TW201231672A - Primer, probe, and method for multi-specimen analysis - Google Patents

Description

201231672 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明之實施形態關於一種引子、探針及偵測方法， 其係用於對多個檢體偵測標的核酸。 【先前技術】 在寵物產業方面，所交易的動物爲健康良好是很重要 的。例如消費者所購買到的動物在購買之後的短時間內疾 病發作，甚至不幸致死，會對消費者造成不必要的經濟損 失或精神傷害。連帶地，提供該動物的販賣者或飼養者停 止營業的情形也不少，而成爲信用失落的原因。 狗，尤其是未成年狗，認爲感染癒熱病毒或小病毒的 致死率爲約1 00%。目前這樣的病毒偵測是採用一種利用了 抗原抗體反應的方法。而爲了藉由抗原抗體反應進行正確 的判定，必須在感染後經過一定時間，而且偵測靈敏度低 。故該等方法仍然不足以用來早期且迅速診斷感染。甚至 在抗原抗體反應的情況，必須對每一種病毒進行偵測操作 【發明內容及實施方式】 若依據一個實施形態，則提供一種方法，可針對複數 檢體解析檢體核酸中之核酸序列。在該方法之中使用了各 檢體不同種類的引子組，以增幅模板序列。引子組含有第 1引子與第2引子。第1引子含有對應於各個檢體而具有彼 -5- 201231672 此不同的序列之標籤序列。第2引子係與第1引子成對使用 。藉此可達成標的序列的增幅。標籤序列插入在第1引子 由3’末端側算起第6〜12個鹼基，標籤序列的鹼基數目爲3 〜7個鹼基。標籤序列設計成在第！引子與部分核酸序列的 模板序列雜交後發生環出。接下來，將由每個檢體所得到 的增幅產物混合，並使所得到的增幅產物混合物與核酸探 針反應。核酸探針被固定化於基體上。以與核酸探針的雜 交爲指標所偵測到的序列爲標的序列。標的序列包含標籤 序列以及每個模板序列的部分核酸序列的模板序列而來的 序列。接下來，藉由偵測雜交作用的量，可偵測及/或測 定標的核酸之有無及/或量。 藉由這樣的實施形態可提供一種方法，能迅速且簡便 地解析多個偵測對象。 〔定義〕 本說明書所使用的「核酸」這樣的用語總括表示DNA 、RNA、PNA、LNA、S-Oligo、寡核苷酸甲基膦酸酯等可 將其一部分的構造以鹼基序列表示的物質。 「檢體」是指欲依據本實施形態的解析方法進行解析 的對象，而只要是可能含有核酸的試樣即可。檢體係以在 不妨礙增幅反應及/或雜交作用反應的狀態爲佳。例如爲 了將由生物體等所得到的材料製成依據本實施形態的檢體 來使用，只要藉由其本身周知的任一種手段進行前處理即 可。例如檢體亦可爲液體，此情況亦可稱爲「被檢液」。 -6- 201231672 所以「被檢液」可解釋成可能存在核酸或模板核酸的溶液 〇 「多個檢體（multiple samples)」及「複數檢體（ plural samples)」的用語表示2個或2個以上的檢體，可交 替使用。 將檢體所含的核酸稱爲「檢體核酸」。在檢體核酸之 中，將欲藉由本實施形態之引子增幅的序列稱爲「模板序 列」。將含有模板序列的核酸稱爲「模板核酸」或「模板 」。將模板核酸所含的一部分序列稱爲「部分核酸序列」 。部分核酸序列係欲解析的序列或鹼基，依據本實施形態 所得的引子，是設計成增幅包含部分核酸序列的區域。部 分核酸序列可與模板序列相等，亦可包含於模板序列》 藉由本實施形態，例如在偵測特定病毒的情況，只要 以來自該病毒的核酸作爲模板核酸即可。此情況下，可將 部分核酸序列設定爲例如對於該病毒爲特異性的序列。 「標的核酸」是指使用依據本實施形態的順向引子與 逆向引子增幅模板核酸或模板序列所得到的增幅產物。標 的核酸於其一部分含有標的序列。 「標的序列」是由標籤序列與模板序列的一部分序列 所構成。該標的序列被利用於使用核酸探針偵以測標的核 酸。 「核酸探針」是指含有與標的序列互補的序列之核酸 。核酸探針是固定化於基體等的固相上而使用，形成含有 來自模板序列的區域的增幅產物與雜交體。 201231672 「來自模板序列的區域」意指藉由引子而增幅的區域 之中，在引子結合區域以外的區域’並反映出模板序列的 區域。在偵測基因多型或基因變異的情況’設計成將該等 部位收在此區域內。 「DNA晶片」是指利用核酸探針與偵測對象的核酸之 間的雜交反應而解析.核酸的裝置’而核酸探針係具有與欲 偵測的核酸互補的序列。DN A晶片的用語與一般所使用的 「核酸晶片」、「微陣列」及「DNA陣列」等的用語同義 ，彼此可交替使用。 「解析多個檢體」是指同時解析多個檢體。「解析檢 體中之多個核酸序列」是指同時解析1個檢體中所含的多 個部分核酸序列。同時被解析的多個部分核酸序列可被包 含在1個模板核酸，亦可分別被包含於檢體所含的不同種 類的檢體核酸。 另外，所解析的項目可爲例如來自病毒及/或細菌等 的基因等的特定核酸的偵測、基因表現量的測定、針對多 型的基因型鑑定及/或變異之有無的偵測等。然而並不受 其所限定。 「增幅」是指使用引子組增幅目標核酸，包括PCR法 及LAMP法。「LAMP法」包括LAMP法及RT-LAMP法。「 RT-LAMP法」爲等溫基因增幅法的LAMP法的1種。RT-LAMP法係藉由同時進行反轉錄反應與LAMP反應，並以 RNA作爲模板而進行LAMP增幅的方法。在此處簡記爲「 LAMP法」的情況’只要沒有特別記載，可解釋成提及「 201231672 LAMP法」與「RT-LAMP法」這兩者。LAMP法與RT-LAMP 法的引子可使用彼此相同的引子。 「反應場所」是指可在該處進行反應的場所。反應場 所可爲例如試管、孔、腔體、流路、杯及皿；以及具備多 個該等場所的板，例如可形成於多孔板所具備的孔內部。 〔實施形態〕 以下針對本實施形態作說明。 圖1表示導入了標籤序列的引子與核酸探針之圖。 <引子> 如圖1之導入了標籤的F引子所例示般，引子含有結合 於模板核酸之引子結合部位的第1啓動序列及第2啓動序列 ;以及導入至第1啓動序列與第2啓動序列之間的標籤序列 。標籤序列是利用來解析多個檢體。在此處，標籤序列分 別對應於多個檢體而具有彼此不同的序列。標籤序列的鹼 基長爲3〜7個鹼基。含有標籤序列的引子與模板核酸結合 時，一方面第1啓動序列與第2啓動序列會與模板核酸結合 ，另一方面，標籤序列的部分不與模板核酸結合，而發生 環出。 爲了解析多個檢體’分別對於被帶進相同反應場所的 多個引子所導入的標籤序列之組合的例子爲「CTG」、「 GGA j 、「CCT」、「TCC」、「ATC」、「GCG」、「 CGC」、「CCTCT」、「GTGCA」、「GACGT」及「 201231672 ACGTC」。在對2個以上的檢體進行偵測的情況，各個檢 體可採用選自「CTG」、「GGA」、「CCT」、「TCC.」 、「ATC」、「GCG」、「CGC」、「CCTCT」、「 GTGCA」、「GACGT」及「ACGTC」所構成之群中至少1 個標籤序列。被帶進相同反應場所的標籤序列所適合的組 合的例子爲「CTG」、「GGA」、「CCT」、「TCC」、 「CGC」及「GTGCA」。另外，在針對2個以上的檢體進 行偵測的情況，亦可將選自「CTG」、「GGA」、「CCT 」、「TCC」、「CGC」及「GTGCA」所構成之群中至少 1個標籤序列使用於各個檢體。 引子的長度爲13〜40個鹼基，例如可爲15〜30個驗基 。含有標籤的引子（此處亦稱爲「含標籤引子」）的情況 可爲長度爲16〜47個鹼基，例如18〜37個鹼基。 關於前述標籤序列插入至引子的場所，重要事項如下 述。亦即在引子與模板結合的情況，標籤序列部分必須不 與模板結合而發生環出。進一步在圖1所示般，偵測變異 或單一鹼基多型等的多型的情況，核酸探針必須含有標籤 序列與來自模板序列的序列這兩者。所以在PCR增幅的情 況，標籤序列只要插入在順向（Forward)引子（F引子） 及/或逆向（Reverse)引子（R引子）由3’末端側算起的第 6〜12個鹼基中的任一個部位即可。在LAMP增幅的情況， 只要插入在F2區域及/或B2區域從3’末端算起的第6〜12個 鹼基中的任一個部位即可。具體而言，只要插入在FIP引 子的F2序列從3’末端算起的第6〜12個鹼基、及/或BIP引子 -10- 201231672 的B2序列的第6〜12個鹼基中的任一個部位即可。 得到良好的增幅與偵測特性。 構成標籤序列的核酸種類只要是DNA、RNA、 LNA、S-Oligo、寡核苷酸甲基膦酸酯等可將其一部 造以鹼基序列表示的物質，則不受特別限定。 <核酸探針> 核酸探針可偵測標的核酸，並可識別標的核酸 自任何的檢體核酸。所以，核酸探針是設計成含有 序列互補的序列。與標籤序列互補的序列是用來偵 序列的序列。進一步而言.，核酸探針如圖1所示般 需求設計成與含有來自模板序列的區域互補的序列 例如在偵測檢體中核酸的基因變異及/或多型 ，則準備一種引子，其基因變異及/或基因多型部 含於增幅產物上的引子結合部位附近的來自模板序 域。另外’核酸探針設計成含有對應於基因變異2 因多型部位的序列。藉此，能夠以核酸探針與增幅 雜交作用之有無及/或量作爲指標而得到檢體核酸 異及/或多型部位的鹼基資訊。例如爲了偵測出檢 爲野生型或變異型，可藉由使用分別相對應的核酸 並比較與標的核酸的雜交作用量，而判定檢體的基 此情況下’核酸探針是採用野生型偵測用的核酸探 變異型偵測用的核酸探針。該等核酸探針含有標籤 測用的序列以及基因變異及/或多型偵測用的序列 藉此可 PNA、 分的構 是否來 與標籤 測標籤 ，因應 〇 的情況 位被包 列的區 5: /或基 產物的 上的變 體核酸 探針， 因型。 針以及 序列偵 。亦即 -11 - 201231672 ，檢體核酸爲野生型或變異型的判定，亦可藉由比較野生 型偵測用的核酸探針以及變異型偵測用的核酸探針與標的 核酸的雜交作用量以決定基因型來進行。 另外，在鑑定細菌之中分類成同屬的多個種的情況， 例如針對每個檢體分別準備導入了同屬共通增幅的前述標 籤的引子，並進行增幅。此時將引子設計成對於各個物種 爲特徵性的而且表現出可與其他物種區別的特異性的區域 被包含於增幅產物上的引子結合部位附近的來自模板序列 的區域。另外，核酸探針是設計成含有用以鑑定這些物種 的部位所對應的序列。藉此，能夠以核酸探針與增幅產物 的雜交作用之有無及/或量爲指標而得到關於分類成同屬 的多個物種的鹼基資訊。這樣的核酸探針含有標籤序列偵 測用的序列以；及具有對於各個物種爲特徵性的序列的物 種鑑定用的核酸探針》進一步還可準備含有表現出與物種 無關的序列之陰性控制組核酸探針，並且與物種鑑定用的 核酸.探針一起使用。例如亦可藉由比較這樣的物種鑑定用 的核酸探針與標的核酸的雜交作用、及含有物種無關的序 列的陰性控制組用核酸探針與標的核酸的雜交作用量以進 行物種鑑定。 在以偵測檢體中核酸增幅之有無作爲解析用的指標的 情況’未必一定要含有與來自模板序列的區域互補的序列 〇 依據本實施形態的核酸探針的鏈長並未受到特別限定 ’而以5〜50個鹼基的範圍爲佳，.10〜40個鹼基的範圍爲 -12- 201231672 較佳，15〜35個鹼基的範圍爲更佳。 另外’爲了使核酸探針固定化於基體，亦可藉著胺基 、羧基、羥基、锍基、颯基等的反應性官能基、抗生物素 蛋白、生物素等物質作修飾。另外，在這樣的官能基與核 苷酸之間亦可導入間隔部位。間隔部位可採用例如烷骨架 、乙二醇骨架等。核酸探針藉由官能基進行的修飾係以核 酸探針的末端爲佳，然而並不受此所限定。 將核酸探針固定化所用的固相，只要是使用作爲一般 DN A晶片用的固相的任一種基體即可。這樣的基體只要由 玻璃、矽、硝基纖維素膜、耐綸膜、微量滴定盤、電極、 磁石、珠子、塑膠、膠乳、合成樹脂、天然樹脂、或光纖 維等所構成即可，而不受該等所限定。將複數種核酸探針 固定化於該等基體上即可構成DNA晶片。 <方法> 接下來針對使用導入了標籤序列的引子與DNA晶片的 多個檢體之解析方法作說明。 如圖2所示般，首先分別對應於多個檢體，亦即檢體1 、檢體2、檢體3，設計出序列彼此不同的多個標籤序列’ 亦即標籤序列1、標籤序列2、標籤序列3。準備好導入了 該等標籤序列1、標籤序列2、標籤序列3的多個導入了標 籤的引子，亦即檢體1用的導入了標籤的引子、檢體2用的 導入了標籤的引子、檢體3用導入了標籤的引子。使該等 導入了標籤的引子與檢體’在多個檢體各種類互相獨立的 -13- 201231672 反應場所進行增幅。各種類的檢體互相獨立的反應場所， 只要是相異的檢體彼此不會混合的反應場所即可。例如可 在各個試管對每個檢體進行增幅。「反應場所」只要是可 在該處進行反應的空間，例如試管及孔等的容器內即可。 在增幅後可得到每個檢體有一部分序列相異的增幅產 物。在模板核酸不存在的情況，亦即檢體2的情況，增幅 不會發生而無法得到增幅產物。在檢體1、3的情況，各個 反應場所得到的增幅產物中含有每個檢體彼此不同的標籤 序列：以及進一步含有來自模板核酸的區域。所以可藉由 鑑定增幅產物所含的標籤序列而辨識、鑑定任一種檢體。 將此增幅產物混合，如圖3所示般，使其與固定化於 基體上的核酸探針反應而進行雜交作用。核酸探針含有與 各個標籤序列互補的序列。然後利用其本身周知的任一種 偵測法，偵測藉由反應所產生的雜交作用之有無及/或量 〇 以圖2及圖3表示3個檢體的範例，然而檢體數目顯然 不受其限定。另外如圖1所示般，只要將引子設計成使變 異或多型部位被包含在來自上述般的增幅產物之模板序列 的區域，即可同時解析藉由標籤序列進行的檢體識別、及 檢體所含的變異及/或多型的偵測或鑑定。此情況下，核 酸探針只要含有標籤序列以及來自模板序列之序列、或含 有與該等互補的序列即可’來自模板序列的序列或其互補 鏈係具有用以偵測或鑑定變異及/或多型的序列。 甚至如圖4所示般，可在一個反應系統中多重增幅序 •14- 201231672 列相異的多個模板序列。增幅後，只要對於檢體的增幅產 物進行DNA晶片偵測，即可針對多個模板序列解析複數檢 體。偵測係以固定化於基體上的核酸探針與增幅產物的雜 交作用作爲指標而進行。此核酸探針含有與各個標籤序列 互補的序列。在進行增幅反應而得到增幅產物之後，只要 利用其本身周知的任一種偵測法偵測該增幅產物與核酸探 針的雜交作用即可。以圖4表示3個模板序列的範例，然而 模板核酸的數目顯然不受其限定。 另外還可將引子設計成使變異偵測用序列及/或物種 鑑定用序列被包含於來自增幅產物之模板序列的區域。變 異偵測用的序列只要是對應於欲偵測或鑑定的變異及/或 多型的部位的序列即可。物種鑑定用序列只要是對於欲鑑 定的生物種爲特徵性的而對於其他生物種表現出特異性的 部位所對應的序列即可。此情況下，核酸探針可進一步設 計成含有標籤序列與變異偵測用序列及/或物種鑑定用序 列。不但可多重增幅彼此不同的多個模板核酸，更可藉由 使用這樣的核酸探針而進行變異、多型、生物種等的解析 〇 在本實施形態中的偵測對象，包括例如個體的基因 DNA、基因RNA、mRNA等。個體並未受到該等所限定， 而包括人類、人類以外的動物、植物以及病毒、細菌（ bacteria)、酵母及黴漿菌等的微生物。 該等核酸可由個體所採取到的試樣，例如血液、血清 、白血球、尿液、糞便、精液、唾液、組織、生物檢體、 -15- 201231672 口腔內黏膜、培養細胞、喀痰等萃取。或由微生物直接萃 取。核酸的萃取可利用市售核酸萃取套組的QIAamp ( QIAGEN公司製）、Smitest (住友金屬公司製）等實行， 然而不受該等所限定。以含有由個體試樣或微生物萃取出 的核酸的溶液作爲被檢液。 檢體可藉由本實施形態之方法所關連之增幅法而增幅 。在偵測對象爲RN A的情況，可在增幅前藉由例如反轉錄 酶轉換成互補鏈DN A。亦可將反轉錄酶與DN A聚合酶這兩 者添加至相同試管內，而同時進行反轉錄與DNA增幅。 關於增幅法，可使用例如Polymerase chain reaction法 (PCR法）、Loop mediated isothermal amplification法（ LAMP 法）、Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids ( ICAN 法）'Nucleic acid sequence-based amplification ^ ( NASBA 法)、Strand disp 1 acement amp 1 ificatiοn ( SDA 法）、Ligase chain reaction ( LCR 法）、Rolling Circle Amplification 法（ RCA法）等方法。所得到的增幅產物可因應必要斷片化或 單鏈化。單鏈化的手段例如有：使用熱變性、珠子（ beads)或酵素等的方法；使用T7 RNA聚合酶進行轉錄反 應的方法。在藉由LAMP法或IC AN法等增幅、在產物中存 在單鏈區域’以此單鏈區域作爲標的序列的情況，可直接 供給至雜交作用步驟。 由於變得不需要該單鏈化步驟，故藉由增幅所得到之 標的核酸係以具有莖-環（Stem-loop)狀構造爲佳。具有 -16- 201231672 莖-環狀構造的增幅產物，其單鏈的環狀部分的序列可適 合使用於與探針的反應。 標的核酸之增幅適合採用LAMP法（參照例如日本專 利第3313358號）。LAMP法爲迅速且簡便的基因增幅法， 並在增幅產物中具有莖-環狀構造。 圖5表示LAMP法所使用的基本引子的設計範例之圖。 使用圖5之模式圖簡單說明LAMP法的原理。在LAMP法中 ，使用6種引子與鏈取代型DN A合成酵素，最大可辨識8個 區域的模板核酸。模板核酸是在等溫（60〜65 °C )條件下 增幅。上述8個區域定義爲：由模板核酸的5'末端側起依序 爲F3、F2、LF、F1區域；由3’末端側起依序爲B3c、B2c、 LBc及 Blc區域。此外，Flc、F2c、F3c、Bl、B2、及 B3 區 域分別表示FI、F2、F3、Blc、B2c、及B3c區域的互補鏈 中的區域。如圖5所示的8種引子係在5'末端側具有與F1互 補的序列，並在3'末端側具有與F2相同的序列之FIP內引子 、在5’末端側具有與Blc相同的序列，並在3’末端側具有與 B2c互補的序列之BIP內引子、具有與F3區域相同的序列之 F3引子、具有與B3c區域互補的序列之B3引子、具有與LF 區域互補的序列之LFc引子、具有與LBc區域相同的序列之 LBc引子。在增幅反應中必須要有的是FIP內引子及BIP內 引子，而爲了提高增幅效率而添加F3、B3、LF及LB引子 〇 藉由LAMP法進行的增幅所得到的產物中，形成如圖6 所示般的環狀構造，F2區域至F1區域之間、F2c區域至Flc -17- 201231672 區域之間、B2區域至B1區域之間、及B2c區域至Blc區域 之間成爲單鏈的區域。因此，只要在此區域設計標的序列 ，即可簡便且高靈敏度地偵測標的核酸（參照例如日本特 開2005- 143492號公報）。LF引子及/或LB引子與標的序列 重疊的情況係以不添加LF引子及/或LB引子爲佳。 使用圖7，針對使用LAMP法的情況，使用導入了標籤 序列的引子與DN A晶片的多個檢體之解析方法作說明。 首先，對於每個檢體準備在F2區域及/或B2區域導入 了前述標籤序列的引子。 接下來使用該引子，在每個檢體各自獨立的反應系統 對每個檢體進行增幅。例如可對每個檢體分別在各試管進 行增幅。增幅後可得到在單鏈環狀部分隨著檢體的不同而 一部分的序列相異的增幅產物。在模板核酸不存在的情況 ，增幅不會發生而無法得到增幅產物。將此增幅產物混合 ，如圖8所示般，與含有與固定化於基體上的各標籤序列 互補的序列的核酸探針發生雜交作用。然後，藉由適當的 偵測法偵測增幅產物與核酸探針的雜交作用。 以圖7及圖8表示3個檢體的範例，然而檢體數顯然不 受其限定。 另外，如圖9所示般，只要將引子設計成使變異或多 型部位位於以核酸探針所偵測到的來自模板序列的區域， 亦即F2區域至F1區域之間、F2c區域至Flc區域之間、B2區 域至B 1區域之間、及B 2 c區域至B 1 c區域之間，即可藉由使 用偵測該等變異或多型的核酸探針而偵測。 -18- 201231672 甚至如圖ίο所示般，亦可在一個反應系統中多重增幅 由相異序列所構成之多種模板序列。只要在增幅後對於檢 體的增幅產物進行DNA晶片偵測，即可針對多個標的序列 解析複數檢體。偵測係使固定化於基體上的各標籤序列與 含有互補的序列的核酸探針發生雜交作用。然後藉由適當 的偵測法，偵測增幅產物與核酸探針的雜交作用。以圖1 0 表示3個模板核酸的範例，然而模板核酸數目顯然不受其 限定。另外，只要將引子設計成使變異或多型部位、及/ 或對於欲鑑定的生物種爲特徵性的而對於其他生物種表現 出特異性的部位位於來自增幅產物的模板序列的區域，即 可使用含有分別與該等部位的鹼基互補的序列，亦即變異 偵測用序列及/或物種鑑定用序列的標籤序列的核酸探針 ，進一步針對變異、多型及/或生物種等解析檢體核酸（ 亦即檢體）。 < DNA晶片> 在本實施形態之中，所使用的DNA晶片只要具備基體 與固定化於基體上的核酸探針即可。DN A晶片的基體，只 要是如以電流偵測型爲代表的電化學的偵測型、螢光偵測 型、化學發色型及放射能偵測型等以往周知的任何種類的 微陣列用的基體即可。 任何種類的微陣列皆可藉由其本身周知的方法製造》 例如電流偵測型微陣列的情況，陰性控制組探針固定 化區域及偵測用探針固定化區域只要分別配置於相異的電 -19- 201231672 極上即可。 將DN A晶片的範例以模式圖表示於圖11，然而並不受 其限定。DN A晶片在基體1具備固定化區域2»核酸探針被 固定於該固定化區域2。這樣的DN A晶片可藉由該領域周 知的方法製造。配置於基體1的固定化區域2的數目及其配 置，業界人士可因應必要適當地設計變更。這樣的DN A晶 片可適當地使用於採用了螢光的偵測方法。 DNA晶片的其他範例如圖12所示。圖12的DNA晶片在 基體11具備電極12。核酸探針被固定化於該電極12。電極 12連接於貼片13。透過貼片13可取得來自電極12的電子訊 號。這樣的DN A晶片可藉由該領域周知的方法製造。配置 於基體11的電極12數目及其配置，業界人士可因應必要適 當地設計變更。 進一步而言，本例之DN A晶片亦可因應必要具備參考 電極及對電極。 電極可使用金、金之合金、銀、白金、水銀、錬、祀 、矽、鍺、鎵或鎢般的金屬單體及該等的合金，或如石墨 、玻璃碳般的碳或該等的氧化物或化合物，然而不受該等 所限定。 如本例般的DNA晶片可適當地使用於電化學的偵測方 法。 <雜交作用條件> 雜交作用只要在可充分形成雜交體的適當條件下進行 -20- 201231672 即可。適當條件依照標的核酸的種類及構造、標的序列所 含鹼基的種類、核酸探針的種類而不同異。例如離子強度 在0.01〜5的範圍，pH在5〜9的範圍之緩衝液中進行雜交 作用即可。反應溫度在l〇t〜90 °C的範圍即可。亦可藉由 攪拌或振盪等以提高反應效率。在反應溶液中，亦可添加 硫酸聚葡萄醣、鮭魚精子DNA、及牛胸腺DNA般的雜交作 用促進劑、EDTA、或界面活性劑等。 <洗淨條件> 雜交作用後將DN A晶片洗淨所用的洗淨液，適合使用 離子強度在〇.〇1〜5的範圍，pH5〜9的範圍之緩衝液。洗 淨液係以含有鹽及界面活性劑等爲佳。適合使用例如使用 氯化鈉或檸檬酸鈉調製的SSC溶液、Tris-HCl溶液、 Tween20溶液、或SDS溶液等。進行洗淨時的溫度定在例 如l〇°C〜70°C的範圍。洗淨液會通過或滯留在將探針固定 基體之表面或核酸探針固定化的區域。或可將DN A晶片浸 漬在洗淨液中。此情況下，洗淨液宜收容於可進行溫度控 制的容器中。 <偵測方法> 藉由雜交作用步驟所產生的雜交體的偵測’可利用螢 光偵測方式及電化學的偵測方式。 (a )螢光偵測方式 •21 - 201231672 使用螢光標識物質進行偵測。亦可藉著如FITC、Cy3 、Cy5、或玫瑰紅等的螢光色素般的螢光光學活性物質標 識核酸的增幅步驟所使用的引子。或可使用以該等物質標 識的第二探針。還可同時使用多個標識物質。藉由偵測裝 置偵測出被標識的序列或2次探針中的標識。因應所使用 的標識，而使用適當的偵測裝置。例如在使用螢光物質作 爲標識的情況，則使用螢光偵測器偵測。 (b )電化學的偵測方式 使用該領域周知的雙鏈辨識物質。雙鏈辨識物質可選 擇Hoechst 33258(赫斯特染劑）、吖啶橙、奎納克林、道 諾黴素、金屬嵌入劑、雙吖啶等的雙嵌入劑、參嵌入劑及 多嵌入劑。甚至還可藉著具有電化學活性的金屬錯合物， 例如二茂鐵、紫原色素等修飾該等雙鏈辨識物質。 雙鏈辨識物質一般而言在濃度Ing/mL〜lmg/mL的範 圍使用，然而依照種類而不同。此時可使用離子強度在 0.001〜5的範圍，pH在5〜10的範圍之緩衝液。 測定方式是施加例如使雙鏈辨識物質發生電化學反應 的電位以上的電位，並測定來自雙鏈辨識物質之反應電流 値。此時，電位係以定速或以脈衝的方式施加，或可施加 定電位。亦可使用恆電位器、多功能數位電表、及函數波 產生器般的裝置控制電流、電壓。電化學的偵測可藉由該 領域周知的方法而實施。例如可使用日本特開平10-1 46 1 83號公報所記載之方法。 -22- 201231672 <試驗套組> 另外本實施形態還提供一種使用在上述核酸的解析方 法之中的試驗套組。這樣的試驗套組只要具備下述物品即 可： 引子組，其係含有第1引子以及與前述第1引子成對使用的 第2引子 該第1引子含有對應於各個檢體而具有不同的序列之標籤 序列， 前述標籤序列設計成在前述各個檢體與模板核酸中之模板 序列雜交後發生環出；以及 含有用以進行增幅反應的基質、酵素、緩衝液等； DNA晶片，其係具備基體以及核酸探針， 該核酸探針固定化於前述基體上，並與含有前述標籤序列 之標的序列互補》 此時核酸探針，可爲與含有標籤序列以及來自檢體中 模板序列之序列之至少一部分之標的序列互補的核酸探針 〇 另外，試驗套組只要含有引子組、用以進行增幅反應 的基質、酵素、緩衝液等般的試藥與DN A晶片即可。 引子組只要含有第1引子以及與第1引子成對使用之第 2引子即可。第1引子含有對應於多個部分核酸序列而具有 彼此不同種類的序列之標籤序列。標籤序列設計成在第1 引子與模板核酸雜交後發生環出。 -23- 201231672 DNA晶片係具備基體與固定化於基體上的核酸探針。 核酸探針含有與標的序列互補的序列。標的序列包含標籤 序列以及進一步含有來自模板序列的序列的至少一部分。 爲了同時增幅及偵測多個檢體，所具備的引子及核酸 探針可具備複數個，並且對應於不同檢體所對應的多個部 分核酸序列。 另外，試驗套組所含的第1引子含有至少1次的解析所 需使用的種類及使用量的引子。在同時解析η個檢體的情 況則是使用η種第1引子。若將不同種類的第1引子針對序 列作比較，則標籤序列以外的部分可爲相等的序列。 試驗套組所含的第2引子含有至少1次的解析所需的使 用量的引子。另外，第1引子以及第2引子皆可含有標籤序 列。此情況下，第2引子只要含有至少1次的解析所需使用 的種類及使用量的引子即可。在同時解析η個檢體的情況 則是使用η種第2引子。若將不同種類的第2引子針對序列 作比較，則標籤序列以外的部分可爲相等的序列。 在試驗套組利用PCR法的情況，第1引子只要含有例如 至少可含有模板核酸之η個檢體所對應的標籤序列；以及 與該模板核酸的一部分序列互補的序列的η種順向引子或 逆向引子即可（此處η爲2以上的整數）。第2引子含有至 少1次的解析所需的使用量的引子。這樣的第2引子只要是 與第1引子成對使用的至少1種逆向引子或順向引子即可。 只要設定爲若第1引子爲順向引子則第2引子爲逆向引子’ 若第1引子爲逆向引子則第2引子爲順向引子即可。 -24- 201231672 本發明還提供利用lamp法的解析方法所使用的試驗 套組。由模板序列的5’末端側起設計成F3、F2、LF、F1區 域，由31末端側起設計成B3c、B2c、LBc、Blc區域的情況 ，則含有選自以下的1〜9所構成之群中至少1種引子組； 1. 在5'末端側具有與F1互補的序列，並在3’末端側具有與 F2相同的序列，且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序 列插入F2序列內而得之FIP引子（亦即第1引子）、及在5’ 末端側具有與Blc相同的序列，並在3’末端側具有與B2c互 補的序列之BIP引子（亦即第2引子）； 2. 在5·末端側具有與F1互補的序列，並在3·末端側具有與 F2相同的序列之FIP引子（亦即第2引子）、及在5'末端側 具有與Blc相同的序列，並在3'末端側具有與B2c互補的序 列，且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序列插入B 2 c 序列內而得之BIP引子（亦即第1引子）； 3. 在5 1末端側具有與F1互補的序列，並在3’末端側具有與 F2相同的序列’且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序 列插入F2序列內而得之FIP引子（亦即第1引子）、及在5’ 末端側具有與B 1 c相同的序列，並在3 ’末端側具有與B 2 c互 補的序列，且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序列插 入B2c序列內而得之BIP引子（亦即第2引子）； 4. 在51末端側具有與F1互補的序列，並在末端側具有與 F 2相同的序列’且對應於多個檢體而將彼此不同的標簾序 列插入F2序列內而得之FIP引子（亦即第丨引子）、在5 |末 端側具有與B 1 c相同的序列’並在3 ·末端側具有與b 2 c互補 -25- 201231672 的序列之BIP引子（亦即第2引子）、具有與F3區域相同的 序列之F3引子（第3引子）、及具有與B3c區域互補的序列 之B3引子（第4引子）； 5.在Y末端側具有與F1互補的序列，並在3,末端側具有與 F2相同的序列之FIP引子（亦即第2引子）、在5,末端側具 有與B 1 c相同的序列’並在3 ’末端側具有與b2c互補的序列 ’且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序列插入B2c序 列內而得之BIP引子（亦即第1引子）、具有與以區域相同 的序列之F3引子（亦即第3引子）、及具有與B3c區域互補 的序列之B3引子（亦即第4引子）； 6 ·在5 '末端側具有與F 1互補的序列，並在3 ’末端側具有與 F2相同的序列’且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序 列插入F2序列內而得之fip引子（亦即第1引子）、在5’末 端側具有與Blc相同的序列，並在3’末端側具有與B2c互補 的序列’且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序列插入 B2c序列內而得之BIP引子（亦即第2引子）具有與F3區域 相同的序列之F3引子（亦即第3引子）、及具有與B3c區域 互補的序列之B 3引子（亦即第4引子）； 7 ·在5 '末端側具有與F 1互補的序列，並在3 '末端側具有與 F2相同的序列，且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序 列插入F2序列內而得之fip引子（亦即第！引子）、在5’末 端側具有與Blc相同的序列，並在3·末端側具有與B2c互補 的序列之BIP引子（亦即第2引子）、具有與F3區域相同序 列之F3引子（亦即第3引子）、具有與B3c區域互補的序列 -26- 201231672 之B3引子（亦即第4引子）、具有與LF區域互補的序列之 LFc引子（亦即第5之引子）、及/或具有與LBc區域相同的 序列之LBc引子（亦即第6引子）； 8. 在5'末端側具有與fi互補的序列，並在3'末端側具有與 F2相同的序列之FIP引子（亦即第2引子）、在5’末端側具 有與Blc相同的序列，並在3'末端側具有與B2c互補的序列 ’且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序列插入B2c序 列內而得之BIP引子（亦即第1引子）、具有與F3區域相同 的序列之F3引子（亦即第3引子）、具有與B3c區域互補的 序列之B3引子（亦即第4引子）、具有與LF區域互補的序 列之LFc引子（亦即第5之引子）、及/或具有與LBc區域相 同的序列之LBc引子（亦即第6引子）； 9. 在5'末端側具有與fi互補的序列，並在3’末端側具有與 F2相同的序列，且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序 列插入F2序列內而得之FIP引子（亦即第1引子）、在5,末 端側具有與B lc相同的序列，並在3’末端側具有與B2c互補 的序列，且對應於多個檢體而將彼此不同的標籤序列插入 B2c序列內而得之Bip引子（亦即第2引子）、具有與以區 域相同的序列之F3引子（亦即第3引子）、具有與B3c區域 互補的序列之B3引子（亦即第4引子）、具有與LF區域互 補的序列之LFc引子（亦即第5引子）、及/或具有與LBcg 域相同的序列之LBc引子（亦即第6引子）。 甚至該試驗套組還可含有用以進行增幅反應的酵素及 /或容器、洗淨液、緩衝液、用以調製緩衝液的鹽類等。 -27- 201231672 另外還可在核酸探針與基體並未一體化的狀態含有DNA晶 片。 藉由這樣的試驗套組可較簡便地進行核酸的解析。 <瘟熱病毒與小病毒> 採用偵測該多個檢體所用的偵測方法，即可同時偵測 癍熱病毒與小病毒。將選擇作爲偵測瘟熱病毒所用的模板 核酸揭示於表1，關於偵測小病毒的則揭示於表2。 -28- 201231672

表1.瘟熱病毒模板序列 ATGGCTAGCCTTCTTAAGAGCCTCACATTGTTCAAGAGGACTCGGGACCAACCCCCAC TTGCCTCGGGCTCCG6AGGAGCAATAAGAGGGATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAAT CCCGGGTGATTCAAGCATTGTTACAAGATCTGGACTATTGGATAGACTTGTTAGATTG GTCGGTGATCCGGAAATCAACGGACCTAAATTAACTGGGATTTTAATCAGTATCCTCT CCTTGTTCGTGGAATCCCCTGGACAGTTGATCCAGAGGATCATAGACGACCCTGATGT AAGCATCAAGTTAGTAGAGGTAATCCCAAGCATCAACTCTGTTTGCGGTCTTACATTT GCATCCAGAGGAGCAAGTTTGGATTCTGAGGCAGATGAGTTCTTCAAAATTGTAGAC6 AAGGGTCGAAAGCTCAAGGACAATTAGGCTGGTTGGAGAATAAGGATATTGTAGACAT AGAA6TTGATGATGCTGAGCAATTCAATATATTGCTAGCTTCCATCTTGGCCCAAATT TG6ATCCTGCTCGCTAAAGCAGTGACTGCTCCTGATACTGCAGCCGACTCGGAGATGA GAAGGTGGATTAAGTATACCCAACAGAGACGTGTGGTCGGGGAATTTAGAATGAACAA AATCTGGCTTGATATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACTTATCTTTGAGGCGATTC ATGGTGGCACTCATCTTGGATATCAAACGATCCCCAGGGAACAAGCCTAGAATTGCTG AAATGATTTGTGATATAGATAACTACATTGTGGAAGCTGGATTAGCTAGTTTCATCTT AACTATCAAATTTGGCATTGAAACTATGTATCCGGCTCTTGG6TTGCATGAGTTTTCC GGAGAGTTAACAACTATTGAATCCCTTATGATGCTATATCAACAGATGGGTGAAACAG CACCGTACATGGTTATTCTGGAAAATTCTGTTCAGAACAAATTTAGTGCAGGATCCTA CCCATTGCTCTGGAGTTATGCTATGGGAGTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCCATGGGA GGGTTAAATTTCGGTAGATGCTAGTTTGATGC6GCCTATTTCA6GCTCGGGCAAGAAA TGGTTAGAAGATCTGCCGGCAAAGTAAGCTCTGCACTTGCCGCCGAGCTTGGCATCAC CAAGGAAGAGGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAGACAACGGA6GACC6GACG ATTCGCGCTGCTGGTCCCAAGCAATCTCAAATCACTTTTCTGCACTCAGAAAGATCCG AAGTCACTAATCAACAACCCCCAACCATCAACAAGAGGTCCGAAAACCAAGGAGGAGA CAAATACCCCATCCACTTCAGTGATGAACGGTTTCCAGGGTACACCCCAGATGTCAAC AGCTCCGAATGGAGTGAATCACGCTATGATACCCAAACTATTCAAGATGATGGAAACG ACGATGACCGGAAATCGATGGAAGCAATC6CCAAGATGAGAATGCTTACTAAGAT6CT CAGTCAACCTGGGACCAGTGAAGAGAGTTCTCCTGTCTATAATGATAGAGAGCTACTC AATTAA -29- 201231672

表2.小病毒模板序列 ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAG CAACAGGATCTGGGAACGGGTCTGGAGGCGGGGGTG6TGGTGGTTCTGGGGGTGTG6G GATTTCTACG6GTACTTTCAATAATCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAAC6GATGG GTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTT6TACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAA ATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACT6CAGTTAACGGAAACATGGC TTTAGATGATACTCATGCACAAATTGTAACACCTT6GTCATTGGTTGATGCAAATGCT TGGGGA6TTTGGTTTAATCCAGGAGATTG6CAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGT TGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGA ATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATG GTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGA CATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCA ATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATA TACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGAAAATTCTGTGCCAG TACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTT6CTACAGGAACATTTTTTTTTGATTGTAA ACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTT CTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTTCAAC AAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATG6GAAATACAAACTATATTACTGAAGCTAC TATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCT ACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGAT6 AAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAA AACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACA GGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAG AAGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATAC TAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTAT CCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATG TAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATT6TCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGC GCCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTA ACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCT CTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATTAATGTAGATAACCAATTTAACTA TGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGTATATGAAAAATCTCAACTAGCACCT AGAAAATTATATTAACATACTTACTATGTTTTTATGTTTATTAACATATCAACTAGCA CCTAG -30- 201231672 <引子的設計> 以來自瘟熱病毒與小病毒的各個模板核酸爲基礎，設 計出LAMP增幅用的引子。分別針對瘟熱病毒與小病毒決 定FI、F2、F3、Bl、B2及B3區域。將該等區域揭示於表 3-1、表3-2及表3-3。表中之序列編號1〜15爲用於瘟熱病 毒的的序列，序列編號16〜46爲用於小病毒的序列。^ F1 區域」、「F2區域」、「F3區域」、「B1區域」、「B2 區域」及「B3區域」之序列分別稱爲「F1序列」、「F2序 列」、「F3序列」、「B1序列」、「B2序列」及「B3序 列」。 表3 — 1

序列編號1 F 1區域 GTAATCCCAAGCATCAACTCTG 序列編號2 F 1區域 TGTTCAGAACAAATTTAGTGCAGG 序列編號3 F 2區域 CCTGGACAGTTGATCCAGAGG 序列編號4 F 2區域 TGATCCAGAGGATCATAGACGAC 序列編號5 F 2區域 GATGGGTGAAACAGCACCGTAC 序列編號6 F 3區域 GGATTTTAATCAGTATCCTCTCCTTG 序列編號7 F 3區域 GTGGAATCCCCTGGACAG 序列編號8 F 3區域 CTCTTGGGTTGCATGAGTTTTC 序列編號9 B 1區域 ACATTTGCATCCAGAGGAGCAAG 序列編號10 B 1區域 CTTGAAAACTCCATGGGAGG 序列編號11 B 2區域 GTAGACGAAGGGTCGAAAGCTC 序列編號12 B 2區域 GAGTTCTTCAAAATTGTAGACGAAG 序列編號13 B 2區域 CTCGGGCAAGAAATGGTTAGAAGA -31 - 201231672

表3 — 2 序列編號14 B 3區域 TGGTTGGAGAATAAGGATATTG 序列編號15 B 3區域 GATCTGCCGGCAAAGTAAGC 序列編號1.6 F 1區域 TCAATGGGATAGAACATTAATACC 序列編號1 7 F 1區域 TCTCATACTGGAACTAGTGGCAC 序列編號1 8 F 1區域 ACCATCTCATACTGGAACTAGTGGC 序列編號19 F 1區域 TGGTACAGATCCAGATGATGTTC 序列編號2 0 F 1區域 CCATGTAGACTAACACATACATGGC 序列編號2 1 F 1區域 GAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTG 序列編號2 2 F 1區域 AGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTG 序列編號2 3 F 2區域 TATCCATGGAAACCAACCATACC 序列編號24 F 2區域 CCATGGAAACCAACCATACCAAC 序列編號2 5 F 2區域 TGGAAACCAACCATACCAACTCC 序列編號2 6 F 2區域 ACCATCTCATACTGGAACTAGTGGC 序列編號2 7 F 2區域 GCCAGTACACTTACTAAGAACAGG 序列編號2 8 F 2區域 GGAAATCACAGCAAACTCAAGCAG -32- 201231672

表3-3 序列編號2 9 F 3區域 CCAGCAGCTATGAGATCTGAGAC 序列編號3 0 F 3區域 GAGATATTATTTTCAATGGGATAGAAC 序列編號31 F 3區域 CATGGTACAGATCCAGATGATGTTC 序列編號3 2 F 3區域 AAATTTTTGGAAAACGGATGGGT 序列編號3 3 B 1區域 CATGGTACAGATCCAGATGATGTTC 序列編號3 4 B 1區域 CTGTGCCAGTACACTTAGTAAGA 序列編號3 5 B 1區域 GGGCTTACCACCATTTCTAAA 序列編號3 6 B 1區域 CTGCAGTTAACGGAAACATGGCT 序列編號3 7 B 2區域 GTACACTTACTAAGAACAGGTGATGA 序列編號3 8 B 2區域 CACTTACTAAGAACAGGTGATGAAT 序列編號3 9 B 2區域 GATTGTAAACCATGTAGACTAACAC 序列編號4 0 B 2區域 AGGAGTTCAACAAGATAAAAGACG 序列編號4 1 B 2區域 GGTCATTGGTTGATGCAAATGC 序列編號4 2 B 2區域 GGTCATTGGTTGATGCAMTG 序列編號4 3 B 3區域 CCATGTAGACTAACACATACATGGC 序列編號4 4 B 3區域 CATGGCAAACAAATAGAGCATTG 序列編號4 5 B 3區域 GGTGTAACTCAAATGGGAAATACA 序列編號4 6 B 3區域 GGGAGTTTGGTTTAATCCAGG <用於瘟熱病毒的引子序列> 以用於瘟熱病毒的F〗、F2、F3、Bl、B2及B3區域爲 基礎，設計出用於特異性地LAMP增幅瘟熱病毒的引子。 將引子的範例揭示於表4-1及表4-2。 -33- 201231672

表4 _ 1 序列 編號 引子名稱 序列 47 Di ΠΡ-1-1 TTCTTGCCCGAGCCTGAA - GTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCC 48 )i ΠΡ-1-2Τ GGATCAAAGTAGGATCTACCGAA-GTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCC 49 Oi FIP-1-2C GGGTCAAAGTAGGATCTACCGAA-GTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCC 50 Oi ΠΡ-1-3 CCATTTCTTGCCCGAGCCTGAA-GTTGGTGTTGAACTTGAAAACTCC 51 )i B1P-1-1 GATCTGCCGGCAAAGTAAGCTC-AGCTGAGCCTdFTCCTTGGTG 52 Di BIP-1-2 GATCTGCCGGCAAAGTAAGCTC-ATGCTATTTCTGACACTAGCTGAGC 53 Di F3-1-1 TGCTCTGGAGTTATGCTATGG 54 Di B3 GCGAATCGTCCGGTCCTC 55 Di LPb-1 GCACTTGCCGCCGAGC 56 Di ΠΡ-2-1 CAGAGTTGATGCTTGGGATTAC-TCCCCTGGACAGTTGATCC 57 Di ΠΡ-2-2 CAGAGTTGATGCTTGGGATTAC-CCTGGACAGTTGATCCAGAGG 58 Di RP-2-3 CAGAGTTGATGCTTGGGATTAC-TGATCCAGAGGATCATAGACGAC 59 Di BIP-2-1 ACATTTGCATCCAGAGGAGCAAG-GAGCTTTCGACCCTTCGTCTAC 60 Di BIP-2-2 ACAimrGGATCCAGAGGAGCAAG-GTTCGTCTACAATnrTGAAGAAGTC 61 Di F3-2-1 GGATTTTAATCAGTATCCTCTCCTTG 62 Di F3-2-2 GTGGAATCCCCTGGACAG 63 Di B3-2-1 CAATATCCTTATTCTCCAACCA 64 〕i LPb-2-1 TGGATTCTGAGGCAGATGAGT 表4 —2 序列 編號 引子名稱 序列 65 Di ΠΡ-3-1 GAGCTTTCGACCCTTCGTCTAC-GGTCTTACATTTGCATCCAGAG 66 Di Β丨P-3-1 TGGTTGGAGAATAAGGATATTG-GGAAGCTAGCAATATATTGAATTGC 67 Di F3-3-1 GTAATCCCAAGCATCAACTCTG 68 Di B3-3-1 GCTTTAGCGAGCAGGATCC 69 Di LPb-3-1 CATAGAAGTTGATGATGCTGAG 70 Di ΠΡ-4-1 CCTGCACTAAATTTGTTCTGAACA-GATGGGTGAAACAGCACCGTAC 71 Di B丨P-4-1 CTTGAAAACTCCATGGGAGG-TCTTCTAACCATTTCTTGCCCGAG 72 Di F3-4-1 CTCTTGGGTTGCATGAGTTTTC 73 Di B3-4-1 GCTTACTTTGCCGGCAGATC 74 Di LPb-4-1T TTCGGTAGATCCTACTTTGATCC 75 Di LPb-4-1C TTCGGTAGATCCTACTTTGACCC 76 附標籤的 Di RP-2-3 CAGAGTTGATGCTTGGGATTAC-TGATCCAGAGGATCCTGATAGACGAC (在Di ΠΡ-2-3插入標籤CTG :底線部分） 在表4-2的最底下一欄揭示含有標籤序列的引子的範 例。此序列是在表4-1之序列編號58的引子名稱爲DiFIP-2-3從3'末端算起的第9個鹼基插入標籤序列CTG的例子。在 -34- 201231672 標籤序列附加底線。製作賦予標籤的引子的情況，只要同 樣地使所希望的位置含有所希望的標籤序列即可。 在將該等引子製成引子組而使用的情況，將合適的組 合的例子揭示於表5。 表5

引子紐扁號 ΠΡ BIP F3 B3 LPb 1 FIP-1-1 BIP-1-1 F3-1-1 B3 LPb-1 2 FIP-1-2T&C BIP-1-1 F3-1-1 B3 LPb-1 3 ΠΡ-1-3 BIP-1-1 F3-1-1 B3 LPb-1 4 ΠΡ-1-1 BIP-1-2 F3-1-1 B3 LPb-1 5 FIP-1-2T&C BIP-1-2 F3-1-1 B3 LPb-1 6 F1P-1-3 BIP-1-2 F3-1-1 B3 LPb-1 7 FIP-2-1 BIP-2-1 F3-2-1 B3-2-1 LPb-2-1 8 FIP-2-2 BIP-2-1 F3-2-1 B3-2-1 LPb-2-1 9 FIP-2-3 BIP-2-1 F3-2-2 B3-2-1 LPb-2-1 10 ΠΡ-2-1 BIP-2-2 F3-2-1 B3-2-1 LPb-2-1 11 ΠΡ-2-2 BIP-2-2 F3-2-1 B3-2-1 LPb-2-1 12 ΠΡ-2-3 BIP-2-2 F3-2-1 B3-2-1 LPb-2-1 13 FIP-3-1 BIP-3-1 F3-3-1 B3-3-1 LPb-3-1 14 ΠΡ-4-1 BIP-4-1 F3-4-1 B3-4-1 LPb-4-1T&C <用於小病毒的引子序列> 以用於小病毒的的F1區域、F2區域、F3區域、B1區域 、B2區域及B3區域爲基礎’設計出用於特異性地LAMP增 幅小病毒的引子，並且決定。將該等區域揭示於表6 -1、 表6-2及表6-3。 -35- 201231672 1—I丨 9« 序列 GGTATTAATGTTCTATCCCATTGA-TATCCATGGAAACCAACCATACC GCCACTAGTTCCAGTATGAGATGGT-TATCCATGGAAACCAACCATACC GTGCCACTAGTTCCAGTATGAGA-TATCCATGGAAACCAACCATACC GGTATTAATGTTCTATCCCATTGA-CCATGGAAACCAACCATACCAAC GCCACTAGTTCCAGTATGAGATGGT-CCATGGAAACCAACCATACCAAC GTGCCACTAGTTCCAGTATGAGA-CCATGGAAACCAACCATACCAAC GGTATTAATGTTCTATCCCATTGA-TGGAAACCAACCATACCAACTCC GCCACTAGTTCCAGTATGAGATGGT-TGGAAACCAACCATACCAACTCC GTGCCACTAGTTCCAGTATGAGA-TGGAAACCAACCATACCAACTCC CATGGTACAGATCCAGATGATGTTC-TCATCACCTGTTCTTAGTAAGTGTAC CATGGTACAGATCCAGATGATGTTC-ATTCATCACCTGTTCTTAGTAAGTG CCAGCAGCTATGAGATCTGAGAC GCCATGTATGTGTTAGTCTACATGG ACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTA 引子名稱 Pa ΠΡ-1-1 I_ Pa ΠΡ-1-2 Pa ΠΡ-1-3 Pa ΠΡ-1-4 Pa ΠΡ-1-5 Pa ΠΡ-1-6 I Pa ΠΡ-1-7 Pa FIP-1-8 Pa ΠΡ-1-9 Pa BIP-1-1 Pa BIP-1-2 Pa F3-1 Pa B3-1 Pa LPb-1 序列 編號 00 σ> § CM 00 s CO 00 s § -36- 201231672 csl- 9« 1 GAACATCATCTGGATCTGTACCA-ACCATCTCATACTGGAACTAGTGGC CTGTGCCAGTACACTTACTAAGA-GTGTTAGTCTACATGGTTTACAATC GAGATATTATTTTCAATGGGATAGAAC CAATGCTCTATTTGTTTGCCATG ACAGGTGATGAATTTGCTACAGG GCCATGTATGTGTTAGTCTACATGG-GCCAGTACACTTACTAAGAACAGG GGGCTTACCACCATTTCTAAA-CGTCTTTTATCTTGTTGAACTCCT CATGGTACAGATCCAGATGATGTTC TGTATTTCCCATTTGAGTTACACC CTGAAGGAGGTACTAACTTTGG CTGAAGGAGGTACTAACTTTGG 引子名稱 Pa FIP-2-1 Pa BIP-2-1 Pa F3-2-1 Pa B3-2-1 Pa Lpb-2-1 Pa F1P-3-1 Pa BIP-3-1 Pa F3-3-1 Pa B3-3-1 Pa Lpb~3_1G Pa Lpb-3-1C 序列 編號 s s ir> O) CO σ> 〇> 00 σ> σ> 〇> o o -37- 201231672 co-9ti 〇 〇 1- 1 〇 〇 〇 Ι- Ι Ο ο ㈢ ο Ι Ο ο i ο ί ί= < μ_ ο < ο l·- ο < ο ο ο ο ο 麵 ο ο 5 ο t ο ο ㈢ ο Ι Ο ο ύ ο a t ο < i ο £ α < < ο ο < ο ο § ο ο ο ί ο ο 1 ο < ο Ι Ο < Η- ο ο Ι Ο ί ο < ο Ε ϋ h- Ο < ο Ο ο Η < Ο 卜 $ ο 1- < ο ο $ ο ο 1- $ & ο < ο Ι Ο < h- ο ο ο % ο < ο Η t Ο Η Ο < Ο π ι ο ο < ο 5 δ t 1 ο < ο ο Η < Ο Ο < ο ο ο 1 l·- ο < ο ο 1~~ ο ο h- ο ο < ο 卜 $ 卜 < 卜 1 5 $ ο ο < ο ο o < o o s 0 H 〇 1 o o < o < 0 1- 1 o 0 1 o H H l·— 〇 < o H H 卜 f 〇 l·- o H- 〇 < o o 5 o o < o o $ 0 Ι Ο 1 o o < o < 0 1 o o ^!_ o < o h- < 5 t o h- 〇 < o o $ o 〇 〇 < 0 卜 1 o 0 1 o H < o o t o o o o o 1- < 0 1 o o o 5 h- o < o o 5 o o < o 卜 $ o o $ o !< o o < o o o o 5 0 1 o o o 5 t o < o o H o o 8 < S 0 1 8 1 1 o o o 卜 0 1 o 0 1 o a H 〇 o 5 〇 < ◦ $ 0 卜 1 O < o o l·- < o 雄 屮 nr> Λ έ £ CM Τ α C 十 Q. ffl CJJ 了 Q. Ξ ί Λ £ ή r— 丄 Q. c2 lO CL Cl c2 Cjsi in Q. C 左 0. Ξ CM J, ά Ξ £ l CO £ z CO CO 工 丄 3 ί£ 眾髌 tt躍 S τ~ S τ—> S g Ύ-· τ- g r-· g o >- r·— CM CO T™ T* 寸 T™ in •^― 在使用該等引子作爲引子組的情況’以例如表7所記 載的組合使用即可。 -38- 201231672 表7 小病毒引子組 引子組編號 FIP BIP F3 B3 LPb 1 FIP-1-1 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 2 FIP-1-2 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 3 FIP-1-3 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 4 FIP-1-4 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 5 FIP-1-5 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 6 FIP-1-6 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 7 FIP-1-7 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 8 FIP-1-8 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 9 FIP-1-9 BIP-1-1 F3-1 B3-1 LPb-1 10 FIP-1-1 BI P-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 11 FIP-1-2 BIP-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 12 FIP-1-3 BIP-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 13 FIP-1-4 BIP-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 14 FIP-1-5 BI P-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 15 FIP-1-6 BI P-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 16 FIP-1-7 BIP-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 17 FIP-1-8 BI P-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 18 FIP-1-9 BI P-1-2 F3-1 B3-1 LPb-1 19 FIP-2-1 BI P-2-1 F3-2-1 B3-2-1 LPb-2-1 20 FIP-3-1 BIP-3-1 F3-3-1 B3-3-1 Lpb-3-1G&C 21 FIP-4-1 BI P-4-1 F3-4-1 B3-4-1 LPb-4-1 22 FIP-4-2 BIP-4-1 F3-4-1 B3**4~1 LPb-4-1 23 FIP-4-1 BIP-4-2 F3-4-1 B3-4-1 LPb-4-1 24 FIP-4-2 BI P-4-2 F3-4-1 B3-4-1 LPb-4-1 25 FIP-5-1 BI P-5-1 F3-5-1 B3-5-1 LPb-5-1 26 FIP-5-2 BIP-5-1 F3-5-1 B3-5-1 LPb-5-1 27 FIP-5-1 BIP-5-2 F3-5-1 B3-5-1 LPb-5-1 28 FIP-5-2 BIP-5-2 F3-5-1 B3~5_1 LPb-5-1 -39- 201231672 <引子> 在用於瘟熱病毒的引子的範例，可爲含有序列編號47 〜75所表示的各個聚核苷酸的序列，或可爲由各個聚核苷 酸所構成之序列。另外還可爲含有序列編號47〜75之互補 序列所表示之各個聚核苷酸的序列、或可爲由各個聚核苷 酸所構成之序列。序列編號47〜75或其互補序列所表示之 各個聚核苷酸，其任一位置之1〜5個（宜爲1〜數個）核 苷酸亦可具有取代、缺損及/或插入。另外，序列編號47 〜75或其互補序列所表示之各個聚核苷酸的任一位置之1 〜5個（宜爲1〜數個）核苷酸亦可爲混合核苷酸或通用型 (universal)核苷酸。 在用於小病毒之引子的範例中，含有序列編號77〜 115所表示之各個聚核苷酸的序列、或由各個聚核苷酸所 構成之序列皆可。另外還可爲含有序列編號77〜115之互 補序列所表示之各個聚核苷酸的序列、或可由各個聚核苷 酸所構成之序列。序列編號77〜1 1 5或其互補序列所表示 之各個聚核苷酸，其任一位置的1〜5個（宜爲1〜數個） 核苷酸亦可具有取代 '缺損及/或插入。另外，序列編號 47〜75或其互補序列所表示之各個聚核苷酸的任一位置的 1〜5個（宜爲1〜數個）核苷酸亦可爲混合核苷酸或通用 型核苷酸。 此處，通用型核苷酸的例子，包括去氧肌核苷（ deoxyinosine ； dl)、或 Gren Research 公司的 3-硝基吡咯 (Nitropyrrole) 、5-硝基吲哚（Nitroindole)、去氧核呋 -40- 201231672 喃基（deoxyribofuranosyl ; dP )、去氧-5·-一甲氧基二苯 甲基-D-核呋喃基（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ; dK)，然而並不受該等所限定。 「混合鹼基」是指將希望設定爲混合鹼基之處的鹼基 設計成「腺嘌呤」、「胸腺嘧啶」、「胞嘧啶」及「鳥嘌 呤」所得的引子之中使用2個以上或全部混合使用的核酸 探針組。另外還可設計成取代爲可與複數種鹼基配對的修 飾鹼基。 另外在此處，引子的各序列間或其末端側亦可含有1 〜100個核苷酸，宜爲2〜30個左右的核苷酸序列（例如作 爲間隔部位所使用的序列）以作爲進一步使用的序列。然 而希望在含有標籤序列之引子的3’末端不含該等進一步使 用的序列。 <引子組> 將用於瘟熱病毒的引子組的範例揭示於表5。合適的 例子爲引子組8、9、1 1、12及14，較合適的例子爲引子組 9、12及14，更合適的範例爲引子組9。 將用於小病毒的引子組的範例揭示於表7。合適的例 子爲引子組 1、3、4、6、7、9、10、12、13、14、15、16 、19、20、25、26、27、28，較合適的例子爲引子組i、4 ' 6、7、9、10、13、15、16、19、25、26、27、28，Μ 合適的例子爲引子組19、25及26，更合適的例子爲引子組 19。此處，表5中的引子組2及5的FIP引子、引子組14的 -41 - 201231672 LPb引子表不混合驗基。 <探針> 探針的序列只要是來自增幅產物的序列即可，而該增 幅產物含有用以雜交並且進行偵測的標籤序列。將用以同 時偵測犬瘟熱病毒與犬小病毒的探針組的1個範例揭示於 表8，然而並不受其限定。 〔例1〕 1 ·犬瘟熱病毒、犬小病毒的引子篩選 設計出可特異性地增幅犬瘟熱病毒、犬小病毒之 LAMP引子，而進行LAMP增幅。關於所使用的引子，於表 4-1及表4-2揭示犬瘟熱病毒的LAMP引子序列、於表5揭示 引子組、於表6-1、表6-2及表6-3、表7揭示犬小病毒的 LAMP引子序列、引子組。 關於模板核酸則是採用分別以人工合成表1所示的犬 瘡熱病毒的NP(Nucleocapsid) gene序列、表2所示的犬小 病毒的VP2 gene序列所得到的質體，以濃度i 000copy/反應 液進行。 LAMP增幅係以表9所示的組成進行，在6 3 °C進行90分 鐘，以使核酸增幅。模板陰性控制組則是使用滅菌水代替 模板核酸。 增幅的上升時間是藉著使用Loopamp即時濁度測定裝 置偵測伴隨增幅反應所產生的焦磷酸與溶液中鎂的白濁而 -42 - 201231672 進行。實驗各進行2次。 圖13表示增幅犬瘟熱病毒的結果。濁度上升時間以引 子組9爲最早。其次濁度上升時間較早的爲引子組12及14 ，接下來爲引子組8及1 1。故在以下的實驗中使用引子組9 。從引子區域的變異少的觀點看來，認爲引子組9也較爲 適合。在陰性控制組中，任何引子組皆未觀察到濁度的上 升。 圖14表示增幅犬小病毒的結果。引子組19的濁度上升 時間爲最早。引子組25以及26的濁度上升時間與引子組19 非常接近。其次濁度上升時間較早的爲引子組1、4、6、7 、9、 10、 13、 15、 16' 27、 28，接下來爲引子組3、 12、 14、20。在以下的實驗中使用了引子組19。從引子區域變 異少的觀點看來，認爲引子組1 9也較爲適合。在陰性控制 組中，任何引子組皆未觀察到濁度的上升。 〔例2〕 標籤的插入位置、標籤鹼基的數目之檢討 使用例1所決定的犬瘟熱病毒的引子組9、犬小病毒的 引子組19，對於標籤的插入位置、標籤鹼基數目進行檢討 。如圖15所示般，係以FIP引子從3’末端側算起的第3個、 第6個、第9個、第I2個、第15個鹼基對於標籤的插入位置 進行檢討；並以3個、5個、7個、9個鹼基對於標籤的鹼基 數目進行檢討；關於標籤鹼基則是設計出2種。 各模板濃度爲l〇〇〇copy/反應液、lOOcopy/反應液、 -43- 201231672 1 Ocopy/反應液。增幅的上升時間與例1同樣地，係以 Loopamp即時濁度測定裝置作測定。 將犬瘡熱病毒的結果表示於圖16。在從3,末端算起第3 個鹼基的情況中，全部的標籤鹼基數目皆未觀察到增幅。 在從Y末端算起第6個鹼基的情況中，在標籤鹼基數目爲3 個、5個鹼基時觀察到增幅。在從3,末端算起第9個、第12 個、第15個鹼基的情況中，在標籤鹼基數目爲3個、5個、 7個鹼基時觀察到增幅。另一方面在數目爲9個鹼基時，增 幅上升時間慢、或並未觀察到增幅。 同樣地將犬小病毒的結果表示於圖17。在從3,末端算 起第3個鹼基的情況中，全部的標籤鹼基數目皆並未觀察 到增幅。在從3'末端算起第6個鹼基的情況中，在標籤鹼基 數目爲3個、5個鹼基時觀察到增幅。在從3,末端算起第9個 、第12個、第15個鹼基的情況中，在標籤鹼基數目爲3個 、5個、7個鹼基時觀察到增幅。另—方面在數目爲9個鹼 基時，增幅上升時間慢、或並未觀察到增幅。 以上的結果提示了標籤插入位置爲從3·末端算起第6個 鹼基的5’末端側，標籤鹼基數目以3〜7個鹼基較爲優異。 〔例3〕 1 2種導入了標籤的增幅產物之晶片偵測 設計12種在F IP引子從3·末端側算起的第9個鹼基插入3 個鹼基的標籤所得到的引子，並且進行增幅。1 2種標籤是 採用：1 .GAC、2.CTG、3.GGA、4.CCT、5. AGG、6.TCC、 -44 - 201231672 7.ATC ' 8.TAG ' 9.ACA、10.TGT、ll.CAA、12.GTT，並 設計成彼此之間有2個鹼基以上序列相異。在此處，標籤 序列前的數字是爲了方便而附上的標籤辨識編號。 將偵測各個標籤的探針固定化於基體上，針對1 2種增 幅產物進行晶片偵測。將所使用的探針序列揭示於表8。 在表8的序列之中，附加底線的部分爲標籤序列。探針序 列與導入至引子的標籤序列互爲相反鏈的序列。晶片偵測 係藉由電化學的手段進行。 表8

標籤名稱 序列 犬瘟熱病毒 Di-2.CTG CATCAGGGTCGTCTATCAGGAT Di-3.GGA CATCAGGGTCGTCTATTCCGAT Di-4.CCT CATCAGGGTCGTCTATAGGGATC Di-14.CGC TCAGGGTCGTCTATGCGG DH9.GTGCA CATCAGGGTCGTCTATTGCACG 犬小病毒 Pa-2.CTG GGTGTGCCACTAGTCAGTCC Pa-3.GGA GGTGTGCCACTAGTTCCTCC Pa-4.CCT GGTGTGCCACTAGTAGGTCC Pa-6.TCC GGTGTGCCACTAGTGGATCC Pa-19.GTGCA GGTGTGCCACTAGTTGCACTCC 在圖1 8 A、圖1 8 B及圖1 8 C表示以晶片偵測瘟熱病毒的 結果。導入了 1.GAC的產物在6.TCC偵測探針觀察到非特 異的訊號。導入了 2. CTG的產物在5. AGG偵測探針觀察到 非特異的訊號。 相反地，導入了 5.AGG的產物在2.CTG偵測探針觀察 -45- 201231672 到非特異的訊號。 對於 8.TAG、9.ACA、10.TGT、ll.CAA、12.GTT 作特 異性地偵測的各個探針的訊號弱。由此結果提示了 2 · CTG 、3.GGA、4.CCT、6.TCC、7.ATC的組合爲較佳。圖 19表 示使用該等5個標籤在1個晶片上進行偵測的結果。結果確 認了表現出良好的特性。 關於小病毒也觀察到同樣的傾向，在2.CTG、3.GGA 、4.CCT、6.TCC、7.ATC的組合之中，並未觀察到非特異 訊號，且特異訊號也強，而爲良好的結果。 〔例4〕 存在於陰性增幅產物中的殘存引子所造成的雜交作用的阻 礙 設計出在從3'末端側算起的第12個、第15個鹼基插入 實施例3所得到的良好的標籤的組合：2.CTG、3.GGA、 4.CCT、6.TCC、7.ATC的引子’並同樣地進行晶片偵測。 其結果如圖20所示般，在從3’末端側算起的第15個鹼基的 情況’單獨偵測各個陽性增幅產物可得到足夠的訊號。相 對於此，在一個陽性增幅產物中混合4個陰性增幅產物可 觀察到特異訊號減弱及非特異訊號增強。如圖2 1所示般， 認爲此特異訊號減弱的原因是存在於陰性增幅產物中而增 幅時並未使用的未反應殘存引子阻礙了 2.CTG增幅產物與 2.CTG偵測探針的雜交。非特異訊號增強同樣地，認爲原 因是未反應的殘存引子與各個探針發生反應。 -46- 201231672 關於從3’末端側算起的第12個、第9個鹼基，即使混合 了陰性增幅產物，訊號也沒有變化。此結果顯示，爲了迴 避殘存引子的不良影響’係以將標籤插入位置設計成從3’ 末端算起第12個鹼基的3’末端側爲佳。 若與例2之增幅特性的結果作對照，則認爲標籤的插 入位置以從3’末端算起的第6〜12個鹼基較爲良好。 〔例5〕 針對良好的標籤之組合追蹤檢討 在例3發現了良好的標籤組合，而進一步爲了增加可 同時偵測的檢體數目，設計了 13.GCG、14.CGC (與實施 例3所取的5個標籤彼此有2個以上相異鹼基的序列），進 一步設計了 8種標籤序列：15.CCTCT、16.CTCTG、 17.AGTGG 、 1 8.TGACC 、 19.GTGCA 、 20.GACGT 、 21.GCAAG、22.ACGTC (彼此有4個以上的鹼基相異）以 作爲5個鹼基的標籤，並且進行晶片偵測。該等標籤係與 例3同樣地導入至FIP引子從3’末端側算起的第9個鹼基。 結果如圖22A及圖22B所示般，顯示出偵測2.CTG增幅 產物時，在 16.CTCTG、17.AGTGG、21.GCAAG偵測探針 的非特異訊號強。另外還顯示出偵測6.TCC增幅產物時， 在18. TGACC偵測探針的非特異訊號強。其他，關於重新 檢討的 13.GCG、 14.CGC 、 15.CCTCT、 19.GTGCA、 20.GACGT、22.ACGTC，如圖22、圖23所示般，可知表現 出良好的結果》藉此証實了藉由使用2.CTG、3.GGA、 -47- 201231672 4.CCT、6.TCC、7.ATC、13.GCG、14.CGC > 15.CCTCT、 19.GTGCA、20.GACGT、22.ACGTC 的 11種標籤可同時偵 測1 1個檢體。 〔例6〕 犬瘟熱病毒及犬小病毒的多重增幅產物的偵測 從例3及5選出的1 1種標籤之中，以表現出特別良好特 性的 2.CTG、3.GGA、4.CCT、14.CGC、19.GTGCA作爲瘟 熱病毒偵測用。並且也針對小病毒同樣地檢討。其結果， 2.CTG、3.GGA、4.CCT、6.TCC、14.CGC、19.GTGCA 較 爲良好。 於是，分別在試管1的增幅試藥中混合瘟熱病毒的 2.CTG插入FIP引子、小病毒的2.CTG插入FIP引子；在試管 2之增幅試藥中混合瘟熱病毒的3 .GGA插入FIP引子、小病 毒的3.GGA插入FIP引子；在試管3之增幅試藥中混合瘟熱 病毒的4.CCT插入FIP引子、小病毒的4.CCT插入FIP引子·， 在試管4之增幅試藥中，瘟熱病毒的14.CGC插入FIP引子、 小病毒的6. TCC插入FIP引子；在試管5之增幅試藥中混合 瘟熱病毒的22.ACGTC插入FIP引子、小病毒的19.GTGCA 插入FIP引子。以由幼犬的糞便檢體所萃取的核酸作爲檢 體，在表1 〇所示組成的反應液中加入RT-LAMP。 將檢體1加入試管1、檢體2爲試管'2、檢體3爲試管3、 檢體4爲試管4、檢體5爲試管5，並且進行增幅。晶片偵測 的結果如圖24所示般，實檢體1爲瘟熱病毒陰性、小病毒 -48- 201231672 陽性；實檢體2、3爲瘟熱病毒陰性、小病毒陰性；實檢體 4爲瘟熱病毒陽性、小病毒陰性；實檢體5爲瘟熱病毒陽性 、小病毒陽性。這些結果與抗原抗體反應的結果一致。 〔增幅用反應液之組成〕 LAMP增幅可使用表9所示的組成。此組成爲例如爲了 增幅所合成出的質體等所使用的組成的1個範例。在針對 於病毒進行增幅的情況，使用例如表1 〇所示的組成即可。 表9 反應Buffer 7//L Tris-HCI pH8.0 40mM KCI 20mM MgS04 16mM (NH4)2S04 20mM Tween20 0.2% Beta i ne 1.6M dNTP 2.8mM FIP 引子(80//M) 0.5#L BIP 引子(80//M) 0. 5juL F3 引子(10//M) 0. 5//L B3 引子(10//M) 0.5"L LBc 引子（4〇a<M) 0.5juL Bst DNA Polymerase 1 Hi 質體DNA 5以 滅菌超純水 9.5//L Total 25 ul -49- 201231672 表1 ο 反應Buffer 7//L Tris-HCI pH8.0 40mM KCI 20mM MgS04 16mM (NH4)2S04 20mM Tween20 0.2% Beta i ne 1 6M dNTP 2. 8mM 瘋熱病毒插入了標籤的FIP引子(80"M) 0.5//L 瘟熱病毒BIP引子(80/yM) 0.5/iL 瘋熱病毒F3引子(10//M) 0.5"L 瘟熱病毒B3引子(10//M) 0.5//L 瘟熱病毒LBc引子（40//M) 0.5//L 小病毒插入了標籤的FIP引子(80//M) 0.5/iL 小病毒BIP引子(80//M) 0.5/yL 小病毒F3引子(彳0//M) 0.5/iL 小病毒B3弓丨子(10//M) 0.5"L 小病毒LBc引子（40/iM) 0.5/iL Bst DNA Polymerase 0. 98/iL Transcriptor RT 0. 02//L 檢體萃取液 5//L 滅菌超純水 7 μΐ Total 25 μΐ 【圖式簡單說明】 圖1表示導入了標籤序列的引子與核酸探針之圖。 圖2表示增幅步驟之模式圖。 -50- 201231672 圖3表示偵測步驟之圖。 圖4表示增幅步驟之模式圖。 圖5表示LAMP引子之圖。 圖6表示LAMP增幅之中間產物之圖。 圖7表示增幅步驟之模式圖。 圖8表示偵測步驟之圖。 圖9表示在LAMP法中導入了標籤序列的引子與核酸探 針之圖。 圖10表示增幅步驟之模式圖。 圖1 1係DNA晶片之平面圖。 圖12係DN A晶片之平面圖。 圖13表示引子的篩選結果之圖形。 圖14表示引子的篩選結果之圖形。 圖15表示關於標籤插入位置與標籤鹼基數目之槪要圖 〇 圖16表示標籤對於增幅的影響之圖形。 圖17表示標籤對於增幅的影響之圖形。 圖1 8 A表示標籤對於偵測的影響之圖形。 圖1 8B表示標籤對於偵測的影響之圖形。 •圖1 8C表示標籤對於偵測的影響之圖形。 圖1 9表示標籤對於偵測的影響之圖形。 圖2 0表示未反應之殘存引子之影響之圖形。 . 圖21表示關於未反應之殘存引子之影響之槪要圖。 圖22A表示標籤對於偵測的影響之圖形。 -51 - 201231672 圖22B表示標籤對於偵測的影響之圖形。 圖23表示標籤對於偵測的影響之圖形。 圖24表示同時偵測複數對象時的結果之圖形。 【主要元件符號說明】 1 :基體 2 :固定化區域 11 :基體 1 2 :電極 1 3 :貼片 -52- 201231672

SEQUENCE LISTING <110> Kabushiki Kaisha Toshiba <120> Method for detectingrimer and primer, probe and assay kit for distemper virus and parvovirus <130〉 11S1016 <160〉 127 <170> Patentln version 3.4

<210〉 1 <211〉 22 <212> DNA <213> canine distemper virus <220〉 <223〉 FI region 〈400〉 1 22 gtaatcccaa gcatcaactc tg

〈210〉 2 <211> 24 <212> DNA <213> canine distemper virus 201231672 <220〉 <223〉 FI region <400〉 2

tgttcagaac aaatttagtg cagg <210〉 3 <211> 21 <212〉 DNA <213> canine distemper virus <220〉 <223> F2 region <400> 3 cctggacagt tgatccagag g

<210> 4 <211> 23 〈212〉 DNA <213> canine distemper virus <220> <223> F2 region <400〉 4 -2- 201231672 tgatccagag gatcatagac gac 23 〈210〉 5 <211> 22 <212> DMA <213〉 canine distemper virus 〈220〉 <223〉 F2 region <400〉 5 gatgggtgaa acagcaccgt ac 22 〈210〉 6 <211> 26 <212> DNA <213〉 canine distemper virus <220〉 <223> F3 region <400> 6 ggattttaat cagtatcctc tccttg 26 <210〉 7 <211〉 18 -3- 201231672

<212> DNA <213> canine distemper virus <220> <223> F3 region 〈400〉 7 gtggaatccc ctggacag 18

<210〉 8 <211> 22 <212〉 DNA <213> canine distemper virus <220> <223> F3 region <400> 8 ctcttgggtt gcatgagttt tc 22

<210〉 9 〈211〉 23 <212> DNA <213> canine distemper virus <220〉 <223> B1 region -4 - 201231672 <400> 9 acatttgcat ccagaggagc aag 23 <210〉 10 <211> 20 <212〉 DNA <213> canine distemper virus <220〉 <223〉 B1 region <400> 10 cttgaaaact ccatgggagg 20 <210〉 11 <211> 22 <212〉 DNA <213> canine distemper virus <220〉 <223> B2 region <400> 11 gtagacgaag ggtcgaaagc tc 22 -5- 201231672 <210〉 12 <211〉 25 <212> DNA <213> canine distemper virus <220> <223〉 B2 region <400> 12 gagttcttca aaattgtaga cgaag 25 <210〉 13 <211> 24 <212> DNA <213> canine distemper virus <220> <223> B2 region <400〉 13 ctcgggcaag aaatggttag aaga 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> canine distemper virus -6- 201231672 <220> <223〉 B3 region <400> 14 tggttggaga ataaggatat tg 22 <210〉 15 <211〉 20 <212> DNA <213〉 canine distemper virus <220> <223> B3 region <400〉 15 gatctgccgg caaagtaagc 20 〈210〉 16 <211> 24 〈212〉 DNA 〈213〉 canine parvovirus . <220〉 <223〉 FI region <400〉 16 tcaatgggat agaacattaa tacc 24 -7- 201231672 <210> 17

<211〉 23 <212> DNA <213> canine parvovirus <220〉 〈223〉 FI region 〈400〉 17 tctcatactg gaactagtgg cac 23

<210〉 18 〈211〉 25 <212〉 DNA <213> canine parvovirus <220> <223〉 FI region <400〉 18 accatctcat actggaacta gtggc 25 <210〉 19

<211〉 23 <212> DNA -8- 201231672 <213> canine parvovirus <220〉 〈223〉 FI region 〈400〉 19 tggtacagat ccagatgatg ttc 23 <210〉 20 <211〉 25 <212〉 DNA <213> canine parvovirus <220> <223〉 FI region <400〉 20 ccatgtagac taacacatac atggc 25 <210> 21 <211〉 28 <212> DNA '· <213〉 canine parvovirus 〈220〉 〈223〉 FI region -9- 201231672 <400〉 21 gaaagtgaaa attatagaag agtggttg 〈210〉 22 <211〉 25 <212〉 DNA <213> canine parvovirus <220〉 <223〉 FI region <400〉 22 agtgaaaatt atagaagagt ggttg <210> 23 <211> 23 <212〉 DNA 〈213〉 canine parvovirus <220> <223> F2 region <400> 23 tatccatgga aaccaaccat acc <210〉 24 201231672 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉 canine parvovirus <220> <223> F2 region <400〉 24 ccatggaaac caaccatacc aac 23 <210〉 25 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉 canine parvovirus <220> <223> F2 region <400〉 25 tggaaaccaa ccataccaac tcc 23 <210〉 26 〈211〉 25 <212> DNA 〈213〉 canine parvovirus <220〉 -11 - 201231672 <223> F2 region <400> 26 accatctcat actggaacta gtggc 25 <210> 27 <211> 24 <212〉 DNA <213〉 canine parvovirus <220> <223〉 F2 region <400〉 27 gccagtacac ttactaagaa cagg 24 〈210〉 28 <211〉 24 <212> DNA 〈213〉 canine parvovirus <220〉 <223> F2 region <400> 28 ggaaatcaca gcaaactcaa gcag 24 -12- 201231672 <210〉 29 <211> 23 <212〉 DNA <213〉 canine parvovirus <220〉 <223> F3 region <400> 29 ccagcagcta tgagatctga gac 23 <210〉 30 〈211〉 27 <212〉 DNA 〈213〉 canine parvovirus <220〉 <223〉 F3 region 〈400〉 30 gagatattat tttcaatggg atagaac 27

<210〉 31 <211> 25 <212> DNA <213> canine parvovirus -13- 201231672 <220〉 〈223〉 F3 region <400〉 31 catggtacag atccagatga tgttc 25 <210〉 32 〈211〉 23 〈212〉 DNA <213〉 canine parvovirus 〈220〉 <223> F3 region <400〉 32 aaatttttgg aaaacggatg ggt 23 〈210〉 33 <211〉 25 <212〉 DNA <213> canine parvovirus <220> <223> B1 region 〈400〉 33 -14- 201231672 catggtacag atccagatga tgttc 〈210〉 34 <211> 23 〈212〉 DNA <213> canine parvovirus 〈220〉 <223> B1 region 〈400〉 34 ctgtgccagt acacttacta aga <210〉 35 <211〉 21 〈212〉 DNA 〈213〉 canine parvovirus <220〉 <223〉 B1 region 〈400〉 8 35 gggcttacca ccatttctaa a <210〉 36 201231672 <211> 23 〈212〉 DNA <213> canine parvovirus <220> <223〉 B1 region <400> 36 ctgcagttaa cggaaacatg get 23 <210> 37 <211〉 26 <212〉 DNA <213> canine parvovirus <220〉 <223〉 B2 region <400> 37 gtacacttac taagaacagg tgatga 26 <210> 38 〈211〉 25 〈212〉 DNA <213〉 canine parvovirus <220> -16- 201231672 <223〉 B2 region <400〉 38 cacttactaa gaacaggtga tgaat 25 <210> 39 <211> 25 <212〉 DNA <213〉 canine parvovirus <220〉 <223> B2 region <400> 39 gattgtaaac catgtagact aacac 25 <210> 40 <211〉 24 <212〉 DNA <213> canine parvovirus <220〉 <223> B2 region <400〉 40 aggagttcaa caagataaaa gacg 24 -17- 201231672 <210〉 41 〈211〉 22 <212〉 DNA <213〉 canine parvovirus 〈220〉 <223〉 B2 region <400〉 41 ggtcattggt tgatgcaaat gc 22 <210> 42 <211> 21 <212〉 DNA <213〉 canine parvovirus <220〉 <223> B2 region <400〉 42 ggtcattggt tgatgcaaat g 21

<210> 43 <211> 25 〈212〉 DNA <213> canine parvovirus -18- 201231672 <220> <223> B3 region <400〉 43 ccatgtagac taacacatac atggc 25 <210> 44 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉 canine parvovirus <220〉 <223> B3 region <400〉 44 catggcaaac aaatagagca ttg 23 <210〉 45 <211〉 24 <212〉 DNA <213> canine parvovirus <220> <223〉 B3 region <400〉 45 -19- 201231672 ggtgtaactc aaatgggaaa taca 〈210〉 46 <211> 21 〈212〉 DNA 〈213〉 canine parvovirus <220> 〈223〉 B3 region <400> 46 gggagtttgg tttaatccag g 〈210〉 47 〈211〉 42 <212> DNA 〈213〉 artificial <220> <223> Primer <400> 47 ttcttgcccg agcctgaagt tggtgttgaa cttgaaaact cc <210〉 48 <211> 47 201231672

<212> DNA <213> artificial <220〉 〈223〉 Primer 〈400〉 48 ggatcaaagt aggatctacc gaagttggtg ttgaacttga aaactcc 47 <210〉 49 <211> 47 <212〉 DNA <213> artificial <220〉 <223> Primer <400> 49 gggtcaaagt aggatctacc gaagttggtg ttgaacttga aaactcc 47 <210〉 50 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220〉 <223〉 Primer ' 21 - 201231672 <400> 50 ccatttcttg cccgagcctg aagttggtgt tgaacttgaa aactcc <210〉 51 〈211〉 43 〈212〉 DNA <213> artificial <220〉 <223〉 Primer <400〉 51 gatctgccgg caaagtaagc tcagctgagc ctcttccttg gtg 〈210〉 52 <211> 47 <212〉 DNA <213> artificial <220> <223> Primer 〈400〉 52 gatctgccgg caaagtaagc tcatgctatt tctgacacta gctgagc 201231672 <210> 53 • <211〉 21 <212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223〉 Primer <400> 53 tgctctggag ttatgctatg g 21 <210> 54 <211〉 18 〈212〉 DNA <213> artificial <220〉 <223〉 Primer <400> 54 gcgaatcgtc cggtcctc 18 <210> 55 <211〉 16 <212> DNA <213> artificial -23- 201231672 <220〉 〈223〉 Primer 〈400〉 55 gcacttgccg ccgagc <210〉 56 <211> 41 〈212〉 DM <213> artificial <220> <223> Primer <400> 56 cagagttgat gcttgggatt actcccctgg acagttgatc c <210〉 57 <211> 43 〈212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400> 57 cagagttgat gcttgggatt accctggaca gttgatccag agg 201231672 <210> 58 <211> 45 <212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 〈223〉 Primer <400〉 58 cagagttgat gcttgggatt actgatccag aggatcatag acgac 45 〈210〉 59 <211> 45 <212> DNA <213〉 artificial <220> 〈223〉 Primer <400〉 59 acatttgcat ccagaggagc aaggagcttt cgacccttcg tctac 45

<210〉 60 〈211〉 48 <212> DNA -25- 201231672 <213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400〉 60 acatttgcat ccagaggagc aagcttcgtc tacaattttg aagaactc 48 〈210〉 61 <211> 26 <212〉 DNA 〈213〉 artificial <220〉 <223> Primer <400〉 61 ggattttaat cagtatcctc tccttg 26 <210〉 62 <211> 18 <212〉 DNA 〈213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer -26- 201231672 <400> 62 gtggaatccc ctggacag <210〉 63 〈211〉 22 <212> DNA 〈213〉 artificial <220〉 <223> Primer <400> 63 caatatcctt attctccaac ca <210〉 64 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220〉 〈223〉 Primer <400〉 64 tggattctga ggcagatgag t 〈210〉 65 201231672 <211> 44 <212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400> 65 gagctttcga cccttcgtct acggtcttac atttgcatcc agag 44 〈210〉 66 <211〉 47 <212〉 DNA 〈213〉 artificial <220〉 〈223〉 Primer <400> 66 tggttggaga ataaggatat tgggaagcta gcaatatatt gaattgc 47 <210> 67 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 -28- 201231672 <223〉 Primer <400〉 67 gtaatcccaa gcatcaactc tg 22 <210> 68 <211〉 19 <212> DNA <213〉 artificial <220〉 <223> Primer <400〉 68 gctttagcga gcaggatcc 19 <210> 69 <211> 22 〈212〉 DNA <213> artificial 〈220〉 〈223〉 Primer <400> 69 catagaagtt gatgatgctg ag 22 -29- 201231672 <210〉 70 <211〉 46 <212〉 DNA <213〉 artificial 〈220〉 <223〉 Primer <400〉 70 cctgcactaa atttgttctg aacagatggg tgaaacagca ccgtac 46 <210〉 71 <211〉 44 <212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400〉 71 cttgaaaact ccatgggagg tcttctaacc atttcttgcc cgag 44 <210〉 72 <211〉 22 <212〉 DNA <213> artificial -30- 201231672 <220> <223> Primer <400〉 72 ctcttgggtt gcatgagttt tc 22 <210〉 73 <211> 20 <212> DM <213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400> 73 gcttactttg ccggcagatc 20 <210〉 74 <211> 23 <212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 〈223〉 Primer <400> 74 31 - 201231672 ttcggtagat cctactttga tcc <210> 75 <211> 23 <212> DNA 〈213〉 artificial <220> <223> Primer <400> 75 ttcggtagat cctactttga ccc <210> 76 <211〉 48 〈212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 〈223〉 Primer including tag <400> 76 cagagttgat gcttgggatt actgatccag aggatcctga tagacgac <210> 77 <211> 47 201231672

<212〉 DNA <213> artificial <220〉 <223> Primer <400> 77 ggtattaatg ttctatccca ttgatatcca tggaaaccaa ccatacc 47 <210〉 78 <211> 48 <212> DNA <213> artificial <220〉 <223〉 Primer <400> 78 gccactagtt ccagtatgag atggttatcc atggaaacca accatacc 48 <210〉 79 <211> 46 • <212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223> Primer 33- 201231672 <400〉 79 gtgccactag ttccagtatg agatatccat ggaaaccaac catacc <210〉 80 <211> 47 〈212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223〉 Primer <400〉 80 ggtattaatg ttctatccca ttgaccatgg aaaccaacca taccaac 〈210〉 81 <211> 48 〈212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223〉 Primer <400> 81 gccactagtt ccagtatgag atggtccatg gaaaccaacc ataccaac 201231672 αΐϋ> 82 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400〉 82 gtgccactag ttccagtatg agaccatgga aaccaaccat accaac 46 <210> 83 <211〉 47 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 83 ggtattaatg ttctatccca ttgatggaaa ccaaccatac caactcc 47 . <210〉 84 <211> 48 <212> DNA <213〉 artificial 35- 201231672 <220〉 <223> Primer <400> 84 gccactagtt ccagtatgag atggttggaa accaaccata ccaactcc <210〉 85 <211〉 46 〈212〉 DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 85 gtgccactag ttccagtatg agatggaaac caaccatacc aactcc <210〉 86 <211〉 51 <212〉 DNA 〈213〉 artificial <220〉 <223> Primer <400〉 86 catggtacag atccagatga tgttctcatc acctgttctt agtaagtgta c 201231672 <210〉 87 <211〉 50 <212> DNA <213〉 artificial <220> <223〉 Primer <400> 87 catggtacag atccagatga tgttcattca tcacctgttc ttagtaagtg <210> 88 <211〉 23 <212〉DNA <213> artificial <220〉 <223〉 Primer <400〉 88 ccagcagcta tgagatctga gac

<210〉 89 <211〉 25 <212〉 DNA 201231672 <213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400〉 89 gccatgtatg tgttagtcta catgg 25 〈210〉 90 <211> 24 <212> DNA <213〉 artificial <220> <223> Primer <400〉 90 actattgaaa attctgtgcc agta 24 <210> 91 <211> 48 <212〉 DNA 〈213〉 artificial <220> <223> Primer -38- 201231672 <400> 91 gaacatcatc tggatctgta ccaaccatct catactggaa ctagtggc 48 <210> 92 <211> 48 〈212〉 DNA <213〉 artificial 〈220〉 <223> Primer <400〉 92 ctgtgccagt acacttacta agagtgttag tctacatggt ttacaatc 48 〈210〉 93 〈211〉 27 <212〉 DNA <213> artificial <220> <223> Primer . <400〉 93 gagatattat tttcaatggg atagaac 27 <210> 94 •39- 201231672 <211> 23 <212〉 DNA <213> artificial <220> 〈223〉 Primer 〈400〉 94 caatgctcta tttgtttgcc atg 23 <210> 95 <211> 23 <212〉 DNA 〈213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400〉 95 acaggtgatg aatttgctac agg 23 <210〉 96 <211〉 49 <212> DNA 〈213〉 artificial <220> -40- 201231672 ^ζζό? Primer <400〉 96 gccatgtatg tgttagtcta catgggccag tacacttact aagaacagg 49 <210〉 97 <211〉 45 <212> DNA <213〉 artificial 〈220〉 <223> Primer <400〉 97 gggcttacca ccatttctaa acgtctttta tcttgttgaa ctcct 45 <210> 98 <211> 25 <212> DNA <213〉 artificial <220> . <223> Primer <400〉 98 catggtacag atccagatga tgttc 25 -41 - 201231672 <210〉 99 <211〉 24 <212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223〉 Primer <400〉 99 tgtatttccc atttgagtta cacc <210〉 100 〈211〉 22 <212〉 DNA <213〉 artificial 〈220〉 <223〉 Primer <400〉 100 ctgaaggagg tactaacttt gg <210> 101 〈211〉 22 <212〉 DNA <213〉 artificial 201231672 <220> <223> Primer <400> 101 ctgaaggagc tactaacttt gg 22 ' <210〉 102 <211> 47 <212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223> Primer <400> 102 gcaactcact catagtatta acaatggtca ttggttgatg caaatgc 47 <210> 103 <211〉 49 <212> DNA <213> artificial <220〉 <223> Primer <400> 103 43- 201231672 cactcatagt attaacaatt agttgccggt cattggttga tgcaaatgc <210〉 104 <211> 47 <212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223> Primer <400> 104 gactgtttca gaatctgcta ctcagaatgc aaccatcaat gatgcag <210> 105 <211〉 47 <212〉 DNA 〈213〉 artificial <220> <223> Primer <400> 105 gactgtttca gaatctgcta ctcagctaat gcaaccatca atgatgc <210〉 106 <211〉 22 201231672

<.zlz> DNA <213〉 artificial <220〉 <223> Primer <400> 106 catgcacaaa ttgtaacacc tt 22 <210> 107 〈211〉 22 <212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223〉 Primer <400> 107 gctgctggag taaatggcat ag 22 <210> 108 <211〉 26 . <212〉 DNA <213> artificial 〈220〉 <223〉 Primer -45- 201231672 <400> 108 ccaccaacta aagtttataa taatga <210〉 109 <211〉 52 <212〉 DNA <213> artificial <220〉 <223> Primer <400> 109 caaccactct tctataattt tcactttcgg aaatcacagc aaactcaagc ag <210〉 110 <211> 49 <212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223> Primer <400〉 110 caaccactct tctataattt tcactggaaa tcacagcaaa ctcaagcag 201231672 111 <211〉 45 <212〉 DNA <213> artificial <220> <223〉 Primer <400> 111 ctgcagttaa cggaaacatg gctgcatttg catcaaccaa tgacc 45 <210〉 112 〈211〉 44 <212> DNA <213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400〉 112 ctgcagttaa cggaaacatg gctcatttgc atcaaccaat gacc 44 <210〉 113 <211〉 23 <212〉 DNA <213> artificial -47- 201231672 <220> <223〉 Primer <400> 113 aaatttttgg aaaacggatg ggt <210〉 114 <211> 21 <212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 <223〉 Primer <400> 114 cctggattaa accaaactcc c <210> 115 <211> 21 〈212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 〈223〉 Primer <400> 115 catgcacaaa ttgtaacacc t 21 -48- 201231672 <210〉 116 <211〉 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223〉 Probe <400〉 116 catcagggtc gtctatcagg at 22 <210〉 117 <211〉 22 <212〉 DNA <213> artificial <220〉 <223〉 Probe 〈400〉 117 catcagggtc gtctattccg at 22

<210> 118 <211> 23 <212〉 DNA -49- 201231672 <213〉 artificial <220〉 <223〉 Probe <400〉 118 catcagggtc gtctataggg ate <210> 119 <211〉 18 <212> DNA <213〉 artificial <220〉 〈223〉 Probe <400〉 119 tcagggtcgt etatgegg 〈210〉 120 <211〉 22 <212> DNA <213〉 artificial <220> 〈223〉 Probe -50- 201231672 、彻，120 catcagggtc gtctattgca eg 22 <210〉 121 <211〉 20 <212〉 DNA <213> artificial <220> <223〉 Probe <400> 121 ggtgtgccac tagtcagtcc 20 <210> 122 〈211〉 20 〈212〉 DNA <213〉 artificial <220> <223〉 Probe <400〉 122 ggtgtgccac tagttcctcc 20 <210〉 123 -51 · 201231672 <211> 20 <212> DNA <213〉 artificial <220> <223〉 Probe <400> 123 ggtgtgccac tagtaggtcc <210〉 124 <211> 20 <212> DNA <213〉 artificial <220〉 <223〉 Probe <400> 124 ggtgtgccac tagtggatcc <210〉 125 <211> 22 <212〉 DNA <213〉 artificial -52- 〈220〉 201231672 ^Z26> Probe 〈400〉 125 ggtgtgccac tagttgcact cc 22

<210〉 126 <211〉 1572 <212〉 DNA <213> canine distemper virus <220> <223> Nucleocapsid gene <400〉 126 atggctagcc ttcttaagag cctcacattg ttcaagagga ctcgggacca acccccactt 60 gcctcgggct ccggaggagc aataagaggg ataaagcatg tcattatagt cctaatcccg 120 ggtgattcaa gcattgttac aagatctcga ctattggata gacttgttag attggtcggt 180 gatccggaaa tcaacggacc taaattaact gggattttaa tcagtatcct ctccttgttc 240 gtggaatccc ctggacagtt gatccagagg atcatagacg accctgatgt aagcatcaag 300 ttagtagagg taatcccaag catcaactct gtttgcggtc ttacatttgc atccagagga 360 gcaagtttgg attctgaggc agatgagttc ttcaaaattg tagacgaagg gtcgaaagct 420 -53- 201231672 caaggacaat taggctggtt ggagaataag gatattgtag acatagaagt tgatgatgct 480 gagcaattca atatattgct agcttccatc ttggcccaaa tttggatcct gctcgctaaa 540 gcagtgactg ctcctgatac tgcagccgac tcggagatga gaaggtggat taagtatacc 600 caacagagac gtgtggtcgg ggaatttaga atgaacaaaa tctggcttga tattgttaga 660 aacaggattg ctgaggactt atctttgagg cgattcatgg tggcactcat cttggatatc 720 aaacgatccc cagggaacaa gcctagaatt gctgaaatga tttgtgatat agataactac 780 attgtggaag ctggattagc tagtttcatc ttaactatca aatttggcat tgaaactatg 840 tatccggctc ttgggttgca tgagttttcc ggagagttaa caactattga atcccttatg 900 atgctatatc aacagatggg tgaaacagca ccgtacatgg ttattctgga aaattctgtt 960 cagaacaaat ttagtgcagg atcctaccca ttgctctgga gttatgctat gggagttggt 1020 gttgaacttg aaaactccat gggagggtta aatttcggta gatcctactt tgatccggcc 1080 tatttcaggc tcgggcaaga aatggttaga agatctgccg gcaaagtaag ctctgcactt 1140 gccgccgagc ttggcatcac caaggaagag gctcagctag tgtcagaaat agcatccaag 1200 acaacggagg accggacgat tcgcgctgct ggtcccaagc aatctcaaat cacttttctg 1260 cactcagaaa gatccgaagt cactaatcaa caacccccaa ccatcaacaa gaggtccgaa 1320 -54- 201231672 aaccaaggag gagacaaata ccccatccac ttcagtgatg aacggtttcc agggtacacc ccagatgtca acagctccga atggagtgaa tcacgctatg atacccaaac tattcaagat gatggaaacg acgatgaccg gaaatcgatg gaagcaatcg ccaagatgag aatgcttact aagatgctca gtcaacctgg gaccagtgaa gagagttctc ctgtctataa tgatagagag ctactcaatt aa 1380 1440 1500 1560 1572

<210> 127 <211> 1803 〈212〉 DNA <213> canine parvovirus <220〉 <223〉 VP2 gene 〈400〉 127 atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagca acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 60 120 180 240 -55- 201231672 agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300 actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360 tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420 tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480 ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540 aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600 aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660 tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720 gttcaatttt atactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780 tttgctacag gaacattttt ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840 acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900 actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960 aatacaaact atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020 ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080 cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140 -56- 201231672 ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt aaccttcctg taacagaaga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta aaagttgcgc ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatta atgtagataa ccaatttaac tatgtaccaa gtaatattgg aggtatgaaa attgtatatg aaaaatctca actagcacct agaaaattat attaacatac ttactatgtt tttatgttta ttaacatatc aactagcacc tag 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1803 -57-

Claims (1)

1. 201231672 七、申請專利範圍： 1. 一種方法，其係針對多個檢體所分別含有的檢體 核酸上的部分核酸序列進行解析之方法，其特徵爲具備： (a )準備多個引子組，其係分別含有多個第1引子及 與前述第1引子成對使用之第2引子，而該多個第1引子分 別含有對應於各個前述多個檢體而具有彼此不同的序列之 標籤序列， 此處設計成： 前述多個引子組所分別含有的前述第1引子具有彼此 不同的標籤序列， 前述標籤序列插入在第1引子由3'末端側算起第6〜12 個鹼基中的任一個部位，且標籤鹼基長爲3〜7個鹼基，在 前述第1引子與模板雜交後，前述標籤序列發生環出（ loop-out)； (b )在互相獨立的反應場所中，分別使用前述對應 的引子增幅前述多個檢體組，得到分別含有前述標籤序列 之增幅產物； (c )將（b )所得到的多個檢體所產生的各個增幅產 物混合； (d )使（c )所得到的前述增幅產物之混合物對於固 定化於基體上的多種核酸探針進行反應； 此處， 各個前述多種核酸探針含有標的序列或其互補序列， 該標的序列係由前述標籤序列與來自模板序列的序列所構 201231672 成，該模板序列包含前述部分核酸序列；及 (e)決定（d)所發生的雜交作用之有無及/或量， 由所得到的結果，針對前述多個檢體核酸上之前述部分核 酸序列進行解析。 2. —種方法，其係針對檢體中之1或多個檢體核酸上 所含有的多個部分核酸序列進行解析之方法，其特徵爲具 備： (a )準備多個引子組，其係分別含有第1引子及與前 述第1引子成對使用之第2引子，而該第1引子分別含有對 應於各個前述多個部分核酸序列，並具有彼此不同的序列 之標籤序列， 此處設計成： 前述多個引子組所分別含有的前述第1引子具有彼此 不同的標籤序列， 前述標籤序列插入在第1引子由3’末端側算起第6〜12 個鹼基中的任一個部位、且標籤鹼基長爲3〜7個鹼基，在 前述第1引子與模板雜交後，前述標籤序列發生環出； (b)在一個反應場所中，使用前述多個引子組多重 增幅前述檢體中之前述1或多個檢體核酸，得到分別含有 前述標籟序列之增幅產物； (c ).使（b )所得到的前述增幅產物對於固定化基體 上的多種核酸探針進行反應；及 此處，各個前述多種核酸探針含有標的序列或其互補 序列，該標的序列係由前述標籤序列與來自模板序列的序 -2- 201231672 列所構成，該模板序列含有選自前述多個部分核酸序列之 1種序列； (d)決定（c)之中所產生的雜交作用之有無及/或 量，由所得到的結果針對前述多個部分核酸序列進行解析 〇 3.如申請專利範圍第1或2項中任一項之方法，其中 此處，由前述模板序列的5’末端側起設定F3區域、F2 區域、LF區域、F1區域、由3'末端側起設定B3c區域、B2c 區域、LB c區域、B 1 c區域時，（a )之前述引子組係選自 以下的（1)〜（9)所構成之群中至少1者： (1 )在5'末端側具有與F1互補的序列，並在3'末端側 具有與F2相同的序列，在前述與F2相同的序列內，對應於 前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體而插入 彼此不同的標籤序列之FIP引子、及 在5’末端側具有與Blc相同的序列，並在3’末端側具有 與B2c互補的序列之BIP引子； (2 )在5'末端側具有與F1互補的序列，且在3'末端側 具有與F2相同的序列之FIP引子、及 在Y末端側具有與Blc相同的序列，且在3'末端側具有 與B2c互補的序列，在前述與B2c互補的序列內，對應於前 述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入彼此 不同的標籤序列之BIP引子； (3 )在5'末端側具有與F1互補的序列，並在3’末端側 具有與F2相同的序列，且在具有前述與F2相同的序列之序 -3- 201231672 列內，對應於前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各 個檢體插入彼此不同的標籤序列之FIP引子、及 在5’末端側具有與Blc相同的序列，並在3'末端側具有 與B2c互補的序列，且在前述與B2c互補的序列內，對應於 前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入彼 此不同的標籤序列之BIP引子； (4)在5’.末端側具有與F1互補的序列，並在3’末端側 具有與F2相同的序列，且在前述與F2相同的序列內，對應 於前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入 彼此不同的標籤序列之FIP引子、及 在5’末端側具有與Blc相同的序列，並在3’末端側具有 與B2c互補的序列之BIP引子、 具有與F3區域相同的序列之F3引子、及 具有與B3c區域互補的序列之B3引子； (5 )在5'末端側具有與F1互補的序列，並在3'末端側 具有與F2相同的序列之FIP引子、 在5'末端側具有與Blc相同的序列，並在3’末端側具有 與B2c互補的序列，且在前述與B2c互補的序列內，對應於 前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入彼 此不同的標籤序列之BIP引子、 具有與F3區域相同的序列之F3引子、及 具有與B3c區域互補的序列之B3引子； (6 )在5'末端側具有與F1互補的序列，並在3'末端側 具有與F2相同的序列，且在前述與F2相同的序列內，對應 201231672 於前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入 彼此不同的標籤序列之FIP引子、 在5'末端側具有與Blc相同的序列，並在3'末端側具有 與B2c互補的序列，且在前述與B2c互補的序列內，對應於 前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入彼 此不同的標籤序列之BIP引子、 具有與F3區域相同的序列之F3引子、及 具有與B3c區域互補的序列之B3引子； (7)在5’末端側具有與F1互補的序列，並在3’末端側 具有與F2相同的序列，且在前述與F2相同的序列內，對應 於前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入 彼此不同的標籤序列之FIP引子、 在5'末端側具有與Blc相同的序列，並在3'末端側具有 與B2c互補的序列之BIP引子、 具有與F3區域相同的序列之F3引子、及 具有與B3c區域互補的序列之B3引子、並有 具有與LF區域互補的序列之LFc引子、及/或與具有 LBc區域相同的序列之LBc引子； (8 )在5’'末端側具有與F1互補的序列’並在3’末端側 具有與F2相同的序列之FIP引子、 在5’末端側具有與B 1 c相同的序列’並在3 ’末端側具有 與B 2c互補的序列，且在前述與B2c互補的序列內’對應於 前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入彼 此不同的標籤序列之BIP引子、 201231672 具有與F3區域相同的序列之F3引子、及 具有與B3c區域互補的序列之B3引子、並有 具有與LF區域互補的序列之LFc引子、及/或與具有 LBc區域相同的序列之LBc引子； (9 )在5'末端側具有與F1互補的序列，並在3’末端側 具有與F2相同的序列，且在前述與F2相同的序列內，對應 於前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入 彼此不同的標籤序列之FIP引子、 在5’末端側具有與Blc相同的序列，並在3’末端側具有 與B2c互補的序列，且在前述與B2c互補的序列內，對應於 前述多個檢體或前述多個部分核酸序列的各個檢體插入彼 此不同的標籤序列之BIP引子、 具有與F3區域相同的序列之F3引子、及 具有與B3c區域互補的序列之B3引子、並有 具有與LF區域互補的序列之LFc引子、及/或與具有 LBc區域相同的序列之LBc引子； 並且，此處（b)之增幅係LAMP法或RT-LAMP法之方法。 4.如申請專利範圍第1〜3項中任一項之方法，其中 前述標籤序列係選自CTG、GGA、CCT、TCC、ATC、GCG 、CGC、CCTCT、GTGCA、GACGT、ACGTC及該等之互補 序列所構成之群中2個以上。 5 ·如申請專利範圍第3或4項之方法，其中前述部分 核酸序列或前述多個部分核酸序列的一個係來自犬瘟熱病 毒的序列，在前述引子組之中，FIP引子係 201231672 CAGAGTTGATGCTTGGGATTAC-TGATCCAGAGGATCATAGACGAC，BIP 引子 係 ACATTTGCATCCAGAGGAGCAAG-GAGCTTTCGACCCTTCGTCTAC，F 3 弓丨子 係 GTGGAATCCCCTGGACAG，B 3 引子係 CAATATCCTTATTCTCCAACCA ，LBc引子係 TGGATTCTGAGGCAGATGAGT。 6 .如申請專利範圍第5項之方法，其中前述標籤序列 係CTG、GGA、CCT、CGC及GTGCA，前述核酸探針之序 歹!J 係 CATCAGGGTCGTCTATCAGGAT、CATCAGGGTCGTCTATTCCGAT、 CATCAGGGTCGTCTATAGGGATC、TCAGGGTCGTCTATGCGG 及 CATCAGGGTCGTCTATTGCACG。 7.如申請專利範圍第3或4項之方法，其中前述部分 核酸序列或前述多個部分核酸序列的一個係來自犬小病毒 的序列，在前述引子組之中，FIP引子係 GAACATCATCTGGATCTGTACCA-ACCATCTCATACTGGAACTAGTGGC，BIP 引子係 CTGTGCCAGTACACTTACTAAGA-GTGTTAGTCTACATGGTTTACAATC ，F3 弓| 子係 GAGATATTATTTTCAATGGGATAGAAC，B3 弓[子係 CAATGCTCTATTTGTTTGCCATG ,及 LBc弓1 子係 ACAGGTGATGAATTTGCTACAGG。 8 .如申請專利範圍第7項之方法，其中前述標籤序列 係CTG、GGA、CCT ' TCC及GTGCA，前述核酸探針係 GGTGTGCCACTAGTCAGTCC、GGTGTGCCACTAGTTCCTCC、 GGTGTGCCACTAGTAGGTCC、GGTGTGCCACTAGTGGATCC、及 GGTGTGCCACTAGTTGCACTCC。 9.如申請專利範圍第2〜4項中任一項之方法，其中 前述多個部分核酸序列的一個係來自犬瘟熱病毒的序列， 201231672 在前述引子組之中，FIP TGATCCAGAGGATCATAGACGAC，BIP 弓| 子係 ACATTTGCATCCAGAGGAGCAAG-GAGCTTTCGACCCTTCGTCTAC - F3 引子 係 GTGGAATCCCCTGGACAG，B 3 弓丨子係 CAATATCCTTATTCTCCAACCA ，及 LBc引子係 TGGATTCTGAGGCAGATGAGT， 前述多個部分核酸序列的另外一個係來自犬小病毒的 序列，在前述引子組之中，FIP引子係 GAACATCATCTGGATCTGTACCA-ACCATCTCATACTGGAACTAGTGGC > B IP 引子係 CTGTGCCAGTACACTTACTAAGA-GTGTTAGTCTACATGGTTTACAATC ，F3 引子係 GAGATATTATTTTCAATGGGATAGAAC，B3 弓| 子係 CAATGCTCTATTTGTTTGCCATG，L B c 弓 f 子係 ACAGGTGATGAATTTGCTACAGG， 用於前述犬瘟熱病毒之引子組與用於前述犬小病毒之 引子組在相同的試管中混合，同時增幅來自前述兩種病毒 的核酸。 1 〇.—種引子組，其係用於特異性地增幅犬瘟熱病毒 之引子組，而前述引子組含有FIP引子、BIP引子、F3引子 及B3弓[子，該FIP引 TGATCCAGAGGATCATAGACGAC，該 BIP引子含有 ACATTTGCATCCAGAGGAGCAAG-GAGCTTTCGACCCTTCGTCTAC，該 F3 弓| 子含有GTGGAATCCCCTGGACAG，該B 3引子含有 CAATATCCTTATTCTCCAACCA。 11.如申請專利範圍第1 0項之引子組，其中進一步含 有LBc引子作爲環狀引子，該LBc引子含有 -8- 201231672 TGGATTCTGAGGCAGATGAGT ° 12. —種引子組，其係用於特異性地增幅犬小病毒之 引子組，其特徵爲：前述引子組含有FIP引子、BIP引子、 F3引子及B3引子，該FIP引子含有 GAACATCATCTGGATCTGTACCA-ACCATCTCATACTGGAACTAGTGGC，該 BIP 弓| 子含有 CTGTGCCAGTACACTTACTAAGA-GTGTTAGTCTACATGGTTTACAATC，該 F3 弓| 子含有 GAGATATTATTTTCAATGGGATAGAAC ,該 B 3 引子含有 CAATGCTCTATTTGTTTGCCATG。 13. 如申請專利範圍第12項之引子組，其中進一步含 有LBc引子作爲環狀引子，而該LBc引子含有 ACAGGTGATGAATTTGCTACAGG。 14. 一種試驗套組，其係含有： 第1引子組，其係用於特異性地增幅犬瘟熱之引子組 ，前述引子組含有FIP引子、BIP引子、F3引子及B3引子， 該 FIP 引子含有 CAGAGTTGATGCTTGGGATTAC-TGATCCAGAGGATCATAGACGAC，該 BIP引子含有 ACATTTGCATCCAGAGGAGCAAG-GAGCTTTCGACCCTTCGTCTAC，該 F3?[ 子含有GTGGAATCCCCTGGACAG，該B 3引子含有 CAATATCCTTATTCTCCAACCA > 在前述F IP引子由3'末端側算起第6〜12個鹼基含有選 自 CTG、GGA、CCT、TCC、ATC、GCG、CGC、CCTCT、 GTGCA、GACGT、ACGTC及該等之互補序列所構成之群 中之標籤序列：及 -9- 201231672 第2引子組，其係用於特異性地增幅犬小病毒之引子 組，前述引子組含有FIP引子、BIP引子、F3引子及B3引子 ，該 FIP 弓f 子含有 GAACATCATCTGGATCTGTACCA-ACCATCTCATACTGGAACTAGTGGC，該 BIP引子含有 CTGTGCCAGTACACTTACTAAGA-GTGTTAGTCTACATGGTTTACAATC ，該 F3 弓f 子含有 GAGATATTATTTTCAATGGGATAGAAC，該 B3 弓| 子含有 CAATGCTCTATTTGTTTGCCATG > 在前述FIP引子由3’末端側算起第6〜12個鹼基含有選 自 CTG、GGA、CCT、TCC、ATC、GCG、CGC、CCTCT、 GTGCA、GACGT ' ACGTC及該等之互補序列所構成之群 中之標籤序列； 而用於同時偵測犬疽熱與犬小病毒。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之試驗套組，其中前述第 1引子組進一步含有LBc引子作爲用於犬瘟熱之環狀引子， 而該LBc引子含有TGGATTCTGAGGCAGATGAGT，第2引子組進一 步含有LBc引子作爲用於犬小病毒之環狀引子，而該LBc 弓 I 子含有 ACAGGTGATGAATTTGCTACAGG。 -10-