JP2024533616A - 新規のＷｎｔアゴニスト抗体およびその治療的使用 - Google Patents

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Abstract

Wntシグナル伝達をアゴナイズし、LRP6結合についてWntリガンドと競合せず、かつ阻害物質の存在下でWntシグナル伝達を活性化する抗体が本明細書において提供される。本開示の抗体を使用する、細胞分化および組織再生を促進するための方法も提供される。TIFF2024533616000045.tif48128

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年9月20日出願の米国仮出願第63/246,250号に対する優先権を主張するものであり、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金R01 CA118919およびR01 CA171315の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。
発明の背景
古典的Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路は、組織再生、幹細胞調節、ならびに細胞増殖および分化を含む、さまざまな生物学的プロセスに関与している(Clevers et al., Science 346(6205), 1248012 (2014)（非特許文献1）；Lien & Fuchs, Genes & Development 28(14), 1517-32 (2014)（非特許文献2）；Steinhart & Angers, Development 145 (2018)（非特許文献3）)。具体的には、スクレロスチンまたはDickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質1(DKK1)などのWntシグナル伝達阻害物質の骨変性作用の分析(Markham, Drugs 79:471-476 (2019)（非特許文献4）)によるものを含めて、骨形成における古典的Wntシグナル伝達の重要な役割がいくつかの研究によって示されている(Baron & Kneissel, Nature Med. 19:179-92 (2013)（非特許文献5）；Florio et al., Nature Comm. 12:3247 (2014)（非特許文献6）；Liu et al., Science Transl. Med. 8 (2016)（非特許文献7）；McDonald et al., Blood 129:3452-64 (2017)（非特許文献8）；Pozzi et al., Bone 53:487-96 (2013)（非特許文献9）)。具体的には、スクレロスチンの遮断が骨粗鬆症に対して臨床的に有効であることが示されており、骨粗鬆症処置向けに抗スクレロスチンモノクローナル抗体(ロモソズマブ)が認可されている。さらに、抗DKK1抗体BHQ880は、多発性骨髄腫によって引き起こされる溶骨性の骨量減少の回復について臨床的に評価されている(Fulciniti et al., Blood 114:371-79 (2009)（非特許文献10）；Iyer et al., Brit. J. Haematol. 167:366-75 (2014)（非特許文献11）；Munshi & Anderson, Clin. Canc. Res. 19:3337-44 (2013)（非特許文献12）)。
阻害性リガンドを標的とする治療は、骨形成を促進することに関して有望な結果を達成しているものの、こうした方法は、疾患領域においてWntリガンドが不在または臨床的閾値未満であれば、有効性が低くなり得る。さらに、抗阻害物質手法は、モノクローナル抗体が結合および中和するように設計される特定の阻害物質に限られる。例えば、ロモソズマブはスクレロスチンを遮断する一方で、それはDKK1を遮断せず、結果として、Wntシグナル伝達に対する阻害活性の遮断は潜在的に限られたものになる(Joiner et al., TEM 24:31-39 (2013)（非特許文献13）)。
代替的には、Wntシグナル伝達は、古典的Wnt経路アゴニストを使用して直接的に活性化され得る。古典的Wntシグナル伝達は、2つの異なるWnt共受容体である、Gタンパク質共役型受容体Frizzled (Fzd)および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5または6 (LRP5またはLRP6)によって誘導される。Wntリガンドの結合は、LRP6のリン酸化を引き起こしてシグナル伝達を開始させるFzd-Wnt-LRP6複合体の形成を導く。抗LRP6抗体による古典的Wntシグナル伝達の阻害は報告されている(Ettenburg et al., PNAS 10:15473-78 (2010)（非特許文献14）)。さらに、Wntシグナル伝達を活性化し、骨形成を促進することが可能なリガンドサロゲートベースのWntアゴニストは報告されている(Janda et al., Nature 545:234-+ (2017)（非特許文献15）)。このリガンドサロゲートベースのWntアゴニストは、抗Fzd scFvおよびDKK1 LRP6結合ドメインからなり、それによって天然のWntリガンドの機構を模倣している。抗Fzd scFvおよび抗LRP6単一ドメイン抗体からなる別のリガンドサロゲートベースのWntアゴニストも報告されている(Fowler et al., Nature Comm. 12:3247 (2021)（非特許文献16）)。多価性および架橋を利用してシグナル伝達を増強する他のWntリガンドサロゲートについても説明されており、これは、天然のWntリガンドおよびコアクチベーターによっても使用され得る機構である(Chen et al., Cell. Signal. 26:1068-74 (2014)（非特許文献17）；Tao et al., eLife 8 (2019)（非特許文献18）)。しかしながら、リガンドサロゲートベースのWntアゴニストのすべてが、受容体複合体への結合について内在性Wntリガンドと競合するものであることから、それらもまた、リガンド結合部位に結合するDKK1およびスクレロスチンなどの内在性阻害物質による阻害を受ける。
Clevers et al., Science 346(6205), 1248012 (2014) Lien & Fuchs, Genes & Development 28(14), 1517-32 (2014) Steinhart & Angers, Development 145 (2018) Markham, Drugs 79:471-476 (2019) Baron & Kneissel, Nature Med. 19:179-92 (2013) Florio et al., Nature Comm. 12:3247 (2014) Liu et al., Science Transl. Med. 8 (2016) McDonald et al., Blood 129:3452-64 (2017) Pozzi et al., Bone 53:487-96 (2013) Fulciniti et al., Blood 114:371-79 (2009) Iyer et al., Brit. J. Haematol. 167:366-75 (2014) Munshi & Anderson, Clin. Canc. Res. 19:3337-44 (2013) Joiner et al., TEM 24:31-39 (2013) Ettenburg et al., PNAS 10:15473-78 (2010) Janda et al., Nature 545:234-+ (2017) Fowler et al., Nature Comm. 12:3247 (2021) Chen et al., Cell. Signal. 26:1068-74 (2014) Tao et al., eLife 8 (2019)
発明の簡単な概要
さまざまな局面において、本明細書において開示される本発明は、下記の態様のいずれか1つまたは複数を含み得るが、それに必ずしも限定されるわけではない。
一局面では、本開示は、Wntシグナル伝達をアゴナイズし、かつWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
別の局面では、本開示は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質6 (LRP6)に特異的に結合してWntシグナル伝達をアゴナイズするモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。この局面のいくつかの態様では、抗体または抗原結合部分は、a) (1) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列；(2) SEQ ID NO:8のアミノ酸配列；(3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；(4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；(5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；(6)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または(7)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3を含む、重鎖可変ドメイン(VH)を含む。いくつかの態様では、抗体は、b) (1) SEQ ID NO:15のアミノ酸配列；(2)それぞれSEQ ID NO:26、27、および29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3；または(3)それぞれSEQ ID NO:26、27、および30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3を含む、軽鎖可変ドメイン(VL)をさらに含む。
いくつかの態様では、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、a) SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む軽鎖と、b) (1)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含むHCDR1～3を含む重鎖；(2)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；(3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；(4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または(5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3を含む重鎖と、を含む。ある特定の局面では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO:3、4、5、6、または7のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:3～7のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、(1) SEQ ID NO:8のアミノ酸配列；(2)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；(3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；(4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；(5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または(6)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3を含む重鎖を含む。いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、b) (1)それぞれSEQ ID NO:26、27、および29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3；または(2)それぞれSEQ ID NO:26、27、および30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3を含む軽鎖を含む。ある特定の局面では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、SEQ ID NO:8、9、10、11、12、または13のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16または17のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:8～13のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ヒトIgG重鎖定常領域を含む。いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、エフェクター減弱型IgG1抗体である。ある特定の態様では、エフェクター減弱型IgG1抗体は、ロイシンからアラニンへの置換を234位および235位に含むIgG1抗体である。いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、IgG2抗体である。いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、Wntリガンドに対する結合部位ともWnt阻害物質に対する結合部位とも重複しないLRP6上のエピトープに特異的に結合する。Wntリガンドは、例えば、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b、Wnts2b、またはWnt9bであり得る。Wnt阻害物質は、例えば、Dickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質1 (DKK1)、Dickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質2 (DKK2)、Dickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質3 (DKK3)、Dickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質4 (DKK4)、Dickkopf様先体タンパク質1 (DKKL1)、スクレロスチン (SOST)、Wise (SOSTDC1 (スクレロスチンドメイン含有1))、IGFBP-4、またはWaif1/5T4であり得る。いくつかの態様では、モノクローナル抗体または抗原結合部分は、非直鎖状エピトープに結合する。いくつかの態様では、エピトープは、K662およびK684を含む。いくつかの態様では、エピトープは、E663も、E708も、H834も、Y875も、M877も含まない。
別の局面では、本開示は、Wntアゴニスト抗体またはその抗原結合部分と薬学的に許容される医薬品添加物とを含む薬学的組成物を提供する。
別の局面では、Wntアゴニスト抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸配列が提供される。本開示は、核酸配列を含むベクターおよび哺乳動物宿主細胞についても説明する。いくつかの態様では、宿主細胞は、CHO、CHO-K1、CHO-S、ExpiCHO、CHO-DG44、CHO-Proマイナス、HEK293A、HEK293F細胞である。いくつかの態様では、本開示は、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の産生を可能にするための条件の下で宿主細胞を培養する工程を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を産生させるための方法を提供する。
さらに別の局面では、本開示は、本明細書において記載されるWntアゴニストモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をインビトロまたはエクスビボで細胞または組織に添加する工程を含む、組織再生を促進するための方法を提供する。
別の局面では、本開示は、組織を回復させることを、それを必要とする個体において行うための方法であって、本明細書において記載されるWntアゴニスト抗体またはその抗原結合部分を含む薬学的組成物を前記個体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様では、組織は、骨組織、腸組織、肝臓組織、または脳組織である。いくつかの態様では、個体は、Wntシグナル伝達が不十分であることによって特徴付けられる疾患または状態を有する。いくつかの態様では、個体は、加齢誘発性の骨粗鬆症、薬物誘発性の骨量減少、骨形成不全症、炎症性腸疾患、重症型アルコール性肝炎、糖尿病性網膜症、滲出型加齢黄斑変性(AMD)、フックスジストロフィー、角膜上皮幹細胞疲弊症、萎縮型AMD、シェーグレンドライアイ、短腸症候群、または難聴を有する。いくつかの態様では、本明細書において記載されるWntアゴニスト抗体またはその抗原結合部分を含む薬学的組成物は、静脈内注射、腹腔内注射、または皮下注射によって投与される。
別の局面では、本開示は、a) LRP6ポリペプチド、または少なくともLRP6ポリペプチドP3E3P4E4ドメインを含むその一部を供給する工程；b) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部を結合分子のライブラリーと接触させる工程；c) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部に結合する1つまたは複数の結合分子をライブラリーより選択する工程；およびd) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部への結合についてWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しない選択結合分子を同定する工程を含む、Wntシグナル伝達をアゴナイズし、かつWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を同定するための方法を提供する。
図1A～1Hは、LRP6への例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)の結合を実証する。図1Aおよび図1Bは、Wnt1またはWnt3aの存在下(図1A)または内在性Wntリガンドの非存在下(図1B)での100 nMのWntアゴニスト抗体による古典的Wntシグナル伝達の活性化を示すグラフである(エラーバーは、n=2のSDを表す。**P<0.01；***P<0.001.)。 図1Aの説明を参照のこと。 図1A～1Hは、LRP6への例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)の結合を実証する。図1Cは、結合アッセイにおいて使用したLRP6の欠失コンストラクトを示す模式図である(SP：シグナルペプチド；P3およびP4：それぞれベータ-プロペラドメイン3および4；E3およびE4：それぞれEGF様ドメイン3および4；LDLR：低密度リポタンパク質受容体A型ドメイン；TM：膜貫通ドメイン；Cyto：細胞質ドメイン)。 図1A～1Hは、LRP6への例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)の結合を実証する。結合アッセイの結果が図1Dに示されている。各LRP6短縮型プラスミドをGFP発現コンストラクトと共にHEK293細胞に個別にトランスフェクションした。GFP陽性細胞集団における66 IgGの結合をフローサイトメトリーによって分析した。 図1A～1Hは、LRP6への例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)の結合を実証する。図1Eは、短縮型LRP6を発現する細胞でのWntシグナル伝達の活性化に対する66抗体の効果を示すグラフである。LRP6短縮型コンストラクトおよびSTFレポータープラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションし、66 IgGありまたはなしでWnt3aCMにおいて細胞をインキュベートした。エラーバーは、n=2のSDを表す。*P<0.05、***P<0.001。N.S =有意ではない。 図1A～1Hは、LRP6への例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)の結合を実証する。図1Fは、LRP6のアラニンスキャニングによる詳細なエピトープマッピング、および66抗体の結合に対するアラニン置換の影響を示すグラフである。LRP6の一重変異体および二重変異体(K662A/K684A)をHEK293細胞に個別にトランスフェクションした。LRP6-P1ドメインに結合する抗LRP6 scFv-Fc融合体を対照として使用してLRP6の細胞表面発現を確認した。66抗体の結合はフローサイトメトリーによって決定し、蛍光強度の中央値(MFI)をP1結合scFv-FcのMFIに対して正規化した。 図1A～1Hは、LRP6への例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)の結合を実証する。図1Gは、Wnt3aリガンドの存在下または非存在下での66抗体の結合に対するLRP6二重変異体(K662A/K684A)の影響を示すグラフである。野生型LRP6 (WT)またはK662A/K684A二重変異体をコードするプラスミドをWnt3a発現プラスミドおよびSTFレポーター発現プラスミドと共にHEK293細胞にトランスフェクションし、66 IgGありまたはなしで細胞をインキュベートした。エラーバーはn = 2のSDを表す。*P<0.05。 図1A～1Hは、LRP6への例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)の結合を実証する。図1Fは、LRP6二重変異体(K662A/K684A)の構造を示し、Wnt3aリガンドへの結合に関与する残基(E663、E708、H834、Y875、M877)は黄色で示されており、66抗体への結合に関与する残基(K662AおよびK684)は赤色で示されている。 図2Aおよび図2Bは、Wnt3aリガンドおよび/または阻害物質DKK1を用いた、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)の結合キネティクスを示すグラフである。LRP6をロードしたバイオセンサーに組換えWnt3a (図2A)またはDKK1 (図2B)を結合させた。Wnt3aおよびDKK1の混合物(黒色)、Wnt3aおよび66 Fabの混合物(D中の青色)、またはDKK1および66 Fabの混合物(図2B中の赤色)中にバイオセンサーをさらに浸した。データは、Wnt3aまたはDKK1のいずれの存在下でも66抗体がLRP6に結合することを示す。 図2Aの説明を参照のこと。 図2Cは、66抗体のアゴニスト活性に対する阻害物質DKK1の影響を示すグラフである。STFレポーターおよびWnt3a発現コンストラクトをHEK293細胞にトランスフェクションした。66 IgG (50 nM)およびDKK1 (20 nM)ありまたはなしで、細胞をインキュベートした。エラーバーは、n = 2のSDを表す。 図2Dは、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体(66)が、内在性リガンドに対する相加効果を有し、阻害物質の存在下でWntシグナル伝達を活性化する、新しいタイプのWntリガンドとして働くことを示す模式的な略図である。 図3Aは、DKK1がWnt3a/RSPO2誘導性のβ-カテニンシグナル伝達を阻害することを示す。STFレポーターおよびWnt3a発現コンストラクトをHEK293細胞にトランスフェクションし、RSPO2のみ(5 nM)と共に、またはRSPO2 (5 nM) + DKK1 (15 nM)と共にHEK293細胞をインキュベートした。エラーバーは、n = 2のSDを表す。設計および結果は右パネル中に模式的にまとめられている。図3Bは、66/RSPO2誘導性のWnt/β-カテニンシグナル伝達に対する阻害効果をDKK1が有さないことを示す。STFレポーターコンストラクトをトランスフェクションしたHEK293細胞を、示されるように66 (100 nM)、RSPO2 (5 nM)、またはDKK1 (15 nM)と共にインキュベートした。Wntリガンドは添加しなかった。エラーバーは、n = 2のSDを表す。設計および結果は右パネル中に模式的にまとめられている。図3Cおよび図3Dは、RSPO2誘導性のWnt/β-カテニンシグナル伝達が66抗体によって増強されることを示す。図3Cでは、STFレポーターおよびWnt3a発現コンストラクトをトランスフェクションしたHEK293細胞に対してRSPO2を漸増させた。一定濃度の66 IgG (20 nM)を培養培地中に添加した。図3Dでは、STFレポーターおよびWnt3a発現コンストラクトをHEK293細胞にトランスフェクションし、RSPO2 (5 nM)の存在下で異なる濃度の66 IgGと共にインキュベートした。エラーバーは、n = 2のSDを表す。設計および結果は右パネル中に模式的にまとめられている。 図4は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)がインビトロで骨芽細胞分化を促進することを示す。図4Aは、ELISAアッセイにおける組換えヒトまたはマウスLRP6の細胞外ドメインへの66の種横断的結合を示すグラフである。対照IgG：非結合ヒトIgG。エラーバーは、n = 2のSDを表す。 図4は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)がインビトロで骨芽細胞分化を促進することを示す。図4Bおよび図4Cは、マウス細胞株であるMC3T3-E1 (図4B)またはC3H/10T1/2 (図4C)における66 IgGによるWnt/β-カテニンシグナル伝達の増強を示すグラフである。Wnt3a発現およびSTFレポーターコンストラクトをMC3T3-E1 (図4B)またはC3H/10T1/2 (図4C)細胞株にトランスフェクションし、66 IgGありまたはなしで細胞株をさらにインキュベートした。レポーターコンストラクトのみをトランスフェクションした対照群に対してルシフェラーゼ活性を正規化した。データは、n=2の平均値±SDを表す。*P<0.05。 図4Cの説明を参照のこと。 図4は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)がインビトロで骨芽細胞分化を促進することを示す。図4Dは、qRT-PCRによって検出された骨芽細胞マーカー遺伝子(Runx2、BMP2、ALP、およびOCN)の相対mRNA発現量を実証するグラフを示す。示されるようにWnt3aCMまたは66 IgGと共にC3H/10T1/2細胞を3日間インキュベートした。骨芽細胞マーカー遺伝子(RUNX2、BMP2、ALP、およびOCN)の発現をqRT-PCRによって評価した。比較Ct法を使用して相対mRNA発現レベルを計算し、GAPDH遺伝子に対して正規化した。*P<0.05；**P<0.01。 図4は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)がインビトロで骨芽細胞分化を促進することを示す。図4Eは、Wnt3a馴化培地の存在下または非存在下でWntアゴニスト66抗体によって誘導されたALP活性を示すグラフである。66 IgGありまたはなしでC3H/10T1/2細胞をWnt3aCM中で7日間培養した。細胞溶解物を使用してALP活性を測定し、これを、Wnt3aCMおよび66処理なしの対照群に対して正規化した。エラーバーはSD (n=2)を表す。*P < 0.05。 図4は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)がインビトロで骨芽細胞分化を促進することを示す。図4Fは、Wntアゴニスト66抗体の存在下または非存在下でWnt3a馴化培地によって誘導された相対ミネラル化率を示す(グラフで示されるか(左パネル)、またはアリザリンレッド染色で示される(右パネル))。示されるように、Wnt3aCMまたは66 IgGが補充された骨形成培地中でC3H/10T1/2細胞を21日間培養した。アリザリンレッド染色アッセイを適用してミネラル化を定量化し(左)、これを対照(Wnt3a CM-/Ab-)に対して正規化した。測定値は平均値±SD (n = 2)として示した。*P < 0.05。代表的な画像が示されている(右)。スケールバー：200μm。 図5は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が多発性骨髄腫介在性のWntシグナル伝達阻害を克服することを示す。図5Aは、3つの多発性骨髄腫細胞株に由来する培養培地によるWnt3a/β-カテニンシグナル伝達の阻害を示すグラフである。STFレポーターおよびWnt3a発現コンストラクトをトランスフェクションしたHEK293細胞を、多発性骨髄腫細胞株から得られた馴化培地(CM)中、およびHEK293から得られたCM (対照としてのもの、Ctrl-CM)中でインキュベートした。値は、n=2の平均値±SDを表す。*P < 0.05、**P < 0.01。 図5は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が多発性骨髄腫介在性のWntシグナル伝達阻害を克服することを示す。図5Bは、MM1.S培養培地によってもたらされるWntシグナル伝達阻害を66抗体が克服することを示すグラフである。STFレポーターおよびWnt3a発現コンストラクトをHEK293細胞にトランスフェクションし、HEK293細胞を異なる濃度の66 IgGと共にMM1.S-CM中でインキュベートした。値は、平均値±SD (n = 2)を表す。*P < 0.05、**P < 0.01。 図5は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が多発性骨髄腫介在性のWntシグナル伝達阻害を克服することを示す。図5Cは、MM1.S細胞を右大腿骨に大腿骨内注射し、1週間定着させた後、毎週の投薬に66抗体を使用する、動物試験の模式的な略図である。PBSまたは66 IgG (10 mg/kg)の毎週の腹腔内注射を全部で6回行った(n = 5/群)。投薬の終了から1週間後に、生きたマウス由来の大腿骨をマイクロコンピューター断層撮影によってスキャンした。インビボスキャンから1週間後、マウスを屠殺し、さらなる分析のために血清および大腿骨組織を採取した。 図5は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が多発性骨髄腫介在性のWntシグナル伝達阻害を克服することを示す。図5Dは、ナイーブであるか、またはPBSもしくは66抗体を注射したMM1.S移植マウスの血清中のヒトIgラムダ軽鎖の濃度を評価するELISAアッセイの結果を示すグラフである(ナイーブ：MM1.S移植マウス。PBS：PBS (媒体対照)を注射したMM1.S移植マウス。66：66 IgGを注射したMM1.S移植マウス。N.S.は有意ではないことを示す。***P<0.001)。 図5は、例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が多発性骨髄腫介在性のWntシグナル伝達阻害を克服することを示す。図5Eは、これらのマウスのマイクロCTから得られた大腿骨全体の平面および3Dビューを示す。マイクロCT画像の閾値を最適化して鮮明な平面断面図(上部)を生成させ、さらに再構成して積層3Dビューを得た(下部)。 図6は、大腿骨内MM1.Sモデルにおいて例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が骨量減少を逆転させることを示す。図6Aは、大腿骨中の骨梁および皮質骨の関心対象領域の3Dビューを示す。マイクロCT画像を使用して、示されるように骨梁および皮質骨領域の3Dデータセットを再構成した。 図6は、大腿骨内MM1.Sモデルにおいて例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が骨量減少を好転させることを示す。図6Bは、ナイーブマウスまたはMM1.S移植大腿骨を有するマウス(PBSもしくは66抗体を与えたもの)の骨梁ROIの代表的な画像を示す。ナイーブまたはMM1.S移植大腿骨(PBSおよび66 IgG)のマイクロCT画像を利用して骨梁領域の3D構造を再構成した。代表的な画像を示した。 図6は、大腿骨内MM1.Sモデルにおいて例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が骨量減少を好転させることを示す。図6Cおよび図6Dは、組織体積に対する骨体積(BV/TV；図6C)および骨梁幅(図6D)を含む骨梁マイクロ構造の定量化を示すグラフである。*P<0.05。 図6Cの説明を参照のこと。 図6は、大腿骨内MM1.Sモデルにおいて例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が骨量減少を好転させることを示す。図6Eは、マイクロCT画像によって視覚的に(左パネル)、および皮質骨幅の尺度としてグラフで(右パネル)示されるように、66抗体が皮質骨形成を増強したことを示す。皮質骨のマイクロCT画像を近位大腿骨領域から再構成した(左)。皮質骨幅(Ct.Th)を測定し、群間で比較した(右)。*P<0.05。 図6は、大腿骨内MM1.Sモデルにおいて例示的なWntアゴニストヒトモノクローナル抗体66 (図中では6-6として示される)が骨量減少を好転させることを示す。図6Fは、遠位大腿骨領域における骨芽細胞の組織学的評価を示し、左パネルはヘマトキシリンおよびエオシン染色を示し(左画像中に示される小パネルは右画像において拡大されており、黄色の三角形は骨芽細胞を特定している)、右パネルは骨梁表層上の骨芽細胞の数の尺度としてグラフを示す。抗体処置ありまたはなしの大腿骨をH&E染色に供した(左)。スケールバー= 50μm。黄色の矢じりは骨芽細胞を示し、骨梁表層上の骨芽細胞数(Ob.N)を数えた(右)。*P<0.05。 図7は、これまでに同定されたLRP6バインダーとは異なるLRP6上部位に66抗体(図中では6-6)が結合することを示す。LRP6発現プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションし、HEK293細胞を66またはE34N19 scFvファージと共に1時間インキュベートした。E34N19は、P3E3P4E4ドメインに結合するWntアンタゴニストとして以前に同定されたものである(Lee et al., 2018)。E34N19 IgGを競合物として同時に添加した。マウス抗fd IgGおよびPE標識化抗マウスIgGの連続インキュベートによって結合ファージを検出した。図7Aは、66抗体の解離曲線を示すグラフである。HEK293細胞を異なる濃度の66 IgGと共にインキュベートし、結合をフローサイトメトリーによって分析した。カーブフィッティングによって見かけのKD (約5.0 nM)を推定した。図7Bは、結合試験においてE34N19E IgGが66 scFvファージと競合しないことを平均蛍光強度の尺度として示すグラフである。陽性対照として、E34N19E IgGは、E34N19E scFvファージと競合する。 図7Aの説明を参照のこと。 図8Aおよび図8Bは、Rosetta抗体モジュールを使用する66抗体(図中では6-6として示される)のモデリング、およびZDOCKによる構造ドッキングを使用するLRP6-P3E3ドメイン(図8A中のPDB：3S8ZおよびPDB：4A0P)とのその相互作用を示す。(青色：66 FvのCDRH、薄灰色：LRP6-P3E3ドメイン、紫色：S2Aにおける66 Fvによる予想潜在結合部位(4オングストローム以内) (T659、G660、K662、L683、K684、T685、H698、V699、E701、F702、G703、D735、G736、Q737、H738、R739)またはS2Bにおける66 Fvによる予想潜在結合部位(4オングストローム以内) (T659、G660、V661、K662、S682、L683、K684、T685、S687、H698、V699、V700、E701、F702、D735、G736、Q737、H738、R739)。黄色：Wnt3a結合に関与する残基(E663、E708、H834、Y875、M877)) (Chen et al., 2011)。図8Cは、Wntリガンドの非存在下で阻害物質DKK1が66誘導性のWnt/β-カテニンシグナル伝達を阻害しないことを示すグラフである。STFレポーターコンストラクトをHEK293細胞にトランスフェクションし、HEK293細胞をDKK1 (15 nM)ありまたはなしで66 (100 nM)と共にインキュベートした。Wntリガンドは添加しなかった。エラーバーは、n = 2のSDを表す。*P<0.05。図8Dは、Wntリガンドの非存在下で66抗体がWnt/β-カテニンシグナル伝達を増強することを示すグラフである。STFレポーターコンストラクトをトランスフェクションしたHEK293細胞に対してWntリガンドなしで66抗体を漸増させた。カーブフィッティングによってEC50 (13.38 nM)を推定した。エラーバーは、n = 2のSDを表す。 図9は、66抗体(図中では6-6として示される)がWntリガンドおよびRSPO2と共にWnt/β-カテニンシグナル伝達増幅を相乗的に強めることを実証するグラフである。STFレポーターおよびWnt1発現コンストラクトをHEK293細胞にトランスフェクションし、HEK293細胞をRSPO2 (5 nM)の存在下で異なる濃度の66 IgGと共にインキュベートした。エラーバーは、n = 2のSDを表す。 図10は、MM1.S細胞を印付けするための抗ヒトIgラムダ軽鎖抗体を用いた、PBSまたは66抗体で処置したマウスから得られた大腿骨組織の遠位領域の免疫組織化学的染色を示す写真である。PBSまたは66処置マウスから得られた大腿骨組織をホルマリンで固定化し、パラフィンに包埋し、4μmで切片化し、抗ヒトIgラムダ(λ)軽鎖抗体で染色してMM1.S細胞を印付けし、ヘマトキシリンで対比染色した。左パネルは、腫瘍移植なしの大腿骨組織のものであり、右パネルは、MM1.Sを注射した大腿骨組織のものである。スケールバー= 100μm。 図11は、卵巣摘出誘導性の骨粗鬆症マウスモデル系における例示的なWntアゴニスト抗体(66および66-11)の効果を分析するために実施した実験の模式的な略図である。卵巣摘出の4週間後を開始時点として、示されるように5週間の間、1週間に1回、Wntアゴニスト抗体(6 mg/kgもしくは1 mg/kg)またはPBS対照を卵巣摘出マウスに腹腔内送達または皮下送達した。インビボでのマイクロCTスキャンを実施して、示される時点で遠位大腿骨に焦点を当てた。骨梁および皮質骨の両方を評価した。 図12は、図11の略図に示されるように実施した実験に由来する骨梁のマイクロCTスキャンの結果を示すグラフである。Wntアゴニスト抗体またはPBS対照の最終用量を投与してから4日の時点でマイクロCTスキャンを実施した。y軸は、総体積に対する骨梁体積を示し、x軸は、投与したものおよび投与経路を示す。x軸上の試験群当たり6匹のマウスを使用し、両足をスキャンして、ImageJ (BoneJ)による解析用の画像を生成させた。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与した。66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。* P < 0.05；*** P < 0.001。 図13Aおよび図13Bは、図11の略図に示されるように実施した実験に由来する骨梁のマイクロCTスキャンの結果を示す。Wntアゴニスト抗体またはPBS対照の最終用量を投与してから28日の時点でマイクロCTスキャンを実施した。図13Aは、グラフで結果を示す。y軸は、総体積に対する骨梁体積を示し、x軸は、投与したものおよび投与経路を示す。x軸上の試験群当たり6匹のマウスを使用し、両足をスキャンした。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与した。66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。** P < 0.01；*** P < 0.001。図13Bは、ImageJ (BoneJ)による各試験群の解析に使用した例示的な画像を示す。 図14Aおよび図14Bは、図11の略図に示されるように実施した実験に由来する骨梁のマイクロCTスキャンの結果を示す。Wntアゴニスト抗体またはPBS対照の最終用量を投与してから73日の時点でマイクロCTスキャンを実施した。図14Aは、グラフで結果を示す。y軸は、総体積に対する骨梁体積を示し、x軸は、投与したものおよび投与経路を示す。x軸上の試験群当たり6匹のマウスを使用し、両足をスキャンした。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与した。66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。** P < 0.01；*** P < 0.001。図14Bは、PBS対照試験群、および66-11抗体で皮下処置した試験群のImageJ (BoneJ)による解析に使用した例示的な画像を示す。 図15は、図11の略図に示されるように実施した実験に由来する骨梁のマイクロCTスキャンの結果を示すグラフである。Wntアゴニスト抗体またはPBS対照の最終用量を投与してから111日の時点でマイクロCTスキャンを実施した。y軸は、総体積に対する骨梁体積を示し、x軸は、投与したものおよび投与経路を示す。x軸上の試験群当たり6匹のマウスを使用し、両足をスキャンして、ImageJ (BoneJ)による解析用の画像を生成させた。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与した。66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。** P < 0.01；**** P < 0.0001。 図16は、図11の略図に示されるように実施した実験に由来する皮質骨のマイクロCTスキャンの結果を示すグラフである。Wntアゴニスト抗体またはPBS対照の最終用量を投与してから4日の時点でマイクロCTスキャンを実施した。y軸は、μmでの皮質骨幅(Ct.Th)を示し、x軸は、投与したものおよび投与経路を示す。x軸上の試験群当たり6匹のマウスを使用し、両足をスキャンして、ImageJ (BoneJ)による解析用の画像を生成させた。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与した。66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。* P < 0.05；ns：有意ではない。 図17は、図11の略図に示されるように実施した実験に由来する皮質骨のマイクロCTスキャンの結果を示すグラフである。Wntアゴニスト抗体またはPBS対照の最終用量を投与してから28日の時点でマイクロCTスキャンを実施した。y軸は、μmでの皮質骨幅(Ct.Th)を示し、x軸は、投与したものおよび投与経路を示す。x軸上の試験群当たり6匹のマウスを使用し、両足をスキャンして、ImageJ (BoneJ)による解析用の画像を生成させた。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与した。66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。* P < 0.05；ns：有意ではない。 図18は、図11の略図に示されるように実施した実験に由来する皮質骨のマイクロCTスキャンの結果を示すグラフである。Wntアゴニスト抗体またはPBS対照の最終用量を投与してから73日の時点でマイクロCTスキャンを実施した。y軸は、μmでの皮質骨幅(Ct.Th)を示し、x軸は、投与したものおよび投与経路を示す。x軸上の試験群当たり6匹のマウスを使用し、両足をスキャンして、ImageJ (BoneJ)による解析用の画像を生成させた。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与した。66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。*** P < 0.001；ns：有意ではない。 図19は、図11の略図に示されるように実施した実験に由来する皮質骨のマイクロCTスキャンの結果を示すグラフである。Wntアゴニスト抗体またはPBS対照の最終用量を投与してから111日の時点でマイクロCTスキャンを実施した。y軸は、μmでの皮質骨幅(Ct.Th)を示し、x軸は、投与したものおよび投与経路を示す。x軸上の試験群当たり6匹のマウスを使用し、両足をスキャンして、ImageJ (BoneJ)による解析用の画像を生成させた。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与した。66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。** P < 0.01；ns：有意ではない。
発明の詳細な説明
I. 序論
古典的Wnt経路をアゴナイズするが、公知のWntリガンドのサロゲートとしては働かない抗体が、本明細書において記載される。こうした新規の抗体は、内在性Wntリガンドの非存在下で古典的Wntシグナル伝達を活性化することができ、活性化は、R-スポンジンによってさらに増幅される。さらに、こうした抗体のアゴニスト活性は、DKK1およびスクレロスチンなどの内在性阻害物質によって遮断されない。こうした新規のアゴニスト抗体を使用することで、組織再生を促進することができる。例えば、古典的Wnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化してインビトロまたはエクスビボでの細胞分化または組織再生を促進するために、ならびに組織減少(例えば、骨、腸、肝臓、脳組織)および疾患または加齢によって引き起こされる他の変性状態の処置のために、アゴニスト抗体が使用され得る。
II. 定義
本明細書において使用される場合、「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」という単数形は、別に内容上明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗体(an antibody)」への言及は、2つ以上のそのような分子の組み合わせおよび同様のものを任意で含む。
「Wntアゴニスト」は、古典的Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を増大させ、それによって、例えば、組織再生および細胞分化を促進する作用物質を指す。例えば、(Clevers et al., Science 346, 54-+ (2014)；Lien & Fuchs, Genes & Development 28, 1517-1532 (2014)；Steinhart & Angers, Development 145 (2018))を参照のこと。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在する対応アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーまで、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーまでを包含する。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合したα炭素を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾R基(例えば、ノルロイシン)または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する化合物を指す。
アミノ酸は、その広く公知の3文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される1文字記号のいずれかによって、本明細書において言及され得る。ヌクレオチドも同様に、その広く認められている1文字表記によって言及され得る。
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種の核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されているか、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来するものであることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然(非組換え)形態の細胞内には見られない遺伝子を発現するか、またはその他の形で異常に発現する、発現が低下している、もしくは全く発現しない天然の遺伝子を発現する。
抗体は、本明細書において記載される場合、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなり得る。認知されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは、ひいては、それぞれ免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを規定する。いくつかの態様では、抗体は、IgG (例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD、またはIgEである。
典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含むことが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一ペアから構成され、各ペアは1つの「軽」鎖(約25kD)および1つの「重」鎖(約50～70kD)を有する。各鎖のN末端は、抗原認識を主に担う約100～110個またはそれ超のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、結合特異性を保持する抗体断片を含む。例えば、よく特徴付けられている抗体断片がいくつか存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド連結に対してC末端側で抗体を消化して、ジスルフィド結合によって自体がVH-CH1に繋がれた軽鎖であるFabの二量体であるF(ab)’2を生成させる。F(ab)’2は、穏和な条件の下で還元されてヒンジ領域中のジスルフィド連結が切断され、それによって(Fab’)2二量体からFab’単量体へと変換され得る。Fab’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を有するFabである(他の抗体断片のより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照のこと)。インタクトな抗体の消化に関してさまざまな抗体断片が定義されているが、化学的に、または組換えDNA方法論を利用することによって、断片をデノボ合成できることを当業者なら理解するであろう。したがって、抗体という用語は、本明細書において使用される場合、抗体全体の修飾によって生成される抗体断片、または組換えDNA方法論を使用して合成される抗体断片をいずれも含む。
抗体においては、置換バリアントは、少なくとも1つのアミノ酸残基が除去されており、その場所に異なる残基が挿入されている。置換による変異導入に最も関心が寄せられる部位には超可変領域が含まれるが、フレームワーク改変も企図される。保存的置換の例は上に記載されている。
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、(a)例えば、β-シートまたはらせん立体配座などの、置換のエリア中のポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の嵩高さを維持することに対するその効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、下記の共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
(1)非極性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)電荷を伴わない極性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(負荷電)：Asp、Glu；
(4)塩基性(正荷電)：Lys、Arg；
(5)鎖の配向に影響を与える残基：Gly、Pro；および
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスのものに交換することによって生じさせる。
生じさせることができる置換の種類の1つは、化学的に反応性であり得る抗体中の1つまたは複数のシステインを、アラニンまたはセリンなどであるが、それに限定されるわけではない別の残基へと変更することである。例えば、非古典的システインの置換が存在し得る。置換は、可変ドメインの相補性決定領域(CDR)もしくはフレームワーク領域、または抗体の定常領域に生じさせることができる。いくつかの態様では、システインは古典的なもの(例えば、ジスルフィド結合形成に関与するもの)である。抗体の適切な立体配座を維持することに関与しない任意のシステイン残基もまた、一般にはセリンで置換されて、分子の酸化安定性が改善され、異常な架橋が阻止され得る。逆に、特に抗体がFv断片などの抗体断片である場合、システイン結合(複数可)が抗体に付加されて、その安定性が改善され得る。
抗体には、可変重領域および可変軽領域が(直接的に、またはペプチドリンカーを介して)一緒に繋がれて連続ポリペプチドを形成する一本鎖Fv抗体(sFvまたはscFv)などの一本鎖抗体(単一ポリペプチド鎖として存在する抗体)を含むVH-VL二量体が含まれる。一本鎖Fv抗体は、直接的に繋がれるか、またはペプチドコードリンカーによって繋がれるかのいずれかである、VHコード配列およびVLコード配列を含む核酸から発現し得る共有結合で連結されたVH-VLである(例えば、Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)。VHおよびVLは単一ポリペプチド鎖として互いに結ばれる一方で、VHおよびVLドメインは非共有結合で結び付く。代替的には、抗体は別の断片であり得る。他の断片もまた、例えば組換え手法を使用して、可溶性タンパク質として、またはディスプレイ法から得られる断片として生成され得る。抗体には、ダイアンチボディ(diantibody)またはミニ抗体も含まれ得る。組織再生を促進するための、および組織減少(例えば、骨組織、腸組織、肝臓組織、または脳組織の減少)を処置するためのWntアゴニスト抗体には、ラクダ由来の抗体などの重鎖二量体も含まれる。いくつかの態様では、抗体は二量体である。他の態様では、抗体は、活性なアイソタイプを有する単量体形態であり得る。いくつかの態様では、抗体は、多価形態、例えば、三価または四価形態である。
本明細書において使用される場合、「可変領域」および「可変ドメイン」という用語は、相補性決定領域(CDR、例えば、HCDR1、HCDR2、HCR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)ならびにフレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列を含む、抗体の軽鎖および重鎖の一部を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、一般に、それぞれVHおよびVLと呼ばれる。可変領域は、本明細書において記載されるFab、F(ab’)2、Fv、およびscFv抗体断片上に含まれており、特異的抗原認識に関与する。
本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」または「CDR」は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域によって確立される4つのフレームワーク領域を分断する各鎖中の3つの超可変領域を指す。CDRは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。各鎖のCDRは、典型的には、N末端から始まって連続的に付番されるCDR1、CDR2、およびCDR3と称され、典型的には、特定のCDRが位置する鎖によっても同定される。したがって、VH CDR3は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、一方、VL CDR1は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成軽鎖および重鎖の統合フレームワーク領域は、三次元空間でCDRを位置決めし、整列させる上で役立つ。
別段の指定がない限り、本明細書において論じられる重鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、およびCDR3は、North法によって決定される(例えば、North et al., J. Mol. Biol. 406(2):228-256, 2011を参照のこと)。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、およびSEQ ID NO:17の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、North法によって決定されるCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。North法は、Chothia付番スキームを開発することにおいて使用されたセットよりも15倍大きな抗体構造のデータセットを使用して開発された。CDRの境界位置を定義することにおいて、North法では、1)抗体間の構造可変性がほぼ存在せず(各CDRループのアンカー(ループの直前または直後の残基)がフレームワークと比較して密にクラスター化した立体配座を含む)、かつ2)β-シートフレームワークにおいて互いに向かい合う(すなわち、フレームワークへと広がる長さが等しい)位置が選択された。Northでは、CDRは、それらがVHおよびVLドメインの間で、程度の差はあれ、対称となるように定義された。
他の態様では、抗体のCDRは、当技術分野において周知の他のさまざまな定義、例えば、Kabat、Chothia、国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)、およびAbMを使用して決定され得る(例えば、前記のJohnson et al.；Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917；Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883；Chothia C. et al., 1992, Structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817；Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 1997, 273(4)を参照のこと)。抗原と結合する部位の定義は、以下のものにも記載されている：Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000)；およびLefranc, M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1；29(1):207-9 (2001)；MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996)；およびMartin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989)；Martin et al., Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991)；Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126, (1992)；ならびにRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)。
本明細書において使用される場合、「キメラ抗体」は、(a)異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および/もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに抗原結合部位(可変領域)が連結されるように、定常領域またはその一部が改変されている、置き換えられている、または交換されているか、あるいは(b)異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域もしくはその一部、または別の種由来もしくは別の抗体クラスもしくはサブクラス由来の対応配列を用いて、可変領域またはその一部が改変されている、置き換えられている、または交換されている、免疫グロブリン分子を指す。
本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」は、ドナー抗体由来のCDRがヒトフレームワーク配列上に移植された免疫グロブリン分子を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク配列中にもドナー起源の残基を含み得る。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部も含み得る。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列中にも見られない残基も含み得る。ヒト化は、「超ヒト化」抗体(Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002)ならびに「リサーフェイシング(resurfacing)」(例えば、Staelens et al., Mol. Immunol. 43: 1243, 2006；およびRoguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994)などの手法を含む、当技術分野において公知の方法(例えば、Jones et al., Nature 321:522-525; 1986；Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988: Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992；米国特許第4,816,567号)を使用して実施され得る。
「抗原」、「免疫原」、「抗体標的」、「標的アナライト」という用語、および同様の用語は、抗体によって認識される、すなわち、抗体によって特異的に結合され得る分子、化合物、または複合体を指すために本明細書において使用される。該用語は、抗体によって特異的に認識され得る任意の分子を指し得、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖質、脂質、化学的部分、またはそれらの組み合わせ(例えば、リン酸化もしくはグリコシル化されたポリペプチドなど)を指し得る。該用語は、あらゆる文脈において分子が免疫原性であることを示すものでなく、単に、それが抗体によって標的とされ得ることを示すものであることを当業者なら理解するであろう。
抗体は、抗原上の「エピトープ」に結合する。エピトープは、抗体によって認識および結合される抗原上の局在化部位である。エピトープは、少数のアミノ酸または少数のアミノ酸の一部、例えば、5つもしくは6つまたはそれ超、例えば、20個またはそれ超のアミノ酸、あるいはそれらのアミノ酸の一部を含み得る。場合によっては、エピトープは、非タンパク質成分、例えば、糖質、核酸、または脂質に由来するものを含み得る。場合によっては、エピトープは三次元部分である。したがって、例えば、標的がタンパク質である場合、エピトープは連続アミノ酸から構成されるか、またはタンパク質フォールディングによって近くに寄せ集められるタンパク質の異なる部分に由来するアミノ酸から構成され得る(例えば、非連続エピトープ)。三次元構造を形成する他のタイプの標的分子にも同じことが当てはまる。エピトープは、典型的には、少なくとも3つ、より通常は、少なくとも5つ、または8～10個のアミノ酸を特有の空間立体配座で含む。エピトープの空間立体配座を決定する方法には、例えば、x線結晶構造解析法および二次元核磁気共鳴法が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照のこと。
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、放射線学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な診断剤または成分である。例示的な標識には、放射標識(例えば、111In、99mTc、131I、67Ga)および他のFDA認可造影剤が含まれる。追加の標識には、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えば放射標識をターゲティング物質に組み入れることによって検出可能になり得るタンパク質または他の実体が含まれる。核酸またはナノ担体を標識にコンジュゲートするための当技術分野において公知の任意の方法が、例えばHermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diegoに記載の方法を使用して、用いられ得る。
「標識化」または「タグ付き」抗体または作用物質は、抗体または作用物質の存在が抗体または作用物質に結合した標識の存在を検出することによって検出され得るように、リンカーもしくは化学結合を介して共有結合で、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、もしくは水素結合を介して非共有結合で標識に結合されたものである。
検出可能なおよび治療用の作用物質を抗体にコンジュゲートするための手法は周知である(例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery” in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates,” Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照のこと)。
「～に特異的」、「特異的に結合する」という用語、および同様の用語は、非標的化合物よりも少なくとも2倍高い親和性で分子(例えば、抗体または抗体断片)が標的に結合することを指し、例えば、同じ結合親和性アッセイ条件の下でアッセイした場合、非関連標的と比較して標的に対する親和性が少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍、またはそれ超のいずれかであることを指す。例えば、標的(例えば、ヒトまたはマウスLRP6)に特異的に結合する抗体は、典型的には、非標的よりも少なくとも2倍高い親和性で標的に結合する。特異性は、標準的な方法、例えば、固相ELISA免疫アッセイ(例えば、特異的な免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイ形式および条件の説明については、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivityを参照のこと)を使用して決定され得る。ある特定の態様では、「特異的結合」、特定の標的「に特異的に結合する」、または特定の標的「に特異的である」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、分子(例えば、抗体)が、標的に対して、例えば、10-2 M未満、例えば、10-3 M、10-4 M、10-5 M、10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、または10-12 Mの平衡解離定数KDを有することによって示され得る。いくつかの態様では、抗体は、100 nM未満または10 nM未満のKDを有する。
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびその一本鎖または二本鎖形態のポリマー、ならびにその相補鎖を指す。該用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは連結を含む、合成の核酸、天然に存在する核酸、および天然に存在しない核酸、参照核酸と類似の結合特性を有する核酸、ならびに参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
別段の指定がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列に加えて、その保存的に修飾されたバリアント(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択される(またはすべての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることによって達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、以下に記載のデフォルトパラメーターを用いてBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを使用して測定するか、または手動アライメントおよび視覚的検証によって測定した場合に2つ以上の配列または部分配列が同じであること、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定の割合で有すること(すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域にわたる一致が最大となるように比較およびアライメントされた場合、特定の領域にわたる同一性が約60%、好ましくは、同一性が65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ超であること)を指す(例えば、NCBIウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/BLAST/または同様のものを参照のこと)。そのような配列は、ひいては、「実質的に同一」と言われる。以下に記載のように、好ましいアルゴリズムはギャップおよび同様のものを考慮し得るものである。好ましくは、同一性は、少なくとも約25のアミノ酸長またはヌクレオチド長である領域にわたって存在し、より好ましくは、50～100またはそれ超のアミノ酸長またはヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
配列比較については、典型的には、1つの配列が、試験配列の比較対象となる参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または代替パラメーターが指定され得る。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用される場合、2つの配列が最適にアライメントされた後に同じ連続位置数の参照配列と配列が比較され得る、約20～600、通常は、約50～約200、より通常は、約100～約150からなる群より選択される連続位置数のいずれか1つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアライメントの方法は当技術分野において周知である。
配列同一性および配列類似性パーセントを決定する上で適したアルゴリズムはBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。本開示の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定するためには、本明細書において記載されるパラメーターを用いてBLASTおよびBLAST 2.0が使用される。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列中の長さWの短い文字列を同定することによって高スコア配列ペア(HSP)を最初に同定する工程を含み、該文字列は、データベース配列中の同じ長さの文字列とアライメントした場合にマッチするか、または何らかの正の値の閾値スコアTを満たすかのいずれかのものである。Tは、隣接文字列スコア閾値と称される(前記のAltschul et al.)。こうした最初の隣接文字列ヒットは、それを含むより長いHSPが発見されるように検索を開始するためのシードとして働く。文字列ヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターM (マッチ残基のペアに対する報酬スコア；常に>0)およびパラメーターN (ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に<0)を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコア付け行列を使用して累積スコアが計算される。各方向への文字列ヒットの拡張は以下の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大達成値からX量分低下した場合；1つもしくは複数の負のスコア付け残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアが0以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメーターであるW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)では、11である文字列長(W)、10である期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較がデフォルトとして使用される。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムでは、3である文字列長、および10である期待値(E)、およびBLOSUM62スコア付け行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと)、50であるアライメント(B)、10である期待値(E)、M=5、N=-4、ならびに両鎖の比較がデフォルトとして使用される。
「対照」試料または値は、試験試料との比較のための参照、通常は公知の参照となる試料を指す。例えば、試験試料は、例えば、試験化合物の存在下といった試験条件から取得され、例えば、試験化合物の非存在下(陰性対照)または公知の化合物の存在下(陽性対照)といった公知の条件から得られる試料と比較され得る。対照は、複数の試験または結果から集められた平均値または範囲も表し得る。任意の数のパラメーターの評価のために対照が設計され得ることを当業者なら認識するであろう。例えば、対照は、薬理学的データ(例えば、半減期)または治療尺度(例えば、利点および/もしくは副作用の比較)に基づいて治療利点が比較されるように考案され得る。対照はインビトロ用途向けに設計され得る。当業者なら、所与の状況においてどの対照が有益であるかを理解し、対照値との比較に基づいてデータを解析できるであろう。対照は、データの有意性を決定する上でも有益である。例えば、対照において所与のパラメーターの値が大幅に変動するのであれば、試験試料における変動は有意とは見なされない。
本明細書における「治療有効用量」、「有効用量」、または「治療有効量」という用語は、投与の目的である効果をもたらす用量が意図される。正確な用量および製剤は処置の目的に依存し、公知の手法を使用して当業者によって確かめることができる(例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003)、およびPickar, Dosage Calculations (1999)を参照のこと)。例えば、所与のパラメーターについては、治療有効量は、少なくとも任意の5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%の、治療効果の増加または減少を示す。治療効力は、増加または減少の「倍率」としても表され得る。例えば、治療有効量は、対照を少なくとも1.2倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、またはそれを上回る効果を有し得る。
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語、薬学的組成物における医薬品添加物または希釈剤。薬学的に許容される担体は、製剤のその他の成分と適合し、かつレシピエントに無害でなくてはならない。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、適切な薬学的安定性を活性成分に付与しなくてはならない。担体の性質は投与の仕方によって異なる。例えば、静脈内投与については、水性溶液担体が一般に使用され；経口投与については、固体担体が好ましい。
「アゴナイズする」、「アゴナイズすること」という用語または同様のものは、古典的Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路をアゴナイズする文脈において使用される場合、同じ条件であるが、本明細書において記載される抗体(例えば、Wntアゴニスト抗体)の非存在下で得られる標準値と比較したときの、Wntシグナル伝達を反映するパラメーターの量の任意の検出可能な正の変化または増加を指す。本明細書において記載される抗体への曝露の後のこの増加のレベルは、いくつかの態様では、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である。
「競合する」という用語は、抗体に関して本明細書において使用される場合、第1の抗体またはその抗原結合部分が第2の抗体もしくはその抗原結合部分またはリガンドもしくは阻害物質と結合について競合することを意味し、この場合、第1の抗体とのその関連エピトープとの結合は、第2の抗体、リガンド、または阻害物質の非存在下での第1の抗体の結合と比較して、第2の抗体、リガンド、または阻害物質の存在下で検出可能に減少する。別の可能性としては、その場合、第2の抗体、リガンド、または阻害物質のそのエピトープへの結合もまた、第1の抗体の存在下で検出可能に減少するが、必ずしもそうはなり得ない。すなわち、第1の抗体は、第2の抗体、リガンド、または阻害物質のそのエピトープへの結合を、その第2の抗体、リガンド、または阻害物質が第1の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく阻害し得る。しかしながら、各抗体、リガンド、または阻害物質が、もう一方の抗体、リガンド、または阻害物質とその関連エピトープまたはリガンドとの結合を程度の差に関係なく検出可能に阻害する場合、これらの抗体は、それらのそれぞれのエピトープ(複数可)の結合について互いに「交差競合する(cross-compete)」と言われる。競合抗体および交差競合抗体は両方共、本開示によって包含される。そのような競合または交差競合が生じる機構(例えば、立体障害、立体配座変化、または共通エピトープもしくはその一部への結合、および同様のもの)が何であれ、そのような競合および/または交差競合抗体が包含され、本明細書において開示される方法に有用であり得ることを、当業者なら本明細書において提供される教示に基づいて理解するであろう。
例えば以下の、多数のタイプの競合結合アッセイが公知である：固相直接または間接放射免疫アッセイ(RIA)、固相直接または間接酵素免疫アッセイ(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)を参照のこと)；固相直接ビオチン-アビジンEIA (Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)を参照のこと)；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照のこと)；I-125標識を使用する固相直接標識RIA(Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)を参照のこと)；固相直接ビオチン-アビジンEIA (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990))；および直接標識化RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990))。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面に結合した精製抗原またはこうしたもののいずれかを有する細胞、非標識化試験免疫グロブリン、および標識化参照免疫グロブリンの使用を含む。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗体(競合抗体)には、参照抗体のものと同じエピトープに結合する抗体、および参照抗体によって結合されるエピトープに十分に近位の隣接エピトープに、立体障害が生じるように結合する抗体が含まれる。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは共通抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも50または75%阻害する。
「処置する」および「処置」という用語は、治療的処置と予防的または阻止的な手段との両方を指すために本明細書において使用され、目的は、望ましくない生理学的変化または障害を阻止すること、または遅延させることである。本開示の目的については、有益または所望の臨床結果には、検出可能か検出不可能かとは無関係に、組織減少が減ること、細胞分化または組織再生が促進されること、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態が安定化すること(すなわち、悪化しないこと)、疾患進行の鈍化または遅延、疾患状態の軽快または緩和、および寛解(部分的または完全を問わず)が含まれるが、それに限定されるわけではない。「処置」は、処置を受けない場合の予測生存期間と比較して生存期間が延びることも意味し得る。
III. Wntアゴニスト抗体
Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路をアゴナイズする抗体(抗体断片を含む)が提供される。LRP6に特異的に結合し、組織減少を処置または阻止するために使用され得るアゴニスト抗体が提供される。ヒトLRP6アミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号O75581で見つけることができる。マウスLRP6アミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号O88572で見つけることができる。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、公知のWntリガンドに対する結合部位ともWnt阻害物質に対する結合部位とも重複しない、LRP6上のエピトープに特異的に結合する。Wntリガンドは、例えば、Wnt1、Wnt2、Wnt2b (Wnt13)、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a (Wnt14)、Wnt9b (Wnt14b)、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、またはWnt16であり得る。ある特定の態様では、Wntリガンドは、古典的シグナル伝達経路に関与する(例えば、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b、Wnts2b、およびWnt9b)。Wnt阻害物質は、例えば、Dickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質1 (DKK1)、Dickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質2 (DKK2)、Dickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質3 (DKK3)、Dickkopf Wntシグナル伝達経路阻害物質4 (DKK4)、Dickkopf様先体タンパク質1 (DKKL1)、スクレロスチン (SOST)、Wise (SOSTDC1 (スクレロスチンドメイン含有1))、IGFBP-4、またはWaif1/5T4であり得る。いくつかの態様では、モノクローナル抗体または抗原結合部分は非直鎖状エピトープに結合する。いくつかの態様では、モノクローナル抗体または抗原結合部分はLRP6のP3ドメインに結合する。いくつかの態様では、エピトープは、K662およびK684を含む。いくつかの態様では、エピトープは、E663も、E708も、H834も、Y875も、M877も含まない。
いくつかの態様では、本開示のWntアゴニスト抗体は、表1および2に記載の重鎖相補性決定領域1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、軽鎖相補性決定領域1 (LCDR1)、LCDR2、LCDR3、重鎖可変領域(VH)、および/または軽鎖可変領域(VL)の配列を含む。表1および2に記載のCDRは、North法によって決定されたものである(例えば、North et al., J. Mol. Biol. 406(2):228-256, 2011を参照のこと)。
Figure 2024533616000002
Figure 2024533616000003
Figure 2024533616000004
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000005
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000006
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。いくつかの態様では、抗体は、66-11抗体である。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000007
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000008
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000009
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000010
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000011
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000012
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000013
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000014
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000015
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000016
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000017
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000018
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000019
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000020
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000021
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000022
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000023
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000024
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000025
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000026
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000027
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000028
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000029
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000030
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000031
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000032
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
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に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000034
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000035
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000036
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000037
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000038
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000039
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000040
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体は、LRP6に特異的に結合する可変領域を含み、重鎖可変領域は、以下：
Figure 2024533616000041
に示される全重鎖可変配列のCDRまたは全重鎖可変配列を含み、以下：
Figure 2024533616000042
に示される全軽鎖可変配列のCDRまたは全軽鎖可変配列を含む軽鎖可変領域と組み合わせられる。
いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:3～7のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:8～13のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)を有する軽鎖可変領域を含む。
本明細書において記載されるWntアゴニスト抗体のいずれも、1つまたは複数のヒトフレームワーク領域(例えば、1つ、2つ、3つ、または4つのFR)を含み得る。いくつかの態様では、1つまたは複数のヒトフレームワーク領域は、少なくとも1つの復帰変異を含む。
さらなる態様では、本明細書において記載されるWntアゴニスト抗体は、マウスLRP6と交差反応し得る。ある特定の態様では、Wntアゴニスト抗体は、古典的Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路をアゴナイズする。さらに、Wntアゴニスト抗体は、LRP6結合についてWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しない。さらに、Wntアゴニスト抗体は、Wnt阻害物質の存在下および/またはWntリガンドの非存在下で古典的Wnt経路を活性化し得、RSPO2の存在下でシグナル伝達Wnt/β-カテニンシグナル伝達を増幅し得る。
いくつかの態様では、PEG化または長鎖ポリエチレングリコールポリマー(PEG)の組み込みなど、(例えば、ポリペプチド鎖内に、またはN末端もしくはC末端のいずれかにおいて)抗体に修飾が任意で導入されることで、例えば、インビボ半減期が延長され得る。PEGまたはPEGの長鎖ポリマーの導入は、ポリペプチドの有効分子量を増加させることで、例えば、尿中への急速ろ過を阻止する。いくつかの態様では、配列中のリジン残基は、直接的に、またはリンカーを介して、PEGにコンジュゲートされる。そのようなリンカーは、例えば、適切に修飾されたPEG鎖への連結のためのチオール官能基を含むGlu残基またはアシル残基であり得る。PEG鎖を導入するための代替方法は、ArgまたはLys残基に対する置換など、C末端または溶媒露出残基においてCys残基を最初に導入するものである。その後、このCys残基は、例えばマレイミド官能基を含むPEG鎖に部位特異的に付加される。PEGまたはPEGの長鎖ポリマーを導入するための方法は、当技術分野において公知であり(例えば、Veronese, F. M., et al., Drug Disc. Today 10: 1451-8 (2005)；Greenwald, R. B., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 217-50 (2003)；Roberts, M. J., et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 459-76 (2002)に記載されている)、これらの内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
ある特定の態様では、ポリペプチドのグリコシル化を改変するために、抗体の特定の変異が作製され得る。そのような変異は、O結合型またはN結合型グリコシル化部位を含むが、それに限定されるわけではない1つまたは複数のグリコシル化部位を導入または排除するように選択され得る。ある特定の態様では、タンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して改変されていないグリコシル化部位およびパターンを有する。ある特定の態様では、タンパク質のバリアントはグリコシル化バリアントを含み、天然に存在するタンパク質と比較してグリコシル化部位の数および/または種類が改変されている。ある特定の態様では、ポリペプチドのバリアントは、天然のポリペプチドと比較して多いまたは少ない数のN結合型グリコシル化部位を含む。N結合型グリコシル化部位は、配列：Asn-X-SerまたはAsn-X-Thrによって特徴付けられ、配列中、Xと表記されるアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、N結合型糖鎖の付加のための新たな潜在部位を与える。代替的には、この配列を排除する置換は、現存するN結合型糖鎖を除去する。ある特定の態様では、N結合型糖鎖の再編成が施され、1つまたは複数のN結合型グリコシル化部位(典型的には、天然に存在するもの)が排除され、1つまたは複数の新たなN結合型部位が作製される。
モノクローナル抗体ならびにキメラおよび特にヒト化抗体は、本明細書において記載される抗体のヒトへの治療的使用に特に有用なものである。モノクローナル抗体は、当業者によく知られているさまざまな手法によって得ることができる。簡潔に記載すると、所望の抗原で免疫化された動物に由来する脾臓細胞が、一般には骨髄腫細胞との融合によって不死化される(例えば、Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)を参照のこと)。不死化の代替方法には、エプスタイン・バーウイルス、がん遺伝子、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当技術分野において周知の他の方法が含まれる。抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生について、単一の不死化細胞から生じるコロニーがスクリーニングされ、そのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含むさまざまな手法によって増強され得る。代替的には、Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)によって概説される一般プロトコールに従ってヒトB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合断片をコードするDNA配列を単離することができる。
さらに、モノクローナル抗体は収集され、免疫アッセイ、例えば、固相担体上に固定化されたリガンドを用いる固相免疫アッセイにおいて、LRP6ポリペプチドに対して力価測定され得る。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、少なくとも約0.1 mM、例えば、少なくとも約1μM、例えば、少なくとも約0.1μMまたはそれよりも良好な値、例えば、0.01μMまたはそれ未満のKdで結合し得る。
本開示の免疫グロブリンは、その結合断片および他の誘導体を含めて、トランスフェクションされた細胞(例えば、骨髄腫もしくはハイブリドーマ細胞などの不死化真核細胞)における、またはマウス、ラット、ウサギ、もしくは周知の方法によって抗体を産生することが可能な他の脊椎動物における発現によるものを含むさまざまな組換えDNA手法によって容易に産生され得る。一局面では、Wntアゴニスト抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸配列が提供される。本開示は、核酸配列を含むベクターおよび哺乳動物宿主細胞についても説明するものである。いくつかの態様では、哺乳動物宿主細胞は、CHO、CHO-K1、CHO-S、ExpiCHO、CHO-DG44、CHO-Proマイナス、HEK293A、HEK293F細胞である。いくつかの態様では、本開示は、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の産生を可能にするための条件の下で宿主細胞を培養する工程を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を産生させるための方法を提供する。DNA配列に適した供給源細胞、ならびに免疫グロブリン発現および分泌のための宿主細胞は、American Type Culture Collection (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Fifth edition (1985) Rockville, Md)などの複数の供給源から得ることができる。
いくつかの態様では、抗体は、Fab、F(ab’)2、Fv、またはscFvなどの抗体断片である。抗体断片は、化学消化(例えば、パパインまたはペプシン)および組換え法を含む、当技術分野において公知の任意の手段を使用して生成され得る。組換え核酸を単離および調製するための方法は、当業者に公知である(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2d ed. 1989)；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995)を参照のこと)。抗体は、大腸菌(E. coli)、他の細菌宿主、酵母、ならびにCOS、CHO、ならびにHeLa細胞株および骨髄腫細胞株などのさまざまな高等真核細胞を含むさまざまな宿主細胞において発現し得る。
競合結合アッセイを使用することで、LRP6に対する特異的結合について本明細書において記載される抗体と競合する抗体が同定され得る。当技術分野において公知の複数の競合結合アッセイのいずれかを使用することで、同じ抗原に対する2つの抗体の間の競合が測定され得る。簡潔に記載すると、異なる抗体が別の抗体の結合を阻害する能力が試験され得る。例えば、抗体は、サンドイッチELISAアッセイを使用して、それらが結合するエピトープによって区別され得る。これは、捕捉抗体を使用してウェルの表面をコートすることによって実施され得る。その後、捕捉表面に対して飽和濃度未満のタグ付き抗原が添加され得る。このタンパク質は、特異的な抗体：エピトープ相互作用を介して抗体に結合し得る。洗浄後、検出可能な部分(例えばHRPであり、標識化抗体は検出抗体として定義される)に共有結合で連結されている第2の抗体がELISAに添加され得る。この抗体が捕捉抗体と同じエピトープを認識するのであれば、その特定のエピトープはもはや結合に利用不可能であろうから、それは標的タンパク質に結合できないことになる。一方で、この第2の抗体が標的タンパク質上の異なるエピトープを認識するのであれば、それは結合できることになり、この結合は、関連基質を使用して活性(ひいては、結合した抗体)のレベルを定量化することによって検出され得る。バックグラウンドは、捕捉抗体および検出抗体の両方として単一抗体を使用して定義することができ、一方、最大シグナルは、抗原特異的抗体で捕捉し、抗原上のタグに対する抗体で検出することによって確立することができる。バックグラウンドおよび最大シグナルを参照として使用することによってペアワイズ様式で抗体を評価してエピトープ特異性が決定され得る。いくつかの態様では、上記のアッセイのいずれかを使用して抗原への第2の抗体の結合が第1の抗体の存在下で少なくとも30%、通常は少なくとも約40%、50%、60%、または75%、多くの場合は少なくとも約90%減少するのであれば、第1の抗体は、第2の抗体の結合を競合的に阻害すると見なされる。
本明細書において記載される抗体は、Fcポリペプチドを含み得る。Fcポリペプチドは、野生型Fcポリペプチド、例えば、ヒトIgG1 Fcポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、本明細書において記載される抗体におけるFcポリペプチドは、エフェクター機能を調節するアミノ酸置換を含み得る。
IV. 組織再生を促進するための方法
本明細書において記載される抗体(抗体断片を含む)はWnt/β-カテニンシグナル伝達経路をアゴナイズし、組織再生を促進する。さまざまな状態および疾患が、例えば、骨組織、腸組織、肝臓組織、または脳組織などの組織の変性または減少を引き起こし得る。本明細書において記載されるWntアゴニスト抗体は、その組織の細胞におけるWnt/β-カテニンシグナル伝達経路をアゴナイズすることによってそのような組織を再生するために使用され得る。
いくつかの態様では、Wntアゴニスト抗体は、抗体またはその抗原結合部分を細胞にインビトロで添加することによってインビトロでの細胞分化または組織再生を促進するために使用され得る。
他の態様では、抗体またはその抗原結合部分はエクスビボで投与される。そのような態様では、再生を必要とする個体の組織から細胞または組織の一部が取り出され、細胞または組織に対して抗体またはその抗原結合部分がエクスビボで投与される。その後、処理された細胞または組織は個体に戻される。
他の態様では、Wntアゴニスト抗体は、組織を回復させることを、それを必要とする個体において行うために使用され得る。ある特定の態様では、個体は、例えば、骨組織、腸組織、肝臓組織、または脳組織などの組織の変性または減少を伴う疾患または状態を有し得る。いくつかの態様では、個体は、Wntシグナル伝達が不十分であることが疾患もしくは状態および/またはその進行に寄与する疾患または状態を有する。いくつかの態様では、個体は、加齢誘発性の骨粗鬆症、薬物誘発性の骨量減少、骨形成不全症、微小重力誘発性の骨量減少、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、関節リウマチ、糖尿病、慢性腎疾患、若年性関節炎、認知症、アルツハイマー病、脳卒中、肝硬変、肝炎、慢性アルコール依存、重症型アルコール性肝炎、糖尿病性網膜症、滲出型加齢黄斑変性(AMD)、フックスジストロフィー、角膜上皮幹細胞疲弊症、萎縮型AMD、シェーグレンドライアイ、短腸症候群、難聴および/または骨組織、腸組織、肝臓組織、もしくは脳組織のうちの1つまたは複数に影響する自己免疫疾患(例えば、原発性胆汁性胆管炎)を有する。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分は個体に投与される。いくつかの態様では、本明細書において記載されるWntアゴニスト抗体またはその抗原結合部分を含む薬学的組成物は、静脈内注射、腹腔内注射、または皮下注射によって投与される。他の態様では、当技術分野において公知のさまざまな他の投与手段のいずれか1つが使用され得る。
いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分は、組織減少を阻止するまたは組織再生を促進するための他の処置と組み合わせて処置することを、それを必要とする個体において行うために使用され得る。例えば、いくつかの局面では、抗体またはその抗原結合部分は、骨量減少が生じている患者を処置するために、ビスホスホネート；カルシトニン；ホルモン療法；副甲状腺ホルモン(PTH)類似体；副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHrp)類似体；RANKリガンド(RANKL)阻害物質；ロモソズマブ；またはそれらの組み合わせに加えて使用される。
V. 薬学的組成物
組織再生を促進し、組織減少(例えば、骨組織、腸組織、肝臓組織、または脳組織の減少)を処置するためのWntアゴニスト抗体は、薬学的組成物において提供され得る。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的には決定される。したがって、本開示の薬学的組成物の適切な製剤は多種多様なものが存在する(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照のこと)。
投与に適した製剤には、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝剤、細菌増殖抑制剤、および製剤を等張にする溶質を含み得る等張滅菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの、単位用量または複数用量が密封された容器中に存在し得る。溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。調節剤もまた、調製される食品または薬物の一部として投与され得る。
ある特定の態様では、薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技能に含まれる。ある特定の態様では、製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。ある特定の態様では、生理学的pHまたは少し低いpH、典型的には、約5～約8のpH範囲内に組成物を維持するために緩衝剤が使用される。
ある特定の態様では、非経口投与が企図される場合、治療組成物は、薬学的に許容される媒体中にWntアゴニスト抗体を含む発熱物質非含有の非経口的に許容される水性溶液の形態であり得る。ある特定の態様では、非経口注射のための媒体は、Wntアゴニスト抗体が滅菌等張溶液として製剤化される滅菌蒸留水であり、適切に保存される。ある特定の態様では、調製は、デポ注射を介して後に送達され得る製品の制御放出または持続放出をもたらし得る注射用マイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物(ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸など)、ビーズ、またはリポソームなどの剤を用いる所望の分子の製剤化を含み得る。ある特定の態様では、ヒアルロン酸を使用することもでき、ヒアルロン酸は、循環における存続時間を促進する効果を有し得る。ある特定の態様では、所望の分子を送達するために植込み型薬物送達デバイスが使用され得る。
患者に投与される用量は、対象における有益な応答を経時的にもたらす上で十分なものであるべきである。任意の患者に最適な用量レベルは、用いられる抗体の効力、患者の年齢、体重、身体活動、および食事を含むさまざまな要因、ならびに他の薬物との可能な組み合わせに依存する。用量は、特定の対象における特定の化合物またはベクターの投与に伴ういずれかの有害副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
投与すべきアゴニスト抗体の有効量を決定することにおいては、医師は、アゴニスト抗体の循環血漿中レベルおよびアゴニスト抗体の毒性を評価し得る。概して、アゴニスト抗体の用量当量は、典型的な対象については約1 ng/kg～10 mg/kgである。いくつかの態様では、皮下投与またはiv投与のための用量範囲は0.1～20 mg/kgであり、例えば、0.3～10 mg/kgである。
投与については、Wntアゴニスト抗体は、アゴニストのEC50およびさまざまな濃度でのアゴニストの副作用によって決定される頻度で投与することができ、これは、対象の体重および健康全般に応じて調節される。投与は、単一用量または分割用量によって達成され得る。
組織減少を処置または阻止するための組成物は、ある期間(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11ヶ月、もしくは1～3年またはそれ超)の間、定期的に(例えば、毎週)投与され得る。
VI. Wntアゴニスト抗体を同定するための方法
本開示は、Wntシグナル伝達をアゴナイズし、かつWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を同定するための方法も提供する。いくつかの態様では、方法は、a) LRP6ポリペプチド、または少なくともLRP6ポリペプチドP3E3P4E4ドメインを含むその一部を供給する工程；b) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部を結合分子のライブラリーと接触させる工程；c) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部に結合する1つまたは複数の結合分子をライブラリーより選択する工程；およびd) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部への結合についてWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しない選択結合分子を同定する工程を含む。ある特定の態様では、結合分子は、抗体である。他の態様では、結合分子は、アプタマー、リガンド、ペプチド、または小分子であり得る。
下記の実施例は、請求される発明を例示するために提供されるものであり、請求される発明を限定するためのものではない。
実施例1 - 材料および方法
細胞株
ヒト胎児腎臓(HEK) 293Aおよび293、多発性骨髄腫H929、MM1.S、MM1.R、およびRPMI8226細胞株、マウスL Wnt-3a細胞株、マウス前骨芽細胞MC3T3-E1細胞株、ならびにマウス間葉系C3H/10T1/2細胞株はAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手した。細胞は、10% FBS (Fisher Scientific)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシン(Axenia BioLogix)が補充されたDMEM、RPMI1640、またはα-MEM中、5% CO2を含む加湿雰囲気下、37℃で維持した。骨髄腫細胞株由来の馴化培地(CM)を、70～80%の培養密度で細胞培養物の遠心分離によって収集した。細胞株はすべて、6回の継代以内に使用し、ショートタンデムリピートプロファイリングによって確認することは行わなかった。細胞は、PCRマイコプラズマ検出キット (abm, Canada)を使用してマイコプラズマに陰性であることを検査した(2020年9月に最終検査を実施した)。
ファージディスプレイライブラリー由来のWntアゴニスト抗体の選択
組換えLRP6 P3E3P4E4ドメインをFc融合タンパク質として産生させ、以前に記載されたように(Lee et al., 2018)プロテインAカラムで精製した。以前に記載されたように(Lee et al., 2018)、ビオチン標識化LRP6-P3E3P4E4断片に対してナイーブファージ抗体ディスプレイライブラリーを選択した。3回の選択の後、モノクローナルファージを96ウェルプレートにアレイ化し、LRP6トランスフェクションHEK293細胞への結合についてフローサイトメトリーによって試験した。LRP6結合ファージから特有のscFv抗体をシークエンスおよび同定し、個々のファージクローンを増幅し、さらなる特徴付けのために精製した。
プラスミド、クローニング、および部位特異的変異導入
全長ヒトLRP6をpCMV-Entry (Origene)にクローニングし、サブクローニング、点変異、またはトランスフェクションに利用した。LRP6エクトドメインの短縮型コンストラクトをpCMV-Entryにクローニングし、一過性発現に使用した。製造者のプロトコールに従ってQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies)を使用してLRP6エクトドメインのアラニン変異体を構築した。Fc融合コンストラクトのクローニングには、pFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen)を使用した。University of ChicagoのPatrick Wilson博士の厚意で提供されたAbvec Ig-γおよびIg-κプラスミドに抗体遺伝子をクローニングした(Smith et al., Nature Protocols 4:372-84 (2009)の変法 (Lee et al., 2018)。Wnt/β-カテニン応答性レポーターアッセイには、TCF/LEFルシフェラーゼレポーターSuperTopFlash (STF)および対照pRL-SV40ウミシイタケルシフェラーゼコンストラクト(Addgene)を使用した。Wntリガンドは、pcDNA-Wnt1または-Wnt3a発現プラスミド(Addgene)の一過性コトランスフェクションによって供給した。
組換えタンパク質および抗体の産生
Fc融合体を構築するためには、LRP6-P3E3P4E4またはscFv遺伝子をpFUSE-hIgG1-Fc2プラスミドにクローニングした。IgGを構築するためには、以前に記載されたように(Lee et al., 2018)、可変重(VH)鎖遺伝子および可変カッパ軽(Vκ)鎖遺伝子をオリジナルのAbvecまたは改変Abvecにサブクローニングした。Fabコンストラクトについては、Ig-γ AbvecからCH2-CH3を欠失させ、CH1のC末端において6X Hisタグを導入した。一過性トランスフェクションについては、プラスミドDNAをOpti-MEM (Life Technologies)中に再懸濁し、ポリエチレンイミンと混合し、HEK293A細胞に添加した。24時間のトランスフェクションの後、Freestyle 293発現培地(Gibco)へと培地を変更し、細胞をさらに6～8日間培養した。上清中に分泌されたタンパク質を収集し、ろ過し、製造者のプロトコールに従って、Fc融合体についてはプロテインAアガロース(Thermo Scientific)で精製し、FabについてはIgGまたはNi-NTA樹脂(Thermo Scientific)で精製した。
SuperTopFlash (STF)ルシフェラーゼレポーターアッセイ
24または96ウェルプレートにおいて培養した細胞に対して、Wnt1またはWnt3a発現コンストラクトありまたはなしで、TransIT-2020 (Mirus Bio)を使用してSTFルシフェラーゼレポーターおよびpRL-SV40プラスミドを一過性にトランスフェクションした。LRP6の短縮型変異体およびアラニン変異体を発現させるために、コンストラクトをコードするプラスミドDNAをレポータープラスミドと共にHEK293細胞にコトランスフェクションした。培養培地において希釈した抗体を組換えDKK1またはRSPO2 (R&D Systems)と共にトランスフェクション細胞に添加し、さらに16時間インキュベートした。以前に記載されたように(Lee et al., 2018)、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)を使用してホタルルシフェラーゼ(FL)およびウミシイタケルシフェラーゼ(RL)活性を検出し、正規化した。データは、レポーターコンストラクトのみをトランスフェクションした対照群に対する倍率として表した。
見かけのKDの決定
抗体の見かけのKDは、記載されたように(Lee et al., 2018)、FACSによって分析した。簡潔に記載すると、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、FACS緩衝液(PBS、1% FBS)中に再浮遊させた。FACS緩衝液において抗体を段階希釈し、標的細胞(3 x 105個細胞/チューブ)と共に4℃で一晩インキュベートした。細胞を洗浄し、Alexa Fluor (登録商標) 647標識化ヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch)と共にインキュベートした。インキュベートから1時間後、PBSにおいて細胞を洗浄し、BD Accuri C6フローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して分析した。カーブフィッティング(GraphPad)によって蛍光強度の中央値 (MFI)を分析して親和性を決定した。
バイオレイヤー干渉法
LRP6エクトドメインに対する抗LRP6 Fabと組換えDKK1またはWnt3aとの間の競合結合活性を、BLitz (ForteBio)装置を使用してバイオレイヤー干渉法(BLI)によって推定した。プロテインAバイオセンサー(ForteBio)にヒトLRP6-ECD-Fc (R&D Systems)を120秒間ロードし、このプロテインAバイオセンサーを組換えDKK1またはWnt3aに75秒間浸した後、DKK1 + Wnt3a、DKK1 + 抗LRP6 Fab、またはWnt3a + 抗LRP6 Fabの混合物に75秒間浸した。製造者の説明に従ってロード工程の前後の30秒間にベースラインを決定した。KD測定については、ストレプトアビジンバイオセンサー(ForteBio)にビオチン化LRP6-P3E3P4E4-Fcを120秒間ロードし、このストレプトアビジンバイオセンサーをIgGまたはFabに120秒間浸した後、PBS中での120秒間の解離に供した。
抗体-受容体ドッキング解析
Rossetta抗体を使用するホモロジーモデリング(Weitzner et al., Nature Protocols 12:401-16 (2017))によって、抗LRP6 VHおよびVκ配列からなる抗体可変断片(Fv)を生成させた。Fvと、3S8Z(Cheng et al., Nature Structural & Mol. Biol. 18:1204-U1244 (2011))または4A0P (Chen et al., 2011)から得られたLRP6-P3E3ドメインとの間のドッキングモデルを、ZDOCK (Pierce et al., Bioinformatics (2014))を使用して生成させた。ドッキングモデルにおいてWnt3a結合残基またはFv結合残基を解析し、PyMOL Molecular Graphics System (Schrodinger, LLC)を使用して視覚化した。
骨分化
以前に記載されたように(Zhong et al., 1481:119-25 (2016))、C3H10T1/2細胞の分化を誘導した。簡潔に記載すると、24ウェル培養プレートにおいて通常の増殖培地(α-MEM、10% FBS、100μg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン)中、70～80%の培養密度でC3H10T1/2細胞を培養した。翌日、培養培地を骨形成培地(50μg/mlのアスコルビン酸、10 mMのβ-グリセロールホスフェートが補充された増殖培地)へと変更し、2～3日ごとに骨形成培地で培地交換した。骨形成培地中で培養するのみとするか、または抗体および/もしくは30%のL細胞Wnt3a馴化培地(Wnt3aCM)の組み合わせで処理するかのいずれかに細胞を21日間供した。マトリックスミネラル化を決定するために、アリザリンレッドS (ARS) Staining Quantification Assay (ScienCell Research Laboratories)を使用して細胞を染色し、BIOREVO BZ-9000顕微鏡(Keyence)をして画像を撮影した。染色した細胞からARS色素を抽出し、製造者の説明に従って定量化した。
定量的リアルタイムPCR (qRT-PCR)
上記のようにC3H/10T1/2細胞の骨分化を3日間誘導した。TRIzol (商標)試薬(Invitrogen)を使用して細胞から全RNAを単離し、これを使用することで、製造者のプロトコールに従ってHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を使用してcDNAを生成させた。ABI 7300リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)でPower SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を使用して15 ngのcDNAでqRT-PCRを実施した。すべての反応を2連で実施し、標的遺伝子転写産物のコピー数をGAPDHに対して正規化した。データは、対照細胞と対比した抗体処理細胞における相対mRNA発現量として示される。各標的遺伝子用の特異的なプライマーセットは下記の通りである：
Figure 2024533616000043
。
アルカリホスファターゼ(ALP)活性アッセイ
上記の骨形成培地において抗体およびWnt3aCM (30%)と共に細胞を7日間インキュベートし、洗浄し、回収し、プロテアーゼ阻害物質(Cell Signaling Technology)が補充されたNP-40緩衝液(150 mM NaCl、1.0% NP-40、50 mM トリス、pH 8.0)における凍結融解サイクルを繰り返すことによって溶解した。製造者の説明に従ってp-ニトロフェニルホスフェート (Sigma-Aldrich)を使用して細胞溶解物におけるALP活性を測定した。抗体およびWnt3a処理なしの対照群に対してALP活性を正規化した。
インビボマイクロCTスキャン
VECTor4/CT (MILabs B.V., Utrecht, The Netherlands)前臨床画像システムのコンポーネントであるマイクロx線コンピューター断層撮影(マイクロCT)を調査に使用した。大腿骨およびその関節を視覚化するために、内蔵光学カメラを使用してマイクロCTの視野を大腿骨周辺に設定した後、50 kVpおよび0.24 mAのx線管設定でCT撮影を行った。各工程でのx線曝露時間を75m秒としてステップ-アンド-シュートモードで360度にわたる合計1,440の投影画像を取得した。取得の間、データビニングは適用しなかった(すなわち、1×1ビニング)。CTデータ取得の間、イソフルラン (医療グレードの酸素と混合したおよそ2%のイソフルラン)を使用して動物を麻酔下に保った。投影画像を取得した後の画像再構成は、ベンダーが提供するコーンビームフィルター補正逆投影アルゴリズムを使用して実施した。再構成画像ボリュームは、0.02 mm×0.02 mm×0.02 mmのボクセルサイズとした。ボリュームマトリックスサイズは、遠位大腿骨のみに焦点を当てて再構成工程の間に選択した視野によるものとした。再構成後、PMOD(PMOD Technologies, Zurich, Switzerland)を使用して等方性ボリュームの向きを再調整することによって共通の向きを示すように画像ボリュームを処理した。
インビボ骨形成試験
NOD/SCID/IL-2Rγ-/- (NSG)雌性マウスの右大腿骨に2 x 105個のMM1.S細胞を移植した。1週間後、マウスを無作為化し(n=5/群)、合計注射回数が6回となるように媒体(PBS)または10 mg/kgの66 IgGで週に1回、腹腔内処置した。処置から1週間後、マウスに麻酔をかけ、マウスをマイクロCTによってスキャンした。CTスキャンから1週間後、血液および大腿骨をマウスから収集し、製造者の説明に従ってHuman Lambda ELISA Kit (Bethyl Laboratories)を使用して血清中の遊離ヒトIgラムダ軽鎖を評価した。マウス試験はすべて、UCSF Institutional Animal Care and Use Committeeが承認したプロトコールに従って実施した。
骨梁および皮質骨画像解析
以前に記載されたように(Doube et al., Bone 47:1076-79 (2010)；Schindelin et al., Nature Methods 9:676-82 (2012))、Fijiソフトウェアによって運用されているBoneJ2プラグインを使用して大腿骨の全体、遠位、および近位領域の3D再構成または平面画像生成を行うためにCTデータファイルを利用した。積層3D骨画像を使用して骨梁および皮質骨のマイクロアーキテクチャパラメーターを解析し、組織体積に対する骨体積(BV/TV)、骨梁幅(Tb.Th)、および皮質骨幅(Ct.Th)を得た。
免疫組織化学
大腿を解剖して軟部組織を除去し、10%の中性緩衝ホルマリン中で固定化し、14%のEDTA中で4週間脱灰した。組織をパラフィン中に包埋し、4 mmサイズに切った。以前に記載されたように(Su et al., JCI Insight 3 (2018))、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)または抗ヒトIgラムダ軽鎖抗体(Abcam)を用いて組織切片を染色した。染色切片の画像は、BIOREVO BZ-9000顕微鏡(Keyence)を使用して撮影した。
統計解析
P値を決定するための統計解析はすべて、両側スチューデントT検定を使用して実施し、P<0.05を使用して帰無仮説を棄却した。多重群間比較については、チューキー検定を使用して一元配置ANOVAを使用した。
実施例2 - 新規のヒトWntアゴニストモノクローナル抗体の同定
新規のLRP6結合Wnt経路アゴニスト抗体を同定するために、LRP6の細胞外ドメイン、具体的には、P3E3P4E4ドメインの組換え断片を生成させた。組換えLPR6 P3E3P4E4ドメインはFc融合タンパク質として産生させ、以前に記載されたように(Lee et al., Scientific Reports 8 (2018))、プロテインAカラムで精製した。Fc融合体を構築するためには、LRP6-P3E3P4E4またはscFv遺伝子をpFUSE-hIgG1-Fc2プラスミドにクローニングした。IgGを構築するためには、以前に記載されたように(Lee et al. (2018))、可変重(VH)鎖遺伝子および可変カッパ軽(Vκ)鎖遺伝子をオリジナルのAbvecまたは改変Abvecにサブクローニングした。Fabコンストラクトについては、Ig-γ AbvecからCH2-CH3を欠失させ、CH1のC末端において6X Hisタグを導入した。一過性トランスフェクションについては、プラスミドDNAをOpti-MEM (Life Technologies)中に再懸濁し、ポリエチレンイミンと混合し、HEK293A細胞に添加した。24時間のトランスフェクションの後、Freestyle 293発現培地(Gibco)へと培地を変更し、細胞をさらに6～8日間培養した。上清中に分泌されたタンパク質を収集し、ろ過し、製造者のプロトコールに従って、Fc融合体についてはプロテインAアガロース(Thermo Scientific)で精製し、FabについてはIgGまたはNi-NTA樹脂(Thermo Scientific)で精製した。
ビオチンで標識化されているこのLRP6断片に対してナイーブファージ抗体ディスプレイライブラリーを選択し、結合クローンを同定した。3回の選択の後、モノクローナルファージを96ウェルプレートにアレイ化し、LRP6トランスフェクションHEK293細胞への結合についてフローサイトメトリーによって試験した。これらのLRP6結合クローンを、SuperTopFlash (STF)レポーターアッセイを使用して古典的Wntシグナル伝達に対するアゴニスト効果について試験した。24または96ウェルプレートにおいて培養した細胞に対して、Wnt1またはWnt3a発現コンストラクトありまたはなしで、TransIT-2020 (Mirus Bio)を使用してSTFルシフェラーゼレポーターおよびpRL-SV40プラスミドを一過性にトランスフェクションした。LRP6の短縮型変異体およびアラニン変異体を発現させるために、コンストラクトをコードするプラスミドDNAをレポータープラスミドと共にHEK293細胞にコトランスフェクションした。培養培地において希釈した抗体を組換えDKK1またはRSPO2 (R&D Systems)と共にトランスフェクション細胞に添加し、さらに16時間インキュベートした。以前に記載されたように(Lee et al. (2018))、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)を使用してホタルルシフェラーゼ(FL)およびウミシイタケルシフェラーゼ(RL)活性を検出し、正規化した。データは、レポーターコンストラクトのみをトランスフェクションした対照群に対する倍率として表した。
LRP6結合ファージから特有のscFv抗体をシークエンスおよび同定し、個々のファージクローンを増幅し、さらなる特徴付けのために精製した。アゴニスト活性を有するものとして1つの抗体、66を、最初にファージディスプレイscFvとして同定し、次いで、IgGとして同定した(図1A)。STFレポーターおよび異なるWntリガンド発現コンストラクトをトランスフェクションしたHEK293細胞を66 IgG (100 nM)ありまたはなしでインキュベートした。エラーバーは、n=2のSDを表す。**P < 0.01；***P < 0.001。内在性Wntリガンドの非存在下で66 IgGのWntアゴニスト活性を試験した。STFレポーターコンストラクトをトランスフェクションしたHEK293細胞を66 IgG (100 nM)ありまたはなしでインキュベートし、抗体処理なしの対照に対してルシフェラーゼ活性を正規化した。興味深いことに、66 IgGは、外部から添加されるWntリガンドが存在しなくてもWnt/β-カテニンシグナル伝達の誘導を示し(図1B)、このことは、この抗体がWntリガンド様特性を有することを示している。LRP6に対する66 IgGの見かけの親和性をHEK293細胞で測定し、約5 nMであることが明らかになった(図7A)。
この新規の古典的Wnt経路アゴニスト66抗体は、Wnt/β-カテニンシグナル伝達に対して拮抗的である以前に同定されたLRP6 P3E3バインダー(Lee et al., 2018)と競合しない(図7B)。LRP6発現プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションし、このHEK293細胞を66 IgGまたはE34N19 scFvファージと共に1時間インキュベートした。E34N19は、P3E3P4E4ドメインに結合するWntアンタゴニストとして以前に同定されたものである(Lee et al., 2018)。E34N19 IgGを競合物として同時に添加した。マウス抗fd IgGおよびPE標識化抗マウスIgGの連続インキュベートによって結合ファージを検出した。結果は、LRP6の異なる部位にアゴニスト66 IgGが結合することを示す。
実施例3 - 新規の作用機構：66アゴニスト抗体はリガンドサロゲートとして機能しない
66抗体がLRP6に結合する場所をマッピングするために、LRP6 P3E3P4E4ドメインの一連の短縮型変異体を生成させた(図1C；SP：シグナルペプチド；P3およびP4：それぞれベータ-プロペラドメイン3および4；E3およびE4：それぞれEGF様ドメイン3および4；LDLR：低密度リポタンパク質受容体A型ドメイン；TM：膜貫通ドメイン；Cyto：細胞質ドメイン)。全長ヒトLRP6をpCMV-Entry (Origene)にクローニングし、サブクローニング、点変異、またはトランスフェクションに利用した。LRP6エクトドメインの短縮型コンストラクトをpCMV-Entryにクローニングし、HEK293細胞における一過性発現に使用した。66抗体への短縮型の結合をフローサイトメトリーによって分析した(図1D)。66抗体は、LRP6のP3ドメインに結合することが明らかになった。LRP6短縮型変異体に対する66アゴニスト活性を、STFレポーターアッセイを使用してさらに調べた(図1E)。66 IgGは、LRP6全長およびLRP6 P3E3P4E4コンストラクトを発現する細胞においては古典的Wntシグナル伝達を活性化したが、P3ドメインが欠失している他のバリアントを発現する細胞においてはそうではなく、このことは、66抗体がP3ドメインに結合することを示す細胞結合試験から得られた結果と一致した。
結合部位をさらにマッピングするために、66 FvならびにLRP6の2つの公知の結晶構造(3S8Zおよび4A0P；それぞれ図8Aおよび8B)についてのホモロジーモデリング予測構造を使用してLRP6への66抗体の結合をモデリングした。いくつかの潜在的な66接触部位がLRP6上で同定された。それらの部位においてアラニンスキャン変異導入を実施した。製造者のプロトコールに従ってQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies)を使用してLRP6エクトドメインのアラニン変異体を構築した。これらのLRP6変異体への66 IgGの結合をフローサイトメトリーによって分析した。K662A単一変異およびK684A単一変異は66結合の顕著な消失を引き起こした(図1F)。二重変異体(K662A/K684A)を産生させ、試験し、この二重変異体は、66抗体への結合のほぼ完全な消失を示し(図1F)、このことから、K662およびK684が決定的に重要な接触部位であることが確認された。結合の結果と一致して、66誘導性のWntシグナル伝達活性は、野生型(WT)対照と比較して、二重変異体(K662A/K684A)をトランスフェクションしたHEK293細胞において有意に減少した(図1G)。これら2つの部位(赤色を付けた残基)は、公知のWnt3a結合部位(黄色を付けた残基、図1H)とは空間的に異なっており、このことは、66抗体がLRP6へのリガンド結合と競合しないことを示唆している。
バイオレイヤー干渉法を使用して66抗体の結合特徴をさらに分析した。LRP6エクトドメインに対する抗LRP6 Fabと組換えDKK1またはWnt3aとの間の競合結合活性を、BLitz (ForteBio)装置を使用してバイオレイヤー干渉法(BLI)によって推定した。プロテインAバイオセンサー(ForteBio)にヒトLRP6-ECD-Fc (R&D Systems)を120秒間ロードし、このプロテインAバイオセンサーを組換えDKK1またはWnt3aに75秒間浸した後、DKK1 + Wnt3a、DKK1 + 抗LRP6 Fab (66 Fab)、またはWnt3a + 抗LRP6 Fabの混合物に75秒間浸した。製造者の説明に従ってロード工程の前後の30秒間にベースラインを決定した。
エピトープマッピングの結果によって予想された通り、66 FabはLRP6-Wnt3a複合体に同時に結合した一方で、Wnt3aおよびDKK1の混合物は該複合体に追加で結合することができなかった(図2A)。66 Fabのこの相加的結合は、それがLRP6-DKK1複合体に添加された場合にも認められたことから(図2B)、LRP6結合について66抗体がWnt3aともDKK1とも競合しないことが確認された。66抗体のこの非競合結合をSTFレポーターアッセイによってさらに調べた。阻害物質DKK1の存在下でさえ、66 IgGは、依然としてシグナル伝達活性を有意に増強することができた(図2C)。こうした結果は、66抗体がリガンドサロゲートとして機能しないことを示唆している。代わりに、それはWntリガンドと並行して作用し、内在性Wnt阻害物質による阻害を受けない(図2D)。
実施例4 - 古典的Wnt経路活性化の増幅
66抗体は公知のWntリガンド結合部位に結合しないことから、66抗体のアゴニスト効果を試験して、該効果がWntシグナル伝達エンハンサーR-スポンジン (RSPO)によって増幅され得るかどうかを決定した。対照として、Wnt3a誘導性のWnt/β-カテニンシグナル伝達がRSPO2の存在下で大幅に増強され、該シグナル伝達増強をDKK1添加が有意に低下させることが最初に示された(図3A)。次に、RSPO2の状況下で66抗体を類似の様式で調べた。興味深いことに、外部から供給されるWntリガンド(Wnt3aまたはWnt1のいずれも)の非存在下において、66 IgGのアゴニスト効果はRSPO2の添加によって劇的に上昇し得、このシグナル伝達増強は、DKK1による添加の影響を受けなかった(図3B)。したがって、66抗体は、アゴニスト活性が公知のWntリガンドから独立しておりかつR-スポンジンによって増幅される、新しいタイプのWntリガンドのように働く。公知のWntリガンドとは異なり、66アゴニスト活性は、内在性阻害物質によって阻害されない。
次に、公知のWntリガンドの存在下での66抗体のアゴニスト活性に対する、RSPO2濃度増加の効果を評価した。図3Cに示されるように、66抗体(20 nM)を供給することは、RSPO2によって増幅される最大Wntリガンドシグナル伝達活性を増加させた(66ありの528倍 対 66なしの308倍)。この効果を、66濃度の幅にわたってさらに調べた。一定濃度のWntリガンド(図3DについてはWnt3a、図9についてはWnt1)およびRSPO2の存在下で、66抗体は用量依存的なアゴニスト活性を示し、Wnt3aおよびWnt1介在性のβ-カテニンシグナル伝達についてのEC50は、それぞれ4.8 nMおよび1.8 nMであった。したがって、こうしたデータは、公知のWntリガンドと相加的に働くが、競合的には働かず、公知のWntリガンドありでもなしでもRSPO2介在性のシグナル伝達増強に応答する新しいタイプのWntリガンドのように、66抗体が挙動することを、さらに裏付ける。
実施例5 - Wntアゴニスト抗体は骨芽細胞分化を誘導する
古典的Wntシグナル伝達活性化の生物学的結果の1つは、骨芽細胞分化および骨形成の誘導である。マウス前骨芽細胞MC3T3-E1および骨髄由来間葉系C3H/10T1/2細胞株に対する66 IgGのWntアゴニスト効果を分析した。最初に、ヒトおよびマウスLRP6への66 IgGの交差反応結合を分析した。66 IgGはヒトおよびマウスLRP6エクトドメインの両方に特異的に結合した(図4A)。次いで、STFレポーターアッセイによるWnt/β-カテニンシグナル伝達活性化に対する66 IgGの効果を前述のマウス由来細胞株を使用して分析した。Wnt3aはレポーター活性を誘導し、66 IgGの添加はMC3T3-E1(図4B)およびCH3/10T1/2(図4C)細胞株の両方においてシグナル伝達を有意に増強した。
次に、qRT-PCRによって骨芽細胞マーカー遺伝子(RUNX2、BMP2、ALP、およびOCN)の発現を測定することによってC3H/10T1/2細胞の骨芽細胞分化の誘導を調べた。上記のようにC3H/10T1/2細胞の骨分化を3日間誘導した。TRIzol (商標)試薬(Invitrogen)を使用して細胞から全RNAを単離し、これを使用することで、製造者のプロトコールに従ってHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を使用してcDNAを生成させた。ABI 7300リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)でPower SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を使用して15 ngのcDNAでqRT-PCRを実施した。すべての反応を2連で実施し、標的遺伝子転写産物のコピー数をGAPDHに対して正規化した。データは、対照細胞と対比した抗体処理細胞における相対mRNA発現量として示される。
各標的遺伝子用の特異的なプライマーセットは下記の通りである：
Figure 2024533616000044
。
図4Dに示されるように、Wntアゴニスト66は、骨芽細胞分化に関与するWnt下流遺伝子の発現を誘導し、Wnt3a馴化培地(Wnt3aCM)と組み合わせた66は、Wnt3aCM単独よりも強力であった。mRNA発現に加えて、本発明者らは66と共にインキュベートされるC3H/10T1/2細胞におけるアルカリホスファターゼ活性(ALP)も測定した。図4Eに示されるように、Wnt3aCMはALP活性を上方制御し、66の添加はWnt3aCMの存在下でのALP活性をさらに増加させた。
C3H/10T1/2細胞の造骨関与を直接的に評価するために、66抗体およびWnt3aCMの存在下でのインビトロミネラル化アッセイ(Gregory et al., Analyt. Biochem. 329:777-84 (2004))を実施した。図4Fに示されるように、Wnt3aCMはミネラル化を増加させ、該ミネラル化は66の添加によってさらに増強された。こうしたデータは、Wntアゴニスト抗体66が骨芽細胞分化を促進し、かつ天然のWntリガンドと相加的に働くことを示唆している。
実施例6 - Wntアゴニスト抗体は骨形成を誘導する
ある特定の種類の原発性がんおよび転移性がんは骨に位置し、患者において広範な骨リモデリングを引き起こす。多発性骨髄腫は骨髄に存在し、古典的Wntシグナル伝達の阻害物質の分泌によって引き起こされる顕著な骨量減少を誘導することが公知である(Edwards, Blood 112:216-17 (2008)；Glass et al., NEJM 349:2479-80 (2003))。新規のWntアゴニスト抗体66はLRP6結合について公知のWnt阻害物質と競合しないことから、66抗体は、骨髄腫細胞によって産生されるWnt阻害物質に効果的に対抗し得る。この仮説を試験するために、STFレポーターおよびWnt3a発現コンストラクトをコトランスフェクションしたHEK293細胞で馴化培地中のWnt阻害物質の存在について一群の多発性骨髄腫細胞株をスクリーニングした。図5Aに示されるように、MM1.S由来の馴化培地(MM1.S-CM)は、対照(馴化培地なし)または異なる多発性骨髄腫細胞株に由来する他の馴化培地と比較して有意な阻害効果を示した。したがって、さらなる試験用としてMM1.S細胞を選択した。Wnt3aおよびMM1.S-CMの両方の存在下でHEK293およびSTFレポーターアッセイを再び使用したところ、66 IgGは、MM1.S-CMによって阻害されるシグナルを回復させ、66処理の濃度を高めると、シグナル伝達がより一層刺激された(図5B)。
インビボでの骨リモデリングに対する66抗体の効果を突き止めるために、NSGマウスの右大腿骨へのMM1.S細胞の移植によって大腿骨内溶骨性モデルを確立した。図5Cに概説されるように、移植から1週間後に抗体処置を開始し、毎週の腹腔内(i.p.)注射によって6週間継続した。生きたマウスをマイクロCTによってスキャンして大腿骨構造の変化を評価した。腫瘍確立を確認するために、本発明者らは、ELISAによって血清中のヒトIgラムダ軽鎖レベルを最初に分析した。図5Dに示されるように、MM1.S移植群(PBSおよび66)におけるヒトIgラムダ軽鎖の濃度は、MM1.S注射なしの群(ナイーブ)のものよりも有意に高かった。66群における軽鎖レベルはPBS群におけるものよりも低かったものの、2つの群の間で統計的に有意な差は存在しなかった(図5D)。免疫組織化学試験によって、右大腿骨中に定着したMM1.S骨髄腫細胞を抗ヒトIgラムダ抗体によっても検出した(図10)。マイクロCT分析によって66 IgGの骨形成効果を評価した。全大腿骨を分析して、CTスキャンデータから平面および3D画像を生成させた。図5Eに示されるように、MM1.S移植は、特に骨梁エリアにおける骨溶解を引き起こした(ナイーブ対PBS)。際だったことに、66 IgGでの処置は、対照と比較して大腿骨量減少を逆転させ(66 IgG対PBS)、このことは、Wntアゴニスト抗体66がインビボで骨形成を促進することを示している(図5E)。
66 IgGの定量的骨形成効果をさらに調査した。骨構造を評価するための関心対象領域(ROI)を図6Aに示されるように指定し、骨マイクロ構造の3Dビューおよび定量化のためにマイクロCT画像を再構成した。骨梁ROIを解析することによって、骨髄腫移植なしのナイーブ群と比較して、PBS群の骨梁は、Wnt/β-カテニンシグナル伝達阻害物質を分泌する移植MM1.S細胞によって分解されていた(図6B)。一方で、全大腿骨画像解析と一致して、66 IgG処置は骨梁同化活性を示した(図6B)。66 IgG処置は、組織体積に対する骨体積(BV/TV)および骨梁幅(Tb.Th)の有意な増加をもたらした(それぞれ図6Cおよび6D)。遠位大腿骨に加えて、本発明者らは近位大腿骨領域における皮質骨を解析した。皮質骨ROIを再構成し、皮質骨幅 (Ct.Th)を測定することによって、本発明者らは、66 IgGが対照群 (PBS)と比較して皮質骨形成を有意に増加させることを見出し(図6E)、このことは、66 Wntアゴニスト効果が骨梁形成および皮質骨形成の両方を刺激することを示唆している。骨芽細胞分化に対する66 IgG効果を評価するために、骨表層骨芽細胞の数を分析し、これが66 IgG処置によって増加することを明らかにした。大腿骨の代表的なH&E染色画像は図6Fに示され、これは、PBS群と比較して66処置群の骨梁表層上の骨芽細胞の数の有意な増加を示す。まとめると、新規のWntアゴニスト抗体66は、大腿骨内MM1.S骨髄腫モデルにおける骨量減少を逆転させ、このことは、溶骨性疾患の処置におけるその潜在力を実証する。
実施例7 - Wntアゴニスト抗体は、骨粗鬆症マウスモデルにおいてインビボでの骨形成を促進する
卵巣摘出誘導性の骨粗鬆症マウスモデルにおける骨組織に対するWntアゴニスト抗体の効果を調べるために実験を実施した(図11)。実験では次の2つの変数を評価した：(1)抗体、より具体的には、抗体の親和性(66抗体と、親和性がより高いそのバリアント66-11抗体(66の用量の1/6におけるもの)との比較)、および(2)送達経路(腹腔内(i.p.)注射と皮下(subcu)注射との比較)。リードアウトについては、骨梁および皮質骨の両方を評価した。
Jackson Laboratory (JAX)によって8週齢の雌性C57BL/6jマウスの卵巣を摘出した。卵巣摘出から4週間後、マウスをWntアゴニスト抗体(66もしくは66-11)またはPBS対照で処置した。66抗体は6 mg/kgで腹腔内に投与し、66-11抗体は1 mg/kgで腹腔内または皮下に投与した。各試験群につき、6匹のマウスを処置し、分析した。5回の1週間用量の後、指定の時点(最終用量から4日後、28日後、73日後、および111日後)でインビボマイクロCT (遠位大腿骨に焦点を当てるもの)によってマウスをスキャンした。各マウスにつき、両足をスキャンして、ImageJ (BoneJ)による解析に使用する画像を生成させた。
骨梁体積の解析の結果は、図12 (最終用量から4日後)、図13Aおよび13B (最終用量から28日後)、図14Aおよび14B (最終用量から73日後)、ならびに図15 (最終用量から111日後)に示される。PBS対照と比較して、66抗体は、最初の2つの解析時点において有意な骨促進活性を示した。66-11抗体は、すべての解析時点において有意な骨促進活性を示した。腹腔内送達経路および皮下送達経路の両方において、有意な骨促進活性が生じた。
皮質骨幅の解析の結果は、図16 (最終用量から4日後)、図17 (最終用量から28日後)、図18 (最終用量から73日後)、および図19 (最終用量から111日後)に示される。PBS対照と比較して、66-11抗体は、腹腔内に投与した場合は3つの時点において有意な骨促進活性を示し、または、皮下に投与した場合はすべての時点において有意な骨促進活性を示した。
こうしたデータは、卵巣摘出マウスにおけるインビボでの骨形成を促進する上でWntアゴニスト抗体が高度に活性であり、親和性がより高い抗体66-11は、親抗体66の用量の1/6であってもより強力な活性を示すことを示す。腹腔内送達経路および皮下送達経路の両方が強力な骨促進活性をもたらし、効果は長く続くものである。実験期間(139日)の間、体重減少も、いかなる明白な毒性も認められなかった。
上記の実施例は本開示を例示するために提供されるものであり、その範囲を限定するためのものではない。本開示の他の変形形態は当業者には容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書において引用される刊行物、データベース、インターネット源、特許、特許出願、およびアクセッション番号はすべて、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
別の局面では、本開示は、a) LRP6ポリペプチド、または少なくともLRP6ポリペプチドP3E3P4E4ドメインを含むその一部を供給する工程；b) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部を結合分子のライブラリーと接触させる工程；c) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部に結合する1つまたは複数の結合分子をライブラリーより選択する工程；およびd) 前記LRP6ポリペプチドまたはその一部への結合についてWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しない選択結合分子を同定する工程を含む、Wntシグナル伝達をアゴナイズし、かつWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を同定するための方法を提供する。
[本発明1001]
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質6 (LRP6)に特異的に結合してWntシグナル伝達をアゴナイズするモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
a) (1) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列；
(2) SEQ ID NO:8のアミノ酸配列；
(3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
(4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
(5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
(6)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または
(7)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3
を含む重鎖可変ドメイン(VH)と、
b) (1) SEQ ID NO:15のアミノ酸配列；
(2)それぞれSEQ ID NO:26、27、および29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3；または
(3)それぞれSEQ ID NO:26、27、および30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3
を含む軽鎖可変ドメイン(VL)と
を含む、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1002]
前記抗体が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む、本発明1001のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1003]
前記抗体が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むVLを含む、本発明1001のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1004]
前記抗体が、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むVLを含む、本発明1001のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1005]
前記抗体が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む、本発明1001のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1006]
前記抗体が、
a) (1)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含むHCDR1～3を含む重鎖；
(2)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
(3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
(4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または
(5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3
を含む重鎖と、
b) SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、本発明1001のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1007]
前記抗体が、SEQ ID NO:3、4、5、6、または7のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む、本発明1006のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1008]
前記抗体が、
a) (1) SEQ ID NO:8のアミノ酸配列；
(2)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
(3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
(4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
(5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または
(6)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3
を含む重鎖と、
b) (1)それぞれSEQ ID NO:26、27、および29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3；または
(2)それぞれSEQ ID NO:26、27、および30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3
を含む軽鎖と
を含む、本発明1001のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1009]
前記抗体が、SEQ ID NO:8、9、10、11、12、または13のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16または17のアミノ酸配列を含むVLを含む、本発明1008のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1010]
前記抗体が、ヒトIgG重鎖定常領域を含む、本発明1001～1009のいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1011]
前記抗体が、エフェクター減弱型IgG1抗体である、本発明1010のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1012]
前記抗体が、ロイシンからアラニンへの置換を234位および235位に含むIgG1抗体である、本発明1011のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1013]
前記抗体が、IgG2抗体である、本発明1010のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1014]
前記抗体が、ヒト抗体である、本発明1001～1013のいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1015]
Wntシグナル伝達をアゴナイズし、かつWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
[本発明1016]
本発明1001～1015のいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される医薬品添加物とを含む、薬学的組成物。
[本発明1017]
本発明1001～1015のいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をコードする、核酸配列。
[本発明1018]
本発明1017の核酸配列を含む、ベクター。
[本発明1019]
本発明1017の核酸配列を含む、哺乳動物宿主細胞。
[本発明1020]
モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を産生させるための方法であって、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の産生を可能にするための条件の下で本発明1019の宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
[本発明1021]
本発明1001～1015のいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をインビトロまたはエクスビボで細胞に添加する工程を含む、組織再生を促進するための方法。
[本発明1022]
組織を回復させることを、それを必要とする個体において行うための方法であって、本発明1016の薬学的組成物を前記個体に投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1023]
組織が、骨組織、腸組織、肝臓組織、または脳組織である、本発明1021または1022の方法。
[本発明1024]
前記個体が、Wntシグナル伝達が不十分であることによって特徴付けられる疾患または状態を有する、本発明1021または1022の方法。
[本発明1025]
前記個体が、加齢誘発性の骨粗鬆症、薬物誘発性の骨量減少、骨形成不全症、炎症性腸疾患、重症型アルコール性肝炎、糖尿病性網膜症、滲出型加齢黄斑変性(AMD)、フックスジストロフィー、角膜上皮幹細胞疲弊症、萎縮型AMD、シェーグレンドライアイ、短腸症候群、および難聴からなる群より選択される疾患または状態を有する、本発明1021、1022、または1023の方法。
[本発明1026]
Wntシグナル伝達をアゴナイズし、かつWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を同定するための方法であって、
a) LRP6ポリペプチド、または少なくともLRP6ポリペプチドP3E3P4E4ドメインを含むその一部を供給する工程；
b)前記LRP6ポリペプチドまたはその一部を結合分子のライブラリーと接触させる工程；
c)前記LRP6ポリペプチドまたはその一部に結合する1つまたは複数の結合分子を前記ライブラリーより選択する工程；および
d)前記LRP6ポリペプチドまたはその一部への結合についてWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しない選択結合分子を同定する工程
を含む、前記方法。
定量的リアルタイムPCR (qRT-PCR)
上記のようにC3H/10T1/2細胞の骨分化を3日間誘導した。TRIzol (商標)試薬(Invitrogen)を使用して細胞から全RNAを単離し、これを使用することで、製造者のプロトコールに従ってHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を使用してcDNAを生成させた。ABI 7300リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)でPower SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を使用して15 ngのcDNAでqRT-PCRを実施した。すべての反応を2連で実施し、標的遺伝子転写産物のコピー数をGAPDHに対して正規化した。データは、対照細胞と対比した抗体処理細胞における相対mRNA発現量として示される。各標的遺伝子用の特異的なプライマーセットは下記の通りである：
Figure 2024533616000090
。
各標的遺伝子用の特異的なプライマーセットは下記の通りである：
Figure 2024533616000091
。

Claims (26)

  1. 低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質6 (LRP6)に特異的に結合してWntシグナル伝達をアゴナイズするモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
    a) (1) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列；
    (2) SEQ ID NO:8のアミノ酸配列；
    (3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
    (4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
    (5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
    (6)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または
    (7)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3
    を含む重鎖可変ドメイン(VH)と、
    b) (1) SEQ ID NO:15のアミノ酸配列；
    (2)それぞれSEQ ID NO:26、27、および29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3；または
    (3)それぞれSEQ ID NO:26、27、および30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3
    を含む軽鎖可変ドメイン(VL)と
    を含む、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  2. 前記抗体が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  3. 前記抗体が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  4. 前記抗体が、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  5. 前記抗体が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  6. 前記抗体が、
    a) (1)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含むHCDR1～3を含む重鎖；
    (2)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
    (3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
    (4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または
    (5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3
    を含む重鎖と、
    b) SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む軽鎖と
    を含む、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  7. 前記抗体が、SEQ ID NO:3、4、5、6、または7のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項6記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  8. 前記抗体が、
    a) (1) SEQ ID NO:8のアミノ酸配列；
    (2)それぞれSEQ ID NO:18、19、および21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
    (3)それぞれSEQ ID NO:18、19、および22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
    (4)それぞれSEQ ID NO:18、19、および23のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；
    (5)それぞれSEQ ID NO:18、19、および24のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3；または
    (6)それぞれSEQ ID NO:18、19、および25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3
    を含む重鎖と、
    b) (1)それぞれSEQ ID NO:26、27、および29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3；または
    (2)それぞれSEQ ID NO:26、27、および30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1～3
    を含む軽鎖と
    を含む、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  9. 前記抗体が、SEQ ID NO:8、9、10、11、12、または13のアミノ酸配列を含むVHおよびSEQ ID NO:16または17のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項8記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  10. 前記抗体が、ヒトIgG重鎖定常領域を含む、請求項1～9のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  11. 前記抗体が、エフェクター減弱型IgG1抗体である、請求項10記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  12. 前記抗体が、ロイシンからアラニンへの置換を234位および235位に含むIgG1抗体である、請求項11記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  13. 前記抗体が、IgG2抗体である、請求項10記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  14. 前記抗体が、ヒト抗体である、請求項1～13のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  15. Wntシグナル伝達をアゴナイズし、かつWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  16. 請求項1～15のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される医薬品添加物とを含む、薬学的組成物。
  17. 請求項1～15のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をコードする、核酸配列。
  18. 請求項17記載の核酸配列を含む、ベクター。
  19. 請求項17記載の核酸配列を含む、哺乳動物宿主細胞。
  20. モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を産生させるための方法であって、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の産生を可能にするための条件の下で請求項19記載の宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
  21. 請求項1～15のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をインビトロまたはエクスビボで細胞に添加する工程を含む、組織再生を促進するための方法。
  22. 組織を回復させることを、それを必要とする個体において行うための方法であって、請求項16記載の薬学的組成物を前記個体に投与する工程を含む、前記方法。
  23. 組織が、骨組織、腸組織、肝臓組織、または脳組織である、請求項21または22記載の方法。
  24. 前記個体が、Wntシグナル伝達が不十分であることによって特徴付けられる疾患または状態を有する、請求項21または22記載の方法。
  25. 前記個体が、加齢誘発性の骨粗鬆症、薬物誘発性の骨量減少、骨形成不全症、炎症性腸疾患、重症型アルコール性肝炎、糖尿病性網膜症、滲出型加齢黄斑変性(AMD)、フックスジストロフィー、角膜上皮幹細胞疲弊症、萎縮型AMD、シェーグレンドライアイ、短腸症候群、および難聴からなる群より選択される疾患または状態を有する、請求項21、22、または23記載の方法。
  26. Wntシグナル伝達をアゴナイズし、かつWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を同定するための方法であって、
    a) LRP6ポリペプチド、または少なくともLRP6ポリペプチドP3E3P4E4ドメインを含むその一部を供給する工程；
    b)前記LRP6ポリペプチドまたはその一部を結合分子のライブラリーと接触させる工程；
    c)前記LRP6ポリペプチドまたはその一部に結合する1つまたは複数の結合分子を前記ライブラリーより選択する工程；および
    d)前記LRP6ポリペプチドまたはその一部への結合についてWntリガンドともWnt阻害物質とも競合しない選択結合分子を同定する工程
    を含む、前記方法。
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