KR20100134025A

KR20100134025A - 뇌막염에 대한 방어소의 용도

Info

Publication number: KR20100134025A
Application number: KR1020107022668A
Authority: KR
Inventors: 한스-헨릭 크리스텐센 호겐하우그; 도르테 샌드뱅
Original assignee: 노보자임스 아데니움 바이오테크 에이/에스
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-03-30
Publication date: 2010-12-22
Also published as: CA2720380A1; PE20091781A1; ZA201006645B; BRPI0909021A2; IL208189A0; CL2009000811A1; MX2010010795A; US20090253629A1; EA201071163A1; AU2009231463A1; WO2009121828A1; CN102036678A; EP2278991A1; JP2011516450A; AR071177A1; AP2010005403A0; TW200942254A

Abstract

본 발명은 방어소(defensin) 폴리펩티드로 박테리아성 뇌막염과 같은 뇌막염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

뇌막염에 대한 방어소의 용도{USE OF DEFENSINS AGAINST MENINGITIS}

본 발명은 방어소 폴리펩티드를 이용한 뇌막염의 치료에 관한 것이다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 컴퓨터로 해독가능한 형태의 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터로 해독가능한 형태는 참조로서 본 발명에 포함된다.

뇌막염은 뇌막으로 전체적으로 알려져 있는, 중추 신경계를 덮는 보호막의 염증이다. 뇌막염은 다수의 원인, 가장 두드러지게는 박테리아 및 바이러스에 의한 반응으로 유발될 수 있다. 뇌막염은 뇌 및 척수에서 염증의 접근 때문에 위중한 상태이다. 심각한 신경학적 손상 또는 심지어 죽음의 가능성이 신속한 의학적 주의 및 평가를 필요로 한다. 박테리아성 뇌막염은 일반적으로 항생제로 치료하고, 철저한 관리를 요구한다. 다수의 미생물들이 박테리아성 뇌막염을 유발할 수 있으나, 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae)("pneumococcus") 및 수막염균(Neisseria meningitidis)("meningococcus")이 면역 결핍이 아닌 환자에서 가장 일반적인 병원체이다. 박테리아성 뇌막염은 연간 전세계적으로 171,000명으로 추정되는 사망의 원인이 되는 세계 보건의 심각한 위협이다.

폐렴연쇄구균(S. pneumoniae)은 어린 아이에서 감염성 박테리아 감염의 원인으로 일반적인 미생물이다. 어린이의 폐렴연쇄구균성 뇌막염에 대한 사망률은 수막구균성 뇌막염보다 적어도 2배 높고, 생존자는 후유증이 높게 발생한다. 최근의 연구는 대부분의 유럽 국가에서의 5세 미만의 어린이에서 폐렴연쇄구균성 뇌막염의 발생에 대한 데이터를 발표했다. 전반적으로, 가장 낮게 발병한 곳은 핀란드이고(0.3/100000), 가장 높게 발병한 곳은 프랑스이다(12.0/100000). 페니실린-저항성 폐렴연쇄구균은 종종 다중-저항성이어서, 치료시 심각한 문제를 일으킨다. 또한, 마크로라이드(macrolides)에 대한 저항성이 광범위하게 퍼지는데, 특히 지중해 연안 지역에서 높다.

본 발명의 목적은 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)을 침투할 수 있는 폴리펩티드 및, 뇌막염의 치료에서 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명자들은 합성 방어소가 폐렴연쇄구균성 뇌막염에 탁월한 활성을 보이고, 박테리아성 뇌막염의 치료에 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

첫 번째 측면에서, 본 발명은 뇌막염의 치료적 처치를 위한 약제의 제조를 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 항균성 폴리펩티드의 용도를 제공한다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 뇌막염의 치료를 위해 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 항균성 폴리펩티드를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항균성 폴리펩티드의 즉, 항-뇌막염 효과량인 효과량으로 치료할 필요가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌막염의 치료 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 폴리펩티드는 방어소 폴리펩티드, 바람직하게는 베타-방어소 폴리펩티드이다. 다른 실시예에서, 폴리펩티드는 혈액-뇌-장벽을 침투할 수 있다.

본 발명에 따른 뇌막염은 박테리아성 뇌막염, 바람직하게는 스트렙토코쿠스 바람직하게는 폐렴연쇄구균(S. pneumoniae)에 의해 발병되는 뇌막염인 폐렴연쇄구균성 뇌막염일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 뇌막염은 페니실린-저항성 폐렴연쇄구균에 의해 발병된다.

본 발명에 따른 용도 또는 본 발명에 따른 뇌막염 치료용 폴리펩티드는 이후 "본 발명의(에 따른) 폴리펩티드"로 지칭하였다.

정의

항균성: 용어 "항균성"은 미생물 세포를 사멸시키거나 그 성장을 억제할 수 있는 활성으로 본 발명에 정의된다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "항균"은 살균 및/또는 정균 및/또는 살진균 및/또는 정진균 효과 및/또는 바이러스살균 효과가 있다는 것을 의미하도록 의도되며, 여기서 용어 "살균"은 박테리아 세포를 죽일 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "정균"은 박테리아의 성장을 억제, 즉 박테리아 세포의 성장을 억제할 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "살진균"은 진균 세포를 죽일 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "정진균"은 진균 성장을 억제, 즉 진균 세포의 성장을 억제할 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "바이러스 살균"은 바이러스를 비활성화할 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "미생물 세포"는 박테리아 또는 진균 세포(효모 포함)를 나타낸다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "미생물 세포의 성장의 억제"는 세포가 비-성장 상태에 있고, 즉 그것이 증식할 수 없다는 것을 의미하도록 의도된다.

바람직한 구체예에서, 용어 "항균성"은 살균 및/또는 정균 활성으로 정의된다. 더욱 바람직하게는 "항균성"은 연쇄상구균, 바람직하게는 폐렴연쇄구균에 대한 살균 및/또는 정균 활성으로 정의된다.

본 발명의 목적을 위해서, 항균성은 문헌(Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137(2) pp. 167-174(1991))에 설명된 과정에 따라서 결정될 수 있다. 다르게는, 항균성은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute;전에는 National Committee for Clinical and Laboratory Standards로 알려짐)로부터 NCCLS 가이드라인에 따라서 결정될 수 있다.

항균성 폴리펩티드는 500 μg/ml의 농도, 바람직하게는 250 μg/ml의 농도, 더욱 바람직하게는 100 μg/ml의 농도, 한층 더 바람직하게는 50 μg/ml의 농도, 가장 바람직하게는 25 μg/ml의 농도, 특히 10 μg/ml의 농도의 항균성 폴리펩티드로 적절한 미생물 성장 기질에서 37℃로 8시간(바람직하게는 4시간, 더욱 바람직하게는 2시간, 가장 바람직하게는 1시간, 및, 특히 30분) 동안 배양한 후에 폐렴연쇄구균(S. pneumoniae)(ATCC 49619)의 살아있는 세포 수를 1/100로 감소시킬 수 있다.

또한, 항균성 폴리펩티드는 500 μg/ml의 농도, 바람직하게는 250 μg/ml의 농도, 더욱 바람직하게는 100 μg/ml의 농도, 한층 더 바람직하게는 50 μg/ml의 농도, 가장 바람직하게는 10 μg/ml의 농도, 특히 5 μg/ml의 농도로 첨가했을 때 적절한 미생물 성장 기질에서 37℃로 8시간 동안 배양한 후에 폐렴연쇄구균(S. pneumoniae)(ATCC 49619)의 과성장을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 항균성을 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 한층 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 한층 더 가장 바람직하게는 적어도 100% 갖는다.

방어소(Defensin): 본 발명에 사용된 용어 "방어소"는 항미생물 펩티드의 방어소 부류에 속하는 당업자에 의하여 인식된 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드가 본 발명에 따른 방어소인지를 결정하기 위하여, 아미노산 서열은 바람직하게는 자유롭게 사용가능한 HMMER 소프트웨어 패키지를 사용함으로써 PFAM 데이터베이스의 은닉 마르코프 모델 프로파일(HMM 프로파일)과 비교된다(실시예 1 참조).

PFAM 방어소 패밀리는 Defensin_1 또는 "포유동물 방어소"(기탁번호 PF00323), Defensin_2 또는 "절지동물 방어소"(기탁번호 PF01097), Defensin_β 또는 "베타 방어소"(기탁번호 PF00711), Defensin_propep 또는 "방어소 프로펩티드"(기탁번호 PF00879) 및 gamma-thionin 또는 "감마-티오닌 패밀리"(기탁번호 PF00304)를 포함한다.

방어소는 알파-방어소 부류, 베타-방어소 부류, 세타-방어소 부류, 곤충 또는 절지동물 방어소 부류, 또는 식물 방어소 부류에 속할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 방어소의 아미노산 서열은 4, 5, 6, 7 또는 8개의 시스테인 잔기, 바람직하게는 4, 5, 또는 6개의 시스테인 잔기, 더욱 바람직하게는 4 또는 6개의 시스테인 잔기, 가장 바람직하게는 6개의 시스테인 잔기를 포함한다.

또한, 방어소는 방어소 부류 중 어떤 것의 특징적인 특성을 공유하는 합성 방어소일 수 있다.

이러한 방어소의 예시는 α-방어소 HNP-1(사람 중성구 펩티드) HNP-2 및 HNP-3; β-방어소-12, 드로소미신(Drosomycin), 헬리오미신(Heliomycin), γ1-퓨로티오닌(Purothionin), 곤충 방어소 A, 및 PCT 출원 WO 99/53053, WO 02/06324, WO 02/085934, WO 03/044049, WO 2006/050737, 및 WO 2006/053565에 개시된 방어소를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

분리된 폴리펩티드: 본 발명에 사용된 용어 "분리된 변이체" 또는 "분리된 폴리펩티드"는 공급원으로부터 분리된 변이체 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 한 측면에서, 변이체 또는 폴리펩티드는 SDS-PAGE를 통해 결정한 바, 적어도 1% 순수한, 바람직하게는 5% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 10% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 20% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 순수한, 한층 더 바람직하게는 적어도 80% 순수한, 및 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수하다.

실질적으로 순수한 폴리펩티드: 본 발명에서 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 자연적 또는 재조합적으로 회합된 다른 폴리펩티드 물질을 최대 10 중량%, 바람직하게는 최대 8 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 6 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 5 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 4 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 3 중량%, 한층 더 바람직하게는 최대 2 중량%, 가장 바람직하게는 최대 1 중량%, 한층 더 가장 바람직하게는 0.5 중량%로 포함하는 폴리펩티드 제제를 의미한다. 따라서, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 제제에서 존재하는 전체 폴리펩티드 물질 중에서 적어도 92 중량% 순수한, 바람직하게는 적어도 94 중량% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 96 중량% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 96 중량% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 97 중량% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 98 중량% 순수한, 한층 더 바람직하게는 적어도 99 중량% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 99.5 중량% 순수한 및 한층 더 가장 바람직하게는 100 중량% 순수한 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태이다. 이는 예를 들면, 잘 알려진 재조합 방법 또는 고전적 정제 방법에 의해 폴리펩티드를 제조함으로써 이루어질 수 있다.

동일성: 두 아미노산 서열 간 또는 두 뉴클레오티드 서열 간의 연관성은 매개변수 "동일성"으로 설명된다.

본 발명의 목적을 위해서, 두 아미노산 서열 간의 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org)의 Needle 프로그램, 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전에서 수행되는 바와 같이, Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 매개 변수는 10의 갭 오픈 벌점, 0.5의 갭 연장 벌점 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻어짐)의 출력을 퍼센트 동일성으로서 사용하며, 하기와 같이 계산된다:

(동일한 잔기 × 100)/(배열 길이 - 배열 중 갭의 전체 수)

본 발명의 목적을 위하여, 두 디옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000; http://emboss.org), 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전의 Needle 프로그램에서 수행되는 바와 같이, Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 매개 변수는 10의 갭 오픈 벌점, 0.5의 갭 연장 벌점 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻어짐)의 출력을 퍼센트 동일성으로서 사용하며, 하기와 같이 계산된다:

(동일한 디옥시리보뉴클레오티드×100)/(배열 길이-배열 중 갭의 전체 수).

대립유전자 변이체: 용어 "대립유전자 변이체"는 본 발명에서 동일한 염색체의 유전자좌를 차지하는 유전자의 두 개 이상의 대안 형태 중 어떤 것을 의미한다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 집단내에 다형성을 야기할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵할 수 있거나(코딩된 폴리펩티드에 변화 없음) 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 폴리펩티드의 대립유전자 변이체는 유전자의 대립유전자 변이체에 의하여 코딩된 폴리펩티드이다.

변형: 용어 "변형"은 본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 어떤 화학적 변형 뿐 아니라, 그 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 유전적 조작을 의미한다. 변형은 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입 뿐 아니라, 아미노산 측쇄의 치환; 아미노산 서열에서 유사한 특징을 갖는 비천연 아미노산의 사용일 수 있다. 특히, 변형은 C-말단의 아미드화와 같은 아미드화 일 수 있다.

항균성 폴리펩티드

첫 번째 측면에서, 본 발명은 항균성을 갖고, 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 특히 적어도 97%로 서열번호 1(즉, 성숙 폴리펩티드)에 대한 동일성의 정도를 갖는 아미노산 서열을 갖는, 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다(이후 "상동성 폴리펩티드"로 지칭). 바람직한 측면에서, 상동성 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 최대 6개 아미노산, 바람직하게는 최대 5개 아미노산, 더욱 바람직하게는 최대 4개 아미노산, 한층 더 바람직하게는 최대 3개 아미노산, 가장 바람직하게는 최대 2개 아미노산, 및 특히 1개 아미노산이 다른 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 대립유전자 변이체를 포함한다. 바람직한 측면에서 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 측면에서 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 대립유전자 변이체로 구성된다. 다른 바람직한 측면에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다.

바람직하게는 아미노산 변화는 폴리펩티드의 접힘 및/또는 활성에 유의한 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환 또는 삽입; 단일 결실; 작은 아미노- 또는 카복시-말단의 연장; 약 20 내지 25개 이하 잔기의 작은 링커 펩티드; 또는 순 전하 또는 폴리-히스티딘 태그, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인과 같은 다른 기능을 바꾸는 것을 통해 정제를 촉진하는 작은 연장과 같은 부수적 성질의 것이다.

보존적 치환의 예시는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소루신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 소형 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 그룹 내에 있다. 일반적으로 특정 활성을 바꾸지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌(H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York)에 의해 설명된다. 가장 흔하게 발생하는 변화는 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.

20개의 표준 아미노산에 추가하여, 비표준 아미노산(예컨대 4-하이드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린, 및 알파-메틸 세린)이 야생형의 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 대해 치환될 수 있다. 제한적인 수의 비보존적 아미노산, 유전자 암호에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 및 비천연 아미노산이 아미노산 잔기에 대하여 치환될 수 있다. "비천연 아미노산"은 단백질 합성후에 변형되고, 및/또는 그들의 측쇄내에 표준 아미노산의 것과는 다른 화학 구조를 갖는다. 비천연 아미노산은 화학적으로 합성될 수 있고, 바람직하게는 시판되는 것일 수도 있으며, 피페콜릭산(pipecolic acid), 티아졸리딘 카르복실산(thiazolidine carboxylic acid), 디하이드로프롤린(dehydroproline), 3- 및 4-메틸프롤린, 및 3,3-다이메틸프롤린(dimethylproline)을 포함한다.

모 폴리펩티드에서의 필수 아미노산은 위치지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085)과 같은 당업계에 공지된 과정에 따라서 확인될 수 있다. 후자의 기술의 경우, 단일 알라닌 돌연변이가 분자 내 모든 잔기에서 도입되었고, 결과적인 돌연변이 분자를 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성(즉, 항균성)에 대하여 시험하였다. 또한, 문헌(Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708)을 참조하라. 또한, 생물학적 상호작용은 추정되는 접촉위치의 아미노산을 돌연변이시키는 것과 연계하여, 핵자기공명, 결정학, 전자회절, 또는 광친화성 표지와 같은 기술로 결정되는 바와 같이, 구조의 물리적 분석에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 문헌(de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64)을 참조하라. 또한, 필수아미노산의 동일성은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 연관된 폴리펩티드와의 동일성 분석으로부터 추측될 수 있다.

단일 또는 다중 아미노산 치환은 돌연변이유발, 재조합, 및/또는 셔플링과 이어서 문헌(Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625)에 개시된 것들과 같은 관련 스크리닝 과정의 공지된 방법을 사용하여 만들고 시험할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 실수-유발 PCR, 파지 디스플레이(예를 들면, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; 미국 특허 5,223,409; WO 92/06204), 및 영역지정 돌연변이(Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)를 포함한다.

돌연변이유발/셔플링 방법은 숙주세포를 통해 발현된, 클로닝되고 돌연변이가 일어난 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위하여 고처리율, 자동화 스크리닝 방법과 조합될 수 있다. 활성 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이된 DNA 분자는 숙주세포로부터 회수될 수 있고 당업계의 표준 방법을 사용하여 신속하게 시퀀싱될 수 있다. 이들 방법은 관심있는 폴리펩티드에서 개별 아미노산 잔기의 중요성의 신속한 결정을 가능하게 하며, 미지의 구조의 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리페티드는 방어소 폴리펩티드, 바람직하게는 베타-방어소 폴리펩티드이다.

N-말단 연장

본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 연장은 적합하게는 1 내지 50 아미노산, 바람직하게는 2-20 아미노산, 특히 3-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 한 구체예에서, N-말단 펩티드 연장은 Arg(R)을 함유하지 않는다. 다른 구체예에서, N-말단 연장은 아래에서 더 설명된 바와 같이, kex2 또는 kex2-유사 절단 위치를 포함한다. 바람직한 구체예에서, N-말단 연장은 하기 서열 중 하나를 포함하는 N-말단 연장과 같이 Glu(E) 및/또는 Asp(D) 아미노산 잔기 중 적어도 두 개를 포함하는 펩티드이다: EAE, EE, DE 및 DD.

Kex2 위치

Kex2 위치(예를 들면, Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), SanDiego, CA, "Gene Expression Technology" 참조) 및 kex2-유사 위치는 일부 단백질의 프로펩티드 코딩 영역 및 성숙한 영역 사이에 발견되는 2-염기 인식 위치(즉, 절단 위치)이다.

kex2 위치 또는 kex2-유사 위치의 삽입은 어떤 경우에 증가된 단백질 분비 수준을 야기하는 프로-펩티드 절단 위치에서의 정확한 엔도펩티다제 가공을 향상시키는 것을 보여주었다.

본 발명의 문맥에서, kex2 또는 kex2-유사 위치의 삽입은, 서열번호 1에 나타난 성숙한 폴리펩티드와 비교하여 연장된 항균 폴리펩티드를 야기하는 N-말단 연장에서 어떤 위치의 절단을 확보할 가능성을 야기한다.

융합 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 또한, 다른 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 융합 폴리펩티드 또는 절단가능한 융합 폴리펩티드를 포함한다. 융합 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 부분)을 본 발명의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 부분)에 융합함으로써 생성된다. 융합 폴리펩티드를 생성하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 그것들이 프레임 안에 들어가고 융합된 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들)와 종결자의 조절하에 있도록, 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 리게이션하는 것을 포함한다.

방법 및 사용

본 발명은 뇌막염의 치료를 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 항균의 수의학적 또는 인간용 치료제 또는 예방제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방어소 변이체는 뇌막염의 치료를 위한 수의학적 또는 인간용 치료제 또는 예방제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 폐렴연쇄구균와 같은 스트렙토코쿠스 종을 죽이거나 성장을 억제하는데 충분한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 제형은 예를 들면, 폐렴연쇄구균성 뇌막염인 박테리아성 뇌막염과 같은 뇌막염을 앓고 있거나, 뇌막염에 취약한 숙주에게 투여된다. 일 구체예에서, 뇌막염은 페니실린-저항성 폐렴연쇄구균의 감염으로 발병된다.

투여는 국소 또는 전신일 수 있다. 일반적으로 본 발명의 항균 폴리펩티드의 투여량은 미생물 군집을 적어도 1 log 감소시키는데 충분할 것이며, 적어도 2 log 또는 그 이상을 죽일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 어떤 부작용을 최소화 시키면서 미생물 군집을 감소시키는 투여량으로 투여된다. 조성물은 생체내 사용을 위한 의사의 지침에 따라서 얻어지고 사용될 것으로 생각된다.

투여를 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 폴리펩티드 제형물은 경구로 제공될 수 있고, 혈관내, 근육내, 피하, 복막내, 에어로졸을 통해서, 안구, 방광 내, 국소 등으로 주사될 수 있다. 치료적 제형의 투여량은 투여되는 특정 항균 폴리펩티드, 투여 빈도, 투여 방법, 숙주에서 제제의 제거율 등에 의존하여 널리 다양할 것이다. 초기 투여량은 더 많을 수 있지만, 그 후에는 더 적은 유지 투여량일 수 있다. 많은 경우에, 경구 투여는 정맥내로 투여되는 경우보다 더 높은 투여량을 요구할 것이다. 아미노 및 카복시 말단 뿐만 아니라 아미드 결합은 경구 투여시 더 큰 안정성을 위하여 변형될 수 있다. 예를 들면, 카르복시 말단은 아미드화 될 수 있다.

제형

본 발명의 폴리펩티드는 치료적 투여를 위한 다양한 제형으로 포함시킬 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 적합한, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 약학적 조성물로 제조될 수 있으며, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 크림, 발포정, 용액, 좌약, 주사, 흡입제, 겔, 미소구체, 로션 및 에어로졸과 같은 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 이유로, 폴리펩티드의 투여는 경구, 구강, 직장, 비경구, 복막내, 진피내, 경피, 기관내 등의 투여를 포함한 다양한 방식으로 성취될 수 있다. 본 발명의 항균 폴리펩티드는 투여 후 전신성일 수 있거나, 국소적일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 단독으로, 서로 조합하여 투여될 수 있고, 또는 다른 공지된 화합물(예를 들면, 페르포린(perforin), 항-염증제, 항생제 등)과 조합하여 사용될 수 있다. 약학적 투여 형태에서, 폴리펩티드는 그것들의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. 하기 방법 및 첨가제는 단지 예시이며, 제한하려는 것은 아니다.

경구용 제제를 위해, 폴리펩티드는 단독으로, 또는 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 만드는 적당한 첨가제, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 옥수수 녹말 또는 감자 녹말과 같은 종래의 첨가제; 결정질 셀룰로스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 녹말 또는 젤라틴과 같은 결합제; 옥수수 녹말, 감자 녹말 또는 나트륨 카복시메틸셀룰로스와 같은 붕해제; 탈크 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제; 및 원하는 경우 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제 및 향료와 조합하여 사용될 수 있다.

폴리펩티드는 이를 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방산 글리세리드, 고급 지방산 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르와 같은 수성 또는 비수성 용매에; 그리고, 원하는 경우 용해제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정제 및 보존제와 같은 종래의 첨가제와 함께 용해, 현탁 또는 유화시켜 주사용 제제로 제형화될 수 있다.

폴리펩티드는 흡입을 통해 투여되도록 에어로졸 형태로 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 압축된 허용가능한 추진제로 제형화될 수 있다.

나아가, 폴리펩티드는 유화 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 혼합하는 것을 통해 좌약으로 만들어질 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 좌약으로 직장 투여될 수 있다. 좌약은 체온에서는 녹지만 실온에서는 응고되는 코코아 버터, 카보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 부형제를 포함할 수 있다.

시럽, 엘릭시르 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여를 위한 단위 투여량 형태가 제공될 수 있는데, 각 투여량 단위, 예를 들면, 티스푼, 테이블 스푼, 정제 또는 좌약은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 사전에 결정된 양을 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여를 위한 단위 투여량 형태는 멸균수, 보통의 식염수, 또는 다른 약학적으로 허용가능한 담체 중의 용액으로서 조성물에 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.

서방형 제형을 위한 이식물은 당업계에 잘 알려져 있다. 이식물은 생분해가능하거나 생분해가능하지 않은 중합체를 가진 미소구체, 슬래브 등으로 제형화된다. 예를 들면, 락트산 및/또는 글리콜산의 중합체는 숙주에 잘 용인되는 분해성 폴리머를 형성한다. 본 발명의 항균 폴리펩티드를 함유하는 이식물은 활성제의 국소적인 농도가 몸의 나머지 부분에 비하여 증가되도록 감염 부위에 인접하게 배치된다.

본 발명에 사용된 용어 "단위 투여량 형태"는 사람 및 동물 개체에 대하여 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하는데, 각 단위는 약학적으로 허용된 희석제, 담체 또는 부형제와 회합하여 원하는 효과를 내기에 충분한 양으로 계산된 사전에 결정된 양의 본 발명의 폴리펩티드를 함유한다. 본 발명의 단위 투여 형태의 상세사항은 사용되는 특정 폴리펩티드 및 달성되어야하는 효과, 및 숙주에서 폴리펩티드와 연관된 약동학에 의존한다.

부형제, 보조제, 담체 또는 희석제와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제는 시중에서 용이하게 구입할 수 있다. 더욱이, pH 조절제 및 완충제, 삼투조절제, 안정제, 습윤제 등과 같은 약학적으로 허용가능한 보조물질은 시중에서 용이하게 구입할 수 있다.

전신 투여를 위한 전형적인 투여량의 범위는 투여당 개체의 체중 kg 당 0.1 pg 내지 100 mg이다. 전형적인 투여량은 한 개의 정제를 매일 2 내지 6회 투여, 또는 하루에 한 번 비교적 높은 함량의 활성 성분을 함유하는 한 개의 시간-방출 캡슐 또는 정제 투여일 수 있다. 시간-방출 효과는 상이한 pH 값에서 용해하는 캡슐 물질에 의하여, 삼투압에 의하여 천천히 분비되는 캡슐에 의하여, 또는 방출이 조절되는 임의의 공지된 수단에 의하여 얻어질 수 있다.

당업자라면 투여량 수준은 특정 폴리펩티드, 증상의 심각성 및 부작용에 대한 개체의 민감성의 함수로서 다양할 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 특정 폴리펩티드 중 일부는 다른 것들보다 더 효능이 있다. 주어진 폴리펩티드의 바람직한 투여량은 다양한 수단에 의하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 바람직한 수단은 주어진 폴리펩티드의 생리학적 효능을 측정하는 것이다.

전달 부형제로서 리포솜을 사용하는 것은 관심있는 하나의 방법이다. 리포솜은 표적 부위의 세포와 융합하여 루멘의 함유물을 세포내로 전달한다. 리포솜은 분리, 결합제 등과 같은 접촉을 유지하는 다양한 수단을 사용하여 융합에 충분한 시간 동안 세포와 접촉하여 유지된다. 본 발명의 한 구체예에서, 리포솜은 폐 투여를 위하여 에어로졸화되도록 설계된다. 리포솜은 센다이 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 등과 같은, 막의 융합을 매개하는 정제된 단백질 또는 펩티드로 제조될 수 있다. 지질은 포스파티딜콜린과 같은 양이온 또는 쌍성이온 지질을 포함한 공지된 리포솜 형성 지질의 어떤 유용한 조합일 수 있다. 나머지 지질은 보통 콜레스테롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤 등과 같은 중성 또는 산성 지질일 것이다.

리포솜을 제조하기 위하여, 문헌(Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361)에 설명된 과정이 사용될 수 있다. 간단히 말하면, 펩티드를 함유하는 지질 및 루멘 조성물은 적당한 수성 매질, 편리하게는 식염수 매질에서 조합되고, 이때 전체 고체는 약 1-10 중량%의 범위이다. 짧은 시간 동안, 약 5-60초 동안 강하게 교반한 후, 튜브를 약 25-40℃의 온수조에 넣고 이 사이클을 약 5-10회 반복한다. 그 후 조성물을 편리한 시간 동안, 일반적으로는 약 1-10 초 동안 초음파분해하고, 와동하여 더 교반할 수 있다. 그 후 수용성 매질을 첨가하여, 일반적으로 약 1-2 배 부피를 증가시키고, 이어서 진탕 및 냉각시킴으로써 부피를 증량한다. 이 방법은 고분자량 분자를 루멘으로 포함시키게 해 준다.

다른 활성제를 함유한 제형

대상 방법에서 사용하기 위하여, 본 발명의 항균 폴리펩티드는 다른 약학적 활성제, 특히 다른 항균제와 함께 제형화될 수 있다. 관심있는 다른 제제는 당업계에 공지된 다양한 항생제를 포함한다. 항생제의 부류는 페니실린, 예를 들면 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 카르베니실린(carbenicillin), 나프실린(nafcillin), 앰피실린 등; 베타-락타마제(beta-lactamase) 억제제, 즉 세팔로스포린(cephalosporins), 예를 들면 세파클로(cefaclor), 세파졸린(cefazolin), 세푸록심(cefuroxime), 모살락탐(moxalactam) 등과 조합된 페니실린; 카바페넴(carbapenems); 모노박탐(monobactams); 아미노글리코시드(amisnoglycosides); 테트라사이클린(tetracyclines); 마크로라이드(macrolides); 린코마이신(lincomycins); 폴리믹신(polymyxin); 술폰아미드(sulfonamides); 퀴놀론(quinolones); 클로람페니콜(cloramphenicol); 메트로니다졸(metronidazole); 스펙티노마이신(spectinomycin); 트리메토프림(trimethoprim); 반코마이신(vancomycin) 등을 포함한다.

폴리엔(polyenes), 예를 들면 암포테리신 B(amphotericin B), 니스타틴(nystatin); 5-플루코신(5-flucosyn); 및 아졸(azoles), 예를 들면 미코나졸(miconazol), 케토코나졸(ketoconazol), 이트라코나졸(itraconazol) 및 플루코나졸(fluconazol)을 포함한 항진균제가 또한 유용하다. 항결핵 약물은 이소니아지드(isoniazid), 에탐부톨(ethambutol), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 리팜핀(rifampin)을 포함한다. 예를 들면, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파, 인터류킨 12 등과 같은 사이토카인 또한 본 발명의 항균 폴리펩티드의 제형에 포함될 수 있다.

시험관내 합성

본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 종래 방법을 사용하여 시험관내 합성에 의하여 제조될 수 있다. 다양한 상업적 합성 장치, 예를 들면 Applied Biosystems Inc., Beckman 등에 의한 자동 합성기가 이용가능하다. 합성기를 사용하면, 자연적으로 발생하는 아미노산은 비천연 아미노산, 특히 D-이성질체(또는 D-형태) 예를 들면, D-알라닌 및 D-이소루신, 부분입체이성질체, 다른 길이 또는 기능성을 가진 측쇄 등으로 치환될 수 있다. 특정 서열 및 제조 방식은 편리성, 경제성, 요구되는 순도 등에 의하여 결정될 것이다.

아미드 또는 치환된 아민 형성, 예를 들면, 환원성 아민화를 위한 아미노기, 티올에테르 또는 이황화물 형성을 위한 티올기, 아미드 형성을 위한 카르복실기 등과 같은 결합을 위한 편리한 기능을 포함하는 화학결합은 다양한 펩티드 또는 단백질에 제공될 수 있다.

원하는 경우, 다른 분자 또는 표면에 대한 결합을 허용하는 다양한 기를 합성하는 동안 또는 발현하는 동안 펩티드에 도입할 수 있다. 따라서, 티오에테르를 만들기 위해 시스테인, 금속 이온 복합체에 연결하기 위해 히스티딘, 아미드 또는 에스테르를 형성하기 위해 카르복실기, 아미드를 형성하기 위해 아미노기 등을 사용할 수 있다.

폴리펩티드는 또한 재조합 합성의 전통적 방법에 따라서 분리되고 정제될 수 있다. 용해물은 발현 숙주의 것을 제조할 수 있으며, 용해물은 HPLC, 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 대부분의 경우, 사용되는 조성물은 생성물의 제조 및 그것의 정제 방법과 관련된 오염물질과 관련하여, 원하는 생성물의 적어도 20 중량%, 더 통상적으로는 적어도 약 75 중량%, 바람직하게는 적어도 약 95 중량%, 그리고 치료 목적을 위하여는 통상적으로 적어도 약 99.5 중량%를 포함할 것이다. 대개, 백분율은 전체 단백질량을 기준으로 할 것이다.

실시예

본 발명은 다음 실시예에 의하여 더 설명되는데, 이것은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.

방어소를 확인하기 위한 PFAM 데이터베이스로부터의 HMM 파일의 사용

은닉 마르코프 모델 프로파일(HMM 프로파일)을 사용한 서열분석은 인터넷상의 온라인으로 또는 잘 알려진 HMMER 자유 이용 소프트웨어 패키지를 사용하여 컴퓨터상에서 현지에서 수행될 수 있다. 현재 버전은 2003년 10월에 나온 HMMER 2.3.2이다.

HMM 프로파일은 잘 알려진 PFAM 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 현재 버전은 2004년 11월에 나온 PFAM 16.0이다. HMMER와 PFAM은 모두 예를 들면 세인트루이스(미국)에 있는 워싱턴 유니버시티 스쿨오브메디신의 모든 컴퓨터 플랫폼에서 사용가능하다(http://pfam.wustl.edu and http://hmmer.wustl.edu).

의문의 아미노산 서열, 또는 그것의 단편이 다음 5개의 PFAM 패밀리 중 하나에 속한다면, 그 아미노산 서열은 본 발명에 따른 방어소이다:

-Defensin-beta 또는 "베타 방어소", 기탁번호: PF00711;

-Defensin_propep 또는 "방어소 프로펩티드", 기탁번호: PF00879;

-Defensin_1 또는 "포유동물 방어소", 기탁번호: PF00323;

-Defensin_2 또는 "절지동물 방어소", 기탁번호: PF01097;

-gamma-thionin 또는 "감마-티오닌 패밀리", 기탁번호: PF00304.

아미노산 서열은, PFAM 데이터베이스를 온라인에서 사용할 때, 또는 hmmpfam 프로그램(HMMER 소프트웨어 패키지)을 현지에서 사용할 때 0.1 보다 큰 E-값 및 0 보다 더 크거나 같은 점수를 발생시키는 경우 본 발명에 따라서 PFAM 패밀리에 속한다.

서열 분석이 hmmpfam 프로그램을 사용하여 현지에서 수행될 때, PFAM 데이터베이스에서 HMM 프로파일을 얻을(다운로드할) 필요가 있다. 각 패밀리에 대한 두 프로파일이 존재한다; 글로컬(glocal) 검색의경우 xxx_ls.hmm, 및 로컬 검색의 경우 xxx_fs.hmm("xxx"는 패밀리의 이름이다). 그것은 앞에서 언급한 5개 패밀리에 대해 전체 10개의 프로파일을 만든다.

이들 10개 프로파일은 개별적으로 사용되거나, 예를 들면 defensin.hmm으로 명명할 수 있는 단일 프로파일(텍스트 에디터를 사용함 - 프로파일은 ASCII 파일이다)로 결합(첨부)될 수 있다. 그 다음, 의문의 아미노산 서열은 하기 명령 라인을 사용하여 평가될 수 있다.

hmmpfam -E 0.1 defensin.hmm sequence_file

-상기 "sequence_file"은 HMMER 소프트웨어 패키지에 의하여 인식된 어떤 포맷에서 의문의 아미노산 서열을 가진 파일이다.

점수가 영(0.0) 보다 크거나 같고, E-값이 0.1 보다 크다면, 의문의 아미노산 서열은 본 발명에 따른 방어소이다.

PFAM 데이터베이스는 문헌(Bateman et al. (2004) "The Pfam Protein Families Database", Nucleic Acids Research, Vol. 32 (Database Issue) pp. D138-D141)에 더 설명되어 있다.

뇌막염 동안의 합성 방어소의 CSF 침투 및 살균 효과 조사

뇌막염을 앓고 있는 78세 고연령 여성의 CSF에서 최초에 분리된, 페니실린-저항성 혈청형 9V 폐렴연쇄구균(S. pneumoniae)(1395)의 분리물이 뇌막염 모델에서 사용되었다. 이 균주는 이전에 목시플록사신(Moxifloxacin)의 뇌막염의 치료에 대한 효과를 평가하는데 사용되었다(Ostergaard et al. "Evaluation of moxifloxacin, a new 8-methoxyquinolone, for treatment of meningitis caused by a penicillin-resistant pneumococcus in rabbits", Antimicrob Agents Chemother, vol. 42(7), pp. 1706-1712 (1998) 참조).

균주의 독성은 마우스 복막염 모델에서 박테리아를 통과시킴으로써 증가되었다. 채취된 복막액으로부터 나온 박테리아를 혈액 아가 플레이트에서 키웠고, 회수한 뒤, 10% 글리세롤을 첨가한 쇠고기-브로스에 희석한 후, -80℃에 얼렸다.

박테리아 분주를 녹인 후, 혈액-아가 플레이트에서 키웠고, 540 nM에서 3.5의 광밀도에 도달하도록 멸균한 소고기-브로스에 부유시키고, 그 후에 1-2 × 10⁶ CFU/ml의 최종 농도를 얻기 위해 희석하였다.

본 실험에서 사용한 합성 방어소는 서열번호 1에 나타난 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 실시예에서 합성 방어소는 "메닌기신(Meningicin)"으로 지칭될 것이다. 폐렴연쇄구균(S. pneumoniae)(1395)에 대한 메닌기신의 최소 억제 농도(MIC)는 0.25 μg/ml인 것으로 결정되었다.

효과-연구에서, 뇌막 감염을 제거하는 것에서 메닌기신의 효과를 페니실린 저항성 균주로 폐렴연쇄구균성 뇌막염을 앓는 환자를 치료하는데 종종 사용되는 항생제인 셉트리악손(Ceftriaxone)의 효과 및 아무 치료도 하지 않았을 때("부형제")의 효과와 비교하였다. 폐렴연쇄구균(S. pneumoniae)(1395)에 대한 셉트리악손의 MIC는 0.5 μg/ml인 것으로 결정되었다.

뇌막염 모델

대략 2500 g의 체중인 수컷 뉴질랜드 흰토끼를 본 실험에 사용하였다. 토끼는 적응을 위해 실험하기 1 내지 2주 전에 시설에 도착하였다. 그들은 사료와 물을 제한없이 제공하며 건초로 덮인 단독 케이지에서 키웠다. 수의사의 전문 감정서가 실험실에서 사용가능하였으며, 실험 설계는 지역 동물 법률 제정 위원회의 허가를 받았다.

주촉성(走觸性) 프레임에서 고정을 위한 준비

토끼의 체중을 재었고, 0.5 ml/kg(midazolam 5 mg/ml)의 도미컴(dormicum)을 피하주사하고, 10분 후 0.35 ml/kg(구연산펜타닐 + 플루아니손(fluanison))의 하이프노름(hypnorm)으로 근육주사하여 마취시켰다.

토끼의 귀, 두피 및 목을 면도한 다음, 피부를 소독하였다. 토끼의 전두에 대략 2 cm로 측정하여 절개한 뒤, 두피를 비절개박리에 의해 노출시켰다. 정사각형 표시를 하여 4개의 구멍을 만들고, 4개의 나사를 표면에 수직으로 조였다(2.5 내지 3회전). 나선식 죔쇠가 깊숙이 박힌 아크릴 헬멧을 치과 주조 물질로 토끼의 두피에서 직접 몰딩하였고, 헬멧을 흐르는 물에서 식혔다. 토끼를 그의 케이지로 돌려보낸 후 사료 및 물을 자유롭게 제공하며 비감염된 토끼의 박테리아 접종 또는 약물 동력학 처치 연구의 시작의 시간까지 8-10시간 휴식시켰다. 0.1 mg/kg의 버프레노르핀(buprenorfin)으로 통각 상실을 주었다.

박테리아 접종

메닌기신으로 처치 실험을 하기 전 날의 저녁 10시에 토끼를 하이프노름-도미쿰으로 재-마취시켰다. 토끼의 머리는 주촉성 프레임에 고정되었고, 척추 캐뉼러를 1 × 10⁵ CFU 폐렴연쇄구균의 접종을 위해 대조(cisterna magna)에 도입하였다. 박테리아 접종 후, 토끼를 다시 8시간 동안 사료와 물을 제공하며 그의 케이지로 돌려보냈다. 버프레노르핀 0.1 mg/kg으로 통각 상실을 주었다(주의: 비감염 토끼는 박테리아 접종 단계를 시행하지 않았다.)

약물동력학 연구에 대한 설정 및 효과-연구

토끼를 오전 7시 30분에 3.5 ml/kg(디메틸-아크릴 50%, 1.75 g/kg)의 유레탄(urethan)으로 피하주사하여 재-마취시켰다. 정맥 카테터를 왼쪽-귀 정맥에 장착시키고, 대략 0.5-1 ml(펜토바비탈 50 mg/ml)의 메부말(Mebumal)을 정맥주사하여 토끼가 잠에 빠져들고, 깊이 마취될 때까지 천천히 주입시켰다. 세 방향 탭을 정맥 카테터에 연결시키고, 추가 마취를 위한 펜토바비탈, 등장 NaCl 및 수세를 위한 헤파린 1 Ul/ml을 함유하는 시린지를 탭에 연결시켰다. 토끼는 매 반시간마다 관찰하였다. 추가적인 마취가 필요할 때, 추가로 0.2 ml 메부말(펜토바비탈 50 mg/ml)을 주었다. 실험 동안 관찰 및 마취는 실험 동물-부서의 도표 및 실험 동물 관찰 책에 기록하였다.

동맥 캐뉼러를 오른쪽 귀의 동맥에 장착하였고, 실험이 진행되는 동안 채혈에 사용하였다. 볼트를 아크릴 헬멧에 깊숙이 박혀있는 나사식 죔쇠에 죄었고, 토끼의 머리는 주촉성 프레임에 고정시켰다. 토끼는 실험이 진행되는 동안 고정시킨채로 있었다.

대조를 척추-캐뉼러로 구멍을 내고 주촉성 프레임에 조였다. 캐뉼러는 실험 동안 왼쪽에 위치시켰고, CSF 채집에 사용되었다.

실시된 실험에 적절한 시간-시점에서 혈액 1 ml 및 CSF 0.3 ml을 동맥 캐뉼러/척추 바늘로부터 흡인하여 EDTA-튜브/에펜돌프-튜브로 옮겼다. 마지막 샘플 채집 후에, 실험을 종료하고 토끼는 메부말(펜토바비탈 200 mg/ml)을 과다투여하여 죽였다.

분석

메닌기신의 CSF 및 혈장 농도는 HPLC를 사용하여 측정하였다. 접종물 및 표본에서 박테리아 농도를 평가할 때, 일련의 10배 희석(시험-물질 20 μl가 필요)을 혈액-아가 플레이트에 50 μl씩 점찍어 플레이팅한 것을 CFU/ml의 계산에 사용하였다.

약물 동력학 연구에 대한 세부 사항

메닌기신(각각 20, 40 및 80 mg/kg의 투여량)을 실험 시작시에 10분에 걸쳐 정맥 주사로 세 방향 탭을 통해 투여하였다.

염증을 일으킨 뇌막을 침투한 메닌기신의 경과에 대한 연구에 사용한 토끼는 상술한 바와 같이 감염시켰고, 박테리아를 접종한지 10시간이 지날 때 까지 메닌기신 정맥 투여를 기다렸다. 두 개의 토끼 그룹을 염증을 일으키거나- 염증을 일으키지 않은 뇌막을 통해 3가지 다른 투여량의 메닌기신의 침투(CSF 및 혈장 수준에 상응하는)를 연구하는데 사용하였다. 혈액 및 CSF는 메닌기신의 농도(HPLC)를 결정하기 위하여 메닌기산의 투여 후 0, ¼, ½, 1, 1½, 2, 3, 4, 5 및 6 시간째에 채취되었다. 메닌기신에 대하여 관찰된 MIC 및 약물동력학에 기반하여, 처치-시험에 대한 투여 체계를 확립하였다.

효능 연구에 대한 세부 사항

척추 캐뉼러를 적용시킨 다음, 0.5 ml의 CSF를 시린지로 흡인하였다. 0.1 ml는 접종 전에 박테리아 접종물을 용해하는데 사용하고, 0.2 ml는 나중에 시린지 및 캐뉼러를 세척하는데 사용하였다. 접종물의 일련의 10배 희석액을 감염 투여량을 확인하기 위하여 제조하였다.

메닌기신 또는 셉트리악손의 처치가 박테리아 접종한지 10 내지 11 시간 후에 시작되었다. 혈액 및 뇌척수액의 표본 채취는 항생제의 정맥주사 투여량 후에 0, 1 , 3, 5, 6 및 10시간에 행하였다. 항생제 농도 및 박테리아 수를 결정하였다.

약물동력학의 결과

상술한 바와 같이, 메닌기신을 20 mg/kg, 40 mg/kg 및 80 mg/kg의 투여량으로 투여하였다. 감염된 토끼의 혈청에서 메닌기신의 농도를 측정하였고, "곡선 아래 면적"(AUC 혈청)을 계산하였다. 마찬가지로, 뇌척수액(CSF)에서 메닌기신의 농도를 측정하였고, "곡선 아래 면적"(AUC CSF)를 계산하였다.

메닌기신 투여량 (mg/kg)	혈청 피크 농도 (μg/l)	AUC 혈청 (μg/l)	CSF 피크 농도 (μg/l)	AUC CSF (μg/l)	혈액-뇌 장벽의 메닌기신 침투
20	31,390	40,162	2,001	8,557	21%
40	113,117	97,040	10,230	47,902	49%
80	376,140	192,990	8,040	30,476	16%

효능 연구 결과

효능 연구를 세 번 반복하였다. 40 mg/kg 메닌기신의 투여량을 0 시간(처치 시작)에 투여하였고, 20 mg/kg 메닌기신의 다른 투여량을 5시간 후 투여하였다. 셉트리악손(0시간에 125 mg/kg)을 양성 대조군으로 사용하였다. 하기 표는 뇌척수액에서 박테리아 존재량을 보여준다.

시간 (시간)	메닌기신 처치 (CFU/ml)	메닌기신 처치 (CFU/ml)	메닌기신 처치 (CFU/ml)	셉트리악손 처치 (CFU/ml)	부형제 처치 (CFU/ml)
-10	240,000	240,000	240,000	240,000	240,000
0	145,000	1,680,000	155,000	3,480,000	1,280,000
3	1,500	2,500	1,250	92,500	5,000,000
5	2,750	0.1	0.1	25,000	8,250,000
10	0.1	0.1	0.1	750	70,000,000

하기 표는 처리하는 동안 뇌척수액에서 박테리아 존재량(Δ log CFU)의 감소를 보여준다. 데이터는 시간이 0일 때를 0.00으로부터 시작하는 것으로 표준화하였다.

상기 결과는 뇌막염을 치료하는데 있어서 메닌기신의 매우 높은 효능을 증명한다. 메닌기신의 효능은 적어도 셉트리악손의 효능만큼 높다.

시간 (시간)	메닌기신 처치(Δ log CFU)
시간 (시간)	토끼 1	토끼 2	토끼 3	토끼 4	토끼 5	토끼 6	평균
0	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
3	-3.84	-3.28	-3.81	-1.99	-2.83	-2.09	-2.97
5	-5.31	-3.86	-5.01	-1.72	-5.23	-4.19	-4.22
10	-5.71	-4.86	-5.01	-4.16	-5.23	-4.19	-4.86

시간 (시간)	셉트리악손 처치(Δ log CFU)
시간 (시간)	토끼 7	토끼 8	토끼 9	토끼 10	평균
0	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
3	-2.26	-2.11	-2.53	-1.58	-2.12
5	-3.28	-2.77	-3.72	-2.14	-2.98
10	-5.16	-3.57	-4.32	-3.67	-4.18

시간 (시간)	부형제(Δ log CFU)
시간 (시간)	토끼 11
0	0.00
3	0.59
5	0.81
10	1.74

<110> Novozymes A/S <120> Use of Defensins Against Meningitis <130> DK10P0930 <150> PCT/EP2009053726 <151> 2008-04-04 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antimicrobial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> mat_peptide <400> 1 Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asn Glu Asp Asp Leu Arg Cys His 1 5 10 15 Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr 35 40

Claims

뇌막염의 치료적 처치를 위한 약제의 제조를 위한 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항균성 폴리펩티드의 용도.
뇌막염의 치료적 처치를 위한 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항균성 폴리펩티드.
서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항균성 폴리펩티드를 효과량 즉, 항-뇌막염 효과량으로 치료할 필요가 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌막염의 치료 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산을 포함하고, 바람직하게는 폴리펩티드는 서열번호 1의 폴리펩티드를 포함하거나 구성되는 것을 특징으로 하는 용도, 폴리펩티드 또는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 방어소 폴리펩티드, 바람직하게는 베타 방어소 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 용도, 변이체 또는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌막염은 박테리아성 뇌막염인 것을 특징으로 하는 용도, 변이체 또는 방법.
제 6항에 있어서, 박테리아성 뇌막염은 연쇄상구균(Streptococcus sp.)의 감염에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 용도, 변이체 또는 방법.
제 6항에 있어서, 박테리아성 뇌막염은 폐렴연쇄구균성 뇌막염(pneumococcal meningitis)인 것을 특징으로 하는 용도, 변이체 또는 방법.
제 8항에 있어서, 폐렴연쇄구균성 뇌막염은 페니실린-저항성 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae)의 감염에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 용도, 변이체 또는 방법.