TW201242977A - Tri-variable domain binding proteins and uses thereof - Google Patents

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TW201242977A
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Cheng-Bin Wu
Hua Ying
Tariq Ghayur
Carrie Goodreau
Philip Bardwell
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Abbott Lab
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Description

201242977 六、發明說明： 本申請案主張2010年12月22曰申請之美國臨時專利申請 案第61/426,133號之優先權，其全部内容以引用的方式併 入本文中。 【先前技術】 此項技術中已知可結合兩個或兩個以上抗原之經工程改 造之蛋白質，諸如多特異性抗體。此等多特異性結合蛋白 可使用細胞融合、化學結合或重組DNA技術產生。 ^ 已使用四源雜交瘤技術（quadroma technology)(參見
Milstem，C.及Cuello, A.C. (1983) Nature 305(5934): 537-40)產 生雙特異性抗體，該技術係基於表現具有雙特異性抗體之 所要特異性之鼠類單株抗體的兩種不同融合瘤細胞株之體 細胞融合。由於所得雜交融合瘤（或四源雜交瘤）細胞株内 兩個不同免疫球蛋白（Ig)重鏈及輕鏈之隨機配對，因此產 生多達10個不同Ig種類，其中僅一種為功能性雙特異性抗 體。錯配副產物之存在及產率之顯著降低意謂需要複雜純 # 化程序。 亦可藉由化學結合兩個不同單株抗體（參見Staerz，U.D. 等人（1985) Nature 314(6012): 628-31)產生雙特異性抗體。 然而，此方法不產生均質製劑。其他方法已使用兩個不同 單株抗體或較小抗體片段之化學結合（參見Brennan，M.等 人（1985) Science 229(4708): 81-3)。 用於產生雙特異性抗體之另一方法為使兩個親本抗體與 雜雙官能交聯劑偶合，但所得雙特異性抗體遭受顯著分子 160878.doc 201242977 異質性’因為交聯劑與親本抗體之反應不為定點反應。為 獲得更均質之雙特異性抗體製劑，已使兩個不同Fab片段 以定點方式在其鉸鏈半胱胺酸殘基處化學交聯（參見
Glennie，M.J.等人（1987) J. Immunol. 139(7): 2367-75)。但 此方法產生Fab’2片段，而非完全igG分子。 已開發廣泛多種其他重組雙特異性抗體形式（參見
Kriangkum，J.等人（2〇〇1) Bi〇m〇i. Engin. 18(2): 31-40)。其 中最廣泛使用的是串聯單鍵Fv分子及雙功能抗體及其各種 衍生物。此等分子之構築通常以識別不同抗原之兩個單鍵
Fv(scFv)片 #又為起始物（參見 Ec〇n〇mides，A.N·等人（2〇〇3) Nat. Med. 9(1): 47-52)。串聯 scFv分子（taFv)表示使兩個 SCFV分子與另一肽連接子簡單連接之直接形式。此等串聯 scFv分子中所存在之兩個scFv片段形成獨立摺疊實體。多 種連接子可用於連接兩個scFv片段且連接子之長度多達63 個殘基（參見 Nakanishi，K·等人（2001) Ann. Rev. Immun〇1 19: 423-74)。儘管親本8(；]^片段通常可以可溶性形式在細 菌中表現，然而，通常觀測到串聯scFv分子在細菌中形成 不>谷性聚集體。因此，通常應用再摺疊方案或使用哺乳動 物表現系統來產生可溶性串聯scFv分子。在一項新近研究 中，報導由轉殖基因兔及牛活體内表現針對CD28及黑素 瘤相關蛋白聚糖之串聯scFv(參見Gracie，j A等人（1999)】 Clin. lnvest. 104(10): 1393_4〇1)。在此構築體中，兩個 scFv分子由CH1連接子連接，且可見雙特異性抗體之血清 濃度高達100 mg/L。採用多種策略，包括改變域順序或使 160878.doc 201242977 用具有不同長度或可撓性之中間連接子，以允許在細菌中 進行可溶性表現。少數研究現已報導使用極短Ala3連接子 或富含甘胺酸/絲胺酸之長連接子在細菌中表現可溶性串 聯 scFv 分子（參見 Leung, B.P.等人（2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502 ; Ito, A.等人（2003) J. Immunol. 170(9): 4802-9 ; Karni, A.等人（2002) J. Neuroimmunol. 125(1-2): 134-40)。在一項新近研究中，採用含有長度為3或6個殘基 之隨機化中間連接子之串聯scFv譜系的噬菌體呈現法以增 濃在細菌中以可溶性及活性形式產生之彼等分子。此方法 導致串聯scFv分子與含6個胺基酸殘基之連接子分離（參見 Arndt，M.及 Krauss，J. (2003) Methods Mol. Biol. 207: 305-21)。不清楚此連接子序列是否代表串聯scFv分子之可溶 性表現之通用解決方案。然而，此研究證明串聯scFv分子 之噬菌體呈現法與定向誘變法之組合為增濃可以活性形式 在細菌中表現之此等分子的有效工具。 雙特異性雙功能抗體（Db)利用雙功能抗體形式進行表 現。藉由使連接VH域與VL域之連接子長度降低至約5個殘 基來自scFv片段產生雙功能抗體（參見Peipp，M_及Valerius, Τ· (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4): 507-11)。連接子尺 寸之此降低有助於兩個多肽鏈藉由VH域與VL域交叉配對 來進行二聚化。藉由在同一細胞内表現具有結構VHA-VLB 及 VHB-VLA(VH-VL 組態）或 VLA-VHB 及 VLB-VHA(VL-VH組態）之兩個多肽鏈來產生雙特異性雙功能抗 體。過去已產生多種不同雙特異性雙功能抗體，且其中大 160878.doc 201242977 多數可以可溶性形式在細菌中表現。一項新近比較研究證 明可變異域之定向可影響活性結合位點之表現及形成（參 見 Mack, Μ·等人（1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15): 7021 -5)。儘管如此，細菌中之可溶性表現代表優於串聯 scFv分子之重要優勢。然而，因為兩個不同多肽鏈係在單 一細胞内表現，所以非活性均二聚體可與活性雜二聚體一 起產生。此需要執行其他純化步驟以獲得雙特異性雙功能 抗體之均質製劑。一種推動產生雙特異性雙功能抗體之方 法為產生孔中鈕（knob-into_hole)雙功能抗體（參見Holliger， P.等人（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444- 8.18)。此方法關於針對HER2及CD3之雙特異性雙功能抗 體得到證實。在抗HER2或抗CD3可變異域中，藉由將 Val37換為Phe且Leu45換為Trp在VH域中引入較大鈕，且藉 由使Phe98突變成Met且Tyr87突變成Ala在VL域中產生互補 孔。藉由使用此方法’雙特異性雙功能抗體之產量可自親 本雙功能抗體的72%增至孔中鈕雙功能抗體的超過9〇〇/〇。 重要的是’產率僅因此等突變略微降低。然而，觀測到若 干所分析之構築體之抗原結合活性降低。因此，此相當精 細方法需要分析多種構築體以鑑別產生結合活性未改變之 雜二聚分子之彼等突變。此外，此方法需要突變修飾免疫 球蛋白序列之恆定區’從而產生抗體序列之非原生及非天 然形式’此可導致免疫原性增加、活體内穩定性不良以及 藥物動力學不合需要。 單鍵雙功能抗體（scDb)代表改良雙特異性雙功能抗體樣 160878.doc 201242977 分子之形成之替代性策略（參見Holliger，Ρ·及Winter，G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30 ； Wu, A.M.等人（1996) Immunotechnology 2(1):第 21-36頁）。藉 由以長度為約15個胺基酸殘基之另一中間連接子連接兩個 形成雙功能抗體之多肽鏈來產生雙特異性單鏈雙功能抗 體。因此，分子量對應於單體單鏈雙功能抗體（50-60 kDa) 之所有分子均為雙特異性的。若干研究已證明雙特異性單 鏈雙功能抗體係以可溶性及活性形式在細菌中表現，其中 大多數經純化分子以單體形式存在（參見Holliger，P.及 Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30 ; Wu，A.M.等人（1996) Immunotechnol. 2(1): 21-36 ； Pluckthun, A.及Pack，P. (1997) Immunotechnol. 3(2): 83-105 ; Ridgway，J.B.等人（1996) Protein Engin. 9(7): 617-21)。因此，單鏈雙功能抗體組合串聯scFv(所有單體均為 雙特異性）及雙功能抗體（在細菌中可溶性表現）之優勢。 新近，已將雙功能抗體融合於Fc以產生更多Ig樣分子， 稱為二雙功能抗體（di-diabody)(參見Lu, D.等人（2004) J. Biol. Chem. 279(4): 2856-65)。此外，已描述在 IgG 之重鏈 中包含兩個Fab重複單元且可結合四個抗原分子之多價抗 體構築體（參見PCT公開案第WO 0177342A1號及Miller，K. 等人（2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61)。 此項技術中需要可結合兩個或兩個以上抗原之經改良多 價結合蛋白。美國專利第7,612，181號提供可以高親和力結 合兩個或兩個以上抗原且稱為雙重可變異域免疫球蛋白 160878.doc 201242977 (Ig )之新穎結合蛋白家族（該專利之全部内容以引 用的方式併入本文中）。 【發明内容】 本發明提供可以高親和力結合三個或三個以上抗原之新 穎結合蛋白家族。 在一個態樣中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白，其 中該多肽鏈包含 VD1_(xl)n_VD2_(X2)n VD3_c (x3)n，其 中VD1為第一重鏈可變異域；ν〇2為第二重鏈可變異域； VD3為第三重鏈可變異域；以重鏈怪定域，a為第—連 接子，Χ2為第二連接子；幻為以區；且η為〇或】；其中該 結合蛋白能夠結合一至三個目標抗原。 在另一態樣中’本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白，其 中該多肽鏈包含 VDl-(Xl)n-VD2_(X2)n_VD3_c_(X3)n，其 中VD1為第一輕鏈可變異域，VD2為第二輕鏈可變異域， VD3為第三輕鏈可變異域’ c為輕鏈恆定域，幻為第一連 接子，X2為第二連接子，χ3不包含卜區，且n為〇或丄，其 中該結合蛋白能夠結合一至三個目標抗原。 在另一態樣中’本發明提供包含第一及第二多肽鏈之結 合蛋白’其中該第一多肽鏈包含第一乂〇1-(乂1)11-¥02- (X2)n-VD3-C-(X3)n，其中VD1為第一重鏈可變異域，vd2 為第二重鍵可變異域’ VD3為第三重鏈可變異域，c為重 鍵‘I·亙定域，XI為第一連接子，X2為第二連接子，且X3為 Fc區，且其中該第二多肽鍵包含第二乂〇1-(乂1)11_\^2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中VD1為第一輕鍵可變異域，vd2 160878.doc 201242977 為第二輕鏈可變異域，VD3為第三輕鏈可變異域，c為輕 鏈恆定域，XI為第一連接子，X2為第二連接子，且χ3不 包含Fc區，且n為〇或1，其中該結合蛋白能夠結合一至三 個目標抗原。 在另一態樣中’本發明提供包含四個多肽鏈之結合蛋 白，其中第一及第三多肽鏈各獨立地包含VDl_(xi)n_VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中VD1為第一重鏈可變異域，VD2 為第二重鏈可變異域，VD3為第三重鏈可變異域，c為重 鏈恆定域，XI為第一連接子，χ2為第二連接子，幻為以 區’且其中第二及第四多肽鏈各獨立地包含VD1_(xl)n_ VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中VD1為第一輕鏈可變異 域，VD2為第二輕鏈可變異域，VD3為第三輕鏈可變異 域，C為輕鏈恆定域，X丨為連接子，χ2為第二連接子，χ3 不包含Fc區，且η為〇或1，其中該結合蛋白能夠結合一至 六個目標抗原。 在一個貫施例中’ pc區係選自由原生序列pc區及變異序 列Fc區組成之群。在另一實施例中，Fc區係選自由來自
IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、lgA、igM、IgE及 IgD 之 Fc 區 組成之群。 在一個實施例中，VD1、VD2及VD3之兩者或兩者以上 係獨立地自相同親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部 分獲得。在另—實施例中，VD1、VD2及VD3各獨立地自 相同親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得。在 另一實施例中，VD1、VD2及VD3之兩者或兩者以上係獨 160878.doc •9· 201242977 立地自不同親本結合蛋白(例如抗體)或其抗原結合部分獲 得。在另一實施例中，VD1、VD2&VD3各獨立地自不同 親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得。在一個 實施例中，不同親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部 分結合目標抗原上之相同抗原決^基。在另—實施例中， 不同親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分結合目標 抗原上之不同抗原決定基。在一個實施例中，不同親本結 合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分以不同效能結合其各 別目標抗原。在一個實施例中，不同親本結合蛋白（例如 抗體）或其抗原結合部分以不同親和力結合其各別目標。 在一個實施例中，不同親本結合蛋白（例如抗體）或其抗 原結合部分係獨立地選自由人類抗體、CDR移植抗體及人 類化抗體組成之群。在另一實施例_，不同親本結合蛋白 (例如抗體）或其抗原結合部分係獨立地選自由以下組成之 群：Fab片段；F(ab，）2片段；包含在鉸鏈區處由二硫橋鍵 連接之兩個Fab片段之二價片段；由Vh及CH1域組成之Fd 片段；由抗體之單一臂之VL及VH域組成的Fv片段；dAb 片段；分離之互補決定區（CDr);單鏈抗體；受體-抗體 (Rab);及雙功能抗體。 在一個實施例中，相同親本結合蛋白（例如抗體）或其抗 原結合部分係選自由人類抗體、CDR移植抗體及人類化抗 體組成之群《在另一實施例中，相同親本結合蛋白（例如 抗體）或其抗原結合部分係選自由以下組成之群：Fab片 段；F(ab’)2片段；包含在鉸鏈區處由二硫橋鍵連接之兩個 160878.doc 201242977
Fab片段之二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗 體之單一臂之VL及VH域組成的Fv片段；dAb片段；分離 之互補決定區（CDR);單鏈抗體；及雙功能抗體。 在一個實施例中，結合蛋白具有至少一種由親本結合蛋 白（例如抗體）或其抗原結合部分展現之所要性質。在一個 實施例中，所要性質係選自一或多個結合蛋白（例如抗體） 參數。在一個實施例中，結合蛋白參數係選自由以下組成 之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效能、生物功能、 抗原決定基識別、穩定性、溶解性、生產效率、免疫原 性、藥物動力學、生物可用性、組織交叉反應性及直系同 源抗原結合。 在一個實施例中，一或多個目標抗原係選自由以下組成 之群：ABCF1 ; ACVR1 ; ACVR1B ; ACVR2 ; ACVR2B ; ACVRL1 ； ADORA2A ；聚集蛋白聚糖（Aggrecan); AGR2 ； AICDA ； AIF1 ； AIG1 ； AKAP1 ； AKAP2 ； AMH ； AMHR2 ； ANGPT1 ； ANGPT2 ； ANGPTL3 ； ANGPTL4 ； ANPEP ; APC ; APOC1 ; AR ; AZGP1(鋅-a-醣蛋白）； B7.1 ； B7.2 ； BAD ； BAFF ； BAG1 ； BAI1 ； BCL2 ； BCL6 ； BDNF ； BLNK ； BLR1(MDR15) ； BlyS ； BMP1 ； BMP2 ； BMP3B(GDF10) ； BMP4 ； BMP6 ； BMP8 ； BMPR1 A ； BMPR1B ; BMPR2 ; BPAG1(網蛋白（plectin)) ; BRCA1 ; C19orflO(IL27w) ； C3 ； C4A ； C5 ； C5R1 ； CANT1 ； CASP1 ； CASP4 ； CAV1 ； CCBP2(D6/JAB61) ； CCLl(l-309)； CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin)) ; CCL13(MCP-4); 160878.doc 201242977 CCL15(MIP-ld) ； CCL16(HCC-4) ； CCL17(TARC)； CCL18(PARC) ； CCL19(MIP-3b) ； CCL2(MCP-1)； MCAF ; CCL20(MIP-3a) ; CCL21(MIP-2) ; SLC ;非淋巴 組織趨化因子-2(exodus-2) ; CCL22(MDC/STC-1); CCL23(MPIF-1) ; CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2) ; CCL25(TECK) ; CCL26(嗜酸性粒細胞趨化因子-3);
CCL27(CTACK/ILC) ； CCL28 ； CCL3(MIP-la) ； CCL4(MIP-lb)； CCL5(RANTES) ； CCL7(MCP-3) ； CCL8(mcp-2) ； CCNA1 ； CCNA2 ； CCND1 ； CCNE1 ； CCNE2 ； CCR1(CKR1/HM145)； CCR2(mcp-lRB/RA) ； CCR3(CKR3/CMKBR3) ; CCR4 ； CCR5(CMKBR5/ChemR13) ； CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6) ； CCR7(CKR7/EBI1) ； CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)； CCR9(GPR-9-6) ； CCRLl(VSHKl) ； CCRL2(L-CCR) ； CD164 ； CD19 ； CD1C ； CD20 ； CD200 ； CD-22 ； CD24 ； CD28 ； CD3 ； CD37 ； CD38 ； CD3E ； CD3G ； CD3Z ； CD4 ； CD40 ； CD40L ； CD44 ； CD45RB ； CD52 ； CD69 ； CD72 ； CD74 ； CD79A ； CD79B ; CD8 ; CD80 ; CD81 ; CD83 ; CD86 ; CDH1(E-鈣黏附 籲 蛋白（E-cadherin)) ; CDH10 ; CDH12 ; CDH13 ; CDH18 ; CDH19 ; CDH20 ； CDH5 ； CDH7 ； CDH8 ； CDH9 ； CDK2 ； CDK3 ； CDK4 ； CDK5 ； CDK6 ； CDK7 ； CDK9 ； CDKN1 A(p21 Wapl/Cipl)； CDKNlB(p27Kipl) ； CDKN1C ； CDKN2A(pl6INK4a)； CDKN2B ； CDKN2C ； CDKN3 ； CEBPB ； CER1 ； CHGA ； CHGB ;殼質酶（Chitinase) ; CHST10 ; CKLFSF2 ; CKLFSF3 ; CKLFSF4 ； CKLFSF5 ； CKLFSF6 ； CKLFSF7 ； CKLFSF8 ； 160878.doc 12· s 201242977
CLDN3 ; CLDN7(緊密連接蛋白-7(claudin-7)) ; CLN3 ; CLU(凝 集素（clusterin)) ； CMKLR1 ; CMKORl(RDCl) ； CNR1 ； COL18A1 ； COL1A1 ； COL4A3 ； COL6A1 ； CR2 ； CRP ； CSFl(M-CSF) ； CSF2(GM-CSF) ； CSF3(GCSF) ； CTLA4 ； CTNNBl(b-索烴素（b-catenin)) ; CTSB(組織蛋白酶 B(cathepsin B)) ； CX3CL1(SCYD1) ； CX3CR1(V28) ； CXCLl(GROl)； CXCLIO(IP-IO) ； CXCLll(I-TAC/IP-9) ； CXCL12(SDF1)； CXCL13 ； CXCL14 ； CXCL16 ； CXCL2(GR02) ； CXCL3(GR03)； CXCL5(ENA-78/LIX) ； CXCL6(GCP-2) ； CXCL9(MIG)； CXCR3(GPR9/CKR-L2) ； CXCR4 ； CXCR6(TYMSTR/STRL33/ Bonzo) ； CYB5 ； CYC1 ； CYSLTR1 ； CGRP ； Clq ； Clr ； Cl ； C4a ； C4b ； C2a ； C2b ； C3a ； C3b ； DAB2IP ； DES ； DKFZp451J0118 ; DNCL1 ; DPP4 ; E-選擇素（E-selectin); E2F1 ； ECGF1 ； EDG1 ； EFNA1 ； EFNA3 ； EFNB2 ； EGF ； EGFR ； ELAC2 ； ENG ； ENOl ； EN02 ； EN03 ； EPHB4 ； EPO ； ERBB2(Her-2) ； EREG ； ERK8 ； ESR1 ； ESR2 ； F3(TF)； 因子VII;因子IX;因子V;因子Vila;因子X;因子XII; 因子 XIII ; FADD ; FasL ; FASN ; Fey 受體；FCER1A ; FCER2 ； FCGR3A ； FGF ； FGFl(aFGF) ； FGF10 ； FGF11 ； FGF12 ； FGF12B ； FGF13 ； FGF14 ； FGF16 ； FGF17 ； FGF18 ； FGF19 ； FGF2(bFGF) ； FGF20 ； FGF21 ； FGF22 ； FGF23 ； FGF3(int-2) ； FGF4(HST) ； FGF5 ； FGF6(HST-2) ； FGF7(KGF) ； FGF8 ； FGF9 ； FGFR3 ； FIGF(VEGFD)； FILl(EPSILON) ； FILl(ZETA) ； FLJ12584 ； FLJ25530 ； 160878.doc -13· 201242977
FLRT1(纖維結合蛋白（fibronectin)) ； FLT1 ； FOS ； FOSLl(FRA-l) ； FY(DARC) ； GABRP(GABAa) ； GAGEB1 ； GAGEC1 ； GALNAC4S-6ST ； GATA3 ； GDF5 ； GFI1 ； GGT1 ； GM-CSF ； GNAS1 ； GNRH1 ； GPR2(CCR10)； GPR31 ； GPR44 ； GPR81 (FKSG80) ； GRCCIO(CIO)； GRP ； GSN(膠溶素（Gelsolin)) ; GSTP1 ;醣蛋白 (GP)IIb/IIIa ； HAVCR2 ； HDAC4 ； HDAC5 ； HDAC7A ； HDAC9 ; Her2 ; HGF ; HJF1A ; HIP1 ;組織胺及組織胺受 體；HLA-A ; HLA-DRA ; HM74 ; HMGB1 ; HMOX1 ； HUMCYT2A ； ICEBERG ； ICOSL ； ID2 ； IFN-a ； IFNA1 ； IFNA2 ； IFNA4 ； IFNA5 ； IFNA6 ； IFNA7 ； IFNB1 ； IFNy ； IFNW1 ； IGBP1 ； IGF1 ； IGF1R ； IGF2 ； IGFBP2 ； IGFBP3 ； IGFBP6 ； IL-1 ； IL-la ； IL-Ιβ ； IL10 ； IL10RA ； IL10RB ； IL11 ； IL11RA ； IL-12 ； IL12A ； IL12B ； IL12RB1 ； IL12RB2 ； IL13 ； IL13RA1 ； IL13RA2 ； IL14 ； IL15 ； IL15RA ； IL16 ； IL17 ； IL17B ；
IL17C ； IL17R ； IL18 ； IL18BP ； IL18R1 ； IL18RAP ； IL19 ； ILIA ； IL1B ； IL1F10 ； IL1F5 ； IL1F6 ； IL1F7 ； IL1F8 ； IL1F9 ； IL1HY1 ； IL1R1 ； IL1R2 ； IL1RAP ； IL1RAPL1 ; IL1RAPL2 ； IL1RL1 ； IL1RL2 ； IL1RN ； IL2 ； IL20 ； IL20RA ； IL21R ； IL22 ； IL22R ； IL22RA2 ； IL23 ； IL24 ； IL25 ； IL26 ； IL27 ； IL28A ； IL28B ； IL29 ； IL2RA ； IL2RB ； IL2RG ； IL3 ； IL30 ； IL3RA ； IL4 ； IL4R ; IL5 ; IL5RA ; IL6 ; IL6R ; IL6ST(醣蛋白 130); 160878.doc -14- s 201242977 IL7 ; IL7R ; IL8 ; IL8RA ; IL8RB ; IL8RB ; IL9 ; IL9R ; ILK ； INHA ； INHBA ； INSL3 ； INSL4 ； IRAKI ； IRAK2 ； ITGA1 ; ITGA2 ; ITGA3 ; ITGA6(a6整合素（a6 integrin)); ITGAV ； ITGB3 ; ITGB4(b4 整合素）；JAG1 ; JAK1 ； JAK3 ; JUN ; K6HF ; KAI1 ; KDR ; KITLG ; KLF5(GC盒 BP) ； KLF6 ； KLK10 ； KLK12 ； KLK13 ； KLK14 ； KLK15 ； KLK3 ； KLK4 ； KLK5 ； KLK6 ； KLK9 ； KRT1 ； KRT19(角蛋白 19(Keratin 19)); KRT2A; KRTHB6(毛髮特 鲁異性II型角蛋白）；L·選擇素；LAMA5 ; LEP(瘦素 (leptin)) ； Lingo-p75 ; Lingo-Troy ； LPS ; LTA(TNF-b)； LTB ； LTB4R(GPR16) ； LTB4R2 ； LTBR ； MACMARCKS ； MAG 或 Omgp ; MAP2K7(c-Jun) ; MDK ; MIB1 ;中期因子 (midkine) ； MIF ； MIP-2 ； MKI67(Ki-67) ； MMP2 ； MMP9 ; MS4A1 ; MSMB ; MT3(金屬硫連接蛋白-Ill(metallothionectin-III)) ； MTSS1 ； MUC1(黏蛋白 (mucin)) ; MYC ; MYD88 ; NCK2 ;神經蛋白聚糖 • (neurocan) ； NKG2D ； NFKB1 ； NFKB2 ； NGF ； NGFB(NGF) ； NGFR ； NgR-Lingo ； NgR-Nogo66(Nogo)； NgR-p75 ； NgR-Troy ； NME1(NM23A) ； NOX5 ； NPPB ； NR0B1 ； NR0B2 ； NR1D1 ； NR1D2 ； NR1H2 ； NR1H3 ； NR1H4 ； NRII2 ； NRII3 ； NR2C1 ； NR2C2 ； NR2E1 ； NR2E3 ； NR2F1 ； NR2F2 ； NR2F6 ； NR3C1 ； NR3C2 ； NR4A1 ； NR4A2 ； NR4A3 ； NR5A1 ； NR5A2 ； NR6A1 ； NRP1 ； NRP2 ； NT5E ； NTN4 ； ODZ1 ； OPRD1 ； P2RX7 ； 160878.doc 15 201242977 PAP ； PARTI ； PATE ； PAWR ； PC A3 ； PCNA ； PDGFA ； PDGFB ; PECAM1 ; PF4(CXCL4) ; PGE2 ; PGF ; PGR ;磷 酸蛋白聚糖（phosphacan) ; PIAS2 ; PIK3CG ;纖維蛋白溶 酶原活化因子（plasminogen activator) ; PLAU(uPA); PLG ； PLXDC1 ； PPBP(CXCL7) ； PPID ； PR1 ； PRKCQ ； PRKD1 ； PRL ； PROC ；蛋白質 C ; PROK2 ; PSAP ; PSCA ； PTAFR ； PTEN ; PTGS2(COX-2) ； PTN ; RAC2(p21Rac2) ； RAGE ； RARB ； RGS1 ； RGS13 ； RGS3 ； RNF110(ZNF144) ； R0B02 ； SI00A2 ； SCGB1D2 (親脂性蛋白B)(lipophilin B) ; SCGB2A1(乳腺珠蛋白 2(mammaglobin 2)); SCGB2A2(乳腺珠蛋白 1); SCYE1(内 皮單核細胞活化細胞激素）；SDF2 ; SERPINA1 ; SERPINA3 ; SERPINB5(乳腺絲抑蛋白（maspin)); SERPINEl(PAI-l) ； SERPINF1 ； SHBG ； SLA2 ； SLC2A2 ； SLC33A1 ； SLC43A1 ； SLIT2 ； SPP1 ； SPRRIB(Sprl)； ST6GAL1 ; STAB1 ; STAT6 ; STEAP ; STEAP2 ; P物質； TB4R2 ； TBX21 ； TCP10 ； TDGF1 ； TEK ； TGFA ； TGFB1 ； TGFB111 ； TGFB2 ； TGFB3 ； TGFBI ； TGFBR1 ； TGFBR2 ; TGFBR3 ; TH1L ; THBS1(血小板反應蛋白-l(thrombospondin-l)) ； THBS2 ； THBS4 ； ΤΗΡΟ ； TIE(Tie-1) ; ΤΙΜίΡ3 ;組織因子；TLR10 ; TLR2 ; TLR3 ; TLR4 ; TLR5 ； TLR6 ； TLR7 ； TLR8 ； TLR9 ； TNF ； TNF-a ； TNFAIP2(B94) ； TNFAIP3 ； TNFRSF11A ； TNFRSF1A ； TNFRSF1B ； TNFRSF21 ； TNFRSF5 ； TNFRSF6(Fas)； 160878.doc -16- s 201242977
TNFRSF7 ； TNFRSF8 ； TNFRSF9 ； TNFSFIO(TRAIL)； TNFSF11 (TRANCE) ； TNFSF12(AP03L) ； TNFSF13 (April)； TNFSF13B ; TNFSF14(HVEM-L) ； TNFSF 15(YEGI)； TNFSF18 ； TNFSF4(OX40 酉己體）；TNFSF5(CD40 酉己體）； TNFSF6(FasL) ； TNFSF7(CD27 西己體）；TNFSF8(CD30 酉己 體）；TNFSF9(4-1BB 配體）；TOLLIP ； Toll 樣受體； TOP2A(拓撲異構酶（topoisomerase)Iia) ; TP53 ; TPM1 ; TPM2 ； TRADD ； TRAF1 ； TRAF2 ； TRAF3 ； TRAF4 ； TRAF5 ； TRAF6 ； TREM1 ; TREM2 ； TRPC6 ； TSLP ； TWEAK ; jk 栓調節蛋白（thrombomodulin);凝血酶 (thrombin) ; VEGF ; VEGFB ; VEGFC ;多功能蛋白聚糖 (versican) ; VHL C5 ; VLA-4 ; XCL1(淋巴細胞趨化因子 (lymphotactin)) ； XCL2(SCM-lb) ； XCR1(GPR5/CCXCR1)； YY1 ;及 ZFPM2。 在一個實施例中，結合蛋白能夠結合三個選自由以下組 成之群之目標抗原：前列腺素E2(prostaglandin E2)(PGE2)、 介白素13(interleukin 13)(IL-13)及介白素18(IL-18)，及/或 腫瘤壞死因子ct(TNFa)、介白素13(IL-13)及介白素18(IL-18)，及/或介白素12(IL-12)、介白素23(IL-23)及腫瘤壞死 因子 a(TNFa)。 在另一實施例中，結合蛋白能夠結合三個選自由以下組 成之群之目標抗原：前列腺素E2(PGE2)、介白素13(IL-13)、介白素18(IL-18)、腫瘤壞死因子a(TNFa)、介白素 23(IL-23)、IL-12、HMGB1、VEGF、RAGE、NGF、IL- 160878.doc -17- 201242977 Ια、IL-Ιβ、E-選擇素、L-選擇素、醣蛋白（GP)Ilb/IIIa、 血栓調節蛋白、凝血酶、CGRP、TREM、PAI-I、ανβ3、 uPA、Her2、IGF1R、EGFR、CD3、Fey受體、NKG2D、Ρ 物質、蛋白質C、因子VII、因子IX、纖維蛋白溶酶原活化 因子、因子V、因子Vila、因子X、因子XII、因子χΙΠ、
Clq、Clr、Cls、C4a、C4b、C2a、C2b、C、C3a及 C3b。 在一個實施例中，結合蛋白能夠調節一或多個目標抗原 之生物功能。 在一個實施例中，結合蛋白能夠中和一或多個目標抗原 之生物功能。 在一個實施例中’ 一或多個目標抗原係選自由細胞激 素、趨化因子、細胞表面蛋白、酶及受體組成之群。 在一個實施例中，細胞激素係選自由淋巴激素 (lymphokine)、單核球激素（monokine)及多肽激素組成之 群。在另一實施例中，細胞激素係選自由以下組成之群·· 生長激素，副甲狀腺激素（parathyroid hormone);甲狀腺 素（thyroxine)，腺島素；騰島素原（pr〇jnsuiin);鬆他素 (relaxin);鬆弛素原（proreiaxin);醣蛋白激素；肝生長因 子’纖維母細胞生長因子；泌乳素（pr〇lactin);胎盤生乳 素（placental lactogen);腫瘤壞死因子·α及腫瘤壞死因子_ β;穆勒氏管抑制物質（mullerian-inhibiting substance);小 鼠促性腺激素（gonadotropin)相關肽；抑制素（inhibin);活 化素（activin);企管内皮生長因子；整合素；血小板生成 素（thrombopoietin，TPO);神經生長因子；血小板生長因 160878.doc -18- 201242977 子；胎盤生長因子（placental growth factor);轉化生長因 子（TGF);胰島素樣生長因子·1及胰島素樣生長因子-11 ; 紅血球生成素（erythropoietin，ΕΡΟ);骨生成誘導因子 (osteoinductive factor);干擾素（interferon);群落刺激因 子（CSF) ; IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23 及 IL-33 ;腫瘤壞死因子；LIF ; 及kit配體（KL)。 # 在一個實施例中，結合蛋白包含選自由SEQ ID NO:45及 55組成之群之三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)重鏈胺基 酸序列；及選自由SEQ ID NO:50及58組成之群之三重可變 異域免疫球蛋白（TVD-Ig)輕鏈胺基酸序列。在另一實施例 中，結合蛋白包含SEQ ID NO:69中所示之三重可變異域免 疫球蛋白（TVD-Ig)重鏈胺基酸序列；及SEQ ID NO: 72中所 示之三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合蛋白包含SEQ ID ΝΟ:1 85及187中所 ® 示之三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)重鏈胺基酸序列； 及SEQ ID NO: 186及188中所示之三重可變異域免疫球蛋白 (TVD-Ig)輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，結合蛋白包 含SEQ ID NO: 193及195中所示之三重可變異域免疫球蛋白 (TVD-Ig)重鏈胺基酸序列；及SEQ ID NO:194及196中所示 之三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)輕鏈胺基酸序列。在 另一實施例中，結合蛋白包含SEQ ID NO:201及203中所示 之三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)重鏈胺基酸序列；及 160878.doc •19- 201242977 SEQ ID NO:202及204中所示之三重可變異域免疫球蛋白 (TVD-Ig)輕鏈胺基酸序列。 在一個實施例中，趨化因子係選自由CCR2、CCR5及 CXCL-13組成之群。 在一個實施例中，細胞表面蛋白係選自由CTLA4及 TNFRSF1B組成之群》 在一個實施例中，酶係選自由激酶及蛋白酶組成之群。 在一個實施例中，受體係選自由淋巴激素受體、單核球 激素受體及多肽激素受體組成之群。 在一個實施例中，第一及第二連接子包含獨立地選自由 以下組成之群之胺基酸序列：AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID ΝΟ:1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:2)； AKTTPKLGG(SEQ ID NO:3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:4) ； SAKTTP(SEQ ID NO:5) ； RADAAP(SEQ ID NO:6) ； RADAAPTVS(SEQ ID NO:7) ； RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO:8) ; RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:9); SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:10) ； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP(SEQ ID NO:13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:14) ； QPKAAP(SEQ ID NO:15) ； QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:16) ； AKTTPP (SEQ ID NO:17) ； AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:18)； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:20)； ASTKGP(SEQ ID NO:21) ； ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:22)； G G G G S G G G G S G G G G S ( S E Q ID N O : 2 3 )； 160878.doc -20- 201242977 G Ε Ν Κ V E Y A P A L M A L S ( S E Q ID N O ： 2 4 ); GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:25); GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:27); 及ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID N0.28)。 在一個態樣中’本發明提供一種結合蛋白結合物，其包 含本發明結合蛋白及選自由免疫黏附分子、顯影劑、治療 劑及細胞毒性劑組成之群之試劑。在一個實施例中，試劑
為選自由以下組成之群之顯影劑：放射性標記、酶、螢光 標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。在 一個實施例中’顯影劑為選自由以下組成之群之放射性標 記：3H、14C、35S、、、99Tc、⑴In、丨 25ι ' 131ι、丨 ％、 丨66Ho及丨53Sm。在一個實施例中，試劑為選自由以下組成 之群之治療劑或細胞毒性劑：抗代謝物、烷基化劑、抗生 素生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂 劑、蒽環黴素（anthracycline)、毒素及細胞祠亡劑。 在-個實施例中，結合蛋白為結晶結合蛋白。在一個實 施例中，結晶結合蛋白為無載劑醫藥控制釋放晶體。在一 個貫施例t ’結晶結合蛋白具有比該結合蛋白之可溶性對 應物長的活體内半衰期。 保留生物活性。 在另I施例中’結晶結合蛋白
在一個實施例中，蚌人I 、、αα蛋白係根據某一方法產生，該 法包含在足以產生該結合 主-哈^ ^ 〇蛋白之條件下在培養基中培養 主細胞，其中該宿主細 匕匕s栽體，該載體包含編碼該 i60878.doc -21 · 201242977 合蛋白之核酸。 另1、樣中本發明提供一種包含本發明結合蛋白及 醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。在一個實施例中， 醫樂組合物另外包含至少-種其他試劑。在-個實施例 中’其他試劑為治療劑或顯影劑。在一個實施例中，其他 試劑係選自由以下組成之群：治療劑、顯影劑、細胞毒性 劑、血營生成抑制劑；激酶抑制劑，·共刺激分子阻斷劑； 黏附分子阻斷劑；抗細胞激素抗體或其功能片甲胺喋 呤（methotrexate);環孢素（cyci〇sp〇nn);雷帕黴素 (rapamycin) ’ FK506 ;可偵測標記或報導體；τΝρ拮抗 劑，抗風濕藥；肌肉鬆弛劑、麻醉劑（narc〇tic)、非類固醇 消炎藥（NSAID)、止痛劑、麻醉劑（anesthetic)、鎮靜劑、 局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬藥 (arUipsoriatic)、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成 素、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素 替代藥物、放射性醫帛、抗抑鬱齊丨、抗精神病藥、刺激 劑、哮喘藥物、β促效劑、吸入性類固醇、腎上腺素 (epinephrine)或類似物、細胞激素及細胞激素拮抗劑。 成之群之放射性標記：、14匚、35§ 在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之結合蛋白 結合物及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。在—個實 施例中，結合蛋白結合物包含選自由放射性標記、酶螢 光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素組 成之群之顯影劑。在一個實施例中，顯影劑為選自由以下 90
Y 99
Tc 160878.doc -22- 201242977
In、 1、⑴1、177]Lu、166ji0 及⑴Sm。在另—f ^ I 中，紝人Iα 隹力貫施例 、。蛋白…合物包含選自由以下組成之群之治療劑 細胞毒性劑·抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、 細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒 素及細胞凋亡劑。 ”
在一個實施例中，本發明之醫藥組合物另外包含第二試 劑。在一個實施例中，第二試劑為治療劑或顯影劑。在一 個=施例中，治療劑或顯影劑係選自群組：細胞毒性劑、 笞成抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑、黏附 为子阻斷劑、抗細胞激素抗體或其功能m ^胺嗓吟、
% ?〇素®帕黴素、FK506、可賴測標記或報導體、TNF 劑抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻醉劑、非類固醇消炎 藥（NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神 經肌肉阻斷劑 '抗微生物劑、抗牛皮癖藥、皮質類固醇、 同化類固醇、紅血球生成素、免疫劑、免疫球蛋白、免疫 抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性醫藥、3h、 153Sm、#'光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標 。己、生物素、抗抑鬱劑、抗精神病藥、刺激劑、哮喘藥 物' β促效劑、吸人性類㈣、腎上腺素或類似物、細胞 激素及細胞激素拮抗劑。 在-個實施例中，結合蛋白對該_或多個目標之締合速 率常數（κοη)選自由以下組成之群：至少約1〇2 m-1s_i;至 少約1〇3 Μ-V ;至少約1〇4 Μ-、·丨；至少約1〇5 M·、丨；及 160878.doc -23- 201242977 至少約ίο6 μΛ·1 ’如藉由表面電漿子共振所量剩。在另— 實施例中，結合蛋白對該一或多個目標之解離速率常數 (Koff)選自由以下組成之群：至多約1〇_3 s•丨；至多約^ 至多約Hr5 S'·及至多約nr?，如藉由表面電漿子：振 所量測。在另-實施例中，結合蛋白對一或多個目標之解 離常數（kd)選自由以下組成之群：至多約1〇·7 m ;至多約 1〇-8 Μ ’·至多約1().9 M ;至多約1(rl。M ;至多㈣u Μ ; 至多約1〇-12 Μ ;及至多ι〇-ΐ3 Μ。 在一個態樣中，本發明亦提供一種包含編碼本發明結合 蛋白之核苷酸序列之分離之核酸分子。 在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之分離之核 酸分子之載體。在一個實施例中，載體係選自由以下組成 之群：pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、 pcDNA3.1 TOPO、PEF6 TOPO及pBJ。 在另一態樣中’本發明提供一種包含本發明載體之宿主 細胞。在一個實施例中，宿主細胞為原核細胞，諸如大腸 桿菌（五· co//)。在另一實施例中，宿主細胞為真核細胞。 在一個實施例中，真核細胞係選自由原生生物細胞、動物 細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。在另一實施例中， 真核細胞為選自由以下組成之群之動物細胞：哺乳動物細 胞、禽類細胞及昆蟲細胞。在一個實施例中，宿主細胞為 CH0細胞。在另一實施例中，宿主細胞為c〇S細胞。在一 個實施例中，宿主細胞為酵母細胞，諸如釀酒酵母 (•Sacc/taromyces cerevbzae)。在一個實施例中，宿主細胞 160878.doc •24- 201242977 為昆蟲S f 9細胞。 本發明亦提供產生本發明結合蛋白之方法，其包含在足 以產生該結合蛋白之條件下在培養基中培養本發明之宿主 細胞。在一個實施例中，產生之50%-75%之結合蛋白為多 特異性（例如三重特異性）多價（例如六價）結合蛋白。在另 一實施例中，產生之75%·9〇%之結合蛋白為多特異性（例 如三重特異性）多價（例如六價）結合蛋白。在一個實施例 中’產生之90%-95%之結合蛋白為多特異性（例如三重特 異性）多價（例如六價）結合蛋白。 本發明亦提供根據本發明方法產生之蛋白質。 在一個態樣中’本發明提供一種治療個體之疾病或病症 之方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明結合蛋 白，藉此治療該疾病或病症。在一個實施例中，病症係選 自由以下組成之群：類風濕性關節炎、骨關節炎、青少年 隄1"生關節、敗血性關節炎、萊姆關節炎（Lyme arthritis)、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節 病、全身性紅斑狼瘡症（Systemic lUpUS erythemat〇sus)、克 羅恩氏病（Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、 騰島素依賴性糖尿病、曱狀腺炎（thyr〇iditis)、哮喘、過敏 性疾病、牛皮癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官 移植排斥反應、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、 類肉瘤病（sarcoidosis)、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝 血、川崎氏病（Kawasaki’s disease)、格雷氏病（Grave's disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽 160878.doc -25- 201242977 腫病（Wegener’s granulomatosis)、亨偌-絲奇恩賴紫癒 (Henoch-Schoenlein purpurea)、腎顯微性血管炎、慢性活 動型肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候群、 敗血症症候群、惡病質（cachexia)、感染性疾病、寄生蟲 病、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎（acute transverse myelitis)、亨廷頓氏舞蹈病（Huntington's chorea)、帕金森氏病（Parkinson’s disease)、阿茲海默氏病 (Alzheimer’s disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血 性貧血、惡性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、艾迪森氏病 (Addison's disease)、偶發性I型多腺體分泌不足症 (polyglandular deficiency)及II型多腺體分泌不足症、施密 特氏症候群（Schmidt's syndrome)、成人（急性）呼吸碧迫症 候群、脫髮、斑形脫髮、血清陰性關節病（seronegative arthopathy)、關節病、萊特爾氏病（Reiter's disease)、牛皮 癬性關節病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎、與彼 衣菌（chlamydia)、耶氏桿菌（yersinia)及沙門氏菌 (salmonella)相關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣化疾病 /動脈硬化、異位性過敏、自體免疫大皰病（autoimmune bullous disease)、尋常天范瘡（pemphigus vulgaris)、落葉 型天疮瘡（pemphigus foliaceus)、類天范瘡（pemphigoid)、 線性IgA病（linear IgA disease)、自體免疫溶血性貧血、庫 姆氏陽性溶血性貧 jk (Coombs positive haemolytic anaemia)、後天性惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛腦炎/ 皇家自由病（Royal Free Disease)、慢性黏膜皮膚念珠菌病 160878.doc • 26- 201242977
(chronic mucocutaneous candidiasis)、巨細月包動脈炎、原 發性硬化性肝炎、隱源性自體免疫肝炎（cryptogenic autoimmune hepatitis)、後天性免疫缺乏病症候群 (Acquired Immunodeficiency Disease Syndrome)、後天性 免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、C型肝炎、一般變異性免 疫缺乏症（一般變異性低丙種球蛋白血症（common variable hypogammaglobulinaemia))、擴張性心肌病、雌性不孕 症、卵巢功能衰竭、早發性卵巢功能衰竭（premature ovarian failure)、纖維化肺病（fibrotic lung disease)、隱源 性纖維化肺泡炎、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結締 組織病相關之間質性肺病、混合性結締組織病相關之肺病 (mixed connective tissue disease associated lung disease) ' 全身性硬化症相關之間質性肺病（systemic sclerosis associated interstitial lung disease)、類風濕性關節炎相關 之間質性肺病、全身性紅斑狼瘡症相關之肺病、皮肌炎/ 多肌炎相關之肺病、休格連氏病相關之肺病（Sj6gren's disease associated lung disease)、僵直性脊椎炎相關之肺 病、血管炎彌漫性肺病（vasculitic diffuse lung disease)、 血鐵黃素沈積症相關之肺病（haemosiderosis associated lung disease)、藥物誘發之間質性肺病、纖維化、放射性 纖維化、阻塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血球性肺炎 (chronic eosinophilic pneumonia)、淋巴球性浸调性肺病 (lymphocytic infiltrative lung disease)、感染後間質性肺 病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、1型自體免疫性肝 160878.doc -27- 201242977 炎（典型自體免疫或類狼瘡性肝炎）、2型自體免疫性肝炎 (抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介導之低血糖症、B型胰島 素抗性伴有黑色棘皮病（type B insulin resistance with acanthosis nigricans)、 副甲狀腺機能減退症 (hypoparathyroidism)、與器官移植相關之急性免疫疾病、 與器官移植相關之慢性免疫疾病、骨關節病 (osteoarthrosis)、原發性硬化性膽管炎、1型牛皮癖、2型 牛皮癬、特發性白血球減少病（idiopathic leucopaenia)、自 體免疫性嗜中性球減少症、NOS型腎病、絲球體腎炎、腎 顯微性血管炎、萊姆病（lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡 (discoid lupus erythematosus)、特發性或NOS型雄性不育 症、精子自體免疫、多發性硬化症（所有亞型）、交感性眼 炎、結締組織病繼發性肺尚血壓、古巴士德氏症候群 (Goodpasture’s syndrome)、結節性多動脈炎之肺部表現 (pulmonary manifestation of polyarteritis nodosa)、急性風 濕熱、類風濕性脊椎炎、史提爾氏病（Still's disease)、全 身性硬化症、休格連氏症候群、高安氏病（Takayasu,s disease)/動脈炎、自體免疫性血小板減少症、特發性血小 板減少症、自體免疫性曱狀腺病、曱狀腺機能亢進症、甲 狀腺腫性自體免疫性甲狀腺低能症（橋本氏病（Hashim〇t〇，s disease))、萎縮性自體免疫性曱狀腺低能症、原發性黏液 水腫（primary myxoedema)、晶狀體源性葡萄膜炎 (phacogenic uveitis)、原發性血管炎、白斑病急性肝病、 慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁營 160878.doc -28· 201242977 滞、特質性肝病、藥物誘發之肝杰 t 奴 < 肝炎、非酒精性脂肝炎、過 敏症及哮喘、B群鏈球菌（gr〇Up Bgbs)感 染、精神障礙（例如抑鬱症及精神分裂症）、Th2型及丁^型 介導之疾病、急性及慢性疼痛（不同形式之疼痛）、及諸如 肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌' 胰臟癌、卵巢癌、 前列腺癌及直腸癌之癌症及造血性惡性疾病（白血病及淋 巴瘤）、無Μ曰蛋白血症（Abetalipoprotemia)、手足發紺 (Acrocyanosis)、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血 籲 病、急性淋巴母細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病 (AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰臟炎、急性腎衰 竭、腺癌、心房異位搏動' AIDS癡呆複合症、酒精誘發 之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻 炎、同種異體移植物排斥反應（all〇graft rejecti〇n)、心卜抗 騰蛋白酶缺乏症（alpha-1-antitrypsin deficiency)、肌萎縮 性側索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療 法、抗磷脂症候群、抗受體過敏性反應、主動脈瘤及周邊 ® 動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血壓、動脈硬化症、動靜 脈瘺、共濟失調（ataxia)、心房纖維性顫動（持續性或陣發 性）、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植物 排斥反應、骨髓移植（BMT)排斥反應、束枝阻滯（bundle branch block)、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma)、燒 傷、心律不整 '心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心 肺繞道發炎反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小 腦病症、紊亂性或多灶性心房心動過速、與化學療法相關 160878.doc • 29- 201242977 之病症、慢性骨髓性白血病（CML)、慢性酒精中毒、慢性 發炎性病變、慢性淋巴球性白血病（CLL)、慢性阻塞性肺 病（COPD)、慢性水揚酸中毒、結腸直腸癌、充血性心臟 衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺原性心臟病（c〇r pulmonale)、冠狀動脈疾病、庫賈氏病（Creutzfeldt_Jak〇b disease)、培養物陰性敗血症、囊腫性纖維化、細胞激素 療法相關之病症、拳擊員癡呆、脫髓鞘疾病、出血性登革 熱（dengue hemorrhagic fever)、皮炎、皮膚病病狀、糖尿 病（diabetes)、糖尿病（diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬 化病、彌漫性路易體疾病（Diffuse Lewy body disease)、擴 張型充血性心肌病、基底神經節病症、中年唐氏症候群 (Down's Syndrome in middle age)、由阻斷 CNS 多巴胺受體 之藥物誘發的藥物誘發之運動障礙、藥物敏感、濕殄、腦 脊髓炎（encephalomyelitis)、心内膜炎、内分泌病、會厭炎 (epiglottitis)、EB病毒感染（epstein-barr virus infection)、 肢端紅痛症、錐體外及小腦病症、家族性嗤血淋巴組織細 胞瘤病、胎兒胸腺植入物排斥反應、弗里德賴希氏共濟失 調（Friedreich’s ataxia)、功能性周邊動脈病症、真菌性敗 也症、氣性壞疽（gas gangrene)、胃潰瘍、腎小球性腎炎、 任何器官或組織之移植物排斥反應、革蘭氏陰性敗血症 (gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症、胞内生物體 引起之肉芽腫、毛細胞白血病、哈洛弗登·施帕茨病 (Hallerrorden-Spatz disease)、橋本氏曱狀腺炎（hashimoto，s thyroiditis)、枯草熱、心臟移植排斥反應、血色素沈著 160878.doc 201242977 症、血液透析、溶a性尿毒癥候群/溶企栓性金小板減少 性紫癜、出血、肝炎（A型）、希氏束心律不整（His bundle arrythmias)、HIV感染/HIV神經病、霍奇金氏病（Hodgkin's
disease)、過動性運動障礙、過敏反應、過敏性肺炎、高 血墨、動作徐緩型運動障礙、下丘腦-垂體-腎上腺轴評 估、特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細 胞毒性、衰弱、嬰兒脊趙性肌萎縮症、主動脈發炎、a型 流感、電離輻射暴露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經 炎、缺血再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節 炎、青少年脊髓性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤（Kap〇si，s sarcoma)、腎臟移植排斥反應、退伍軍人病（legi〇nelia)、 利什曼體病（leishmaniasis)、麻風病、皮質脊髓系統病 變、脂肪水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫、瘧疾、惡性 淋巴瘤、惡性組織細胞增多症、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦 膜炎球菌血症、代謝性/特發性疾病、偏頭痛、粒線體多 系統病症、混合結締組織疾病、單株丙種球蛋白症、多發 性骨髓瘤、多系統退化（曼切代哲因_托馬斯史_德爾格及馬 查多-約瑟夫（Mencel Dejerine_Thomas Shi_Drager and
Machado-Joseph))、重症肌無力、禽細胞内分枝桿菌 (mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿菌 (mycobacterium tubercul〇sis)、骨髓發育不良症候群、心 肌梗塞、心肌缺血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎 炎、腎病、神經退化性疾病、了型神經性肌肉萎縮、嗜中 性球減少性發熱、非霍奇金氏淋巴瘤（n〇n_H〇dgkins 160878.doc •31· 201242977 lymphoma)、腹主動脈及其分支堵塞、阻塞性動脈病症、 okt3療法、睾丸炎/副睾丸炎、睾丸炎/輸精管復通術 (vasectomy reversal procedure)、器官腫大（organomegaiy)、骨
質疏鬆症、姨臟移植排斥反應、胰臟癌、副腫瘤症候群/ 惡性高血弼症、副甲狀腺移植排斥反應、盆腔炎、常年性 鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周邊血管病 症、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎（pneum〇CyStiS carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群（多發性神經 病、器官腫大、内分泌病、單株丙種球蛋白症及皮膚變化 籲 症候群）、灌流後症候群、泵後症候群、MI心切開術後症 候群、子癇前症（preeclampsia)、進行性核上性麻痹、原發 性肺高血壓、放射療法、雷諾氏症候群（Raynaud，s phenomenon)及疾病、雷諾氏病（Rayn〇ud，s disease)、雷弗 素姆氏病（Refsum's disease)、規則性狹窄qrs心動過速、 腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬 皮病、老年性舞蹈病（senile chorea)、路易體型老年癡呆 (Senile Dementia of Lewy body type)、血清陰性關節病、春 休克、鐮形細胞性貧血（sickle ceii anemia)、皮膚同種異 體移植排斥反應、皮膚變化症候群、小腸移植排斥反應、 實體腫瘤 '特異性心律不整、脊椎共濟失調、脊髓小腦退 化、鏈球菌肌炎（streptococcal myositis)、小腦結構病變、 亞急丨生硬化性全腦炎（Subacute sclerosing panencephalitis)、
昏厥、心血管系統梅毒、全身性過敏、全身性發炎反應症 候群全身發作型青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB 160878.doc
S -32- 201242977 ALL、毛細管擴張、血检閉塞性脈管炎（thromboangitis obliterans)、血小板滅少症、中毒、移植、創傷/出血、III 型過敏性反應、IV型過敏、不穩定型心絞痛、尿毒癥、尿 敗血病 '蓴麻療、心臟瓣膜病、靜脈曲張、血管炎、靜脈 疾病、靜脈血栓形成、心室纖維性顫動、病毒及真菌感 染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關之嗜血細胞症 候群、韋尼克科爾薩科夫症候群（Wernicke-Korsakoff syndrome)、威爾遜氏病（Wilson's disease)、任何器官或組 織之異種移植物排斥反應、急性冠狀動脈症候群、急性特 發性多發性神經炎、急性發炎性脫髓鞘性多神經根神經 病、急性缺、成人史爾氏病（adult Still’s disease)、斑 形脫髮、全身性過敏反應、抗磷脂抗體症候群、再生不能 性貧血、動脈硬化、異位性濕疹、異位性皮炎、自體免疫 性皮炎、與鏈球菌感染相關之自體免疫病症、自體免疫性 腸病、自體免疫性聽力損失、自體免疫淋巴組織增生症候 群（ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性早發性纟卩巢功 能衰竭、瞼炎、支氣管擴張、大皰性類天疱瘡（buU〇us pemphigoid)、心血管疾病、災難性抗磷脂症候群、乳糜 瀉、頸椎關節病（cervical Sp0ndyl〇sis)、慢性缺血、瘢痕性 類天疱瘡、伴以多發性硬化症風險之臨床上分離症候群 (cis)、結膜炎、兒童期發作精神病症、慢性阻塞性肺病 (COPD)、淚囊炎（dacryocystitis)、皮肌炎、糖尿病性視網 膜病變 '糖尿病、椎間盤突出症、椎間盤脫垂（disk prolaps)、藥物誘發之免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子 160878.doc -33- 201242977 宮内膜異位、眼内炎、上鞏膜炎（episcleritis)、多形性紅 斑、重症多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、古立安_白瑞症 候群（Guillain-Barr6 syndrome)(GBS)、枯草熱、休斯症候 群（Hughes syndrome)、特發性帕金森氏病、特發性間質性 肺炎、IgE介導之過敏症、免疫性溶血性貧血、包涵體肌 炎、感染性眼發炎疾病、發炎性脫髓鞘疾病、發炎性心臟 病、發炎性腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角 膜結膜炎（keratojuntivitis sicca)、庫斯毛爾病（Kussmaul disease)或庫斯毛爾-梅爾病（Kussmaul-Meier disease)、蘭 德里氏麻痒（Landry’s paralysis)、朗格罕氏細胞組織細胞 增多症（Langerhan’s cell histiocytosis)、網狀青斑（iived〇 reticularis)、黃斑部變性、顯微性多血管炎、白赫鐵列夫 症（morbus bechterev)、運動神經元病症、黏膜類天疮瘡、 多器官衰竭、重症肌無力、骨髓發育不良症候群、心肌 炎、神經根病症、神經病、非A非B型肝炎、視神經炎、 骨質溶解、卵巢癌、少關節性JRA(pauciarticular JRA丨、 周邊動脈閉塞性疾病（PAOD)、周邊血管疾病（pvd)、周邊 動脈疾病（PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎（或結節性動脈 周圍炎）、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症（p〇li〇sis)、 多關節性JRA、多内分泌缺乏症候群、多肌炎、風濕性多 肌痛（PMR)、泵後症候群、原發性帕金森氏症（primary Parkinsonism)、前列腺及直腸癌及造血性惡性疾病（白血 病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅血球發育不全、原發性腎 上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再狹窄、風濕性心 160878.doc •34· 201242977 臟病、sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥大及骨炎）、硬 皮病、繼發性澱粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經 痛、繼發性腎上腺機能不全、聚矽氧相關之結締組織疾 病、史奈登-威爾金森皮膚病（sneddon-wilkinson dermatosis)、 強直性脊椎炎、史蒂芬-瓊森症候群（Stevens-Johnson syndrome ’ SJS)、全身性發炎反應症候群、顳動脈炎 (temporal arteritis)、弓蟲性視網膜炎（toxoplasmic retinitis)、中毒性表皮壞死溶解、橫貫性脊髓炎、 TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、1型過敏反應、η型糖尿病、 蓴麻疹、常見間質性肺炎（UIP)、血管炎、春季結膜炎、 病毒性視網膜炎、沃格特-小柳·原田症候群（v〇gt_ Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群）、濕式黃斑部變 性、傷口癒合、耶氏桿菌及沙門氏菌相關之關節病。 在一個實施例中’向個體投藥係藉由至少一種選自以下 之模式達成：非經腸、皮下、肌肉内、靜脈内、關節内、 支氣管内、腹内、囊内、軟骨内、腔内（intracavitary)、體 腔内（intracelial)、小腦内、腦室内、結腸内、子宮頸内、 胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、 胸膜内、前列腺内、肺内、直腸内、腎内、視網膜内 '脊 椎内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、推注、經陰 道、經直腸、經頰、舌下、鼻内及經皮。 在另一態樣中，本發明提供一種產生能夠結合三個抗原 之三可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)之方法，其包含獲得能 夠結合第一目標抗原之第一親本結合蛋白（例如抗體）或其 160878.doc -35- 201242977 抗原結合部分，獲得能夠結合第二目標抗原之第二親本結 合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分，獲得能夠結合第三 目標抗原之第二親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部 分，構築包含VDl-(xi)n_VD2_(X2)n VD3 c_(X3)n之第一 及第三多肽鏈，其中VD1為自該第一親本結合蛋白（例如抗 體）或其抗原結合部分獲得之第一重鏈可變異域，VD2為自 該第二親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之 第二重鏈可變異域，VD3為自該第三親本結合蛋白（例如抗 體）或其抗原結合部分獲得之第三重鏈可變異域，c為重鏈 怪定域，X2為第一連接子’ X1為第二連接子，幻為Fc 區’且η為 0或 1，及構築包含 VD1_(xl)n_VD2-(X2)n_VE>3_ C-(X3)n之第二及第四多肽鍵，其中VD1為自該第一親本 結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈可 變異域’ VD2為自該第二親本結合蛋白（例如抗體）或其抗 原結合部分獲得之第二輕鏈可變異域，VD3為自該第三親 本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈 可變異域’ C為輕鏈恆定域，XI為第一連接子，χ2為第二 連接子，X3不包含Fc區，且η為0或1，及表現該第一、第 二、第三及第四多肽鏈，以便產生能夠結合第一、第二及 第三目標抗原之三可變異域免疫球蛋白。 在一個實施例中，VD1、VD2及VD3重鏈可變異域包含 選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID ΝΟ:46、47、 48、70、71、163、165、167、169及 171，其中 VD1、VD2 及VD3輕鏈可變異域包含選自由以下組成之群之胺基酸序 160878.doc •36· 201242977 列：SEQ ID N〇:51、52、53、73、74、164、166、168、 170及172。 在一個實施例中，第一、第二及第三親本結合蛋白（例 如抗體）或其抗原結合部分係獨立地選自由以下組成之 群：人類抗體、CDR移植抗體及人類化抗體。在另一實施 例中’第一、第二及第三親本結合蛋白（例如抗體）或其抗 原結合部分係獨立地選自由以下組成之群：Fab片段、 F(ab')2片段 '包含在鉸鏈區處由二硫橋鍵連接之兩個Fab 片段之二價片段、由VH及CH1域組成之Fd片段、由抗體之 單一臂之VL及VH域組成之Fv片段、dAb片段、分離之互 補決定區（CDR)、單鏈抗體、受體-抗體（Rab)及雙功能抗 體。 在一個實施例中，第一親本結合蛋白（例如抗體）或其抗 原結合部分具有至少一種由三可變異域免疫球蛋白展現之 所要性質。在一個實施例中’第二親本結合蛋白（例如抗 體）或其抗原結合部分具有至少一種由三可變異域免疫球 蛋白展現之所要性質。在一個實施例中，第三親本結合蛋 白（例如抗體）或其抗原結合部分具有至少一種由三可變異 域免疫球蛋白展現之所要性質。 在一個實施例中’ Fc區係選自由原生序列Fc區及變異序 列Fc區組成之群。在另一實施例中，Fc區係選自由來自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE及 IgD之 Fc 區 組成之群》 在一個實施例中’所要性質係選自一或多個結合蛋白 160878.doc •37· 201242977 (例如抗體）參數。在一個實 貫施例中’結合蛋白(例如抗體) 參數係選自由以下組成之群 抗原特異性、對抗原之親和 力、效能、生物功能、抗原法 π决疋基識別、穩定性、溶解 性、生產效率、免疫原性、藥 樂物動力學、生物可用性、組 織交叉反應性及直系同源抗原結合。 在個實施例中，第-親本結合蛋白（例如抗體）或其抗 原結合部分以不同於第二親本結合蛋白(例如抗體)或其抗 原結合部分結合第二抗原或第三親本結合蛋白（例如抗體） 或其抗原結合部分結合第三抗原之親和力的親和力結合第 抗原。在另-實施例中，第_親本結合蛋白（例如抗體） 或其抗原結合部分以不同於笛_ I π Α β 刀乂个丨j於第一親本結合蛋白（例如抗體） 或其抗原、结合部分結合第二抗原或第三親本結合蛋白(例 如抗體）或其抗原結合部分結合第三抗原之效能的效能結 合第一抗原。 在本發明之一個態樣中，提供一種確定測試樣品中抗原 或其片&之存在、量或濃度的方法，其中該抗原或其片段 係選自由以下組成之群：前列腺素E2(PGE2)、介白素 13(IL-13)、腫瘤壞死因子a(TNFa)、介白素13(IL13)及介 白素18(IL-18)。該方法包括藉由免疫分析來分析測試樣品 之抗原或其片段，其中該免疫分析採用至少一種結合蛋白 及至少一種可偵測標記且包括由該可偵測標記所產生直接 或間接指示該測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或濃 度的信號與對照組或校準劑中所產生直接或間接指示該抗 原或其片段之存在、量或濃度的信號相比較，其中該校準
160878.doc -38· S 201242977 劑視情況為一系列校準劑之一部分，其中該等校準劑各自 之抗原或其片段的濃度不同於系列中之其他校準劑，且其 中該至少一種結合蛋白之一者包含一或多個包含 (Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n2 多肽鏈，其中 vm 為自 第一親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第 一重鏈可變異域，VD2為自第二親本結合蛋白（例如抗體） 或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變異域’ VD3為自第 三親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第三 籲 重鏈可變異域，c為重鏈恆定域，幻為第一連接子，χ2為 第一連接子，Χ3為Fc區，且η為〇或丨，且可結合選自由以 下組成之群之三抗原組：前列腺素E2(pGE2)、介白素 13(IL-13)及介白素18(il-18);及腫瘤壞死因子a(TNFa)、 介白素13(IL-13)及介白素18(江_18)，從而確定該測試樣品 中抗原或其片段之存在、量或漠度。 在另一態樣中，本發明提供一種確定測試樣品中抗原或 其片段之存在、量或濃度的方法，其中該抗原或其片段係 選自由以下組成之群··前列腺素E2(pGE2)、介白素13(IL_ 13)、腫瘤壞死因子a(TNFa)、介白素13(IL13)及介白素 18(IL-18)。該方法包括藉由免疫分析來分析測試樣品之抗 原或其片段，其中該免疫分析採用至少一種結合蛋白及至 > -種可偵測標記且包括由該可偵測標記所產生直接或間 翻示該測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或漢度之 ^號與對照組或校準劑中所產生直接或間接指示該抗原或 其片筷之存在、量或濃度之信號相比較，其中該校準劑視 160878.doc -39- 201242977 情況為一系列校準劑之一部分，其中該等校準劑各自之抗 原或其片段的濃度不同於系列中之其他校準劑，且其中該 至少一種結合蛋白之一者包含一或多個包含VDl-(XI )n- VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鏈，其中VD1為自第一親 本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第一重鏈 可變異域’ VD2為自第二親本結合蛋白（例如抗體）或其抗 原結合部分獲得之第二重鏈可變異域，VD3為自第三親本 結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第三重鏈可 變異域’ C為重鍵恆定域，XI為第一連接子，χ2為第二連 接子’ X3為Fc區，且n為〇或！，且可結合選自由以下組成 之群之三抗原組：前列腺素E2(PGE2)、介白素13(IL-13)及 介白素18(IL-18);及腫瘤壞死因子a(TNFa)、介白素 13(IL-13)及介白素18(IL-18)，從而確定該測試樣品中抗原 或其片段之存在、量或濃度。 在一個實施例中，該方法包括使測試樣品與至少一種結 合抗原或其片段上之抗原決定基之捕捉劑接觸以便形成捕 捉劑/抗原或其片段複合物，使該捕捉劑/抗原或其片段複 合物與至少一種包含可偵測標記且結合該抗原或其片段上 不由該捕捉劑結合之抗原決定基的偵測劑接觸以形成捕捉 劑/抗原或其片段/偵測劑複合物，及基於由所形成之該捕 捉劑/抗原或其片段/偵測劑複合物中之該可偵測標記產生 的信號確定該測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或濃 度’從而確定該測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或 濃度，其中至少一種捕捉劑及/或至少一種偵測劑為至少 160878.doc 201242977 一種結合蛋白。 在另一實施例中’該方法包括使測試樣品與至少—種結 合抗原或其片段上之抗原決定基之捕捉劑接觸以便形成捕 捉劑/抗原或其片段複合物，及同時或以任一順序依序使 該測試樣品與可與該測試樣品中之任何抗原或其片段競爭 結合該至少一種捕捉劑之經可偵測標記的抗原或其片段接 觸’其中該測試樣品中存在之任何抗原（或其片段）與該經 可偵測標記之抗原彼此競爭以分別形成捕捉劑/抗原或其 片段複合物及捕捉劑/經可偵測標記之抗原或其片段複合 物，及基於由所形成之該捕捉劑/經可彳貞測標記之抗原或 其片扠複合物中之該可偵測標記產生的信號確定該測試樣 品中該抗原或其片段之存在、量或濃度，其中至少一種捕 捉劑為至少一種結合蛋白，其中由該捕捉劑/經可偵測標 記之抗原或其片段複合物中之該可偵測標記產生的該信號 與該測試樣品中之抗原或其片段之量或濃度成反比，從而 確定該測試樣品中抗原或其片段之存在、量或濃度。 在一個f施例中’贼樣品來自於患者且方法另外包含 診斷:預後或評估該患者之治療性/防治性治療之功效， 其中若方法另外包含評估該患者之治療性/防治性治療之 功效，則該方法視情泥另外包含在需要時改進該患者之該 治療性/防治性治療以改良功效。 在個實施例中，方法經調適以用於自動系統或半自動 系統中。 個心樣中’本發明提供—種用於分析測試樣品之抗 160878.doc •41 · 201242977 原、其片段之套組。該套組包括至少一種用於分析測試樣 品之抗原或其片段之組分及用於分析該測試樣品之抗原或 其片段之說明書，其中該至少一種組分包括至少一種包含 結合蛋白之組合物，該結合蛋白包含一或多個包含VD1_ (Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鏈，其中 VD1 為自 第一親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第 一重鏈可變異域，VD2為自第二親本結合蛋白（例如抗體） 或其抗原結合部分獲得之第二重鍵可變異域，VD3為自第 三親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第三 重鏈可變異域，C為重鏈恆定域，幻為第一連接子，X2為 第二連接子，X3為Fc區，且n為〇或1 ,且可結合選自由以 下組成之群之三抗原組：前列腺素E2(PGE2)、介白素 13(IL-13)及介白素18(IL-18);及腫瘤壞死因子a(TNFa)、 介白素13(IL-13)及介白素18(IL-18)，其中該結合蛋白視情 況經可偵測標記。 在另一態樣中，本發明提供一種用於分析測試樣品之抗 原或其片段之套組。s玄套組包括至少一種用於分析測試樣 品之抗原或其片段之組分及用於分析該測試樣品之抗原或 其片段之說明書，其中該至少一種組分包括至少一種包含 結合蛋白之組合物’該結合蛋白包含一或多個包含VD1_ (Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽键，其中 vdi 為自 第一親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第 一重鏈可變異域’ VD2為自第二親本結合蛋白（例如抗體） 或其抗原結合部分獲得之第二重鍵可變異域，為自第 160878.doc -42- 201242977 三親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第三 重鏈可變異域，C為重鏈恆定域，XI為第一連接子，又2為 第二連接子，X3為Fc區，且n為〇或1，且可結合選自由以 下組成之群之三抗原組：前列腺素E2(PGE2)、介白素 13(11^13)及介白素18(11^-18);及腫瘤壞死因子01(7^17〇[)、 介白素13(IL-13)及介白素18(IL-18)，其中該結合蛋白視情 況經可偵測標記。 【實施方式】 本發明係關於可結合三個或三個以上抗原之多價及/或 多特異性結合蛋白。詳言之，本發明係關於三重或三可變 異（TVD)域結合蛋白及其醫藥組合物以及用於製備此等 TVD結合蛋白之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明 亦涵蓋使用本發明之TVD結合蛋白活體外或活體内偵測特 定抗原之方法。 除非本文另外定義，否則關聯本發明使用之科學及技術 術語將具有一般技術者通常瞭解之含義。術語之含義及範 嘴應為清晰的；然而’若存在任何隱含歧義，則本文提供 之定義優先於任何字典或外來定義。另外，除非上下文另 外需要，否則單數術語將包括複數且複數術語將包括單 數。在本申請案中，除非另外陳述，否則使用術語「或」 意謂「及/或」。此外，使用術語「包括（including)」以及 其他形式，諸如「包括（includes)」及「包括（included)」 不具有限制性。此外，除非另外明確陳述，否則諸如「要 素」或「組分」之術語涵蓋構成一個單元之要素及組分及 160878.doc •43· 201242977 構成一個以上次單元之要素及組分^除非另外自上下文明 確可知，否則本文之所有值皆可理解為由術語「約」修 飾。容許之變化量將視特定值而定，但通常視為在平均值 之兩個標準偏差内。「約」可理解為變化至多1〇%、9%、 8%、7%、6%、5%、4% ' 3%、2%、1%、〇 1%或 〇 〇1%。 本文提供之範圍應理解為包括在範圍内之所有值或在範圍 内之範圍或值之任何子集。舉例而言，U0應理解為包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9及10，或彼等值之任何範圍 或子集’及適當時分數值。類似地，以「多達」某一值提 供之範圍應理解為包括自零至範圍之頂端之值；且「小 於」應理解為包括自彼數值至零之值。 一般而言，與本文所述之細胞及組織培養、分子生物 學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及 雜交關聯使用之命名法及其技術為此項技術中熟知且常用 者。除非另外指示’否則通常根據此項技術中熟知及如本 說明書整篇引用及論述之多種一般性及更具體之參考文獻 中所述的習知方法來執行本發明之方法及技術。酶反應及 _ 純化技術係根據製造商說明書，如此項技術中通常所達成 或如本文所述來進行。與本文所述之分析化學、合成有機 化學及醫學及醫藥化學關聯使用之命名法及其實驗室程序 及技術為此項技術中熟知且常用者。標準技術用於化學合 成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞及患者治療。 為更谷易理解本發明，以下定義所選術語。 如本文所用之術語「結合蛋白」或「結合分子」包括含
160878.doc •44· S 201242977 有至^自特異性結合相關分子之抗原結合位點之分子。 結合蛋白可Ιλ. 、几或任何其他多肽，例如受體-抗體（Rab) 蛋白質。 沾如本文所用之術語「三可變異結合蛋白」、「三重可變異 σ蛋白」及「TVD結合蛋白」包括含有三個或六個各自 獨立且特異陡結合目標抗原之抗原結合位點之分子。在一 個實施例中’ TVD結合蛋白為tvd免疫球蛋白(TVD ig)結 合蛋白。
如本文所用之關於結合蛋白與第二化學物質（諸如蛋白 質或多肽）之相互作用的術語「特異性結合（specific binding) j ^ ^ ^ ^ ^ ^ (specifically binding) j t §1 4a 互作用依賴於化學物質上存在特定結構（例如抗原決定子 或抗原決定基）；舉例而言，結合蛋白識別且結合特定蛋 ^質結構而非普遍結合蛋白質。若結合蛋白對抗原決定基 A」具有特異性，則在含有經標記「a」及結合蛋白之 反應中存在含有抗原決定基A(或游離未經標記之a)之分子 將降低與抗體結合之經標記A的量。然而，應注意特異性 結合目標抗原之結合蛋白可能與來自其他物種之目標抗原 具有交又反應性。 一般而έ，本發明之TVD結合蛋白包含含 VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)!^多肽鏈，其中VD1為第一可變 異域，VD2為第二可變異域，VD3為第三可變異域，匸為 恆定域，XI為第一連接子，χ2為第二連接子，幻為以區 且η為0或1，且能夠結合三個目標抗原。圖丨描述本發明之 160878.doc •45- 201242977 一例示性TVD結合蛋白之結構。 在例示性實施例中，「VD1」、「VD2」及「VD3」各獨立 地為重鏈可變異域或輕鏈可變異域。 如本文所用，片語r重鏈可變異域」或「重鏈抗原結合 域」（在本文中稱為VD或VDH)意欲包括雙重重鍵可變異 域、二重重鏈可變異域、域抗體、ScFv、受體及骨架抗原 結合蛋白之重鏈可變異域。應瞭解獨立於本發明之結合蛋 白之第二多肽上存在的配對輕鏈可變異域，重鏈抗原結合 域可結合或可不結合抗原。舉例而言，若重鏈可變異域源 於域抗體、scFv或受體，則預期其將獨立於第二多肽鏈上 之任何胺基0^序列結合目標。因為本發明之結合蛋白形成 功能性抗原結合位點，所以若重鏈抗原結合域不能獨立地 特異性結合目標抗原（亦即不單獨提供功能性抗體結合位 點），則應存在第二多肽以提供互補輕鏈可變異域來提供 功能性抗體結合位·點。 ^ 如本文所用，片語「輕鏈可變異域」或「輕鏈抗原結合 域」（在本文中稱為VD或VDL)意欲包括雙重輕鏈可變異 域、三重輕鏈可變異域、域抗體、ScFv、受體及骨架抗原 結合蛋白之輕鏈可變異域。應瞭解獨立於本發明之結合蛋 白之另-多肽上存在之配對重鏈可變異域，輕鏈抗原結合 域可結合或可不結合抗原。舉例而言，若輕鏈可變異域源 於域抗體、*或受體，則預期其將獨立於第二多肽鏈上 之任何胺基酸序列結合目標。 否則如本文所用，單獨 除非另外自上下文明確可知 160878.doc -46· 201242977 「VD」應理解為重鏈抗原結合域或輕鏈抗原結合域。 在一個實施例巾，VD1、VD2及VD3各為重鏈可變異 域。在另一實施例中，VD1、VD2及VD3各為輕鏈可變異 域。 在例示性實施例中，「XI」及「X2」各為連接子且 「η」各獨立地為,〇或1。
術語「連接子」係指包含由用於連接一或多個抗原結合 部分或域之肽鍵接合之兩個或兩個以上胺基酸殘基的多 肽。此等連接子多肽在此項技術中為熟知的（參見例如 Holliger，P.#、（1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448 ; Poljak，R.J.等人（1994) Structure 2:一1121-1123)。例示 性連接子包括(但不限於)AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID N0:1); AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:2) ； AKTTPKLGG (SEQ ID N0:3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID N0:4) ； SAKTTP (SEQ ID N0:5) ； RADAAP(SEQ ID N0:6) ； RADAAPTVS (SEQ ID NO:7) ； RADAAAAGGPGS(SEQ ID N0:8) ； RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID N0:9); SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:10)； ADAAP(SEQ ID N0:11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID N0:12)； TVAAP(SEQ ID N0:13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:14)； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16)； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18)； AKTTAP(SEQ ID NO:19) ； AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:20)； ASTKGP(SEQ ID NO:21) ； ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:22)； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23) ； GENKVEYAPALMALS 160878.doc 47- 201242977 (SEQ ID NO:24) ； GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:25)； G Η E A A A V M Q V Q Y P A S ( S E Q ID N 0 : 2 6 )； TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:27);及 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:28)。 在一個實施例中，（XI )n為〇。在另一實施例中，（X On 為1。在另一實施例中，（Χ2)η為0。在另一實施例中， (Χ2)η為1。在另一實施例中，（χ2)η不為CH1且可為〇或1。 在例示性實施例中，「C」為重鏈或輕鏈恆定域。 如本文所用，「輕鏈恆定域」（在本文中亦稱為「CL」）φ 係指源於免疫球蛋白分子之輕鏈之恆定域的域。除非有規 定，否則如本文所用，「輕鏈恆定域」可為λ輕鏈恆定區或 κ輕鏈恆定區。人類輕鏈恆定域胺基酸序列在此項技術中 為已知的。 如本文所用，「重鏈恆定域」（在本文中亦稱為「cH」） 係指源於免疫球蛋白分子之重鏈之恆定域的域。重鏈恆定 區包含三個域CH1、CH2及CH3及視情況第四域CH4。人 類重鍵怪定域胺基酸序列在此項技術中為已知的。 鲁 應瞭解，除非另外自上下文明確可知，否則如本文所 用’單獨「C」可理解為重鏈恆定域或輕鏈恆定域。 在一個實施例中，c為輕鏈恆定域。在另一實施例中， C為重鍵恆定域。在另一實施例中，c為重鍵CH1域。在一 個實施例中，C為重鏈CH2域。在另一實施例中，c為重鏈 CH3域。在另一實施例中，c為重鏈CH4域。在一個實施 例中’ c不為重鍵CH1域。在另一實施例中，c不為重鏈 160878.doc
S • 48 · 201242977 CH2域。在一個實施例中’ C不為重鏈CH3域。在另—實 施例中，C不為重鏈CH4域。 在例示性實施例中’「（χ3)η」為以區且Γη」為。 在一個實施例中’ n為〇。在另一實施例中，η為1。 術語「Fc區」用於定義可藉由木瓜蛋白酶（papain)消化 完整抗體產生之免疫球蛋白重鏈的C端區。Fc區可為原生 序列Fc區或變異以區。免疫球蛋白之卜區通常包含兩個怪 定域CH2域及CH3域，且視情況包含CH4域。置換Fc部分 ® 中之胺基酸殘基以改變抗體效應功能在此項技術中為已知 的（美國專利第5,648,260號及第5,624,821號）。抗體之以部 分介導若干重要效應功能，例如細胞激素誘導、ADCC、 吞噬作用、補體依賴性細胞毒性（CDC)及抗體及抗原-抗體 複合物之半衰期/清除率《視治療目標而定在一些情況 下，此等效應功能為治療性抗體所需，但在其他情況下可 能並不必要或甚至有害。某些人類IgG同型，特定言之 IgGl及IgG3分別經由結合FcyR及補體Clq來介導ADCC及 春 CDC。新生兒Fc受體（FcRn)為確定抗體循環半衰期之關鍵 組分。在另一實施例中，置換結合蛋白（例如抗體）之怪定 區（例如抗體之Fc區）中之至少一個胺基酸殘基以使結合蛋 白（例如抗體）之效應功能改變。免疫球蛋白之兩個相同重 鍵之二聚化係由CH3域之二聚化介導，且由鉸鏈區内之雙 硫鍵穩定（Huber等人（1976) Nature 264: 415-20 ; Thies等人 (1999) J. Mol. Biol. 293: 67-79)。 TVD結合蛋白包含兩個重鏈TVD多肽及兩個輕鏈TVD多 160878.doc -49- 201242977 肽且在本文中稱為「TVD-k蛋白質」或「TVD-Ig結合蛋 白」。TVD-Ig蛋白質之每一半包含一個重鏈TVD多肽及一 個輕鏈TVD多肽及三個抗原結合位點。各結合位點包含重 鏈可變異域及輕鏈可變異域，其中每個抗原結合位點有總 計六個CDR參與抗原結合。 如本文所用之術語「多肽」或「多肽鏈」係指任何聚合 胺基酸鏈。術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使 用且亦係指聚合胺基酸鏈。術語「多肽」涵蓋原生或人工 蛋白質、蛋白質片段及具有蛋白質序列之多肽類似物。多 肽可為單體多肽或聚合多肽。除非另外陳述，否則在本文 中使用「多肽」意欲涵蓋多肽及其片段及變異體（包括變 異體之片段）。對於抗原多肽，多肽之片段視情況含有多 肽之至少一個鄰接或非線性抗原決定基。至少一個抗原決 定基片段之確切邊界可使用此項技術中之一般技術確認。 片·^包含至少約5個鄰接胺基酸，諸如至少約1 〇個鄰接胺 基酸、至少約15個鄰接胺基酸或至少約2〇個鄰接胺基酸。 多肽之變異體係如本文所述。 本發明之結合蛋白可包含免疫球蛋白分子之任何同型 (例如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 及 IgY)、類別（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2)或子類的免疫球 蛋白重鏈。結合蛋白可具有重鏈與輕鏈兩者。如本文所 用’術語結合蛋白亦包括抗體（包括全長抗體）、單株抗體 (包括全長單株抗體）、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特 異性抗體）、人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體、及抗體 160878.doc 201242977 片段（例如Fab片段、F(ab’）片段、藉由Fab表現文庫產生之 片段、以上任一者之抗原決定基結合片段）及抗體之經工 程改造形式（例如scFv分子），只要其展現所要活性，例如 結合目標抗原即可。 如本文所用之術語「抗體」泛指包含四個多肽鏈，即兩 個重（H)鏈及兩個輕（L)鏈之任何免疫球蛋白（Ig)分子或其 保留Ig分子之必需抗原決定基結合特徵之任何功能片段、 突變體、變異體或衍生物。此等突變、變異或衍生抗體形 式在此項技術中為已知的，且下文論述其非限制性實例。 在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變異區（在本文中縮 寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域 CHI、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變異區（在本文中縮 寫為LCVR或VL)及輕鍵恒定區。輕鏈怪定區包含一個域 CL。VH區及VL區可進一步再分為高變區（稱為互補決定區 (CDR))，其間穿插有更保守區，稱為構架區（FR)。各VH 及VL由按以下順序自胺基端排列至羧基端之三個CDR及四 個 FR 構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型（例如IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA及 IgY)、類別（例如 IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgAl 及 IgA2)或子類。 如本文所用之術語結合蛋白（例如抗體）之「抗原結合部 分」（或簡稱為「其抗原結合片段」）係指結合蛋白（例如抗 體）之保留特異性結合抗原之能力的一或多個片段。已顯 示結合蛋白（例如抗體）之抗原結合功能可由全長結合蛋白 160878.doc -51 - 201242977 (例如抗體）之片段執行。此等結合蛋白（例如抗體）實施例 亦可為雙特異性、雙重特異性或多特異性形式（特異性結 合兩個或兩個以上不同抗原）。術語結合蛋白（例如抗體）之 「抗原結合部分」内所涵蓋之結合片段的實例包括（i)Fab 片段，即由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段； (ii)F(ab')2片段’即包含在鉸鍵區處由二硫橋鍵連接之兩個 Fab片段的二價片段；（iii)Fd片段，其係由vh及CH1域組 成；（iv)Fv片段’其係由抗體之單一臂之VL及vh域組成； (v)dAb 片段（Ward (1989) Nature 341: 544-546 ;及 PCT公開 案第WO 90/05144 A1號），其包含單一可變異域；（vi)受 體-抗體（Rab)片段；及（vi)分離之互補決定區（Cdr)。此 外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH係由獨立基因編碼，但 其可使用重組方法藉由合成連接子接合，該連接子使其能 夠被製備成VL區與VH區配對形成單價分子之單一蛋白質 鏈（稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等人（1988) Science 242: 423-426 ;及 Huston等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。此等單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗 體之「抗原結合部分」内。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式， 諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中 VH域及VL域表現在單一多肽鏈上，但使用過短以致同一 鏈上之兩個域之間不能配對的連接子，藉此迫使該等域與 另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點（參見例如
Holliger，P.等人（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 ; Poljak，R.J.等人（1994) Structure 2: 1121- 160878.doc • 52· 201242977 1123)。此等結合部分在此項技術中為已知的（Kontermann 及Dubel編，Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.第 790 頁（ISBN 3-540-41354-5))。此外，單鏈 抗體亦包括「線抗體」，其包含連同互補輕鏈多肽一起形 成一對抗原結合區之一對串聯Fv區段（VH-CH1-VH-CHl)(Zapata等人（1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062及美 國專利第5,641，870號）。 術語「多價結合蛋白」在整篇本說明書中用於表示包含 兩個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。在一個實施例 中，多價結合蛋白經工程改造以具有三個或三個以上抗原 結合位點且通常不為天然產生之抗體，例如為分離及/或 重組抗體。在一個實施例中，多價結合蛋白經工程改造以 具有三個抗原結合位點。在另一實施例中，多價結合蛋白 經工程改造以具有六個抗原結合位點。 術語「多特異性結合蛋白」係指可結合兩個或兩個以上 相關或無關目標之結合蛋白。本發明之結合蛋白包含三個 或六個抗原結合位點且為三價或六價多價結合蛋白。本發 明之結合蛋白可為單特異性的，亦即能夠結合一個目標， 或為多特異性的，例如能夠結合兩個或兩個以上目標，亦 即兩個、三個、四個、五個或六個目標。 如本文所用，「雙重可變異域免疫球蛋白」或「DVD-IgTM」及其類似表述應理解為包括具有在圖1中示意性表 示及在美國專利公開案20100260668及20090304693中提供 之結構的免疫球蛋白分子，該兩個公開案均以引用的方式 160878.doc •53· 201242977 併入本文中，包括序列表e DVD-IgTM包含配對重鏈DVD 多肽及輕鏈DVD多肽，其中各配對重鏈及輕鏈提供兩個抗 原結合位點。各結合位點包括每個抗原結合位點有總計6 個CDR參與抗原結合。DVD-IgTM通常具有兩個臂（為二 價）’其中DVD之各臂為雙重特異性的，提供免疫球蛋白 四個結合位點。 如本文所用之術語「雙特異性抗體」係指藉由以下技術 產生之全長抗體：四源雜交瘤技術（參見MUstein，c.及
Cuello, A.C. (1983) Nature 305(5934):第 537-540頁）；使 兩個不同單株抗體化學結合（參見Staerz，u D等人（1985) Nature 314(6012): 628-631);或將突變引入Fc區中之孔中 鈕技術或類似方法（參見HoUiger，p等人（1993) Pr〇c Nau
Acad· Sci USA 90(14): 6444-6448) ’ 該等技術產生多個不
牙一瓦培合之抗原的相同抗原。 如本文所用之術語「雙重特異性結合蛋白 」係指可在兩 160878.doc
S •54· 201242977 個結合臂（一對HC/LC)之 ^ τ、，，。合兩個不同抗原f劣浐 原決定基）之全長抗體（參見prT、 』仉原（次杬 (參見PCT公開案第WO 02/02773 號）。因此，雙重特異性結合 贫白具有兩個具有相同特異 性及相同CDR序列之相同抗e纟士 、 ^ 一 沉原、，°合臂，且對於其結合之各 抗原而s為一價的。在木發明夕 .^ 杜尽發明之一個實施例中，tvd_ 白質為雙重特異性的，因τ ⑽a TVD-Ig蛋白f之兩個臂在以 下方面為相同的：各结人劈（_ + 一如 〇 口 #上之二個可變異域之兩者各獨 立地結合第一抗原且各结合臂卜
合、、口口 f上之第二可變異域結合不同 第二抗原。 如本文所用，「受體_抗體免疫球蛋白」<及 其類似表述應理解為包括在美料利申請案繼心2則 中提供之免疫球蛋白分子’豸申請案以引用的方式併入本 文中’包括序列表。RAb_Ig&含重鏈RAb多肽及輕鍵驗 多肽，其-起形成總計三個抗原結合位點。—個抗原結合 位點係藉由以下方式形成：重鏈RAb多肽及輕鏈RAb多肽 之每一者中存在之重抗體可變異域與輕抗體可變異域配對 形成具有總計6個CDR之單一結合位點，從而提供第一抗 原結合位點。重鏈RAb多肽及輕鏈RAb多肽各包括獨立結 合配體之受體序列，從而提供第二及第三「抗原」結合位 結合蛋白質之「功能性抗原結合位點」為可結合目標抗 原之位點。抗原結合位點之抗原結合親和力不必與抗原結 合位點所源於之親本結合蛋白（例如抗體）一樣強，但結合 抗原之能力必須可使用已知用於評估抗體與抗原結合之多 160878.doc -55- 201242977 種方法的任一者量測。此外， r 本文之多價結合蛋白（例如 抗體）之各抗原結合位點的y s ^ a ”的彳几原、，、α合親和力無需在數量上 相同。 術°。77離之蛋白質」或「分離之多肽」係指由於起源 或衍f來源而不與原生狀態中所伴隨之天然締合組分締 合’貫質上不含來自同一物種之其他蛋白質；由來自不同 物種之細胞表現；或在自然界中 因此，化學合成或在不同於天然 不存在的蛋白質或多肽。 起源細胞之細胞系統中合 成的多肽將與其天㈣合組分「分離」。#由使用此項技 術中熟知之蛋白質純化技術進行分離，亦可使蛋白質實質 上不含天然締合組分。 如本文所用之術語「回收」係指藉由例如使用此項技術 中熟知之蛋白質純化技術進行分離，使化學物質（諸如多 肽）實質上不含天然締合組分之過程。 如本文所用《「生物活性」係指分子之任何一或多種固 有生物性質（如活體内可見之天然存在之性質，或藉由重 組手段提供或賦予之性質卜生物性質包括（但不限於）結合 受體、誘導細胞增殖、抑制細胞生長、誘導其他細胞激 素、誘導細胞凋亡及酶促活性。生物活性亦包括1§分子之 活性。 術語「細胞激素」為由一個細胞群體釋放之以細胞間介 體形式作用於另一細胞群體之蛋白質的通用術語。此等細 胞激素之實例為淋巴激素、單核球激素及傳統多肽激素。 細胞激素包括生長激素’諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯 160878.doc -56- 201242977 基人類生長激素及牛生長激素；副曱狀腺激素；甲狀腺 素’胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激 素’諸如促濾泡素（FSH)、促甲狀腺素（TSH)及促黃體激素 (LH)，肝生長因子；纖維母細胞生長因子；泌乳素；胎盤 生乳素；腫瘤壞死因子·α及腫瘤壞死因子_β ;穆勒氏管抑 制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管 内皮生長因子；整合素；血小板生成素（τρ〇);神經生長 因子，諸如NGF-α ;血小板生長因子；胎盤生長因子；轉 化生長因子（TGF) ’諸如TGF-α及TGF-β ;胰島素樣生長因 子-1及胰島素樣生長因子-11 ;紅血球生成素（EP〇);骨生 成誘導因子；干擾素’諸如干擾素_a、干擾素_卩及干擾素_ γ ;群落刺激因子（CSF)，諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒 細胞巨噬細胞-CSF(GM-CSF);及粒細胞-CSF(G-CSF);介 白素（IL)，諸如11^1、11^2、11^3、11^4、11^5、11^6、1[-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23及IL-33 ;腫瘤壞死因子，諸如 TNF-a或TNF-β ;及其他多肽因子，包括LIF及kit配體 (KL) ^如本文所用，術語細胞激素包括來自天然來源或重 組細胞培養物之蛋白質及原生序列細胞激素之生物活性相 等物。 如本文所用之術語「單株抗體（monoclonal antibody)」 或「單株抗體（monoclonal antibody)」係指自實質上均質 之抗體之群體獲得的抗體，亦即除可以少量存在之可能天 然產生之突變外，構成該群體之個別抗體為相同的。單株 16087B.doc -57- 201242977 抗體針對單一抗原具有高*姓s认 、穷间度特異性。此外，與通常包 對不同決定子（抗原決定基） 計 丞）之不同抗體的多株抗體製劑不 同’各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單 株」不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。 如本文所用之術語「人類抗體」意欲包括具有源於人類 生殖系免疫球蛋白序列之可變異區及恆定區的抗體。本發 明之人類抗體可例如在CDR且特定言之CDR3中包括不由 人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如藉由 活體外隨機或位點特異性誘變法或藉由活體内體細胞突變 引入之突變）。然而，如本文所用之術語「人類抗體」不 意欲包括源於另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之生殖系之 CDR序列已移植至人類構架序列上的抗體。 如本文所用之術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組 手段製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用 轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體（在以下第 IIC章節中進一步描述）、自重組組合人類抗體文庫分離之 抗體（Hoogenboom，H.R. (1997) TIB Tech· 15: 62-70 ; Azzazy，Η.及 Highsmith，W.E. (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445 ； Gavilondo, J. V.及 Larrick, J.W. (2002)
BioTechniques 29: 128-145 ; Hoogenboom，H.及 Chames，P. (2000) Immunol. Today 21:_371-378)、自人類免疫球蛋白 基因之轉殖基因動物（例如小鼠）分離之抗體（參見Taylor，L. D.等人（1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295 ；
Kellermann，S-A.及 Green，L.L. (2002) Cur. Opin. in 160878.doc -58 * 201242977 •otechnol. 13. 593-597，Little，Μ·等人（2000) Immunol.
Today 21: 364-370)、或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序 列剪接至其他DNA序列之任何其他手段製備、表現、產生 或分離之抗體。此等重組人類抗體具有源於人類生殖系免 疫球蛋白序列之可變異區及恆定區。然而’在某些實施例 中’使此等重組人類抗體進行活體外誘變法（或當使用人 類Ig序列之轉殖基因動物時，使其進行活體内體細胞誘變 法）且因此重組抗體之VH區及VL區之胺基酸序列為儘管源 於人類生殖：系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL序列 相關’但可能並不活體内天然存在於人類抗體生殖系譜系 内的序列。 「親和力成熟」抗體為在一或多個CDR中具有一或多個 變化之抗體’該（等）變化使抗體對抗原之親和力相較於不 具有彼（等）變化之親本抗體得以改良。例示性親和力成熟 抗體對目標抗原將具有奈莫耳或甚至皮莫耳（pic〇rn〇iar)級 親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知之程序產 生。Marks 等人（1992) Bio/Technology 10: 779-783 描述藉 由VH及VL域改組進行親和力成姑。以下文獻描述cdR及/ 或構架殘基之隨機誘變法：Barbas等人（1994)卩1：〇〇仏1 Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 ; Schier 等人（1995) Gene 169: 147-155 ; Yelton等人（1995) J. Immunol. 155: 1994· 2004; Jackson等人（1995) J. Immunol. 154(7): 3310-9;及 Hawkins等人（1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896 ;且在美國 專利第6,914，128號中描述在選擇性誘變位置、接觸或超突 -59- 160878.doc 201242977 變位置處以活性增強型胺基酸殘基進行選擇性突變。 術語「嵌合抗體」係指包含來自某一物種之重鏈及輕鏈 可變異區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，諸如 具有鼠類重鏈及輕鏈可變異區連接於人類恆定區之抗體。 術語「CDR移植抗體」係指包含來自某一物種之重鍵及 輕鏈可變異區序列但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之 序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有一或多 個鼠類CDR(例如CDR3)已經人類CDR序列置換之鼠類重鏈 及輕鏈可變異區的抗體。 術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種（例如小 鼠）之重鏈及輕鏈可變異區序列，但其中VH及/或VL序列 之至少一部分已經改變而更「類人類」，亦即更類似於人 類生殖系可變異序列的抗體。一種類型之人類化抗體為 CDR移植抗體’其中將人類CDR序列引入非人類vh及VL 序列令以置換相應非人類CDR序列。「人類化抗體」亦為 免疫特異性結合相關抗原且包含實質上具有人類抗體之胺 基酸序列之FR區及實質上具有非人類抗體之胺基酸序列之 CDR區的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。如本 文所用，術語「實質上」在CDR之情形下係指cdr具有與 非人類抗體CDR之胺基酸序列至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%—致的胺基酸序列。 人類化抗體包含至少一個且通常兩個可變異域（pab、 Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)之實質上全部，其中全部或實質 上全部CDR區對應於非人類免疫球蛋白（亦即供者抗體）之 160878.doc •60· 201242977 CDR區且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白共同序 列之FR區。在一個實施例中，人類化抗體亦包含免疫球蛋 白Fc區（通常為人類免疫球蛋白之Fc區）之至少一部分。在 一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變 異域。抗體亦可包括重鏈之CH1區、鉸鏈區、CH2區、 CH3區及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人 類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重 鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈及/或人類 化重鏈之人類化可變異域。 術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在 本文中可互換使用。此項技術中公認之此等術語係指對比 抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變異區中之其他胺 基酸殘基更可變（亦即高變）之胺基酸殘基編號的系統 (Kabat 等人（1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 ;及 Kabat, Ε.Α·等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH出版物編號91-3242)。對 於重鏈可變異區，CDR1之高變區在胺基酸位置31至35之 範圍内，CDR2之高變區在胺基酸位置50至65之範圍内， 且CDR3之高變區在胺基酸位置95至102之範圍内。對於輕 鏈可變異區，CDR1之高變區在胺基酸位置24至34之範圍 内，CDR2之高變區在胺基酸位置50至56之範圍内，且 CDR3之高變區在胺基酸位置89至97之範圍内。 如本文所用，術語「CDR」係指結合蛋白（例如抗體）可 160878.doc -61 - 201242977 變異序列内之互補決定區。重鏈及輕鏈之各可變異區中存 在三個CDR，各可變異區之該三個CDR稱為CDR1、CDR2 及CDR3。如本文所用之術語「CDR組」係指存在於單一 可變異區中可結合抗原之三個CDR之群。此等CDR之確切 邊界已根據不同系統不同地加以界定。Kabat所述之系統 (Kabat 等人（1987; 1991) Sequences of Proteins of
Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda，Md.)不僅提供適用於結合蛋白（例如抗體）之任何 可變異區的明確殘基編號系統，而且亦提供界定三個CDR 之確切殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及 其同事（Chothia及 Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 ; 及 Chothia等人（1989) Nature 342: 877-883)發現 Kabat CDR 内之某些子部分即使在胺基酸序列層面上具有極大多樣 性，但亦採用幾乎相同之肽主鏈構形。此等子部分稱為 LI、L2及L3或HI、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示 輕鏈區及重鏈區。此等區可稱為Chothia CDR，其具有與 Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR之 其他邊界已由 Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 及
MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-45描述。其他 CDR邊界界定可能不嚴格遵循本文中之一個系統，但仍將 與Kabat CDR重疊，然而根據特定殘基或殘基群或甚至整 個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗研究結果，其可 能會縮短或延長。本文中所用之方法可利用根據此等系統 之任一者所界定之CDR，但某些實施例使用Kabat或 160878.doc -62· 201242977
Chothia界定之 CDR。 如本文所用，術語「構架」或「構架序列」係指可變異 區減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之確切界定可由不 同系統確定，所以構架序列之含義遵循相應不同解釋。六 個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3以及重鏈之 CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區 在各鏈上分成四個子區（FR1、FR2、FR3及FR4)，其中 CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且 CDR3位於FR3與FR4之間。在不將特定子區規定為FR1、 FR2、FR3或FR4之情況下，構架區當以其他名稱提及時代 表天然產生之單一免疫球蛋白鏈之可變異區内的組合FR。 如本文所用，一個FR代表四個子區之一，且多個FR代表 構成構架區之四個子區之兩者或兩者以上。 如本文所用，術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」 係指由未經歷導致遺傳重排及突變以表現特定免疫球蛋Θ 之成熟過程之非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列（參見例 如 Shapiro 等人（2002) Crit· Rev· Immunol. 22(3): 183-200 ;
Marchalonis等人（2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484: 13-30) 0 由本發明之多個實施例提供之一個優點基於以下認知··生 殖系抗體基因比成熟抗體基因更可能保留物種中個體& # 需胺基酸序列結構特徵，因此當在治療上用於彼物種+ 時，被識別成來自外來來源之可能性較小。 如本文所用，術語「中和」係指當結合蛋白特異性結合 抗原時抵消抗原之生物活性。在一個實施例中，中和，结合 160878.doc -63· 201242977 蛋白結合細胞激素且使其生物活性降低至少約2〇%、 40%、60%、80%、85%或 85%以上。 術語「活性」包括TVD結合蛋白對兩個或兩個以上抗原 之活性’诸如結合特異性及親和力。 術語「抗原決定基」包括可特異性結合免疫球蛋白或τ 細胞受體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定 基決定子包括分子之化學活性表面基團（諸如胺基酸、糖 側鏈、填醯基或磺醯基），且在某些實施例中，其可具有 特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗原決定基為抗 原之由結合蛋白（例如抗體）結合之區域。因此，抗原決定 基由抗原（或其片段）之已知會結合特異性結合搭配物上之 互補位點之區域的胺基酸殘基組成。抗原性片段可含有一 個以上抗原決定基。在某些實施例中，當結合蛋白（例如 抗體）識別其在蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中之目標 抗原時’稱該結合蛋白（例如抗體）特異性結合抗原。若結 合蛋白（例如抗體）交又競爭（一種結合蛋白阻止另一結合蛋 白之結合或調節效應），則稱該等結合蛋白（例如抗體）「結 合相同抗原決定基」。此外，抗原決定基之結構定義（重 疊、類似、相同）提供豐富資訊，但因為功能定義涵蓋結 構（結合）及功能（調節、競爭）參數，所以其通常更相關。 本文所用之術語「表面電漿子共振」係指允許藉由例如 使用 BIAcore® 系統（BIAcore International AB, 〇Ε Healthcare公司，Uppsala，Sweden及 Piscataway，NJH貞測生 物感測器基質内蛋白質濃度之改變來分析即時生物特異性 160878.doc •64- 201242977 相互作用的光學現象。關於進一步描述，參見j0nsson，U. 等人（1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jdnsson，U.等人 (1991) Biotechniques 11: 620-627 ; Johnsson，B.等人（1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131 ;及 Johnnson，B.等人（1991) Anal· Biochem. 198: 268-277。 如本文所用之術语「Kon」意欲指代如此項技術已知， 結合蛋白（例如抗體）與抗原締合以形成例如抗體/抗原複合 物之締合速率常數。「Kon」亦已知為如在本文中可互換使 用之術語「締合速率常數」或「ka .」。指示抗體與其目標 抗原之結合速率或抗體與抗原之間的複合物形成速率之此 值亦藉由方程式：抗體（「Ab」）+抗原（「Ag」）—八13_八§展 示0 如本文所用之術語「Koff」意欲指代如此項技術中已 知’結合蛋白（例如抗體）自例如抗體/抗原複合物解離之解 離速率常數。「Koff」亦已知為如在本文中可互換使用之術 語「解離速率常數」或「kd」。此值指示抗體自其目標抗 原解離或Ab-Ag複合物隨時間推移分離成游離抗體及抗原 之解離速率’如由方程式：Ab+Ag—Ab-Ag所示。 如在本文中可互換使用之術語「平衡解離常數」或 「KD」係指在滴定量測中在平衡時獲得之值或藉由用解離 速率常數（koff)除以締合速率常數（k<jn)獲得之值。締合速率 常數、解離速率常數及平衡解離常數用於表示結合蛋白 (例如抗體）與抗原之結合親和力。測定締合及解離速率常 數之方法在此項技術中為熟知的。使用基於螢光之技術提 160878.doc •65- 201242977 供檢查在平衡狀態下生理緩衝液中之樣品的高靈敏度及能 力。可使用其他實驗方法及儀器，諸如BIAcore⑧（生物分 子相互作用分析）分析（例如儀器可自BIACOre lnternatiQnal AB，GE Healthcare公司，Uppsala，Sweden購得）。另外，亦 可使用可自 Sapidyne Instruments(Boise, Idaho)購得之 KinExA®(動力學排除分析（Kinetic Exclusion Assay))分 析。 「標記」及「可偵測標記」意謂連接於特異性結合搭配 物（諸如抗體或分析物）例如以使特異性結合對之成員（諸如 抗體及分析物）之間的反應可偵測之部分，且如此經標記 之特異性結合搭配物（例如抗體及分析物）稱為「經可彳貞測 標記」。因此，如本文所用之術語r經標記之結合蛋白」 係指併有提供對結合蛋白之鑑別之標記的蛋白質。在一個 實施例中，標記為可產生可藉由目視或儀器手段偵測之信 號的可偵測標S己’例如併入經放射性標記之胺基酸或連接 於具有可由經標記抗生蛋白（avidin)(例如含有可藉由光學 或比色方法偵測之螢光標記或酶促活性之抗生蛋白鏈菌素 (streptavidin))偵測之生物素基部分的多肽。用於多肽之標 記之實例包括（但不限於）下列標記：放射性同位素或放射 性核種（例如3H、丨4C、35S、90Y、99Tc、丨丨丨In、丨25ι、丨4、
Lu、 Ho及153Sm);色素原；螢光標記（例如fitc、若 丹明（rhodamine)及鑭系金屬磷光體）；酶標記（例如辣根過 氧化酶（horseradish peroxidase)、螢光素酶（luciferase)及鹼 性填酸醋酶（alkaline phosphatase));化學發光標記；生物 160878.doc • 66 - 201242977 素基；由第二報導體識別之預定多肽抗原決定基（例如白 胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域及抗 原決定基標籤）；及磁性劑，諸如乳螯合物。通常用於免 疫分析之標記之代表性實例包枯發光部分（例如°丫咬鑌 (acridinium)化合物）及發勞光部分（例如螢光素 (fluorescein))。本文中描述其他梯§己。就此而吕’部分本 身可能未經可偵測標記但在與另/部分反應後可變得可债 測《使用「經可偵測標記」意欲涵蓋後一類型之可偵測標 記。 術語「結合物」係指結合蛋白（諸如抗體）化學連接於第 二化學部分（諸如治療劑或細胞毒性劑）°術語「藥劑」在 本文中用於表示化合物、化合物之丨合物、生物巨力子或 自生物材料製備之提取物。在一個實施例中，治療劑或細 胞毒性劑包括（但不限於）百曰咳毒素（Pertussis toxin)、紫 杉醇（taxol)、細胞鬆弛素B(cyt〇chalasin B)、短桿菌肽 D(gramicidin D)、漠化乙鍵、吐·根素（emetine)、絲裂徽素 (mitomycin)、依託泊苷（etoposide)、特 s去波赛（ten0P0Side)、 長春新鹼（vincristine)、長春鹼（vinblastine)、秋水仙驗 (colchicin)、小紅葛（doxorubicin)、道諾徽素（daunorubicin)、 二經基炭疽菌素二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽 酿（mitoxantrone)、光神黴素（mithramycin)、放線菌素 D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮（l-dehydrotestosterone)、 糖皮質激素（glucocorticoids)、普魯卡因（procaine)、四卡 因（tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普萘洛爾（propranolol) 160878.doc -67- 201242977 及嗓吟黴f (pUr〇mycin)及其類似物或同系物。當在免疫分 析之情形下使用時，結合抗體為用作偵測抗體之經可價測 標記之抗體。 如本文所用之術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式 存在之結合蛋白(例如抗體)或其抗原結合部分。晶體為物 質之-種固態形式，其不同於諸如非晶固態或液晶態之其 他形式。晶體由原子、離子、分子（例如蛋白質，諸如抗 體）或分子裝配體（例如抗原/抗體複合物）之規則重複三維 陣列構成。此等二維陣列係根據此領域中充分瞭解之特定 數學關係排列。晶體中重複之基本單元或構築嵌段稱為不 對稱單元。不對稱單元以符合既定明確晶體學對稱性之排 列進行重複可k供晶體之「單位晶胞」。單位晶胞在所有 三個維度中藉由規則平移進行重複可提供晶體。參見
Giege，R.及 Ducmix，A· Banrett，Crystallization 〇f Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，第 2版，第 201-16 頁 ’ Oxford University Press，New York，New York， (1999)。 術si·「聚核苦酸」意謂兩個或兩個以上核苦酸（核糖核 苷酸或去氧核苷酸或任一類型之核苷酸之經修飾形式）之 聚合形式。該術語包括DNA之單股及雙股形式。 術語「分離之聚核苦酸」將意謂一種聚核脊酸（例如基 因組、cDNA或合成來源之聚核苷酸或其某種組合），由於 其來源’該「分離之聚核普酸」不與在自然界中發現與該 「分離之聚核苷酸」在一起之聚核苷酸的全部或一部分締 160878.doc -68- 201242977 合；可操作地連接於在自然界t不與其連接之聚核苷酸； 或在自然界中不作為較大序列之一部分存在。 術語「載體」意欲指代能夠轉運已連接之另一核酸的核 酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指内部可連接 其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類型之载體為病毒 載體’其中可將其他DNA區段連接於病毒基因組中。某些 載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製（例如具 有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物载體其 他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞中 後整合至宿主細胞之基因組中，且藉此連同宿主基因組一 起複製。此外，某些載體能夠指導與其可操作地連接之基 因的表現。此等載體在本文中稱為「重組表現載體」（或 簡稱為「表現載體」）。一般而言，適用於重組DNA技術 中之表現載體常呈質體形式。因為質體為載體之最常用形 式，所以在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使 用。然而’本發明意欲包括表現載體之起相等作用之此等 其他形式，諸如病毒載體（例如複製缺陷型反轉錄病毒、 腺病f及腺相關病毒）。 術語「可操作地連接」係指所述組分呈允許其以其預定 方式起作用之關係的併接。控制序列「可操作地連接」於 編碼序列係以編碼序列之表現在可與控制序列相容之條件 下達成的方式連接。「可操作地連接」之序列包括與相關 基因鄰接之表現控制序列與以反式或在一定距離下起控制 相關基因之作用之表現控制序列兩者。 160878.doc -69- 201242977 如本文所用之術語「表現控制序列」係指為實現編碼序 列之表現及加工所必需連接的聚核苷酸序列。表現控制序 列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列；高效 RNA加工信號’諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質 mRNA穩定之序列；增強轉譯效率之序列（亦即，Kozak共 同序列），增強蛋白質穩定性之序列；及必要時增強蛋白 質分泌之序列。此等控制序列之性質視宿主生物體而不 同；在原核生物中，此等控制序列一般包括啟動子、核糖 體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，此等控制序 列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意 欲包括為進行表現及加工所必需存在之組分，且亦可包括 宜存在之其他組分，例如前導序列及融合搭配物序列。 轉型」係指使外源DNA進入宿主細月包中之任何過程。 可使用此項技術中熟知之多種方法，在天然或人工條件下 進行轉型。轉型可憑藉用於將外來核酸序列插入原核或真 核宿主細胞令之任何已知方法。方法係基於所轉型之宿主 細胞加以選擇且可包括(但不限於)病毒感染、電穿孔、脂 質體轉染及粒子轟擊。此笙「# 彝拏此等轉型」細胞包括所插入之 D Ν Α能夠以自主複製質體报,ιλ ., 是教負媸形式或作為宿主染色體之一部分 複製的穩定轉型細胞。其亦包括在有限時期内短暫表現插 入之DNA或RNA的細胞。 術語「重組宿主細胞」（或簡稱為「宿主細胞」）意欲指 代已引入外源舰之細胞。應瞭解此等術語不僅意欲指代 特定個體細胞，而且亦指代該種細胞之子代。因為某此終 160878.doc •70· 201242977 飾可由於突變或環境影響而在繼代中發生，所以此子代實 際上可能不與母細胞相同，但仍包括在如本文所用之術語 伯主細胞」之範疇内。在一個實施例中，宿主細胞包括 選自生物界之任一者之原核細胞及真核細胞。在另一實施 例中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。 在另一實施例中’宿主細胞包括（但不限於）原核細胞株大 腸桿菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293、COS、NS0、 SP2及PER.C6 ;昆蟲細胞株Sf9 ;及真菌細胞釀酒酵母。 標準技術可用於重組DNA、募核苷酸合成及組織培養及 轉型（例如電穿孔、脂質體轉染）。酶促反應及純化技術可 根據製造商說明書或如此項技術中通常所達成或如本文所 述來進行。上述技術及程序可通常根據此項技術中熟知及 如本說明書整篇引用及論述之多種一般性及更具體之參考 文獻中所述的習知方法來執行。參見例如Sambrook等人 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第 2版’
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) 〇 如此項技術中已知之「轉殖基因生物體」係指具有含有 轉殖基因之細胞的生物體，其中引入生物體（或生物體之 祖先）中之轉殖基因表現不在該生物體中天然表現之多 肽°「轉殖基因」為穩定且可操作地整合至可發育成轉殖 基因生物體之細胞之基因組中，從而指導所編碼基因產物 於轉殖基因生物體之一或多個細胞類型或組織中表現的 DNA構築體。 160878.doc -71· 201242977 術語調控（regulate)」與「調節（m〇dulate)」可互換使 用，且如本文所用，係指改變或變化相關分子之活性（例 如細胞激素之生物活性）。調節可為增加或降低相關分子 之某一活性或功能之量值。分子之例示性活性及功能包括 (但不限於）結合特徵、酶促活性、細胞受體活化及信號轉 導。 相應地’術S吾「調節劑」為能夠改變或變化相關分子之 活性或功能（例如細胞激素之生物活性）之化合物。舉例而 言，調節劑可引起分子之某一活性或功能之量值相較於在 不存在調節劑下所觀測到之活性或功能之量值增加或減 小。在某些實施例中，調節劑為降低分子之至少一種活性 或功能之量值的抑則卜例示性抑制冑包括（但π限於）蛋 白質、肽、抗體、肽體（peptibody)、碳水化合物或小有機 分子。肽體描述於例如PCT公開案第〜〇〇1/83525號令。 術語「促效劑」係指當與相關分子接觸時會引起分子之 某一活性或功能之量值相較於在不存在促效劑下所觀測到 之活性或功能之量值增加的調節劑m目關促效劑可包 括（但不限於）多肽、核酸、碳水化合物及結合抗原之任何 其他分子。 術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指當與相關分子接觸時 會引起分子之某一活性或功能之量值相較於在不存在拮抗 劑下所觀測到之活性或功能之量值降低的調節劑。特定相 關拮抗劑包括阻斷或調節抗原之生物或免疫活性之拮抗 劑。抗原之拮抗劑及抑制劑可包括（但不限於）蛋白質、核 160878.doc -72· 201242977 酸、碳水化合物及結合抗原之任何其他分子。 如本文所用，術語「有效量」係指足以降低或改善病症 或其一或多種症狀之嚴重性及/或持續時間；抑制或預防 病症進展·，引起病症消退；抑制或㈣與病症相關之一或 多種症狀復發、發展、發作或進展；偵測病症，或增強或 改良另一療法（例如防治劑或治療劑）之防治或治療效應的 療法之量。
「患者」與「個體」在本文中可互換使用來指代動物， 諸如哺乳動物，包括靈長類動物（例如人類、猴及黑猩 猩）、非靈長類動物（例如母牛、豬、路欺、美洲轮 (Hama)、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、天竺鼠㈣^ P g) I田狗大鼠、小鼠及録）、禽類（例如鴨或鶴）及1 魚。較佳地，患者或個體為人類，諸如正針對疾病、病症 或病狀進行治療或評估之人類、處於疾病、病症或病狀風 險中之人類、患有疾病、病症或病狀之人類及/或正針 對疾病、病症或病狀進行治療之人類。 如本文所狀術語「樣品」細其最廣泛意義使用。如 本文所用之「生物樣品」包括（但不限於）來自活物⑴— 如㈣或先前為活物之任何量的物質。此等活物包括（但不 人類、小鼠、大鼠、猴、狗、兔及其他動物。此等 物質包括(但不限於)金液(例如全血).、血漿、企清、尿' 、滑液、Θ皮細胞、白血球、單核細胞、其他細胞、 态吕、組織、骨髓、淋巴結及脾。 「組分」及「至少一錄 ^種組分」一般係指可包括於套組中 160878.doc -73- 201242977 以根據本文所述之方法及此項技術中已知之其他方法分析 測試樣品（諸如患者尿、血清或血漿樣品）之捕捉用結合蛋 白（例如抗體）、偵測或結合用結合蛋白（例如抗體）、對 照、校準劑、一系列校準劑、靈敏度組（sensitivity panel) '容器、緩衝劑、稀釋劑、鹽、酶、酶之輔因子、 偵測試劑、預處理試劑/溶液、受質（例如呈溶液形式）、終 止溶液及其類似物。因此，在本發明之情形下，「至少一 種組分」及「組分」可包括如上之多肽或其他分析物諸 如包含分析物（諸如多肽）之組合物，其視情況諸如藉由結 合抗分析物（例如抗多肽）抗體而固定在固體支撐物上。一 些組分可呈溶液形式或經凍乾以在復原後用於分析中。 「對照」係指已知不含分析物（「陰性對照」）或含有分 析物（「陽性對照」）之組合物。陽性對照可包含已知濃度 之分析物。「對照」、「陽性對照」及「校準劑」在本文中 可互換使用來指代包含已知濃度之分析物的組合物。「陽 性對照」可用於確定分析效能特徵且為試劑（例如分析物） 之完整性的適用指示劑。 「預定截斷」及「預定程度」通常係指用於藉由將分析 結果相對於預定截斷/程度進行比較來評估診斷/預後/治療 功效結果的分析截斷值，其中預定截斷/程度已與各種臨 床參數（例如疾病之嚴重性、進展/無進展/改良等）相聯繫 或相關聯。儘管本發明可提供例示性預定程度，但熟知的 是截斷值可視分析，諸如免疫分析之性質（例如所用抗體 等）而變化。另外’針對其他分析，例如免疫分析來調適 160878.doc -74· 201242977 本發明以基於本發明獲得用於彼等其他免疫分析之免疫分 析特定截斷值完全屬於此項技術中之人士的一般技能《儘 管各分析的預定載斷/程度之確切值可變化，但如本文所 述之相關性（若存在）應普遍適用。 如本文所述之診斷分析中所用之「預處理試劑」（例如 溶解、沈澱及/或增溶試劑）為使存在於測試樣品中之任何 細胞溶解及/或使存在於測試樣品中之任何分析物增溶的 試劑。如本文中進一步所述，預處理並不為所有樣品所必 需。使分析物（例如相關多肽）增溶尤其可能導致分析物自 存在於樣品中之任何内源性結合蛋白釋放。預處理試劑可 為均質的（無需分離步驟）或異質的（需要分離步驟）。在使 用異質預處理試劑之情況下，在進行分析之下一步驟之前 需要自測试樣品移除任何沈澱之分析物結合蛋白。 「品質控制試劑」在本文所述之分析（例如免疫分析）及 套組的情形下包括（但不限於）校準劑、對照及靈敏度組。 通常使用「校準劑」或「標準物」（例如-或多個，諸如 複數個）來建立用於内插分析物（諸如抗體或分析物）之濃度 ㈣準（標準）曲線。或者’可❹接近狀陽性/陰性截斷 之單校準劑。可聯合使用多種校準劑（亦即一種以上校 準劑或不同量之校準劑）以構成「靈敏度組」。 &「風險」係指目前或在將來某個時點發生特定事件之可 能性或機率。「風險分層」係指允許醫師將患者分類成具 ::展特定疾病、病症或病狀之低、中等、高或最高風險 的一系列已知臨床風險因素。 160878.doc -75- 201242977 「特異性（Specific)」及「特異性（specificity)」在特異 性結合對之成員（例如抗原（或其片段）與結合蛋白（例如抗 體）（或其抗原反應性片段））之間的相互作用之情形下係於 相互作用之選擇性反應性。片語「特異性結合」及類似片 語俾指例如抗體（或其抗原反應性片段）特異性結合分析物 (或其片段）且不特異性結合其他實體之能力。特異性結合 應理解為優先結合某一抗原、抗原決定基、受體配體或結 合搭配物，比結合對照非特異性抗原、抗原決定基、受體 配體或結合搭配物優先至少丨〇3、ι〇4、ι〇5、1〇6、ι〇7、 ^ 1 〇、1 0倍。選擇適當非特異性對照之方法屬於熟習此項 技術者之能力。 「特異性結合搭配物」為特異性結合對之成員。特異性 結合對包含兩個不同分子，其經由化學或物理手段彼此特 異性結合。因此，除例如常見免疫分析之抗原與抗體特異 性結合對以外，其他特異性結合對可包括生物素與抗生蛋 白（或抗生蛋白鏈菌素）；碳水化合物與凝集素（lectin);互 補核苷酸序列；效應分子與受體分子；輔因子與酶；酶抑 _ 制劑與酶；及其類似物。此外，特異性結合對可包括作為 原始特異性結合成員之類似物的成員例如分析物類似 物。免疫反應性特異性結合成員包括分離或重組產生之抗 原、抗原片段及抗體（包括單株及多株抗體）以及其複合 物、片段及變異體（包括變異體之片段）。 如本文所用之「變異體」意謂因胺基酸之添加（例如插 入）、缺失或保守性取代而在胺基酸序列方面不同於既定 160878.doc
•76· S 201242977 多肽（例如 TNFa、PGE2、IL-12、IL-13、IL-18、 HMGB1、VEGF、RAGE、NGF、IL-la、IL-Ιβ、E-選擇 素、L-選擇素、醣蛋白（GP)IIb/IIIa、血栓調節蛋白、凝血 酶、TREM、PAI-I、ανβ3、uPA、Her2、IGF1R、EGFR、 CD3、Fey受體、NKG2D、P物質、CGRP、蛋白質c、因子 VII、因子IX、纖維蛋白溶酶原活化因子、因子v、因子
Vila、因子 X、因子 χΠ、因子 XIII、ciq、cir、Cls、 C4a、C4b、C2a、C2b、C、C3a及C3b多肽或抗多肽抗 體）’但保留既定多肽之生物活性（例如變異丨8可與抗 IL-1 8抗體競等結合IL-18)的多肽。此項技術中公認胺基酸 之保守性取代（亦即用具有類似性質（例如親水性及帶電區 程度及分佈）之不同胺基酸置換某一胺基酸）通常涉及微小 變化。如此項技術中所瞭解，可部分地藉由考慮胺基酸之 親水指數來鑑別此等微小變化（參見例如Kyte等人（丨982)】
Mol. Biol· 157: 105-132)。胺基酸之親水指數係基於對其 疏水性及電荷之考慮。此項技術中已知具有類似親水指數 之胺基酸可經取代且多肽仍將保留蛋白質功能。在一個態 樣中，親水指數為±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦 可用於揭示將產生保留生物功能之蛋白質的取代。對胺基 酸之親水性之考慮在肽之情形下允許計算彼肽之最大局部 平均親水性，其為一種已經報導與抗原性及免疫原性密切 相關之適用量度（參見例如美國專利第4,554，1〇1號卜如此 項技術中所瞭解，具有類似親水性值之胺基酸之取代可產 生保留生物活性（例如免疫原性）之肽。在一個態樣令用 160878.doc -77- 201242977 親水性值在±2内之胺基酸彼此進行取代。胺基酸之疏水性 指數與親水性值兩者均受彼胺基酸之特定側鏈影響。與彼 觀測結果一致，可與生物功能相容之胺基酸取代據瞭解係 視胺基酸，且特定言之彼等胺基酸之側鏈之相對類似性 (如由疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他性質所揭示）而 定。「變異體」亦可用於描述已諸如藉由蛋白水解、墙酸 化或其他轉譯後修飾進行差異性加工但仍保留生物活性或 杬原反應性（例如結合IL_18之能力）之多肽或其片段。除非 上下文另外相反說明，否則本文中使用「變異體」意欲涵 蓋變異體之片段。 I·產生TVD結合蛋白 本發明係關於可結合一或多個目標之包含三個或六個抗 原結合位點之三可變異域（TVD)結合蛋白及其製備方法。 圖1提供本發明之一例示性TVD結合蛋白之結構的示意 圖〇 一般而言，本發明之結合蛋白包含多肽鏈，其中該多
鍵包含 VDK(X1)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中 VD1 第一可變異域’ VD2為第二可變異域，彻為第三可變 域，C為恆定域，X1為第-連接子，X2為第二連接子，: 為Fc區且η為〇或1。 在例示性實施例中，「vm」、「VD2」及「彻」各獨 地為重鍵可變異域或輕鏈可變異域。除非另外自上下文 〇 否則如本文所用，單獨「VD」應理解為重鏈 原結合域或輕鏈抗原結合域。 160878.doc
S •78· 201242977 在一個實施例中’ VD1為重鏈可變異域4另一實施例 中’VD2為重鏈可變異域。在另—實施例中，vd3為重鍵 可變異域。在-個實施例中，VD!為輕鏈可變異域。在另 -實施例中’ VD2為輕鏈可變異域。在另一實施例中， VD3為輕鏈可變異域。 在例示性實施例中，「XI」及「X2」各為連接子且 「η」各獨立地為〇或1。 在一個實施例_，（Χ1)η*〇。在另一實施例中，（χ1)η 為1。在另一實施例中，（乂2)11為〇。在另一實施例中， (Χ2)Π為1。在另一實施例中，（Χ2)η不為CH1且可為0或1。 在例示性實施例中，「C」為重鏈或輕鏈恆定域。應瞭 解，除非另外自上下文明確可知，否則如本文所用，單獨 C」可理解為重鍵怪定域或輕鏈怪定域。 在一個貫施例中’ C為輕鏈恆定域。在另一實施例中， C為重鏈恆定域。在另一實施例中，C為重鏈CH1域。在另 一實施例中，C為重鏈CH2域。在另一實施例中，c為重鏈 CH3域。在另一實施例中，c為重鏈CH4域。在一個實施 例中’ C不為重鏈CH1域。在另一實施例中，^不為重鏈 CH2域。在另—實施例中，C不為重鏈CH3域。在一個實 施例中，C不為重鏈(^114域。 在例不性實施例中’「（X3)n」為Fc區且「η」為0或1。 在一個實施例中，（又3)11為0。在另一實施例中，（X3)rl為 1 ° TVD結合蛋白包含兩個重鏈tvd多肽及兩個輕鏈TVD多 160878.doc -79- 201242977 肽且在本文中稱為「TVD-Ig蛋白質」或「TVD-Ig結合蛋 白」》TVD-Ig蛋白質之每一半包含一個重鏈TVD多肽及一 個輕鏈TVD多肽及三個抗原結合位點。各結合位點包含重 鏈可變異域及輕鏈可變異域，其中每個抗原結合位點有總 計六個CDR參與抗原結合。 在本發明之一個實施例中，TVD結合蛋白包含含有VD1 -(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鏈，其中 VD1 為第 一重鏈可變異域’ VD2為第二重鏈可變異域，VD3為第三 重鏈可變異域，C為重鏈恆定域，XI為第一連接子，χ2為 第二連接子，X3為Fc區，且η為0或1，其中該結合蛋白能 夠結合一至三個目標抗原。 在本發明之另一實施例中，TVD結合蛋白包含含有vdi- (Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鍵，其中 VD1 為第 一輕鏈可變異域’ VD2為第二輕鏈可變異域，VD3為第三 輕鏈可變異域，C為輕鏈恆定域，乂丨為第一連接子，Χ2為 第二連接子’ Χ3不包含Fc區，且η為〇或1 ;其中該結合蛋 白能夠結合一至三個目標抗原。 在一個實施例中’本發明之結合蛋白包含第一及第二多 肽鏈。在本發明之此實施例中，第一多肽鏈包含第一 VD1_ (Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中 VD1 為第一重鏈可 變異域，VD2為第二重鏈可變異域，VD3為第三重鏈可變 異域，c為重鏈恆定域，X1為第—連接子，χ2為第二連接 子，且Χ3為Fc區。第二多肽鏈包含第二乂以^丨沁乂叫· (X2)n-VD3-C-(X3)n ’其中VD1為第一輕鏈可變異域，VD2 160878.doc 201242977 為第二輕鏈可變異域，VD3為第三輕鍵可變異域，c為幸® 鏈恆定域，XI為第一連接子，X2為第二連接子，且幻不 包含Fc區且η為0或1，其中該結合蛋白能夠結合一至六個 目標抗原。 在另一實施例中’本發明之結合蛋白包含四個多肽鍵。 在本發明之此實施例中，第一及第三多肽鏈各獨立地包含 VDl-(Xi)n-VD2_(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中 VD1 為第一重 鍵可變異域’ VD2為第二重鏈可變異域，VD3為第三重鏈 可變異域，C為重鏈恆定域，XI為第一連接子，χ2為第二 連接子’ Χ3為Fc區’且η為〇或1。第二及第四多肽鏈各獨 立地包含 VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中 01為 第一輕鏈可變異域，VD2為第二輕鏈可變異域，VD3為第 三輕鏈可變異域，C為輕鏈恆定域，XI為第一連接子，χ2 為第一連接子’ Χ3不包含Fcg，且η為〇或1 ;其中該結合 蛋白能夠結合一至六個目標抗原。 用於本發明之結合蛋白中之可變異域可源於任何適合或 所要結合蛋白或自任何適合或所要結合蛋白獲得，該任何 適合或所要結合蛋白諸如編碼相關受體之多肽及/或親本 結合蛋白，例如結合相關目標抗原之抗體。親本結合蛋白 (例如抗體）可為結合相關目標抗原之任何適合結合蛋白， 例如抗體，包括（但不限於）嵌合抗體、多株抗體及單株抗 體。此等抗體可天然產生或可藉由重組技術產生。 用於本發明之結合蛋白中之可變異域可自相同或不同親 本結合蛋白’例如親本抗體獲得。在一個實施例中， 160878.doc • 81 · 201242977 VDl、VD2及VD3之兩者或兩者以上係獨立地自相同親本 結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得。在另一實施 例中，VDl、VD2及VD3各獨立地自相同親本結合蛋白（例 如抗體）或其抗原結合部分獲得。在一個實施例中，vm、 VD2及VD3之兩者或兩者以上係獨立地自不同親本結合蛋 白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得。在另一實施例中， VDl、VD2及VD3各獨立地自不同親本結合蛋白（例如抗 體）或其抗原結合部分獲得。 相同或不同親本結合蛋白（例如親本抗體）或其抗原結合鲁 部分可獨立地選自由人類抗體、CDR移植抗體及人類化抗 體組成之群。在另一實施例中，相同或不同親本抗體或其 抗原結合部分係獨立地選自由以下組成之群：Fab片段； F(ab·)2片段；包含在鉸鏈區處由二硫橋鍵連接之兩個 片段之二價片段；由VH&CH1域組成之以片段；由抗體之 單一臂之VL及VH域組成之Fv片段；dAb片段；分離之互 補決定區（CDR);單鏈抗體；Rab ;及雙功能抗體。 在不同親本結合蛋白（例如抗體）用於獲得相關可變異域 鲁 之本發明之實施例中，不同親本結合蛋白（例如抗體）或其 抗原結合片段可結合目標抗原上之相同抗原決定基或不同 抗原決定基。在不同親本結合蛋白（例如抗體）用於獲得相 關可變異域之本發明之實施例中，不同親本結合蛋白（例 如抗體）或其抗原結合片段可以不同效能及/或不同親和力 結合其各別目標抗原。 用於本發明之結合蛋白中之親本結合蛋白，例如親本抗 I60878.doc
-82- S 201242977 體可使用多種技術產生。本發明提供產生結合蛋白之表現 載體、宿主細胞及方法。 Α.產生親本結合蛋白 Α1.單株抗體 TVD結合蛋白之可變異域可自可結合相關抗原之親本結 合蛋白，例如抗體，包括多株抗體及單株抗體獲得。此等 抗體可天然產生或可藉由重組技術產生。
舉例而言，用於本發明之結合蛋白上之單株抗體可使用 此項技術中已知之廣泛多種技術製備，包括使用融合瘤、 重組及噬菌體呈現技術或其組合。舉例而言，單株抗體可 使用融合瘤技術產生，該等技術包括此項技術中已知及例 如以下教示者：Had〇w等人（1988) Antib〇dies: Α
Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, M2^)； Hammerling# λ(1981), Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier，N.Y.)。如本文所 用之術°°「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗 體術°株抗體」係指源於單一純系，包括任何真 核原核或喔菌體純系之抗體，而非係指由產生其之方法 產生的抗體。如以下實例i中所論述，選擇、選殖且針對 所需特徵(包括旺盛融合瘤生長、高抗體產量及所需抗體 特徵)進步師檢融合瘤。融合瘤可在同基因型動物、缺 乏免疫系統之動物(例如裸小鼠)中活體内培養及擴增或在 、胞σ養物中力體外培養及擴增。選擇、選殖及擴增融合 瘤之方法為—般技術者所熟知。在-特定實施财，融合 160878.doc -83· 201242977 瘤為小鼠融合瘤。在另一實施例中’融合瘤係在非人類非 小鼠物種’諸如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬中產生。 在另一實施例中’融合瘤為人類融合瘤，其中人類非分泌 性骨趟瘤與表現可結合特定抗原之抗體的人類細胞融合。
如美國專利第5,627,052號、PCT公開案第WO 92/02551 號及 Babcock, J.S.等人（1996) Proc· Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848中所述’亦使用此項技術中稱為選擇淋巴細 胞抗體法（SLAM)之程序自單一分離之淋巴細胞產生重組 單株抗體。在此方法中，鑑別分泌相關抗體之單一細胞 (例如源於經免疫動物之淋巴細胞），且藉由逆轉錄酶PCR 自細胞救援重鏈及輕鏈可變異區cDNa。可接著在適當免 疫球蛋白恆定區（例如人類恆定區）之情形下，在諸如c〇s 或CHO細胞之哺乳動物宿主細胞中表現此等可變異區。可 接著例如藉由淘選經源於活體内選擇之淋巴細胞之經擴增 免疫球蛋白序列轉染的宿主細胞以分離表現針對相關抗原 之抗體的細胞來對經轉染細胞進行進一步活體外分析及選 擇。經擴增免疫球蛋白序列可在活體外諸如藉由活體外親 和力成熟法（諸如PCT公開案第W0 97/29131號及第WO 00/56772號中所述者）進一步操作。 亦藉由用相關抗原使包含一些或全部人類免疫球蛋白基 因座的非人類動物免疫來產生單株抗體。在一個實施例 中’非人類動物為XEN0M0USE轉殖基因小鼠，其為包含 人類免疫球蛋白基因座之大片段且缺乏小鼠抗體產生之經 工程改造之小鼠品系。參見例如Green等人（1994) Nature 160878.doc -84 * 201242977
Genet. 7: 13-21及美國專利第 5,916,771號；第 5,939,598 號；第 5,985,615 號；第 5,998,209號；第 6,075，181號；第 6,091，001號；第 6,114,598號；及第6，130,364號。亦參見 PCT公開案第 WO 91/10741號；第 WO 94/02602號；第 WO 96/34096號；第 WO 96/33735號；第 WO 98/16654號；第 WO 98/24893號；第 WO 98/50433號；第 WO 99/45031 號； 第 WO 99/53049 號；第 WO 00/09560 號；及第 WO 00/037504號。XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人類 抗體之成年樣人類譜系且產生抗原特異性人類單株抗體。 XENOMOUSE轉殖基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及X 輕鍵基因座之百萬驗基（megabase)大小的生殖系組態YAC 片段而含有約80%人類抗體譜系。參見Mendez等人（1997) Nature Genet. 15: 146-156 ; Green&Jakobovits(1998)J· Exp. Med. 188: 483-495 ° 活體外方法亦可用於製備親本抗體，其中篩檢抗體文庫 以鑑別具有所要結合特異性之抗體。此篩檢重組抗體文庫 之方法在此項技術中為熟知的且包括例如以下所述之方 法：Ladner等人美國專利第5,223,409號；PCT公開案第 WO 92/18619號；第 WO 91/17271號；第 WO 92/20791 號； 第 WO 92/15679號；第 WO 93/01288號；第 WO 92/01047 號；第 WO 92/09690 號及第 WO 97/29131 號；Fuchs 等人 (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372 ; Hay等人（1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 ; Huse 等人（1989) Science 246: 1275-1281 ; McCafferty 等人（1990) Nature 348: 552- 160878.doc -85- 201242977 554 ; Griffiths等人（1993) EMBO J. 12: 725-734 ； Hawkins 等人（1992) J. MoL Biol_ 226: 889-896 ; Clackson 等人 (1991) Nature 352: 624-628 ; Gram等人（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580 ; Garrad 等人（1991)
Bio/Technology 9: 1373-1377 ; Hoogenboom 等人（1991) Nucl. Acid Res. 19: 4133-4137 ； >51 Barbas # A (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982 ;及美國專利公開案第 2003/0186374號。 A2. scFv及活體外產生之抗體 亦可使用此項技術中已知之多種噬菌體呈現法產生本發 明之親本結合蛋白。在噬菌體呈現法中，功能性抗體域呈 現於攜帶編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體粒子表面上。特 定言之，此噬菌體可用於呈現自譜系或組合抗體文庫（例 如人類或鼠類）表現之抗原結合域。可用抗原，例如使用 經標記抗原或結合或捕捉於固體表面或珠粒上之抗原來選 擇或鑑別表現結合相關抗原之抗原結合域的噬菌體。此等 方法中所用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，其包括自Fab、 Fv或二硫化物穩定之Fv抗體域與噬菌體基因III或基因VIII 蛋白質重組融合之噬菌體表現的fd及M13結合域。可用於 製備本發明抗體之噬菌體呈現法之實例包括以下所揭示 者：Brinkman 等人（1995) J. Immunol· Methods 182: 41-50 ; Ames 等人（1995) J. Immunol. Methods 184: 177-186 ； Kettleborough等人（1994) Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic 等人（1997) Gene 187: 9-18 ; Burton 等人（1994) 160878.doc -86 · 201242977
Advances in Immunol. 57: 191-280 ; PCT 申請案第 PCT/GB91/01134號；PCT公開案第 WO 90/02809號；第 WO 91/10737號；第 WO 92/01047號；第 WO 92/18619號；第 WO 93/11236號；第 WO 95/15982 號及第 WO 95/20401 號； 及美國專利第5,698,426號；第5,223,409號；第5,403,484 號；第 5,580,717號；第 5,427,908號；第 5,750,753號；第 5,821，047 號；第 5,571，698 號；第 5,427,908 號；第 5,516,637 號；第 5,780,225 號；第 5,658,727 號；第 5,733,743號及第 5,969，108號。 如本文參考文獻中所述，在噬菌體選擇後，可自嗤菌體 分離抗體編碼區且用於產生包括人類抗體之完整抗體或任 何其他所要抗原結合片段，且例如如以下所詳述’在包括 哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌之任何 所要宿主中表現。舉例而言’亦可使用此項技術中已知之 方法採用重組產生Fab、Fab'及F(ab’）2片段之技術，該等方 法諸如PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax等人（1992) BioTechniques 12(6): 864-869 ; Sawai等人（1995) AJRI 34: 26-34 ;及 Better 等人（1988) Science 240: 1041-1043 中所揭 示者。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術之實例包括美國專 利第 4,946,778 號及第 5,258,498 號；Huston 等人（1991)， Methods Enzymol. 203:46-88 ; Shu 等人（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999 ;及 Skerra 等人（1988)
Science 240: 1038-1040 中所述者。 替代藉由噬菌體呈現篩檢重組抗體文庫，可應用此項技 160878.doc -87 - 201242977 術中已知之用於篩檢大型組合文庫之其他方法來鑑別親本 抗體。一種類型之替代表現系統為如以下所述之其中重組 抗體文庫表現為RNA-蛋白質融合物的表現系統：pct公開 案第 WO 98/31700 號’及 Roberts, R.W·及 Szostak, J.W (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12302。在此 系統中，在mRNA與其藉由活體外轉譯在3’端攜帶嘌呤黴 素（一種肽基受體抗生素）之合成mRNA而編碼之肽或蛋白 質之間形成共價融合物。因此’可基於所編碼之肽或蛋白 質（例如抗體或其一部分）之性質（諸如抗體或其一部分與雙 隹 重特異性彳几原之結合）自mRNA之複雜混合物（例如組合文 庫）富集特定mRNA。可藉由如本文所述之重組手段（例如 在哺乳動物宿主細胞中）表現由篩檢此等文庫回收之編碼 抗體或其一部分之核酸序列，且此外，可藉由再進行數輪 已在最初選擇之序列中引入突變之mRNA-肽融合物的篩檢 或藉由如本文所述使重組抗體活體外親和力成熟之其他方 法使該等核酸序列經受進一步親和力成熟。 在另一方法中’亦可使用此項技術中已知之酵母呈現法 · 產生親本結合蛋白。在酵母呈現法中，遺傳學方法用於將 抗體域繫栓於酵母細胞壁且使其在酵母表面上呈現。特定 。之’此酵母可用於呈現自譜系或組合抗體文庫（例如人 類或鼠類）表現之抗原結合域。可用於製備親本抗體之酵 母呈現法之實例包括美國專利第6,699,658號中所揭示者。 A3·人類化及工程改造之抗體 本發明之親本結合蛋白亦可經修飾以產生（：]〇11移植抗體 160878.doc
S -88· 201242977 及人類化親本抗體《 CDR移植親本抗體包含來自人類抗體 之重鏈及輕鏈可變異區序列，其中VH及/或VL之一或多個 CDR區經可結合相關抗原之鼠類抗體之CDR序列置換《來 自任何人類抗體之構架序列均可充當CDR移植之模板。然 而，該種構架上之直鏈置換常導致對抗原之結合親和力在 一定程度上損失。人類抗體與原始鼠類抗體之同源性愈 高，組合鼠類CDR與人類構架將在CDR中引入可降低親和 力之失真的可能性愈小。因此，在一個實施例中，經選擇 以置換除CDR之外的鼠類可變構架之人類可變構架與鼠類 抗體可變異區構架具有至少65%序列一致性。在一個實施 例中，人類與鼠類可變異區除CDR之外具有至少70%序列 一致性。在一特定實施例中，人類與鼠類可變異區除CDR 之外具有至少75%序列一致性。在另一實施例中，人類與 鼠類可變異區除CDR之外具有至少80%序列一致性。產生 此等抗體之方法在此項技術中為已知的（參見EP 239,400 ; ?(：1[公開案第\^〇 91/09967號；及美國專利第5,225,539 號；第5,530，101號及第5,585,089號）；鑲飾或表面重塑（EP 592,106 ； EP 519,596 ； Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5): 489-498 ; Studnicka 等人（1994) Prot. Engineer. 7(6): 805-814 ;及Roguska等人（1994) Proc. Acad. Sci. USA 91: 969-973);鏈改組（美國專利第5,565,352號）；及抗個體 基因型抗體。 人類化抗體為來自非人類物種之抗體分子’其結合所要 抗原且具有一或多個來自非人類物種之CDR及來自人類免 160878.doc -89- 201242977 疫球蛋白分子之構架區。已知人類ig序列揭示於例如以下 中：www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi ; www.atcc.org/phage/ hdb.html ； www.sciquest.com ； www.abcam.com ； www.antibodyresource. com/onlinecomp.html ； www.public.iastate.edu/.about.pedro/research tools.html ； www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html ； www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm ; www.library. thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html i www.hhmi.org/grants/ lectures/1996/vlab ; www.path.cam.ac.ukAabout.mrc7/m-ikeimages.html ;
www.antibodyresource.com ； mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html. ； www.immunologylink.com ； pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/ index.-html ； www.biotech.ufl.edu/.abouthcl ； www.pebio.com/pa/340913/ 340913.html- ； www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody ； www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html ; www.biodesign.com/table.asp ; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html ； www.biotech.ufl.edu/ .about.fccl/protocol.html ； www.isac-net.org/sites_geo.html ； aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html ； baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/ linksl.html ； www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/ ； www.mrc- cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html ; www.ibt.unam.mx/vir/ V_mice.html ； imgt.cnusc.fr:8104/ ； www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/ abs/index.html ; antibody.bath.ac.uk/ ; abgen.cvm.tamu.edu/lab/ wwwabgen.html ； www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/ SlideOl .html ； www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/ ； www.nimr.mrc.ac.uk/ CC/ccaewg/ccaewg.htm ; www.path.cam.ac.ukAabout.mrc7/h-umanisation/ TAHHP.html ； www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat aim.html ； 160878.doc -90- s 201242977 www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html ； www.cryst.bioc.cam.ac.uk/ .abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html ； www.jerini.de/fr roducts.htm ; www.patents.ibm.com/ibm.html ;及Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)。此等輸入序列可用於降低免疫原性或降低、增強 或改變結合、親和力、締合速率、解離速率、親合力、特 異性、半衰期或如此項技術中已知之任何其他適合特徵。 可用來自CDR供者抗體之相應殘基取代人類構架區中之 構架殘基以改變（例如改良）抗原結合。此等構架取代係藉 由此項技術中熟知之方法鑑別，例如藉由對CDR與構架殘 基之相互作用進行模型化以鑑別對抗原結合重要之構架殘 基以及進行序列比較以鑑別特定位置處之異常構架殘基 (參見例如美國專利第5,585,089號；Riechmann等人（1988) Nature 332: 323)。三維免疫球蛋白模型通常可用且為熟習 此項技術者所熟悉。說明及顯示所選候選免疫球蛋白序列 之可能三維構形結構的計算機程序可用。對此等顯示之檢 查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功能中的可能 作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的 殘基。以此方式，可自共同及輸入序列選擇及組合FR殘基 以便達成所要抗體特徵，諸如對目標抗原之親和力增加。 一般而言，CDR殘基直接且最實質上參與影響抗原結合。 可使用此項技術中已知之多種技術使抗體人類化，該等技 術諸如（但不限於）以下所述者：Jones等人（1986) Nature 321: 522 ; Verhoeyen等人（1988) Science 239: 1534 ; Sims 160878.doc -91- 201242977 等人（1993) J. Immunol· 151: 2296 ; Chothia及 Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 ; Carter等人（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 ; Presta 等人（1993) J. Immunol. 151: 2623 ； Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5): 489-498 ；
Studnicka 等人（1994) Prot. Engineer. 7(6): 805-814 ;
Roguska等人（1994) Proc. Natl· Acad. Sci. USA 91: 969-973 ; PCT 公開案第 WO 91/09967 號：US 98/16280 ; US 96/18978 ； US 91/09630 ； US 91/05939 ； US 94/01234 ； GB 89/01334 ； GB 91/01134 ； GB 92/01755 ； WO 90/14443 ； WO 90/14424 ;及WO 90/14430 ;歐洲專利公開案第EP 229246 號；第 EP 592,106 號；第 EP 519,596 號及第 EP 239,400號；及美國專利第5,565,332號；第5,723,323號； 第 5,976,862 號；第 5,824,514 號；第 5,817,483 號；第 5,814,476 號；第 5,763，192 號；第 5,723,323 號；第 5,766,886 號；第 5,714,352 號；第 6,204,023 號；第 6，180,370 號；第 5,693,762 號；第 5,530，101 號；第 5,585,089號；第 5,225,539號及第 4,816,567號。 A4.例示性單一可變異域 用於本發明之TVD結合蛋白中之例示性單一可變異域包 括下列可變異域序列。 表1:用於產生TVD結合蛋白之結合蛋白的VH及VL區之胺 基酸序列的清單
1D4.1 VH SEQ IDNO:46
EVXLRESGPALVKPTQTLTL
TCTFSGFSLSKSVMGVSWIR
QPPGKALEWLAHIYWDDDKY
YNPSLKSRLTISKDTSKNQV
VLTMTNMDPVDTATYYCARR 160878.doc •92· 201242977
GIRS AMD YWGQGTTVTVS S mAB 2.5 VH SEQ ID NO:47 EVQLVQSGTEVKKPGESLK工 SCKGSGYTVTSYWIGWVRQM PGKGLEWMGFIYPGDSETRY SPTFQGQVTISADKSFNTAF LQWSSLKASDTAMYYCARVG SGWYPYTFDIWGQGTMVTVS S 2BSVH SEQ ID NO:48 EVQLVQSGAEVKKPGASVKV SCKASGYTFTKYWLGWVRQA PGQGLEWMGDIYPGYDYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAY ME-LRSLRSDDTAVYYCARSD GS STYWGQGT LVTVS S 1D4.1 VL SEQ IDNO:51 DIVMTQSPDSLAVSLGERAT INCKASQSVSNDVAWYQQKP GQPPKLLIYYASNRYTGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQA EDVAVYYCQQDYNSPWTFGG GTKVEIKR mAB 2.5 VL SEQIDNO:52 EIVMTQSPATLSVSPGERAT LSCRASESISSNLAWYQQKP GQAPRLFIYTASTRATDIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDFAVYYCQQYNNWPSITFG QGTRLEIKR 2B5 SEQ IDNO:53 DVLMTQTPLSLPVTPGEPAS ISCTSSQNIVHSNGNTYLEW YLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQVSHVP YTFGGGTKVEIKR D2E7 VH SEQIDNO:70 EVQLVESGGGLVQPGRSLRL SCAASGFTFDDYAMHWVRQA PGKGLEWVSAITWNSGHIDY ADSVEGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVS YLSTASSLDYWGQGTLVTVS S 13C5.5L3F VH SEQ IDNO:71 EVTLRESGPGLVKPTQTLTL TCTLYGFSLSTSDMGVDWIR QPPGKGLEWLAHIWWDDVKR YNPALKSRLTISKDTSKNQV VLKLTSVDPVDTATYYCART VS SGYIYYAMDYWGQGTLVT VSS D2E7VL SEQ IDNO:73 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT ITCRASQGIRNYLAWYQQKP GKAPKLLIYAASTLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDVATYYCQRYNRAPYTFGQ GTKVEIKR 13C5.5L3F VL SEQIDNO:74 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT IS CRASQDIRNY LNWYQQKP 160878.doc 93- 201242977
GKAPKLLIFYTSKLHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQP EDIATYYCQQGLTPPLTFGG GTKVEIKR VHHIV (seq. 1) SEQ ID NO:75 QVQLQQSGAELMKPGASVKI SCKASGYTFTSYWIEWIKQR PGHGLEWIGEILPGTGSLNN NEKFRDKATFTADTSSNTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARGY RYDGWFAYWGQGTLVTVSA VLHIV (seq. 1) SEQ ID NO:76 DIQMTQSPASLSASVGETVT ITCRTSENIYSYLAWYQQKP GKSPHLLVYNTKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKINSLQP EDFGSYYCQHHYDSPLTFGS GTKLELKR VHNGAL (seq· 1) SEQ ID NO:77 EVQLVESGGGLVQPGGSLKL SCAASGFTFNNYYMSW VRQTPERRLEWVAYISSSGG STYYSDSVRGRFTISRDTAR NTLYLQMTSLKSEDTAMYYC ARHFGDYSYFDYWGQGTTLT VSS VLNGAL (seq. 1) SEQ ID NO:78 DIQMTQSPASLSASVGETVT ITCRASENFYSYLAWYQQKQ GKSPQLLVYNAKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKINSLQP EDFGTYYCQHHYDIPLTFGA GTKLELKR VHNGAL (seq. 2) SEQ ID NO:79 KIQLVQSGPELKKPGETVKI SCKASGYTFTNYGMNWVKQA PGKGLKWMGWININTGEPTY AEEFKGRFAFSLETSATTAF LQINNLKNEDTATYLCARDS YSGGFDYWGQGTIVTVSS VLNGAL (seq. 2) SEQ 1DNO:80 DIVMTQSPSSLSVSAGEKVT LSCKSSQSLLISGDQKNYLA WYQQKPGQPPKLLIYGASTR DSGVPDRFTGSGSGADFTLT ISSVQAEDLAVYYCQNDHSF PPTFGAGTKLELKR VHHIV (seq. 2) SEQIDNO:81 QIQLVQSGPELKKPGETVKI SCKASGYTFTDYSMHWVKQA PG KGL KWMGWIΗTET GE PRY VDDFKGRFAFSLETSASTAY LQINNLKNEDTATYFCARDS YYFGSSYYFDYWGQGTTLTV SS VLHIV (seq. 2) SEQIDNO:82 DTVMTQSHKFMSTSVGDRVS ITCKASQDVS SAVAWYQQKP GQSPKLLIYSASYRYTGVPD RFTGSGSGMDFTFTISSVQA EDLAVYYCQQHYSXPLTFGA GTKLELER
160878.doc •94- s 201242977
VHHIV (seq. 3) SEQIDNO:83 EVQLQQSGPELVKPGASMKI SCKASDYSFTAYTIHWMKQS HGKNLEWIGLINPYNGGTSY NQKFQGRATLTVDKSSSIAY MELLSLTSEDSAVYYCARRG YDREGHYYAMDYWGQGTSVT VSS VL HIV (seq· 3) SEQ ID NO:84 DIQMTQSPASLAASVGETVT ITCRASENIYTFLAWYQQKQ GKSPQLLVYTTKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKIKSLQP EDFGSYYCQHHYGLPLTFGA GTKLELKR VHHIV (seq. 4) SEQ IDNO:85 EVQLQQSGPELVQPGASMK工 SCKASGYSFTDYTMNWVKQS HGKNLEWIGLINPYNGGSRY NQKFMAKATLTVDKS SNTAY MELLSVTSEDSAVYYCARDA GYFGSGFYFDYWGQGTTLTV SS VLHIV (seq· 4) SEQ ID NO:86 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVS ITCKASQDVSTAVAWYQQKP GQ SPKLLIYSAS YRS TGVPD HFTGSGSGTDFTFTISSVQA EDLAVYYCQQHYSTPTFGAG TKLELKR VH EL-18 SEQ ID NO:87 QVQLQQPGSELVRPGASVKL SCKASGYTFTSYWMHWVKQR PGQGLEWIGNIYPGTVNTNY DEKFKNKATLTVDTSSSTAY MLLSSIiTSEDSAVYYCTRDY YGGGLNYWGQGTTLTVSS VLIL-18 SEQ ID NO:88 SIVMTQTPKFLLVSAGDRVT ITCKASQSVSNDVAWFQQKP GQSPKLLIYYASNRYAGVPD RFTGSGFGTDFTFTISTVQA EDLAVYFCHQDYSSPRTFGG GTKLEIKR VH BNP (seq. 1) SEQ ID NO:89 QIQLVQSGPELRKPGETVKI SCKGSGYTFTHYGINWVKQT PRKDLKWMGWINTHTGEAYY ADDFKGRFAFSLETSANTAY LQINNLNNGDMGTYFCTRSH RFGLDYWGQGTSVTVSS VL BNP (seq. 1) SEQ ID NO:90 DNVLTQSPPSLAVSLGQRAX ISCKANWPVDYNGDSYLNWY QQKPGQPPKFLIYAASNLES GIPARFSGSGSGTDFNLNIH PVEEEDAATYYCQQSNEDPF TFGSGTKLEIKR VHBNP (seq. 2) SEQIDNO:91 QVQLQQPGAELVRPGASVKL SCKASGYTFTSYWMNWVKQR PEQGLEV3IGRIDPYDSETHY NQKFKDKAILTVDKSSSTAF 160878.doc 95- 201242977
VQLTSLTSEDSAVYYCVSDG YWGAGTTVTVSS VL BNP (seq_ 2) SEQ ID NO:92 DWMTQTPLTLSVTTGQPAS ISCKSSQSLLDSDGKTYLNW LFQRPGESPKLLIYVVSKLE SGVPDRFTGSGSGTDFTLKI SRVEAEDLGVYYCLQATHFP WTFGGGTKLEIKR VH BNP (seq. 4) SEQ IDNO:93 QVQLQQPGAELVRPGASVKL SCKASGYTFTSYWMNWVKQR PEQGLEWIGRIDPYDSETHY NQKFKDKAILTVDKSSSTAF VQLTSLTSEDSAVYYCVSDG YWGAGTTVTVSS VLBNP (seq. 4) SEQ IDNO:94 DWMTQTPLTLSVTTGQPAS ISCKSSQSLLDSDGKTYLNW LFQRPGESPKLLIYVTDILE SGVPDRFTGSGSGTDFTLKI SRVEAEDLGVYYCLQATHFP WTFGGGTKLEIKR VHTnl SEQ ID NO:95 EVQLQQSGPDLVKPGASVRI SCKASGYTFTDYNLHWVKQS HGKSLEWIGYIYPYNGITGY NQKFKSKATLTVDSSSNTAY MDLRSLTSEDSAVYFCARDA YDYDYLTDWGQGTLVTVSA VLTnl SEQ ID NO:96 DILLTQSPVILSVSPGERVS F S CRT S KNVGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASERLPGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQSNNWPYTFGG GTKLEIKR CD3 VH SEQ ID NO: 163 QVQLQQSGAELARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKS S S TAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSS CD3VL SEQ ID NO: 164 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINR EGFR VH SEQ Π) NO: 165 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSI TCTVSGFSLTNYGVHWVRQS PGKGLEWLGVIWSGGNTDYN TPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALT YYDYEFAYWGQGTLVTVSA EGFR VL SEQ ID NO: 166 DILLTQSPVILSVSPGERVS FSCRASQSIGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES
160878.doc -96- s 201242977
EDIADYYCQQNNNWPTTFGA GTKLELKR IGF1R VH SEQ ID NO:167 EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCTASGFTFSSYAMNWVRQA PGKGLEWVSAISGSGGTTFY ADSVKGRFTISRDNSRTTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKDL GWSDSYYYYYGMDVWGQGTT VTVSS IGF1RVL SEQ ID NO: 168 DIQMTQFPSSLSASVGDRVT 工TCRASQGIRNDLGWYQQKP GKAPKRLIΪAASRLHRGVP S RFSGSGSGXEFTLTISSLQP EDFATYYCLQHNSYPCSFGQ GTKLEIKR CD20VH SEQ ID NO: 169 QVQLQQPGAELVKPGASVKM SCKASGYTFTSYNMHWVKQT PGRGLEWIGAIYPGNGDTSY NQKFKGKATLTADKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARST YYGGDWYFNVWGAGTTVTVS A CD20 VL SEQ ID NO: 170 QIVLSQSPAILSPSPGEKVT MTCRASSSVSYIHWFQQKPG SSPKPWIYATSNLASGVPVR FSGSGSGTSYSLTISRVEAE DAATYYCQQWTSNPPTFGGG TKLEIKR HER2VH SEQ Π) NO: 171 EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFNIKDTYIHWVRQA PGKGLEWVARIYPTNGYTRY ADSVKGRFXISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWG GDGFVAMDYWGQGTLVTVSS HER2VL SEQ ID NO: 172 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT ITCRASQDVNTAVAWYQQKP GKAPKLLIYSASFLYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKR 以下實例中提供其他單一可變異域序列。 A5.雙重可變異域結合蛋白 用於本發明之TVD結合蛋白中之相關可變異域（重及/或 輕）可源於美國專利公開案20100260668及20090304693中 提供之序列。應暸解單一可變異域可選自其中揭示之用於 本發明之TVD結合蛋白中的雙重可變異域結合蛋白。序列 亦可選自下列表格。 -97- 160878.doc 201242977 用於本發明之結合蛋白中之例示性雙重可變異域包括結 合所指示蛋白質之下列雙重可變異域序列。 表2 :結合HIV之雙重可變異域序列
SEQ ID HO： DVD可變 異域名稱 外部可變 異域名稱 連接子 内部可變 異域名稱 序列 123456789012345676901234567S90123456 97 DVD715H AB081VH HG- 短 AB081VH QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKASGYTFTSYWIEW IKQRPGHGLEWIGEILPGTGSLNNNBKFRDKATFTA DTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGYRYDGWFAY WGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQQSGAELMKPGASVK ISCKASGYTF'XSYWIEWIKQRPGHGLEWIGEILPGT GSLNNNEKFRDKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSSDS AVYYCARGVRYDGWFAYWGQGTLVTVSA 98 DVD715L AB081VL LK- 短 AB081VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWY QQKPGKSPHLLVYNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPEDFGSYYCQHHYDSPLTFGSGTKLELKR TVAAPDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYS YLAWYQQKPGKSPHLLVyNTKTLAEGVPSRFSGSGS GTQFSLXINSLQPEDFGSYYCQHHYDSPLTFGSGTK LELKR 99 DVD716H AB081VH HG- 長 AB081VH QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKASGyTFTSYWIEW IKQRPGHGLEWIGEILPGTGSLNNNEKFRDKATFTA DTSSNTAyMQLSSLTSEDSAVYYCARGYRYDGWFAY WGQGTLVTVSAASTKGPSVTPLAPQVOLQQSGAELM KPGASVKISCKASGYTFTSYWIEWIKQRPGHGLEWI GEILPGXGSLNNNEKFRDKATFTADXSSNTAYMQLS SLTSEDSAVYYCARGYRYDGWFAYWGQGTLVTVSA 100 DVD716L AB081VL LK- 長 AB081VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWY QQKPGKSPHLLVyNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPSDFGSYYCQHHYDSPLTFGSGTKLELKR TVAAPSVFIFPPDIQMTQSPASLSASVGETVTITCR TSENIYSYLAWYQQKPGKSPHLLVYNTKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYXCQHHYDSPL TFGSGTKLELKR 101 DVD717H A3081VH HG- 長χ2 AB081VH QVQLQOSGAELMKPGASVKISCKASGYTFTSYWXEW IKQRPGKGLEWIGEILPGTGSLNNNEKrRDKATFTA dxssntaymqlssltsedsavyycargyrydgwfay WG^TLVTVSAASTKGPSVFPUU>A$TXGP5VFE>LA PQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKASGYTFTSYWIE WIKQRPGHGLEWIGEILPGTGSLNNNEKFRDKATFT ADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGYRYDGWFA YWGQGXLVTVSA 102 DVD717L AB061VL LK-長x2 AB081VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWY QQKPGKSPHLLVYNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPEDFGSYyCQHHYDSFLTFGSGTKLELKR TVAAPSVFIPPPTVAAPSVFIFPPDIQMTQSPASLS ASVGETVTITCRTSENIYSYLAKYQQKPGKSPHLLV YNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKXNSLQPEDFG SyyCQHHYOSPLTFGSGTKLELKR 103 0VD746H AB081VH HG— 長 AB085VH QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKASGYTFTSYWIEW IKQRPGHGLEWIGEILPGTGSLNNNEKFRDKATFTA dtssntaymqlssltsedsavyycargyrydgwfay WGQGTLVTVSAASTKGPSVTPIAPEVGbQQSGPELV KPGASMKISCKASDYSFTAYTIKWMKOSHGKNLEWI GLINPYNGGTSYNQKFQGRATLTVDKSSSXAYMELL SLTSEDSAVYYCARRGYDREGHY^AMDYWGOGTSVT vss 104 DVD746L AB081VL LK- 長 AB085VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWY QQKPGKSPHLLVYNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPEDFGSYYCQHHYDSPLTFGSGTKLELKR TVAAPSVriFPPDIQMTQSPASLAASVGETVTrTCR 98 160878.doc 201242977
ASENIYTFLAWYQQKQGKSPQLLVyTTKXLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKIKSLQPEDFGSYYCQHHYGLPL TFGAGXKLELKR 105 DVD747H AB081VH HG-長x2 AB085VH QVQLQQSGAELMKPGASVKXSCKASGYTFTSYWIEW IKQRPGHGLEWIGEILPGXGSLNNNEKFRDKATFTA DTSSNTAYI-1QLSSLTSEDSAVYYCARGYRYDGWFAY WGQGTLVTVSAASTKGPSVFPIAPASTKGPSVFPLA PSVQLQQSGPELVKPGASKKISCKASDYSFTAYTIH Wr4KQSHGKNLEWIGLXNPYNGGTSYNQKFQGRATLT VDKSSSIAYMELLSLTSEDSAVYYCARRGYDREGHY YMDY WGQG T SVTVS S 106 DVD747L AB081VL LK- 長x2 AB085VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWY QQKPGKSPHLLVYNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPEDFGSYYCQHHYDSPLTFGSGTKLELKR TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPPDIQMIOSPASLA ASVGSTVTITCRASENIYIFLAKYQQKQGKSPQLLV YTTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKIKSLQPEDFG SYYCQHHYGLPLTFGAGTKLEL-KR 107 DVD748H AB085VH HG- 長 AB081VH evqlqqsgpelvkpgasmkxsckasdysftaytihw MKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQKFQ6RATLTV DKSSSIAYMELLSLTSEDSAVYYCARRGYDREGHYY AMDY WGQGT SVTVS SASTKGPSVFPIAPQVQLQQSG AELMKPGASVKISCKASGYTFTSY WIEWIKORPGHG LEWIGEItiPGTGSL酬EKFRDKATFTADTSSNTAY MQLSSLTSEDSAVYYCAKGYRYDGWFAYWGQGTLVT VSA 108 DVD74BL AB085VL LK- 長 AB081VL DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYTFLAWY QQKQGKSPQLLVYTTKTLAEGVFSRFSGSGSGTQFS LKIKSLQPEDFGSYYCQHHYGLPLTFGAGTKLELKR TVAAPSVFIFPPDIQMTQSPASLSASVGETVTXTCR TSENIYSYLAWYQQKPGKSPHLLVYNTKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYD3PL TFGSGTKLELKR 109 DVDT49H AB085VH HG-長x2 AB081VH EVQLQQSGPELVKPGASMKXSCKASDYSFTAYTIHW MKQSHGKNLEWIGL ΙΝΡΥΝσβΤεΥΝΟΚΪ^ΗΑΊΧΤν DKSSSIAYMELLSLTSEDSAVYYCAPBGYDBSGHYY AMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLftPASTKGPSV PPLAPQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKASGYTFTS WIEWIKQRPGHGLEWIGEILPGTGSLNNNSKFRDK ATFTADTSSNTAYMQLS5LTSED5AVYYCARGYRYD GWFAYWGQGTLVTVSA 110 DVD749L AB085VL LK-長x2 AB081VL DrQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYTFLAWY QQKQGKSPQLLVYTTKTIAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKXKSLQPEDFGSYYCQHHYGLPLTFGAGTKLELKR TVAAPSVPIPPPTVAAPSVFIFPPDIQMTOSPASLS ASVGETVTITCRTSENXYSYLAWYQQKPGKSPHLLV YNTKTLAEGVPSRrSGSGSGTQFSLKXNSliQPEDFG SYYCQKHYDSPLXFGSGTKLELKR 111 DVD744H AB034VH HG- 長 AB084VH qiqlvqsgpelkkpgetvkisckasgytftoysmhw VKQAPGKGLKWMGWIHTETGEPRYVDDFKGRFAFSL ETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARDSYYFiSSSYY FDYWGQGTTLXVSSASTKGPSVFPIAPQIQLVQSGP EUKKPGETVlQSCKASGyTFTDYSMHWVKQAPGKGL ΚΜΜανϊΙΗΤΕΤΘΕΡΚΥνΟΟΡΚΟΚΡΑΓβΙ^ΤεΑΒΤΑΥΙ* QIWNLKNEDTATYFCARDSYYFGSSY^FDYWGQGTT LTVSS 112 DVD744L AB084VL LK- 長 AB084VL DXVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSSAVAWY QQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGMDFT ΓΤίεενΌΑΕΟΙΑνΥΥεΟΟΗΥεΤΡΙ^ΟΑΟΤΚΙ^ΕΚ TVAAPSVFIFPPDTVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCK ASQDVSSAVAWYQQKPGQSPKLLXYSASYRYTGVPD RFTGSGSGMDFTFTISSVQAEDIAVYYCQOHYSTPI/ TFGAGTKLELER 113 DVD745H AB084VH HG- 短 AB084VH QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDVSMHW VKQAPGKGLKWMGWIHTETGEPRYVDDFKGRPAFSL ETSASTAYX.QXNMLKNEDTATyFCARDSYYFGSSyY FDYWGQGTTLTVSSASTKGPQIQLVQSGPELKKPGE 160878.doc 99- 201242977
TVKISCKASGYTFTDySMHWVKQAPGKGLKWMGWIH tETGEPRYVDDFKGRFArSLEXSASTAYLQXKNLKN EDTATYFCARDSYYFGSSYYFDYWGQGTTLTVSS 114 DVD745L AB084VL LK- 短 AB084VL DTVMTOSHKFMS TS VGDRVSITCKASODVS SAVAWY QQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGMDFT FTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELER TVAAPDTVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSS AVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGV^PDRFTGSGS GMDFTFTISSVQAEDLAVYyCQQHYSTPLTFGAGTK LCLER 115 DVD7S0H AB086VH HG- 長 AB086VH EVQLQQSGPELVOPGASMKISCKASGYSFTDYTMNW VKQSHGKNLEWIGLINPYKGGSRYNQKFMAKATLTV DKSSNTAYMELLSVTSEDSAVYYCARDAGYFGSGFY FDYWGQGTTLTVSSASXKGPSVFPLAPEVQLQQSGP ELVCPGASMKISCKASGYSFTDYTMNVfVKOSHGKNL EWlGUINpyNGGSRYNQKFMAKATLTVDKSSNTAYM ELLSVTSEDSA^YCARDAGYFGSGFYFDYWGQGTT LTVSS 1X6 DVD750L AB086VL LH- 長 AB086VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWY OOKPGOSPKLLIYSASYRSTGVPDRFTGSGSGTDFT VA»PSVFIFPPDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKA SQDVSTAVAWYQOKPGQSPKLLiySASyRSTGVPDR FTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPTF GAGTKLELKR
表3 :結合NGAL之雙重可變異域序列
SEQ ID NO DVD可變 異域名稱 外部可變 異域名稱 連接子 内部可變 異域名稱 序列 12345678901234567Θ901234567Θ90123456 117 DVD719H AB082VH HG— 長 AB082VH EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTriWYYMSW VRQTPERRLEtiVAYrSSSGGSTYYSDSVBGRFTISR DTARNXI.YLQMTSLKSEDTAMYYCARHFGDYSYFDY WGQGTTLTVSSASTKGPSVPPIAPEVOLVESGGGLV QPGGSLKLSCAASGFTFNNYYMSWVRQTPERRLEWV AYISSSGGSTYYSDSVRGRFTISRDXARNTLYLQMT SLKSEDTAMYYCARHFGDYSYFDYWGQGTTLTVSS 118 DVD7X9L AB082VL LK- 長 AB082VL DIOMTQSPASLSASVGETVTXTCRASENFYSYLAWY qqkqgkspqllvvnaktlaegvpsrfsgsgsgtqfs LKINSLQPEDFGTrYCQHHYDIPLTFGAGTKLELKR TVAAPSVFIFPPDIQMTQSPASLSASVGETVTITCR ASENFYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYVCOHHyDIPL TFGAGTKLELKR Π9 DVD720H AB082VH HG- 短 AB082VH EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNNYYMSW VRQTPERRLEWVAYISSSGGSTYYSDSVRGRFTISR DTARNTLYLQMTSLKSEDTAMyyCARHFGDySYFDY WGQGTTLTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPGGSLK LSCAASGFTFNNYYMSWVHQTPERRLEWVAVISSSG GSTYySDSVRGKFTISRDTARNTLYLQMTSLKSEDT AMYYCARHFGDYSYFDYWGQGTTLTVSS 120 DVD720L AB082VL LK- 短 AB082VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENFYSYLAWY QQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPEDFGTYYCQHHYDIPLTFGAGTKLELKR TVAAPDIQMXQSPASLSASVGETVTITCRASENFYS YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGS GTQFSLKINSLCPEDFGTVYCQHHYDIPLTFGAGTK LELKR 121 DVD721H AB083VH HG- 長 AB083VH KIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNVGMNW VKQAPGKGLKWMGWININTGEPTyAEEFKC-RFAFSL ETSATTATLQINNLKNEDTATYLCARDSYSGGFDYW GQGTIVTVSSASTKGPSVFP1APKIOLVQSGPELKK
160878.doc -100-
S 201242977
PGETVKISCKASGYTTTNyGMNWVKQAPGKGIiKWMG WININXGEPTYAEEFKGRFAFSLETSATXAFLQIHN LKNEDTATYLCARDSYSGGFDYWGQGTIVTVSS 122 DVD721L AB083VL LK- 長 AB083VL DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTLSCKSSQSLL.iSGDQK NYLAWYQQKPGOPPKLLIYGASTRDSGVPDRFTGSG SGADFTLTISSVQAEDLAVYyCQNDHSFPFTFGAGX KLELKRTVAAPSVFIFPPDIVMTQSPSSLSVSAGEK VTLSCKSSQSLLISGDQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI YGASTRDSGVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLA VYYCQNDHSFPPTFGAGTKLELKR 123 DVD722H AB083VH HG- 短 AB083VH KIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW VKQAPGKGLKWMGWININTGEPTYAEEFKGRFAFSL BTSATTAFLQINNLKNBDTATYLCARDSYSGGFDYW GQGTIVTVSSASTKGPKIQLVQSGPELKKPGETVKI SCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWININTG EPTYAEEFKGRFAFSLETSATTAFLQINNLKNEDTA TYLCARDSYSGGFDYWGQGTIVTVSS 124 DVD722L AB0B3VL LK- 短 AB083VT- DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTLSCKSSQSLLISGDQK KYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRDSGVPDRFTGSG SGADFTLTISSVQREDLAVYyCQNDHSFPPTFGAGT KLELKRTVAAPDIVMTQSPSSLSVSAGEKVTLSCKS SOSLLISGDQKNyLAWYQQKPGOPPKLLIYGASTRD SGVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAVYYCQND HSFPPTFGAGTKLELKR 125 DVD723H AB082VH HG- 長 AB083VH EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNNYYMSW VRQTPERRLEWAyiSSSGGSTYY-SDSVRGRFTISR DTARNTLYLQMTSLKSEDTAMYYCARHFGDYSYFDY WGQGTTLTVSSASTKGPSVTPLAPKIQLVQSGPELK KPGETVKXSCKASGVTFTNYGMNWVKQAPC-KGLKWM GWININTGEPTYASEFKGRFAFSLETSATTAFLQIN NLKNEDTATYLCARDSySGGFDYWGQGTIVTVSS 126 DVD723L· AB082VL LK- 長 AB083VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENE'YSYLAWY QQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPEDFGTYYCQHHYDIPLTFGAGTKLELKR TVAAPSVPIFPPDIVMTQSPSSLSVSAGEKVTLSCK SSQSLUSGDQKNYLAWYQQKPGOPPKIiLIYGASTR DSGVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAVYYCQN DKSPPPXFGAGTKLELKR L27 DVD724H AB082VH HG··· 短 AE083VH EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNNYYMSW VRQTPERRLEWVAYISS SGGSTYYSDSVRGRFTISR DTARNTLTLQMTSLKSEDTAMyyCARHFGDYSYFDY WGQGTTLTVSSASTKGPKIQLVQSGPELKKPGETVK ISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWXNI NT GEPTYAEEFKGRFAFSLETSATTAFLQINNLKNEDT ATYLCARDSYSGGFDYWGQGTIVTVSS 128 DVD724L AB082VL LK- 短 AB083VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENFYSY1AWY QQKQGKSPQLLVYKAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPEDFGTyYCQHHYDIPLTFGAGTKLELKR TVAAPDIVMTQSPSSLSVSAGSKVTLSCKSSQSLLI SGDQKNYIAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRDSGVPDR FTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSFPPT FGAGTKLELKR 129 DVD725H AB083VH HG- 長 AB082VH KIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW VKQAPGKGLKWMGWIKINTGEPTYAEEFKGRFAFSL EXSATTAFLQINNLKNEDTATVLCARDSYSGGFDYW GQGTIVTVSSASTKGPSVFPLAPSVQLVESGGGLVQ PGGSLKISCAASGFTFNNYYMSWVRQXPERRLEWVA YISSSGGSTyYSDSVRGRFTISRDTARNTIiYLQMTS LKSEDTAMYYCARHFGDYSYFDYWGQGTTLTVSS 130 DVD725L AB083VL LK- 長 AB032VL DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTLSCKSSQSLLISGDQK NYLAWYOQKPGQPPKLLIYGASTRDSGVPDRFTGSG SGADFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSFPPTFGAGT KLELKRTVaAPSVFirPPDIQMTQSPASLSASVGET VTITCRASENFYSYLAWVQQKQGKSPQLLVYNAKTL AEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQH HYDIPLIFGAGTKLELKR DVD726H 1 AB083VH HG- AB082VH KIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 160878.doc 101 · 201242977
131 短 VKQAPGKGLKWMGWlNINTGEPTyAEEFKGRFAFSL ETSATTAFLQINNIiKNEDTATYLCARDSYSGGFDYW GQGTIVTVSSASTKGP£V〇LVESGGGLVQPGGSLKL SCAASGFTFNNVYMSWRQTPERRLEWVAYISSSGG STyYSDSVRGRFTISRDTARNTLYLQMTSLKSEDTA -MYYCAEHFGDYSYFDYWGQGTTLTVSS 132 DVD726L ABOS3VL LK- 短 AB082VL DIVMTOSPSSLSVSAGEKVTLSCKSSQSLLISGDQK NYLAWiQQ；<PGQPPKLLIYGASTRDSGVPDRFTGSG SGADFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSFPPTFGAGT KLELKRTVAAPDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRA SENFYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSR FSGSGSGTOFSLKINSLQPEDFGTYYCQHKYDIPLT FGAGTKLELKR 表4 :結合NGAL及IL-18之雙重可變異域序列
SEQ ID KO DVD可變 異域名稱 外部可變 異域名稱 連接子 内部可變 異域名稱 序列 123456709012345678901234567890123456 133 DVD727H AB082VH HG- 短 AB088VH EVQLVESGGGLVQPGG3LKLSCAASGFTFNNYYMSW VRQTPERRLEWVAYISSSGGSTYYSDSVRGRFTISR DTARNTLYLQMTSLKSEDTAMYYCARHFGDYSYFDY WGCJGTTLTVSSASTKGPQVQLQQPGSELVRPGASVK LSCKASG^IFTS YWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGX VNTNYDEKFKNKATLTVDTSSSTAYMLLSSLTSEDS AVYYCTRDYYGGGLNYWGQGTTLTVSS 134 DVD727L AB082VL LK- 短 AB088VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENFySYLAWY QQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKXNSLQPEDrGTYYCQHHrDIPLTFiSAGTKLELKR TVAAPSIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSN DVAWPQQKPGQSPKLLIYYASNRYAGVPDRFTGSGF GTDFTFTISTVQAEDLAVYFCHQDYSSPRTFGGGXK LEIKR 135 DVD728H AB082VH HG- 長 AB088VH ΕνΟ^ΕΒΟΟΰ^ΟΡασδΙ,ΚΙ,δΟΑΑεΟΓΤΕΝΝΥΥΜΒΜ VRQTPERRLEWVAYISSSGGSTYYSDSVRGRFTISR DTARNTLyLQMTSLKSEDTAMYYCARHFGDYSYFDY WGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPQVQLQQPGSELV RPGASVKLSCKASGYTFTS YWMHWVKQRPGQGLEW t GNIYPGTVNTNYDEKFKNKAXLTVDTSSSTAYMLLS SLTSEDSAVYYCTRDYYGGGLNYMGQGTTLTVSS 136 DVD728L AB082VL LK— 長 AB088VL ΟΙ〇Μ1Ό5ΡΑ5Ι^Α5νβΕΤνΤηΧΚΑ$εΝΓ^ΥΙΑΪ^ QQKCJGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFS LKINSLQPEDFGTYYCQHHYDIPLTFGAGTKLELKR tvaapsvpifppsivmiqtpkfllvsagdrvtitck ASQSVSNDVAWFQQKPGQSPKLLIYVASNRYAGVPD RFTGSGFGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCHQDYSSPR TFGGGTKLSIKR 137 DVD729H AB082VH HG-長χ2 AB088VH VRQTPSRRLEWVAYISSSGGSTYYSDSVRGRFTISR DTARNTLYLQMTSLKSEDTAMYYCARKFGDYSYFDy WGQGTTLTVSSASTKGPSVPPLAPA8TKGPSVFPLA pqvqlqqpgselvrpgasvklsckasgytftsywmh WVK0RPGQGLEWI6NTYPGTVNTNYDEKFKNKATLT VDTSSSTAYMLLSSLTSEDSAVYYCTRDYYGGGLNY WGQGTTLTVSS 138 DVD729L AB082VL LK-長χ2 AB088VL DIQMTQSFASLSASVGEr/TITCRASENFYSYLAWY QQKQGKSPOLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTOFS LKINSLQPEDFGTYYCQHHYDIPLTFGAGTKLELKR TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPPS XVMTQTPKFLL VSAGDRVTXTCKASQSVSNDVAWFQQKPGQSPKLLI YYASNRYAGVPDRFTGSGFGTDFTFTISTVQAEDLA VYFC HQDYS SPRTFGGGTKLEIXR 139 DVD730H AB088VH HG— 短 AB082VH QVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHW VKQRPGQGLEWIGNIYPGTVNTNYDEKFKNKATLTV
I60878.doc -102-
S 201242977
SEQ ID HO DVD可變 異域名稱 外部可變 異域名稱 連接子 内部可變 異域名稱 序列 12345678901234567890123456789012345$ DTSSSTAyKLLSSLTSEDSAVYYCTRDYYGGGLNYW GQGTTLTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPGGSLKL SCAASGFTFNNYYMSWVRQTPERRLEWVAYISSSGG STYYSDSVRGRFTISRDTARNXLYLQMTSLKSEDTA MYYCARHFGDYSYFDYWGQGTTLTVSS 140 DVD730I* ftB088VL LK- 短 AB0S2VL SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWF QQKPGQSPKLLIYYASNRYAGVPDRFTGSGFGTDFT FTISXVQAEDLAVYFCHQDYSSPRTFGGGTKLEIKR TVAAPDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENFYS YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGS GTQFSLKINSL〇PEDFGTYYCQHHYDIPLTFGAGTK LELKR 141 DVD731H AB088VH HG— 長 AB082VH QVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHW VKQRPGQGLEWIGNIYPGTVNTNYDEKFKNKATLTV DTSSSTAYMLLSSl.TSEDSAVYYCTRDYYGGGLNYW G〇GTTLTVSSASTKGPSVFPIAPEV〇LVESGGGLVQ PGGSLKLSCAASGFTFNNYYMSWROTPERRLEIWA YXSSSGGSTYYSDSVRGRFTISKDTARNTLyLQMTS LKSEDTAMYYCARHFGDYSYFDYWGQGTTLTVSS 142 DVD731L AB088VL LK- 長 AB082VL SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTIXCKASQSVSNDVAWF QQKPGQSPKLLIYYASNRYAGVPDRFTGSGFGTDFT FXISTVQAEDLAVYFCHQDYSSPRTFGGGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPDIQMIQSPASLSASVGETVTITCR ASENFYSYLAWyQQKQGKSPQLLVVNAKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYDIPL TFGAGTKLELKR 143 DVD732H AB088VH HG-長x2 AB082VH QVQLQOPGSELVRPGASVXLSCKaSGYTFTSYWMHW VKQRPGQGLEWIGNIYPGTVNINYDEKFKNKATLTV DTSSSTAYMLLSSLTSEDSAVYYCTRDYYGGGLNYW GQGT TLTVS SASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNNYYMSW VRQTPERRLEWVAYXSSSGGSTYYSDSVRGRFTISR DTARNTLYLQMTSLKSEDTAMXYCARHFGDYSyFDY WGQGTTLTVSS 144 DVD732L AB088VL LK-長x2 AB082VL SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWF QQKPGOSPKLLIYYASNRYAGVPDRFTGSGFGTDPT FTISTVQAEDLAVYFCHQDYSSPRTFGGGTKLEIKR ΤνΑΑΜνΓΙΓΡΡΤνΑΑΡενΓΙΓΡΡΟΙΟΜΤί^ΡΑεί^ ASVGETVTITCRASENFYSYLAWYQQKQGKSPQLX.V YNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFG TYYCQHHYDIPLTFGAGTKLELKR 表5 :結合BNP之雙重可變異域序列
SEQ ID NO DVD可變 異域名稱 外部可變 異域名稱 連接子 内部可變 異域名稱 序列 123456789012345678901234567690123456 145 DVTH33H AB089VH HG- 長 AB089VH QIQLVQSGPELRKPGETVKISCKGSGYTFTHVGINW VKQTPRKDLKWI'lGWrNTHTGEAiYADDFKGRFAFSL· ETSANTAYLQINNLNNGDMGTYFCTRSHRFGLDYWG QGTSVTVSSASTKGPSVFPIAPQIQLVOSGPELRKP GETVKISCKGSGYTFTHYGINWVKQTPRKDLKWMGW INTHTGEAYyADDFKGRFAFSLETSANTAYLQINKL NNGDMGXYFCTRSHRFGLDYWGQGTSVTVS3 146 DVDT33L AB089VL LK- 長 AB089VL DNVLTQSPPSLAVSLGQRATISCKANWPVDYNGDSY LNWYQQSCPGQPPKFLIYAASNLESGIPARFSGSGSG TDFNLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPDNVLTQSPPSLAVSLGQRAT ISCKAWflPVDYNGDSYLNWYQQKPGQPPKFLIYAAS NLESGIPARFSGSGSGTDFNLNIHPVEEEDAATYYC QQSNEDPFTrGSGTKLEIKR DVD734H AB089VH HG- AB089VH QrQLVQSGPELRKPGETVKISCKGSGYTFTHYGINW 160878.doc 103- 201242977
147 短 VKQTPRKDLKWMGWINTHTGEAYYADDFKGRFAFSL ETSANTAYLQINNLNNGDMGTYFCTRSHRFGLDYWG QGTSVTVSSASTKGPQIQLVQSGPELRKPGETVKIS CKGStSYTFTHYGINWVKQTPRKOLKlfMGWINTHTGE AYYADDFKGRFAFSLETSANTAYLQINNLMNGDMGT YFCTRSHRFGLDYWGQGT5VTVSS 148 DVD734L AB089VL LK- 短 AB089VL DNVLTQSPPSLAVSLGQRATXSCiCANWPVDyNGDSY LNWYQQKPGQPPKFLIYAASNLESGIPARFSGSGSG TDFNLNIHPVEEEDAATYYCQOSNEDFFTFGSGTKL EIKRTVAAPDNVLTQSPPSUVVSLGQRATISCKANW PVDYNGDSYJL,NWyQQKPGQPPKFLIYAASNLESGIP ARFSGSGSGTDFNLNIHPVEEEPAATYYCQQSNEDP FTFGS6TKLEIKR 149 DVD735H AB090VH HG- 長 AB090VH QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCXASGYIFTSYWMNW vkqrpeqglewigridpydsethynqkfkdkailtv DKSSSTAFVQLTSLTSEDSAVYYCVSDGYWGAGTXV TVSSASTKGPSVPP1APQVQLQQPGAELVRPGASVK LSCKASGYTFTSYWMNWVKQRFEQGl.EWXGRrD?YD SETHYNQKFKDRAILTVDKSSSTAFVQLTSLTSEDS AVYYCVSDGYWGAGTTVTVSS 150 DVD735L AB090VL LK- 長 AB090VL OWMTOTPLTLSVTTGQPASISCKSSQSLLDSDGKT YLNWLFQRPGESPKLLIYWSKLESGVPDRFTGSGS gtdftlkisrveaedlgvyyclqathffwtfgggtk LEIKRTVAAPSVPIFPPDWMTQTPLTLSVTTGQPA SISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLFQRPGESPKLLIYV VSKLESGVPDRFTGSGSGXDFTLKISRVEAEDLGVY YCXiQATHFPWTFGGGTKLErKR 151 DVD736H AB090VH HG- 長 AB089VH qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgytftsywmnw VKQRPEQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTV DKSSSTAFVQLTSUTSEDSAVYYCVSDGYWGAGTTV TVSSASTKGPSVFPLAPQIQLVQSGPELRKPGETVK ISCKGSGYTFTHYGINWVKQTPRKDLKWMGWINTHT GEAYYADDFKGRFAFSLETSANTAYLQIbWLNNGDM GTYFCIRSHRFGLDYWGQGTSVTVSS 152 DVD736L AB090VL LK- 長 AB089VL DWMTQTPLTLSVTTGQFASISCKSSQSLLDSDGKT yLNWLFQE^PGESPKLl.IYVVSKLESGVPDRFTGSGS gtdftlkisrveaedlgvyyclqathfpwtfgggtk LEIKRTVAAPSVFIPPPDNVLTQSPPSLAVSLGQRA TISCKANWPVDyNGDSyLNWYQQKPGQPPKFLryAA SNLESGIPARFSGSGSGTDFNLNIHPVEEEDAATYY CQQSNEDPFTFGSGTKLEIKR 153 DVD737H AB090VH HG-長x2 AB089VH QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNW VKQRPEQGLEWXGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTV DKSSSTAFVQLTSLTSEDSAVYYCVSDGYV7GAGTTV tvssastkgpsvfplapastkgpsvfplapqiqlvq SGPELRKPGETVKISCKGSGYTFTHYGINWVKCTPR KDLKWMGWINTHTGEAYyADDPKGRFAFSLETSANT AYLQINNLNNGDMGTYFCTRSHRFGLDYWGQGTSVT VSS 154 DVD737L AB090VL LK-長x2 AB089VL DWMT〇TPLTLSVTTGQPASlSCKSSQSLLDSDGKT YLNWLFQRPGESPKLUIYWSKLSSGVPDRFTGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQATHFPV3TFGGGTK LEIKRTVAAPSVPIFPPTVAAPSVFIFPPDNVLTQS PPSLAVSLGQRATISCKANWPVDYNGDSYLNWYQQK PGQPPKFLIYAASKLESGIPARFSGSGSGTDFNLNI HPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIKP 155 DVD738H AB089VH HG- 長 AB090VH QIQLVQSGPELBKPGETVKISCKGSGYTFTHYGINW VKQTPRKDLKWMGWINTHTGEAYyADDFKGRFAFSL ETSANTAYLQINNLNNGDM6TYFCTRSHRFGLDYWG QGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPQVQLQQPGAELVRP GASVKLSCKASGyTFTSYWMNWVKQRPEQGLEWIGR IDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAFVOLTSL TSEDSAVYYCVSDGYWGAGTTVTVSS 156 DVD73BL AB089VL LK- 長 AB090VL DNVLTQSPPSLAVSLGQRATISCKANWPVDYNGDSy LNWYQQKPGQPPKFLlYAASNLESGXPARrSGSGSG TDFNLNIHPVEEEDAATyYCOQSNEDPFTFGSGTKL
160878.doc -104- s 201242977
EIKRTVAAPSVFIFPPDWMTQTPLTLSVTXGQPAS ISCKSSQSLLDSDGKTYL1WLFQRPGESPKLLIYW sklesgvpdrftgsgsgtdftlkisrveaedlgvyy CLQMHFPWXFGGGTKLEIKR 157 DVD739H AB089VH HG-長β AB050VH QIQLVQSGPELRKPGETVKISCKGSGYTFTHYGINW VKQTPRKDLKWMGWINTHTGEAYYADDFKGRFAFSL ETSANTAYLQINNLNNGEMGTYFCTRSHRFGLDYWG QGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPIAPQ VQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSyWMNWV korpeqglewigridpydsethynqkfkdkailtvd KSSSTAFVQLTSJVTSEDSAVYYCVSDGYWGAGTTVT vss 158 DVD739L AB089VL LK- 長β AB090VL DNVLTQSPPSLAVSLGQRATISCKANWPVDYNGDSY LNWYQQKPGQPPKFLIYAASNLESG1PARFSGSGSG TDFNLNIHPVEEEDAATYYCQQSWEDPFXFGSGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPPDVVMTQTP LTLSVTTGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLFQR PGESPKLLIYWSKLESGVPDRFTGSGSGTDFTLKI srveaedlgvyyclqathfpwtfgggtkleikr 159 DVD742H AB092VH HG- 長 AB092VH QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNW VKQRPEQGLSWIGRIDPVDSETHYNQKFKDKAILTV DKSSSTAFVQLTSLTSEDSAVYYCVSDGyWGAGTTV TVSSASTKGPSVFPLAPQVQLQQPGAELVRPGASVK LSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPEQGLEWIGRIDPYD SETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAFVQLTSLTSEDS AV^YCVSDGYWGAGTTVTVSS 160 DVD742L AB092VL LK- 長 AB092VL DWMTQTPLTLSVTTGQPASISCKSSQSLLDSDGKT YLNWLFQRPGESPKLLIYVTDILESGVPDRFTGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQATHFPViTFGGGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPDWMTQTPLTLSVXTGQPA SISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLFQRPGESPKLLXYV TDIIiESGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVSAEDLGVY YCLQAXHFPWTFGGGTKLEIKR
表6 :結合Tnl之雙重可變異域序列
SSQ ZD MO DVD可變 異域名稱 外部可變 異域名稱 連接子 内部可變 異域名稱 序列 123456789012345678901234567890123456 161 DVD743H AB093 VH KG- .長 AB093VH EVQLQQSGPDLVKPGASVRISCKASGYTFTDY NLKWVKQSHGKSLEWIGVIYPYNGITGYNQKF KSKATLTVDSSSNTAYMDLRSLTSEDSAVYFC ARDAYDYDYLTDtiGQGTLVTVSAASTKGPSVP PIAPEVQLQQSGPDLVKPGASVRISCKASGYT FTDYNLHWVKQSHGKSLEWIGYIYPYNGITGY NQKFKSKATLTVDSSSNTAYMDLRSLTSEDSA VYFCARDAYDYDYLTDWGQGTLVTVSA 162 DVD743L AB093 VL LK- 長 AB093VL DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRTSKNVGTN IHWYQQRTNGSPRLLIKYASERLPGIPSRFSG SGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNNWPY TFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPDILLTQSP VILSVSPGERVSFSCRTSKNVGTNIKWYQQRT NGSPRLLIKYASERLPGIPSRFSGSGSGTDFT LSINSVESEDXADYYCQQSNNWPYTFGGGTKL EIKR A5.域抗趙 用於本發明之TVD結合蛋白中之親本結合蛋白可包括重 160878.doc 105· 201242977 鏈抗原結合域及輕鏈抗原結合域，其中抗原結合域為域抗 體。域抗體在此項技術中為已知的且例如於7,829,096(以 引用的方式併入本文中）中提供篩檢結合特定抗原決定基 之域抗體之方法。許多域抗體序列公開可得於例如美國專 利 7,696,320及 7,829,096 ;及美國專利公開案 20100266616、 20100234570、20100028354、20060002935 中，該等專利 皆以全文引用的方式併入本文中。 A7.受體免疫球蛋白 用於本發明之TVD結合蛋白中之親本結合蛋白可包括重 鲁 鍵抗原結合域及輕鏈抗原結合域，其中抗原結合域為受體 序列。許多受體序列在此項技術中為已知的且可使用 BLAST或許多公開可用資料庫之任一者鑑別。其他受體序 列包括美國專利申請案2002/0127231中提供之彼等免疫球 蛋白分子，該專利申請案以引用的方式併入本文中，包括 序列表。受體序列可使用用於產生包括其他可變異域序列 之半體（half-body)之相同分子生物學技術併入本發明之半 Ig結合蛋白中。適用於本發明之TVD結合分子中之例示性 _ 受體序列包括例如 CTLA4(AMHVAQPAVVLASSRGIASFV CEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELT FLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPP PYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD ； SEQ ID NO]63)及
TNFRSF1B(AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSK
CSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLS
CGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCR 160878.doc -106· s 201242977 LCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSST DICRPHQIC ; SEQ ID NO:164)。 Α8·骨架抗原結合蛋白 用於本發明之TVD結合蛋白中之親本結合蛋白可包括重 鏈抗原結合域及輕鏈抗原結合域，其中抗原結合域為骨架 抗原結合蛋白。骨架抗原結合蛋白在此項技術中為已知 的，舉例而言，纖維結合蛋白及經設計之錫蛋白（ankyrin) 重複蛋白質（DARPin)已用作抗原結合域之替代性骨架，參 _ 見例如 Gebauer及 Skerra. Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及 Stumpp等人 Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discov Today 13: 695-701 (2008)，該兩者均以全文引用的方式併入本文中。 A9.半Ig結合蛋白 用於本發明之TVD結合蛋白中之親本結合蛋白可包括源 於以下提供之半免疫球蛋白結合蛋白或半Ig之重鏈抗原結 • 合域及輕鏈抗原結合域：2010年12月22日申請之美國專利 申請案第61/426,207號及2011年9月26曰申請之美國專利申 請案第61/539,130號、及在同一天以相同受讓人名義正作 為本申請案申請之美國專利申請案第________號。上述申 請案各自之全部内容以引用的方式併入本文中’包括序列 表。 B.選擇親本結合蛋白之準則 本發明之一個實施例係關於選擇具有一或多種為TVD結 160878.doc -107· 201242977 合蛋白中所要之性質的親本結合蛋白，例如抗體；可變異 域及/或受體。在一個實施例中，所要性質係選自一或多 個結合蛋白（例如抗體）參數。在另一實施例中，結合蛋白 參數係選自由以下組成之群：抗原特異性、對抗原之親和 力、效能、生物功能、抗原決定基識別、穩定性、溶解 性、生產效率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組 織交叉反應性及直系同源抗原結合。 B1.對抗原之親和力 治療性結合蛋白（例如單株抗體）之所要親和力可視抗原 之丨生質及所要冶療終點而定。在一個實施例中，當單株抗 體阻斷細胞激素-細胞激素受體相互作用時，其具有較高 親和力（Kd=〇.〇i_0.50 pM)，目為此等相互作用通常為高親 和力相互作用（例如<ρΜ·<ηΜ範圍）。在此等情況下，單株 =體對其目標之親和力應等於或高於細胞激素（配體）對其 又體之親和力。在另_方面，親和力較小卜福範圍）之單 株抗體可在治療上有效用於例如清除循環之潛在病原性蛋 質丫丨如可、、螯合及清除Αβ殿粉樣蛋白（amyloid)之 循環中㈣之單株抗體。在其他情況下，#由定點誘變法 降低現有高親和力嵐姓> _ 早株抗體之親和力或使用對目標之親和 力較低之單株抗體，·^ 體 了用於避免潛在副作用，例如高親和 力皁株抗體可螯合/ 中和其所有預定目標，藉此完全消耗/ /为除所靶向之蛋白皙 抗的功能。在此情況下，低親和力單株 才几體可整合/中和目姆 π之可能造成疾病症狀（病理性或過度 座生之含量）之八 ， 刀從而允許目標之一部分繼續執行其 160878.doc 201242977 正常生理功能。因此，有可能降低Kd以調整劑量及/或降 低副作用。親本單株抗體之親和力可能影響適當靶向細胞 表面分子，以達成所要治療結果。舉例而言，若目標以高 密度表現在癌細胞上且以低密度表現在正常細胞上，則親 和力較低之單株抗體將在腫瘤細胞上比在正常細胞上結合 更多數量之目標，從而經由ADCC或CDC消除腫瘤細胞， 且因此可能具有治療所需效應。因&，選擇具有所要親和 力之單株抗體可與可溶性目標與表面目標兩者相關。 透過觉體與其配體相互作用後所引起之信號傳導可視受 體-配體相互作用之親和力而定。類似地，認為可由單株 抗體對表面受體之親和力來決定細胞内信號傳導之性質及 單株抗體係傳遞促效劑信號抑或傳遞拮抗劑信號。單株抗 體介導之信號傳導之基於親和力的性質可影響其副作用概 況。因此，需要藉由活體外及活體内實驗仔細確定治療性 單株抗體之所要親和力及所要功能。 結合蛋白（例如抗體）之所要Kd可視所要治療結果而定以 實驗方式確定^在―個實施例中，選擇對特定目標抗原之 親和力（Kd)等於或大於TVD結合蛋白對相同抗原之所要親 和力的親本結合蛋白，例如抗體。針對既定TvD結合蛋白 之親本結合蛋白（例如抗體）可為相同結合蛋白（例如抗體） 或不同結合蛋白（例如抗體）。藉由Biac〇rei另一類似技術 评估抗原結合親和力及動力學。在_個實施例中，各親本 、’σ σ蛋白（例如抗體）對其目標抗原之解離常數（Kd)選自由 以下組成之群：至多約10-7m;至多約1〇·8μ;至多約1〇·9μ; 160878.doc 201242977 至多約10 10 Μ ;至多約ι〇-〗ι M ;至多約1〇-i2 M ;及至多 約10 13 M。可變異域所獲自之親本結合蛋白（例如抗體）可 對其各別目標抗原具有類似或不同親和力（κ〇)。如藉由表 面電漿子共振所量測，各親本結合蛋白（例如抗體）對抗原 之締合速率常數(U選自由以下組成之群：至少約1〇2 ，· 至少約1〇3 Μ、-1 ;至少約1〇4 ΜΛ·1 ;至少約1〇5 ; 及至少約1〇6 。可變異域所獲自之親本結合蛋白（例 如抗體）可對其各別目標抗原具有類似或不同締合速率常 數（Kcn)。在一個實施例中，如藉由表面電漿子共振所量 測，各親本結合蛋白（例如抗體）對抗原之解離速率常數 (Koff)選自由以下組成之群：至多約1〇·3〆；至多約1〇_4 ^ ; 至夕約10 S ，及至多約1〇·6 S-I。可變異域所獲自之親本 結合蛋白（例如抗體）可對各別抗原具有類似或不同解離速 率常數（Km)。 B2.效能 親本結合蛋白（例如單株抗體）之所要親和力/效能將視所 要治療結果而定。舉例而言，對於受體_配體（r_l)相互作 用’親和力（kd)等於或大於R_L範圍）。對於簡單清 除病理性循環蛋白質，例如清除各種循環A_p肽物質 當例如本發明之結合蛋白之 才/1·原但結合不同抗原決定基時 三個可變異域結合相同目標 ’ TVD結合蛋白將含有至少 可處於低nM範圍内。此外， 抗原決定基之多個複本而定， 中之構形抗原決定基。
Kd亦將視目標是否表現相同 例如單株抗體靶向Αβ寡聚物 160878.doc •110- 201242977 三個針對相同抗原之結合位點，從而增加親合力且藉此增 加TVD結合蛋白之表觀kd。在一個實施例中，選擇kd等於 或小於TVD結合蛋白中之所要kd的親本結合蛋白，例如抗 體。對親本單株結合蛋白（例如抗體）之親和力考慮亦可視 TVD結合蛋白是否含有三個或三個以上相同抗原結合位點 (例如三個可變異域（重及輕）係自單一單株抗體獲得之 TVD-Ig蛋白質）而定。在此情況下，歸因於親合力，表觀 kd將大於單株抗體。此等TVD結合蛋白可用於交聯表面受 體、增加中和效能、增強病理性蛋白質之清除等。 在一個實施例中，選擇對特定抗原之中和效能等於或大 於TVD結合蛋白對相同抗原之所要中和潛力的親本結合蛋 白（例如抗體）。可藉由目標依賴性生物分析評估中和效 能，其中適當類型之細胞反應於目標刺激而產生可量測信 號（亦即增殖或細胞激素產生），且單株抗體對目標之中和 可以劑量依賴性方式減弱該信號。 B3.生物功能 結合蛋白（例如單株抗體）可潛在地執行若干功能。一些 此等功能列於表7中。此等功能可藉由活體外分析（例如細 胞基分析及生物化學分析）與活體内動物模型兩者來評估。 表7:治療性結合蛋白之一些潛在應用 目標(類別） 作用機制（目標） 可溶性 活性中和(例如細胞激素） (細胞激素，其他） 增強清除(例如Αβ寡聚物） 增加半衰期(例如GLP 1) 細胞表面 促效劑(例如GLP1 R ; CTLA4 ; TNFSR1 ; EPOR等） (受體，其他） 拮抗劑(例如整合素等）、細胞毒素(CD20等） 蛋白質沈積物 增強清除/降解(例如Αβ斑塊，澱粉樣蛋白沈積物） 160878.doc -111- 201242977 可選擇具有本文實例中於例如表1-6' 8、11、13、14及 15中所述之不同功能之結合蛋白（例如單株抗體）以達成所 要治療結果。可接著以TVD結合蛋白形式使用一或多種所 選親本結合蛋白（例如單株抗體）以在單-TVD結合蛋白中 達成-或多種不同功能。舉例而言，可藉由選擇一或多種 中和特疋細胞激素之功能之親本結合蛋白(例如單株抗體) 及選擇-或多種增強對病理性蛋白f之清除之親本結合蛋 白（例如單株抗體）來產生TVD結合蛋白。類似地，可選擇 識別兩種不同細胞表面受體之兩種親本結合蛋白（例如單 株抗體），例如-種mAb對—種受體具有促效劑功能，且 另iAb對不同受體具有括抗劑功能。此兩難自具有不 同功能之所選單株抗體可用於構築將在單一分子中具有所 選單株抗體之兩種不同功能（促效劑及拮抗劑）的單一咖 結合蛋白。類似地，兩種各自阻斷各別受體配體（例如Egf 及IGF)的結合之針對細胞表面受體之拮抗性結合蛋白（例 如單株抗體）可以TVD結合蛋白形式使用。相反，可選擇 拮抗性抗受體mAb(例如抗EGFR)及中和抗可溶性介體（例 如抗IGFl/2)mAb來製備TVD結合蛋白。 亦可藉由選擇-種中和特定細胞激素之功能之親本結合 蛋白（例如單株抗體）’選擇一種增強對病理性蛋白質之清 除之親本結合蛋白（例如單株抗體）及具有選擇性細胞毒性 之第二親本結合蛋白（例如單株抗體）來產生結合蛋 白。類似地，可選擇識別三種不同細胞表面受體之三種親 本結合蛋白（例如單株抗體），例如一種單株抗體對一種受 J12 160878.doc 201242977 體具有促效劍功能’一種單株抗體斜ππ < 不早株抗組對不同受體具有拮抗劑
功能，且一種單株抗體增強對病理性蛋白質之清除。劑 種各自具有不同功能之所選結合蛋白可用於構^將在^ 分子令具有所選結合蛋白之三種不同功能(促效劑 劑）的單—TVD結合蛋白。類似地，三種各自阻斷各^ 體配體（例如刪、跡及PDGF)的結合之針對細胞表面二 體之括抗性結合蛋白（例如單株抗體）可以tvd結合蛋白= 式使用。另外’可選擇括抗性抗受體結合蛋白（例如 抗體（例如抗EGFR))、第—中和抗可溶性介體⑼如抗 咖）結合蛋白（例如單株抗體）及第二中和抗可溶性介體 (例如抗IGF2)來製備TVd結合蛋白。 B4·抗原決定基識別 蛋白質之不同區可執行不同功能。舉例而言，細胞激素 之特定區域與細胞激素受體相互作用以引起受體活化，而 蛋白質之其他區域可為使細胞激素穩定所需。在此情況 下：可選擇一或多種特異性結合細胞激素上之受體相互作 用區之結合蛋白（例如單株抗體）且藉此阻斷細胞激素-受體 乍用在些情況下，例如在結合多個配體之某些趨 子又體之情況下，可選擇結合僅與一種配體相互作用 ^几原決定基（趨化因子受體上之區域）的結合蛋白，例如 早株抗體。在其他實施例中’可選擇結合例如趨化因子受 體上之與一#以上配體相互作用《抗原&定基的結合蛋 ^ 1如單株抗體。在其他情況下，結合蛋白（例如單株 抗體)可結合目標上之不直帛負責蛋白質生理功能之抗原 160878.doc •113- 201242977 決定基’但單株抗體與此等區域之結合可干擾蛋白質之生 理功能（位阻）或改變蛋白質之構形以使蛋白質不能起作用 (單株抗體與具有多個配體之受體結合會改變受體構形以 使無配體可結合）。亦已鑑別不阻斷細胞激素與其受體結 合但阻斷信號轉導之抗細胞激素結合蛋白，例如單株抗體 (例如125-2H，—種抗IL-18單株抗體）。 抗原決疋基及結合蛋白（例如單株抗體）功能之實例包括 (但不限於）阻斷受體-配體（R_L)相互作用（中和結合R相互 作用位點之單株抗體）；例如引起R_結合減少或無R結合 之位阻。抗體可在除受體結合位點以外之位點處結合目 才示’但仍藉由誘導構形變化及消除功能（例如X〇lair)，例 如結合R但阻斷信號傳導（125_211)來干擾目標之受體結合 及功能。 在一個實施例中，親本單株結合蛋白（例如抗體）需要靶 向適當抗原決定基以達成最大功效。此抗原決定基在Tvd 結合蛋白中應為保守的。結合蛋白（例如單株抗體）之結合 抗原決定基可藉由若干方法來確定，包括共結晶術 '單株 抗體-抗原複合物之限制性蛋白質水解加質譜肽圖分析 (mass spectrometric peptide mapping)(Legros，V.等人（2000)
Protein Sci. 9: 1002-10)、噬菌體呈現肽文庫（〇，c〇nn〇r， K.H.等人（2005) J. Immunol. Methods 299: 21-35)以及誘變 法（Wu C.等人（2003) J. Immunol. 170:5571-7) 〇 Β5·物理化學及醫藥性質 用結合蛋白（例如抗體）進行治療性治療常需要投與高劑 160878.doc -114- 201242977 量，通常為每公斤數毫克（歸因於由於分子量通常較大而 基於質量之效能較低）。為調節患者順應性且為適當處理 慢性疾病療法及門診患者治療，需要皮下（s c )或肌肉内 (i.m·)投與治療性結合蛋白，例如單株抗體。舉例而言， 皮下投藥之最大所需體積為約1〇 mL，且因此，需要 >100 mg/mL之濃度以限制每劑量之注射次數。在一個實施 例中，以單劑量投與治療性結合蛋白，例如抗體。然而， 此等調配物之開發受限於蛋白質_蛋白質相互作用（例如潛 在地增加免疫原性風險之聚集）及在加工及傳遞期間之限 制（例如黏度）。因此，為臨床功效所需之大量及相關開發 約束會限制抗體調配物之潛能之充分利用及以高劑量方案 皮下4又藥。顯然的是蛋白質分子及蛋白質溶液之物理化學 及醫藥性質（例如穩定性、溶解性及黏度特徵）極為重要。 B5.1.穩定性 「穩定」結合蛋白（例如抗體）調配物為結合蛋白（例如抗 體）在儲存後基本上保留其物理穩定性及/或化學穩定性及/ 或生物活性的調配物。可量測在所選溫度下在所選時期内 之穩定性。在一個實施例中，調配物中之結合蛋白（例如 抗體）在室溫（約30°C )下或在40°C下穩定至少1個月及/或在 約2至8 C下穩又至少1年、諸如至少2年。此外，在一個實 施例中’調配物在將調配物冷凍（至例如-7〇°c )及解凍（下 文稱為「凉/融循環」）後為穩定的。在另一實例中，「穩 定」調配物可為調配物中少於約1 〇〇/〇及少於約5〇/〇之蛋白質 以聚集體形式存在之調配物。 160878.doc -115· 201242977 在各種溫度下在活體外長時期穩定之TVd結合蛋白為合 乎需要的。可藉由快速篩檢在高溫下（例如在4〇〇c下）在活 體外穩定2-4週之親本結合蛋白（例如單株抗體）來達成此目 的’且接著評估穩定性。在2-8它下儲存期間，蛋白質在 至少12個月，例如至少24個月内展現穩定性。穩定性（完 整單體分子之百分比）可使用各種技術，諸如陽離子交換 層析、尺寸排阻層析、SDS-PAGE以及生物活性測試來評 估。關於可用於分析共價及構形修飾之分析技術的更全面 列舉’請參見Jones，A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems, Formulation and delivery of peptides and proteins, Cleland及 Langer編第 1版，ACS，Washington，第 22-45 頁； 及 Pearlman，R.及 Nguyen, T. Η. (1990) Analysis of protein drugs, Peptide and protein drug delivery, Lee編第 1版，
Marcel Dekker, Inc., New York,第 247-301 頁。 異質性及聚集體形成：結合蛋白（例如抗體）之穩定性可 使調配物可顯示低於約10%，諸如低於約5%，諸如低於約 2/〇 ’或在0.5%至1.5%之範圍内或低於〇·5%之GMP結合蛋 白（例如抗體）物質以聚集體形式存在。尺寸排阻層析為一 種在偵測蛋白質聚集體方面靈敏、可再現且極穩健的方 法。 除低聚集體含量之外，在一個實施例中，結合蛋白（例 如抗體）必須具有化學穩定性。化學穩定性可藉由離子交 換層析（例如陽離子或陰離子交換層析）、疏水性相互作用 160878.doc -116- 201242977 層析或諸如等電聚焦或毛細管電泳之其他方法來測定。舉 例而言，結合蛋白（例如抗體）之化學穩定性可使得在2-8°C 下儲存至少12個月後，相較於儲存測試前之抗體溶液，陽 離子交換層析中表示未經修飾之抗體的峰值可增加至多 20%，諸如至多10%或至多5%。 在一個實施例中，親本結合蛋白（例如抗體）呈現結構完 整性；正確雙硫鍵形成及正確摺疊。歸因於結合蛋白（例 如抗體）之二級或三級結構變化之化學不穩定性可影響抗 體活性。舉例而言，如由抗體之活性指示之穩定性可使得 在2-8°C下儲存至少12個月後，相較於儲存測試前之抗體 溶液，抗體之活性可降低至多50%，諸如降低至多30%、 至多10%或至多5%或1%。適合抗原結合分析可用於測定 抗體活性。 B5.2.溶解性 結合蛋白（例如單株抗體）之「溶解性」與正確摺疊之單 體IgG之產生相關。因此，可藉由HPLC評估IgG之溶解 性。舉例而言，可溶性（單體）IgG將在HPLC層析譜上產生 單一峰，而不溶性（例如多聚及聚集）IgG將產生複數個 峰。因此，熟習此項技術者將能夠使用常規HPLC技術偵 測IgG溶解性之增加或降低。關於可用於分析溶解性之分 析技術之更全面列舉，參見Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK.編者： Shamlou, P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions (1993), 93-117。出版商：Butterworth-Heinemann，Oxford, UK ;及 160878.doc -117- 201242977
Pearlman及 Nguyen (1990) Advances in Parenteral Sciences， 4 (Pept. Protein Drug Delivery)，247-301。治療性單株抗體 之溶解性對於調配成通常為足量給藥所需之高濃度而言至 關重要。如本文所概述，可能需要 > 丨00 mg/mL之溶解度以 適應高效抗體給藥。舉例而言，在研究初期，抗體溶解度 可不低於約5 mg/mL ’在過程科學後期諸如不低於約25 mg/mL ’諸如不低於約1〇〇 mg/mL，或不低於約15〇 mg/mL。熟習此項技術者顯而易知蛋白質分子之固有性質 對於蛋白質溶液之物理化學性質（例如穩定性、溶解性、 黏度）而言為重要的。然而，熟習此項技術者應瞭解存在 廣泛多種可用作添加劑以有利影響最終蛋白質調配物之特 徵的賦形劑。此等賦形劑可包括：⑴液體溶劑、共溶劑 (例如醇，諸如乙醇）；（ii)緩衝劑（例如磷酸鹽、乙酸鹽、 檸檬酸鹽及胺基酸緩衝劑）；（iii)糖或糖醇（例如蔗糖、海 溱糖、果糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨糖醇及葡聚糖）； (iv)界面活性劑（例如聚山梨醇酯2〇、聚山梨醇酯4〇、聚山 4醇自曰60及聚山梨醇醋8〇及泊洛沙姆（p〇i〇xamer)) ; (v)等 張性調節劑（例如鹽（諸如NaCl)、糖及糖醇）；及（vi)其他賦 形劑（例如防腐劑、螯合劑、抗氧化劑、螯合物質（例如 EDTA)、生物可降解聚合物及載劑分子（例如HAS及 PEG))。 黏度為與抗體製造及抗體加工（例如透濾/超濾）、填充_ 精製製程（泵送態樣、過濾態樣）及傳遞態樣（可注射性、複 雜裝置傳遞）相關之極重要參數，低黏度使結合蛋白（例如 160878.doc 201242977 抗體）之液體溶液能夠具有較高濃度。此使得可以較小體 積投與相同劑量。小注射體積固有注射疼痛感覺較小之優 勢，且溶液不必需為等張的以減輕患者注射時之疼痛。結 合蛋白（例如抗體）溶液之黏度可使得在1〇〇 (1/s)之剪切速 率下，抗體溶液黏度低於200 mPa s，諸如低於125 mpa s， 諸如低於70 mPa s，諸如低於25 mpa s或甚至低於1〇 mPa s。 B5.3.生產效率 在一個實施例中，高效表現於哺乳動物細胞（諸如中國 倉鼠卵巢細胞（CHO))中之TVD結合蛋白之產生將需要三種 自身高效表現於哺乳動物細胞中之親本結合蛋白，例如單 株抗體。由穩定哺乳動物細胞株（亦即CH〇)獲得之產率 應尚於約0.5 g/L，諸如高於約1 g/L ’諸如在約2-5 g/L或 5 g/L 以上之範圍内（Kipriyanov, S.M 及 Little M· (1999) Mol. Biotechnol. 12: 173-201 ; Carroll，S.及人1如13以，]^· (2004) Expert. Opin. Biol. Ther. 4: 1821-9) 〇 在哺乳動物細胞中產生結合蛋白（例如抗體及Ig融合蛋 白）受若干因素影響。經由併入強啟動子、增強子及選擇 標記對表現載體進行工程改造可使相關基因自整合載體複 本之轉錄最大化。鑑別允許高度基因轉錄之載體整合位點 可增加蛋白質自載體表現（Wurm等人（2004) Nature Biotechnol. 22(11): 1393-1398)。此外，產生量受抗體重鏈 與輕鏈之比率及蛋白質裝配及分泌過程中之各種步驟影響 (Jiang等人（2006) Biotechnol· Prog. 22(1): 313-8)。 B 6·免疫原性 160878.doc •119· 201242977 才又與治療性結合蛋白（例如單株抗體）可引起特定免疫反 應發生（亦即形成針對治療性單株抗體之内源性抗體卜在 選擇親U蛋白（例如單株抗體）期間應分析可能誘導免 疫原性之潛在要素，且可採取降低此風險之步驟以在 結合蛋白構築之前最佳化親本結合蛋白，例如單株抗 體已發現小鼠源性抗體在患者中具有高度免疫原性。 產生匕3小鼠可變異區及人類恆定區之嵌合抗體為降低 治療性抗體免疫原性之下一合乎邏輯步驟。或者，如由 Riechmann 等人（1988) Nature 332: 323_327 關於治療性抗 體所述，可藉由將鼠類CDR序列轉移至人類抗體構架中 (重塑/CDR移植/人類化）來降低免疫原性。另一方法稱為 「表面重塑」或r鑲飾」’其以齧齒動物可變異輕域及重 域起始’僅將表面可接觸之構架胺基酸變為人類構架胺 基酸’同時CDR及内埋胺基酸仍來自親本齧齒動物抗體 (Roguska 等人（1996) Prot. Engineer 9: 895-904)。在另一 類型之人類化中，一種技術僅移植「特異性決定區」 (SDR)而非移植整個CDR，該等SDR定義為抗體與其目標 結合中所涉及之CDR殘基子集（Kashmiri等人（2005) Methods 36(1): 25-34)。此使得有必要經由分析抗體-目標 複合物之可用三維結構或對抗體CDR殘基進行突變分析以 確定與目標相互作用之殘基來鑑別SDR。或者，相較於鼠 類、嵌合或人類化抗體，完全人類抗體可具有降低之免 疫原性8 另一降低治療性結合蛋白（例如抗體）之免疫原性的方法 160878.doc -120- 201242977 為消除經預測具有免疫原性之某些特定序列。在一種方法 中，在人類中測試第一代生物製劑且發現其具有不可接受 之免疫原性之後，可對B細胞抗原決定基進行定位，且接 著進行改變以避免免疫偵測。另一方法使用預測及移除潛 在T細胞抗原決定基之方法。已開發計算方法來掃描且鑑 別有可能結合MHC蛋白質之生物治療劑之肽序列（Desmet 等人（2005) Proteins 58: 53-69)。或者，人類樹突狀細胞基 方法可用於鑑別潛在蛋白質過敏原中之CD4+ T細胞抗原決 定基（Stickler 等人（2000) J. Immunother. 23: 654-60 ; S.L. Morrison及 J· Schlom (1990) Important Adv. Oncol. 3-18 ; Riechmann等人（1988) Nature 332: 323-327; Roguska等人 (1996) Protein Engineer· 9: 895-904; Kashmiri 等人（2005) Methods 36(1): 25-34 ; Desmet 等人（2005) Proteins 58: 53-69 ;及 Stickler 等人（2000) J. Immunotherapy 23: 654-60)。 B 7.活體内功效 為產生具有所要活體内功效之TVD結合蛋白，重要的是 產生並選擇在以組合形式給予時具有類似所要活體内功效 之結合蛋白，例如單株抗體。然而，在一些情況下，TVD 結合蛋白可展現兩種或兩種以上獨立結合蛋白（例如單株 抗體）之組合不能達成的活體内功效。舉例而言，TVD結 合蛋白可使兩個或兩個以上目標緊密鄰近，從而產生兩種 或兩種以上獨立單株抗體之組合不能達成的活性。當有益 的是特異性靶向腫瘤細胞且使免疫效應細胞緊密鄰近於腫 瘤以引發及/或增強對腫瘤之免疫反應時，此結合蛋白適 160878.doc -121 - 201242977 用於治療例如腫瘤病症。 因此’在一個實施例中，本發明之TVD結合蛋白結合 CD3及存在於腫瘤（例如具有混合細胞類型之腫瘤）之異質 細胞上之兩種不同細胞表面分子。在另一實施例中，本發 明之TVD結合蛋白結合免疫細胞受體（諸如NKG2D或Fc<y受 體）及存在於腫瘤（例如具有混合細胞類型之腫瘤）之異質細 胞上之兩種不同細胞表面分子。 其他所需生物功能於本文B 3章節中描述。具有TVD結 合蛋白中所需之特徵的親本結合蛋白（例如抗體）可基於諸 · 如藥物動力學伙；組織分佈；可溶性目標相對於細胞表面 目標；及目標濃度（可溶性）/密度（表面）之因素來選擇。 B8.活體内組織分佈 為產生具有所要活體内組織分佈之TVD結合蛋白，在一 個實施例中，必須選擇具有類似所要活體内組織分佈概況 之親本結合蛋白’例如單株抗體。就此而言，兩種或兩種 以上親本結合蛋白（例如單株抗體）可為相同抗體或不同結 σ蛋白，例如抗體。或者，基於三特異性靶向策略之機 籲 制’在其他情況下可能不需要選擇兩種或兩種以上在以組 合形式給予時具有類似所要活體内組織分佈之親本結合蛋 白（例如單株抗體）（例如在一種結合組分使TVD結合蛋白靶 向一特異性位點，藉此將第二（及/或第三）結合組分引至相 同目標位點之TVD結合蛋白的情況下即如此）。舉例而 ° TVD結合蛋白之一或多種結合特異性可靶向胰臟（胰 島細胞）且另一（一或多種）特異性可將GLP1引至胰臟以誘 160878.doc
S •122- 201242977 導胰島素。 B 9.同型 在-個實施例中，為產生具有所要性質(包括(但不限於) 同型、效應功能及循環半衰期）之TVD結合蛋白，視治療 效用及所要治療終點而定選擇一或多種具有適當Fc效應功 能之親本結合蛋白，例如單株抗體。兩種或兩種以上親本 結合蛋白（例如單株抗體）可為相同抗體或不同抗體。存在 五個主要重鏈類別或同型，其中一些具有若干亞型，且此 等類別或同型決定抗體分子之效應功能。此等效應功能存 在於抗體分子之鉸鏈區、CH2域及CH3域中。然而，抗體 分子之其他部分中之殘基亦可對效應功能具有影響。鉸鏈 區Fc效應功能包括：⑴抗體依賴性細胞毒性；（Η)補體 (C1 q)結合、活化及補體依賴性細胞毒性（Cdc) ; (iii)抗原_ 抗體複合物之吞噬/清除；及（iv)在一些情況下，細胞激素 釋放。抗體分子之此等Fc效應功能係經由Fc區與一組類別 特異性細胞表面受體之相互作用來介導》IgGl同型抗體最 具活性，而IgG2及IgG4具有最小效應功能或不具有效應功 能。IgG抗體之效應功能係經由與三種結構上同源之細胞 Fc受體類型（及亞型）（FcgRl、FcgRII及FcgRIII)相互作用來 介導。可藉由使下游鉸鏈區中之為FcgR及Clq結合所需之 特定胺基酸殘基突變（例如L234A、L235A)來消除IgGl之 此等效應功能。Fc區，特定言之CH2-CH3域中之胺基酸殘 基亦決定抗體分子之循環半衰期。此Fc功能係經由Fc區與 新生兒Fc受體（FcRn)之結合來介導，該結合負責使抗體分 160878.doc •123. 201242977 子自酸性溶酶體再循環回全身循環中。 單株抗體應具有活性抑或非活性同型將視抗體之所要治 療終點而定。同型之使用及所要治療結果之一此實例列於 下文： a)右所要終點為功能性巾和可溶性細胞激素，則可使 用非活性同型； )右所要結果為清除病理性蛋白質，則可使用活性同 型； c) 右所要結果為清除蛋白質聚集體則可使用活性同 型； d) 右所要結果為拮抗表面受體，則使用非活性同型（泰 沙比（Tysabri)，igG4 ; 〇KT3，突變 IgGl); e) 右所要結果為消除目標細胞，則使用活性同型（赫赛 >T(Heixeptin) ’ IgGl(且具有增強之效應功能））；及 0若所要結果為自循環清除蛋白質而 不進入CNS中，貝ij 可使用IgM同型（例如清除循環Ab肽物質）。 親本結合蛋白（例如單株抗體）之Fc效應功能可藉由此項鲁 技術中熟知之各種活體外方法來測定。 如所論述’對同型之選擇，及藉此對效應功能之選擇將 視所要治療終點而定。在需要簡單中和循環目標（例如阻 斷文體-配體相互作用）之情況下，可能不需要效應功能。 在此等情況下’抗體之消除效應功能之同型或以區突變為 合乎需要的。在消除目標細胞為治療終點（例如消除腫瘤 細胞）之其他情況下’增強效應功能之同型或Fc區突變或 160878.doc •124· 201242977 去海藻糖基化（de-fucosylation)為合乎需要的（Presta，G.L. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58:640-656及 Satoh，M.等人 (2006) Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1161-1173) 〇 類似地， 視治療效用而定，抗體分子之循環半衰期可藉由在Fc區中 引入特定突變來調節抗體-FcRn相互作用而縮短/延長 (Dall’Acqua, W.F.等人（2006) J. Biol. Chem. 281: 23514· 23524 ; Petkova, S.B. (2006)等人 Internat. Immunol. 18:1759-1769; Vaccaro, C.等人（2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18709-18714)。 關於TVD結合蛋白，可能需要確認關於影響正常治療性 單株抗體之不同效應功能之多種殘基的公開資訊。在TVD 結合蛋白形式中，除經鑑別用於調節單株抗體效應功能之 Fc區殘基以外之其他（不同）Fc區殘基有可能為重要的》 總之，關於最終TVD結合蛋白形式中關鍵之Fc效應功能 (同型）之決定將視疾病適應症、治療目標及所要治療終點 及安全考慮而定。下文列出例示性適當重鏈及輕鏈恆定 區，包括（但不限於）： 〇 IgGl-異型：Glmz 〇 IgGl 突變體·Α234、A235 〇 IgG2-異型：G2m(n-) 〇 K-Km3 ο λ
Fc受體及Clq研究：可藉由（例如L234A、L235A)鉸鏈區 突變來消除由抗體與細胞膜上任何過度表現之目標複合引 160878.doc -125- 201242977 起非所要之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)及補 體依賴性細胞毒性（CDC)之可能性。預期此等出現於單株 抗體之IgGl鉸鏈區中的經取代胺基酸會降低單株抗體與人 類Fc受體（而非FcRn)之結合，因為認為FcgR結合係發生在 IgGl鉸鏈區上之重疊位點内。單株抗體之此特徵可使其安 全性概況比含有野生型IgG之抗體有所改良。單株抗體與 人類Fc受體之結合可藉由流動式細胞測量實驗，使用細胞 株（例如THP-1、K562)及表現FcgRIIb(或其他FcgR)之經工 程改造之CHO細胞株來測定。相較於IgGl對照單株抗體， 單株抗體展示與FcgRI及FcgRIIa之結合性降低，而與 FcgRIIb之結合不受影響。抗原/IgG免疫複合物結合及活化 Clq會引發經典補體級聯及後續發炎性及/或免疫調節反 應。IgG上之Clq結合位點已定位至IgG鉸鏈區内之殘基。 藉由Clq ELISA評估Clq與遞增濃度之單株抗體的結合。 結果證實如所預期，當與野生型對照IgGl之結合相比時， 單株抗體不能結合Clq。總之，L234A、L235A鉸鏈區突變 破壞單株抗體與FcgRI、FcgRIIa及Clq之結合，但不影響 單株抗體與FcgRIIb之相互作用。此等資料表明具有突變 Fc之單株抗體通常將在活體内與抑制性FcgRIIb相互作 用，但將可能無法與活化FcgRI及FcgRIIa受體或Clq相互 作用。 人類FcRn結合：新生兒受體（FcRn)負責轉運IgG穿過胎 盤且控制IgG分子之分解代謝半衰期。可能需要增加抗體 之終末半衰期以改良功效、降低投藥之劑量或頻率、或改 160878.doc -126- 201242977 良對目標之定位。或者，可能適宜進行相反操作，亦即縮 短抗體之終末半衰期以降低全身暴露或改良目標與非目標 結合比。調整IgG與其救助受體FcRn之間的相互作用可提 供增加或縮短IgG之終末半衰期的方式。循環中之蛋白質 (包括IgG)經由某些細胞（諸如血管内皮之細胞）之微胞飲作 用被吸收在流體相中。IgG在内體中在略微酸性之條件（pH 6.0-6.5)下可結合FcRn且可再循環至細胞表面，在細胞表 面上其在幾乎中性條件（pH 7.0-7.4)下釋放。對FcRn80、 16、17上之Fc區結合位點之圖譜分析顯示在物種之間保守 之兩個組胺酸殘基（His310及His435)造成此相互作用之pH 值依賴性。使用嗟菌體呈現技術，鑑別增加與FcRn之結合 且延長小鼠IgG之半衰期的小鼠Fc區突變（參見Victor, G.等 人（1 997) Nature Biotechnol. 15(7): 637-640)。亦已鑑別增 加人類IgG在pH 6.0下而非在pH 7.4下對FcRn之結合親和力 的 Fc 區突變（參見 Dall’Acqua，William F.等人（2002) J. Immunol. 169(9): 5 171-80)。此外，在一種情況下，對於 恒河猴（rhesus)FcRn亦觀測到類似pH值依賴性結合增加（多 達27倍），且此使得在恆河猴中之血清半衰期相較於親本 IgG增加兩倍（參見 Hinton，Paul R.等人（2004) J. Biol· Chem. 279(8): 6213-6216)。此等研究結果指示藉由調整Fc 區與FcRn之相互作用來延長抗體治療劑之血漿半衰期為可 行的。相反，減弱與FcRn之相互作用的Fc區突變可縮短抗 體半衰期。 B.10藥物動力學（PK) 160878.doc -127- 201242977 在一個實施例中，為產生具有所要藥物動力學概況之 TVD結合蛋白’選擇兩種或兩種以上具有類似所要藥物動 力學概況之親本結合蛋白，例如單株抗體。_個考慮為對 結合蛋白（例如單株抗體）之免疫原性反應（亦即haha，人 類抗人類抗體反應；HACA，人類抗嵌合抗體反應）進一步 使此等治療劑之藥物動力學複雜化。在一個實施例中具 有最低免疫原性或不具有（疫原性之結合蛋白（例如單株 抗體）用於構築TVD結合蛋白以使所得TVD結合蛋白亦將 具有最低免疫原性或不具有免疫原性。決定單株抗體之 之一些因素包括（但不限於）單株抗體之固有性質（VH胺基 I序列）、免疫原性、FcRn結合及Fc功能。 所選親本結合蛋白（例如單株抗體）之？反概況可容易在齧 齒動物體中測定，因為齧齒動物中之ρκ概況與單株抗體在 食蟹獼猴（cynomolgUS monkey)及人類中之ρκ概況密切相 關（或前者可精密預測後者ρ ρκ概況可使用一般技術者慣 用之方法測定。 在選擇具有所要ΡΚ特徵（及如本文所論述之其他所要功 能性質）之親本結合蛋白（例如單株抗體）之後，構築丁乂^^結 合蛋白。因為TVD結合蛋白含有三個或三個以上來自一或 多種親本結合蛋白（例如單株抗體）之抗原結合域，所以亦 评估TVD-Ig蛋白質iPK性質。因此，在測定TVD結合蛋 白之PK性質時，可採用基於源於一或多種親本結合蛋白 (例如單株乂體）之三個抗原結合域之功能性來測定概況 的PK分析》可影響TVD結合蛋白之卩&概況之其他因素包
160878.doc •128· S 201242977 括抗原結合域（CDR)定向、連接子尺寸及Fc/FcRn相互作 用。親本結合蛋白（例如抗體）之PK特徵可藉由評估下列參 數來評估：吸收、分佈、代謝及排泄。
吸收：迄今為止’治療性單株抗體係經由非經腸途徑 (例如靜脈内（IV)、皮下（SC)或肌肉内（IM))投與。在SC或 IM投藥後，結合蛋白（例如單株抗體）主要經由淋巴路徑自 間質空間吸收至全身性循環中。可飽和之全身循環前蛋白 水解降解可在也管外投藥之後產生可變之絕對生物可用 性。通常’由於在較高劑量下蛋白水解容量飽和，可觀測 到絕對生物可用性隨單株抗體之劑量增加而增加。因為淋 巴流體緩慢排入血管系統中，所以單株抗體之吸收過程通 常相當緩慢，且吸收之持續時間可歷經數小時至數天。單 株抗體在SC投藥之後的絕對生物可用性通常在5〇%至丨〇〇% 之範圍内。 分佈·在IV技藥之後，結合蛋白（例如單株抗體）通常遵 循兩相血清（或血漿）濃度_時間概況，以快速分佈期開始， 繼之以緩慢消除期。一般而言，雙指數藥物動力學模型最 佳描述此種藥物動力學概況。單株抗體在中心室（v幻中之 分佈體積通常等於或略高於血漿體積（2_3公升）。其他非經 腸投藥途徑(諸如说或抑之血清(血漿)濃度相對於時間之 概況的獨特兩相樣式可能不明顯，因為血清(血毁)濃 間曲線之分佈期由長吸收部分掩蓋。包括物理化學： 位點特異性及目標定向受體介導之攝取、組織之結合能力 及單株抗體劑量在内之多種因素可影響單株抗體之生物八 160878.doc -129. 201242977 佈。一些此等因素可造成單株抗體生物分佈之非線性。 代謝及排泄：完整結合蛋白（例如單株抗體）由於分子尺 寸而不經由腎臟排泄至尿中。其主要藉由代謝（例如分解 代謝）而不活化。對於IgG基治療性單株抗體，半衰期通常 在數小時或1-2天至20天以上之範圍内。單株抗體之消除 可文多種因素影響，包括（但不限於）對FcRn受體之親和 力、單株抗體之免疫原性、單株抗體之糖基化程度、單株 抗體對蛋白質水解之敏感性及受體介導之消除。 B 11人類及毒理學物種之组織交叉反應性樣式： 相同染色樣式表明可在毒理學物種中評估潛在人類毒 性。毒理學物種為用於研究無關毒性之彼等動物。 選擇滿足以下兩個準則之個別結合蛋白（例如抗體）： 組織染色適合於已知抗體目標表現；及（2)來自相同器官之 人類組織與毒理學物種組織之間的染色樣式類似。 準則1 :免疫及/或抗體選擇通常採用重組或合成抗原（蛋 白質、碳水化合物或其他分子）。結合天然對應物及針對 無關抗原之反.筛檢通常為用於治療性抗體之篩檢漏斗 (screening funnel)的一部分。然而，針對大量抗原進行篩 檢通常不切實際。因此，使用來自所有主要器官之人類組 織進行組織交叉反應性研究可用於避免抗體與任何無關抗 原之非所要結合。 準則2 :對人類及毒理學物種組織（食蟹獼猴、狗、可能 為齧齒動物及其他動物，如人類研究中般測試相同36或37 個組織）之比較組織交又反應性研究有助於驗證毒理學物 160878.doc 201242977 種之選擇。在對冷凍組織切片之典型組織交又反應性研究 中，治療性抗體可展現與已知抗原之預期結合及/或基於 低程度相互作用（非特異性結合、與類似抗原之低程度結 合、基於低電平電荷之相互作用等）與組織以較低程度結 合。在任何情況下，最具相關性之毒理學動物物種為與人 類及動物組織之結合重合度最高的動物物種。
組織交又反應性研究遵循適當法規指南，包括EC CPMP 指南 III/5271/94「Production and quality control 〇f monoclonal antibodies」及 1997 US FDA/CBER「Points to
Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」。在物鏡上固定且乾燥 在屍體解剖或生檢時獲得之人類組織之冷束切片（5 μιη)，。使用抗生蛋白_生物素系統對組織切片進行過氧化 酶染色（FDA指南ω Conhi/er in iAe Manw/aciwre and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」）。 組織交又反應性研究通常以兩個階段進行，其中第一階 段包括製成來自一個人類供者之32個組織（通常：腎上 腺、胃腸道、前列腺、膀胱、心臟、骨骼肌、血球、腎 臟、皮膚、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾臟、小腦、淋 巴結、睾丸、大腦皮質、卵巢、胸腺、結腸、胰臟、甲狀 腺、内皮、副甲狀腺、輸尿管、眼、垂體、子宮、輸印管 及胎盤）的冷凍切片。在第二階段中，用來自3個無關成人 之多達38個組織（包括腎上腺、血液、血管、骨髓、小 160878.doc -13卜 201242977 腦、大腦、子宮頸、食道、眼、心臟、腎臟、大腸、肝、 肺、淋巴結、乳腺、卵巢、輸卵管、肤臟、副甲狀腺、周 邊神經、垂體、胎盤、前列腺、唾液腺、皮膚、小腸、脊 髓、脾臟、胃'橫紋肌、睾丸、胸腺、甲狀腺、扁桃體、 輸尿管、膀胱及子宮）進行完全交叉反應性研究。通常在 最少兩個劑量下進行研究。 治療性結合蛋白（例如抗體）（亦即測試物品）及同型匹配 對照抗體可經生物素標記以用於抗生蛋白·生物素複合物 (ABC)偵測；其他偵測方法可包括對經FITC(或以其他方 式）標記之測試物品進行三次抗體偵測，或使未標記之測 試物品與經標記之抗人類IgG預複合。 簡言之，在物鏡上固定且乾燥在屍體解剖或生檢時獲得 之人類組織之冷凍切片（約5 μηι)。使用抗生蛋白生物素系 統對組織切片進行過氧化酶染色。首先（在預複合偵測系 統之情況下），將測試物品與經生物素標記之二次抗人類 IgG—起培育且形成免疫複合物。將測試物品之最終濃度 為2叫就及10心紅之免疫複合物添加至物鏡上的組織 切片上’且接著使組織切片與抗生蛋白·生物素·過氧化酶 套組反應30分鐘。隨後，塗覆DAB(3,3,二胺基聯苯胺）(過 氧化酶反紅受質）4分鐘料行組織染色1原_瓊脂糖珠 粒用作陽性對照組織切片。 基於所述之目標抗原之已知表現來判斷任何特異性毕色 為預期反應性(例如符合抗原表現)或非預期反應性 強度及頻率，對任何❹请具特隸之染色進料分 160878.doc •132· 201242977 原或血清競爭或阻斷研究可進一步有助於確定所觀測之染 色為特異性的抑或非特異性的。 若發現兩種所選結合蛋白（例如抗體）滿足選擇準則（即組 織染色適合及人類與毒理學動物特定組織之間的染色匹 配）’則可選擇其用於TVD結合蛋白產生。 必須用最終TVD結合蛋白構築體重複組織交又反應性研 究，但當此等研究遵循與本文概述相同之方案時，對其之 評估更複雜，因為任何結合均可由親本結合蛋白(例如抗 體）之任-者所致，且需要用複雜抗原競爭研究確認任何 無法解釋之結合。 顯而易知的是若選擇如下一或多種親本結合蛋白（例如 抗幻’則可極大簡化對多特異性分子（如TVD結合蛋白）之 組織交叉反應性研究的複雜操作：⑴缺乏非預期之組織交 又反應性研究結果及(2)相應人類與毒理學動物物種組織之 間的组織交又反應性研究結果存在適當類似性。 Β·12特異性及選擇性 為產生具有所要特異性及選擇性之TVD結合蛋白，需要 產生並選擇具有類似所要特異性及選擇性概況之親本結合 蛋白’例如單株抗體。就此而言，兩種或兩種以上親本結 合蛋白（例如單株抗體）可為相同抗體或不同結合蛋白，例 如抗體。 一針對TVD結合蛋白之特異性及選擇性之結合研究可由於 :個或三個以上結合位點而變得複雜。簡言之，對TVD结 合蛋白進行之使用ELISΑ(酶聯免疫吸附分析)、βια·: 160878.doc -133- 201242977 ΚιηΕχΑ之結合研究或其他相互作用研究需要監測一種、 兩種、二種、四種、五種或六種抗原與TVD結合蛋白之結 合。儘管BIAcore技術可判定多種抗體之連續獨立結合， 但較傳統之方法（包括EUSA)或較現代之技術（如κίηΕχΑ) 部不能。因此，對各親本結合蛋白（例如抗體）進行仔細表 徵至關重要。在已針對特異性對各個別結合蛋白（例如抗 體）進行表徵後，對TVD結合蛋白中之個別結合位點之特 異性保留的確認將極大簡化。 顯而易知的是若針對特異性來選擇親本結合蛋白（例如 籲 抗體.），之後將其，纟且合成TVD結合蛋白，則測定TVD結合 蛋白之特異性之複雜操作將極大簡化。 抗原-結合蛋白（例如抗體）相互作用研究可採用許多形 式’包括許多經典蛋白質·蛋白質相互作用研究、elisa、 質δ普法、化學交聯、使用光散射之SEC、平衡透析、凝膠 滲透、超濾、凝膠層析、大區域分析型SEC、微量製備級 超速離心（沈降平衡）、光譜法、滴定微量熱法、沈降平衡 (在分析型超速離心機中）、沈降速度（在分析型離心機中）鲁 及表面電漿子共振（包括BIAcore)。相關參考文獻包括由
John Wiley & Sons Inc.出版之「Current Protocols in
Protein Science」，Coligan，J.E.等人（編）第 3卷，第 19及 20 章，及由 John Wiley & Sons Inc.出版之「Current Protocols in Immunology」，Coligan，J.E.等人（編）；及其中 包括之相關參考文獻。 全血中之細胞激素釋放：可藉由細胞激素釋放分析研究 160878.doc -134-
S 201242977 結合蛋白（例如單株抗體）與人類血球之相互作用（Wing, M.G. (1995)Therapeut. Immunol. 2(4): 183-190 ;由 John Wiley & Sons Inc 出版之「Current Protocols in
Pharmacology」，Enna，S_J.等人 〇^);Madhusudan，S· (2004) Clin. Cancer Res. 10(19): 6528-6534 ； Cox, J. (2006) Methods 38(4): 274-282 ； Choi, I. (2001) Eur. J. Immunol. 31(1): 94-106)。簡言之，各種濃度之結合蛋白 (例如單株抗體）與人類全血一起培育24小時。所測試之濃 度應涵蓋包括模擬患者中之典型血液含量之最終濃度的寬 範圍（包括（但不限於）100 ng/ml-100 pg/ml)。在培育之後， 分析上清液及細胞溶解產物中各種細胞激素之存在。比較 單株抗體產生之細胞激素濃度概況與陰性人類IgG對照及 陽性LPS或PHA對照產生之概況。來自細胞上清液與細胞 溶解產物之單株抗體呈現之細胞激素概況與對照人類IgG 之概況相當。在一個實施例中，結合蛋白（例如單株抗體） 不與人類血球相互作用以自發釋放發炎性細胞激素。 TVD結合蛋白之細胞激素釋放研究由於三個或三個以上 結合位點而變得複雜。簡言之’如本文所述之細胞激素釋 放研究量測整個TVD結合蛋白對全血或其他細胞系統之效 應，但不可判定分子之哪部分引起細胞激素釋放。一旦已 偵測到細胞激素釋放，即必須確定TVD結合蛋白製劑之純 度，因為一些共純化細胞組分可單獨引起細胞激素釋放。 若純度並非問題，則可能需要採用TVD結合蛋白之斷裂 (包括（但不限於）移除Fc部分、分離結合位點等）、結合位 160878.doc •135- 201242977 點誘變法或其他方法來重疊合任何觀測結果。顯而易知的 是若選擇缺乏細胞激素釋放之親本結合蛋白（例如抗體）， 之後將其組合成TVD結合蛋白，則可極大簡化此複雜操 作。 Β.13與用於毒理學研究之其他物種之交又反應性 在一個實施例中，選擇與適當毒理學物種（例如食蟹獼 猴）具有充为交叉反應性之個別結合蛋白，例如抗體。親 本結合蛋白（例如抗體）需要結合直系同源物種目標（亦即食 蟹獼猴）且引發適當反應（調節、中和、活化）。在一個實施 鲁 例中’與直系同源物種目標之交又反應性（親和力/效能）應 在人類目標之10倍以内。在操作法中，針對包括小鼠大 鼠、狗、猴（及其他非人類靈長類動物）之多種物種以及疾 病模型物種（亦即用於哮喘模型之綿羊）來評估親本結合蛋 白，例如抗體》親本結合蛋白（例如單株抗體）與毒理學物 種之可接受之交叉反應性允許將來在同一物種令對TVD結 合蛋白進行毒理學研究。出於彼原因，親本結合蛋白（例 如單株抗體）應對常見毒理學物種具有可接受之交又反應 鲁 性，藉此允許在同一物種中對TVD結合蛋白進行毒理學研 究。 親本結合蛋白（例如單株抗體）可選自可結合特定目標且 在此項技術中熟知之各種單株抗體。親本結合蛋白（例如 抗體）可相同或不同。此等親本結合蛋白包括（但不限於）抗 PGE2抗體、抗TNF抗體（美國專利第6,258,562號）、抗江· 12及/或抗lL_12p4〇抗體（美國專利第6,914，128號）；抗 160878.doc .136·
S 201242977 18抗體（美國專利公開案第2005/0147610號）、抗C5、抗 CBL、抗 CD147、抗 gpl20、抗 VLA-4、抗 CDlla、抗 CD18、抗VEGF、抗CD40L、抗CD-40(例如參見PCT公開 案第 WO 2007/124299 號）、抗 Id、抗 ICAM-1、抗 CXCL13、抗CD2、抗EGFR、抗TGF-p2、抗HGF、抗cMet、 抗DLL-4、抗NPR1、抗PLGF、抗ErbB3、抗E選擇素、抗 因子 VII(Fact VII)、抗 Her2/neu、抗 F gp、抗 CD11/18、抗 CD14、抗 ICAM-3、抗 RON、抗 SOST、抗 CD-19、抗 CD80(例如參見PCT公開案第WO 2003/039486號）、抗 CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2-整合素、抗α4β7、抗 CD52、抗HLA DR、抗CD22(例如參見美國專利第 5,789,554 號）、抗 CD20、抗 MIF、抗 CD64(FcR)、抗 TCR αβ、抗 CD2、抗 Hep B、抗 CA 125、抗 EpCAM、抗 gpl20、 抗 CMV、抗 gpllbllla、抗 IgE、抗 CD25、抗 CD33、抗 HLA、抗 IGF1，2、抗 IGFR、抗 VNR整合素、抗 IL-la、抗 IL-Ιβ、抗IL-1受體、抗IL-2受體、抗IL-4、抗IL-4受體、 抗IL5、抗IL-5受體、抗IL-6、抗IL-8、抗IL-9、抗IL-13、 抗 IL-13受體、抗IL-17 及抗 IL-23(參見卩^81&，1^0.(2005)：[· Allergy Clin. Immunol· 116: 731-6及 www.path.cam.ac.uk/ 〜mrc7/humanisation/antibodies.html)。 親本結合蛋白（例如單株抗體）亦可選自各種核准使用、 處於臨床試驗中或處於開發中以供臨床使用之治療性抗 體。此等治療性抗體包括（但不限於）利妥昔單株抗體 (rituximonoclonal antibody)(Rituxan®，IDEC/Genentech/ 160878.doc -137- 201242977
Roche)(參見例如美國專利第5,736，137號），一種核准用於 治療非霍奇金氏淋巴瘤之嵌合抗CD20抗體；HuMax-CD20，一種當前正由Genmonoclonal antibody開發之抗 CD20 ;美國專利第5,500,362號所述之抗CD20抗體，八1^£-133(Applied Molecular Evolution) ； hA20(Immunomedics,
Inc.) ; HumaLYM(Intracel);及 PR〇70769(PCT 申請案第 PCT/US2003/040426號）；曲妥珠單株抗體 (trastuzumonoclonal antibody)(Herceptin®，.Genentech)(參 見例如美國專利第5,677，171號），一種核准用於治療乳癌 φ 之人類化抗Her2/neu抗體；當前正由Genentech開發之帕妥 珠單株抗體（pertuzumonoclonal antibody)(rhu 單株抗體-2C4，Omnitarg®);抗 Her2 抗體（美國專利第 4,753,894 號）；西妥昔單株抗體（cetuximonoclonal antibody) (Erbitux®，Imclone)(美國專利第 4,943,533號；PCT公開案 第WO 96/40210號），一種處於臨床試驗中之用於多種癌症 之喪合抗EGFR抗體；當前正由Abgenix-Immunex-Amgen 開發之ABX-EGF(美國專利第6,235,883號）；當前正由 鲁 Genmonoclonal antibody 開發之 HuMax-EGFr(美國專利第 7,247,301 號）；425、EMD55900、EMD62000及 EMD72000 (Merck KGaA)(美國專利第 5,558,864 號；Murthy 等人 (1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2):549-60 ; Rodeck等 人（1987) J. Cell. Biochem. 35(4): 315-20 ; Kettleborough等 人（1991)，Protein Eng. 4(7):773-83) ; ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT 公開案第 WO 95/20045 號； 160878.doc -138- s 201242977
Modjtahedi 等人（1993) J. Cell. Biophys. 22(1-3): 129-46 ; Modjtahedi 等人（1993) Br. J. Cancer 67(2): 247-53 ； Modjtahedi 等人（1996) Br. J. Cancer 73(2): 228-35 ; Modjtahedi 等人（2003) Int. J. Cancer 105(2): 273-80); TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular，Cuba)(美國專利第 5,891，996號； 美國專利第 6,506,883 號；Mateo 等人（1997) Immunotechnol. 3(1): 71-81);單株抗體-806(Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth 等人（2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(2): 639-44) ； KSB-102(KS Biomedix) ; MR1_1(IVAX，National Cancer Institute)(PCT 公開案第 WO 01/62931A2號）；及 SC100(Scancell)(PCT公開 案第 WO 01/88138號）；阿來組單株抗體（alemtuzumonoclonal antibody)(Campath®，Millenium)，.一 種當前核准用於治療 B細胞慢性淋巴細胞性白血病之人類化單株抗體；莫羅莫 那-CD3(muromonab-CD3)(Orthoclone OKT3®)，一種由 Ortho Biotech/Johnson & Johnson開發之抗 CD3抗體；替伊 莫單株抗體（ibritumomonoclonal antibody tiuxetan) (Zevalin®)，一種由 IDEC/Schering AG 開發之抗 CD20 抗 體；吉妥單株抗體（gemtuzumonoclonal antibody ozogamicin) (Mylotarg®)，一種由 Celltech/Wyeth.開發之抗CD33 (p67蛋 白）抗體；阿法赛特（alefacept)(Amevive®)，一種由Biogen 開發之抗LFA-3 Fc融合物；由Centocor/Lilly開發之阿昔單 株抗體（abciximonoclonal antibody)(ReoPro®);由 Novartis 160878.doc •139· 201242977 開發之巴利昔單株抗體（basiliximonoclonal antibody) (Simulect®);由Medimmune開發之帕利珠單株抗體 (palivizumonoclonal antibody)(Synagis®)；英利昔單株抗 體（infliximonoclonal antibody)(Remicade®)，一 種由 Centocor開發之抗TNFa抗體；阿達木單株抗體 (ad ali mumo no clonal antibody)(Humira®)，一種由 Abbott 開 發之抗TNFa抗體；Humicade®，一種由Celltech開發之抗 TNFa抗體；戈利木單株抗體（golimumonoclonal antibody) (CNTO-148)，一種由Centocor開發之完全人類TNF抗體； 籲 依那西普（etanercept)(Enbrel®)，一種由 Immunex/Amgen 開 發之p75 TNF受體Fc融合物；來那西普（lenercept)，一種先 前由Roche開發之p55TNF受體Fc融合物；ABX-CBL，一種 正由Abgenix開發之抗CD147抗體；ABX-IL8，一種正由 Abgenix開發之抗IL8抗體；ABX-MA1，一種正由Abgenix 開發之抗MUC18抗體；帕姆替珠單株抗體 (Pemtumomonoclonal antibody)(R1549，90Y-muHMFGl)， 一種由Antisoma開發之抗MUC1 ;塞來克斯（Therex) # (R1550)，一種正由Antisoma開發之抗MUC1抗體；正由 Antisoma開發之安吉奥單株抗體（AngioMonoclonal antibody)(AS1405);正由 Antisoma 開發之 HuBC-1 ;正由 Antisoma開發之硫翻（Thioplatin)(AS1407) ; Antegren®(那 他珠單株抗體（natalizumonoclonal antibody))，一 種正由 Biogen開發之抗a-4-p-l(VLA-4)及 α-4-β-7抗體；VLA-1 單 株抗體，一種正由Biogen開發之抗VLA-1整合素抗體；
160878.doc -140· S 201242977
LTBR單株抗體，一種正由Biogen開發之抗淋巴毒素β受體 (LTBR)抗體；CAT-152，一 種正由 Cambridge Antibody Technology開發之抗TGF-p2抗體；ABT 874 (J695)，一種 正由Abbott開發之抗IL-12 p40抗體；CAT-192，一種正由 Cambridge Antibody Technology及 Genzyme 開發之抗 TGFpi 抗體；CAT-213，一 種正由 Cambridge Antibody Technology 開發之抗Eotaxinl抗體；LymphoStat-B®，一種正由 Cambridge Antibody Technology及 Human Genome Sciences Inc.開發之抗Blys抗體；TRAIL-R1單株抗體，一種正由 Cambridge Antibody Technology及 Human Genome Sciences, Inc.開發之抗TRAIL-R1抗體；Avastin®貝伐單株抗體 (Avastin® bevacizumo no clonal antibody，rhu 單株抗體-VEGF)，一種正由Genentech開發之抗VEGF抗體；正由 Genentech開發之抗HER受體家族抗體；抗組織因子 (ATF)，一種正由Genentech開發之抗組織因子抗體； Xolair®(奥馬珠單株抗體（Omalizumonoclonal antibody))， 一種正由Genentech開發之抗IgE抗體；Raptiva®(依法利珠 單株抗體（Efalizumonoclonal antibody))，一 種正由 Genentech及Xoma開發之抗CD 11a抗體；正由Genentech及 Millenium Pharmaceuticals 開發之 MLN-02 抗體（先前為 LDP-02) ; HuMax CD4，一 種正由 Genmonoclonal antibody 開發之抗CD4抗體；HuMax-IL15，一 種正由 Genmonoclonal antibody 及 Amgen開發之抗 IL15抗體；正由Genmonoclonal antibody 及 Medarex 開發之 HuMax-Inflam ; HuMax-Cancer， 160878.doc -141- 201242977 一種正由 Genmonoclonal antibody 及 Medarex 及 Oxford GcoSciences開發之抗I型肝素酶抗體；正由Genmonoclonal
antibody 及 Amgen 開發之 HuMax-Lymphoma ;正由 Genmonoclonal antibody 開發之 HuMax-TAC ;正由 IDEC Pharmaceuticals 開發之 IDEC-131 及抗 CD40L抗體；IDEC-151(克立昔單株抗體（Clenoliximonoclonal antibody))，一 種正由 IDEC Pharmaceuticals 開發之抗 CD4 抗體；IDEC-114，一種正由 IDEC Pharmaceuticals 開發之抗 CD80 抗體； IDEC-152，一 種正由 IDEC Pharmaceuticals 開發之抗 CD23 ;正由IDEC Pharmaceuticals開發之抗巨嗟細胞遷移 因子（MIF)抗體；BEC2，一種正由Imclone開發之抗個體基 因型抗體；IMC-1C11，一種正由Imclone開發之抗KDR抗 體；DC101，一種正由Imclone開發之抗flk-Ι抗體；一種正 由Imclone開發之抗VE鈣黏素抗體；CEA-Cide®(拉貝珠單 株抗體（labetuzumonoclonal antibody))，一 種正由 Immunomedics開發之抗癌胚抗原（CEA)抗體 ； LymphoCide®(依帕珠單株抗體(Epratuzumonoclonal antibody))，一 種正由 Immunomedics開發之抗CD22抗體； 正由 Immunomedics 開号务之 AFP-Cide ;正由 Immunomedics 開發之MyelomaCide ; 正由Immunomedics開發之 LkoCide ;正由 Immunomedics 開發之 ProstaCide ; MDX-010，一種正由Medarex開發之抗CTLA4抗體；MDX-060， 一種正由Medarex開發之抗CD30抗體；正由Medarex開發 之MDX-070 ;正由 Medarex開發之MDX-018 ;正由 Medarex
160878.doc -142- S 201242977
及 Immuno-Designeci Molecules 開發之 Osidem®(IDM-l)及 抗 Her2 抗體；HuMax®-CD4，一 種正由 Medarex 及 Genmonoclonal antibody 開發之抗 CD4 抗體；HuMax-IL15，一 種正由 Medarex及Genmonoclonal antibody開發之 抗IL15抗體；CNTO 148，一種正由Medarex及 Centocor/J&J開發之抗TNFa抗體；CNTO 1275，一種正由 Centocor/J&J開發之抗細胞激素抗體；MOR101及 MOR102，正由MorphoSys開發之抗細胞間黏附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗體；MOR201，一種正由 MorphoSys 開 發之抗纖維母細胞生長因子受體3(FGFR-3)抗體； Nuvion®(維西珠單株抗體（visilizumonoclonal antibody))， 一種正由Protein Design Labs開發之抗CD3抗體； HuZAF®，一種正由Protein Design Labs開發之抗γ干擾素 抗體；正由Protein Design Labs開發之抗α5β1整合素；正 由 Protein Design Labs 開發之抗 IL-12 ; ING-1，一 種正由 Xoma開發之抗Ep-CAM抗體；Xolair®(奥馬珠單株抗體）， 一種由Genentech及Novartis開發之人類化抗lgE抗體；及 MLN01，一種正由Xoma開發之抗β2整合素抗體《在另一 實施例中，治療劑包括KRN330(Kirin) ; huA33抗體（Α33， Ludwig Institute for Cancer Research) ； CNTO 95(aV整合 素，Centocor) ; MEDI-522(aVp3整合素，Medimmune); 伏洛昔單株抗體（volociximonoclonal antibody)(aVpl 整合 素，Biogen/PDL);人類單株抗體216(B細胞糖基化抗原決 定基，NCI) ; BiTE MT103(雙重特異性 CD19XCD3， 160878.doc 143- 201242977
Medimmune) ; 4G7><H22(雙重特異性 B 細胞 xFcyRl， Medarex/Merck KGa) ; rM28(雙重特異性CD28xMAPG，歐 洲專利第EP 1444268號）；MDX447(EMD 82633)(雙重特異性 CD64xEGFR，Medarex);卡妥索單株抗體（Catumaxomonoclonal antibody，removab)(雙重特異性 EpCAMx 抗 CD3 ， Trion/Fres);厄妥索單株抗體（Ertumaxomonoclonal antibody)(雙重特異性HER2/CD3，Fresenius Biotech);奥 戈伏單株抗體（〇16呂0乂01110110(：1〇11&1311^1)0(1>^，〇¥3尺6\)(〇八-125，ViRexx) ; Rencarex®(WX G250)(碳酸酐酶 IX， Wilex) ; CNTO 888(CCL2，Centocor) ; TRC105(CD105(endoglin)，
Tracon) ; BMS-663513(CD137促效劑，Brystol Myers Squibb); MDX-1342(CD19 ， Medarex);西利珠單株抗體
(Siplizumonoclonal antibody，MEDI-507)(CD2，Medimmune); 奧法木單株抗體（0【3111111111110110〇1〇1181311^1)0(1丫，1111111&\-CD20)(CD20，Genmonoclonal antibody);利妥昔單株抗體 (Rituxan)(CD20 ， Genentech);維塔珠單株抗體 (veltuzumonoclonal antibody，hA20)(CD20，Immunomedics)； 依帕珠單株抗體（CD22，Amgen);魯昔單株抗體 (lumiliximonoclonal antibody > IDEC 152)(CD23，Biogen); 莫羅莫那-CD3(CD3，Ortho) ; HuM291(CD3 fc受體，PDL Biopharma) ; HeFi-l(CD30，NCI) ; MDX-060(CD30， Medarex) ; MDX-1401(CD30，Medarex) ; SGN-30(CD30， Seattle Genentics) ； SGN-33(林妥珠單株抗體 (Lintuzumonoclonal antibody))(CD33，Seattle Genentics);紮 s 160878.doc 201242977
木單株抗體（Zanolimumonoclonal antibody，HuMax-CD4)(CD4，Genmonoclonal antibody) ； HCD122(CD40， Novartis) ; SGN-40(CD40，Seattle Genentics) ; Campathlh (阿來組單株抗體）(CD52，Genzyme) ; MDX-1411(CD70， Medarex) ; hLLl(EPB-l)(CD74.38，Immunomedics);加利 昔單株抗體（Galiyimonoclonal antibody，IDEC-144) (CD80，Biogen) ; MT293(TRC093/D93)(裂解之膠原蛋 白，Tracon) ; HuLuc63(CSl，PDL Pharma);伊普利單株 抗體（ipilimumonoclonal antibody，MDX-010)(CTLA4，Brystol Myers Squibb);川利木單株抗體（Tremelimumonoclonal antibody，替西單株抗體（Ticilimumonoclonal antibody)， CP-675,2)(CTLA4 > Pfizer) ； HGS-ETR1(馬帕木單株抗體 (Mapatumumonoclonal antibody))(DR4 TRAIL-R1促效劑， Human Genome Science/Glaxo Smith Kline) ; AMG-655(DR5，Amgen);阿普單株抗體（Apomonoclonal antibody)(DR5，Genentech) ; CS-1008(DR5，Daiichi Sankyo); HGS-ETR2(來沙木單株抗體（lexatumumonoclonal antibody))(DR5 TRAIL-R2促效劑，HGS);西妥昔單株抗 體（Erbitux)(EGFR，Imclone) ; IMC-11F8(EGFR，Imclone);尼 妥珠單株抗體（Nimotuzumonoclonal antibody)(EGFR，YM Bio);帕尼單株抗體（Panitumumonoclonal antibody， Vectabix)(EGFR ’ Amgen)；紮魯木單株抗體 (Zalutumumonoclonal antibody ， HuMaxEGFr)(EGFR ， Genmonoclonal antibody) ; CDX-110(EGFRvIII，AVANT 160878.doc • 145- 201242977
Immunotherapeutics) ； 阿 德木單 株抗體 (adecatumumono clonal antibody ， MT201 )(Epcam ，
Merck);依決洛單株抗體（edrecolomonoclonal antibody， Panorex，17-lA)(Epcam，Glaxo/Centocor) ; MORAb-003(葉酸鹽受體a，Morphotech) ; KW-2871(神經結醣脂 GD3 ? Kyowa) ； MORAb-009(GP-9 * Morphotech) ； CDX-1307(MDX-1307)(hCGb，Celldex);曲妥珠單株抗體（赫赛 汀（Herceptin))(HER2，Celldex)；帕妥珠單株抗體 (rhuMonoclonal antibody 2C4)(HER2(DI)，Genentech);阿 泊珠單株抗體（apolizumonoclonal antibody)(HLA-DRp 鍵， PDL Pharma) ; AMG-479(IGF-1R，Amgen);抗 IGF-1R R1507(IGF1-R，Roche) ; CP 751871(IGF1-R，Pfizer); IMC-A12(IGF1-R，Imclone) ; BIIB022(IGF-1R，Biogen); Mik-P-l(IL-2Rb(CD122) ，Hoffman LaRoche) ； CNTO 328(IL6，Centocor);抗 KIR(1-7F9)(殺手細胞 Ig 樣受體 (KIR)，Novo) ； Hu3S193(Lewis (y)，Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research) ； hCBE-ll(LTpR * Biogen)； HuHMFGl(MUCl，Antisoma/NCI) ; RAV12(N連接碳水化 合物抗原決定基，Raven) ; CAL(副甲狀腺激素相關蛋白 (PTH-rP)，University of California) ; CT-011(PD1 ， CureTech) ； MDX-1106(ono-4538)(PD 1 > Medarex/Ono)； 單株抗體 CT-011(PD1，Curetech) ; IMC-3G3(PDGFRa， Imclone);巴維昔單株抗體（bavituximonoclonal antibody)(填月旨醢絲胺酸，Peregrine) ; huJ591(PSMA， 160878.doc -146- s 201242977
Cornell Research Foundation) ； muJ591(PSMA > Cornell Research Foundation) ； GC1008(TGFb (pan)抑制劑 (IgG4)，Genzyme);英利昔單株抗體（Remicade)(TNFa， Centocor) ; A27.15(轉鐵蛋白受體，Salk Institute， INSERN WO 2005/111082) ; E2.3(轉鐵蛋白受體，Salk Institute);貝伐單株抗體（阿瓦斯 $丁（Avastin))(VEGF， Genentech) ； HuMV833(VEGF » Tsukuba Research Lab, PCT 公開案第 WO/2000/034337號，University of Texas); IMC-18F1(VEGFIU，Imclone) ; IMC-1121(VEGFR2, Imclone)。 C.構築TVD結合蛋白 三可變異域結合蛋白經設計以藉由重組DNA技術使來自 可相同或不同之三種親本結合蛋白（例如單株抗體）之三個 不同輕鏈可變異域（VDL)以串聯方式直接連接或經由短連 接子連接，隨後為輕鏈恆定域及視情況Fc區。類似地’重 鏈包含三個以串聯方式連接之不同重鏈可變異域（VDH)， 隨後為恆定域及Fc區（圖1)。 在某些實施例中，第一及第二多肽（或第二及第四多肽 鏈）中之一或多個重及輕可變異域一起為互補可變異域且 形成單一功能性抗原結合位點。在某些實施例中，可變異 域形成各多肽鏈上之完整獨立抗原結合位點。舉例而言’ 當三個重鏈抗原結合域各獨立地選自域抗體、受體及scFv 時，三個完整獨立抗原結合位點存在於多肽鏈上。 可使用重組DNA技術自一或多種藉由本文所述之任一方 法產生之親本結合蛋白（例如抗體）獲得可變異域。在一個 160878.doc -147· 201242977 實施例中，可變異域為鼠類重鏈或輕鏈可變異域。在另一 實施例中，可變異域為CDR移植或人類化可變異重鏈或輕 鏈域。在一個實施例中，可變異域為人類重鏈或輕鏈可變 異域。 在一個實施例中，使用重組DNA技術使第一及第二可變 異域彼此直接連接。在另一實施例中，使用重組DN A技術 使第二及第三可變異域彼此直接連接。在另一實施例中， 使用重組DNA技術使第一、第二及第三可變異域彼此直接 連接。在一個實施例中，第一及第二可變異域係經由連接 子序列連接。在另一實施例中，第二及第三可變異域係經 由連接子序列連接。在另一實施例中，第一、第二及第三 可變異域係經由連接子序列連接。可變異域可結合相同抗 原或可結合不同抗原。本發明之TVD結合蛋白可包括免疫 球蛋白可變異域及/或非免疫球蛋白可變異域，諸如受體 之配體結合域或酶之活性域。TVD結合蛋白亦可包含三個 或三個以上非Ig域。 連接子序列可為單一胺基酸或多肽序列。在一個實施例 中，連接子序列係選自由以下組成之群： AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID ΝΟ:1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:2) ； AKTTPKLGG(SEQ ID NO:3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:4) ； SAKTTP(SEQ ID NO:5) ； RADAAP(SEQ ID NO:6)； RADAAPTVS(SEQ ID NO:7) ； RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:8)； RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:9) ； SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:10) ； ADAAP(SEQ ID NO:ll) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:12)； 160878.doc -148 - 201242977 TVAAP(SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14)； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16)； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18)； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:20)； ASTKGP(SEQ ID NO:21) ； ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:22)； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23) ； GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO:24) ； GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:25)； GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:26) ； TVAAPSWIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO:27);及ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO:28)。 基於對若干Fab分子之晶體結構之分析來選擇連接子序 列。在Fab或抗體分子結構中，可變異域與CH1/CL恆定域 之間存在天然可撓性鍵聯。此天然鍵聯包含約10-12個胺 基酸殘基，由來自V域之C端的4-6個殘基及來自CL/CH1域 之N端的4-6個殘基提供。本發明之TVD結合蛋白係分別使 用CL或CH1之N端5-6個胺基酸殘基或11-12個胺基酸殘基 作為TVD結合蛋白之輕鏈及重鏈中之連接子產生。CL或 CH1域之N端殘基（特定言之前5-6個胺基酸殘基）採用環構 形而無穩固二級結構，且因此可充當兩個可變異域之間的 可撓性連接子。CL或CH1域之N端殘基由於其為Ig序列之 一部分而為可變異域之天然延長，且因此在很大程度上使 任何可能由連接子及接點引起之免疫原性降至最低。 其他連接子序列可包括CL/CH1域之任何長度之任何序 列，但非CL/CH1域之所有殘基（例如CL/CH1域之前5-12個 160878.doc • 149· 201242977 胺基酸殘基）；輕鏈連接子可來自Ck或(：λ;且重鍵連接子 可源於任何同型之CH1，包括Cyl、Cy2、Cy3、、 Cal、Ca2、C5、Cs及Cp e連接子序列亦可源於其他蛋白 質，諸如Ig樣蛋白質（例如TCR、FcR、KIR) ; G/S基序列 (例如G4S重複序列源於鉸鏈區之序列；及來自其他蛋 白質之其他天然序列。 在一個實施例中’使用重組DNA技術使恆定域連接於三 個連接之可變異域。在一個實施例中，包含連接之重鏈可 變異域之序列連接於重鍵怪定域而包含連接之輕鍵可變異 域之序列連接於輕鍵怪定域。在一個實施例中，值定域分 別為人類重鍵怪定域及人類輕键悝定域。在一個實施例 中，TVD分子重鏈進一步連接於以區。Fc區可為原生序列 Fc區或變異Fc區。在另一實施例中，fc區為人類fc區。在 另一實施例中’ Fc區包括來自igGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA、IgM、IgE或 IgD之 Fc 區。 在另一實施例中，兩個重鏈TVD多肽及兩個輕鍵TVD多 肽經組合以形成TVD-Ig蛋白質。表1·6、8、11、13、14及 1 5列出適用於治療疾病，例如治療發炎疾病或病症之針對 各目標的例示性結合蛋白（例如抗體）之VH及VL區之胺基 酸序列。在一個實施例中，本發明提供一種包含例如表^ 6、8、11、1 3、14及1 5中所列之呈任何定向之三個VH及/ 或VL區的TVD結合蛋白。下文實例章節中提供可結合特定 目標之特異性TVD結合蛋白及其製備方法的詳細描述。 D.產生TVD結合蛋白 160878.doc •150- 201242977 可藉由此項技術中已知之許多技術之任一者產生本發明 之TVD結合蛋白。舉例而言，自宿主細胞表現，其中藉由 標準技術將編碼TVD結合蛋白重鏈及TVD結合蛋白輕鏈之 表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意 欲涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之 廣泛多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖 轉染及其類似技術。儘管可能在原核或真核宿主細胞中表 現本發明之TVD蛋白質，但TVD蛋白質應表現於真核細胞 (例如哺乳動物宿主細胞）中，因為此等真核細胞（且特定言 之哺乳動物細胞）比原核細胞更有可能裝配及分泌適當摺 疊且具免疫活性之TVD蛋白質。 表現本發明之重組結合蛋白（例如抗體）之例示性哺乳動 物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢（CHO)細胞（包括dhfr-CHO細 胞，描述於 Urlaub 及 Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220中，例如如Kaufman，R.J.及Sharp，P.A. (1982) Mol. Biol. 159: 601-621 中所述，其係與 DHFR 可選 擇標記一起使用）、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞、SP2及 PER.C6細胞。當將編碼TVD結合蛋白之重組表現載體引入 哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以使 TVD結合蛋白在宿主細胞中表現或足以將TVD結合蛋白分 泌至使宿主細胞生長之培養基中的時期來產生TVD蛋白 質。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收TVD結合蛋 白。 在用於重組表現本發明之TVD結合蛋白之一例示性系統 160878.doc -151 - 201242977 中，藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼TVD重鏈及TVD輕鏈之 重組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體内， TVD重鏈及輕鏈基因各自可操作地連接於CMV增強子/AdMLP 啟動子調控元件以驅動基因高度轉錄。重組表現載體亦攜 帶DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤選擇/擴增來選擇已經 該載體轉染之CHO細胞。培養所選轉型體宿主細胞以允許 表現TVD重鏈及輕鏈且自培養基回收完整TVD結合蛋白。 標準分子生物學技術用於製備重組表現載體、轉染宿主細 胞、選擇轉型體、培養宿主細胞及自培養基回收TVD蛋白 質。本發明更另外提供一種藉由在適合培養基中培養本發 明之宿主細胞直至合成本發明之TVD結合蛋白來合成本發 明之TVD結合蛋白的方法。該方法可另外包含自培養基分 離TVD結合蛋白。 TVD結合蛋白之重要特徵在於其可以與習知抗體類似之 方式產生並純化。TVD結合蛋白之產生形成具有所要特定 活性之均質單一主要產物，而無對恆定區之任何序列修飾 或任何種類之化學修飾。其他先前所述之產生「雙特異 性」、「多特異性」及「多特異性多價」全長結合蛋白之方 法不產生單一主產物，而是引起細胞内產生或分泌產生經 裝配之非活性、單特異性、多特異性、多價全長結合蛋白 及具有不同結合位點組合之多價全長結合蛋白的混合物。 舉例而言，基於由Miller及Presta(PCT公開案第W0 2001/077342號）所述之設計，重鏈與輕鏈存在16種可能組 合。因此，僅6.25%蛋白質可能呈所要活性形式，且相較 160878.doc -152- 201242977 於其他15種可能組合’並不為單一主要產物或單一主產 物。使用通常用於大規模製造中之標準層析技術使蛋白質 之所要完全活性形式與蛋白質之非活性及部分活性形式分 離仍有待證實。 驚人地，如下所述，本發明之「多（例如「三」）特異性 多價全長結合蛋白」之設計會產生主要裝配成所要「多 (例如「三」）特異性多價全長結合蛋白」的多（例如三）可 變異域輕鍵及三可變異域重鍵。 • 至少50%、至少75%及至少90%之經裝配及經表現之多 (例如三）可變異域免疫球蛋白分子為所要多（例如三）特異 性多價蛋白質。此態樣特別會增強本發明之商業效用。因 此，本發明包括一種使多（例如三）可變異域輕鏈及多（例如 「三」）可變異域重鏈在單一細胞中表現，從而產生「多 (例如「三」）特異性六價全長結合蛋白」作為單一主產物 的方法。 本發明提供一種使多（例如三）可變異域輕鏈及多（例如 三）可變異域重鏈在單-細胞中表現，從而產生「多（例如 「三」）特異性六價全長結合蛋白」作為「主產物」的方 法，其中該產物」佔包含多（例如三）可變異域輕鏈及 夕(例如二)可變異域重鏈之所有經裝配蛋白質的以 本發明提供一種伸客, 、 一 λ . 使夕（例如三）可變異域輕鏈及多（例如 二）可變異域重鏈在單一 卜mi: 中表現，從而產生「多(例如 二」）特異性六價全長結合蛋白」作為單-「主產物」 160878.doc •153· 201242977 的方法’其中該「主產物I佔句令多丨i 、 在切」伯匕3夕（例如三）可變異域輕 鍵及多（例如三）可變異域番絲右 叉升场鏈之所有經裝配蛋白質的75% 以上》 本發明提供-種使多(例如三)可變異域輕鏈及多(例如 二）可變異域重鏈在單一細胞中表現，從而產生「多（例如 「三」）特異性六價全長結合蛋白」作為單一「主產物」 的方法其中該「主產物」佔包含多（例如三）可變異域輕 鏈及多（例如三）可變異域重鏈之所有經裝配蛋白質的9〇% 以上。 E·經衍生之TVD結合蛋白 一個實施例提供本發明之結合蛋白經衍生或連接於另一 功旎分子（例如另一肽或蛋白質）的經標記結合蛋白。舉例 而言，可藉由將本發明之結合蛋白與一或多個其他分子實 體功能性連接（藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或 其他方式）來衍生本發明之經標記結合蛋白，該一或多個 其他分子實體諸如另一抗體（例如雙特異性抗體或雙功能 抗體）、可偵測試劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可介導結 合蛋白與另一分子（諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺 酸標籤）締合之蛋白質或肽。 可用於衍生本發明之結合蛋白之適用可偵測試劑包括螢 光化合物。例示性螢光可偵測試劑包括螢光素、異硫氰酸 螢光素、若丹明、5-二曱胺-1-萘磺醯氯、藻紅素 (phycoerythrin)及其類似物，亦可用諸如鹼性磷酸酯酶、 辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶及其類似物之可偵測酶衍生 160878.doc -154- 201242977 結合蛋白。當用可偵測酶衍生結合蛋白時，其係藉由系加 使酶用於產生可㈣反應產物之其他試劑加以偵測。舉例 而言，當存在可㈣試劑辣根過氧化酶時，添加過氧化& 及二胺基聯苯胺會產生可偵測之有色反應產物。亦可用生 物素衍生結合蛋白，且經由間接量測抗生蛋白或抗生蛋白 鏈菌素結合來偵測。 本發明之另一實施例提供一種結晶結合蛋白及包含此等 晶體之調配物及組合物。在一個實施例中，結晶結合蛋白 具有比結合蛋白之可溶性對應物高之活體内半衰期。在另 一實施例中，結合蛋白在結晶之後保留生物活性。 本發明之結晶結合蛋白可根據此項技術中已知及如p c τ 公開案第WO 02/072636號中揭示之方法產生。 本發明之另一實施例提供一種糖基化結合蛋白，其中結 合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分包含一或多個碳水化 合物殘基。初期活體㈣白質|生可經歷料轉譯後修飾 之進-步加工。特定言之，可以酶促方式添加糖（糖基）殘 基，此過程稱為糖基化。所得攜帶共價連接之寡醣側鏈之 蛋白質稱為糖基化蛋白質或醣蛋白。抗體為在以域以及可 ’父異域中具有一或多個碳水化合物殘基之聰蛋白。Fc域中 之碳水化合物殘基對Fc域之效應功能具有重要影響，而對 抗體之抗原結合或半衰期影響極小（Jefferis，R (2〇〇5) Biotechnol. Prog. 21:11_16)。相反’可變異域之糖基化可 對抗體之抗原結合活性具有影響。可變異域中之糖基化可 對抗體結合親和力具有負面影響，此可能歸因於位阻（c〇. 160878.doc •155· 201242977 M.S.等人（1993) Mol. Immunol. 30: 1361-1367)，或導致對 抗原之親和力增加（Wallick，S.C.等人（1988)£叉卩.]^€1· 168: 1099-1109; Wright，Α·等人（1991) EMBO J. 10: 2717 2723) ° 本發明之一個態樣係有關產生結合蛋白之〇連接或N連 接糖基化位點已經突變之糖基化位點突變體。熟習此項技 術者可使用標準熟知技術產生此等突變體。保留生物活性 但具有增加或減小之結合活性之糖基化位點突變體為本發 明之另一目標。 在另一實施例中’本發明之結合蛋白（例如抗體）或抗原 結合部分之糖基化經修飾。舉例而言，可製備去糖基化結 合蛋白’例如抗體（亦即缺乏糖基化之抗體）^糖基化可經 改變以例如增加例如抗體對抗原之親和力。此等碳水化合 物修飾可藉由例如改變抗體序列内之一或多個糖基化位點 來達成。舉例而言，可進行導致消除一或多個可變異區糖 基化位點以藉此消除彼位點處之糖基化的一或多個胺基酸 取代。此去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。該種方法 進一步詳述於PCT公開案第WO 2003/016466號及美國專利 第 5,714,350 號及第 6,350,861 號中。 或者或另外’可製備具有改變之糖基化類型之本發明的 經修飾結合蛋白’諸如海藻糖基殘基之量減少之低海藻糖 基化抗體（參見 Kanda 等人（2007) J. Biotechnol. 130(3). 300-310.)或平分型（}1(^八(：結構增加之抗體。已證明此等
經改變之糖基化樣式會增加結合蛋白（例如抗體）之AdCC 160878.doc -156- 201242977
能力。此等碳水化合物修飾可藉由例如使結合蛋白（例如 抗體）在糖基化機構改變之宿主細胞中表現來達成。此項 技術中已描述糖基化機構改變之細胞且其可用作表現本發 明之重組結合蛋白（例如抗體）以藉此產生糖基化改變之結 合蛋白的宿主細胞。參見例如Shields, R丄等人（2〇〇2) J
Biol. Chem· 277: 26733-26740 ; Umana 等人（1999) Nat. Biotech. 17: 176-1 ;以及歐洲專利第 EP 1，176,195 號及 PCT 公開案第WO 03/035835號及第WO 99/54342 80號。 蛋白質糖基化視相關蛋白質之胺基酸序列以及表現該蛋 白質之宿主細胞而定。不同生物體可產生不同糖基化酶 (例如糖基轉移酶（glyC〇Syltransferases)及醣苦酶 (glycosidases))且具有不同可用受質（核苷酸糖）。歸因於此 等因素，蛋白質糖基化樣式及糖基殘基之組成可視表現特 疋蛋白質之宿主系統而不同。適用於本發明中之糖基殘基 可包括（但不限於）葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、n_ 乙醯基葡糖胺及唾液酸。在一個實施例中，糖基化結合蛋 白包含糖基殘基以使糖基化樣式為人類糖基化樣式。 熟習此項技術者已知不同蛋白質糖基化可產生不同蛋白 質特徵。舉例而言，在諸如酵母之微生物宿主中產生且利 用酵母内源性路徑加以糖基化之治療性蛋白質的功效可能 比諸如CHO細胞株之哺乳動物細胞中表現之相同蛋白質的 功效低。此等醣蛋白亦可在人類中具有免疫原性且在投與 之後展示降低之活體内半衰期。人類及其他動物中之特定 受體可識別特定糖基殘基且促進蛋白質自血流中快速清 160878.doc -157- 201242977 溶解性、對蛋白酶 、由其他蛋白質或 因此，從業者可選 人類細胞或預定個 同或至少類似的糖 除。其他不利作用可包括蛋白質摺叠、 之敏感性、運輸、轉運、區室化、分泌 因子識別、抗原性或過敏原性之改變。 擇具有特定糖基化組成及樣式（例如與 體動物之物種特異性細胞中所產生者相 基化組成及樣式）之治療性蛋白質。 表現不同於宿主細胞之糖基化蛋白質的糖基化蛋白質可 藉由基因修飾宿主細胞以表現異源糖基化酶來達成。使用 此項技術中已知之技術，從業者可產生展現人類蛋白質糖 基化之結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分。舉例而 吕’已對酵母菌株進行基因修娜以表現非天然產生之糖美 化酶以使此等酵母菌株中產生之糖基化蛋白質（醣蛋白）展 現與動物細胞（尤其人類細胞）之蛋白質糖基化相同的蛋白 質糖基化（美國專利第7,449,308號及第7,029,872號；及 PCT公開案第 WO 2005/100584號）》 除結合蛋白外，本發明亦係有關對本發明之此等結合蛋 白具有特異性之抗個體基因型（抗Id)抗體。抗Id抗體為識 別通常與另一抗體之抗原結合區締合之獨特決定子的抗 體。可藉由以結合蛋白或其含CDR之區域使動物免疫來製 備抗Id。經免疫動物將識別免疫抗體之個體基因型決定子 且對其起反應並產生抗Id抗體。顯而易知的是可較容易產 生併入TVD結合蛋白中之多種親本結合蛋白（例如抗體）的 抗個體基因型抗體；且藉由此項技術中公認之方法（例如 BIAcore、ELISA)確認結合研究以驗證對各親本抗體之個 160878.doc • 158· 201242977 體基因型具有特異性之抗個體基因型抗體在TVD結合蛋白
之情形下亦識別個體基因型（例如抗原結合位點）^對TVD 結合蛋白之三個或三個以上抗原結合位點之每一者具有特
異性的抗個體基因型抗體提供量測患者血清中之人類TVD 結合蛋白之TVD結合蛋白濃度的理想試劑；TVD結合蛋白 濃度分析可使用「夾心式分析ELISA形式」建立，其中將 針對第一抗原結合區之抗體塗佈在固相（例如BiAcore晶 片、ELISA盤等）上’用沖洗緩衝液沖洗，與血清樣品一起 ® 培月，再次沖洗，且最終與針對另一抗原結合位點之另一 抗個體基因型抗體一起培育，該另一抗個體基因型抗體自 身經酶標記以定量結合反應。在一個實施例中，對於具有 三個以上不同結合位點之TVD結合蛋白，針對兩個最外側 (位於恆定區之最遠端及最近端）結合位點的抗個體基因型 抗體將不僅有助於測定人類血清中之TVD結合蛋白濃度， 且亦有助於證明分子在活體内之完整性。各抗1(1抗體亦可 用作在另-動物中誘導免疫反叙「免疫原」，從而產生 響 所謂抗抗Id抗體。 此外熟I此項技術者應瞭解可使用經基因工程改造以 表現各種糖基化酶之宿主細胞之文庫來表現相關蛋白質以 使該文庫之宿主細胞成員產生具有變異糖基化樣式之相關 蛋白質。從業者可接著選擇及分離具有特定新賴糖基化樣 式之相關蛋白質。在一個實施例中，具有經特定選擇之新 穎糖基化樣式之蛋白質展現改良或改變之生物性質。 II· TVD結合蛋白之用途 160878.doc •159· 201242977 蓉於本發明之結合蛋白能夠結合多個抗原，該等結合蛋 白可用於使用習知分析，例如免疫分析，諸如elisa、放 射免疫分析（RIA)或組織免疫組織化學㈣抗原（例如生物 樣品(諸如血清或血漿)中之抗原）。㈣結合蛋白經可偵測 物質直接或間接標記以便於㈣結合或未結合抗體。適合 可偵測物質包括各種酶、輔基、螢絲f、發光物質及放 射性物質。適合酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酯 酶、P-半乳糖㈣及乙醯膽驗醋酶；適合輔基複合物之實 例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生蛋白/生物素；適合 螢光物質之實例包括傘酮（umbellifer〇ne)、螢光素、異硫 氰酸螢光素、若丹明、二氣三嗪基胺螢光素、丹磺醯： (dansyl chloride)及藻紅素；發光物質之實例包括魯米諾 (luminol);且適合放射性物質之實例包括3h、丨4匚、ay、 90γ、"Tc、、，251、13n 。 在一個實施例中，本發明之結合蛋白在活體外及在活體 内均可中和抗原之活性。因此，此等TVD結合蛋白可用於 例如在含有抗原之細胞培養物中、在具有與本發明之結合 蛋白交又反應之抗原的人類個體或其他哺乳動物個體中抑 制抗原活性。在另一實施例中，本發明提供一種降低罹患 抗原活性有害之疾病或病症之個體中的抗原活性之方法。 可出於治療目的向人類個體投與本發明之結合蛋白。 如本文所用，術語「抗原活性有害之病症」意欲包括以 下疾病及其他病症，其中已顯示罹患或疑似罹患該病症之 個體中存在抗原為造成該病症之病理生理學的原因，或為 160878.doc 201242977 促使該病症惡化之因素。因此，抗原活性有害之病症為降 低抗原活性預期會減輕病症之症狀及/或進展的的病症。 此等病症可例如藉由罹患該病症之個體之生物流體中的抗 原濃度增加（例如個體之血清、血漿、滑液等中之抗原濃 度增加）來證實。可用本發明之結合蛋白治療之病症的非 限制性實例包括下文及關於本發明之結合蛋白之醫藥組合 物的章節中論述之彼等病症。
本發明之TVD結合蛋白可結合一個目標或多個目標抗 原。此等目標抗原包括（但不限於）下列資料庫中所列之目 標。此等目標資料庫包括以下清單： 治療性目標（xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp); 細胞激素及細胞激素受體（www.cytokinewebfacts.com， www.copewithcytokines.de/cope.cgi 5 及 cmbi.bjmu.edu.cn/ cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine. medic, kumamoto-u.ac.jp/ CFC/indexR.html)； 趨化因子（cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/ Chemokine.html)； 趨化因子受體及 GPCR(csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/ Receptor.html，及 www.gpcr.org/7tm/); 嗅覺受體（senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp); 受體（www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm); 癌症目標（cged.hgc.jp/cgi-bin/input_cgi); 作為潛在目標之分泌蛋白（spd.cbi.pku.edu.cn/); 蛋白激酶（spd.cbi.pku.edu.cn/);及 160878.doc -161 - 201242977 人類 CD 標記（content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD table final locked.pdf)及（Zola Η (2005) Blood 106: 3123-6)。 TVD結合蛋白適用作治療劑以同時阻斷兩種或兩種以上 不同目標以增強功效/安全性及/或增加患者覆蓋範圍。此 等目標可包括可溶性目標（例如TNF)及細胞表面受體目標 (例如VEGFR及EGFR)。其亦可用於誘導腫瘤細胞與T細胞 (例如Her2及CD3)之間（對於癌症療法而言）、或自體反應 性細胞與效應細胞之間（對於自體免疫疾病或移植而言）、 或任何目標細胞與效應細胞之間的重定向細胞毒性以消除 任何既定疾病中引起疾病之細胞。 此外，當TVD結合蛋白經設計以靶向同一受體上之兩個 或兩個以上不同抗原決定基時’其可用於引發受體叢集及 活化。舉例而言，此可有益於製備促效性及拮抗性抗 GPCR治療劑。在此情況下，TVD結合蛋白可用於把向一 個細胞上之兩個或兩個以上不同抗原決定基（包括環區與 細胞外域兩者上之抗原決定基）以達成叢集/信號傳導（兩個 細胞表面分子）或信號傳導（一個分子上）。類似地’ TVD結 合蛋白可經設計以藉由靶向CTLA-4細胞外域之兩個不同 抗原決定基（或同一抗原決定基之2個複本）來引發CTLA-4 連接及負信號，從而導致免疫反應下調。CTLA-4為治療 性治療許多免疫學病症之經臨床驗證之目標。CTLA-4/B7 相互作用藉由削弱細胞週期進展、IL-2產生及T細胞在活 化後之增殖來負調控T細胞活化’且CTLA-4(CD 152)嚙合 可下調T細胞活化及促進誘導免疫耐受性。然而，藉由 160878.doc -162- 201242977 CTLA-4之促效性抗體嚙合肖丨J弱T細胞活化之策略已失敗， 因為CTLA-4活化需要連接。如晶體結構分析所證實， CTLA-4/B7之分子相互作用係呈 「斜拉鏈（skewed zipper)」陣列形式（Stamper (2001) Nature 410: 608)。然 而，當前可用之CTLA-4結合試劑（包括抗CTLA-4單株抗 體）均不具有連接性質。已進行若干嘗試來處理此問題。 在一種情況下，產生與細胞成員結合之單鏈抗體，且其顯 著抑制小鼠中之同種異體排斥（Hwang (2002) J. Immunol. 169: 633)。在另一種情況下，產生針對CTLA-4之人工APC 表面連接型單鏈抗體，且證實其會削弱T細胞反應（Griffin (2000) J. Immunol. 164: 4433)。這兩種情況下，藉由在人 工系統中緊密定位與成員結合之抗體來達成CTLA-4連 接。儘管此等實驗藉由引發CTLA-4負信號傳導提供免疫 下調之概念驗證（proof-of-concept)，但此等報導中使用之 試劑不適於治療性用途。為此，可藉由使用靶向CTLA-4 細胞外域之兩個不同抗原決定基（或同一抗原決定基之2個 複本）的TVD結合蛋白來達成CTLA-4連接。基本原理為跨 越IgG之兩個結合位點的距離（約150-170人）過大，以致無 法達成CTLA-4之活性連接（2個CTLA-4均二聚體之間為30-5 0 A) 。 然而， T VD 結 合蛋白 （一 個臂） 上之三 個結合 位點之 間的距離短得多（亦在30-50 A之範圍内），從而允許CTLA-4之適當連接。 類似地，TVD結合蛋白可靶向細胞表面受體複合物之兩 個不同成員（例如IL-12Ra及IL-12RP)。此外，TVD結合蛋 160878.doc -163- 201242977 白可乾向CR1及可溶性蛋白f/病原體，以驅使快速清除目 標可溶性蛋白質/病原體。 另外本發明之TVD結合蛋白可用於組織特異性傳遞 (靶向組織標記及疾病介體，以增強局部ρκ，從而具有較 向力效及/或較低毒性），包括細胞内傳遞（輕向内化受體及 細胞内分子）及傳遞至腦内部（靶向運鐵蛋白（transferrin)受 體及CNS疾病介體以跨越血腦障壁）。TVD結合蛋白亦可充 當載體蛋白質，以經由與抗原之非中和抗原決定基結合而 將該抗原傳遞至特定位置，及延長抗原半衰期。此外， TVD結合蛋白可設計成物理性連接於植入患者中之醫學裝 置或靶向此等醫學裝置（參見Burke，s E等人（2〇〇6) Adv Dmg Deliv. Rev_ 58(3): 437_446 ; midebrand，H F 等人 (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23)： 6318- 6324 ’ Wu，P.等人（2006) Bi〇materials 27(11): 2450-2467 ; Marques，A. P.等人（2005) Biodegrad. Syst. Tissue Eng.
Regen. Med· 377-3 97)。簡言之，將適當類型之細胞引導至 醫學植入物部位可促進癒合及修復正常組織功能。或者， 亦對在植入該裝置時由與該裝置偶合或靶向該裝置之TVD 分子所釋放之介體（包括（但不限於）細胞激素）提供抑制作 用。舉例而言，多年來已在介入性心臟病學中使用支架來 疏通阻塞之動脈及改良企液至心肌之流動。然而，已知傳 統裸金屬支架在一些患者中會引起再狹窄（使所治療區域 中之動脈再變狹窄）且會產生血液凝塊。最近，已描述塗 有抗CD34抗體之支架，其藉由捕捉在整個血液中循環之 160878.doc 201242977 内皮祖細胞（EPC)來降低再狹窄且防止出現血液凝塊。内 皮細胞為内襯於血管内使血液順暢流動之細胞。EPC黏附 於支架之硬質表面上’形成光滑層，該光滑層不僅促進癒 合而且防止再狹窄及血液凝塊、先前與使用支架相關之併 發症（Aoji 等人（2005) J. Am. Coll. Cardiol. 45(10): 1574- 9)。除改良需要支架之患者之結果以外，對需要心血管繞 道手術之患者亦存在意義。舉例而言’塗有抗EPC抗體之 修復金管管道（人工動脈）將消除使用來自患者腿部或手臂
之動脈以達成繞道手術移植的需要。此將減少手術及麻醉 -人數，從而又將減少冠狀動脈手術死亡。以使Tvd結合蛋 白結合細胞表面標記（諸如CD34)以及已塗佈在植入之裝置 上之蛋白質（或任何種類之抗原決定基，包括（但不限於）蛋 白質月曰質及多醣）以促進細胞募集的方式設計tvd結合 蛋白。此等方法一般亦可用於其他醫學植入物。或者，可 將TVD結合蛋白塗佈在醫學裝置上且在植入及自該裝置釋 放所有TVD結合蛋白後（或可能需要其他新鮮TVD結合蛋 白之任何其他需求，包括已裝載之TVD結合蛋白之老化及 變性），可藉由向患者全身性投與新鮮TVD結合蛋白來再 裝載該裝置，其中TVD結合蛋白經設計以一組結合位點結 合兩個或兩個以上相關目標（細胞激素、細胞表面標記（諸 如CD34)等）且以另一組結合位點結合裝置上塗有之目標 (包括蛋白質及任何種類之抗原決定基，包括(但不限於)脂 質夕醣及聚合物）。此技術具有擴展經塗佈植入物之適 用性的優勢。 160878.doc -165- 201242977 A. TVD結合蛋白在各種疾病中之用途 本發明之TVD結合蛋白亦適用作治療各種疾病之治療性 分子。此等TVD結合蛋白可結合特定疾病中所涉及之一或 多種目標。以下描述各種疾病中之此等目標之實例。 1·人類自體免疫及發炎反應 全身性自體免疫及發炎反應中已牵涉許多蛋白質，包括 C5、CCLl(I-309)、CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子）、 CCL13(mcp-4) 、 CCL15(MIP-ld) 、 CCL16(HCC-4)、 CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-l)、 CCL20(MIP-3a) 、 CCL21(MIP-2) 、 CCL23(MPIF-1)、 CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、 CCL25(TECK)、CCL26、CCL3(MIP-la)、CCL4(MIP-lb)、CCL5(RANTES)、CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、 CXCL1 、 CXCLIO(IP-IO) 、 CXCL11 (I-TAC/IP-9)、 CXCL12(SDF1) ' CXCL13、CXCL14、CXCL2 ' CXCL3 ' CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、 IL8、CCL13(mcp-4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、 IL8RA、XCRl(CCXCRl)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、 ILIA、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、 IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、 SCYE1(内皮單核細胞活化細胞激素）、SPP1 、TNF、 TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、 IL5RA 、IL9 、 IL9R 、 ABCF1 、 BCL6 、 C3 、 C4A 、 160878.doc -166- s 201242977 CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1 、IL1RN、IL8RB、 LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAKI 、IRAK2、MYD88、 NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、 TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、 ACVR2B、ACVRL1 、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、 CD69 、CD80、CD86 、CNR1 ' CTLA4 、CYSLTR1 、
FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、 OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、 TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、 CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、 CCL15 、 CCL16 ' CCL17 、 CCL18 、 CCL19 、 CCL20 、 CCL21 、 CCL22 、 CCL23 、 CCL24 、 CCL25 、 CCR1 、 CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、 CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、 CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11 、CXCL12、 CXCL13 、 CXCR4 、 GPR2 、 SCYE1 、 SDF2 、 XCL1 、 XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、 BMPR2、C19orflO(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、 CSF3、CTLA4、DKFZp451J0118、E-選擇素、L-選擇素、 Fey 受體、FGF2、GFI1、HMGB1、IFNA1、IFNB1、 IFNG、IGF1 、ILIA、IL1B、IL1R1 、IL1R2、IL2、 IL2RA、IL2RB 、IL2RG、IL3 ' IL4、IL4R、IL5 、 IL5RA 、IL6 、IL6R、IL6ST 、IL7 、IL8 、IL8RA、 IL8RB ' IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、 160878.doc -167- 201242977 IL11RA、IL-12、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、 IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、 IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、 LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、 NGF、NKG2D、NPPB、PDGFB、PGE2、RAGE、 TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB111、TGFB2、 TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、 TNF、TNFa、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、 TNFRSF8 、 TNFRSF9 、 TNFRSF11A 、 TNFRSF21 、 TNFSF4 、 TNFSF5 、 TNFSF6 、 TNFSF11 、 VEGF 、 ZFPM2、RNF110(ZNF144)、NKG2D、Fey 受體、醣蛋白 (GP)IIb/IIIa、血栓調節蛋白、凝血酶、TREM、PAI-I、 ανβ3、uPA、Her2、IGF1R、EGFR、CD3、P 物質、 CGRP、蛋白質C、因子VII、因子IX、纖維蛋白溶酶原活 化因子、因子V、因子Vila、因子X、因子XII、因子 XIII、Clq、Clr、Cls、C4a、C4b、C2a、C2b、C、C3a及 C 3 b。在一個態樣中，提供可結合一或多個本文所列目標 之TVD結合蛋白。 2.哮喘 過敏性哮喘之特徵在於存在嗜伊紅血球增多、杯狀細胞 化生、上皮細胞改變' 氣管過度反應（AHR)以及Th2及Thl 細胞激素表現以及血清I g E含量升高。目前廣泛接受氣管 發炎為哮喘發病機制之潛在關鍵因素，涉及諸如T細胞、B 細胞、嗜伊紅血球、肥大細胞及巨噬細胞之發炎性細胞及 160878.doc •168· 201242977 其分泌之介體（包括細胞激素及趨化因子）的複雜相互作 用。皮質類固酵為當今用於哮喘之最重要的消炎治療劑； 然而’其作用機制不具特異性，且存在安全性問題，尤其 在青少年患者群體中。因此有必要開發更具特異性及乾向 性之療法。日益增加之證據表明小鼠申之比_13模擬許多 哮喘特徵’包括AHR、黏液分泌過多及氣管纖維化，而與 嗜伊紅血球發炎無關（Finotto等人（2005) Internat. Immunol. 17(8): 993-1007 ; Padilla等人（2005) J. Immunol. 174(12): 8097-8105)。 已暗示IL-13在引起與哮喘相關之病理性反應中具有關 鍵作用。降低IL-13在肺中之效應之抗IL-13單株抗體療法 的發展為激勵人心之新方法’其作為哮喘之新穎治療具有 相當大的前景。然而’哮喘發病機制中亦涉及差異免疫路 徑之其他介體，且除IL- Π之外亦阻斷此等介體可提供其 他治療益處。此等目標組包括（但不限於）IL_丨3及促炎性細 胞激素，諸如IL-18及腫瘤壞死因子-a(TNF-a)。TNF-α可 增強哮喘中之發炎反應且可能與疾病嚴重性相關聯 (McDonnell等人（2001) Progr. Respir. Res. 31: 247-250)。 IL-18使肥大細胞及嗜鹼性血球活化。此表明阻斷IL13、 IL-18及TNF-a可能具有有益作用，特別在重度氣管疾病 中。在一個實施例中’本發明之TVD結合蛋白結合目掉 IL-13、IL-18及TNFa且用於治療哮喘。 可評估發炎與AHR兩者之動物模型（諸如〇VA誘導哮喘 之小鼠模型）在此項技術中為已知的且可用於測定各種 160878.doc -169- 201242977 TVD結合蛋白治療哮喘之能力。用於研究哮喘之動物模型 揭不於以下中· C〇ffman等人（2005) J. Exp· Med. 201(12): 1875-1879 ’ Lloyd 等人（2〇〇1) Adv. Immunol. 77: 263-295 ; Boyce 等人（2005) j Exp. Med. 201(12): 1869-1873 ;及 Snibson*#A(20〇5)j.Brit.s〇c.Allerg.Clin.Immunol· 35(2): 146-52 °除此等目標對之常規安全性評估之外，亦 可能有必要針對免疫抑制程度進行特定測試且該等測試可 有助於選擇最佳目標對（參見Luster等人（1994) Toxicology 92(1-3). 229-43，Descotes 等人（1992) Devel. Biol. Stand. 77. 99-102 ’ Hart 等人（2001) J. Allerg. Clin. Immunol. 108(2): 250-257) 〇 基於本文揭示之基本原理且使用功效及安全性之相同評 估模型’可確定TVD結合蛋白可結合且可適用於治療哮喘 之其他目標組。在一個實施例中，此等目標包括（但不限 於）IL-13與IL-Ιβ，因為IL-Ιβ亦涉及於哮喘中之發炎反應 中；IL-13與發炎中涉及之細胞激素及趨化因子，諸如IL-13與 IL-9 ; IL-13 與 IL-4 ; IL-13 與 IL-5 ; IL-13 與 IL-25 ; IL-13與 TARC ; IL-13與 MDC ; IL-13與 MIF ; IL-13 與 TGF-β ; IL-13 與 LHR 促效劑；IL-13 與 CL25 ; IL-13 與 SPRR2a ; IL-13與 SPRR2b ; 及IL-13與ADAM8。本發明亦提供可結合哮 喘中涉及之一或多個選自由以下組成之群之目標的TVD結 合蛋白：CSFl(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、 FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、組織胺及組織胺受體、 ILIA、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、 160878.doc •170· 201242977 IL9、IL10、ILll、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、 IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、 IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2 .、 IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、 CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、 CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24、CX3CL1、 CXCL1 、 CXCL2 、 CXCL3 、 XCL1 、 CCR2 、 CCR3 、 CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、 XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、 TGFB1、TNF、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、 FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR及殼質酶》 3.類風濕性關節炎 類風濕性關節炎（RA)為一種全身性疾病，其特徵在於關 節滑膜中之慢性發炎反應，且與軟骨退化及近關節骨磨損 相關。患病關節中表現許多促炎性細胞激素，包括TNF、 趨化因子及生長因子《向RA小鼠模型全身性投與抗TNF抗 體或sTNFR融合蛋白顯示具有消炎性及關節保護性。用靜 脈内投與之英利昔單株抗體（Harriman，G.等人（1999) Ann. Rheum. Dis. 58 (增刊1): 161-4)(—種嵌合抗TNF單株抗體） 阻斷RA患者中之TNF活性的臨床研究已提供證據表明TNF 調控IL-6、IL-8、MCP-1及VEGF產生、免疫及發炎性細胞 募集至關節中、ir管生成及降低基質金屬蛋白酶1及3之血 液含量。對類風濕性關節炎中之發炎路徑的較佳理解已導 致鑑別類風濕性關節炎中涉及之其他治療目標。在過去幾 160878.doc • 171 - 201242977 年中，已在隨機對照試驗中測試有前景之治療劑，諸如介 白素-6拮抗劑（由Chugai，Roche開發之IL-6受體抗體 MRA)(參見 Nishimoto, N.等人（2004) Arthrit. Rheum. 50(6): 1761-1769)、CTLA4Ig(阿巴西普（abatacept)，Genovese， Μ·等人（2005) N. Engl. J. Med. 353: 1114-23.)及抗 B細胞療 法（利妥昔單株抗體；Okamoto, H.及 Kamatani, N. (2004) N. Engl. J. Med. 351: 1909)。已鑑別其他細胞激素，且已 顯示其在動物模型中具有益處，包括介白素-15(治療性抗 體 HuMax-IL_15，AMG 714(參見 Baslund，B·等人（2005) Arthrit. Rheum· 52(9): 2686-2692))、介白素-17及介白素-1 8，且當前正在進行此等藥劑之臨床試驗。多（例如三）特 異性抗體療法組合抗TNF及其他介體在增強臨床功效及/或 患者覆蓋範圍方面具有極大潛力。舉例而言，阻斷TNF與 VEGF兩者可能會根除發炎及血管生成，此兩者皆涉及於 RA之病理生理學中。亦涵蓋用特定TVD結合蛋白阻斷RA 中涉及之其他目標組，包括（但不限於）NGF、TNF及 PGE2 ; ILIA、IL-1B 及 PGE2 ; TNF 及 IL-18 ; TNF 及 IL-12 ; TNF及 IL-23 ; TNF及 IL-Ιβ ; TNF及 MIF ; TNF及 IL-17 ; TNF及IL-15 ; TNF及SOST。在一個實施例中，本發 明之結合蛋白結合選自由以下組成之群之目標：NGF、 TNF及 PGE2 ;及 IL-la、IL-Ιβ及 PGE2。 另外，NGF及IL-Ιβ之高表現量與骨關節炎中之疼痛相 關。因此，在一個實施例中，本發明之結合蛋白結合選自 由以下組成之群之目標：IL-la、IL-Ιβ及NGF ; IL-la、IL- I60878.doc -172· 201242977 1β及PGE2。 除此等目標組之常規安全性評估之外，亦可能有必要針 對免疫抑制程度進行特定測試且該等測試有助於選擇最佳 目標組（參見 Luster 等人（1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43 . Descotes等人（1992) Devel. Biol· Stand. 77: 99-102; Hart 等人（2001) J. Allerg· Clin. Immunol. l〇8(2): 250-257)。可 使用臨床前動物RA模型（諸如膠原蛋白誘導關節炎之小鼠 模型）a平估TVD結合蛋白是否將適用於治療類風濕性關節 炎。其他適用模型亦為此項技術中所熟知（參見Brand， D.D· (2005) Comp· Med. 55(2): 114-22)。基於親本結合蛋 白（例如抗體）對人類及小鼠直系同源物之交叉反應性（例如 對人類與小鼠TNF、人類與小鼠iL_15等之反應性），可用 「匹配代用抗體」衍生之TVD結合蛋白在小鼠CIA模型中 進行驗證研究；簡言之，基於兩個或兩個以上小鼠目標特 異性結合蛋白（例如抗體）之TVD結合蛋白可在可能之程度 上匹配用於人類TVD結合蛋白構築之親本人類或人類化結 合蛋白（例如抗體）之特徵（類似親和力、類似中和效能、類 似半衰期等）。
4. SLE SLE之免疫病原性標誌為多株b細胞活化，此導致高球 蛋白血症、產生自體抗體及形成免疫複合物。基本異常似 乎為T細胞由於全身性τ細胞調控異常而無法抑制禁忌8細 胞純系。此外，若干細胞激素（諸如IL-1 〇)以及起始第二信 號之共刺激分子（諸如CD40、CD40L、B7、CD28及CTLA-160878.doc -173- 201242977 4)促進B細胞與T細胞相互作用。此等相互作用連同免疫複 合物及細胞凋亡物質之吞噬細胞清除受損一起使免疫反應 及由此導致之組織損傷持續。下列目標可涉及於SLE中且 可潛在地用於供治療性干預之TVD結合蛋白方法中：Β細 胞靶向療法：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、 CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、 TNFRSF6 、 TNFSF5 、 TNFSF6 、 BLR1 、 HDAC4 、
HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、 RGS1 、 SLA2 、 CD81 、 IFNB1 、 IL10 、 TNFRSF5 、 TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、 HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、 IL4、INHA、ΙΝΗΒΑ、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、 CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、 TNFRSF8 、TNFSF7 、CD24、CD37、CD40 、CD72 、 CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、 MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA及ΝΤ5Ε ;協同刺激信號：CTLA4或Β7.1/Β7.2 ;抑制Β · 細胞存活：BlyS或BAFF ;補體不活化：C5 ;細胞激素調 節：關鍵原理在於任何組織中之淨生物反應均為促炎性細 胞激素或消炎細胞激素局部含量之間的平衡結果（參見 Sfikakis，P.P.等人（2005) Curr. Opin. Rheumatol. 17: 550-7)。SLE被視為一種Th-2驅動之疾病，已證實其中血清IL-4、IL-6及IL-10升高。亦涵蓋可結合兩個或兩個以上選自 由以下組成之群之目標的TVD結合蛋白：IL-4、IL-6、IL-
160878.doc -174- S 201242977 10、IFN-α及TNF-α。本文所論述之目標之組合將增強針對 SLE之治療功效，其可在許多狼瘡臨床前模型中進行測試 (參見 Peng，S.L. (2004) Methods Mol. Med. 102: 227-72)。 基於親本結合蛋白（例如抗體）對人類及小鼠直系同源物之 交又反應性（例如對人類及小鼠CD20、人類及小鼠干擾素α 等之反應性）’可用「匹配代用抗體」衍生之TVD結合蛋 白在小鼠狼瘡模型中進行驗證研究。簡言之，基於兩個或 兩個以上小鼠目標特異性結合蛋白（例如抗體）之TVD結合 蛋白可在可能之程度上匹配用於人類TVD結合蛋白構築之 親本人類或人類化結合蛋白（例如抗體）之特徵（類似親和 力、類似中和效能、類似半衰期等）。 5.多發性硬化症 多發性硬化症（MS)為一種病因基本上未知之複雜人類自 體免疫型疾病。在整個神經系統中髓鞘驗性蛋白（MBp)之 免疫破壞為多發性硬化症之主要病理。MS為一種具有複 雜病理的疾病，涉及CD4 +及CD8+ T細胞浸潤及中樞神經 系統内之反應。細胞激素、反應性氮物質及共刺激劑分子 在CNS中之表現皆已在]^3中有所描述。主要考慮因素為促 進產生自體免疫性之免疫機制。特定言之，抗原表現、細 胞激素與白血球相互作用及有助於平衡/調節其他τ細胞 (諸如Thl及Th2細胞）之調控性T細胞為治療目標鑑別之重 要方面。 IL-12為一種由APC產生且促進ΤΜ效應細胞分化之促炎 性細胞激素。IL-12在MS患者之正發展之病變中以及在受 160878.doc -175- 201242977 EAE影響之動物中產生。先前已展示干擾IL-12路徑可有效 防止齧齒動物之EAE，且使用抗IL-12單株抗體活體内中和 IL-12p40在普通狨猿之髓鞘誘發性EAE模型中具有有益作 用。 TWEAK為TNF家族之成員，其組成性表現於中樞神經系 統（CNS)中，視細胞類型而定具有促炎性、增殖性或細胞 凋亡效應。其受體Fn 14係由内皮細胞、反應性星形膠質細 胞及神經元表現於CNS中。在實驗性自體免疫腦脊髓炎 (EAE)期間，脊髓中之TWEAK及Fnl4 mRNA表現增加。對 鲁 C57BL/6小鼠中之髓鞘寡樹突神經膠質細胞醣蛋白（MOG) 誘發之EAE進行抗TWEAK抗體治療在激活（priming)階段後 治療小鼠時會引起疾病嚴重性及白血球浸潤降低。 本發明之一個態樣係關於可結合兩個或兩個以上，例如 三個選自由以下組成之群之目標的TVD結合蛋白：IL-12 、 TWEAK 、 IL-23 、 CXCL13 、 CD40 、 CD40L 、 IL-18 、 VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNy、GM-CSF、FGF、C5、CD52及 CCR2。 · 若干用於評估TVD結合蛋白治療MS之適用性之動物模 型為此項技術所已知（參見Steinman. L.等人（2005) Trends Immunol. 26(11): 565-71 ; Lublin, F.D·等人（1985) Springer Semin. Immunopathol. 8(3): 197-208 ; Genain，C.P.等人 (1997) J. Mol. Med. 75(3): 187-97 ; Tuohy，V.K·等人（1999) J. Exp. Med. 189(7): 1033-42 ; Owens，T.等人（1995)
Neurol. Clin.13(1): 51-73 ;及 Hart，B.A.等人（2005) J. 160878.doc -176- s 201242977
Immunol. 175(7): 4761-8)。基於親本結合蛋白（例如抗體〕 對人類及動物物種直系同源物之交又反應性（例如對人類 及小鼠IL-12、人類及小鼠TWEAK等之反應性），可用「匹 配代用抗體」衍生之TVD結合蛋白在小鼠EAE模型中進行 驗證研究。簡言之，基於兩個或兩個以上小鼠目標特異性 結合蛋白（例如抗體）之TVD結合蛋白可在可能之程度上匹 配用於人類TVD結合蛋白構築之親本人類或人類化結合蛋 白（例如抗體）之特徵（類似親和力、類似中和效能、類似半 衰期等）。相同概念適用於其他非齧齒動物物種中之動物 模型，其中將選擇「匹配代用抗體」衍生之TVD結合蛋白 用於預期藥理學及可能安全性研究。除此等目標對之常規 安全性評估之外，亦可能有必要針對免疫抑制程度進行特 定測試且該等測試有助於選擇最佳g標對（參見Luster等人 (1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43 ; Descotes 等人（1992)
Devel. Biol. Stand. 77： 99-102 ； Jones, R. (2000) IDrugs 3(4): 442-6)。 6. 敗血症 敗血症之病理生理學係由革蘭氏陰性（gram_negative)生 物體（脂多醣（LPS)、脂質A、内毒素）及革蘭氏陽性生物體 (脂磷壁酸（lipoteichoic acid)、肽聚醣）之外膜組分引發。 此專外膜組分能夠結合單核細胞表面上之CD 14受體。根 據新近描述之toll樣受體，信號接著傳遞至細胞，從而導 致最終產生促炎性細胞激素腫瘤壞死因子_a(TNF a)及介 白素-1 (IL-1)。嚴重發炎及免疫反應為敗血性休克之基本 160878.doc -177· 201242977 特徵且在由敗血症誘發之組織損壞、多器官衰竭及死亡之 發病機制中起重要作用。細胞激素，尤其腫瘤壞死因子 (TNF)及介白素（IL-1)已顯不為敗血性休克之關鍵介體。此 等細胞激素對組織具有直接毒性作用；其亦活化構脂酶 A2。此等及其他效應導致血小板活化因子濃度增加、促進 氧化氮合成酶活性、促進嗜中性白▲球進行組織浸潤及促 進嗜中性白血球活性》 對敗A症及敗血性休克之心療仍為臨床難題，且用針對 發炎反應之生物反應調節劑（亦即抗TNF及抗MIF)進行之 新近前瞻性試驗僅展示中等臨床益處。近來，關注已轉向 旨在逆轉免疫抑制之伴發期之療法。在實驗動物及危重患 者中進行之研究已表明淋巴器官及一些薄壁組織之細胞凋 亡增加會促進此免疫抑制、無反應性、及器官系統功能障 礙。在敗血症症候群期間，淋巴細胞之細胞凋亡可由不存 在IL2或由釋放糖皮質激素、顆粒酶（granzyme)或所謂 『死亡』細胞激素：腫瘤壞死因子α或Fas配體引發。細胞 凋亡經由細胞溶質及/或粒線體卡斯蛋白酶（caspases)之自 體活化繼續進行，該自體活化可受Bcl 2家族之促細胞凋 亡及抗細胞凋亡成員影響。在實驗動物中，用細胞凋亡抑 制劑治療不僅可防止淋巴細胞之細胞凋亡；其亦可改良結 果。儘管對抗細胞凋亡劑之臨床試驗在很大程度上歸因於 與其投藥及組織靶向相關之技術困難而難以進行，但抑制 淋巴細胞之細胞凋亡代表一種用於敗血症患者之有吸引力 的治療目標。同樣’靶向發炎性介體及細胞凋亡介體兩者 160878.doc •178· 201242977 之多特異性藥劑可具有額外益處。本發明之一個態樣係關 於可結合兩種或兩種以上涉及於敗血症中之目標的TVD結 合蛋白。在一個實施例中，兩種或兩種以上目標係選自由 以下組成之群：TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、 IL-12、IL-23、FasL、LPS、Toll樣受體、TLR-4、組織因 子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、CASP4、IL-10、IL-1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、CCR3、 IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、 HMOX1、中期因子、IRAKI、NFKB2、SERPINA1、 SERPINE卜 TREM1、TNFWJMTNFa)、PGE2、IL-12、IL-13、IL-18、HMGB1、VEGF、RAGE、NGF、IL-a、IL-1β、E-選擇素、L-選擇素、醣蛋白（GP)IIb/IIIa、血栓調節 蛋白、凝血酶、TREM1、ΡΑΙ-Ί、ανβ3、uPA、凝血級聯之 組分（例如蛋白質C、因子VII、因子IX、纖維蛋白溶酶原 活化因子、因子V、因子Vila、因子X、因子XII及因子 XIII)及補體組分（例如 Clq、Clr、Cls、C4a、C4b、C2a、 C2b、C、C3a及C3b)。在一個實施例中，本發明之TVD結 合蛋白結合三個選自由以下組成之群之目標：HMGB1、 VEGF 及 TNF(例如 TNFa) ; RAGE、VEGF 及 TNF(例如 TNFa) ; NGF、TNF(例如 TNFa)及 PGE2 ; IL-la、IL-Ιβ及 PGE2 ;及IL-la、IL-Ιβ及NGF。此等TVD結合蛋白對敗血 症之功效可在此項技術中已知之臨床前動物模型中評估 (參見 Buras，J· A.等人（2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4(10): 854-65;及 Calandra，T.等人（2000) Nat. Med. 6(2): 164- 160878.doc •179· 201242977 70) 〇 7.神經病症 7·1·神經退化性疾病 慢性神經退化性疾病通常為特徵在於神經元功能進行性 喪失（神經元細胞死亡、脫髓鞘）、運動性喪失及記憶喪失 之年齡相關疾病。對慢性神經退化性疾病（例如阿茲海默 氏病）之潛在機制的新興認識展示複雜病因且已認識到多 種因素會造成其發展及進展，例如年齡血糖狀況、殿粉 樣蛋白產生及多聚化、晚期糖基化終點產物（AGE)(其結合籲 其受體RAGE(AGE之受體））累積、腦氧化應激增加、腦血 流量減少、包括發炎性細胞激素及趨化因子之釋放的神經 發炎、神經元功能障礙及微神經膠質細胞活化。因此，此 等慢性神經退化性疾病代表多種細胞類型與介體之間的複 雜相互作用。針對此等疾病之治療策略有限且主要為用非 特異性消炎劑（例如皮質類固醇、c〇x抑制劑）或防止神經 元喪失及/或突觸功能之藥劑阻斷發炎過程◦此等治療不 能阻止疾病進展。冑近研究表B月更具乾向性之療法（諸如 φ 針對可溶性Αβ肽（包括Αβ寡聚形式）之抗體）不僅可有助於. 阻止疾病進展而且亦可有助於維持記憶力。此等初步觀測 、。果表明靶向一種以上疾病介體(例如Αρ及一或多種促炎 性細㈣素（諸如TNF))之特異性療法可對慢性神經退化性 疾病提（、比乾向單-疾病機制（例如單獨彳溶性增所觀測 到之治療功效甚至更佳的治療功效（參見Neis〇n, r B (2005) Curr. Pharm. Des. n： 3335 ； Klein. W. (2002) 160878.doc s •180· 201242977
Neurochem. Int. 41: 345 ; Janelsins，M.C.等人（2005) J. Neuroinflamm. 2: 23 ; Soloman，B. (2004) Curr. Alzheimer Res. 1: 149 ; Klyubin，I.等人（2005) Nat. Med· 11: 556-61 ; Bornemann，K.D 等人（2001) Am. J. Pathol. 158: 63 ; Deane， R.等人（2003) Nat. Med. 9: 907-13 ;及 Masliah，E·等人 (2005) Neuron. 46: 857) ° 本發明之TVD結合蛋白可結合兩種或兩種以上涉及於諸 如阿茲海默氏病之慢性神經退化性疾病中的目標。此等目 標包括（但不限於）涉及於AD發病機制中之任何可溶性或細 胞表面介體，例如AGE(S100 A、兩性黴素（amphoterin))、 促炎性細胞激素（例如IL-1)、趨化因子（例如MCP 1)、抑制 神經再生之分子（例如Nogo、RGM A)、增強神經突生長之 分子（神經營養素（neurotrophin))。TVD結合蛋白之功效可 在諸如過度表現澱粉樣前驅蛋白質或Rage且發展阿茲海 默氏病樣症狀之轉殖基因小鼠的臨床前動物模型中加以驗 證》此外，可構築TVD結合蛋白且測試其在動物模型中之 功效，且可選擇最佳治療性TVD結合蛋白以在人類患者中 進行測試。TVD結合蛋白亦可用於治療其他神經退化性疾 病，諸如帕金森氏病。α-突觸核蛋白（Alpha-Synuclein)涉 及於帕金森氏病之病理中。可靶向α-突觸核蛋白及發炎性 介體（諸如TNF、IL-1、MCP-1)之TVD結合蛋白可證明為帕 金森氏病之有效療法且亦涵蓋在本發明中。 7.2神經元再生及脊趙損傷 儘管對病理機制之認識增加’但脊髓損傷（SCI)仍為一 160878.doc • 181 - 201242977 種破壞性病狀且代表特徵在⑥高醫藥需求之醫學適應症。 大多數脊趙損傷為挫傷或壓傷，且原發性損傷後通常為 使初始損傷惡化且引起病變區域顯著擴大（有時1〇倍以 上）之繼發性損傷機制（發炎性介體，例如細胞激素及趨 化因子）。SCI中之此等原發性及繼發性機制與由其他方 式（例如中風）引起之腦損傷中之機制極為相似。不存在 令人滿意之治療且高劑量快速注射甲潑尼龍 (methylprednis〇l〇ne)(MP)為唯一在損傷後8小時之窄時間 窗内使用之療法。然而，此治療僅意欲預防繼發性損傷而 不引起任何顯著功能恢復。其由於缺乏明確功效且不利作 用嚴重（如免疫抑制伴有後續感染及嚴重組織病理學肌肉 改變）而受到嚴厲批評。無其他刺激内源再生潛能之藥 物、生物劑或小分子獲核准，但近年來有前景之治療原理 及藥物候選物已在SCI動物模型中展示功效。在很大程度 上’人類SCI中功能恢復之缺乏係由抑制病變部位處、症 痕組織中、髓鞘中以及損傷相關細胞上之神經突生長之因 子所引起。此等因子為髓勒相關蛋白質NogoA、OMgp及 MAG、RGM A、症痕相關CSPG(硫酸軟骨素蛋白聚膽 (Chondroitin Sulfate Proteoglycans))及反應性星形膠質細 胞上之抑制因子（一些臂板蛋白（semaphorin)及蝶素 (ephrin))。然而，在病變部位處不僅發現生長抑制性分子 而且亦發現神經突生長刺激因子（如神經營養素、層黏連 蛋白（laminin)、L1及其他因子）。神經突生長抑制分子及 生長促進分子之此組合可解釋阻斷如NogoA或RGM A之單 160878.doc -182- 201242977 一因子會在齧齒動物SCI模型中引起顯著功能恢復，因為 減小抑制性影響可使平衡自生長抑制作用轉向生長促進作 用。然而，在阻斷單一神經突生長抑制分子之情況下觀測 到之恢復不完全。為達成更快且更明顯之恢復，可能需要 阻斷兩種神經突生長抑制分子（例如Nogo及RGM A)，或阻 斷神經突生長抑制分子且增強神經突生長增強分子（例如 Nogo及神經營養素）之功能，或阻斷神經突生長抑制分子 (例如Nogo)及促炎性分子（例如TNF)(參見McGee，A.W.等 人（2003) Trends Neurosci. 26: 193 ; Domeniconi，M.等人 (2005) J. Neurol. Sci. 233: 43 ; Makwanal，Μ.等人（2005) FEBS J. 272: 2628 ； Dickson, B.J. (2002) Science 298: 1959; Yu, F.及 Teng，H.等人（2005) J. Neurosci. Res· 79: 273 ; Karnezis, T·等人（2004) Nature Neurosci. 7: 736 ; Xu， G.等人（2004) J. Neurochem. 91: 1018)。 在一個態樣中，提供可結合以下目標組之TVD結合蛋 白：諸如NgR 及 RGM A ; NogoA 及 RGM A ; MAG 及 RGM A ; OMGp及 RGM A ; RGM A及 RGM B ; CSPG及 RGM A ; 聚集蛋白聚糖、中期因子、神經蛋白聚糖、多功能蛋白聚 糖、磷酸蛋白聚糖、Te38及TNF-α ;及與促進樹突及軸突 萌芽之抗體組合之Αβ球聚體特異性抗體。樹突病變為AD 的極早期徵象，且已知NOGO Α會限制樹突生長。可將一 種此類型之Αβ與任何一或多種SCI-候選物（體稍-蛋白 質）Ab組合。其他TVD結合蛋白目標可包括NgR-p75、 NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、 160878.doc •183· 201242977 1^11吕〇-卩75、]^八0及〇111§卩之任何組合。另外，目標亦可包 括涉及抑制神經突之任何可溶性或細胞表面介體，例如 Nogo、Ompg、MAG、RGM A、臂板蛋白、蝶素、可溶性 A-b、促炎性細胞激素（例如IL-1)、趨化因子（例如MIP 1 a) 及抑制神經再生之分子。此等TVD結合蛋白之功效可在脊 髓損傷之臨床前動物模型中加以驗證。此外，可構築此等 TVD結合蛋白且測試其在動物模型中之功效，且可選擇最 佳治療性TVD結合蛋白以在人類患者中進行測試。此外， 可構築乾向單一受體（例如結合三種配體Nogo、Qmpg及 MAG之Nogo受體以及結合Αβ及S100 A之RAGE)上之兩個 不同配體結合位點的TVD結合蛋白。此外，在如多發性硬 化症之免疫疾病中，例如Nogo及Nogo受體之神經突生長 抑制劑亦在防止神經再生中起作用。已在多發性硬化症之 動物模型中顯示，抑制Nogo-Nogo受體相互作用可增強恢 復。因此，可阻斷兩種免疫介體（例如細胞激素（如IL-12及 TNFa)及神經突生長抑制分子（例如Nogo或RGM))之功能的 TVD結合蛋白可提供比單獨阻斷免疫或神經突生長抑制分 子更快且更大之功效。 8.腫瘤病症 單株抗體療法已顯現為癌症之重要治療模態（von Mehren Μ等人（2003) Annu. Rev. Med. 54: 343-69)。抗體 可藉由誘導細胞凋亡、重導向細胞毒性、干擾配體-受體 相互作用或阻止對贅生性表型至關重要之蛋白質之表現來 發揮抗腫瘤作用。此外，抗體可靶向腫瘤微環境之組分， 160878.doc -184- 201242977 從而擾亂重要結構，諸如腫瘤相關血管結構之形成。抗體 亦可靶向配體為生長因子之受體’諸如表皮生長因子受 體。因此，抗體可抑制刺激細胞生長之天然配體結合靶向 之腫瘤細胞。或者，抗體可誘導抗個體基因型網狀物、補 體介導之細胞毒性或抗體依賴性細胞毒性（ADCC) »使用 靶向兩種或兩種以上各別腫瘤介體之多特異性結合蛋白 (例如抗體）相較於單特異性療法將可能提供其他益處。亦 涵蓋可結合下列目標組以治療腫瘤疾病之TVD結合蛋白： NGF、Her2及 VEGF ; NGF、EGFR及 IGF1R ; NGF、EGFR 及 VEGF ; EGFR、Her2 及 VEGF ; IGF1 及 IGF2 ; IGF1/2 及 HER-2 ; VEGFR及 EGFR ; CD20及 CD3 ; CD138及 CD20 ; CD38 及 CD20 ; CD38 及 CD138 ; CD40 及 CD20 ; CD138 及 CD40 ; CD38 及 CD40 ; CD-20 及 CD-19 ; CD-20 及 EGFR ; CD-20及 CD-80 ; CD-20及 CD-22 ; CD-3 及 HER-2 ; CD-3 及 CD-19 ; EGFR及 HER-2 ; EGFR及 CD-3 ; EGFR及 IGF1，2 ; EGFR及 IGF1R ; EGFR 及 RON ; EGFR 及 HGF ; EGFR 及 c-MET ; HER-2 及 IGF1，2 ; HER-2 及 IGF1R ; RON 及 HGF ; VEGF及 EGFR ; VEGF及 HER-2 ; VEGF及 CD-20 ; VEGF 及 IGF1，2 ; VEGF 及 DLL4 ; VEGF 及 HGF ; VEGF 及 RON ; VEGF 及 NRP1 ; CD20 及 CD3 ; VEGF 及 PLGF ; DLL4 及 PLGF ; ErbB3 及 EGFR ; HGF及 ErbB3、HER-2及 ErbB3 ; c-Met 及 ErbB3 ; HER-2 及 PLGF ; HER-2 及 HER-2 ; TNF 及 SOST。 其他目標組合包括EGF/erb-2/erb-3家族之兩個或兩個以 160878.doc • 185- 201242977
上成員。腫瘤疾病中所涉及之TVD結合蛋白可結合的其他 目標（一或多種）包括（但不限於）選自由以下組成之群者： CD52 ' CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、 IL12A、ILIA、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、 TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、 FGF12 、 FGF13 、 FGF14 、 FGF16 、 FGF17 、 FGF18 、 FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、 FGF3 、 FGF4 、 FGF5 、 FGF6 、 FGF7 、 FGF8 、 FGF9 、 GRP、IGF1、IGF2、IL12A、ILIA、IL1B、IL2、INHA、 TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、 FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1R ' IL2、 BCL2 、 CD164 、 CDKN1A 、 CDKN1B 、 CDKN1C 、 CDKN2A 、 CDKN2B 、 CDKN2C 、 CDKN3 、 GNRH1 、 IGFBP6、ILIA、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、 AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、 CDK9、E2F1、EGFR、ENOl、ERBB2、ESR1、ESR2、 IGFBP3 、 IGFBP6 、 IL2 、 INSL4 、 MYC 、 NOX5 、 NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、 FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、 TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、 INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、 NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、NR0B2、 NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、 NR2E1 、 NR2E3 、 NR2F1 、 NR2F2 、 NR3C1 、 NR3C2 、 160878.doc -186- s 201242977 NR4A1 、 NR4A2 、 NR5A1 、 NR5A2 、 NR6A1 、 PGR 、 RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、 BRCA1 、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1 、COL6A1 、 EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、 FGF14 、 FGF16 、 FGF17 、 FGF18 、 FGF2 、 FGF20 、 FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、 FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、 IGFBP6、IL12A、ILIA、IL1B、IL2、IL24、INHA、
INSL3 ' INSL4 、 KLK10 、 KLK12 ' KLK13 、 KLK14 、 KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、 MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1 、PAP、PLAU、PRL、 PSAP 、SERPINA3 、SHBG、TGFA、TIMP3 、CD44、 CDH1 、CDH10 、CDH19 、CDH20 、 CDH7 、CDH9 、 CDH1 、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、 CDH7、CDH8、CDH9、ROB02、CD44、ILK、ITGA1、 APC 、CD164 、COL6A1 、MTSS1 、PAP 、TGFB1I1 、 AGR2 、 AIG1 、 AKAP1 、 AKAP2 、 CANT1 、 CAV1 、 CDH12、CLDN3 、CLN3、CYB5 、CYC1 、DAB2IP、 DES 、 DNCL1 、 ELAC2 、 EN02 、 EN03 、 FASN 、 FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1 、GAGEC1 、GGT1 、 GSTP1 、HIP1 、HUMCYT2A、IL29、K6HF 、KAI1 、 KRT2A 、 MIB1 、 PARTI 、 PATE 、 PCA3 、 PIAS2 、 PIK3CG、PPID、PR1 、PSCA、SLC2A2、SLC33A1 、 SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、 160878.doc -187- 201242977 ANGPTl、ANGPT2、ANPEP、ECGFl、EREG、FGFl、 FGF2、FIGF、FLT1、JAG1 、KDR、LAMA5、NRP1 、 NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、 ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、 NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、 SERPINF1 、 TNFAIP2 、 CCL11 、 CCL2 、 CXCL1 、 CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、
IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、 EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、 ITGB3 、 PDGFA 、TEK 、TGFA ' TGFB1 、 TGFB2 、 TGFBR1 、CCL2、CDH5、C0L18A1 、EDG1 、ENG、 ITGAV 、 ITGB3 、 THBS1 、 THBS2 、 BAD 、 BAG1 、 BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、 CDH1(E-鈣黏附蛋白）、CDKNlB(p27Kipl)、 CDKN2A(pl6INK4a)、C0L6A1、CTNNBl(b-索烴素）、
CTSB(組織蛋白酶 B)、ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2 ' F3(TF)、FOSLl(FRA-l)、GATA3、GSN(膠溶素）、 IGFBP2 ' IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(醣蛋白 130)、 ITGA6(a6 整合素）、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-
Jun) 、 MKI67(Ki-67) 、 NGFB(NGF) 、 NGFR 、 NME1(NM23A) 、 PGR 、 PLAU(uPA) 、 PTEN 、 SERPINB5(乳腺絲抑蛋白）、SERPINEl(PAI-l)、TGFA、 THBS1 (血小板反應蛋白-1)、TIE(Tie-l)、TNFRSF6(Fas)、 TNFSF6(FasL) 、 TOP2A(拓撲異構酶 Iia) 、 TP53 、 160878.doc • 188 · s 201242977
AZGP1(鋅-a-醣蛋白）、BPAG1(網蛋白）、 CDKNlA(p21Wapl/Cipl)、CLDN7(緊密連接蛋白-7)、 CLU(凝集素）、ERBB2(Her-2)、FGF1、FLRT1(纖維結合蛋 白）、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6(a6 整合 素）、ITGB4(b 4 整合素）、KLF5(GC 盒 BP)、KRT19(角蛋白 19)、KRTHB6(毛髮特異性II型角蛋白）、MACMARCKS、 MT3(金屬硫連接蛋白-III) ' MUC1(黏蛋白）、？丁052((：0又-2)、RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2(親脂性蛋白 B)、SCGB2A1(|L腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、 SPRRlB(Sprl) 、 THBS1 、 THBS2 、 THBS4 、及 TNFAIP2(B94)、RON、c-Met、CD64、DLL4、PLGF、 CTLA4、磷脂醯絲胺酸、R0B04、CD80、CD22、CD40、 CD23、CD28、CD80、CD55、CD38、CD70、CD74、 CD30、CD138、CD56、CD33、CD2、CD137、DR4、 DR5、RANKL、VEGFR2、PDGFR、VEGFR1、MTSP1、 MSP、EPHB2、EPHA1、EPHA2、EpCAM、PGE2、 NKG2D、LPA ' SIP、APRIL、BCMA、MAPG、FLT3、 PDGFRa、PDGFRp、ROR1、PSMA、PSCA、SCD1 及 CD59。 在另一實施例中，本發明之TVD結合蛋白特異性靶向腫 瘤細胞且使免疫效應細胞緊密鄰近於腫瘤以引發及/或增 強對腫瘤之免疫反應。在一個實施例中，本發明之TVD結 合蛋白結合CD3及存在於腫瘤（例如具有混合細胞類型之腫 瘤）之異質細胞上之兩種不同細胞表面分子。在另一實施 160878.doc -189- 201242977 例中，本發明之TVD結合蛋白結合免疫細胞受體（諸如 NKG2D或Fey受體）及存在於腫瘤（例如具有混合細胞類型 之腫瘤）之異質細胞上之兩種不同細胞表面分子。 9.其他疾病、病症及病狀 已知神經生長因子（NGF)會影響發炎性疼痛及神經疼 痛，且抗NGF療法已顯示會減輕此兩種疼痛。因此，NGF 可用於治療敗血症及類風濕性關節炎（如上所論述）以及治 療疼痛及骨關節炎。顯示涉及於疼痛中之其他因子包括例 如 TNF、IL-la、IL-Ιβ、IL-6、CGRP、P物質及前列腺素 E2(PGE2)。因此，在一個實施例中，本發明之結合蛋白結 合選自由以下組成之群之目標.IL-la、IL-Ιβ及N G F，IL _ la、IL-Ιβ及 PGE2 ; IL-la、NGF及 P物質；及 IL-la、NGF 及CGRP。 另外，NGF及IL-1 β之高表現量與骨關節炎中之疼痛相 關。因此，在一個實施例中，本發明之結合蛋白結合選自 由以下組成之群之目標：IL-1 a、IL-1 β及NGF ; IL- 1 a、IL-1β及PGE2。 BNP已牽涉於心臟功能中。在其他疾病中，BNP TVD結 合蛋白可潛在地用於治療心血管疾病，包括涉及心臟、血 管或循環之各種臨床疾病、病症或病狀。疾病、病症或病 狀可歸因於冠狀動脈、腦動脈或周邊動脈之動脈粥樣硬化 損害。此類可潛在治療之心血管疾病包括（但不限於）冠狀 動脈疾病、周邊血管疾病、高血·壓、心肌梗塞、心臟衰竭 及其類似疾病。同樣，HIV TVD結合蛋白可潛在地用於治 160878.doc -190- 201242977 療AIDS或AIDS之症狀。
IL-18已確定為包括（但不限於）以下之各種病狀或疾病狀 態之標記：發炎病症（例如過敏及自體免疫疾 病）（Kawashima 等人（1997) J. Educ. Inform. Rheumatol. 26(2): 77)、急性腎臟損傷（Parikh 等人（2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16: 3046-3052 ;及 Parikh 等人（2006) Kidney Int，l. 70: 199-203)、慢性腎臟疾病（諸如當用作組分析（panel assay)之一部分時）、極小變化型腎炎症候群 (MCNS)(Matsumoto 等人（2001) Nephron 88: 334-339)、成 人發作型史提爾氏病（Kawaguchi等人（2001) Arthrit. Rheum. 44(7): 1716-1717)、青少年異位性皮炎（Hon等人 (2004) Ped. Derm. 21 (6): 619-622)、嗤血淋巴組織細胞瘤 病（HLH)(Takeda等人（1999) Brit. J. Haematol. 106(1): 182-189)、青少年特發性關節炎（Lotito等人（2007) J. Rheumatol. 34(4): 823-830)、印巢癌（Le Page 等人（20060 Int'l J. Cancer 1 18: 1750-1758)、全身性紅斑狼瘡症 (Amerio 等人（2002) Clin. Exp. Rheum. 20(4): 535-538)及未 來心血管事件（Blankenberg 等人（2003) Circul. 108(20): 2453-2459)。 NGAL為急性腎損傷或疾病之早期標記。除由活化人類 嗜中性白血球之特定顆粒分泌之外，NGAL亦由腎元反應 於腎小管上皮損壞而產生且為腎小管間質性（TI)損傷之標 記。在由缺血或腎毒性引起之急性腎小管壞死（ATN)中， 甚至在輕度「無症狀性」腎缺血之後，NGAL含量亦會上 160878.doc -191 - 201242977 升。此外，已知在慢性腎臟疾病（CKD)及急性腎臟損傷 ((AKI);參見例如Devarajan 等人（2008) Amer. J. Kidn. Dis. 52(3): 395-399及 Bolignano 等人（2008) Amer. J. Kidn. Dis. 52(3): 595-605)之情況下，NGAL由腎臟表現。已表明尿 NGAL含量升高預示進行性腎衰竭。先前已證實在動物與 人類模型兩者中在缺血性或腎毒性損傷之後極早期， NGAL由腎小管大量表現。NGAL快速分泌入尿中，在尿 中，其可容易經偵測及量測，且其先於缺血性損傷之任何 其他已知尿或血清標記出現。該蛋白質對蛋白酶具有抗 性，表明其可在尿中作為NGAL在腎小管中表現之可靠標 記加以回收。另外，源於腎臟外部（例如自血液過濾）之 NGAL不出現在尿中，而是由近端小管定量吸收。NGAL 亦為許多其他疾病（參見例如Xu等人（2000) Biochim. et Biophys. Acta 1482: 298-307)、病症及病狀，包括發炎， 諸如與感染相關之發炎之診斷及/或預後中的標記。其為 大腸急躁症（irritable bowel syndrome)(參見例如美國專利 公開案第2008/0166719號及第2008/0085524號）；腎病症、 疾病及損傷（參見例如美國專利公開案第2008/0090304號、 第 2008/0014644號、第 2008/0014604號、第 2007/0254370 號及第2007/0037232號）；全身性發炎反應症候群（SIRS)、 敗血症、重度敗血症、敗血性休克及多重器官功能障礙症 候群（MODS)(參見例如美國專利公開案第2008/0050832號 及第2007/0092911號；亦參見美國專利第6，136,526號）； 牙周病（參見例如美國專利第5,866,432號）；及靜脈血栓栓 201242977 塞性疾病（參見例如美國專利公開案第2007/0269836號）以 及其他疾病之標記。在呈其游離未複合形式時，其為卵巢 癌、侵襲性及非侵襲性乳癌、及非典型乳腺管增生（其為 乳癌之一種主要風險因素）之標記（參見例如美國專利公開 案第2007/0196876號；關於評估癌瘤之增生狀態，亦參見 美國專利第5,627,034號及第5,846,739號）。其亦為結腸癌 (Nielsen 等人（1996) Gut 38: 414-420)、胰臟癌（Furutani 等 人（1998) Cane. Lett. 122: 209-214)及食道癌之標記。當與 MMP-9複合時，其亦為與組織重塑相關之病狀之標記（參 見例如美國專利第7,432,066號及第7，153,660號）。高NGAL 量（例如約 350 gg/L)(Xu fA(i995)Scand.J.Clin.Lab.
Invest· 55: 125-13 1)亦可指示與病毒感染相對之細菌感染 (參見例如美國專利第7,056,702號）。 在其他疾病中’ IL-18及NGAL TVD結合蛋白可潛在地用 於治療腎病’包括腎臟之任何疾病、病症或損壞或損傷， 包括例如急性腎衰竭、急性腎炎症候群、止痛劑腎病變 (analgesic nephropathy)、粥狀栓塞性腎病（ather〇emb〇lie renal disease)、慢性腎衰竭、慢性腎炎、先天性腎炎症候 群、末期腎病、古巴士德症候群、間質性腎炎、腎癌、腎 損壞、腎感染、腎損傷、腎結石、狼瘡腎炎〇upus nephritis)、膜增生性GN I、膜增生性GN II、膜性腎病 變、極小變化型疾病、壞死性絲球體腎炎、腎母細胞瘤、 腎鈣質沉著（nephrocalcinosis)、腎性尿崩症（nephr〇genic diabetes insipidus)、腎病變-IgA、腎病（腎病症候群）、多 160878.doc -193- 201242977 囊性腎臟疾病、鏈球菌感染後gn、回流腎病變、腎動脈 栓塞、腎動脈狹窄、腎乳頭狀壞死（renal papiUary necrosis)、第I型腎小管性酸中毒、第^型腎小管性酸中 毒、腎灌注低下（renal underperfusion)、腎靜脈栓塞及其 類似疾病。 III.醫藥组合物 本發明亦提供包含本發明之結合蛋白及醫藥學上可接受 之載劑的醫藥組合物。包含本發明之結合蛋白之醫藥組合 物係用於（但不限於）診斷、積測或監測病症；預防（例如抑 制或延遲疾病、病症或其他病狀之發作）、治療處理或 改善病症《其一或多種症狀；及/或研究。在一特定實施 例中，組合物包含一或多種本發明之結合蛋白。在另一實 施例中’醫藥組合物包含一或多種本發明之結合蛋白及除 本發月之，,σ 5蛋白以外之—或多種用於治療病症的防治劑 或治療劑ϋ實施例中，防治劑或治療劑為已知適用 於或已用於或當前正用於預防（例如抑制或延遲疾病、病 症或其他病狀之發作）、治療、處理或改善病症或其一或 多種症狀的防治劑或治療劑。根據此等實施例，組合物可 另外包含載劑、稀釋劑或賦形劑。 本發明之結合蛋白可併入適於向個體投與之醫藥组合』 中。通常’醫藥組合物包含本發明之結合蛋白及醫藥學 可接受之載劑。如本文所用，「醫藥 酋樂学上可接受之載劑 包括在生理學上相容之任何乃 仕彳7及所有溶劑、分散介質、丨 衣、抗細菌劑及抗真菌劑、笤谋 W寺張及吸收延遲劑及其類^ I60878.doc
S -194· 201242977 物。醫藥學上可接受之載劑之實例包 磷酸鹽緩衝生理食鹽水自食鹽水、 之-或多者以及其組合。二=乙醇及其類似物 等張劑，例如糖;多元·，諸合物中包括 氣化納。醫藥學上可接受之載劍可另外:含::: = 或其抗原結合片段之存放期或有效性之辅助物質:= 潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑。
各種傳遞系統為已知的且可用於投與—或多種本發明之 結合蛋白(例如抗體)或一或多種本發明之結合蛋白(例如抗 體）與適用於預帽如抑制或延遲疾病、病症或其他病狀 之發作）、處理、治療或改善病症或其—或多種症狀之防 治劑或治療劑的組合，例如囊封於脂質體、微粒、微膠囊 中，可表現抗體或抗體片段之重組細胞；受體介導之内飲 作用（參見例如 Wu 及 Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429- 4432);及構築作為反轉錄病毒或其他載體之一部分之核 酸等。投與本發明之防治劑或治療劑之方法包括（但不限 於）非經腸投與（例如皮内、肌肉内、腹膜内、靜脈内及皮 下）、硬膜外投與、腫瘤内投與及黏膜投與（例如鼻内及經 口途徑）。此外，可例如藉由使用吸入器或喷霧器及含有 氣霧劑之調配物採用經肺投藥》參見例如美國專利第 6,019,968 號；第 5,985,320 號；第 5,985,309 號；第 5,934,272 號；第 5,874,064 號；第 5,855,913 號；第 5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號；第 WO 97/32572號；第 WO 97/44013號；第 160878.doc •195- 201242977 WO 98/31346號；及第WO 99/66903號》在一個實施例 中’使用Alkermes AIR®經肺藥物傳遞技術（Alkermes， Inc.，Cambridge，ΜΑ)投與本發明之結合蛋白、組合療法或 本發明之組合物。在一特定實施例中’本發明之防治劑或 治療劑係肌肉内、靜脈内、腫瘤内、經口、鼻内、經肺或 皮下投與。防治劑或治療劑可藉由任何適宜途徑，例如藉 由輸注或快速注射、藉由經上皮或黏膜皮膚内層（例如口 腔黏膜、直腸及腸黏膜等）吸收進行投與且可連同其他生 物活性劑一起投與。投與可為全身性或局部投與。 在一特定實施例中，可能需要向需要治療之區域局部投 與本發明之防治劑或治療劑；此可藉由例如（但不限於）局 部輸注、注射或藉助於植入物（該植入物為多孔或無孔材 料，包括膜及基質’諸如矽橡膠膜（sialastic membrane)、 聚合物、纖維基質（例如Tissuel②）或膠原蛋白基質）達成。 在一個實施例中，向個體之受影響區域局部投與有效量之 一或多種本發明之結合蛋白拮抗劑以預防、治療、處理及/ 或改善病症或其症狀。在另一實施例中，向個體之受影響 區域局部投與有效量之一或多種本發明之結合蛋白與有效 量之一或多種除本發明之結合蛋白以外之療法（例如一或 多種防治劑或治療劑）的組合以預防、治療、處理及/或改 善病症或其一或多種症狀。
在另實知例中，防治劑或治療劑可以控制釋放或持續 釋放系統傳遞。在一個實施例中’可使用系來達成控制釋 放或持續釋放（參見Langer，同上；Sefton (1987) CRC 160878.doc 201242977
Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20 ; Buchwald 等人（1980) Surgery 88: 507 ； Saudek等人（1989) N. Engl. J. Med. 321: 574)。在另一實施例中，可使用聚合材料來達成本發明之 療法之控制釋放或持續釋放（參見例如Medical Applications of Controlled Release，Langer及 Wise (編），CRC Pres.， Boca Raton, Fla. (1974) ； Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen 及 Ball (編），Wiley，New York (1984) ; Ranger及 Peppas (1983) J·， Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 ;亦參見Levy 等人（1985) Science 228: 190 ; During 等人（1989) Ann. Neurol. 25: 351 ; Howard 等人（1989) J. Neurosurg. 71: 105 ;美國專利第5,679,377號；第5，916,597號；第 5,912,015號；第 5,989,463 號及第 5，128,326號；及 PCT公開 案第WO 99/15154號；第WO 99/20253號）。持續釋放調配 物中使用之聚合物之實例包括（但不限於）聚（2-羥基曱基丙 烯酸乙酯）、聚（曱基丙烯酸曱酯）、聚（丙烯酸）、聚（乙烯· 共-乙酸乙烯酯）、聚（曱基丙烯酸）、聚乙交酯（PLG)、聚酸 酐、聚（N-乙烯基吡咯啶酮）、聚（乙烯酵）、聚丙烯醯胺、 聚（乙二醇）、聚丙交酯（PLA)、聚（丙交酯·共-乙交 酯）(PLGA)及聚原酸酯。在一個實施例中，持續釋放調配 物中使用之聚合物為惰性的、不含可浸出雜質、儲存穩 定、無菌且生物可降解。在另一實施例中’控制釋放或持 續釋放系統可鄰近防治或治療目標置放，因此僅需要全身 劑量之一部分（參見例如 G〇〇ds〇n，Medical Applications of 160878.doc -197- 201242977
Controlled Release，同上，第2卷，第 115-138 頁（1984))。 控制釋放系統於Langer之評述（（1990) Science 249: 1 527-1533)中論述。熟習此項技術者已知之任何技術皆可 用於產生包含一或多種本發明之治療劑之持續釋放調配 物。參見例如美國專利第4,526,938號；PCT公開案第WO 91/05548 號；第 WO 96/20698 號；Ning 等人（1996) Radiotherap. Oncol. 39: 179_ 189 ; Song等人（1995) PDA J.
Pharma. Sci. Tech· 50:372-397 ; CleekfA(1997)Pro.Int，l· Symp. Control. Rel. Bioact. Matter. 24: 853-854 ;及 Lam等 人（1997) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Matter. 24:759-760 ° 在本發明之組合物為編碼防治劑或治療劑之核酸的特定 實施例中’可藉由將核酸構築為適當核酸表現載體之一部 分’且例如藉由使用反轉錄病毒載體（參見美國專利第 4,980,286號）或藉由直接注射或藉由使用微粒轟擊（例如基 因搶；Biolistic，Dupont)或用脂質或細胞表面受體或轉染 劑塗佈，或藉由將其與已知進入核之同源盒樣肽鍵聯投與 (參見例如 Joliot 等人（1991) Proc. Nati. Acad. Sci USA 88: 1864-1868)投與核酸以使其變為在細胞内來活體内投與核 酸以促進其編碼之防治劑或治療劑表現。或者，可將核酸 引入細胞内且藉由同源重組使其併入宿主細胞dna内以供 表現。 調配本發明之醫藥組合物以使其與其預定投藥途徑相 容。投藥途徑之實例包括（但不限於）非經腸，例如靜脈 160878.doc •198· 201242977 内、皮内、皮下、經口、鼻内（例如吸入）、經皮（例如表 面）、經黏膜，·及經直腸投藥。在一特定實施例中，組合 物係根據常規程序調配為適於靜脈内、由丁 汉广、肌肉内、經 口、鼻内或表面投與人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈 内投藥之組合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要 時，組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑(諸如利多卡因 (lignocamne))以減輕注射部位處之疼痛。
若欲表面投與本發明之組合物，則組合物可調配成軟 膏、乳膏、經皮貼片、洗劑、凝膠、洗髮精、喷霧劑、氣 霧劑、溶液、乳液之形式或熟習此項技術者熟知之其他形 式。參見例如Remington’s心砸咖㈤％⑽“ _
Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, ^ 19^ , MackPub. Co.，East0n，Pa (1995)。在一個實施例中對 於不可噴霧之表面劑型而言，採用包含與表面用藥相容之 載劑或4多種賦形劑且動力黏度大於水之黏祠形式至半 固組或固體形式。適合調配物包括(不限於)溶液、懸浮 液乳液、乳膏、軟膏、散劑、擦劑、油膏及其類似物， 必要時將其滅菌或與影響諸如滲透壓之純性質之助劑 (例如防腐劑、穩定劑、濕潤劑、緩衝劑或鹽)混合。其他 適合表面劑型包括可噴霧之氣霧劑製劑，”在—個實施 例中，活性成分與固體或液體惰性載劑組合以與加壓揮發 \ ’、·刀（例如氣體推進劑，諸如氟利昂（fre〇n))之混合物形 弋包裝或包裝於壓擠航（squeeze 。必要時，亦可 向醫樂組合物及劑型中添加增濕劑或保濕劑。此等其他成 160878.doc 201242977 分之實例在此項技術中為熟知的β 若本發明之方法包含鼻内投與組合物，則組合物可調配 成氣霧劑形式、喷霧劑、霧劑或滴劑形式。特定言之，供 根據本發明使用之防治劑或治療劑可使用適合推進劑（例 如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氣四氟乙烷、二氧化碳 或其他適合氣體）以氣霧劑喷霧呈現形式自加壓包裝或喷 霧器方便地傳遞。在加壓氣霧劑之情況下，可藉由提供閥 門來確定劑量單位以傳遞計量之量。可調配含有化合物與 諸如乳糖或澱粉之適合粉末基劑之粉末混合物的膠囊及藥 筒（由例如明膠構成）用於吸入器或吹入器中。 若本發明之方法包含經口投藥，則組合物可調配為經口 之錠劑、膠囊、扁囊劑、膠囊錠（gelcap)、溶液、懸浮液 及其類似物之形式。錠劑或膠囊可藉由習知手段用醫藥學 上可接受之賦形劑製備，該等賦形劑諸如黏合劑（例如= 膠凝化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維 素），填充劑（例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣）；潤滑劑 (例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化矽）；崩解劑（例如馬鈴薯澱 粉或羥基乙酸澱粉鈉”或濕潤劑（例如十二烷基硫酸鈉卜 旋劑可藉由此項技術中熟知之方法包覆包衣。用於經口投 藥之液體製劑可採用（但不限於）溶液、糖衆或懸浮液形 式，或其可以在使用之前用水或其他適合媒劑復原之乾燥 產品形式提供。此等液體製劑可藉由習知手段用醫藥學上 可接受之添加劑來製備’該等添加劑諸如懸浮劑（例I山 梨糖醇糖聚、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪）；乳化劑 I60878.doc •200. 201242977 (例如卵碟脂（lecithin)或阿拉伯膠（acacia));非水性媒劑 (例如杏仁油、油性酯、乙醇或經分餾之植物油）；及防腐 劑（例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯曱酸丙酯或山梨 酸）。適當時’製劑亦可含有緩衝鹽、調味劑、著色劑及 甜味劑。用於經口投藥之製劑可經適當調配以達成緩慢釋 放、控制釋放或持續釋放防治劑或治療劑。 本發明之方法可包含例如藉由使用吸入器或喷霧器經肺 投與與氣霧劑一起調配之組合物。參見例如美國專利第 6,〇19,968 號；第 5,985,320 號；第 5,985 3〇9 號；第 5,934,272號；第 5,874,064號；第 5,855,913號；第 5,290,540 號及第4,880,078號；及PCT公開案第W0 92/19244號；第 WO 97/32572號；第 W0 97/44013號；第嬋〇 98/31346號； 及第WO 99/6_號。在一特定實施例中，使用他簡 AIR®經肺藥物傳遞技術（Alkermes，Inc，cambddge，ma) 投與本發明之結合蛋白、組合療法及/或本發明之組合 物0 本發月之方法可包含藉由注射（例如藉由快速注射或連 續輸注）投與經調配用於非經腸投藥之组合物。用於注射 之調配物可以添加有防腐劑之單位劑型(例如於安瓿中或 於多劑量容器中）提供。組合物可採用諸如於油性或水性 媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式且可含有諸如懸浮 劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成分可呈 在使用之前用適合媒劑⑽如無菌無熱原質水）復原之粉末 160878.doc 201242977 本發明之方法可另外包含投與調配成儲槽式製劑之組合 物。此等長效調配物可藉由植入（例如皮下或肌肉内）或藉 由肌肉内注射來投與。因此，舉例而言，組合物可與適合 聚合或疏水性物質（例如調配成可接受之油中之乳液）或與 離子父換樹脂一起調配；或調配成微溶衍生物（例如調配 成微溶鹽）。 本發明之方法涵蓋投與調配成中性或鹽形式之組合物。 醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自 鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形 成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀'氫氧化銨、氫 氧化約、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2乙胺基乙醇、組 胺酸、普魯卡因等之鹽。 般而a，組合物之成分係單獨或以單位劑型混合在一 起（例如以乾燥束乾粉末或無水濃縮物_式）於指示活性劑 之量之雄、封容器（諸如安瓶或藥囊）中供應。當投藥模式為 輸注時，組合物可用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸 液瓶施配。當投_式為注射時，可提供含有無菌注射用 水或生理食鹽水之安瓶以便可在投藥之前混合各成分。 特定言之，本發明亦提供—或多種本發明之防治劑或治 療劑或醫藥組合物包穿於沪 —— 匕裒於扣不樂劑之量之密封容器(諸如 女瓿或樂囊）中。在一個實施例中， 治劑或治療劑或醫藥…你或夕種本發明之防 噥缩物开” Μ 、 乾燥滅菌凍乾粉末或無水 /晨縮物$式於密封容器中 理食越水其可復原（例如用水或生 一)成適备遭度以向個體投與。在—個實施例中， I60878.doc 201242977 一或多種本發明之防治劑或治療劑或醫藥組合物係以乾燥 無菌凍乾粉末形式’以至少5 mg、至少1〇 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、 至少75 mg或至少1〇〇 mg之單位劑量於密封容器中供應。 本發明之凍乾防治劑或治療劑或醫藥組合物應在其原始容 器中在2 C與8 C之間下儲存，且本發明之防治劑或治療劑 或醫藥組合物應在復原之後1週内，例如5天内、72小時
内、48小時内、24小時内、12小時内、6小時内、5小時 内、3小時内或丨小時内投與。在一替代性實施例中，一或 多種本發明之防治劑或治療劑或醫藥組合物係以液體形式 於指示藥劑之量及濃度的密封容器中供應。在一個實施例 中’所投與組合物之液體形式係以至少〇 25 mg/ml、至少 0.5 mg/nU、至少！ mg/m卜至少2 5 mg/m卜至少$ 卜 至少 8 mg/ml、至少 10 mg/ml、至少 15 mg/kg、至少 25 mg/m卜至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少mg/ml之 濃度於密封容器中供應。液體形式應在其原始容器中在 2°C至8°C之間下儲存。 本發明之結合蛋白可併入適於非經腸投藥之醫藥組合物 中在個貫細*例中，結合蛋白或其抗原結合片段將製備 成含有0.1-250 mg/mi結合蛋白之可注射溶液。可注射溶液 可由燧石或琥珀色小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或 凍乾劑型構成。緩衝劑可為L-組胺酸（1-50 mM)，最佳5_ l〇mM，pH值為5〇至7〇(最佳pH6〇)。其他適合緩衝劑包 括（但不限於）丁二酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可 160878.doc 201242977 使用濃度為0-300 mM(對於液體劑型而言最佳15〇 mM)之 氣化納來調節溶液毒性。對於凉乾劑型而言，可包括低溫 保護劑，主要為0_10%蔗糠（最佳〇·5_1〇%)。其他適合低溫 保護劑包括海藻糖及乳糖。對於凍乾劑型而言，可包括增 積劑’主要為1 -〗甘露糖醇（最佳2_4%)。液體與凌乾劑 型兩者中均可使用穩定劑’主要為丨_5〇 L-甲硫胺酸 (最佳5-10 mM)。其他適合增積劑包括甘胺酸及精胺酸（其 任者可以〇-〇.05%之濃度包括在内）及聚山梨醇酯·8〇(最 佳以0.005-0.01 %之濃度包括在内）。其他界面活性劑包括籲 (但不限於）聚山梨醇酯20及BRJJ界面活性劑。製備成用於 非經腸投藥之可注射溶液之包含本發明之結合蛋白的醫藥 組〇物可另外包含適用作佐劑之試劑，諸如用於增加治療 性蛋白質（例如抗體）之吸收或分散之試劑。特別適用之佐 齊J為玻尿酸_ (hyaluronidase)，諸如Hylenex®(重組人類玻 尿酼酶）。在可注射溶液中添加玻尿酸酶會在非經腸投藥 之後，特定言之在皮下投藥之後改良人類生物可用性。其 亦允許較大注射部位體積（亦即大於i 而疼痛及不適較籲 少且注射部位反應之發生率最低（參見P C T公開案第w 〇 2004/078140號及美國專利公開案第2〇〇6/1〇4968號）。 本發明之組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液 體、半固體及固體劑型’諸如液體溶液（例如可注射溶液 及可輸注溶液）、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、 脂質體及栓劑。所選形式視預定投藥模式及治療應用而 疋，、51組口物係呈可注射或可輸注溶液形式諸如類似 160878.doc
•204- S 201242977 於用於與其他抗體一起使人類被動免疫之組合物的組合 物。所選投藥模式為非經腸(例如靜脈内、皮下、腹： 内、肌肉内）模式。在一個實施例中，結合蛋白係藉由靜 脈内輸注或注射投與。在另—實施例中，結合蛋白係藉由 肌肉内或皮下注射投與。 曰
治療組合物在製造及儲存條許通常必彡貞無菌且穩定。 ，’且。物可調成溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於高 藥物濃度之其他有序結構。可藉由將活性 人蛋 白或其抗原結合片段）以所要量與本文列舉之一種 該等成刀之组合-起併人適#溶劑中，必要時隨後進行過 據滅菌來製備無菌可注射溶液。-般而言，藉由將活性化 合物併入含有基本分散介質及來自本文列舉之成分之所需 其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備益菌可 注射溶液之無㈣乾粉末之情況下，製備方法為真空乾燥 及喷霧乾燥’其產生活性成分加來自其先前經無菌過滤之 ㈣之任何其他所要成分的粉末。可例如藉由使用諸如卵 磷脂之包衣；在分散液之情況下藉由維持所需粒度；及藉 由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可注射組合 之n及收可藉由在組合物中包括延緩吸收之試劑（例 如單硬脂酸鹽及明膠）來達成。 可藉由此項技術中已知之多種方法投與本發明之結合蛋 4在個貫把例中，對於許多治療應用而言，投藥途 仫/模式為皮下注射、靜脈内注射或輸注。如熟習此項技 術者所應瞭解’投藥途徑及/或模式將視所要結果而變 160878.doc 201242977 化。在某些實施例中’可用將防止化合物快速釋放之載劑 來製備活性化合物’諸如控制釋放調配物，包括植入物、 經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解之生物相 容性聚合物’諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、 膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備此等調配物之許多方 法已取得專利權或通常為熟習技術者所知。參見例如
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems， J.R. Robinson編，Marcel Dekker，Inc‘，New York，1978。 在某些實施例中，本發明之結合蛋白可例如與惰性稀釋 籲 劑或可吸收之可食用載劑一起經口投與。化合物（必要時 及其他成分）亦可封閉於硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓製成 錠劑或直接併入個體之膳食中。對於經口治療性投藥而 言’化合物可併有賦形劑且以以下形式使用··可攝取錠 劑 '經頰錠劑、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉 片及其類似形式。為藉由除非經腸投藥以外之方式投與本 發明之化合物，可能需要以防止化合物不活化之材料塗覆 化合物或將化合物與防止其不活化之材料共投與。 · 補充活性化合物亦可併入組合物中。在某些實施例中， 將本發明之結合蛋白與一或多種適用於與本發明之結合蛋 白一起治療病症的其他治療劑共調配及/或共投與。舉例 ° 了將本發明之結合蛋白與一或多種結合其他目標之 其他結合蛋白（例如抗體）（例如結合其他細胞激素或結合細 胞表面分子之抗體）共調配及/或共投與。此外，一或多種 本發明之結合蛋白可與兩種或兩種以上上述治療劑組合使 160878.doc
S •206· 201242977 用。此等組合療法宜利用較低劑量之所投與治療劑，從而 避免與各種單藥療法相關之可能毒性或併發症。 在某些實施例中，結合蛋白連接於此項技術中已知之半 衰期延長媒劑。此等媒劑包括（但不限於）Fc域、聚乙二醇 及葡聚糖。此等媒劑描述於例如美國專利第6,660,843號及 公開之PCT公開案第WO 99/25044號中。 在一特定實施例中，投與編碼本發明之結合蛋白或本發 明之另一防治劑或治療劑之核酸序列以藉由基因療法治 療、預防、處理或改善病症或其一或多種症狀。基因療法 係指藉由向個體投與已表現或可表現之核酸執行之療法。 在本發明之此實施例中，核酸產生介導防治或治療作用之 其所編碼之本發明的結合蛋白或防治劑或治療劑。 此項技術中可用之用於基因療法之任何方法皆可根據本 發明加以使用。關於基因療法之方法之一般性評述，參見 Goldspiel 等人（1993) Clin. Pharm. 12: 488-505 ; Wu及 Wu (1991) Biotherapy 3: 87-95 ； Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 ； Mulligan (1993) Science 260: 926-932 ;及 Morgan 及 Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; 5 月（1993) TIBTECH 11(5):155-215。可使用之重組DNA技術領域中通常已知的方法描述 於 Ausubel 等人（編），Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons, NY (1993);及Kriegler，Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)中。基因療法之各種方法之詳細描述揭示 160878.doc -207· 201242977 於美國專利公開案第20090297514號中。 本發明之結合蛋白適用於治療由該等結合蛋白識別之目 標為有害的各種疾病。此等疾病包括（但不限於）類風濕性 關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗血性關節炎、 萊姆關節炎、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節 病、全身性紅斑狼瘡症、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發 炎性腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏 性疾病、牛皮癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官 移植排斥反應、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病' 類肉瘤病、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝血、川崎氏 病 '格雷氏病、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏 肉芽腫病、亨偌·絲奇恩賴紫癜、腎顯微性血管炎、慢性 活動型肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候 群、敗血症症候群、惡病質、感染性疾病、寄生蟲病、後 天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈 病、帕金森氏病、阿茲海默氏病、中風 '原發性膽汁性肝 硬化、溶血性貧血、惡性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、艾 迪森氏病、偶發性I型多腺體分泌不足症及π型多腺體分泌 不足症、施捃特氏症候群、成人（急性）呼吸窘迫症候群' 脫髮、斑形脫髮、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏 病、牛皮癖性關節病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜 炎、與披衣菌、耶氏桿菌及沙門氏菌相關之關節病、脊椎 關節病、動脈粥樣化疾病/動脈硬化、異位性過敏、自體 免疫大皰病、尋常天疱瘡、落葉型天疱瘡、類天疱瘡、線 160878.doc -208 - 201242977 性IgA病、自體免疫溶血性貧血、庫姆氏陽性溶血性貧 血、後天性惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛腦炎/皇家 自由病、慢性黏膜皮膚念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性 硬化陡肝炎、隱源性自體免疫肝炎、後天性免疫缺乏病症 候群、後天性免疫缺乏相關疾病、肝炎、c型肝炎、 一般變異性免疫缺乏症（一般變異性低丙種球蛋白血症）、 擴張性心肌病、雌性不孕症、卵巢功能衰竭、早發性卵巢 功能衰竭、纖維化肺病、隱源性纖維化肺泡炎、發炎後間 質性肺病、間質性肺炎、結締組織病相關之間質性肺病、 混合性結締組織病相關之肺病、全身性硬化症相關之間質 性肺病、類風濕性關節炎相關之間質性肺病、全身性紅斑 狼瘡症相關之肺病、皮肌炎/多肌炎相關之肺病、休格連 氏病相關之肺病、僵直性脊椎炎相關之肺病、血管炎彌漫 性肺病、血鐵黃素沈積症相關之肺病、藥物誘發之間質性 肺病、纖維化、放射性纖維化、阻塞性細支氣管炎、慢性 嗜伊紅血球性肺炎、淋巴球性浸潤性肺病、感染後間質性 肺病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、丨型自體免疫性 肝炎（典型自體免疫或類狼瘡性肝炎）、2型自體免疫性肝炎 (抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介導之低血糖症、b型胰島 素抗性伴有黑色棘皮病、副甲狀腺機能減退症、與器官移 植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之慢性免疫疾 病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、丨型牛皮癖' 2型牛 皮癬、特發性白血球減少病、自體免疫性嗜中性球減少 症' NOS型腎病、絲球體腎炎、腎顯微性血管炎、萊姆 160878.doc -209- 201242977 病、盤狀紅斑狼瘡、特發性或NOS型雄性不育症、精子自 體免疫、多發性硬化症（所有亞型）、交感性眼炎、結締組 織病繼發性肺高血壓、古巴士德氏症候群 '結節性多動脈 炎之肺部表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、史提爾氏 病、全身性硬化症、休格連氏症候群、高安氏病/動脈 炎、自體免疫性血小板減少症、特發性血小板減少症、自 體免疫性曱狀腺病、甲狀腺機能亢進症、甲狀腺腫性自體 免疫性曱狀腺低能症（橋本氏病）、萎縮性自體免疫性曱狀 腺低能症、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發 聲 性血管炎、白斑病急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、 酒精誘發之肝損傷、膽汁鬱滯、特質性肝病、藥物誘發之 肝炎、非酒精性脂肝炎、過敏症及哮喘、B群鏈球菌（GBS) 感染、精神障礙（例如抑鬱症及精神分裂症）、Th2型及ΤΜ 型介導之疾病、急性及慢性疼痛（不同形式之疼痛）、及諸 如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢 癌、前列腺癌及直腸癌之癌症及造血性惡性疾病（白血病 及淋巴瘤）、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢性寄生 _ 或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病 (ALL)、急性骨髓白血病（AML)、急性或慢性細菌感染、 急性胰臟炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位搏動、AIDS 癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接 觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植物排斥反應、α-1_ 抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、 刖角細胞退化、抗C(J3療法、抗磷脂症候群、抗受體過敏 160878.doc -210-
S 201242977 ι·生反應、主動脈瘤及周邊動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高 血壓、動脈硬化症、動靜脈瘺、共濟失調、心房纖維性顫 動（持續性或陣發性）、心房撲動、房室傳導阻滯、Β細胞 淋巴瘤、骨移植物排斥反應、骨髓移植（ΒΜΤ)排斥反應、 束枝阻滯、伯基特氏淋巴瘤、燒傷、心律不整、心臟頓抑 症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺繞道發炎反應、軟骨移 植排斥反應、小腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多灶性 心房心動過速、與化學療法相關之病症、慢性骨髓性白血 病（CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎性病變、慢性淋巴球 性白血病（CLL)、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、慢性水揚酸中 毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮 炎、肺原性心臟病、冠狀動脈疾病、庫賈氏病、培養物陰 性敗血症、囊腫性纖維化、細胞激素療法相關之病症、拳 擊員癡呆、脫髓鞘疾病、出血性登革熱、皮炎、皮膚病病 狀、糖尿病、糖尿病、糖尿病性動脈硬化病、彌漫性路易 體疾病、擴張型充血性心肌病、基底神經節病症、中年唐 氏症候群、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的藥物誘發 之運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓炎、心内膜炎、内 分泌病、會厭炎、EB病毒感染、肢端紅痛症、錐體外及小 腦病症、家族性噬血淋巴組織細胞瘤病、胎兒胸腺植入物 排斥反應、弗里德賴希氏共濟失調、功能性周邊動脈病 症' 真菌性敗血症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球性腎炎' 任何器官或組織之移植物排斥反應、革蘭氏陰性敗血症、 革蘭氏陽性敗血症、胞内生物體引起之肉芽腫、毛細胞白 160878.doc •211 · 201242977 血病、哈洛弗登-施帕茨病、橋本氏甲狀腺炎、枯草熱、 心臟移植排斥反應、血色素沈著症、血液透析、溶血性尿 毒癥候群/溶血栓性血小板減少性紫癜、出血、肝炎（A 型）、希氏束心律不整、HIV感染/HIV神經病、霍奇金氏 病、過動性運動障礙、過敏反應、過敏性肺炎、高血壓、 動作徐緩型運動障礙、下丘腦-垂體·腎上腺轴評估、特發 性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細胞毒性、 衰弱、嬰兒脊髓性肌萎縮症、主動脈發炎、a型流感、電 離輻射暴露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺血再鲁 灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節炎、青少年 脊髓性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤、腎臟移植排斥反應、退 伍軍人病、利什曼體病、麻風病、皮質脊髓系統病變、脂 肪水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴 瘤' 惡性組織細胞增多症、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦膜炎 球菌血症、代謝性/特發性疾病、偏頭痛、粒線體多系統 病症、混合結締組織疾病、單株丙種球蛋白症、多發性骨 髓瘤、多系統退化（曼切代哲因·托馬斯史_德爾格及馬查鲁 多-約瑟夫）、重症肌無力、禽細胞内分枝桿菌、結核分枝 桿菌、骨髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺血病症、 鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經退化性疾 病1型神經性肌肉萎縮、嗜中性球減少性發熱、非霍奇 金氏淋巴瘤、腹主動脈及其分支堵塞、阻塞性動脈病症、 〇kt3療法、睾丸炎/副睾丸炎、睾丸炎/輸精管復通術、器 官腫大、骨質疏鬆症、騰臟移植排斥反應、騰臟癌、副腫 160878.doc
•212· S 201242977 瘤症候群/惡性高血鈣症、副甲狀腺移植排斥反應、盆腔 炎、常年性鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周 邊金管病症、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎、肺 炎、POEMS症候群（多發性神經病、器官腫大、内分泌 病、單株丙種球蛋白症及皮膚變化症候群）、灌流後症候 群、泵後症候群、MI心切開術後症候群、子癇前症、進行 性核上性麻痺、原發性肺高血壓、放射療法、雷諾氏症候 群及疾病、雷諾氏病、雷弗素姆氏病 '規則性狹窄QRS心 動過速、腎企管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、 肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆、血清 陰性關節病、休克、鐮形細胞性貧血、皮膚同種異體移植 排斥反應、皮膚變化症候群、小腸移植排斥反應、實體腫 瘤、特異性心律不整、脊椎共濟失調、脊髓小腦退化、鏈 球菌肌炎、小腦結構病變、亞急性硬化性全腦炎、昏厥、 心血管系統梅毒、全身性過敏、全身性發炎反應症候群、 全身發作型青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、 毛細管擴張、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少症、中毒、 移植、創傷/出血、IXI型過敏性反應、IV型過敏、不穩定 型心絞痛、尿毒癥、尿敗血病、蓴麻疹、心臟瓣膜病、靜 脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心室纖維性 顫動、病毒及真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病 毒相關之嗜血細胞症候群、韋尼克_科爾薩科夫症候群、 威爾遜氏病及任何器官或組織之異種移植物排斥反應（參 見PCT公開案第w〇 2002/097048號；第WO 95/24918號及 160878.doc •213- 201242977 第 WO 00/56772號）。 +發明之結合蛋白可用於治療羅患自體免疫疾病，特定 S之與發炎相關之自體免疫疾病（包括類風濕性關節炎、 脊椎炎、過敏、自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄膜炎）的 人類。在-個實施例中，本發明之結合蛋白或其抗原結合 部分用於治療類風濕性關節炎、克羅恩氏病、多發性硬化 症、胰島素依賴性糖尿病及牛皮癣。 在個貫施例中，可用本發明之組合物及方法治療或診 斷之疾病包括（但不限於）原發性及轉移性癌症，包括乳鲁 癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下资癌、食道癌、 胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿道癌 (包括腎臟癌、膀胱癌及尿道上皮癌）、雌性生殖道癌（包括 子呂頸癌、子宮癌及卵巢癌、以及絨膜癌及妊娠性滋養母 細胞疾病）、雄性生殖道癌（包括前列腺癌、精囊癌、睾丸 癌及生殖細胞腫瘤）、内分泌腺癌（包括曱狀腺癌、腎上腺 癌及垂體腺癌）及皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤（包 括骨骼及軟組織產生之肉瘤以及卡波西氏肉瘤）、腦腫籲 瘤、神經腫瘤、眼腫瘤及腦膜腫瘤（包括星形細胞瘤、神 經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤' 神經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤）、由諸如白血病之造 血性惡性疾病引起之實體腫瘤、及淋巴瘤（霍奇金氏淋巴 瘤與非霍奇金氏淋巴瘤兩者）。 在一個實施例中’本發明之結合蛋白或其抗原結合部分 在單獨使用或與放射線療法及/或其他化學治療劑組合使 160878.doc
S -214- 201242977 用時可用於治療癌症或抑制自本文所述之腫瘤轉移。 本發明之結合蛋白或其抗原結合部分可與包括（但不限 於）以下之藥劑組合：抗贅生劑；放射線療法；化學療 法’諸如DNA烧基化劑、順銘（cisplatin)、卡始 (carboplatin)、抗微管蛋白劑、太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、歐洲紫杉醇（d〇cetaxel)、紫杉醇（taxol)、小 紅莓、吉西他濱（gemcitabine)、健擇（gemzar)、蒽環黴素 (anthracyclines)、阿德力黴素（a(jriamycin)、拓撲異構酶 I 抑制劑、拓撲異構酶Π抑制劑、5_氟尿嘧啶（5_FU)、甲醯 四氫葉酸（leucovorin)、伊立替康（irinotecan)、受體赂胺酸 激酶抑制劑（例如埃羅替尼（erlotinib)、吉非替尼 (gefitinib))、COX-2抑制劑（例如塞内昔布（celec〇xib))、激 酶抑制劑及siRNA。 本發明之結合蛋白亦可與一或多種適用於治療各種疾病 之其他治療劑一起投與。 本發明之結合蛋白可單獨或組合使用以治療此等疾病。 應暸解結合蛋白可單獨使用或與另-藥劑(例如治療劑)組 合使用，該另一藥劑係由熟習此項技術者出於其預期目的 來選擇|例而言，另一藥劑可為此項技術公認為適用於 治療由本發明之結合蛋白治療之疾病或病狀的治療劑。另 一樂劑亦可為賦予治療組合物有益屬性之藥劑，例如影趣 組合物之黏度之藥劑。 〜曰 應進:步瞭解欲包括在本發明内之組合為適於其預定目 的之彼等組合。下述藥劑為說明性的且不欲具有限制性。 160878.doc -215· 201242977 作為本發明之一部分之組合可為本發明之結合蛋白及至少 一種選自以下清單之其他藥劑。若組合使得所形成之組合 物可執行其預定功能，則組合亦可包括一種以上其他藥 劑，例如兩種或三種其他藥劑。 治療自體免疫及發炎疾病之組合為非類固醇消炎藥（亦 稱為NSAID)，其包括如布洛芬（ibuprofen)之藥物》其他組 合為皮質類固醇，包括潑尼龍（prednisolone);可藉由在與 本發明之TVD結合蛋白組合治療患者時逐漸減少所要之類 固醇劑量來降低或甚至消除類固醇使用之熟知副作用。可 隹 與本發明之結合蛋白或其抗原結合片段組合用於類風濕性 關節炎之治療劑的非限制性實例包括下列治療劑：細胞激 素抑制性消炎藥（CSAID);針對其他人類細胞激素或生長 因子之抗體或拮抗劑，該等其他人類細胞激素或生長因子 為例如 TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干擾 素、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF。本發明之結合蛋 白或其抗原結合部分可與針對細胞表面分子之抗體組合， ® 該等分子諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、 CD30、CD40、CD45、CD69 ' CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、 CD90 及 CTLA 或其配體，包括 CD154(gp39 或 CD40L)。
治療劑之組合可在自體免疫及後續發炎性級聯中之不同 點處進行干擾；實例包括TNF拮抗劑（如嵌合、人類化或人 類TNF抗體）、阿達木單株抗體（PCT公開案第WO 97/29131 號）、CA2(RemicadeTM)、CDP 571及可溶性 p55 或 p75 TNF
160878.doc -216· S 201242977 受體、其衍生物（p75TNFRlgG(EnbrelTM)或 p55TNFRlGg (來那西普））以及TNFa轉化酶（TACE)抑制劑；類似地，IL-1抑制劑（介白素-1轉化酶抑制劑、IL-. 1RA等）可能由於相同 原因而為有效的。其他組合包括介白素11。另一組合包括 可與IL-12功能平行起作用、依賴於IL-12功能起作用或與 IL-12功能協同起作用之自體免疫反應關鍵作用者；尤其 IL-18拮抗劑，包括IL-18抗體、可溶性IL-18受體及IL-18 結合蛋白。已顯示IL-12及IL-18具有重疊但不同之功能， 且兩者之拮抗劑之組合可能最有效。另一組合為非消耗性 抗CD4抑制劑。其他組合包括共刺激路徑CD80(B7.1)或 CD86(B7.2)之拮抗劑，包括抗體、可溶性受體及拮抗性配 體。 本發明之結合蛋白亦可與以下藥劑組合：諸如曱胺喋 吟、6-MP、硫η坐嘌呤、柳氮橫胺β比咬、美色拉嗓 (mesalazine)、奥色拉嗪、氯喹/羥基氯喹、青黴胺 (pencillamine)、硫代蘋果酸鹽（aurothiomalate)(肌肉内及 經口）、硫唑嘌呤、秋水仙鹼、皮質類固醇（經口、吸入及 局部注射）、β-2腎上腺素受體促效劑（沙丁胺醇 (salbutamol)、特布他林（terbutaline)、沙美特羅 (salmeteral))、黃嗓吟（茶驗（theophylline)、胺茶驗 (aminophylline))、色甘酸鹽（cromoglycate)、奈多羅米 (nedocromil)、酮替酚（ketotifen)、異丙托銨（ipratropium) 及氧托銨（oxitropium)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚 酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬）、皮質類固 160878.doc •217- 201242977 醇（諸如潑尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血 栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾促炎性細胞激 素（諸如TNF-α或IL-1)信號傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、 IKK、p38或MAP激酶抑制劑）、IL-Ιβ轉化酶抑制劑、 TNFa轉化酶（TACE)抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑（諸如 激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、硫唑 °票吟、6 -疏基嗓吟、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細 胞激素受體及其衍生物（例如可溶性p55或p75 TNF受體及 衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM及p55TNFRIgG(來那西普））、 sIL-lRI、sIL-lRII及sIL-6R)、消炎性細胞激素（例如IL-4、 IL-10、IL-11、IL-13及TGFP)、塞内昔布、葉酸、硫酸羥 基氣喹、羅非考昔（rofecoxib)、依那西普、英利昔單株抗 體、蔡普生（naproxen)、伐地考昔（valdecoxib)、柳氮續胺 0比咬、甲潑尼龍（methylprednisolone)、美洛西康 ' (meloxicam)、乙酸曱潑尼龍、硫代蘋果酸金鈉、阿司匹靈 (aspirin)、曲安奈德（triamcinolone acetonide)、萘碌酸丙 氧芬（propoxyphene napsylate)/apap、葉酸鹽、萘 丁美酮 (nabumetone)、雙氣芬酸（diclofenac)、°比羅昔康 (piroxicam)、依託度酸（etodolac)、雙氯芬酸納（diclofenac sodium)、奥沙普嘻（oxaprozin)、鹽酸經考酮（oxycodone hcl)、氫可酮酒石酸氫鹽（hydrocodone bitartrate)/apap、雙 氣芬酸納/米索前列醇（misoprostol)、芬太尼（fentanyl)、人 類重組阿那白滯素（anakinrra，human recombinant)、鹽酸曲 馬多（tramadol hcl)、雙水楊 S旨、(salsalate)、舒林酸 160878.doc -218- 201242977
(sulindac)、氰銘胺素（cyanocobalamin)/fa/ D比哆醇 (pyridoxine)、乙醯胺苯紛（acetaminophen)、阿命膦酸納 (alendronate sodium)、潑尼龍、硫酸嗎 °非（morphine sulfate)、鹽酸利多卡因、。引°朵美辛（indomethacin)、硫酸 葡糖胺（glucosamine sulf)/軟骨素、鹽酸阿米替林 (amitriptyline hcl)、確胺。密咬（sulfadiazine)、鹽酸經考酮/ 乙酿胺苯紛、鹽酸奥洛他定（olopatadine hcl)、米索前列 醇、萘普生納、奥美拉°坐（omeprazole)、環鱗酿胺 (cyclophosphamide)、利妥昔單株抗體、IL-1 TRAP、 MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗 IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特 (Roflumilast)、IC-485、CDC-801及美索潘（Mesopram)。組 合包括曱胺喋呤或來氟米特，且在中度或重度類風濕性關 節炎情況下，包括環孢素。 亦可與結合蛋白組合用於治療類風濕性關節炎之非限制 性其他藥劑包括（但不限於）下列藥劑：非類固醇消炎藥 (NSAID);細胞激素抑制性消炎藥（CSAID) ; CDP-571/BAY-10-3356(人類化抗 TNFct抗體；Celltech/Bayer); cA2/英利昔單株抗體（嵌合抗TNFa抗體；Centocor) ; 75 kdTNFR-IgG/依那西普（75 kD TNF受體-IgG融合蛋白； Immunex ;參見例如（1994) Arthr· Rheum. 37: S295; (1996) J. Invest. Med. 44: 235A) ； 55 kdTNF-IgG(55 kD TNF^H-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ; IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性靈長類動物化抗CD4抗體； 160878.doc -219- 201242977 IDEC/SmithKline ;參見例如（1995) Arthr. Rheum. 38: S185); DAB 486-IL-2及 / 或 DAB 389-IL-2(IL-2 融合蛋白； Seragen;參見例如（1993) Arthrit· Rheum. 36: 1223);抗 Tac(人類化抗 IL-2Ra ; Protein Design Labs/Roche) ; IL-4(消炎性細胞激素；DNAX/Schering) ; IL-10(SCH 52000 ;重組IL-10消炎性細胞激素；DNAX/Schering) ; IL-4 ; IL-10及/或IL-4促效劑（例如促效劑抗體）；IL-1RA(IL-1 受體拮抗劑；Synergen/Amgen); 阿那白滯素 (Kineret®/Amgen); TNF-bp/s-TNF(可溶性 TNF結合蛋白； 參見例如（1996) Arthr. Rheum· 39(9 (增刊））：S284 ; (1995) Amer. J. Physiol.-Heart and Circ. Physiol. 268: 37-42)； R973401 (IV型磷酸二酯酶抑制劑；參見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S282) ; MK-966(COX-2抑制劑；參 見例如（1996) Arthr. Rheum. 3 9(9 (增刊）：S81);伊洛前列 素（Iloprost)(參見例如（1996) Arthr· Rheum. 39(9 (增刊）： S82);甲胺喋呤；沙立度胺（thalidomide)(參見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S282)及沙立度胺相關藥物（例 如西爾金（Celgen));來氟米特（消炎藥及細胞激素抑制 劑；參見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S131; (1996) Inflamm. Res. 45: 103-107);胺甲環酸（tranexamic acid)(纖維蛋白溶酶原活化抑制劑；參見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S284) ; T-614(細胞激素抑制劑；參 見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S282);前列腺 素 E1(參見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S282); 201242977 替尼達普（Tenidap)(非類固醇消炎藥；參見例如（1996) Arthr· Rheum. 39(9 (增刊）：S280);萘普生（非類固醇消炎 藥；參見例如（1996) Neuro. Report 7: 1209-1213);美洛西 康（非類固醇消炎藥）；布洛芬（非類固醇消炎藥）；D比羅昔 康（非類固醇消炎藥）；雙氣芬酸（非類固醇消炎藥）；吲哚 美辛（非類固醇消炎藥）；柳氮磺胺咕啶（參見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S281);硫0坐嗓0令（參見例如 (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S281); ICE抑制劑（酶 介白素-1 β轉化酶之抑制劑）；zap-70及/或lck抑制劑（路胺 酸激酶zap-70或lck之抑制劑）；VEGF抑制劑及/或VEGF-R 抑制劑（血管内皮細胞生長因子或金管内皮細胞生長因子 受體之抑制劑；血管生成抑制劑）；皮質類固醇消炎藥（例 如SB203580) ; TNF轉化酶抑制劑；抗IL-12抗體；抗IL-18 抗體；介白素-11(參見例如（1996) Arthr. Rheum· 39(9 (增 刊）：S296);介白素 _13(參見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S308);介白素-17抑制劑（參見例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S120);金；青黴胺；氣啥； 苯丁酸氮芥（chlorambucil);經基氯喧；環抱素；環麟酿 胺；全身淋巴組織照射；抗胸腺細胞球蛋白；抗CD4抗 體；CD5毒素；經口投與之肽及膠原蛋白；氯苯紮利二鈉 (lobenzarit disodium);細胞激素調控劑（CRA)HP228 及 HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.) ; ICAM-1 反義硫代 構酸酯寡去氧核苷酸（ISIS 2302 ; Isis Pharmaceuticals, Inc.);可溶性補體受體 1(TP10 ; T Cell Sciences，Inc.);強 160878.doc -221 - 201242977 的松（prednisone);肝蛋白（orgotein);葡糖胺聚糖多硫酸 鹽（glycosaminoglycan polysulphate);二甲胺四環素 (minocycline);抗IL2R抗體；海洋生物及植物脂質（魚及植 物種子脂肪酸；參見例如DeLuca等人（1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759-777);金諾芬（auranofin);苯基丁 氮酮（phenylbutazone);曱氣芬那酸（meclofenamic acid); 氟芬那酸（flufenamic acid);靜脈内免疫球蛋白；齊留通 (zileuton);阿紮立平（azaribine);黴酚酸（mycophenolic acid)(RS-61443);他克莫司（tacrolimus)(FK-506);西羅莫 司（sirolimus)(雷帕黴素）；胺普立糖（amiprii〇se)(鹽酸胺普 立糖（therafectin));克拉曲濱（cladribine)(2-氣脫氧腺苷）； 甲胺嗓吟；bcl-2抑制劑（參見Bruncko，M.等人（2007) J. Med. Chem. 50(4). 641-662)，及抗病毒劑及免疫調節劑。 在一個實施例中，結合蛋白或其抗原結合部分係與一種 下列藥劑組合投與以治療類風濕性關節炎：KDR之小分子 抑制劑；Tie-2之小分子抑制劑；甲胺喋呤；強的松；塞内 昔布；葉酸；硫酸經基氣喧；羅非考昔；依那西普；英利 昔單株抗體；來敗米特；萘普生；伐地考昔；柳氣項胺„比 啶；曱潑尼龍；布洛芬；美洛西康；乙酸甲潑尼龍；硫代 蘋果酸金鈉；阿司匹靈；硫唑嘌呤；曲安奈德；萘磺酸两 氧芬/apap ;葉酸鹽；萘丁美酮；雙氣芬酸；吡羅昔康；依 託度酸；雙氯芬酸納；奥沙普嗪；鹽酸羥考酮；氫可酮酒 石酸氫鹽/apap ;雙氣芬酸鈉/米索前列醇；芬太尼；人類 重組阿那白滯素；鹽酸曲馬多；雙水揚酯；舒林酸；氰鈷 160878.doc •222 · 201242977 胺素/fa/吡哆醇；乙醢胺苯酚；阿侖膦酸鈉；潑尼龍；硫 酸嗎啡；鹽酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/軟骨 素；環孢素；鹽酸阿米替林；磺胺嘧啶；鹽酸羥考酮/乙 醯胺苯酚；鹽酸奥洛他定；米索前列醇；萘普生鈉；奥美 拉唑；黴酚酸嗎啉乙酯；環磷醯胺；利妥昔單株抗體； IL-1 TRAP ; MRA ; CTLA4-IG ; IL-18 BP ; IL-12/23 ;抗 IL 18 ;抗 IL 15 ; BIRB-796 ; SCIO-469 ; VX-702 ; AMG-548 ; VX-740 ;羅氟司特；IC-485 ; CDC-801 ;及美索 潘。 可與本發明之結合蛋白組合用於發炎性腸病之治療劑的 非限制性實例包括以下：布地奈德；表皮生長因子；皮質 類固醇；環孢素；柳氮磺胺吡啶；胺基水楊酸鹽；6-酼基 嘌呤；硫°坐嘌呤；甲硝達°坐；脂質加氧酶抑制劑；美色拉 嗪；奥色拉嗪；巴柳氮；抗氧化劑；血栓素抑制劑；IL-1 受體拮抗劑；抗IL-Ιβ單株抗體；抗IL-6單株抗體；生長因 子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；及針對其 他人類細胞激素或生長因子（例如TNF、LT、IL-1、IL-2、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。本發明之結 合蛋白或其抗原結合部分可與針對細胞表面分子（諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、 CD45、CD69及CD90)或其任何配體之抗體組合。本發明 之結合蛋白或其抗原結合部分亦可與諸如以下之藥劑組 合：曱胺喋呤；環孢素；FK506 ;雷帕黴素；黴酚酸嗎啉 160878.doc -223· 201242977 乙酯；來氟米特；NSAID，諸如布洛芬；皮質類固醇，諸 如潑尼龍；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷促效劑；抗血栓劑； 補體抑制劑；腎上腺素激導劑；干擾促炎性細胞激素（諸 如TNFa或IL-1)信號傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、IKK、 p38或MAP激酶抑制劑）；IL-Ιβ轉化酶抑制劑；TNFa轉化 酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑，諸如激酶抑制劑；金 屬蛋白酶抑制劑；柳氮磺胺吡啶；硫唑嘌呤；6-髄基嘌 呤；血管收縮素轉化酶抑制劑；可溶性細胞激素受體及其 衍生物（例如可溶性p55或p75 TNF受體、SIL-1RI、sIL-1RII及SIL-6R);消炎性細胞激素（例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13及 TGFp);及 bcl-2抑制劑。 可與結合蛋白組合用於克羅恩氏病之治療劑的實例包括 以下：TNF拮抗劑（例如抗TNF抗體）、阿達木單株抗體（PCT 公開案第 WO 97/29131 號；HUMIRA)、CA2(REMICADE)、CDP 571 、 TNFR-Ig 構築體(p75TNFRIgG(ENBREL)及 p55TNFRIgG(來那昔普）)抑制劑及PDE4抑制劑。本發明之 結合蛋白或其抗原結合部分可與皮質類固醇（例如布地奈 德及地塞米松）組合。本發明之結合蛋白或其抗原結合部 分亦可與以下藥劑組合：諸如柳氮磺胺吡啶、5-胺基水楊 酸及奥色拉嗪，以及干擾諸如IL-1之促炎性細胞激素合成 或作用的藥劑（例如IL-Ιβ轉化酶抑制劑及IL-lra)。本發明 之結合蛋白或其抗原結合部分亦可與T細胞信號傳導抑制 劑（例如酪胺酸激酶抑制劑6-酼基嘌呤）一起使用。本發明 之結合蛋白或其抗原結合部分可與IL-11組合。本發明之 160878.doc -224· 201242977
結合蛋白或其抗原結合部分可與以下組合：美色拉嗪、強 的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英利昔單株抗體、甲潑尼龍 丁二酸鈉、地芬諾醋（diphenoxylate)/硫酸阿托品（atrop sulfate)、鹽酸洛娘丁胺（loperamide hydrochloride)、曱胺 嗓吟、奥美拉。坐、葉酸鹽、環丙沙星（ciprofloxacin)/右旋 糖-水、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、鹽酸四環素（tetracycline hydrochloride)、醋酸 I輕鬆（fluocinonide)、曱硝達嗅、硫 柳汞（thimerosal)/删酸、消膽胺（cholestyramine)/蔗糖、鹽 酸環丙沙星、硫酸莨菪驗（hyoscyamine sulfate)、鹽酸娘替 咬（meperidine hydrochloride)、鹽酸 °米達吐侖（midazolam hydrochloride)、鹽酸經考酮/乙醯胺苯紛、鹽酸普敏太定 (promethazine hydrochloride)、填酸鈉、續胺甲0惡0坐 (sulfamethoxazole)/ 曱氧苄胺嘴咬（trimethoprim)、塞内昔 布、聚卡波非（polycarbophil)、萘確酸丙氧芬、氫化可的 松（hydrocortisone)、多維生素劑（multivitamin)、巴柳氮二 納、碌酸可待因（codeine phosphate)/apap、鹽酸考來維舍 (colesevelam hcl)、氣結胺素、葉酸、左氧敦沙星 (levofloxacin)、甲潑尼龍、那他珠單株抗體及干擾素-γ。 可與本發明之結合蛋白組合用於多發性硬化症之治療劑 的非限制性實例包括下列治療劑：皮質類固醇；潑尼龍； 曱潑尼龍；硫唑嘌呤；環磷醯胺；環孢素；曱胺喋呤；4-胺基吡啶；替紮尼定（tizanidine);干擾素-pia(AVONEX; Biogen);干擾素 _pib(BETASERON ; Chiron/Berlex);干 擾素 a-n3(Interferon Sciences/Fujimoto);干擾素-a(Alfa 160878.doc •225- 201242977
Wassermann/J&J);干擾素piA-IF(Serono/Inhale Therapeutics); 聚乙二醇化干擾素a 2b(Enzon/Schering-Plough);共聚物 l(Cop-l ;克帕松（COPAXONE) ; Teva Pharmaceutical Industries，Inc.);高壓氧；靜脈内免疫球蛋白；克拉曲濱 (clabribine);針對其他人類細胞激素或生長因子及其受體 (例如 TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、 IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及 PDGF) 之抗體或拮抗劑。本發明之結合蛋白可與針對細胞表面分 子（諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、 CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86 ' CD90)或其配體之抗體組合。本發明之結合蛋白亦可與諸 如以下之藥劑組合：甲胺喋呤、環孢素、FK506、雷帕黴 素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬）、 皮質類固醇（諸如潑尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效 劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾促炎 性細胞激素（諸如TNFa或IL-1)信號傳導之藥劑（例如 IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑）、IL-Ιβ轉化酶 抑制劑、TACE抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑（諸如激酶 抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮確胺°比咬、硫。坐嗓 呤、6 -疏基嗓吟、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞 激素受體及其衍生物（例如可溶性p55或p75 TNF受體、sIL-1RI、sIL-lRII及 SIL-6R)、消炎性細胞激素 〇HWIL-4、IL-1〇、11^-13及丁〇?0)及1)(；1-2抑制劑。 可與本發明之結合蛋白組合用於多發性硬化症之治療劑 160878.doc -226- 201242977 的實例包括干擾素-β(例如11?：^01&及IFNPlb);克帕松、皮 質類固醇、卡斯蛋白酶抑制劑（例如卡斯蛋白酶-1抑制 劑）、IL-1抑制劑、TNF抑制劑及針對CD40配體及CD80之 抗體。 本發明之結合蛋白亦可與以下藥劑組合：諸如阿來組單 株抗體、屈大麻酴（dronabinol)、尤利美（Unimed)、達利珠 單株抗體（daclizu單株抗體）、米托蒽醌、鹽酸紮利羅登 (xaliproden hydrochloride)、胺0比咬（fampridine)、乙酸格 拉替美（glatiramer acetate)、那他珠單株抗體、西納°比哆 (sinnabidol)、a-伊木諾金NNS03(a-immunokine NNS03)、 ABR-215062、AnergiX.MS、趨化因子受體拮抗劑、BBR-2778、卡拉胍素（calagualine)、CPI-1189、LEM(脂質體囊 封之米托蒽酿）、THC.CBD(類大麻酌·（cannabinoid)促效 劑）、MBP-8298、美索潘（PDE4抑制劑）、MNA-715、抗 IL-6受體抗體、萘羅瓦西（neurovax)、°比非尼鲷 (pirfenidone)、阿羅曲普 l258(allotrap 1258)(RDP-1258)、 sTNF-Rl 、他余帕奈（talampanel)、特立 胺 (teriflunomide)、TGF-P2、替利莫肽（tiplimotide)、VLA-4 拮抗劑（例如 TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干擾素γ拮抗劑及江-4促效劑。 可與本發明之結合蛋白組合用於心絞痛之治療劑的非限 制性貫例包括以下·阿司匹靈、硝化甘油（nitr〇glyCerin)、 單硝酸異山梨醇、丁二酸美托洛爾（met〇pr〇l〇l succinate)、阿替洛爾（aten〇i〇1)、酒石酸美托洛爾、苯磺 160878.doc -227· 201242977 酸胺氣地平（amlodipine besylate)、鹽酸地爾硫卓 (diltiazem hydrochloride)、 二硝酸異山梨醇酯、氣吡格雷 硫酸氫鹽（clopidogrel bisulfate)、墙苯地平（nifedipine)、 阿托伐他ί*Γ 4弓（atorvastatin calcium)、氯化卸、吱喃苯胺酸 (furosemide)、辛伐他汀（simvastatin)、鹽酸維拉帕米 (verapamil hcl)、地高辛（digoxin)、鹽酸普萘洛爾、卡維 地洛（carvedilol)、賴諾普利（lisinopril)、螺内酯 (spironolactone)、氫氯苯噻噠嗪（hydrochlorothiazide)、順 丁烯二酸依拉普利（enalapril maleate)、納多洛爾 (nadolol)、雷米普利（ramipril)、依諾肝素納（enoxaparin sodium)、肝素納、顯沙坦（valsartan)、鹽酸索他洛爾 (sotalol hydrochloride)、非諾貝特（fenoHbrate)、依澤替米 貝（ezetimibe)、布美他尼（bumetanide)、氯沙坦鉀（l〇sartan potassium)、賴諾普利/氫氣苯噻噠嗪、非洛地平 (felodipine)、卡托普利（captopril)及反丁烯二酸比索洛爾 (bisoprolol fumarate) 0 可與本發明之結合蛋白組合用於僵直性脊椎炎之治療劑 的非限制性實例包括以下：布洛芬、雙氣芬酸及米索前列 醇、萘普生、美洛西康、吲哚美辛、雙氣芬酸、塞内昔 布、羅非考昔、柳氮績胺"比咬、曱胺喋呤、硫峻嘌吟、二 曱胺四環素、強的松、依那西普及英利昔單株抗體。 可與本發明之結合蛋白組合用於哮喘之治療劑的非限制 性實例包括以下：沙丁胺醇（albuterol)、沙美特羅 (salmeterol)/氟替卡松（fluticasone)、孟魯司特納 160878.doc •228- 201242977
(montelukast sodium)、丙酸氟替卡松、布地奈德 (budesonide)、強的松、經萘甲酸沙美特羅、鹽酸左旋沙 丁胺醇（levalbuterol hcl)、硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、潑尼 龍填酸納、曲安奈德、二丙酸倍氣米松（beclomethasone dipropionate)、漠化異丙托敍、阿奇黴素（azithromycin)、 乙酸°比布特羅（pirbuterol acetate)、潑尼龍、無水茶驗、曱 潑尼龍丁二酸納、克拉黴素（clarithromycin)、紮魯司特 (zafirlukast)、反丁烯二酸福莫特羅（formoterol fumarate)、流感病毒疫苗、甲潑尼龍、三水合阿莫西林 (amoxicillin trihydrate)、氣尼縮松（flunisolide)、過敏注射 液、色甘酸納、鹽酸非索非那定（fexofenadine hydrochloride)、氟尼縮松/薄荷腦、阿莫西林/棒酸鹽 (clavulanate)、左氧氟沙星、吸入器辅助裝置、愈創甘油 醚（guaifenesin)、地塞米松構酸納、鹽酸莫西沙星 (moxifloxacin hcl)、鹽酸多西環素（doxycycline hyclate)、 愈創甘油醚/d-美沙芬（d-methorphan)、對麻黃素/cod/氯芬 那敏（chlorphenir)、加替沙星（gatifloxacin)、鹽酸西替利 唤（cetirizine hydrochloride)、糠酸莫美他松（mometasone furoate)、羥萘曱酸沙美特羅、苯佐那酯（benzonatate)、頭 孢胺苄（cephalexin)、pe/氫可酮/氣芬那敏、鹽酸西替利唤/ 假麻黃素（pseudoephed)、苯腎上腺素/cod/普敏太定、可待 因/普敏太定、頭孢丙稀（cefprozil)、地塞米松、愈創甘油 醚/假麻黃素、氯芬尼拉明（chlorpheniramine)/氫可酮、奈 多羅米鈉、硫酸特布他林、腎上腺素、甲潑尼龍及硫酸間 160878.doc -229- 201242977 經異丙腎上腺素（metaproterenol sulfate)。 可與本發明之結合蛋白組合用於COPD之治療劑的非限 制性實例包括以下：硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、溴化異丙 托知：、沙美特羅/氟替卡松、沙丁胺醇、經萘甲酸沙美特 羅、丙酸氟替卡松、強的松、無水茶鹼、甲潑尼龍丁二酸 鈉、孟魯司特鈉、布地奈德、反丁烯二酸福莫特羅、曲安 奈德、左氧氟沙星、愈創甘油齡、阿奇黴素、二丙酸倍氣 米松、鹽酸左旋沙丁胺醇、氟尼縮松、頭孢曲松鈉 (ceftriaxone sodium)、三水合阿莫西林、加替沙星、紮魯 司特、阿莫西林/棒酸鹽、氟尼縮松/薄荷腦、氣芬尼拉明/ 氫可酮、硫酸間羥異丙腎上腺素、甲潑尼龍、糠酸莫美他 松、對麻黃素/C〇d/氣芬那敏、乙酸》比布特羅、對麻黃素/ 洛拉他定（loratadine)、硫酸特布他林、噻托溴銨 (tiotropium bromide)、（R，R)-福莫特羅、TgAAT、西洛司 特（Cilomilast)及羅氟司特。 可與本發明之結合蛋白組合用於HCV之治療劑的非限制 性實例包括以下：干擾素a-2a、干擾素a_2b、干擾素α coni、干擾素α-ηΐ、聚乙二醇化干擾素a_2a、聚乙二醇化 干擾素a-2b、病毒唑（ribavirin)、聚乙二醇化干擾素a_2b + 病毒唑、熊脫氧膽酸（Ursodeoxycholic Acid)、甘草酸 (Glycyrrhizic Acid)、胸腺法新（Thymaifasin)、二鹽酸組胺 (Maxamine)、VX-497及藉由干預以下目標以治療Hcv之任 何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解螺旋酶及 HCV IRES(内部核糖體入口位點）。 160878.doc •230 201242977 可與本發明之結合蛋白組合用於特發性肺纖維化之治療 劑的非限制性實例包括以下：強的松、硫唑嘌呤、沙丁胺 醇、秋水仙鹼、硫酸沙丁胺醇、地高辛、γ干擾素、甲潑 尼龍丁 一酸鈉、勞拉西泮（lorazepam)、β夫喝笨胺酸、賴諾 普利、硝化甘油、螺内酯、環磷醯胺、溴化異丙托銨、放 線菌素d、阿替普酶（alteplase)、丙酸氟替卡松、左氡氟沙 星、硫酸間羥異丙腎上腺素、硫酸嗎啡、鹽酸羥考酮、氯 化鉀、曲安奈德、無水他克莫司、鈣、干擾素α、甲胺喋 呤、黴酚酸嗎啉乙酯及干擾素γ_ 1 β。 可與本發明之結合蛋白組合用於心肌梗塞之治療劑的非 限制性實例包括以下：阿司匹靈、确化甘油、酒石酸美托 洛爾、依諾肝素鈉、肝素鈉、氣吡格雷硫酸氫鹽、卡維地 洛、阿替洛爾、硫酸嗎啡、丁二酸美托洛爾、華法林鈉 (warfarin sodium)、賴諾普利、單硝酸異山梨醇酯、地高 辛、呋喃苯胺酸、辛伐他汀、雷米普利、替奈普酶 (tenecteplase)、順丁烯二酸依拉普利、托西邁 (torsemide)、瑞替普酶（retavase)、氣沙坦鉀、鹽酸喹那普 利（quinapril hcl)/mag carb、布美他尼、阿替普酶、依那普 利拉（enalaprilat)、鹽酸乙胺碘呋酮（amiodarone hydrochloride)、m-水合鹽酸替羅非班（tir〇fiban hcl m_ hydrate)、鹽酸地爾硫卓、卡托普利、厄貝沙坦 (irbesartan)、纈沙坦、鹽酸普萘洛爾、福辛普利鈉 (fosinopril sodium)、鹽酸利多卡因、埃替菲巴肽 (eptifibatide)、頭孢唑林鈉（cefazoHn sodium)、硫酸阿托 160878.doc -231 ^ 201242977 品（atropine sulfate)、胺基己酸、螺内酯、干擾素、鹽酸 索他洛爾、氣化钟、多庫醋鈉（docusate sodium)、鹽酸多 巴酚丁胺（dobutamine hcl)、阿普唑侖（aipraz〇iam)、普伐 他汀鈉（pravastatin sodium)、阿托伐他汀鈣、鹽酸咪達唑 侖、鹽酸哌替啶、二硝酸異山梨醇酯、腎上腺素、鹽酸多 巴胺、比伐盧定（bivalirudin)、羅素他汀（rosuvastatin)、依 澤替米貝/辛伐他>丁、阿伐麥布（avasimibe)及卡立泊來德 (cariporide) 〇 可與本發明之結合蛋白組合用於牛皮癬之治療劑的非限 制性實例包括以下：KDR之小分子抑制劑、Tie-2之小分子 抑制劑、鈣泊三醇（calcipotriene)、丙酸氯倍他索 (clobetasol propionate)、曲安奈德、丙酸鹵貝他索 (halobetasol propionate)、他紮羅汀（tazarotene)、曱胺喋 吟、醋酸氟輕鬆、強化二丙酸倍他米松（betamethasone diprop augmented)、醋酸氟輕鬆（fiuocino丨one acetonide)、 阿曲汀（acitretin)、植物性洗髮精（tar shampoo)、戊酸倍他 米松（betamethasone valerate)、糠酸莫美他松、酮康唾 (ketoconazole)、普莫卡因（pramoxine)/ i 輕鬆 (fluocinolone)、戊酸氫化可的松（hydrocortisone valerate)、氟氫縮松（flurandrenolide)、尿素、倍他米松 (betamethasone)、丙酸氣倍他索/潤膚劑、丙酸氟替卡松 (fluticasone propionate)、阿奇黴素、氫化可的松、增濕配 方（moisturizing formula)、葉酸、地奈德（des()nide)、吡美 莫司（pimecrolimus)、煤焦油（coal tar)、二乙酸二氟拉松 160878.doc -232- 201242977 (diflorasone diacetate)、葉酸依那西普（etanercept folate)、 乳酸、甲氧沙林（methoxsalen)、he/驗式沒食子酸叙 (bismuth subgal)/znox/resor 、乙酸甲潑尼龍 (methylprednisolone acetate)、強的松、防曬劑、哈西奈德 (halcinonide)、水楊酸、蒽三紛（anthralin)、特戊酸氣可托 龍（clocortolone pivalate)、煤提取物、煤焦油/水楊酸、煤 焦油/水揚酸/硫、去經米松（desoximetasone)、安定 (diazepam)、潤膚劑、醋酸氣輕鬆/潤膚劑、礦物油/蓖麻油 9 /na lact、礦物油/花生油、石油/十四院酸異丙醋、·補骨脂 素（psoralen)、水楊酸、息類/三溴沙命（tribromsalan)、硫 柳汞/硼酸、塞内昔布、英利昔單株抗體、環孢素、阿法 赛特、依法利珠單株抗體、他克莫司、吡美莫司、 PUVA、UVB及柳氮磺胺吡啶。 可與本發明之結合蛋白組合用於牛皮癬性關節炎之治療 劑的非限制性實例包括以下：甲胺喋呤、依那西普、羅非 考昔、塞内昔布、葉酸、柳氮磺胺。比啶、萘普生、來氟米 ® 特、乙酸曱潑尼龍、吲哚美辛、硫酸羥基氯喹、強的松、 舒林酸、強化二丙酸倍他米松、英利昔單株抗體、曱胺嗓 呤、葉酸鹽、曲安奈德、雙氯芬酸、二甲亞砜、吡羅昔 康、雙氣芬酸納、酮洛芬（ketoprofen)、美洛西康、曱潑尼 龍、萘丁美酮、托美丁納（tolmetin sodium)、飼泊三醇、 環抱素、雙氯芬酸納/米索前列醇、醋酸敦輕鬆、硫酸葡 糖胺、硫代蘋果酸金鈉、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、布洛 芬、利塞膦酸鈉、磺胺嘧啶、硫鳥嘌呤、伐地考昔、阿法 160878.doc •233 - 201242977 赛特、依法利珠單株抗體及bcl-2抑制劑。 可與本發明之結合蛋白組合用於再狹窄之治療劑的非限 制性實例包括以下：西羅莫司、太平洋紫杉醇、依維莫司 (everolimus)、他克莫司、唑他莫司（zotarolimus)及乙醯胺 苯齡。 可與本發明之結合蛋白組合用於坐骨神經痛之治療劑的 非限制性實例包括以下：氫可酮酒石酸氫鹽/apap、羅非考 昔、鹽酸環苯紮林（CyCl〇benzaprine hcl)、甲潑尼龍、萘普 生、布洛芬、鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、塞内昔布、伐地 _ 考昔、乙酸曱潑尼龍、強的松、雄酸可待因/apap、鹽酸曲 馬多/乙酿胺苯紛、美他沙酮（metaxal〇ne)、美洛西康、美 索巴莫（methocarbamol)、鹽酸利多卡因、雙氣芬酸鈉、加 巴喷丁（gabapentin)、地塞米松、肌安寧（carisoprodol)、酮 洛酸胺丁二醇（ketorolac tromethamine)、0引°朵美辛、乙酿 胺苯酚、安定、萘丁美酮、鹽酸羥考酮、鹽酸替紮尼定、 雙氣芬酸鈉/米索前列醇、萘磺酸丙氧芬/apap ' asa/oxycod/羥考酮ter、布洛芬/氫可酮酒石酸氫鹽、鹽酸 · 曲馬多、依託度酸、鹽酸丙氧芬、鹽酸阿米替林、肌安寧 /磷酸可待因/asa、硫酸嗎啡、多維生素、萘普生鈉、檸檬 酸奥芬那君（orphenadrine citrate)及替馬西泮 (temazepam) ° 可與本發明之結合蛋白組合用於SLE(狼瘡）之治療劑的 實例包括以下：NSAID，例如雙氣芬酸、萘普生、布洛 芬、°比羅昔康、吲哚美辛；COX2抑制劑’例如塞内昔 160878.doc
S -234· 201242977 布、羅非考昔、伐地考昔；抗瘧劑，例如羥基氯喹；類固 醇，例如強的松、潑尼龍、布地奈德、地塞米松；細胞毒 性劑，例如硫唑嘌呤、環磷醯胺、黴酚酸嗎啉乙酯、曱胺 喋呤；及PDE4抑制劑或嘌呤合成抑制劑，例如駿悉 (Cellcept)。本發明之結合蛋白亦可與諸如以下之藥劑組 合：柳氮磺胺吡啶、5-胺基水楊酸、奥色拉嗪、依木蘭 (Imuran)及干擾促炎性細胞激素（諸如IL-1)合成、產生或作 用之藥劑，例如卡斯蛋白酶抑制劑，如IL-Ιβ轉化酶抑制 劑及IL·Ira。本發明之結合蛋白亦可與T細胞信號傳導抑制 劑（例如酪胺酸激酶抑制劑）或靶向T細胞活化分子之分子 (例如CTLA-4-IgG或抗B7家族抗體及抗PD-1家族抗體）一起 使用。本發明之結合蛋白可與IL-11或抗細胞激素抗體（例 如芳妥珠單株抗體（fonotolizumonoclonal antibody)(抗 IFNg 抗體））或抗受體之受體抗體（例如抗IL-6受體抗體）及針對B 細胞表面分子之抗體組合。本發明之抗體或其抗原結合部 分亦可與以下藥劑一起使用：LJP 394(阿貝莫司 (abetimus));消耗B細胞或使B細胞不活化之藥劑，例如利 妥昔單株抗體（抗CD20抗體）、貝利單株抗體（lymphostat-B)(抗BlyS抗體）；TNF拮抗劑，例如抗TNF抗體、阿達木 單株抗體（PCT公開案第WO 97/29131號；HUMIRA)、 CA2(REMICADE) 、 CDP 571 、 TNFR-Ig 構築體 (p75TNFRIgG(ENBREL)及 p55TNFRIgG(來那西普））；及 bcl-2抑制劑，因為已證實bcl-2在轉殖基因小鼠中之過度 表現會產生狼瘡樣表型（參見Marquina, R.等人（2004) J. 160878.doc 235 · 201242977
Immunol. 172(11): 7177-7185)，因此預期抑制可具有治療 作用。 本發明之醫藥組合物可包括「治療有效量」或「防治有 效量」之本發明之結合蛋白。「治療有效量」係指在必需 劑量下且歷經必需時期有效達成所要治療結果之量。結合 蛋白之治療有效量可由熟習此項技術者確定且可根據諸如 疾病狀態、個體之年齡、性別及體重以及結合蛋白在個體 中引起所要反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為結 合蛋白或其抗原結合片段之治療有益作用超過任何毒性或 有=作用的量〇「防治有效量」係指在必需劑量下且歷經 必需時期有效達成所要防治結果之量。通常，因為在疾病 早期階段之前或在疾病早期階段時對個體使用防治劑量， 所以防治有效量將小於治療有效量。 可調整給藥方案以提供最佳所要反應(例如治療或防治 反應）。舉例而t，可投與單一大丸冑，可隨時間投與若 干分次劑#，或可如由治療情況之緊急性所指$，按比例 降低或增加劑量。出於投藥簡便性及劑量均一性考慮，尤 其宜以單位劑型調配非經腸組合物。如本文㈣之^劑 型係指適合作為單一劑量用於欲治療之哺乳動物個體的物 理個別單元，·各單元含有經計算以產生所要治療作用之預 定量之活性化合物以及所需醫藥載劑。本發明之單位劑型 之規格係由以下因素規定且直接視以下因素而定：⑷活性 化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療或防治作用；及(b) 混配該種活性化合物以治療個體敏感性之技術中所固有之 160878.doc -236- 201242977 限制。 本發明之結合蛋白之治療或防治有效量之一例示性非限 制範圍為0.1-20 mg/kg，例如1-10 mg/kg。應注意劑量值可 能隨欲減輕之病狀之類型及嚴重性而變化。應進一步瞭解 對於任何特定個體而言’特定給藥方案應根據個體需要及 才又與或監督組合物投與之人士之專業判斷隨時間加以調 整’且本文所述之劑量範圍僅具有例示性，而並非意欲限 制所主張之組合物之範疇或操作法。 • IV.診斷 本文之揭示内容亦提供診斷應用。以下對此進行進一步 闡明。 A.診斷方法 本發明亦提供一種使用至少一種如本文所述之TVD結合 蛋白測疋測試樣品中分析物（或其片段）之存在、量或濃度 的方法。如此項技術中已知之任何適合分析皆可用於該方 法中。實例包括（但不限於）免疫分析，諸如夾心式免疫分 析（例如單株、多株及/或TVD結合蛋白夾心式免疫分析或 其任何變化形式（例如單株/TVD結合蛋白、TVD結合蛋白/ 多株分子等），包括放射性同位素偵測（放射免疫分析 (RIA))及酶偵測（酶免疫分析（EIA)或酶聯免疫吸附分析 (ELISA)(例如 Quantikine ELISA 分析，R&D Systems, Minneapolis’ MN))、競爭抑制免疫分析（例如正向及反 向）、螢光偏振免疫分析（FPIA)、酶倍增免疫分析技術 (EMIT)、生物發光共振能量轉移（BRET)及均質化學發光 160878.doc •237- 201242977 分析等。在基於SELDI之免疫分析中，將特異性結合相關 分析物（或其片段）之捕捉試劑連接於質譜探針（諸如預活化 之蛋白質晶片陣列）之表面。分析物（或其片段）接著特異性 捕捉於生物晶片上，且藉由質譜偵測所捕捉之分析物（或 其片段）。或者，可自捕捉試劑溶離分析物（或其片段）且藉 由傳統MALDI(基質輔助雷射脫附/離子化）或藉由seldim 以偵測。化學發光微粒免疫分析（特定言之採用 ARCHITECT㊣自動分析儀（Abbott [^咖如，鳩⑽
Park, IL)之化學發光微粒免疫分析）為較佳免疫分析之一實 例0 舉例而言，當如本文所述之TVD結合蛋白用作免疫診斷 試劑及/或用於分析物免疫分析套組中時，此項技術中熟 知之收集、處理及加工尿、血液、血清及血毁及其他體液 之方法用於實施本發明。除相關分析物之外，測試樣品亦 可包含其他部分，諸如抗體、抗原、半抗原、激素、藥 物、酶、受體、蛋白質、肽、多肽、寡核皆酸及/或聚核 苷酸。舉例而言，樣品可為自個體獲得之全血樣品。在如 本文所述之免疫分析之前可能必需或需要例如用預處理試 劑處理測試樣品，特定言之全血。即使在預處理並非必需 之情形（例如大多數尿樣品）下，仍可視情況進行預處理（例 如作為在商業平台上執行之方案之一部分）。 預處理試劑可為適於與本發明之免疫分析及套組一起使 用之任何試劑。預處理視情況包含：（a)一或多種溶劑（例 如曱醇及乙二醇）及視情況選用之鹽，一或多種溶劑及 160878.doc 201242977 鹽及視情況選用之清潔劑，（C)清潔劑，或（d)清潔劑及 鹽。預處理試劑在此項技術中為已知的，且可例如以如文 獻（參見例如 Yatscoff 等人（1990) Clin. Chem. 36: 1969-1973 及 Wallemacq 等人（1999) Clin. Chem. 45: 432-435)所述在
Abbott TDx、AxSYM® 及 ARCHITECT® 分析儀（Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)上進行分析所使用之形式及/ 或市售形式採用此預處理。另外，預處理可如美國專利第 5,135,875號、歐洲專利公開案第£110471293號、美國專利 第6,660,843號及美國專利申請案第20080020401號中所述 進行。預處理試劑可為異質試劑或均質試劑。 在使用異質預處理試劑之情況下，預處理試劑使樣品中 存在之分析物結合蛋白（例如可結合分析物或其片段之蛋 白質）沈澱。該種預處理步驟包含藉由使沈澱之分析物結 合蛋白與藉由添加預處理劑至樣品中所形成之混合物之上 清液分離來移除任何分析物結合蛋白。在該種分析中’不 存在任何結合蛋白之混合物之上清液用於分析中，從而直 接進行至抗體捕捉步驟。 在使用均質預處理試劑之情況下，不存在此分離步驟。 使測試樣品與預處理試劑之整個混合物與分析物（或其片 段）之經標記之特異性結合搭配物，諸如經標記之抗分析 物抗體（或其抗原反應性片段）接觸。通常在由第一特異性 結合搭配物捕捉之前或期間，將用於該種分析之預處理試 劑於經預處理之測試樣品混合物中稀釋。儘管存在此稀 釋，但在捕捉期間在測試樣品混合物中仍存在（或殘留）一 160878.doc 239- 201242977 疋量之預處理則卜根據本發明經標記之特異性結合搭 配物可為TVD結合蛋白(或其片&、變異體或變異體之片 在異質形式t，在自個體獲得測試樣品之後，製備第一 混合物。混合物含有待評估分析物(或其片段)之測試樣品 及第-特異性結合搭配物，#中該第—特異性結合搭配物 與測4樣中含有之任何分析物形成第—特異性結合搭配 物刀析物複合物。第一特異性結合搭配物較佳為抗分析 物抗體或其特異性結合搭配物可為如本文所述 之TVD結合蛋白（或其片段、變異體或變異體之片段）。添 力測D式樣及第-特異性結合搭配物以形成混合物之順序 並不關鍵。較佳將第—特異性結合搭配物較在固相上。 用於免疫刀析(針對第一特異性結合搭配物及視情況第二 及/或第一特異性結合搭配物)中之固相可為此項技術中已 知之任何IU相’諸如（但不限於）磁性粒子、珠粒、試管、 微量滴定盤、比色管、mf架分子、薄膜、濾紙、圓盤 及晶片。 在形成3冑帛一特#性結合搭配物分析物複合物之混 。物之後’使用此項技術中已知之任何技術自複合物移除 任何未、。之分析物。舉例而言，可藉由洗蘇移除未結合 之刀析物ϋ而，合乎需要的是存在之第—特異性結合搭 配物之量超過測試樣品中存在之任何分析物，以使測試樣 品中存在之所有分析物皆與第-特異性結合搭配物結合。 在移除任何未結合之分析物後，添加第二特異性結合搭 160878.doc 201242977 配物至混合物中以形成第一特異性結合搭配物分析物第 二特異性結合搭配物複合物。第二特異性結合搭配物較佳 為結合分析物上不同於分析物上由第一特異性結合搭配物 結合之抗原決定基之抗原決定基的抗分析物抗體。此外， 第二特異性結合搭配物亦較佳經如上所述之可横測標記加 以b S己或含有如上所述之可偵測標記。第二特異性結合搭 配物可為如本文所述之TVD結合蛋白（或其片段、變異體 或變異體之片段）。在形成含有第二特異性結合搭配物_分 析物複合物之混合物之後，可使用此項技術中已知之任何 技術自複合物移除任何未結合之分析物。 可使用如此項技術中已知之任何適合之可偵測標記。舉 例而言，可偵測標記可為放射性標記（諸如3H、12勺、35S、 14C、32P及33p)、酶標記（諸如辣根過氧化酶、鹼性過氧化 酶、葡萄糖6-填酸脫氫酶及其類似物）、化學發光標記（諸 如°丫咬鑌醋、硫醋、或續酿胺；魯米諾、異魯米諾 (isoluminol)、啡啶鏽酯（phenanthridinium ester)及其類似 物）、螢光標記（諸如螢光素（例如5-螢光素、6-缓基榮光 素、36-緩基營光素、5(6)-缓基螢光素、6-六氣-螢光素、 6-四氣螢光素、異硫氰酸螢光素及其類似物））、若丹明、 藻膽蛋白（phycobiliprotein)、R-藻紅素、量子點（例如硫化 辞封端之硒化鎘）、測溫標記或免疫聚合酶鏈反應標記。 標記之引入、標記程序及對標記之偵測可見於p〇lak& Van
Noorden，Introduction to Immunocytochemistry，第 2版， Springer Verlag，Ν·Υ· (1997)及 Haugland，Handbook of 160878.doc -241 - 201242977
Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)(其為由 Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oregon出版之組合手冊及 目錄）中。螢光標記可用於FPIA中（參見例如美國專利第 5,593,896 號；第 5,573,904 號；第 5,496,925 號；第 5,359,093號及第5,352,803號）。吖啶鏽化合物可在均質或 異質化學發光分析中用作可偵測標記（參見例如Adamczyk 等人（2006) Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328;
Adamczyk 等人（2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313- 2317 ; Adamczyk 等人（2004) Biorg· Med. Chem. Lett. 14: 鲁 3917-3921 ;及 Adamczyk 等人（2003) Org. Lett. 5: 3779-3782)。
較佳吖啶鏽化合物為吖啶鏽-9-曱醯胺。製備吖啶鏽9-甲 酿胺之方法描述於 Mattingly (1991) J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 ; Adamczyk 等人（1998) J. Org. Chem. 63: 5636-5639 ; Adamczyk 等人（1999) Tetrahedron 55: 10899-10914 ; Adamczyk等人（1999) Org. Lett. 1: 779-781 ; Adamczyk 等人（2000) Biocon. Chem. 11: 714-724 ；
Mattingly 等人 Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications ; Dyke，K. V.編；CRC Press: Boca Raton， 第 77-105 頁（2002); Adamczyk 等人（2003) Org. Lett. 5: 3779-3782 ;及美國專利第5,468,646號；第5,543,524號及 第5,783,699號中。另一較佳吖啶鏽化合物為吖啶鏽-9-甲 酸芳酯。吖啶鏽-9-曱酸芳酯之一實例為氟磺酸10-曱基-9-(苯氧幾基）°丫咬鑌（可自 Cayman Chemical，Ann Arbor，MI獲 160878.doc -242- s 201242977 得）。製備吖啶鏽9-甲酸芳酯之方法描述於McCapra等人 (1965) Photochem· Photobiol. 4: 1111-21 ; Razavi 等人 (2000) Luminescence 15: 245-249，Razavi 等人（2000)
Luminescence 15:239-244;及美國專利第 5,241，0705虎中。 關於吖咬鑌-9-曱酸芳酯及其用途之其他詳情闡述於美國專 利公開案第20080248493號中。 可根據 Adamczyk 等人（2006) Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67中所述之方法進行化學發光分析（例如使用如上所述 之吖啶鏽或其他化學發光劑）。儘管可使用任何適合之分 析形式，但微盤化學光度計（Mithras LB-940，Berthold
Technologies U.S.A.，LLC，Oak Ridge，TN)使得能夠快速分 析多個小體積樣品。 添加測試樣品及特異性結合搭配物以形成用於化學發光 分析之混合物之順序並不關鍵。若第一特異性結合搭配物 經諸如吖啶鑌化合物之化學發光劑可偵測標記’則形成經 可偵測標記之第一特異性結合搭配物-分析物複合物。或 者，若使用第二特異性結合搭配物且第二特異性結合搭配 物經諸如吖啶鏽化合物之化學發光劑可偵測標記’則形成 經可偵測標記之第一特異性結合搭配物-分析物-第二特異 性結合搭配物複合物。可使用此項技術中已知之任何技術 (諸如洗滌）自混合物移除任何經標記或未經標記之未結合 的特異性結合搭配物。 在添加上述吖啶鑌化合物之前、同時或之後’可當場在 混合物中產生過氧化氫或可向混合物中提供或供應過氧化 160878.doc -243- 201242977 氫（例如作為-或多種已知含有過氧化氫之 溶液之過氧化氣來源小過氧化氣可以許多方式(諸如將為 熟習此項技術者顯而易知之方式）當場產生。 在同時或隨後向樣品中添加至少一種驗性溶液後，產生 指不分析物存在之可偵測信號，亦即化學發光信號。驗性 溶液含有至少-種驗且具有大於或等於lQ，較佳大於或等 於12之pH值。驗性溶液之實例包括（但不限於）氣氧化納、 氫氧化卸、氫氧化妈、氫氧化錄、氫氧化鎮、碳酸納 '碳 酸氫納、氫氧化弼、碳酸約及碳酸氫詞。添加至樣品中之 驗性溶液之量視驗性溶液之漢度而定。基於所用驗性溶液 之濃度’熟習此項技術者可容易確定添加至樣品中之驗性 溶液之量。 可使用熟習此項技術者已知之常規技術偵測所產生之化 學發光佗號。基於所產生之信號之強度，可定量樣品中之 分析物之量。詳言之，樣品中之分析物之量與所產生之信 號之強度成正比。可藉由將所產生之光之量與分析物之標 準曲線相比較或藉由與參照標準物相比較來定量存在之分 析物之量。可藉由質譜分析、重量分析法及此項技術中已 知之其他技術使用已知濃度之分析物之連續稀釋液或溶液 來產生標準曲線。儘管以上著重描述使用吖啶鏽化合物作 為化學發光劑’但一般技術者可容易調適此描述以使用其 他化學發光劑》 分析物免疫分析一般可使用此項技術中已知之任何形 式’諸如（但不限於）夾心式形式來進行。詳言之，在一種 160878.doc -244- 201242977 免疫分析形式中，採用至少Λ接 兩種〜合蛋白（例如抗體）來分 離及疋量樣品令之分析物（諸如人細、. 人類分析物）或其片段。更 詳言之，至少兩種結合蛋白(例如抗體)結合分析物(或其片 段）上之不同抗原決定基’從而形成稱為「夫心」之免疫 :合物。-般而言，在免疫分析中，可使用一或多種抗體 來捕捉測试樣品中之分析物（或其片段）（此等抗體常稱為 「捕捉」抗體），且可使用一或多種結合蛋白（例如抗體）以 使可制（亦即可定量）標記結合夹心（此等抗體常稱為「偵 測抗體」、「結合物」）。因此，在夾心式免疫分析形式之 情形下，如本文所述之結合蛋白或TVD結合蛋白（或盆片 段、變異體或變異體之片段）可用作捕捉抗體、偵測^體 或兩者。舉例而言’-種具有可結合分析物（或其片段）上 之第-抗原決；t基之域的結合蛋白或TVD結合蛋白可用作 捕捉劑及/或另一具有可結合分析物（或其片段）上之第二抗 原決定基之域的結合蛋白或TVD結合蛋白可用作偵測劑。 就此而言，具有可結合分析物（或其片段）上之第—抗原決 定基之第一域及可結合分析物（或其片段）上之第二抗原決 定基之第二域的結合蛋白或TVD結合蛋白可用作捕：劑及: 或伯測齊卜或者，一種具有可結合第一分析物（或其片段） 上之抗原決定基之第一域及可結合第二分析物（或其片段） 上之抗原決定基之第二域的結合蛋白或TVD結合蛋白可用 作捕捉劑及/或偵測劑來偵測並視情況定量兩種或兩種以 上分析物。若分析物可以一種以上形式（諸如單體形式及 二聚/多聚形式，其可為均聚或雜聚）存在於樣品中，則一 160878.doc -245- 201242977 種具有可結合僅暴露於單體形式上之抗原決定基之域的結 合蛋白或TVD結合蛋白及另一種具有可結合二聚/多聚形 式之不门0卩刀上之抗原決疋基之域的結合蛋白或TVD結合 蛋白可用作捕捉劑及/或偵測劑，藉此使得能夠偵測並視 情況定量不同形式之既定分析物。此外，採用單一結合蛋 白或TVD結合蛋白内及/或結合蛋白或TVD結合蛋白之間親 和力有所不同之結合蛋白或TVD結合蛋白可提供親合力優 勢。在如本文所述之免疫分析之情形下，將一或多個連接 子併入結合蛋白或TVD結合蛋白之結構内—般可 助或所要的。當存在連接子時，連接子最佳應具有足夠長 度及結構可撓性以使内部域能夠結合抗原決定基以及外部 域此夠結合另一抗原決定基。就此而言，當結合蛋白或 :VD結合蛋白可結合兩種不同分析物且一種分析物大於另 一種時，則合乎需要的是較大分析物由外部域結合。 一般而言，可使測試（例如懷疑含有）分析物（或其片段） 之樣品同時或依序及按任何順序與至少__種捕㈣及至少 -種偵測劑（例如在捕捉劑及/或㈣劑包含多種試劑時， 其可為第二谓測劑或第三倘測劑或甚至連續編號之試齊。 接觸》舉例而言，可使測續媒σ音 便Ί式樣首先與至少—種捕捉劑接 觸’且接著（依序）與至少一種賴測劑接觸。或者，可使測 試樣品首先與至少—種偵測劑接觸且接著（依序）與至少一
種捕捉劑接觸。在另—^ /JL· Jk- L ^替代方案中，可使測試樣品同時盥 捕捉劑及偵測劑接觸。 〃 在夾心式分析形式中，使懷疑含有分析物（或其片段）之 160878.doc
S •246· 201242977 樣品首先與至少―插笛— ㈣第一捕捉劑在允許形成第-試劑/分 析物複〇物之條件下接觸。 ,.^ ^ _ 種从上捕捉劑，則形 種或兩種以上捕捉劑之第―捕捉劑/分析物複合 : 心式分析中，以比測試樣品中預期之分析物(或 ,、片奴）之最大I莫耳過量之量使用試劑，亦即較佳至少 一種捕捉劑。舉例而古， / - 了使用每毫升緩衝液（例如微粒 塗佈緩衝液）約5微克至約〗毫克試劑。
因為需要僅由-種抗體(亦即在本發明之情形結人 蛋白及/或TVD結合蛋白)結合，所以常用於量測小分析物 之競爭性抑制免疫分析包含依序及典型形式。在依序競爭 性抑制免疫分析中’將針對相關分析物之捕捉劑塗佈在微 量滴定盤之孔或其他固體支撐物上。當將含有相關分析物 之樣品添加至孔中時，相關分析物結合捕捉劑。在洗蘇之 後將已知里之能夠結合捕捉抗體之經標記（例如經生物 素或辣根過氧化酶（HRP)標記）分析物添加至孔中。酶標記 之受質為產生信號所必需。HRP之適合受質之一實例為 3,3’，5,5’-四曱基聯苯胺（丁]^]8)。在洗滌之後，量測由經標 記之分析物產生之信號且該信號與樣品中分析物之量成反 比。在典型競爭性抑制免疫分析中，通常將針對相關分析 物之抗體（亦即在本發明之情形下之結合蛋白及/或TVD結 &蛋白）塗佈在固體支撲物（例如微量滴定盤之孔）上。然 而，不同於依序競爭性抑制免疫分析’樣品及經標記之分 析物係同時添加至孔中。樣品中之任何分析物皆與經標記 之分析物競爭結合捕捉劑。在洗滌之後，量測由經標記之 160878.doc 247· 201242977 分析物產生之信號且該信號 當然，存在此等形式之許多 受質時，該形式為一步、 式），且一般技術者將認識到 與樣品中分析物之量成反比。 變化形式（例如，當結合固體 兩步、延遲兩步及其類似形 此等變化形式。 視情況，在使測試樣品與至少一種捕捉劑(例如第 捕 捉劑)接觸之前’可使至少-種捕捉劑結合固體支撐物， 此有助於使卜試劑/分析物（或其片段）複合物自測試樣品 刀離捕捉劑所結合之受f可為有助於捕捉劑_分析物複 合物自樣品分離之任何適合固體支撐物或固相。 實例包括盤(諸如微量滴定盤)之孔、f式管、多孔凝膠⑽ 如矽膠、瓊脂糖、葡聚糖或明膠)、聚合薄膜(例如聚丙烯 醯胺）、珠粒（例如聚苯乙稀珠粒或磁性珠粒）、據紙/膜（例 如硝化纖維素或耐綸）之條帶、微粒（例如乳膠粒子）、可磁 化微粒（例如具有氧化鐵或氧化鉻核心及均聚或雜聚塗層 且半徑為約1-10微米之微粒）。受質可包含適合多孔材料， 其具有適於結合抗原之表面親和力及足以允許偵測抗體進 入之孔隙率。微孔材料一般較佳，但可使用呈水合狀態之 凝膠狀材料。此等多孔受質較佳呈厚度為約0 01至約0 5 mm ’較佳約〇. i mm之薄片形式。儘管微孔尺寸可大不相 同’但微孔尺寸較佳為約0.025至約1 5 μιη，更佳為約〇. J 5 至約15 μηι。此等受質之表面可被動經塗佈或藉由使抗體 與受質共價鍵聯之化學製程活化β —般藉由經疏水力吸附 達成抗原或抗體與受質不可逆結合；或者，可使用化學偶 合劑或其他手段使抗體與受質共價結合，其限制條件為此 160S78.doc -248 · 201242977 結合不干擾抗體結合分析物之能力。或者，抗體（亦即在 本發明之情形下之結合蛋白及/或丁乂0結合蛋白）可與微粒 結合，該等微粒先前已塗有抗生蛋白鏈菌素（例如 DYNAL⑧磁性珠粒’ Invitr〇gen，CaHsbad，CA)或生物素（例 如使用P〇wer-BindTM-SA-MP抗生蛋白鏈菌素塗佈之微粒 (Seradyn，Indianapolis，IN))或抗物種特異性單株抗體（亦即 在本發明之情形下之結合蛋白及/或TVD結合蛋白）。必要 或需要時，受質（例如標記之受質）可經衍生以對抗體（亦即 在本發明之情形下之結合蛋白或TVD結合蛋白）上之各種 官能基具有反應性《此衍生化需要使用某些偶合劑，其實 例包括（但不限於）順丁烯二酸酐、N_羥基丁二醯亞胺及卜 乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）碳化二亞胺。需要時，可使各 自對分析物具有特異性之一或多種捕捉劑，諸如抗體（或 其片段）（亦即在本發明之情形下之結合蛋白及/或TVD結合 蛋白））連接於固相之不同物理或可定址位置上（例如呈生物 晶片組態）（參見例如美國專利第6,225,〇47號；pCT公開案 第W0 99/51773號；美國專利第6,329,2〇9號；pCT公開案 第W0 00/56934號及美國專利第5,242,828號若使捕捉劑 連接於作為固體支撐物之質譜探針，則可藉由雷射脫附離 子化質s普偵測結合於探針之分析物之量。或者，可用經一 或多種捕捉劑衍生之不同珠粒填充單一管柱，藉此在單一 位置捕捉分析物（參見基於經抗體衍生化之珠粒的技術， 例如 Luminex(Austin，TX)之χΜΑΡ技術）。 在使用於分析分析物（或其片段）之測試樣品與至少一種 160878.doc -249- 201242977 劑（例如第—捕捉劑）接觸之後，培育混合物以允許形 —捕捉劑（或第若干捕捉劑）_分析物（或其片段）複合 :培育可在約4.5至約1(^之pH值下，在約代至約45t =咖度下進行，且持續至少約—⑴分鐘至約十八（18)小 拉’較佳約1分鐘至約24分鐘，最佳約4分鐘至約18分鐘之 十本文所述之免疫分析可以—個步驟進行（意謂依序 同時將測試樣品、至少—種捕捉劑及至少—種偵測劑全 :添加至反應容器中)，或以-個以上步驟，諸如兩個步 驟、二個步驟等進行。 ^第-或第若干）捕捉劑/分析物（或其片段）複合物形成 後，接著使複合物與至少一種偵測劑在允許形 或第若干)捕捉劑/分析物(或其片段)/第二偵 :=觸。儘管為明確起見而冠以「第二」試劑(例： 劑）之名稱，但實際上當使用多種試劑進行捕捉 及…貞測時，至少一種偵測劑可為用於免疫分析中之第 =劑、第三試劑、第四試劑等。若使捕捉劑/分析物（或 :片段）複合物與一種以上制劑接觸，則形成（第—或第 右干）捕捉劑/分析物（或其片段）/(第若干）偵測劑複合物。 如同捕捉劑（例如第-捕捉劑）—樣，當使至少一種（例如第 二及任何後續編號)偵測劑與捕捉劑/分析物(或其 合物接觸時’需要在與上文所述之條件類似之條件下培育 -段時期以形成(第一或第若干)捕捉劑/分析物(或其二 段）/(第二或第若干）偵測劑複合物。較佳地，至少一種 測劑含有可偵測標記。可偵測標記可在(第_或第若干)捕 160878.doc •250· 201242977 捉劑/分析物（或其片段）/ (第二或第若干）偵測劑複合物形成 之前、同時或之後結合至少一種偵測劑（例如第二偵測 劑）。可使用此項技術中已知之任何可偵測標記（參見以上 論述’包括 Polak 及 Van Noorden (1997)及 Haugland (1996) 參考文獻之論述）。 可福測標記可直接或經由偶合劑結合試劑。可使用之偶 合劑之一實例為EDAC(1-乙基-3-(3-二曱基胺基丙基）碳化 二亞胺鹽酸鹽），其可自 Sigma-Aldrich，St. Louis，MO 購 得。可使用之其他偶合劑在此項技術中為已知的。使可偵 測標記結合抗體之方法在此項技術中為已知的。另外，許 多已含有促進可偵測標記偶合於試劑之端基的可偵測標記 可購得或合成’諸如CPSP·吖啶鑌酯（亦即9[N甲苯磺醯 基-N-(3-叛丙基）]_ι〇_(3_續丙基）吖啶鏽甲醯胺）或spSp吖 啶鏽酯（亦即Ν10·(3-磺丙基）·Ν-(3-磺丙基）-吖啶鏽_9_曱醯 胺）。 在定量標記之前，可（但並非必須）使（第一或第若干）捕 捉劑/分析物/(第二或第若干）偵測劑複合物與測試樣品之 其餘部分分離。舉例而言，若至少一種捕捉劑（例如第一 捕捉劑，諸如根據本發明之結合蛋白及/或TVD結合蛋白） 結合固體支撐物（諸如孔或珠粒），則可藉由移除（測試樣品 之）流體而不再與固體支撐物接觸來達成分離。或者，若 至少第一捕捉劑結合固體支撐物，則其可同時與含有分析 物之樣品及至少一種第二偵測劑接觸以形成第一（第若干） "式齊]/刀析物/第一（第若干）試劑複合物，隨後移除流體（測 160878.doc •251 · 201242977 試樣品）而不再與固體支撐物接觸。若至少一種第一捕捉 劑未結合_支撑物，則無須自測試樣品移除（第一或第 若干）捕捉劑/分析物/(第二或第若干Μ貞測劑複合物即可定 量標記之量。 在經標記之捕捉劑/分析物/偵測劑複合物（例如第一捕捉 劑/分析物/第二偵測劑複合物）形成之後，使用此項技術中 已知之技術定量複合物中之標記之量。舉例而言，若使用 酶標記，則使經標記之複合物與標記之會產生可定量反應 (諸如顯色）之受質反應。若標記為放射性標記，則使用適 當手段（諸如閃爍計數器）定量標記。若標記為螢光標記， 則藉由用單色光（其稱為「激發波長」）刺激標記且偵測由 標記反應於刺激所發射之另一顏色（其稱為「發射波長」） 來定量標記。若標記為化學發光標記，則藉由目測或使用 光度計、X射線膠片、高速攝影膠片、CCD攝像機等偵測 所發射之光來定量標記。一旦已定量複合物中之標記之 量’即藉由適當手段，諸如藉由使用已使用已知濃度之分 析物或其片段之連續稀釋液所產生之標準曲線，來測定測 試樣品中分析物或其片段之濃度。除使用分析物或其片段 之連續稀釋液以外，標準曲線可以重量分析方式，藉由質 譜及藉由此項技術中已知之其他技術產生。 在採用ARCHITECT®分析儀之化學發光微粒分析中，結 合物稀釋液pH值應為約6.0+/-0.2，微粒塗佈緩衝液應維持 在約室溫（亦即在約17至約27°C下）’微粒塗佈緩衝液pH值 應為約6.5+/-0.2，且微粒稀釋液pH值應為約7.8+/-0.2。固
160878.doc • 252· S 201242977 體較佳少於約0.2%，諸如少於約〇 15%、少於約〇 14%、少 於、力0.1 3 /0少於約0* 12%或少於約〇 i丨。/〇，諸如約〇丨〇%。
FPIA係基於競爭性結合免疫分析原理。經螢光標記之化 合物在由線性偏#光激|時將發射偏振度與其旋轉速率成 反比之螢光虽由線性偏振光激發經螢光標記之示蹤劑_ 抗體複合物時’所發射之光保持高度偏振，因為螢光團在 吸收光之時間與發射光之時間之間旋轉受限。當藉由線性 偏振光激發「游離」示蹤劑化合物（亦即未結合抗體之化 口物)時其旋轉比競爭性結合免疫分析中產生之相應示 蹤劑抗體結合物(或根據本發明之示蹤劑'结合蛋白及，或 不蹤劑TVD結合蛋白）快得多。由於不存在需要特殊處理 及處置之放射性物質’所以FPIA優於RIA。此外，舰為 可谷易且快速進行之均質分析。 雲於上文，提供一種確定測試樣品中分析物（或其片段） 之存在、量或濃度的方法。方法包括藉由如下分析來分析 測試樣品之分析物（或其片段），該分析⑴採用⑼可結合分 析物之結合蛋白(例如抗體、抗體片段)、可結合分析物之 結合蛋白(例如抗體)之變異體、可結合分析物之抗體之變 異體的片段、如本文揭示之結合蛋白及可結合分析物之 ⑽結合蛋白（或其片段、變異體或變異體之片段）之至少 e a ()至少種可偵測標記；及（Π)包含將由可偵測 仏。己產生之作為測試樣品中分析物（或其片段）之存在、量 或激度的直接㈣接㈣之錢與產生之料對照或校準 知丨中刀析物(或其片段)之存在、量或濃度的直接或間接指 160878.doc •253- 201242977 π㈣㈣h校準㈣情況為—系列校準劑之一部 分，其中各校準劑與其他校準劑之分析物濃度不同。 方法可包括⑴使測試樣品與至少一種結合抗原或其片段 上之抗原決定基之捕捉劑接觸以便形成捕捉劑/抗原或其 片段複合物，⑻使該捕捉劑/抗原或其片段複合物與至少 一種包含可偵測標記且結合該抗原或其片段上不由該捕捉 劑結合之抗原m的偵測劑接觸以形成捕捉劑/抗原或 其片段/㈣劑複合物，及㈣基於由（ii)中形叙該捕捉 劑/抗原或其片⑽測劑複合物中之該可偵測標記產生的 仏唬確定該測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或濃 度，從而確定該測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或 濃度’其中至少一種捕捉劑及/或至少一㈣測劑為至少 一種結合蛋白。 至少-種針對分析物（或其片段）之第—特異性結合搭配 物及至少-種針對分析物(或其片段)之第二特異性結合搭 配物為如本文揭示之結合蛋白或如本文所述之tvd結合蛋 白(或其片段、變異體或變異體之片段)的方法可為較佳 的。 或者，方法可包括⑴使測試樣品與至少一種結合抗原或 其片段上之抗原決定基之捕捉劑接觸以便形成捕捉劑/抗 原或其片段複合物，及同時或以任一順序依序使該測試樣 品與可與該測試樣品中之任何抗原或其片段競爭結合該至 少-種捕捉劑之經可債測標記的抗原或其片段接觸，其中 該測試樣品中存在之任何抗原（或其片段）與該經可偵測標 160878.doc •254·
S 201242977 記之抗原彼此競爭以分別形成捕捉劑/抗原或其片段複合 物及捕捉劑/經可偵測標記之抗原或其片段複合物，及（ii) 基於由（ii)中形成之該捕捉劑/經可偵測標記之抗原或其片 段複合物中之該可偵測標記產生的信號確定該測試樣品中 s亥抗原或其片段之存在、量或濃度，其中至少一種捕捉劑 為至少一種結合蛋白，其中由該捕捉劑/經可偵測標記之 抗原或其片段複合物中之該可偵測標記產生的該信號與該 測試樣品中之抗原或其片段之量或濃度成反比，從而確定 該測試樣品中抗原或其片段之存在、量或濃度。 以上方法可另外包含診斷、預後或評估測試樣品所獲自 之患者之治療性/防治性治療的功效。若方法另外包含評 估測试樣品所獲自之患者之治療性/防治性治療的功效， 則方法視情況另外包含在需要時改進該患者之該治療性/ 防治性 >、台療以改良功效。方法可經調適以用於自動系統或 半自動系統中》 更詳言之，提供一種確定測試樣品中抗原（或其片段）之 存在、量或濃度的方法《抗原（或其片段）係選自由α_ΐ2、 IL-13、IL-18、TNFa及PGE2組成之群。該方法包含藉由 免疫分析來分析測試樣品之抗原（或其片段）。免疫分析⑴ 採用至少-種結合蛋白及至少一種可偵測標記且⑼包含 將由可偵測標記產±之作為測試樣品中抗原(或其片段)之 存在、量或濃度的直㈣間接指示之㈣與所產生之作為 對照或校準财抗原（或其諸）之存在、量或濃度的直接 或間接指示之信號相比較。校準劑視情況為一系列校準劑 .160878.doc -255· 201242977 之一部分’在該一系列校準劑中，各校準劑與系列中其他 校準劑之抗原（或其片段）之濃度不同。 在一個實施例中，至少一種結合蛋白之一（i，）包含一或 多個包含 VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鏈， 其中VD1為自第一親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合 部分獲得之第一重鏈可變異域，VD2為自第二親本結合蛋 白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變異 域’ VD3為自第三親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合 部分獲得之第三重鏈可變異域，C為重鏈恆定域，XI為第 一連接子，X2為第二連接子，X3&Fc區；且η為〇或卜 在另一實施例中，至少一種結合蛋白之一包含一或 多個包含 VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鏈， 其中VD1為自第一親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合 部分獲得之第一輕鏈可變異域，VD2為自第二親本結合蛋 白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變異 域’ VD3為自第三親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合 部分獲得之第三輕鏈可變異域，C為輕鏈恆定域，XI為第 一連接子’ X2為第二連接子，X3為Fc區；且η為0或1。 在另一實施例中，至少一種結合蛋白之一者包含四個多 肽鏈’其中第一及第三多肽鏈各獨立地包含VD1-(XI )η-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中VD1為第一重鏈可變異 域，VD2為第二重鏈可變異域，VD3為第三重鏈可變異 域，C為重鏈恆定域，XI為第一連接子，X2為第二連接 子，X3為Fc區且其中第二及第四多肽鍵各獨立地包含
160878.doc •256- S 201242977 VDl_(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中 VD1 為第一輕 鏈可變異域’ VD2為第二輕鏈可變異域，VD3為第三輕鍵 可變異域，C為輕鏈恆定域，XI為連接子，χ2為第二連接 子，Χ3不包含Fc區且η為0或1。 測試樣品可來自患者，在該情形下，方法可另外包含診 斷、預後或評估患者之治療性/防治性治療之功效。若方 法另外包含評估患者之治療性/防治性治療之功效，則方 法視情況另外包含在需要時改進該患者之該治療性/防治 性治療以改良功效。方法可經調適以用於自動系統或半自 動系統中。 關於分析方法（及其套組），可能採用市售抗分析物抗體 或如文獻中所述用於產生抗分析物之方法。各種抗體之商 業供應商包括（但不限於）Santa Cruz Biotechnc)1()gy
Inc.(Santa Cruz, CA) > GenWay Biotech, Inc.(San Diego, CA)及 R&D Systems(RDs; Minneap〇lis, MN)。 ， 一般而s，可採用預定含量作為評估在分析測試之分析 物或其片& (例如用於谓測疾病或疾病風險）後獲得之結果 的基準。一般而言’在進行該種比較時，藉由在適合條件 下進行m數之特定分析法來獲得預定含量，以便建立 所存在分析物、其含量或其濃度與疾病、病症或病狀之特 :1¾ 士或”點或與特定臨床指標之聯繫性或相關性。通 力藉由刀析參照個體（或個體群體）獲得預定含量。所量 測之刀析物可包括其片段、其降解產物及/或其酶促分解 160S7S.doc -257· 201242977 特定言之，關f ;如用於監測疾病進展及/或治療之預定 a量刀析物或其片段之量或濃度可「不變」、「有利」 (一或有利地改變或「不利」（「不利地改變」）。「升 问」或i曾加」係指測試樣品中之量或濃度高於典型或正 常含量或範圍(例如預定含量)，或高於另-參照含量或範 圍(例如早期或基線樣品)。術語「降低」或「減少」係指 ： °〇中之量或濃度低於典型或正常含量或範圍(例如 預：含量)’或低於另-參照含量或範圍(例如早期或基線 7 )術°。改邊」係指樣品中之量或濃度改變（增加或 降低）超出典型或正常含量或範圍（例如預定含量）或超出另 一參照含量或範圍（例如早期或基線樣品）。 —分析物之典型或正常含量或範圍係根據標準操作法來確 疋。因為分析物含量在一些情況下將極低，所以當相較於 典型或正常含量或範圍或參考含量或範圍存在不能由實驗 誤差或樣品差異解釋之任何淨變化時，可認為已發生所謂 改變之含量或改變。因此，所量測之特定樣品中之含量: 與所測定之來自所謂正常個體之類似樣品中的含量或含量 範圍相比較。在此情形下，「正常個體」$例如無可^ :病之個體，且「正常」(有時稱作「對照」)患者或群體 分別為例如不展現可㈣疾病之患者或群體。此外，繁於 在大多數人類群體中通常未發現高含量之分析物，「正常 個體」可視為分析物之量或漠度無實質性可谓測增加或升 南之個體，且「正常」(有時稱為「對照」）患者或群體為 不展現分析物之量或濃度實質性可谓測增加或升高的患者 160878.doc •258· 5 201242977 或群體。「表觀正常個體」為尚未評估分析物或當前正坪 估分析物之個體。當分析物通常為不可偵測(例如正常含 量為零’或在正常群體之約25%至約75%之範圍内），但在 測試樣品中偵測到分析物時，以及當測試樣品中之分析物 3量冋於正*含量時，認為分析物之含量「升高」。因 此，本發明尤其提供-種篩檢患有特定疾病、病症或病狀 或處於患有特定疾病、病症或病狀之風險中之個體的方 法。分析方法亦可涉及分析其他標記及其類似物。 因此，本文所述之方法亦可用於確定個體是否患有既定 疾病、病症或病狀或處於發展既定疾病、病症或病狀之風 險中。詳言之’該種方法可包含以下步驟：⑷測定來自個 體之測試樣品中之分析物（或其片段）之濃度或量（例如使用 本文所述之方法或此項技術中已知之方法）；及（b)將步驟 (a)中測定之分析物（或其片段）之濃度或量與預定含量相比 較，其中若步驟（a)中測定之分析物之濃度或量相對於預定 含量為有利的結果時，則確定個體未患有既定疾病、病症 或病狀或未處於患有既定疾病、病症或病狀之風險中。然 而，若步驟（a)甲測定之分析物之濃度或量相對於預定含量 為不利的結果時，則確定個體患有既定疾病、病症或病狀 或處於患有既定疾病、病症或病狀之風險中。 另外’本文提供監測個體中之疾病之進展的方法。方法 包括以下步驟：（a)測定來自個體之測試樣品中之分析物之 濃度或量；（b)測定來自個體之隨後測試樣品中之分析物之 濃度或量；及（c)將如步驟（b)中測定之分析物之濃度或量 160878.doc •259· 201242977 與步驟（a)中測定之分析物之濃度或量相比較，其中若步驟 (b)中測定之濃度或量在相較於步驟中測定之分析物之 濃度或量時無變化或為不利的結果時，則確定該個體中之 疾病已持續、進展或惡化。相比而言，若如步驟⑻令測定 之分析物之濃度或量在相較於如步驟⑷十測定之分析物： 濃度或量時為有利的結果時，則確定該健巾之疾病 止、消退或改善。 該方法視情況另外包括將如步驟（b)中測定之分析物之 濃度或量例如與預定含量相比較。另外，該方法視情況包 括：若比較顯示如步驟附測定之分析物之漢度或量例如 相對於預定含量出現不利改變時，則用一或多種醫藥組合 物治療個體一段時期。 f I V使用該等方法來監測接受用—或多種醫藥組合 物治療之個體中之治療。詳言之，此等方法涉 個體之第一，目丨丨4果自 人 / 隨後向該個體投與一或多種醫藥組 σ物。隨後，刺定边占 疋來自該個體之第-測試*品中之分析物 :;農度在❹(例如使用本文所述或如此項技財 Z農二定分析物之濃度或量之後，接著視情況將分析 量與預定含量相比較。若如所測定之第 樣-中之为析物的漠度或量低於預： 品中之分析物的Γ 所測定之第一測試樣 藥組合物治療個體一段時期。用一或多種=组=醫 期了由熟習此項技術者决定㈤如該時間期可 160878.doc 201242977 為約七（7)天至約兩年，較佳 在用〇 千較佳斜四〇句天至約—⑴年 在用-或多種醫藥組合物治療之過程期間 獲得第二及後續測試樣品。測 自個體 該等測試樣品之時間並非關鍵。舉:;而言目獲得 ::與第―或:::藥組―得 週_二樣物之後兩⑺ 兹,人1 火向個體投與一或多種醫 =物之後三(3)週獲得第四測試樣品，可在第一次向個 體扠與一或多種醫藥組合物 品，依此類推。 纟四⑷週獲件第五測試樣 在自個«得各第二或後續輯樣品之後，測定 或後續測試樣品中之分析物之濃度或量（例如使用本文所 述或如此項技術中已知之方法卜接著將如所料之各第 :及後續測試樣品中之分析物的濃度或量與如所測定之第 一測試樣品（例如最初視情況與預定含量相比較之測試樣 =)中之分析物的濃度或量相比較。若如步驟⑷中測定之 /刀析物之濃度或量在相較於如步驟⑷中測定之分析物之濃 度或量時為有利的結果時’則確定個體中之疾病已中止、 消退或改善，且應繼續向該個體投與步驟（b)之一或多種醫 藥組合物。然而，若步驟⑷中測定之濃度或量在相較於如 步驟（a)中測疋之分析物之濃度或量時無變化或為不利的結 果時則確疋個體中之疾病持續、進展或惡化，且應用較 高濃度之一或多種在步驟（b)中向個體投與之醫藥組合物治 療6玄個體或應用一或多種不同於在步驟（b)中向個體投與之 160878.doc 201242977 一或多種醫藥組合物的醫藥組合物治療該個體。詳言之， 可用一或多種不同於個體先前已接受之一或多種醫藥組合 物的醫藥組合物來治療個體以減少或降低該個體之分析物 含量。 一般而言，對於可能進行重複測試之分析（例如監測疾 病進展及/或對治療之反應），在已自個體獲得第一測試樣 品之後一段時間内按時獲得第二或後續測試樣品。詳言 之，可在已自個體獲得第一測試樣品之後數分鐘、數小 時、數天、數週或數年自個體獲得第二測試樣品。舉例而 言，可在自個體獲得第一測試樣品之後約丨分鐘、約5分 鐘、約10分鐘、約15分鐘 '約3〇分鐘、約45分鐘、約6〇分 鐘、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、 約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約u小時、約 12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時約 17小時、約18小時、約19小時、約2〇小時、約21小時約 22小時、約23小時、約24小時、約2天 '約3天、約4天、 約5天、'約6天、約7天、約2週、約3週、約4週、約5週、 約6週、約7週、約8週、約9週、約1〇週、約π週、約12 週、約13週、約14週、約15週、約16週、約17週、約i 8 週、約19週、約20週、約21週、約22週、約23週、約24 週、約25週、約26週、約27週、約28週、約29週、約30 週、約31週、約32週、約33週、約34週、約35週、約36 週、約37週、約38週、約39週、約40週、約41週、約42 週、約43週、約44週、約45週、約46週、約47週、約48 160878.doc -262- 201242977 週、約49週、約50週、約51週、約52週、約1.5年、約2 年、約2.5年、約3·〇年、約3.5年、約4.0年、約4.5年、約 5.0年、約5.5年、約6_〇年、約6.5年、約7.0年、約7 5年、 約8.0年、約8.5年、約9.0年、約9.5年或約10.0年之時期自 個體獲得第二測試樣品。
當以上分析用於監測疾病進展時，其可用於監測罹患急 性病狀之個體中之疾病的進展β急性病狀亦稱為緊急照護 病狀’其係指危及生命之急性疾病或涉及例如心血管系統 或排泄系統之其他緊急醫學病狀。緊急照護病狀通常係指 需要在醫院類環境（包括（但不限於）急救室、加護病房、創 傷中心或其他緊急照護環境）中進行急性醫學介入或由護 理人員或其他領域之醫務人員進行投藥的彼等病狀。對於 緊急照護病狀，一般在較短時間範圍，即數分鐘' 數小時 或數天（例如約1分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、 約30分鐘、約45分鐘、約6〇分鐘、約2小時、約3小時
4小時、約5小時、約6小時 時、約ίο小時、約η小時、 時、約15小時、約16小時、 時、約20小時、約21小時、 時 '約2天、約3天、約4天 行重複監測，且初始分析同 短時間範圍’例如約數分鐘 、約7小時、約8小時、約9小 約12小時、約13小時、約14小 約17小時、約18小時、約19小 約22小時、約23小時、約24小 、約5天、約6天或約7天）内進 樣一般在疾病或病狀發作之較 、數小時或數天内進行。 病 分析亦可用於慢性或㈣性雜之個體中之疾 的進展。非緊急照護或非急性病狀係指除危及生命之急 160878.doc •263- 201242977 性疾病及涉及例如心血管系統及/或排液系統之其他緊条 醫學病狀以外的病狀1急性病狀通常包括具有較長期= 慢性持續時間之病狀。對於非急性病狀一般在較長時間 範圍，例如數小時、數天、數週、數月或數年（例如⑴小 時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時 ^小時、約8小時、約9小時、約1〇小時、約u小時約 約16小時、約 約21小時、約 約2天、約3天、約4天、 約3週、約4週、約5週、 約10週、約11週、約i 2 勺17週 12小時、約13小時、約14小時 17小時、約18小時、約19小時 22小時、約23小時、約24小時 約5天、約6天、約7天、約2週 約6週、約7週、約8週、約9週 約1 5小時 約20小時
週 週 週 週 週 週 週 年 約13週、約14週 勺19週、約20週 約25週、約26週 勺31週、約32週 約37週 約43週 約49週 約2.5年 約3 8週 約44週 約50週 約3.0年 約15週 約21週 約2 7週 約33週 約39週 約45週 約51週 約16週 約22週 約28週 約34週 約40週 約46週 約52週 約23週 約29週 約3 5週 約41週 約47週-約1.5年 約1 約2 約3丨 約3丨 約4: 約4! 約：
約3.5年、約4.〇年、約4 5年、 5.0年、約5.5年、約6.〇年、約6.5年、約7 〇年、約人5年， 約8.0年、約8.5年、約9.〇年、約9 5年或約1〇 〇年）内進; 重複監測’且初始分析同樣―般在疾病或病狀發作之較 時間範圍’例如約數小時、數天、數月或數年内進行。 此外’可使用自個體獲得之第一測試樣品進行以上 160878.doc 5 •264· 201242977 析，其中該第-測試樣品係自一種來源，諸如尿、血清或 血聚獲付。可接著視情況使用自個體獲得之第二測試樣品 重複以上分析，其中該第二測試樣品係自另一來源獲得。 。j而α若第一測試樣品係自尿獲得，則第二測試樣品 可自血清或血漿獲得。可比較自使用第-測試樣品及第二 、J式樣進行之分析獲得之結果。比較結果可用於評估個 體中之疾病或病狀之狀態。 此外’本發明亦係關於確定易患或罹患既定疾病、病症 或病狀之個體是否將受益於治療之方法。特定言之，本發 明係關於分析物相伴診斷方法及產品。因此，如本文所述 之「監測對個體中之疾病之治療」的方法另外最佳亦可涵 蓋選擇或鑑別療法之候選者。 因此，在特定實施例中，本發明亦提供一種確定患有既 定疾病、病症或病狀或處於患有既定疾病、病症或病狀之 風險中的個體是否為療法之候選者的方法。一般而言，個 體為已經歷既定疾病、病症或病狀之一些症狀之個體，或 實際上已診斷為患有既定疾病、病症或病狀或處於患有既 定疾病、病症或病狀之風險中之個體，及/或如本文所述 顯示不利濃度或量之分析物或其片段之個體。 方法視情況包含如本文所述之分析，其令在用一或多種 醤藥組合物（例如特定言之用與涉及分析物之作用機制相 關之醫藥）、用免疫抑制療法或藉由免疫吸附療法來治療 個體之前及之後評估分析物，或其中在此治療之後評估分 析物且將分析物之濃度或量與預定含量相比較。在治療之 160878.doc 160878.doc •265· 201242977 後觀測到不利遺序十具 、 進一步或繼體將不受益於接受 八=:! 而在治療之後觀測到有利濃度或量之 古—〜4繼續治療。此確認 有助於B理6«床研究且提供改良之患者照護。 ::而喻：是儘管本文之某些實施例在用於評估如本文 响、之既S疾病、病症或病狀時為有利的，但可使用分 析及套組來評估其他疾病、病症及病狀中之分析物。分析 方法亦可涉及分析其他標記及其類似物。 厶分析方法亦可用於鑑別改善既定疾病、病症或病狀之化 合物。舉例而言’可使表現分析物之細胞與候選化合物接 觸。可使用本文所述之分析方法將與化合物接觸之細胞中 之分析物的表現量與對照細胞中之分析物的表現量相比 較。 B.套组 亦提供一種分析測試樣品之分析物（或其片段）在測試樣 品中之存在、量或濃度的套組。該套組包含至少一種用於 分析測試樣品之分析物（或其片段）的組分及用於分析測試 樣品之分析物（或其片段）的說明書。至少一種用於分析測 試樣品之分析物（或其片段）之組分可包括包含視情況固定 於固相上之如本文揭示之結合蛋白及/或抗分析物TVD結 合蛋白（或其片段、變異體或變異體之片段）的組合物。 套組可包含至少一種藉由免疫分析（例如化學發光微粒 免疫分析）分析測試樣品之分析物的組分及藉由免疫分析 (例如化學發光微粒免疫分析）分析測試樣品之分析物的說
160878.doc -266- S 201242977
明書。舉例而言，套組可包含針對分析物之至少 性結合搭配物’諸如抗分析物單株/多株抗體（或 分析物之片段，其可結合分析物之變異體，或可結合: 物之變異體之片段)、如本文揭示之結合蛋白或抗分析物 谓結&蛋白（或其片段、變異體或變異體片段卜其任一 者皆可經可谓測標記。另外或或者，套組可包含經可㈣ 標記之分析物（或其可結合抗分析物單株/多株抗體、如本 文揭示之結合蛋白或抗分析物TVD結合蛋白（或其片严 變異體或變異體片段）之片段），其可與測試樣品中之:何 分析物競爭結合抗分析物單株/多株抗體(或其可結合分析 物之片段’其可結合分析物之變異體，或可結合分析物之 變異體之片段)、如本文揭示之結合蛋白或抗分析物_ 結合蛋白（或其片段、變異體或變異體片段），其任一者皆 可固定在固體支樓物上。套組可包含校準劑或對照，例如 經分離或純化之分析物。套組可包含至少—種用於進行分 析:容器（例如管、微量滴定盤或條帶，其可例如已塗有 =特異性結合搭配物）；及/或緩衝液，諸如分析緩衝液 A I緩衝液’其任一者皆可以濃縮溶液之形式提供；可 積測標记（例如酶標記）之受f溶液；或終止溶液。套組較 佳包含為進行分析所必需之所有組分，亦即試劑、標準 物緩衝液、稀釋劑等。說明書可呈紙張形式或電腦可讀 形’’諸如磁盤、CD、DVD或其類似物。 咩5之，提供一種用於分析測試樣品之抗原（或其片 又之套組。套組包含至少一種用於分析測試樣品之抗原 160878.doc •267· 201242977 (或其片段）之組分及用於分析測試樣品之抗原（或其片段） 之說明書，其中該至少一種組分包括至少一種包含結合蛋 白之組合物，該結合蛋白包含一或多個包含VD1- (Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鏈，其中 VD1 為自 第一親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第 一重鏈可變異域’ VD2為自第二親本結合蛋白（例如抗體） 或其抗原結合部分獲得之第二重鍵可變異域，VD3為自第 三親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第三 重鏈可變異域，C為重鏈恆定域，XI為第一連接子，X2為 第二連接子，X3為Fc區；且η為0或1，且（ii，）可結合選自 由以下組成之群之三抗原組：前列腺素E2(pgE2)、介白素 13(IL-13)及介白素l8(IL·18);及腫瘤壞死因子α(TNFα)、 介白素13(IL-13)及介白素18(IL-18)。 在另一實施例中，結合蛋白（i，）包含一或多個包含VD1- (Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鏈，其中 VD1 為自 第一親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第 一輕鏈可變異域，VD2為自第二親本結合蛋白（例如抗體） 或其抗原結合部分獲得之第二輕鍵可變異域，VD3為自第 三親本結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分獲得之第三 輕鏈可變異域，C為重鏈恆定域，XI為第一連接子，X2為 第二連接子，X3為Fc區；且η為0或1。 在另一實施例中，結合蛋白包含四個多肽鍵，其中第一 及第三多肽鏈各獨立地包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n ’其中VD1為第一重鏈可變異域，VD2為第二重鏈可 160878.doc -268 - 201242977 變異域，VD3為第=舌雜π掛
一重鏈可變異域，C為重鏈恆定域，XI 二第連接子，χ2為第二連接子，χ3為^區且其中第二 及第四多肽鏈各獨立地包含VDl_(xi)n VD2_(x2)n_vD3_c_ (X3)n，其中VD1為第—輕璉可變異域，·為第二輕键可 變異域’ VD3為第三輕鏈可變異域，Cl為輕鍵恨定域，幻 為連接子，X2為第-择4* 7 勹弟一連接子，χ3不包含Fc區且η為〇或卜 用於本發明之卷Ζρ V. 套，、且中之結合蛋白可視情況經可偵測標 記。 • ㈣結合蛋白，例如抗體(諸如抗分析物抗體)、如本文 揭不之任何結合蛋白、任何抗分析物TVD結合蛋白或示縱 齊11皆可併有如本文所述之可偵測標記，諸如螢光團、放射 〖生邛刀、酶、生物素/抗生蛋白標記、發色團、化學發光 標己或，、類似物，或套組可包括用於進行可铺測標記之試 劑。抗體、校準劑及/或對照可提供於各別容器中或預先 77配於適▲刀析形式中，例如預先分配入微量滴定盤中。 "視匱’兄包括質控制組分（例如靈敏度組、校準劑 及陽性對照)。品質控制試劑之製備在此項技術中為熟知 的且於多種免疫診斷產品之插頁上描述。靈敏度組成員視 It况用於確定分析效能特徵，且另外視情況為免疫分析套 組4劑之完整性及分析標準化之適用指示劑。 套，且亦可視情況包括為進行診斷分析或有助於品質控制 «平估所需之其他試劑，諸如緩衝液、鹽、酶、酶輔因子、 酶又質债測δ式劑及其類似物。套組中亦可包括其他組 分，諸如緩衝液及用於分離及/或處理測試樣品之溶液（例 160878.doc 201242977 如預處理試劑）。套組可另外包括一或多種其他對昭。套 組之一或多種組分可經象乾，在該情況下，套組可另外包 含適於復原凍乾組分之試齊j。 套組之各種組分必要時視情況提供於適合容n，例如微 量滴定盤中。套組可另外包括容納或儲存樣品之 如供尿樣錢用之容器或適當時，套組視心_ 含有反應容器、混合容器及有助於製備試劑或測試樣品之 其他組分。套組亦可包括—舒種有助於獲得職樣品之 儀器’諸如注射器、吸移管、鉗子、量匙(m— spoon)或其類似物。 若可偵測標記為至少_種。丫錢化合物則套組可包含 至少-種吖啶鏽-9-甲醯胺、至少一種吖啶鐫_9_曱酸芳酯 或其任何組合。若可偵測標記為至少一種。丫咬鏽化合物， 則套組亦可包含過氧化氫之來源，諸如緩衝液、溶液及/ 或至少-種驗性溶液。必要時，套組可含有㈣目諸如磁 性粒子、珠粒、試管、微量滴定盤、比色管、膜、骨架分 子、薄膜、濾紙、圓盤或晶片。 C.套组及方法之調適 藉由如本文所述之分析（諸如免疫分析）確定測試樣品中 之分析物之存在、量或濃度的套組（或其組分）以及方法可 經調適以用於例如美國專利第5，G89,424號及第5，祕，3〇9號 中所述且例如由 Abbott Laboratories(Abbott Park，IL)以 ARCHITECT®銷售之多種自動及半自動系統（包括固相包 含微粒之系統）中。 160878.doc •270· 201242977 自動或半自動系統相較於非自動系統（例如ELISA)之一 些差異包括第一特異性結合搭配物（例如抗分析物單株/多 株抗體（或其片段、其變異體或其變異體之片段）、如本文 揭示之結合蛋白、或抗分析物TVD結合蛋白（或其片段、 其變異體或其變異體之片段），任一方式皆可影響夾心形 成及分析物反應性）所連接之受質；以及捕捉、偵測及/或 任何視情況選用之洗滌步驟之時長及時序。非自動形式 (諸如ELISA)可能需要與樣品與捕捉試劑一起培育相對較 長時間（例如約2小時），但自動或半自動形式（例如 ARCHITECT®, Abbott Laboratories)可具有相對較短之培 育時間（例如對於ARCHITECT®而言，約1 8分鐘）。類似 地，非自動形式（諸如ELISA)可培育偵測抗體（諸如結合試 劑）相對較長之培育時間（例如約2小時），但自動或半自動 形式（例如ARCHITECT®)可能具有相對較短之培育時間（例 如對於ARCHITECT®而言，約4分鐘）。 可自Abbott Laboratories賭得之其他平台包括（但不限 於）AxSYM®、IMx®(參見例如美國專利第 5,294,404號）、 PRISM®、EIA(珠粒）及QuantumTM II以及其他平台。另 外，分析、套組及套組組分可以其他形式使用，例如在電 化學或其他手持式或重點照護（point-of-care)分析系統上使 用。本發明例如適用於進行夾心式免疫分析之商品化 Abbott 重點照護（i-STAT®，Abbott Laboratories)電化學免疫 分析系統。免疫感測器及其製造方法及在單次使用測試裝 置中操作之方法描述於例如美國專利第5,063,081號；第 160878.doc -271 · 201242977 7,419,821號及第7,682,833號；及美國專利公開案第 20040018577 號及第 20060160164 號中。 特定言之’就調適分析物分析以用於j_STAT⑧系統而 言，下列組態較佳。製造具有一對金電流分析工作電極及 銀-氣化銀參照電極的微加工之矽晶片。在一個工作電極 上，將具有固定之抗分析物單株/多株抗體（或其片段、其 變異體或其變異體之片段）、如本文揭示之結合蛋白、或 抗分析物TVD結合蛋白（或其片段、其變異體或其變異體 之片段）之聚苯乙烯珠粒（〇.2 mm直徑）黏附於電極上經圖案籲 化之聚乙烯醇的聚合物塗層上。將此晶片裝配入具有適於 免疫分析之流體形式iLSTAT⑧匿中。在昆中容納樣品之 腔室之壁的-部分上’存在包含對分析物具特異性之結合 搭配物（諸如抗分析物單株/多株抗體（或其可結合分析物之
蛋白、或抗分析物TVD結合蛋白（或其可結合分析物之片 段、其變
測標記）之 之水性試劑。 在操作中 納腔室中， 將懷疑έ有刀析物之樣品添加至測試g之容
出且進入管道中以將樣品 道中。此時，將其振盪以促進形 二個步驟中’迫使流體自囊中流 自晶片洗除且進入廢料腔室中β 160878.doc
S -272- 201242977 在分析之最後步驟巾’㈣磷酸s旨酶標記與對胺基苯紛攝 酸酯反應以分㈣酸㈣錢所釋放之對胺基苯盼在工作 電極處經電化學氧化。基於所量測之電流，讀取器能夠藉 助於嵌入演算法及工廠測定之校準曲線來計算樣品中之分 析物之量。 更不言而喻的是如本文所述之方法及套組必定涵蓋用於 進行免疫分析之其他試劑及方^舉例而言，涵蓋各種緩 衝液，諸如此項技術中已知及/或可容易製備或最佳化以 例如用於洗滌、用作結合物稀釋劑、微粒稀釋劑及/或用 作校準劑稀釋劑的緩衝液。一例示性結合物稀釋劑為某些 套組（Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)中採用且含有 2_ (N-嗎啉基）乙烷磺酸（MES)、鹽、蛋白質阻斷劑、抗微生 物劑及清潔劑之ARCHITECT®結合物稀釋劑。一例示性校 準劑稀釋劑為某些套組（Abbott Laboratories，Abbott Pai*k IL)中採用之ARCHITECT®人類校準劑稀釋劑，其包含含 有MES、其他鹽、蛋白質阻斷劑及抗微生物劑之緩衝液。 另外，如2008年12月31日申請之美國專利申請案第 61/142,048號中所述’可例如在i-stat匣形式中，使用連接 於信號抗體之核酸序列作為信號放大物來獲得改良之信號 產生。 將為熟習此項技術者顯而易知的是本文所述之方法之其 他適合修改及調適為顯而易見的且可使用適合相等物在不 脫離所主張之本發明或本文揭示之實施例的範嘴下作出。 現已詳細描述本發明，藉由參照下列實例將更明碎理解本 160878.doc -273 - 201242977 發明，該等實例僅出於說明目的包括在内且不意欲限制所 主張之本發明。 實例 實例1 : 產生識別PGE2、IL-12及IL-18之多（亦即三）可變 異域免疫球蛋白（TVD-Ig)分子 三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)分子經設計以藉由重 組DNA技術使來自一或多種親本單株結合蛋白（例如抗體） 之三個不同輕鏈可變異域（VL)以串聯方式直接或經由短連 接子連接，隨後為輕鏈怪定域。類似地，重鍵包含三個以 串聯方式連接之來自一或多種親本單株結合蛋白（例如抗 體）之不同重鏈可變異域（VH)，隨後為恆定域CH1及Fc區 (圖 1)。 實例1.1 : 構築、表現及純化識別PGE2、IL-12及IL-18之 多（亦即三）可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)分子 TVD-Ig蛋白質經設計為IgG樣分子，例外之處為TVD-Ig 蛋白質之各輕鏈及重鏈在IgG中具有三個串聯可變異域而 非一個可變異域。此三個可變異域由短連接子分開。源於 人類CHI/Ck之N端序列之任一連接子序列為下列序列：
輕鏈（κ)，短連接子：TVAAP 重鏈（γΐ)，短連接子：ASTKGP 此等選自人類Ck及CH1之Ν端之連接子序列為可變異域 之天然延伸部分且基於若干Fab晶體結構之分析，展現無 明顯二級結構之可撓性構形。 親本結合蛋白（亦即單株抗體）包括先前揭示之三種高親 160878.doc -274- 201242977 和力單株抗體抗PGE2(2B5)、抗hIL-12(lD4.1)及抗hlL-18(mAb 2.5)。此三種單株抗體之VL/VH域藉由重疊PCR經 由短連接子（VL之連接子序列為TVAAP且VH之連接子序列 為 ASTKGP)在 HC 與 LC 兩者中均以 5’VD(1D4.1)-SL-VD(mAb 2.5)-SL-VD(2B5)3，，隨後為恆定區之域順序融合 在一起，稱為TVD-Ig 001。亦在HC與LC兩者中均以 5’VD(2B5)-SL-VD(lD4.1)-SL-VD(mAb 2.5)3，，隨後為恆定 區之域順序產生不同TVD-Ig(TVD-Ig 002)。以下描述PCR 選殖之詳細程序。 為產生重鏈構築體TVD-Ig 001，使用特異性引子1及 4(引子含有SL序列）對lD4.1-SL-mAb 2.5 TVD-Ig蛋白質之 VH域進行PCR擴增；同時使用特異性引子2及3(引子含有 SL序列）擴增抗PGE2抗體之VH域。兩個PCR反應均係根據 標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產物且一起 用作使用標準PCR條件及引子3及4進行之後續重疊PCR反 應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將重疊PCR產 物次選殖入經FspAl及Sal I雙重消化之pHybE-hCg mut(234、235)z non-a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為產生輕鏈構築體TVD0(H，使用特異性引子6及8(引子 含有 SL 序列）對 lD4.1-SL-mAb 2.5 DVD-Ig 之 VL 域進行 PCR 擴增；同時使用特異性引子5及7(引子含有SL序列）擴增抗 PGE2抗體2B5之VL域。兩個PCR反應均係根據標準PCR技 術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產物且一起用作使用標 準PCR條件及引子7及8進行之後續重疊PCR反應的重疊模 160878.doc -275 - 201242977 板。藉由使用標準同源重組方法將重疊PCR產物次選殖入 經BsiWI及Nrul雙重消化之pHybE-hCk哺乳動物表現載體 中〇 為產生重鏈構築體TVD002，使用特異性引子9及12(引 子含有SL序列）對lD4.1-SL-mAb 2_5 TVD-Ig之VH域進行 PCR擴增；同時使用特異性引子10及11(引子含有SL序列） 擴增抗PGE2抗體2B5之VH域。兩個PCR反應均係根據標準 PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產物且一起用作 使用標準PCR條件及引子11及12進行之後續重疊PCR反應 的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將重疊PCR產物 次選殖入經FspAl及Sal I雙重消化之pHybE-hCg mut(234、 235)z non-a哺乳動物表現載體中。 為產生輕鏈構築體TVD002，使用特異性引子13及15(引 子含有SL序列）對lD4.1-SL-mAb 2.5 DVD-Ig之VL域進行 PCR擴增；同時使用特異性引子14及16(引子含有SL序列） 擴增抗PGE2抗體之VL域。兩個PCR反應均係根據標準PCR 技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產物且一起用作使用 標準PCR條件及引子15及16進行之後續重疊PCR反應的重 疊模板。藉由使用標準同源重組方法將重疊PCR產物次選 殖入經BsiW I及Nru I雙重消化之pHybE-hCk哺乳動物表現 載體（Abbott)中。 引子1 : lD4.1-SL-mAb 2.5-SL-2B5-8.1 VH pHybE之3’内部 VH GCACCTCTGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGAC CATTGTCCCTTGGCCCC AGATA(SEQ ID NO:29) 160878.doc •276· 201242977 引子2 : lD4.1-SL-mAb 2.5-SL-2B5-8.1 VH pHybE之5,内部 VH ACCGTCTCTTCAGCGTCGACCAAGGGCCCAGAGGTGCAGC TGGTGCAGAGCGGCGCC GAGGTGAA(SEQ ID NO:30)
引子3 : lD4.1-SL-mAb 2.5-SL-2B5-8.1 VH pHybE之3,外部VH
AGGGTGCCAGGGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTCGACG CGCTGCTCACGGTCACCA GGGTGCCC(SEQ ID NO:31) 引子4 : lD4.1-SL-mAb 2.5-SL-2B5-8.1 VH pHybE之5,外部VH TGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCGA GGTCACCTTGAGGGAGT CTGGTC(SEQ ID NO:32) 引子5 : lD4.1-SL-mAb 2.5-SL-2B5-8.2 VL pHybE之5’内部 VL GGAGATTAAACGAACGGTGGCTGCACCAGACGTGCTGATG ACCCAGACCCCCCTGAG CCTGCCCG(SEQ ID NO:33) 引子6 : lD4.1-SL-mAb 2.5-SL-2B5-8.2 VL pHybE之3’内部 VL CATCAGCACGTCTGGTGCAGCCACCGTTCGTTTAATCTCCA GTCGTGTCCCTTGGCCG AAGGTGAT(SEQ ID NO:34)
引子7 : lD4.1-SL-mAb 2.5-SL-2B5-8.2 VLpHybE之3’外部VL CATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCAC CGTCCGCTTGATCTCCA CCTTGGTGC(SEQ ID NO:35) 引子8 : lD4.1-SL-mAb 2.5-SL-2B5-8.2 VL pHybE之5,外部 VL GGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGCGAC ATCGTGATGACCCAGTCT CCAGACT(SEQ ID NO:36)
引子9 : 5’内部 2B5-8.1-SL-1D4.1-SL-325 VH pHybE GAGCAGCGCGTCGACCAAGGGCCCAGAGGTCACCTTGAG GGAGTCTGGTCCTGCGCT GGTGAAA(SEQ ID NO:37) 160878.doc -277- 201242977 引子 10 : 3’内部 2B5-8.1-SL-1D4.1-SL-325 VH pHybE AGGTGACCTCTGGGCCCTTGGTCGACGCGCTGCTCACGGT CACCAGGGTGCCCTGGC CCCAGTAG(SEQ ID NO:38) 引子11:5’外部285-8.1-51^104.1-3[-325 乂11?1^5丑 TGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCGA GGTGCAGCTGGTGCAGA GCGGCGC(SEQ ID NO:39) 引子12:3，外部285-8.1-31^-104.1-51^325 乂11?1^5丑 GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTCGACGCTGA AGAGACGGTGACCATT GTCCCTTGG(SEQ ID NO:40) · 引子 13 : 5,内部 2B5-8.2-SL-1D4.1-B3-SL-325 VL: pHybE AGATCAAGCGGACGGTGGCTGCACCAGACATCGTGATGAC CCAGTCTCCAGACTCCC TGGCTGTG(SEQ ID NO:41)
引子 14 : 3'内部 2B5-8.2-SL-1D4.1-B3-SL-325 VL: pHybE CACGATGTCTGGTGCAGCCACCGTCCGCTTGATCTCCACCT TGGTGCCGCCGCCGAAG GTGTAGG(SEQ ID NO:42) 5J ^-15 ： 5'^h^2B5-8.2-SL-lD4.1-B3-SL-325 VL: pHybE TGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGC · GACGTGCTGATGACCCA GACCCCC(SEQ ID NO:43)
引子 16 : 3’外部 2B5-8.2-SL-1D4.1-B3-SL-325 VL: pHybE TGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACCGTACGT CGTTTAATCTCCAGTCG TGTCCCTTG(SEQ ID NO:44) 將TVD-Ig載體構築體轉染入293細胞中以產生TVD-Ig蛋 白質。所用之293短暫轉染程序為Durocher等人（2002) Nucleic Acids Res. 30(2): E9及 Pham 等人（2005) Biotech. 160878.doc -278- s 201242977
Bioengineering 90(3): 332-44中公開之方法的修改形式。 轉染中使用之試劑包括： • HEK 293-6E細胞（穩定表現EBNA1之人類胚腎細胞 株；自 National Research Council Canada獲得），在言史定為 130 rpm、37°C及5% C〇2之含濕氣培育箱中，在拋棄式錐 形瓶中培養。 •培養基：Freestyle 293表現培養基（invitrogen 12338-018)加 25 pg/mL 遺傳黴素（Geneticin)(G418)(Invitrogen 10131-027)及 0.1% 普洛尼克（Plur〇nic)F-68(Invitrogen 24040-032) ° •轉染培養基：FreeStyle 293表現培養基加1〇 mM HEPES(Invitrogen 15630-080)。 •聚伸乙基亞胺（PEI)儲備液：1 mg/mL無菌儲備溶液， pH 7_0，用直鍵 25 kDa PEI(Polysciences)製備且在-15°C 以 下儲存。 •胰化蛋白饋料培養基：肤化蛋白Nl(Organotechnie， 19554)於FreeStyle 293表現培養基中之5 w/v%無菌儲備 液。 用於轉染之細胞製備：在轉染之前約2-4小時，藉由離 心收集HEK 293-6E細胞，且以每毫升約1百萬個活細胞之 細胞密度再懸浮於培養基中。對於各轉染，將400 mL細胞 懸浮液轉移入2 L拋棄式錐形瓶中且培育2-4小時。 轉染：將轉染培養基及PEI儲備液預升溫至室溫（RT)。 對於各轉染，將250 pg質體DNA與500 pg聚伸乙基亞胺 160878.doc -279· 201242977 (PEI)組合於50 mL轉染培養基中，且在室溫下培育15-20分 鐘以允許形成DNA:PEI複合物。向400 mL先前製備之培養 物中添加各50 mL DNA:PEI複合物混合物，且放回設定為 130 rpm、37°C及5% C02之含濕氣培育箱中。在20-28小時 之後，向各轉染反應中添加50 mL胰化蛋白饋料培養基且 繼續培養六天。 純化：使用AKTA純化器（Amersham biosciences)純化來 自293轉染反應之上清液。添加10% IgG結合緩衝液（Pierce #21007)至上清液中且此裝載物用0.2 mM CA過濾器過濾。 5 mL蛋白A管柱用IgG結合缓衝液S平衡。樣品在1 5 mL/min之流速下裝載於管柱上。管柱接著用8管柱體積之 lxTBS洗滌。樣品在10 mL/min之流速下溶離於IgG溶離緩 衝液（Pierce)中且收集2.5 mL溶離份。管柱接著使用6 Μ脈 再生且用0.5 M NaOH清潔管線。收集溶離份且獲取OD 280 nm。含有OD>0.1之彼等溶離份用10% 2 M Tris(pH 7.5)中和且在SEC上進行分析。含有聚集度較低之TVD-Ig 之溶離份接著經匯合、濃縮且在4t下在攪拌盤上透析至 緩衝液（10 mM Na2HP04、10 mM檸檬酸鈉，pH 6.0)中隔 夜。測定樣品之OD 280 nm且表徵蛋白質。 160878.doc 280 201242977 表8 ·能夠結合PGE2、IL-12及IL-18之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 蛋白質區 序列識別號 序列 12345678901234567890 TVD-Ig001重可變異 SEQIDNO:45 EVTLRE S GPALVKPTQTLTL TCTFSGFSLSKSVMGVSWIR QPPGKALEWLAHIYWDDDKY YNPSLKSRLTrSKDTSKNQV VLTMTNMDPVDTATYYCARR GIRSAMDYWGQGTTVTVS S ASTKGPEVQLVQSGTEVKKP GESLKISCKGSGYTVTSYWI GWVRQMPGKGLEWMGFIYPG DSETRYSPTFQGQVTISADK SFNTAFLQWS SLKAS DTAMY YCARVGSGWYPYTFDIWGQG TMVTVSSASTKGPEVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTKYWLGWVRQAPGQGLEW MGDIYPGYDYTHYNEKFKDR VTLTTDTSTSTAYMELRSLR SDDTAVYYCARSDGSSTYWG QGTLVTVSS 1D4.1 VH SEQIl)NO:46 EVTLRESGPALVKPTQTLTL TCTFSGFSLSKSVMGVSWIR QPPGKALEWLAHIYWDDDKY YNPSLKSRLTISKDTSKNQV VLTMTNMDPVDTATYYCARR GIRSAMDYWGQGTTVTVSS 連接子 SEOIDNO:21 ASTKGP MAB 2.5 VH SEQIDNO:47 EVQLVQSGTEVKKPGESLKI SCKGSGYTVTSYWIGWVRQM PGKGLEWMGFIYPGDSETRY SPTFQGQVTISADKS FNTAF LQWSSLKASDTAMYYCARVG SGWYPYXFDIWGQGTMVTVS S 連接子 SEOIDNO:21 ASTKGP 2B5VH SEQIDNO:48 EVQLVQSGAEVKKPGASVKV SCKASGYTFTKYWLGWVRQA PGQGLEWMGDIYPGYDYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAY MELRSLRSDDTAVYYCARSD GSSTYWGQGTLVTVSS CH SEQIDNO:49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN 281 · 160878.doc 201242977 表8 :能夠結合PGE2、IL-12及IL-18之TVD_Ig之胺基酸序列
蛋白質 蛋白質區 序列識別號 序列 12345678901234567890 STYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVF S C S VMH E AL HN Η YT QKSLSLSPGK TVD-Ig001輕可變異 SEQ ID NO:50 DIVMXQSPDSLAVSLGERAT INCKASQSVSNDVAWYQQKP GQPPKLLIYYASNRYTGVPD RFSGSGSGTDFTLT工SSLQA EDVAVYYCQQDYNSPWTFGG GTKVEIKRTVAAPEIVMTQS PATLSVSPGERATLSCRASE SIS SN LAWYQQKPGQAPRLF IYTASTRATDIPARFSGSGS GTEFTLTISSLQSEDFAVYY CQQYNNWPSITFGQGTRLEI KRTVAAPDVLMTQTPLSLPV TFGEPASISCTSSQNIVHSN GNTYLEWYLQKPGQSPQLLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSG TDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 1D4.1 VL SEQ ID NO:51 DIVMTQSPDSLAVSLGERAT INCKASQSVSNDVAWYQQKP GQPPKLLIYYASNRYTGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQA EDVAVYYCQQDYNSPWTFGG GTKVEIKR 連接子 SEO IDNO:13 TVAAP MAB 2.5 VL SEQ IDNO:S2 EIVMTQSPATLSVSPGERAT LSCRASESISSNLAWYQQKP GQAPRLFIYTASTRATDIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDFAVYYCQQYNNWPSITFG QGTRLEIKR 連接子 SEO ID NO: 13 TVAAP 2B5 SEQ IDNO:53 DVLMTQTPLSLPVTPGEPAS ISCTSSQNIVHSNGNTYLEW YLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQVSHVP YTFGGGTKVEIKR CL SEQ ID NO:S4 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS 282 - 160878.doc 201242977 表8 :能夠結合PGE2、IL-12及IL-18之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 蛋白質區 序列識別號 序列 12345678901234567890 FNRGEC TVD-Ig002重可變異 SEQ ID NO:55 EVQLVQSGAEVKKPGASVKV SCKASGYTFTKYWLGWRQA PGQGLEWMQDIYPGY DYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAY MELRSLRSDDTAVYYCARSD GS 5 TYWGQGTLVTVS SASTK GPEVQLVQSGTEVKKPGESL K1SCKGSGYTVTSYWIGWVR QMPGKGLEWMGFIYPGDSET RYSPTFQGQVTISADKSFNT AFLQWSSLKASDTAMYYCAR VGSGWYPYTFDIWGQGTMVT VSSASTKGPEVTLRESGPAL VKPTQTLTLTCTFSGFSLSK SVMGVSWIRQPPGKALEWLA HIYWDDDKYYNPSLKSRLTI SKDTSKNQWLTMTNMDPVD TATYYCARRGIRSAMDYWGQ GTTVTVSS 2B5 VH SEQ ID NO:48 EVQLVQSGAEVKKPGASVKV SCKASGYTFTKYWLGWRQA PGQGLEWMGDIYPGYDYTHY NEKFKDRVTLTTDTSTSTAY MELRSLRSDDTAVYYCARSD GSSTYWGQGTLVTVSS 連接子 SE〇IDNO:21 ASTKGP 1D4.1 VH SEQ ID NO:46 EVTLRESGPALVKPTQTLTL TCTFSGFSLSKSVMGVSWIR QPPGKALEWLAHIYWDDDKY YWPSLKSRLTISKDTSKNQV VLTMTNMDPVDTATYYCARR GIRS AMDYVJGQGTTVTVSS 連接子 SEO ID NO:21 ASTKGP MAB2.5VH SEQ ID NO:47 BYQLVQSGTEVKKPGESLKI SCKGSGYTVTSYWIGWVRQM PGKGLEWMGFIYPGDSETRY SP T FQGQVTISADKS FNTAF LQWS S LKAS DTAMYYC ARVG SGWYPYTFDIWGQGTMVTVS S CH SEQ ID NO:49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLySLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN 283 - 160878.doc 201242977 表8 :能夠結合PGE2、IL-12及IL-18之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列 蛋白質區 序列識別號 12345678901234567890 STYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVVTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK TVD-Ig 002輕可變異 SEQ ID NO:58 DVLMTQTPLSLPVTPGEPAS ISCTSSQNIVHSNGNTYLEW YLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQVSHVP YTFGGGTKVEIKRTVAAPEI VMTQSPATLSVSPGERATLS CRASESISSNLAWYQQKPGQ AP RL FIY rAS TRATDIPARF SGSGSGTEFTLTISSLQSED FAVYY CQQYNNWPSITFGQG TRLEIKRTVAAPDIVMTQSP DSLAVSLGERATINCKASQS VSNDVAWYQQKPGQPPKLLI YYASNRYTGVPDRFSGSGSG TDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQDYNSPWTFGGGTKVEIKR 2B5 SEQIDNO:53 DVLMTQTPLSLPVTPGEPAS ISCTSSQNIVHSNGNTYLEW YLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQVSHVP YTFGGGTKVEIKR 連接子 SE01D NO: 13 TVAAP 1D4.1 VL SEQ IDNO:59 DIVMTQSPDSLAVSLGERAT INCKASQSVSNDVAWYQQKP GQPPKLLIYYASNRyTGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQA EDVAVYYCQQDYNSPWTFGG GTKVEIKR 連接子 SEO ID NO:13 TVAAP MABVL SEQIDNO:60 EIVMTQSPATLSVSPGERAT LSCRASESISSNLAWYQQKP GQAPRLFIYTASTRAXDIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDFAVYYCQQYNNWPSITFG QGTRLEIKR CL SEQIDNO:54 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS 284 160878.doc 201242977 表8 :能夠結合PGE2、IL-12及IL-18之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 12345678901234567890 蛋白質區 FNRGEC 實例1.2:表徵三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig) 實例1.2.1 : TVD-Ig之尺寸排阻層析及質譜分析 經純化之 TVD-Ig 〇〇1 及 TVD-Ig 002 於 10 mM Na2HP04、 10 mM檸檬酸鈉（pH 6.0)中稀釋至濃度0.2 mg/ml且施加50 ml 於 Supedex 200 10/300 GL 管柱（Amersham Bioscience， Piscataway，NJ)上。l〇A 型號之 HPLC 儀器（Shimadzu， Columbia，MD)用於SEC。移動相緩衝液為211 mM Na2S04、92 mM Na2HP04、5 mM NaZ3(pH 7.04)。所有 蛋白質皆使用紫外偵測在280 nm及214 nm下測定。溶離為 在0.75 mL/min之流速下之等度溶離。SEC概況指示TVD-Ig 001與TVD-Ig 002兩者展現分別為77%及86%之主要單體 峰，有少量聚集物。未偵測到較小片段。 為測定TVD-Ig蛋白質之重鏈及輕鏈分子量，用1.〇 μ DTT(5 μΙ〇 還原 10 μΐ TVD-Ig 001 或 TVD-Ig 002(0.1 mg/ml)。Videx C4 300 A 1 mm 4072041 管柱（The Nest Group，Southboro，MA)用於分開重鏈及輕鏈管柱。Agilent 1200 與質譜儀 Agilent 6210 飛行時間 LC/MS(Agilent Technologies Inc·, Palo Alto，CA)—起使用。緩衝液 A為 0.01% TFA、0.1% FA於HPLC級H20 中。缓衝液B為 0.01% TFA、0.1% FA於ACN中。流速為50 mL/min，且樣品注射 ’160878.doc •285 - 201242977 體積為2.0 mL。所有MS原始資料皆使用Agilent MassHunter軟體分析。基於質譜結果，TVD-Ig 001之HC分 子量為78119道爾頓（dalton)，與理論分子量78115道爾頓 一致。同樣，TVD-Ig 001之LC分子量為48625道爾頓，與 理論分子量48624道爾頓一致。TVD-Ig 002之HC分子量為 78119道爾頓，與理論分子量78115道爾頓一致。同樣， TVD-Ig之LC分子量為48781道爾頓，與理論分子量48780 道爾頓一致。 實例 1.2.2 :藉由 Biacore分析測定IL-12/IL-18/PGE2 TVD _ Ig之IL-12或IL-18結合親和力 藉由根據製造商說明書及標準程序使用BIAcore系統 (Biacore AB，Uppsala, Sweden)進行表面電漿子共振（SPR) 來量測經捕捉之TVD-Ig分子（經由山羊抗人類IgG捕捉於生 物感測器基質上之人類TVD-1218PGE2或TVD-PGE21218) 與重組IL-12或IL-18之間的即時結合相互作用。簡言之， 重組IL-12或IL-18於HBS操作緩衝液（Biacore AB)中稀釋且 50 μΐ等分試樣在5 ml/min之流速下注射穿過經固定蛋白質 隹 基質。所用重組IL-12或IL-18之濃度為62.5、125、187.5、 250 ' 375、500 ' 750、1000、1500及 2000 nM ° 為確定解 離常數（解離速率）、締合常數（締合速率），使用BIAcore動 力學評估軟體（第3.1版）。 實例1·2·3 : 藉由放射免疫分析（RIA)測定IL-U/IL-18/PGE2 TVD Ig之PGE2結合親和力 藉由使用3H-PGE2進行放射免疫分析來測定抗IL-12/IL-
160S78.doc -286- S 201242977
18/PGE2 TVD_Ig對PGE2之結合親和力。各盤用5 pg/ml之 山羊抗人類IgG(Fc)塗佈。TVD-1218PGE2或TVD-PGE21218於 PBST+10% Superblock 中稀釋至 0.04 pg/mL且 各50 μΐ添加至預阻斷ELISA盤之各孔（每孔2 ng)中且在室 溫下培育1小時。用PBS + 0.1%吐溫-20(Tween-20)洗滌各孔 3次。前列腺素E2 [5,6,8，11，12，14，15-3Η(Ν)](ΝΕΤ-428， PerkinElmer)於 PBST+10% Superblock 中稀釋至 6 ηΜ(2χ儲 備液）至不同濃度（20 ηΜ、10 nM、5 ηΜ、2.5 ηΜ、1.25 ηΜ、0.625 ηΜ、0.3125 ηΜ、0.156 ηΜ、0.078 ηΜ、0.039 ηΜ、0.019 ηΜ、0.0098 ηΜ)且添加至盤中以在室溫下培育 1小時》用PBST+10% Superblock洗滌各孔6次且添加50 μΐ 閃爍流體至各孔中。使用TopCount讀取器來讀取各盤。 實例1.2.4 : 使用細胞基生物分析進行功能分析 IL-12結合ELISA :首先藉由ELISA測定TVD-Ig與IL-12 之結合。用Superblock預阻斷經Reacti-bind抗生蛋白鍵菌 素塗佈之96孔盤（Pierce目錄號15124)。各盤用lx PBST洗 滌五次。經生物素標記之IL-12於10% superblock/PBST中 稀釋至100 ng/ml且添加100 ml至各孔中。各盤在室溫下培 育2小時且接著用lx PBST洗滌五次。對照抗體（人類IgG及 1D4.1)及 TVD-Ig 稀釋至 1000 ng/ml 且於 10% SB/PBST 中 1:3 連續稀釋。以每孔100 ml添加樣品至盤中且在室溫下培育 1小時。接著洗滌各盤五次。接著以每孔丨〇〇 ml添加 1:10,000稀釋之山羊抗人類IgG(H & L)Pierce #31410。各 盤在室溫下培育1小時且接著洗滌五次。接著使用1步 160878.doc -287- 201242977 TMB(Pierce #34028)，在室溫下培育15分鐘來使各盤顯 色，隨後用2 N硫酸終止。在分光光度計上在OD 450 nm下 讀取各盤。使用S形曲線擬合分析自結合曲線確定EC50 值。 PGE2生物分析：為測定TVD-Ig針對PGE2之效能，使用 EP4 HEKG al6#2細胞進行FLIPR分析。EP4 HEKG al6#2 細胞以每孔3E4個細胞塗鋪在黑色/透明聚D-離胺酸盤 (Corning #3667)中。細胞在室溫下培育15分鐘，隨後進行 平穩沈降*各盤在37艺、5% C02下培育隔夜。在使用之前 30分鐘開啟 FLIPR» 製備由1><1^88(1訂“1'(^611#14065-056)、20 mM HEPES(Invitrogen #15630-080)、0.1% BSA 及 2.5 mM 丙續舒（Probenecid)(Sigma #P-8761)組成之 FLIPR 緩衝液。藉由添加10 mL水至Mol Dev不洗滌染料粉末中來 製備l〇x不洗滌染料儲備液且加以渦旋。不洗滌染料儲備 液於FLIPR緩衝液中1:10稀釋。自各盤移除培養基且每孔 添加80 ml lx染料。樣品在室溫下在緩慢搖擺器上培育1.5 小時。使用FLIPR緩衝液自5 mM之儲備濃度稀釋含PGE2 之200標準酒度（proof)乙醇。抗體（或TVD-Ig)於FLIPR緩衝 液中稀釋至1000 ng/ml。抗體（或TVD-Ig)以1:3連續稀釋。 組合PGE2與抗體（或TVD-Ig)且於FLIPR緩衝液中稀釋。向 各孔中添加20 ml PGE2/抗體且在FLIPR上讀取樣品。 KG-1生物分析：藉由KG-1分析量測TVD-Ig針對rhIL-18 之效能。KG-1細胞株為人類急性骨髓性白血病細胞株 (ATCC 目錄號 CCL-246) 0 於完全 RPMI 1640(10% FBS、2
160878.doc • 288· S 201242977 mM L-麵酿胺酸、50單位/毫升青黴素（penicillin)、50 mg/ml鍵黴素（streptomycin)及0.075%碳酸氫鈉）中製備mAb 2.5或TVD-Ig之連續稀釋液。抗體稀釋液與重組人類IL-18(2 gg/mL)—起以100 μΐ在37°C下於96孔組織培養盤 (Costar #3599)中預培育1小時。在20 ng/mL TNF-a存在下 以每孔1.0-3.〇χ105個細胞之密度添加KG-1細胞（100 μΐ)且 在37°C、5% C02下培育16-20小時。在培育之後，收集不 含細胞之上清液且藉由標準ELISA(R&D Systems)量測人類 IFN-γ之含量。相對於2 ng/ml rIL-18對照將抑制百分比相 對於抗體濃度繪圖。使用S形曲線擬合分析自抑制曲線確 定IC5Q值。 人類IL-12生物分析：人類IFN-γ係由PHA母細胞反應於 人類IL-12刺激以濃度依賴性方式釋放。為測定中和效 能，在分析中在200 pg/mL rhIL-12存在下在le-7 Μ至le-14 Μ之最終濃度範圍下測試TVD-Ig。50 μΐ^ TVD-Ig與50 μ!^ 人類IL-12—起在37°C下於RPMI完全培養基中在96孔平底 微量滴定盤中預培育1小時。解凍冷凍PHA母細胞且於培 養基中洗滌兩次，且接著進行錐蟲藍（trypan blue)計數。 細胞於培養基中調整至密度2.5e6個細胞/毫升。隨後’添 加100 pL PHA母細胞至TVD-Ig+IL-12混合物中。人類IL-12在 分析中 之最終 濃度為 200 pg/mL 。 混 合物在 37°C 、 5% C02下培育18小時，此後藉由人類IFN-γ ELISA量測IFN-γ 在上清液中之含量。由使用GraphPad Prism軟體將IFN-γ濃 度相對於Ig(TVD-Ig 003或單株抗體）濃度（S形曲線劑量反 160878.doc -289- 201242977 應）繪圖來產生ic5〇值。一式四份進行各量測，且各實驗最 少進行兩次。 表9 :藉由抗 IL12 ELISA 表徵 TVD-Ig 001 及 TVD-Ig 002
Ig ED50 (nM) 對照單株抗體 0.38 TVD-Ig 001 0.66 TVD-Ig 002 ΝΑ 表10 :藉由細胞基生物分析表徵TVD-Ig 001及TVD-Ig 002 中和效能（IC50，nM)
Ig IL-12 IL-18 PGE2 對照單株抗體 0.624 0.58 0.03 TVD-Ig 001 0.559 0.29 0.074 TVD-Ig 002 ΝΑ 0.21 0.05 N/A :在測試之TVD-Ig濃度範圍内未觀測到可偵測活性。 初始IL-12結合ELIS A結果指示TVD-Ig 001能夠以類似於 親本單株抗體1.D4.1之ED5〇的ED5。結合IL-12(表9)，而此 方法未偵測到TVD-Ig 002與IL-12之結合。在隨後細胞基 生物分析中，證實TVD-Ig 001能夠中和IL-12、IL-1 8及 PGE2，效能類似於親本單株抗體之效能（表10)。類似於 ELISA資料，在IL-12生物分析中在測試之濃度範圍内未觀 測到TVD-Ig 002對IL-12之抑制。然而，TVD-Ig 002具有 中和IL-1 8與PGE2兩者之活性，效能類似於兩種親本單株 抗體之效能（表10)。 EP4分析：在Ca++通量分析中使用於HEK293 Gal6細胞 中穩定轉染之人類EP4測定抗PGE2抗體及含有抗PGE2之 抗IL-12/IL-18/PGE2 TVD-Ig分子抑制PGE2之細胞反應之 160878.doc -290- 201242977 能力。將細胞塗鋪在黑色/透明聚-D-離胺酸盤（Corning #3667)中且與Ca++敏感性染料（Molecular Devices) —起培 育90分鐘。用FLIPR緩衝液（含有lxHBSS、20 mM HEPES、0.1% BSA及2.5 mM丙磺舒）稀釋儲備PGE2(於200 標準酒度乙醇中）。亦於FLIPR緩衝液中預稀釋抗PGE2抗 體、TVD-1218PGE2、TVD-PGE21218或同型匹配對照抗 體。向預塗鋪有細胞之孔中添加25 μΐ PGE2或預培育之 PGE2/抗體混合物或預培育之PGE2/TVD-Ig蛋白質混合 物。藉由PGE2之連續滴定來進行PGE2之劑量反應且使用 FLIPR1 或 Tetra(Molecular Devices)加以測定。使用 GraphPad Prism 5確定EC5〇。對於測試抗體及TVD-Ig蛋白 質，將EC5〇濃度下之PGE2與不同濃度之測試物品或同型 匹配抗體（陰性對照）一起培育20分鐘，添加至於HEK293 Gal6細胞中之裝載染料之人類EP4中。使用FLIPR1監測 Ca++通量且使用GraphPad Prism 5分析資料0
HuPBMC-SCID小鼠模型：IL-12與IL-18兩者均為反應 於各種刺激物產生最佳IFNy所需。使用huPBMC-SCID小 鼠模型測定抗IL-12/IL-18 DVD-Ig之活體内生物活性。在 此模型中，腹膜内或靜脈内注射抗IL-12抗體（1D4.1)、抗 IL-18抗體（mAb 2.5)、DVD lD4.1-mAb、TVD-1218PGE2 或TVD-PGE21218(每隻小鼠250 mg)，隨後腹膜内轉移新 鮮純化之人類PBMC(huPBMC)至SCID小鼠中。十五分鐘 後，小鼠用乾燥金黃色葡萄球菌細胞（SAC)攻擊以誘導人 類IFNy產生。18-20小時後處死動物（n=7-8/組）且藉由 160878.doc -291 - 201242977 ELISA測定血清huIFNγ含量。lD4·l及mAb2.5通常抑制 SAC誘導之IFNy約70%，此表示此模型中用各化合物達成 之最大IF]S[y抑制。然而，預期用lD4.1+mAb 2.5及TVD-1218PGE2 或 TVD-PGE21218 處理小鼠幾乎 100%抑制 IFNy 產生。 角又菜谬（Carrageenan)誘導之爪水踵模型：藉由確定 角叉菜膠誘導之爪水腫來評估小鼠抗PGE2抗體2B5-8.0、 TVD-1218PGE2或TVD-PGE21218之活體内功效。與先前 所述（Joseph P. Portanova 等人 J. Exp. Med. 184: 883-891 (1996)類似，用角又菜膠誘導爪發炎。在攻擊之前18小時 用抗 PGE2 抗體或 TVD-1218PGE2 或 TVD-PGE21218 分子 (30-1 mg/kg)對雌性C57BL/6N小鼠腹膜内給藥且接著在 T=0時在足墊中進行皮内注射，其中在左墊中用30 mL 0.9%生理食鹽水或在右墊中用含0.5% 1-角叉菜膠之〇.9°/〇 生理食鹽水（FMC Corp.，Rockland，ME)。在2及4小時時藉 由彈簧卡鉗量測水腫且計算為經攻擊足之厚度變化減去對 照足之厚度變化。在處理結束時使小鼠安樂死且收集血清 以量測蛋白質含量。 實例1.2.5 : IL-12/IL-18/PGE2 TVD Ig之藥物動力學及藥 力學研究 在雄性史泊格多利（Sprague-Dawley)大鼠中評估TVD-1218PGE2或TVD-PGE21218及親本單株抗體1D4」、mAb 2.5及Hu2B5.7之藥物動力學性質。經由頸靜脈套管或在背 側皮膚下皮下以4 mg/kg之單一靜脈内劑量向雄性sd大鼠 】60878.doc -292· 201242977 投與TVD-Ig及mAb。歷經37天之時期在不同時間點收集血 清樣品且藉由人類IL-12捕捉及/或人類IL-18捕捉ELISA及 生物素-PGE2 ELISA加以分析。簡言之，ELISA盤用山羊 抗生物素抗體（5 pg/ml，4°C ，隔夜）塗佈，用 Superblock(Pierce)阻斷，且與經生物素標記之人類IL-12(IL-12 捕捉 ELISA)或 IL-18(IL-18 捕捉 ELISA)或生物素-PGE2(PGE2 ELISA) — 起在室溫下在 50 ng/ml 下於.10% Superblock TTBS中培育2小時。連續稀釋血清樣品（0.5%血 清、10% Superblock於TTBS中）且在室溫下在盤上培育30 分鐘。用經HRP標記之山羊抗人類抗體進行偵測，且藉助 於使用四參數邏輯擬合之標準曲線來確定濃度》 實例2 :產生識別TNF、IL-13及IL-18之三重可變異域免 疫球蛋白（TVD-Ig 003) 先前揭示親本結合蛋白（亦即單株抗體抗hIL-18(mAb 2.5))及抗 TNF/IL-13 DVD-Ig 分子 D2E7-SL-13C5.5L3F» 此 三種單株抗體之VL/VH域藉由重疊PCR經由短連接子（VL 之連接子序列為TVAAP且VH之連接子序列為ASTKGP)在 HC 與 LC 兩者中均以 5，VD(D2E7)-SL-VD(13C5.5L3F)-SL-VD(mAb 2.5)，隨後為恆定區之域順序融合在一起，稱為 TVD-Ig 003。PCR選殖、表現及純化方法之程序類似於對 於TVD-Ig 001及TVD-Ig 002所述者，例外之處為引子序列 歸因於VL/VH序列差異而不同。 實例2.1: 構築、表現及純化三重可變異域免疫球蛋白 (TVD-Ig003) 160878.doc -293 - 201242977 為產生輕鏈構築體TVD-Ig 003，使用特異性引子17及18 對02£7-51^13€5.5[3?0¥0-1§之¥1^域進行？01擴增；同 時使用特異性引子19及20擴增抗IL-18抗體mAb 2.5之VL 域。兩個PCR反應均係根據標準PCR技術及程序進行。凝 膠純化兩種PCR產物且一起用作使用標準PCR條件及引子 17及19進行之後續重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標 準同源重組方法將重疊PCR產物次選殖入經FspAl及Sal I 雙重消化之pHybE-hCg mut(234、235)z non-a哺乳動物表 現載體（Abbott)中。 為產生重鏈構築體TVD-Ig 003，使用特異性引子21及22 對 D2E7-SL-13C5.5L3F DVD-Ig之 VH域進行 PCR擴增；同 時使用特異性引子23及24擴增抗IL-18抗體mAb 2.5之VH 域。兩個PCR反應均係根據標準PCR技術及程序進行。凝 膠純化兩種PCR產物且一起用作使用標準PCR條件及引子 21及23進行之後續重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標 準同源重組方法將重疊PCR產物次選殖入經BsiW I及Nru I 雙重消化之pHybE-hCk哺乳動物表現載體（Abbott)中。 引子 17 : 5，-AGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCC-3(SEQ ID NO:61) 引子 18 : 5，-CACTATTTCAGGAGCTGCAACTGTCCGCTTGATCTCC ACCTTGG-3'(SEQ ID NO:62) 引子 19 : 5'-TCCAGATTTCAACTGCTCATCAGA-3'(SEQIDNO:63) 3'(SEQ ID NO:64) 201242977 引子21 : 5'-AGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCG-3(SEQ ID NO:65) 引子22 : 5’-CACCTCAGGTCCTTTAGTGCTTGCGCTGCTCACGGT CACCAGGG-3'(SEQ ID NO:66) 引子 23 : 5，-TGTGCCCCCAGAGGTGCTCTTGGAGGA-3’(SEQ ID NO:67) 引子24 : 5'-GCAAGCACTAAAGGACCTGAGGTGCAGCTGGTGCA GTC-3'(SEQ ID NO:68)
表11:能夠結合TNF、IL-13及IL-18之TVD-Ig 003之胺基 酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 12345678901234567890 蛋白質區 TVD-Ig 003重可變異 SEQIDNO:69 EVQLVESGGGLVQPGRSLRL SCAASGFTFDDYAMHWVRQA PGKGLEWVSAITWNSGHIDY ADSVEGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVS YLSTASSLDYWGQGTLVTVS SASTKGPEVTLRESGPGLVK PTQTLTLTCTLYGFSLSTSD MGVDWIRQPPGKGLEWLAHI WWDDVKRYNPALKSRLTISK DTSKNQWLKLTSVDPVDTA TYYCARTVSSGYIYYAMDYW GQGTLVTVSSASTKGPEVQL VQSGTEVKKPGES LKISCKG SG YTVTS YWIGWVRQMPGKG LEWMGFIYPGDSETRYSPTF QGQVTISADKSFNTAFLQWS SLKASDTAMYYCARVGSGWY PYTFDIWGQGTMVTVSS D2E7VH SEQIDNO:70 EVQLVESGGGLVQPGRSLRL SCAASGFTFDDYAMHWVRQA PGKGLEWVSAITWNSGHIDY ADSVEGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVS YLSTASSLDYWGQGTLVTVS S 295- 160878.doc 201242977 表11:能夠結合TNF、IL-13及IL-18之TVD-Ig 003之胺基 酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 12345678901234567890 蛋白質區 連接子 SEO IDNO:21 ASTKGP 13C5.5L3F VH SEQIDNO:71 EVTLRESGPGLVKPTQTLTL TCTLYGFSLSTSDMGVDWIR QPPGKGLEWLAHIWWDDVKR YNPALKSRLTISKDTSKNQV VLKLTSVDPVDTATYYCART VSSGYIYYAMDYWGQGTLVT VSS 連接子 SEO ID NO:21 ASTKGP MAB 2.5 VH SEQ ID NO:47 EVQLVQSGTEVKKPGESLKI SCKGSGYTVTSYWIGWVRQM PGKGLEWMGFIYPGDSETRY SPTFQGQVTISADKSFNTAF LQWS SLKAS DTAMYYCARVG SGWYPYTF DIWGQGTMVTVS S CH SEQ ID NO:49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFVPSDr AVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK 296- 160878.doc 201242977 表11:能夠結合TNF、IL-13及IL-18之TVD-Ig 003之胺基 酸序列
蛋白質 蛋白質區 序列識別號 序列 12345678901234567890 TVD-Ig 003輕可變異 SEQIDN0:72 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT ITCRASQGIRNYLAWYQQKP GKAPKLLIYAASXLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDVATYYCQRYNRAPYTFGQ GTKVEIKRTVAAPDIQMTQS PSSLSASVGDRVTISCRASQ DIRNYLNWYQQKPGKAPKLL IFYTSKLHSGVPSRFSGSGS GTDYTLTISSLQPEDIATYY CQQGLTPPLTFGGGTKVEIK RTVAAPEIVMTQSPATLSVS PGERATLSCRASESISSNLA WYQQKPGQAPRLFIYTASTR ATDIPARFSGSGSGTEFTLT ISSLQSEDFAVYYCQQYNNW PSITFGQGTRLEIKR D2E7 VL SEQIDNO：73 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT ITCRASQGIRNYLAWYQQKP GKAPKLLIYAASTLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDVATYYCQRYNRAPYTFGQ GTKVEIKR 連接子 SEOIDNO:13 TVAAP 13C5.5L3F VL SEQ ID NO:74 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT ISCRASQDIRNYLNWYQQKP GKAPKLLIFYTSKLHSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDIATYYCQQGLTPPLTFGG GTKVEIKR 連接子 SEOID NO:13 TVAAP MAB 2.5 VL SEQIDNO:52 EIVMTQSPATLSVSPGEE^AT LSCRASESISSNLAWYQQKP GQAPRLFIYTASTRATDIPA RFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDFAVYY CQQYNNWP SITFG QGXRLEIKR CL SEQIDNO:54 TVAAPSVFIFPPSDEQLECSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC 實例2.2: 表徵多（亦即三）可變異域免疫球蛋白分子 (TVD-Ig 003) 實例2.2.1 : TVD-Ig 003之尺寸排阻層析及質譜分析 - 297· 160878.doc 201242977 如對於TVD-Ig 001及TVD-Ig 002所述，藉由SEC及MS分 析經純化之TVD-Ig 003。TVD-Ig 003在SEC上展現單體概 況，顯然以均質蛋白質形式存在（96.9%單體）。基於質譜 結果，TVD-Ig 003之HC分子量為78854道爾頓，與理論分 子量78873道爾頓一致。同樣，LC分子量為48047道爾頓， 與理論分子量48060道爾頓一致。 實例2.2.2:測定TVD-Ig之生物活性 為確定TVD-Ig是否能夠抑制TNF、IL-13或IL-8介導之信 號傳導，使用3種細胞基生物分析： L929生物分析：L929細胞在補充有2 mM 1-麩醯胺酸、 及經調整以含有1.5 gA碳酸氫鈉之俄勒氏平衡鹽溶液 (Earle’s balanced salt solution)、0.1 mM非必需胺基酸、 1.0 mM丙酮酸鈉、1.0% FBS及50 pg/ml健大徽素 (gentamycin)之伊格爾氏最低必需培養基（Eagle's minimal essential medium)中增殖。細胞在整個研究中皆維持在 37°C及5% C02下。添加於完全生長培養基中總計35,000個 L929細胞至96孔盤之各孔中且生長隔夜。為評估TVD-Ig 003及D2E7之中和效能，樣品（在le-7 Μ至le-14 Μ之各種 濃度下）與TNF-a(350 pg/ml)—起在室溫下預培育30分鐘。 在TNF-α處理之前即刻移除生長培養基且用0.5體積含有 10°/〇 FBS及1 pg/ml放線菌素D之伊格爾氏最低必需培養基 替換。接著在更換培養基之後即刻添加TNF-a-TVD-Ig 003 複合物至盤中以使細胞暴露於放線菌素D不超過1 5分鐘。 接著在37°C下培育L929細胞20-24小時。次日，添加20 μΐ 160878.doc -298 - 201242977 WST-1至各孔中且在37°C下再培育4小時，並接著讀取 〇〇450。藉由使用卩1^81113.02軟體（〇1&卩11?3(1，3&11〇16§0)自 此等讀數確定IC5〇。一式四份進行各量測，且各實驗最少 進行兩次。 KG-1生物分析：如章節1.2.4中所述。 A-549生物分析： A-549細胞（ATCC目錄號CCL-185，在含有10%胎牛血清 且補充有1% L-麩醯胺酸、1%碳酸氫鈉、50單位/毫升青黴 素及50 mg/mL鏈黴素之F12基本培養基中培養）為在TNF存 在下反應於IL-13產生TARC之人類肺癌上皮細胞。其於 100 pL體積中以每孔（96孔盤）2χ105個細胞塗鋪且在37°C、 5% C02下培育隔夜。在培育隔夜16-20小時之後，移除原 始100 μΐ培養基接種體積且用200 μΐ^含有rhTNF-a(200 ng/mL)、hIL-1.3(5 ng/mL)及各種濃度之 TVD-Ig 003 或對 照單株抗體13C5.5L3F(le-7 Μ至le-14 Μ)之新鮮培養基替 換。在培育16-20小時之後，收集孔内含物以使用標準 ELIS A(R&D Systems)測定hTARC含量。藉由計算由使用 GraphPad Prism軟體將TARC濃度相對於Ig(TVD-Ig 003 或 單株抗體）濃度（S形曲線劑量反應）繪圖產生之IC5〇值來測 定TVD-Ig 003及13C5.5L3F之中和效能。一式四份進行各 量測，且各實驗最少進行兩次。 基於使用針對TNF、IL-13及IL-18之3種不同生物分析進行 之功能表徵，證實TVD-Ig 003能夠抑制TNF、IL-13及IL-18， 效能類似於親本結合蛋白，例如單株抗體之效能（表12)。 160878.doc •299- 201242977 表12 :藉由特異性細胞基生物分析表徵TVD-Ig 003針對 TNF、IL-13及 IL-18之中和欵能（IC5〇，nM)
Ig TNF IL-13 IL-18 TVD-Ig 003 0.05 0.12 0.16 對照單株抗體 0.02 0.05 0.10 實例3:構築、表現及純化識別CD3、EGFR及IGF1R之 三可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)分子 親本單株抗體抗CD3、抗EGFR及抗IGF1R用於構築 TVD-Ig 003a及TVD-Ig 004。此三種單株抗體之Vl/VH域 藉由重疊PCR經由短連接子（VL之連接子序列為TVAAP且 VH之連接子序列為ASTKGP)在HC與LC兩者中均以 5’VD(CD3)-SL-VD(EGFR)-SL-VD(IGF1R)，隨後為恆定區 之域順序融合在一起，稱為TVD-Ig 003a。亦在HC與LC兩 者中均以 5'VD(CD3)-SL-VD(IGF1R)-SL-VD(EGFR)，隨後 為恆定區之域順序產生不同TVD-Ig(TVD-Ig 004)。PCR選 殖、表現及純化方法之程序類似於對於TVD-Ig 001及 TVD-Ig 002所述者，例外之處為引子序列歸因於VL/VH序 列差異而不同。 實例3.1: 構築、表現及純化三重可變異域免疫球蛋白 (TVD-Ig003a 及 TVD004)
為產生輕鏈構築體TVD-Ig 〇〇3a，使用特異性引子28及 25對CD3抗體之VL域進行PCR擴增；同時使用特異性引子 26 及 27 擴增 EGFR SL-IGF1R DVD-Ig 之 VL 域。兩個 PCR 反 應均係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR
160878.doc -300- S 201242977 產物且一起用作使用標準PCR條件及引子27及28進行之後 續重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法 將重疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之 pHybE-hCk哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為產生重鏈構築體TVD-Ig 003a，使用特異性引子32及 29對EGFR-SL-IGFR DVD-Ig之VH域進行PCR擴增；同時 使用特異性引子31及30擴增抗CD3抗體之VH域。兩個PCR 反應均係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種 PCR產物且一起用作使用標準PCR條件及引子29及30進行 之後續重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組 方法將重疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之 pHybE-hCgl z-non-a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為產生輕鏈構築體TVD-Ig 004，使用特異性引子28及34 對CD3抗體之VL域進行PCR擴增；同時使用特異性引子33 及27擴增IGF1R SL-EGFR DVD-Ig之VL域。兩個PCR反應 均係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產 物且一起用作使用標準PCR條件及引子27及28進行之後續 重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將 重疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之pHybE-hCk哺乳動物表現載體（Abbott)中。
為產生重鏈構築體TVD-Ig 004，使用特異性引子36及29 對IGF1R-SL-EGFR DVD-Ig之VH域進行PCR擴增；同時使 用特異性引子35及30擴增抗CD3抗體之VH域。兩個PCR反 應均係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR 160878.doc -301 · 201242977 產物且一起用作使用標準PCR條件及引子29及30進行之後 續重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法 將重疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之 pHybE-hCgl z-non-a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 引子25 : TVD003a VL 3'内部 TACAGGACTTTGTGTCAGAAGGATATCAGGAGCTGCGACGG TGCGATTGATCTCAAGCTTAGTGCCACTA(SEQ ID NO: 173) 引子26 : TVD003a VL5’内部 TAGTGGCACTAAGCTTGAGATCAATCGCACCGTCGCAGCTCC TGATATCCTTCTGACACAAAGTCCTGTA(SEQ ID NO: 174) 引子27 : TVD-VL-CD3 3'外部 GTCGAGGTCGGGGGATCCGGCCTTGCCGGCCTCGA(SEQ ID NO:175) 引子28 : TVD-VL-CD3 5'外部 CGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGT (SEQ ID NO:176) 引子 29 : TVD VH-CD3 3’外部 GTCGAGGTCGGGGGATCCGGCCTTGCCGGCCTCGA(SEQ ID NO:177) 引子30 : TVD-VH CD3 5'外部 ACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATT TTA(SEQ ID NO:178) 引子31 : TVD003 VH 3·内部
GGCCCGCTCTGTTTGAGCTGAACCTGAGGCCCTTTCGTGGA 160878.doc - 302 - s 201242977 GGCGGAGGACACGGTCAGAGTGGTACCCT(SEQ ID NO: 179) 引子32 ·· TVD003 VH 5'内部 AGGGTACCACTCTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACGAAAGGG CCTCAGGTTCAGCTCAAACAGAGCGGGCC(SEQ ID NO: 180) 引子33 : TVD004 VL 5·内部 TAGTGGCACTAAGCTTGAGATCAATCGCACCGTCGCAGCTCC TGATATCCAGATGACTCAGTTTCCCAGC(SEQ ID NO: 181) 引子34 : TVD004 VL3'内部
GCTGGGAAACTGAGTCATCTGGATATCAGGAGCTGCGACGG TGCGATTGATCTCAAGCTTAGTGCCAC：TA(SEQ ID NO: 182) 引子35 : TVD004 VH 3'内部 GCCGCCCCCGGACTCAAGGAGCTGCACCTCAGGCCCTTTCG TGGAGGCGGAGGACACGGTCAGAGTGGTACC(SEQ ID NO: 183) 引子36 : TVD004 VH 5’内部 GGTACCACTCTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACGAAAGGGCCT GAGGTGCAGCTCCTTGAGTCCGGGGGCGGC(SEQ ID NO: 184) 表13 :能夠結合CD3、EGFR及IGF1R之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 12345678901234567890 蛋白質區 TVD-Ig 003a重可變異 SEQ ID NO:185 QVQLQQSGAELARPGASVKM SCKA.SGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSSA STKGPQVQLKQSGPGLVQPS QSLSITCTVSGFSLTNYGVH WVRQSPGKGLEWLGVIWSGG NTDYNTPFTSRLSINKDNSK -303· 160878.doc 201242977 表13 :能夠結合CD3、EGFR及IGF1R之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 12345678901234567890 蛋白質區 SQVFFKMNSLQSNDTAIYYC ARALTYYDYEFAYWGQGTLV TVSAASTKGPEVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCTASGFTFS SYAMNWVRQAPGKGLEWVSA ISGSGGTTFYADSVKGRFTI SRDNSRTTLYLQMNSLRAED TAVTrCAKDLGWSDSYYYYY GMDVWGQGTTVTVSS CD3 VH SEQ ID NO:163 QVQLQQSGAELARPGASVKH S C KAS GY TF TRY TMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKS SSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSS . .. 連接子 SEOIDNO:21 ASTKGP EGFR VH SEQ ID NO:16S QVQLKQSGPGLVQPSQSLSI TCTVSGFSLTNYGVHWVRQS PGKGLEWLGVIWSGGNTDYN TPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALT YYDYEFAYWGQGTLVTVSA 連接子 SEO ID NO:21 ASTKGP IGF1R VH SEQIDNO:167 EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCTASGFTFSSYAMNWVRQA PGKGLEWVSAISGSGGTTFY ADSVKGRFTISRDNSRTTLY LQMNSLRAEDTAVYyCAKDL GWSDSYYYYYGMDVWGQGTT VTVSS CH SEQIDNO:49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVS HE DPE VKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN STVRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVKHEALHNHYT QKSLSLSPGK 304 160878.doc 201242977 表13 :能夠結合CD3、EGFR及IGF1R之TVD_Ig之胺基睃序列
蛋白質 序列. 蛋白質區 序列識別號 12345678901234567890 TVD-Ig 003a^可變異 SEQIDNO:186 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINRTVAAPDILLTQSP VILSVSPGERVSFSCRASQS IGTNIHWYQQRTNGSPRLLI KYASESISGIPSRFSGSGSG TDFTLSINSVESEDIADYYC QQNNNWPTTFGAGTKLELKR TVAAPDIQMTQFPSSLSASV GDRVTITCRASQGIRNDLGW YQQKPGKAPKRLIYAASRLH RGVPSRFSGSGSGTEFTLTI SSLQPEDFATYYCLQHNSYP CSFGQGTKLEIKR CD3VL SEQ IDNO:164 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINR 連接子 SEO ID NO:13 TVAAP EGFR VL SEQIDNO:166 DILLTQSPVILSVSPGERVS FSCRASQSIGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQNNNWPTTFGA GTKLELKR 連接子 SE〇IDNO:13 TVAAP IGF1R VL SEQ ID NO:168 DIQMTQFPSSLSASVGDRVT ITCRASQGIRNDLGWYQQKP GKAPKRLIYAASRLHRGVPS RFSGSGSGTEFTLTISSLQP EDFATYYCLQHNSYPCSFGQ GTKLEIKR CL SEQ IDNO:54 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC TVD-Ig004重可變異 SEQIDNO:187 QVQLQQSGAELARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSSA STKGPEVQLLESGGGLVQPG 305 · 160878.doc 201242977 表13 :能夠結合CD3、EGFR及IGF1R之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列 蛋白質區 序列識別號 12345678901234567890 GSLRLSCTASGFTFSSYAMN WVRQAPGKGLEWVSAISGS G GTTFYADSVKGRFTISRDNS RTTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKDLGWSDSYYYYYGMDVW GQGTTVTVSSASTKGPQVQL KQSGPGLVQPSQSLSITCTV SGFSLTNYGVHWVRQSPGKG LEWLGVIWSGGNTDYNTPFT SRLSINKDNSKSQVFFKMNS LQSNDTAIYYCARALTY YDY EFAYWGQGTLVTVSA CD3 VH SEQIDNO:163 QVQLQQSGAELARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSS 連接子 SEO ID NO:21 ASTKGP IGF1R VH SEQIDN0:167 EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCTASGFTFSSYAMNWVRQA PGKGLEWVSAISGSGGTTFY ADSVKGRFTISRDNSRTTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKDL GWSDSYYYYYGMDVWGQGTT VTVSS 連接子 SEOIDNO:21 ASTKGP EGFR VH SEQ ID NO:16S QVQLKQSGPGLVQPSQSLSI TCTVSGFSLTNYGVHWVRQS PGKGLEWLGVIWSGGNXDYN TPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALT YYDYEFAYWGQGTLVTVSA CH SEQ IDNO：49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK 306 160878.doc 201242977
表13 :能夠結合CD3、EGFR及IGF1R之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列 蛋白質區 序列識別號 12345678901234567890 TVD-Ig 004輕可變異 SEQ IDNO:188 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRAS S SVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMBAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINRTVAAPDILLTQSP VILSVSPGERVSFSCRASQS IGTNIHWYQQRTKGSPRLLI KYASESISGIPSRFSGSGSG TDFTLSINSVESEDIADYYC QQNNNWPTTFGAGTKLELKR TVAAPDILLTQSPVILSVSP GERVSFSCRASQSIGTNIHW YQQRXNGSPRLLIKYASESI SGIPSRFSGSGSGTDFTLSI NSVESEDIADYYCQQNNNl'iP TTFGAGTKLELKR CD3 VL SEQ ID NO:164 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINR 連接子 SEO ID NO:13 TVAAP IGF1RVL SEQ ID NO: 168 DILLTQSPVILSVSPGERVS FSCRASQSrGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQNNNWPTTFGA GTKLELKR 連接子 SEOIDNO:13 TVAAP EGFRVL SEQIDNO:l(>6 DILLTQSPVILSVSPGERVS FSCRASQSIGINIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQNNNWPTTFGA GTKLELKR CL SEQIDNO:S4 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC 實例3.2 :表徵三可變異域免疫球蛋白分子（TVD-Ig 003a) 實例3.2.1 : TVD-Ig 003a之尺寸排阻層析分析 如對於TVD-Ig 001及TVD-Ig 002所述，藉由SEC分析經 純化之TVD-Ig 003a。TVD-Ig 003a在SEC上展現單體概 160878.doc .307- 201242977 況，顯然以均質蛋白質形式存在（72.4%單體）。 實例3.2.2 : 使用重定向細胞毒性分析（rCTL分析）對TVD-Ig進行功能分析 為確定TVD-Ig是否能夠抑制重定向細胞毒性，使用2種 細胞基生物分析。 實例3.2.2a : FACS基重定向細胞毒性分析（rCTL分析） 人類CD3+ T細胞係藉由負性選擇富集管柱（R&D目錄號 HTCC-525)自先前冷凍之分離之PBMC分離。T細胞於完全 RPMI培養基（L-麩醯胺酸、55 mM β-ΜΕ、青黴素/鏈黴 素、10% FCS)中在經 10 pg/mL 抗 CD3(OKT-3，BD)及 2 pg/mL抗CD28(CD28.2，Abeam)塗佈之燒瓶中刺激4天。T細 胞於30 U/mL IL-2(Peprotech)中靜息隔夜，隨後用於分析 中。根據製造商說明書用PKH26(Sigma)標記DoHH2或Raji目 標細胞。在整個rCTL分析中皆使用含有L-麩醯胺酸及10% FBS(Hyclorie)之RPMI 1640培養基（無苯盼，invitrogen)。 效應T細胞（E)及目標（T)分別以每孔1〇5及1〇4個細胞塗鋪 於96孔盤（Costar #3799)中以得到1〇:1之E:T比率。適當稀 釋DVD-Ig分子以獲得濃度依賴性滴定曲線。在培育隔夜 之後’集結細胞且用PBS洗滌一次，隨後再懸浮於含有 0.1% BSA(Invitrogen)及 0.5 pg/mL 碘化丙錠（BD)之 PBS 中。在FACSCanto機器（BD)上收集FACS資料且在 Flowjo(Treestar)_ 加以分析。 計算DVD-Ig處理樣品中之活目標百分比除以總目標（對 照’未處理）百分比以測定特異性溶解百分比。將數據繪 160878.doc -308- 201242977 圖且在 Prism(Graphpad)中計算 IC50。 實例3.2.2b :阻抗(impedence)基重定向細胞毒性分析(rCTL·分析） 如上製備T細胞》使表現EGFR之目標細胞黏附於ACEA RT-CES 96 孔盤（ACEA Bio，San Diego)隔夜。效應 T 細胞 (E)及目標（T)接著以每孔2χ105及2χ104個細胞塗鋪以得到 10:1之Ε:Τ比率。適當稀釋DVD-Ig分子以獲得濃度依賴性 滴定曲線。DVD-Ig處理樣品中之目標之細胞指數除以對 照目標（未處理）之細胞指數以計算特異性溶解百分比。將 數據繪圖且在Prism(Graphpad)中計算IC50。 TVD003a之重定向細胞毒性數據可見於表16中。 實例4 : 構築、表現及純化識別CD3、EGFR及HER2之三 可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)分子 親本單株抗體抗CD3、抗EGFR及抗HER2用於構築TVD-Ig 005及TVD-Ig 006。此三種單株抗體之VL/VH域藉由重 疊PCR經由短連接子（VL之連接子序列為TVAAP且VH之連 接子序列為ASTKGP)在HC與LC兩者中均以5'VD(CD3)-SL-VD(EGFR)-SL-VD(Her2)，隨後為恆定區之域順序融合在 一起，稱為TVD-Ig 005。亦在HC與LC兩者中均以 5'VD(CD3)-SL-VD(Her2)-SL-VD(EGFR)，隨後為恆定區之 域順序產生不同TVD-Ig(TVD-Ig 006)。PCR選殖、表現及 純化方法之程序類似於對於TVD-Ig 001及TVD-Ig 002所述 者，例外之處為引子序列歸因於VL/VH序列差異而不同。 實例4.1: 構築、表現及純化三重可變異域免疫球蛋白 (TVD-Ig005 及 TVD006) 160878.doc -309- 201242977 為產生輕鏈構築體TVD-Ig 005，使用特異性引子28及25 對CD3抗體之VL域進行PCR擴增；同時使用特異性引子26 及27擴增EGFR SL-Her2 DVD-Ig之VL域。兩個PCR反應均 係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產物 且一起用作使用標準PCR條件及引子27及28進行之後續重 疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將重 疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之pHybE-hCk 哺乳動物表現載體（Abbott)中》 為產生重鏈構築體TVD-Ig 005，使用特異性引子32及29 # 對EGFR-SL-Her2 DVD-Ig之VH域進行PCR擴增；同時使用 特異性引子31及30擴增抗CD3抗體之VH域。兩個PCR反應 均係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產 物且一起用作使用標準PCR條件及引子29及30進行之後續 重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將 重疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之pHybE-hCgl z-non-a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為產生輕鏈構築體TVD-Ig 006，使用特異性引子28及3 9 · 對CD3抗體之VL域進行PCR擴增；同時使用特異性引子40 及27擴增Her2 SL-EGFR DVD-Ig之VL域。兩個PCR反應均 係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產物 且一起用作使用標準PCR條件及引子27及28進行之後續重 疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將重 疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之pHybE-hCk 哺乳動物表現載體（Abbott)中。 160878.doc •310·
S 201242977 為產生重鏈構築體TVD-Ig 006，使用特異性引子38及29 對Her2-SL-EGFR DVD-Ig之VH域進行PCR擴增；同時使用 特異性引子37及30擴增抗CD3抗體之VH域。兩個PCR反應 均係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產 物且一起用作使用標準PCR條件及引子29及30進行之後續 重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將 重疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之pHybE-hCgl z-non-a哺乳動物表現載體（Abbott)中。
引子37TVD006 VH3'内部 CTCCACCAGCTGGACCTCAGGCCCTTTCGTGGAGGCGGAGGA CACGGTCAGAGTGGT ACCCTGCCCCCAG(SEQ ID NO: 189) 引子38 : TVD006 VH 5’内部 CTGGGGGCAGGGTACCACTCTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACG AAAGGGCCTGAGGT CCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO: 190) 引子39 : TVD006 VL3’内部 TGGATGGACTTTGCGTCATCTGTATATCAGGAGCTGCGACGGT GCGATTGATCTCAAG CTTAGTGCCACT(SEQ ID NO:191) 引子40 : TVD006 VL 5·内部 AGTGGCACTAAGCTTGAGATCAATCGCACCGTCGCAGCTCCTG ATATACAGATGACG CAAAGTCCATCCA(SEQ ID NO: 192) 表14 :能夠結合CD3、EGFR及Her2之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 12345678901234567890 蛋白質區 TVD-Ig 005重可變異 SEQIDNO:193 QVQLQQSGAELARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHViVKQR 160878.doc -311 - 201242977 表14 :能夠結合CD3、EGFR及Her2之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列 蛋白質區 序列識別號 12345678901234567890 PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSSA STKGPQVQLKQSGPGLVQPS QSLSITCTVSGFSLTMYGVH WVRQSPGKGLEWLGVIWSGG NTDYNTPFTSRLSINKDNSK SQVFFKMNSLQSNDTAIYYC ARALTYYDYEFAYWGQGTLV TVSAASTKGPEVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFNIK DTYIHWVRQAPGKGLEWAR iyPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAED TAVYYC S RWGGDGFYAMDYW GQGTLVTVSS CD3VH SEQ ID NO:163 QVQLQQS GAE LARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKAXLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSS 連接手 SE〇 IDNO:21 ASTKGP EGFRVH SEQ IDNO:165 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSI TCTVSGFSLTNYGVHWRQS PGKGLEWLGVIWSGGNTDYN TPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALT YYDYEFAYWGQGTLVTVSA 遲接手 SE〇IDNO:21 ASTKGP HER2VH SEQ ID NO;171 EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFNIKDTYIHWVRQA PGKGLEWVARIYPTNGYTRY ADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWG GDGFYAMDYWGQGTLVTVSS CH SEQroNO:49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNH KPSNTKVDECKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
•312· 160878.doc 201242977 表14 :能夠結合CD3、EGFR及Her2之TVD-Ig之胺基睃序列
蛋白質 蛋白質區 序列識別號 序列 12345678901234567890 AVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK TVD-Ig 005輕可變異 SEQIDNO:194 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINRTVAAPDILLTQSP VILSVSPGERVSFSCRASQS IGTNIHWYQQRTNGSPRLLI KYASESISGIPSRFSGSGSG TDFTLSINSVESEDIADYYC QQNNNWPTTFGAGTKLELKR TVAAPDIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQDVNTAVAW YQQKPGKAPKLLIYSASFLY SGVPSRFSGSRSGTDFTLTI SSLQPEDrATYYCQQHYTTP PTFGQGTKVEIKR CD3VL SEQIDNO:164 QIVLXQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINR 速接子 SEO ID NO:13 TVAAP EGFR VL SEQ IDNO:166 DILLTQSPVILSVSPGERVS FSCRASQSIGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQNNNWPTTFGA GTKLELKR 連接子 SEO ID NO:13 TVAAP HER2VL SEQ ID NO:172 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT ITCRASQDVMTAVAWYQQKP GKAPKLLIYSASFLYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKR CL SEQ ID NO:54 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC TVD-Ig 006重可變異 SEQIDN0:19S QVQLQQSGAELARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY 160878.doc 313- 201242977 表14 :能夠結合CD3、EGFR及Her2之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列 蛋白質區 序列識別號 12345678901234567890 NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLXSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSSA STKGPEVQLVESGGGLVQPG GSLRLSCAASGFNIKDTYIH WVRQAPGKGLEWVARIYPTN GYTRYADSVKGRFTISADTS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYY CSRWGGDGFYAMDYWGQGTL VTVSSASTKGPQVQLKQSGP GLVQPSQSLSITCTVSGFSL TNYGVHWVRQSPGKGLEWLG VIWSGGNTDYNTPFTSRLSI NKDNSKSQVFFKMNSLQSND TAIYYCARALTYYDYEFAYW GQGTLVTVSA CD3 VH SEQ ID NO: 163 QVQL QQS GAE LARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLXVSS 連接子 SEO ID NO:21 ASTKGP HER2VH SEQIDNO:171 EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFNIKDTYIHWVRQA PGKGLEWVARIYPTNGYTRY ADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMN S L RAE D T A VYYC S RWG GDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 連接芋 SEO ID NO:21 ASTKGP EGFR VH SEQIDNO:165 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSI TCTVSGFSLTNYGVHWVRQS PGKGLEWLGVIWSGGNTDYN TPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALT YYDyEFAYWGQGTLVTVSA CH SEQ ID NO:49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP E VTC VWDVS Η E DPE VKFNW YVDGVEVHNAKIKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPV 314- 160878.doc 201242977 表14 :能夠結合CD3、EGFR及Her2之TVD-Ig之胺基睃序列
蛋白質 蛋白質區 序列識別號 序列 12345678901234567890 LDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK TVD-Ig006輕可變異 SEQ IDNO:196 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINRTVAAPDIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRASQD VNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSG TDFTLTISSLQPEDrATYYC QQHYTTPPTFGQGTKVEIKR TVAAPDILLTQSPVILSVSP GERVSFSCRASQSIGTNIHW YQQRTNGSPRLLIKYASESI SG1PSRFSGSGSGTDPTLSI NSVESEDIADYYCQQNNNWP TTFGAGTKLELKR CD3VL SEQ ID NO: 164 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINR 連接子 SE〇IDNO:13 TVAAP HER2VL SEQIDNO:172 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT ITCRASQDVNTAVAWYQQKP GKAPKLLIYSASFLYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKR 連接子 SEO IDNO:13 TVAAP EGFR VL SEQIDNO:166 DILLTQSPVILSVSPGERVS FSCRASQSIGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQNNNWPTTFGA GTKLELKR CL SEQIDNO：54 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC 實例5 :構築、表現及純化識別CD3、CD20及EGFR之三 可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)分子 160878.doc -315- 201242977 親本單株抗體抗CD3、抗EGFR及抗HER2用於構築TVD-Ig 007及TVD-Ig 008。此三種單株抗體之VL/VH域藉由重 疊PCR經由短連接子（VL之連接子序列為TVAAP且VH之連 接子序列為ASTKGP)在HC與LC兩者中均以5'VD(CD3)-SL-VD(CD20)-SL-VD(EGFR)，隨後為恆定區之域順序融合在 一起，稱為TVD-Ig 007。亦在HC與LC兩者中均以 5’VD(CD3)-SL-VD(EGFR)-SL-VD(CD20)，隨後為恆定區 之域順序產生不同TVD-Ig(TVD-Ig 008)。PCR選殖、表現 及純化方法之程序類似於對於TVD-Ig 001及TVD-Ig 002所 隹 述者，例外之處為引子序列歸因於VL/VH序列差異而不 同。 實例5.1: 構築、表現及純化三重可變異域免疫球蛋白 (TVD-Ig007及 TVD008) 為產生輕鏈構築體TVD-Ig 007，使用特異性引子28及41 對CD3抗體之VL域進行PCR擴增；同時使用特異性引子42 及27擴增CD20 SL-EGFR DVD-Ig之VL域。兩個PCR反應均 係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產物 籲 且一起用作使用標準PCR條件及引子27及28進行之後續重 疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將重 疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之pHybE-hCk 哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為產生重鏈構築體TVD-Ig 007，使用特異性引子44及29 對CD20-SL-EGFR DVD-Ig之VH域進行PCR擴增；同時使 用特異性引子43及30擴增抗CD3抗體之VH域。兩個PCR反
160878.doc -316- S 201242977 應均係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR 產物且一起用作使用標準PCR條件及引子29及30進行之後 續重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法 將重疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之 pHybE-hCgl z-non-a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為產生輕鏈構築體TVD-Ig 008，使用特異性引子28及25 對CD3抗體之VL域進行PCR擴增；同時使用特異性引子26 及27擴增EGFR SL-CD20 DVD-Ig之VL域》兩個PCR反應均 係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR產物 且一起用作使用標準PCR條件及引子27及28進行之後續重 疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法將重 疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之pHybE-hCk 哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為產生重鏈構築體TVD-Ig 008，使用特異性引子32及29 對EGFR-SL-CD20 DVD-Ig之VH域進行PCR擴增；同時使 用特異性引子31及30擴增抗CD3抗體之VH域。兩個PCR反 應均係根據標準PCR技術及程序進行。凝膠純化兩種PCR 產物且一起用作使用標準PCR條件及引子29及30進行之後 續重疊PCR反應的重疊模板。藉由使用標準同源重組方法 將重疊PCR產物次選殖入經Nru I及Not I雙重消化之 pHybE-hCgl z-non-a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 引子41 : TVD007 VL3'内部 AGCGGGAGACTGGGAGAGCACGATTTGAGGAGCTGCGACG GTGCGATTGATCTCAAGCTTAGTGCCACTA'(SEQ ID NO: 197) 160878.doc -317- 201242977 引子42 : TVD007 VL5'内部 TAGTGGCACTAAGCTTGAGATCAATCGCACCGTCGCAGCTCC TCAAATCGTGCTCTCCCAGTCTCCCGCT(SEQ ID NO:198) 引子43 : TVD007 VH 3’内部 GCCCCAGGTTGCTGCAGCTGAACCTGAGGCCCTTTCGTGGA GGCGGAGGACACGGTCAGAGTGGTACCCT(SEQ ID NO: 199) 引子44 : TVD007 VH 5,内部 AGGGTACCACTCTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACGAAAGGG CCTCAGGTTCAGCTGCAGCAACCTGGGGC(SEQ ID NO:200) 表15 :能夠結合CD3、EGFR及CD20之TVD_Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 12345678901234567890 蛋白質區 TVD-Ig007重可變異 SEQIDNO:201 QVQLQQSGAELARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSSA STKGPQVQLQQPGAELVKPG ASVKMSCKASGYTFTSYNMH WVKQTPGRGLEWIGAIYPGN GDTSYNQKFKGKATLTADKS SSTAYMQLSSLTSEDSAVYY CARSTYYGGDWYFNVWGAGT TVTVSAASTKGPQVQLKQSG PGLVQPSQSLSITCTVSGFS 318- 160878.doc 201242977 表15 :能夠結合CD3、EGFR及CD20之TVD-Ig之胺基酸序列
杳白質 序列識別號 序列 蛋白質區 12345678901234567890 LTNYGVHWVRQSPGKGLEWL GVIWSGGNTDYNTPFtSRLS INKDNSKSQVFFKMNSLQSN DTAIYYCARALTYYDYEFAY WGQGTLVTVSA CD3VH SEQIDNO:163 QVQLQQS GAE LARPG AS VKM SCKASGYTFTRYTMHWKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLS S LT SED SAVYYCARYY DDHYCLDyWGQGTTLTVSS 連接子 SEO IDNO:21 ASTKGP CD20 VH SEQ IDNO:169 QVQLQQPGAELVKPGASVKM SCKASGYTFTSYNMHWVKQT PGRGLEWIGAIYPGNGDTSY NQKFKGKATLTADKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARST YYGGDWYFNVWGAGTTVIVS A 連接子 SEOIDNO:21 ASTKGP . EGFR VH SEQ IDNO:165 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSI TCTVS GF S LTNYGVHWVRQS PGKGLEWLGVIWSGGNTDYN TPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALT YYDYEFAYWGQGTLVTVSA CH SEQ IDNO:49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNS GALT SGVHXFPAVLQS S GLYSLSSWTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIΕΚΤIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWE SNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLIVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK 319- 160878.doc 201242977 表15 :能夠結合CD3、EGFR及CD20之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 蛋白質區 12345678901234567890 TVD-Ig 007輕可變異 SEQIDNO:202 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINRTVAAPQIVLSQSP AILSPSPGEKVTMTCRASSS VSYIHWFQQKPGSSPKPWIY ATSNLASGVPVRFSGSGSGT SYSLTISRVEAEDAATVYCQ QWTSNPPTFGGGTKLEIKRT VAAPDILLTQSPVILSVSPG ERVSFSCRASQSIGTNIHWY QQRTNGSPRLLIKYASESIS GIPSRFSGSGSGTDFTLSIN SVESEDIADYYCQQNNNWPT TFGAGTKLELKR CD3VL SEQIDNO:164 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINR 連接手 SE〇IDNO:13 TVAAP CD20VL SEQ ID NO:170 QIVLSQSPAILSPSPGEKVT MTCRASSSVSYIHWFQQKPG S S PKP.W IY AT S NL AS GVPVR FSGSGSGTSYSLTISRVEAE DAATYYCQQWTSNPPTFGGG TKLEIKR 連接子 SEO ID NO: 13 TVAAP EGFR VL SEQ ID NO:166 DILLTQSPVILSVSPGERVS FSCRASQSIGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIA.DYYCOQNNNWPTTFGA GTKLELKR CL SEQ ID NO:54 TVAAPSVFIF PPS DEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC TVD-Ig 008重可變異 SEQ IDNO:203 QVQLQQSGAELARPGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYY DDHYCLDYWGQGTTLTVSSA STKGPQVQLKQSGPGLVQPS -320- 160878.doc 201242977 表15 :能夠結合CD3、EGFR及CD20之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 序列識別號 序列 12345678901234567890 蛋白質區 QSLS1TCTVSGFSLTNYGVH WRQSPGKGLEWLGVIWSGG NTDYNTPFTSRLSINKDNSK SQVFFKMNSLQSNDTAIYYC AKALTYYDYEFAYWGQGTLV TVSAASTKGPQVQLQQPGAE LVKPGASVKMSCKASGYTFT SYNMHWVKQTPGRGLEWIGA IYPGNGDTSYNQKFKGKATL TADKSSS丁AYMQLSSLTSED SAVYYCARSTYYGGDWyFNV WGAGTXVTVSA CD3 VH SEQIDNO:163 QVQLQQSGAELAE^PGASVKM SCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNY NQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARVY DDHYCLDYWGQGTTLTVSS 連接子 SEOID NO:21 ASXKGP EGFR VH SEQIDNO:165 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSI TCTVSGFSLTNYGVHWVRQS PGKGLEWLGVIWSGGNTDYN TPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALT YYDYEFAYWGQGTLVXVSA 運接手 SEOIDNO:21 ASTKGP CD20VH SEQIDNO:169 QVQLQQPGAELVKPGASVKM SCKASGYTFTSYNMHWVKQT PGRGLEWIGAIYPGNGDTSY NQKFKGKATLTADKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARST YYGGDWYFNVWGAGTTVTVS A CH 1 SEQIDNO;49 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WN SGALT SGVHTFPAVLQS S GLYSLSSWTVPSSSLGIQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKIIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYX QKSLSLSPGK 321 - 160878.doc 201242977 表15 :能夠結合CD3、EGFR及CD20之TVD-Ig之胺基酸序列
蛋白質 蛋白質區 序列識別號 序列 12345678901234567890 TVD-Ig 008輕可變異 SEQ IDNO:204 QIVLTQSPAIHSASPGEKVT MTTCRASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINRTVAAPDILLTQSP VILSVSPGERVSFSCRASQS IGTNIHWYQQRTNGSPRLLr KYASESISGIPSRFSGSGSG TDFTLSINSVESEDIADYYC QQNNNWPTTFGAGTKLELKR TVAAPQIVLSQSPAILSPSP GEKVTMTCRASSSVSYIHWF QQKPGSSPKPWIYATSNLAS GVPVRFSGSGSGTSYSLTIS RVEAE DAATY YCQQWT S NPP TFGGGTKLEIKR CD3VL SEQ ID NO:164 QIVLTQSPAIMSASPGEKVT MTCRASSSVSYMNWYOQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSG TKLEINR 連接子 SEO ID NO: 13 TVAAP EGFRVL SEQ ID NO: 166 DILLTQSPVILSVSPGERVS FSCRASQSIGXNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQNNNWPTTFGA GTKLELKR 連接早 SE〇IDNO:13 TVAAP CD20 VL SEQ IDNO:170 QIVLSQSPAILSPSPGEKVT MTCRASSSVSYIHWFQQKPG SSPKPWIYATSNLASGVPVR FSGSGSGTSYSLTISRVEAE DAATYYCQQWTSNPPTFGGG TKLEIKR CL SEQ ID NO:54 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
實例5.2:表徵三可變異域免疫球蛋白分子（TVD-Ig 008) 實例5.2.1 : TVD-Ig 008之尺寸排阻層析分析 如對於TVD-Ig 001及TVD-Ig 002所述，藉由SEC分析經 純化之TVD-Ig 008。TVD-Ig 008在SEC上展現單體概況， I60878.doc -322-
S 201242977 顯然以均質蛋白質形式存在（76.4%單體）。 實例5.2.2 : 使用重定向細胞毒性分析（rCTL分析）對TVD-Ig進行功能分析 為確定TVD-Ig是否能夠抑制重定向細胞毒性，使用2種 細胞基生物分析。 實例5.2.2a : FACS基重定向細胞毒性分析（rCTL分析） 人類CD3+ T細胞係藉由負性選擇富集管柱（R&D目錄號 HTCC-525)自先前冷凍之分離之PBMC分離。T細胞於完全 RPMI培養基（L-麩醯胺酸、55 mM β-ME、青黴素/鏈黴 素、10% FCS)中在經 10 pg/mL 抗 CD3(OKT-3，BD)及 2 pg/mL抗CD28(CD28.2，Abeam)塗佈之燒瓶中刺激4天。T 細胞於30 U/mL IL-2(Peprotech)中靜息隔夜，隨後用於分 析中。根據製造商說明書用PKH26(Sigma)標記DoHH2或 Raji目標細胞。在整個rCTL分析中皆使用含有L-麩醢胺酸 及 10% FBS(Hyclone)之 RPMI 1640 培養基（無苯酚， Invitrogen) 〇 效應T細胞（E)及目標（T)分別以每孔105及104個細胞塗鋪 於96孔盤（Costar #3799)中以得到10:1之E:T比率。適當稀 釋DVD-Ig分子以獲得濃度依賴性滴定曲線。在培育隔夜 之後，集結細胞且用PBS洗滌一次，隨後再懸浮於含有 0.1% BSA(Invitrogen)及 0.5 pg/mL 蛾化丙鍵（BD)之 PBS 中。在FACSCanto機器（BD)上收集FACS資料且在 Flowjo(Treestar)中加以分析。 計算DVD-Ig處理樣品中之活目標百分比除以總目標（對 160878.doc -323- 201242977 照，未處理）百分比以測定特異性溶解百分比。將數據繪 圖且在 Prism(Graphpad)中計算 IC50。 實例5.2.2b:阻抗基重定向細胞毒性分析（rCTL分析）
如上製備T細胞。使表現EGFR之目標細胞黏附於ACEA RT-CES 96孔盤(ACEA Bio，San Diego)隔夜。效應T細胞 ’(E)及目標（T)接著以每孔2χ105及2xlO4個細胞塗鋪以得到 10:1之Ε:Τ比率。適當稀釋TVD-Ig分子以獲得漠度依賴性 滴定曲線。TVD-Ig處理樣品中之目標之細胞指數除以對照 目標（未處理）之細胞指數以計算特異性溶解百分比。將數 據繪圖且在Prism(Graphpad)中計算IC5〇。TVD003a與 TVD008兩者之阻抗基rCTL分析之結果可見於表16中。 表16 :使用阻抗基分析對TVD-Ig構築逋進行之rCTL分析 親本抗姐或TVD-igro IC5〇(nM) TVD003a 2.636 TVD008 1.037 實例5.2.2.C : 如藉由使用FACSCanto進行流動式細胞測 量術評估之TVD-Ig與人類腫瘤細胞株之表面的結合 自組織培養燒瓶收集過度表現相關細胞表面抗原之穩定 細胞株或人類腫瘤細胞株且使其再懸浮於含有5%胎牛血 清之磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)(PBS/FBS)中。在染色之 前，將人類腫瘤細胞在冰上與5 pg/ml於PBS/FCS中之人類 IgG(100 μΐ) —起培育。將1-5X105個細胞在冰上與於 PBS/FBS中之抗體或TVD-Ig(50 ηΜ) —起培育30-60分鐘。 洗條細胞兩次且添加1 00 μΐ F(ab*)2山羊抗人類IgG Fcy- 160878.doc -324· 201242977
Dylight488(於 PBS 中 1:200稀釋）(Jackson ImmunoResearch，
West Grove，PA，目錄號109-486-098)。在冰上培育3〇分鐘 之後，洗滌細胞兩次且使其再懸浮於PBS/FBS中。使用 Becton Dickinson FACSCanto(Becton Dickinson, San Jose, CA)量測螢光。 下表含有親本抗體及TVD-Ig構築體在50 nM下之FACS幾 何平均值。表17表示TVD008關於三個細胞株Jurkat、A431 及Raji細胞之FACS結合資料》 表17 :使用FACS Canto對TVD-Ig構築想進行之勞光活化 細胞揀選 親本抗通或TVD-Ig ID 所用細胞株 FACS幾何平均值 (N端） FACS幾何平均值 (c端） CD3mAb Jurkat 572 TVD008 Jurkat 439 EGFRmAb A431 53006 TVD008 A431 1096 CD20 mAb Raji 3484 TVD008 Raji 176 TVD008顯示與細胞表面目標結合。N端域結合細胞表面 上之目標與親本抗體一樣良好或優於親本抗體。可藉由調 整連接子長度來恢復或改良結合。 以引用的方式併入 本發明以全文引用的方式併入分子生物學及藥物傳遞領 域中熟知之技術。此等技術包括（但不限於）下列出版物中 所述之技術：
Ausubel 等人(編)，€111^61^?1^〇〇〇18 111]\1〇16^|13圹81〇1〇经5^·
John Wiley & Sons, NY (1993)； 160878.doc -325· 201242977
Ausubel 等人（編），Short Protocols In Molecular Biology, JohnWiley&Sons，NY(第4版，1999)(ISBN0-471-32938-X);
Giege，R_ 及 Ducruix，A. Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，第 2版，第 20 1-16 頁，Oxford University Press, New York，New York，（1999);
Goodson，Medical Applications of Controlled Release,第 2 卷，第 115-138 頁（1984);
Hammerling 等人 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)； 鲁
Harlow等人Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版 1988);
Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1987)及（1991);
Kabat, E.A.等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，U.S· Department of Health and
Human Services, NIH 出版物編號91-3242 ;
Kontermann 及 Dubel 編，Antibody Engineering (2001)
Springer-Verlag. New York.第 790 頁（ISBN 3-540-41354-5);
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press，NY (1990);
Langer及 Wise (編），Medical Applications of Controlled Release, CRC Press, Boca Raton, FL (1974)；
Lu 及 Weiner編，Cloning and Expression Vectors for Gene
Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, 160878.doc -326- s 201242977 ΜΑ.第 298 頁（ISBN 1-881299-21-X);
Old, R.W·及S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (第 3版 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology ;第 2 卷：第 409 頁（ISBN 0-632-01318-4) ; Robinson, J.R.(編），
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,
Marcel Dekker, Inc., NY (1978)；
Ruan, Q·，Skinner, J.P.及 Tetin，S.Y. Using non-fluorescent
FRET acceptors in protein binding studies. Analyt. Biochemistry (2009), 393, 196-204 ；
Sambrook，J.等人編，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第 2版 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY· 第 1-3卷。（ISBN 0-87969-309-6);
Smolen及Ball (編），Controlled Drug Bioavailability· Drug Product Design and Performance, John Wiley & Sons, NY (1984)；
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers，NY (由 Horst Ibelgaufts 翻譯）。第 634頁（ISBN 0-89573-614-4)。 本申請案整篇引用之所有引用參考文獻（包括參考文 獻、專利、專利申請案、資料庫及網站）之内容據此出於 任何目的以全文引用的方式明確併入本文中，其中引用之 參考文獻同樣以全文引用的方式明確併入本文中。除非另 外指示，否則本發明之實施將採用此項技術中熟知之免疫 160878.doc -327- 201242977 學、分子生物學及細胞生物學的習知技術。 相等物 本發明可在不脫離其精神或基本特徵之情況下以其他特 定形式體現。因此，上述實施例在所有方面皆應視為說明 性的而非限制本文所述之本發明。因&，本發明之範“ 隨附申睛專利範圍而非上述說明書指示， 包括申請專利範圍之相等含義及範圍内此本文意欲 【圖式簡單說明】 變化。 之示意圖且展示自親 白質之策略。 圖1為三可變異域（TVD)-Ig構築體 本結合蛋白（例如抗體）產生TVD-Ig蛋 160878.doc 328· 201242977 序 列 表 <n〇>美商亞培公司 <120>三可變異域結合蛋白及其用途
<130> 117813-50620WO <140〉 100148131 <141> 2011/12/22 <150> 61/426,133 <151> 2010-12-22 <160> 205 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成肽 <400> 1
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 15 10 15 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 2
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 15 10 15
Val
<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 3
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Ser Ala Lys Thr Thr Pro <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽
<400> 6
Arg Ala Asp Ala Ala Pro <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 人工序列之描述：合成肽 <400> 7
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽
<400> 8
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 9
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 s 160878-序列表.doc 201242977 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述··合成肽 <400> 10
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala 15 10 15
Arg Val <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽
<400> 11
Ala Asp Ala Ala Pro <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 12
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 13
Thr Val Ala Ala Pro <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 14
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 1 5 10 160878-序列表.doc 201242977 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <22〇> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 15
Gin Pro Lys Ala Ala Pro <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 16
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro 1 5 10
<210> 17 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 17
Ala Lys Thr Thr Pro Pro <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 18
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> J9
Ala Lys Thr Thr Ala Pro <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 160878·序列表.doc -4- s 201242977 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 20
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro
<210> 22 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15 <210>24 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 24
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<400> 27
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala 15 10 15
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 20 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr 15 10 15
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 20 25 <210> 29 <211> 62 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 29 gcacctctgg gcccttggtc gacgctgaag agacggtgac cattgtccct tggccccaga 60 ta 62 <210> 30 <211> 65 <212> DNA <213>人工序列 160878-序列表.doc ·6· s 60201242977 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 30 accgtctctt cagcgtcgac caagggccca gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaa 65 <210> 31 <211> 65 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 31 agggtgccag ggggaagacc gatgggccct tggtcgacgc gctgctcacg gtcaccaggg tgccc 60 65
<210> 32 <211> 64 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 32 tggctttttc ttgtcgcgat tttaaaaggt gtccagtgcg aggtcacctt gagggagtct gfitc 60 64 <210> 33 <211> 65 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子
<400> 33 ggagattaaa cgaacggtgg ctgcaccaga cgtgctgatg acccagaccc ccctgagcct gcccg 60 65 <210> 34 <211> 66 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 34 catcagcacg tctggtgcag ccaccgttcg tttaatctcc agtcgtgtcc cttggccgaa ggtgat 60 <210> 35 <211> 66 <212> DNA <213>人工序列 160878·序歹ij 表doc 66 列 序 Ax 4065DN人 0>1>2>3> <21<21<21<21 201242977 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 35 catcagatgg cgggaagatg aagacagatg gtgcagccac cgtccgcttg atctccacct 60 tggtgc 66 <210> 36 <211> 65 <212> IM <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <40Q> 36 gggcctgctg ctgctgtggt tccccggctc gcgatgcgac atcgtgatga cccagtctcc 60 agact 65 <210> 37 <211> 64 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 37 gagcagcgcg tcgaccaagg gcccagaggt caccttgagg gagtctggtc ctgcgctggt 60 gaaa 64 <210> 38 <211> 65 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <40O> 38 aggtgacctc tgggcccttg gtcgacgcgc tgctcacggt caccagggtg ccctggcccc 60 agtag 65 <210> 39 <211> 65 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述··合成引子 <400> 39 tggctttttc ttgtcgcgat tttaaaaggt gtccagtgcg aggtgcagct ggtgcagagc 60 figcgc 65 160878-序列表.d〇c
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<210> 42 <211> 65 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 42 cacgatgtct ggtgcagcca ccgtccgctt gatctccacc ttggtgccgc cgccgaaggt gtagg 60 65 <210> 43 <211> 65 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 43 tgctgggcct gctgctgctg tggttccccg gctcgcgatg cgacgtgctg atgacccaga
60 65 <210> 44 <211> 66 <212> IM <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 44 tggcgggaag atgaagacag atggtgcagc caccgtacgt cgtttaatct ccagtcgtgt cccttg 60 <210> 45 <211> 368 <212> PRT <213>人工序列 160878-序列表,doc 9- 66 201242977 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 45
Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin 15 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser G]y Phe Ser Leu Ser Lys Ser 20 25 30
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Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Va] 65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cyis Ala Arg Arg Gly lie Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin 115 120 125
Leu Val Gin Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys 130 135 140 lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr Trp lie Gly 145 150 155 160
Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Phe lie 165 170 175
Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Thr Phe Gin Gly Gin .180 185 190
Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Phe Leu Gin Trp 195 200 205
Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Val 210 215 220
Gly Ser Gly Trp Tyr Pro Tyr Thr Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr 225 230 235 240
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu 245 250 255
Val Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 260 265 270
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Trp Leu Gly Trp 275 280 285 •10·
160878·序列表.doc 201242977
Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp lie Tyr 290 295 300
Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val 305 310 315 320
Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg 325 330 335
Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp 340 345 350
Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 355 360 365 <210> 46 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 46
Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin 15 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser 20 25 30
Val Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val 65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly He Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 47 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 47
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu •11 - 160878·序列表.doc 201242977 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Phe lie Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Thr Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
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Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 116 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 48
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
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Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
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160878-序列表.doc •12· s 201242977 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述•合成多肽 <400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Vai Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 •13· 160878-序列表.doc 201242977
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <21Q> 50 <211> 340 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 50
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Asp Tyr Asn Ser Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 115 120 125
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser lie Ser Ser 130 135 140
Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Phe 145 150 155 160 lie Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp lie Pro Ala Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin 180 185 190 160S78-序列表.doc -14- s 201242977
Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Trp Pro 195 200 205
Ser lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg Thr Val 210 215 220
Ala Ala Pro Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 225 230 235 240
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie 245 250 255
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 260 265 270
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 275 280 285
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 290 295 300
Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 305 310 315 320
Phe Gin Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 325 330 335
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Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Asp Tyr Asn Ser Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg •15· 160878-序列表.doc 201242977 100 105 <210> 52 <211〉 109 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 52
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser lie Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Phe He 35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
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Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Val 85 90 95 160878-序列表.doc -16· s 201242977
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly G3y Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 54
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30
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Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 •17- 160878-序列表.doc 201242977
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Val Gin 115 120 125
Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Giu Ser Leu Lys lie Ser Cys 130 135 140
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Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Phe lie Tyr Pro Gly 165 170 175
Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Thr Phe Gin Gly Gin Val Thr lie 180 185 190
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201242977
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Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 275 280 285
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 290 295 300
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Gin Gin Asp Tyr Asn Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 325 330 335
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
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160878-序列表.doc •26- s 201242977
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<400> 74
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Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 15 10 15
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Lys Arg -31 · 160878-序列表.doc 201242977 <210> 81 <211> 122 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 81
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160878-序列表.doc -32-
S 201242977
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Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Lys Ser Leu Gin Pro -33- 160878-序列表.doc 201242977 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Gly Leu Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 85 <211> 122 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 85
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Gin Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Met Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Leu He Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Arg Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Val Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ala Gly Tyr Phe Gly Ser Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 86 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 86
Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 160878-序列表.doc •34- s 201242977
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He Ser Ser Val Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 87 <211> 118 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽
<400> 87
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 88 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 88
Ser lie Val Met Thr Gin Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 •35· 160878-序列表.doc 201242977
Val Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Thr Val Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gin Asp Tyr Ser Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 89 <211> 117 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 89
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Va丨 Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30
Gly lie Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin lie Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 90 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 90
Asp Asn Val Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15 s 160878-序列表.doc 201242977
Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Phe Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Hir Asp Phe Asn Leu Asn lie His 65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110
<210> 91 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 91
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Arg lie Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala lie Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Fhe 65 70 75 80
Val Gin Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 92 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 92
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly -37· 160878·序列表.doc 201242977 1 5 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gin Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 93 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 93
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Arg lie Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala lie Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80
Val Gin Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 94 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> 160878-序列表.doc -38- s 201242977 <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 94
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gin Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Val Thr Asp lie Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 95 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 95
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Asn Leu His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Gly lie Thr Gly Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ala Tyr Asp Tyr Asp Tyr Leu Thr Asp Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala -39- 160878-序列表.doc 201242977 115 <210> 96 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 96
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Val lie Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Thr Ser Lys Asn Val Gly Thr Asn .20 25 30
He His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Leu Pro Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Asn Trp Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 97 <211> 244 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 97
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 160878-序列表.doc -40-
S 201242977
Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr. Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin 115 120 125
Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp lie Glu 145 150 155 160
Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp lie Gly Glu lie 165 170 175
Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe Arg Asp Lys 180 185 190
Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu 195 200 205
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 210 215 220
Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 225 230 235 240
Thr Val Ser Ala <210> 98 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 98
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala -41 - 160878-序列表.doc 201242977 100 105 110
Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val 115 120 125
Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn lie Tyr Ser 130 135 140
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu 145 150 155 160
Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin 180 185 190
Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Ser Pro 195 200 205
Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 210 215 220 <210> 99 <211> 251 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 99
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser G】y Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met 130 135 140 160878-序列表.doc -42-
201242977
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Trp lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly 165 170 175
Leu Glu Trp lie Gly Glu lie Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn 180 185 190
Asn Glu Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser 195 200 205
Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr 225 230 235 240
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 245 250
<210> 100 <211> 228 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 100
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro 115 120 125
Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg 130 135 140 -43· * 160878-序列表.doc 201242977
Thr Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 145 150 155 160
Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu 165 170 175
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser 180 185 190
Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 195 200 205
Gin His His Tyr Asp Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 210 215 220
Glu Leu Lys Arg 225 <210> 101 <211> 264 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 101
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly A]a 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140
Pro Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 145 150 155 160 -44- 160878-序列表.doc 201242977
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 165 170 175
Tyr Trp lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp 180 185 190 lie Gly Glu lie Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys 195 200 205
Phe Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 210 215 220
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240
Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 260
<210> 102 <211> 240 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 102
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 lie Phe Pro Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser 130 135 140
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn -45- 160878-序列表.doc 201242977 145 150 155 160 lie Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro 165 170 175
His Leu Leu Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn 195 200 205
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr 210 215 220
Asp Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 235 240 <210> 103 <211> 255 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 103
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala *Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu TTir Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val 130 135 140
Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser 145 150 155 160
Phe Thr Ala Tyr Thr lie His Trp Met Lys Gin Ser His Gly Lys Asn 165 170 175
160878-序列表.doc •46- s 201242977
Leu Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr 180 185 190
Asn Gin Lys Phe Gin Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 195 200 205
Ser lie Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Arg Glu Gly His Tyr. Tyr 225 230 235 240
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 . 250 255 <210> 104 <211> 228 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 104
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro 115 120 125
Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg 130 135 140
Ala Ser Glu Asn lie Tyr Thr Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin 145 150 155 160
Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val Tyr Thr Thr Lys Thr Leu Ala Glu 165 170 175 •47· 160878-序列表.doc 201242977
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser 180 185 190
Leu Lys lie Lys Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 195 200 205
Gin His His Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 210 215 220
Glu Leu Lys Arg 225 <210> 105 <211> 268 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 105
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140
Pro Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 145 150 155 160
Ala Ser Met Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Ala 165 170 175
Tyr Thr lie His Trp Met Lys Gin Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp 180 185 190
160878·序列表.doc •48- s 201242977 lie Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys 195 200 205
Phe Gin Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser lie Ala 210 215 220
Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240
Cys Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Arg Glu Gly His Tyr Tyr Ala Met Asp 245 250 255
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 260 265 <210> 106 <211> 240 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 106
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s 201242977
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 15 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Thr Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Gly Leu Pro Leu 85 90 95
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Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Phe Gly Ser 225 230 235 240 160878-序列表.doc -54-
s 201242977
Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 245 250 255
Ser <210〉 112 <211> 228 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <2幻> 人工序列之描述：合成多肽 <400> 112
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Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Arg 210 215 220 <210> 115 <211> 257 <212> PRT <213>人工序列 ·57· 160878-序列表.doc 201242977 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 115
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Gin Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Met Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp lie 35 40 45
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Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
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Ser <210> 116 <211> 226
160878-序列表.doc -58- s 201242977
<212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 116
Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
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Lys Arg 225 <210> 117 <211> 251 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 -59- 160878-序列表.doc 201242977 <400> 117
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Set Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 -61 - 160878-序列表.doc 201242977
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30
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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin 115 120 125
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Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 225 230 235 240
Thr Val Ser Ser <210> 120 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 120
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 •62· 160878-序列表.doc 201242977
Glu Thr Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 '
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45
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Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp lie Pro Leu 85 90 95
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Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thi Lys Leu Glu Leu Lys Arg 210 215 220 <210> 121 <211> 249 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 121
Lys lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
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Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 lie Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Lys lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 130 135 140
Pro Gly Glu Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 145 150 155 160
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Lys Trp Met Gly Trp lie Asn lie Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 180 185 190
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Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu lie Ser 20 25 30
Gly Asp Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 160878-序列表.doc -64- s
201242977
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp lie 115 120 125
Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys 130 135 140
Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu lie Ser Gly Asp 145 150 155 160
Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 165 170 175
Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp 180 185 190
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 195 200 205
Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn Asp His 210 215 220
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Gly Trp lie Asn lie Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Phe
65 70 75 SO • 65· 160878-序列表.doc 201242977
Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly G3y Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr * loo 105 no lie Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Lys lie Gin Leu 115 120 125
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Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp 145 150 155 160
Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp lie Asn 165 170 175 lie Asn Thr GJy Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe 180 185 190
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Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Arg Asp Ser 210 215 220
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Gly Asp Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 -66- 160878-序列表.doc 201242977 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
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Ser Gin Ser Leu Leu lie Ser Gly Asp Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 145 150 155 160
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Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45
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Ser Ser Gin Ser Leu Leu lie Ser Gly Asp Gin Lys Asn Tyr Leu Ala 145 150 155 160
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly 165 170 175
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Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp 195 200 205
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Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30
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Ϊ 60878·序列表.doc -70- s 201242977
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Leu Ala Pro Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 130 135 140
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Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110
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160878-序列表.doc -72- s 201242977
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<220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 131
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Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 lie Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu 115 120 125
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Gly Asp Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
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Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 135 <211> 250 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 135
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Pro Leu Ala Pro Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ser Glu Leu Val 130 135 140
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Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 136 <211> 228 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 136
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Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser lie Val Met Thr Gin Thr Pro 115 120 125
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Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190
Phe Thr lie Ser Thr Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys 195 200 205
His Gin Asp Tyr Ser Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 210 215 220
Glu lie Lys Arg 225
160S78-序列表.doc •78· s 201242977 <210> 137 <211> 263 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 137
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Tyr lie Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe. Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140
Pro Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly 145 150 155 160
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 165 170 175
Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 180 185 190 lie Gly Asn lie Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys 195 200 205
Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala 210 215 220
Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240
Cys Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gin Gly 245 250 255
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser •79- 160878-序列表.doc 260 201242977 <210> 138 <211> 240 <212> PRT <213>•人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 138
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly gr Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp He Pro Leu
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 120
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 lie Phe Pro Pro Ser lie Val Met Thr Gin Thr Pro Lys Phe Leu Leu 130 135 140
Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser 145 150 155 160
Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro G]y Gin Ser Pro 165 170 175
Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp 180 185 190
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser 195 200 205
Thr Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gin Asp Tyr 210 215 220
Ser Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 225 230 235 240 <210> 139 <211> 243 160878-序列表.doc -80-
s 201242977 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 139
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
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Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Ser Trp 145 150 155 160
Val Arg Gin Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr lie Ser 165 170 175
Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe 180 185 190
Thr lie Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Thr 195 200 205
Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Phe 210 215 220
Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr 225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 140 <211> 221 <212> PRT •81 · 160878-序列表.doc 201242977 <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 140
Ser lie Val Met Thr Gin Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30
Val Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala G]y Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Thr Val Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gin Asp Tyr Ser Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Va] 115 120 125
Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser 130 135 140
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu 145 150 155 160
Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Giy Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin 180 185 190
Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp lie Pro 195 200 205
Leu Thr Phe Gly Ala Giy Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 210 215 220 <210> 141 <211> 250 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 141
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15
160878-序列表.doc -82· s 201242977
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60
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Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
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Leu Ala Pro Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 130 135 140
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Thr Leu Tyr Leu Gin Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240 (Sly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 142 <211> 228 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 142
Ser lie Val Met Thr Gin Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 15 10 15 -83- 160878-序列表.doc 201242977
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30
Val Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Thr Val Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gin Asp Tyr Ser Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro 115 120 125
Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg 130 135 140
Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin 145 150 155 160
Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 165 170 175
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser 180 185 190
Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys 195 200 205
Gin His His Tyr Asp lie Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 210 215 220
Glu Leu Lys Arg 225 <210> 143 <211> 263 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 143
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
160878-序列表.doc •84· s 201242977
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Gly Asn lie Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn 50 55
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Leu Gin Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr 225 230 235
Ala Met Tyr Tyr Cys 240
Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp 245 250
Tyr Trp Gly Gin Gly 255
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 260 <210> 144 <211> 240 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 144 Ser lie Val Met Thr Gin Thr Pro Lys Phe Leu 1 5 10
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Asp Arg Val Thr He Thr Cys Lys Ala Ser Gin
Ser Val Ser Asn Asp 160878-序列表.doc -85- 201242977 20 25 30
Val Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Thr Val Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gin Asp Tyr Ser Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 lie Phe Pro Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser 130 135 140
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro 165 170 175
Gin Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 180 185 190
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Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr 210 215 220
Asp lie Pro Leu Thr Phe Gly Ala GJy Thr Lys Leu Glu Lea Lys Arg 225 230 235 240 <210> 145 <211> 247 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 145
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 15 10 15
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160878-序列表.doc •86- s 201242977
Gly Trp lie Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60
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Ala Tyr Leu Gin lie Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr 210 215 220
Phe Cys Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 225 230 235 240
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Asp Asn Val Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45 -87- 160878-序列表.doc 201242977
Lys Phe Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn lie His 65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn 85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp Asn Val Leu 115 120 125
Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr 130 135 140 lie Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn Gly Asp Ser Tyr 145 150 155 160
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Phe Leu lie 165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu 195 200 205
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe 210 215 220
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 225 230 235 <210> 147 <211> 240 <212> PRT <213>人工序列
<220> <223>人工序列之描述··合成多肽 <400> 147
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30
Gly lie Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 160878·序列表.doc • 88 - s 201242977
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin lie Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin lie Gin Leu Veil 115 120 125
Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys lie Ser 130 135 140
Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly lie Asn Trp Val 145 150 155 160
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Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gin lie Asn Asn 195 200 205
Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Ser His Arg 210 215 220
Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 <210> 148 <211> 229 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 148
Asp Asn Val Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Phe Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60
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Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn -89· 160878-序列表.doc 201242977 85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110
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Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Asn Trp 130 135 140
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Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 180 185 190
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Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 210 215 220
Leu Glu lie Lys Arg 225 <210> 149 <211> 237 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 149
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Arg lie Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala lie Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80
Val Gin Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 160878-序列表.doc -90-
s 201242977
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gin Val Gin 115 120 125
Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 145 150 155 160
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Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys 180 185 190
Ala lie Leu Thr Va] Asp Lys Ser Ser Scr Thr Ala Phe Val Gin Leu 195 200 205
Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ser Asp 210 215 220
Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 150 <211> 238 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 150
Asp Val Va] Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Scr Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gin Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Val Val Ser Lys Leu Giu Scr Gly Val Pro 50 55 60
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Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly Gin Pro Ala 130 135 140
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Leu lie Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val 195 200 205
Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala Thr His Phe 210 215 220
Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 225 230 235 <210> 151 <211> 242 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 151
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 】 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Arg lie Asp Pro Tyr Asp Ser Gtu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala lie Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80
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Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys 130 135 140
160878-序列表.doc -92- s 201242977 lie Scr Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly He Asn 145 150 155 160
Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met Gly Trp He 165 170 175
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Ser Ser
<210> 152 <211> 237 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述··合成多肽 <400> 152
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Scr Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gin Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Scr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Ήιγ Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp Asn Val 115 120 125
Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala 130 135 140
Thr lie Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn Gly Asp Ser •93· 160878-序列表.doc 201242977 145 150 155 160
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Phe Leu 165 170 175 lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser 180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn lie His Pro Val Glu 195 200 205
Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro 210 215 220
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 225 230 235
<210> 153 <211> 255 <212> FRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 153
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45
Gly Arg lie Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala lie Leu Thr Val Asp Lys vSer Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80
Val Gin Leu Thr Ser Leu Thr Set Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Fro Ala Ser Thr 115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gin lie Gin Leu Val Gin 130 135 140
Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys lie Ser Cys 145 150 155 160
Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly lie Asn Trp Val Lys 165 170 175 160878·序列表.doc •94· s 201242977
Gin Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met Gly Trp He Asn Thr His 180 185 190
Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe 195 200 205
Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gin lie Asn Asn Leu 210 215 220
Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Ser His Arg Phe 225 230 235 240
Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 <210> 154 <211> 249 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 154
Asp Val Val Met Thi Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyi Leu Asn Trp Leu Phe Gin Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pto Set Val Phe lie Phe Pro Pro Thr Val Ala 115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Asp Asn Val Leu Thr Gin Ser 130 135 140
Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys 145 150 155 160
Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp 165 170 175 -95· 160878-序列表.doc 201242977
Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Phe Leu He Tyr Ala Ala 180 185 190
Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 205
Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala 210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly 225 230 235 240
Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 245 <210> 155 <2ll> 242 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <40〇> 155
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30
Gly He Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin He Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 ITir Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 325
Ala Pro Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 130 135 140
Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 145 150 155 160
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu 165 170 175
160878-序列表.doc -96- s 201242977
Trp lie Gly Arg lie Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin 180 185 190
Lys Phe Lys Asp Lys Ala lie Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 195 200 205
Ala Phe Val Gin Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 210 215 220
Tyr Cys Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240
Ser Ser <210> 156 <211> 237 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 156
Asp Asn Val Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Phe Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn lie His 65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asa 85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp Val Val Met 115 120 125
Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly Gin Pro Ala Ser 130 135 140 lie Scr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys rrhr 145 150 155 160
Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gin Arg Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu 165 170 175 lie Tyr Val Val Scr Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr •97- 160878-序列表.doc 201242977 180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu 195 200 205
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala Thr His Phe Pro 210 215 220
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 225 230 235 <210> 157 <211> 255 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 157
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30
Gly lie Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin lie Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125
Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gin 130 135 140
Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser 145 150 155 160
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 165 170 175
Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly 180 185 190
Arg He Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 195 200 205 •98· 160878-序列表.doc 201242977
Asp Lys Ala lie Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Val 210 215 220
Gin Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val 225 230 235 240
Scr Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 <210> 158 <211> 249 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 158
Asp Asn Val Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Phe Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn lie His 65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn S5 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala 115 120 125
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro 130 135 140
Leu γΠιγ Leu Ser Val Thr Thr Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys 145 150 155 160
Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp 165 170 175
Leu Phe Gin Arg Pro Gly Glu Scr Pro Lys Leu Leu lie Tyr Val Val 180 185 190
Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 -99· 160878-序列表.doc 201242977
Gly Thr Asp Phe Thi Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala GIu Asp Leu 210 215 220
Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly 225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 245 <210> 159 <211> 237 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 159
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Arg lie Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala lie Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80
Val Gin Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gin Val Gin 115 120 125
Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 145 150 155 160
Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg lie 165 170 175
Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys 180 185 190
Ala He Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Val Gin Leu 195 200 205
160878-序列表.doc •】00- s 201242977
Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Scr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ser Asp 210 215 220
Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 160 <211> 238 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 160
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Scr lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phc Gin Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Val T^r Asp He Leu Glu Ser Gly Val Pro
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala 85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phc Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp Val Val 115 120 125
Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly Gin Pro Ala 130 135 140
Scr lie Scr Cys Lys Ser Ser Gin Scr Leu Leu Asp Scr Asp Gly Lys 145 150 155 160
Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gin Arg Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu 165 170 175
Leu He Tyr Val Thr Asp lie Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val 195 200 205
Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ala Thr His Phe 210 215 220
Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg -101 - 160878·序列表.doc 201242977 225 230 235 <210> 161 <2Π> 251 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 161
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Va) Arg lie Ser Cys Lys AJa Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Asn Leu His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr He Tyr Pro Tyr Asn Gly lie Thr Gly Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ala Tyr Asp Tyr Asp Tyr Leu Thr Asp Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Asp Leu Val 130 135 140
Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Scr Gly Tyr Thr 145 ISO 155 160
Phe Thr Asp Tyr Asn Leu His Trp Val Lys Gin Scr His Gly Lys Ser 165 170 175
Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Tyr Pro Tyr Asn Gly I】e Thr Gly Tyr 180 185 190
Asn Gin Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser 195 200 205
Asn Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Scr Ala 210 235 220
Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ala Tyr Asp Tyr Asp Tyr Leu Thr Asp 225 230 235 240
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 245 250 •102·
160878-序列表.doc 201242977 <210> 162 <211> 228 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 162
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Val lie Leu Ser Val Set Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Thr Ser Lys Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 lie His Tip Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Leu Pro Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Asn Trp Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro 115 120 125
Val lie Leu Ser Val Ser Fro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg 130 135 140
Thr Ser Lys Asn Val Gly Thr Asn lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr 145 150 155 160
Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Leu Pro 165 170 175
Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190
Leu Scr lie Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys 195 200 205
Gin Gin Ser Asn Asn Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 210 215 220
Glu lie Lys Arg 225
<210> 163 <211> 119 <212> PRT •103· 160878-序列表.doc 201242977 <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 163
Gin Val Gin Leu Gin G3n Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr He Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 丁yr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 164 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 164
Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Giu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Set Val Ser Tyr Met 20 25 30
Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly γΠιγ Ser Pro Lys Arg Trp lie Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 丁rp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Asn Arg 100 105 -104-
160878-序列表.doc 201242977 <210> 165 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 165
Gin Val Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser lie Thi Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60
Ser Arg Leu Scr lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 166 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 166
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Val lie Leu Scr Val Ser Pro Gly ] 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn 20 25 30 lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Scr Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Scr lie Asn Ser Va] Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr -105- 160878·序列表.doc 201242977 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 167 <211> 125 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 167
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Tlir Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 168 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 168
Asp lie Gin Met Thr Gin Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Tlir lie Thr Cys Arg Aia Ser Gin Giy lie Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu fie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 160878-序列表.doc •106· s 201242977
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Cys 85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 169 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 169
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ήιγ Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Sex Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Scr Leu Thr Ser Glu Asp Scr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Va] Ser Ala 115 120 <210> 170 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 170
Gin lie Val Leu Scr Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Pro Set Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr lie 20 25 30
His Ττρ Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr 35 40 45 -107- 160878-序列表.doc 201242977
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105 <210> 171 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 171
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ala Arg lie Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
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201242977
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Scr Leu Gin Pro 65 70 75 80
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accatggagt ttgggctgag ctggcttttl cttgtcgcga tttta 45 <210> 179 <21i> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 179 ggcccgctct gtttgagctg aacctgaggc cctttcgtgg aggcggagga cacggtcaga 60 gtggtaccct 70 <210> 180 <2il> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述··合成引子
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<400> 183 gccgcccccg gactcaagga gctgcacctc aggccctttc gtggaggcgg aggacacggt cagagtggta cc 60 72 <210> 184 <211> 72 <212> Wk <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 184 ggiaccactc tgaccgtgtc ctccgcctcc acgaaagggc ctgaggtgca gctccttgag tccgggggcg gc 60 72 <210> 185 <211> 375 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽
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s 201242977
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Gly Val He Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 305 310 315 320
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Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu 290 295 300
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Gin Val Gin Leu Gin Gin Scr Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Tro Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 160878-序列表.doc 117- 201242977
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Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Va) Gin Pro Ser GIti Ser Leu Ser 130 135 140 lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His 145 150 155 160
Trp Va〗 Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Va丨 lie 165 170 175
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 260 265 270
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Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr 245 250 255
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Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin 290 295 300
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160878-序列表.doc •120· s 201242977
Leu Scr Cys Ala Ala Scr Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr Tyr lie His 145 150 155 160
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Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190
Phe Thr He Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met 195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220
Gly Gly Asp Gly Fhe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Lys 245 250 255
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Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu 325 330 335
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Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly ITir 245 · 250 255
Asn lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 260 265 270 lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser 275 280 285
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Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro 305 310 315 320 -122- 160878-序列表.doc 201242977
Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Uu Glu Leu Lys Arg 325 330 <210> 197 <211> 70 <212> mk <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 197 agcgggagac tgggagagca cgatttgagg agctgcgacg gtgcgattga tctcaagctt agtgccacta 60 70
<210> 198 <211> 70 <212> Wk <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述··合成引子 <400> 198 tagtggcact aagcttgaga tcaatcgcac cgtcgcagct cctcaaatcg tgctctccca gtctcccgct 60 70 <210> 199 <211> 70 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 199 gccccaggtt gctgcagctg aacctgaggc cctttcgtgg aggcggagga cacggtcaga gtggtaccct 60 70
<21.0> 200 <211> 70 <2\2> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引子 <400> 200 agggtaccac tctgaccgtg tcctccgcct ccacgaaagg gcctcaggtt cagctgcagc aacctggggc 60 70 <210> 201 <211> 371 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 201 Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 160878-序列表.doc 123 _ 201242977 1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Scr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Scr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin 115 120 125
Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140
Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 145 150 155 160
Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp lie Gly Ala He 165 170 175
Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys 180 185 190
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu 195 200 205
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 210 215 220
Thv Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu 245 250 255
Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie 260 265 270
Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp 275 280 285
Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie Trp 290 295 300 160878-序列表.doc •124· s 201242977
Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phc Thr Ser Arg Leu Scr 305 310 .315 320 lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe Lys Met Asn Ser 325 330 335
Leu Gin Ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Ήιγ 340 345 350
Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 355 360 365
Val Ser Ala 370 <210> 202 <21L> 332 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 202
Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30
Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp lie Tyr 35 40 45
Asp Thr Scr Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Scr Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly TTir Scr Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Gla 65 70 75 80 '
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 )10
Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Pro Ser Pro Gly 115 120 125
Glu Lys Val Thr Met Ihr Cys Arg Ala Scr Ser Scr Val Ser Tyr lie 130 135 140
His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr 145 150 155 160
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Thr Scr Tyr Ser Leu Thr lie Set Arg Val Glu Ala Glu -125- 160878·序列表 _doc 201242977 180 185 190
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 195 200 205
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 210 215 220
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Val He Leu Ser Val Ser Pro Gly 225 230 235 240
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn 245 250 255 lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu He 260 265 270
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 275 280 285
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Ser 290 295 300
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Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15
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Thr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Giy Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asa Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Scr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
160878-序列表.doc -126- s 201242977
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120
Gly iSGln Val Gln
Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro 130 135
Ser Gln Ser Leu Ser 140 lie Thr Cys Thr Val Scr Gly Phc Ser Leu Thr 145 150 155
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Trp Leu Gly Val lie 175
Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro 180 185
Phe Thr Ser Arg Leu 190
Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val 195 200
Phe Phe Lys Met Asn 205
Scr Leu Gin Ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr 210 215
Cys Ala Arg Ala Leu 220
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Gln Gly Thr Leu Val 240
Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin 245 250
Val Gln Leu Gln Gln 255
Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 260 265
Va】Lys Met Ser Cys 270
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn 275 280
Met His Trp Val Lys 285
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Ala lie Tyr Pro Gly 300
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Giy Thr Thr Val Thr 365
Val Ser Ala 370 <210> 204 <211> 332 <212> PRT <213>人工序列 160878·序列表.doc -127· 201242977 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 204
Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala He Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
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Gly SeT Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95
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Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Val lie Leu Ser Val Ser Pro Gly 115 120 125
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn 130 135 140
He His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie 145 150 155 160
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 165 170 175
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Ser 180 185 190
Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Asn Asn Trp Pro Thr 195 200 205
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 210 215 220
Pro Gin lie Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Pro Ser Pro 225 230 235 240
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr 245 250 255 lie His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie 260 265 270
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly 275 280 285
160878-序列表.doc -128· s 201242977
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala 290 295 300
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Ser Asn Pro Pro 305 310 315 320
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 325 330
<210> 205 <211> 5 <212> PRT 人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成肽 <400> 205
Gly Gly Gly Gly Ser I 5
129· 160878-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201242977 七、申請專利範圍： 1. 一種包含多肽鍵之結合蛋白，其中該多肽鏈包含VD1-(Xl)n-VD2r(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中： VD1為第一重鏈可變異域； VD2為第二重鏈可變異域； VD3為第三重鏈可變異域； C為重鏈恆定域； XI為第一連接子； φ X2為第二連接子； X3為Fc區，且 η為0或1 ; 其中該結合蛋白能夠結合一至三個目標抗原。 2. 一種包含多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包含VD1-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中： VD1為第一輕鏈可變異域； VD2為第二輕鏈可變異域； # VD3為第三輕鏈可變異域； C為輕鏈恆定域； XI為第一連接子； X2為第二連接子； X3不包含Fc區；且 η為0或1 ; 其中該結合蛋白能夠結合一至三個目標抗原。 3· 一種包含第一及第二多肽鏈之結合蛋白，其中該第一多 160878.doc 201242977 肽鍵包含第一VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n， 其中 VD1為第一重鍵可變異域； VD2為第二重鍵可變異域； VD3為第三重鏈可變異域； C為重鏈怪定域； XI為第一連接子； X2為第二連接子； 且 X3為Fc區；且 其中該第二多肽鏈包含第二VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中 VD1為第一輕鏈可變異域； VD2為第二輕鏈可變異域； VD3為第三輕鍵可變異域； C為輕鏈恆定域； XI為第一連接子； X2為第二連接子；且 X3不包含Fc區；且 η為0或1 ’其中該結合蛋白能夠結合一至三個目標抗 原。 4. 一種包含四個多肽鏈之結合蛋白，其中該第一及該第三 多肽鏈各獨立地包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中 160878.doc 201242977 VD1為第一重鏈可變異域； VD2為第二重鏈可變異域； VD3為第三重鏈可變異域； C為重鏈恆定域； XI為第一連接子； X2為第二連接子； X3為Fc區；且 其中該第二及該第四多肽鏈各獨立地包含VD1_(xl)n_ • VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n，其中 VD1為第一輕鏈可變異域； VD2為第二輕鏈可變異域； VD3為第三輕鏈可變異域； C為輕鏈恆定域； XI為連接子； X2為第二連接子； X3不包含Fc區；且 _ n為0或1;其中該結合蛋白能夠結合一至六個目標抗 原。 5. 如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中該Fcg係選自 由原生序列F c區及變異序列F c區組成之群。 6. 如請求項5之結合蛋白’其中該Fc區係選自由來自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE及 IgD之 Fc 區 組成之群。 7. 如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中VD1、VD2及 160878.doc 201242977 者或兩者以上係獨立地得自相同親本結合蛋白 或其抗原結合部分。 .如”月求項1至4中任一項之結合蛋白，其中彻、彻及 獨立地件自相同親本結合蛋白或其抗原結合部 分0 9. 如明求項1至4中任一項之結合蛋白，其中彻、及 VD3中兩者或兩者以上係獨立地得自不同親本結合蛋白 或其抗原結合部分。 10. 士凊求項1至4中任一項之結合蛋白，其中及 VD3各獨立地得自不同親本結合蛋白或其抗原結合部 分。 11·如吻求項9或10之結合蛋白，其中該等不同親本結合蛋 白係結合目標抗原上之相同抗原決定基。 12. 如請求項9或1〇之結合蛋白，其中該等不同親本結合蛋 白係結合目標抗原上之不同抗原決定基。 13. 如請求項9或1〇之結合蛋白，其中該等不同親本結合蛋 白或其抗原結合部分係依不同效能結合其各別目標抗 原。 14. 如請求項9或1〇之結合蛋白，其中該等不同親本結合蛋 白或其抗原結合部分係依不同親和力結合其各別目標。 15. 如請求項9或10之結合蛋白’其中該等不同親本結合蛋 白或其抗原結合部分係獨立地選自由人類抗體、CDR移 植抗體及人類化抗體組成之群。 16. 如請求項9或10之結合蛋白，其中該不同親本抗體或其 160878.doc 201242977 抗原結合部分係獨立地選自由以下組成之群：Fab片 段’ F(ab h片段；包含在鉸鏈區處由二硫橋鍵連接之兩 個Fab片段之二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段； 由抗體之單一臂之VL&VH域組成的以片段；dAb片段； 分離之互補決定區（CDR);單鏈抗體；及雙功能抗體。 17·如請求項7或8之結合蛋白，其中該相同親本結合蛋白或 其抗原結合部分係選自由人類抗體、CDR移植抗體及人 類化抗體組成之群。 18. 如請求項7或8之結合蛋白，其中該相同親本結合蛋白或 其抗原結合部分係選自由以下組成之群：Fab片段； F(ab h片段；包含在鉸鏈區處由二硫橋鍵連接之兩個Fab 片段之二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體 之單一臂之VL及VH域組成的Fv片段；dAb片段；分離之 互補決定區（CDR);單鏈抗體；及雙功能抗體。 19. 如請求項1至18中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白 具有至少一種由該親本結合蛋白或其抗原結合部分展現 之所要性質。 20. 如清求項19之結合蛋白，其中該所要性質係選自一或多 個結合蛋白參數。 21·如請求項19之結合蛋白，其中該等結合蛋白參數係選自 由以下組成之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效 能、生物功能、抗原決定基識別、穩定性、溶解性、生 產效率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交 叉反應性及直系同源抗原結合。 160878.doc 201242977 22.如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中該一或多個目 標抗原係選自由以下組成之群：ABCF1 ; ACVR1 ; ACVR1B ； ACVR2 ； ACVR2B ； ACVRL1 ； ADORA2A ； 聚集蛋白聚糖（Aggrecan) ; AGR2 ; AICDA ; AIF1 ; AIG1 ； AKAP1 ； AKAP2 ； AMH ； AMHR2 ； ANGPT1 ； ANGPT2 ； ANGPTL3 ； ANGPTL4 ； ANPEP ； APC ； APOC1 ; AR ; AZGP1(鋅- a-醣蛋白）；B7.1 ; Β7·2 ; BAD ； BAFF ； BAG1 ； BAI1 ； BCL2 ； BCL6 ； BDNF ； BLNK ； BLR1(MDR15) ； BlyS ； BMP1 ； BMP2 ； BMP3B(GDF10) ； BMP4 ； BMP6 ； BMP8 ； BMPR1A ； BMPR1B ; BMPR2 ; BPAG1(網蛋白（plectin)) ; BRCA1 ; C19orflO(IL27w) ； C3 ； C4A ； C5 ； C5R1 ； CANT1 ； CASP1 ； CASP4 ； CAV1 ； CCBP2(D6/JAB61) ； CCL1(1-3 0 9) ; CCL1 1 (嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin)); CCL13(MCP-4) ； CCL15(MIP-ld) ； CCL16(HCC-4)； CCL17(TARC) ； CCL18(PARC) ； C C L 1 9 (ΜIP - 3 b)； CCL2(MCP-1) ； MCAF ； CCL20(MIP-3a) ； CCL21(MIP-2 ) ； S L C ；非淋巴組織趨化因子（e x o d u s ) - 2 ; CCL22(MDC/STC-1) ； CCL23(MPIF-1) ； CCL24(MPIF-2/ 嗜酸性粒細胞趨化因子-2) ; CCL25(TECK) ; CCL26(嗜 酸性粒細胞趨化因子-3) ; CCL27(CTACK/ILC) ; CCL28 ; CCL3(MIP-la) ； CCL4(MIP-lb) ； CCL5(RANTES) ； CCL7(MCP-3)； CCL8(mcp-2) ； CCNA1 ； CCNA2 ； CCND1 ； CCNE1 ； CCNE2 ； CCR1(CKR1/HM145) ； CCR2(mcp-lRB/RA) ； CCR3(CKR3/CMKBR3)； 160878.doc 201242977
    CCR4 ； CCR5(CMKBR5/ChemR13) ； CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6) ； CCR7(CKR7/EBI1) ； CCR8(CMKBR8/TER1/ CKR-L1) ； CCR9(GPR-9-6) ； CCRLl(VSHKl) ； CCRL2(L-CCR)； CD164 ； CD19 ； CD1C ； CD20 ； CD200 ； CD-22 ； CD24 ； CD28 ； CD3 ； CD37 ； CD38 ； CD3E ； CD3G ； CD3Z ； CD4 ； CD40 ； CD40L ； CD44 ； CD45RB ； CD52 ； CD69 ； CD72 ； CD74 ； CD79A ； CD79B ; CD8 ; CD80 ; CD81 ; CD83 ; CD86 ; CDH1 (E-鈣黏附 蛋白（E-cadherin)) ; CDH10 ; CDH12 ; CDH13 ; CDH18 ； CDH19 ； CDH20 ； CDH5 ； CDH7 ； CDH8 ； CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7； CDK9 ； CDKNlA(p21Wapl/Cipl) ； CDKNlB(p27Kipl)； CDKN1C ； CDKN2A(pl6INK4a) ； CDKN2B ； CDKN2C ； CDKN3 ; CEBPB ; CER1 ; CHGA ; CHGB ;殼質酶 (Chitinase) ； CHST10 ； CKLFSF2 ； CKLFSF3 ； CKLFSF4 ； CKLFSF5 ； CKLFSF6 ； CKLFSF7 ； CKLFSF8 ; CLDN3 ; CLDN7(緊密連接蛋白-7(〇1&11以11-7)) ; CLN3 ; CLU(凝集素（clusterin)) ; CMKLR1 ; CMKORl(RDCl) ； CNR1 ； COL18A1 ； COL1A1 ； COL4A3 ； COL6A1 ； CR2 ； CRP ； CSFl(M-CSF)； CSF2(GM-CSF) ; CSF3(GCSF) ; CTLA4 ; CTNNBl(b-索 烴素（b-catenin)) ; CTSB(組織蛋白酶 B(cathepsin B)); CX3CL1(SCYD1) ； CX3CR1(V28) ； CXCLl(GROl)； CXCLIO(IP-IO) ； CXCLll(I-TAC/IP-9) ； CXCL12(SDF1)； CXCL13 ； CXCL14 ； CXCL16 ； CXCL2(GR02)； 160878.doc 201242977 CXCL3(GR03) ； CXCL5(ENA-78/LIX) ； CXCL6(GCP-2) ； CXCL9(MIG) ； CXCR3(GPR9/CKR-L2) ； CXCR4 ； CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo) ； CYB5 ； CYC1 ； CYSLTR1 ； CGRP ； Clq ； Clr ； Cl ； C4a ； C4b ； C2a ； C2b ； C3a ； C3b ； DAB2IP ； DES ； DKFZp45 1 JO 11 8 ； DNCL1 ; DPP4 ; E-選擇素（E-selectin) ; E2F1 ; ECGF1 ; EDG1 ; EFNA1 ; EFNA3 ; EFNB2 ; EGF ; EGFR ; ELAC2 ； ENG ； ENOl ； EN02 ； EN03 ； EPHB4 ； EPO ； ERBB2(Her-2) ； EREG ； ERK8 ； ESR1 ； ESR2 ； F3(TF)； 因子VII;因子IX;因子V;因子Vila;因子X;因子 XII ;因子 XIII ; FADD ; FasL ; FASN ; FCER1A ; FCER2 ; Fey受體；FCGR3A ; FGF ; FGFl(aFGF); FGF10 ； FGF11 ； FGF12 ； FGF12B ； FGF13 ； FGF14 ； FGF16 ； FGF17 ； FGFI8 ； FGF19 ； FGF2(bFGF)； FGF20 ； FGF21 ； FGF22 ； FGF23 ； FGF3(int-2)； FGF4(HST) ； FGF5 ； FGF6(HST-2) ； FGF7(KGF) ； FGF8 ； FGF9 ； FGFR3 ； FIGF(VEGFD) ； FIL1 (EPSILON)； FILl(ZETA) ; FLJ12584 ; FLJ25530 ; FLRT1(纖維結合蛋 白（fibronectin)) ; FLT1 ; FOS ; FOSLl(FRA-l); FY(DARC) ； GABRP(GABAa) ； GAGEB1 ； GAGEC1 ； GALNAC4S-6ST ； GATA3 ； GDF5 ； GFI1 ； GGT1 ； GM- CSF ； GNAS1 ； GNRH1 ； GPR2(CCR10) ； GPR31 ； GPR44 ； GPR8 1 (FKSG80) ； GRCCIO(CIO) ； GRP ； GSN(膠溶素（Gelsolin)) ; GSTP1 ;醣蛋白（GP)IIb/IIIa ; 160878.doc s 201242977
    HAVCR2 ； HDAC4 ； HDAC5 ； HDAC7A ； HDAC9 ； Her2 ; HGF ; HIF1A ; HIP1 ;組織胺及組織胺受體； HLA-A ； HLA-DRA ； HM74 ； HMGB1 ； HMOX1 ; HUMCYT2A ; ICEBERG ; ICOSL ; ID2 ; IFN-a ; IFNA1 ； IFNA2 ； IFNA4 ； IFNA5 ； IFNA6 ； IFNA7 ； IFNB1 ； IFNy ； IFNW1 ； IGBP1 ； IGF1 ； IGF1R ； IGF2 ； IGFBP2 ； IGFBP3 ； IGFBP6 ； IL-1 ； IL-la ； IL-Ιβ ； BL10 ； IL10RA ； IL10RB ； IL11 ； IL11RA ； IL-12 ； IL12A ； IL12B ； IL12RB1 ； IL12RB2 ； IL13 ； IL13RA1 ； IL13RA2 ； IL14 ； IL15 ； IL15RA ； IL16 ； IL17 ； IL17B ； IL17C ； IL17R ； IL18 ； IL18BP ； IL18R1 ； IL18RAP ; IL19 ； ILIA ； IL1B ； IL1F10 ； IL1F5 ； IL1F6 ； IL1F7 ； IL1F8 ； IL1F9 ； IL1HY1 ； IL1R1 ； IL1R2 ； IL1RAP ； IL1RAPL1 ； IL1RAPL2 ； IL1RL1 ； IL1RL2 ； IL1RN ； IL2 ； IL20 ； IL20RA ； IL21R ； IL22 ； IL22R ； IL22RA2 ； IL23 ； IL24 ； IL25 ； IL26 ； IL27 ； IL28A ； IL28B ； IL29 ； IL2RA ； IL2RB ； IL2RG ； IL3 ； IL30 ； IL3RA ； IL4 ； IL4R ； IL5 ； IL5RA ； IL6 ； IL6R ； IL6ST(醣蛋白 130) ; IL7 ; IL7R ; IL8 ; IL8RA ; IL8RB ; IL8RB ； IL9 ； IL9R ； ILK ； INHA ； INHBA ； INSL3 ； INSL4 ； IRAKI ； IRAK2 ； ITGA1 ； ITGA2 ； ITGA3 ； ITGA6(a6整合素）；ITGAV ; ITGB3 ; ITGB4(b 4整合 素）；JAG1 ; JAK1 ; JAK3 ; JUN ; K6HF ; KAI1 ; KDR ; KITLG ; KLF5(GC 盒 BP) ; KLF6 ; KLK10 ; 160878.doc 201242977 KLK12 ; KLK13 ; KLK14 ; KLK15 ; KLK3 ; KLK4 ; KLK5 ; KLK6 ; KLK9 ; KRT1 ; KRT19(角蛋白 19); KRT2A ; KRTHB6(毛髮特異性II型角蛋白）；L-選擇素； LAMA5 ; LEP(瘦素（leptin)) ; Lingo-p75 ; Lingo-Troy ; LPS ； LTA(TNF-b) ； LTB ； LTB4R(GPR16) ； LTB4R2 ； LTBR ; MACMARCKS ; MAG *Omgp;MAP2K7(c-Jun) ; MDK ; MIB1 ;中期因子（11^41<:1116);]^1?;141?-2 ； MKI67(Ki-67) ； MMP2 ； MMP9 ； MS4A1 ； MSMB ； MT3(金屬硫連接蛋白-Ill(metallothionectin-III)); MTSS1 ; MUC1(黏蛋白（mucin)) ; MYC ; MYD88 ; NCK2 ;神經蛋白聚糖（neurocan) ; NKG2D ; NFKB1 ; NFKB2 ； NGF ； NGFB(NGF) ； NGFR ； NgR-Lingo ； NgR-Nogo66(Nogo) ； NgR-p75 ； NgR-Troy ； NME1(NM23A)； NOX5 ； NPPB ； NR0B1 ； NR0B2 ； NR1D1 ； NR1D2 ； NR1H2 ； NR1H3 ； NR1H4 ； NRII2 ； NRII3 ； NR2C1 ； NR2C2 ； NR2E1 ； NR2E3 ； NR2F1 ； NR2F2 ； NR2F6 ； NR3C1 ； NR3C2 ； NR4A1 ； NR4A2 ； NR4A3 ； NR5A1 ； NR5A2 ； NR6A1 ； NRP1 ； NRP2 ； NT5E ； NTN4 ； ODZ1 ； OPRD1 ； P2RX7 ； PAP ； PARTI ； PATE ； PAWR ； PCA3 ； PCNA ； PDGFA ； PDGFB ； PECAM1 ； PF4(CXCL4) ; PGE2 ; PGF ; PGR ;填酸蛋白聚糠 (phosphacan) ; PIAS2 ; PIK3CG ;纖維蛋白溶酶原活化 因子；PLAU(uPA) ; PLG ; PLXDC1 ; PPBP(CXCL7); PPID ; PR1 ; PRKCQ ; PRKD1 ; PRL ; PROC ;蛋白質 160878.doc -10- s 201242977 C ； PROK2 ； PSAP ； PSCA ； PTAFR ； PTEN ； PTGS2(COX-2) ； PTN ； RAC2(p21 Rac2) ； RAGE ； RARB ； RGS1 ； RGS13 ； RGS3 ； RNF1 1 0(ZNF144)； R0B02 ; SI00A2 ; SCGB1D2(親脂性蛋白 B(lipophilin B)); SCGB2A1(乳腺珠蛋白 2(mammaglobin 2)); SCGB2A2(乳腺珠蛋白1) ; SCYE1(内皮單核細胞活化細 胞激素）；SDF2 ; SERPINA1 ; SERPINA3 ; SERPINB5(乳腺絲抑蛋白（maspin)) ; SERPINEl(PAI-l); SERPINF1 ； SHBG ； SLA2 ； SLC2A2 ； SLC33A1 ； SLC43A1 ； SLIT2 ； SPP1 ； SPRRlB(Sprl) ； ST6GAL1 ； STAB1 ; STAT6 ; STEAP ; STEAP2 ; P物質；TB4R2 ; TBX21 ； TCP10 ； TDGF1 ； TEK ； TGFA ； TGFB1 ； TGFB111 ； TGFB2 ； TGFB3 ； TGFBI ； TGFBR1 ； TGFBR2 ; TGFBR3 ; TH1L ; THBS1 (血小板反應蛋白_ l(thrombospondin-l)) ； THBS2 ； THBS4 ； ΤΗΡΟ ； TIE(Tie-l) ; TIMP3 ;組織因子；TLR10 ; TLR2 ; TLR3 ； TLR4 ； TLR5 ； TLR6 ； TLR7 ； TLR8 ； TLR9 ； TNF ; TNF-a ; TNFAIP2(B94) ； TNFAIP3 ; TNFRSF11A ； TNFRSF1A ； TNFRSF1B ； TNFRSF21 ； TNFRSF5 ； TNFRSF6(Fas) ； TNFRSF7 ； TNFRSF8 ； TNFRSF9 ； TNFSFIO(TRAIL) ； TNFSF 11 (TRANCE)； TNFSF12(AP03L) ； TNF S F 1 3 (Apri 1) ； TNFSF13B ； TNFSF14(HVEM-L) ； TNFSF1 5(VEGI) ； TNFSF18 ； TNFSF4(OX40配體）；TNFSF5(CD40酉己體）； 160878.doc -11 - 201242977 TNFSF6(FasL) ; TNFSF7(CD27 酉己體）；TNFSF8(CD30 西己 體）；TNFSF9(4-1BB 配體）；TOLLIP ; Toll 樣受體； TOP2A(拓撲異構酶 Iia) ; TP53 ; TPM1 ; TPM2 ; TRADD ； TRAF1 ； TRAF2 ； TRAF3 ； TRAF4 ； TRAF5 ； TRAF6 ； TREM1 ； TREM2 ； TRPC6 ； TSLP ； TWEAK ； 血检調節蛋白；凝血酶；VEGF ; VEGFB ; VEGFC ;多 功能蛋白聚糖（versican) ; VHL C5 ; VLA-4 ; XCL1 (淋巴 細胞趨化因子）；XCL2(SCM-lb) ; XCR1(GPR5/CCXCR1); YY1 ;及 ZFPM2。 23. 如請求項22之結合蛋白，其中該結合蛋白包含選自由 SEQ ID NO:185及187組成之群之三重可變異域免疫球蛋 白（TVD-Ig)重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO:186 及188組成之群之三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)輕鏈 胺基酸序列。 24. 如請求項22之結合蛋白，其中該結合蛋白包含選自由 SEQ ID NO:193及195組成之群之三重可變異域免疫球蛋 白（TVD-Ig)重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO:194 及196組成之群之三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)輕鏈 胺基酸序列。 25. 如請求項22之結合蛋白，其中該結合蛋白包含選自由 SEQ ID NO:201及203組成之群之三重可變異域免疫球蛋 白（TVD-Ig)重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO:202 及204組成之群之三重可變異域免疫球蛋白（TVD-Ig)輕鏈 胺基酸序列。 160878.doc 12· 201242977 26.如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白能 夠結合選自由以下組成之群之三個目標抗原：前列腺素 E2(PGE2)、介白素13(IL-13)、介白素18(IL-18)、腫瘤壞 死因子 a(TNFa)、介白素 23(IL-23)、IL-12、HMGB1、 VEGF、RAGE、NGF、IL-la、IL-Ιβ、E-選擇素、L-選 擇素、醣蛋白（GP)IIb/IIIa、血栓調節蛋白、凝血酶、 CGRP、TREM、PAI-I、ανβ3 ' uPA、Her2、IGF1R、 EGFR、CD3、NKG2D、P物質、蛋白質c、因子VII、因 子IX、纖維蛋白溶酶原活化因子、因子V、因子VIIa、 因子 X、因子 XII、因子 XIII、Clq、Clr、Cls、C4a、 C4b、C2a、C2b、C、C3a及C3b。 27. 如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白能 夠調節該一或多個目標抗原之生物功能。 28. 如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白能 夠中和該一或多個目標抗原之生物功能。 29·如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中該一或多個目 標抗原係選自由細胞激素、趨化因子、細胞表面蛋白、 酶及受體組成之群。 30_如請求項29之結合蛋白，其中該細胞激素係選自由淋巴 激素、單核球激素及多肽激素組成之群。 31 ·如請求項30之結合蛋白，其中該細胞激素係選自由以下 組成之群：生長激素；副曱狀腺激素（pamhyr〇id hormone)，曱狀腺素（thyroxine);騰島素；胰島素原 (proinsulin);鬆弛素（relaxin);鬆弛素原（pr〇reiaxin); 160878.doc •13· 201242977 醣蛋白激素；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；泌乳 素（prolactin);胎盤生乳素（placental iact〇gen);腫瘤壞 死因子-α及腫瘤壞死因子-β ;穆勒氏管抑制物質 (mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素 (gonadotropin)相關肽；抑制素（inhibin);活化素 (activin);血管内皮生長因子；整合素（integrin);血小 板生成素（thrombopoietin，TPO);神經生長因子；血小 板生長因子’胎盤生長因子（placental growth factor); 轉化生長因子（TGF);胰島素樣生長因子-丨及胰島素樣生 長因子-11 ;紅血球生成素（erythropoietin，EPO);骨生 成誘導因子（osteoinductive factor);干擾素（interferon); 群落刺激因子（CSF) ; IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23 及 IL-33 ;腫瘤 壞死因子；LIF ;及kit配體（KL)。 32. 如請求項3 1之結合蛋白，其中該結合蛋白包含選自由 SEQ ID NO:45及55組成之群之三重可變異域免疫球蛋白 (TVD-Ig)重鏈胺基酸序列；及選自由seq m NO:50及58 組成之群之三重可變異域免疫球蛋白（TVD_Ig)輕鏈胺基 酸序列。 33. 如請求項31之結合蛋白，其中該結合蛋白包含SEQ m NO:69令所示之三重可變異域免疫球蛋白（TVD_Ig)重鏈 胺基酸序列；及SEQ ID NO:72中所示之三重可變異域免 疫球蛋白（TVD-Ig)輕鍵胺基酸序列。 160878.doc 14 201242977 34. 如請求項29之結合蛋白，其中該趨化因子係選自由 CCR2、CCR5 及 CXCL-13 組成之群。 35. 如請求項29之結合蛋白，其中該細胞表面蛋白係選自由 CTLA4及TNFRSF1B組成之群。 36. 如請求項29之結合蛋白，其中該酶係選自由激酶及蛋白 酶組成之群。 37. 如請求項29之結合蛋白，其中該受體係選自由淋巴激素 受體、單核球激素受體及多肽激素受體組成之群。 • 38.如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中該第一及該第二 連接子包含獨立地選自由以下組成之群之胺基酸序列：
    AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID ΝΟ:1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO:2) ； AKTTPKLGG(SEQ ID NO:3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:4) ； SAKTTP(SEQ ID NO:5) ； RADAAP(SEQ ID NO:6)； RADAAPTVS(SEQ ID NO:7) ； RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:8)； RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:9) ; SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:12) ； TVAAP(SEQ ID NO:13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:14)； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16)； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18)； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:20)； ASTKGP(SEQ ID NO:21) ； ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:22)； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23) ； GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO:24) ； GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:25)； G Η E A A AV M Q V Q Y P A S ( S E Q ID N 0 : 2 6 )； -15- 二' 160878.doc 201242977 39 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID N〇:27);及 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID N〇:28)。 一種結合蛋白結合物’其包含如請求項1至4令任一項之 結合蛋白及選自由免疫黏附分子、顯影劑、治療劑及細 胞毒性劑組成之群之試劑。 如凊求項3 9之結合蛋白結合物，其中該試劑為選自由以 下組成之群之顯影劑：放射性標記、酶、螢光標記、發 光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。 如請求項40之結合蛋白結合物，其中該顯影劑為選自由 以下組成之群之放射性標記：3H、！4C、35s、90γ、 "Tc、"〗Ιη、丨25】、131ι、丨 77Lu、丨 66η〇 及丨5、。
    如請求項39之結合蛋白結合物，其中該試劑為選自由以 下組成之群之治療劑或細胞毒性劑··抗代謝物、烷基化 劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗 有絲分裂劑、蒽環黴素（anthraeycline)、毒素及細胞〉周亡 劑。 如請求項1至4中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白為 結晶結合蛋白。 如唄求項43之結合蛋白’其中該結晶結合蛋白為無載劑 醫藥控制釋放晶體。 如請求項43之結合蛋白’其活體内半衰期大於該結合蛋 白之可溶性對應物。 如请求項43之結合蛋白，纟中該結合蛋白保留生物活
    160878.doc S 16 201242977 47. 如請求項⑴中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白之 製法包括在足以產生該結合蛋白之條件下，在培養基中 培養宿主細胞’其中該宿主細胞包含載體，該載體包含 編碼該結合蛋白之核酸。 48. —種醫藥組合物，其包含如請求項1至38及43至46中任 一項之結合蛋白及醫藥學上可接受之载劑。 49. 如請求項48之醫藥組合物，其另外包含至少一種其他試 劑。 50. 如請求項49之醫藥組合物，其中該其他試劑為治療劑或 顯影劑。 51. 如請求項49之醫藥組合物，其中該其他試劑係選自由以 下組成之群：治療劑、顯影劑、細胞毒性劑、血管生成 抑制劑，激酶抑制劑；共刺激分子阻斷劑；黏附分子阻 斷劑，抗細胞激素抗體或其功能片段；曱胺喋呤 (methotrexate)；環孢素（Cyclosporin);雷帕黴素 (rapamycin) ; FK506 ;可偵測標記或報導體；TNI^抗 劑；抗風濕藥；肌肉鬆弛劑、麻醉劑（narc〇tic)、非類固 醇消炎藥（NSAID)、止痛劑、麻醉劑（anesthetic)、鎮靜 劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛 皮癬藥（antipsoriatic)、皮質類固醇、同化類固醇、紅血 球生成素、免疫劑、免疫球蛋白 '免疫抑制劑、生長激 素、激素替代藥物、放射性醫藥、抗抑鬱劑、抗精神病 藥、刺激劑、哮喘藥物、β促效劑、吸入性類固醇、腎 上腺素（epinephrine)或類似物、細胞激素及細胞激素拮 160878.doc 17 201242977 抗劑。 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 種醫藥組合物，其包含如請求項3 9之結合蛋白結合物 及醫藥學上可接受之載劑。 如》月求項52之醫藥組合物，其中該結合蛋白結合物包含 選自由以下組成之群之顯影劑：放射性標記、酶、螢光 枯圯、發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。 如凊求項53之醫藥組合物，其中該顯影劑為選自由以下 、卫成之群之放射性標記：3h、丨4c、35s、90γ、99tc、 丨、、丨251、丨3丨1、i”Lu、i“H〇及 153Sm。 如”月求項52之醫藥組合物，其中該結合蛋白結合物包含 選自由以下組成之群之治療劑或細胞毒性劑：抗代謝 物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞激素、抗血管 生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒素及細胞〉周亡 劑。 ’其另外包含第二試劑。 ’其中該第二試劑為治療劑或 如請求項52之醫藥組合物 如請求項56之醫藥組合物 顯影劑》 如睛來項57之醫 自以下群組：細胞毒性劑、灰管生成抑制劑、激酶押 劑、共刺激分子阻斷劑、黏附分子阻斷劑、抗細胞激 抗體或其功能片段、甲胺噪吟、環抱素、雷帕黴素 FK506、可偵測標記或報導體、tnf拮抗劑、抗風 藥、肌肉鬆弛劑、麻醉劑、非類固醇消炎藥⑽⑽ 止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉四 160878.doc 201242977 劑、抗微生物劑、抗牛皮癖藥、 皮質類固酵、同化類固 知、紅血球生成素、免疫劑、 . Ε ^ φ 免疫球蛋白、免疫抑制 劑、生長激素、激素替代荸物 1乂罙物放射性醫藥、3η、14c、 35 s )Y、99Tc、"】In 12 5ι、 I3l 1 ' 1?7Lu ^ 166Ho ^ no /SL Sm、螢光標記、發光標記、生 初發光標、磁性標 5己、生物素、抗抑鬱劑、抗精神 4甲届樂、刺激劑、哮喘藥 物、β促效劑、吸入性類固醇、腎 ’上腺素或類似物、細 胞激素及細胞激素拮抗劑。
    其中如藉由表面電 或多個目標之締合 至少約ΙΟ2 Μ、·1 ; 至少約ΙΟ5 Μ、·1 ; 59.如請求項1至4中任一項之結合蛋白， 漿子共振所量測，該結合蛋白對該— 速率常數（Κ〇η)係選自由以下組成之群： 至少約103 M-1s_1 ;至少約1〇4 μ'-ι ; 及至少約ΙΟ6 ΜΎ1。 60. 如請求項1至4中任一項之結合蛋白甘 口龙白，其中如藉由表面電 漿子共振所量測’該結合蛋白對該—七文 τ 或多個目標之解離 速率常數（Koff)係選自由以下組成之群：至多約ι〇_3 (丨； 至多約10-4 s-ι;至多約10-5 s-ι;及至多約1〇-6一。 ’ 61. 如請求項丨至4中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白對 該一或多個目標之解離常數（KD)係選自由以下組成之 群：至多約ΙΟ·7 Μ ;至多約ΙΟ·8 Μ ;至多約1〇-9 M ;至多 約1〇-10Μ;至多約10-丨丨至多約10•丨2M;及至多1〇•丨3m。 62· —種分離之核酸分子’其包含編碼如請求項1至4中任一 項之結合蛋白之核苷酸序列。 63. —種載體，其包含如請求項62之分離之核酸。 160878.doc -19· 201242977 64. 如請求項63之載體，其中該載體係選自由以下組成之 群：pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、 pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO及 pBJ。 65. —種宿主細胞，其包含如請求項63之載體。 66. 如請求項64之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞。 67. 如請求項66之宿主細胞，其中該宿主細胞為大腸桿菌（五· coli)。 68. 如請求項65之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。 69. 如請求項68之宿主細胞，其中該真核細胞係選自由以下 組成之群：原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌 細胞。 70. 如請求項68之宿主細胞，其中該真核細胞為選自由以下 組成之群之動物細胞：哺乳動物細胞、禽類細胞及昆蟲 細胞。 71. 如請求項65之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞。 72. 如請求項65之宿主細胞，其中該宿主細胞為COS細胞。 73. 如請求項65之宿主細胞，其中該宿主細胞為酵母細胞。 74. 如請求項70之宿主細胞，其中該酵母細胞為釀酒酵母 («SaccAaromyces cerevzWae) ° 75. 如請求項65之宿主細胞，其中該宿主細胞為昆蟲Sf9細 胞。 76. —種產生結合蛋白之方法，其包括在足以產生該結合蛋 白之條件下’在培養基中培養如請求項65至75中任一項 之宿主細胞。 160878.doc 201242977 7 7 ·如請求項7 6之太、、ι >去’其中所產生結合蛋白中之5〇%_75〇/〇 為二重特異性六價結合蛋白。 求項76之方法，其中所產生結合蛋白中之75%-90% 為三重特異性六價結合蛋白。 79.如請求項76之方 法’其中所產生結合蛋白中之9〇%_95% 為三重特異性六價結合蛋白。 8〇·種蛋白質，其係根據如請求項76之方法產生。 81.種冶療個體之疾病或病症之方法，其包括向該個體投 與/口療有效量之如請求項m中任一項之結合蛋白，藉 此治療該疾病或病症^ 如咱求項8 1之方法，其中該病症係選自由以下組成之 群.類風濕性關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、 敗血性關節炎、萊姆關節炎（Lyme arthdtis)、牛皮癖性 關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡 症（systemic lupus erythematosus)、克羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、胰島素依賴性糖 尿病、甲狀腺炎（thyroiditis)、哮喘、過敏性疾病、牛皮 癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反 應、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、類肉瘤病 (sarcoidosis)、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝血、川崎 氏病（Kawasaki’s disease)、格雷氏病（Grave，s disease)' 腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫病 (Wegener’s granulomatosis)、亨偌·絲奇恩賴紫癜 (Henoch-Schoenlein purpurea)、腎顯微性血管炎、慢性 \60S72.doc 21 201242977 活動型肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候 群、敗血症症候群、惡病質（cachexia)、感染性疾病、寄 生蟲病、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎 (acute transverse myelitis)、亨廷頓氏舞蹈病 (Huntington's chorea)、帕金森氏病（parkinson，s disease)、阿兹海默氏病（Alzheimer’s disease)、中風、原 發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性疾病、心臟衰 竭、心肌梗塞、艾迪森氏病（Addison’s disease)、偶發性 I型多腺體分泌不足症（polyglandular deficiency)及II型多 腺體分泌不足症、施密特氏症候群（Schmidt's syndrome)、成人（急性）呼吸窘迫症候群、脫髮、斑形脫 髮、血清陰性關節病（seronegative arthopathy)、關節 病、萊特爾氏病（Reiter's disease)、牛皮癬性關節病、潰 瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎、與彼衣菌 (chlamydia)、耶氏捍菌（yersinia)及沙門氏菌（salmonella) 相關之關節病、脊椎關節病 '動脈粥樣化疾病/動脈硬 化、異位性過敏、自體免疫大皰病（autoimmune bullous disease)、尋常天范瘡（pemphigus vulgaris)、落葉型天范 瘡（pemphigus foliaceus)、類天范瘡（pemphigoid)、線性 IgA病（linear IgA disease)、自體免疫溶血性貧血、庫姆 氏陽性溶血性貧 jk (Coombs positive haemolytic anaemia)、後天性惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛腦 炎/皇家自由病（Royal Free Disease)、慢性黏膜皮膚念珠 菌病（chronic mucocutaneous candidiasis)、巨細胞動脈 160878.doc . -22- 201242977
    炎、原發性硬化性肝炎、隱源性自體免疫肝炎 (cryptogenic autoimmune hepatitis)、後天性免疫缺乏病 症候群（Acquired Immunodeficiency Disease Syndrome)、 後天性免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、C型肝炎、一般變 異性免疫缺乏症（一般變異性低丙種球蛋白血症（common variable hypogammaglobulinaemia)) > 擴張性心肌病、雌 性不孕症、卵巢功能衰竭、早發性卵巢功能衰竭 (premature ovarian failure)、纖維化肺病（fibrotic lung disease)、隱源性纖維化肺泡炎、發炎後間質性肺病、間 質性肺炎、結締組織病相關之間質性肺病、混合性結締 組織病相關之肺病（mixed connective tissue disease associated lung disease)、全身性硬化症相關之間質性肺 病(systemic sclerosis associated interstitial lung disease)、類風濕性關節炎相關之間質性肺病、全身性紅 斑狼瘡症相關之肺病、皮肌炎/多肌炎相關之肺病、休格 連氏病相關之肺病（Sjogren’s disease associated lung disease)、僵直性脊椎炎相關之肺病、血管炎彌漫性肺病 (vasculitic diffuse lung disease)、血鐵黃素沈積症相關之 肺病（haemosiderosis associated lung disease)、藥物誘發 之間質性肺病、纖維化、放射性纖維化、阻塞性細支氣 管炎、慢性嗜伊紅企球性肺炎（chronic eosinophilic pneumonia)、淋巴球性浸潤性肺病（lymphocytic infiltrative lung disease)、感染後間質性肺病、痛風性關 節炎、自體免疫性肝炎、1型自體免疫性肝炎（典型自體 160878.doc -23- 201242977 免疫或類狼瘡性肝炎）、2型自體免疫性肝炎（抗LKM抗體 肝炎）、自體免疫介導之低血糖症、B型胰島素抗性伴有 黑色棘皮病（type B insulin resistance with acanthosis nigricans)、副曱狀腺機能減退症（hypoparathyroidism)、 與器官移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之慢 性免疫疾病、骨關節病（osteoarthrosis)、原發性硬化性 膽管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癬、特發性白血球減少病 (idiopathic leucopaenia)、自體免疫性嗜中性球減少症、 NOS型腎病、絲球體腎炎、腎顯微性血管炎、萊姆病 籲 (lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡（discoid lupus erythematosus)、特發性或NOS型雄性不育症、精子自體 免疫、多發性硬化症（所有亞型）、交感性眼炎、結締組 織病繼發性肺高血壓、古巴士德氏症候群（G〇odpasture，s syndrome)、結卽性多動脈炎之肺部表現（pUim〇nary manifestation of polyarteritis nodosa)、急性風濕熱、類 風濕性脊椎炎、史提爾氏病（Still’s disease)、全身性硬 化症、休格連氏症候群、高安氏病（Takayasu’s disease)/ 秦 動脈炎、自體免疫性企小板減少症、特發性血小板減少 症、自體免疫性甲狀腺病、曱狀腺機能亢進症 '甲狀腺 腫性自體免疫性甲狀腺低能症（橋本氏病（Hashim〇t〇,s disease))、萎縮性自體免疫性甲狀腺低能症、原發性黏 液水腫（primary myxoedema)、晶狀體源性葡萄膜炎 (phacogenic uveitis)、原發性血管炎、白斑病急性肝 病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發之肝損傷、膽 160878.doc S •24- 201242977 汁鬱滯、特質性肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肝 炎、過敏症及哮喘、B群鏈球菌（gr〇up B streptococci ， GBS)感染、精神障礙（例如抑鬱症及精神分裂症）、Th2 型及Thl型介導之疾病、急性及慢性疼痛（不同形式之疼 痛）、及諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰臟 癌、印巢癌、前列腺癌及直腸癌之癌症及造血性惡性疾 病（白灰病及淋巴瘤）、無β脂蛋白血症 (Abetalipoprotemia)、手足發甜（Acrocyanosis)、急性及 慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白 血病（ALL)、急性骨髓白血病（Aml)、急性或慢性細菌感 染、急性胰臟炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位搏動、 AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過 敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植物排斥反 應（allograft rejection)、α-l-抗胰蛋白酶缺乏症（aipha_i_ antitrypsin deficiency)、肌萎縮性側索硬化、貧血、心 絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、抗破脂症候群、抗 受體過敏性反應、主動脈瘤及周邊動脈瘤、主動脈剝 離、動脈性高jk壓、動脈硬化症、動靜脈瘺、共濟失調 (ataxia)、心房纖維性顫動（持續性或陣發性）、心房撲 動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植物排斥反 應、骨趙移植（BMT)排斥反應、束枝阻滞（bundle branch block)、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma)、燒傷、 心律不整、心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺 繞道發炎反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小 160878.doc -25- 201242977 腦病症、紊亂性或多灶性心房心動過速、與化學療法相 關之病症、慢性骨髓性白血病（CML)、慢性酒精中毒、 慢性發炎性病變、慢性淋巴球性白血病（CLL)、慢性阻 塞性肺病（COPD)、慢性水揚酸中毒、結腸直腸癌、充血 性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺原性心臟病（c〇r pulmonale)、冠狀動脈疾病、庫賈氏病（Creutzfeidt_Jak〇b disease)、培養物陰性敗血症、囊腫性纖維化、細胞激素 療法相關之病症、拳擊員癡呆、脫髓鞘疾病、出血性登 革熱（dengue hemorrhagic fever)、皮炎、皮膚病病狀、_ 糖展病（diabetes)、糖尿病（diabetes me„itus)、糖尿病性 動脈硬化病、彌漫性路易體疾病（Diffuse Lewy body disease)、擴張型充血性心肌病、基底神經節病症、中年 唐氏症候群（Down's Syndrome in middle age)、由阻斷 CNS多巴胺党體之藥物誘發的藥物誘發之運動障礙、藥 物敏感、濕療、腦脊髓炎（encephal〇myelitis)、心内膜 炎、内分泌病、會厭炎（epigl〇ttitis)、EB病毒感染 (epstein-barr vims infection)、肢端紅痛症、錐體外及小 鲁 腦病症、家族性噬血淋巴組織細胞瘤病、胎兒胸腺植入 物排斥反應、弗里德賴希氏共濟失調（Friedreich，s ataxia)、功能性周邊動脈病症、真菌性敗血症、氣性壞 疽（gas gangrene)、胃潰瘍、腎小球性腎炎、任何器官或 組織之移植物排斥反應、革蘭氏陰性敗血症（gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症、胞内生物體引起 之肉芽腫、毛細胞白血病、哈洛弗登-施帕茨病 160878.doc •26· S 201242977 (Hallerrorden-Spatz disease)、橋本氏甲狀腺炎 (hashimoto's thyroiditis)、枯草熱、心臟移植排斥反應、 血色素沈著症、血液透析、溶企性尿毒癥候群/溶血栓性 血小板減少性紫癜、出血、肝炎（A型）、希氏束心律不整 (His bundle arrythmias)、HIV感染/HIV神經病、霍奇金 氏病（Hodgkin’s disease)、過動性運動障礙、過敏反應、 過敏性肺炎、高血壓、動作徐緩型運動障礙、下丘腦-垂 體-腎上腺轴評估、特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維 化、抗體介導之細胞毒性、衰弱、嬰兒脊髓性肌萎縮 症、主動脈發炎、A型流感、電離輻射暴露、虹膜睫狀 體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺血再灌注損傷、缺血性中 風、青少年類風濕性關節炎、青少年脊髓性肌萎縮症、 卡波西氏肉瘤（Kaposi's sarcoma)、腎臟移植排斥反應、 退伍軍人病（legionella)、利什曼體病（leishmaniasis)、麻 風病、皮質脊髓系統病變、脂肪水腫、肝移植排斥反 應、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多 ® 症、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝性/特 發性疾病、偏頭痛、粒線體多系統病症、混合結締組織 疾病、單株丙種球蛋白症、多發性骨髓瘤、多系統退化 (曼切代哲因-托馬斯史-德爾格及馬查多-約瑟夫（Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager and Machado-Joseph))、重 症肌無力、禽細胞内分枝桿菌（mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis)、骨髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺 160878.doc -27- 201242977 血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經 退化性疾病、I型神經性肌肉萎縮、嗜中性球減少性發 熱、非霍奇金氏淋巴瘤（n〇n-Hodgkins lymphoma)、腹主 動脈及其分支堵塞、阻塞性動脈病症、〇kt3療法、睾丸 炎/田彳睾丸炎、睾丸炎/輸精管復通術（vasect〇rny reversal procedure)、器官腫大（organomegaly)、骨質疏鬆症、胰 臟移植排斥反應、胰臟癌、副腫瘤症候群/惡性高血鈣 症、副甲狀腺移植排斥反應、盆腔炎、常年性鼻炎、心 包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周邊血管病症、腹膜 炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎（pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群（多發性神經病、器官 腫大、内分泌病、單株丙種球蛋白症及皮膚變化症候 群）' 灌流後症候群、泵後症候群、MI心切開術後症候 群、子癇前症（preeclampsia)、進行性核上性麻痺、原發 性肺高血壓、放射療法、雷諾氏症候群（Raynaud，s phenomenon)及疾病、雷諾氏病（Raynoud，s disease)、雷 弗素姆氏病（Refsum’s disease)、規則性狹窄QRS心動過 速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉 瘤、硬皮病、老年性舞蹈病（senile chorea)、路易體型老 年癡呆（Senile Dementia of Lewy body type)、血清陰性 關節病、休克、鐮形細胞性貧血（sickle cell anemia)、皮 膚同種異體移植排斥反應、皮膚變化症候群、小腸移植 排斥反應、實體腫瘤、特異性心律不整、脊椎共濟失 調、脊髓小月由退化、鍵球菌肌炎（streptococcal 160878.doc •28· 201242977 myositis)、小腦結構病變、亞急性硬化性全腦炎 (Subacute sclerosing panencephalitis)、昏厥、心血管系 統梅毒、全身性過敏、全身性發炎反應症候群、全身發 作型青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、毛細 管擴張、血栓閉塞性脈管炎（thromboangitis obliterans)、 血小板減少症、中毒、移植、創傷/出血、ΙΠ型過敏性反 應、IV型過敏、不穩定型心絞痛、尿毒癥、尿敗血病、 蓴麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、 ^ 靜脈血栓形成、心室纖維性顫動、病毒及真菌感染、病 毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關之嗜血細胞症候群、 韋尼克-科爾薩科夫症候群（Wernicke-Korsakoff syndrome)、威爾遜氏病（Wilson's disease)、任何器官或 組織之異種移植物排斥反應、急性冠狀動脈症候群、急 性特發性多發性神經炎、急性發炎性脫髓鞘性多神經根 神經病、急性缺血、成人史提爾氏病（adult Stiu，s disease)、斑形脫髮、全身性過敏反應、抗磷脂抗體症候 _ 群、再生不能性貧血、動脈硬化、異位性濕療、異位性 皮炎、自體免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關之自體免疫 病症、自體免疫性腸病、自體免疫性聽力損失、自體免 疫淋巴組織增生症候群（ALPS)、自體免疫性心肌炎、自 體免疫性早發性卵巢功能衰竭、瞼炎、支氣管擴張、大 皰性類天疱瘡（bullous pemphigoid)、心血管疾病、災難 性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎關節病（cervical spondylosis)、慢性缺血、瘢痕性類天疱瘡、伴以多發性 160878.doc •29- 201242977 硬化症風險之臨床上分離症候群（cis)、結膜炎、兒童期 發作精神病症、慢性阻塞性肺病（COPD)、淚囊炎 (dacryocystitis)、皮肌炎、糖尿病性視網膜病變、糖尿 病、椎間盤突出症、椎間盤脫垂（disk prolaps)、藥物誘 發之免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼 内炎、上鞏膜炎（episcleritis)、多形性紅斑、重症多形性 紅斑、妊娠性類天疱瘡、古立安-白瑞症候群（Guillain_ Bard syndrome)(GBS)、枯草熱、休斯症候群（Hughes syndrome)、特發性帕金森氏病、特發性間質性肺炎、 IgE介導之過敏症、免疫性溶血性貧血、包涵體肌炎、 感染性眼發炎疾病、發炎性脫髓勒疾病、發炎性心臟 病、發炎性腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角 膜結膜炎（keratojuntivitis sicca)、庫斯毛爾病（Kussmaul disease)或庫斯毛爾-梅爾病（Kussmaul-Meier disease)、 蘭德里氏麻痺（Landry’s paralysis)、朗格罕氏細胞組織細 胞增多症（Langerhan’s cell histiocytosis)、網狀青斑 (livedo reticularis)、黃斑部變性、顯微性多血管炎、白 赫鐵列夫症（morbus bechterev)、運動神經元病症、黏膜 類天疱瘡、多器官衰竭、重症肌無力、骨髓發育不良症 候群、心肌炎、神經根病症、神經病、非八非B型肝炎、 視神經炎、骨質溶解、印巢癌、少關節性 JRA(pauciarticular JRA)、周邊動脈閉塞性疾病 (PA0D)、周邊血管疾病（PVD)、周邊動脈疾病（pAD)、靜 脈炎、結節性多動脈炎（或結節性動脈周圍炎）、多軟骨 160878.doc 201242977 炎、風濕性多肌痛、白髮症（P〇li0sis)、多關節性JRA、 多内分泌缺乏症候群、多肌炎、風濕性多肌痛（pMR)、 泵後症候群、原發性帕金森氏症（pdmary Parkinsonism)、前列腺及直腸癌及造血性惡性疾病（白血 病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅血球發育不全、原發性腎 上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再狹窄、風濕性 心臟病、sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨缸大及骨 炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐 Φ 骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚矽氧相關之結締 組織疾病、史奈登-威爾金森皮膚病（sneddon-wilkinson dermatosis)、強直性脊椎炎、史蒂芬-瓊森症候群 (Stevens-Johnson syndrome，SJS)、全身性發炎反應症候 群、顳動脈炎（temporal arteritis)、弓蟲性視網膜炎 (toxoplasmic retinitis)、中毒性表皮壞死溶解、橫貫性脊 髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、1型過敏反應、π型 糖尿病、蓴麻疹、常見間質性肺炎（Uip)、血管炎、春季 _ 結膜炎、病毒性視網膜炎、沃格特-小柳-原田症候群 (Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群）、濕式黃 斑部變性、傷口癒合、耶氏桿菌及沙門氏菌相關之關節 病0 83·如請求項81之方法，其中對該個體之投藥法係藉由至少 一種選自以下模式達成：非經腸、皮下、肌肉内、靜脈 内、關節内、支氣管内、腹内、囊内、軟骨内、腔内 (intracavitary)、體腔内（intracelial)、小腦内、腦室内、 160878.doc •31 - 201242977 結腸内、子宮頸内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆 内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直腸 内、腎内、視網膜内、脊椎内、滑膜内、胸腔内、子宮 内、膀胱内、推注、經陰道、經直腸、經頰、舌下、 异 内及經皮。 84. —種產生能夠結合三個抗原之三可變異域結合蛋白之方 法，其包括： a) 獲得能夠結合第一目標抗原之第一親本結合蛋白或其 抗原結合部分； b) 獲得能夠結合第二目標抗原之第二親本結合蛋白或 其抗原結合部分； c) 獲得能夠結合第三目標抗原之第三親本結合蛋白或其 抗原結合部分； d) 構築包含 VDl-(Xl)n_VD2_(X2)n_VD3 c (X3)n之第— 及第三多肽鏈，其中 糧為自該第-親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第一重鏈可變異域； VD2為自§玄第一親本結合蛋白 來曰戎再抗原結合部分獲得 之第二重鏈可變異域； VD3為自§亥第二親本結合蛋白或且> π 艾曰及其抗原結合部分獲得 之第三重鏈可變異域； C為重鏈恆定域； Χ2為第一連接子； XI為第二連接子； -32- 160878.doc S 201242977 X3為Fc區；且η為0或1 ;及 e) 構築包含 VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之第二 及第四多肽鏈，其中 VD1為自該第一親本結合蛋白或其抗原結合部分獲 得之第一輕鏈可變異域； VD2為自該第二親本結合蛋白或其抗原結合部分獲 得之第二輕鏈可變異域； VD3為自該第三親本結合蛋白或其抗原結合部分獲 得之第三輕鏈可變異域； C為輕鍵恆定域； XI為第一連接子； X2為第二連接子； X3不包含Fc區；且η為0或1 ;及 f) 表現該第一、該第二、該第三及該第四多肽鏈； 以便產生能夠結合該第一、第二及第三目標抗原之三可 變異域免疫球蛋白》 ® 85.如請求項84之方法，其中該VD1、該VD2及該VD3重鏈 可變異域包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:46、47、48、70、71、163、165、167、169及 171 ’其中該VD1、該VD2及該VD3輕鏈可變異域包含選 自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO:51、52、 53、73及74、164、166、168、170及172。 86.如請求項84之方法，其中該第一、該第二及該第三親本 結合蛋白或其抗原結合部分係獨立地選自由以下組成之 160878.doc •33· 201242977 群·人類抗體、CDR移植抗體及人類化抗體。 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 如請求項81之方法，其中該第一、該第二及該第三親本 、结合蛋白或其抗原結合部分係獨立地選自由以下組成之 群· Fab片段、F(ab，)2片段、包含在鉸鏈區處由二硫橋鍵 連接之兩個Fab片段之二價片段、由Vh及CH1域組成之 Fd片段、由抗體之單一臂之及vh域組成之Fv片段、 dAb片段 '分離之互補決定區、單鏈抗體及雙功能 抗體。 如請求項84之方法’其中該第一親本結合蛋白或其抗原 _ 結合部分具有至少一種由該三可變異域免疫球蛋白展現 之所要性質。 如請求項84之方法’其中該第二親本結合蛋白或其抗原 結合部分具有至少一種由該三可變異域免疫球蛋白展現 之所要性質。 如請求項84之方法，其中該第三親本結合蛋白或其抗原 結合部分具有至少一種由該三可變異域免疫球蛋白展現 之所要性質。 鲁 如請求項84之方法，其中該Fc區係選自由原生序列Fc區 及變異序列F c區組成之群。 如請求項84之方法’其中該Fc區係選自由來自IgG1、 402、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE 及 IgD 之Fc區組成之 群。 如明求項8 8至9 0中任一項之方法，其中該所要性質係選 自一或多個結合蛋白參數。 160878.doc S -34- 201242977 組成：員93之方法’其中該結合蛋白參數係選自由以下 功处抗原特異性、對抗原之親和力、效能、生物 -、抗原決定基識別、穩定性、溶解性、生產效率、 ==性、藥物動力學、生物可用性、組織交又反應性 及直糸同源抗原結合。 # 95·:=Γ3之方法’其中該第一親本結合蛋白或其抗原 ::邛分結合該第一抗原之親和力不同於該第二親本結 口白或其抗原結合部分結合該第二抗原或該第三親本 結合蛋白或其抗原結合部分結合該第三抗原之親和力。 96 項93之方法，其中該第一親本結合蛋白或其抗原 、’·“部分結合該第一抗原之效能不同於該第二親本結合 蛋白或其抗原結合部分結合該第二抗原或該第三親本結 合蛋白或其抗原結合部分結合該第三抗原之效能。 97· -種確^測試樣品中抗原或其片段之存在 '量或濃度之 方法， 其中該抗原或其片段係選自由以下組成之群：前列腺 素E2(PGE2)、介白素13(IL13)、腫瘤壞死因子 a(TNFa)、介白素 13(IL_13)及介白素 i8(il i8)， 該方法包括藉由免疫分析法來分析該測試樣品中之該 抗原或其片段， 其中該免疫分析法⑴採用至少一種結合蛋白及至少一 種可偵/則& Z且（11)包括由該可偵測標記所產生直接或間 接指示該測試樣品+該抗原或其片段之存在、量或漠度 之信號與對照Μ或校準劑中所產生直接或間接指示該抗 I60878.doc -35- 201242977 原或其片段之存在、量或濃度之信號相比較， 其中該校準劑視情況為一系列校準劑之一部分，其中 s玄等校準劑系列中各校準劑彼此差異在於該抗原或其片 段的濃度，且 其中該至少一種結合蛋白之一者 (1)包含一或多個包含\^1-(又1)11-\^2-(乂2)11-\^3-(：-(X3)n之多肽鏈，其中： VD1為自第一親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第一重鏈可變異域； VD2為自第二親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第二重鏈可變異域； VD3為自第三親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第三重鍵可變異域； C為重鏈恆定域； XI為第一連接子； X2為第二連接子； X3為Fc區；且n為〇或丨；且 (ii’）可結合選自由以下組成之群之三抗原組：前列腺 素 E2(PGE2)、介白素 13(IL_13)及介白素 18(il_18); 及腫瘤壞死因子a(TNFa)、介白素13(IL_13)及介白素 18(IL-18)， 從而確定該測試樣品中抗原或其片段之存在、量或濃 度。 98. -種確定測試樣品中抗原或其片段之存在、量或濃度之 160878.doc •36- 201242977 方法， 其中該抗原或其片段係選自由以下組成之群：前列腺 素E2(PGE2)、介白素13(IL_13)、腫瘤壞死因子 a(TNFa)、介白素13(IL_13)及介白素18(1]^18)， 該方法包括藉由免疫分析法來分析該測試樣品中之該 抗原或其片段， 其中該免疫分析法⑴採用至少一種結合蛋白及至少一 種可偵測標記且（ϋ)包括將由該可偵測標記所產生直接或 間接指示該測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或濃 度之信號與對照組或校準劑中所產生直接或間接指示該 抗原或其片段之存在、量或濃度之信號相比較， 其中該校準劑視情況為一系列校準劑之一部分，其中 該等校準劑系列中各校準劑彼此差異在於該抗原或其片 段的濃度，且 其中該至少一種結合蛋白之一者 (1’）包含一或多個包含VDi-(xi)n_VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多狀鍵，其中： VD1為自第一親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第一重鏈可變異域； VD2為自第二親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第二重鏈可變異域； VD3為自第三親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第三重鏈可變異域； C為重鏈恆定域； 160878.doc •37- 201242977 χι為第一連接子； X2為第二連接子； X3為Fc區；且η為0或1 ;且 (ii')可結合選自由以下組成之群之三抗原組：前列腺 素 E2(PGE2)、介白素 13(IL-13)及介白素 18(IL-18); 及腫瘤壞死因子a(TNFa)、介白素13(IL-13)及介白素 18(IL-18)， 從而確疋s亥測试樣品中抗原或其片段之存在、量或濃 度。 99·如請求項97或98之方法，其中該方法包括下列步驟： (1)使該測試樣品與至少一種結合該抗原或其片段上 之柷原決定基之捕捉劑接觸，以便形成捕捉劑/抗原或其 片段複合物， (η)使該捕捉劑/抗原或其片段複合物與至少一種包含 可偵測標記且結合該抗原或其片段上不與該捕捉劑結合 之抗原決定基的偵測劑接觸，以形成捕捉劑/抗原或其片 段/偵測劑複合物，及 (111)基於由（U)中形成之該捕捉劑/抗原或其片段/偵測 劑複合物中之該可憤測標記產线信號確定該測試樣品 中該抗原或其片段之存在、量或濃度，從而確定該測試 樣品中S亥抗原或其片段之存在、量或濃度， 其中至少一種捕才足劑及/或至少-種侧劑為該至少-種結合蛋白。 100.如請求項97或98之方法，盆士 — 士a A a乃次，其中該方法包含下列步驟： 160878.doc S -38- 201242977 (i)使該測試樣品與至少一種結合該抗原或其片段上 之抗原決定基之捕捉劑接觸，以便形成捕捉劑/抗原或其 片段複合物，及同時或以任一順序依序使該測試樣品與 可與該測試樣品中任何抗原或其片段競爭結合該至少一 種捕捉劑之經可偵測標記的抗原或其片段接觸，其中該 測試樣品中存在之任何抗原（或其片段）與該經可偵測標 記之抗原彼此競爭分別形成捕捉劑/抗原或其片段複合物 及捕捉劑/經可偵測標記之抗原或其片段複合物，及 ^ (11)基於由⑴）中形成之該捕捉劑/經可偵測標記之抗 原或其片段複合物中之該可偵測標記產生的信號確定該 測試樣品中該抗原或其片段之存在、量或濃度， 其中至少一種捕捉劑為該至少一種結合蛋白， 其中由該捕捉劑/經可偵測標記之抗原或其片段複合物 中之该可偵測標記產生的該信號與該測試樣品中之抗原 或其片段之量或濃度成反比， 從而確定該測試樣品中抗原或其片段之存在、量或濃 • 度。 胤如請求項97至1()()中任一項之方法，其中該測試樣品來 自於患者且該方法另外包含診斷、預後或評估該患者之 治療性/防治性治療之功效，其中若該方法另外包括評估 該患者之治療性/防治性治療之該功效，則該方法視情況 另外包括在需要時改進該患者之該治療性/防治性治療， 以改良功效。 102·如請求項97至101中任一珀夕古、i i T仕碩之方法，其中該方法經調適 160878.doc •39- 201242977 以用於自動系統或半自動系統中。 103. 104. 一種用於分析測試樣品中之抗原或其片段之套組，該套 組包含至少一種用於分析該測試樣品中之抗原或其片段 之組分及用於分析該測試樣品中之抗原或其片段之說明 書，其中該至少一種組分包括至少一種包含結合蛋白之 組合物，該結合蛋白 (i’）包含一或多個包含 VDl-(Xl)n_VD2-iX2)n_VD3_ C-(X3)n之多肽鍵，其中： VD1為自第一親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第一重鏈可變異域； VD2為自第二親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第二重鏈可變異域； VD3為自第二親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第三重鏈可變異域； C為重鏈恆定域； XI為第一連接子； X2為第二連接子； X3為Fc區；且η為〇或1 ;且 (ii1)可結合選自由以下組成之群之三抗原組：前 列腺素E2(PGE2)、介白素13(IL-13)及介白素18(IL_ 18);及腫瘤壞死因子a(TNFa)、介白素13(IL13)及 介白素 18(IL-18)， 其中該結合蛋白視情況經可偵測標記。 一種用於分析測試樣品中之抗原或其片段之套組，該套 160878.doc 201242977 組包含至少一種用於分析該測試樣品中之抗原或其片段 之組分及用於分析該測試樣品中之抗原或其片段之說明 書，其中該至少一種組分包括至少一種包含結合蛋白之 組合物，該結合蛋白 (Γ)包含一或多個包含VD卜(Xl)n-VD2-(X2)n-VD3-C-(X3)n之多肽鏈，其中： VD1為自第一親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第一重鏈可變異域； VD2為自第二親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第二重鏈可變異域； VD3為自第三親本結合蛋白或其抗原結合部分獲得 之第三重鏈可變異域； C為重鏈恆定域； XI為第一連接子； X2為第二連接子； X3為Fc區；且η為0或1 ;且 ^ (u')可結合選自由以下組成之群之三抗原組：前 列腺素E2(PGE2)、介白素13(IL-13)及介白素i8(IL_ 18);及腫瘤壞死因子a(TNFa)、介白素i3(il_13)及 介白素 18(IL-18)， 其中該結合蛋白視情況經可偵測標記。 160878.doc •41 ·
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