TW201306852A - 包含補骨脂（ｐｓｏｒａｌｅａ ｃｏｒｙｌｉｆｏｌｉａ ｌ.）萃取物的組成物 - Google Patents

Abstract

本發明揭示含一補骨脂萃取物或其溶離份之組成物及其用途，更特定地，一補骨脂萃取物或其溶離物、及一含該萃取物或溶離份作為活性成份之用於預防、減輕或治療膀胱過動症候群的組成物。

Description

包含補骨脂(PSORALEA CORYLIFOLIA L.)萃取物的組成物 發明領域

本發明係有關於含一補骨脂萃取物或其溶離份之組成物及其用途。

發明背景

根據International Continence Society(ICS)(2002)，膀胱過動症(OAB)之定義為具或不具尿失禁(UUI)的尿急，其通常顯現增加的頻尿及夜頻尿症(Abrams P.等人，Neurourol Urodyn,21,p 167-178,2002)。而且，應該無感染、代謝障礙或可誘發此等症狀之其它基礎疾病。雖然對於膀胱過動症的盛行率尚未有充份研究，但是已報告其實際在發生於每一年齡族群的人身上，且就雄性與雌性的發病率而言，已發現尚未有顯著差異。其發病率隨年齡之增加而增加，且每一個國家之OAB患者數正快速增加。此外，罹患膀胱過動症候群的患者傾向於孤立生活以避免社交活動及人際關係。由於膀胱過動症對於生活品質的影響比糖尿病更嚴重，所以已被認為是需要立即注意及治療的嚴重疾病。

由於膀胱係由平滑肌組成且膀胱排尿機能係藉神經系統而調節，所以該平滑肌及神經系統之異常會導致膀胱過動症。雖然會誘發不隨意膀胱收縮之膀胱過動症的起因係衍生自藉腦疾或脊髓受傷而導致的神經源性排尿障礙、作為男性之攝護腺肥大代表的膀胱出口阻塞、女性的盆構造 之衰弱、尿道及膀胱之局部疾病等，但是膀胱過動症通常係由迫尿肌細胞之老化、迫尿肌之不明瞭的機能障礙等所引起。膀胱過動症的主因目前尚未經確認(KIM,Tae Hyung,Chungang Journal of Medicine 28(3),p 143-149,2003)。

雖然抗毒蕈鹼劑療法業經廣泛用於早期膀胱過動症的治療，但是目前並沒有已被明確證明具有療效的國際性對照臨床試驗。由於這些藥劑之抗膽素激性的性質，所以有副作用(諸如劇渴性癲狂、便秘、視力模糊及急性無尿症)的風險。由於此等原因，有研發用於膀胱過動症之新的替代藥物之繼續不斷的需求。此外，由於該抗毒蕈鹼劑的機制為抑制排尿反射之傳出神經傳遞，其不能抑制排尿反射(其係為膀胱過動症的第一個原因)之傳入(亦即，一感覺機制之機能亢進)，所以目前需要研發一可抑制膀胱過動症之感覺機制的藥物(Andersson KE.Antimuscarinics for treatment of overactive bladder.Lancet Neurol 2004；3：46-53)。

由於排尿障礙通常係根據患者之主觀症狀而診斷，所以除了膀胱及神經系統的控制外，心智原因亦扮演重要角色。而且，在用於膀胱過動症或其發病之藥物研發的動物研究中，發現在非麻醉狀態下的排尿機能被認為具重要性。此外，由於根據中樞及周圍神經系統之影響，不隨意膀胱收縮(亦即迫尿肌過度活動)可被視為一症狀，所以重要的是使用一其中排尿參數可在無麻醉條件下經客觀地發現的動物模式(Abrams P.等人。The standardisation of terminology of lower urinary tract funtion：Reprort from the Standardisation Sub-committee of the interational continence Society.Neurourol Urodyn 2002；21：167-178)。最近，已經使用利用各種動物模式之許多實驗以確認膀胱過動症群的機制。然而，未使用可活化膀胱感覺系統之內源性神經遞質，而是已進行使用其中已自然發生膀胱過動症之自發性高血壓大鼠(SHR)的實驗。首先已培育該等SHR作為用於人類高血壓的動物模式，但是近來已使用該等SHR作為膀胱過動症模式。在尿道動力研究中，該等SHR顯示具有小便頻繁的迫尿肌過動症，因此其等業經視為一用於膀胱過動症的客觀性認可的動物模式(Jin LH等人.substantial detrusor overactivity in conscious spontaneously hypertensive rats with hyperactive behavior.Scand J Urol Nephrol 2009；43：3-7)。在使用很類似人類膀胱過動症症候群的該等SHR之實驗內，由於各種機制的效應及非一特定機制的效應，在一藥物投與後，用於評估排尿時間間隔的增加之該動物模式適於用以評估改善程度。

在另一方面，神經激肽(NK)受體係分成3種亞型：NK1、NK2及NK3，且其等係為作為在中樞及周圍神經系統上作用之神經胜肽以及一速激肽族(諸如神經激肽A及神經激肽B)的物質P(SP)之內源性受體。[S.Harrison等人，Int.J.Biochem.Cell Biol.,33：p 555-576,2001]作為該等存在於膀胱內之NK受體，NK1主要存在於內皮細胞內，而NK2主要存在於迫尿肌內。在數項研究內已發現NK2阻斷劑可降 低大鼠的迫尿肌過動症，但是對於人類膀胱並沒有得到一致的結果。然而，最近已報告NK-1受體阻斷劑可防止速激肽被吸入感覺膀胱及脊髓內，因此會導致誘發排尿的門檻增加及膀胱容量之增加且不會阻礙解尿階段。因此，該脊髓內之NK受體業經積極研究作為用於膀胱過動症之治療的新目標(Green SA等人.Efficacy and safety of a neurokinin-1 receptor antagonist in postmenopausal women with overactive bladder with urge urinary incontinence.J Urol 2006；176：2535-40)。

發明概要

本發明者因此已致力研發一能有效治療膀胱過動症症候群的新物質，且已發現補骨脂之種子萃取物及其餾份顯示以下效用：延長排尿時間間隔以及增加其中已發生膀胱過動症之自發性高血壓大鼠(SHR)的膀胱容量。

本發明之一目標為提供一補骨脂莘取物或其餾份。

本發明之另一目標為提供一用於預防、減輕或治療膀胱過動症症候群的組成物，其包含該補骨脂萃取物或其溶離份作為一活性成份。

根據其第一方面，本發明係提供一補骨脂萃取物或其溶離份。

此外，根據第二方面，本發明係提供一用於預防、減輕或治療膀胱過動症症候群的組成物，其特徵為包含該作為一活性成份之補骨脂萃取物或其溶離份。

根據本發明，該補骨脂萃取物或其溶離份顯示一對於NK1或M₃受體的抑制效用，且因此，可有效用以預防、減輕或治療與NK1或M₃受體有關的疾病或症狀。此等疾病或症狀之代表性實例為膀胱過動症症候群。

圖式簡單說明

第1圖表示使用UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)分析補骨脂種子之熱水萃取物或乙醇萃取物的層析圖結果。自上圖可知，1)表示該熱水萃取物的層析圖，而2)表示該50%(v/v)乙醇萃取物的層析圖。

第2圖為補骨脂種子之乙醇萃取物的層析圖結果。自上部可知，其等係為10%(v/v)、30%(v/v)、50%(v/v)、70%(v/v)、90%(v/v)或100%(v/v)乙醇莘取物的層析圖。

第3圖為使用SHR膀胱過動症模式比較補骨之熱水萃取物與乙醇萃取物對於排尿頻率的減少效用之圖解。

第4圖補骨脂種子之溶離份的層析圖結果。自上部可知，其等係為以下的層析圖：一50%(v/v)乙醇萃取物、該50%(v/v)乙醇萃取物之一10%(v/v)甲醇溶離份、該50%(v/v)乙醇萃取物之一40%(v/v)甲醇溶離份、該50%(v/v)乙醇萃取物之一60%(v/v)甲醇溶離份、該50%(v/v)乙醇萃取物之一80%(v/v)甲醇溶離份、及該50%(v/v)乙醇萃取物之一100%(v/v)甲醇溶離份。

第5圖為經由使用一SHR膀胱過動症模式而比較補骨脂種子之溶離份對排尿頻率的減少效用之圖解。F3代表該 50%(v/v)乙醇萃取物之一60%(v/v)甲醇溶離份。F4代表該50%(v/v)乙醇萃取物之一80%(v/v)甲醇溶離份，而F5代表該50%(v/v)乙醇萃取物之一100%(v/v)甲醇溶離份。

較佳實施例之詳細說明

下文更詳細說明本發明。

為了獲得上述目標，本發明提供一補骨脂種子(亦稱為“Gaeampul種子”)萃取物、及一用於預防、減輕或治療膀胱過動症症候群之含彼等的組成物。

本發明已發現該補骨脂種子萃取物或其溶離份對於延長排尿時間間隔及增加其中係自然發生膀胱過動症之自發性高血壓大鼠(SHR)的膀胱容量具有高效力。自這些事實可知，本發明已確認該補骨脂種子萃取物或其溶離份可有效用以治療或預防膀胱過動症症候群。該補骨脂種子萃取物或其溶離份之此等效用業經認為係起因於涉及一包括該膀胱、脊髓及其上路徑之腸神經系統之膀胱收縮的NK-1或M₃受體之抑制作用。然而，本發明之範圍並不受限於上述機制。

可根據熟悉本項技藝者已熟知的習知萃取法以製造根據本發明之該補骨脂種子萃取物。例如可藉在陰涼處乾燥補脂種子，切成小片，經萃取溶劑萃取，並可選擇性進行濃縮(在減壓下)、乾燥或純化而製造本發明該種子萃取物。以該等補骨脂種子的體積計，該萃取溶劑之體積為1至200倍。根據上述方法，更佳藉以下步驟而自該等補骨脂種子 萃取活性成份：(a)於50~100℃下在冷卻冷凝器內加熱該等補骨脂種子，費時1~20小時，以預防溶劑蒸發、或(b)於5~37℃下將其等浸漬在該萃取溶劑內，費時0.5~15天。亦可根據其它萃取法(諸如攪拌萃取、回流萃取、冷却萃取、冷浸漬萃取、超音波萃取及超臨界流體萃取)製造本發明該種子萃取物。

適於製造根據本發明之該種子萃取物的該等溶劑可包括，但不限於習知有機溶劑，諸如C1-C4醇或水性C1-C4醇溶液；甘油、多羥醇，諸如丁二醇或丙二醇；烴溶劑，諸如乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙醇、苯、己烷、二乙醚或二氯甲烷；及其等之混合物。其中，較佳使用C1-C4醇或其水溶液、且更佳為C1-C4醇之水溶液。此外，該較佳C1-C4醇可以是甲醇或乙醇。該萃取溶劑最佳為乙醇水溶液。該乙醇水溶液可較佳為一水性乙醇溶液(10~100%(v/v)乙醇)(就100%(v/v)而言，其係為乙醇)、更佳為一水性乙醇溶液(30~70%(v/v)乙醇)、最佳為一水性乙醇溶液(40~60%(v/v)乙醇)。

根據本發明，可藉以下步驟而製造該補骨脂之溶離份：(a)使用C1-C4醇或其醇水溶液獲得一補骨脂種子萃取物；及(b)使用C1-C4醇與水之混合物作為流動相，在一濃度梯度下經由柱式層析法而溶析該種子萃取物。

該用於步驟(b)之C1-C4醇較佳為甲醇或乙醇。

作為一適於根據本發明之上述層析法的柱，可使用十八基甲矽烷基二氧化矽樹脂(ODS)，以一裝填於其上之試樣 的數量計，該樹脂的數量為10~20倍。可使用醇及水之混合溶劑作為一用於上述層析法的溶劑。於此時，雖然增加該極性醇的數量，可以以階梯梯度方式使用以該樹脂之體積計2至3倍的體積之該水與醇之混合溶劑。經由該方法，可陸續獲得一系列溶離份，且該等經水性醇溶液(60~100%(v/v)醇)、較佳經水性醇溶液(70~100%(v/v)醇)、更佳經水性醇溶液(70~90%(v/v)醇)溶析的溶離份顯示最高生理活性。

根據本發明，可以在一醫藥或機能食品內製備該用於預防、減輕或治療膀胱過動症症候群之含該補骨脂萃取物或其溶離份的組成物。此種醫藥或機能食品可分別包含藥學或醫學上可接受賦形劑或添加劑。本發明該組成物可單獨或與任何合適載劑或賦形劑一起投與，且該調配物可投與一次或重複投與。

含本發明該組成物之該醫藥或機能食品可以是一固體調配物或液體調配物。該固體調配物可包括，但不限於：散劑、顆粒、錠劑、塞劑等。該固體調配物可包括，但不限於：賦形劑、調味劑、結合劑、防腐劑、分解劑、潤滑劑、填料等。該液體調配物可包括，但不限於：水、溶液(諸如丙二醇溶液)、懸浮液、乳化劑等。該液體調配物可包括，但不限於：著色劑、調味劑、安定劑、黏性劑等。

例如可藉簡單混合根據本發明之該補骨脂萃取物或其溶離份與一藥學上可接受賦形劑(諸如乳糖、澱粉或微結晶狀纖維素)而製成該散劑。該等顆粒的製法為混合根據本發 明之該補骨脂萃取物或其溶離份、一藥學上可接受賦形劑、及一藥學上可接受結合劑(諸如聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基纖維素)，繼而使用一溶劑(諸如水、乙醇或異丙醇)進行濕式粒化、或藉壓縮力而進行乾式粒化。此外，可藉混合該顆粒與一藥學上可接受潤滑劑(諸如硬脂酸鎂)，並使用製錠機將所形成混合物製片而製成該錠劑。

根據欲經治療的疾病及患者之狀況，可以投與呈以下形式的本發明該組成物：口服劑、注射劑(例如肌內注射劑、腹腔內注射劑、靜脈內注射劑、輸液、皮下注射劑、及植入物)、吸入藥、鼻內劑、陰道內劑、直腸內劑、舌下劑、經皮劑或局部劑，但不限於彼等。根據投藥方式，可將其調配成一含一非毒性且藥學上可接受載劑、添加物或賦形劑的單位劑量。本發明的範圍亦可包括能持續釋放藥物，費時一段時間的貯存調配物。

為了達成根據本發明之治療、預防或減輕膀胱過動症症候群的目的，可以以約10毫克/公斤/每天至約2400毫克/公斤/每天、且較佳約100毫克/公斤/每天至約1200毫克/公斤/每天的每日劑量投與該補骨脂萃取物或其溶劑份。然而，可根據以下決定上述劑量：該補骨脂萃取物及其溶離物的純度程度、該患者之狀況(年齡、性別、體重等)、該欲經治療之疾病的嚴重性等。若必要，為方便起見，可將每日總劑量分成數劑量並每天投與數次。

該根據本發明之補骨脂萃取物及其溶離份對於神經激肽-1(NK1)受體及/或毒蕈鹼-3受體具有抑制效用。此外，當 使該根據本發明之補骨脂萃取物或其溶離份與NK1或M3受體表現細胞接觸時，可抑制該等NK1(神經激肽-1)及M3受體的活性。

因此，該根據本發明之補骨脂萃取物或其溶離份可有效用以預防、減輕或治療NK1或M3受體相關疾病或症狀、特別是與該NK1或M3受體之抑制劑有關的疾病或症狀。

該等NK1受體相關疾病或症狀可包括急性及慢性疼痛、噁心、嘔吐、炎性疾病，例如腦膜炎、關節炎、氣喘、牛皮癬及(日光)灼傷；胃腸病，特別是大腸激躁症、發炎性大腸病(克隆氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎；膀胱或胃腸運動過度症，特別是膀胱過動症症候群、尿失禁；尿道感染；過敏反應，例如濕疹及鼻炎；心血管病，例如高血壓、動脈粥瘤硬化、水腫、心絞痛、叢集性頭痛及偏頭痛；皮膚病，例如蕁麻疹、紅斑性狼瘡及搔癢；呼吸病，例如慢性阻塞性肺病、支氣管痙攣、支氣管肺炎、支氣管炎、呼吸窘迫症候群及纖維囊泡症；各種贅生疾病；精神病及/或神經疾病，例如精神分裂症及其它精神病性障礙；情緒障礙，例如雙相性I型情緒障礙、雙相性II型情緒障礙及非極性抑鬱，諸如輕度抑鬱症、季節性情緒障礙、產後輕度抑鬱症及重度抑鬱症；焦慮障礙，例如恐慌障礙(廣場恐懼症之存在或不存在)、社交恐懼症、強迫症(伴隨之病理性慢性抽搐障礙或精神病人格障礙之存在或不存在)、創傷後的應激性精神障礙及廣泛性焦慮障礙；藥物相關性障礙，例如(諸如依賴性及濫用)、精神活性物質使用不當及(諸 如藥物脫癮)及藥物誘發的障礙；全面性精神發育障礙，例如自閉症及雷特氏症(Rett’s disorder)；注意力缺損及破壞性行為障礙，例如注意力缺損過動症；衝動控制障礙，諸如功擊、病態性嗜賭；飲食障礙，諸如厭食症及貪食症、肥胖症；睡眠障礙，諸如失眠症；抽搐障礙，諸如托雷德氏症(Tourette’s disorder)；腿不寧症候群；認知障礙及健忘症，例如阿滋海默氏症(Alzheimer’s disease)、克魯滋費德-賈可症(Creutzfeldt-Jacob disease)、哈丁頓氏症(Huntington’s disease)、帕金森氏症(Parkinson disease)及神經受傷復健(創傷後腦病)等。

該等M3受體相關疾病或症狀可包括慢性阻塞性肺病、慢性支氣管炎、氣喘、成人/急性呼吸窘迫症、慢性呼吸阻塞、支氣管過動症、纖維樣肺、氣腫或過敏性鼻炎；大腸激躁症、痙攣性結腸炎、胃與十二指腸潰瘍、骨痛或蠕動過度、憩室炎、疼痛伴隨的胃腸平滑肌之抽搐；神經源性排尿、神經源性膀胱、遺尿、精神性及肉體性膀胱、膀胱轉換或慢性膀胱炎相關失禁、膀胱過動症症候群、尿道障礙伴隨的排尿障礙，諸如快速排尿及頻尿；及運動原病。

本發明進一步藉以下實例而闡明。然而，應該瞭解這些實例僅用以明確地闡明本發明而非以任何形式限制本發明。

製法實例1：補骨脂種子萃取物的製法

自該等補骨脂種子製造乙醇萃取物。在陰涼處乾燥100 克該等種子並將其等切成小片後，添加10%(v/v)、30%(v/v)、50%(v/v)、70%(v/v)、及90%(v/v)乙醇水溶液各0.7升於其中並於80℃在回流下萃取兩次，費時3小時。然後添加100%(v/v)乙醇至所形成溶液以便進行冷浸漬，且使自其獲得之各萃取物經過濾、濃縮並乾燥，然後作為一用於以下實驗的試樣。

而且，如下述製造補骨脂種子之熱水萃取物。將100克該等種子放入一藥物標識器(DAEWOONG Co.,Ltd.Model No.：DWP5000M)內後，添加1.5升蒸餾水於其中，且使該混合物進行第一次萃取，費時150分鐘。其後，添加等量之蒸餾水至所形成混合物，繼而進行第二次萃取，費時120分鐘。使自其獲得之各萃取物經過濾、濃縮並乾燥，然後作為一用於以下實驗的試樣。

試驗實例1：該等萃取物之組份之差異的分析

使用UPLC進行評估

第1圖為補骨脂種子之一熱水萃取物及一50%(v/v)乙醇萃取物的UPLC層析圖，而第2圖為經由改變乙醇%(v/v)含量而獲得之各乙醇萃取物的UPLC層析圖[System Waters AQUITY；柱C18柱(100×2.1毫米ID，S-1.8微米)；偵檢波長210奈米]。

如第1圖內所示，經由比較該熱水萃取物與50%(v/v)乙醇萃取物的層析圖，已發現經8分鐘滯留時間後，在該熱水萃取物內幾乎不能偵檢出尖峰。此外，如在第2圖內可知，已確認該10%(v/v)乙醇萃取物與該熱水萃取物的層析圖圖 案類似，但是在該30%(v/v)或更高之乙醇萃取物內之萃取物組份有顯著差異。

試驗實例2：經由使用SHR膀胱過動症模式而測定該補骨脂萃取物對解尿頻率之減少的效用

為了檢查該補骨脂種子萃取物對膀胱過動症症候群的療效，如下測定投與一試驗藥物後，自發性高血壓大鼠(SHR)的解尿頻率。文中，該等SHR顯示頻尿，其係為人類膀胱過動症症候群之一特徵。

使用9-14週大的雄性SHR。於第1天，使該等SHR接受0.5% CMC賦形劑並於第2天接受該試驗藥物(該補骨脂種子萃取物及對照物，使用相同溶劑作為該賦形劑)。這兩天之投藥體積相同。

該賦形劑及試驗藥物投與後，立即將該等SHR放入籠子內並在未供應水及飼料的情況下藉使用一等長轉換器(Harvard Apparatus)及MP150(BIOPAC Systems Model No.MP150CE)而進行解尿測定，費時4小時。比較該賦形劑(第1天)及試驗藥物(第2天)投與後2小時之解尿頻率的結果並使用一配對t-試驗進行統計學分析。

在表1及第3圖內，“賦形劑”代表該等SHR僅口服賦形劑的群組，“TTD”代表該等SHR口服10毫克/公斤之托特羅定(tolterodine)的正性群組，“熱水”代表該等SHR口服100毫克/公斤之該熱水萃取物的群組，而“乙醇”代表該等SHR可服100毫克/公斤之該50%(v/v)乙醇萃取物的群組。

如表1及第3圖內所示，該50%(v/v)乙醇萃取物顯示對 於解尿頻率的減少效用，且此種減少效用高於使用托特羅定作為正性對照物之減少效用。反之，該熱水萃取物顯示對於解尿頻率之極微減少效用。自這些結果已證明在補骨脂的各種種子萃取物內的乙醇萃取物中包括該等對於膀胱過動症症候群具有療效的活性成份。將第1圖之結果列入考慮，可預期在該層析圖內之8分鐘的滯留時間後，會出現該等活性成份包括在一尖峰內。

製法實例2：補骨脂種子溶離份的製法

使5克上文製成之補骨脂的該50%(v/v)乙醇萃取物進行使用一已充填十八基甲矽烷基二氧化矽樹脂的柱(ODS，12奈米，S-50微米)之柱式層析法。文中，該樹脂的使用量以一試樣之數量計為10-至20-倍(100克)，且使用甲醇及水之混合溶劑。在增加該甲醇之數量時，以階梯梯度方式使用以該樹脂體積計2至3-倍體積(200毫升)的該甲醇水溶液。藉分別使用水性甲醇溶液(10、40、60、80及100%(v/v)甲醇)而陸續溶析一系列溶離份。濃縮、乾燥如此獲得的溶離份並用於以下實驗中。

試驗實例3：該等溶離份之組份之差異的分析

使用UPLC進行評估

第4圖為藉使該補骨脂種子萃取物進行柱式層析而獲得之5種溶離份的UPLC層析圖[System Waters AQUITY；柱C18柱(100×2.1毫米ID，S-1.8微米)；偵檢波長210奈米]。

比較這5種溶離份與該50%(v/v)乙醇萃取物的層析圖，含高極性物質之第一種溶離份(F1，10%(v/v)甲醇溶離份)係位於該層析圖的前部。隨著該溶劑內之甲醇含量增加，該溶離份的極性會逐漸減少。因此，第5種溶離份(F5，100%(v/v)甲醇溶離份)僅含有具很低極性的物質。這些結果建議在藉使用柱式層析法而製造補骨脂萃取物的溶離份時，根據溶析溶劑的類型，該溶離份包含的組份有差異。

試驗實例4：活體外機制分析

速激肽NK₁受體抑制活性

添加100微升經改質HEPES緩衝劑(20mM(毫莫耳濃度)HEPES,pH 7.4、1mM MnCl₂，0.1% BSA)至各井，添加5微升各該補骨脂種子萃取物及其5種溶離份(各10及100微克/毫升)在DMSO內之溶液至其內。於此時，使用5微升L-703,606(0.5、2.5、5、25、50Mm(微莫耳濃度))作為一正性對照物。其後，添加50微升作為NK₁受體配位體之[³H]Substance P 0.8nM(毫微莫耳濃度)至各井，且添加100微升含人類衍生的神經激肽NK₁受體表現性細胞膜(人類重組型CHO細胞)之經改質HEPES緩衝劑於其中。於4℃在以200rpm攪拌下培育該井平皿，費時90分鐘，繼而過濾 並清洗。

使用β射線計數器計算該同位素([³H]Substance P)所連接之細胞膜數。於此時，由於該試驗物質強烈地與該受體鍵結，所以該配位體([³H]Substance P)的結合親和力減少，且因此，計算值降低(競爭性結合力)。就該配位體僅以0%抑制作用所添加之該井的結果、以及該配位體並非以100%抑制作用所添加之該井的結果而言，係根據一藥物的濃度計算該抑制速率(%)。用於一實驗之各試樣數為2(n=2)，且結果示於下表2內。

毒蕈鹼M₃受體抑制活性

添加100微升經改質Tris緩衝劑(0mM Tris-HCl,pH 7.4、10mM MgCl₂、1mM EDTA)至各井，添加5微升各該補骨脂種子萃取物及其5種溶離份(各10及100微克/毫升)之DMSO溶液於其內。於此時，使用5微升4-DAMP(0.5、2.5、5、25,50μM)作為一正性對照物。其後，添加50微升作為M₃受體配位體之[³H]N-甲基莨菪鹼0.8nM至各井，且添加100微升含人類衍生的神經激肽M₃受體表現性細胞膜(人類重組型CHO細胞)之經改質Tris緩衝劑於其內。於4℃在以200rpm攪拌下培育該井平皿，費時90分鐘，繼而過濾並清洗。

使用β射線計數器計算該同位素([³H]N-甲基莨菪鹼)所連接的細胞膜數。就該配位體僅以0%抑制作用所添加之該井的結果、以及該配位體並非以100%抑制作用所添加之該井的結果而言，係根據一藥物的濃度計算該抑制速率(%)。用於一實驗之各試樣數為2(n=2)，且結果示於下表2內。

如表2內所示，已發現在其中100微克/毫升各該補骨脂之50%(v/v)乙醇萃取物、60%%(v/v)甲醇溶離份(F3)、80%(v/v)甲醇溶離份(F4)及100%(v/v)甲醇溶離份(F5)經處置的試驗群組內，發現對於該神經激肽受體及毒蕈鹼受體有50%或更高的抑制活性。根據這些結果，已認為根據本發明之該補骨脂種子萃取物及其溶離份顯示經由抑制該NK受體及M₃受體(其等涉及經由有害的刺激及膀胱頸活動之傷害感受性路徑)之合併作用而減輕排尿障礙的療效。

試驗實例5：使用無麻醉SHR膀胱過動症模式測定該等補骨脂溶離份對解尿頻率的減少效用

為了確認可顯示對於實例4內的該等NK1及M₃受體之抑制活性之3種溶離份(F3、F4及F5)對於膀胱過動症候群的療效，在根據如試驗實例2中所述的相同方法投與一試驗藥物後，測定自發性高血壓大鼠(SHR)的解尿頻率。於此時，口服100毫克/公斤之劑量的各溶離份。結果示於下表3及第 5圖內。

如表3及第5圖內所示，所有3種溶離份對於該等SHR之解尿頻顯示減少之效用，且特別是，F4之此減少效用最高。 根據這些結果，較佳使用該經60~100%(v/v)甲醇溶析過的補骨脂種子溶離份。

試驗實例6：使用無麻醉SHR膀胱過動症模式，經由尿動力研究而測定對於排尿壓力及排尿量的影響

實驗動物

使用9-14週大的雄性SHR。使該等大鼠適應可自由取得水及飼料之12/12小時的亮-暗週期之實驗條件。在進行該尿動力學研究當天，使一試驗組的大鼠口服300毫克/公斤之該等補骨脂種子的乙醇萃取物。就所有該等大鼠而言，在進行膀胱內壓測量法期間，在未投與任何可作為對照物之藥物的情況下，使該等大鼠進行3-5次的排尿循環。口服一藥物後30分鐘，使其等排尿，費時1小時且測定各尿動力學之數值。在經測定之該等排尿週期之中，2-3個連續排尿收縮尖峰係選自一藥物之投與前及後，且計算其等之平均值。

輸尿管支架插入

為了測定膀胱壓力並注入生理鹽水，在尿動力學測定 前3天，切閉該等大鼠的下腹，並經由荷包口縫法(purse-string suture)而將具有環帶之聚乙烯導尿管(PE-50,Becton Dickinson,Parsippany,USA)固定於膀胱圓頂(bladder dome)。其後，使該導尿管通過皮下層並固定於背部皮膚上。

用於測定膀胱壓力的裝置

在輸尿管支架插入及腹內壓力測定後3天，在無麻醉狀態下將該等大鼠自由地安置在代謝籠內。藉使用三通旋塞而使位於該頸部之輸尿管支架連接至一注射泵(PHD22/2000泵；Harvard Apparatus)及一壓力轉換器(Reaserch Grade Blood Pressure Transducer；Harvard Apparatus,Holliston,USA)，且在以10毫升/小時-1之速率輸注生理鹽水至該輸尿管支架時，測定膀胱內壓(基於以下事實：當該膀胱充滿一特定量之生理鹽水時，其會收縮以排尿)。為了測定排尿量，使一流體收集器與一力位移轉換器(Reaserch Grade Isometric Transducer；Harvard Apparatus)連接，且測定其內所收集的尿量。藉使用MP150資料取得系統(BIOPAC systems,Goleta,USA)及Acq Knowledge 3.8.1軟體而進行該膀胱內壓、腹壓及排尿量的資料分析。

測定用於尿動力學研究的參數

在3次重複排尿週期內，將作為該膀胱內壓之一指數的基底壓力定義為在該膀胱內壓力試驗中所測定之最低壓力，將一底限壓力定義為就在該膀胱收縮前之壓力，而將一排尿壓力定義為在該排尿期間之最大壓力。藉使一流體 收集器連接至力位移轉換器並測定其內所收集的尿量而測定作為一體積參數之指數的排尿量。藉排尿完成後，使已插入膀胱內之該支架位於該大鼠身體的下部，費時一段時間，並測定其內所收量的生理鹽水量而測定殘留量。藉合併該殘留量及排尿量而測定膀胱容量。在3次排尿週期間，藉測定一先前排尿週期之排尿壓力與下一排尿週期之排尿壓力間時間間隔，並自該時間間隔減去測定該殘留量的時間而測定一排尿間隔。測定該排尿週期，費時60分鐘，自該等經測定之排尿週期選出代表性的3次連續週期，然後計算各參數的平均值。

在投藥前，開始測定，且獲得約5次之安定化排尿週期。其後，自該等大鼠分離導尿管，且使用一探測器使該等大鼠口服一試驗藥物。投藥後30分鐘，使該導尿管的連接至該等大鼠，且測定該排尿週期，費時1小時。

如表4內所示，已發現該補骨脂之乙醇萃取物可顯著增加作為與在膀胱過動症症候群內所發現的頻尿有關之體積參數的膀胱容量(BC)、排尿量(VV)及排尿時間間隔(MI)，且因此能有效用以治療頻尿。此外，如自表5可知，已確認與該補骨脂萃取物比較，於較低濃度下，該補骨脂之柱溶離份對於與頻尿有關的體積參數顯示很顯著的影響。

調配物實例

下文，詳述含根據本發明之該萃取物或其溶離物的調配物，但不限於彼等。

散劑之製造

成份：根據本發明之萃取物或其溶離份20~100毫克；乳糖100毫克；及滑石10毫克

混合上述成份並填入一不漏氣囊內以製造散劑。

錠劑之製造

成份：根據本發明之萃取物或其溶離份10~100毫克；玉米澱粉100毫克；乳糖100毫克；及硬脂酸鎂2毫克

混合上述成份並根據習知製片方法製成錠劑。

膠囊之製造

成份：根據本發明之萃取物或其溶離份10~100毫克；結晶狀纖維素3毫克；乳糖14.8毫克；及硬脂酸鎂0.2毫克

混合該等成份並根據習知方法填入明膠膠囊內以得到膠囊藥劑。

注射調配物之製造

成份：根據本發明之萃取物或其溶離份10~100毫克；甘露醇180毫克；用於注射之蒸餾水2974毫克；及Na₂HPO₄12H₂O 26毫克

根據習知方法，將含上述成份之可注射調配物製成(2毫升)安瓿。

液體調配物之製造

成份：根據本發明之萃取物或其溶離份20~100毫克；異構化糖10克；甘露醇5克；及純水 合適量

根據習知方法，使各成份溶解在純水內。添加一合適量之檸檬調味料至上述成份並混合。然後，添加純水以將最終體積調整至100毫升，裝在褐色瓶內並滅菌以製造液體調配物。

健康食品之製造

成份：根據本發明之萃取物或其溶離份100~1,000毫克；維生素 一合適量；維生素A乙酸鹽70微克；維生素E 1.0毫克；維生素B1 0.13毫克；維生素B2 0.15毫克；維生素B6 0.5毫克；維生素B12 0.2微克；維生素C 10毫克；生物素10微克；菸草酸醯胺1.7毫克；葉酸50微克；泛酸鈣0.5毫克； 礦物混合物 一合適量；硫酸亞鐵1.75毫克；氧化鋅0.82毫克；碳酸鎂25.3毫克；磷酸二氫鉀15毫克磷酸氫二鉀55毫克檸檬酸鉀90毫克；碳酸鈣100毫克；及氯化鎂24.8毫克

根據習知健康食品製法，混合上述成份並製成顆粒。其後，根據習知方法將該等顆粒製成呈錠劑或膠囊形成的健康食品。

健康飲料的製造

成份：根據本發明之萃取物或其溶離份100~1,000毫克；檸檬酸1,000毫克；寡糖100克；李子濃縮物2克；牛磺酸1克；及純水 一合適量(總共900毫升)

根據習知健康飲料製法，混合上述成份，並於85℃下攪拌，費時一小時，過濾，然後裝填在2升無菌容器內，繼而消毒並密封。然後，在使用前將本發明該健康飲料貯存在冰箱內。

第1圖表示使用UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)分析補骨脂種子之熱水萃取物或乙醇萃取物的層析圖結果。自上圖可知，1)表示該熱水萃取物的層析圖，而2)表示該50%(v/v)乙醇萃取物的層析圖。

第2圖為補骨脂種子之乙醇萃取物的層析圖結果。自上部可知，其等係為10%(v/v)、30%(v/v)、50%(v/v)、70%(v/v)、90%(v/v)或100%(v/v)乙醇莘取物的層析圖。

第3圖為使用SHR膀胱過動症模式比較補骨之熱水萃取物與乙醇萃取物對於排尿頻率的減少效用之圖解。

第4圖補骨脂種子之溶離份的層析圖結果。自上部可知，其等係為以下的層析圖：一50%(v/v)乙醇萃取物、該50%(v/v)乙醇萃取物之一10%(v/v)甲醇溶離份、該50%(v/v)乙醇萃取物之一40%(v/v)甲醇溶離份、該50%(v/v)乙醇萃取物之一60%(v/v)甲醇溶離份、該50%(v/v)乙醇萃取物之一80%(v/v)甲醇溶離份、及該50%(v/v)乙醇萃取物之一100%(v/v)甲醇溶離份。

第5圖為經由使用一SHR膀胱過動症模式而比較補骨脂種子之溶離份對排尿頻率的減少效用之圖解。F3代表該50%(v/v)乙醇萃取物之一60%(v/v)甲醇溶離份。F4代表該50%(v/v)乙醇萃取物之一80%(v/v)甲醇溶離份，而F5代表該50%(v/v)乙醇萃取物之一100%(v/v)甲醇溶離份。

Claims (13)

1. 一種補骨脂種子萃取物，其對NK1或M₃受體具抑制活性。
2. 如申請專利範圍第1項之補骨脂種子萃取物，其中該萃取物係藉以一選自由C1~C4醇、水性C1~C4醇溶液、甘油、丁二醇、丙二醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、苯、己烷、二乙醚、二氯甲烷及其等之混合物所組成之群組的溶劑萃取該等補骨脂種子而製成。
3. 如申請專利範圍第2項之補骨脂種子萃取物，其中該萃取物係藉以C1~C4醇或水性C1~C4醇溶液萃取該等補骨脂種子而製成。
4. 如申請專利範圍第3項之補骨脂種子萃取物，其中該醇為甲醇或乙醇。
5. 一種對NK1或M₃受體具抑制效用的補骨脂種子萃取物之溶離份，其係藉添加水性C1~C4醇溶液(60~100%(v/v)醇)至該補骨質種子萃取物並自其分離而製成，其中該種子萃取物係藉以C1~C4醇或水性C1~C4醇溶液萃取該等補骨脂種子而製成。
6. 如申請專利範圍第5項之溶離份，其中該醇為甲醇或乙醇。
7. 一種用於預防、減輕或治療膀胱過動症症候群的藥學組成物，其包含一作為活性成份之補骨脂種子萃取物或其溶離份。
8. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該萃取物係 藉以一選自由C1~C4醇、水性C1~C4醇溶液、甘油、丁二醇、丙二醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、苯、己烷、二乙醚、二氯甲烷及其等之混合物所組成之群組的溶劑萃取該等補骨脂種子而製成。
9. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該萃取物係藉以C1~C4醇或水性C1~C4醇溶液萃取該等補骨脂種子而製成。
10. 如申請專利範圍第9項之藥學組成物，其中該醇為甲醇或乙醇。
11. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該溶離份係藉添加水性C1~C4醇溶液(60~100%(v/v)醇至該補骨脂種子萃取物，並自其分離而製成，其中該種子萃取物係藉以C1~C4醇或水性C1~C4醇溶液萃取該等補骨脂種子而製成。
12. 如申請專利範圍第11項之藥學組成物，其中該醇為甲醇或乙醇。
13. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該萃取物或其溶離份對NK1或M₃受體具抑制活性。