201249453 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種抑制癌幹細胞生長或癌細胞轉移 (cancer stem cells )之醫藥組成物及其應用，尤指一種含 小檗驗化合物（berberine compounds )以抑制癌幹細胞生長 或癌細胞轉移之醫藥組成物以及使用小檗鹼化合物製造抑 制癌幹細胞生長或癌細胞轉移的藥劑之用途。 【先前技術】 癌症係位於十大死因之一，已連續二十七年為居十大 死因之榜首。引發癌症起因主要為：細胞變成異常，且持 續的自行分裂’形成更多的異常細胞，就是癌症。 一般腫瘤細胞中，潛存些許具有幹細胞特性的癌細 胞’此種癌細胞雖然數量不多，但卻類似幹細胞，可以不 斷的進行癌細胞分裂及分化’因此稱之為癌幹細胞。由於 癌幹細胞具有極高的抗藥性，西方醫學化學治療藥物難以 將之毒殺。因此，常聽到許多經過化療的病患，體内癌症 復發的情形，目前生物醫學已知的標準癌症療法，對癌幹 細胞根本束手無策。 況且，目前西醫療法所使用之手術、放射線治療、化 學療法、賀爾蒙療法、生物製劑療法等，常常對於患者身 體產生強烈副作用，因此，若能使用比較溫和，且能抑制 癌幹細胞生長或癌細胞轉移之療法，進行癌症治療，對於 病患而言將是一大福音。 201249453 現今，民眾普遍認以中藥對患者進行治療，屬於比較 溫和之治療方法，且具有相當高之市場接受度，而成為一 種替代性療法（complementaryahernativemedicines)。因 此，自眾多中藥材之中，經篩選實驗後，可證實某中藥材 確實可阻止癌幹細胞進行分裂並抑制癌細胞轉移，勢必可 對於癌症治療具有相當之幫助。 【發明内容】 本發明之主要目的係在提供一種抑制癌幹細胞生長或 癌細胞轉移之醫藥組成物，俾能顯著的減低癌細胞株的細 胞存/舌率’如非小細胞型肺癌細胞（n〇n_small_cel丨丨ung carcinoma，NSCLC )，但在有效劑量下不會使正常細胞株 受到影響，並且能有效抑制癌細胞轉移。 本發明之另一目的係在提供一種使用小檗鹼化合物製 造抑制癌幹細胞生長或癌細胞轉移的藥劑之用途，此藥劑 能降低癌細胞增生、轉移以及類癌幹細胞的比例，藥劑亦 包含預防與治療癌症之保健食品與臨床治療用藥。 為達成上述目的，本發明之一態樣提供一種抑制癌幹 細胞生長或癌細胞轉移之醫藥組成物，包括：一小檗鹼化 合物；以及一醫藥上可接受性載體。 本發明之另一態樣提供一種使用小檗鹼化合物製造抑 制癌幹細胞生長或癌細胞轉移的藥劑之用途。 本發明抑制癌幹細胞生長或癌細胞轉移之醫藥組成物 及上述用途中，該小檗鹼化合物可以在市面上購買而得， 例如小祭驗氣化物（berberine chloride )及其水合物、小檗 201249453 驗硫酸鹽（berberine sulfate )、小檗驗半硫酸鹽（berberine hemisulfate)、小檗鹼硫酸氫鹽（berberine bisulfate)等， 或者利用黃連藥材萃取而得。 若萃取黃連藥材，則小檗驗化合物係包含於黃連萃取 物中。舉例而言’可以提供黃連藥材，添加5〇倍至200倍該 黃連藥材重量之水’形成一混合物後，對該混合物加熱萃 取持續30分鐘至2小時，或直至該混合物係加熱至艎積成為 原始體積之四分之一至二分之一，便可以得到一黃連水萃 取物《如此’該黃連水萃取物便含有小檗驗化合物，且該 黃連水萃取物可經過乾燥製程，如喷霧乾燥法 '冷凍乾燥 法、科學中藥造粒法等，形成一乾燥形式的萃取物。 由上述可知’含有小檗鹼化合物且用於抑制癌幹細胞 生長或癌細胞轉移之醫藥組成物、抑制癌幹細胞生長或癌 細胞轉移之治療方法、以及小檗鹼化合物用於製造抑制癌 幹細胞生長或癌細胞轉移的藥劑之用途，同樣落於本發明 的範疇中，其中該癌幹細胞或該癌細胞可為非小細胞型肺 癌細胞。 综上所述’本發明上述抑制癌幹細胞生長或癌細胞轉 移之醫藥組成物、以及使用小檗鹼化合物製造抑制癌幹細 胞生長或癌細胞轉移的藥劑之用途，可以突破癌症治療中 無法有效抑制癌幹細胞之瓶頸，進而發展成為預防與治療 癌症之保健食品與臨床治療用藥。 【實施方式】 201249453 本發明將黃連藥材萃取而得之黃連萃取物，經過一系 列生物性測試實驗，發現此可以抑制癌幹細胞生長或癌細 胞轉移’並對此黃連萃取物初步進行成分分析，而發現黃 連萃取物中主要成分為小檗鹼，因此推測小檗鹼化合物應 該同樣可以達到相同功效，故利用市面上購得的小檗鹼化 合物’配製成溶液形式後同樣進行生物性測試實驗，進而 確認小樂驗與黃連萃取物皆可以達到抑制癌幹細胞生長或 癌細胞轉移的功效。 本文所使用的「抑制」一詞，係指將一種含小檗驗化 合物之醫藥組成物，投予患有癌症、具有癌症症狀、或朝 癌症發展傾向的主趙，以期達到治療、治癒、減輕、減緩、 改變、醫治、改善、改進、或影響此病症、其症狀或朝 癌症發展之傾向。「有效劑量」一詞係指能夠對於受抑制 主體產生預期療效所需的活性藥劑量。對於有效劑量，本 領域具有通常知識者可了解到其會根據投藥路徑、使用賦 形劑、以及與其它藥劑共同使用的可能性而改變。 本發明的方法可治療的癌症，包含各種器官的實體或 血液腫瘤兩者。實體腫瘤舉例包含：胰腺癌；膀胱癌；大 腸直腸癌；乳癌’包括轉移性乳癌；腎癌，例如包括轉移 性腎細胞癌；肝$ ;肺癌，例如包括非小細胞型肺癌 (non-smal丨 cell lung cacin〇ma，NSCLC ) ' 細支氣管肺泡 癌（b_ch1〇l〇alve〇iarcarcin〇ma，BAC)、和肺腺癌；前 列腺癌’包括雄激素依賴性和雄激素非依賴性前列腺癌 症4巢癌’例如包括進行性上皮或原發性腹膜癌；神經 6 201249453 内分泌癌，包括轉移性神經内分泌腫瘤；腦腫瘤，例如包 括神經膠瘤、退化性寡軸突膠質細胞瘤、多型性神經膠母 細胞瘤、以及成人退化性星細胞瘤；子宮頸癌；胃癌；食 道癌；頭頸部癌，例如包括頭頸部之鱗狀細胞癌；黑色素 瘤；骨癌；以及軟組織肉瘤。惡性血液疾病舉例包括：急 性骨髓性白血病（AML);慢性骨髓性白血病（CML)， 包括加速性CML和CML的爆發階段 （CML-BP);骨趙增 生不良症候群（myelodysplastic syndromes，MDS)，包括 頑抗性貧血（refractory anemia，RA)、伴有環狀含鐵胚細 胞之頑抗性貧血（refractory anemia with ringed siderblasts，RARS )、伴有過多胚細胞之頑抗性貧血 (refractory anemia with excess blasts » RAEB )、及轉變中 的 RAEB ( RAEB-T );非霍奇金氏病（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL )，包括渡泡型淋巴瘤、和外套細胞淋巴 瘤；B細胞淋巴瘤；T細胞淋巴瘤；多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM ):急性淋巴母細胞性白血病（ALL ):慢 性淋巴母細胞性白血病（CLL);霍奇金氏病（Hodgkin’s disease，HD );華爾登氏巨球蛋白血症（Waldenstrom’s macroglobulinemia ):以及骨趙增生性症候群。 本發明的醫藥組成物可更包含如細胞毒性劑之治療 劑，或者與如放射性治療、或免疫性治療之治療法一起施 用。舉例而言，此細胞毒性劑可為：抗代謝藥物 (antimetabolites )，包含如卡培他濱（capecitibine )、吉 西他濱（gemcitabine )、5-氟尿略咬（5-fluorouracil )或 5- 201249453 氟尿嚷咬/白葉酸（leucovorin )、氟達拉濱（fludarabine )、 阿拉伯糖基胞嘴咬 （cytarabine )、疏基嗓吟 (mercaptopurine )、硫代烏嗓吟（thioguanine )、喷司他 丁（ pentostatin )、和胺甲葉酸（methotrexate );拓鎮異 構酶（topoisomerase )抑制劑，例如包括依妥普賽 (etoposide )、坦尼坡赛（teniposide )、喜樹驗 (camptothecin )、拓鎮替康（topotecan )、伊立替康 (irinotecan )、阿德力徽素（doxorubcin )、和道諾魯比辛 (daunorubicin);長春花生物驗（vinca alkaloid)，例如 包括長春新检（vincristine)、和長春檢（vinblastin);紫 杉烧類（taxanes )，例如包括紫杉醇（paclitaxel )、和多 西紫杉醇（docetaxel ) •，轴劑（platinum agents )，例如包 括順翻（cisplatin )、卡始定（carbop丨atin )、和奥沙利始 (oxaliplatin );抗生素（antibiotics )，例如包括放線菌 素 D ( actinomycin D )、博來徽素（bleomycin )、絲裂黴 素 C ( mitomycin C )、阿徽素（adriamycin )、道諾魯比 辛（daunorubicin )、艾達魯比辛（idarubicin ) '阿德力擻 素（doxorubicin )、和聚乙二醇脂質體阿德力黴素（pegylated liposomal doxorubicin);炫基化劑(alkylating agents)， 如徽法蘭（melphalan )、氣芬苯丁酸（chlorambucil )、硫 酸布他卡因（busulfan )、沙奥特帕（thiotepa )、依弗酿 胺（ifosfamide )、卡氮芥（carmustine )、環己亞硝 (lomustine )、司莫司江（semustine )、鍵球撤素 (streptozocin )、達卡巴仁（decarbazine ) '和環填酿胺 8 201249453 (cyclophosphamide);沙利竇邁（thalidomide)和相關類 似物，例如包括CC-5013和CC-4047 ;蛋白酪胺酸激酶抑製 劑，例如包括甲石黃酿伊麻替尼普（imatinibmesylate)、吉 非替尼 （gefitinib )、達沙替尼（dasatinib )、埃羅替尼 (erlotinib )、拉帕替尼（lapatinib )、舒尼替尼（sunitinib)、 尼羅替尼（nilotinib )、以及索拉非尼（sorafenib );抗體， 例如包括曲妥珠單抗（trastuzumab )、利妥西單抗 (rituximab)、西妥昔單抗（cetuximab)、和貝伐珠單抗 (bevacizumab );邁杜蔥酮（mitoxantrone );地塞米松 (dexamethasone);普賴松（prednisone);以及替莫嗤胺 (temozolomide ) ° 為實行本發明所述之方法，上述醫藥組成物可經由口 服、非口服、喷霧吸入、局部、經直腸、經鼻、舌下、陰 道、或經由植入型藥盒（implanted reservoir )等方式投藥。 於此使用之「非口服」（parenteral )係指皮下注射、皮内 注射、靜脈内注射、肌肉内注射、關節腔内注射、動脈内 注射、關節液内注射、胸腔内注射、脊髓内注射、疾病部 位内注射、及顱内注射或注入技術。 無菌可注射之組成物，例如無菌可注射水性或油性懸 浮液，可根據本領域已知技術，使用適合的分散劑或濕潤 劑（如Tween 80 )及懸浮劑來配製。無菌可注射之配製液 可為無菌可注射的溶液、或是懸浮於無毒的非口服注射稀 釋液或溶劑中，例如1，3-丁二醇的溶液。可使用之可接受 載體及溶劑為甘露醇（mannitol )、水、林格氏溶液（Ringer’s 201249453 solution )或等滲透之氣化鈉溶液。除此之外，非揮發油係 習用之溶劑或是懸浮介質（例如：合成單甘油酯或雙甘油 酯）。脂肪酸如油酸（oleic acid )與其甘油酯衍生物，亦 可用於製備注射劑’天然醫藥可接受之用油，例如撖梗油 或蓖麻油’特別是其多氧乙基化之型態，同樣可用於製備。 這些油酯溶液或懸浮液’可包含長鏈醇類稀釋液或分散 劑、羧甲基纖維素、或類似之分散劑。其他常用之界面活 性劑，如Tween或Spans、或其他相似乳化劑、或一般醫藥 製造業所使用於番藥可接受之固態、液態或其他可用於劑 型開發目的之劑量型式之生物可利用增強劑。 用於口服投藥之組成物可為任何一種口服可接受之 劑型，包括朦囊、键片、乳化液與水懸浮液、分散液與溶 液，但不限於此。以錠片為例，一般所使用之載體為乳糖 或是玉米澱粉，潤滑劑（如硬脂酸鎂）亦常被添入其中。 以口服膠囊投藥型式而言，可用的稀釋劑包括乳糖與乾燥 2米澱粉。當以水懸浮液或乳化液經口投藥時，活性成分 °J懸浮或是溶解於混有乳化劑或懸浮劑之油狀界面中。如 果需要，可添加適度力甜味齊卜風味劑&是色素。鼻用氣 化喷霧劑或吸入劑組成物，可根據醫藥劑型領域中已知技 術進行製備。例如’此組成物可製備為鹽溶液，應用苯甲 醇（benzyl alcoh〇丨）或其他適合的防腐劑、增強生物可利 用fi之促吸收劑、碳氟化合物、及/或該領域中其他技藝令 已知之溶解劑或分散劑。含小檗鹼化合物之醫藥組成物， 亦可以拴劑方式進行直腸投藥。 201249453 醫藥組成物之載體必須為「可接受性」，即其必須與 組成物之活性成份相容（較佳係能穩定活性成份），並且 不能對被治療之試趙造成傷害…種或多種能與小禁驗化 合物形成溶解性更佳之複合物的溶解劑（如環糊精），也 可用為傳遞活性化合物之醫藥載體。其他載體舉例包括膠 質氧化石夕、硬月曰酸鎮、纖維素、月桂硫酸鈉與黃色^ 〇 號。 以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方 式，熟習此技藝之人士，可由本說明書所揭示之内容’輕 易地了解本發明之其他優點與功效，亦可瞭解以下實施例 僅為說明用’並非用於限制本發明範圍。本發明亦可藉由 其他不同的具體實施例加’以施行或應用，本說明書中的 各項細節，亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之 精神下進行各種修飾與變更。 黃連萃取物之製備 取11.25克黃連藥材（Cop/z’sc/i/wewiz’i)，加入1.2公升 的水，煮沸萃取持續1小時後，大約可得到450 ml的萃取產 物，分成數份儲存於4°C。除上述直接儲存水萃產物於4°C 之外，亦可使用冷凍乾燥儲存萃取產物。 於進行後續實驗前，儲存於4°C的萃取產物先行使用 0.22 μπι之滤膜過渡。 小檗礆溶液之製備 201249453 使用二曱基亞硬（dimethyl sulfoxide，DMSO)作為溶 劑，溶解小檗驗氣化物（berberine chloride，購自Sigma， B325 1 )，以製備不同濃度之小檗鹼溶液。 細胞培養 自台灣生物資源保存及研究中心（Bioresource Collection and Research Center，BCRC )購得非小細胞型肺 癌（non-small cell lung cacinoma，NSCLC)細胞株A549、 NCI-H460與NCI-H520以及正常肺細胞株MRC5，其中A549 以 F12K 培養基（21127，GIBCO，Carlsbad，U.S.A.)培養， NCI-H460與NCI-H520兩者皆以RPMI1640培養基（23400， GIBCO，Carlsbad，U.S.A.)陪養，MRC5則以 MEM培養基 (41500，GIBCO，Carlsbad，U.S.A.)培養。上述所有培 養基皆含有 10% FBS( 10437，GIBCO，Carlsbad，U.S.A.)， 且所有細胞培養皆在37°C、5% C〇2的培養箱（Thermo forma 370，Waltham，U.S.A.)中進行。 高效液相層析分析 使用裝配有逆相管柱（reverse-phase Zorbax ODS II， 150 mm x 4.6 mm，5 μηι )之高效液相層析系統 (High-performance liquid chromatography system，HPLC system，Hitachi )，於管柱溫度為40°C下進行分析。樣本注 射體積為10 μΐ，流速為1.0 ml/min，並測量流出液的UV吸 收值（346 nm )。 鱗酸氣钟（Potassium hydrogen phosphate，1.36g)溶 解於100〇1111水，並以填酸（〇1111〇卩11〇5卩11〇1^3(^(1)將卩1^值 12 201249453 調整至pH 2.5，以作為緩衝液A，其中緩衝液A與緩衝液B (乙腈）濃度比例調整為：O.Olmin，A: B = 80: 20 20min， A : B = 50 : 50 26min，A : B = 80 : 20。 將上述小檗鹼溶液與黃連萃取物進行HPLC分析，其結 果顯示小檗鹼吸收峰的滯留時間大約在9.5分，而黃連萃取 物在滯留時間大約在9.5分的位置同樣具有一大片吸收峰， 此表示本發明之黃連萃取物含有大量的小檗鹼化合物。 統計分析 以下測試例所得之數據，全數皆以平均值士標準差 (mean 土 SE)表示，並使用SPSS軟體，以學生氏測試法 (Student’s test)與變異數分析法（Analysis of variance， ANOVA)判定各群組之差異顯著與否，其中當尸值小於0.05 時，則視為顯著差異。 測試例一細胞增殖測試 於24孔盤中，每孔培養1 X 104個待測細胞，待培養16小 時後，將黃連萃取物或不同濃度之小檗鹼溶液等待測樣本 直接加入24孔盤内，再於37°C下培養24小時、48小時與72 小時。 MTT分析法 使用經0.22 μπι過濾膜過濾之PBS，配置出濃度為5.5 mg/ml 之漠0塞0坐藍漠化四0圭（Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，m5655，Sigma，St. Louis，U.S.A.)溶液。 配置所得之MTT溶液，取50 μΐ加入經過24小時、48小時與 72小時培養之 Α549、NCI-H460、NCI-H520 與MRC5等細胞 201249453 株之24孔盤内，再於37°C下培養2小時後，移除所有的培養 液。每孔再加入500 μΐ DMSO，以溶解MTT與粒線體中去氫 酶反應所得之產物甲腹（formazan )。以吸液器反覆吸吐使 甲臢完全溶解，將200 μΐ所得溶液轉至96孔ELISA盤，使用 微孔盤測量儀（Microplate Autoreader EL311，Bio-Tek Instruments，Winooski，U.S.A.)賴測吸光值（O.D. 570 nm )， 其結果如圖1、圖2A、圈2B及圖2C所示。 參考圖1，其為黃連萃取物（0.6% v/v )對A549、 NCI-H460、NCI-H520與MRC5等細胞株之測試結果，其中* 代表/><0.05。由圖1可知添加黃連萃取物經過48小時培養 後，便可以明顯看到相較於正常細胞之存活率，癌細胞之 存活率明顯下降，持續培養至72小時後，癌細胞之存活率 更是顯著下降，此表示本發明之黃連萃取物可以在不影響 正常細胞的前提下毒殺癌細胞，使其存活率下降。 參考圖2A，其為小檗鹼溶液（3 μΜ、6 μΜ、9 μΜ、12 μΜ)與Α549細胞株培養48小時後之測試結果。如圖2Α所 示，對於Α549細胞株的抑制隨著小檗鹼溶液之濃度增加而 增加，且其半抑制濃度 （half maximal inhibitory concentration，IC50)約為7 μΜ β 參考圖2Β，其為小檗鹼溶液（10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、 40 μΜ)與NCI-H460細胞株培養48小時後之測試結果》如 圖2Β所示，對於NCI-H460細胞株的抑制隨著小檗鹼溶液之 濃度增加而增加，且其半抑制濃度（half maxima丨inhibitory concentration，IC5。）約為 40 μΜ。 201249453 參考圖2C，其為小檗鹼溶液（10 μΜ' 20 μΜ、30 μΜ、 40 μΜ)與NCI-H520細胞株培養48小時後之測試結果。如 圖2C所示，對於NCI-H520細胞株的抑制隨著小檗鹼溶液之 濃度增加而增加，且其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC5〇)約為 20 μΜβ 由圖2Α、圖2Β與圖2C可知小檗鹼化合物類似於本發明 黃連萃取物，同樣可以毒殺癌細胞，使其存活率下降》 萘胺藍染劑分析 使用萘胺藍染劑（Trypan blue，T10282，Invitrogen， Carlsbad，U.S.A.)，對經過黃連萃取物（0.6% v/v )處理 之A549細胞株染色，然後將細胞染色液轉至細胞計數腔室 玻片上（Countess® Cell Counting Chamber Slide，C10228， Invitrogen，Carlsbad，U.S.A.)，再使用自動化細胞計數器 (Countess® Automated Cell Counter，C10227，Invitrogen， Carlsbad，U.S. A.)測量細胞數目，其結果如圖3所示。 參考圖3,其為黃連萃取物（0.6% v/v)對A549細胞株 之測試結果，其中*代表p<0.05。由圖3可知添加黃連萃取 物經過48小時培養後，便可以明顯看到相較於無處理組（控 制組，Ctrl )之存活率，處理組癌細胞之存活率明顯下降， 持續培養至72小時後，癌細胞之存活率更是顯著下降，此 結果同於圖1，因此更加證明本發明之黃連萃取物可以在不 影響正常細胞的前提下毒殺癌細胞，使其存活率下降。 測試例二 細胞週期測試 15 201249453 於10 cm培養皿中，培養3χ1〇5個A549細胞株，當細胞 進入對數（logarithmical)生長期時’細胞數目便足以進行 分析。待16小時後，此細胞以黃連萃取物處理24小時、48 小時與72小時，再以膝蛋白酶處理（trypsinization)以收集 細胞。使用冰乙醇（70% )於-20°C下將細胞固定過夜後， 使用PBS清洗細胞以移除乙醇。將PI染色緩衝液（PBS : RNase ( 10pg/ml) : PI ( 1 Mg/ml) = 97 : 1 : 2)加入細胞 液，其中每1 x 1 〇6個細胞添加1 ml PI染色緩衝液’以確保 DNA完全染色，於37°C下避光持續震盪染色30分鐘。使用 尼龍篩（35 μπι )過濾細胞，防止細胞群集。然後，將樣本 移入圓底管並盡快以流式細胞儀（FACSCalibur)分析，並 制訂單細胞閘以排除聚集的細胞。每樣本收集一萬五千個 細胞，以完成細胞週期分佈，再使用Modfit軟體（Verity Software House » Topsham * U.S.A.) ’計算不同細胞週期 階段的百分比，其結果如圖4所示。 參考圊4,其為黃連萃取物處理後A549細胞株之細胞 週期分析結果，其中*代表尸<〇.〇5，***代表Ρ<〇.〇〇1。由圖4 可知黃連萃取物處理24小時後，A549細胞株的細胞週期明 顯阻斷在G1階段，而黃連萃取物處理48小時後，A549細胞 株的細胞週期則明顯阻斷於G2階段，此表示本發明之黃連 萃取物可抑制癌細胞持續分裂。 測試例三 西方氏點墨測試 於10 cm培養中，培養3χ105個Α54·9細胞株’當細胞 進入對數（logarithmical )生長期時’細胞數目便足以進行 16 201249453 分析。細胞以IC5〇劑量的黃連萃取物或小檗鹼處理48小時， 收集細胞並以RIPA緩衝液（10mM Tris ( pH 7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA ( pH 8.0)，0.1% SDS，1% DOS，1% NP40) 溶解，再混入蛋白酶抑制劑混合組（protease inhibitor cocktail，Pierce，Rockford，U.S. A.)、填酸酶抑制劑渡合 組(phosphatase inhibitor cocktail，Sigma，St. Louis， U.S.A.)，而後以13,000 g、4°C離心30分鐘，以將細胞殘渣 離心而沉降於底部，離心後收集上清液，再混入樣本緩衝 液（100mM Tris-Cl ( pH 6.8)，4% ( w/v ) SDS · 0.2% (w/v )漠紛藍，20% ( v/v )甘油，200 mM β-疏基乙醇， 儲存於-80°C直至使用為止）。 根據製造商操作手冊，以BCA蛋白質分析套組（BCA protein assay kit，23250，Thermo Scientific ♦ Waltham » U.S.A.)定量蛋白質濃度，每一樣本取20 pg的蛋白質，以 10%至15%的SDS-PAGE進行電泳，SDS-PAGE的濃度係根 據與偵測之蛋白質的分子量決定。而後將SDS-PAGE，以400 mA轉印至墙酸纖維（nitrocellulose，NC )膜，持續1至2小 時。 轉印膜置於含5%脫脂奶粉之TBST ( Tris Buffered Saline with 0.05% Tween-20 )中，在室溫下浸泡1小時》而 後，轉印膜以TBST清洗兩次，每次五分鐘，以去除多餘的 牛奶，而後在4°C下，將轉印膜泡在適當稀釋的一級抗體並 緩和震盪持續過夜。轉印膜以TBST清洗三次，去除過多一 級抗體後，再將轉印膜浸泡於對應HRP鍵結之二級抗體持 17 201249453 續1小時。最後，膜上添加HRP基質（WBKLS0050, Millipore， Billerica，U.S.A.)，以顯現蛋白質表現圖型，再利用影像 系統（Fuji LAS-3000 imaging system)抓取影像，而後使 用軟髅（Multi Gauge software ( FUJIFILM, Tokyo, Japan) 對墨點影像定量，其結果如圖5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖 5E、圖5F、圖5G、圖5H所示。 參考圊5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖5E、圖5F、圖5G、 圖5H，其分別為黃連萃取物處理後CDK4、CDK6、cyclin D3 (G1/S調控蛋白）、cyclin B1 ( G2/M調控蛋白）、Vimentin (間葉標幟蛋白）與ALDH1A1、β-catenin、ABCG2 (三 者為癌幹細胞標幟蛋白）的表現結果，其中*代表；?<〇.05， ** 代表p<0.01，*** 代表;?<0.001，胞内控制組（internal Ctrl) 為β-肌動蛋白。由圖5A、圖5B、圊5C、圖5D、圖5E、圖5F、 圖5G、圖5H可知黃連萃取物處理後，上述調控蛋白與標幟 蛋白的表現量皆顯著減少，此表示本發明之黃連萃取物可 以抑制癌幹細胞及其轉移作用。 測試例四 穿孔（Transwe丨丨）分析 於24孔穿孔盤（Corning, Lowell，U.S.A.)中，每孔使 用不含血清的培養基100 μΐ培養2x104個A549細胞，每一6.5 mm嵌插件之上方部分設有孔，尺寸為8 μπι，底間隔填滿有 500 μΐ含10% FBS之F12K培養基。以黃連萃取物（0.6% ν/ν) 處理四小時後，以對甲链（paraformaldehyde，PFA )固定 細胞10分鐘，然後使用4·，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI: PBST， =1 : 10000 » PBST ： Phosphate Buffered Saline with 0.2% 18 201249453
Tween-20)染色10分鐘。嵌插件以PBST清洗三次每次10分 鐘’而後以活細胞影像系統（Leica，Wetzlar，Germany)觀 察’並用 MetaXpress軟體（Molecular Devices, Sunnyvale, U.S.Α·)定出細胞數量，其結果如圖6所示》 參考圖6,其為黃連萃取物處理後全數15個顯微鏡觀察 視野中單位視野的細胞數量，其中* * *代表p<〇.001。由圖6 結合圖5E，可知相較於控制組，黃連萃取物可以明顯減少 癌細胞轉移。 測試例五 側族群（Side popu丨ation )分析 於10 cm培養i中，培養3χ105個A549細胞株，獲得足 以進行分析之細胞數目。細胞以IC5〇劑量的黃連萃取物或小 檗鹼處理48小時，以胰蛋白酶處理收集細胞後離心，細胞 重新懸浮於含2% FBS之培養基，其中每一毫升含有lxl 06 個細胞。將50 μΜ作為阻斷劑之reserpine ( Sigma, St. Louis, U.S.A.)連同 Hoechst33342 染劑（Invitrogen，Carlsbad, li.S.A.，5 pg/ml)加入細胞，或上述染劑單獨加入細胞。 所得樣本在37°C下緩和震盪培養2小時，以確保染色均勻》 以PBS清洗細胞後，使用PI染色（20 ng/ml)判定活/死細胞。 為了設定螢光補償，亦製備單染色及無染色群組。以35 μπι 尼龍篩過濾樣本，防止細胞群聚。PI陽性反應之死細胞首 先排除，以避免偽陽性，然後赫斯特藍（Hoechst blue )與 赫斯特紅點繪製可判定側族群。對於樣本兩組群（reserpine 添加族群與無reserpine添加組群）減少之區域則定亦為側族 201249453 群，側族群的百分比則以Flowjo軟體（TreeStar，Ashland, U.S.A.)分析，其結果如圖7A與7B所示。 參考圖7 A與圖7B，其分別為黃連萃取液與小檗鹼溶液 處理後之SP分析結果。由圖7A與圖7B可知經過黃連萃取液 與小檗鹼溶液處理後，側族群大幅減少；結合參考圖5F、 圖5G、圖5H，可知黃連萃取液可以抑制癌幹細胞。 上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所 主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限 於上述實施例。 【圖式簡單說明】 圖1係黃連萃取物對A549、NCI-H460、NCI-H520與MRC5 等細胞株之測試結果。 圖2A係小檗鹼溶液與A549細胞株培養48小時後之MTT測 試結果。 圖2B係小檗鹼溶液與NCI-H460細胞株培養48小時後之 MTT測試結果。 圖2(:係小檗鹼溶液與NCI-H520細胞株培養48小時後之 MTT測試結果。 圖3為黃連萃取物對A549細胞株之萘胺藍染劑測試結果。 圖4為黃連萃取物處理後A549細胞株之細胞週期分析結 果。 圖5A為黃連萃取物處理後CDK4之表現結果。 圖5B為黃連萃取物處理後CDK6之表現結果。 圖5C為黃連萃取物處理後cyclinD3之表現結果。 20 201249453 圖5D為黃連萃取物處理後cyclin B1之表現結果。 圖5E為黃連萃取物處理後Vimentin之表現結果。 圖5F為黃連萃取物處理後ALDH1A1之表現結果。 圖5G為黃連萃取物處理後β-catenin之表現結果。 圖5H為黃連萃取物處理後ABCG2之表現結果。 圖6為穿孔分析中黃連萃取物處理後全數15個顯微鏡觀察 視野中單位視野的細胞數量。 圖7A為黃連萃取液處理後之SP分析結果。 圖7B為小檗鹼溶液處理後之SP分析結果。 【主要元件符號說明】