TW201239093A - A cost-effective method for expression and purification of recombinant proteins in plants - Google Patents

A cost-effective method for expression and purification of recombinant proteins in plants Download PDF

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Description

201239093 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明提供一種表現及純化轉殖基因植物中之重組蛋白 質之具成本效益且有效的方法。重組蛋白質表現為與ELp· 内含肽標籤之融合體且包括藥物、抗體鏈及其他有用蛋白 質8其可於各種植物部分，諸如葉子、種子、根、塊莖、 果實及細胞培養物中產生。 本申咕案主張2010年12月21曰申請之美國臨時申請案 61/425,703之優先權。此文獻之内容係以引用之方式併入 本文中。 【先前技術】 使用轉殖基因植物來大規模生產藥物蛋白質與傳統微生 物及哺乳動物生物反應器相比已顯示為具有低成本、高產 率、易收集及低健康風險之優點之有吸引力的系統，且如 概念驗證及可行性示範，許多有價值的重組治療蛋白質已 在轉殖基因植物中得以表現（Giddings，G.等人， (2000) 18:1 151-1 155 ; Twyman等人，办 价(2003) 21:570-578 ; Ko，K_等人，Γορ.
Microho/. /wmMwo/· (2009) 332:55-78)。對於植物生物反 應器之進一步發展’目標蛋白質自植物樣品之下游純化 (其在治療蛋白質的情況下估計佔生產成本之8〇%(Walter， J. K.等人，In Subramanian，G (編）Bioseparation and
Bioprocessing, Wiley-VCH, Weinheim,第 I 卷：465-496 (1998)))為由基於植物之生物反應器大規模工業生產重組 160499.doc 201239093 蛋白質中最重要的因素。 傳統蛋白質純化方法涉及使目標蛋白質表現為與親和標 籤（諸如His標籤、麩胱甘肽s_轉移酶標籤、c_myc標籤、 strepll抗原決定基、鈣調蛋白結合肽及麥芽糖結合蛋白）之 融合體（Desai，U. A.等人，.尸(2〇〇2) 25:195-202 ; Witte，C. P.等人，户/_ 杨/ (2〇〇4) 55:135-147 ; Rubio, V.等人，价乂 （2005) 41: 767-778 ; Valdez-Ortiz，Α.等人，乂細⑽办⑽/ (2005) 1 15: 413-423 ； Streatfield, S. J., Plant Biotechnol J. (2007) 5:2-15)。此等方法遭受所需親和層析擴大（scaUng_up)之困難 及高成本。已出現幾種簡化下游蛋白質純化的新策略。油 質蛋白融合體（Parmenter，D· L·等人，从〇/扪〇/ (1995) 29:1 167-1 180； Bhatla, S. C.^ Λ，Biotechnol Ad, (2〇10) 28:293_则)使所需蛋白f|£向油體，其可容易地與 水溶性部分分離。疏水蛋白融合體（LahUnen，τ等人， />_/· (2008) 59:18_24)改變融合蛋白質之疏 水性’隨後藉由基於界面活性劑之水性兩相系統促進純 化。與γ-玉来蛋白域之融合（T〇rreni，M #人，祕油 MW(2_)獻193撕）能使重組蛋白質形成含有高 濃度所需蛋白質之緻密ER定位蛋白暂挪 曰真體’其可輕易地使用 基於密度之分離方法自細胞物質中八她 ， 貞宁刀離。然而’因為融合 標籤可影響重組蛋白質之生物活性，& Γ 所以需要將標籤移除 且此一般依賴於蛋白酶之蛋白水觝烈初 解裂解。除可能發生非特 異性蛋白質裂解之外’此另外裂解牛 解步驟由於蛋白酶之成本 160499.doc 201239093 及其移除的額外步驟而導致成本較高。因此，極需要開發 簡單且具成本效益的下游重組蛋白質純化系統。 彈性蛋白樣多肽（ELP)-内含肽系統為一種自大腸桿菌（£. co/z·)純化蛋白質之簡單且有效的方法（Kang，H J等人，义
Microbiol Bi〇technol (200Ί) \7.Λ75\-Ή57 .，Um, Ό. 專 人，別omacrowo/ecw/α (2007) 8:1417-1424 ; Floss，D· Μ. 等人，7>6«办万沁紿〜仙/ (2010) 28:37-45 ; Hu，F.等人， 价oc/zew (2010) 160:2377-2387)。ELP蛋白 質由V-P-G-X-G(X可為脯胺酸以外的任意胺基酸）之重複五 肽組成且具有溫度敏感相變之有吸引力的特性：當溫度升 高至其轉變溫度（Tt)時，可溶性ELP將聚集成不溶相，可 容易地藉由離心沈澱成團塊；但當添加冷的缓衝液時，聚 集之ELP可再溶解且變回可溶相。Tt可由鹽濃度、溫度及 重複五肽之長度及組分調節。ELP具有低成本且易於擴大 之優點。 内含肽為一種催化自身裂解之蛋白質剪接元件且在其某 些胺基酸經取代之情況下，内含肽可經調節以回應於阳值 改變或毓基試劑而在其N_端及/或c_端裂解。内含肽存在 於大量蛋白質中且催化「原體」形式自身裂解為成熟蛋白 質。許多内含肽已經鑑別，且可在網址「滅咖」之名 稱「neb/inteins」下發現該等序列之目錄。以，可應用 内含肽之自身裂解特性以替代蛋白水解裂解。許多内含狀 蛋白質之描述亦已問世：（Perler，F. B，#㈣仏如办細 〇27:346·347)且用作ELP或其他親和標籤之融合搭配 160499.doc 201239093 物（Fong，B. A.等人’75厂〇以/«£：<7^/>“"(/'(2009) 66:198-202 ; Gillies，A. R.等人，Mdo心 Mo/_ 价〇/.(2009) 498:173-183 ; Srinivasa Babu，K.等人，Ze" (2009) 31.659-664，Hong, I.等人，乂从z.cr0^/0/ 方/0，％/^0/ (2010) 20:350-355 ; Ma， C.等人，Ze". (2010) 17:1245-1250) 〇 因此’ ELP-内含肽（Ei)融合策略為用於蛋白質純化之有 吸引力的方法。在ELP相變之若干循環之後，融合蛋白質 將經由溫度變化及離心與其他蛋白質分離。隨後，内含肽 之裂解可由pH值改變或添加化學物來觸發以使所需蛋白質 自Ei標籤裂解’接著ELp進行另一輪相變以分離所需蛋白 質上清液及呈離心塊形式之Ei標籤。在整個程序中無需額 外的蛋白酶或特殊設備，因此降低純化成本且在很大程度 上簡化操作。美國專利公開案第揭 示由ELP-内含肽融合系統自大腸桿菌細胞純化重組蛋白 質。 在最近二十年中，已研究ELP或内含肽在轉殖基因植物 中之替代應用（Morassutti，C.等人，FMS (2002) 519:141-146 ; Scheller，J.等人，尸/㈣，出0，ec/m0/ j (2〇〇6) 4.243 249 ’ Lao，U. L.等人，价0它叹·（2007) 98.349-355，Patel，J·等人，及以.（2〇〇7) 16:239· 249 ; Con】ey，A. J.等人，別〇iec/z„〇/ (2〇〇9a) 1〇3:562_ 573，Conley，A. J.等人，价〇/ (2009b) 7:48 ; Floss等 人，同上（2010))。 160499.doc 201239093 ELP融合據報導可增強重組蛋白質在轉殖基因種子及葉 子中之表現（Scheller，J.專人 ’ TVimsgem.c (2006) 13:51-57 ; Patel等人，同上（2007))，且指示ELP之長度對 重組蛋白質積聚及逆向轉變循環期間蛋白質回收有不同作 用（Conley等人，同上（2009a))。此外，Conley等人，同上 (2009b)已評估ELP融合對GFP乾向細胞質、葉綠體、無 生質體系及内質網（ER)之積聚的作用。
Morassutti，C.等人，同上（2〇〇2)最先證明轉殖基因植物 中藉由利用内含肽介導之自身裂解機制產生重組蛋白質。 然而’所有此等報導均將ELp或内含肽替代用作融合標 籤。申睛人未發現關於在轉殖基因植物中組合使用ELp與 内含肽的任何報導。 已報導ELP融合蛋白質在菸葉中形成蛋白質體（c〇nley, A. J.等人，同上（2〇〇9b))。吾人亦已發現與ELp内含肽標 籤融0之重組蛋白質在稻穀種子中形成ER-衍生之蛋白質 體（Tian，L.等人，未公開）。鑒於ELp之疏水性質，ELp融 :蛋白質有可能形成蛋白質體’導致難以提取可溶性ELP 融口蛋白質以作進一步純化。可能需要提取及純化程序 (諸如提取緩衝液、提取方法及純化操作)之常規優化以由 ELP-内含肽系統自植物樣品純化目標蛋白質。 」&關於重組蛋白質在植物中之ELP融合表現的許多先 =導^表明ELP融合蛋白f可經純化，’然而此等實驗大 & 藉由短暫基因表現在终葉中進行，短暫基因表現可 此引起異質蛋白質暫時性高積聚。然⑥，當吾人最初嘗試 160499.doc 201239093 自穩定轉型之菸葉表現及純化與ELP·内含肽標籤融合之重 組蛋白質（人類粒細胞群落刺激因子（hG_CSF))時’表現極 低且純化在回收大量目標蛋白質方面遭遇較大困難（Tian， L·等人，未公開）。因此，似乎ELp融合表現相當不同於 ELP-内含肽融合，且穩定植物轉型體中之ELp•内含肽融合 表現及純化的情況似乎更複雜。再次，應採用條件的常規 優化。 【發明内容】 本發明提供一種自植物表現及純化重組蛋白質之具成本 效益、有效且可縮放的方法◦本發明亦關於融合ELp-内含 肽之蛋白質、重組材料及其產生方法及植物轉型體。 本發明利用ELP.内含肽融合表現及純化系統自植物樣品 屯化重組蛋白Λ。該等重組蛋白質包括藥物、抗體鍵、工 業酶及任何其他有用的蛋白冑。此等重組蛋白質可在任何 植物及各種植物部分（諸如癒傷組織（^11丨）、葉子、種子、 根、塊莖、果實及細胞培養物)中產生。該方法操作簡單 且可易於放大以經由ELp之溫度敏感性逆向相變進行工業 生產’而無需親和層析及特殊設備。與楂物中所 ^ 合表現策略之傳統純化方法相比，本發明方法利用‘使内^ 肽蛋白質自身裂解來自融合標籤釋放所需重組蛋 此避免使用蛋白酶進行融合標藏裂解。 〜、 但曰 很物部^ 在一個I、樣中，本發明係 植物細胞獲得所需蛋白質的方法，該方法包含 ⑷自該等植物、植物部分或植物細胞製備蛋白以 160499.doc 201239093 * 物’遠等植物、植物部分或植物細胞產生呈融合蛋白質形 式之忒所需蛋白質’該融合蛋白質在所需蛋白質之N_端或 c-端或兩端包含ELP•内含肽標籤，該ELp内含肽標藏包含 彈性蛋白樣多肽（ELP)域及内含肽剪接元件（内含狀），其中 内3肽在所需蛋白質的N_端及/或c_端或兩端與ELp域之 - 間； (b) 視情況自該提取物移除不溶性物質； (c) 使融合蛋白質聚集且使其與提取物之其餘部分分 離； (d) 將融合蛋白質再溶解成水溶液； 視情況重複步驟（c)及步驟（d); (e) 進行融合蛋白質之裂解；及 (0使所需蛋白質與標籤分離。 在其他態樣中，本發明係關於可在植物中操作以產生該 融合蛋白質之表現系統，及包含該融合蛋白質或包含該表 現系統之植物、植物部分或植物細胞以及在植物、植物部 分或植物細胞令產生該等融合蛋白質的方法。 【實施方式】 1 本發明在基於植物產生重組蛋白質中將目標基因表現與 下游純化方法偶聯。植物樣品可來自任何種類之植物（單 子葉植物或雙子葉植物）及各種植物部分（諸如癒傷組織、 葉子、種子、根、塊莖或細胞培養物）^基於樣品性質， 表現及純化之桌略可不同。舉例而言，新鮮樣品（諸如葉 子及癒傷組織）考慮到其溶解簡單可較佳用於提取及進— 160499.doc 201239093 步純化，而乾燥樣品（諸如種子）由於具有蛋白質降解較 低、蛋白質含量較高及運輸方便之優點而為用於提取及純 化的良好起始樣品。 由本發明方法所i生及純化之重組蛋白質可具有任何狀 尺寸、來自任何哺乳動物、細菌或植物來源且具有對人 類、動物或植物執行的任何功能。 採用ELP-内含肽系統來表現所需蛋白質與ELp-内含肽標 籤之融合體，其中内含肽位於ELp與重組蛋白質之間。 ELP之溫度敏感性相變特性用於使融合蛋白質與其他細胞 組分分離，且内含肽之自身裂解功能使重組蛋白質自ELp· 内含肽標籤釋放。在裂解之後，ELp·内含肽標籤可藉由 ELP相變轉化成不溶性聚集體，其可容易地自可溶性重組 蛋白質中分離及移除。 融合蛋白質由包括編碼ELP、編碼内含肽及編碼重組蛋 白質之基料列之序列的連續開放閱讀才匡架編碼，其中内 含肽基因插於ELP與重組蛋白質基因序列之間。需要時， 可將編碼較短胺基酸序列之適當連接子序列插入ELp與内 含肽之間或内含肽與重組蛋白質之間或甚至ELp單元之間 以允許ELP、内含肽及重組蛋白質進行必要的摺疊。 一個ELP蛋白質域可含有一或多個ELp單元，亦即v_p_ G-X-G肽，其中X為脯胺酸以外的任意胺基酸。ELp單元之 重複數目T影響ELP蛋白質之相變溫度，因此ELp域之長 度（亦即ELP單元之數目）可經根據實際需要調節。ELp翠元 之數目可為"至幾百不等；由此，可採用具有5個、1〇 160499.doc -10- 201239093 個、20個、3〇個、50個、1〇〇個或1〇〇個以上單元的ELp 域。亦包括中間數目。融合蛋白質含有至少一個ELp域， 但可含有一個以上ELp域。舉例而言，兩個ELp域可分別 位於重組蛋白質之N_端及匕端’且内含肽蛋白質在末端與 ELP域之間。 内含肽一般位於ELP與重組蛋白質之間，且内含肽之裂 解位點N-端或C·端可藉由内含肽蛋白f中某些胺基酸之取 代來調節。裂解反應可藉由改變環境條件（諸如仲值）、添 加疏基試劑及溫度升高來實現。在本發明之—個實施例 中，内含肽在其C.端裂解以使重組蛋白質自·•内含狀釋 放可藉*由將pH值自8.5改變至6·〇至65來實現。在另一實施 例中，藉由添加毓基試劑使内含肽在其Ν_端裂解。 目標蛋白質中㈣含肽裂解位點連接之第—或最後胺基 酸可在裂解反應中起作用且決定裂解效率。因此，為了使 裂解起作用，應考慮改變或維持目標蛋白質之第一 /最後 胺基酸或添加另一胺其舱。+ , Λ月女基酉文。在—個實施例中，將胺基酸
Met添加至重組蛋白質 3 < ·Ν· ^ ’亦即露兜樹凝集素 (〜_晴leetin ; pAL)。該等㈣不限於此敎蛋白質。 不官所需蛋白質之性質如何，苴比 其白可為有益的。若標籤處 於c-端，則亦可能需要修飾c_端胺基酸。 重組蛋白質在植物中之積聚詈 ,^ Τ $始終在其後續下游純化中 起重要作用。一般而言，高 積聚對於純化較佳。因此，可 、冱由使用強啟動子，優化密碼^ ^ 1 卞使用及/或由靶向信號使 蛋白貝靶向特定細胞小室來進行 仃貝體構建之任意組分的優 160499.doc 201239093 化以增強蛋自質表現及促進目標蛋自質在特定器官、组織 或細胞内位置中之積聚。在優化表現之_個實施例中，使 用泛素融合策略。 用於構建融合表現f體之編碼融合蛋白f之核酸序列包 含編碼ELP_内含肽融合蛋白質的開放閱讀框架，其中編石馬 ELP-内含肽融合標籤之序列可位於重組蛋白質的n:端或。 端。任何連接子序列均可位㈣“與内含肽之間及/或内含 肽與重組蛋白質之間及/或ELP單元自身之間，但選擇連接 子之序列以免影響融合蛋白質或其任何組分的摺疊。可藉 由控制ELP單元數目及在内含肽蛋白f中進行胺基酸取代 基來優化編碼ELP及内含肽蛋白質域之序列以改良重組蛋 白質之表現及純化。表現可在轉錄、轉譯及後轉譯層面進 行優化且靶向位置藉由選擇啟動子、所應用之任何信號肽 或靶肽、5’ UTR組分、密碼子使用及其他融合組合物來實 現。 可使用引起ELP-内含肽融合蛋白質之短暫或穩定表現的 各種轉型方法，諸如土壤桿菌屬介導之轉 型及基因搶粒子遞送系統（biolistic particle delivery system)。 自植物樣品提取及純化所需蛋白質可藉由包含以下之方 法進行常規優化： 0)優化提取技術，包括（但不限於）提取緩衝液、所應 用之儀器、提取溫度、樣品溶解及基於融合蛋白質位置預 純化任何組織； 160499.doc 201239093 (b) 在藉由ELP相變純化之前預處理粗製提取樣品，包 括移除任何不溶性及其他非特異性組分； (c) 調節條件以觸發ELP相變，包括溫度、pH值、鹽組 分、所應用之設備、其他ELP蛋白質或任何其他組分之添 加； (d) 選擇使聚集之elp融合蛋白質與其他污染性組分分 離之方法，諸如微過濾、離心或任何其他引起分離的方 法； (e) 修改方法以使聚集之eLP融合蛋白質再溶解，包括 溫度、緩衝液組分、pH值及所應用之任何設備； (f) 修改ELP相變之操作以獲得純的ELp_内含肽融合蛋 白虞，諸如相變之循環、與上述（c)、（d)及⑷中基於 之純化有關的不同方法的組合； (g) 調節條件以觸發内含肽誘導之裂解，諸如緩衝液組 分、pH值、溫度及化學物添加；及 (h) 在内含肽誘導之裂解之後進行優化以使最終裂解之 重組蛋白質與裂解之ELP-内含肽標籤分離，諸如相關ELp 相變及任何進一步純化。 有時，内含肽之自身裂解可在活體内發生，尤其對於回 應於pH值的固有裂解功能而t，其可由於細胞内位置或甚 至植物生長環境而變化。在以下實例巾，存在咖-内含 肽-PAL融合蛋白質在活體内之部分裂解。然而，活體内裂 解並不影響未裂解之融合蛋白質的純化。 可執仃该方法以自短暫及穩定表現而純化重組蛋白質。 160499.doc •13· 201239093 轉型方法亦可根據實際情況（諸如實驗條件及宿主植物）調 節及實施。 表現後’蛋白質提取為後續純化步驟中的一個關鍵因 素。可進行常規優化提取條件，包括緩衝液組分、pH、溫 度、溶解細胞所用之設備及所需的梯度分離。提取方法亦 可基於此項技術中所知之目標蛋白質的細胞内位置進行調 節。在本發明之例示性實施例中，使用種子粉末進行提 取，且向提取緩衝液中添加尿素以提取稻種子之蛋白質體 中與内源性醇溶蛋白聚集的融合蛋白質。 在藉由ELP-内含肽系統純化之前，可能需要進行預處理 以藉由過濾、、離心或其他可能的程序來移除任何不溶性植 分。若提取緩衝液中存在某些影響融合蛋白質溶解度或隨 後ELP相變或内含肽裂解的組分，則可經由除鹽、透析、 過遽及進-步離心來進行預清除。在本發明之例示性實施 例中’提取缓衝液中之尿素藉由除鹽或透析移除。 在提取樣品之後，開始經由ELp.内含肽系統純化。如以 上[先則技術]中所提及，ELP之相變溫度受許多因素今 響，包括ELP蛋白質之長度及組分、ELp融合蛋白質之： 度、内含肽及重組蛋白質的尺寸及性質、溫度及鹽濃度及 組成。為了實現ELP之聚集，可調節並優化條件，較佳用 適度溫度及緩衝液組分。 在聚集步驟之後’使ELP_内含肽融合蛋白質聚集體再溶 =。—般而言’低溫及冷緩衝液有助於聚集之融合蛋白質 變回其可溶相。可藉由調節再溶解緩衝液之組分:延長冰 160499.doc
S •14· 201239093 '合或低溫培育或甚至藉由設備之助（諸如微過濾及震盪）來 進行優化°在聚集之融合蛋白質再溶解之後，可能需要進 步離。來移除任何不溶性組分。在本發明之—個實施例 中，使用微過濾來替代第一循環離心以促進融合睪白質之 回收，而在第二及第三循環令應用正常離心。在另一實施 例申，例如4t攪拌隔夜增強ELp再溶解。 在使ELP融合蛋白質與其他污染性蛋白質分離之整合程 序中，自可溶性ELP融合蛋白質聚集至回收聚集之融合蛋 白貝至可溶狀態的步驟定義為一個分離循環。為了獲得純 的融合蛋白質’可將該循環重複若干次’且循環中之分離 刼作可用不同方法（諸如經由微過濾及/或離心）進行調節。 然而’雖然廣泛且較長的分離程序可得到較高純度，但融 合蛋白質之產率可能降低。 一旦獲得所需純度之ELP-内含肽融合蛋白質，即可藉由 =變反應PH值及/或溫度及/或藉由添加其他化學物（諸:調 郎鹽濃度）來觸發内含肽之裂解反應。可應用其他補充操 作(諸如藉由延長反應時間及凍融)來加速裂解。裂解比率 可藉由SDS-PAGE或其他方法進行評估。 較佳在裂解之ELP-内含肽標籤與釋放 分離之前達/ 之重組蛋白質最終
類似方式藉1 溶性蛋白質中移除來進行分離 終產物進一步透析或除鹽以移 合需要之少量組分。 160499.doc 15 201239093 在以下一個實例中，轉殖基因稻穀種子用作露兜樹凝集 素（PAL)之產生系統，其表現為與ELP-内含肽標籤之融合 體。PAL蛋白質為來自七葉蘭amary/hyb/z'M·?)之 單子葉植物甘露糖結合凝集素。分子量（Mw)為約12.5 kD 之PAL蛋白質（蛋白質序列顯示於圖1(c)中）對若干人類癌細 胞株之增殖展現抑制活性（Tian, L.等人，未公開）。 如以下所闡述亦在菸草中證明本發明之融合蛋白質之表 現及純化系統的可適用性。 提供以下實例來說明但不限制本發明。 實例1 自轉殖基因稻穀種子純化重組抗腫瘤蛋白質 在此實例中，轉殖基因稻榖種子用作產生系統且分子量 (Mw)為約12.5 kD之露兜樹凝集素（PAL)(蛋白質序列顯示 於圖lc中）用作目標蛋白質。PAL對若干人類癌細胞株 (HepG2、A549、DLD-1、U87及 Capan-2)之增殖展現抑制 活性。PAL以與ELP-内含肽標籤之融合體形式表現，其中 ELP含有60個重複「VPGXG」肽，且内含肽蛋白質回應於 低pH值在其C-端裂解。ELP-内含肽標籤插入於PAL之N-端，且在自稻榖種子純化ELP-内含肽-PAL融合蛋白質 後，可藉由降低缓衝液pH值來觸發内含肽裂解以使目標 PAL蛋白質與Ei標籤分離。 顯示於圖1 (a)中之ELP-内含肽-PAL融合蛋白的表現卡匣 由稻榖蛋白GhA(Gtl)啟動子及信號肽驅動。將此序列選 殖至T-DNA二元載體pSB130之多個選殖位點進行稻轉型。 160499.doc -16-
S 201239093 該構築物稱為SA。 編碼ELP60域之序列係藉由與Scheller，J.等人 (7><2«叹6«化/?以.（2006) 13:51-5 7)所述類似之方法自顯示 於圖1(b)中之ELP10基因之六個重複序列產生。Ssp DnaB 内含肽（稱為内含肽1)及連接子基因係獲自見於全球資訊網 (World Wide Web)neb.com/nebecomm/products/productN6952.asp 之NEB購買的PTWIN2載體（連接子基因為5902 bp至5940 bp且内含肽基因為5941 bp至6402 bp)。ELP10及内含肽基 因均針對稻之較佳密碼子使用進行優化且由GenScript公司 合成。 土壤桿菌屬介導之轉型係使用稻栽培品種9983用上述載 體構築物進行。稻穀種子癒傷組織誘導、土壤桿菌屬介導 之轉型、稻植物之選擇及再生係按照由CAMBIA於全球資 訊網 cambia.org/daisy/cambia/4214.html所提供的方案進行。 再生之轉殖基因稻苗在香港中文大學（Chinese University of Hong Kong)轉移至土壤且於用於轉殖基因植物之設施中 生長。在藉由PCR對再生之稻植物初步篩選之後，藉由南 方墨點法（Southern blot)進一步證實轉殖基因整合至稻植 物之基因組中。獲得含有轉殖基因之一至兩個複本的若干 轉殖基因植物。成熟的陽性轉殖基因稻縠種子收集為T1種 子。自陽性T1植物產生之T2種子用於藉由SDS-PAGE及西 方墨點法（Western Blot)使用特異性抗體進行蛋白質分析。 如圖2中所示及下文所述，藉由SDS-PAGE及西方墨點法 分析使用抗PAL抗體偵測轉殖基因稻穀種子中之pal蛋白 I60499.doc -17· 201239093 質表現。 由摻混機將成熟稻榖種子研磨成粉末。將總蛋白質提取 緩衝液（0.1 M Tris-HCl ’ pH 8.5，50 mM NaCl，5% SDS， 4 M尿素，5% β-疏基乙醇）以2〇 μΐ/mg添加至種子粉末中， 且在強烈震盪下在35t至371下培育2小時至4小時。使全 部勻漿在室溫下在20,000xg下離心1〇分鐘兩次。收集上清 液作為來自種子的總提取蛋白質（TEP)進行表現分析。對 於西方墨點法，TEP係藉由15% SDS_pAGE使用裝載緩衝 液（50 mM Tris-HCl ’ pH 8.5，2% SDS ; 10%甘油；〇 〇2% 溴酚藍）分離且轉移至PVDF膜。西方墨點法係使用來自兔 之抗PAL—次抗體及抗兔1§(}_過氧化酶抗體（Sigma)進行。 由大腸桿菌產生之重組PAL用作陽性對照。 在SA轉型稻穀種子中，在SDS_pAGE分析中可觀察到具 有預期Mw(56 kD)之融合蛋白質。某些融合蛋白質在3八種 子中在活體内自身裂解’產生游離PAL且偵測到糖基化 PAL。對來自獨立稻株之總種子蛋白質的西方墨點法分析 顯示於圖2⑷及圖2(b)中。當僅關注藉由西方墨點法測定 之活體内未裂解之EiP融合蛋白f時，从轉殖基因稻穀種 子中⑽白質的積聚量平均計為14〇續乾燥種子。 總蛋白質提取至最終純化的程序示意性顯示於圖3中。 -般而言，需機相變之兩或三個循環來獲得純的阶蛋 白質，且由於在兩個步驟中的隔夜培育而需要約2至3天。 更詳細而言，由Bt緩衝液（〇1 M Tdsa，pH Μ ; % 福NaC1 ; 6 M尿素；〇.5% τ_ηΤΜ·2〇)提取總蛋白質。將 160499.doc
S -18- 201239093 提取樣品（EX)過濾（EXF)以移除任何碎片，由pD_1〇管柱 (GE Healthcare)除鹽（DS)或用 Bp緩衝液（〇1 Μ , pH 8·5，50 mM NaCI)透析以移除尿素，隨後在下在 20,000xg^離心（DSC)1〇分鐘以移除任何不溶性碎片。收 集上清液進行純化β 為了觸發ELP之溫度敏感性逆向相變，將5 M NaCl以 l:l(v/v)之比率添加至樣品中，且將混合物在45它下培育 10 分鐘。如 Ge 等人（价(2006) 95:424-432)
所述在作少許修改的情況下進行第一純化循環。將經Naci 處理之樣品轉移至配備有MUlip〇re™過濾器（PES膜，〇22 μηι)的針疴中，且棄去遽液，而積聚之ELp_内含肽融 合蛋白保留在過濾器中。使1毫升冷的Bs緩衝液（〇·丨M
Tris-HCn’ pH 8.5 ; 50 mM NaCl ; 0.1% TweenTM-20)快速 通過以自過濾器移除其他NaC卜且由於一些融合蛋白質可 變回可溶狀態且通過過濾器因此收集洗滌液。將另外1 ml 至3 ml(或初始TEP樣品之W1 〇體積）冷的Bs緩衝液添加至無 活塞的針筒中’且使整個系統保持在4。(：下隔夜，在過濾 器下方用試管由重力收集洗出液（可溶性Eip)。用活塞推進 任何殘留的溶液以收集餘下的可溶性Eip。將洗出液及洗 滌液合併為1CS樣品。 第二循環係利用如Wu等人（iVaiwre尸roioc. (2006) 1:2257_2262)所報導之逆向相變程序進行。以1:1 v/v之比 率添加NaCl(5 M)，且在45°C下培育混合物10分鐘，隨後 立即離心。使離心塊再懸浮具有1/5原始體積之冷的仏緩 160499.doc -19- 201239093 衝液中’且在輕緩攪拌下在冰上保存1小時。在4〇c下離心 之後’收集上清液作為2CS樣品。第三循環如第二循環進 行’例外為使用50 mM PBS緩衝液（pH 7.2)再溶解離心 塊°收集上清液作為3CS樣品。 為了觸發内含肽之裂解反應，將1/10體積之1 M Tds_ HC1 (pH 4 · 5 )添加至3 C S樣品中，使最終pH值為6.0至6 5。 使樣品在室溫下裂解2小時，隨後在下隔夜（達成完全 裂解）。藉由添加NaCl繼之以離心進行另一相變。收集上 清液作為最終純化之目標蛋白質（FS)且再懸浮離心塊作為 最終ELP-内含肽標籤（ρρ)。 在2或3個循環之後在SDS-PAGE中可觀察到經純化之Eip 融合蛋白質。在裂解步驟中，藉由添加低pH值之Tris緩衝 液達成之pH值改變引發内含肽裂解反應，但使用在ye下 較長時間培育（諸如24小時至36小時）來達成完全裂解。可 使用凍融處理來加速裂解。裂解及後續純化步驟為有效 的’原因在於PAL之最終上清液中無ELP-内含肽標藏殘留 (圖4 ’泳道FS)。藉由此高度優化之方法，純的pal蛋白質 之產率為約30 pg/g乾燥種子至80肫/g乾燥種子。 PAL屬於單子葉植物甘露糖結合凝集素且對人類癌細胞 的增殖表現出抑制活性（圖5，樣品PH)。吾人使用對若干 不同人類癌細胞株（HepG2(肝癌）、A549(肺癌）、DLD-1 (結 腸癌）、U87(神經膠母細胞瘤）及Capan_2(胰腺癌））的增殖 抑制活性分析來測試由ELP-内含肽系統自稻縠種子純化之 PAL蛋白質的生物活性。結果顯示由ELp_内含肽系統純化 160499.doc ΛΛ -iu · s 201239093 之PAL展現類似於自大腸桿菌純化之1>八]1蛋白質的劑量依 賴性抑制活性（如圖5中所示），表明ELP_内含肽融合表現 及純化系統並未減弱重組蛋白質的生物活性。 實例2
.自轉殖基因菸草純化重組人類G-CSF 在此實施例中’轉殖基因菸葉用作產生系統，同時人類 粒細胞群落刺激因子（hG_CSF)( 一種已廣泛用於腫瘤學及 感染保護的重要人類細胞因子）用作目標蛋白質。 使用一元載體pBii2l中之CaA/T 35S啟動子來構建hG-CSF融合表現嵌合體，且引入菜豆蛋白（phase〇lin)信號肽 以將表現之融合蛋白質引導至植物細胞分泌路徑。表現卡 匣顯示於圖6中。引入泛素以改良目標蛋白質之表現且其 將由内源性泛素特異性蛋白酶（ubp)自融合蛋白質精確加 工（Tian，L.及 Sun，S.S.Μ·, 5MC1 5(2011) 11:91)。 圖6顯示編碼由括號表示2hG_CSF·内含肽2_ELpu〇融合蛋 白貝的序列’且箭頭表示藉由添加DTT或β-疏基乙醇觸發 之内含肽2的裂解位點。 hG-CSF以在C-端具有内含肽Elp(IE)標籤之融合體形式 表現，顯示為hG-CSF-内含肽-ELP或「GIE」（圖6)，其中 ELP含有110個重複rVPGXG」肽而内含肽蛋白質（稱為内 含肽2)回應於巯基試劑（諸如二硫蘇糖醇（DTT)或β_巯基乙 醇）之添加在其Ν•端裂解。在自菸葉純化GIE融合蛋白質 後’藉由添加β-巯基乙醇來觸發内含肽裂解以使目標hG_ CSF蛋白質自IE標籤釋放。 160499.doc -21 - 201239093 ELPl 10基因係藉由上述類似方法自ELP10基因之11個重 複序列（圖1(b))產生。Mth RIR1内含肽及連接子基因獲自NEB 於全球資訊網 neb.com/nebecomm/products/productN6952.asp 鱗買的pTWIN2載體（内含肽基因為6445 bp至6846 bp且連 接子基因為6847 bp至6888 bp)。 藉由電穿孔將pBI121表現載體中之嵌合基因轉型至根癌 土 壤桿菌iwwe/ac/e«s)LBA4404 中，且使用 新於葉如先前所述進行土壤桿菌屬介導之轉型（Tian，L及
Sun，S.S.M，5MC (2011) 11:91)。在植物再生之 後’使用hG-CSF特異性引子對個別植物進行Pcr篩選且15 個轉染植物中有11個顯示陽性結果。 為了镇測經轉染植物中GIE蛋白質的表現，用提取緩衝
液[0.1 Μ麟酸鹽緩衝生理食鹽水（pBS)，pH 7.2 ; 1 mM edta ; ο·ι% TweenTM_20 ; 1〇〇爪厘抗壞血酸；2%聚乙烯 吡咯啶酮；完全蛋白酶抑制劑（混合錠，R〇che)]自21天齡 轉殖基因植物之新鮮新葉中提取總可溶性蛋白質。將新鮮 葉子（1 g)在研钵中在液氮下研磨成粉末，且添Mi ml提取 緩衝液將王部勻聚轉移至2 ml Eppendorf管中，在冰上 培育15分鐘且在2〇〇〇〇Xg下4<t下離心1〇分鐘。收集上清 、、文且再離〜1 0分鐘。收集最終上清液作為來自葉子的總可 溶性蛋白質。 用 4x 裝載緩衝液（0.2 M Tris_Hcl，pH 6 8 ; 〇 8 g SDS ; 4〇%甘油，5% β•巯基乙醇；50 mM EDTA; 8 mg溴酚藍） 釋自葉子提取之總可溶性蛋白質，煮沸5分鐘且在"％ 160499.doc
S •22- 201239093 SDS-PAGE上用10 gg至50 蛋白質/泳道分離，隨後用 Coomassie®亮藍染色達成蛋白質顯現。對於免疫墨點法， 將藉由SDS-PAGE分離之總蛋白質在不染色之情況下直接 轉移至PVDF膜。西方墨點法係使用兔多株抗hG_CSF抗體 (PeproTech)及抗ELP抗體作為一次抗體及抗兔IgG過氧化 酶抗體（Sigma)作為二次抗體進行且使用ECL偵測系統 (Amersham Co” Bucks，UK)進行顯色。購自 Pepr〇Tech之重 組hG-CSF及由大腸桿菌產生之ELp6〇蛋白質用作陽性對 昭〇 如圖7(a)中所示，具有預期分子量（8〇 kD)之gie融合蛋 白質在無活體内自身裂解之情況下在轉殖基因菸葉中合 成，但經由SDS-PAGE未觀察到野生型（WT)與轉殖基因植 4:之間有明顯的蛋白質帶型差異。對來自個別植物之總可 洛f生蛋白為的西方墨點法分析顯示於圖了⑻及圖7⑷中。 轉殖基因料中GIE蛋白f的積聚量平均計為126⑽鮮 重（FW)。 * 乂、心可/奋性蛋白質萃取起始至最終純化之獲得經純化目 «白質的程序示意性顯示於圖8中…般而言，需要ELp 相變之三個或三個以上循環來獲得純的GIE蛋白質，由於 在兩個步驟中的隔夜培育而持續2天或2天以上。 在此貫財，吾人使用由11G個VPGXG重複序列組成的 LP來改/ELP相變之效率。由於⑽融合蛋白質在於葉中 的積聚讀低’因此為了在純化期間觸發GIE聚集’採用 添加相同體積之3 MNaa且在37tTiffi小時至3小時。 160499.doc •23· 201239093 在蛋白質積聚繼之以離心之後，藉由添加懸浮液緩衝 液（5〇 mM碟酸鹽緩衝生理食鹽水㈣S)，PH 7.2;01% τ—20;完全蛋白酶抑制劑)且在代了搜拌隔夜來進 #第n壤中目標融合蛋白f之再溶解。冑懸浮液在 2〇〇〇xg下4C下離心2〇分鐘且收集上清液作為樣品似。 在第二及第三循環令使賴似純化方法，例外在第三循 裒中使用預裂解緩衝液⑼mM Tds HC卜pH 8 5 ; 峨 NaCl，1 mM EDTA)來使積聚之⑽融合蛋白質再溶解。 隨同純化程序，提取中之顏料亦逐漸移除。 為了觸發内含肽之裂解，在3個循環之後將卜酼基乙醇 添加至樣品中，使最終濃度為1〇 mM，且將樣品在室溫下 保持30分鐘且在4t：T保持2小時以完成裂解。& 了監測裂 解反應，在室溫下培育1〇分鐘之後收集部分樣品（樣品 CL)。在裂解之後，如上所述進行ELp之另一相變循環且 收集上清液中之最終裂解之hG_CSF(樣品FS)及離心塊中之 内含肽-ELP標籤（樣品fp)。參見圖9。 在3個循環之後在SDS_PAGE中可清楚地觀察到經純化之 GIE融合蛋白質且可觸發内含肽裂解以自内含肽_£1^標籤 釋放hG-CSF。如圖9中所示，裂解及後續純化步驟為有效 的，原因在於hG-CSF之最終上清液中無正標籤殘留（泳道 FS)。最終hG-CSF之回收率為10 ng/g新鮮葉子至2〇 ng/g新 鮮葉子且目標蛋白質的表現量為126 pg/g新鮮葉子。 人類G-CSF為一種重要的藥物蛋白質，其可用於增強患 有人類免疫缺乏病毒（HIV)、肺炎、糖尿病性足感染、白 160499.doc -24- 201239093 血病及發熱性嗜中性白血球減少症患者之免疫系統及治療 進行化學療法之癌症患者以減輕由細胞毒性治療劑所引起 的白細胞含量降低。 將hG-CSF之最終上清液（如上所述之樣品FS)除鹽，冷凍 乾燥且再懸浮於偵測緩衝液（5〇 mM PBS，pH 7.2)中進行 生物活性測試’該測試係藉由量測促進hG_CSF依賴性 NFS-60細胞株之增殖的能力來進行。此細胞株僅在hG_ CSF或其他已知生長因子存在下生長。培育72小時以後， 用偵測緩衝液處理之細胞顯示與未經處理之樣品類似的基 線增殖水準。當用1 ng市售hG_CSF處理時，NFS_6〇細胞之 增殖相對於未經處理的樣品CT提高26〇%，而含有補充有1 ng自菸葉純化之hG-CSF之偵測緩衝液的樣品顯示促進 NFS-60細胞增殖的類似能力，表明經純化的h(}_csF生物 活性與市售hG_CSF一樣。經純化之GIE蛋白質亦經測試且 顯示生物活性但細胞增殖活性相應降低，表明内含肽_ELp 標箴並未破壞目標hG-CSF之生物活性。此等結果證實 ELP-内含肽融合表現及純化系統並不減弱重組蛋白質之生 物活性。 【圖式簡單說明】 圖1(a)至圖1(c)顯示關於以下所例示之轉型質體的資 訊。 圖2(a)至圖2(b)顯示成熟轉殖基因稻榖種子中所積聚之 ELP-内含肽-PAL融合蛋白質的SDS_pAGE&西方墨點法分 析。 160499.doc •25- 201239093 圖3顯示自稻榖種子純化ELP-内含肽-PAL融合蛋白質之 方案。 圖4顯示由ELP-内含肽系統自轉殖基因稻穀種子成功純 化 PAL。 圖5(a)至圖5(e)顯示根據本發明之方法純化之PAL對各種 細胞株之作用的圖示。 圖6顯示用於在菸草中產生包含hG-CSF之融合蛋白質之 表現系統的圖式。 圖7(a)至圖7(c)顯示在菸葉中人類G-CSF表現為融合蛋白 質的SDS-PAGE結果。 圖8顯示當hG-CSF以融合蛋白質之形式產生時，自菸草 種子中純化hG-CSF之步驟的圖式。 圖9顯示自菸葉中融合蛋白質表現純化hG-CSF之SDS-PAGE的結果。 160499.doc •26·

Claims (1)

  1. 201239093 七、申請專利範圍： 1. 一種自植物、植物部分或植物細胞獲得所需 a㈡買的方 法，該方法包含： (a)自該等植物、植物部分或植物細胞製備蛋白質提 取物’該等植物、植物部分或植物細胞產生該所需蛋^ 質呈融合蛋白質，在所需蛋白質的N_端或C-端或兩端包 SELP-内含肽（lntein)標籤，該ELp_内含肽標籤包含彈性 蛋白樣多肽（ELP)域及内含肽剪接元件（内含狀），其令該 内含肽係在該所需蛋白質_•端及/或匕端或 < ELP域之間； ” @ (b)視情況自該提取物移除不溶性物質； (C)使5亥專融合蛋白聚隼且作盆 取果立便其與该提取物之其餘部 分分離； (d) 將該等融合蛋白再溶解成水溶液； 視情況重複步驟（c)及步驟（d); (e) 進行該融合蛋白之裂解；及 (f) 使該所需蛋白質與該（等）標籤分離。 2·如請求項1之方法，复中哕 八ThLP域含有至少1個ELP単 元。 3. 4. 白質另外包括一或多 含狀之間及/或内含肽 如請求項1之方法’其中該融合蛋 個連接子序列在該所需蛋白質與内 與ELP之間及/或在ELp單元之間。 如印求項1之方法，其中琴舌 丹甲°玄重組蛋白質為凝集素（lectin) 或細胞因子。 160499.doc 201239093 5· 士咕求項1之方法，其中步驟（C)包含一或多次調節溫 度、pH、溶劑内含物及/或所應用之設備。 6. 明求項丨之方法，其中步驟（c)中之分離包含離心或微 過渡。 7·如吻求項丨之方法，其中步驟（d)包含修改溫度、pH、鹽 · 及/或含有該等聚集體之水性混合物之其他組分。 8.如吻求項1之方法，其中步驟（e)包含調節pH、溫度及該 水溶液之組分。 9_如明求項1之方法’其中步驟（f)包含聚集及分離該eLP-内含肽標籤。 10. —種核酸，其在植物細胞中可操作以在該等植物細胞中 表現融合蛋白質，該融合蛋白質在所需蛋白質的N_端或 C-端或兩端包含ELP_内含肽標籤，該ELP_内含肽標籤包 含彈性蛋白樣多肽（ELP)域及内含肽剪接元件（内含肽）， 其中該内含肽係在該所需蛋白質的N_端及/或C-端或兩端 與該ELP域之間。 11. 一種植物細胞或組織，其含有如請求項10之核酸。 12. —種產生融合蛋白質的方法，該融合蛋白質包含在所需 蛋白質之N-端及/或C-端具有ELP-内含肽標籤之融合蛋 · 白質’該方法包含培養如請求項11之植物、植物細胞或 - 植物部分* 1 3.如請求項1 〇之核酸，其中該ELP域含有至少1個ELP單 元。 14.如請求項10之核酸，其中該融合體另外包括一或多個連 160499.doc - 2 · S 201239093 接子序列在該所需蛋白質與内含肽之間及/或内含肽與 ELP之間及/或在ELP單元之間。 集素或細胞 15_如請求項1〇之核酸，其中該重組蛋白質為凝 因子。 16. 如請求項1 〇之核酸，其中該内含肽係在該 丨高蛋白質之 N-端與該（等）ELP域之間。 17. 如請求項10之核酸，其中該内含肽係在該所需蛋白質之 C-端與該（等）ELP域之間。 18. —種包含融合蛋白質的植物細胞或組織，該融合蛋白所 在所需蛋白質的N-端或C-端或兩端包含ELp_R含肽標 籤，該ELP-内含肽標籤包含彈性蛋白樣多肽（el^域及 内含肽剪接元件（内含肽）’其中該内含肽係在該所需蛋 白質的N-端及/或C-端或兩端與該ELP域之間。 19. 一種產生含有如請求項1〇之核酸之植物的方法，其包含 將如請求項10之核酸轉染至該等植物的基因組中及再生 §玄荨植物。 20· -種產生包含融合蛋白質之植物的方法’其包含將表現 及嘁α蛋白質之核酸轉染至該等植物的基因組中及再生 。亥等植物，其中該融合蛋白質在所需蛋白質的N—端或。 知或兩端包含ELP-内含肽標籤，該ELp-内含肽標籤包含 彈性蛋白樣多肽（ELP)域及内含肽剪接元件（内含肽），其 中4内含肽係在該所需蛋白質的N_端及/或c_端或兩端與 5玄ELP域之間。 160499.doc
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