TW201224143A - Method for producing and purifying recombinant proteins in plants - Google Patents

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201224143 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係屬基因工程與生物技術領域。明確言之，本 發明係關於一種藉由製造基因轉殖植物以獲得經純化之異 源重組蛋白的方法，該基因轉殖植物可表現出透過蛋白酶 可辨識之序列而與澱粉粒結合蛋白融合之重組蛋白。此方 法允許藉由均質化、離心及使用蛋白酶進行處理之簡單步 驟純化蛋白。本發明亦關於所述方法中使用的載體（ vector)、宿主、細胞和植物。 【先前技術】 使用植物作爲生物工廠（分子農場）係關於利用植物 生產高附加價値的化合物，所生產的化合物可應用於不同 產業，例如醫藥產業、食品產業、化學工業，等等。其針 對植物進行基因修飾，目的在於產製所感興趣的化合物。 用於產製工業用之重組蛋白的系統目前是使用細菌、 酵母菌和經培養之哺乳動物細胞，但此等系統各自有本身 的限制條件。使用植物作爲生物工廠具有經濟（大規模生 產時成本較低）、產品安全性（避免於萃取和純化製程中 將病原引入動物組織中的風險）和技術上的優點，技術上 的優點意指在某些情況下植物可形成唯一能夠有效產製某 些人蛋白（例如，生長調節因子及細胞週期抑制因子）的 系統，此等人蛋白在基因轉殖動物體內或經培養之動物細 胞內表現時可能具有不良影響（參閱Giddings 2001 ; Ma -5- 201224143 等人於2003年發表之文獻；Twyman等人於2003年發表 之文獻）。另一方面，表現於種子內的蛋白可於室溫下持 續數年保持穩定而無損蛋白活性（參閱Giddings 2001; Ma等人於2003年發表之文獻）。目前治療用的蛋白係於 各種植物體內產製而得，該等植物包括菸草、穀類、油料 作物、果實、蔬菜、飼料作物和單細胞藻類（參閱 Twyman等人於2003年發表之文獻；Fischer等人於2004 年發表之文獻）。 表現於細菌內的重組蛋白係不需進行醣化作用（ glycosylation )以活化的蛋白，且該等重組蛋白通常堆積 成爲不溶性聚集體，而不溶性聚集體的純化和復性（ renaturation)的成本令人難以接受。當該等重組蛋白需 進行轉譯後修飾處理時，係使用其它表現系統，例如哺乳 動物細胞培養，使用此等表現系統獲得重組蛋白需要高起 始成本，且當需要提高生產規模時需要投入龐大的額外資 本。由於蛋白之合成與分泌機制和轉譯後修飾作用係真核 細胞獨有且允許產製和組裝複雜的蛋白，因此可藉著使用 植物作爲生物工廠解決上述問題。 「分子農場」工業的當前目標係獲得新產物及提高生 產力。後者主要取決於生產和純化製程（參閱Twyman等 人於2005年發表之文獻）。 重組蛋白的大部分生產成本並非來自生產階段，而是 來自產物之後續純化製程。例如在Ward與Swiatek所發 表之最新回顧文獻（Ward與Swiatek於2009年發表）中 201224143 指出’獲得純蛋白並非易事。即使在產製方法預 計和最佳化之表現系統中生產該等重組蛋白的情 用單一步驟之方法（通常需要一或多個附加步驟 相對少量的純度達9 9 %之蛋白。該等純化方法中 方法係始於快速且低分析性之步驟，以允許高度 之蛋白並去除污物，此等步驟係例如使用硫酸銨 沈澱且接著離心。對於相當普遍的重組蛋白，通 層分析法（chromatography)執行重組蛋白之精 例如親和性層析法。然而，這是一種於獲得經純 以前需經數個階段的昂貴方法。其他非色層分析 例如’電泳法）具有諸如分析用之實務用途，而 具，以便於評估蛋白之純度，但不允許分離超過 的量。 除了純化方法之成本及獲得所需純度之蛋白 步驟數目之外，另一附加問題則是蛋白的完整性 到之蛋白欲用於醫藥應用時此完整性問題特別重 藥應用中，該蛋白必需完整且亦需處於能發揮該 物活性的安定構形。例如當必需採取濃縮該等植 器官內的重組蛋白產物或當採用可將該等重組蛋 胞中利於純化重組蛋白之特定胞器內的表現技術 楚體會到此問題之重要性。爲此，通常採取設計 的「融合蛋白」，融合蛋白係由兩條或兩條以上 鍵結成單個蛋白的多胜肽鏈。每條多胜肽通常源 源，且無論如何，組成該雜合多胜肽或融合蛋白 先經過設 況下，利 )可純化 之大部分 回收所欲 進行微差 常利用色 製純化， 化之蛋白 的技術（ 非製備工 微克以上 所必要的 。當所得 要，於醫 蛋白之生 物之某些 白置於細 時，能清 該等所謂 之多胜肽 自不同來 的該等多 201224143 胜肽是無法在自然界發現彼等多胜肽天然形成單一個多胜 肽。爲製造融合蛋白，係將該等對應之編碼序列插入載體 中，以利用該等載體轉形微生物、植物或動物，且於該等 微生物、植物或動物體內如同一般蛋白般地合成該等融合 蛋白。隨後，自所培養的對應基因轉殖微生物或植物或動 物組織樣本中純化該等蛋白。 使融合蛋白產物集中在植物器官或植物細胞之特定胞 器中，並無法解決純化上的困難和需要採取數個通常頗爲 昂貴的步驟以獲得所需純化程度的問題。曾經使所欲的蛋 白與油體膜蛋白（oleo si η)融合，油體膜蛋白是一種形成 油體之一部分的膜蛋白，油體則是存在於某些專門積存油 脂之種子的細胞溶質中的胞器（參閱 Markley等人於 2 006年發表之文獻）。用於純化與油體膜蛋白接合之重 組蛋白的方法係憑藉著使組織均質化且隨後經單次的均質 離心使油體浮起後純化該基因轉殖植物之油體。然而，此 方法無法避免許多可溶性的蛋白污染該油體製備物，使得 後續難以純化與油體膜蛋白接合的重組蛋白。再者，油體 膜蛋白具有致過敏性的特殊問題，因此於純化製程期間必 需完全去除油體膜蛋白，特別是若欲純化之蛋白將施用於 人體時更是如此；此等問題皆使純化製程更加複雜。與油 體膜蛋白融合之蛋白的合成亦非一種相對高產率的方法， 因爲油體膜蛋白僅位於油體的表面，而非位於油體內，因 此相對於油體總重量而言，所獲得之融合蛋白的總量並不 高。 . Ο -8- 201224143 所用的其他類似技術係利用小的疏水性蛋白（疏水蛋 白，hydrophobins)與該重組蛋白融合，以幫助重組蛋白 之純化（參閱Joensuu等人於2010年發表之文獻）、於 細胞細胞質膜中製造含有整合序列的重組蛋白（參閱 Schillberg等人於2000年發表之文獻）或使該重組蛋白 分泌至胞外空間或質外體（參閱Borisjuk等人於1 999發 表之文獻）。然而，所有此等藉由使用重組油體膜蛋白而 純化重組蛋白的技術具有諸如前述般的類似問題，特別是 有關難以獲得期望高純度之蛋白的問題。 國際專利申請案WO 98/1 4601號描述一種融合蛋白 ’於該融合蛋白中，所欲的多胜肽係與該案申請人所稱「 澱粉中的封裝區域」接合（SER :澱粉封裝區，starch-encapsulating region) 。 此區 域允許 澱粉粒 與參與澱粉代 謝的酶結合，該等酶例如可溶性澱粉合成酶I、可溶性澱 粉合成酶II或可溶性澱粉合成酶III (SSI、SSII或 SSIII)、澱粉粒結合性澱粉合成酶（GBSS)、分枝酶I 、分枝酶Ila及分枝酶IIBb或葡萄糖澱粉酶。因此，當於 植物體內表現該融合蛋白時，該融合蛋白係封裝在澱粉粒 中。此申請案之主要提案係獲得經修飾的澱粉粒，該等經 修飾之澱粉粒可直接使用於例如於動物飼料中添加某些胺 基酸或配合食物一同提供所欲之藥物或荷爾蒙，所添加的 胺基酸、藥物或荷爾蒙將受到與彼等結合的澱粉本身所保 護而避免在胃中被分解。因此’在將該所欲之蛋白餵食給 動物之前’可免除該蛋白之純化步驟。該申請案亦建議可 -9- 201224143 能採用類似先前專利（例如，美國專利案US5202247號 )中所述之方法利用親和管柱純化該融合蛋白，該美國專 利案US5202247號係關於能夠與多醣基質結合的雜交蛋 白（hybrid protein)。國際專利申請案WO98/14601號亦 建議在該澱粉封裝區域和所欲的多胜肽之間可能存在剪切 序列，以便於使該澱粉封裝區域與該融合蛋白的其餘部分 分離且進行後續獨立的純化製程。除了利用蛋白分解作用 進行剪切之外，可利用諸如降低pH値或使用溴化氰等化 學方法執行剪切作用。當於該重組融合蛋白上添加聚精胺 酸尾部時，係提出另一種色層分析法-離子交換色層分析 法作爲純化該期望多胜肽的替代方法。 國際專利申請案第WO98/1 460 1號甚至提供必需能在 宿主體內表現該雜交多胜肽之DNA架構的結構圖，該結 構中之構成部分的順序係：啓動子-介入子（可隨意願）-該轉運胜肽之編碼區域-所欲之蛋白的編碼區域-SER-終 止子。經證明含有該轉運胜肽是正確的，使得該蛋白可轉 運至胞器（例如質粒體），以利於形成澱粉體。然而，將 如以下討論般，當純化與澱粉粒結合的所欲之多胜肽時， 此結構將帶來問題，即使分析國際專利申請案 WOOO/77 1 65號，彼專利亦顯現此等問題。 國際專利申請案WOOO/77165號細別關於在植物體內 表現融合蛋白，其中該融合蛋白具有澱粉結合域（SBD ) 。在該國專利申請案中，SBD可視爲澱粉封裝區域（參閱 國際專利申請案WO98/1 460 1號）及具有某些微生物所表 -10- 201224143 現之澱粉分解酶的澱粉結合域。然而，較佳表現方式係與 SBD接合的所欲之蛋白是一種能與澱粉交互作用的酶，而 獲得不僅簡單藉著存在該外源蛋白且藉由該外源蛋白之活 性而經修飾性質的澱粉。上述任一者皆不要求該與SBD 接合的蛋白是完整的，雖然較佳希望見到所選的片段可使 融合蛋白保留所欲之蛋白的生物活性。即使如此，鑒於使 用該方法商業化地產製蛋白、使所欲之蛋白與澱粉粒分離 或自該融合蛋白分離出所欲蛋白的可行性，建議利用剪切 位置的存在。爲了純化融合蛋白，係提到使用SBD以提 供利用該等SBD作爲親和性尾部而有助於透過澱粉管柱 藉由親和性色層分析法純化該等與此SBD接合之蛋白的 可能性，由於此方法適用於數種情況下，因此此方法似乎 是較佳的純化方法。因此，可認爲專利申請案 WOOO/77 1 65號中所建議的蛋白純化系統（同樣地， WO98/14601的蛋白純化系統）可包含：（a)於細菌、植 物細胞或動物細胞中產製與「澱粉結合域（SBD)」接合 的重組蛋白，（b)藉由打破/均質化/硏磨該等細胞/組織/ 器官進行萃取·，及（c)藉由於澱粉管柱（含有SBD的該 等重組蛋白將會專一性地與該澱粉管柱結合）中進行親和 性色層分析而純化該蛋白。可藉由添加內切蛋白酶’該內 切蛋白酶可專一性地辨識存在於該SBD與所欲之蛋白之 間的胺基酸序列以執行後續自澱粉中釋出該蛋白的步驟。 該重組蛋白的純化係仰賴使用於專利申請案w〇9 8/1 460 1 號申請之時即爲眾所週知的系統一藉由澱粉管柱進行親和 -11 - 201224143 性色層分析。 在細胞溶質中所合成之大多數的葉綠體蛋白係呈前驅 物形式。此等前驅物於胺基末端中含有剪切信號，該胺基 末端又稱轉運胜肽，該等轉運胜肽可引導該等前驅物前往 葉綠體。藉著葉綠體外膜轉運蛋白（Toe translocon，位 於葉綠體外膜中）和該葉綠體內膜轉運蛋白（Tic translocon，位於葉綠體內膜中）的結合運作，形成toc-tic系統而使該等前驅物蛋白通過葉綠體膜而改變位置（ 參閱Jarvis及Soil於2002年發表之文獻）。用於處理質 粒體蛋白的toe-tie系統並不完全精確。該Toe-tic系統係 基於辨識該等可進行剪切以於正確點處切開該轉運胜肽的 非預期性疏水域。因此，預測與轉運蛋白接合之蛋白在細 胞內的位置和處理位置的提案可能於進行（a)該蛋白在 細胞內的正確位置預測，及（b )該轉運胜肽的剪切/處理 位置預測時具有諸多問題（Bahaji等人於2011年發表之 文獻）。要找到可作爲質粒體轉運胜肽的序列非常困難， 該質粒體轉運胜肽允許在經移除之後使該蛋白完全地倂入 澱粉體中且使該期望之序列正確地插入該質粒體轉運胜肽 之胺基末端中。再者，沒有一種在與任何蛋白融合後可確 保使該蛋白完整轉運至質粒體的「模範」胺基酸序列。 因此，極可能發生的是，在經處理之後，該蛋白與存 在於該質粒體之膜中的該toe-tie系統雜合，在所含之關 注蛋白的胺基末端處具有該轉運胜肽之羧基末端的殘餘部 分或遺留部分。如前述申請案申請案WO98/1 460 1號和 Ο -12- 201224143 WOOO/77 1 65號中所指出般，若該澱粉結合域位於該融合 蛋白的羧基末端時，則此方法具有當該等申請案之方法用 於純化所欲之蛋白時在實際應用上的問題。如第1圖所示 ，當該融合蛋白藉由該澱粉結合域進入該質粒體時（在此 實例中，該澱粉結合域係澱粉封裝域（SER))，該轉運 胜肽極可能已經脫離，使得所欲之多胜肽（此實例中係 GFP爲例）具有該轉運胜肽的一部分胺基酸或所欲之多胜 肽缺少本身胺基末端的一些胺基酸，當該融合蛋白經純化 且進行最後剪切以使所欲之蛋白與含有澱粉結合域的部分 分開時，此缺陷仍將保留。若該蛋白欲用於醫藥領域中（ 如先前解釋般，醫療用胜狀的胺基酸序列不允許含有修飾 )，則此蛋白將不被接受且拒絕該蛋白用於醫藥方面。 上述問題並非申請案W09 8/14601號的唯一問題。該 申請案除了沒有在植物和細菌中產製融合蛋白的具體實施 例及所欲之蛋白的後續純化製程之外，在該案中用於使所 屬技術領域中熟悉該項技藝者承認該案之教示內容爲可靠 資訊，以使熟悉該項技藝者可根據該申請案之內容發展且 實施從植物體內表現出與澱粉結合之融合多胜肽中純化出 蛋白的方法的內容中，更具有其他段落令人對該蛋白的可 使用性置疑。該申請案W09 8/1460 1號提到在植物或細菌 體內產製的該雜合蛋白可能包含該技術領域中已知的多種 轉譯後修飾，例如醣化作用、醯化作用及該多胜肽活性所 需的其它修飾作用。由於醣化作用（特別是N-糖化作用 )發生在內質網系統/高基氏體系統中，故此陳述內容幾 -13- 201224143 乎與製造出欲自「基因轉殖澱粉」粒中釋出重組蛋白而純 化該重組蛋白之植物的提案/理念相左。該經醣化之蛋白 會分泌出來或留在分泌途徑中的膜內（細胞質膜、液胞膜 ，等等）或胞器內。在該申請案WO98/14601的時間點上 ，尙未知曉有經醣化之質粒體蛋白的存在。又，雖晚了許 多時間，但Villarejo等人於2005年、Nanjo等人於2006 年和Kitajima等人於2009年證明了在內質網（ER) /高 基氏體與質粒體隔室之間存在N-醣化蛋白分泌途徑，但 直到現在仍未能製造出在植物質粒體中積存經醣化的所欲 之蛋白的基因轉殖植物。再者，皆知細菌無法使蛋白醣化 ，故此陳述內容與在細菌中製造經醣化之蛋白的提案相矛 盾。 結論是，需要尋找用於純化蛋白（該等蛋白係形成融 合蛋白之一部分）的替代方法，該等替代方法係容易執行 、需要較少數目的步驟便可獲得高純度蛋白（特別是在該 等蛋白用於醫藥領域的情況下），且較佳比目前主要依賴 的色層分析法（特別是親和性層析法）更經濟。表現出可 與特定胞器結合的相應融合蛋白無法解決此問題，且在某 些情況下’例如該蛋白與油體膜蛋白結合的情況下，具有 諸如可能引起過敏的附加問題。將融合蛋白引導至澱粉粒 的相關方法亦沒有能夠取代親和管柱且實際並有效的純化 替代方案’再者，針對特定領域之應用中的某些問題仍懸 而未決，因此可設計出確保能獲得完整的所欲之蛋白，使 該蛋白能用於醫藥領域中》解決此等問題對於使「分子農 -14- 201224143 場」成爲一門贏利事業而言是很重要的。 本發明提出一種針對此等問題的解決方案。 【發明內容】 本發明利用簡單且低成本之系統解決大規模純化重組 蛋白的問題，該系統適於自植物中所表現的融合多胜肽純 化所欲之蛋白，且如必要，能獲得完整蛋白而盡可能地無 需損失任一末端處的附加片段或胺基酸。 所提出之解決方案包括以自基因轉殖植物中純化該等 融合蛋白爲基礎的方法，該等基因轉殖植物能經濟地表現 出與具有澱粉結合域之多胜肽片段融合的該重組蛋白（工 業用/商業用多胜肽）。該融合蛋白具有數個重要特性： a) 該具有澱粉結合域之多胜肽片段係藉由含有蛋白 酶剪切序列之片段而與所欲之蛋白接合，該蛋白酶剪接序 列係幫助分離該所欲之蛋白和該多胜肽片段； b ) 所欲之蛋白係位於該融合蛋白之羧端區域中， 該具有澱粉結合域之多胜肽片段係位於該胺端區域中；因 此該含有蛋白酶剪切序列之片段使該具有澱粉結合域之多 胜肽片段的羧端與所欲之多胜肽的胺端相連； c) 該具有澱粉結合域之多胜肽片段可包含下述任一 者： i ) 選自於已知可與澱粉粒結合之蛋白群組中的植 物蛋白，例如澱粉粒結合性灑粉合成酶（GBSS )(即， 不僅天然含有澱粉結合域且所合成之該蛋白前驅物形式中 -15- 201224143 亦包含可將該蛋白前驅物自細胞溶質引導至質粒體（ plastids)之典型轉運胜肽的蛋白）：或 ϋ ) 細菌澱粉酶之澱粉結合域，且於該澱粉結合 域前方具有可與澱粉粒結合的植物蛋白之轉運胜肽，該轉 運胜肽允許在細胞溶質中所合成的蛋白抵達質粒體，使該 蛋白於質粒體處與澱粉結合。 利用此方案，該純化方法係用基因轉殖植物經濟地表 現出經由蛋白酶可辨識之序列而與澱粉粒結合蛋白（例如 GBSS )融合的蛋白。因此，所欲之蛋白連同該融合蛋白 之其餘部分將牢附於澱粉粒上。高密度的澱粉粒允許於單 次組織均質化作用和離心之後輕易地洗清其餘的細胞成分 。使用蛋白酶進行後續處理允許釋出所欲之蛋白，而於重 新離心且去除蛋白酶之後可獲得純的所欲之蛋白。因此， 該新方法提出溶解該與不可溶結構結合的關注蛋白，可輕 易地與該培養基中之可溶性蛋白分離，由於該新方法係採 單次沈澱，因此該方法遠比至今仍使用的該等方法更有效 率。對照主要基於色層分析法之現今最常用的方法而言（ 特別是該些利用親和性層析法進行純化的方法），該方法 進一步允許降低成本。再者，當使用該基因轉殖植物或該 植物之萃取物開始進行純化製程時，藉著於該融合蛋白之 胺端區域中置入該澱粉結合域且於該澱粉結合域前方設置 轉運胜肽，即便所欲之多胜肽/蛋白係位於羧端區域內， 也能確保所欲之蛋白在轉移至質粒體的過程中不會經歷胺 基酸切除’使得所欲蛋白之胺基酸序列完整地形成該澱粉 -16- 201224143 粒結合性融合蛋白之一部分的機率較大。上述內容槪要圖 示於第2圖中，其中該澱粉結合域及該轉運胜肽係形成與 澱粉結合之該天然形式植物蛋白（GBSS )的一部分，因 此如第3圖所示，對應於該澱粉結合域係細菌澱粉酶之澱 粉結合域的具體實施例，在該具體實施例中，最初合成的 該融合蛋白係呈前驅物蛋白形式，該前驅物蛋白含有可將 該融合蛋白引導至質粒體且從而引導至澱粉粒的轉運胜肽 。於該等具體實施例之任一者中，慎選該含有蛋白酶辨識 位置之片段將最終允許獲得不僅完整且沒有額外胺基酸的 所欲之蛋白，此將使該蛋白能夠用於諸如醫藥品之用品中 〇 落於本發明方法之範圍內者，係包含該等先前步驟之 該等具體實施例，於該等具體實施例中獲得且培養能表現 含有所欲多胜肽之融合蛋白的基因轉殖植物。本發明亦關 於適用於執行本發明方法以獲得基因轉殖植物的載體、含 有所述載體之宿主微生物，及經該載體轉形之植物細胞和 由該植物細胞所獲得之基因轉殖植物。 因此，本發之第一方面係有關由基因轉殖植物或經培 養之基因轉殖細胞獲得經純化之重組蛋白的方法，該方法 包含下述步驟： a) 使帶有融合蛋白的該經培養之細胞或累積澱粉之 植物組織均質化，其中該融合蛋白包含： i ) 位於羧端區域中對應欲純化之該重組蛋白的多 胜肽； -17- 201224143 ii ) 位於該胺端區域中的澱粉結合域’ iii ) 含有蛋白酶剪切位置之連接片段，該連接片 段係位於該胺端區域與該羧端區域之間； b ) 離心且選出含有該澱粉粒蛋白的最濃稠部分； c) 利用能辨識該連接片段中所包含之該剪切位置的 該蛋白酶處理步驟b)所選出的該部分； d ) 離心且選擇該上清液； e ) 可隨意地純化該上清液所含之該重組蛋白達高等 級。 當執行附加的純化步驟時，可利用所屬技術領域中熟 悉該項技藝者已知的任何方法執行該等附加的純化步驟， 例如任何的大小分離技術、免疫吸附技術、離子交換技術 或螢光偵測技術。 如前文已述，本發明所屬範圍內的本發明方法之具體 實施例係包含獲得且培養基因轉殖植物之步驟的實施例。 因此，於一可行實施例中，本發明方法包含下述前置步驟 a ) i ) 藉由利用表現載體使該野生型植物轉形而獲 得基因轉殖植物，該表現載體包含植物表現啓動子，該植 物表現啓動子係與編碼序列操作性接合，該編碼序列自V 至3'方向包含引導從細胞溶質轉運至質粒體之轉運作用的 胜肽、澱粉結合域、蛋白酶剪切位置和與該欲純化之該重 組蛋白對應的多胜肽； a) ii) 於適合該先前步驟所獲得之該基因轉殖植物 Ο -18- 201224143 生長的條件下培養該基因轉殖植物。 如先前所討論般，該等序列中之澱粉結合 粉酶結合域的序列、及該等序列中之結合域屬 (該植物蛋白通常是天生能與澱粉結合的酶） 係本發明之可行實施例。於此第二種情況下， 蛋白包含所述植物蛋白的完整多胜肽序列，且 係於細胞溶質中合成出前驅物形式的融合蛋白 包含前述驅物形式之植物蛋白的完整胺基酸序 前驅物包含所述蛋白之天然轉運胜肽，因此該 編碼序列將不需要除所述蛋白本身特有之轉運 轉運胜肽。 於該澱粉結合域屬於細菌澱粉酶的情況下 域係選自已知的澱粉結合域（SBD )之任一者 ，例如可選自於由Janecek與Sevcik之論文第 的該等SBD (參閱Janecek與Sevcik於1999 獻）。於國際專利申請案WOOO/7 7165號之第 述的該等SBD (即，該等具有序列編號：3、戶 、序列編號：5和序列編號：6所示之序列的 選擇而爲最小序列。於該情況下，該融合蛋白 不需在該SBD編碼序列的V端包含轉運胜肽 〇 如以上述，本發明亦有關用於獲得基因轉 體（vector)及經該載體轉形的宿主，且本發 獲得植物轉形載體之中間載體和經該中間載體 域係細菌澱 於植物蛋白 的融合蛋白 較佳該融合 該融合蛋白 ，該前驅物 列，即，該 融合蛋白之 胜肽以外的 ，所述結合 ，舉例而言 1圖中得知 年發表之文 1圖中所描 F列編號：4 SBD )可經 之編碼序列 之編碼片段 殖植物的載 明有關允許 轉形之宿主 -19- 201224143 因此’本發明之一種體系是有關用於本發明方法中的 載體’該載體自5'至3'方向包含允許於植物體內表現的 啓動子且該啓動子與該融合蛋白之編碼序列操作性接合， 該融合蛋白自胺基至羧基方向包含細胞溶質-質粒體轉運 胜肽、澱粉結合域、含有蛋白酶剪切位置之連接片段及該 與欲遵循本發明方法進行純化之重組蛋白對應的多胜狀。 較佳該所述載體係質體（plasmid)。 同樣地，本發明之另一體系係一種經上述載體轉形的 生物。較佳，該生物係細菌性農桿菌。 又一體系是一種含有上述宿主生物的經轉形植物細胞 。同樣地，本發明之又一體系是由上述載體及/或經所述 生物轉形之細胞而獲得的基因轉殖植物、該植物之種子或 繁殖物質。 最後，由於該等中間質體將會是能夠實施本發明方法 以用於擴增且純化各種不同蛋白的質體，因此該等可獲得 轉形載體的該等中間質體亦爲本發明之一體系。明確而言 ，於本發明之實例中，藉由Gate way®技術而避免使用核 酸內切酶剪切和連接作用，改採於重組酶存在下進行連續 重組事件以取代核酸內切酶剪切和連接作用，重組酶辨識 成對的互補重組位置，該等互補重組位點係如Gateway® 技術手冊中所述者（Gateway® Technology protocol ’ http://www.invitrogen.com/site/us/in/home/Products-and-Services/Applications/Cloning/Gateway- -20- 201224143 C1 〇ni ng/Gate way C -Mi sc/Pr 〇 to cο 1 s · htm 1 #bp )。於本發明 方法中，係使用澱粉粒結合性澱粉合成酶（gbss)作爲 澱粉粒結合性蛋白之實例。爲獲得該轉形載體，係使用一 種中間載體，該中間載體允許藉由該Gateway®技術使所 欲之任何蛋白的編碼序列與GBSS支編碼序列融合。因此 ，本發明之附加體系描述一種經特殊設計以用於本發明方 法中的載體，該載體自V至3'方向包含啓動子、GBSS編 碼序列及夾在attRl序列和attR2序列之間的核苷酸序列 ，該等attRl序列和attR2序列允許在GBSS下游處選殖 任何夾在attLl序列和attL2序列之間的核苷酸序列。 本發明亦有關一種可供前述載體寄宿的宿主生物，特 別是大腸桿菌。 【實施方式】 如前所述，本發明提供一種大規模純化在基因轉殖植 物體內產製或在可表現欲純化之重組蛋白的基因轉殖植物 培養物中產製之重組蛋白的替代方法。 該純化蛋白的新方法係基於製造澱粉累積性植物或細 胞，該澱粉累積性植物或細胞可表現出透過連接子片段而 與用於和澱粉粒結合之蛋白（例如澱粉粒結合性澱粉合成 酶，GBSS )融合或具有細菌性酶之澱粉結合域的所欲之 蛋白，且該連接子片段含有可被內切蛋白酶（例如凝血酶 或腸激酶）專一辨識的序列。因此，所欲之蛋白可與澱粉 粒牢牢結合，高密度的澱粉粒允許在經過組織均質化、離 -21 - 201224143 心且利用內切蛋白酶進行剪切處理後溶出所欲之重組蛋白 的單次過程之後，輕易地自其餘的細胞成分中純化出該蛋 白。該方法示例於第4圖中。如圖所見，相較於常用於純 化重組蛋白（特別是融合蛋白）之色層分析法，特別是相 較於常用的親和性管柱而言，上述方法係一種簡單且更經 濟的方法。此外，所費時間係短於一天：在以下提供之實 例3的特定情況下，1 2小時便足以從丨〇公斤的馬鈴薯塊 莖中獲得1毫克（mg )經高度純化的GFP (例如，於此 實例中GFP係欲純化的所欲之重組蛋白）。 事實上最初係分離出與澱粉粒結合的融合蛋白，此做 法的附加優點係可避免該融合蛋白例如與油體膜蛋白結合 之風險，有時油體膜蛋白具有可能造成過敏作用的污染物 。因此’對於純化施用於人體的蛋白而言，與澱粉粒結合 是一項附加優點。 此方法已有效用於利用馬鈴薯植物表現出經由可被內 切蛋白酶專一辨識的胺基酸序列而與GBSS之羧基末端融 合的綠色螢光蛋白（GFP)。如上述般，此點非常重要， 欲純化之所欲的多胜肽接合至該包含澱粉結合域之融合蛋 白片段的羧基末端，因爲若不如此，會如第1圖所繪示般 ，該用於將蛋白從細胞溶質轉運至質粒體之toc-tic系統 的作用行動可能導致得到在該多胜肽末端處缺失部分序列 或具有額外胺基酸的所欲之多胜肽。由於該多胜肽並非完 整序列，因此該多胜肽可能無法用於例如醫藥應用或要求 該關注蛋白之胺基酸序列完整性的他種應用中。根據該融 -22- 201224143 合蛋白中之該等構成部分的組織方式所得到的此情況與根 據申請案WO98/14601和WOOO/771 65 (特別是提出澱粉 粒結合域較佳位於羧基末端區中的前者申請案）所建議的 該等系統具有明顯差異。根據該融合蛋白中之該等構成部 分的組織方式所得到的此情況亦能夠實際利用該方法純化 蛋白，並確保最終將獲得不只是完整的多胜肽，還能預測 最終經純化的多胜肽在彼任一末端處是否含有或不含任何 額外的胺基酸。 如於實例2和實例3中所見，該純重組澱粉經適當內 切蛋白酶處理後釋出經高度純化的GFP。因此，此種產製 及純化重組蛋白之方法的主要難題在於取得純澱粉。 亦需指出的重要一點係如第6圖和第1 0圖所示， GFP在與融合蛋白結合的澱粉粒中保持活性，因此此新方 法允許從源自儲存器官取得的澱粉中產製和純化出經適當 摺疊和組合的蛋白。 本案下述內容提出之該等實例中使用於3 5S啓動子爲 基礎的系統，該系統允許達到每公斤新鮮塊莖重量含有約 6毫克GFP累積量（約每公斤馬鈴薯塊莖澱粉含有約60 毫克的GFP )。如實例3所證實，於單次流程中，該新方 法允許使GFP純化600〜1 000倍（以簡單快速的方式從1 公斤基因轉殖馬鈴薯塊莖中獲得最少50-100毫微克（ng )之經高度純化的GFP)。因此，此新方法係一種有效率 、快速且簡單的方法，並可作爲目前所使用之昂貴方法的 可行替代方案。 -23- 201224143 如實例3中所討論般，該使用花椰菜嵌紋病毒之3 5 S 啓動子（CaMV )的表現系統允許達到每公斤新鮮塊莖含 有約6毫克GFP累積量。經估計GFP約占該基因轉殖塊 莖之總蛋白量的0· 1 %。可利用本發明所屬範圍內的具體 實施例使該系統最佳化，在該系統中係使用允許提高該多 胜肽之累積量的較強啓動子。 另一種提高所得純化蛋白最終產率之本發明方法的可 行實施例係在使用內切蛋白酶消化該等澱粉粒之前實施一 道附加步驟，於該步驟中係對澱粉粒進行處理以打破或消 化該澱粉粒，使得該內切蛋白酶可接觸到與澱粉粒結合的 所欲之重組蛋白中的大部分蛋白，而不非僅只接觸到位於 澱粉粒表面的重組蛋白。這是一個特別有趣的具體實施例 ，因爲藉著對天然且完整的澱粉粒進行單次消化處理僅能 從存在於1公斤塊莖內約6毫克的GFP中萃取出1 %的 GFP (明確言之爲50毫微克至100毫微克）。利用酶分 解反應（例如使用澱粉酶）是一種可行方法，雖然也可利 用物理性破壞處理打破澱粉粒。 可對本發明方法做出諸多變化而無需修改該方法之基 本要件，因此該等變化皆落入本發明範圍。 另一方面，如前所述，含有此類結構域之細菌性酶的 澱粉結合域可用於做爲本發明之澱粉結合域（縮寫爲SBD )。如上述，可於諸多文獻中找到細菌來源之SBD的實 例。在含有細菌來源之SBD的具體實施例中，重要的是 考慮到該融合蛋白轉移至質粒體的作用必需在細胞溶質中 Ο -24- 201224143 所合成的融合蛋白前驅物中存在著轉運胜肽。因此，用來 製備基因轉殖植物的表現載體必需具有對應於適當轉運胜 肽的編碼序列，且該轉運胜肽之編碼序列係成爲該融合蛋 白之編碼序列的一部分。可作爲該轉運胜肽係例如序列編 號：8所示者，且序列編號：7所示之序列係該轉運胜肽 的可行編碼序列。本案發明團隊用於上述場合者係一種胜 肽，已證實該胜肽的用處係用於將蛋白（例如，綠色螢光 蛋白GFP，見Bahaji等人於2011年發表之文獻a)或細 菌蛋白（例如，GlgC，見Bahaji等人於2011年發表之文 獻b)運送至質粒體。該胜肽係自然界中允許將P54 1蛋 白送入辣椒色素體中的轉運胜肽（見Ηοιιΐηέ等人於1994 年發表之文獻）。 若該澱粉結合域屬於某一植物蛋白，較佳使該融合蛋 白包含所述植物蛋白之完整多胜肽序列，且在細胞溶質中 合成前驅物形式的該融合蛋白，該前驅物包含所述植物蛋 白之前驅物形式的完整胺基酸序列，即含有所述蛋白之天 然轉運胜肽的前驅物。因此，該融合蛋白之編碼序列將包 含所選擇之澱粉結合性質物白的完整天然編碼序列，該編 碼序列將包含本身的天然胜肽前驅物，因此在所述蛋白前 方無需附加的轉運胜肽。 雖然上述作法對於本發明方案而言非必要條件，但較 偏好存在可與澱粉結合之植物蛋白的天然完整序列，勝過 存在植物蛋白的片段，因爲存在植物蛋白的天然完整序列 可確保在轉運至質粒體的過程中被toc-tic系統去除的該 -25- 201224143 等胺基酸皆屬於所述植物蛋白的胺基酸’而用來使所欲之 多胜肽脫離該融合蛋白的蛋白酶辨識序列或該融合蛋白皆 不受影響。 含有澱粉結合域的植物蛋白可選自下述群組： -澱粉粒結合性澱粉合成酶（GBSS) (EC 2.4.1.242 )； -葡聚糖二激酶（Rl) ( EC 2.7.9.4)； -由ΒΕΙ、BEIIa及BEIIb組成的澱粉分枝酶群組 中一者 （EC 2.4.1 · 1 8 )； -由SSI、SSII及SSIII組成的可溶性澱粉合成酶 群組中一者 （EC2.4.1.21):及 -質粒體澱粉磷酸化酶 （EC2.4.1.1)。 所述植物蛋白的編碼序列可與天然序列相同或可爲與 天然序列具有至少60%同源性（homology )的序列，使得 由所述編碼序列合成出的蛋白保有與澱粉結合的能力且提 供能夠作爲轉運胜肽而將最初合成之前驅物引導至質粒體 的傳訊序列（signaling sequence)。本發明之較佳具體實 施例係該等憑藉任一個前述酶之天然序列的實施例，例如 本案實例1和實例2中所示實例，於該等實例中係使用經 選殖後的阿拉伯芥GBSS之天然序列，該阿拉伯芥GBSS 天然序列係由基因At lg3 2 900所編碼。例如，亦可使用馬 鈴薯之天然序列（UniProt accession no.: Q00775 ; EMBL accession no·: CAA41359.1 )。 當使用含有澱粉結合域之植物蛋白的天然序列時，利 p -26- 201224143 用對應用來獲得基因轉殖植物之物種的該序列係較佳作法 ，但此做法並非必要條件。 關於含有蛋白酶可辨識之剪切位置的連接子片段方面 ，原則上，該蛋白酶可爲任意蛋白酶。然而，$口欲於該方 法結束時獲得完整的所欲之胜肽，則該剪切位置須經選擇 ，使得該剪切位置亦不會出現在所欲之蛋白的內部序列中 。可用的蛋白酶係凝血酶，凝血酶切開位於精胺酸（Arg )之後的多胜肽序列，公認最適合剪切的辨識序列是 Gly-Arg//Gly 及 A-B-Pro-Arg-//-X-Y，其中 A 和 B 係疏水 性胺基酸，且X和Y是非酸性胺基酸。當所欲的多胜肽 欲用於醫藥用途時，以剪切後該蛋白酶之辨識序列可完整 留在羧基末端且沒有胺基酸留在胺基末端中（留在胺基末 端的胺基酸可能改變所欲之多胜肽的序列）的蛋白酶爲特 佳。蛋白酶之實例可爲腸激酶，腸激酶是一種當發現 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列時會在離胺酸後方進行剪切的 特殊蛋白酶，因此該胺基酸（在此胺基酸後方進行剪切） 是蛋白酶辨識序列的最後一個胺基酸，且沒有該辨識序列 的殘餘部分留在剪切後所產生的胺基末端中。 如先前討論般，當所欲的多胜肽欲用於醫藥領域或用 於任何要求重組蛋白胺基酸序列之整體完整性的其他領域 時，使用腸激酶及腸激酶辨識序列的選擇特別重要，因爲 可確保該方法結束時所獲得的多胜肽將具有本身完整的序 列而不含酶剪切序列之遺留部分且不缺失部分的該多胜肽 胺基酸。基於此原因，在使用本發明方法製備臨床用或治 -27- 201224143 療用蛋白（例如帕利夫明、美卡舍明和白蛋白）的實例4 中係選擇內切蛋白酶。在該方法中，部分所述蛋白是欲擴 增及純化的所欲之多胜肽且本發明載體包含融合蛋白之編 碼序列（該融合蛋白形成所述多胜肽之一部分），且此方 法亦屬本發明範圍。 如以下討論般，由於GFP是一種發出綠色螢光的蛋 白，因此可輕易偵測該GFP之表現，且允許輕易地觀察 結果，因此發展出使用GFP作爲所欲之多胜肽模型（欲 擴增及純化之重組蛋白）的系統。由於GFP是一種普遍 的試驗工具，因此可輕易找到有關GFP之特性和配合 GFP使用之試劑（例如，專一性抗體）的資料。基於GFP 的優點，在特別感興趣的本發明方法之具體實施例中，該 GFP係做爲所欲的多胜肽，該連接子片段可能是含有凝血 酶剪切位置和植物蛋白GBSS的連接子片段，例如本案之 實例1、實例2和實例3中所示者。亦特別偏好包含對應 於GBSS-凝血酶剪切位置-GFP融合蛋白（序列編號：2) 之編碼序列（序列編號：1 )的本發明載體。 關於用於取得基因轉殖植物的物種方面，原則上可使 用任何植物，但該植物較佳爲可累積澱粉的植物，舉例而 言，例如穀類植物（如稻米、大麥、小麥及玉米）、馬鈴 薯、菸草、番茄或阿拉伯芥植物。本案中係顯示使用圓葉 薛草（Wcoi/aHa 薛草種類的一種）或馬鈴 薯（5·〇/α«Μ»ί 進行試驗，但本案中顯不的技 術效果可推及至任何可累積澱粉的植物’並推及至可累積 -28- 201224143 澱粉之植物的任何器官（例如塊莖、葉、果實·、種子，等 等）。 獲得本發明方法中所使用的基因轉殖植物需要利用針 對本發明目的而特殊設計的表現載體進行轉形。因此，本 發明之一體系是關於用於使植物轉形的表現載體，該表現 載體自5'至V方向包含允許在植物體內表現的啓動子且 該啓動子與融合蛋白之編碼序列操作性接合，該融合蛋白 包含自胺基至羧基方向包含細胞溶質-質粒體轉運胜狀、 澱粉結合域、含有蛋白酶剪切位置之連接子片段及對應於 欲遵照本發明方法進行純化之重組蛋白的多胜肽。較佳， 所述載體係一種質體。 前述關於構成融合蛋白之該等要件、彼等之編碼序列 及用於表現融合蛋白的啓動子的所有可行替代例或較佳例 亦適用於本發明之載體，且可利用該等載體產生基因轉殖 植物。用於本案所提出之下述實施例中且對應於該等替代 例的該等特定載體係本發明所述體系的重要具體實施例， 且該等載體係： -於載體中與該融合蛋白編碼序列操作性接合之啓 動子是35S啓動子的該等載體； -於載體中該細胞溶質-質粒體轉運胜肽序列和澱 粉結合域是屬於能與澱粉粒結合的植物蛋白之天然編碼序 列（特別偏好使用GBSS，且特佳係阿拉伯芥之GBSS或 馬鈴薯之GBSSI)的該等載體； -於載體中該連接子片段包含凝血酶或腸激酶辨識 -29- 201224143 位置之編碼序列的該等載體； -於載體中含有選自GFP、帕利夫明、美卡舍明與 成熟人白蛋白中的多胜肽之編碼序列的該等載體。 操作時，亦較佳利用gateway®技術獲得該載體。 因此，較佳亦使該融合蛋白的編碼序列夾在attB : attBl 序列與attB2序列之間。 GATEWAY®技術可相當程度地簡化該選殖方法，然而 ，可利用其他已知的選殖手段（例如，用限制酶、接合酶 進行剪切與疊合）或用於其他領域中的其他手段獲得本發 明方法中所使用的表現載體。 藉由本發明所述載體獲得基因轉殖植物的本發明方法 之具體實施例亦屬本發明範圍。 含有所述載體的該宿主生物亦是本發明的重要一環， 因爲該宿主允許擴增且在獲得基因轉殖植物的過程中可能 扮演媒介者的角色。這是也是爲何經導入所述載體的細菌 宿主亦爲本發明之一體系的緣故。基於此理由，該宿主較 佳係農桿菌，因爲農桿菌是將該含有融合蛋白之編碼序列 和啓動子之構築體導入植物體內的合適途徑。 本發明之附加體系描述經所述宿主轉形的植物細胞及 由該等細胞生成或得自該等細胞的基因轉殖植物。表現出 與澱粉粒結合之融合蛋白的轉形細胞亦可用於執行本發明 方法，而從該等經培養的細胞中純化該蛋白。亦可使用源 自植物之其他細胞株且經本發明載體轉形的培養細胞，該 等細胞可採用所屬技術領域中熟悉該項技藝者已知的方法 -30- 201224143 進行培養，且該等細胞較佳爲可快速生長的細胞株（例如 源自圓葉菸草植株BY-2之細胞株），且較佳可在細胞介 素（cytokines)存在下培養該等細胞株（見Enami等人於 2011年發表之文獻）。該等植物細胞通常是使細胞懸浮 於液體培養基中的方式培養，或亦可於固態培養基中以組 織團塊（未經分化的細胞團）的形式培養。在未經分化細 胞的例子中，必需在植物生長激素（auxins )與細胞介素 (cytokines )之間取得必要的平衡。進一步的細節資訊可 查閱一般關於植物細胞培養之一般文獻（見Bhojwani與 Razdan於1 996年發表之文獻；Georgiev等人於2009發 表之文獻；Singh與Seema於2009年發表之文獻）或特 別是關於ΒΥ·2細胞的文獻（見Nagaka等人於2004年發 表之文獻）。 同樣地，本發明範圍所涵蓋之所述基因轉殖植物可定 義爲該等含有倂入彼等植物之基因體中之DNA片段的基 因轉殖植物，且該DNA片段含有用於在植物體內表現的 啓動子，且該啓動子係與本發明之融合蛋白的編碼序列可 操作地連接。因此，基因轉殖植物、彼之種子或繁殖物質 亦屬本發明範圍，且特徵係於彼植物之基因體內自5'至 3'方向倂入允許於植物體內表現的啓動子，且該啓動子與 融合蛋白之編碼序列操作性接合，該融合蛋白自胺基至羧 基方向包含細胞溶質-質粒體轉運胜肽、澱粉結合域、含 有蛋白酶剪切位置之連接子片段及該基因轉殖植物所屬物 種體內無法天然表現之蛋白的多胜肽序列。可邏輯推知該 -31 - 201224143 最後的蛋白將是欲擴增和純化的重組蛋白。 針對本發明之目的闡明下述用語： •基因轉殖植物：一種植物，彼之基因體係經基因 工程改造以達到相對於野生型對照植物（_WT )而言具有 不同及/或改進之生物特性的目的。 •經轉形之植物細胞：一種於彼等細胞之基因體中 導入且表現外源遺傳物質而導致具有基因改造的植物細胞 •嵌合蛋白 GBSS-thrombin-GFP之異位表現：植 物可異位性地表現該嵌合蛋白 GBSS-thrombin-GFP，當在 相同條件下且同時培養經轉形之植物和野生型植物時， 抗-GFP免疫墨點法可在經轉形之植物的萃取物中測得信 號（band )，但在野生型植物之萃取物中未測得該信號。 舉例而言，於第5圖中可觀察到，使用GFP專一性抗體 在經基因轉殖而表現GBSS-thr-GFP之圓葉菸草植株的蛋 白萃取物中測得大小相當於該嵌合蛋白的信號，但未在野 生植株萃取物中測得該信號。另一種確定植物表現該蛋白 GBSS-凝血酶-GFP的方法係偵測該GFP蛋白所發出的螢 光。如第6圖所示，螢光僅專只且完全出現在澱粉粒中， 故可確定GFP與GBSS結合。 在本申請案所提出之下述具體實施例中，該GBSS係 用於作爲與澱粉粒結合之蛋白的具體實例，特別是阿拉伯 芥的GBSS。爲獲得該轉形載體，係使用藉由GATEWAY® 技術獲得專爲用於所述方法中而設計的中間載體，在該等 -32- 201224143 中間載體中，該GBSS的編碼序列已與所選用之啓動子 作性接合（在此實例中，該啓動子係35S)，且該等中 載體允許使任何關注之蛋白的編碼序列與該GB S S融合 因此，該等載體包含當本發明方法實施於任何蛋白時所 要的有用工具，包括可用的中間媒介，而於每次實施本 明方法時僅需將所欲之特定多胜肽的編碼序列加入該中 媒介中。因此，自5'至3'方向包含允許在植物體內表 之啓動子、可澱粉粒結合之植物蛋白的編碼序列（該植 蛋白的-碼序列係可操作地與啓動子接合）、接在該編 序列之後且夾在attRl序列和attR2序列間之片段（該 段較佳含有指示基因或選擇基因）的表現載體係形成本 明之另一體系。此作法允許在該含有澱粉結合域之植物 白編碼序列的下游處選殖任何夾在attLl序列與attL2 列之間的核苷酸序列。該載體可包含任何常用於此等目 之啓動子和任何合適的終止子，及含有不同的抗生素抗 性標目志基因（antibody-resistance markers)，而不會改 本發明之本質。較佳，所述載體（vector )係一種質體 plasmid )。較佳，所編碼之植物蛋白係GBSS，特別是 拉伯芥或馬鈴薯的GBSS。特別是該載體可能是一種自 至P方向包含35S啓動子、編碼該GBSS之序列及夾 attRl序歹!J與attR2序列間之核苷酸序列的載體，例如 體；g/w，且於實例1和第7圖中詳細描述 等載體，並且該載體pGWS giw亦繪示於第12圖至第 圖且用於實例4中。 操 間 〇 需 發 間 現 物 碼 片 發 蛋 序 的 藥 變 ( 阿 5, 在 載 此 -33- 15 201224143 經所述載體轉形的細菌宿主亦成爲本發明之附加體系 。最佳實例是該宿主爲大腸桿菌。 以下具體實施例詳細說明本發明。該等具體實施例不 應解釋成本發明範圍之限制條件。 具體實施例 以下描述所進行的該等具體實施例，在該等實施例中 ，詳細示出獲得基因轉殖植物的方法（該基因轉殖植物表 現經由蛋白酶可專一辨識之序列而與GBSS蛋白融合的重 組蛋白）。綠色螢光蛋白GFP係用於作爲與該GBSS接合 之蛋白的實例。凝血酶可辨識的胺基酸序列係最先用於作 爲蛋白酶可專一辨識之序列的範例。 實例1 :獲得表現尸之基因轉殖植物及 探討該表現尸之基因轉殖植物的特性 1.1 獲得質體 要製造可表現經由蛋白酶可辨識之胺基酸序列而與 GBSS接合之蛋白的基因轉殖植物，需先製造出二元表現 質體（binary plasmid)，製備步驟係如第7圖中所示。 該GBSS係由阿拉伯芥之基因所編碼。係從該 基因之核苷酸序列合成出該GBSS特有的寡聚 核苷酸。係利用此等寡聚核苷酸藉由RT-PCR從阿拉伯芥 葉片的全體RNA中擴增出該編碼著GBSS的完整cDNA 片段。將該經擴增的片段選殖至該載體pGEM-T-easy ( -34- 201224143 promega)中，產生質體且於宿主細菌XLl Blue 中擴增該質體尸。該編碼GBSS的cDNA係夾在attB 重組位置之間，且利用寡聚核苷酸GBSS-attBl ( 5·-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatggcaactgtgactgcttcttc-3')與寡聚核 ^ ^ GBSS-attB2 ( 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatcacggcgtcgctac gttctc-3’）從該質體；中擴增該編碼GBSS的cDNA。利 用attPl和attP2重組位置藉由GATEWAY®重組反應將該 PCR所產生的產物選殖至載體pDONR/Zeo中，產生質體 pDONR-GBSS。藉著 GATEWAY®重，組反應，該 GBSS * 0 從該質體轉移至該質體；，而產生含 有GBSS基因且受35S啓動子控制的；構築體 。使用該質體pG妒M-GMS、寡聚核苷酸35S-HindIII ( 5'-cgtgctcccaagcttactagagccaagctgatctcc-3')和寡聚核苷 酸 GBSS-Xbal ( 5'-ggctctagactcggcgtcgctacgttctcc-3，）作 爲模板，藉由PCR擴增該序列，該 序列係由35S啓動子與夾在Hindlll和Xbal限制剪切位 置之間的GBSS基因融合而成。於該質體中，係 利用Hindlll和Xbal限制剪切位置使該PCR產物取代該 35S啓動子，而創造出質體grw，該質體 pGWB2-GBSS gtw ^ ^ ^ « tt 3 5 S 啓動子、該 ^基 因和夾在attRl序列與attR2序列之間的GATEWAY®重組 匣，該GATEWAY®重組匣允許引入任何所欲的基因，藉 以產生由所欲之蛋白與GBSS蛋白之C-端融合而成的重組 蛋白。利用電穿孔法將該載體.pGFW-GSSS giw導入大腸 -35- 201224143 桿菌（五· co/z·)內。

1.2 獲得質體户G 藉由聚合酶鏈鎖反應（PCR )利用寡聚核苷酸Thr-Egfp-attB 1 ( 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctiaatgctggtg ccgcgcggcagcatggtgagcaagggcgaggagc-3')與寡聚核苷酸 Egfp-attB2 ( 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtattacttgtac agctcgtccatgc-3·)自該編碼GFP蛋白的cDNA擴增出經設 計且命名爲 的序列。該寡聚核苷酸Thr-Egfp- attBl 含有 attB 1 序歹！J ( 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcagg ctta-3 )且接著含有編碼蛋白酶（凝血酶）之剪切位置的 序列（5'-atgctggtgccgcgcggcagc-3)和編碼所欲蛋白（此 實例中爲 GFP )之 N-端的序列（5'-catggtgagcaaggg cgaggagc3') »該寡聚核苷酸Egfp-attB2含有編碼所欲蛋 白（此實例中爲 GFP )之 C-端的核苷酸序列（5·-ggggaccactttgtacaagaaagctgggta-3')且接著含有 attB2 序 歹 lj (5’-ttacttgtacagctcgtccatgc-3’）。利用 GAREWAY® 重 組技術將所產生的PCR產物選殖至載體pDONR/Zeo中， 產生質體尸尸。利用 GATEWAY®重組技術由 pDONR-Thr-GFP與p G W B 2 - G B S S - gtw獲得該含有持續性 啓動子35S、嵌合基因GBSS-thromb-GFP和終止子Nos 的質體 1.3獲得可異位表現出經由凝血酶可辨識的序列而與

-36- 201224143 GBSS接合之蛋白的基因轉殖植物 利用電穿孔法將該質體尸户導入農 桿菌內。依據文獻（Rocha-Sosa等人1989年發表之文獻 ;Clough和Bent於1 99 8發表之文獻；Voinnet等人於 1 999年發表之文獻）中所述程序利用所產生的菌株使圓 葉蘇草（Wcoriawa 、馬鈴薯（So/awww iwkrwwm)及阿拉伯芥又稱擬南芥）轉形 〇 該質體含有由阿拉伯芥GBSS 基因' 編碼有蛋白酶（凝血酶）剪切位置之序列和編碼有 GFP之基因所形成的基因匣。此表現匣的核苷酸序列係以 序列編號：1表示。該蛋白GBSS-thrombin-GFP的轉譯胺 基酸序列係以序列編號：2表示。利用農桿菌株（該菌株 含有該質體pGWB2-GBSS-Thr-GFP)獲得經基因轉殖而可 持續表現GBSS-Mr-GFP的圓葉菸草和馬鈴薯植株。當該 等經基因轉殖的植株與未經轉形的植株相比較時，表現嵌 合蛋白GBSS-thrombin-GFP的該等植株累積一種約96kDa 的蛋白，且GFP的專一性單株抗體能辨識該蛋白，而未 經轉形之植株未出現該種蛋白（見第5圖）。利用配備 488氬氣躍遷雷射 '綠光用濾鏡BA5 15/30、紅光用濾鏡 BA65 0LP及光偵測器的D-Eclipse Cl (NIKON)共軛焦顯 微鏡對該基因轉殖植株進行GFP細胞內螢光位置分析。 可於第6圖的照片中觀察到該GFP蛋白位於澱粉粒內。 -37- 201224143 實例2 :純化與鑑定經構築體轉形之 植物中的GFP蛋白 2.1從基因轉殖植物中純化該GFP蛋白 從經該尸構築體轉形之植物的澱粉 粒中純化GFP蛋白的程序係： -利用攪拌器於1〇毫升萃取緩衝液（含5〇11^1'^-HC1 (pH 8.0 ) 、ImM EDTA、5mM DTT、0.05% Triton ) 中將1公克之經35S-GBSS-thr-GFP構築體轉形的植物葉 片均質化。 -透過兩層濾布Miracloth過濾該均質物且靜置於 4〇C。 -丟棄該上清液，且將該澱粉富集之沈澱物重新懸浮 於3 00微升的凝血酶消化緩衝液（含20mM Tris-HCl， pH8.4、1 50mM NaCl、2.5mM CaCh )中。取 150 微升之 此懸浮液’於22 °C利用0.16單位的凝血酶消化此懸浮液 1 2小時。剩餘1 50微升之該懸浮液係用於作爲陰性對照 組。 -—旦該凝血酶之消化反應結束後，以1000 g離心 該樣本10分鐘。取該上清液進行SDS-PAGE丙烯醯胺凝 膠電泳’且利用抗-GFP初次抗體藉由免疫墨點法進行 GFP的免疫偵測。 2.2鑑定該GFP蛋白 可利用下述方法之任一者鑑定GFP : ( a )藉著使用 201224143 抗-GFP專一性抗體進行免疫墨點法，及（b)藉著偵測該 GFP蛋白所發出之螢光。 利用免疫墨點法：利用抗 GFP專一性抗體根據 Towbin等人於1 979年發表之文獻中所描述的免疫墨點法 偵測GFP。藉著與接有鹼性磷酸酶的抗-IgG兔子二次抗 體偵測該抗原-抗體複合物。 利用共軛焦顯微鏡分析GFP蛋白的螢光：利用所得 到之如第8圖繪示的GBSS-thr-GFP嵌合構築體使馬鈴薯 和阿拉伯芥植株轉形。利用共軛焦顯微鏡觀察該等植株， 以鑑定GFP的細胞內螢光位置（見第6圖）。 使用根據第7圖和第8圖繪示之本發明方法所獲得的 GBSS-thr-GFP嵌合構築體使菸草植株轉形。使菸草葉經 均質化且接著以低速離心後可自該等菸草葉中獲得澱粉粒 ，並利用凝血酶消化該等澱粉粒以釋出GFP蛋白。藉著 再次離心，可從該等澱粉粒中分離出可溶性GFP蛋白， 而獲得富集GFP蛋白的上清液。利用抗GFP專一性抗體 進行免疫墨點法以確認GFP蛋白自該等澱粉粒中釋出。 如第9圖中所見，在經凝血酶處理之該樣本的上清液中， 可偵測到大小約2 9 k D a而與從澱粉粒中釋出之G F P蛋白 相應的蛋白。當該等澱粉粒未經凝血酶處理時，則不會出 現此蛋白，此表示只有在蛋白酶「凝血酶」的存在下才會 發生與該GBSS結合之蛋白釋出的現象。在該等不溶性澱 粉粒中，抗GFP抗體辨識到大小爲96kDa而與該GBSS-凝血酶-GFP融合蛋白相應的蛋白。 -39- 201224143 實例3:確認該方法於馬鈴薯植物中的再現性 爲測試該方法的再現性，於此實例中，在馬 (Solanum 中再次執行1.3節之獲得 植物的方法。 如實例1和實例2般，該基因轉殖植物累積 現出與阿拉伯芥GBSS融合的GFP，在此實例中 欲純化之所欲的重組蛋白，且阿拉伯芥GBSS係 粉粒結合的蛋白。因此，如前述實例般，所欲的 與澱粉粒結合，高密度之蛋白與澱粉粒結合則允 組織均質化、離心且利用內切蛋白酶進行剪切處 所欲之重組蛋白的單次過程之後，輕易地自其餘 分中純化出該蛋白。 該系統（如第4圖中所槪述者）係分成兩個 :(1)使該馬鈴薯塊莖均質化，接著用濾布過 物並以1 〇〇〇 g離心5分鐘後獲得澱粉粒；（2 ) 內切蛋白酶（在此實例中係凝血酶）處理該澱粉 離心之後而釋出GFP。可採1克塊莖使用1毫升 比例，使用含有 50mM ( pH8 )之 Tris-CIH、 EDTA ' 5mM Z DTT 0.0 5 % ^ if ^ f!| Triton ^ 該等塊莖均質化。爲利用腸激酶消化澱粉，以1 用10毫升緩衝液的比例，使澱粉重新懸浮在含 之 Tris-CIH (pH 8.4 ) 、150mM 之 NaCl、：

CaCl2的經緩衝之溶液中。該經緩衝之溶液每 0.3單位的凝血酶。 ，鈴薯植物 ，基因轉殖 :澱粉且表 ，GFP 係 用於與澱 蛋白應會 許在經過 理後溶出 的細胞成 主要階段 濾該均質 以對應的 且接著經 緩衝液的 1 m Μ 之 緩衝液使 克澱粉使 有 2 0 m Μ 2 _ 5 m Μ 之 毫升含有 -40- 201224143 自10公斤塊莖中獲得1毫克（mg )經高度純 GFP所需要的時間係1 2小時（5小時用於階段1，及 時用於階段2)。 利用共I®焦顯微鏡進行塊莖澱粉粒之分析（此分 應於第10圖之顯微照片）。於同—圖中可看見GFP 鈴薯塊莖澱粉粒中保有活性而發出GFp特有的綠色 ’故此新方法允許產製且從儲存器官所獲得的澱粉中 出經適當摺疊和組合的蛋白。 該藉著於構築中使用35S啓動子以獲得基因轉植 的表現系統允許達到每公斤新鮮塊莖量含有約6毫 GFP累積量（約每公斤馬鈴薯塊莖澱粉含有60毫 GFP)。考慮到1公斤重的新鮮馬鈴薯塊莖含有約6 白，估計GFP約占該基因轉殖塊莖之總蛋白含量的 〇 待執行利用內切蛋白酶進行消化且隨後離心的步 後，藉由電泳法檢驗該蛋白的純度。第11圖中可見 結果，該等結果係如下述：從下述來源取得之萃取物 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺（SDS-PAGE)膠體電泳 後經考馬斯藍（coomasie blue)染色（A圖）或利用 墨點法進行分析（B圖），該等來源係：（1 )能表 由凝血酶可專一辨識的胺基酸序列而與GBSS接合之 的馬鈴薯塊莖，（2)純澱粉，及（3)用凝血酶處理 澱粉後釋出的蛋白。跑道（1)中裝入源自1.6毫克 新鮮塊莖的10微克蛋白。跑道（2)中裝入1微克經 化之 7小 析對 在馬 螢光 純化 植物 克的 克的 克蛋 0.1% 驟之 該等 進行 且隨 西方 現經 GFP 該純 重之 純化 -41 - 201224143 的澱粉蛋白，及跑道（3)中裝入0.15微克之經凝血酶處 理後從該純化澱粉中釋出的蛋白。相較於裝入已知量GFP 的標準分析而言，「B」圖的免疫墨點分析顯示在裝入跑 道（1)內的10微克蛋白中含有約10毫微克的GFP (占 總蛋白量的0.1%)，而裝入跑道（3)內的150毫微克蛋 白中含有約100毫微克的GFP(占該蛋白量的66%)。換 言之，在單次程序中（純化澱粉及使用內切蛋白酶進行處 理），係（a)從澱粉粒中釋出GFP且（b )使GFP純化 600倍至1000倍。 需強調，執行單次的該新方法允許使GFP純化600 倍至1 0 00倍，以簡單且快速的方式從1公斤的基因轉殖 馬鈴薯塊莖中獲得最少50〜100毫微克的高純度GFP (從 1公斤基因轉殖馬鈴薯塊莖澱粉中獲得0.5〜1毫克之經高 度純化的GFP )。 在此實例中，用於釋出GFP的蛋白酶係經生物素化 ，而可簡單地從最後製備物中去除蛋白酶。然而，蛋白質 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE)及 後續染色顯示在從澱粉粒「釋出」GFP之階段後所獲得的 GFP製備物含有來自一種蛋白的少量污染（再次參閱第 1 1圖）。在此實例中，預期該附加之純化步驟可作爲本 發明方法的可行選用步驟，且該附加之純化步驟係方便執 行。 實例4:蛋白質於臨床/治療領域上的延伸應用 -42- 201224143 如先前所討論般’本發明方法的主要用途之一在於擴 增和純化醫藥用之目標蛋白的應用，該等蛋白目前是藉由 重組方法在微生物（特別是大腸桿菌）體內進行擴增而得 〇 如先前所討論般，當所欲的重組多胜肽將用於醫藥領 域時，該蛋白必需完整、沒有缺少該蛋白特有序列的任何 代表性胺基酸且亦不含該蛋白以外的附加胺基酸。 爲此係製備馬鈴薯植株，該等馬鈴薯植株將可表現與 所欲之治療用蛋白接合的阿拉伯芥GBSS。該方法類似於 前述該等實例中所描述之方法，只除了在此實例中，用於 連接所欲蛋白和GBSS的連接子片段不含凝血酶辨識序列 而是含有腸激酶辨識序列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，在 該融合蛋白中，該離胺酸（Lys)係與所欲之多胜肽的第 一個胺基酸直接連接。因此該腸激酶緊接在該離胺酸之後 進行剪切，故可獲得完整的所欲之多胜肽而不含附加胺基 酸。 經選出的醫藥用多胜肽係如下所示： —帕利夫明（Palifermin ):係一種N-端截除1 40個 胺基酸的重組型人角質細胞生長因子 KGF ( UniProt Accession No. : P21781 ; GenBank Accession No.: M60828 )。帕利夫明目前係於大腸桿菌內產製而得。帕 利 夫明之 明確序 列請見 ： http://www.drugbank.ca/drugs/BTD00042。帕利夫明是一 種用於促進接受化療之癌症病患腸胃道黏膜發育的藥物。 -43- 201224143 —美卡舍明（Mecasermin):利用重組生長技術於大 腸桿菌中所獲得的人IGF-I (—種類似胰島素1的生長 因子）。該70個胺基酸的序列係與人1GF_I的序列相同 。明確序列請見：httP://www.drugbank.ca/drugs/DB01277 (cDNA 序歹 IJ 請見 GenBank Accession No. : X 5 7 0 2 5 )。 一白蛋白（Albumin):係由成熟的人蛋白編碼序列 於酵母菌內產製而得（在人體中，所合成的白蛋白係呈驅 物形式）。較佳係使用重組蛋白形式的白蛋白，以避免從 血清中萃取白蛋白時受肝炎病毒和人免疫缺陷病毒（HI V )污染。白蛋白係於管柱中經純化而得（成熟白蛋白之序 列請見：http://www.drugbank.ca/drugs/DB00062;白蛋白 的完整 CDS 請見 GenBank Accession No. : M 1 2 523 )。 利用上述有關治療用序列及其編碼序列之資料，執行 與實例1所描述之方法相似的方法，但使用一種類似於 pGWB2-GBSS gtw且亦含有阿拉伯芥之GBSS序列並受 35S啓動子控制的質體作爲中間質體pGBSS gtw。應用該 方法允許產生基因轉殖的馬鈴薯植物，在該等植物中係表 現出該GBSS的融合蛋白（其包含所欲之對應胜肽的編碼 序列）。獲得達成此目的之必要質體的方法係槪述於第 12圖、第13圖和第μ圖中，且該中間質體pGBSS gtw 的結構亦見於該等圖中。 利用類似方法再次實行該方法之運作，其中所欲之蛋 白同樣爲GFP。獲得該必要質體的方法係槪述於第丨5圖 中。該系統（如第4圖中所槪述者）係分成兩個主要階段 -44- 201224143 :(η使該馬鈴薯塊莖均質化且接著用濾布過濾該均質 物並以l〇〇〇g離心5分鐘後獲得澱粉粒；（2 )以對應的 內切蛋白酶（在此實例中係腸激酶）處理該澱粉且隨後經 離心之後而釋出GFP。可採1克塊莖使用1毫升緩衝液的 比例，使用含有 50mM ( pH8 )之 Tris-CIH、1 mM之 EDTA、5mM之DTT和0.05%之清潔劑Triton的緩衝液使 該等塊莖均質化。爲利用腸激酶消化澱粉，以1克澱粉使 用1 〇毫升緩衝液的比例，使澱粉重新懸浮在每毫升溶液 含有0.3單位腸激酶的經緩衝之溶液中。隨後於該方法結 束時，檢測該經腸激酶處理後所釋出的GFP，根據該GFP 的胺基酸序列檢驗該GFP之完整性（該GFP的胺基端部 分中未缺少胺基酸或多出胺基酸）。爲此，該經純化之 GFP的胺基末端係經定序，以確認經純化之GFP的胺基 末端與GFP之胺基末端（序列編號：2的第63 2至661個 胺基酸）的序列完全一致。 用於分離、利用腸激酶釋出所欲之胜肽及純度鑑定的 方法係類似於上述實例2和實例3之該等方法，其中所欲 之該等多胜肽係以期望的形式取得，該等多胜肽包含本身 完整的序列且不含有該內切蛋白酶可辨識之胺基酸序列的 遺留部分。 【圖式簡單說明】 第1圖顯示經合成而成爲融合蛋白之一部份的重組多 胜肽在細胞溶質中合成、轉運至質粒體（基質）、與澱粉 -45- 201224143 結合、脫離澱粉粒及純化的過程圖解，其中該澱粉封裝區 (SER:澱粉結合域）係位於該融合蛋白的羧基區段內， 而所欲的多胜肽（此圖繪示爲綠色登光蛋白，GFP)則位 於接續在該轉運胜肽（TP)之後的胺基區段內。藉由一段 核酸內切酶可專一辨識的連接性胺基酸序列使GFP與 SER隔開。利用Toc-Tic轉運蛋白系統將蛋白轉運至該基 質的轉運作用涉及切除不明數目的胺基酸（如圖中不規則 箭頭之末端處所顯示的修飾作用），切除不明數目的胺基 酸可能造成GFP蛋白之胺基端損失一部分的胺基酸或是 留下該轉運胜肽的一部分，一旦釋出且純化該多胜肽時， 此修飾仍會保留。 第2圖顯示經合成而成爲融合蛋白之一部份的重組多 胜肽在細胞溶質中合成、轉運至質粒體（基質）、與澱粉 結合、脫離澱粉粒及純化的過程圖解，其中所欲的多胜肽 (此圖繪示爲綠色螢光蛋白，GFP)位於該融合蛋白的羧 端區域內，而具有灑粉結合域（此圖中繪示爲GBSS:濺 粉粒結合性澱粉合成酶）的植物蛋白則位於該融合蛋白的 胺端區域內，且該植物蛋白具有該植物蛋白處於前驅物形 式時本身所擁有的轉運胜肽（TP )。利用Toc-Tic轉運蛋 白系統將蛋白轉運至基質的轉運作用不會影響該GFP蛋 白，一旦使用核酸內切酶（此實例中使用腸激酶）切下該 多胜肽並純化該多胜肽時，係回收完整的GFP蛋白。 第3圖顯示經合成而成爲融合蛋白之一部份的重組多 胜肽在細胞溶質中合成、轉運至質粒體（基質）、與澱粉 -46 - 201224143 結合、脫離澱粉粒及純化的過程圖解，其中源自細菌的澱 粉結合域（SBD )係位於該融合蛋白的胺端區段內，且該 轉運胜肽（TP)位於該澱粉結合域之前，而所欲的多胜肽 (此圖繪示爲綠色螢光蛋白，GFP )係位於該羧端區域內 。雖然利用Toc-Tic轉運蛋白系統將蛋白轉運至基質的轉 運作用可能影響SBD，但此影響應該不會擴及GFP，一旦 使用核酸內切酶（此實例中使用腸激酶）切下該對應GFP 的多胜肽並純化該多胜肽時，同樣可回收完整的GFP蛋 白。 第4圖顯示遵照本發明方法從表現出與GBSS結合之 關注蛋白的馬鈴薯塊莖獲得所欲之多胜肽（重組蛋白）的 步驟：使該等塊莖均質化，過濾、清洗及離心，獲得純澱 粉粒，使用相應的蛋白酶進行消化分解，再次離心並分離 出該上清液中所欲的蛋白且同時該等澱粉粒留在離心沈澱 物（pellet)中。 第5圖顯示利用抗GFP抗體免疫墨點法偵測表現 GBSS-凝血酶（thr) -GFP之圓葉菸草基因轉殖植物中的 GBSS-thr-GFP 蛋白。 第6圖顯示GBSS-凝血酶-GFP在細胞內的位置。該 等照片顯示利用配備波長48 8之氬氣躍遷雷射、綠光用濾 鏡 BA515/30 及紅光用濾鏡 BA65 0LP 的 D-Eclipse C1 ( NIKON )共鞭焦顯微鏡分析該表現GBSS-thr-GFP之阿拉 伯芥植物細胞中的螢光。於該等照片中可觀察到GBSS-thrombin-GFP所發出的綠色螢光係與該等澱粉粒重合， 201224143 因此可確定GFP蛋白與GBSS蛋白接合。紅色螢光係由存 在於質粒體（plastids)中的葉綠素所發出。 第7圖顯示構築該PGWB2-GBSS gtw質體的步驟， 該質體允許引入任何關注之蛋白的編碼序列而與該GBSS 之編碼序列接合》 第7A圖顯示利用GATEWAY技術產生含有GBSS基 因且受35S啓動子控制的PGWB2-GBSS質體架構。 第7B圖顯示倂入GATEWAY重組匣之pGWB2-GBSS gtw質體的產生。 第8圖顯示構築pGWB2-GBSS-Thr-GFP質體的步驟 ，該質體係用於透過農桿菌製造出可經濟地表現該GBSS-GFP的植物，該GBSS係透過內切蛋白酶可辨識的胺基酸 序列與GFP接合，於此實例中該內切蛋白酶係凝血酶。 該Thr-GFP序列係藉由 GATEWAY技術引入第7圖之 pGWB2-GBSS gtw 載體中。 第9圖顯示使用抗GFP抗體藉由免疫墨點法進行 GFP蛋白之分析。該表現户之基因轉殖植物 的經純化之澱粉粒係經或不經蛋白酶（凝血酶）處理。之 後，該等澱粉粒係以1 000 g離心10分鐘。圖中由左至右 分別爲：澱粉粒、未經凝血酶處理之澱粉粒於離心後所獲 得的上清液及經凝血酶處理之澱粉粒於離心後所獲得的上 清液。 第10圖顯示表現含有GBSS-凝血酶辨識序列-GFP之 融合蛋白的馬鈴薯塊莖濺粉粒的共軛焦顯微照片。下方照 -48- 201224143 片顯示所有澱粉粒內和所有澱粉粒表面中的 示存在著活性形式的GFP。 第11圖顯示從表現介於GBSS與GFP 的澱粉粒所分離出之GFP的純度與濃度鑑定 第11A圖顯示SDS-PAGE (含十二烷基 烯醯胺）膠體電泳且以考馬斯藍（coomasie 膠體。 第11B圖顯示該膠體經西方墨點法處理 道（1):馬鈴薯塊莖蛋白萃取物，該蛋白 由含有凝血酶辨識序列之連接子片段而與 GFP。跑道（2 ):自相同植物中所純化出 萃取物。跑道（3):於該澱粉經凝血酶剪 所釋出的蛋白。箭頭指出對應於GBSS-GFP 釋出之GFP的位置。 第12圖顯示利用GATEWAY技術構 Entk- Palifermin質體的步驟，該質體允許 合蛋白的基因轉殖植物，於該質體中，震 palifermin )編碼序列係藉由含有腸激酶辨 子片段而與GBSSI接合。製造PCR產物， 對應於含有腸激酶辨識序列的帕利夫明編碼 的序列片段係皆夾在attBl與attB2序列之 重組酶的存在下藉由重組反應使該片段插^ 質體中，而產生 pDONR-Entk-Palifermin 質 與含有GBSS編碼序列且在該GBSS編碼序 綠色螢光，表 間之融合蛋白 〇 硫酸鈉的聚丙 blue )染色之 後的照片。跑 萃取物表現藉 GBSS接合的 之澱粉的蛋白 切且經離心後 融合蛋白和所 築該pGBSS- 產生可表現融 亥帕利夫明（ 識序列之連接 该PCR產物係 序列，且所有 間。於相應之 、pDONR/Zeo 體。上述質體 列前方具有與 -49- 201224143 花椰菜嵌紋病毒之35S啓動子可操作接合之GATEWAY重 組匣的質體（此實例中所使用的質體係pGBSS gtw)進行 新的重組反應，允許創造出質體（pGBSS-Entk-Palifermin )，該質體（pGBSS-Entk-Palifermin )含有 GBSS-帕利夫 明融合蛋白之編碼序列且藉由腸激酶辨識序列隔開GBSS 和帕利夫明，所有編碼序列受該3 5 S啓動子控制。 第13圖顯示依照與第12圖之方法類似的方法利用 GATEWAY 技術構築該 pGBSS-Entk-Mecasermin 質體的步 驟，該質體允許產生可表現融合蛋白的基因轉殖植物，於 該融合蛋白中，美卡舍明（mecasermin)係藉由含有腸激 酶辨識序列之連接子片段與GBSS接合。 第1 4圖顯示依照與第1 2圖之方法類似的方法利用 GATEWAY技術構築該pGBSSI-Entk-Albumin質體的步驟 ，該質體允許產生可表現融合蛋白的基因轉殖植物，於該 融合蛋白中，成熟的白蛋白（albumin )係藉由含有腸激 酶辨識序列之連接子片段與GBSSI接合。 第1 5圖顯示依照與第1 2圖之方法類似的方法利用 GATEWAY技術構築該pGBSS-Entk-GFP質體的步驟，該 質體允許產生可表現融合蛋白的基因轉殖植物，於該融合 蛋白中，綠色螢光蛋白（GFP)係藉由含有腸激酶辨識序 列之連接子片段與GBSS接合。 -50- 201224143 參考文獻

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Patentln version 3.3 2613 DNA人造序列 |gGBSS之編碼序列、選殖位置之殘餘部分、 凝血酶剪切位置及GFP之編碼 <220> <221> <222> <223> CDS (1).. (2613)完整嵌合序列 <220> < 2 21> misc^feature <222> (1).7(1830) <220><221> 來源 <222> (1).. (1830) <223> <220> <221> <222> <223> Η拉伯茶(Arabidopsis thaliana) misc—recomb (1831).,(1872)選殖位置之殘餘部分

0 12 3 2 2 2 2 2 2 2 2 V V V V 蛋白結合 (1873)..(1893)凝血酶結合位置 <220> <221> misc_feature <222> (1894)..(2613)<223> GFP之編碼序列 <400> 1 atg gca act gtg act get tet tet aac ttt gtg tea aga act tea ett 43 Met Ala Thr Val Thr Ala Ser Ser Asn Phe Val Ser Arg Thr Ser Leu 15 10 15 ttc aac aat cat ggt get tet tea tgc tet gat gtc get cag att acc 96

Phe Asn Asn His Gly Ala Ser Ser Cys Ser Asp Val Ala Gin lie Thr 20 25 30 tta aaa ggc caa tee ttg act cat tgt ggg tta agg tea ttc aac atg 144

Leu Lys Gly Gin Ser Leu Thr His Cys Gly Leu Arg Ser Phe Asn Met 3S 40 45 gtg gat aac ett cag agg aga tet caa get aaa cct gtt tet get aaa 192

Val Asp Asn Leu Gin Arg Arg Ser Gin Ala Lys Pro Val Ser Ala Lys 50 55 60 tee tea aag aga tet tet aaa gtt aag act get ggt aag att gtg tgt 240

Ser Ser Lys Arg Ser Ser Lys Val Lys Thr Ala Gly Lys lie Val Cys 65 70 75 80 gag aaa gga atg tet gtg att ttt att gga get gaa gtt ggt cca tgg 288

Glu Lys Gly Met Ser Val lie Phe lie Gly Ala Glu Val Gly Pro Trp 85 90 95 agt aaa act ggt ggt ett ggt gat gtt etc ggt ggt eta ect cca get 336

Ser Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Fro Fro Ala 100 105 110 ett get get aga ggc cac cgt gtg atg aca att tgt cct egg tat gac 384

Leu ilia Ala Arg Gly His Arg Val Met Thr lie Cys Pro Arg Tyr Asp 115 120 125 caa tat aaa gat get tgg gac act tgt gtt gtg gtt cag ate aaa gtt 432

Gin Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Cys Val Val Val Gin lie Lys Val 130 135 140 ggg gat aaa gtt gag aat gtt cgt ttc ttc cat tgc tac aaa ega gga 480

Gly Asp Lys Val Glu Asn Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly 145 150 155 160 gtt gat cgt gtc ttt gtt gac cat cca ate ttt ett get aag gtt gtg 528

Val Asp Arg Val Phe Val Asp His Pro lie Phe Leu Ala Lys Val Val 165 170 175 ggc aaa aca gga tee aaa ate tat ggt cct ata act gga gta gac tac 576

Gly Lys Thr Gly Ser Lys lie Tyr Gly Pro lie Thr Qly Val Asp Tyr 180 185 190 aat gac aac caa etc egg ttc agt ttg ttg tgt cag get get ett gag 624

Asn Asp Asn Gin Leu Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gin Ala Ala Leu Glu 195 200 205 gca cca cag gtt ctg aac ctg aac age age aag tac ttc tet gga cca 672

Ala Pro Gin Val Leu Asn Leu Asn Ser Ser Lys Tyr Phe Ser Gly Pro 210 215 220 tat ggt gaa gat gta gtc ttt gtt gee aat gac tgg cac act get eta 720

Tyr Gly Glu Asp Val Val Phe Val Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu 225 230 235 240 ett cca tgt tac etc aaa tet atg tat caa tee ege gga gtc tac atg 768

Leu Pro Cys Tyr Leu Lys Ser Met Tyr Gin Ser Arg Gly Val Tyr Met 245 250 255 2- aat gca aag gtg gtc ttc tgc att cac aac ata gcc tac cag gga aga 816

Asn Ala Lys Val Val Phe Cys lie His Asn lie Ala Tyr Gin Gly Arg 260 265 270 ttt gcc ttt gat gac tat tcc ctt etc aac ttg ccc ate age ttt aaa 864

Phe Ala Phe Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Asn Leu Pro lie Ser Phe Lys 275 280 285 agt tet ttc gac ttc atg gac ggg tat gaa aag cca gta aaa gga egg 912

Ser Ser Phe Asp Phe Met Asp Gly Tyr Glu Lys Pro Val Lys Gly Arg 290 295 300 aaa att aac tgg atg aag get gca att ctg gaa get: cac cgt gtc tta 960

Lys lie Asn Trp Met Lys Ala Ala lie Leu Glu Ala His Arg Val Leu 305 310 315 320 aca gtt agt cca tac tac get caa gaa etc ate tet gga gtt gat aga 1008

Thr Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Gin Glu Leu He Ser Gly val Asp Arg 325 330 335 ggc 9tg gaa ttg cat aaa tat ctt ega atg aaa aca gtt tcc gga att 1056

Gly Val Glu Leu His Lys Tyr Leu Arg Met Lys Thr Val Ser Gly lie 340 345 350 att aat gga atg gat gtt caa gaa tgg aac ccg tet act gac aag tac 1104

He Asn Gly Met Asp Val Gin Glu Trp Asn Pro Ser Thr Asp Lys Tyr 35S 360 365 ate gat ate aaa tac gat att acc act gtt aca gat gefc aaa cca ttg 1152 lie Asp lie Lys Tyr Asp He Thr Thr Val Thr Asp Ala Lys Pro Leu 370 375 380 ate aaa gaa gca ctt cag get get gtt gga ctt ccc gtg gac agg gat 1200 lie Lys Glu Ala Leu Gin Ala Ala Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Asp 385 330 395 400 gtc ccg gtt ate ggt ttc ata ggg aga ttg gag gag cag aag ggt tet 1248

Val Pro Val lie Gly Phe lie Gly Arg Leu Glu Glu Gin Lys Gly Ser 405 410 415 gat att eta gtg gaa get att tcc aag ttc atg ggg etc aat gtt cag 1256

Asp lie Leu Val Glu Ala lie Ser Lys Phe Met Gly Leu Asn Val Gin 420 425 430 atg gtt ate ctt ggg act gga aag aag aag atg gag get cag att ctt 1344

Met Val lie Leu Gly Thr Gly Lys Lys Lys Met Glu Ala Gin lie Leu 435 440 445 gaa eta gaa gag aag ttc cca ggg aag geg gtt gga gtg geg aaa ttc 1392

Glu Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gly Lys Ala Val Gly Val Ala Lys Phe 450 455 460 aac gtg cca ttg get cat atg ate act get gga get gac ttc ate att 1440

Asn Val Pro Leu Ala His Met lie Thr Ala Gly Ala Asp Phe lie lie 465 470 475 480 gtc cca age agg ttt gag ccg tgt ggt etc att cag ctg cac gca atg 1488

Val Pro Ser Arg Phe Olu Pro Cys Gly Leu lie Gin Leu His Ala Met 201224143 485 490 495 aga tat gga acc gtc cct att gtg gca tct act ggt gga ctt gtg gac 1536

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Val Thr Arg Ala Val Ala Val Tyr Qly Thr Ser Ala Met Gin Glu Met 545 550 555 560 gtc aag aac tgc atg gac caa gac ttc tcc tgg aag gga cct geg agg 1728

Val Lys Asn Cys Met Asp Gin Asp Phe Ser Trp Lys Gly Pro Ala Arg 565 570 575 ttg tgg gag aag gt:a eta ttg tcc ett aat gtg geg gga agt gaa gcc 1776

Leu Trp Glu Lys Val Leu I>eu Ser Leu Asn Val Ala Gly Ser Glu Ala 580 585 590 gga acc gag ggt gaa gag ata get cct ctg gcc aag gag aac gta geg 1824

Gly Thr Glu Gly Glu Glu He Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala 595 600 605 aeg ccg agt eta gag tta tea aca agt ttg tac aaa aaa gca ggc tta 1872

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€90 695 70Q ege tac ccc gac cac atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg 2160

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• 4 - 201224143

Pro Glu Gly Tyr val Gin Glu Arg Thr lie Phe Phe I*ys Asp Asp Gly 725 730 735 aac tac aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val 740 745 750 aac cgc ate gag ctg aag ggc ate gac ttc aag gag gac ggc aac ate Asn Arg lie Glu Leu hye Gly lie Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn lie 755 7β0 765 ctg ggg cac aag ctg gag tac adc tac aac age cac aac gtc tdt ate Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr lie 770 775 780 atg gcc gac aag cag aag aac ggc ate aag gtg aac ttc aag ate cgc Met Ala Asp Lys Gin Lys Asn Gly He Lys Val Asn Phe Lys lie Arg 785 790 795 800 cac aac ate gag gac ggc age gtg cag etc gcc gac cac tac cag cag His Asn lie Glu Asp Gly Ser Val Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin 805 810 8X5 aac acc ccc ate ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac tac Asn Thr Pro lie Gly Asp Qly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyx 820 825 830 ctg age acc cag tcc gcc ctg age aaa gac ccc aac gag aag cgc gat Leu Ser Thr 61n Ser Ala I«eu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp 835 840 845 cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc gcc gcc ggg ate act etc ggc His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly lie Thr Leu Gly 850 855 8β0 atg gac gag ctg tac aag t:aa Met Asp Glu Leu Tyr Lys 865 870 2256 2304 2352 2400 2448 2496 2544 2592 2613 <210> 2 <211> 870 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223>合成構築體 <400> 2 Met Ala Thr Val Thr Ala Ser Ser Asn Phe Val Ser Arg Thr Ser Leu 15 10 15 Phe Asn Asn His Gly Ala Ser Ser Cys Ser Asp Val Ala Gin lie Thr 20 25 30 Leu Lys Gly Gin Ser Leu Thr His Cys Gly Leu Arg Ser Phe Asn Met 35 40 45 -5- 201224143

Val Asp Asn Leu Gin Arg Arg Ser Gin Ala Lys Pro Val Ser Ala Lys 50 55 60

Ser Ser Lys Arg Ser Ser Lys Val Lys Thr Ala Gly Lys lie Val Cys 65 70 75 80

Glu Lys Gly Met Ser Val lie Phe lie Gly Ala Glu Val Gly Pro Trp 85 90 95

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Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Met Thr He Cys Pro Arg Tyx Asp 115 120 125

Gin Tyx Lys Asp Ala Trp Asp Thr Cys Val Val Val Gin lie Lys Val 130 135 140

Gly Asp Lys Val Glu Asn Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lye Arg Gly 145 150 X55 160

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Leu Pro Cys Tyr Leu Lys Ser Met Tyr Gin Ser Arg Gly Val Tyr Met 245 250 255

Asn Ala Lys Val Val Phe Cys lie His Asn lie Ala Tyr Gin Gly Arg 260 265 270

Phe Ala Phe Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Aen Leu Pro lie Ser Phe Lys 275 280 285

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Gly Val Glu Leu His Lys Tyx Leu Arg Met Lys Thr val Ser Gly lie 340 345 350 lie Asn Gly Met Asp Val Gin Glu Trp Asn Pro Ser Thr Asp Lys Tyr 355 360 365 -6 lie Asp lie Lys Tyr Asp 工le Thr Thr Val Thr Asp Ala Lys Pro Leu 370 375 380 lie Lys Glu Aid Leu Gin Ala Ala Val Gly Leu Pro Val Asp Arg Asp 385 390 395 400 val Pro Val lie Gly Phe lie Gly Arg Leu Glu Glu Gin Lys Gly Ser 405 4X0 415

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Thr Pro Ser Leu Glu Leu Ser Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Leu 6X0 615 620

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Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro 675 680 685

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Asn Thr Pro lie Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr 820 825 830

Leu Ser Thr Gin Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp 835 840 845

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<212> PRT <213> 環狀芽孢桿菌(Bacillus circuhas) <220> <221> 結合 <222> (1)..(104) <223>環糊精葡萄糖基轉移酶之澱粉結合域(SBD) <400> 3

Ser Gly Asp Gin Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr 1 5 10 15

Ala Leu Gly Gin .Asn Val Tyr Leu Thr Gly Ser Val Ser Glu Leu Gly 20 25 30

Asn Trp Asp Pro Ala Lys Ala lie Gly Pro Met Tyr Asn Gin Val Val 35 40 45 201224143

Tyr Gin Tyr Pro Asn Trp Tyr Tyr Asp Val Ser Val Pro Ala Gly Lys 50 55 60

Thr lie Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gin Gly Ser Thr Val Thr Trp 65 70 75 80

Glu Gly Gly Ser Asn His Thr Phe Thr Ala Pro Ser Ser Gly Thr Ala 85 90 95

Thr lie Asn Val Asn Trp Gin Pro 100 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> 黑麯菌(Aspergillus niger) <220> <221> 結合 <222> (X)..(109) <223> 葡萄糖澱粉酶之澱粉結合域6BD) <400> 4

Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala X 5 10 15

Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn lie Tyr Leu Val Gly Ser lie Ser Gin 20 25 30

Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly lie Ala Leu Ser Ala Asp Lys 35 40 45

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Gly Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe lie Arg He Glu Ser Asp Asp Ser 65 70 75 80

Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gin Ala 85 90 95

Cys Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg 100 105 <210> 5 <211> 104

<212> PRT <213> 高溫财熱菌之嗜熱硫梭抱菌(Γ hamoanaeiDbacter ihermosuliirDgenes) <220> <221> 結合 <222> (1)..(104) <223>嗜熱硫梭孢菌之環糊精葡萄糖基轉移酶的澱粉結合域⑦BD) -9 - 201224143 <400> 5

Thr Gly Asn Gin He Cys Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Ser Thr IS 10 15

Val Tyr Gly Glu Asn Val Tyr Leu Thr Gly Asn Val Ala Glu Leu Gly 20 25 30

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Thr lie Gin Phe Lys Phe lie Lys Lys Asn Gly Asn Thr lie Thr Trp 65 70 75 80

Glu Gly Gly Ser Asn His Thr Tyr Thr Val Pro Ser Ser Ser Thr Gly 65 90 95

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<212> PRT <213> 嗜熱脂肪芽抱桿菌Φacillis stearolheraophibs) <220> <221> 結合 <222> (1)..(105) <223>嗜熱脂肪芽孢桿菌脂環糊精葡萄糖基轉移酶的澱粉結合域(SBD) <400> 6

Thr Asn Asp Gin Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr 1 5 10 15

Asn heu Gly Gin Asn lie Tyr lie Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly 20 25 30

Asn Trp Asp Thr Ser Lys Ala lie Gly Pro Met Phe Asn Gin Val Val 35 40 45

Tyr Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr lie Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lya 50 55 60

Thr lie Glu Phe Lys Phe lie Lys Lys Asp Ser Gin Gly Asn Val Thr 65 70 75 80

Trp Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr 85 B0 95

Gly Lys lie lie Val Asp Trp Gin Asn 100 105 <210> 7

-10- 201224143 <211> 180 <212> DNA<213> 辣板Capsicum annuum ) <220> <22X> CDS <222> (1)..(180) <223>辣椒蛋白P541之質粒體轉運胜肽的編碼序列 <400> 7 atg gaa acc ctt eta aag cct ttt cca tet cct tta ett tee att cct Met Glu Thr Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Pro Leu Leu Ser lie Pro 1 5 10 15 act cct aac atg tat agt ttc aaa cac aac tee act ttt cca aat cca Thr Pro Asn Met Tyr Ser Phe Lys His Asn Ser Thr Phe Pro Asn Pro 20 25 30 acc aaa caa aaa gat tea aga aag ttc cat tat aga aac aaa age agt Thr Lys Gin Lys Asp Ser Arg Lys Phe His Tyr Arg Asn Lys Ser Ser 35 40 45 aca cat ttt tgt age ttt ctt gat tta gca ccc atg Thr His Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Met 50 55 60 4β

BS 144 180 <2X0> 8 <211> 60 <212> PRT <213> 辣椒(Capsicum annuum ) <400> 8

Met Glu Thr Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Pro Leu Leu Ser lie Pro 15 10 15 Thr Pro Asn Met Tyr Ser Phe Lys His Asn Ser Thr Phe Pro Asn Pro 20 25 30 Thr Lys Gin Lys Asp Ser Arg Lys Phe His Tyr Arg Asn Lys Ser Ser 35 40 45 Thr His Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Met 50 55 60 -11 -

Claims (1)

1. 201224143 七、申請專利範圍： 1. 一種自基因轉殖植物或經培養之基因轉殖細胞獲 得經純化之重組蛋白之方法，該方法包含下述步驟： a) 使帶有融合蛋白的該經培養之細胞或累積澱粉之 植物組織均質化，其中該融合蛋白包含： i) 位於羧端區域中對應欲純化之該重組蛋白的多 胜肽； ϋ) 位於該胺端區域中的澱粉結合域， iii ) 含有蛋白酶剪切位置之連接片段，該連接片 段係位於該胺端區域與該羧端區域之間； b ) 離心且選出含有該澱粉粒蛋白的最濃稠部分； c) 利用能辨識該連接片段所包含之該剪切位置的該 蛋白酶處理步驟b)所選出的該部分； d) 離心且選擇該上清液； e ) 可隨意地純化該上清液所含之該重組蛋白達高等 級。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，該方法包含下述 前置步驟： a) i) 藉由利用轉形載體使野生型植物轉形而獲得 基因轉殖植物，該轉形載體包含植物表現啓動子，該植物 表現啓動子係與該融合蛋白之編碼序列操作性接合，該融 合蛋白自5’至P方向包含引導從細胞溶質轉運至質粒體之 轉運作用的胜肽、澱粉結合域、蛋白酶剪切位置及與該欲 純化之該重組蛋白對應的多胜肽； 201224143 a) ϋ) 於適合該先前步驟所獲得之該基因轉殖植物 生長的條件下培養該基因轉殖植物。 3-如申請專利範圍第2項之方法，其中該澱粉結合 域係係細菌澱粉酶結合域。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該細菌澱粉 酶結合域係選自序列編號：3、序列編號：4、序列編號： 5及序列編號：6所組成之群組。 5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中用於製備該 基因轉殖植物的該表現載體包含位於該啓動子與該澱粉結 合域之間且與合適之轉運胜肽對應的編碼部分。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該轉運胜肽 係序列編號：8所示者。 7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該澱粉結合 域係屬植物蛋白。 8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該融合蛋白 包含該植物蛋白之完整多胜肽序列，該植物蛋白係與澱粉 結合，且在該細胞溶質中合成的該植物蛋白係呈現包含該 植物蛋白前驅物形式之完整胺基酸序列的前驅物形式。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中用於製備該 基因轉殖植物的該表現載體包含該與澱粉結合的植物蛋白 之完整天然編碼序列，且該完整天然編碼序列包括與該質 粒體轉運胜肽對應之序列部分。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該包含澱粉 結合域之植物蛋白可選自下述群組：澱粉粒結合性澱粉合

   -2- 201224143 成酶（GBSS)、葡聚糖二激酶（R1)、由ΒΕΙ、BEIIa及 BEIIb組成的澱粉分枝酶群組中一者、由SSI、SSII及 SS III組成的可溶性澱粉合成酶群組中一者及質粒體澱粉 磷酸化酶。 11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中唯於選自 下述群組中由天然編碼序列所合成的酶具有澱粉結合域且 具有能作爲將該初合成之前驅物引導至質粒體之轉運胜肽 的傳訊序列之情況下，該植物蛋白之編碼序列與該選自下 述群組之酶的天然編碼序列具有60%同源性，該群組係： 澱粉粒結合性澱粉合成酶（GBSS)、葡聚糖二激酶（R1 )、由BEI、BEIIa及BEIIb組成的澱粉分枝酶群組中一 者、由SSI、SSII及SSIII組成的可溶性澱粉合成酶群組 中一者及質粒體澱粉磷酸化酶。 12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該植物蛋 白之編碼序列係選自下述群組之酶的天然編碼序列，該群 組係：澱粉粒結合性澱粉合成酶（GBSS)、葡聚糖二激 酶（R1)、澱粉分枝酶I(BEI)、澱粉分枝酶IIa(BEIIa )、澱粉分枝酶Ib(BEIIb)、可溶性澱粉合成酶SSI、 可溶性澱粉合成酶SSII、可溶性澱粉合成酶SSIII及質粒 體澱粉磷酸化酶。 13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該植物蛋 白係澱粉粒結合性澱粉合成酶（GBSS)。 1 4 ·如申請專利範圍第1至1 3項中任一項之方法， 其中步驟c)所使用的該蛋白酶係於該連接片段之辨識序 -3- 201224143 列的最後一個胺基酸之後進行剪切。 15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該蛋白酶 係腸激酶，該連接片段具有位於羧端的腸激酶辨識序列 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，且於該蛋白酶作用之前，所欲之 多胜肽的胺端係與該腸激酶辨識序列直接接合。 16. 如申請專利範圍第1 5項之方法，其中所欲之多 胜肽係選自帕利夫明（palifermin )、美卡舍明（ mecasermin)及白蛋白（albumin)所組成之群組。 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該具有澱 粉結合域之植物蛋白係阿拉伯芥（) 之澱粉粒結合性澱粉合成酶（GBSS)。 1 8 .如申請專利範圍第1至1 3項中任一項之方法， 其中步驟c)所使用之該蛋白酶係凝血酶（thrombin)。 1 9.如申請專利範圍第1至1 3項中任一項之方法， 其中引導該融合蛋白表現的.該啓動子係花椰菜嵌紋病毒之 35S啓動子。 20·如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該具有澱 粉結合域之植物蛋白係阿拉伯芥之澱粉粒結合性澱粉合成 酶（GBSS )，該連接片段含有凝血酶剪切位置，與該連 接片段接合的所欲之多胜肽係綠色螢光蛋白（GFP )，引 導該融合蛋白表現的該啓動子係RNA 35S之啓動子，該 融合蛋白之編碼序列係序列編號：1所示之序列，且所合 成之該融合蛋白係序列編號：2所示之序列。 2 1 ·如申請專利範圍第2至1 3項中任一項之方法，

   -4- 201224143 其中係藉由利用載體獲得該基因轉殖植物，該載體自 v至 3'方向包含允許於植物體內表現的啓動子且該啓動子與該 融合蛋白之編碼序列操作性接合，該融合蛋白自胺基至羧 基方向包含細胞溶質-質粒體轉運胜肽、澱粉結合域、含 有蛋白酶剪切位置之連接片段及該與欲純化之該重組蛋白 對應的多胜肽。 22. 如申請專利範圍第1至1 3項中任一項之方法， 其中係藉由利用選自大小分離法、免疫吸附法、離子交換 法及螢光偵測法所組成的群組之技術進行該可隨意之步驟 e ) ° 23. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之方法， 其中於進行施用該蛋白酶之步驟c)之前，先對步驟b) 所獲得之澱粉粒進行酶降解處理或物理性斷裂處理以破裂 該澱粉粒。 24. 如申請專利範圍第1至1 3項中任一項之方法， 其中用於獲得該基因轉殖植物的植物種類係選自稻米、大 麥、小麥、玉米、馬鈴薯、菸草、番茄及阿拉伯芥所組成 之植物群組。 25. 如申請專利範圍第丨至1 3項中任—項之方法， 其中該方法之步驟a)所實施的該累積澱粉之植物組織係 選自塊莖、葉、果實及種子之群組。 2 6. —種用於如申請專利範圍第1至25項中任—項 之方法使植物轉形之表現載體，該表現載體自5,至3'方向 包含允許於植物體內表現的啓動子，且該啓動子與該融合 -5- 201224143 蛋白之編碼序列操作性接合，該融合蛋白自胺基至羧基方 向包含細胞溶質-質粒體轉運胜肽、澱粉結合域、含有蛋 白酶剪切位置之連接片段及該與欲純化之該重組蛋白對應 的多胜肽。 27.如申請專利範圍第26項之載體，其中該載體係 質體。 28·如申請專利範圍第27項之載體，其中與該融合 蛋白之編碼序列操作性接合的該啓動子係35S啓動子。 29. 如申請專利範圍第27項之載體，其中與澱粉結 合的該植物蛋白之天然編碼序列包含該細胞溶質-質粒體 轉運胜肽序列及該澱粉結合域。 30. 如申請專利範圍第29項之載體，其中與澱粉結 合的該植物蛋白係澱粉粒結合性澱粉合成酶（GBSS ) » 3 1 ·如申請專利範圍第27至30項中任一項之載體， 其中該連接片段包含凝血酶或腸激酶的辨識位置之編碼序 列。 32.如申請專利範圍第27至30項中任一項之載體， 該載體包含多胜肽之編碼序列，該多胜肽之編碼序列係與 該連接片段之羧端接合，且該多胜肽係選自綠色螢光蛋白 (GFP )、帕利夫明（palifermin )、美卡舍明（ mecasermin)、人膜島素前驅物胜肽及成熟人白蛋白（ a 1 b u m i η )所組成之群組。 3 3 .如申請專利範圍第2 7至3 0項中任一項之載體’ 其中attB序列、即attB 1序列和attB2序列係分別位於該 201224143 融合蛋白之編碼序列的兩側。 34. —種用於如申請專利範圍第2至25項中任一項 之方法之宿主生物’該宿主生物係經如申請專利範圍第26 至3 3項中任一項之載體轉形。 35. 如申請專利範圍第34項之宿主生物，該宿主生 物係農桿菌。 3 6 . —種經如申請專利範圍第3 4或3 5項之宿主生物 轉形之植物細胞。 3 7 · —種由如申請專利範圍第3 6項之細胞所獲得的 基因轉殖植物、該植物之種子或繁殖物質。 38. —種基因轉殖植物、該植物之種子或繁殖物質， 其特徵在於該植物、種子或繁殖物質之基因體中自V至V 方向倂有允許於植物體內表現的啓動子，且該啓動子與該 融合蛋白之編碼序列操作性接合，該融合蛋白自胺基至羧 基方向包含細胞溶質-質粒體轉運胜肽、澱粉結合域、含 有蛋白酶剪切位置之連接片段及該基因轉殖植物所屬之植 物種類天然不會表現的蛋白之多胜肽序列。 39. —種用於產生如申請專利範圍第26至33項中任 一項之載體之中間載體，其特徵在於該中間載體自V至V 方向包含允許於植物體內表現的啓動子，該啓動子係與能 與澱粉結合的植物蛋白之編碼序列操作性接合，該植物蛋 白之編碼序列隨後接續片段，且attRl序列和attR2序列 係分別位於該片段之兩側。 40. 如申請專利範圍第39項之載體，其中該載體係 201224143 質體》 41. 如申請專利範圔第40項之載體，其中該編碼的 植物蛋白係澱粉粒結合性澱粉合成酶（GBSS )。 42. 如申請專利範圍第41項之載體，其中該澱粉粒 結合性灘粉合成酶（GBSS)係阿拉伯芥C Arabidopsis thaliana)或馬鈴馨（So/ant/m iMfteroiw/n)之殿粉粒結合 性澱粉合成酶。 43. —種經如申請專利範圍第39至42項中任一項之 載體轉形之細菌宿主。 44. 如申請專利範圍第43項之宿主’該宿主係屬大 腸桿菌菌種。