TW201226571A - Production method of microbial exopolysaccharide - Google Patents

Description

201226571 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種微生物胞外多糖 (Ex_yS⑽haride，EPS )之生產方法，特別係指利用微 生物學的方法來製造的微生物胞外多糖。 【先前技術】 利用微生物生產的胞外多糖是一種生物性聚合物 (bi〇P〇lymers )，其因為具有良好的生物相容性 • (biocompatibility)和生物可降解性（bi〇degradability)， 因此若能將其具體的進行相關應帛，對於日益惡化的地球 環境將有許多助益，此外，因為這些產出生物聚合物的微 生物菌株其生存環境（乾燥、溫度、壓力、鹽度、酸度） 大多較為特殊，因此，在進行工業生產加工過程中，即使 遭遇加工上的極端條件（溫度、鹽度和酸鹼值），這些微生 物所產出的生物聚合物仍能維持其本身性能而不易受加工 過程所產生的極端條件所影響。 由於生物性聚合物有著多變的物理化學性質和流變性 等特性’因此胞外多糖已經是一種廣泛應用於在例如紡 織、洗務劑、粘合劑、微生物採油（微生物驅油）、廢水處 理、壤造、下游加工、美容、藥理學及食品添加劑等工業 領域的生物材料，又最近有研究指出，微生物所產生之EpS 具有清除超氧自由基的活性及對羥自由基的清除活性（Liu et al·，2009 )，可以預期胞外多糖所深具的潛在價值和發展 潛力對未來生活將會產生莫大的影響。 胞外多糖係在微生物醱酵後過程所產生的糖類聚合代 201226571 謝產物’而現今在進行微生物酸酵時都是利用嚴糖、葡萄 糖或是其他糖類物質為碳/氮源，且微生物胞外多糖的分泌 十分容易受到外界培養條件的影響，這些條件例如為碳 源、氮源、酸鹼值、通氣量、溫度和培養時間等，若是缺 乏適當的條件，將致使菌株無法發揮最佳的生長效率，更 進一步的將會影響這些代謝產物的產出量。 【發明内容】 為達上述目的’本發明人特致力於相關菌株利用生物 性廢材生產微生物胞外多糖效率之開發，以提升胞外多糖 之產量以及達到妥善運用生物資源廢棄物之目的，終於發 明出本發明之微生物胞外多糖生產方法。 本發明之目的在於提供一種微生物胞外多糖 (EX〇P〇lysaccharide，以下簡稱EPS )之生產方法，其係利 用調控微生物的培養條件來提升EPS的產量，本發明中係 使用寄存於新竹生物資源保存及研究中心編號為 BCRC91(M90之類芽抱桿菌屬Sp菌株（以下簡 稱BCRC 9104 90菌株）為主要生產微生物胞外多糖之微生物 菌株，S以烏賊軟骨粉（SqUid pen pOW(jer，以下簡稱spp ) 做為發酵時所需碳氮/源時’ BCRC91〇49〇菌株會比在一般 習用糖類之碳/氮源中，產生更高產量之胞外多糖，在一實 施例中，此spp的添加量為0.5%至15%，培養液中更添加 有培養時係以添加有〇1%磷酸鉀（K2Hp〇4)及〇 〇5%七 水硫酸鎂（MgS〇4 · me )，在一較佳實施例中此 BCRC910490菌株在以”它為培養溫度的條件下可以具有 較佳的胞外多糖產量，培養時間至少為四天，在取得培養 201226571 BCRC91 0490菌株的培養液後進行純化分離即可以獲得微 生物胞外多糖。 【實施方式】 為使審查委員得以更加了解本發明，特以下列實施例 進行說明。 實施例一：係說明碳氮源種類對於微生物生產微生物 胞外多糖的影響 本實把例中’係使用寄存於新竹生物資源保存及研究 籲中心編號為BCRC9UH90之類芽孢桿菌屬 菌株（以下簡稱BCRC910490菌株）探討以各種不同生物性 水產廢棄物做為碳/氮源對於菌株生產微生物胞外多糖的影 響，這些水產廢棄物包括有蝦頭粉（shrimp head p〇wdej_，以 下簡稱SHP)、烏賊軟骨粉（以下簡稱spp)等，培養時係以 添加有0.1%K2HP〇4及0.05%MgS〇4 · 7H2〇等無機鹽類的 100 mL液態培養基，於37〇c培養箱搖瓶培養1至5天。 _ β參考第1圖所示，其中標線i和2分別使用spp和 SHP為碳/氮為培養BCRC91〇49〇菌株後，微生物胞外多糖 的產量曲線圖，當使用spp烏賊軟骨粉做為碳/氮源進行菌 株培養時，胞外多糖的含量會逐漸增加，並在培養第4天 可以達到最高產量約每毫升32〇〇微克，而使用SHp蝦殼粉 時’並無法顯著提升胞外多糖的產量。 實施例二：細說明各種培養參數條件對於微生物生產 微生物胞外多醣的影響 (1)故/氮源濃度：係0.5、1 〇和丨5%的SPP為碳氮 源的條件下進行BCRC910490菌株培養，結果請 201226571 參見第2圖所示，標線3、4和分別代表SPP濃度 為0.5、1.0和1.5%時的總糖量變化區線，當添加 的SPP濃度為1.0%(標線4)時，所產生的胞外多糖 總量和1.5。/。SPP(標線5)的效果十分相近，因此在 進行BCRC910490菌株培養時，選用1 〇 0/〇 Spp即 可。 (2) 培養體積的影響：係在以i 〇%spp為碳/氮源的條 件下，比較BCRC910490菌株在不同體積培養液 下生產胞外多糖的能力，請參見第3圖所示，其 鲁 中標線6至9分別代表培養液體積分別為25、5〇、 1〇〇和200毫升，由圖中可以明顯看出，當培養液 體積較小時，胞外多糖可以達到較高的產量，顯 見在通氣條件下較為良好的狀態下，BCRC9 10490 菌株可能具有較佳的胞外多糖生產能力，其中， 又以50毫升培養液的培養下，可以使得胞外多糖 達到最佳的產量。 (3) 溫度的影響：以if/ospp當作碳/氮源，在5〇毫鲁 升培養液下，改變不同溫度，探討在固定培養溫 度 25 c (標線 10)、3〇t (標線 u)、37°c (標線 12) 衫響，凊參見第4圖所示，低溫下，胞外多糖的 產出效率並不理想，且也無助於提升胞外多糖產 量，但是以37芄進行培養在第4天時，胞外多糖 的含量可達最高產量約為35〇〇微克/毫升。 (4) 馱鹼值的影響：係在以1〇%Spp當作碳/氮源，在 5〇毫升培養液，以37。(：進行培養的條件下，不調 6 201226571 整培養液酸鹼值或調整培養基的酸驗值為pH2〜12 對BCRC910490菌株進行培養，請參見第5圖所 示，BCRC9 10490菌株在鹼性環境下的胞外多糖生 產效率略優於酸性環境，且在不調整培養液酸鹼 值的狀況下’胞外多糖產量可達將進4000微克/ 毫升。 實施例三：胞外多糖製備方法 回收：本實施例中係說明將BCRC910490菌株利用實 施例二所得的各項條件參數進行醱酵後所收取的上清液以 12 1°C加熱20分鐘使EPS完全溶於液體中後，加入兩倍體 積之甲醇進行脫色’並以離心（1 3420X发）方式回收沉澱物， 以少量去離子水回溶並進行冷凍乾燥，每1 〇〇〇毫升培養液 可以得到粗EPS約1 ·763 1公克

去蛋白：取500毫克粗EPS回溶於1〇〇毫升蒸館水中， 待完全溶解後’加入四倍體積的無水乙醇，並放置於4<>c隔 夜攪拌，將離心（1342〇xg，15分鐘）所得沉澱物以少量蒸 顧水回溶’加入1/5倍體積之Sevag試劑（CHCi3_Bu()h，v/v =5/1) ( Staub，1965 )並重複上述步驟數次以取得去蛋白之 EPS，在進行冷凍乾燥約可取得ι25毫克去蛋白Eps。 水解：取25毫克去蛋白EPS回溶於50毫升蒸掏水 並加入0.5 U/mL的α-澱粉酶（於2〇。〇、pH 6.9 )進行欠解 水解後對水進行透析，收集透析臈外之溶液進行 燥’可得凍乾粉末約7_75毫克。 冷凍乾 實施例四：BCRC910490菌株生產之胞外多糖組成 將實施例三中進行脫色、去蛋白及水解步驟後所得之 201226571 EPS 進行薄層層析法（thin layer chromatograph，TLC)，利 用構酸铜（phosphomolybdic acid )試劑（2.4% ( v//v )鱗 酸鉬，5%( v/v)硫酸，1·5%( v/v)磷酸）或寧海準（ninhydrin) 試劑進行呈色，使用寧海準染色時只發現葡萄糖（Rf= 0.45 ) 與麥芽糖（Rf值= 0.38)，而使用磷酸鉬（phosphomolybdic acid )染色，發現樣品呈色位置（Rf= 0.4 )與麥芽糖相近； 進一步取10毫克EPS溶於重水（D20)因此將EPS與麥芽 糖進一步進行核磁共振光譜分析（Nuclear Magnetic Resonance，NMR)，其氫譜和碳譜結果顯示利用 BCRC910490菌株生產之胞外多糖體具有麥芽糖之化學結 構。 綜上所述，本發明提供了 一種生物性胞外多糖的生產 方法’可以有效提升生物性胞外多糖的產量，同時此生產 方法的操作方式十分簡單，以利作為後續進行生物性胞外 多糖的應用及開發。 【圖式簡單說明】 第1圖係說明不同碳/氮源對本發明微生物胞外多糖生 產方法的影響。 第2圖係說明不同濃度碳/氮源對本發明微生物胞外多 糖生產方法的影響。 第3圖係說明不同培養體機對本發明微生物胞外多糖 生產方法的影響。 第4圖係說明不同溫度對本發明微生物胞外多糖生產 方法的影響。 第5圖係說明以不同培養液酸鹼值對本發明微生物胞 201226571 外多糖生產方法的影響。 【主要元件符號說明】 1以烏賊軟骨粉為碳/氮源的微生物胞外多糖生產曲線 2以蝦頭粉為碳/氮源的微生物胞外多糖生產曲線 3以0.5°/。烏賊軟骨粉為碳/氮源的微生物胞外多糖生產曲線 4以1.0¼烏賊軟骨粉為碳/氮源的微生物胞外多糖生產曲線 5以1.5%烏賊軟骨粉為碳/氮源的微生物胞外多糖生產曲線 6培養液體積為25毫升時的微生物胞外多糖生產曲線 7培養液體積為50毫升時的微生物胞外多糖生產曲線 8培養液體積為100毫升時的微生物胞外多糖生產曲線 9培養液體積為200毫升時的微生物胞外多糖生產曲線 10以25C進行培養時的微生物⑽外多糖生產曲線 11以30 C進仃培養時的微生物胞外多糖生產曲線 12以37 C進仃培養時的微生物胞外多糖生產曲線

Claims (1)

1. 201226571 七、申請專利範圍： 1·—種微生物胞外多糖的生產方法，其係以寄存於生物 資源保存及研究中心編號為BCRC91_之類芽抱桿菌屬 心"P，菌株為生產菌，並在〇.跑15%烏賊軟 月粉為唯-碳/氮源的培養液甲以37〇c的溫度進行培養至少 2天’取得培養液進行-純化分離以獲得_微生物胞外多 糖0 八離=請專利範圍第1項所述的生產方法，其中該純化 刀離包括有下列步驟： 回收：將該培養液以121t加熱2Q分鐘後，加 體積之f醇進行脫色，以離心 cl342〇xW方式回收沉澱物， 以v量去離子水回溶並進行冷凍乾燥； ::白··前述回收步驟得到的冷束乾燥粉末回溶於蒸 7 全溶解’加入四倍體積的無水乙醇，並放置於 4C的溫度下隔夜搜拌’再以離心（134〜Η分鐘）方 式取得沉殿物以少量蒸顧水回溶，加入 試劑反應數次，並進行冷②乾燥； &8 水解：將前述去蛋白步驟取得之冷康乾燥粉末回溶於 蒸餾水’並加入〇.5 u/mI^ @ 、 & 歲叔細進仃水解，水解後對 水進仃透析’收集透析膜外之溶液進行〜東乾燥 到該微生物胞外多糖之粉末。 于 3.如申請專利範圍第2項 液中更添加有。·帽鉀（匕二：方广其中該培養 、八2m^u4 )及 〇.〇5% 七 鎂（MgS04 · 7H2〇)。 酸 10