜模組2而輸送。在配管84，亦可設置壓力計、流量計、滅菌用裝置、滅菌用過濾器等。
又，在連續發酵裝置100亦可設置差壓控制部7。差壓控制部7可偵測分離膜模組2之膜間差壓(TPD：Transmembrane Pressure Difference)。亦即，偵測在分離膜模組2之1次側(供給培養液側)與2次側(透過液(即濾液)排出側)之間之差壓。
進一步，連續發酵裝置100係為供給氣體於分離膜模組2之1次側之構成。
在連續發酵裝置100，尤其是相對於分離膜模組2，係自分離膜模組2之下部，及連通發酵槽1及分離膜模組2之配管81之至少一者供給氣體。尤其是，設置一機構，其可調整來自氣體供給源、氣體供給口、及氣體供給源之氣體供給速度。
具體言之，連續發酵裝置100具備：模組氣體供給控制閥15、模組氣體供給裝置16、配管氣體供給控制閥17、配管氣體供給裝置18、泵前配管氣體供給控制閥19、及泵前配管氣體供給裝置20。
但是，在模組氣體供給裝置16、配管氣體供給裝置18、及泵前配管氣體供給裝置20中，可設置至少一種氣體供給源即可。亦即，設置該等裝置之僅一個、僅二個、或全部3個之構成，也含於本發明實施形態中。模組氣體供給控制閥15、配管氣體供給控制閥17、泵前配管氣體供給控制閥19，係各自與模組氣體供給裝置16、配管氣體供給裝置18、泵前配管氣體供給裝置20形成對之構件。
模組氣體供給裝置16，相對於分離膜模組2，係經由配管86而連接分離膜之1次側，即在供給培養液之側。配管86，係與供給培養液於分離膜模組2之配管81為不同之管。亦即，模組氣體供給裝置16，係藉由與培養液之供給路不同之流路，而直接連接分離膜模組2。又，配管86係連接於分離膜模組2之下部。在本說明書中「下部」，可指分離膜模組2之底部，也可指自底面至分離膜模組2之1/3高度為止之範圍。經由配管86，模組氣體供給裝置16可將氣體自分離膜模組2之下部送入。模組氣體供給控制閥15，係藉由配置於配管86上，而可藉由開閉來調整氣體之供給量。
配管氣體供給裝置18係在循環泵8之下游側藉由配管87而連接於配管81。配管氣體供給控制閥17係設置於配管87上，而可藉由開閉來調整氣體之供給量。配管氣體供給裝置18，係供給氣體於連通發酵槽1及分離膜模組2之配管81。
泵前配管氣體供給裝置20係在循環泵8之上游側藉由配管88而連接至配管81。泵前配管氣體供給控制閥19係設置於配管88上，而可藉由開閉來調整氣體之供給量。泵前配管氣體供給裝置20，係供給氣體於連通發酵槽1及分離膜模組2的配管81。
在配管86至88，亦可設置滅菌用裝置或滅菌用過濾器等，以使雜菌無法進入發酵槽1內。
氣體供給口，係指將氣體釋放於培養液或液體內之部分。氣體供給口較佳為以產生氣泡之方式來形成。所產生之氣泡可為微細氣泡亦可為粗大氣泡。氣泡之大小係藉由分離膜之種類及氣體供給量等條件來改變氣體供給口之形狀，藉此進行變更。氣體供給口亦可藉由在氯乙烯製或不銹鋼製之配管上設置空氣排出孔而形成，亦可使用多孔性之橡膠、陶瓷、用膜的散氣管(diffuser pipe)等。氣體供給口之大小，為可供給規定量之氣體，且不發生因發酵液所致之堵塞的大小即可。為了不讓雜菌進入發酵系統中，亦可在氣體供給口設置滅菌用過濾器等。
在實施之形態1，氣體供給口係在配管86至88之2個端部中，設置於分離膜模組2側之端部。換言之，配管86至88係自氣體供給源連上氣體供給口之管。
氣體供給口，可設置於分離膜模組2之下部，且在使用循環泵8而將培養液自發酵槽1朝向分離膜模組2供給之構成，亦可設置於發酵槽1與循環泵8之間，或循環泵8與分離膜模組2之間之任一方式。
又，亦可設置測定所供給之氣體之線速度的機構，一例係在第1圖，表示流量計91、92及93。流量計91設置於配管86，可測定通過配管86內之氣體流量。流量計91可被利用於以模組氣體供給裝置16所供給之氣體線速度之測定。又，流量計92可測定設置於配管87，通過配管87內之氣體流量。流量計92係被利用於以配管氣體供給裝置18所供給之氣體線速度之測定。又，流量計93可測定被設置於配管88，且通過配管88內之氣體流量。流量計93可被利用於以泵前配管氣體供給裝置20所供給之氣體線速度之測定。
本發明實施形態中連續發酵裝置100，並無具有在發酵槽1中被稱為旋轉軸或攪拌葉片等的機械式攪拌機構。培養液之攪拌，僅因：連接發酵槽1與分離膜模組2之配管81及82以及分離膜模組2內循環泵8所致輸送液；與供給於分離膜模組2及/或配管81之氣體，而發生。亦即，係表示在使發酵槽1自循環系統分離時，在發酵槽1內不產生培養液之攪拌的構成。此外，直接連接於發酵槽1之發酵槽氣體供給裝置21，並不含攪拌機構。發酵液之循環速度及氣體之線速度可如後述被控制。
2.分離膜模組
分離膜模組2，具備分離膜與容置分離膜的殼體。
分離膜模組2所用之分離膜，可為有機膜、無機膜之任一種。分離膜可使用於培養液之過濾，對藉由氣體供給之衝撃具有耐久性之膜即可。例如作為分離膜，可 列舉聚偏二氟乙烯製、聚碸製、聚醚碸製、聚四氟乙烯製、聚乙烯製、聚丙烯製、陶瓷製之膜。尤其是，較佳為聚偏二氟乙烯製之分離膜，其難以發生發酵液所致污染，且易於洗淨，更對氣體供給之衝撃之耐久性優異。
為了有效地分離發酵液中之細胞，分離膜較佳為具有平均細孔徑0.001μm以上小於10μm之細孔之多孔性膜。又，分離膜之形狀亦可採用平膜、中空纖維膜等任一形狀之物，但，較佳為相對於模組體積，膜面積廣的中空纖維膜。膜之平均孔徑可依照ASTM：F316-86記載之方法(另稱：半乾法)來決定。此外，藉由該半乾法所決定者，係膜之最小孔徑層之平均孔徑。
此外，藉由半乾法之平均孔徑測定之標準測定條件，係如下述。
使用液體：乙醇
測定溫度：25℃
升壓速度：1kPa/秒
平均孔徑[μm]係由下式求得。
平均孔徑[μm]=(2860×表面張力[mN/m])/半乾空氣壓力[Pa]
乙醇於25℃中表面張力為21.97mN/m(日本化學會編、化學便覽基礎編訂3版、II-82頁、丸善(股)、1984年)，故在本發明中標準測定條件之情形，可以下式求得：平均孔徑[μm]=62834.2/(半乾空氣壓力[Pa])。
外壓式中空纖維膜之外徑，以0.5mm以上3mm以下為理想。藉由使外徑為0.5mm以上，而將中空纖維膜中流動的過濾液之阻力抑制成較小。又，藉由使外徑為3mm以下，而可抑制中空纖維膜因發酵液或氣體所致外壓而破裂。
內壓式中空纖維膜之內徑，以0.5mm以上3mm以下為理想。藉由使內徑為0.5mm以上，而可將中空纖維膜中流動的發酵液之阻力抑制成較小。又，因藉由使內徑為3mm以下，而可確保膜表面積，故可抑制使用模組個數之增大。
分離膜模組2之殼體，係以耐壓性優異的材質製作，圓筒型、多角筒型等，可使發酵液朝模組之1次側供給的形狀即可。若考慮發酵液之流動或處理性時，則殼體較佳為圓筒型。
3.化學品之製造方法
本實施形態之製造方法係以連續發酵製造化學品之方法，其特徵為具備以下之步驟(a)至(e)；培養液之攪拌，係藉由：培養液供給步驟、過濾步驟及回流步驟中藉由泵之培養液之強制循環；與在氣體供給步驟供給氣體於分離膜模組或配管來進行：(a)化學品產生步驟，其係在發酵槽內將培養液中細胞在無利用攪拌機構攪拌之情況下進行培養，藉此使原料發酵而產生化學品；(b)培養液供給步驟，其係將包含在該化學品產生步驟所產生的化學品之培養液供給至分離膜模組； (c)過濾步驟，其係過濾該培養液供給步驟所供給的培養液，並分離含該化學品之透過液；(d)回流步驟，其係將該過濾步驟中未被過濾之濃縮液回流至該發酵槽內；及(e)氣體供給步驟，其係供給氣體於該分離膜模組或配管。
3-1.化學品之製造步驟(a)[細胞]
在本說明書中，「細胞」係指包含微生物及培養細胞、以及真核細胞及原核細胞之概念。作為微生物而言，可使用在發酵工業被廣泛使用的麵包酵母等之酵母；大腸菌、乳酸菌、棒型細菌等之細菌；絲狀菌；放線菌等。培養細胞係來自多細胞生物之細胞，有例如動物細胞及昆蟲細胞等。使用於化學品之製造的細胞，可為從自然環境單離者，又，也可為藉由突變或基因重組而有一部分性質改變者。
真核細胞具有在細胞內被稱為細胞核(核)之結構，可與不具有細胞核(以下簡稱「核」)之原核生物明確地區別。在化學品之製造上，在真核細胞中可適當使用酵母。作為適於化學品之製造的酵母而言，有例如屬於酵母菌屬(Genus Saccharomyces)的酵母。其中特佳之種類為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
原核細胞，並無具有在細胞內被稱為細胞核(核)之結構，可與具有細胞核(核)之真核生物明確地區別。在化學品之製造上，例如在原核細胞中，較佳可使用乳酸菌。
細胞可因應作為目的之化學品、原料、培養條件等而作選擇。
作為生產L-胺基酸之細胞，有例如在發酵工業被廣泛使用的大腸菌或棒型細菌等之細菌。
具體言之，以L-蘇胺酸生產菌而言，有屬於大腸桿菌屬(Genus Escherichia)、普羅威登斯菌屬(Genus Providencia)、棒狀桿菌屬(Genus Corynebacterium)、短桿菌屬(Genus Brevibacterium)或鋸桿菌屬(Genus Serratia)之細菌等。其中特佳之種類係大腸桿菌(Escherichia coli)、雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳酸發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)及黏質沙雷氏桿菌(Serratia marcescens)。
又，以L-離胺酸生產菌而言，有大腸桿菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬之細菌等。其中特佳之細菌係大腸桿菌、麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌及乳酸發酵短桿菌。
以L-麩胺酸生產菌而言，較佳為麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌及乳酸發酵短桿菌。
以L-色胺酸生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳酸發酵短桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、芽孢枯草桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)及大腸桿菌等。
以L-異白胺酸生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳酸發酵短桿菌及黏質沙雷氏桿菌等。
以L-麩醯胺生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳酸發酵短桿菌及里加黃桿菌(Flavobacterium rigense)等。
以L-精胺酸生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、黏質沙雷氏桿菌、大腸桿菌及枯草桿菌等。
以L-丙胺酸生產菌而言，有黃色短桿菌及氧化節桿菌(Arthrobacter oxydans)等。
以L-組胺酸生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)、黏質沙雷氏桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌及天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)等。
以L-脯胺酸生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、缺陷株(Kurthia catenaforma)、黏質沙雷氏桿菌及大腸桿菌等。
以L-苯丙胺酸生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳酸發酵短桿菌或大腸桿菌等。
以L-天門冬胺酸生產菌而言，有黃色短桿菌、巨桿菌(Bacillus megatherium)、大腸桿菌及螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等。
以L-酪胺酸生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳酸發酵短桿菌及大腸桿菌等。
以L-甲硫胺酸生產菌而言，較佳為大腸桿菌、麩胺酸棒狀桿菌。
以L-絲胺酸生產菌而言，有大腸桿菌、麩胺酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、氧化節桿菌、嗜醋酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)及乳酸發酵短桿菌等。
以L-纈胺酸生產菌而言，有乳酸發酵短桿菌、黏質沙雷氏桿菌及克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)等。
以L-白胺酸生產菌而言，有麩胺酸棒狀桿菌、乳酸發酵短桿菌及黏質沙雷氏桿菌等。
具有L-胺基酸之生產能力的微生物，可為單離自自然環境之物，又，亦可為藉由突變或基因重組而使一部分性質改變之物。作為一例，有日本特開平2-219582號公報所記載之提高L-蘇胺酸生產性的雷氏普羅威登斯菌、及日本特表平3-500486號公報所記載之提高L-丙胺酸生產性之的麩胺酸棒狀桿菌等。
培養液中所含之L-胺基酸之分離及精製，可組合先前周知之過濾、濃縮、蒸餾及晶析等之方法進行。
在製造D-乳酸之情形，較佳為使用D-乳酸去氫酶之酵素活性已增強之野生型株之細胞。就增強酵素活性之方法而言，可使用先前周知的藉由藥劑突變之方法。就野生型株而言，例如乳酸菌，可列舉屬於具有合成乳酸能力之乳酸桿菌屬(Genus Lactobacillus)、桿菌屬(Genus Bacillus)、小球菌屬(Genus Pediococcus)、四體 球菌屬(Genus Tetragenococcus)、肉品桿菌屬(Genus Carnobacterium)、徘徊球菌屬(Genus Vagococcus)、白念珠球菌屬(Genus Leuconostoc)、酒球菌屬(Genus Oenococcus)、奇異菌屬(Genus Atopobium)、鏈球菌屬(Genus Streptococcus)、腸球菌屬(Genus Enterococcus)、乳酸球菌屬(Genus Lactococcus)及芽孢乳酸桿菌屬(Genus Sporolactobacillus)之細菌。
例如，以選擇D-乳酸具有生產能力之乳酸菌而言，可列舉屬於芽孢乳酸桿菌屬之D-乳酸生產菌，較佳之具體例，可使用左旋乳酸芽孢乳酸桿菌(Sporolactobacillus laevolacticus)或菊糖芽孢乳酸桿菌(Sporolactobacillus inulinus)。更佳為左旋乳酸芽孢乳酸桿菌ATCC 23492、ATCC 23493、ATCC 23494、ATCC23495、ATCC 23496、ATCC 223549、IAM 12326、IAM 12327、IAM 12328、IAM 12329、IAM 12330、IAM 12331、IAM 12379、DSM 2315、DSM 6477、DSM 6510、DSM 6511、DSM 6763、DSM 6764、DSM 6771等與嗜酸芽胞乳桿菌JCM 6014等。
又，藉由在細胞中組入編碼D-乳酸去氫酶之基因(以下亦稱為D-LDH)，而可賦予或增強D-乳酸去氫酶之酵素活性。亦即，在化學品之產生，亦可適當使用基因重組細胞。
在使用基因重組細胞製造D-乳酸之情形，以宿主細胞而言，較佳為屬原核細胞之大腸菌、乳酸菌、及真核細胞之酵母等，特佳為酵母。又，在酵母中較佳 為屬於酵母菌屬(Genus Saccharomyces)的酵母，更佳為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
D-LDH只要是編碼具有將還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)與丙酮酸轉換為氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)與D-乳酸的活性的蛋白質即可，並無限定於特定之排列。例如以D-LDH而言，較佳為來自胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、及乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)、左旋乳酸桿菌(Bacillus laevolacticus)、美洲鱟(Limulus polyphemus)、中華鱟(Tachypleus tridentatus)、南方鱟(Tachypleus gigas)、及圓尾鱟(Tachypleus rotundicauda)之基因，更佳為來自左旋乳酸桿菌、及美洲鱟之基因。
在製造L-乳酸之情形，較佳為使用可使L-乳酸去氫酶之酵素活性增強的野生型株之細胞。以增強酵素活性之方法而言，亦可使用先前周知的藉由藥劑突變之方法。野生型株中，例如作為乳酸菌，可列舉具有乳酸合成能力之乳酸桿菌屬(Genus Lactobacillus)、桿菌屬(Genus Bacillus)、小球菌(Genus Pediococcus)、四聯球菌屬(Genus Tetragenococcus)、肉品桿菌屬(Genus Carnobacterium)、徘徊球菌屬(Genus Vagococcus)、白念珠球菌屬(Genus Leuconostoc)、酒球菌屬(Genus Oenococcus)、奇異菌屬(Genus Atopobium)、鏈球菌屬(Genus Streptococcus)、腸球菌屬(Genus Enterococcus)、乳酸球菌屬(Genus Lactococcus)及芽孢乳酸桿菌屬(Genus Sporolactobacillus)所屬之細菌。又，可選擇乳酸 之對糖產率高的乳酸菌，或所得乳酸之光學純度高的乳酸菌使用。
又，以L-乳酸之對糖產率高的乳酸菌而言，有例如山梨乳酸桿菌(Lactobacillus yamanashiensis)、動物乳酸桿菌(Lactobacillus animalis)、敏捷乳酸桿菌(Lactobacillus agilis)、鳥乳酸桿菌(Lactobacillus aviaries)、酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei)、德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbruekii)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、瘤胃乳酸桿菌(Lactobacillus ruminis)、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)、沙氏乳酸桿菌(Lactobacillus sharpeae)、糊精小球菌(Pediococcus dextrinicus)、及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等，可選擇該等，使用於L-乳酸之生產。又，可使用以人工方式賦予乳酸生產能力，或者以人工方式增強乳酸生產能力的細胞。例如藉由導入L-乳酸去氫酶基因(以下有稱為「L-LDH」之情形)於細胞中，而可賦予或增強L-乳酸生產能力。亦即亦可適當使用基因重組細胞。
在使用基因重組細胞製造L-乳酸之情形，以宿主細胞而言，較佳為屬原核細胞之大腸菌及乳酸菌；以及屬真核細胞之酵母等。特佳可使用酵母。又，在酵母中較佳為屬於酵母菌屬(Genus Saccharomyces)之酵母，更佳為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
L-LDH，只要是編碼具有將還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)與丙酮酸轉換為氧化型菸鹼醯 胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)與L-乳酸的活性的蛋白質即可，並無限定於特定之排列。例如作為L-LDH，可使用對糖產率高的來自乳酸菌、來自哺乳類、或來自蛙之基因。以來自哺乳類之基因而言，可適當使用來自智慧人(Homo sapiens)之L-LDH。又，以來自蛙之基因而言，特佳為使用屬負子蟾科(Pipidae)之來自蛙之L-LDH，在屬於負子蟾科之蛙中，較佳可使用來自有爪蟾蜍(Xenopus laevis)之L-LDH。
在D-LDH、L-LDH中亦包含遺傳上多型性之基因，及藉由突變誘發等之突變型之基因。遺傳上多型性係指因基因上之自然突變而使基因之鹼基序列一部分變化者。又，突變誘發係指以人工方式將突變導入基因之意。突變誘發，例如以使用部位特異的突變導入用套組(「"Mutan(註冊商標)"」-K(Takarabio公司製))之方法，及使用隨機突變導入用套組(BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH公司製))之方法等實施。又，D-LDH、L-LDH，如果係編碼具有將NADH及丙酮酸轉換成NAD+及L-乳酸之活性的蛋白質，則鹼基序列之一部分存在缺損或插入亦無妨。
以使用之乳酸生產微生物而言，特佳為表示50%以上之對糖產率的微生物。對糖產率係指乳酸生產量對已消耗的全糖量之比率。
茲就製造丙酮酸之情形加以敘述。以生產丙酮酸之細胞而言，有例如屬於假單孢菌屬(Genus Pseudomonas)、棒狀桿菌屬(Genus Corynebacterium)、大 腸桿菌屬(Genus Escherichia)、不動桿菌屬(Genus Acinetobacter)之細菌。又，更佳為螢光假單胞菌(Pseudomonas fuluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)等之細菌。更佳為使用以突變或基因重組，使性質之一部分改變的細菌。例如，較佳可使用直接參與藉由氧化的磷酸化之ATP生產的ATPase基因經突變、或缺損的細菌。
又，亦可適當使用黴菌及酵母等。例如可使用屬於酵母菌屬(Genus Saccharomyces)、球擬酵母菌屬(Genus Toluropusis)、假絲酵母菌屬(Genus Candida)、或裂摺菌屬(Genus Schizophyllum)之黴菌及酵母。更佳為使用屬於啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomyces copsis、光滑假絲酵母(Candida glabrata)、解脂假絲酵母(Candida lipolytica)、光滑球擬酵母(Toluropusis glabrata)或裂褶菌(Schizophyllum commune)等之黴菌及酵母，而可製造丙酮酸。
培養液所含之丙酮酸之分離及精製，可藉由使用過濾及陰離子交換柱之方法來進行。例如，可適當使用日本特開平6-345683所示之弱鹽性離子交換體的精製法。
茲就製造琥珀酸之情形加以敘述。以生產琥珀酸之細胞而言，可適當利用例如屬於厭氧螺菌屬(Genus Anaerobiospirillum)或放線桿菌屬(Genus Actinobacillus)之細菌。具體言之，有美國專利第5143833 號說明書記載之琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)及James.B.Mckinlay(詹姆士.B.瑪金理)等人所揭示之琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)[Appl.Microbiol.Biotechnol.,71,6651-6656(2005)]。又亦可利用：棒狀桿菌屬(Genus Corynebacterium)或短桿菌屬(Genus Brevibacterium)等之棒形細菌(Coryneform bacterium)；及大腸桿菌(Escherichia Coli)等。又，在棒型細菌中較佳為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、及乳酸發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)等。
又，使用藉由基因重組而改善琥珀酸之生產能力的微生物，藉此可提高琥珀酸之生產性。以此種微生物而言，可使用例如日本特開2005-27533號公報記載之缺損乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase)的黃色短桿菌MJ233AB-41(FERM BP-1498)、非專利文獻1(Toshihiko Hirao et.al.、Appl.Microbiol.Biotechnol.,32,269-273(1989))記載之麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、美國專利第5770435號說明書記載之缺損丙酮酸-甲酸裂解酶(pyruvate formatelyase)與乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase)的菌株的大腸菌AFP111菌株等。
茲就製造伊康酸之情形加以敘述。以生產伊康酸之細胞而言，可適當使用例如黴菌或者酵母。更佳為屬於麴菌屬(Genus Aspergillus)或黑穗病菌屬(Genus Ustilago)之黴菌；及屬於假絲酵母菌屬(Genus Candida) 及紅酵母屬(Genus Rhodotorula)之酵母。其中土麴黴(Aspergillus terreus)、解伊康酸曲黴(Aspergillus itaconicus)、玉蜀黍黑穗病菌(Ustilago maydis)、百慕達草黑穗病菌(Ustilago cynodontis)及Ustilago rabenhorstina之黴菌，或南極假絲酵母(Candia antarctica)可較佳使用在伊康酸之生產上。
茲就製造屍鹼之情形加以敘述。以可生產屍鹼細胞而言，較佳為已使離胺酸脫碳酸酵素及/或離胺酸‧屍鹼反向輸送蛋白之酵素活性增強的微生物。更佳有組入有編碼離胺酸脫碳酸酵素及/或離胺酸‧屍鹼反向輸送蛋白之基因的基因重組微生物。再更佳有組入有1或2種以上編碼離胺酸脫碳酸酵素之基因的基因重組微生物。
在製造屍鹼之情形，以基因重組微生物而言，較佳為大腸菌及棒型細菌，更佳為具有離胺酸脫碳酸酵素活性，且具有高絲胺酸營養要求性或S-(2-胺基乙基)-L-半胱胺酸耐性中至少一種特徵的棒型細菌。更佳為微生物缺損高絲胺酸去氫酶活性，再更佳為利用基因挿入突變之產生，而缺損高絲胺酸去氫酶活性。又，棒型細菌之屬別，較佳係選自由棒狀桿菌屬及短桿菌屬所構成群組中至少1個屬別。更佳為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacuterium gulutamicum)。
[培養基]
發酵原料(以下簡稱「原料」)係指以發酵產生目的之化學品的物質。原料因應細胞、培養條件及作為目的之化學品等而可變更。
培養所用之培養基包含原料，同時包含促進細胞之生育，且可良好地生產作為目的之屬發酵生產物的化學品之成分。在本說明書，只要無特別限定，則「培養基」係指液體培養基。培養基含有例如碳源、氮源、無機鹽類及可依照需要之胺基酸、及維生素等之有機微量營養素。
以上述碳源而言，可使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖及乳糖等之糖類；含有該等糖類之澱粉、澱粉水解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、甘蔗汁；來自甜菜糖蜜或甘蔗汁之萃取物或者濃縮液；甜菜糖蜜或甘蔗汁之過濾液；糖漿(Hi Test molasses)；來自甜菜糖蜜或甘蔗汁之經精製或者結晶化的原料糖；來自甜菜糖蜜或甘蔗汁之經精製或者結晶化的精製糖；乙酸或反丁烯二酸等之有機酸；乙醇等之醇類；以及甘油等。在此糖類係指碳水化合物，其係多元醇之最初氧化產物，具有一個醛基或酮基，其中具有醛基之糖被分類為醛糖，具有酮基之糖被分類為酮糖。
又，以上述氮源而言，例如使用氨氣、氨水、銨鹽類、脲、硝酸鹽類、其他作輔助使用的有機氮源，例如可使用油粕類、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他胺基酸、維生素類、玉米浸液、酵母或酵母萃取物、肉萃取物、蛋白腖等之肽類、各種發酵菌體及其水解物等。
又，以上述無機鹽類而言，可適宜使用例如磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽及錳鹽等。
[培養液]
培養液係指含有培養基及其中所培養之細胞，可含有培養之結果產生之化學品。
在以分離膜模組2所得濾液，實質上不含細胞，不過為說明便利起見，濾液亦有稱為培養液之情形。
[培養]
在連續發酵裝置100，將原料導入發酵槽1內，同時自發酵槽1內抽離培養液，而進行連續培養。
在培養初期進行分批(Batch)培養或饋料分批(Fed-Batch)培養，在增高細胞濃度後，開始連續培養亦可。此時，可依照需要進行細胞之抽離。又，接種高濃度之細胞，在培養開始之同時連續培養亦可。
茲就原料之導入加以說明。在第1圖，藉由於實行培養中使培養基供給泵9運轉，而在發酵槽1內導入培養基，其結果則導入原料。
在實行培養中，原料之導入亦可不予停止地不斷進行，亦可因應狀況使原料之導入與停止進行切換。例如，如上述，培養基之導入之開始及停止，亦可根據等級偵測器61之檢測結果進行，根據圖未示出之計時器之計測結果，每隔一定時間進行亦可。此外，原料之導入並非僅是自動進行之形態，以手動進行之形態亦包含於本發明之技術範圍中。
其次，就培養液之抽離加以說明。培養液中細胞之濃度在不致使培養液之環境變得不適合微生物或培養細胞增殖而使死亡比率增高之範圍內，維持在高狀態的情形，在獲得效率良好的生產性方面為較佳。
連續發酵裝置100，係藉由以循環系統而抽離培養液，在進行化學品回收之同時，可一面維持高細胞濃度，一面進行連續培養。茲就使用循環系統的培養液抽離之詳細內容予以後述。
在發酵槽1，除了與分離膜單元2連接之配管81之外，亦可連接抽離用之流路，培養液之抽離，亦可通過該抽離用之流路來進行。此時，不僅培養液之液體部分，亦可將細胞抽離。
在培養中亦可導入新的細胞於發酵槽1。細胞之導入亦可以手動進行，亦可自動地進行。
在發酵槽1中，原料之供給與培養液之抽離之開始時期未必為相同。又，原料之供給及培養液之抽離可為連續的，亦可為間歇的。
連續培養操作，在管理上通常較佳為在單一之發酵槽1進行。但是，若為使細胞增殖，同時產生生產物之連續發酵培養法，則不論發酵槽1之個數。基於發酵槽1容量小等之理由，亦可使用複數個發酵槽1。在此情形，將複數個發酵槽1以配管並聯或串聯連接，進行連續培養，亦可獲得高生產性。
在第1圖之連續發酵裝置100中，發酵槽1內之培養液，藉由溫度控制部3、pH控制部5、等級控制部6、發酵槽氣體供給裝置21等而維持於適於發酵之條件。
細胞之培養，通常可在pH3以上10以下，溫度15℃以上65℃以下之範圍進行。培養液之pH，係 藉由無機之酸或者有機之酸、鹼性物質，進一步以脲、氫氧化鈣、碳酸鈣及氨氣等，而調整於上述範圍內之已被預先設定之範圍內。在連續發酵裝置100中，控制裝置28之控制下，藉由pH控制部5而經自動控制pH，並以溫度控制部3而自動控制溫度。
3-2.培養液之過濾步驟(c)
藉由過濾步驟，而可自培養液連續地回收化學品，且繼續培養。具體言之，在第1圖，藉由循環泵8，使培養液自發酵槽1抽離，通過配管81供給於分離膜模組2。培養液以分離膜模組2而分離為濃縮液與透過液。
第1圖之循環泵8相當於交叉流(crossflow)循環泵，在分離膜模組2進行交叉流過濾。藉由交叉流過濾，可以培養液之剪斷力將附著於膜的微生物等污染有效地除去。藉由進一步將對膜之1次側的氣體供給加以組合，而可實現更高的洗淨效率。
過濾之驅動力，亦可藉由利用發酵槽1與分離膜模組2之液位差(水位差)的虹吸管而獲得，亦可藉由以交叉流循環泵而發生之膜間差壓而獲得。又，作為過濾之驅動力，係在分離膜模組2之濾液側設置吸引泵亦可。在第1圖之形態，過濾泵11相當於吸引泵。
在使用交叉流循環泵之情形，可藉由吸引泵之吸引壓力來控制膜間差壓。進一步，藉由在配管81或82設置圖未示出之閥來改變導入分離膜模組2之1次側的氣體或液體之壓力，而亦可控制膜間差壓。將分離膜模組2之1次側之壓力與濾液側之壓力之差作為膜間差壓檢測，根據該膜間差壓，可進行泵之控制等。
第1圖之結構，係以循環泵8，自發酵槽1供給培養液至分離膜模組2。又，因應藉由差壓控制部7所偵測的膜間差壓，藉由控制循環泵8及過濾泵11之動作，而可適切地調整供給於分離膜模組2的培養液之量。
過濾可連續地進行，亦可間歇地進行。在進行間歇地過濾之情形，例如每持續實行過濾5至120分鐘，可停止過濾預定之時間(例如0.1至10分鐘)。更佳為，每持續過濾5至10分鐘，則停止過濾0.25至3分鐘。如後述，氣體供給可在過濾停止中進行，亦可在過濾中進行。
3-3.分離及循環步驟(b、d)
因培養液中之細胞並不透過分離膜，故在通過分離膜模組2之濃縮液(未透過的液體)，細胞濃度增高。藉由使濃縮液通過配管82回至發酵槽1，則可在發酵槽1內保持細胞。透過分離膜模組2之分離膜的濾液，通過配管83而排出裝置外。如此，非透過液回流至發酵槽1內，且透過分離膜的濾液被分離。結果，可保持發酵槽1內之細胞濃度為高，且使化學品連續地自培養系統分離。
循環系統培養液之循環速度較佳為每模組剖面積之屬流量的交叉流速度(m3/m2/sec)為0.1m3/m2/sec以上1.0m3/m2/sec以下。更佳為0.1m3/m2/sec以上0.5m3/m2/sec以下。藉由使速度為0.1m3/m2/sec以上，而可獲得用以除去附著於膜的微生物等之污染之交叉流剪斷力。又，藉由使速度為1.0m3/m2/sec以下，而可抑 制培養液之發泡量。若泡過剩地發生時，易於產生下列問題：因使泡自排氣口溢出，而發生污染：或因泡而使等級偵測器61誤偵測發酵槽1內液面之位置。
又，較佳為在不進行過濾間，循環系統中培養液之循環仍被繼續。
循環速度可藉由利用控制裝置28控制循環泵8而調整。
3-4.氣體供給步驟(e)
以氣體之供給於製造裝置之步驟而言，有下述二步驟。
第一氣體供給步驟(e)，在第1圖之結構中，在循環系統之氣體供給，亦即在將分離膜模組2、發酵槽1及分離膜模組2連接的配管81，與用以細胞之發酵之氣體供給兼作為刷洗洗淨實行。就具體的氣體供給方法記載於以下。在第1圖所示構成，於模組氣體供給裝置16、配管氣體供給裝置18、及泵前配管氣體供給裝置20中，藉由任一種或二種以上之裝置來供給氣體。藉由氣體之供給，汙垢會自分離膜模組2內之分離膜去除。
在氣體供給之開始時，模組氣體供給控制閥15、配管氣體供給控制閥17、及泵前配管氣體供給控制閥19之至少1個，因控制裝置28之控制或以手動而開啟。在氣體供給之停止時，該等閥同樣地藉由控制裝置28之控制或手動而關閉。
在氣體供給時，進行對分離膜模組2之液體供給。藉由氣體供給之刷洗洗淨效果與分離膜模組2中液體流動之洗淨效果合在一起，而可獲得高洗淨效果。
尤其在第1圖之結構，在氣體供給時，培養液自發酵槽1供給至分離膜模組2。具體言之，在供給氣體時，則循環泵8運轉。此時，過濾泵11停止且過濾閥12關閉，亦即亦可使過濾停止。又，亦可使過濾泵11運轉且使過濾閥12開啟。
如此，藉由培養液之流動所致剪斷力與氣體供給所致之刷洗洗淨效果，而可獲得高洗淨效果。
以供給氣體而言，可使用氣體鋼瓶、鼓風機、壓縮機或者以配管所供給之壓縮氣體等。亦即，以模組氣體供給裝置16、配管氣體供給裝置18及泵前配管氣體供給裝置20而言，可使用：可壓縮氣體，另一方面，可以一定壓力供給該氣體的裝置；或可容置經壓縮的氣體並以一定壓力供給該氣體的槽。
所供給之氣體，較佳為含有氧之氣體，亦可為純氧。又，氧之濃度可藉由混合對發酵無不良影響之氣體，例如空氣、氮、二氧化碳、甲烷或該氣體等之混合氣體等，而來調整。在提高氧之供給速度時，可使用下述方法：加氧於空氣，保持氧濃度21%以上；加壓培養液；或者提高氣體供給量等。
若有必要降低氧之供給速度，亦可將二氧化碳、氮、甲烷及氬等不含氧之氣體混合於空氣再行供給。
在第1圖之結構，供給於分離膜模組2之氣體量可以流量計91、92及93計測。控制裝置28係藉由偵測在流量計91至93所計測之氣體供給量，並改變閥15、17及19之開閉之程度來調整供給量。
在僅以模組氣體供給裝置16而供給氣體之情形，氣體之供給速度，根據流量計91之偵測結果，藉由使模組氣體供給閥15開閉來調整。又，以配管氣體供給裝置18來供給氣體之情形，氣體之供給速度，根據流量計92之偵測結果，藉由使配管氣體供給閥17開閉來調整。又，在以泵前配管氣體供給裝置20供給氣體之情形，氣體之供給速度，根據流量計93之偵測結果，藉由使泵前配管氣體供給閥19開閉來調整。
此外，氣體供給量之調整，亦可藉由控制裝置28及自動閥而自動控制，亦可使用手動閥進行手動控制。
對氣體之供給量並無特別限定，較佳為以下式(1)計算，屬每分離膜模組剖面積之氣體供給量的氣體之線速度以0.15cm/s以上為理想，在70cm/s以下為理想。更佳為0.30cm/s以上35cm/s以下。藉由使線速度為0.15cm/s以上，而可獲得分離膜之洗淨效果，以及藉由氣體供給之培養液之攪拌及氧供給等之效果。藉由使氣體線速度為70cm/s以下，則可抑制培養液之發泡量。連續發酵裝置100係如上述，因具備用以使空氣自發酵槽1中逸脫至外之發酵槽壓力調整閥22及排氣口，故若泡自排氣口溢出，則易於發生污染。藉由使氣體供給量設在上述之量以下，而可抑制發泡量，此種問題難以產生。又，亦難以產生因泡而等級偵測器61誤偵測發酵槽1內液面之位置的問題。
氣體線速度(m/s)=氣體供給量(m3/s)×100÷(分離膜模組內部剖面積(m2)×(100-膜填充率(%)))…(1)
在利用本實施形態之連續發酵裝置100時，亦可提高發酵效率。藉由模組氣體供給裝置16、配管氣體供給裝置18或泵前配管氣體供給裝置20等所供給之氣體，與培養液接觸，在配管之中與培養液接觸同時流動，在分離膜模組2之中，與分離膜接觸，並搖動膜，自分離膜模組2至發酵槽1為止，在配管中與培養液一面接觸一面流動，而進入發酵槽1。在發酵槽1中與培養液同時導入的氣體，與發酵槽1中之培養液混合，經攪拌後，在位於發酵液面上部之空間上升，與培養液之接觸完成。一方面，例如在如第3圖所示之先前所使用之連續發酵裝置200，在發酵槽1以發酵槽氣體供給裝置21而直接供給氣體，在發酵槽1中經攪拌後，即刻在位於發酵液面上部之空間上升，與發酵液之接觸完成。
模組氣體供給裝置16、配管氣體供給裝置18或泵前配管氣體供給裝置20等之氣體供給之實行條件，亦即氣體供給實行之時機、頻率、1次之氣體供給時間等，並無具體地限定。氣體供給之實行條件，可因應膜間差壓、膜間差壓之變化、發酵槽1內之壓力、供給氣體之種類、所培養細胞種類、所製造之化學品種類及原料種類等各式各樣條件而變更。例如，氣體供給亦可連續進行，亦可前次氣體供給完成至每次經過預定時間來進行，亦可在分離膜模組2中每次過濾量或膜間差壓達到預定之值進行。為了決定氣體供給開始時及完成 時，故連續發酵裝置100亦可設置圖未示出之計時器等之計測器。
在間歇地進行氣體供給之情形，氣體供給頻率，較佳為0.1次/小時以上360次/小時以下，更佳為12次/小時以上120次/小時以下。藉由使氣體供給頻率為360次/小時以下，則不易發生因培養液之發泡所致之不良情況、對過濾膜之損傷、及運轉成本之上升等之問題。又，藉由使氣體供給之洗淨頻率為0.1次/小時以上，則可充分獲得洗淨效果，因可維持發酵槽1內之壓力於充分地高，故可抑制雜菌混入。
1次之氣體供給時間，可由氣體供給頻率、膜間差壓、膜間差壓之變化、發酵槽內之壓力、化學品之生產速度來決定。
間歇式進行氣體供給之情形之洗淨時間係在5秒/次以上1小時/次以下之範圍，更佳為10秒/次以上600秒/次以下。藉由使氣體供給時間為1小時/次以內，則可抑制過濾膜之損傷及乾燥、以及運轉成本上升等問題之發生。又，藉由使氣體供給時間為5秒/次以上，則可充分獲得洗淨效果，同時可抑制發酵槽1內壓力降低，故可抑制雜菌之混入。此外，因應氣體供給時間，而可調整氣體之線速度。
本實施形態中此等化學品之製造方法，與該第一氣體供給步驟不同，作為第二氣體供給步驟，亦可在發酵槽1進一步具備供給氣體之步驟。在第1圖之結構，對發酵槽1供給氣體之步驟，可以發酵槽氣體供給裝置21來實行。
尤其是在第一氣體供給步驟之氣體供給(作成循環系統氣體供給)間歇式進行之情形，在循環系統之停止氣體供給之期間，藉由供給氣體於發酵槽1，而可維持微生物之生育所需氣體之供給量。亦即，在連續發酵裝置100中於循環系統之氣體供給間歇式實行之情形，在循環系統停止氣體供給時，藉由控制裝置28可加以控制，以使發酵槽氣體供給裝置21等其他機構所致對發酵槽1之氣體供給速度，以較於循環系統之氣體供給時該等其他機構所致對發酵槽1之氣體供給速度更快。供給速度要快到何種程度，可因應發酵之條件等而加以變更。
4.化學品
以本說明書所述製造方法所得化學品，係使細胞在培養液中生產之物質。以化學品而言，有例如醇、有機酸、二胺、胺基酸及核酸等在發酵工業中大量生產的物質。又，上述製造方法亦可適用於酵素、抗生物質及基因重組蛋白質之物質的生產。
例如以醇而言，有乙醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇及甘油等。
又，以有機酸而言，有乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、蘋果酸、伊康酸、胺基酸及檸檬酸等。又，以二胺而言，有屍鹼，若為核酸，可列舉肌苷、鳥苷、及胞苷等。
以胺基酸而言，有L-蘇胺酸、L-離胺酸、L-麩胺酸、L-色胺酸、L-異白胺酸、L-麩醯胺、L-精胺酸、 L-丙胺酸、L-組胺酸、L-脯胺酸、L-苯丙胺酸、L-天門冬胺酸、L-酪胺酸、L-甲硫胺酸、L-絲胺酸、L-纈胺酸及L-白胺酸等，特佳為L-蘇胺酸、L-離胺酸及L-麩胺酸。
實施例
以下，茲表示實施例就本發明更具體說明。但是，本發明並非限定於該等實施例。在以下之實施例及比較例所使用的連續發酵裝置之概略結構，係如第1圖(無旋轉式攪拌葉片)或第3圖(有旋轉式攪拌葉片)所示。就有無旋轉式攪拌葉片，在各實施例、及比較例中明白記載。又，在以下之例中，藉由連續發酵製造L-蘇胺酸、L-離胺酸及D-乳酸作為化學品。
[A.L-蘇胺酸濃度之測定方法]
培養液中所含之L-蘇胺酸濃度之測定以下述方法進行。取25μL含測定之L-蘇胺酸的培養液，在此添加150μl之NaHCO3(75mM)及作為內標之25μl之L-甲硫胺酸(2g/L)。在上述溶液中，進一步添加900μl乙醇及150μl 0.2M二硝基氟苯(DNFB)並混合。將上述溶液在37℃之溫度，靜置1小時後，以下述條件進行HPLC分析。
‧管柱：CAPCELLPAK C18 TYPE SG120(資生堂)
‧移動相：0.1%(w/v)H3PO4：乙腈=7：3(流速1.2mL/min)
‧檢測方法：UV(360nm)
‧溫度：23℃
校正曲線係將濃度已知之L-蘇胺酸作為試樣進行分析，繪製橫軸為L-蘇胺酸濃度、縱軸為L-蘇胺酸面積/L-甲硫胺酸(內標)面積之面積比而製成。
[B.L-離胺酸濃度之測定方法]
培養液中所含之L-離胺酸濃度之測定，係以下述方法進行。取25μL含測定之L-離胺酸之培養液，在此添加400μL NaHCO3(75mM)及作為內標之25μL 1,4-丁二醇(2g/L)。在上述溶液中添加150μL 0.2MDNFB後，在37℃反應1小時。
將該溶液50μl溶解於1mL乙腈，將以10,000rpm經離心5分鐘的上澄液10μL於以下條件，以HPLC進行分析。
‧管柱：CAPCELLPAK C18 TYPE SG120(資生堂)
‧移動相：0.1%(w/w)磷酸水溶液：乙腈=45：55(流速1mL/min)
‧檢測方法：UV(360nm)
‧溫度：23℃
校正曲線係將濃度已知之L-賴胺酸作為試樣進行分析，繪製橫軸為L-賴胺酸濃度、縱軸為L-賴胺酸面積/1,4-丁二醇(內標)面積之面積比之圖表，予以製成。
[C.D-乳酸濃度之測定方法]
培養液中所含之D-乳酸濃度之測定，係以下述方法進行。取100μL含D-乳酸之培養液，於下述所示條件以HPLC法測定乳酸量，藉此加以確認。
‧管柱：Shim-Pack SPR-H(島津公司製)
‧移動相：5mM對甲苯磺酸(流速0.8mL/min)
‧反應液：5mM對甲苯磺酸、20mM Bis-tris、0.1mM EDTA‧2Na(流速0.8mL/min)
‧檢測方法：電導度
‧溫度：45℃
校正曲線係將濃度已知之D-乳酸作為試樣進行分析，繪製橫軸為D-乳酸濃度、縱軸為檢測波峰面積之圖表，予以製成。
[D.葡萄糖濃度之測定方法]
在葡萄糖濃度之測定係使用「Glucose Test Wako C」(註冊商標)(和光純藥公司製)。
[E.膜過濾模組之製作]
將東麗(股)製之加壓式聚偏二氟乙烯中空纖維膜模組「HFS1020」予以解體，僅切出無黏結固定的部分。藉由將如此切出的聚偏二氟乙烯中空纖維膜容置於殼體內，來製作分離膜模組。以殼體而言，係使用聚碳酸酯樹脂之成型品。經製作的膜過濾模組之容量為0.016L，有效過濾面積為280平方公分。
[F.藉由連續發酵製造L-離胺酸所用之基因重組株之製作]
作為具有L-離胺酸生產能力之微生物，係進行麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032(以下簡稱ATCC13032株)之高絲胺酸去氫酶(HOM)基因破壞株之製作。具體言之，以日本特開2008-212138記載之方法，進行基因改造。所得之菌株稱為麩胺酸棒狀桿菌delta-HOM株(以下簡稱delta-HOM株)。使用delta-HOM株，如後述，進行L-離胺酸之連續發酵。
[G.藉由連續發酵製造D-乳酸所用之基因重 組株之製作]
作為具有D-乳酸生產能力之微生物，係製作在PDC1基因、SED1基因、及TDH3基因座導入有來自美洲鱟之1dh基因的酵母。具體言之，藉由WO2010/140602記載之方法進行基因改造。所得之菌株稱為SU042株。使用SU042株，如後述，進行D-乳酸之連續發酵。
[H.藉由連續發酵製造L-蘇胺酸]
(比較例1)
使第3圖所示連續發酵裝置200運轉，實施L-蘇胺酸之連續發酵。在分離膜，利用在[E]製作的中空纖維膜。作為L-蘇胺酸連續發酵中之運轉條件，以下之實施例及比較例之共通條件如下。
共通條件
‧微生物：雷氏普羅威登斯菌SGR588-77株(FERM P-10528)
‧培養基：L-蘇胺酸發酵培養基(表1)
‧發酵液容量：3.0(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧溫度：37(℃)
‧滅菌：含有中空纖維膜模組之發酵槽，及所使用之培養基全部於121℃、20min之熱壓釜進行高壓(2氣壓)蒸氣滅菌。
‧pH調整：以28%氨水溶液調整至pH7
‧循環速度0.3m/s
‧過濾速度：225mL/h(固定)
又，該比較例中之特有條件(變更條件)如下。
變更條件
‧旋轉式攪拌葉片：有、攪拌速度350(rpm)
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：無
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2及/或配管81之氣體線速度：0cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：1000mL/min
以下培養基等之條件在實施例及比較例均共通。此外，無論是作為目的之化學物質，在發酵原料中之碳源，係使用葡萄糖。以氮源及無機鹽類而言，各自使用後述之物質。
首先，將刮取自瓊脂培養基之雷氏普羅威登斯菌SGR588-77株植菌到已投入100mL葡萄糖肉汁 (bouillon broth)培養基(1%葡萄糖、3%肉汁(Nippon Suisan公司製))的500mL容積之三角燒瓶中。將其在溫度37℃且轉速140rpm下一面攪拌一面培養(亦即進行前置培養)。將所得之前置培養液，植菌於已投入3L之L-蘇胺酸發酵培養基(表1)的連續發酵裝置200，進行24小時培養。其後，一面控制供給量，使發酵槽1內之培養液量成為一定，一面連續供給L-蘇胺酸發酵培養基，藉此進行連續培養。如此，進行藉由連續發酵之L-蘇胺酸之製造。
以[A]及[D]所示方法，測定過濾液中所含L-蘇胺酸濃度及殘存葡萄糖濃度。
在比較例1之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)中L-蘇胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表2所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第4圖所示。
在比較例1，在發酵槽1內發酵液顯著發泡之後，自位於發酵槽上部之旋轉式攪拌葉片4之密封部分發生液漏。在一經採樣發酵槽1內培養液，且進行顯微鏡觀察，可確認發生污染。
(比較例2)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為下述條件以外，其他與比較例1相同之條件下進行連續發酵。
‧旋轉式攪拌葉片：無
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：無
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2及/或配管81之氣體線速度：0cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：1000mL/min
在比較例2之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)中L-蘇胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表2所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第4圖所示。
在比較例2，並無自旋轉式攪拌葉片之密封部分發生之污染之風險。因此，進行連續發酵完成時培養液之顯微鏡觀察後，可確認沒有發生污染。但是，生產速度及對糖產率卻大幅降低。
(實施例1)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為下述條件以外，其他與比較例1相同之條件下進行連續發酵。
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：500mL/min
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2之氣體線速度：17.7cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：0mL/min
‧旋轉式攪拌葉片：無
在實施例1之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)中L-蘇胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表2所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第4圖所示。
相較於比較例1，雖然L-蘇胺酸生產速度減少，儘管氣體供給量少，但是對糖產率提高，可獲得發酵效率 之提高效果，同時亦可獲得氣體供給量之削減效果。進一步，膜間差壓之上升速度亦較比較例1更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，而可確認顯現出膜洗淨效果。與其一之比較例2比較時，則生產速度、對糖產率均提高。
藉由如此簡便的裝置構成之變更，而可提高藉由連續發酵之化學品之生產性，且除去以往為必要的旋轉式攪拌葉片，可大幅降低污染之風險。
(實施例2)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為下述條件以外，其他與比較例1相同之條件下進行連續發酵。
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：無
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：500mL/min
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於配管81之氣體線速度：17.7cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：0mL/min
‧旋轉式攪拌葉片：無
實施例2之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)中L-蘇胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表2所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第4圖所示。
相較於比較例1及2，L-蘇胺酸之對糖產率進一步提高，可獲得發酵效率之提高效果，同時亦可獲得氣體供給量之削減效果。進一步，膜間差壓之上升速度較比較例1及2更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，而可確認顯現膜洗淨效果。又，相較於實施例1，對糖產率進一步提高。
(實施例3)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為下述條件以外，其他與比較例1相同之條件下進行連續發酵。
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：無
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：500mL/min
‧供給於配管81之氣體線速度：17.7cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：0mL/min
‧旋轉式攪拌葉片：無
在實施例3之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之L-蘇胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表2所示。又，膜間差壓(kPa)之變遷如第4圖所示。
與比較例1及2相較，則L-蘇胺酸之對糖產率更加提高。可確認膜間差壓之上升速度亦較比較例1及2更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，顯現出膜洗淨效果。又，相較於實施例1，對糖產率更加提高。
(實施例4)
將與實施例3相同條件之試驗，使用具有如第2圖所示形狀之發酵槽1的連續發酵裝置進行連續發酵。在實施例4之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)，L-蘇胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表2所示。又，膜間差壓(kPa)之變遷如第4圖所示。
相較於比較例1及2、實施例1、2及3，生產速度大幅提高。
[I.藉由連續發酵之L-離胺酸之製造]
(比較例3)
使用第3圖所示連續發酵裝置200，實施L-離胺酸之連續發酵。在分離膜係利用以[E]製作的中空纖維膜。作為L-離胺酸連續發酵中之運轉條件，以下之實施例及比較例之共通條件如下。
共通條件
‧微生物：麩胺酸棒狀桿菌delta-HOM株
‧培養基：L-離胺酸發酵培養基(表3)
‧發酵液容量：3.0(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧溫度：30(℃)
‧滅菌：含有中空纖維膜模組之發酵槽、及使用培養基全部以121℃、20min之熱壓釜進行高壓(2氣壓)蒸氣滅菌
‧pH調整：以28%氨水溶液調整至pH7.3
‧循環速度0.3m/s
‧過濾速度：225mL/h(固定)
變更條件
‧旋轉式攪拌葉片：有，攪拌速度350(rpm)
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：無
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2及/或配管81之氣體線速度：0cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：500mL/min
首先，將刮取自瓊脂培養基之delta-HOM株植菌到已投入5mL BY培養基(0.5%酵母萃取物(yeast extract)、0.7%肉萃取物(meat extract)、1%蛋白腖、0.3%氯化鈉)之試管。使其於溫度30℃下振盪培養24小時(前置前培養)。將所得之前置前培養液全量植菌到已投入 50mL表3所示培養基之500mL三角燒瓶，並於30℃下進行前置培養。將所得前置培養液植菌到已投入3L之L-離胺酸發酵培養基的連續發酵裝置200，進行24小時培養。其後，一邊控制供給量，使發酵槽內之培養液量維持一定，一邊連續供給L-離胺酸發酵培養基，藉此進行連續培養。如此藉由連續發酵進行L-離胺酸之製造。
以[B]及[D]所示方法，適宜地測定過濾液中之所生產的L-離胺酸濃度及殘存葡萄糖濃度。
在比較例3之自培養開始至120小時後中(進入不變期之時間點)之L-離胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表4所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第5圖所示。
在比較例3，發酵槽1內之發酵液顯著發泡之後，自位於發酵槽1上部之旋轉攪拌葉片4之密封部分發生液漏。在一經採樣發酵槽1內之培養液，進行顯微鏡觀察，可確認發生污染。
(比較例4)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為下述條件以外，其他與比較例3相同之條件下進行連續發酵。
‧旋轉式攪拌葉片：無
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：無
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2及/或配管81的氣體線速度：0cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：500mL/min
在比較例4之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之L-離胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表4所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第5圖所示。
在比較例4，並無來自旋轉式攪拌葉片污染之風險。因此，進行連續發酵完成時培養液之顯微鏡觀察後，可確認沒有發生污染。但是，生產速度及對糖產率卻大幅降低。
(實施例5)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為下述條件以外，其他與比較例3相同之條件下進行連續發酵。
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：250mL/min
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2之氣體線速度：8.9cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：0mL/min
‧旋轉式攪拌葉片：無
在實施例5之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之L-離胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表4所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第5圖所示。
相較於比較例3，雖然L-離胺酸生產速度減少，儘管氣體供給量少，但是對糖產率提高，可獲得發酵效率之提高效果，同時亦可獲得氣體供給量之削減效果。進一步，膜間差壓之上升速度較比較例3更受到抑制，在 保持低值的情況下變遷，可確認顯現出膜洗淨效果。相較於其一之比較例4，則生產速度、對糖產率均提高。
藉由如此簡便的裝置構成之變更，而可提高藉由連續發酵之化學品之生產性，且除去以往為必要的旋轉式攪拌葉片，可將污染之風險大幅降低。
(實施例6)
將與實施例5相同條件之試驗，使用具有如第2圖所示形狀之發酵槽1之連續發酵裝置進行連續發酵。在實施例6之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之L-離胺酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表4所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第5圖所示。
相較於比較例4及3、實施例5，生產速度大幅提高。
[J.藉由連續發酵之D-乳酸之製造]
(比較例5)
使用第3圖所示連續發酵裝置200，實施D-乳酸之連續發酵。在分離膜係利用以[E]製作的中空纖維膜。D-乳酸連續發酵中運轉條件，共通條件係如下述。
共通條件
‧微生物：啤酒酵母SU042株
‧培養基：發酵培養基(表5)
‧發酵液容量：1.0(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧溫度：32(℃)
‧滅菌：包含中空纖維膜模組之發酵槽及所使用之培養基全部於121℃、20min之熱壓釜進行高壓(2氣壓)蒸氣滅菌
‧pH調整：以5N氫氧化鈣水溶液調整為pH4.5
‧循環速度0.3m/sec
‧過濾速度：225mL/h(固定)
變更條件
‧旋轉式攪拌葉片：有，攪拌速度400(rpm)
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：無
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2及/或配管81之氣體線速度：0cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：125mL/min
首先，將刮取自瓊脂培養基脂之SU042株植菌到已投入5mL SC培養基(100g/L葡萄糖、6.7g/L酵母氮培養基、152mg/L白胺酸除外之標準19種胺基酸、760mg/L白胺酸、152mg/L肌醇、16mg/L對胺基苯甲酸、40mg/L腺嘌呤、152mg/L尿嘧啶)之試管。使其於溫度30℃下振 盪培養24小時(前置前培養)。將所得前置前培養液總量植菌到已投入50mL表5所示培養基之500mL三角燒瓶，並於30℃進行前置培養。將所得前置培養液植菌到已投入1.0L之D-乳酸發酵培養基之連續發酵裝置200，進行24小時培養。其後，藉由一邊控制供給量，使發酵槽1內之培養液量成一定，一邊連續供給D-乳酸發酵培養基，而進行連續培養。如此，進行藉由連續發酵之D-乳酸之製造。
以[C]及[D]所示方法適宜地測定過濾液中所生產之D-乳酸濃度及殘存葡萄糖濃度。
在比較例5之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表6所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第6圖所示。
在比較例5，在發酵槽內之發酵液顯著的發泡之後，位於發酵槽1上部之旋轉攪拌葉片4之密封部分發生液漏。在一經採樣培養液，並進行顯微鏡觀察，可確認發生污染。
(比較例6)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為下述條件以外，其他與比較例5相同之條件下進行連續發酵。
‧旋轉式攪拌葉片：無
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：無
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2及/或配管81之氣體線速度：0cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：125mL/min
在比較例6之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表6所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第6圖所示。
在比較例6，並無來自旋轉式攪拌葉片污染之風險。因此，進行連續發酵完成時之培養液之顯微鏡觀察，可確認沒有發生污染。但是，生產速度及對糖產率卻大幅降低。
(實施例7)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為以下之條件以外，其他與比較例5相同之條件下，進行連續發酵。
‧模組氣體供給裝置(16)之氣體供給量：50mL/min
‧配管氣體供給裝置(18)之氣體供給量：無
‧泵前配管氣體供給裝置(20)之氣體供給量：無
‧供給於分離膜模組2之氣體線速度：1.77cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：0mL/min
‧旋轉式攪拌葉片：無
在實施例7之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表6所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第6圖所示。
相較於比較例5，表示同等之D-乳酸之生產速度，另一方面，對糖產率提高，可獲得發酵效率之提高效果，同時亦可獲得氣體供給量之削減效果。進一步，可確認 膜間差壓之上升速度較比較例5更受到抑制，在照樣低值變遷，可確認亦顯現膜洗淨效果。與其一之比較例6比較，生產速度、對糖產率均提高。
藉由如此簡便的裝置構成之變更，而可提高藉由連續發酵之化學品之生產性，且除去以往為必要的旋轉式攪拌葉片，可大幅降低污染風險。
(實施例8)
將與實施例7相同條件之試驗，使用具有如第2圖所示形狀之發酵槽1之連續發酵裝置，進行連續發酵。
在實施例8之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表6所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第6圖所示。
相較於比較例5及6、實施例7，生產速度大幅提高。
(比較例7)
使用第7圖所示連續發酵裝置300，實施D-乳酸之連續發酵。在分離膜係利用以[E]製作的中空纖維膜。在比較例7、及實施例9至15之D-乳酸連續發酵中作為運轉條件，共通條件係如下述。
共通條件
‧微生物：啤酒酵母SU042株
‧培養基：發酵培養基(表5)
‧溫度：32(℃)
‧pH調整：以5N氫氧化鈣水溶液調整至pH4.5
‧過濾速度：225mL/h(固定)
‧旋轉式攪拌葉片：無
‧模組氣體供給裝置(16)之供給氣體線速度：1.77cm/s
‧發酵槽氣體供給裝置(21)之氣體供給量：0mL/min
變更條件
‧循環泵：無藉由泵所致之循環
‧循環速度：0m/sec
‧發酵液容量：1.0(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧滅菌：含有中空纖維膜模組之發酵槽及所使用之培養基全部於121℃、20min之熱壓釜進行高壓(2氣壓)蒸氣滅菌
‧前置前培養培養基量5mL
‧前置培養培養基量50mL
首先，將刮取自瓊脂培養基之SU042株植菌到已投入SC培養基(100g/L葡萄糖、6.7g/L酵母氮培養基、152mg/L白胺酸除外之標準19種胺基酸、760mg/L白胺酸、152mg/L肌醇、16mg/L對胺基苯甲酸、40mg/L腺嘌呤、152mg/L尿嘧啶)之試管。使其於溫度30℃下振盪培養24小時(前置前培養)。將所得之前置前培養液總量植菌到已投入表5所示培養基的500mL三角燒瓶，進行30℃培養(前置培養)。將所得前置培養液植菌到已投 入D-乳酸發酵培養基的連續發酵裝置200，進行24小時培養。其後，一邊控制供給量，以使發酵槽1內之培養液量成為一定，同時連續供給D-乳酸發酵培養基，藉此進行連續培養。如此，進行藉由連續發酵之D-乳酸之製造。
以[C]及[D]所示方法，適宜地測定過濾液中所生產的D-乳酸濃度及殘存葡萄糖濃度。
在比較例7之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表7及8所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第8圖及9所示。
在比較例7，D-乳酸生產速度及對糖產率顯著降低，又，在分離膜模組2中膜間差壓之上升快速，長時間之連續運轉有困難。
(實施例9)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為以下條件以外，其他與比較例7相同之條件下，進行連續發酵。
‧循環泵：管泵Cole Parmer公司製Master Flex L/S
‧循環速度：0.5m/sec
‧發酵液容量：1.0(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧滅菌：含有中空纖維膜模組之發酵槽及所使用之培養基全部於121℃、20min之熱壓釜進行高壓(2氣壓)蒸氣滅菌
‧前置前培養培養基量5mL
‧前置培養培養基量50mL
在實施例9之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表7及8所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第8圖及9所示。
可確認：相較於比較例7，D-乳酸之生產速度、對糖產率均提高，進一步，膜間差壓之上升速度較比較例7更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，亦顯現出膜洗淨效果。
(實施例10)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100，且為以下之條件以外，其他與比較例7相同之條件下，進行連續發酵。
‧循環泵：管泵Cole Parmer公司製Master FlexL/S
‧循環速度：0.1m/sec
‧發酵液容量：1.0(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧滅菌：含有中空纖維膜模組之發酵槽、及所使用之培養基全部於121℃、20min之熱壓釜進行高壓(2氣壓)蒸氣滅菌
‧前置前培養培養基量5mL
‧前置培養培養基量50mL
在實施例10之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表7所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第8圖所示。
可確認：相較於比較例7，D-乳酸之生產速度、對糖產率均提高，進一步，膜間差壓之上升速度亦較比較例7更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，亦顯現出膜洗淨效果。
(實施例11)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為以下條件以外，其他與比較例7相同之條件下，進行連續發酵。
‧循環泵：Masterflex公司製管泵L/S
‧循環速度：1.0m/s
在實施例11之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表7所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第8圖所示。
可確認：相較於比較例7，D-乳酸之生產速度、對糖產率均提高，進一步，膜間差壓之上升速度亦較比較例7更受到抑制，在保持非常低值的情況下變遷，亦顯現出膜洗淨效果。
如此進行0.1m/s至1.0m/s之強制循環，在無閉塞分離膜下，可進行長期間穩定的生產性高的化學品之連續生產，且除去以往為必要的旋轉式攪拌葉片，可大幅降低污染風險。
(實施例12)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為以下條件以外，其他與比較例7相同之條件下，進行連續發酵。
‧循環泵：漩渦泵AlfaLaval公司製LKH
‧循環速度：0.5m/sec
‧發酵液容量：1(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧滅菌：含有中空纖維膜模組之發酵槽、及所使用之培養基全部於121℃、0.2MPa、20min之加壓蒸氣滅菌
‧前置前培養培養基量5mL
‧前置培養培養基量50mL
在實施例12之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表8所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第9圖所示。
可確認：相較於比較例7自不待言，相較於實施例9，D-乳酸之生產速度、對糖產率均顯著提高；進一步，膜間差壓之上升速度亦較比較例7更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，亦顯現出膜洗淨效果。
(實施例13)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為以下條件以外，其他與比較例7相同之條件下，進行連續發酵。
‧循環泵：隔膜泵Tcamina公司製APLS-20
‧循環速度：0.5m/sec
‧發酵液容量：20(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.38(L)
‧滅菌：含有中空纖維膜模組之發酵槽，及所使用之培養基全部於121℃、0.2MPa、20min之加壓蒸氣滅菌
‧前置前培養培養基量50mL
‧前置培養培養基量1000mL
在實施例13之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表8所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第9圖所示。
可確認：相較於比較例7，D-乳酸之生產速度、對糖產率顯著提高；且在膜間差壓之上升速度方面，相較於比較例7自不待言，相較於實施例9也更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，亦顯現出膜洗淨效果。
(實施例14)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為以下條件以外，其他與比較例7相同之條件下，進行連續發酵。
‧循環泵：Vane pump伏虎金屬工業公司製小型Radial vane pumpVBB
‧循環速度：0.5m/sec
‧發酵液容量：1(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧滅菌：包含中空纖維膜模組之發酵槽，及所使用之培養基全部於121℃、20min之熱壓釜進行高壓(2氣壓)蒸氣滅菌
‧前置前培養培養基量5mL
‧前置培養培養基量50mL
在實施例14之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表8所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第9圖所示。
可確認：相較於比較例7自不待言，相較於實施例9，D-乳酸之生產速度、對糖產率稍有提高；進一步，膜間差壓之上升速度亦較比較例7更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，亦顯現出膜洗淨效果。
(實施例15)
除了使用第1圖所示連續發酵裝置100並為以下條件以外，其他與比較例7相同之條件下，進行連續發酵。
‧循環泵：齒輪泵ISMATEC公司製Magnet couplings式齒輪泵MCP-Z
‧循環速度：0.5m/sec
‧發酵液容量：1(L)
‧中空纖維膜MD容量：0.016(L)
‧滅菌：含有中空纖維膜模組之發酵槽及所使用之培養基全部於121℃、20min之熱壓釜進行高壓(2氣壓)蒸氣滅菌
‧前置前培養培養基量5mL
‧前置培養培養基量50mL
在實施例15之自培養開始至120小時後(進入不變期之時間點)之D-乳酸生產速度(g/L/h)及對糖產率(%)如表8所示。又膜間差壓(kPa)之變遷如第9圖所示。
可確認：與比較例7比較，D-乳酸之生產速度、對糖產率提高；進一步，膜間差壓之上升速度亦較比較例 7更受到抑制，在保持低值的情況下變遷，亦顯現出膜洗淨效果。
如此，藉由進行各式各樣泵之強制循環，在不致閉塞分離膜，而可長期間穩定的進行生產性高的化學品之連續生產，且可除去以往為必要的旋轉式攪拌葉片，可大幅降低污染之風險。
產業上可利用性
本發明使用製造裝置，其具備循環機構，該循環機構具有發酵槽與連接於發酵槽的分離膜模組，並可由不具攪拌功能，或攪拌可藉由在循環機構中泵所致培養液之強制循環與氣體之供給來實現，以連續發酵進行化學品製造的簡便方法，藉此，可提高分離膜模組運轉及連續發酵之長期穩定性、與發酵成績，故被廣泛利用於發酵工業而可以低成本生產屬於發酵生產物的化學品。
1‧‧‧發酵槽
2‧‧‧分離膜模組
3‧‧‧溫度控制部
5‧‧‧pH控制部
6‧‧‧等級控制部
7‧‧‧差壓控制部
8‧‧‧循環泵
9‧‧‧培養基供給泵
10‧‧‧中和劑供給泵
11‧‧‧過濾泵
12‧‧‧過濾閥
13‧‧‧洗淨泵
14‧‧‧洗淨閥
15‧‧‧模組氣體供給控制閥
16‧‧‧模組氣體供給裝置
17‧‧‧配管氣體供給控制閥
18‧‧‧配管氣體供給裝置
19‧‧‧泵前配管氣體供給控制閥
20‧‧‧泵前配管氣體供給裝置
21‧‧‧發酵槽氣體供給裝置
22‧‧‧發酵槽壓力調整閥
23‧‧‧發酵槽壓力計
28‧‧‧控制裝置
51‧‧‧pH偵測器
61‧‧‧等級偵測器
81‧‧‧配管
82‧‧‧配管
83‧‧‧配管
84‧‧‧配管
86‧‧‧配管
87‧‧‧配管
88‧‧‧配管
91‧‧‧流量計
92‧‧‧流量計
93‧‧‧流量計
100‧‧‧連續發酵裝置

Claims (18)

  1. 一種藉由連續發酵之化學品之製造方法，其特徵為：包含下列步驟：化學品產生步驟，其係藉由在不具備攪拌機構之發酵槽內培養細胞，使原料發酵而產生化學品；培養液供給步驟，其係將包含在該化學品產生步驟所產生的化學品之培養液供給至分離膜模組；過濾步驟，其係過濾在該培養液供給步驟所供給的培養液，並分離含該化學品之透過液；回流步驟，其係將該過濾步驟中未被過濾之濃縮液回流至該發酵槽內；及氣體供給步驟，其係將氣體供給至該分離膜模組或配管；並且，該培養液之攪拌係藉由如下進行：在該培養液供給步驟、該過濾步驟及該回流步驟中利用泵來進行該培養液之強制循環，以及在該氣體供給步驟中之氣體供給。
  2. 如申請專利範圍第1項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該泵所致培養液之循環速度為0.1m/s以上1.0m/s以下。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該氣體含有氧。
  4. 如申請專利範圍第3項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該氣體供給步驟係間歇地進行該氣體之供給；在該氣體供給步驟中停止該氣體供給之期間，係增加對該發酵槽之氣體供給量。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該過濾步驟係間歇地進行該過濾操作。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該細胞為細菌。
  7. 如申請專利範圍第6項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該細菌係屬於大腸桿菌屬(Genus Escherichia)、普羅威登斯菌屬(Genus Providencia)、棒狀桿菌屬(Genus Corynebacterium)、短桿菌屬(Genus Brevibacterium)或鋸桿菌屬(Genus Serratia)之任一種細菌。
  8. 如申請專利範圍第7項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該細菌係大腸桿菌(Escherichia coli)、雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳酸發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)或黏質沙雷氏桿菌(Serratia marcescens)之任一種。
  9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該細胞為酵母。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該化學品為胺基酸。
  11. 如申請專利範圍第10項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該胺基酸為L-蘇胺酸、L-離胺酸、L-麩胺酸、L-色胺酸、L-異白胺酸、L-麩醯胺、L-精胺酸、 L-丙胺酸、L-組胺酸、L-脯胺酸、L-苯丙胺酸、L-天門冬胺酸、L-酪胺酸、L-甲硫胺酸、L-絲胺酸、L-纈胺酸或L-白胺酸。
  12. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該化學品為有機酸。
  13. 如申請專利範圍第12項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該化學品為乳酸。
  14. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之藉由連續發酵之化學品之製造方法，其中該化學品為屍鹼(cadaverine)。
  15. 一種連續發酵裝置，其特徵為具備：不具有攪拌機構之發酵槽，其係藉由將發酵原料以細胞進行發酵培養，而將該發酵原料轉換成含有化學品之培養液；分離膜模組，其具有自該培養液分離化學品之分離膜；培養液循環機構，其自該發酵槽以泵將培養液送液至該分離膜模組；及氣體供給機構，其係將氣體供給至該分離膜模組之下部、或連通該發酵槽與該分離膜模組之配管；藉由以該培養液循環機構所致該培養液之循環，與以該氣體供給機構所致氣體供給，來攪拌培養液。
  16. 如申請專利範圍第15項之連續發酵裝置，其具備發酵槽氣體供給機構，其供給氣體至該發酵槽；其中該氣體供給機構，間歇地進行該氣體之供給至該分離膜 模組；在使該氣體供給機構停止該氣體供給至該分離膜模組之期間，藉由該發酵槽氣體供給機構，增加氣體供給量至該發酵槽。
  17. 如申請專利範圍第15或16項之連續發酵裝置，其中該發酵槽之底壁係朝下凸型之錐面狀或球面狀底壁；在該凸型底壁之凸部前端，具有將培養液送液至分離膜模組之配管的連接部。
  18. 如申請專利範圍第17項之連續發酵裝置，其中將該發酵槽之底壁作成頂角120度以下之錐面狀底壁而成。
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