TW201309725A - 新穎免疫調節胜肽 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種具有免疫調節性之裂解哺乳動物β防禦素。裂解或截斷之胜肽可與全長哺乳動物β防禦素一樣有效，且可用於治療免疫及自體免疫病症，包括(但不限於)發炎性腸疾病及類風濕性關節炎。

Description

新穎免疫調節胜肽

本發明係關於一種具免疫調節性之裂解哺乳動物β防禦素。裂解或截斷之胜肽可用於治療免疫病症，包括(但不限於)發炎性腸疾病及類風濕性關節炎。

在許多其他要素中，先天性免疫之關鍵組分為抗微生物胜肽(AMP)，其個別地展示相當大的選擇性，但共同地能夠迅速殺死大範圍之細菌、病毒及真菌。AMP之生物學重要性係由其在自然界中之普遍分佈來突出且其可能由所有多細胞生物產生。在人類中，主要AMP為防禦素。人類防禦素為陽離子小胜肽，其可基於其三個分子內半胱胺酸雙硫鍵之形態分為α-防禦素及β-防禦素。β-防禦素主要由包括皮膚、氣管、胃腸道、泌尿生殖系統、腎臟、胰臟及乳腺之各種組織及器官中之上皮細胞產生。β-防禦素家族之最佳特性化成員為人類β防禦素1至人類β防禦素3(hBD1至hBD3)。一些人類防禦素以組成性方式產生，而其他則由促發炎性細胞介素或外源微生物產品誘導。

日益清楚的是，人類防禦素除其直接抗微生物活性以外亦具有廣泛範圍之免疫調節/替代性。此等特性包括誘導各種趨化因子及細胞介素；趨化性及細胞凋亡活性；誘導前列腺素、組織胺及白三烯釋放；抑制補體；經由鐘樣受體信號傳導刺激樹突狀細胞成熟及由嗜中性白血球刺激病 原體清除。此外，人類防禦素亦在傷口癒合、上皮細胞及纖維母細胞增殖、血管生成及血小管生成中起作用。

WO 2007/081486提出人類防禦素在發炎性腸疾病之治療中的用途。本發明者提出以允許防禦素在腸腔中之適當位置釋放之調配物形式向克隆氏(Crohn's)病患者經口投予防禦素將減少侵襲細菌之數量，重建正常上皮障壁功能且因此降低發炎性疾病之嚴重性。

WO 2010/007166揭示用哺乳動物β防禦素(特定而言人類β防禦素2)治療發炎性腸疾病。WO 2010/007168揭示使用哺乳動物β防禦素(特定而言人類β防禦素2)治療類風濕性關節炎。WO 2010/007165揭示用哺乳動物防禦素(特定而言人類β-防禦素2(hBD2))治療免疫病症。

本發明論證裂解hBD2在使用人類外周血液單核細胞(PBMC)之試管內模型中之抗發炎活性。術語「裂解防禦素(cleaved defensin)」意謂與普通野生型胜肽相比胜肽已藉由移除一或多個末端胺基酸而裂解。換言之，裂解胜肽比其裂解自之胜肽短。自多胜肽或胜肽移除末端胺基酸之過程亦可稱為截斷。因此，「裂解防禦素」亦為「截斷防禦素」。本發明之裂解及截斷防禦素係藉由與野生型序列相比具有較短N端而在N端截斷或裂解。

此未必意謂產物必須為較長產物裂解之結果。已認識到較短形式之野生型哺乳動物防禦素具生物活性，可想像 得到可在無需實際裂解的情況下直接製造該等較短形式。

裂解或截斷哺乳動物防禦素較佳為裂解或截斷哺乳動物β-防禦素2。

代表性裂解或截斷哺乳動物β-防禦素2(hBD2)之活性意外地與先前對全長hBD2之報導相同，表明裂解hBD2亦將對IBD及可用hBD2治療之其他病症具有有益治療作用。當自全長hBD2中去除之序列在物種中具極強保守性時，此尤其出乎意料。強保守性通常指示保守殘基對胜肽之功能很重要。

與全長哺乳動物β防禦素相比，本發明之裂解β防禦素較短且因此為較小分子。因分子較短，故給出相同濃度之胜肽的以mg或μg計之有效劑量比全長哺乳動物β-防禦素少。

本發明之裂解哺乳動物β-防禦素可在高溫下在強酸性環境中出乎意料地穩定延長之時間。裂解哺乳動物β-防禦素至少與全長哺乳動物β-防禦素一樣有效。

更特定言之，本發明係關於一種選自由以下組成之群的胜肽：a)胺基酸序列為SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11中之任一者的胜肽；b)與該等SEQ ID NO相比具有1至5個胺基酸取代之a)胜肽的抗發炎胜肽變異體；c)與SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7及 SEQ ID NO 8具有至少80%序列一致性且具有選自由IGDPVT-、GDPVTC-、DPVTCL-或PVTCL-組成之群、較佳具有PVTCL-之N端的抗發炎胜肽變異體；及d)具有共同序列PVTCLX₁X₂GAICHPX₃FCPRRYKX₄IGTCGLX₅X₆X₇KCCKKP之抗發炎胜肽，其中獨立地X₁為K或R，X₂為S或N，X₃為V或G，X₄為Q或H，X₅為P或S，X₆為G或V，及X₇為T或I。

在另一態樣中，本發明係關於一種製造本發明中之任一者之胜肽的方法，該方法包含重組表現、使用自動胺基酸合成器或全長哺乳動物β-防禦素2之酸裂解。

在另一態樣中，本發明係關於一種包含選自由以下組成之群的核苷酸序列之聚核苷酸：a)編碼由與本發明之胜肽連接之N端真核信號序列組成的多胜肽之聚核苷酸；及b)編碼由與可裂解連接子連接之N端M及本發明之胜肽組成的多胜肽之聚核苷酸。

此外，本發明係關於一種包含本發明之聚核苷酸的表現載體及用本發明之表現載體轉換(transduce)或轉染之細胞。

在又一態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含本發明之胜肽及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

此外，本發明係關於用作特定而言用於治療自體免疫病症及發炎性病症之醫藥品的本發明之胜肽及治療該等病症之方法。

定義：

自體免疫疾病：如本文中所用之術語「自體免疫疾病(autoimmune disease)」係指因身體針對通常存在於身體中之物質及組織的過度活性免疫反應而出現之疾病。術語自體免疫疾病與自體免疫病症在本申請案中可互換使用。

防禦素：如本文中所用之術語「防禦素(defensin)」係指由熟習此項技術者識別為屬於抗微生物胜肽之防禦素類型的多胜肽。為確定多胜肽是否為本發明之防禦素，可藉由使用可自由獲取之HMMER套裝軟體將胺基酸序列與PFAM資料庫之隱式馬可夫模型(hidden markov model)型態(HMM型態)對比。

PFAM防禦素家族包括例如防禦素_1或「哺乳動物防禦素」(登記號PF00323)及防禦素_2或防禦素_β或「β防禦素」(登記號PF00711)。

本發明之防禦素屬於β防禦素類型。β防禦素類型之防禦素具有熟習此項技術者已知之共同結構特徵，諸如半 胱胺酸形式。

更特定言之，本發明之裂解哺乳動物β-防禦素為裂解哺乳動物β-防禦素2。

一致性：兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性由參數「一致性」來描述。

出於本發明之目的，兩個胺基酸序列之間的一致性程度係如EMBOSS套件之Needle程式(較佳為版本3.0.0或較晚版本)(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000,Trends in Genetics 16：276-277；http：//emboss.org)所實施，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)來測定。所用之視情況選用之參數為間隙開口罰分10、間隙延伸罰分0.5及EBLOSUM62(EMBOSS版本之BLOSUM62)取代矩陣。使用Needle標記之「最長一致性」之輸出(使用-nobrief選項獲得)作為一致性百分比且如下計算：(一致殘基×100)/(比對長度-比對中之間隙總數)

分離胜肽：如本文中所用之術語「分離胜肽(isolated peptide)」係指自來源分離之胜肽。在一個態樣中，藉由RP-HPLC分析所測定，胜肽為至少1%純、較佳至少5%純、更佳至少10%純、更佳至少20%純、更佳至少40%純、更佳至少60%純、甚至更佳至少80%純及最佳至少90%純。

實質性純胜肽：本文中術語「實質性純胜肽(substantially pure peptide)」表示一種胜肽製劑，其含有 與其以天然或重組方式締合之至多10重量%、較佳至多8重量%、更佳至多6重量%、更佳至多5重量%、更佳至多4重量%、更佳至多3重量%、甚至更佳至多2重量%、最佳至多1重量%且甚至最佳至多0.5重量%之其他胜肽材料。因此，以製劑中存在之胜肽材料之總重量計，實質性純胜肽較佳為至少92%純、較佳至少94%純、更佳至少95%純、更佳至少96%純、更佳至少96%純、更佳至少97%純、更佳至少98%純、甚至更佳至少99%、最佳至少99.5%純。本發明之胜肽較佳呈實質性純形式。此可例如藉由用熟知重組方法或用經典純化方法製備胜肽來實現。

發炎性腸疾病(IBD)：發炎性腸疾病(IBD)為結腸及小腸之發炎病狀集合。IBD之主要類型為克隆氏病及潰瘍性結腸炎(UC)。

並不總是歸類為典型IBD之其他形式之IBD佔極少病例：

．膠原性結腸炎

．淋巴球性結腸炎

．缺血性結腸炎

．分流結腸炎(diversion colitis)

．白塞氏病(Behcet's disease)

．未定型結腸炎

克隆氏病與潰瘍性結腸炎(UC)之間的主要區別為炎性位置及性質改變。克隆氏病可累及自口腔至肛門之胃腸道的任何部分(跳躍性病變)，不過大多數病例始於迴腸 末端。相比之下，潰瘍性結腸炎限於結腸及直腸。

治療：如本文中所用之術語「治療(treatment及treating)」係指出於與病狀、疾病或病症抗爭之目的管理及護理患者。該術語意欲包括對患者遭受之給定病狀之全部範圍的治療，諸如出於以下目的投予活性化合物：緩解或減輕症狀或併發症；遲延病狀、疾病或病症之進展；治癒或消除病狀、疾病或病症；及/或預防病狀、疾病或病症，其中「預防」被理解為係指出於阻礙、減慢或遲延病狀、疾病或病症之發展的目的管理及護理患者，且包括投予活性化合物以預防症狀或併發症或降低其發病之風險。待治療患者較佳為哺乳動物，尤其為人類。待根據本發明治療之患者可具有各種年齡。

哺乳動物β防禦素

本發明係關於截斷或裂解哺乳動物β防禦素，諸如猴β防禦素或人類β防禦素，更佳為人科β防禦素，更佳為人類β防禦素。在本發明之一個尤佳具體實例中，裂解或截斷哺乳動物β-防禦素屬於類型2。

本發明之裂解哺乳動物β-防禦素可在高溫下在強酸性環境中出乎意料地穩定延長之時間。特定而言，具有N端PVTCL-之裂解哺乳動物β-防禦素在高溫及低pH值下極其穩定。

在一個較佳具體實例中，本發明之胜肽係選自由具有以下序列之胜肽組成之群：SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 8、較佳為SEQ ID NO 5。

與SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 8中之一者相比，最佳與SEQ ID NO 5相比，該等序列之變異體可具有1-5個胺基酸修飾、較佳1-4個胺基酸修飾、更佳1-3個胺基酸修飾、最佳1-2個胺基酸修飾。

在本發明之一個具體實例中，裂解哺乳動物β防禦素之N端包含選自由組成之群的序列：IGDPVT-、GDPVTC-、DPVTCL-或PVTCL-，較佳為PVTCL-。

在一個具體實例中，本發明之裂解哺乳動物β防禦素為至多40個胺基酸長，較佳39個胺基酸長，諸如38個胺基酸，更佳37個胺基酸長。

胜肽更佳為精確地37個胺基酸長。甚至更佳，該37個胺基酸長之胜肽具有N端PVTCL-。更特定言之，與SEQ ID NO 5相比，37個胺基酸長之胜肽可具有至多5個胺基酸取代，更佳至多4個胺基酸取代，更佳至多3個胺基酸取代，更佳至多2個胺基酸取代，更佳至多1個胺基酸取代。

在本發明之一個具體實例中，胜肽不包含N端GIGD序列。胜肽更佳在任何地方皆不包含任何GIGD序列。

在一個具體實例中，本發明之裂解哺乳動物β防禦素與胺基酸序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中之任一者的一致性程度為至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%及最佳至少95%。

在一個較佳具體實例中，本發明之哺乳動物β防禦素與胺基酸序列SEQ ID NO：5之一致性程度為至少80%、較 佳至少85%、更佳至少90%及最佳至少95%。在一個較佳具體實例中，本發明之哺乳動物β防禦素由裂解人類β防禦素2(SEQ IDNO：5)組成。

在本發明之一個較佳具體實例中，哺乳動物β防禦素係選自由以下組成之群：PVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP(SEQ ID NO 5)、DPVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP(SEQ ID NO 9)、GDPVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP(SEQ ID NO 10)及IGDPVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP(SEQ ID NO 11)；及與SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10及SEQ ID NO 11中之一者相比，具有1-5個胺基酸修飾、較佳1-4個胺基酸修飾、更佳1-3個胺基酸修飾、最佳1-2個胺基酸修飾之該等序列的變異體。

本發明之裂解胜肽更佳包含具有至多5個胺基酸修飾、較佳至多4個胺基酸修飾、更佳至多3個胺基酸修飾、更佳至多2個胺基酸修飾、更佳1個胺基酸修飾之來自人類β防禦素2之37個鄰接殘基(SEQ ID NO 5)，且無其他人類β-防禦素序列。因此，本發明之胜肽可包含來自例如呈標記或融合蛋白形式的其他蛋白或胜肽之額外胺基酸，只要該等額外胺基酸不存在於人類β-防禦素2中之對應位置處。

在一個尤佳具體實例中，本發明之裂解哺乳動物β-防禦素為37個胺基酸長，具有含以下序列PVTCLK-之N端，且與SEQ ID NO 5相比具有1-5個胺基酸修飾，較佳1-4個 胺基酸修飾，更佳1-3個胺基酸修飾，最佳1-2個胺基酸修飾。

本發明之裂解哺乳動物β防禦素亦可由以下共同序列來描述：PVTCLX₁X₂GAICHPX₃FCPRRYKX₄IGTCGLX₅X₆X₇KCCKKP，其中獨立地：X₁為K或R，X₂為S或N，X₃為V或G，X₄為Q或H，X₅為P或S，X₆為G或V，及X₇為T或I。

本發明之胜肽較佳以分離及/或實質性純形式提供。

生物活性胜肽較佳呈二聚體、較佳同源二聚體形式。

功能等效變異體

在本發明之上下文中，裂解哺乳動物(例如人類)β防禦素之「功能等效變異體」為經修飾哺乳動物(例如人類)β防禦素，其在諸如實施例2之檢定的試管內及活體內檢定中，對促發炎性細胞介素及趨化因子及/或抗發炎細胞介素之活性展示與全長哺乳動物(例如人類)β防禦素大致相同之作用。預期本發明之胜肽對促發炎性細胞介素或趨化因子及/或抗發炎細胞介素之作用為大致相同之作用，該作用在相同檢定中在相同濃度(μg/ml)下為hBD2 (SEQ ID NO 1)之作用的至少50%、更佳至少60%、更佳至少70%、更佳至少75%、更佳至少80%、更佳至少90%、更佳其中胜肽具有不顯著低於hBD2(SEQ ID NO 1)之活性的作用。本發明之胜肽更佳能夠在相同濃度下在與hBD2大致相同之程度上誘導抗發炎細胞介素及減少促發炎性趨化因子及細胞介素。在本發明之一些具體實例中，胜肽展示高於野生型(全長)胜肽之活性。

在一個具體實例中，與全長哺乳動物(例如人類)β防禦素相比，功能等效變異體對促發炎性細胞介素及趨化因子及/或抗發炎細胞介素之活性展示改良之作用。

在一個具體實例中，對促發炎性及抗發炎細胞介素之活性的作用係如WO 2010/007166之實施例4及實施例6中所述來量測。該作用可在選自由以下組成之群的人類細胞中量測：人類PBMC、源自人類CD14+單核球之樹突狀細胞、人類單核球細胞株及人類未成熟樹突狀細胞，較佳為人類PBMC。

本發明之胜肽的活性較佳為下調至少一種選自由促發炎性細胞介素及趨化因子組成之群的細胞介素之活性。該活性較佳為下調至少一種選自由以下組成之群的細胞介素之活性：促發炎性IL-23、促發炎性IL-1 β、促發炎性IL-6、促發炎性IL-8、促發炎性MCP-1及促發炎性TNF α，及/或上調抗發炎細胞介素IL-10之活性。

根據本發明，與裂解哺乳動物(例如人類)β防禦素胺基酸序列相比，裂解哺乳動物(例如人類)β防禦素之 功能等效變異體可包含1-5個胺基酸修飾、較佳1-4個胺基酸修飾、更佳1-3個胺基酸修飾、最佳1-2個胺基酸修飾及特定而言一個胺基酸修飾。較佳與裂解人類β防禦素2相比具有SEQ ID NO 5。

本文中術語「修飾(modification)」意謂對裂解哺乳動物(例如人類)β防禦素之任何化學修飾。修飾可為胺基酸之取代、缺失及/或插入以及胺基酸側鏈之置換；或使用胺基酸序列具有相似特性之非天然胺基酸。特定而言，修飾可為醯胺化，諸如C端之醯胺化。修飾較佳為胺基酸取代，更佳為如Clustal W群所界定之保守或半保守取代。

胺基酸修飾較佳性質輕微，其為不顯著影響多胜肽之摺疊及/或活性之保守胺基酸取代或插入；單一缺失；小胺基或羧基末端延伸且其不源自β-防禦素。

在一個具體實例中，裂解胜肽包含藉由改變淨電荷或另一功能來促進純化之小延伸，諸如聚組胺酸標記、抗原性抗原決定基或結合域。在一個具體實例中，小延伸(諸如聚組胺酸標記、抗原性抗原決定基或結合域)經由具有至多約20個至25個殘基之小連接子胜肽連接於裂解哺乳動物(例如人類)β防禦素，且該連接子可含有酶裂解位點或替代裂解位點，諸如可由酸裂解之位點。在另一具體實例中，小標記可添加至胜肽之N端或C端。此標記較佳不為哺乳動物β-防禦素2或其片段。

本發明之多胜肽之N端延伸可適當地由1至50個胺基酸、較佳2至20個胺基酸、尤其3至15個胺基酸組成。 在一個具體實例中，N端胜肽延伸不含有Arg(R)。在另一具體實例中，N端延伸包含以下將進一步定義之kex2或kex2樣裂解位點。在一個較佳具體實例中，N端延伸為胜肽，其包含至少兩個Glu(E)及/或Asp(D)胺基酸殘基，諸如包含以下序列中之一者的N端延伸：EAE、EE、DE及DD。延伸較佳不為哺乳動物β-防禦素2或其片段。

圖3或圖4中之Clustal W比對可用於預測哪一個胺基酸殘基可在不實質上影響蛋白質之生物活性的情況下取代。序列係使用Clustal W 2.1(http：//www.genome.ip/tools/clustalw/)及以下設定來比對：間隙開口罰分：10，間隙延伸罰分：0.05，重量變化：無，蛋白質之親水性殘基：GPSNDQE，親水性間隙：有，權重矩陣：BLOSUM(用於蛋白質)。

在本發明之含義中，以下群(Clustal W，『強』保守群)中之取代被視為保守取代：- STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。

在本發明之含義中，以下群(Clustal W，『弱』保守群)中之取代被視為半保守取代：- CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、VLIM、HFY。

保守取代之實例為以下之群中進行之取代：鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸及組胺酸)、酸性胺基酸(麩胺酸及天冬胺酸)、極性胺基酸(麩胺醯胺及天冬醯胺)、疏水 性胺基酸(白胺酸、異白胺酸及纈胺酸)、芳香族胺基酸(苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸)及小胺基酸(甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及甲硫胺酸)。通常不改變比活性之胺基酸取代為此項技術中已知且例如由H.Neurath及R.L.Hill,1979,The Proteins,Academic Press,New York描述。最常發生之交換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly。

除20種標準胺基酸以外，非標準胺基酸(諸如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及α-甲基絲胺酸)亦可取代野生型多胜肽之胺基酸殘基。有限數目之非保守胺基酸、不由遺傳密碼子編碼之胺基酸及非天然胺基酸可取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」在蛋白質合成之後已經修飾及/或其側鏈中之化學結構與標準胺基酸不同。非天然胺基酸可化學合成及較佳可市面上購得，且包括2-哌啶甲酸、噻唑啶羧酸、去氫脯胺酸、3-甲基脯胺酸及4-甲基脯胺酸及3,3-二甲基脯胺酸。

哺乳動物β防禦素中之必需胺基酸可根據此項技術中已知之諸如定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發之程序來識別(Cunningham及Wells,1989,Science 244：1081-1085)。在後一技術中，單一丙胺酸突變在分子中之每一殘基處引入，且測試所得突變分子之生物活性(亦即針對發炎性腸疾病之活性及/或對TNF-α活性之抑制)以識別對分子之活 性具關鍵性之胺基酸殘基。亦參見Hilton等人，1996,J.Biol.Chem.271：4699-4708。必需胺基酸之一致性亦可自與哺乳動物β防禦素有關之多胜肽之一致性的分析來推斷(參見圖4及圖5中之Clustal W比對)。

可進行單一或多個胺基酸取代且使用諸如由以下所揭示之突變誘發、重組及/或改組之已知方法繼之以相關篩選程序來測試：Reidhaar-Olson及Sauer,1988,Science 241：53-57；Bowie及Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。可使用之其他方法包括易於出錯之PCR、噬菌體呈現(例如，Lowman等人，1991,Biochem.30：10832-10837；美國專利第5,223,409號；WO 92/06204)及定區突變誘發(Derbyshire等人，1986,Gene 46：145；Ner等人，1988,DNA 7：127)。

當不能肯定地預測給定取代之結果時，可根據上文所述之方法容易地分析衍生物以確定存在或不存在生物活性。

本發明之胜肽亦可藉由將胜肽共價鍵聯至諸如不同胜肽或多胜肽、親和力標記、碳水化合物、脂質及合成聚合物之另一化學部分來修飾。

方法及用途

本發明論證裂解hBD2在使用人類外周血液單核細胞(PBMC)之試管內模型中之抗發炎活性。觀察到之活性至少與先前報導之全長hBD2相同，表明裂解hBD2亦將在治療諸如IBD之自體免疫疾病中具有有益作用。如圖2中所 示，似乎裂解人類β-防禦素2(SEQ ID NO 5)在一些濃度下比全長人類β-防禦素2(SEQ ID NO1)更有效。

因此，裂解hBD2顯示作為治療諸如潰瘍性結腸炎及克隆氏病之發炎性腸疾病之醫藥品的潛能。

用於研究IBD之公認模型為如下所描述之DSS結腸炎小鼠模型：Kawada等人，「Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease」,World J.Gastroenterol，第13(42)卷，第5581-5593頁(2007)；以及Wirtz及Neurath「Mouse models of inflammatory bowel disease」,Advanced Drug Delivery Reviews，第59(11)卷，1073-1083(2007)。

本發明之發炎性腸疾病係關於克隆氏病及潰瘍性結腸炎。

在本發明之另一具體實例中，投予裂解哺乳動物β防禦素可用於在胃腸道中在上皮內襯處或全身性地經由在上皮內襯處之相互作用調節細胞介素產生。

該調節較佳為下調至少一種選自由促發炎性細胞介素及趨化因子組成之群的細胞介素之活性。調節較佳為下調至少一種選自由促發炎性IL-23、IL-1 β及TNF α組成之群的細胞介素之活性，及/或上調抗發炎細胞介素IL-10之活性。

在另一具體實例中，本發明提供治療發炎性腸疾病之方法，該治療包含投予有效量之呈醫藥組成物形式之裂解哺乳動物β防禦素。

在另一具體實例中，本發明提供治療類風濕性關節炎之方法，該治療包含投予有效量之呈醫藥組成物形式之裂解哺乳動物β防禦素。全長hBD2(SEQ ID NO 1)已在類風濕性關節炎之動物模型中展示治療潛能(WO 2010/007168)。

亦可想像得到本發明之裂解哺乳動物β-防禦素適用於治療選自由以下組成之群的發炎性疾病或病症：類風濕性關節炎、牛皮癬、骨關節炎、多發性硬化、動脈粥樣硬化、硬皮病(全身性硬化)、狼瘡、全身性紅斑狼瘡(SLE)、(急性)腎小球性腎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫症候群(ARDS)、血管炎、眼色素層炎、皮膚炎、異位性皮膚炎、脫髮、鼻炎(過敏性)、過敏性結膜炎、重症肌無力、硬皮病、肉狀瘤病、牛皮癬性關節炎、關節黏連性脊椎炎、幼年特發性關節炎、葛瑞夫茲氏病(Graves disease)、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)及白塞氏病。此等疾病為全長人類β-防禦素2已對其展示潛能之適應症(WO 2010/007165)。

投藥途徑

裂解哺乳動物β防禦素在治療上可以經調配以便藉由任何習知途徑投藥之組成物形式來使用。在本發明之一個具體實例中，裂解哺乳動物β防禦素經口投予。此可能是因為本發明之裂解哺乳動物β-防禦素具有極高程度之酸穩定性。胜肽在85℃及pH 2.3下可耐受酸水解16小時。本發明之一個特別酸穩定胜肽具有N端：PVTCL-。

在本發明之另一具體實例中，裂解哺乳動物β防禦素係藉由非經腸投藥來投予。

在本發明之另一具體實例中，裂解哺乳動物β防禦素係藉由全身性投藥來投予。

經口投藥通常用於經腸藥物傳遞，其中藥劑經由腸黏膜來傳遞。

非經腸投藥為非經口/經腸途徑之任何投藥途徑，藉此醫藥品避免在肝臟中之首次通過(first-pass)降解。因此，非經腸投藥包括任何注射及輸注，例如快速注射或連續輸注，諸如肌內投藥及皮下投藥。皮下及肌內形式之非經腸投藥通常較佳。

全身性投藥通常直接投予至待治療個體之血流中。在一個具體實例中，其可為靜脈內注射。

在其他具體實例中，較佳具體實例之組成物可利用提供如凍乾產物之穩定性的適當賦形劑調配成為凍乾產物且隨後再水合。

含有裂解哺乳動物β防禦素(諸如裂解人類β防禦素)之醫藥組成物可根據習知方法例如藉由混合、粒化、塗佈、溶解或凍乾製程來製造。

較佳具體實例之醫藥組成物包含裂解哺乳動物β防禦素(諸如裂解人類β防禦素)及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或稀釋劑。

醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑為熟習此項技術者所熟知。對於調配為液體溶液之組成物而言，可接受之載 劑及/或稀釋劑包括鹽水及無菌水，且可視情況包括抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及其他常見添加劑。

非經腸投藥可呈注射及輸注之形式，且該等調配物可採取諸如油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式。或者，活性成分可呈粉末形式，藉由無菌固體之無菌分離或藉由自溶液凍乾(以便在使用之前用適合媒劑(例如無菌無熱原質水)復原)而獲得。調配物可存在於單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿、小瓶、預填充注射器、輸注袋)中，或可儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件下，僅需要在使用之前即刻添加無菌液體賦形劑(例如水)以便注射。

油性或非水性載劑、稀釋劑、溶劑或媒劑之實例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯且可含有調配劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑或懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。

本發明之化合物可以多種口服調配物之形式來調配。固體形式製劑可包括粉劑、錠劑、滴劑、膠囊、扁囊劑、口含劑及可分散性顆粒劑。適於口服之其他形式可包括液體形式製劑，包括乳液、糖漿、酏劑、水溶液、水性懸浮液、牙膏劑、凝膠牙膏劑、咀嚼用膠；或固體形式製劑，其意欲在使用前不久轉化為液體形式製劑，諸如溶液、懸浮液及乳液。

在粉劑中，載劑為細粉狀固體，其為與細粉狀活性組分之混合物。在錠劑中，活性組分與具有必要黏合能力之載劑以適合比例混合且壓實成所要形狀及尺寸。適合載劑 為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可脂及其類似物。

本發明之滴劑可包含無菌或非無菌水性或油性溶液或懸浮液，且可藉由將活性成分溶解於適合水溶液中來製備，視情況包括殺細菌劑及/或殺真菌劑及/或任何其他適合之防腐劑，且視情況包括表面活性劑。適合製備油性溶液之溶劑包括甘油、稀醇及丙二醇。

乳液可以溶液形式在丙二醇水溶液中製備，或可含有乳化劑，諸如卵磷脂、去水山梨醇單油酸酯或阿拉伯膠。水溶液可藉由將活性組分溶於水中且添加適合之著色劑、調味劑、穩定劑及增稠劑來製備。水性懸浮液可藉由以諸如天然或合成膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及其他熟知懸浮劑之黏性材料將細粉狀活性組分分散於水中來製備。

調配物可含有(除裂解哺乳動物β防禦素及其他視情況選用之活性成分以外)載劑、填充劑、崩解劑、流量調節劑、糖及甜味劑、芳香劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、增溶劑、用於調節滲透壓之鹽、緩衝劑、稀釋劑、分散劑及表面活性劑、黏合劑、潤滑劑及/或此項技術中已知之其他醫藥賦形劑。

熟習此項技術者可以適當方式且根據諸如Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro編，Mack Publishing公司，Easton,PA 1990中所描述之公認作法進一步調配裂解哺乳 動物β防禦素。

裂解哺乳動物β防禦素(諸如裂解人類β防禦素)可單獨使用，或以與一種、兩種、或大於兩種之其他醫藥化合物或藥物物質之組合療法形式使用，及/或與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑一起使用。

製造方法

裂解哺乳動物β防禦素可藉由試管內合成使用此項技術中已知之習知方法來製備。各種商業合成儀器(例如自動合成器)可購自Applied Biosystems有限公司，Beckman等。藉由使用合成器，天然存在之胺基酸可由特定而言為D-異構體(或D形式)(例如D-丙胺酸及D-異白胺酸)之非天然胺基酸、非對映異構體、具有不同長度或官能性之側鏈及其類似物取代。製備之特定順序及方式將由便利性、經濟性、所需純度及其類似因素決定。

亦可根據重組合成之習知方法在表現卡匣編碼截斷形式之原核與真核宿主中分離並純化裂解哺乳動物β防禦素。裂解哺乳動物β防禦素可由表現宿主產生且防禦素可使用如RP-HPLC、離子交換層析、尺寸排阻層析、親和性層析之液相層析方法或如結晶、沈澱及過濾技術之其他純化技術來純化。

在真核宿主細胞中表現時，編碼本發明之裂解哺乳動物β-防禦素之序列融合至編碼適當信號序列之序列上以確保胜肽分泌至周圍介質中。

在細菌宿主細胞中表現時，編碼序列可融合至適當標 記上以便純化，該序列包含起始甲硫胺酸。標記較佳包含裂解位點，諸如腸激酶裂解位點，從而允許隨後移除標記。在一個較佳具體實例中，裂解位點為酸裂解位點。該等位點可僅藉由使用酸來裂解，由此排除對昂貴之酶的需要。此亦可能係歸因於本發明之胜肽對於甚至在高溫下之酸水解的高穩定性。

裂解哺乳動物β防禦素亦可藉由部分或完全純化之哺乳動物β防禦素中之D-P(天冬胺酸-脯胺酸)胜肽鍵之酸水解來產生。可使用高溫下之酸水解作為哺乳動物β防禦素之標準純化製程中之附加步驟，隨後為其餘純化步驟。或者，可將酸水解用於最終純化之全長哺乳動物β防禦素中，且裂解胺基酸藉由其他純化步驟使用如RP-HPLC、離子交換層析、尺寸排阻層析、親和性層析之液相層析方法或如結晶、沈澱及過濾技術之其他純化技術來移除。酸水解之條件係就作為參數之各產品溶液之pH值、溫度及時間來最佳化，這是因為防禦素含量及純度影響水解速率。

聚核苷酸

本發明之胜肽可使用此項技術已知之方法由插入適當表現載體中之聚核苷酸來表現。適合聚核苷酸包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：a)編碼由與本發明之胜肽連接之N端真核信號序列組成的多胜肽之聚核苷酸；及b)編碼由與可裂解連接子連接之N端M及本發明之胜肽組成的多胜肽之聚核苷酸。

第一組聚核苷酸可用於在編碼序列具備適合信號序列時能夠分泌胜肽至介質中之真核宿主細胞中表現。針對適當表現宿主、真菌、酵母、昆蟲、哺乳動物及其他細胞選擇適合信號序列為此項技術中已知。有可能使用可獲得之諸如Signal P之預測算法來預測對信號序列之恰當加工。

第二組聚核苷酸可用於原核表現系統。N端甲硫胺酸及可裂解連接子可藉由酶裂解或化學裂解來移除。裂解位點較佳為可藉由便宜之酸代替酶來裂解之酸裂解位點。此舉之所以可能是因為本發明之胜肽耐受酸水解。在一個較佳具體實例中，表現構築體亦包含編碼親和力標記之序列。此標記可用於純化胜肽。親和力標記較佳與連接子及N端甲硫胺酸一起藉由裂解連接子而移除。

劑量

裂解哺乳動物β防禦素(諸如人類β防禦素)較佳以醫藥組成物形式以有效治療發炎性腸疾病且較佳對患者具有可接受之毒性之量使用。在該治療中，適當劑量將理所當然視例如以下因素而改變：所用本發明化合物之化學性質及藥物動力學資料、個別宿主、投藥模式及所治療病狀之性質及嚴重性。然而，一般而言，為了在較大哺乳動物(例如人類)中獲得令人滿意之結果，指定日劑量較佳為每公斤體重約0.0001 mg至每公斤體重約10 mg、更佳每公斤體重約0.001 mg至每公斤體重約10 mg(諸如每公斤體重0.005 mg至每公斤體重5 mg)、更佳每公斤體重約0.01 mg至每公斤體重約10 mg、較佳每公斤體重約0.1 mg至每 公斤體重約10 mg，例如分次投藥至多一天一次、兩次、三次或四次。與習知所使用相比，較佳具體實例之化合物可以相似劑量藉由相似投藥模式向較大哺乳動物(例如人類)投藥。

在一個具體實例中，日劑量較佳為每公斤體重0.0001 mg至10 mg、更佳每公斤體重0.001 mg至10 mg、更佳每公斤體重0.005 mg至5 mg。

在某些具體實例中，較佳具體實例之醫藥組成物可包括裂解哺乳動物β防禦素，諸如裂解人類β防禦素，視投藥途徑而定其量為每單位劑型約0.5 mg或小於0.5 mg至約1500 mg或大於1500 mg，較佳為約0.5 mg、0.6 mg、0.7 mg、0.8 mg或0.9 mg至約150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、450 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg或1000 mg，且更佳為約1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg、15 mg、20 mg或25 mg至約30 mg、35 mg、40 mg、45 mg、50 mg、55 mg、60 mg、65 mg、70 mg、75 mg、80 mg、85 mg、90 mg、95 mg或100 mg。然而，在某些具體實例中，低於或高於以上提及之劑量的劑量可能較佳。適當濃度及劑量可由熟習此項技術者容易地確定。

在一個具體實例中，裂解哺乳動物β防禦素係以每天至少一次來投藥，諸如每天至少兩次，例如每天至少3次，諸如每天至少4次。

本發明由以下實施例進一步說明，該等實施例不應解 釋為限制本發明之範疇。

實施例 實施例1 裂解人類β防禦素2之純化

人類β防禦素2(hBD2)hBD2以重組方式製造。將編碼hBD2之合成DNA片段(DNA 2.0)選殖至pET-32(+)表現載體(Novagen)中。所得質體編碼轉譯融合胜肽，該胜肽含有N端硫還原蛋白(thioredoxin)部分，繼之以His標記、腸激酶裂解位點及最終的hBD2胜肽。表現質體轉型成大腸桿菌菌株BL21。

將此菌株之隔夜培養物在含有100 μg/ml安比西林之TB-甘油中稀釋100倍，且在37℃下生長至OD600為約8，且用0.5 mM IPTG誘導3小時，此後藉由離心收穫細胞。將His標記之trx-hBD2融合胜肽在Ni-NTA珠粒(QIAGEN)上使用標準方案純化。隨後將His標記之純化融合胜肽滲析隔夜至腸激酶緩衝液(50 mM tris-HCl，pH 7.5，1 mM CaCb)中並以腸激酶裂解以釋放成熟hBD2。hBD2胜肽進一步藉由陽離子交換層析使用Source 15 S矩陣(Amersham Biosciences)來純化。hBD2之恰當分子量使用MALDI-TOF質譜分析術來驗證。hBD2分子之適當摺疊及雙硫橋形態隨後使用胰蛋白酶消化以及LC-MS及NMR光譜術來驗證。

內毒素係在低pH值下藉由製備型RP-HPLC移除，且內毒素含量係藉由LAL檢定(Endosafe KTA2)來測定，且發現含量低於檢定之偵測限值(0.05 EU/mg)。為確定低於 內毒素檢定之偵測限值的含量不能刺激PBMC，繪製用極有效之脂多糖(大腸桿菌、O111：B4、Sigma L4391)刺激之滴定曲線。極低含量之該LPS(0.06 pg/ml)能夠刺激PBMC產生可偵測之細胞介素。

將以約100 mg/mL於PBS中調配之純化人類β防禦素2用1體積pH 2.3之400 mM磷酸鈉稀釋。將pH值調節至2.3且在85℃下經受酸水解16小時。隨後藉由製備型RP-HPLC(15 μm C-18取代矽石樹脂，孔徑為100 Å)使用甲酸/乙醇基溶劑系統將裂解人類β防禦素2純化。將純化產物凍乾並溶於PBS中。人類β防禦素2之裂解形式係藉由LC-MS驗證，且純度藉由RP-UPLC估計為在280 nm下>99%且在215 nm下>96%。

實施例2 裂解hBD2之試管內分析 PBMC之分離及刺激

外周血液抽取自健康志願者(由丹麥有關倫理委員會批准)。肝素化血液經RPMI稀釋1/1 v/v且在抽取2小時內經受菲科爾密度離心(Ficoll density centrifugation)。血漿收集自個別供體之頭部且保持於冰上直至其以2%用於培養基(自體培養基)中。將已分離之PBMC再懸浮於自體培養基中且在96孔培養平板中接種，每孔255.000個細胞，總共200 μl。單獨用100 μg/ml、10 μg/ml或1 μg/ml之hBD2(全長或裂解)或與0.6 ng/ml或20 ng/ml下之LPS(大腸桿菌，O111：B4，Sigma L4391)一起刺激來 自同一供體之PBMC，作為對發炎性細胞介素3.5 ng/ml地塞米松(Sigma D8893)及1μg/ml英利昔單抗(Centocur B.V.，NCI039843LA)之下調的對照。該等化合物之濃度基於初始滴定研究，其中在不影響生存力之情況下使用最高可能濃度。在37℃下培育24小時之後收集上清液，且儲存於-80℃下直至細胞介素量測。生存力係藉由Alamar Blue(Biosource，DALL 1100)量測以保證抗發炎作用不歸因於毒性。

細胞介素量測

上清液中之TNF及IL-10產生係藉由流動式細胞測量術用人類發炎細胞測量珠粒陣列(CBA)按照製造商指示(BDBioSciences)在FACSarray流動式血細胞計數器(BDBiosciences)上量測。

數據分析

所有實驗皆在若干供體上進行至少兩次，展示代表性結果。所呈現之數據表示為平均數加/減標準偏差(SD)。統計顯著性藉由2因子ANOVA來測定，其中變數為處理(hBD2、地塞米松等)及刺激(LPS)，隨後為如表格圖例中所報導之Bonferroni後檢驗。p<0.05時認為差異具顯著性。

結果

吾人先前已清楚當將全長hBD2添加至以LPS或另一TLR配位體刺激之人類PBMC中時，其藉由下調TNF及上調IL-10來展示抗發炎作用(WO 2010/007166)。在圖1 及圖2中可見，裂解hBD2具有與全長hBD2相同之試管內抗發炎活性，且因此該兩種胜肽潛在地具有相同之活體內抗發炎活性。令人驚奇及意外的是，相對較短之hBD2胜肽的N端4個胺基酸對胜肽之生物活性並無明顯影響。鑒於人類及猴中該四個胺基酸之高保守程度，此情況甚至更為意外。特定而言，在全長β-防禦素2中之位置2處異白胺酸完全保存(圖3)。此通常表明胺基酸對胜肽之功能具重要性。

因此，裂解hBD2可在自體免疫疾病或病症中用作抗發炎化合物。該等病症(疾病)包括發炎性腸疾病(例如克隆氏病)及結腸炎(例如潰瘍性結腸炎)。

序列概覽

SEQ ID NO 1：人類β防禦素2(hBD2)

SEQ ID NO 2：恆河獼猴β防禦素2

SEQ ID NO 3：黑猩猩β防禦素2

SEQ ID NO 4：紅毛猩猩β防禦素2

SEQ ID NO 5：較佳裂解人類β防禦素2

SEQ ID NO 6：較佳裂解恆河獼猴β防禦素2

SEQ ID NO 7：較佳裂解黑猩猩β防禦素2

SEQ ID NO 8：較佳裂解紅毛猩猩β防禦素2

SEQ ID NO 9：裂解hBD2變異體(SEQ ID NO 5+1 N端AA)

SEQ ID NO 10：裂解hBD2變異體(SEQ ID NO 5+2 N端AA)

SEQ ID NO 11：裂解hBD2變異體(SEQ ID NO 5+3 N端AA)

圖1.自用全長或裂解hBD2(以供比較)處理之外周血液單核細胞(PBMC)產生IL-10。全長hBD2與裂解hBD2在用LPS刺激之PBMC中皆顯著誘導IL-10產生。使用地塞米松(Dexamehtasone)與英利昔單抗(infliximab)作為抗發炎效果(下調TNF)之對照，但在許多供體中吾人已觀察到英利昔單抗(抗TNF抗體)與地塞米松皆不上調IL-10，相反其下調IL-10。

圖2.自用全長或裂解hBD2(以供比較)處理之PBMC產生TNF。全長hBD2與裂解hBD2在用LPS刺激之PBMC中皆顯著減少TNF產生。使用地塞米松及英利昔單抗作為抗發炎效果(下調TNF)之對照。

圖3.人類(SEQ ID NO 1)、恆河獼猴(Rhesus macaque)(SEQ ID NO 2)、黑猩猩(SEQ ID NO 3)及紅毛猩猩(SEQ ID NO 4)β防禦素2之Clustal W(2.1)多序列比對。

圖4.較佳裂解人類(SEQ ID NO 5)、恆河獼猴(SEQ ID NO 6)、黑猩猩(SEQ ID NO 7)及紅毛猩猩(SEQ ID NO 8)β防禦素2之Clustal W(2.1)多序列比對。

*指示具有單一完全保守殘基之位置。

：指示以下『強』群中之一者具完全保守性：-STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。

.指示以下『較弱』群中之一者具完全保守性：-CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、VLIM、HFY。

<110> 諾佛酵素公司(Novozymes A/S)

<120> 新穎免疫調節胜肽

<130> P2659US01

<150> EP 11178133.2

<151> 2011-08-19

<150> US 61/559,818

<151> 2011-11-15

<160> 11

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 41

<212> PRT

<213> 恆河獼猴

<400> 2

<210> 3

<211> 41

<212> PRT

<213> 黑猩猩

<400> 3

<210> 4

<211> 44

<212> PRT

<213> 婆羅洲猩猩

<400> 4

<210> 5

<211> 37

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (1)..(37)

<223> N端截斷hBD2

<400> 5

<210> 6

<211> 37

<212> PRT

<213> 恆河獼猴

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (1)..(37)

<223> N端截斷恆河獼猴BD2

<400> 6

<210> 7

<211> 37

<212> PRT

<213> 黑猩猩

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (1)..(37)

<223> N端截斷黑猩猩BD2

<400> 7

<210> 8

<211> 37

<212> PRT

<213> 黑猩猩

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (1)..(37)

<223> N端截斷紅毛猩猩BD2

<400> 8

<210> 9

<211> 38

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (1)..(38)

<223> 裂解hBD2變異體(SEQ ID NO 5+1N端AA)

<400> 9

<210> 10

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (1)..(39)

<223> 裂解hBD2變異體(SEQ ID NO 5+2N端AA)

<400> 10

<210> 11

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (1)..(40)

<223> 裂解hBD2變異體(SEQ ID NO 5+3N端AA)

<400> 11

Claims (39)

1. 一種胜肽，其選自由以下組成之群：a)胺基酸序列為SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11中之任一者的胜肽；b)與該等SEQ ID NO相比具有1至5個胺基酸取代之a)胜肽的抗發炎胜肽變異體；c)與SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 8中之任一者具有至少80%序列一致性且具有選自由IGDPVT-、GDPVTC-、DPVTCL-或PVTCL-組成之群、較佳具有PVTCL-之N端的抗發炎胜肽變異體；及d)具有以下共同序列之抗發炎胜肽：PVTCLX₁X₂GAICHPX₃FCPRRYKX₄IGTCGLX₅X₆X₇KCCKKP，其中獨立地X₁為K或R，X₂為S或N，X₃為V或G，X₄為Q或H，X₅為P或S，X₆為G或V，及X₇為T或I。
2. 如申請專利範圍第1項之胜肽，其選自由具有以下任一胺基酸序列之胜肽組成之群：SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 8，較佳具有SEQ ID NO 5。
3. 如申請專利範圍第1項之胜肽，其選自由與SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 8中之任一者相比、較佳與SEQ ID NO 5相比具有1-5個胺基酸取代之抗發炎胜肽變異體組成之群。
4. 如申請專利範圍第3項之胜肽，其與SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8相比、較佳與SEQ ID NO 5相比具有1-4個、更佳1-3個、更佳1-2個、更佳1個胺基酸取代。
5. 如申請專利範圍第1項之胜肽，其具有共同序列：PVTCLX₁X₂GAICHPX₃FCPRRYKX₄IGTCGLX₅X₆X₇KCCKKP，其中獨立地X₁為K或R，X₂為S或N，X₃為V或G，X₄為Q或H，X₅為P或S，X₆為G或V，及X₇為T或I。
6. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其與SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 8中之任一者具有至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%序列一致性。
7. 如申請專利範圍第6項之胜肽，其中該序列一致性係就SEQ ID NO 5而言。
8. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其具有選自由IGDPVT-、GDPVTC-、DPVTCL-或PVTCL-組成之群、較佳具有PVTCL-之N端。
9. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其中該胜肽不包含N端GIGD序列，較佳其中該胜肽不包含任何GIGD序列。
10. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其不超過40個胺基酸長、較佳不超過39個胺基酸、更佳不超過38個胺基酸、更佳不超過37個胺基酸長。
11. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其為37個胺基酸長。
12. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其為37個胺基酸長且具有N端：PVTCL-。
13. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其為37個胺基酸長且胺基酸序列與SEQ ID NO 5相比具有至多5個胺基酸取代、較佳至多4個胺基酸取代、更佳至多3個胺基酸取代、更佳至多2個胺基酸取代、更佳1個胺基酸取代。
14. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其為37個胺基酸長且胺基酸序列為SEQ ID NO 5。
15. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其呈二聚體、較佳同源二聚體之形式。
16. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其係共價鍵聯至另一化學部分，諸如不同胜肽或多胜肽、親和力標記、碳水化合物、脂質及合成聚合物。
17. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其中該胜肽有效下調至少一種選自由IL-23、IL-1 β、IL-6、lL-8、MCP-1及TNF α組成之群、較佳TNF α之細胞介素或趨化因子的活性。
18. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其中該胜肽有效上調IL-10之活性。
19. 如申請專利範圍第17項及第18項中任一項之胜肽，其中該活性係在選自由人類PBMC、源自人類CD14+單核球之樹突狀細胞、人類單核球細胞株及人類未成熟樹突狀細胞組成之群、較佳為人類PBMC之人類細胞中測定。
20. 如前述申請專利範圍中任一項之胜肽，其中在相同濃度(μg/mL)下該胜肽對促發炎性細胞介素或趨化因子及/或抗發炎細胞介素之作用為hBD2(SEQ ID NO 1)之作用的至少50%、更佳至少60%、更佳至少70%、更佳至少75%、更佳至少80%、更佳至少90%、更佳其中該胜肽之作用不顯著低於hBD2(SEQ ID NO 1)之活性。
21. 一種製造如前述申請專利範圍中任一項之胜肽的方法，該方法包含重組表現、使用自動胺基酸合成器或全長哺乳動物β-防禦素2之酸裂解。
22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該重組表現為原核或真核的。
23. 如申請專利範圍第21項之方法，其包含自哺乳動物β-防禦素2裂解該N端四個胺基酸且隨後純化該裂解胜肽，較佳其中該裂解為在高溫下之酸裂解。
24. 如前述申請專利範圍第21項至第23項中任一項之方法，其進一步包含純化該裂解胜肽且隨後驗證該N端、適當摺疊及/或半胱胺酸橋之恰當存在。
25. 一種聚核苷酸，其包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：a)編碼由與如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之胜肽連接之N端真核信號序列組成之多胜肽之聚核苷酸；及b)編碼由與可裂解連接子連接之N端M及如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之胜肽組成之多胜肽之聚核苷酸。
26. 如申請專利範圍第25項之聚核苷酸，其進一步包含位於該N端M與該可裂解連接子之間的親和力標記。
27. 如申請專利範圍第25項之聚核苷酸，其中該連接子可由酸或酶裂解。
28. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第25項之聚核苷酸。
29. 一種細胞，其以如申請專利範圍第28項之表現載體轉換(transduce)或轉染。
30. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之胜肽及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
31. 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之胜肽，其係用作醫藥品。
32. 如申請專利範圍第31項之胜肽，其用於治療自體免疫病症。
33. 如申請專利範圍第31項之胜肽，其用於治療發炎性病症。
34. 如申請專利範圍第33項之胜肽，其中該發炎性病症係選自由以下組成之群：發炎性腸疾病(IBD)、類風濕性關節炎、牛皮癬、骨關節炎、多發性硬化、動脈粥樣硬化(artherosclerosis)、硬皮病(全身性硬化)、狼瘡、全身性紅斑狼瘡(SLE)、(急性)腎小球性腎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫症候群(ARDS)、血管炎、眼色素層炎、皮膚炎、異位性皮膚炎、脫髮、鼻炎(過敏性)、過敏性結膜炎、重症肌無力、硬皮病、肉狀瘤病、牛皮癬性關節炎、關節黏連性脊椎炎、幼年特發性關節炎、葛瑞夫茲氏病(Graves disease)、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)及白塞氏病(Behget disease)。
35. 如申請專利範圍第34項之用途，其中該病症為發炎性腸疾病或病症。
36. 如申請專利範圍第35項之用途，其中該發炎性腸病症為克隆氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎。
37. 如申請專利範圍第34項之用途，其中該病症為類風濕性關節炎。
38. 如申請專利範圍第31項至第37項中任一項之用途，其中該截斷哺乳動物β防禦素適宜至少每天投藥一次，諸如至少每天兩次，例如至少每天3次。
39. 如申請專利範圍第31項至第38項中任一項之用途，其中該截斷哺乳動物β防禦素適宜以日劑量約0.0001 mg/kg至10 mg/kg、較佳0.001 mg/kg至10 mg/kg、更佳0.005 mg/kg至5 mg/kg來投藥。