TW201300113A - 含有針對胸腺核苷酸合成酶之shRNA分子之微脂體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種以TS為標靶之shRNA之活體內送達方法。一種抗腫瘤劑,其係包含可藉由RNAi作用而抑制胸腺核苷酸合成酶之表現的短髮夾RNA(shRNA)與PEG修飾陽離子性微脂體者,並且該shRNA結合於該PEG修飾陽離子性微脂體之表面,且於3'末端具有包含至少2個鹼基之突出物。
Description
本發明係關於以含有針對胸腺核苷酸合成酶之shRNA(short hairpin RNA,短髮夾RNA)分子之微脂體作為有效成分之抗腫瘤劑及其用途,尤其是關於其與化學治療劑併用之用途。
近年來,引起RNA干擾(以下,RNAi)之RNAi分子作為用於治療腫瘤等之有效工具而備受關注,目前正開發可抑制腫瘤之增殖之各種RNAi分子。本發明者等人於先前報告有以參與DNA合成之胸腺核苷酸合成酶(以下,為TS)為標靶之RNAi分子,並且報告有:該RNAi分子顯著地抑制TS之表現,藉此具有抗腫瘤效果,又,可增強5-FU(5-fluorouracil,5-氟尿嘧啶)系抗腫瘤劑(尤其是替加氟-吉美嘧啶-氧酸鉀複合劑)之抗腫瘤效果(專利文獻1)。
然而,一般而言,RNAi分子會因活體內投予而迅速地分解。因此,極難將足夠量之RNAi分子送達腫瘤。
為了解決該問題,現今開發有各種RNAi分子之送達方法。例如可列舉將編碼RNAi分子(尤其是具有短髮夾構造之RNAi分子(shRNA))之DNA組入適當之載體,並投予該載體之方法(專利文獻1)。但是,該方法必須將該載體直接注入腫瘤內而投予,若考慮到臨床應用,則期待更容易之投予方法(例如靜脈內投予等)。又,開發出使用包含RNAi分子與微脂體之複合體(脂複合體)而將RNAi分子送達腫瘤
細胞之方法(非專利文獻1~3)。但是,於反覆投予該等脂複合體時,脂複合體會因所投予之活體之免疫系統之作用而被迅速地排除,從而無法獲得充分之效果,又,會發生產生嚴重副作用等問題。
因此,於該領域中依然迫切需求藉由活體內投予而有效率地將RNAi分子送達腫瘤之方法。
[專利文獻1] WO 2010/113844
[非專利文獻1] Qixin Leng et al., Drug Future. 2009 September; 34(9): 721.
[非專利文獻2] Sherry Y. Wu et al., The AAPS Journal, Vol.11, No.4, December 2009
[非專利文獻3] B. Ozpolat et al., Journal of Internal Medicine 267; 44-53 2009
本發明之目的在於提供以TS為標靶之shRNA之簡易且有效率之活體內送達方法。
本發明者等人為了解決上述問題而反覆進行努力研究,結果發現:使可抑制TS之表現之shRNA靜電結合於經PEG(polyethylene glycol,聚乙二醇)修飾之陽離子性微脂
體表面,藉此可簡單地送達癌細胞。又,發現藉由將結合有shRNA之經PEG修飾之陽離子性微脂體與化學治療劑、尤其是5-FU系抗腫瘤劑併用,可提高對癌細胞之靶向性,並且可顯著增大於癌細胞中之效果。進而發現,藉由將結合有shRNA之經PEG修飾之陽離子性微脂體與具有TS抑制作用之化學治療劑(例如5-FU系抗腫瘤劑或培美曲塞鈉水合物)併用,可提高癌細胞對該化學治療劑之敏感性,而增強抗腫瘤效果。本發明係基於該等見解。
即,本發明如下所述。
[1]一種抗腫瘤劑,其係包含可藉由RNAi作用而抑制胸腺核苷酸合成酶之表現之短髮夾RNA(shRNA)與PEG修飾陽離子性微脂體者,並且該shRNA結合於該PEG修飾陽離子性微脂體之表面,且於3'末端具有包含至少2個鹼基之突出物。
[2]如[1]之抗腫瘤劑,其中shRNA含有包含序列編號1所表示之鹼基序列之義鏈與於嚴格條件下與該義鏈雜交之反義鏈。
[3]如[1]或[2]之抗腫瘤劑,其中shRNA含有包含序列編號1所表示之鹼基序列之義鏈與包含序列編號2所表示之鹼基序列之反義鏈。
[4]如[1]至[3]中任一項之抗腫瘤劑,其中shRNA包含序列編號8所表示之鹼基序列。
[5]如[1]至[4]中任一項之抗腫瘤劑,其中PEG修飾陽離子性微脂體包含陽離子性微脂體,該陽離子性微脂體包含二
油醯基磷脂乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯甘油磷醯膽鹼(POPC)、膽固醇(CHOL)及O,O'-雙十四碳醯基-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。
[6]如[5]之抗腫瘤劑,其以3:2:3:2之莫耳比含有DOPE、POPC、CHOL及DC-6-14。
[7]如[1]至[6]中任一項之抗腫瘤劑,其中抗腫瘤劑之粒徑為200~300 nm。
[8]如[1]至[7]中任一項之抗腫瘤劑,其中進而於PEG修飾陽離子性微脂體之表面結合有可抑制選自由參與腫瘤細胞之增殖之基因所組成之群中之基因之表現的siRNA或shRNA。
[9]如[8]之抗腫瘤劑,其中參與腫瘤細胞之增殖之基因係選自由編碼VEGF(vascular endothelial growth factor,血管內皮生長因子)、EGFR(epidermal growth factor receptor,表皮生長因子受體)、PDGF(platelet-derived growth factor,血小板衍生生長因子)、HGF(hepatocyte growth factor,肝細胞生長因子)、Wint(Wingless-type MMTV integration site,無翅型MMTV整合位點)、Bcl-2(B cell lymphoma factor-2,B細胞淋巴瘤因子-2)、凋亡抑制基因、核糖核苷酸還原酶、DNA聚合酶之基因所組成之群中之一種或複數種基因。
[10]如[1]至[9]中任一項之抗腫瘤劑,其係與用於處理腫瘤之化學治療劑併用。
[11]一種組合物,其包含如[1]至[10]中任一項之抗腫瘤
劑及用於處理腫瘤之化學治療劑。
[12]如[10]之抗腫瘤劑及[11]之組合物,其中用於處理腫瘤之化學治療劑係具有TS抑制作用之抗腫瘤劑。
[13]如[12]之抗腫瘤劑或組合物,其中具有TS抑制作用之抗腫瘤劑為5-FU系抗腫瘤劑或培美曲塞鈉水合物。
[14]如[13]之抗腫瘤劑或組合物,其中5-FU系抗腫瘤劑為替加氟-吉美嘧啶-氧酸鉀複合劑。
本說明書包括作為本申請案之優先權之基礎的日本專利申請案2011-114946號說明書及/或圖式所記載之內容。
本發明之以含有針對胸腺核苷酸合成酶之shRNA分子的微脂體為有效成分之抗腫瘤劑可藉由活體內投予而抑制表現TS之腫瘤之增殖。
本發明中之可抑制胸腺核苷酸合成酶(以下記作「TS」)之表現之短髮夾RNA(以下記作「shRNA」)可藉由以胸腺核苷酸合成酶之mRNA部分為標靶,TS特異性地發揮RNAi作用,而顯著地抑制TS之表現。此處,本發明之RNAi分子「以mRNA部分為標靶」係指以下詳述之shRNA之反義鏈可於嚴格條件下與目標mRNA部分雜交。
所謂於嚴格條件下,可基於依據常法形成雜交體之核酸之熔解溫度(Tm)而求得。例如作為可維持雜交狀態之洗淨條件,通常可列舉「1×SSC、0.1% SDS、37℃」左右之條件、更嚴格為「0.5×SSC、0.1% SDS、42℃」左右之條
件、進而嚴格為「0.1×SSC、0.1% SDS、65℃」左右之條件。
本發明中之shRNA包含具有編碼TS之ORF(open reading frame,開放讀碼框)之鹼基序列或與其一部分相同之鹼基序列之義鏈、與於嚴格條件下與該義鏈雜交之反義鏈。此處,「ORF之鹼基序列或與其一部分相同之鹼基序列」係指將ORF之鹼基序列中之胸腺嘧啶置換為尿嘧啶所表示之鹼基序列或與其一部分相同之鹼基序列。
該義鏈包含15~25個鹼基,較佳為19個鹼基。義鏈之鹼基序列較理想為與編碼TS之ORF之鹼基序列相同,亦可實質上相同、即為同源序列。即,義鏈之鹼基序列亦可於ORF之鹼基序列中,亦可置換、缺失、插入及/或附加1或複數個、即1~3個鹼基,較佳為1~2個鹼基,更佳為1個鹼基。
該反義鏈具有可於嚴格條件下與義鏈雜交之鹼基序列。反義鏈只要可於嚴格條件下雜交,則亦可為具有包含1~3個鹼基,較佳為1~2個鹼基,更佳為1個鹼基之置換、缺失、插入及/或附加之錯配者。較佳為反義鏈包含與義鏈完全互補之鹼基序列。
義鏈及反義之鹼基序列可基於編碼TS之公知之鹼基序列(GenBank:CR601528.1)而選擇。作為選擇該等鹼基序列之方法,已知有各種方法,例如可使用siRNA設計支援系統(siRNA Design Support System,TAKARA BIO股份有限公司)等。
於本發明中,作為義鏈可列舉包含以下之鹼基序列者,但並不限定於該等:5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(序列編號1);5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3'(序列編號3);5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3'(序列編號5);5'-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3'(序列編號11)。
較佳為本發明中之shRNA包含義鏈5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(序列編號1)與反義鏈5'-UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3'(序列編號2);義鏈5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3'(序列編號3)與反義鏈5'-AUUCCAUAUCUCUGUAUUC(序列編號4);或義鏈5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3'(序列編號5)與反義鏈5'-ACACUCUACAUCAUGAUCG-3'(序列編號6);義鏈5'-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3'(序列編號11)與反義鏈5'-AACAACUCCUCCAAAACACCC-3'(序列編號12)。
進而較佳為本發明中之shRNA含有包含序列編號1所表示之鹼基序列之義鏈與包含序列編號2所表示之鹼基序列之反義鏈。
義鏈與反義鏈係藉由連接子部分而連接,該連接子部分藉由形成環狀而摺疊,該反義鏈與該義鏈進行雜交而形成雙鏈部分。shRNA分子所含之連接子部分只要可連接義鏈與反義鏈而形成莖環構造,則可為聚核苷酸連接子,亦可為非聚核苷酸連接子,並無特別限定,較佳為從業者公知之2~22個鹼基之聚核苷酸連接子。具體可例示UAGUGCUCCUGGUUG(序列編號7)、UUCAAGAGA、
CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCC及UUCG,較佳為UAGUGCUCCUGGUUG(序列編號7)。
本發明中之shRNA於3'末端具有包含至少2個鹼基之突出物。
於本發明中,突出物係指附加在反義鏈之3'末端,並且於義鏈之對應位置不存在可互補結合之鹼基的鹼基。反義鏈之3'末端不具有突出物之情形與具有突出物之情形相比,於使用以下詳述之PEG修飾陽離子性微脂體之轉染中,由shRNA引起之TS之表現抑制之程度約降低40~60%。該突出物之鹼基之種類、數量不受限定,例如可列舉包含1~5,較佳為1~3,進而較佳為1或2個鹼基之序列,例如可列舉TTT、UU或TT。較佳為UU。
於本發明中,作為較佳之shRNA,為包含序列編號8所表示之鹼基序列之單鏈RNA。
又,義鏈或反義鏈視需要可使5'末端磷酸化,亦可於5'末端結合有三磷酸(ppp)。
本發明中之PEG修飾陽離子性微脂體係於陽離子性微脂體之表面共價鍵結有一或複數個聚乙二醇分子(PEG),藉此可增加於活體內之陽離子性微脂體之血中滯留性。
陽離子性微脂體可基於公知方法、例如薄膜振盪法(Bangham法)而製作(A.D.Bangham et al.,J.Mol.Biol.,13,238-252(1965);A.D.Bangham and R.W.Horne,J.Mol.Biol.,8,660-668(1964))。即,於燒瓶等容器內,將至
少1種磷脂質溶解於氯仿等有機溶劑中,使該有機溶劑揮發並於容器之底部形成脂質膜後,向其中加入緩衝液等水溶液並且攪拌,藉此可獲得包含微脂體之懸浮液。
本發明中之陽離子性微脂體係具有1張或複數張包含選自以下之一種以上之磷脂質的膜:二油醯基磷脂乙醇胺(以下記作「DOPE」)、棕櫚醯油醯甘油磷醯膽鹼(以下記作「POPC」)、膽固醇(以下記作「CHOL」)、O,O'-雙十四碳醯基-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺氯化物(以下記作「DC-6-14」)、氫化精製蛋黃磷脂醯膽鹼、氫化精製大豆磷脂醯膽鹼、二軟脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼及1-軟脂醯-2-油醯磷脂醯膽鹼。
較佳為本發明中之陽離子性微脂體包含DOPE、POPC、CHOL及DC-6-14。陽離子性微脂體中之DOPE、POPC及DC-6-14之含有比(莫耳比)為DOPE:POPC:CHOL:DC-6-14=2~4:4~1:3~1:1~4,較佳為3:2:3:2。
陽離子性微脂體之表面所結合之PEG係選自分子量為500~5000之範圍者,較佳為分子量為2000左右。PEG對陽離子性微脂體之結合可藉由公知方法進行,並無特別限定,可使用製備後插入法而進行。即,於形成上述陽離子性微脂體後,藉由於適當條件下(例如30~60℃,30分鐘~3小時)將包含磷脂質及PEG之複合分子與該陽離子性微脂體進行培養,可於將PEG暴露於陽離子性微脂體之表面之形態下,將複合分子之脂質部分組入陽離子性微脂體之外側之磷脂質膜中。此時,所使用之複合分子之量相對於上述
陽離子性微脂體之總脂質,為3~10%(莫耳比),較佳為5%。於本發明中,作為可利用之包含磷脂質與PEG之複合分子,可列舉mPEG2000-DSPE,但並不限定於此。
本發明中之PEG修飾陽離子性微脂體之粒徑為80~200 nm,較佳為約100 nm。本發明中之PEG修飾陽離子性微脂體之ζ電位為10~40 mV,較佳為約25 mV。
上述shRNA係藉由共價鍵結或非共價鍵結而結合於上述PEG修飾陽離子性微脂體之膜表面。於上述shRNA與上述PEG修飾陽離子性微脂體之結合時,係將含有上述shRNA與上述PEG修飾陽離子性微脂體之混合液激烈地攪拌1~15分鐘,較佳為10分鐘左右。藉由施加攪拌,可將具備所獲得shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體之粒徑製備為數百nm之大小(Barichello,J.M.,et al.,Int.J.Pharm.(2011),doi:10.1016/j.ijpharm.2011.03.001)。又,藉由施加攪拌,可使上述shRNA均勻地分散並結合於PEG修飾陽離子性微脂體上,而防止由shRNA之不均勻結合引起之組織的PEG修飾陽離子性微脂體攝入之不均勻性。
於本發明中,具備shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體之粒徑為120~600 nm,較佳為200~300 nm。又,於本發明中,具備shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體之ζ電位為5~30 mV,較佳為約10~25 mV。由於具備shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體之表面電荷更接近中性,並且由於存在由PEG引起之位阻,故而與血清蛋白質之結合較少,因此可防止被肺泡捕獲,而增加血中滯留性。
本發明中之具備shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體除上述shRNA以外,亦可包含以於腫瘤細胞中表現之其他基因為標靶之siRNA或shRNA。所謂「於腫瘤細胞中表現之其他基因」,可列舉參與腫瘤細胞之增殖之因子,例如編碼VEGF、EGFR、PDGF、HGF、Wint、Bcl-2、凋亡抑制基因等增殖調節因子群之基因;編碼核糖核苷酸還原酶、DNA聚合酶等核酸合成相關酶群等之基因,但並不限定於該等。以於上述shRNA及腫瘤細胞中表現之其他基因為標靶之siRNA或shRNA可結合於同一PEG修飾陽離子性微脂體上,亦可分別結合於各別PEG修飾陽離子性微脂體上。
再者,於本說明書中,有時將具備shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體稱為「PEG修飾脂複合體」。
如以下實施例所詳述,具備上述shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體可藉由活體內投予而抑制腫瘤細胞之增殖,並且用作用於治療癌之抗腫瘤劑。
作為使用本發明之抗腫瘤劑可治療之癌,可列舉高度表現TS之癌,並無特別限制,例如可列舉:結腸直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊膽管癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、攝護腺癌、睪丸腫瘤、骨軟組織肉瘤、白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦腫瘤、惡性胸膜間皮瘤等。較佳為結腸直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、胰腺癌、膽道癌、肝癌、惡性胸膜間皮瘤,尤佳為結腸直腸癌、惡性胸膜間皮瘤。
又,本發明之抗腫瘤劑除了具備shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體亦外,亦可同時含有醫藥製造中通常使用之賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、溶解助劑、懸浮劑、等張劑、pH值調節劑、緩衝劑、穩定劑、著色劑、矯味劑、矯臭劑、組胺酸等。
作為賦形劑,例如可列舉:乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、肌醇、葡聚糖、山梨糖醇、白蛋白、尿素、澱粉、碳酸鈣、高嶺土、結晶纖維素、矽酸、甲基纖維素、甘油、海藻酸鈉、阿拉伯膠及該等之混合物等。作為潤滑劑,例如可列舉:精製滑石、硬脂酸鹽、硼砂、聚乙二醇及該等之混合物等。作為黏合劑,例如可列舉:單糖漿、葡萄糖液、澱粉液、明膠溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素、蟲膠、甲基纖維素、乙基纖維素、水、乙醇、磷酸鉀及該等之混合物等。作為崩解劑,例如可列舉:乾燥澱粉、海藻酸鈉、瓊脂粉、混布糖粉、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧伸乙基山梨糖醇酐脂肪酸酯類、月桂基硫酸鈉、甘油單硬脂酸酯、澱粉、乳糖及該等之混合物等。作為稀釋劑,例如可列舉:水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇、聚氧伸乙基山梨糖醇酐脂肪酸酯類及該等之混合物等。作為穩定劑,例如可列舉:焦亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸、巰基乙酸、硫代乳酸及該等之混合物等。作為等張劑,例如可列舉:氯化鈉、硼酸、葡萄糖、甘油及該等之混合物等。作為pH值
調節劑及緩衝劑,例如可列舉:檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸鈉、磷酸鈉及該等之混合物等。
本發明之抗腫瘤劑,可藉由經口或非經口(例如:靜脈內投予、動脈內投予、藉由注射之局部投予、對腹腔或胸腔之投予、皮下投予、肌內投予、舌下投予、經皮吸收或直腸內投予等)進行投予。較佳為本發明之抗腫瘤劑為靜脈內投予、腹腔內投予或胸腔內投予。
又,本發明之抗腫瘤劑可根據投予路徑而採用適當之劑型。具體可製備為注射劑、懸浮劑、乳化劑、軟膏劑、乳霜劑錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、丸劑、細粒劑、喉錠、直腸投予劑、油脂性栓劑、水溶性栓劑等各種製劑形態。
本發明之抗腫瘤劑之效果係以如下內容為指標並且可評價為:對源自上述癌之細胞或組織、及罹患上述癌之個體投予該抗腫瘤劑,腫瘤之大小與未投予該抗腫瘤劑之(或投予前之)細胞或組織及個體中之腫瘤之大小相比,腫瘤縮小或消失。作為可用於評價本發明之抗腫瘤劑之效果的癌細胞,只要表現TS,則癌症種類等並無特別限制,例如可列舉:人類結腸直腸癌細胞株DLD-1、DLD-1/5FU(5-FU耐藥性之DLD-1株)、KM12C/5FU(5-FU耐藥性之KM12C株)、HT29/5FU(5-FU耐藥性之HT29株)、人類胃癌細胞株NUGC-3/5FU(5-FU耐藥性之NUGC-3株)、人類惡性胸膜間皮瘤細胞株(MSTO 211H)等。
本發明之抗腫瘤劑之效果與以TS之mRNA為標靶之從業
者公知之以RNAi分子為有效成分之抗腫瘤劑相比,可具有2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍或者更高之抗腫瘤效果。
先前,shRNA向標靶細胞之活體內送達係利用包含編碼shRNA之DNA之病毒載體(WO 2010/113844),編碼該shRNA之DNA藉由注入該病毒載體時之水壓或病毒感染而轉移至細胞內,於核內表現shRNA。所表現之shRNA與內源性shRNA同樣地,與稱為Dicer之酶接觸而切出莖環構造,成為包含互補雙鏈RNA之siRNA並產生RNAi作用。另一方面,本發明之抗腫瘤劑藉由經口或非經口而將承載於PEG修飾陽離子性微脂體上之shRNA送達腫瘤細胞。送達腫瘤細胞之shRNA藉由內噬作用而轉移至細胞內。即,與上述先前技術不同,本發明中之shRNA並非於標靶細胞中表現者。本發明者等人首次發現:如此於活體內,在自細胞外導入之shRNA不分解之情況下發揮RNAi作用,可抑制標靶細胞中表現之內源性基因之表現。
又,於PEG修飾陽離子性微脂體上承載siRNA之情形時,於其製造過程中可能會僅承載未形成互補雙鏈之正義鏈或反義鏈。此種僅承載有正義鏈或反義鏈之PEG修飾陽離子性微脂體可為雜質,就醫藥品之觀點而言不理想。另一方面,藉由將shRNA承載於PEG修飾陽離子性微脂體上,產生如上述之雜質之可能性較低,就醫藥品之觀點而言較理想。
本發明之抗腫瘤劑可與現有之化學治療劑一併使用。作
為現有之化學治療劑,可列舉具有TS抑制作用之抗腫瘤劑。
作為「具有TS抑制作用之抗腫瘤劑」,只要可抑制TS之功能,則無特別限定,例如可列舉5-FU系抗腫瘤劑、培美曲塞鈉水合物、雷替曲塞(Tomudex)、甲胺蝶呤(MTX)、OSI-7904L(OSI公司)等。
目前報告有TS之表現量與5-FU系抗腫瘤劑之敏感性之關係(Patrick G.Johnston et al.,Cancer Res 1995;55:1407-12.及Kun-Huei Yeh et al.,Cancer 1998;82:1626-31)。對於癌症患者中TS之表現較低之癌症患者,5-FU系抗腫瘤劑效果顯著,另一方面,對於癌症患者中TS之表現較亢進之多數癌症患者對5-FU系抗腫瘤劑具有耐藥性。藉由投予本發明之抗腫瘤劑,可抑制腫瘤組織內之TS之產生,並提高該腫瘤組織之5-FU系抗腫瘤劑之敏感性。又,上述PEG修飾陽離子性微脂體於與5-FU系抗腫瘤劑併用之情形時,選擇性地蓄積於腫瘤內(Yusuke Doi et al.,Cancer Sci,November,2010,vol.101,no.11,2470-2475)。
藉由該等效果,於與5-FU系抗腫瘤劑併用之情形時,包含該PEG修飾陽離子性微脂體之本發明之抗腫瘤劑可將上述shRNA有效率地送達腫瘤,與單獨使用5-FU系抗腫瘤劑或本發明之抗腫瘤劑之情形相比,可獲得2倍、3倍、4倍、5倍或更高之顯著之高抗腫瘤效果。
作為「5-FU系抗腫瘤劑」,可列舉5-FU及活性代謝物質為5-FU之5-FU衍生物。作為5-FU衍生物例如可列舉含有
替加氟者。作為5-FU衍生物,較佳為含有替加氟之複合劑,具體可例示替加氟-尿嘧啶複合劑(例如優福定(UFT)(註冊商標)(大鵬藥品工業股份有限公司))、替加氟-吉美嘧啶-氧酸鉀複合劑等。其中尤佳為以下詳述之替加氟-吉美嘧啶-氧酸鉀複合劑,例如替吉奧(TS-1)(註冊商標)(大鵬藥品工業股份有限公司)。再者,於本說明書中,5-FU系抗腫瘤劑有時會記作「S-1」、「TS-1」,該等用語可相互間互換使用。
又,作為培美曲塞鈉水合物,可列舉愛寧達(註冊商標)(日本Eli Lilly股份有限公司)。培美曲塞鈉水合物亦與上述5-FU系抗腫瘤劑相同地,可藉由與本發明之抗腫瘤劑併用而將上述shRNA有效率地送達腫瘤,及/或與單獨使用該培美曲塞鈉水合物或本發明之抗腫瘤劑之情形相比,可獲得2倍、3倍、4倍、5倍或更高之顯著之高抗腫瘤效果。
本發明之抗腫瘤劑除了上述具有TS抑制作用之抗腫瘤劑以外,亦可與其他現有之化學治療劑併用,亦可使用其他現有之化學治療劑代替上述具有TS抑制作用之抗腫瘤劑與本發明之抗腫瘤併用。作為此種化學治療劑,可列舉:環磷醯胺、N-氧化氮芥、異環磷醯胺、美法侖、補束剋、二溴甘露醇、卡波醌、噻替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、卡莫司汀、培美曲塞二鈉、甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤核苷、巰嘌呤、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、依諾他濱、吉西他濱、氟達拉濱、培美曲塞、順鉑、卡鉑、奧賽力鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、
鹽酸伊立替康、卡培他濱等,可使用選自該等中之一種或複數種化學治療劑。該等化學治療劑亦與上述具有TS抑制作用之抗腫瘤劑同樣地,可藉由與本發明之抗腫瘤劑併用而將上述shRNA有效率地送達腫瘤,及/或與單獨使用該化學治療劑或本發明之抗腫瘤劑之情形相比,獲得2倍、3倍、4倍、5倍或更高之顯著之高抗腫瘤效果。
只要本發明之抗腫瘤劑與上述現有之化學治療劑係併用投予,即可作為組合物而提供。
「組合物」可為含有本發明之抗腫瘤劑與上述現有之化學治療劑作為有效成分之複合劑,並且亦可為將本發明之抗腫瘤劑與上述現有之化學治療劑以適合併用投予之封裝(套組製劑)之形式製造、包裝、流通者。
「併用投予」不僅包含同時投予本發明之抗腫瘤劑與上述現有之化學治療劑之情形,亦包含間隔投予本發明之抗腫瘤劑及上述現有之化學治療劑之情形。
本發明之抗腫瘤劑之投予量及投予次數可根據患者之年齡、體重、疾病之嚴重度等因素而變化,關於shRNA之量,可每次投予選自每1 kg體重為0.0001 mg~100 mg之範圍內的量,1天1~3次,每天投予或於每1~21天投予。本發明之抗腫瘤劑所包含之具備上述shRNA之PEG修飾陽離子性微脂體由於與先前公知之包含RNAi分子及微脂體之複合體(脂複合體)相比,具有較高之血中滯留性,故而可避免多次投予。藉此,可使得不易受到被投予之活體內之免疫系統之異物識別。
上述現有之化學治療劑之投予量可根據有效成分之化學物質之種類、患者之年齡、體重、疾病之嚴重度等因素而變化,可每次投予選自每1 kg體重為0.0001 mg~1000 mg之範圍內的量,1天1~3次,每天投予或於1~14天每天投予。例如現有之化學治療劑為5-FU系抗腫瘤劑之情形時,可每天投予,或於1~7天每天投予替加氟60~160 mg。上述現有之化學治療劑與單獨使用之情形相比,可低用量且多次投予。藉此,可抑制或延遲可能由上述現有之化學治療劑之投予引起之副作用(例如:骨髓抑制、溶血性貧血、瀰漫性血管內凝血症候群、猛爆性肝炎、脫水症狀、腸炎、間質性肺炎、口炎、消化道潰瘍、消化道出血、消化道穿孔、急性腎功能衰竭、皮膚黏膜眼症候群、中毒性表皮壞死症、精神神經障礙、急性胰腺炎、橫紋肌溶解症、嗅覺喪失等,並不限定於該等)之發病。
本發明亦關於使用上述本發明之抗腫瘤劑的癌症治療方法。作為可藉由該方法治療之癌症,包含上述所定義之癌。又,該方法中上述本發明之抗腫瘤劑及現有之化學治療劑之用法及用量如上所述。
以下,揭示實施例,更詳細地說明本發明。然而,本發明並不受該等實施例之限制。
基於公知之一般方法,合成以下之siRNA及shRNA。
(I)以TS為標靶之siRNA
以TS為標靶之siRNA係基於已確認抗腫瘤效果之針對TS之siRNA(WO 2010/113844)而合成,並且包含以下之正義鏈及反義鏈。
正義鏈:5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(序列編號1)
反義鏈:5'-UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3'(序列編號2)
再者,以下,將以TS為標靶之siRNA記作「siTS」。
(II)以螢光酶為標靶之siRNA
合成以螢光酶為標靶之siRNA而作為對照之siRNA。該siRNA包含以下之正義鏈及反義鏈。
正義鏈:5'-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3'(序列編號9)
反義鏈:5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3'(序列編號10)
再者,以下,將以螢光酶為標靶之siRNA記作「siCont」。
(III)以TS為標靶之shRNA
以TS為標靶之shRNA係基於已確認抗腫瘤效果之針對TS之shRNA(WO 2010/113844)而合成,並且具有以下之序列。
TS-shRNA:5'-GUAACACCAUCGAUCAUGAUAGUGCUCCUGGUUGUCAUGAUCGAUGGUGUUACUU-3'(序列編號8)
就3'末端具有2個尿嘧啶(突出物)而言,與上述公知之針對TS之shRNA不同。再者,以下,將以TS為標靶之shRNA
記作「shTS」。
<轉染>
轉染試劑係使用作為陽離子微脂體之一種的LipofectamineTM RNAi MAX(以下,「記作Lf RNAi MAX」)。
實施例1所製備之shRNA或siRNA與Lf RNAi MAX分別利用OptiMEM進行稀釋,以shRNA或siRNA與Lf RNAi MAX之比成為100(pmol):5(μL)之方式進行混合。此時,shRNA或siRNA溶液與Lf RNAi MAX溶液之量設為等量。將此混合液於室溫下放置10~20分鐘,藉此形成複合體(脂複合體)。
將各脂複合體分別直接添加至預先添加有OptiMEM之10 cm培養皿內,以合計容積成為5 ml之方式進行調整。其次,以成為500,000細胞/培養皿之方式將DLD-1或DLD-1/FU細胞懸浮液10 ml接種至該培養皿內,將最終合計容積設為15 ml並進行轉染。此時,以shRNA或siRNA之最終濃度成為1、5、10 nM之方式進行調整。自開始轉染起於37℃、5% CO2條件下於培養基中培養72小時,其後藉由以下方法製備細胞提取液。
<細胞提取液之製備>
自開始轉染起72小時後,去除培養基並利用冷PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸鹽緩衝液)(-)進行清洗後,使用胰蛋白酶溶液剝離細胞,並進行離心而去除上清液。進而,利用冷PBS(-)進行清洗後,添加冷裂解緩衝液
(Lysis buffer,50 mM之Tris-HCl(pH值7.4)、1% NP-40、0.25%去氧膽酸鈉、150 mM之NaCl及綜合蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail,Sigma-Aldrich,MO,USA))100~150 μL,並於冰上(4℃)之條件下培養1小時而將細胞溶解。其後,進行離心分離(15,000×g、15分鐘、4℃)並將所獲得之上清液作為細胞提取液。
<SDS-PAGE用樣本之製備>
將上述細胞提取液與2×樣本緩衝液逐次等量混合,使用設定為95℃之微管用熱板加熱3分鐘。其後,離心30秒,於室溫下冷卻而作為SDS-PAGE用樣本。
<SDS-PAGE>
將上述樣本各6 μL(9 μg蛋白質/泳道)供於凝膠,與電源供應器(Bio-Rad laboratories)連接,利用2片凝膠,於40 mA(1片凝膠為20 mA)之恆定電流下進行電泳約80分鐘。
<西方墨點法>
將切成適當大小之濾紙及Hybond-ECL浸於轉漬緩衝液作為前處理。於進行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)後,使用轉印裝置將蛋白轉印於Hybond-ECL上。將轉印後之Hybond-ECL浸於封閉緩衝液(5%脫脂乳)並於室溫下封閉1小時,利用Tween緩衝液以5分鐘清洗3次。
為了檢測TS及β-肌動蛋白,將利用Tween緩衝液進行稀釋之各自一級抗體(小鼠抗人類TS單株抗體(Mouse monoclonal
anti-human TS antibody)(1:1000)(ANASPEC,Inc.CA,USA)、小鼠抗人類β-肌動蛋白單株抗體(Mouse monoclonal anti-human β-actin antibody)(1:500)(Bio Vision,Inc.,CA,USA))於4℃下反應一晚。利用Tween緩衝液以5分鐘清洗3次後,將利用Tween緩衝液進行稀釋之二級抗體(辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二級抗體(HRP-conjugated goat anti-mouse secondary antibody)(1:2000)(MP Biomedicals,LLC,Japan))溶液於室溫下反應1小時。利用Tween緩衝液以5分鐘清洗3次後,與ECL化學發光試劑反應約1分鐘。藉由X射線膠片檢測出目標蛋白質之條帶。
結果示於圖1。
明確實施例1所製備之shRNA及siRNA可顯著地抑制DLD-1細胞及DLD-1/FU細胞中之TS之表現。
本實驗係以96孔板級進行實驗。將與上述實施例2相同地製備之脂複合體直接添加至預先添加有OptiMEM之孔中,使總容積成為50 μl。其次,將人類結腸腺癌細胞DLD-1或DLD-1/FU之細胞懸浮液(2,000細胞/100 μl)添加至加入有脂複合體之孔中(最終合計容積為150 μl)進行轉染。此時,孔中之shRNA或siRNA之最終濃度為5 nM。
開始轉染24小時後,去除培養基,並添加含有或不含現有之化學治療劑5-FU(5-氟尿嘧啶)之新培養基(200 μl)。此時,以相對於DLD-1為0.1 μg/mL之濃度,相對於DLD-
1/FU為10 μg/mL之濃度添加5-FU。於添加新培養基0、24、48、72、96小時後,去除培養基,加入0.5% MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)溶液50 μL,於37℃、5% CO2條件下培養4小時。又,於未加入細胞之孔內亦加入0.5% MTT溶液而作為背景對照(background)。
培養結束後,於各孔內加入酸性異丙醇150 μL,使用攪拌器溶解甲臢結晶,使用讀板儀,以570 nm之波長測定吸光度,算出細胞之增殖率。
細胞之增殖率(%)=[A570(添加新培養基X小時後)/A570(添加新培養基0小時後)]×100
結果示於圖2及3。
如圖2及圖3所示,siTS及shTS於5-FU之存在下顯著地抑制DLD-1細胞及DLD-1/FU細胞之增殖。
陽離子性微脂體係藉由Bangham法而製備。
陽離子性脂質、即DOPE、POPC、CHOL及DC-6-14分別預先溶解於氯仿而製備儲備溶液。以脂質組成成為DOPE:POPC:CHOL:DC-6-14=3:2:3:2(莫耳比)之方式,分別使用玻璃注射器自儲備溶液準確量取,加入至具塞試管並混合(總脂質量為150 mmol)。其次,使用旋轉蒸發器(IWAKI,東京)於減壓下去除氯仿,其後,為了完全地去除氯仿而將試管放入真空泵內一晚,於試管內形成脂質薄膜。於該脂質薄膜上加入9%蔗糖溶液(30 mL,pH值7.4)作為內水相,並藉由於37℃下激烈攪拌,使脂質薄
膜完全地水合,而獲得MLV(multilamellar vesicle,多層微脂粒)(最終脂質濃度為50 mM)。一面將該溶液加溫至37℃,一面使用200、100、50 nm之聚碳酸酯膜(Nucleopore,CA,USA)並藉由擠壓法製備粒徑成為約100 nm之LUV(large unilamellar vesicle,單層大微脂粒)。微脂體之粒徑(動態光散射法)及ζ電位(電泳光散射法)係利用NICOMP 370(粒度測定系統(Particle Sizing System),CA,USA)而測定。所製備之微脂體之平均粒徑為119.9 nm,ζ電位為25.56 mV。
對微脂體之PEG修飾係藉由製備後插入法進行。製備基本之微脂體後,添加微脂體溶液以使完全溶解於9%蔗糖溶液中之mPEG2000-DSPE相對於脂質(DOPE、POPC、CHOL、DC-6-14)總量以莫耳比計成為5%,於附帶振盪機之培養箱中於37℃下輕輕地振盪1小時,同時進行PEG修飾。
PEG修飾脂複合體係藉由如下方式製備:將上述實施例4所製備之PEG修飾陽離子性微脂體及上述實施例1所製備之shTS混合,以使陽離子性微脂體:shTS=2000:1(莫耳比),激烈地攪拌10分鐘。所製備之PEG修飾lipoplex之平均粒徑及ζ電位為286.8 nm及15.81 mV。
DLD-1患癌小鼠之製作
於BALB/c nu/nu雄性小鼠之皮下接種DLD-1細胞懸浮液(2×106細胞/100 μL)。將細胞移植8天後腫瘤體積達到50~100 mm3之小鼠用於活體內之實驗。
PEG修飾脂複合體之抗癌活性評價
自腫瘤移植後第8天起,針對上述DLD-1患癌小鼠,每隔一天自小鼠尾靜脈投予以shRNA量計為80 μg/300 μL之PEG修飾脂複合體,合計投予8次。
於與現有之化學治療劑「TS-1」(大鵬藥品工業)併用之情形時,自腫瘤移植後第8天起,以6.9 mg替加氟/kg之用量每天經口投予,持續15天。
抗癌活性係對腫瘤體積變化與體重變化進行研究。
腫瘤體積係根據以下之式算出。
腫瘤體積(mm3)=(腫瘤之長邊)×(腫瘤之短邊)2×0.5
結果示於圖4及圖5。
與對照群相比,單獨使用TS-1或PEG修飾脂複合體進行處理之群顯示出約34%之腫瘤生長抑制效果。另一方面,TS-1及PEG修飾脂複合體之併用處理群顯示出約66%之腫瘤生長抑制效果。於處理群中均未發現包含體重增加抑制之嚴重毒性。又,如圖5所示,可確認藉由將PEG修飾脂複合體與TS-1併用,腫瘤生長受到顯著地抑制。
於本實驗中,使用人類惡性胸膜間皮瘤細胞MSTO 211H代替人類結腸腺癌細胞DLD-1或DLD-1/FU作為癌細胞,使
用培美曲塞鈉水合物(培美曲唑(日本Eli Lilly股份有限公司))代替5-FU作為現有之化學治療劑,除此以外,使用與上述實施例3相同之方法進行。再者,進行轉染時,孔中之shRNA之最終濃度係調整為5 nM及10 nM,培美曲塞鈉水合物係以10 ng/mL之濃度添加至培養基中使用。
細胞之增殖率係以與上述實施例3相同之方法測定。結果示於圖6。
如圖6所示,shTS係於培美曲塞鈉水合物之存在下顯著地抑制了MSTO 211H細胞之增殖。
MSTO 211H患癌小鼠之製作
於BALB/c nu/nu雄性小鼠之皮下接種MSTO 211H細胞懸浮液(5×106細胞/100 μL)。於細胞移植14天後,確認腫瘤體積達到50~100 mm3之小鼠,用於活體內之實驗。
PEG修飾脂複合體之MSTO 211H患癌小鼠中之抗癌活性評價
自腫瘤移植後第14天起,針對上述MSTO 211H患癌小鼠,每隔一天自小鼠尾靜脈投予以shRNA量計為40 μg/200 μL之上述實施例5所製備之PEG修飾脂複合體,合計投予6次。
於與現有之化學治療劑培美曲塞鈉水合物(培美曲唑(日本Eli Lilly股份有限公司))併用之情形時,自腫瘤移植後第14天起,以100 mg/kg之用量進行腹腔內投予,合計6次(第1、2、3、8、9、10天)。
抗癌活性係以,投予開始後第21日之腫瘤增殖抑制率(TGI(%))而表示,TGI(%)係與上述實施例6相同地算出。
結果示於圖7。
單獨使用培美曲塞鈉水合物或含有針對TS之shRNA(TS shRNA)之PEG修飾脂複合體進行處理之群分別顯示出約28%、約19%之腫瘤生長抑制效果。又,於將培美曲塞鈉水合物與含有不具有標靶之shRNA(NS shRNA)之PEG修飾脂複合體併用之情形時,顯示出約22%之腫瘤生長抑制效果,此效果與培美曲塞鈉水合物單獨處理群中之腫瘤生長抑制效果同等。另一方面,培美曲塞鈉水合物與含有TS shRNA之PEG修飾脂複合體之併用處理群顯示出約42%之腫瘤生長抑制效果。如圖7所示,可確認藉由將培美曲塞鈉水合物與含有TS shRNA之PEG修飾脂複合體併用,腫瘤生長受到顯著地抑制。
本發明之以含有針對胸腺核苷酸合成酶之shRNA分子之微脂體作為有效成分的抗腫瘤劑可藉由活體內投予而抑制表現TS之腫瘤之增殖。進而,藉由將該抗腫瘤劑與化學治療劑併用,可提高對癌組織之靶向性,顯著地提昇抗腫瘤效果。本發明可期待於癌治療之領域之貢獻。
本說明書所引用之全部刊物、專利及專利申請案直接作為參考而併入本說明書中。
圖1係表示於人類結腸直腸癌株DLD-1(A)及DLD-1/FU(B)中,以TS為標靶之siRNA及shRNA之TS表現抑制效果之特性圖。各泳道分別表示以下之經siRNA或shRNA處理之樣本。1:未處理;2:siCont 10 nM;3:siTs 1 nM;4:siTs 5 nM;5:siTs 10 nM;6:shTS 1 nM;7:shTS 5 nM;8:shTS 10 nM。
圖2係表示於人類結腸直腸癌株DLD-1中,以TS為標靶之siRNA(A)及shRNA(B)之由有無5-FU引起之TS表現抑制效果的特性圖。(C)表示添加新培養基並培養96小時後之各樣本之細胞生長抑制率(%)。
圖3係表示於人類結腸直腸癌株DLD-1/FU中,以TS為標靶之siRNA(A)及shRNA(B)之由有無5-FU引起之TS表現抑制效果的特性圖。(C)表示添加新培養基並培養96小時後之各樣本之細胞生長抑制率(%)。
圖4係表示於人類結腸直腸癌株DLD-1患癌小鼠中,以TS為標靶之shRNA之由有無S-1引起之腫瘤生長抑制效果(A)及體重之增減(B)的特性圖。
圖5係表示於人類結腸直腸癌株DLD-1患癌小鼠中,以TS為標靶之shRNA之由有無TS-1引起之腫瘤生長抑制效果的照片圖。1:對照(投予蔗糖);2:S-1;3:TS-shRNA微脂體;4:S-1+TS-shRNA微脂體。
圖6(A)、(B)係表示於人類惡性胸膜間皮瘤株MSTO 211H中,培美曲塞鈉水合物、以TS為標靶之shRNA或培美曲塞鈉水合物及以TS為標靶之shRNA之細胞生長抑制率(%)之
隨時間經過之變化。
圖7係表示於人類惡性胸膜間皮瘤株MSTO 211H患癌小鼠體內,由有無以TS為標靶之shRNA之培美曲塞鈉水合物引起之腫瘤生長抑制效果的特性圖。
<110> 日商德爾塔菲製藥股份有限公司
<120> 含有針對胸腺核苷酸合成酶之shRNA分子之微脂體及其用途
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Claims (17)
- 一種抗腫瘤劑,其係包含可藉由RNAi作用而抑制胸腺核苷酸合成酶之表現之短髮夾RNA(shRNA)與PEG修飾陽離子性微脂體者,並且該shRNA結合於該PEG修飾陽離子性微脂體之表面,且於3'末端具有包含至少2個鹼基之突出物。
- 如請求項1之抗腫瘤劑,其中shRNA含有包含以序列編號1所表示之鹼基序列之正義鏈與於嚴格條件下與該正義鏈雜交之反義鏈。
- 如請求項1之抗腫瘤劑,其中shRNA含有包含以序列編號1所表示之鹼基序列之正義鏈與包含以序列編號2所表示之鹼基序列之反義鏈。
- 如請求項1之抗腫瘤劑,其中shRNA包含以序列編號8所表示之鹼基序列。
- 如請求項1之抗腫瘤劑,其中PEG修飾陽離子性微脂體含有包含二油醯基磷脂乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯甘油磷醯膽鹼(POPC)、膽固醇(CHOL)及O,O'-雙十四碳醯基-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)的陽離子性微脂體。
- 如請求項5之抗腫瘤劑,其以3:2:3:2之莫耳比含有DOPE、POPC、CHOL及DC-6-14。
- 如請求項1之抗腫瘤劑,其中抗腫瘤劑之粒徑為200~300nm。
- 如請求項1之抗腫瘤劑,其進而於PEG修飾陽離子性微脂 體之表面結合有可抑制選自由參與腫瘤細胞之增殖之基因所組成之群中之基因之表現的siRNA或shRNA。
- 如請求項8之抗腫瘤劑,其中參與腫瘤細胞之增殖之基因為選自由編碼VEGF、EGFR、PDGF、HGF、Wint、Bcl-2、凋亡抑制基因、核糖核苷酸還原酶、DNA聚合酶之基因所組成之群中之一種或複數種基因。
- 如請求項1至9中任一項之抗腫瘤劑,其與用於處理腫瘤之化學治療劑併用。
- 一種組合物,其包含如請求項1至9中任一項之抗腫瘤劑與用於處理腫瘤之化學治療劑。
- 如請求項10之抗腫瘤劑,其中用於處理腫瘤之化學治療劑為具有TS抑制作用之抗腫瘤劑。
- 如請求項12之抗腫瘤劑,其中具有TS抑制作用之抗腫瘤劑為5-FU系抗腫瘤劑或培美曲塞鈉水合物。
- 如請求項13之抗腫瘤劑,其中5-FU系抗腫瘤劑為替加氟-吉美嘧啶-氧酸鉀複合劑。
- 如請求項11之組合物,其中用於處理腫瘤之化學治療劑為具有TS抑制作用之抗腫瘤劑。
- 如請求項15之組合物,其中具有TS抑制作用之抗腫瘤劑為5-FU系抗腫瘤劑或培美曲塞鈉水合物。
- 如請求項16之組合物,其中5-FU系抗腫瘤劑為替加氟-吉美嘧啶-氧酸鉀複合劑。
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