TW201313288A - 檢體中生物標記之精確定量 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於用於精確定量乾燥血液漬斑(dried blood spots;DBS)中生物標記之方法及裝置,其包括提供包含至少一個DBS之基板,其中該DBS包含以梯度模式分佈於該基板上之至少一種生物分子;自該DBS切除至少一個扇形狀檢體;及分析該扇形狀檢體中之該生物分子。
Description
乾燥血液漬斑法(DBS)係作為收集人類血液以用於臨床分析之方法。易於收集及儲存之DBS基板卡上的血液檢體係相對穩定且成本有效之檢體收集方法。然而,分析物在乾燥血液漬斑上的擴散並不均勻。分析物分佈會受乾燥及基質濃度與組份影響,因此從檢體中心至邊緣產生了分析物濃度梯度。測試來自DBS基板卡之檢體的標準方法係與從DBS檢體上所切除的不同直徑圓形打孔片有關。由於分析物在基板卡上並非均勻分佈,因此此檢體採集方法會引入顯著的差異性及偏差。
檢體採集DBS之先前技術方法闡述於以下文獻中:US 7,819,161;US 7,498,133;US 6,379,318;US 6,171,868;US 5,427,953;US 5,641,682;US 5,211,252;US 5,156,948;US 2011/0158500;US 2011/0133077;US 2011/0132111;US 2011/0129940;US 2010/0286560;US 2010/0010373;US 2008/0268495;US 2004/0101966;US 2003/0039788;WO 2010/043668;WO 2007/098184;WO 2012/027048;El-Hajjar等人,Clinica Chimica Acta,377(1-2,2):179-184(2007);及Tack等人,Journal of the Association for Laboratory Automation,10(4):231-236(2005);該等文獻皆係全文以引用方式併入本文中。
本文所述實施例包括製備方法、使用方法及器件與裝
置。
為改良與先前技術DBS檢體採集方法相關之差異性及偏差,例如,本文所述實施例可從DBS中心以輻射方式朝向邊緣獲得均勻的檢體,由此產生更佳地代表真實分析物濃度及彼此更趨於一致之檢體。
舉例而言,一實施例提供包含以下之方法:提供包含至少一個DBS之基板,其中該DBS包含以梯度模式分佈於該基板上之至少一種生物分子;自DBS切除至少一個扇形狀檢體;及視情況分析扇形狀檢體中之生物分子。
在一實施例中,基板包含用於沈積DBS之至少一處檢體沈積區域。在另一實施例中,基板係濾紙。在又一實施例中,基板係Whatman 903檢血片。
在一實施例中,DBS係由全血製備。在另一實施例中,DBS係由合成性血液基質製備。在又一實施例中,DBS係由包含至少一種蛋白質載體之合成性血液基質製備。
在一實施例中,生物分子係蛋白質。在另一實施例中,生物分子係細胞介素。在又一實施例中,生物分子係細胞介素,其係IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10或TNF-α。
在一實施例中,生物分子在DBS中心比在周邊濃度高。在另一實施例中,生物分子在DBS周邊比在中心濃度高。
在一實施例中,扇形狀檢體係以鋒利切割工具切除。在另一實施例中,扇形狀檢體係以可調整的切割工具切除。
在一實施例中,扇形狀檢體係從DBS中心以輻射方式朝向周圍切除。在另一實施例中,扇形狀檢體係由以兩條半
徑及位於該兩條半徑間之圓弧為邊界之扇形區域組成。在又一實施例中,自DBS切除2個或更多個大小及形狀相同之扇形狀檢體。在再一實施例中,自DBS切除8個或更多個大小及形狀相同之扇形狀檢體。
在一實施例中,分析生物分子之步驟包含量測生物分子之含量。在另一實施例中,分析生物分子之步驟包含量測生物分子之含量,且其中生物分子之量係在2個或更多個扇形狀檢體中量測。
本文所述另一實施例提供包含以下之方法:提供包含至少一個生物流體乾燥漬斑之基板,其中該乾燥漬斑包含以梯度模式分佈於基板上之至少一種生物分子;自乾燥漬斑切除至少一個扇形狀檢體;及量測生物分子在扇形狀檢體中之含量。
在一實施例中,基板係濾紙。
在一實施例中,生物分子係蛋白質。在另一實施例中,生物分子選自由以下組成之群:核酸、多糖、脂質、維生素、激素及神經傳遞物。
在一實施例中,生物流體係選自由以下組成之群之動物體液:血液、淚液、唾液、淋巴液、胃腸液及尿液。在另一實施例中,生物流體選自由以下組成之群:植物木質部流體、植物韌皮部流體及細菌之液體培養物。
在一實施例中,生物分子在乾燥漬斑中心比在周邊濃度高。在另一實施例中,生物分子在乾燥漬斑周邊比在中心濃度高。
在一實施例中,扇形狀檢體係以鋒利切割工具切除。
在一實施例中,扇形狀檢體係由以兩條半徑及位於該兩條半徑間之圓弧為邊界之扇形區域組成。
在一實施例中,自乾燥漬斑切除2個或更多個大小及形狀相同之扇形狀檢體。
本文所述又一實施例提供用於自DBS切除至少一個檢體之裝置,其包含:打孔板,其包含至少兩個會在定錨點彼此會合之切割臂;位於該打孔板上方之印模板,其包含孔隙可供該等切割臂穿過;位於該印模板上方之校準片,其包含位於該等切割臂及該孔隙正上方之檢體校準器;且其中將該DBS牢固地置於印模板與校準片之間及用該檢體校準器校準,且其中可將印模板壓向打孔板,從而使該等切割臂可穿過該孔隙並切除該DBS。
在一實施例中,打孔板包含會在定錨點彼此會合之足夠數目的切割臂,以將DBS切割成3個、4個、5個、6個、8個、10個或12個大小相同之扇形區域。
在一實施例中,切割臂係由金屬、聚合物或矽基材料製成。在另一實施例中,切割臂係由鋼製成。在又一實施例中,校準片係由聚碳酸酯製成。
在一實施例中,校準器包含至少一個以定錨點為中心之外環。在另一實施例中,校準器包含至少一個外環及至少一個內環,二者皆以定錨點為中心,其中外環與內環同心。
在一實施例中,打孔板另外包含至少一個連接至少兩個
切割臂之切割裙(cutting skirt)。在另一實施例中,打孔板另外包含至少一個連接至少兩個切割臂之弧形切割裙。
另一實施例提供包含以下之方法:提供包含至少一個乾燥血液漬斑(DBS)之基板,其中該DBS包含至少一種以不均勻模式分佈於基板上之生物分子;自DBS切除至少一個扇形狀檢體;及視情況分析扇形狀檢體中之生物分子。
另一實施例提供包含以下之方法:提供包含至少一個生物流體乾燥漬斑之基板,其中該乾燥漬斑包含至少一種以不均勻模式分佈於基板上之生物分子;自乾燥漬斑切除至少一個扇形狀檢體;及量測生物分子在扇形狀檢體中之量。
另一實施例提供包含以下之方法:評估至少一種佈置於基板上之生物分子,其中該評估係對基板上至少兩個大小近乎相同的扇形部分實施。
至少一個實施例之至少一種優點包括例如分析乾燥血液漬斑評估中具有更精確及/或可重複性的量測。
多種重要臨床分析以及調查相關研究係使用乾燥血液漬斑(DBS)作為檢體收集方法。在檢體收集期間,通常係以扎手指或足跟收集數滴全血,且將其與特製濾紙片(例如,Whatman-903「Proteinsaver」檢血片)接觸,而血液組份隨後會經由濾紙擴散開來。在正確操作時,將血液檢體施加至Whatman 903檢血片上預先標記之圓形收集區
域之中心。在收集檢體時,其會經由濾紙從DBS中心擴散至邊緣。在將檢體收集於基板卡上後,使血液在室溫下乾燥,且將收集基板卡與乾燥劑一起儲存於-20℃或更低溫度下,以保存檢體之完整性。在剛開始擴散及後續乾燥過程中,血清中的組份會隨著血液乾燥而在基板卡上遷移。另外,血液中一些組份可能會與檢體中蛋白質特異性結合,從而使該等蛋白質與彼等組份可經由濾紙協力性地遷移。因此,血清或血漿中許多分析物會以梯度模式乾燥,在中心處濃度較低,而在到達乾燥血液漬斑周邊時濃度較高,或在某些情形中反之亦然,端視所用基質而定。分子在表面上之佈局不均勻係一問題。
亦已知「合成性血液」基質常設計作為DBS之用。通常,將經洗滌紅血球再懸浮於水性懸浮液(PBS或類似物)中且添加蛋白質載體(如牛血清白蛋白)來代替血清組份。含緩衝液基質之總蛋白質濃度及組成與全血相當的不同。
令人驚訝地,不同DBS基質組分可顯著改變蛋白質生物標記(例如細胞介素)在DBS濾紙片上之分佈模式,且生物標記在含有緩衝液基質中之遷移與在含有血清之基質或全血中之遷移顯著不同。
對於一些使用DBS檢體之分析方法(例如,藉由PCR進行之HIV測試),簡單的「陽性或陰性」結果即已足夠,且精確分析物濃度並不重要。然而,對於多種其他分析方法而言,則要求更能以含量表示之結果。在不依賴所採用測試方法的情況下,從DBS紙片採集檢體之「技術現況」係涉
及從DBS紙片取得固定直徑之圓形打孔片及使用水性緩衝液或有機溶劑從紙片打孔片溶析出分析物。通常自DBS檢體取得一個以上打孔片;通常如此做是為了重複測試或為了以一次以上檢驗測試相同檢體。在重複測試需要多個打孔片及/或要求定量結果之條件下,DBS檢體內分析物之分佈及打孔片之佈局變成是一個重要的變因。例如,因為分析物會有類似梯度的分佈,取自DBS檢體之中心及周邊之重複打孔片當以臨床分析測試時會呈現出相當不同之分析物濃度。類似地,自DBS檢體之單一打孔片所測得之結果可能不能代表檢體實際分析物的濃度。在每一情形下,以此方式取得測試檢體會造成顯著差異性及錯誤分析結果。
為校正分析物在整個DBS檢體中之分佈差異性及更一致性地達成更佳地代表平均分析物濃度之可複現檢體,最簡單的解決方案係分析整個DBS檢體。然而,此解決方案在大多數情形下不具有實務性。因此,從單一DBS檢體取得多個檢體之方法係最佳的,其中每一檢體具有相等分析物濃度同時亦儘可能地代表平均分析物濃度。根據本申請案之較佳實施例,對於標準圓形DBS,藉由自DBS檢體切割相等扇形區域或「餅形」楔(起點在圓形中心,在圓形邊緣結束)以取得多個檢體。扇形區域或楔形的數目可取決於所需要的重複數目、所用的溶析方法及分析物在檢體中之濃度。低豐度之分析物可能需要較大檢體區域。以此方式所取檢體,一旦經過溶析後可提供分析物在整個濃度梯度上之濃度之量度,且亦將提供所需要的精確重複性檢
體。
生物流體乾燥漬斑可根據本文所述方法進行檢體採集及分析。在一實施例中,例如,生物流體係人類或動物體液,包括血液、淚液、唾液、淋巴液、胃腸液、尿液等。在另一實施例中,生物流體係植物流體,包括木質部流體、韌皮部流體等。在又一實施例中,生物流體係細菌之液體培養物。
在較佳實施例中,本申請案之生物流體係人類全血,包括來自新生兒之血液。在另一較佳實施例中,生物流體係合成性血液基質。合成性血液基質係使經洗滌紅血球再懸浮於水性緩衝液(例如,PBS等)中,並添加至少一種蛋白質載體(例如,BSA等)來製備。合成性血液基質可具有與全血不同之總蛋白質譜。
製備合成性血液基質之方法為技藝所熟知的且闡述於(例如)McDade等人,Clin.Chem.,50:652-654(2004)中,其係全文以引用方式併入本文中。
可根據本文所述方法來分析或量測生物流體中之任何生物分子。在一實施例中,生物分子係蛋白質。在另一實施例中,生物分子係核酸,例如DNA或RNA。在又一實施例中,生物分子係多糖。在再一實施例中,生物分子係脂質。生物分子之其他實施例包括維生素、激素及神經傳遞物。
本文所述方法可尤其有效且精確地量測以梯度模式分佈於基板上之生物分子之真實濃度。已知多種生物分子在吸收性濾紙(例如Whatman 903檢血片)上的乾燥漬斑會呈現出此特徵,包括各種細胞介素(例如,IL-1b、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a等)。該等生物分子中有些可能在DBS的中心濃度較高,而其他生物分子可能在周邊濃度較高。對於在乾燥漬斑中具有未知分佈模式之生物分子,熟習此項技術者可遵循實例1中之方法容易地測定其分佈模式。
本文所述方法可使用任何適於接收諸如血液等生物流體之基板。在一實施例中,基板係濾紙。可使用標準市售基板。管製意見可鼓勵相關工業使用標準基板。在較佳實施例中,基板係Whatman 903檢血片。在另一實施例中,基板係Guthrie卡。在又一實施例中,基板係Ahlstrom 226濾紙。在再一實施例中,基板係CoreMedica生物碟片。
在一實施例中,基板包含一或多個可接收諸如血液等生物流體之檢體沈積區域。基板可另外包含用以在檢體收集前及後保護檢體沈積區域之蓋子。在另一實施例中,基板包含獨一無二的序號或條碼。在又一實施例中,基板包含人口統計部分以供輸入關於收集諸如血液等生物流體之資訊。在再一實施例中,基板包含一或多個用於檢體沈積之圓形區域,該等圓形區域的直徑可為(例如)0.1-1英吋,或0.25-0.75英吋,或約0.5英吋。
DBS之製備為技藝所熟知的且詳細闡述於(例如)ACTN Laboratory Technologist Committee,ACTN Dried Blood Spots Procedure,1.1版(2009年3月11日)中,其係全文以引用方式併入本文中。
在一實施例中,DBS可藉由將數滴手指、足跟或腳趾之血液施加至濾紙加以製備。所施加血液之量可為50-100 μl,或60-90 μl,或75-80 μl。然後使血液滲透濾紙並在空氣中乾燥(例如)數小時(例如約2小時或3小時)。在切割檢體之前,可將DBS在(例如)-20℃下儲存於(例如)低透氣性塑膠袋中。可添加乾燥劑以降低濕度。
本文所述扇形狀檢體可定義為以兩條從相同定錨點以輻射方式延伸之半徑及連接該兩條半徑之外部界線為邊界之區域,其中扇形狀檢體之定錨點定義為兩條半徑會合之點,其中當該定錨點位於DBS中心時,該區域足夠大到該區域涵蓋介於兩條半徑間之整個DBS部分。外部界線可為(例如)圓弧、直線、複數條內連直線、波浪線或任何其他能連接兩條半徑以形成涵蓋位於該兩條半徑之間之整個DBS部分之線條。在一實施例中,扇形狀檢體係由以兩條半徑及位於該兩條半徑之間之圓弧為邊界之區域組成之幾何扇形區域。在另一實施例中,扇形狀檢體並非幾何扇形區域,而係多邊形,例如三角形或四邊形。扇形狀檢體之非限制性實例展示於(例如)圖6中。
用於自DBS基板卡採集檢體之已知方法涉及自DBS卡取得一或多個固定直徑之圓形打孔片。例如,參見美國專利第6,171,868號、美國專利第5,862,729號、美國專利第5,641,682號及美國專利第5,638,170號,該等文獻皆係全文以引用方式併入本文中。
為獲得多個在溶析及分析時能提供可重複出現結果之檢體,可自血液漬斑周邊取得與檢體邊緣等距之檢體(圖2)。假定血滴從圓心擴散至邊緣,則在中心附近之同心環中所取得打孔片中的分析物濃度應相等。在乾燥血液漬斑邊緣附近取得與血液漬斑邊緣等距之檢體將可以獲得最多數目之相同檢體。然而,由於分析物在整個血液漬斑中係以梯度模式分佈,因此在邊緣附近所取得的檢體可能無法精確地量測到血液本身中實際的分析物濃度。
為從圓形DBS最精密地獲得可重複性出現分析檢體(其分析結果可提供最精確地代表原始血液濃度之分析物濃度值),應取扇形狀檢體(例如,圖1中所示之實例性「餅形」楔)而非圓形打孔片。由於在檢體擴散及乾燥期間會產生中心至周邊梯度模式,因此採用此方法所取得之檢體將可提供代表整個濃度梯度之最精確檢體截面。另外,在需要重複檢體時,兩個或更多個取自相同檢體且具有相同大小及形狀之此類檢體亦應可提供最能重複出現之結果。
為獲得此類檢體,一種方法係量測並使用鋒利切割儀器(例如x-acto刀或類似器件)切除相同扇形切片,且切片之數目取決於量測任一給定分析物(基於其相對濃度)所需之
檢體大小。另一種方法係使用(特製)可調整切割器,可將其校準血液漬斑周圍附近或與血液漬斑中心校準,然後其將檢體切割為多個相同大小之扇形切片。相同扇形切片之數目應可變化,以針對檢體採集之需要及檢體大小來調節。
扇形狀檢體可係由以兩條半徑及位於該兩條半徑間之圓弧為邊界之區域組成之幾何扇形區域。在根據圖4之一實施例中,將基板上之圓形DBS完美地分為多個大小相同之扇形區域,其中切除並分析該等扇形區域中之一或多者。在根據圖5之一實施例中,將基板上之圓形DBS分為多個大小相同之扇形區域加不同大小之剩餘部分,其中切除並分析該等相同大小之扇形區域中之一或多者。
可根據本文所述方法使用鋒利切割工具來切除扇形狀檢體。鋒利切割工具可為(特製)可調整之切割工具,係將其校準血液漬斑周圍附近或與血液漬斑中心校準,然後其將檢體切割成多個相同大小的扇形切片。
圖8-11係顯示用於從DBS切除扇形狀檢體之裝置的實施例之主要組合零件、基本裝配成及基本操作。可使用其他實施例。該裝置之主要組合零件包括(例如)打孔板、印模板及校準片。在特定實施例中,裝置之主要組合零件包括鋼打孔板、鋼印模板及Lexan聚碳酸酯校準片。使用聚碳酸酯校準片上之環將DBS基板卡定位於聚碳酸酯校準片與鋼印模板之間,以便將DBS平坦地定位於打孔板上,以從
DBS切割相同大小的檢體。在校準後,將聚碳酸酯校準片壓低以將DBS基板卡固定就位,且將聚碳酸酯校準片/鋼印模板組合在鋼打孔板上向下壓以切割DBS基板卡切片。由於DBS直徑之可能差異性,視情況進行第二步驟,以便將切割切片與DBS基板卡完全分離。該第二步驟係涉及使用直徑經選擇的圓形打孔板,以對應於特定DBS之直徑。此係一實施例;其他實施例係可能的。
裝置可包含足夠數目之切割臂,以將目標區域完美地分成任何數目之大小相同之扇形區域。舉例而言,切割臂可將目標區域分為3個、4個、5個、6個、8個、10個或12個大小相同之扇形區域。切割臂可由任何適於製備鋒利切割工具之材料製成。舉例而言,切割臂可由金屬、聚合物或矽基材料製成。在一實施例中,切割臂係由鋼製成。每一切割臂經調整以沿DBS上始於DBS中心且在其周圍向外延伸之直線切割。切割臂之長度(例如)約0.1-0.5英吋、約0.2-0.4英吋或約0.3英吋。
或者,除切割臂外,打孔板亦可包含至少一個連接至少兩個切割臂之切割裙。切割裙可為任何形狀,只要切割臂及切割裙能一起操作,以便從DBS切除扇形狀檢體即可。在一實例中,切割裙係直徑經選擇之圓形打孔板,以對應於特定DBS之直徑。倘若裝置之打孔板包含切割臂及切割裙二者,則可能不需要將切割切片與DBS基板卡分離之額外步驟。
如圖8中所示,校準片可係Lexan聚碳酸酯校準片。校準
片包含校準器,該校準器包含複數個對應於打孔板上之切割臂之臂及至少一個用於標記供切除之DBS檢體之外環。外環之直徑可係(例如)0.1-1英吋,或0.25-0.75英吋,或0.4-0.6英吋,或約0.5英吋。校準片可另外包含至少一個內環,其中外環與內環同心。
對檢體中之生物分子之分析/量測為業內已知且詳細闡述於以下文獻中:Parker及Cubitt,J.Clin.Pathol.52(9):633-9,1999;Alberts等人,Molecular Biology of the Cell,第5版,2007;及Lodis等人,Molecular Cell Biology,第5版,2007,該等文獻皆係全文以引用方式併入本文中。本文所述對生物分子之分析/量測包含業內已知之任何生物化學或生物物理學測試。
在一實施例中,將自DBS切除之扇形狀檢體佈置至微量離心機旋轉過濾器單元之過濾器部分中。將溶析緩衝液(NanoInk封阻緩衝液)添加至過濾器單元中。在振盪及培育後,將過濾器部分轉移至潔淨微量離心管中。在旋轉後,棄去過濾器單元及扇形基板卡,且將溶析物儲存於-20℃或更低溫度下以供後續測試。
在另一實施例中,將自DBS切除之扇形狀檢體佈置至平底微量滴定板中。然後可使用含有0.05% Tween 80及0.005%疊氮化鈉之磷酸鹽緩衝鹽水溶析出血液,在4℃下過夜。可使用含有溶析物之所得板作為「母體(master)」,且可自「母體」製備稀釋液以供後續測試。
另外,可在分析/量測生物分子之過程中使用浸筆奈米微影術(DPN)。DPN方法闡述於(例如)美國專利第6,635,311號、美國專利第6,827,979號及美國專利第7,744,963號中,其皆係全文以引用方式闡述於本文中。
以下實例及工作實例中提供其他實施例。
此實驗比較自Whatman 903檢血片溶析之DBS標準檢體中之中心及周邊打孔片之細胞介素濃度(例如,參見圖3及12)。檢體係根據以下程序來製備及溶析:
試劑:
1. 40 ml存於Alsever's溶液中之經洗滌人類紅血球(RBC's)。(Valley Biomedical公司,Winchester,VA.,目錄號RC1026)
2.彙集人類血清(Bioreclamation,LLC.,目錄號HRSRM)
3.磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)+0.5%牛血清白蛋白
4.生理鹽水(0.9% NaCl)
5.重組細胞介素原液
6. Whatman 903 Protein Saver DBS檢血片。
程序:
1.將紅血球均勻分佈於2個50 ml圓錐管中。用生理鹽水將體積補足至50 ml,並將圓錐管上下倒置溫和地混合。將圓錐管蓋子蓋緊。
2.將圓錐管置於4℃下之旋翼式轉子離心機中,以2,750 rpm旋轉5分鐘。
3.以真空抽取方式,從非緊密性擠塞之RBC「沈澱物」溫和地移除上清液。
4.將細胞再懸浮於至50 ml生理鹽水中,溫和地將圓錐管上下倒置。
5.重複旋轉(步驟2)
6.旋轉完成時,以真空抽取方式溫和地移除上清液。
7.將圓錐管上下倒置,將每一沈澱物再懸浮於約10 ml生理鹽水中,並將再懸浮紅血球轉移至2個15 ml圓錐管中。
8.用生理鹽水將體積補足至15 ml,且將圓錐管上下倒置加以混合。
9.重複旋轉(步驟2)
10.以真空抽取方式溫和地移除上清液。(最終上清液應澄清狀,且不含可見血紅素)。
11.使用圓錐管側面上的標記量測沈澱物體積。向沈澱物添加等體積之彙集人類血清或PBS+0.5% BSA,並將圓錐管上下倒置溫和地使細胞再懸浮。充分混合。(此產生近似血球比容為50%之「合成性血液」混合物)
12.根據預定稀釋方案將再懸浮RBC's等分。將濃縮細胞介素混合物摻入濃度最高之標準品中,且藉由上下倒置溫和地混合。
13.藉由連續稀釋製備標準品及QC檢體。所有檢體皆應在每一步驟中以溫和上下倒置加以充分混合。
14.所有標準品及QC檢體已製備後,將50 μl RBC細胞介素混合物謹慎地移液至DBS基板卡上的每一漬斑位置處。移液至漬斑位置處的中心,從而使混合物擴散至周邊。每一基板卡上儘可能多填充漬斑位置處。
15.所有基板卡經製備後,將基板卡在受控濕度環境中風乾至少4小時。
16. DBS基板卡經乾燥後,將其與乾燥劑一起置於密封夾鏈袋中,且在使用前儲存於-20℃下。
注意:可將含有血液檢體之Whatman 903 DBS檢血片儲存於-20℃下之含有乾燥劑之密封袋或容器中。
1.在溶析前,自儲存庫取出DBS基板卡,並在含有乾燥劑之密封袋中經30-60分鐘使其達到室溫,以避免形成冷凝物。
2.使用3 mm打孔裝置,從DBS檢體取打孔片,且確定係從濾紙完全滲透區域取得完整之打孔片。另外,若欲比較檢體(即用於標準品或重複品),則應確定所有打孔片皆取自與實際血液漬斑之邊緣等距之DBS漬斑區域。
3.移除過濾器單元,且將50 μl緩衝液或水置於微量離心管底部以減少蒸發。更換過濾器單元且將DBS基板卡打孔片置於微量離心機旋轉過濾器單元(Millipore 1.5 ml UFC3-0DV-00或類似物)之過濾器部分中。謹慎且精確地將溶析緩衝液(NanoInk封阻緩衝液)移液至過濾器單元中之打孔片上。標準溶析體積為25 ul/3 mm打孔片。
4.封閉微量離心管頂部且用石蠟膜密封。
5.將微量離心管在4℃下置於振盪器中6小時(振盪器設定:1400 rpm)
6.在培養後,打開微量離心管並將過濾器部分轉移至潔淨經標記微量離心管中。
7.將微量離心管在4℃下以12,000 rpm旋轉5分鐘
8.棄去過濾器單元且溶析打孔片。封閉微量離心管且在使用前儲存於-20℃下。
1.將檢體載玻片面朝上定位至48孔裝置中。
2.將4 μl/孔*封阻緩衝液置於檢體載玻片上之孔中。
3.將奈米陣列載玻片以印刷側朝下謹慎地置於頂部且在RT下培育1小時。
4.使用真空器件藉由真空自奈米陣列及檢體載玻片二者移除封阻液。
5.將4 μl細胞介素標準曲線混合物或檢體施加至經封阻檢體載玻片。
6.將奈米陣列載玻片謹慎地置於檢體上且在RT下培育3小時。
7.謹慎地移除奈米陣列載玻片且使用移液管在槽或容器上方用*洗滌緩衝液洗滌5次(3 ml/洗滌),然後將其置於培育裝置中,並用洗滌緩衝液再洗滌5次且藉由真空移除。
8.在封阻液(2 ml)中稀釋檢測抗體混合物,且將其移液至整體式裝置中並在RT及溫和振盪下培育1小時。
9.藉由真空自培育裝置移除檢測抗體混合物且用洗滌緩衝液將載玻片洗滌5次,再次藉由真空移除洗滌緩衝液。
10.將Alexa-Fluor 647-抗生蛋白鏈菌素偶聯物(Invitrogen目錄號S21374)稀釋於封阻液(1 μg/ml)中且移液至培育裝置中並在RT及溫和振盪下培育30'。
11.藉由真空移除抗生蛋白鏈菌素偶聯物且用洗滌緩衝液將載玻片洗滌5次,之後依次在洗滌緩衝液及ddH2O中(在50 ml圓錐管中)整體洗滌。
12.將載玻片旋轉乾燥並進行掃描。
*封阻液=Bio-Rad PBS/酪蛋白封阻劑目錄號161-0783
*洗滌緩衝液=含有0.1% Tween-20之PBS
對於該等實驗,如所述製備摻入細胞介素之血液檢體。自血液漬斑中心或血液漬斑周邊自DBS基板卡取3 mm打孔片(參見圖3右側之4個血液漬斑)。然後根據上文之檢體溶析方案溶析該等檢體,且在NanoInl's 48孔分析載玻片上運行經溶析檢體。然後在Innopsys掃描儀上讀取載玻片且藉由相對螢光單位(RFU)值來測定細胞介素濃度。RFU值較高表示存在更多細胞介素,RFU值較低反映檢體中之細胞介素濃度較低。
該等實驗明確顯示:
1)細胞介素在整個血液漬斑中分佈不均勻。取自血液漬斑中心之檢體之細胞介素濃度與取自血液漬斑周邊之檢體顯著不同。
2)細胞介素具有不同分佈,端視用於製備檢體之基質而定。個別細胞介素在PBS+0.5% BSA之基質中具有不同分佈,一些細胞介素在血液漬斑中心濃度較高,一些在周邊濃度較高,且一些在血液漬斑上均勻分佈(參見表1及圖13)。在血清基質中,所有細胞介素皆表現在血液漬斑周邊濃度較高之分佈,但中心對周邊之比率可隨個別分析物而變(參見表2及圖16)。
根據該等結果得出結論,用於自DBS基板卡取檢體以供分析之方法會引入差異性及不精確性。
實例2提供新實施例之更多上下文。
在實驗中使用用於定量測定IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10及TNF-α之奈米陣列多重分析以證實,在自高度控制區域取3 mm打孔片檢體時,可自乾燥血液漬斑檢體獲得可複現數據。在此實例中,自DBS周邊取多個與其邊緣等距之檢體(展示於圖2及14中)。假定血滴自圓形中心擴散至邊緣,則在中心附近之同心環中所取打孔片中之分析物濃度應相等。在乾燥血液漬斑之邊緣附近取與DBS邊緣等距之檢體將容許取多個相同檢體。
奈米陣列分析程序之全部細節闡述於實例1之「48孔分析方案」部分中。經3次獨立運行使用自DBS檢體製備之每一QC檢體之5份獨立製備品來測定運行內及運行間精確度及精密度。每次運行含有覆蓋預期工作範圍之校正曲線、空白及QC。該3次運行係在不同的2天實施。
分析驗證係藉由關於檢體精確度、精密度及可複現性之嚴格要求來引導。由於分析物分佈不均勻且檢體採集方法不一致,在大型零件中滿足使用DBS檢體之驗證要求尤其困難。為使DBS分析驗證中之差異性降至最低同時仍使用標準3 mm圓形檢體採集方法,所有檢體(包括標準品及QC檢體)皆取自DBS檢體之高度控制區域。使用此方法,表3-8及圖15中所示驗證實驗之結果反映高可複現分析方法,其標準品及QC精確度介於80-120%之間且CV(精密度)<25%。
表3-A至3-C所示數據證實,自DBS製備之標準品可顯示在三次實驗性運行中可複現之精確度。亦參見圖7A、7B及7C。
表4-6所示數據證實,自DBS之嚴格控制區域製備之品質控制檢體亦顯示良好可複現結果。
表7所示數據顯示針對封阻液標準曲線反算且針對稀釋液調節之DBS標準品之精確回收率。DBS標準曲線顯示得自藉由以下方式製備之DBS標準品之數據:將細胞介素添加至含有人類紅血球及血清之基質中,之後在濾紙片上乾
燥且隨後溶析以供分析。封阻液標準曲線顯示得自藉由將細胞介素添加至緩衝液中製備之封阻液標準品之數據。
該等數據共同證實,使用對DBS進行精確檢體採集之器件可顯著影響所獲得數據之品質,從而克服細胞介素在DBS中不均勻分佈獲得可重複出現的數據。
濾紙片上DBS檢體分佈之固有差異性會使得對DBS檢體之分析困難且伴隨錯誤。數據表明,謹慎控制從DBS基板卡之檢體採集可充分減小此差異性,從而使得自DBS基板卡溶析之標準品及檢體二者皆可滿足對其他檢體類型要求之嚴格驗證準則。該等結果更進一步表明,利用本文所述檢體採集器件不僅可促進自DBS檢體取受類似控制之相同檢體,且以此方式所取之檢體亦應在分析後更精確地反映血液檢體中之實際分析物濃度。
經2天在三個載玻片上運行之標準品之精確度%
(根據標準品反算)及CV%
使用圖9-11中所示裝置,可從DBS切除大小相同之扇形狀檢體。如圖10所示,在一實施例中,裝置可包含鋼打孔板、印模板及聚碳酸酯校準片。如圖11中所示,在裝置之基本裝配中,將鋼印模板置於鋼打孔板上方,且將聚碳酸酯校準片置於鋼印模板上方。如圖9中所示,在裝置之操作期間,使用聚碳酸酯校準片上之環將DBS基板卡定位於聚碳酸酯校準片與鋼印模板之間,以將DBS平坦地定位於打孔板上,以自DBS切割大小相同之檢體。在校準後,將聚碳酸酯校準片壓低以將DBS基板卡固持就位,且將聚碳酸酯校準片/鋼印模板在鋼打孔板上向下壓以將DBS切割成
大小相同之扇形切片。由於DBS之可能之差異性,實施另一步驟以自DBS基板卡完全分離切割切片,以供在後續步驟中分析至少一種生物分子。該另一步驟係涉及使用圓形打孔板,其直徑係經選擇以對應於特定DBS之直徑。
圖1顯示,在一實施例中,欲藉由本文所述方法採集檢體之DBS之俯視圖。將DBS分為多個(8個)大小相同之扇形區域,且切除該等扇形區域中之一或多者以供分析。
圖2顯示,在一實施例中,欲藉由先前技術方法採集檢體之DBS之俯視圖-自DBS取一或多個固定直徑之圓形打孔片。
圖3顯示,在一實施例中,藉由先前技術方法採集檢體之Whatman 903檢血片之俯視圖-自DBS取一或多個固定直徑之圓形打孔片。
圖4顯示,在一實施例中,藉由本文所述方法採集檢體之DBS之示意圖-將DBS分為8個大小及形狀相同之檢體區域。
圖5顯示,在一實施例中,藉由本文所述方法採集檢體之DBS之示意圖-將DBS分為6個大小及形狀相同之檢體區域及剩餘區域。
圖6顯示,在一實施例中,本申請案中所述不同形狀之檢體之俯視圖。
圖7A-7C顯示,在一實施例中,本文所述方法量測細胞介素在DBS中之真實濃度之精確度及精密度(圖7A:運行
1;圖7B:運行2;圖7C:運行3)。
圖8顯示,在一實施例中,本文所述用於自DBS切除扇形狀檢體之裝置。(所有尺寸皆以英吋計;材料:1個1/16"厚聚碳酸酯、1個1/8"厚聚碳酸酯;各自設計-如圖中所示之切穿材料,僅用於標記之同心圓切入材料(0.005"至0.025")。)
圖9顯示,在一實施例中,本文所述用於自DBS切除扇形狀檢體之裝置之基本操作。
圖10顯示,在一實施例中,本文所述用於自DBS切除扇形狀檢體之裝置之主要組合零件。
圖11顯示,在一實施例中,本文所述用於自DBS切除扇形狀檢體之裝置之基本裝配。
圖12顯示,在一實施例中,藉由在DBS之中心及一周邊區域取固定直徑之圓形打孔片採集檢體之DBS之俯視圖。
(在RBC's+PBS-BSA中製備之標準檢體。)
圖13顯示,在一實施例中,對在DBS之中心及一周邊區域中檢測之細胞介素之量之比較。(為測試在不存在細胞時細胞介素在DBS基板卡上之分佈,在封阻緩衝液中製備細胞介素標準品,將其點至DBS基板卡上,乾燥且根據標準程序加以溶析。)
圖14顯示,在一實施例中,藉由在DBS之中心及兩個周邊區域中取固定直徑之圓形打孔片採集檢體之DBS之俯視圖。(自與中心等距之環取周邊檢體以減小差異性。)
圖15顯示,在一實施例中,對在DBS之中心及兩個周邊
區域中檢測之細胞介素之量之比較。(標準品之DBS打孔片取自周邊;灰色區域代表65%-135%可接受範圍)
圖16顯示,在一實施例中,血清對DBS中之細胞介素分佈之效應。(DBS基質係使用人類血清代替PBS-BSA來製備)
Claims (47)
- 一種方法,其包含:提供包含至少一個乾燥血液漬斑(dried blood spots;DBS)之基板,其中該DBS包含以梯度模式分佈於該基板上之至少一種生物分子;自該DBS切除至少一個扇形狀檢體;及視情況,分析該扇形狀檢體中之該生物分子。
- 如請求項1之方法,其中該基板包含用於沈積該DBS之至少一處檢體沈積區域。
- 如請求項1之方法,其中該基板係濾紙。
- 如請求項1之方法,其中該基板係Whatman 903檢血片。
- 如請求項1之方法,其中該DBS係自全血製備。
- 如請求項1之方法,其中該DBS係自合成性血液基質製備。
- 如請求項1之方法,其中該DBS係自包含至少一種蛋白質載體之合成性血液基質製備。
- 如請求項1之方法,其中該生物分子係蛋白質。
- 如請求項1之方法,其中該生物分子係細胞介素。
- 如請求項1之方法,其中該生物分子係細胞介素,其係IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10或TNF-α。
- 如請求項1之方法,其中該生物分子在該DBS中心比在周邊較為聚集。
- 如請求項1之方法,其中該生物分子在該DBS周邊比在中心較為聚集。
- 如請求項1之方法,其中該扇形狀檢體係以鋒利切割工具切除。
- 如請求項1之方法,其中該扇形狀檢體係使用如請求項32之裝置加以切除。
- 如請求項1之方法,其中該扇形狀檢體係自該DBS中心以輻射方式朝向周圍切除。
- 如請求項1之方法,其中該扇形狀檢體係由以兩條半徑及位於該兩條半徑間之圓弧為邊界之扇形區域組成。
- 如請求項1之方法,其中自該DBS切除2個或更多個尺寸及形狀相同之扇形狀檢體。
- 如請求項1之方法,其中自該DBS切除8個或更多個尺寸及形狀相同之扇形狀檢體。
- 如請求項1之方法,其中該分析步驟係經完成,且分析該生物分子之步驟包含量測該生物分子之含量。
- 如請求項1之方法,其中分析步驟係經完成,且分析該生物分子之步驟包含量測該生物分子之含量,且其中該生物分子之含量係在2個或更多個扇形狀檢體中量測。
- 一種方法,其包含:提供包含至少一個生物流體乾燥漬斑之基板,其中該乾燥漬斑包含以梯度模式分佈於該基板上之至少一種生物分子;自該乾燥漬斑切除至少一個扇形狀檢體;及量測該扇形狀檢體中之該生物分子之含量。
- 如請求項21之方法,其中該基板係濾紙。
- 如請求項21之方法,其中該生物分子係蛋白質。
- 如請求項21之方法,其中該生物分子選自由以下組成之群:核酸、多糖、脂質、維生素、激素及神經傳遞物。
- 如請求項21之方法,其中該生物流體係選自由以下組成之群之動物體液:血液、淚液、唾液、淋巴液、胃腸液及尿液。
- 如請求項21之方法,其中該生物流體選自由以下組成之群:植物木質部流體、植物韌皮部流體及細菌之液體培養物。
- 如請求項21之方法,其中該生物分子在該乾燥漬斑中心比在周邊較為聚集。
- 如請求項21之方法,其中該生物分子在該乾燥漬斑周邊比在中心較為聚集。
- 如請求項21之方法,其中該扇形狀檢體係以鋒利切割工具切除。
- 如請求項21之方法,其中該扇形狀檢體係由以兩條半徑及位於該兩條半徑間之圓弧為邊界之扇形區域組成。
- 如請求項21之方法,其中自該乾燥漬斑切除2個或更多個尺寸及形狀相同之扇形狀檢體。
- 一種用於自DBS切除至少一個檢體之裝置,其包含:打孔板,其包含會在定錨點彼此會合之至少兩個切割臂;位於該打孔板上方之印模板,其包含孔隙可供該等切割臂穿過; 位於該印模板上方之校準片,其包含位於該等切割臂及該孔隙正上方之檢體校準器;且其中該裝置經調整,如此使得(i)可將該DBS牢固地置於該印模板與該校準片之間,並以該檢體校準器校準,且(ii)該印模板及該打孔板可朝向彼此移動,從而使得該等切割臂穿過該孔隙並切除該DBS。
- 如請求項32之裝置,其中每一切割臂之長度為約0.1-0.5英吋。
- 如請求項32之裝置,其中每一切割臂之長度為約0.2-0.4英吋。
- 如請求項32之裝置,其中該打孔板包含會在該定錨點彼此會合之足夠數目的切割臂,以將該DBS切割成2個、3個、4個、5個、6個、8個、10個或12個尺寸相同之扇形區域。
- 如請求項32之裝置,其中該等切割臂係由金屬、聚合物或矽基材料製成。
- 如請求項32之裝置,其中該等切割臂係由鋼製成。
- 如請求項32之裝置,其中該校準片係由聚碳酸酯製成。
- 如請求項32之裝置,其中該校準器包含至少一個以該定錨點為中心之外環。
- 如請求項32之裝置,其中該校準器包含至少一個外環及至少一個內環,該二環皆以該定錨點為中心,其中該外環與該內環同心。
- 如請求項32之裝置,其中該打孔板進一步包含至少一個 連接該至少兩個切割臂之切割裙(cutting skirt)。
- 如請求項32之裝置,其中該打孔板進一步包含至少一個連接該至少兩個切割臂之弧形切割裙,其中該等切割臂及該切割裙一起操作,以切除幾何扇形狀檢體。
- 一種方法,其包含:提供包含至少一個乾燥血液漬斑(DBS)之基板,其中該DBS包含至少一種以不均勻模式分佈於該基板上之生物分子;自該DBS切除至少一個扇形狀檢體;及視情況,分析該扇形狀檢體中該生物分子。
- 一種方法,其包含:提供包含至少一個生物流體乾燥漬斑之基板,其中該乾燥漬斑包含至少一種以不均勻模式分佈於該基板上之生物分子;自該乾燥漬斑切除至少一個扇形狀檢體;及量測該扇形狀檢體中該生物分子之含量。
- 一種方法,其包含:評估佈置於基板上之至少一種生物分子,其中該評估係在該基板上至少兩個尺寸近乎相同之扇形部分上實施。
- 如請求項1之方法,其中該基板包含至少一個在沈積該DBS前未預先切割之檢體沈積區域。
- 如請求項46之方法,其中該基板係濾紙,且其中該檢體沈積區域係該濾紙上預先標記之圓形收集區域。
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