TW201307393A - 用於治療肝癌之Ｒｏｂｏ１－Ｆｃ融合蛋白 - Google Patents

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TW201307393A
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Sanofi Sa
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Abstract

本發明係關於Robo1-Fc重組蛋白用於治療癌症，特定而言肝癌之用途。

Description

用於治療肝癌之Robo1-Fc融合蛋白
本發明係關於重組蛋白Robo1-Fc，且係關於其用於治療Slit蛋白過表現之疾病之用途。特定而言，本發明係關於Robo-Fc蛋白用於治療癌症，尤其肝癌之用途。本發明亦係關於包括此一重組蛋白之組合物。本發明之另一態樣由Robo1-Fc分子作為用於檢測Slit家族分子在患者體內之過表現之診斷工具的用途組成。
首先，闡述Slit配體在神經元發育中排斥軸突生長之作用。其後，亦闡述腫瘤血管生成中之Robo/Slit調節途徑。具體而言，已闡述Robo4/Slit2途徑用於抑制內皮細胞對VEGF之反應(Jones C.A.等人，Nat. Med 14,448-453(2008))。藉由Robo/Slit途徑調節使得可引導內皮不成熟新生血管或芽(非產生性血管生成)之過度增殖且可使該等血管成熟。在轉錄層面上，已在若干種人類癌症細胞株中顯示Slit2之表現，特定而言源自結腸癌之HCT116、源自卵巢癌之Skov-3、源自子宮頸癌之HeLa、源自黑色素瘤之MDA-MB-435、源自子宮癌之Hec-1A及(最後)源自腎癌之769-P(Stella MC等人，Mol Biol Cell. 2009第20卷，第2期，642-657)。亦已在以下癌之人類組織上顯示Slit2蛋白之過表現：口腔癌(Wang等人2008,Cancer Sci. 2008年3月；99(3): 510-7)、前列腺癌(Latil等人2003 Int J Cancer. 2003年1月20日；103(3): 306-15)、結腸癌(Wang等人2003,Cancer Cell，第4卷，第1期，2003年7月，第19-29頁)及肝部癌症(Avci等人，2008,BMC cancer,8: 392)。最近，已在子宮內膜異位症之樣品上顯示Slit2蛋白之過表現(Shen等人，2009,AJP 175(2): 479)。
Robo1蛋白以兩種異構體a及b形式存在。Robo1蛋白異構體b(NP_598334)之細胞外結構域包括5個免疫球蛋白結構域：Ig1、Ig2、Ig3、Ig4及Ig5。Robo蛋白與Slit配體在Ig1及Ig2結構域之層面上相互作用。Liu等人(2004,Mol. Cell Neurosci,26: 232-240)已展示Ig2結構域在與Slit之相互作用及在Robo之活性(化學排斥)中之重要性。
Robo1及Slit2蛋白之特異性抗體之使用已闡述於申請案WO2003/075860中。該等抗體使得可抑制腫瘤血管生成。
然而，業內有利地提出治療癌症之替代性方法，特定而言係能夠抑制Slit2信號轉導途徑之分子。
本發明者已研發出可溶性嵌合Robo1受體策略，該等受體能夠結合Slit配體且因此能夠抑制Robo/Slit途徑之細胞內信號轉導。驚人地，本發明之Robo1-Fc分子藉由防止成熟血管形成而非藉由抑制內皮細胞增殖而具有抗血管生成效應。
本發明者已顯示，Robo1-Fc分子亦在肺癌及肝部癌症中具有抗腫瘤效應。
本發明之標的係Robo-Fc重組蛋白，其包括Robo1蛋白異構體b之細胞外結構域或此結構域之一部分、接合區(連接體)及免疫球蛋白Fc結構域。
在一特定實施例中，Robo1蛋白異構體b之細胞外結構域由Ig1及Ig2結構域組成。該等結構域對應於由核苷酸序列SEQ ID NO.1編碼之SEQ ID NO.2之肽或與序列SEQ ID NO.2具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性之序列之肽。
融合蛋白亦包括接合區(亦稱為「連接體」)。在本發明之上下文中，連接體特定而言藉由限制活體內裂解使得可獲得重組蛋白穩定性。可用於Robo1-Fc分子之連接體係(例如)GluArgProSerPheVal及GlyGlyGlyGlySer。彼等熟習此項技術者具有足夠知識來選擇適用於此用途的連接體。
本發明之Robo1-Fc重組分子之Fc結構域對應於免疫球蛋白之可結晶片段。此Fc片段可來自各種免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。其負責免疫反應之效應子功能(WO2008/065543)。
在本發明之一實施例中，Fc結構域來自IgG4免疫球蛋白。在一特定實施例中，已將至少一個點突變或缺失引入IgG4 Fc結構域中，從而尤其藉由穩定由兩個Fc結構域構成之鉸鏈區來增強分子之穩定性(Angla等人，1993,Mol. Immunol.,30: 105-108)；降低或消除IgG4-Fc之殘留活性，尤其效應子活性(WO 97/09351)；且在重組蛋白產生期間提高同質性。特定而言，已將至少兩個點突變、較佳三個點突變引入IgG4 Fc結構域中。在本發明之Robo1-Fc L1、Robo1-Fc L2及Robo1-Fc L3分子中，較佳突變如下：
-　S241P(Kabat編號)，以穩定Fc鉸鏈區中之二硫橋鍵結；
-　L248E(Kabat編號)，以消除IgG4-Fc結構域之殘留效應子活性；
-　不存在C-末端離胺酸，以降低蛋白之異質性。
如上所述本發明包括Robo1異構體b之Ig1及Ig2結構域、連接體及突變IgG4結構域之Robo1-Fc分子係Robo1-Fc L1、Robo1-Fc L2及Robo1-Fc L3。
Robo1-Fc L1對應於由核苷酸序列SEQ ID NO.3編碼之序列SEQ ID NO.4之蛋白質。
Robo1-Fc L2對應於由核苷酸序列SEQ ID NO.5編碼之序列SEQ ID NO.6之蛋白質。
Robo1-Fc L1與Robo1-Fc L2之不同之處在於連接體之性質。
Robo1-Fc L3對應於由核苷酸序列SEQ ID NO.23編碼之序列SEQ ID NO.24之蛋白質。
在本發明之一特定實施例中，已引入一或多個點突變或缺失以在產生期間提高同質性。特定而言，已在N-末端位置截短一個胺基酸、較佳兩個胺基酸。本發明之此一Robo-1-Fc分子係Robo1-Fc L3分子，其中已截斷兩個胺基酸(Ser20及Arg21)且其中胺基酸Leu 22已與介白素2之信號肽融合。
亦如先前所述藉由使C-末端Lys缺失來提高本發明之Robo1-Fc分子之同質性。
本發明之標的亦係以下蛋白質：蛋白質序列對應於序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.24，或與序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.24具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。該等蛋白質變體與具有序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.24之蛋白質具有相同生物活性，尤其係其與Slit家族蛋白質相互作用之能力。
本發明之Robo1-Fc蛋白可藉由以下方式來產生：將編碼該等蛋白質之表現質體轉染至適於表現真核重組蛋白之任一類型細胞(HEK293、CHO等)中，且然後自培養上清液中回收並根據習用方法來純化。
對本發明之Robo1-Fc L1、Robo1-Fc L2及Robo1-Fc L3蛋白之表徵已使得可證實，其具有將其作為生物治療劑投與所需要之品質。
本發明之Robo1-Fc蛋白具有與Slit家族之蛋白質相互作用之能力。
本發明之Robo1-Fc蛋白特定而言藉由與人類Slit1、Slit2及Slit3蛋白及鼠類Slit2蛋白之D2結構域相互作用來特異性識別該等蛋白質。其對Slit家族之3個成員之親和性相似。
本發明之另一標的對應於編碼本發明蛋白質之核酸分子。
因此，對應於序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.23或與具有序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.23之分子具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性之核酸分子係本發明之一部分。
本發明之另一標的由本發明之Robo1-Fc蛋白用於治療Slit家族蛋白質過表現之疾病之用途組成。
可成為本發明之Robo1-Fc之靶之Slit家族蛋白質係Slit1、Slit2或Slit3。
已顯示，Robo1可與Slit家族之各個成員相互作用。因此，有利地應注意，本發明之Robo1-Fc蛋白能夠同時抑制藉由Slit1、Slit2及Slit3介導之信號轉導途徑，此使得與僅對該等途徑中之一者具有特異性之抗體相比可拓寬治療譜。
在另一實施例中，使用Robo1-Fc蛋白藉由抑制血管生成而非抑制內皮細胞增殖來治療Slit家族蛋白質過表現之疾病。此與血管成熟缺陷相關之抗血管生成活性稱為「非產生性血管生成」。
具體而言，實驗性研究已顯示，本發明之Robo1-Fc分子能夠抑制細管之形成，而不抑制內皮細胞增殖。其使得可極顯著地減小肺癌鼠類模型中之腫瘤體積。
在一較佳實施例中，可用於治療Slit蛋白過表現之疾病之Robo1-Fc蛋白係Robo1-Fc L1、Robo1-Fc L2及Robo1-Fc L3，且自其衍生之分子特定而言包含旨在在產生期間提高同質性而不顯著修改該等分子之生物性質之點突變或缺失。
通常，可用本發明之Robo-1-Fc蛋白治療之疾病係所有抑制Slit途徑可產生治療效應之疾病，特定而言Slit家族蛋白質過表現之疾病，且特定而言Slit2過表現之疾病。
由於本發明之Robo1-Fc分子特異性結合Slit2分子，故有趣地注意到，該等分子能夠同時抑制兩個涉及Slit2之途徑，即Robo1/Slit2及Robo4/Slit2途徑。
在本發明之具體實施例中，使用本發明之Robo1-Fc蛋白來治療癌症，特定而言胰腺癌、結腸癌、具有或不具有淋巴轉移之結腸直腸癌、乳癌、肺癌及肺轉移、卵巢癌、子宮頸癌、黑色素瘤、腎癌、口腔癌、前列腺癌、肝部癌症等等。
在一特定實施例中，使用Robo-Fc蛋白來治療肺癌。
在另一特定實施例中，使用Robo-Fc蛋白來治療肝部癌症，例如肝癌。
亦可使用本發明之Robo1-Fc分子作為替代或補充目前療法之抗癌藥劑。
特定而言，該等分子可與抗癌化合物組合(視情況同時)投與。
本發明之另一標的係關於包括如上文所定義之Robo1-Fc蛋白及一或多種醫藥上可接受之賦形劑之組合物。
可在醫藥組合物中調配本發明之Robo1-Fc蛋白以供局部投與、經口投與、非經腸投與、鼻內投與、靜脈內投與、肌內投與、皮下投與、眼內投與等等。較佳地，醫藥組合物含有用於可注射調配物之醫藥上可接受之媒劑。特定而言，其可係等滲無菌鹽水溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等等，或此等鹽之混合物)，或乾燥(特定而言冷凍乾燥)組合物，其藉由視需要添加無菌水或生理鹽水使得可形成可注射溶質。
本發明之另一態樣由Robo1-Fc分子作為用於檢測Slit家族分子在患者體內之過表現之診斷工具之用途組成。此乃因已顯示，Slit途徑與多種癌症有關。對於選擇能夠對基於投與Robo1-Fc分子之治療作出反應之患者之目的而言，提供評價對Slit信號轉導途徑之干擾之測試極為有用。
此診斷工具可呈包括Robo1-Fc分子之即用套組形式，該Robo1-Fc分子之形式適於使其與來自患者之易於展現Slit分子過表現之生物樣品(血液、尿、腫瘤活組織切片)接觸。可視情況預先標記Robo-Fc分子，且檢測Robo-Fc與Slit之組合以便評價生物樣品中之Slit蛋白表現與對照樣品相比之增加。此套組可(例如)呈ELISA套組形式。
 實例 實例1：Robo1-Fc蛋白之製備
a.　允許表現用作生物治療劑之Robo1-Fc重組蛋白之構築體
Robo1-Fc重組蛋白由人類Robo1蛋白異構體b(NP_598334)之前兩種免疫球蛋白結構域(Ig1-Ig2)與人類免疫球蛋白G4之Fc結構域(hIgG4-Fc,SwissProt IGHG4_HUMAN)之間之融合體組成。
為獲得Robo1-Fc L1構築體，使用人類胎兒心臟cDNA庫(參考編號HL5042T,Clontech)藉由PCR來擴增對應於此蛋白質(SEQ ID NO.2)之免疫球蛋白(Ig)結構域Ig1及Ig2之cDNA片段(SEQ ID NO.1)及之後的GluArgProSerPheVal連接體。然後將此擴增片段選殖至真核表現載體pXL4904中(圖1中所述)，從而使得Robo1之兩個Ig結構域表現為與人類IgG4之Fc結構域在C-末端位置融合之融合體。將三個點突變引入IgG4-Fc結構域中以獲得以下特性：S241P(Kabat編號)，以穩定Fc鉸鏈區中之二硫橋鍵結；L248E，以消除IgG4-Fc結構域之殘留效應子活性；不存在C-末端離胺酸，以降低蛋白質之異質性。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.3。所獲得重組蛋白稱為Robo1-Fc L1且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.4。
為獲得Robo1-Fc L2構築體，將對應於Ig1-Ig2結構域但不具有所提及連接體之相同cDNA選殖至真核表現載體pXL4909中(圖1中所述)，其允許該等Ig結構域表現為與在Robo1-Fc L1之構築中所述相同之IgG4 Fc結構域融合之融合體，其含有3個點突變，且此次在Fc結構域上游引入GlyGlyGlyGlySer連接體。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.5。所獲得之重組蛋白稱為Robo1-Fc L2且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.6。
b.用作對照之Robo1-Fc蛋白之構築
為獲得Robo1-Fc Slit2(-)構築體，藉由PCR來修飾預先選殖至pXL4904質體中之cDNA以引入點突變，該等點突變允許將位置38處之白胺酸取代為麩醯胺酸且將位置89處之苯丙胺酸取代為酪胺酸。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.7。所獲得之重組蛋白稱為Robo1-Fc Slit2(-)且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.8。
為獲得Robo1-Fc肝素(-)構築體，藉由PCR修飾選殖至pXL4904質體中之cDNA以引入點突變，該等點突變允許將位置97處之精胺酸取代為苯胺且將位置98處之離胺酸取代為丙胺酸。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.9。所獲得之重組蛋白稱為Robo1-Fc肝素(-)且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.10。
c.　各種Robo1-Fc蛋白之產生
兩種蛋白質Robo1-Fc L1及 Robo1-Fc L2係藉由分別使用pXL4904及pXL4909質體以及輔助質體pXL4544及pXL4551瞬時轉染HEK293細胞系(FreeStyle 293-F細胞，參考編號51-0029，Invitrogen，根據供應商建議)來產生，該等輔助質體pXL4544及pXL4551允許表現兩種N-聚糖糖基化酶(即α-2,3-唾液酸轉移酶及β-1,4-半乳糖基轉移酶)，如在申請案WO2008/065543中所述。該等蛋白亦係藉由分別使用pXL4904及pXL4909質體轉染CHO細胞系(CHO-S細胞，參考編號11619-012，Invitrogen，根據供應商建議)來產生。
藉由以下方式來純化在HEK293細胞之培養上清液中表現之Robo1-Fc L1及Robo1-Fc L2蛋白：在蛋白A親和管柱(MabSelect，參考編號17-5199-02，Amersham Biosciences)上層析，並在20 mM NaCl/100 mM乙酸緩衝液中洗脫，且然後在PBS緩衝液(參考編號14190-094，Invitrogen)中進行調配。
以相同方式產生並純化Robo1-Fc Slit2(-)及Robo1-Fc肝素(-)重組蛋白。
d. Robo1-Fc重組蛋白之物理化學表徵
SDS-PAGE及凝膠滲透分析使得可顯示，蛋白質係二聚體且純度大於96%。質譜分析使得可展示該等蛋白之身份，所量測去糖基蛋白質之重量與在電腦上所計算之重量完全一致。如由Saddic等人2002.(Methods Mol. Biol. 194: 23-36及Anumula等人1998. Glycobiology 8: 685-694)所述對單糖組成之分析及對N-聚糖唾液酸之定量使得可展示，蛋白質以極高程度上唾液酸化。結果於表1中給出。應注意，Robo1-Fc L1及Robo1-Fc L2分子之N-末端分析顯示，該等純化蛋白之前2個殘基(Ser20及Arg21)截斷之形式的比例可變(0至40%)。
表1：Robo1-Fc蛋白之身份
實例2：用作配體之Slit蛋白之製備
編碼人類Slit2蛋白之cDNA對應於參考蛋白NP_004778。藉由PCR使用人類腦cDNA庫(參考編號639300，Clontech)擴增此cDNA之片段。
將對應於D2結構域之cDNA選殖至真核表現載體pXL4911中以表現在C-末端位置含有His標籤之此結構域。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.11。所獲得之重組蛋白稱為Slit2-D2且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.12。
將對應於D1-D2結構域之cDNA選殖至真核表現載體pXL4912中以表現在C-末端位置含有His標籤之該兩個結構域。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.13。所獲得之重組蛋白稱為Slit2-D1D2且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.14。
將對應於Slit2蛋白之細胞外部分(Nt)之cDNA選殖至真核表現載體pXL5033中以表現在C-末端位置具有His標籤之此蛋白。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.15。所獲得之重組蛋白稱為Slit2-N且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.16。
編碼鼠類Slit2蛋白之D2結構域且對應於所述參考蛋白NP_848919之D2結構域之cDNA得自選殖至pXL4911質體中之cDNA。藉由PCR以pXL4911作為模板來生成使得可生成五個點突變之四個片段，且然後使用該等片段作為模板藉由連續PCR來擴增編碼完整D2結構域之cDNA。該蛋白質攜帶Thr311Ser、Lys313Arg、Ile329Leu、Ile411Val及Pro418Ala突變，從而允許其與鼠類Slit2蛋白之D2結構域一致。此質體使得可表現在C-末端位置具有His標籤之鼠類Slit2蛋白之D2結構域。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.17。所獲得之重組蛋白稱為mSlit2-D2且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.18。
編碼人類Slit1蛋白之cDNA對應於所述參考蛋白NP_003052。藉由PCR使用人類腦cDNA庫(參考編號639300，Clontech)來擴增此cDNA之片段。將對應於D2結構域之cDNA選殖至真核表現載體pXL5020中以表現在C-末端位置含有His標籤之此結構域。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.19。所獲得之重組蛋白稱為Slit1-D2且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.20。
編碼人類Slit3蛋白之cDNA對應於所述參考蛋白NP_003053。藉由PCR使用人類腦cDNA庫(參考編號639300，Clontech)來擴增此cDNA之片段。將對應於D2結構域之cDNA選殖至真核表現載體pXL5021中以表現在C-末端位置含有His標籤之此結構域。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.21。所獲得之重組蛋白稱為Slit3-D2且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.22。
稱為Slit2-D2、Slit2-D1D2及Slit2-N之三種蛋白質係藉由使用pXL4911質體(分別係pXL4912或pXL5033)瞬時轉染HEK293細胞系(根據供應商建議之FreeStyle 293-F細胞，Invitrogen)來產生。
在HEK293細胞之培養上清液中表現之Slit2-D2及Slit2-D1D2蛋白係藉由以下方式來純化：在Ni-螯合瓊脂糖管柱(參考編號17-0409-03，Amersham Biosciences)上層析並在咪唑緩衝液中洗脫，且然後在調節至1 M NaCl之PBS緩衝液(參考編號14190-094，Invitrogen)中進行調配。質譜分析(LC/MS)使得可展示該等蛋白之身份。
以可比方式產生、純化並表徵稱為mSlit2-D2、Slit1-D2及Slit3-D2之三種蛋白質。
實例3：藉助三種方法(ELISA、SPR及FACS)研究Robo1-Fc重組蛋白對Slit蛋白及肝素之親和性
a. Robo1-Fc蛋白對肝素之親和性
為測定Robo1-Fc構築體對肝素之親和性，將經純化並調配於10 mM磷酸鹽(pH 7.0)中之2 mg Robo1-Fc蛋白在肝素管柱(1 mL HiTrap Heparin-Sepharose HP,GE Heathcare)上層析，且藉由用自0至1.5 M NaCl之線性梯度來洗脫。
表2指示，如文獻(Fukuhara,N.等人2008 J. Biol. Chem. 283 p16226-16234)中所述，洗脫Robo1-Fc L1蛋白所需NaCl濃度為448 mM。
表2：Robo1-Fc對肝素之親和性
該等結果顯示，Robo1-Fc肝素(-)蛋白不在此管柱上保留，且因此其對肝素不再具有任何親和性。因此，此蛋白係肝素陰性突變體。
b.　對Robo1-Fc蛋白變體與人類Slit2蛋白之D2結構域之相互作用之評價
此實例藉由ELISA分析闡述稱為Robo1-Fc L1與Robo1-Fc L2之兩種變體與其天然配體(在該等實驗中，係人類Slit2之D2結構域)之相互作用。
使人類Slit2-D2蛋白與Immulon-4酶連接板(VWR Scientific公司，Swedesboro，NJ)結合。添加一濃度範圍(自20 μg/mL至0.02 μg/mL)之Robo1-Fc L1及Robo1-Fc L2變體，且然後藉助與過氧化物酶偶聯之山羊抗人類IgG抗體(Sigma；參考編號A0170，稀釋至1:50 000)來檢測。用TMB-H2O2受質(Interchim；參考編號UP664780)來實施可視化，且用讀板器在450 nm下來實施量測。結果報告於圖2中。其顯示，兩種變體Robo1-Fc L1及L2與人類Slit2蛋白(特定而言與D2結構域)特異性地相互作用。
c.　對Robo1-Fc蛋白與Slit家族之人類變體(即，Slit1及Slit3)之相互作用之評價
此實例藉由ELISA分析闡述Robo1-Fc L1融合蛋白與Slit1-D2、Slit2-D2及Slit3-D2變體之相互作用。
使人類Slit變體之D2結構域與Immulon-4酶連接板(VWR Scientific公司，Swedesboro，NJ)結合。添加一濃度範圍(自1 μg/mL至0.001 μg/mL)之Robo1-Fc L1融合蛋白，且然後使用過氧化物酶偶聯之山羊抗人類IgG抗體(Sigma；參考編號A0170，稀釋至1:50 000)來檢測。用TMB-H2O2受質(Interchim；參考編號UP664780)來實施可視化，且用讀板器在450 nm下來實施量測。類似地，在上文所述之相同條件下，藉由ELISA分析來評價一濃度範圍(自20 μg/mL至0.02 μg/mL)之Robo1-Fc Slit2(-)變體，其在Slit2-結合位點層面上突變。結果報告於下文表3中。
表3：Robo1-Fc對Slit蛋白之人類變體之親和性
該等結果顯示，Robo1-Fc蛋白與三種該家族蛋白質Slit1、Slit2及Slit3(特定而言與其D2結構域)特異性地相互作用。
另外，Robo1-Fc Slit2(-)蛋白對肝素不再具有親和性且因此其係肝素陰性突變體。
d.對Robo1-Fc蛋白與鼠類Slit2蛋白之相互作用之評價
此實例藉由ELISA分析闡述Robo1-Fc L1融合蛋白與鼠類蛋白mSlit2-D2之相互作用。
使鼠類蛋白mSlit2-D2與Immulon-4酶連接板(VWR Scientific公司，Swedesboro，NJ)結合。添加一濃度範圍(自2 μg/mL至0.002 μg/mL)之Robo1-Fc L1融合蛋白且然後使用過氧化物酶偶聯之山羊抗人類IgG抗體(Sigma；參考編號A0170，稀釋至1:50 000)來檢測。用TMB-H2O2受質(Interchim；參考編號UP664780)來實施可視化，且用讀板器在450 nm下來實施量測。結果報告於下文表4中。
表 4：Robo1-Fc L1對鼠類Slit2蛋白之親和性
該等結果顯示，Robo1-Fc蛋白與鼠類Slit2蛋白特異性地相互作用。
e.　藉由SPR量測Robo1-Fc對Slit蛋白之親和性
此實例闡述藉由SPR(表面電漿共振；BIAcore 2000)測定Robo1-Fc L1融合蛋白與人類Slit2蛋白(在此實驗中，Slit2-D2)之親和常數。在使Robo1-Fc融合蛋白結合至CM5晶片之後，分析Robo1-Fc蛋白與人類Slit2蛋白之間之相互作用。動力學量測係根據Canziani等人之方案(2004. Anal. Biochem. 325: 301-307)來實施。
表5：藉由SPR(穩態分析)獲得之Robo-Fc L1與人類Slit2-D2之親和常數
在使Slit2-D2蛋白結合至CM5晶片之後，分析用於測定Robo1-Fc L1融合蛋白與人類Slit2蛋白之間之親和常數之第二種方法。動力學量測係根據Canziani等人之方案(2004. Anal. Biochem. 325: 301-307)使用Scatchard方法根據具有兩個非等效結合位點之模型來實施。
表6：根據兩相Scatchard模型藉由SPR獲得之Robo1-Fc與人類Slit2-D2之親和常數
f.　藉由FACS量測Robo1-Fc對Slit之親和性
此實例闡述Robo1-Fc蛋白對表現Slit2之HEK293哺乳動物細胞之親和性。
使用以下質體來轉染如實例1中所述及所用之HEK293細胞：不具有在哺乳動物細胞中編碼之cDNA之ballast質體，或實例2中所述之編碼Slit2-D2蛋白之pXL4911質體，或編碼Slit2-D1D2蛋白之pXL4912質體，或編碼Slit2-N蛋白之pXL5033。在轉染後48小時將細胞分配至96孔板中，且以0.01 mg/L至3 mg/L之濃度範圍添加Robo1-Fc蛋白並在4℃下保持30 min。Robo1-Fc蛋白係Robo1-Fc L1生物治療劑或Robo1-Fc Slit2(-)突變體或Robo1-Fc肝素(-)突變體。洗滌細胞且將經Alexa 488(參考編號：A-11013，Invitrogen)標記之抗人類Fc抗體在4℃下培育30 min。然後藉由FACS(Geomean)來定量經標記之HEK293細胞。
圖3經由在不存在Slit2表現時藉由FACS量測之螢光來闡述HEK293細胞與Robo1-Fc蛋白之結合。Robo1-Fc蛋白亦及Robo1-Fc Slit2(-)突變體與HEK293細胞結合，而Robo1-Fc肝素(-)突變體不結合。因此，在0.3 mg/L至0.03 mg/L之低Robo1-Fc濃度下，Robo1-Fc經由肝素結合與HEK293細胞部分結合。
圖4經由在藉由瞬時轉染表現Slit2-N時藉由FACS量測之螢光來闡述HEK293細胞與Robo1-Fc蛋白之結合。僅Robo1-Fc蛋白與表現Slit2-N之HEK293細胞結合。在3.0 mg/L至0.3 mg/L之Robo1-Fc濃度範圍下，與生物治療性Robo1-Fc L1蛋白相比，Robo1-Fc Slit2(-)及Robo1-Fc肝素(-)突變體不結合(或實際上不結合)。
表7闡述在Slit2-N、Slit2-D1D2或Slit2-D2蛋白於HEK293細胞系中表現時，藉由FACS量測之Robo1-Fc蛋白之親和常數。
表7：藉由FACS獲得之Robo1-Fc對細胞上Slit2蛋白之親和性
如在先前實例中所證實，Robo1-Fc Slit2(-)突變體係Slit2陰性且Robo1-Fc肝素(-)突變體對Slit2之親和性弱於生物治療性蛋白質。
Robo1-Fc以相當親和性與HEK293細胞表現之Slit2-N及Slit2-D1D2結合，該等親和性大於與Slit2-D2之親和性。
實例4：Robo1-Fc L1及Robo1-Fc L2蛋白之藥物代謝動力學性質
此實例闡述在小鼠中靜脈內(iv)注射一次之Robo1-Fc蛋白之藥物代謝動力學特徵及血漿濃度。
經由尾靜脈注射三隻Balb/C小鼠(每次)，且每種Robol-Fc蛋白係以100 μL/10 g(25 mg/kg)之比例以2.5 mg/mL注射。在預定時間(投與後0.5 h、1 h、6 h、24 h、48 h及72 h)麻醉小鼠，且取血樣並收集於含有10 μL檸檬酸鹽(CPD-A,C-4431 Sigma)及2 μL蛋白酶抑制劑(完全蛋白酶抑制劑混合劑，Roche Molecular Biochemical)之管中。將管離心且收集血漿樣品並在-20℃下冷凍。
將96孔板之孔用Slit2蛋白(Slit2-D2)塗覆，且使稀釋至1/5000及1/20 000之血漿樣品在37℃下與其接觸1小時。隨後培育過氧化物酶偶聯之抗人類Fc抗體(參考編號31413，Pierce)，且然後用TMB-H2O2(參考編號UP664780，Interchim)進行可視化且在450 nm下讀取吸光度。用每一純化Robo1-Fc蛋白製備校準範圍。
Robo1-Fc L1及Robo1-Fc L2蛋白之血漿濃度展示於圖5中。藥物代謝動力學參數闡述於下表8中且顯示，該蛋白質在注入小鼠後係穩定的。
表8：在靜脈內注入小鼠後，Robo1-Fc蛋白之藥物代謝動力學參數
實例5：對在N-末端位置之同質性有所改良之Robol-Fc生物治療性蛋白質之說明
此實例闡述另一Robo1-Fc蛋白(稱為Robo1-Fc L3)之表現質體、產生及物理化學表徵，該Robo1-Fc L3與Robo1-Fc L1蛋白之不同之處在於不存在前兩個殘基Ser20及Arg21。
藉由PCR修飾選殖至pXL4904質體中之cDNA以消除Ser20及Arg21密碼子，且使下一密碼子(Leu22)與介白素2之信號肽之編碼序列融合。然後生成pXL5004表現質體，參見圖1。用於表現此重組蛋白之cDNA序列對應於序列SEQ ID NO.23。
如實例1中所述來產生、純化並表徵Robo1-Fc L3蛋白。N-末端分析顯示，此純化蛋白質具有完全同質性。所獲得之重組蛋白稱為Robo1-Fc L3且對應於蛋白質序列SEQ ID NO.24。
實例6：對Robo1-Fc L3蛋白與人類Slit2蛋白之相互作用之評價
此實例藉由ELISA分析闡述Robo1-Fc L3融合蛋白與人類Slit2蛋白(Slit2-D2)之相互作用。
使人類Slit2-D2蛋白與Immulon-4酶連接板(VWR Scientific公司，Swedesboro，NJ)結合。添加一濃度範圍(自1 μg/mL至0.001 μg/mL)之Robo1-Fc L3融合蛋白，且然後藉助過氧化物酶偶聯之山羊抗人類IgG抗體(Sigma；參考編號A0170，稀釋至1:50 000)來檢測。用TMB-H2O2受質(Interchim；參考編號UP664780)來實施可視化，且用讀板器在450 nm下來實施量測。所獲得之結果報告於下文表9中。
表9：Robo1-Fc L3蛋白對Slit2蛋白之親和性-與Robo1-Fc L1蛋白相比
該等結果顯示，兩種變體Robo1-Fc L1及Robo1-Fc L3對Slit2-D2蛋白之親和性相當。
實例7：對Robo-Fc蛋白對新生血管生成之活性之評價
a.內皮細胞及纖維母細胞之活體外共培養模型：Robo1-Fc L1分子之比活性
活體外血管生成模型對應於人類靜脈內皮細胞在人類真皮纖維母細胞之單層上之重排。簡言之，將纖維母細胞(Lonza)以40 000細胞/孔接種於24孔板(Becton Dickinson)之1 ml培養基中。在增殖3天之後(D3)，將人類靜脈內皮細胞(HUVEC-Lonza)以10000細胞/孔接種於500 μl 培養基(內皮細胞基礎培養基，Lonza)+2% FCS(胎牛血清-Lonza)+10 μg/ml hEGF(重組人類表皮生長因子-Lonza)中之纖維母細胞單層上。用30 ng/mL之VEGF(R&D Systems)、500 μg/ml濃度之Robo1-Fc L1分子或Robol-Fc Slit2(-)陰性對照刺激細胞(D3至D9)。3天之後，更換培養基且根據實驗條件刺激各孔。
2天之後，用乙醇固定細胞並用HUVEC特異性抗CD31抗體標記，隨後用抗鹼性磷酸酶抗體標記，且然後用鹼性磷酸酶受質進行可視化(D11)。藉助在顯微鏡(×4物鏡)下採集之影像對經抗CD31抗體標記之細管實施定量，且使用影像分析軟體(Biocom Visiolab 2000軟體)來分析假性細管(pseudotubule)之長度(圖6)。
在此活體外血管生成分析中，Robo1-Fc L1(500 μg/ml)顯示對由HUVEC形成之細管之形成之抑制活性。此抑制計為82%且其與用Robo1-Fc Slit2(-)分子(陰性對照)獲得之效應相比，在統計學上係顯著的。
b.　小鼠主動脈環離體模型：Robo1-Fc L1分子之比活性
在小鼠主動脈環模型中評價Robo1-Fc L1分子。簡言之，移除並清潔小鼠主動脈，並將其切成1 mm之切片(D0)。 在10 ng/ml之VEGF、500 μg/ml濃度之Robo1-Fc L1分子或500 μg/ml濃度之Robo1-Fc Slit2(-)陰性對照之存在下，將該等環包埋於大鼠膠原蛋白中。將自環形成細管，由此在活體外模擬新生血管之形成。6天之後，藉助在顯微鏡(×3物鏡)下採集之影像來實施對經標記細管之定量(圖7A)，且使用影像分析軟體(Biocom Visiolab軟體2000)來分析假性細管之長度(圖7)。
在該等實驗條件下，與用作陰性對照之Robo1-Fc Slit2(-)分子相比，Robo1-Fc L1(500 μg/ml)顯示對所形成細管之形成之強抑制活性。
該等結果表明，Robo1-Fc L1能夠抑制新生血管之形成而不抑制內皮細胞增殖。此與血管成熟缺陷相關之抗血管生成活性稱為「非產生性血管生成」。
實例8：在小鼠肺腫瘤模型中對Robo1-Fc L1蛋白之評價
在C57/Bl6小鼠之肺癌腫瘤模型中評價Robo1-Fc L1分子。
a.鼠類肺腫瘤模型
為建立鼠類肺腫瘤模型，麻醉8週齡雌性C57/B16小鼠。將小鼠左肩胛骨層面之區域的毛剃光並消毒。在肩胛骨上方切出1 cm切口。
欲注射之細胞源自Lewis肺癌腫瘤細胞系(ATCC,CRL-1642)。將細胞與以1體積Matrigel比4體積細胞之比率混合。細胞濃度係62500個細胞/ml。將細胞以每只小鼠20 μl之比率注射至肺中，且然後縫合傷口。
23天之後，使小鼠安樂死。打開胸腔，且移除左肺及縱膈淋巴結。使用電子卡尺量測存在於左肺上之腫瘤，以根據式12×L×0.52來確定腫瘤體積。將縱膈淋巴結稱重。結果表示為平均值±平均值之標準偏差。藉助參數性Student's測試來實施統計分析。
b.用Robo1-Fc重組蛋白治療具有肺腫瘤之小鼠
如下實施使用Robo1-Fc蛋白之治療：在注射腫瘤細胞之後D10、D14、D17及D21時，以25 mg/kg/天之劑量靜脈內注射含有Robo1-Fc蛋白之製劑。用PBS緩衝液(10 ml/kg)注射對照組。
c.結果
在D23，在用Robo1-Fc重組蛋白治療之組中所獲得之腫瘤之平均體積係21.45±2.16 mm3；在對照組中所獲得之腫瘤之平均體積係39.93±8.41 mm3。在用Robo1-Fc蛋白治療之動物中，腫瘤體積減小46%。此差異在統計學上顯著(p<0.05)。在用Robo1-Fc蛋白治療之組中所獲得之縱膈淋巴結(轉移淋巴結)之平均重量係12.50±1.26 mg。在對照組中所獲得之縱膈淋巴結之平均重量係30.67±7.69 mg。對於用Robo1-Fc蛋白治療之組，縱膈淋巴結之重量減小59%(在顯著性極限處，p=0.07)。
實例9：在兩種人類肝癌模型中對Robo1-Fc L1蛋白之評價
在SCID小鼠中之兩種人類肝癌模型中評價Robo1-Fc L1分子。
A.使用HepG2細胞系之SCID小鼠中之人類肝癌之原位模型
a.模型之說明
麻醉(用克他明(ketamine)/甲苯噻嗪(xylazine)之混合物)雌性SCID小鼠且將切口區域的毛剃光。將皮膚清潔並消毒，之後在皮膚及肌肉壁中切出1 cm肋下緣切口。自腹膜小心地提取一部分肝葉以實施細胞注射。將50 μl體積之細胞懸浮液(來源於ATCC之HepG2，以40×106細胞/ml與Matrigel混合之人類肝母細胞瘤細胞)注射至左葉中。將該葉放回至腹腔中。用外科膠封閉腹膜且然後用U形釘(staple)縫合皮膚。用每週腹腔注射兩次之以25 mg/kg溶解於PBS中之Robo1-Fc來治療小鼠。在植入細胞後兩週開始治療。在接種細胞後四週，殺死動物以供屍體剖檢。
b.用Robo1-Fc重組蛋白治療具有人類肝癌之小鼠
在此以25 mg/kg之劑量每週治療兩次之模型中評價Robo1-Fc。在方案之第一天及最後一天量測小鼠重量。在注射細胞後28天，在殺死動物之後量測腫瘤之重量。
c.結果
在方案期間，腫瘤生長導致對照動物之重量顯著降低，而用Robo1-Fc治療之動物在實驗結束時具有相同重量(表10)。在實驗結束時，在4次腹腔注射Robo1-Fc之後，與接受溶劑注射之對照組相比，Robo-1-Fc治療組的平均腫瘤重量顯著減少30%(p<0.05)(圖8)。
表10：在方案開始及結束時動物之重量
B.　使用Hep3B細胞系之SCID小鼠中之人類肝癌之原位模型
a.　模型之說明
在此HCC模型中，使用Hep3B細胞系。此腫瘤細胞系係來自年輕患者之肝母細胞瘤之市售細胞系(來自ATCC)。使用與先前在實例9Aa)中所述相同之細胞注射方案。細胞之初始濃度係2.106/50 μl注射體積。
b.　用Robo1-Fc治療具有Hep3B腫瘤之小鼠
在此模型中藉由以5 mg/kg每週治療兩次來評價Robo1-Fc。在治療之前及每下次治療之前將小鼠稱重，以用注射體積調節劑量。在方案之最後一天，在將小鼠殺死之前亦稱重。在方案之最後一天，在殺死之後，量測具有腫瘤之葉。此外，在殺死之前，抽取小鼠之血液且棄去血清以供測定α胎蛋白(AFP)；AFP係藉由癌症肝細胞分泌且目前公認其係人類中HCC發生之生物標記(Fimus等人，2004,Mol Diagn8(4):207-12. Review)。
c.　結果
在35天之腫瘤發生期間，小鼠重量未增加。以5 mg/kg Robo1-Fc治療顯示對小鼠重量無影響(表11)。在實驗結束時，對照組之平均腫瘤重量係895±156 mg。Robo1-Fc治療組之平均腫瘤重量係483±55 mg(圖9)。用Robo1-Fc治療誘導腫瘤負荷顯著減少46%。
此外，在具有腫瘤之對照小鼠中，血漿AFP濃度為316±73 μg/ml，且在經Robo1-Fc治療之小鼠中為139±28 μg/ml，此顯示，在經治療動物中，血漿AFP抑制56%(圖10)。此血漿AFP之抑制與Robo1-Fc之抗腫瘤活性密切相關。
表11：在方案開始及結束時之小鼠重量
圖1：Robo1-Fc L1、Robo1-Fc L2及Robo1-Fc L3蛋白之表現質體。
圖2：藉由ELISA評價Robo1-Fc融合蛋白變體與Slit2蛋白之相互作用。
圖3：藉由FACS量測Robo1-Fc對不表現Slit2之HEK293細胞之親和性。
圖4：藉由FACS量測Robo1-Fc對表現Slit2之HEK293細胞之親和性。
圖5：Robo1-Fc蛋白在小鼠中靜脈注射後之藥物代謝動力學特徵。A.投與Robo1-Fc L1，B.投與Robo1-Fc L2。
圖6：Robo1-Fc L1分子在與內皮細胞及間葉細胞共培養測試中之效應。A. Robo1-Fc L1在培養中抑制細管形成。B. Robo1-Fc L1顯著抑制VEGF-誘導之假性細管形成。
圖7：評價Robo1-Fc L1分子對小鼠主動脈環離體模型之效應。A：闡述製備主動脈環及量測細管之方案。B：a.對照；b. Robo1-Fc Slit2(-)500 μg/mL+VEGF 10 ng/mL；c. Robo1-Fc L1 500 μg/mL+VEGF 10 ng/mL。
圖8：注射細胞後28天，在對照組中及在已接受4次25 mg/kg之Robo1-Fc注射之組中之平均腫瘤重量(SCID小鼠之肝左葉中之HepG2細胞)。
圖9：注射細胞後28天，在對照組中及在每週兩次接受5 mg/kg Robo1-Fc之組中之平均腫瘤重量(SCID小鼠之一個肝葉中之Hep3B細胞)。
圖10：在對照組及在每週兩次接受5 mg/kg Robo1-Fc之組中之血漿AFP濃度。
<110>　法商賽諾菲公司
<120>　用於治療肝癌之Robo1-Fc融合蛋白
<130>　FR2010-090
<140>　100148130
<141>　2011/12/22
<150>　1061163;11306336.6
<151>　2010/12/23;2011/10/14
<160>　24
<170>　PatentIn version 3.3
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(無元件符號說明)

Claims (11)

  1. 一種重組蛋白，其包括源自Robo1蛋白之細胞外結構域或此結構域之一部分，該重組蛋白用於治療癌症。
  2. 如請求項1之重組蛋白，其用於治療肝癌。
  3. 如請求項1或2中任一項之重組蛋白，其不抑制內皮細胞增殖。
  4. 如請求項1至3中任一項之重組蛋白，此蛋白係源自Robo1之異構體b。
  5. 如請求項4之重組蛋白，其中該Robo1之細胞外結構域由該結構域之Ig1及Ig2免疫球蛋白結構域組成。
  6. 如請求項5之重組蛋白，其中該Robo1之細胞外結構域與序列SEQ ID NO.2具有至少80%一致性。
  7. 如請求項6之重組蛋白，此蛋白進一步包括連接體及免疫球蛋白Fc結構域。
  8. 如請求項7之重組蛋白，其中該Fc結構域來自人類免疫球蛋白G4。
  9. 如請求項8之重組蛋白，其中該Fc結構域含有S241P及L248E突變，且其中不存在位於C-末端位置之離胺酸。
  10. 如前述請求項中任一項之重組蛋白，其序列與序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.24具有至少80%一致性。
  11. 如前述請求項中任一項之重組蛋白，其序列係該等序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.24。
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