TW201217338A - Crystalline oxalate salts of a diamide compound - Google Patents

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201217338 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於新穎二醯胺化合物之結晶草酸鹽。本發明 亦係關於含有該等結晶鹽之醫藥組合物；適用於製備該等 結晶鹽之製程及中間體；及使用該等結晶鹽例如治療肺病 症之方法。 【先前技術】 2010年10月28日公開之WO 2010/123766 A1揭示預期可 用作治療諸如慢性阻塞性肺病（C0PD)及哮喘之肺病症之 治療劑之二酿胺化合物。在本申請案中揭示之一種化合物 為聯苯-2-基胺基甲酸羥基_2_(8_羥基_ 2-側氧基-1，2-二氫喹啉_5_基）乙胺基]甲基丨苯胺曱醯基）丁 基]曱胺甲醯基}乙基）哌啶_4_基酯，其化學結構由式工表 示：

通吊使用吸入裝置（諸如乾粉吸入器（Dpi)、定量吸入器 (MDI)或噴霧吸入器）直接將用於治療肺病症之治療劑投與 至乎吸道中。當調配用於該等裝置之治療劑時，宜具有穩 疋結晶形式之治療劑，其可微粉化或以其他方式調配及儲 存而不顯著分解或損失結晶度。特定言之，、结晶形式不應 158525.doc 201217338 為過度吸濕的或易潮解的。另外，結晶形式應具有相對較 南之溶點（亦即約高於13〇t )以使加工及儲存期間之熱降解 降至最低。 然而’形成有機化合物之結晶形式非常不可預料。不存 在預測有機化合物之形式是否將結晶之可靠方法。此外， 不存在預測結晶形式是否將具有用於例如醫藥吸入裝置所 需之物理性質之方法。 目前，尚未有聯苯-2-基胺基曱酸-羥 基-2-(8-羥基_2_側氧基_丨，2·二氫喹啉_5基）乙胺基]甲基}苯 胺甲醯基）丁基]甲胺曱醯基}乙基）哌啶-4-基酯之結晶形式 揭示。因此，需要此化合物之穩定結晶形式。特定言之， 需要穩定、不潮解的結晶形式，其具有可接受程度之吸濕 性及相對較高之熔點。 【發明内容】 本發明係關於呈結晶固態形式之聯苯_2_基胺基曱酸卜 (2-{[4-(4-{[(i?)-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基 _ι，2-二氫喹啉· 5-基）乙胺基]甲基}苯胺甲醯基）丁基]甲胺甲醯基丨乙基）哌 定4基ga之草酸加成鹽。該等結晶草酸鹽包括結晶草酸鹽 異丙醇溶劑合物鹽及結晶草酸鹽水合物鹽。 - 已發現當暴露於大氣濕度時，本發明之某些結晶草酸鹽 ， 為不潮解的且具有可接受之吸濕性。此外，本發明之結晶 草酸鹽具有至少為約160°c之相對較高之炼點。 因此，在一個態樣中，本發明提供聯苯_2_基胺基子酸 ^-{[…(‘{[⑻冬經基-2-(8,基_2_側氧基心，二氫喹 158525.doc ·4· 201217338 啉-5-基）乙胺基]f基}苯胺甲醯基）丁基]平胺甲醯基}乙基） 派唆-4-基醋之結晶草酸鹽。 在一個實施例中’本發明之結晶草酸鹽為異丙醇溶劑合 物’其特徵在於11.66±0.20、15.75士0.20、19.55±0.20、 23.00±0,20及23.45±0,20之2Θ值處包含繞射峰之粉末乂射線 繞射圖s普。此結晶形式或多晶型物已命名為形式1。 在另一實施例中’本發明之結晶草酸鹽為水合物，其特 徵在於 15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20 及 23.73±0.20 之2Θ值處包含繞射峰之粉末χ射線繞射圖譜。此結晶形式 或多晶型物已命名為形式2。 在一個實施例中，本發明之結晶草酸鹽為藉由暴露聯 笨2-基胺基甲酸羥基_2_(8_羥基_2·側 氧基-1，2-二氫喹啉_5_基）乙胺基]甲基}苯胺曱醯基）丁基]曱 胺甲醯基}乙基）娘咬_4_基酯之結晶草酸鹽於約至約 100%相對濕度約i至約5天之時間而製備之水合物3 在另一態樣中，本發明提供包含本發明之結晶草酸鹽之 組合物》 在個貫施例中，組合物為包含（a)本發明之結晶草酸鹽 及（b)醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。 在另一實施例中，組合物為包含（a)本發明之結晶草酸 鹽；(b)類固㈣炎劑或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合 物’及（c)醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。 在另一態樣中，本發明提供本發明之結晶草酸鹽用於治 療0 158525.doc 201217338 貫施例中，本發明之結晶草酸鹽用於治療肺病 ;在特疋貫施例中，肺病症為慢性阻塞性肺病。在另一 特定實施例中，肺病症為哮喘。 在個實施例中，本發明提供治療肺病症之方法，該方 法包含向患者投與本發明之結晶草酸鹽。 在另#施例中’本發明提供治療肺病症之方法，該方 法包3向患者投與⑷本發明之結晶草酸鹽；及（b)類固醇 ’肖炎劑或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。 在另-實施例中’本發明提供在哺乳動物中產生支氣管 擴張之方法，該方法包含藉由吸入向哺乳動物投與本發明 之結晶草酸鹽。 在另-實施例中，本發明提供本發明之結晶草酸鹽用於 製造藥劑》 ' 本發明之其他態樣及實施例在本文中揭示。 【實施方式】 本發明之各種態樣參考附圖來說明。 本發明係關於呈結晶固態形式之聯苯-2-基胺基甲酸 Μ2_{[4-(4-_·2_經基_2_(8_經基_2側氧基十2_二氫喹 琳-5-基）乙胺基W基}苯胺f醯基）丁基胺甲醯幻乙 …-基酯之草酸加成鹽，包括其異丙醇溶劑合物及：合 物。除非另外指出，否則本發明之結晶草醆鹽可呈現為一 或多種相異結晶固態形式且本發明涵蓋所有該等形式，勺 括各形式之混合物。 ^ 在-個實施例中，本發明提供本文中稱為形式^之第一 158525.doc

201217338 結晶草酸鹽固態形式之式〗化合物之草酸加成鹽。形式1為 異丙醇溶劑合物形式。 在另一實施例中，本發明提供本文中稱為形式2之第二 結晶草酸鹽固態形式之式I化合物之草酸加成鹽。形式2為 ' 水合物。 式1化合物含有一個具有（及）組態之對掌性中心。然而， 熟習此項技術者將瞭解除非另外指出，否則少量（$1)立體異 構體可存在於本發明之組合物中’其限制條件為組合物之 效用整體看來不因存在該異構體而消除β 式I化合物及其中間體已使用市售MDL® ISIS/Draw軟體 (Symyx，Santa Clara，California)之 AutoNom特徵命名。 定義 當描述本發明之化合物、組合物、方法及製程時，除非 另外指出’否則以下術語具有以下涵義。 術語「熔點」意謂藉由差示掃描熱量測定觀察到最大吸 熱熱流之溫度。 術語「微粉化」或「呈微粉化形式」意謂至少約90%顆 粒之直徑小於約10 μιη之顆粒。 • 術語「溶劑合物」意謂一或多個溶質分子（亦即式I化合 - 物之草酸鹽）及一或多個溶劑分子之締合物，諸如複合物 或聚集物。代表性溶劑包括，例如水及異丙醇。當溶劑為 水時，形成之溶劑合物為水合物。 術語「治療有效量」意謂當投與需要治療之患者時足以 有效治療之量。 158525.doc 201217338 術語「治療（treating或treatment)」奇含胃 亦即預防性治療患者或 (a)預防疾病或醫學病況發生 個體； (b)改善疾病或醫學病況，亦即消 1月除患者之疾病或醫學 病況或導致其消退； ⑷抑制疾病或醫學病況，亦即減緩或阻止患者之疾病 或醫學病況之發展；或 (d)減輕患者中之疾病或醫學病況之症狀。 術語「單位劑型」意謂適用於對患者給藥之物理個別單 位，亦即各單位含有預定數量之推算單獨或與一或多種其 他單位組合產生治療效果之治療劑。舉例而言’該等單位 劑型可為乾粉吸入器膠囊、纟自定量吸入器之定劑量、膠 囊、錠劑、藥丸及其類似物。 本發明之代表性結晶草酸鹽 已發現聯苯-2-基胺基曱酸1-(2-{[4_(4-{[(/?)-2·羥基-2-(8-羥基-2-側氧基―丨’^二氫喹啉_5_基）乙胺基]曱基丨苯胺曱醯 基）丁基]曱胺曱醯基}乙基）哌啶基酯之結晶草酸鹽以至 少兩個不同結晶形式存在。出於本發明之目的，此等形式 在本書中確定為形式1及形式2。 形式1為異丙醇溶劑合物’其特徵在於在約11.66±0.20、 15.75±〇·2〇、19.55±0.20、23.0〇±〇.2〇 及 23.45±0.20 之 2Θ 值 處具有顯著繞射峰之粉末Χ射線繞射（PXRD)圖譜。形式i 之差不掃描熱量測定（DSC)跡線在約162〇C至約164°C下（例 如在約163.3 °C下）在吸熱熱流中展現峰。形式1包含每莫耳 158525.doc 201217338 當量之式i化合物草酸鹽約丨至約2莫耳當量之異丙醇，包 括約1.25至約1.75莫耳當量，諸如J 5莫耳當量。 形式2為水合物，其特徵在於在約15 32±〇 μ、 16.90±0.2〇、19.25±0.2〇及 23 73±〇 2〇之“值處具有顯著繞 射峰之粉末乂射線繞射（PXRD)圖譜。形式2之差示掃描熱 量測定（DSC)跡線在約162。〇至約16代下（例如在^ ^ 162.6°C下）在吸熱熱流中展現峰。形式2包含每莫耳當量之 式I化合物草酸鹽約]至約3莫耳當量之水，包括約15至約2 莫耳當量。 ~ 本發明之結晶草酸鹽通常含有每莫耳當量之式〗化合物 約0.90至約LiO莫耳當量之草酸；包括每莫耳當量之式%化 合物約0.95至約L05莫耳當量之草酸。在特定實施例中， 本發明之草酸鹽含有每莫耳當量之式丨化合物約丨莫耳當量 之草酸。使用習知方法（諸如nc NMR、元素分析、離;分 析或HPLC)測定莫耳比。 酸二水合物及聯 本發明之結晶草酸鹽通常使用草酸或草 苯-2-基胺基曱酸1_(2_{[4_(4_{[(Λ)_2_羥基·2_(8_羥基·2_側 氧基-1，2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基}苯胺甲醯基）丁基]曱 胺甲醯基}乙基）哌啶-4-基酯製備。草酸及草酸二水合物可 例如自Sigma-Alddch，St. Louis，ΜΟ購得。用於本發明之 側氧基-1’2-二氫啥琳-5·基）乙胺基]甲基}笨胺甲酿基）丁基] 甲胺甲醯基}乙基）哌啶_4_基酯可容易地使用以下實例中所 述之程序或藉由使用本申請案之先前技術部分中所述之共 158525.doc 201217338 同讓渡之美國申請案中所述之程序自市售起始物質及試劑 製備。 用於製備本發明之結晶草酸鹽之方法或製程在實例中提 供。通常，聯苯-2-基胺基甲酸卜(2-{[4-(4-{[(幻-2-羥基_2_ (8症基2側氧基_ι，2 - 一氫喧琳-5-基）乙胺基]曱基}苯胺曱 酿基）丁基]甲私·甲酿基}乙基）派咬基醋與約〇 90至約1.1 莫耳當量（諸如1.0莫耳當量）之草酸或草酸二水合物於稀釋 劑中接觸。一般地，此反應在介於約〇°C至約60。(：（包括約 2〇°C至約35°(：，諸如約25t：至約3(rc)之範圍内之溫度下 進行。用於此反應之適合惰性稀釋劑包括（但不限於）視情 况3水之甲醇、異丙醇及其類似物。視情況，反應混合物 可使用常規設備超音波處理以促進結晶。 製備本發明之結晶草酸鹽之製程可視情況包括使用晶種 :主要製備特定結晶形式。舉例而言，藉由使用形式之之 晶種’結晶草酸鹽水合物鹽可製備為具有基本上與晶種 (亦即形式2)相同之形—、 ^式 虽最初形成本發明之結晶草酸鹽 時可使用該等晶種，岑装 4具了用於再結晶結晶或部分結晶形 i常藉由不搜拌且不應用冷卻之情況下減緩結晶來驾 備晶，。經由例證說明，為獲得晶種，式ι化合物通常4 足以提供溶解之溫度下溶解於稀釋劑中。舉例而言，式 物冷解於熱1Q%(v/v)水於甲醇中且隨後使其冷卻至月 圍溫度。使此溶液線悍 y ’’又式發以提供本發明之結晶草酸鹽c 所得晶體藉由過濾或其

他㈢知方法分離。或者，晶種可I 158525.doc

-10- 201217338 先前結晶物質製備中獲得。 已發現當結晶物質在高濕度下在環境溫度下儲存時，形 式2之結晶度改良。舉例而言，當形式2之樣品在84%相對 濕度下在環境溫度下健存時’如藉由樣品2PXRD圖譜量 測之結晶度在約5天之時期内改良。 組合物、組合及調配物 本發明之結晶草酸鹽可與其他物質（諸如治療劑、载 劑、賦形劑、稀釋劑、溶劑及其類似物）組合以形成組合 物。 在一個實施例中’本發明之結晶草酸鹽以載劑或賦形劑 調配以形成醫藥組合物或調配物。該等醫藥組合物通常將 含有治療有效量之本發明之結晶草酸鹽。然而在某些情況 下’醫藥組合物可含有多於治療有效量，例如濃縮總成 分；或少於治療有效量，例如意欲多元投與之單位劑型。 醫藥組合物通常將含有約0.01至約95重量％之本發明之 結晶草酸鹽，包括例如約0·05至約3〇重量％或約〇ι至約⑺ 重量％。 該等醫藥組合物可使用習知載劑或賦形劑製備。特定載 劑或賦形劑、或載劑或賦形劑之組合之選擇，將取決於各 種因素，諸如投與模式、或正治療之疾病或醫學病況。製 備醫藥組合物之許多適合載劑及賦形劑可自市售商品取 得。舉例而言，物質可購自Sigma(St. Louis, Μ0)。製備適 用於特疋投與模式之醫藥組合物之程序及物質在醫藥技術 中有所描述，包括例如：及⑽以以印a a" I58525.doc 201217338 〇/ P/mrwijrc;;，第 20 版，Lippincott Williams & White, Baltimore，Maryland (2000);及 H.C. Ansel 等人， Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery ，第 7版 ’ Lippincott Williams & White，Baltimore， Maryland (1999) ° 醫藥學上可接受之載劑之代表性實例包括（但不限於）： (1)糖’諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；（2)澱粉，諸如玉米澱 粉及馬鈐薯澱粉；（3)纖維素及其衍生物，諸如羧曱基纖維 素納、乙基纖維素及乙酸纖維素；（4)粉末黃蓍膠；（5)麥 芽’（6)明膠；（7)滑石；（8)固化油及蠘，諸如可可脂及栓 劑纖，（9)液體油（在室溫下），諸如花生油、棉籽油、紅花 油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；〇〇)二醇，諸如 丙二醇；（11)多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及 聚乙二醇；（12)酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；（13)瓊 月曰，（14)緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氮氧化鋁；5)褐藻 酸；（16)無熱原質水；（17)等滲鹽水；（18)林格氏溶液 (Ringer’s s〇lution) ; (19)乙醇；（2〇)磷酸鹽緩衝液；^。壓 縮推進氣體’諸如氣敦碳化物及氫氟碳化物；及（22)用於 醫藥组合物之其他無毒相容物質。 邊藥組合物通常藉由完全地且均勻地混合或摻合本發明 之、’Ό aa草I鹽與醫藥學上可接受之載劑及任何其他視情況 選用之成份來製備。若必需或需要，則隨後可將所得經均 勻L s之/¾ a物使用習知程序及設備成形或載人鍵劑、膠 囊、藥丸、罐、藥筒、分配器及其類似物中。 158525.doc

-12- 201217338 在一個實施例中，醫藥組合物適合用於吸入投與。用於 吸入投與之醫藥組合物通常呈氣溶膠或粉末之形式。該等 組合物一般使用吸入器傳送裝置（諸如定量吸入器（mdi)、 乾粉吸入器（DPI)、喷霧吸入器或類似傳送裝置）投與。 在特定實施例中，醫藥組合物藉由使用乾粉吸入器吸入 來投與。該等乾粉吸入器通常以在吸氣期間分散於患者氣 流中的自由流動粉末形式投與醫藥組合物。為獲得自由流 動粉末組合物，治療劑通常以適合賦形劑（諸如乳糖、澱 粉、甘露糖醇、右旋糖、聚乳酸（PLA)、聚丙交酯-共-乙 交酯（PLGA)或其組合）調配。通常，治療劑經微粉化且與 適合載劑組合以形成適用於吸入之組合物。因此，在一個 實施例中’本發明之結晶草酸鹽呈微粉化形式。 用於乾粉吸入器之代表性醫藥組合物包含乳糖及呈微粉 化形式之本發明之結晶草酸鹽。該乾粉組合物可例如藉由 合併乾燥磨成粉的乳糖與治療劑且隨後乾摻和組份來製 造。組合物接著通常載入至乾粉分配器中或至與乾粉傳送 裝置一起使用之吸入藥筒或膠囊中。 適用於藉由吸入投與治療劑之乾粉吸入器傳送裝置在此 項技術中有所描述且該等裝置之實例可自市售商品取得。 舉例而言，代表性乾粉吸入器傳送裝置或產品包括 Aeohzer(Novartis) ^ Airmax(IVAX) ^ ClickHaler(Innovata Biomed) ' Diskhaler(GlaxoSmithKIine) ^ Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline) ^ Easyhaler(Orion Pharma) ^ Eclipse (Aventis)、FlowCaps(Hovione)、Handihaler(Boehringer 158525.doc 13 201217338

Ingelheim)、Pulvinal(Chiesi)、Rotahaler(GlaxoSmithKline)、 SkyeHaler/Certihaler(SkyePharma) 、 Twisthaler( Schering-Plough) > Turbuhaler(AstraZeneca)、Ultrahaler(Aventis)及 其類似物》 在另一特定實施例中，醫藥組合物藉由使用定量吸入器 吸入來投與。該等定量吸入器通常使用壓縮推進氣體排出 實測數量之治療劑。因此，使用定量吸入器投與之醫藥組 合物通常包含治療劑於液化推進劑中之溶液或懸浮液。可 使用任何適合液化推進劑，包括氫氟烷烴（HFA)，諸如 1，1，1，2-四氟乙烷（HFA 134a)及 1，1，1，2,3,3,3-七氟-正丙烷 (HFA 227);及氯氟碳化物，諸如cclf。在特定實施例 中，推進劑為氫氟烷烴。在某些實施例中，氫氟烷烴調配 物含有共溶劑（諸如乙醇或戊烷）及/或界面活性劑（諸如脫 水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂及甘油）。 用於疋量及入器之代表醫藥組合物包含約重量％至 ^重量从本發明之結晶草酸鹽：約⑼^至⑽重量 之乙醇，及約〇重量％至約5重量％之界面活性劑；其餘 部分為職推進#卜該等組合物—般係藉由添加經冷珠或 加壓之氫氟烧煙至含有活性劑、& # + +、n β 乙知（右存在）及界面活性 幻（右存在）之合適容器中來製 衣侑马氟備懸洋液，將治療 劑被粉化且隨後與推進劑組 .、 中，1通當开4一 B 、，且°物接考載入氣溶膠罐 通㊉形成疋罝吸入器裝置之一部分。 適用於藉由吸入投與治療劑之定量吸入 術中有所描述且該等裝置 技 置之貫例可自市售商品取得。舉例 158525.doc 201217338 而言，代表性定量吸入器裝置或產品包括AeroB id吸入器 系統（Forest Pharmaceuticals)、Atrovent 吸入氣溶膠 (Boehringer Ingelheim)、Flovent(GlaxoSmithKline)、Maxair 吸入器（3M)、Proventil吸入器（Schering)、Serevent吸入氣 溶膠（GlaxoSmithKline)及其類似物。 在另一特定實施例中’醫藥組合物藉由使用喷霧吸入器 吸入投與。該等噴霧器裝置通常產生高速空氣流，其引起 醫藥組合物呈霧化形式噴霧送至患者之呼吸道中因此， 當調配用於喷霧吸入器時，治療劑可溶解於適合載劑中形 成溶液。或者，治療劑可經微粉化且與適合載劑組合，以 形成微粉化顆粒之懸浮液〇 用於喷霧吸入器之代表性醫藥組合物包含等滲水性懸浮 液，其包含約0.05 pg/mL至約1〇 mg/mL之呈微粉化形式之 本發明之結晶草酸鹽《在一個實施例中，溶液pH值為約4 至約6。 適用於藉由吸入投與治療劑之喷霧器裝置已說明於相關 技術中，且s亥等裝置之實例可自市售商品取得。舉例而 s，代表性喷霧器裝置或產品包括Respimat s〇ftmist吸入 器（Boehringer Ingelheim)、AERx 肺傳送系統（Aradigm

Corp·)、PARI LC Plus重覆使用式噴霧器（pari GmbH)及其 類似物》 若需要，本發明之結晶草酸鹽可與一或多種其他治療劑 組合投與。在本發明之此態樣中，本發明之結晶草酸鹽與 其他治療劑物理性混合’以形成含有兩種藥劑之組合物； 158525.doc 201217338 或各藥劑同時或相繼分別向患者投與。 舉例而言’本發明之結晶草酸鹽可使用習知程序及設 備，與第二治療劑組合，形成包含本發明之結晶草酸鹽及 第二治療劑之組合物。另外，治療劑可與醫藥學上可接受 之載劑組合，以形成包含本發明之結晶草酸鹽、第二治療 齊J及醤藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。在此實施例 中，通常混合或摻合組合物之組份，以產生物理混合物。 物理混合物接著使用任何本文中所描述之途徑向患者投 與。 —或者，治療劑在投與患者之前可保持分離且獨立。在此 實：例中’治療劑在投與之前不物理混合在一起但作為獨 立藥劑或組合物同時或相繼投與。舉例而言，本發明之結 晶草酸鹽可與另—治療劑同時或相繼藉由使用吸入傳送裝 置（其使用用於各治療劑之獨立區室（例如泡殼包裝））吸入 來投與。或者，組合可使用獨立傳送裝置投與，亦即用於 各。療劑之-種傳送裝置1外，治療劑可藉由不同投與 途徑傳送，亦即_種藉由吸人傳送且另—藉由口服傳送。 何/、本發明之結晶草酸鹽相容之治療劑可與該等鹽組 合使用。在特定實施例中，第二治療劑為藉由吸人有效地 投與之治㈣卜經由例證朗，可使用之治療劑之代表性 ㈣&括c但不限;:消炎劑’諸如類固醇消炎劑（包括皮 口醇及糖皮質激素）、非類固醇消炎劑（奶八1〇)及 P制劑，支氣官擴張劑，諸如pDE3抑制劑、腺普2b調節劑 及β2腎上腺素激導性受體促效劑；抗感染劑，諸如革蘭氏 158525.doc 201217338 陽性（Gram-positive)抗生素、革蘭氏陰性（Gram_negative) 抗生素及抗病毒劑；抗組織胺劑；蛋白酶抑制劑；傳入阻 斷劑，諸如D2促效劑及神經激肽調節劑；及簟毒鹼受體拮 抗劑（抗膽驗激導性劑）^該等治療劑之許多實例在此項技 術中已知。此等其他治療劑之適合劑量亦在此項技術中已 知且通常介於約〇.〇5微克/日至約500毫克/日之範圍内。在 一個實施例中，第二治療劑適用於治療肺病症。 在特定實施例中’本發明之結晶草酸鹽與類固醇消炎劑 組合投與。代表性類固醇消炎劑包括（但不限於）：二丙酸 倍氣米松（beclomethasone dipropionat);布地奈楝 (budesonide);丙酸布替可特（butixocort propionate); 20/?-16α，17α-[亞 丁基雙（氧基）]-6α，9α-二氟·1ΐβ_羥基 _17β_ (曱硫基）雄留-4-稀-3-酮（RPR-106541);環索奈德；地塞米 松（dexamethasone) ; 6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基艘基）氧 基]-11β-羥基-16α-曱基-3-側氧基雄错- ΐ，4-二烯_17β·硫代 甲酸^氟甲基酯；6α，9α-二氟-11β-羥基_ΐ6α-甲基_17〇1_[(4-甲基-1,3-»塞唾-5-叛基）氧基]-3-側氧基雄甾-ΐ，4-二稀_ΐ7β_ 硫代甲酸5*-氟甲基酯；6α，9α-二氟-11β-羥基_ΐ6α-曱基_3-側氧基-17α-丙醯基氧基雄甾-1，4-二稀-17β-硫代甲酸（s)-(2-側氧基四氫呋喃基）酯；氟尼縮松（fiunisolide);糠 酸氟替卡松（fluticasone furoate);丙酸氟替卡松（fiuticasone propionate);甲基去氫皮質醇（methyl prednisolone);糠酸 莫美他松（mometasone furoate);去氫皮質醇；強的松 (prednisone);羅氟奈德（rofleponide) ; ST-126 ;曲安奈德 158525.doc -17. 201217338 (triamcinolone acetonide);艿甘缸， )，及其類似物及其醫藥學上可接 受之鹽及溶劑合物。該等類固醢准 貝醇沩炎劑可自市售商品取得 或可使用習知程序及試劑製偌。與7 , 丨取備舉例而言，類固醇消炎劑 之製備及用途在2003年3月γ α沒从 乃25日頒佈之美國專利第 6,537,983 號、2004年 6月 15 日滿你 + * m $ H項佈之美國專利第6,750,210 B2號、細4年7月6日頒佈之美國專利第PM· μ號、 2005年2月22日頒佈之美國專利第6 858 596 B2號、雇年 9月5日頒佈之U.S. 7，101，866 B2及其中引用之參考文獻中 有所描述。 當使用類EI醇消炎劑時’其通常以#與本發明之結晶草 酸鹽共投與時產生治療上有益效應之量投與^常類固 醇消炎劑投與量足以提供每劑量約〇.〇5叫至約5〇〇㈣之藥 劑。 代表性醫藥組合物包括（但不限於）以下實例： A. 乾粉組合物 將本發明之微粉化結晶草酸鹽（100 mg)與乾燥磨成粉的 乳糖（25 g)摻合。接著將此經摻合之混合物以足以提供每 劑量約10 至約500 pg之本發明之結晶草酸鹽之量載入可 剝離泡殼包裝之個別泡殼中。泡殼之内容物使用乾粉吸入 器投與。 B. 乾粉組合物 將本發明之微粉化結晶草酸鹽（1 g)與乾燥磨成粉的乳糖 (200 g)摻合以形成結晶草酸鹽與乳糖之重量比為1:2〇〇之 總成分。將經摻合之組合物塞入能夠傳送每劑量約1〇畔 I58525.doc 201217338 至約500 pg之本發明之結晶草酸鹽之乾粉吸入裝置中。 c. 乾粉組合物 將本發明之微粉化結晶草酸鹽（100 mg)及微粉化類固醇 消炎劑（500 mg)與乾燥磨成粉的乳糖（3〇 g)摻合。接著將 此經摻合之混合物以足以提供每劑量約1〇叫至約5〇〇叫之 本發明之結晶草酸鹽之量載入可剝離泡殼包裝之個別泡殼 中。泡殼之内容物使用乾粉吸入器投與。 D. 定量吸入器組合物 將本發明之微粉化結晶草酸鹽（1〇 g)分散於藉由溶解即 填脂（0.2 g)於脫礦物質水（2〇〇 mL)中製備之溶液中。將所 得懸浮液噴霧乾燥且接著微粉化以形成微粉化組合物，其 包含平均直徑小於約1 ·5 μιη之粒子。接著將微粉化組合物 載入含有加壓1，1，1，2-四氟乙烷之定量吸入器藥筒中，當 藉由定量吸入器投與時，其量足以提供每劑量約1〇叫至 約500 pg之本發明之結晶草酸鹽。 效用 聯苯-2-基胺基曱酸[(幻_2_羥基_2_(8_羥基_ 2-側氧基-1，2-二氫喹啉_5_基）乙胺基]曱基}苯胺甲醯基）丁 基]曱基胺曱醯基}乙基）旅啶_4_基酯同時擁有β2腎上腺素 激導性受體促效劑及蕈毒鹼受體拮抗劑活性，且因此預期 此化合物之草酸鹽適用作治療藉由h腎上腺素激導性受體 或蕈毒驗受體所介導之醫學病況（亦即藉由以β2腎上腺素激 導性受體促效劑或蕈毒鹼受體拮抗劑治療而改善之醫學病 況）之治療劑。 158525.doc 19· 201217338 該等醫學病況在此項技術中已知，如藉由例如以下教示 例示· Eglen^ A * Muscarinic Receptor Subtypes: Pharmacology and Therapuetic Potential, DN&P 10(8), 462-469 (1997) \ Emilien 等人 > Current Therapeutic Uses and Potential of beta-Adrenoceptor Agonists and Antagonists, European J· Clinical Pharm., 53(6)，389-404 (1998);及其中引用之參 考文獻。舉例而言，該等醫學病況包括例如：與可逆性氣 管阻塞相關之肺病症或疾病，諸如慢性阻塞性肺病、哮 喘、支氣管炎、肺氣腫、肺纖維化，等等病症。慢性阻塞 性肺病或COPD在此項技術中已知包括各種呼吸病況（其包 括慢性阻塞性支氣管炎及肺氣腫），如藉由Barnes, C/zroWc Obstructive Pulmonary Disease, N. Engl. J. Med., 2000: 3 43:269-78之教示及其中引用之參考文獻例示。其他病況 包括早產、抑變症、充血性心臟衰竭、皮膚病（例如發炎 性、過敏性、牛皮癬性及增生性皮膚病）、其中需要降低 胃液酸性之病況（例如消化性潰瘍及胃潰瘍）及肌肉萎縮 病。 在一個態樣中，本發明提供本發明之結晶草酸鹽用於治 療。舉例而言，本發明之結晶草酸鹽可用於治療肺病症， 諸如慢性阻塞性肺病或哮喘。 當用以治療肺病症時，本發明之結晶草酸鹽投與需要治 療之患者。在一個實施例中，結晶草酸鹽藉由吸入投與。 本發明之結晶草酸鹽可依每日多次劑量（例如每日兩次或 每曰三次）、依每曰一次劑量（例如每曰一次）、依每週單次 158525.doc -20- 201217338 劑直或視需要投與…般1於治療肺病症之劑量將介於 約10¼克/日至約L000微克/日之範圍内。 田藉由吸入投與哺乳動物時，本發明之結晶草酸鹽通常 引起支氣管擴張，且因此本發明之結晶草酸鹽適用作在哺 乳動物（諸如人類、犬、天竺鼠、大鼠，等等動物）中引起 支氣管擴張之藥劑。在此實施例中，本發明之結晶草酸鹽 通常藉由讓哺乳動物吸入可以引起支氣管擴張之量來投 藥。一般，引起支氣管擴張之劑量將介於約0 25卜岁“至 約20 Kg/kg之範圍内。 當用作治療劑時，本發明之結晶草酸鹽視情況與一或多 種其他治療性組合投與。特定言之，藉由與類固醇消炎劑 起投與本發明之結晶草酸鹽，三重肺治療法（亦即h腎上 腺素激導性受體促效劑活性、蕈毒鹼受體拮抗劑活性及消 炎活性）可僅使用兩種治療劑實現。因為含有兩種治療劑 之醫藥組合物（及組合）與含有三種治療劑之組合物相比通 常較易於調配及/或投與，所以該等兩組份組合物提供優 於含有三種治療劑之組合物之顯著優勢。因此，在特定實 施例中，本發明之醫藥組合物、組合及方法進一步包含類 固醇消炎劑或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。 本發明結晶草酸鹽之性質及效用可使用熟習此項技術者 已知之各種活體外及活體内檢定得以證明。舉例而言，代 表性檢定在以下實例中加以描述。 實例 提供以下實例以說明本發明之各種代表性實施例及態樣 158525.doc 21 201217338 且除非特別指示，否則不意欲以任何方式限制本發明之範 以下實例中所用之所有試劑、起始物質及溶劑購自商業 供應商（諸如 Sigma-Aldrich Chemical Company，St. Louis， MO)且除非另外指示，否則無需進一步純化即可使用。以 下縮寫用於稀釋劑：DCM=二氣甲烷；DMF=#,iV-二曱基甲 醯胺；DMSO=二甲亞颯；EtOAc=乙酸乙酯；MeOH=甲 醇；及THF=四氫呋喃。 除非另外指示，否則4 NMR光譜在400 MHz Varian AS400光譜儀上記錄。化學位移以ppm為單位相對於作為 内標之四曱矽烷（TMS)報導為δ值。耦合常數（·/值）以赫茲 (Hz)為單位提供且多重性使用以下縮寫報導：s =單峰，d= 雙峰，t=三重峰，q=四重峰，m=多重峰，br=寬峰，nd=未 測定。 液相層析質譜分析（LC-MS)條件 使用Agilent 1100液相層析系統-G13 12A二元栗（Agilent Technologies)、ZORBAX快速解析 3.5 μιη Rx，Bonus-RP 管 柱（3.5 μιη 粒徑；2.1 mm><50 mm)(Agilent Technologies)及 API 150EX 單四極 LC/MS 質譜儀（Perkin-Elmer Sciex Instruments)獲得LC-MS資料。所用溶劑系統為：

溶劑 A : 98% 水及 2°/。乙腈（v/v)+l mL/L TFA

溶劑 B : 90% 乙腈及 10% 水（v/v)+l mL/L TFA 流動速率：500 pL/min 梯度： （方法10至90) : 10% B至90% B歷時3分鐘 158525.doc -22- 201217338 (方法2至90) : 2% B至90% B歷時3分鐘 (方法10至70): 10% B至70% B歷時3分鐘。 HPLC條件 使用 HP 1100 系列 HPLC 系統（Agilent Technologies)及 ZORBAX快速解析 3.5 μιη Rx，Bonus-RP管柱（3.5 μηι粒徑； 2.1 mm><50 mm)(Agilent Technologies)或 Ascentis Express C18 HPLC管柱（2.7 0111粒徑 ’ 3.0 mm><3 cm)進行HPLC。所 用溶劑系統為： 溶劑 A : 98%水及2%乙腈〇/乂)+11111^/[丁？八

溶劑 B : 90%乙腈及 10%水（v/v)+i mL/L TFA 流動速率：500 pL/min 梯度： （方法1〇至50) : 10% B至50% B歷時6分鐘 (方法10至70): 10% B至70% B歷時6分鐘 (方法2至90): 2% B至90% B歷時<5分鐘。 實例1 製備3-[4-(聯苯-2-基胺甲醯基氧基）派咬_ι_基】丙酸 在50C下加熱聯苯-2 -基胺基曱酸α辰。定_4_基醋（5〇.〇 g， 168.7 mmol)(參見例如2006年2月16曰公開之美國專利公開 案第 2006/0035931 A1 號）及丙烯酸（15.1 mL，219.3 mmol) 於DCM(500 mL)中之攪拌溶液隔夜。在減壓下濃縮反應混 合物且溶解殘餘物於MeOH(600 .mL)中。在75°C下加熱所 得溶液2 h且隨後使其在室溫下靜置約48 h。所得固體藉由 過滤'收集、以MeOH洗蘇且乾燥得到標題化合物（61.5 g， 99%產率）。 158525.doc •23- 201217338 實例2 製備5-甲胺基戊酸曱酯鹽酸鹽 在100C下加熱1-曱基-2-痕°定酮（4.40 mL，40.0 mmol)於 含水氫氧化鈉（4 Μ，11.0 mL，44.0 mmol)中之攪拌溶液15 h °將反應混合物冷卻至室溫且隨後以濃鹽酸酸化至pH值 為2。隨後在減壓下濃縮混合物得到呈帶粉紅色的白色固 體狀之粗產物5-甲胺基戊酸。向粗產物5-曱胺基戊酸中添 加 Me〇H(40.0 mL，987 mmol)及濃鹽酸（0.33 mL，4.0 mmol)。在60°C下加熱所得混濁溶液39 h，此時LC-MS展 示剩餘起始物質。另外添加濃鹽酸（0.33 mL，4.0 mmol)且 在60°C下加熱所得混合物33 h且隨後在65°C下再加熱24 h ° LC-MS展示剩餘起始物質。在減壓下濃縮反應混合物 且添加氣化氫於MeOH( 1.25 M)中之溶液至殘餘物。在 60°C下加熱所得混合物72 h，此時藉由LC-MS觀察不到剩 餘起始物質。在減壓下部分濃縮反應混合物且藉由過濾、 以MeOH洗滌來移除形成之固體物質。隨後在減壓下濃縮 濾液以提供呈淡黃色固體狀之5_甲胺基戊酸曱酯鹽酸鹽 (7.57 g，1〇〇%產率）。 LC-MS(方法 2至 90): Rt 1.10 min; w/z 146.4 [M+H]+ 〇 H NMR (CD3OD) δ 4.86 (s), 3.66 (s), 3.30 (t), 3.〇〇 (t), 2.69 (s)，2.41 (t)，1.71(m)。 實例3 製備5-( {3-[-(聯苯-2-基胺甲酿基氧基）〇底咬基】丙醢基j甲 胺基）戊酸甲醋 158525.doc -24- 201217338 在室溫下攪拌5-甲胺基戊酸甲酯鹽酸鹽（7.27 g，40.0 mmol)、3-[4-(聯苯-2-基胺甲醯基氧基）哌啶-基]丙酸 (13.3 g，36.0 mm〇i)及ι_羥基_7_氮雜苯并三唑（5 14 g， 37.8 mmol)於 DCM(160 mL)及二曱基吡啶（12.5 mL，108 mmol)中之混合物3 h。添加iV-(3·二甲胺基丙基）_#，_乙基碳 化一亞胺鹽酸鹽（10.4 g，54.0 mmol)且在室溫下揽拌所得 混合物2 h。添加碳酸氫鈉飽和水溶液（約丨〇〇 mL)且分離各 層。以DCM(5 0 mL)萃取水層且合併有機層、經硫酸鈉乾 燥、過濾且在減壓下濃縮。藉由矽膠急驟層析法（3 〇%至 100% EtOAc於己烷中；隨後2%至i〇〇/0 MeOH於DCM中）純 化殘餘物得到呈淡黃色稠油/白色固體狀之標題化合物 (12.38 g，69%產率）。 LC-MS(方法 2至 90) : Rt 2.43 min ; m/z 496.6 [M+H]+。 !H NMR (CDC13) δ 8.10 (d, 1H), 7.40 (m, 6H), 7.20 (m, 2H), 6.58 (s, 1H), 4.74 (m, 1H), 3.66 (d, 3H), 3.37 (t, 1H), 3.29 (m5 1H), 2.97 (s, 2H), 2.91 (s, 1H), 2.70 (m, 4H), 2.49 (m，2H)，2.34 (m，4H)，1.92 (m，2H)，1.60 (m，5H)。 實例4 製備5-({3_[-(聯苯-2-基胺甲醯基氧基）哌啶基】丙醯基）甲 胺基）戊酸 向5-({3-[4-(聯苯-2-基胺甲醯基氧基）哌啶基]丙醯基卜 甲胺基）戊酸甲酯（10.21 g，20.60 mm〇i)、第三丁醇（20 mL)及水（20 mL)之混合物中添加1 · 1 Li〇H :水之混合物 (1.97 g，41.2 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物4 h且隨後 158525.doc -25- 201217338 使用鹽酸水溶液（1 N)調整混合物之pH值至約pH 2。以 Μ㈠80 mL 2-人）萃取水層且合併有機層、經硫酸鈉乾 燥過;慮且在減壓下濃縮得到呈灰白色多泡沐固體狀之標 題化合物（12.23g’定量）(含有殘餘第三丁醇）。 LC MS(方法 2至 90) . Rt 2,32 min ; m/z 482.4 [M+H]+。 實例5 製備2-(4-硝I苯基，夂二氧雜環戊烷 在120 C下在配備有迪恩_斯達克分水器trap) 之燒瓶中加熱對硝基苯曱路（HH.5 g，672 mm〇l)、乙二醇 (112 mL)及對甲苯磺酸（12 8 g，67 2 於曱苯（8〇〇 mL)中之攪拌溶液4 h。冷卻至室溫之後，在減壓下濃縮反 應混合物。向殘餘物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液（800 mL) 且在至溫下攪拌此混合物15 min。藉由過濾分離所得固體 且在真空下乾燥得到呈黃色固體狀之標題化合物（121.8 g ’ 92%產率）。 H NMR (DMSO-d6): 5=8.12 (d, 2H), 7.59 (d, 2H), 5.78 (s, 1H), 3.8-4.0 (m，4H)。 實例6 製備4-(1,3-二氧雜環戊烷_2_基）苯胺 在乾氮氣下向二氧化鉑（227 mg，1.00 mmol)及碳酸氫鈉 (420 mg’ 5.00 mmol)之混合物中添加2-(4-硝基苯基）-l，3-二氧雜環戊烷（976 mg，5.00 mmol)於 EtOH(30.0 mL)中之 溶液。以氫氣鼓泡反應混合物15 min且隨後在氫氣氛（氣 球）下揽拌2 h。反應混合物隨後經矽藻土墊以MeOH洗滌

I58525.doc ^26· S 201217338 來過濾。在減壓下濃縮濾液得到標題化合物（〇 8〇| g，96% 產率）。 實例7 製備聯苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4·(1，3-二氧雜環戊烷_2_ 基）苯胺甲醯基）丁基】甲胺甲醢基}乙基）哌啶_心基酿 向5-({3-[4-(聯苯-2-基胺甲醯基氧基）哌啶_丨_基]丙醯基} 甲胺基）戊酸（2.33 g，4.84 mmol)、4-(1，3-二氧雜環戊烧·2_ 基）苯胺（800 mg，5 mmol)及愚#-二異丙基乙胺26 , 7.26 mmol)於DCM(48.4 mL)中之攪拌溶液中添加卜羥基_7_ 氮雜苯并三唑（692 mg，5.08 mmol)及#-(3-二甲胺基丙基）_ 乙基碳化二亞胺鹽酸鹽（1.39 g，7.26 mmol)。在室溫下 攪拌所得混合物隔夜。反應混合物隨後以碳酸氫鈉飽和水 溶液洗務、經硫酸鈉乾燥、過濾且在減壓下濃縮得到呈黃 色固體狀之標題化合物（3.04 g，1〇〇%產率）。 LC-MS(方法 10至 70) : Rt 2.67 min ;別/艺 629.6 [M+H]+。 實例8 製備聯苯-2-基胺基甲酸甲醯基苯胺甲醯基）丁 基】甲胺甲酿基}乙基）旅唆_4_基酯 在50 C下加熱聯苯_2_基胺基曱酸ι_(2·{[4_(4_(]，3_二氧 雜環戍烧-2-基）苯胺曱醯基）丁基]曱胺曱醯基丨乙基）哌啶_ 4-基酯（3.04 g，4.84 mmol)於含水鹽酸（1 Μ , 10 mL)及乙 腈（1 0 mL)中之攪拌混合物2 h。在減壓下瀑縮反應混合物 且添加碳酸氫鈉飽和水溶液及1)(：]^至殘餘物。分離各層且 經硫酸納乾燥有機層、過濾且在減壓下濃縮得到標題化合 158525.doc •27· 201217338 物（2.83 g，100%產率）。 LC-MS(方法 10至 70) : Rt2.67min 實例9 製備聯苯·2·基胺基甲酸[(2俱(Μ叫2-(第三丁基二？ 基矽烷氧基)-2*羥基-2_側氧基μ二氫喹啉_5胃基)乙胺 基】甲基卿了基】W甲醯以基财_4基輯 向聯苯-2 -基胺基甲酸m ^ {[4·(4-甲醯基苯胺甲醯基）丁 基]曱胺曱醯基}乙基）。底。定_4_基西t 〇 8 霉知（2.83 g ’ 4.84 mmol)及 5- [(i?)-2 -胺基-1-(第三丁基二甲其^ 、 ^ Τ基矽烷氧基）乙基]-8-羥基- ^嗜琳-2-酮乙酸鹽（1.91 g，4.84 職〇1)於Me0H:DCM 1:1 之混合物（40·0 mL，312 mm〇1)中之攪拌溶液令添加三乙醯 氧基删氫化納（3.08 g ’ 14.5 mm〇1)。在室溫下搜拌反應混 。物2 h且隨後分離各層。以碳酸氫鈉飽和水溶液洗滌有 機層、經硫酸鈉乾燥、過濾且在減壓下濃縮得到黃色固 體。藉由矽膠急驟層析法（〇至3〇% MeOH於DCM+0.5% ΝΗβΗ中）純化固體得到呈黃色固體狀之標題化合物（3 6〇 g ’ 82%產率）。 LC-MS(方法 10至 70) : Rt 2.72 min ; m/z 903.8 [M+H]+。 實例10 製備聯苯基胺基甲酸1-(2_{[4_(4_川及)_2_羥基_2(8羥 基-2-側氧基4,2-二氫喹啉_5_基）乙胺基】甲基}苯胺甲酿基） 丁基]曱胺甲酿基}乙基）略咬-4-基酯二（三氟乙酸）鹽 向聯苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[〇R)-2-(第三丁基二曱 基石夕炫•氧基）-2-(8-經基-2-側氧基- i，2-二氫喧琳_5_基）乙胺 158525.doc 28·

S 201217338 基]曱基}苯胺曱醯基）丁基]甲胺甲醯基}乙基）哌啶·4-基酯 (3,60 g，3.98 mmol)於 DCM:DMF 9:1 之混合物（32.9 mL)中 之攪拌溶液中添加三氬氟化三乙胺（1.95 mL，12.0 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物隔夜且隨後在減壓下濃 縮。藉由HPLC(方法1〇至70)純化殘餘物得到呈白色固體狀 之標題化合物（1.90 g，46%產率）。 LC-MS(方法 1〇至 70) : Rt 2.12 min ; m/z 789.6 [M+H].。 實例11 製備聯苯-2-基胺基甲酸1(2-(14-(4-(1(10-2-羥基-2-(8-羥 基-2-側氧基-i，2-二氫喹啉_5_基）乙胺基】甲基}苯胺甲醯基） 丁基】甲胺甲醯基}乙基）旅啶_4_基酯二氫氟酸鹽 向聯苯-2-基胺基甲酸i_(2_{[4-(4-{[(及)-2-(第三丁基二甲 基矽烷氧基）-2-(8-羥基-2-側氧基-l，2-二氫喹啉-5-基）乙胺 基]曱基}苯胺甲醯基）丁基]甲胺甲醯基丨乙基）哌啶_4_基酯 (3.87 g，4.28 mmol)於 DCM(20 mL)及 DMF(2.5 mL)之混合 物中之搜拌溶液中添加三氫氟化三乙胺（21 ，13 mmol)。在室溫下搜拌所得混合物隔夜。添加dcM(68 mL) 至反應混合物，且隨後在攪拌下逐滴添加EtOAc(68 mL)。 形成的淺色沈澱產生槳液。經中等孔隙率燒結玻璃過濾器 過濾漿液混合物且濾餅以Et〇Ac( 10 mL，2次）沖洗且隨後 在II氣Μ力上壓縮乾燥得到標題化合物（3.73 g , 99%產 率）。 實例12 製備聯苯基胺基甲酸^(之气丨4^4^【(及)_2_羥基2_(8_羥 I58525.doc -29· 201217338 基-2-側氧基-1,2-二氫喹啉-5-基）乙胺基】甲基}苯胺曱醯基） 丁基】f胺甲酿基}乙基）旅咬-4-基酯 將聯苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(及)-2-羥基-2-(8-羥 基-2-側氧基-1,2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]甲基}苯胺甲醯 基）-丁基]曱胺曱醯基}乙基）哌啶-4-基酯二氫氟酸鹽（丨5 2 g’ 16·7 mmol)於含有1〇% 〇.5 μ氫氧化銨於MeOH中之 DCM溶液（150 mL總溶液）中之溶液裝載至粗縫燒結玻璃漏 斗中之矽膠（80 g)上，該漏斗已預先以含有10% 〇·5 μ氫氧 化銨於MeOH中之DCM溶液（200 mL)潤濕。矽膠依次以含 有20〇/〇 0.5 Μ氫氧化銨於MeOH中之DCM溶液（1000 mL，1 次）及含有25% 0.5 Μ氫氧化銨於MeOH中之DCM溶液（1000 mL ’ 1次）沖洗。在減壓下濃縮濾液得到黃色玻璃狀固體 (1 3.6 g)。此物質溶解於DCM(600 mL)中且經燒結玻璃過 濾器過濾所得溶液且以DCM(150 mL，3次）洗滌過濾器。 在減壓下濃縮濾液且使用油浴將殘餘物升溫至50°c且保持 在高真空下隔夜以提供標題化合物（12.7 g)(含有約6重量％ 之 DCM)。 實例13 製備結晶聯苯-2-基胺基甲酸羥基-2-(8-經基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]甲基}苯胺甲醯 基）丁基】甲胺甲醯基}乙基）哌啶_4_基酯草酸犟水合物鹽（形 式2) 向聯苯-2-基胺基曱酸羥基-2-(8-羥 基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉_5_基）乙胺基]甲基}苯胺甲醯基） 158525.doc •30· 201217338 丁基]甲胺甲醯基}乙基)哌啶_4_基酯(0 50 g，〇 63職叫於 THF(5 mL，60 mm〇i)中之攪拌溶液中逐滴添加草酸二水合 物（80 mg，〇·63 mm〇_Me〇H(2 虹，5〇 麵〇1)中之溶 液。立即形成灰白色沈澱，且固體在5 min之時期内聚結 形成黏性球。隨後在6(rc下加熱反應混合物2 h，此時混 合物已形成灰白色極細粒之濃漿。緩慢冷卻此混合物至室 孤且隨後授拌約72 h。試圖過濾混合物但大部分沈殿物穿 過過濾器。隨後在減壓下濃縮濾液形成殘餘物。 移出約四分之一之殘餘物且將其溶解於1〇%(v/v)水於 MeOH中之熱溶液中。冷卻此溶液至室溫但沒有沈澱物形 成。隨後使溶液靜置且在4天之時期内在室溫下緩慢蒸 發，其產生展示一些雙折射率之顆粒。在5天之時期内繼 續攪拌同時不定期超音波處理以形成展示更好雙折射率之 白色漿液物質。藉由過濾收集此物質且在高真空下在室溫 下乾燥2 h得到標題化合物^ PXRD圖譜展示此物質為結晶 或半晶質。 實例14 製備結晶聯苯-2-基胺基甲酸羥基_2_(8_ 羥基-2-側氧基-1，2_二氫喹啉_5_基）乙胺基】曱基丨革胺甲醯 基）丁基]曱胺甲酿基}乙基）派咬-4-基醋草酸鹽水合物鹽（形 式2) 向聯苯-2-基胺基曱酸〖-('{[‘(々-{[(π)-、羥基_2_(8_羥 基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉_5_基）乙胺基]甲基}苯胺甲醯基） 丁基]甲胺甲醯基}乙基）哌啶_4_基酯（0.65 g，0.824 mmol) 158525.doc -31· 201217338 於MeOH(12.4 mL)中之攪拌溶液中逐滴添加草酸二水合物 (104 mg, 0.824 mmol)於水（0.6 mL)中之溶液。立即形成 微黏性沈澱物且添加來自實例13之晶種。在室溫下授掉所 得漿液約72小時且隨後超音波處理5 min。隨後在3〇^下 攪拌漿液隔夜《隨後將漿液冷卻至,攪拌3〇分鐘且過 濾以收集沈澱物。將濾餅風乾丨^且隨後在高真空下在室 溫下乾燥2 h得到標題化合物（705 mg，96%產率，大於99% 純度）。 實例15 暴露形式2至高相對濕度 將聯苯-2-基胺基甲酸-羥基_2_(8_羥 基-2-側氧基-1，2 _二氫喹啉_5_基）乙胺基]曱基}苯胺甲醯 基）丁基]甲基胺曱醯基}乙基）哌啶_4_基酯草酸鹽水合物（約 100 mg，來自貫例14)鋪於置放於培養皿中之濾紙上。培 養皿置放於飽和氣化鉀水溶液（1〇〇 mL)上方之多孔板上之 乾燥器中且乾燥器密封。腔室内之相對濕度如藉由濕度計 量測保持在約84% RH。三天之後，自乾燥器中移除固 體。此物質之PXRD、DSC、7(}八及DMS圖分別展示於圖 4、5、6及7 中。 實例16 製備結晶聯苯-2_基胺基甲酸羥基_2 (8_ 羥基-2-側氧基_1，2_二氫喹啉_5_基）乙胺基】甲基丨苯胺甲醯 基）丁基】甲胺甲醯基}乙基）哌啶_4_基酯草酸鹽水合物鹽（形 式2) 158525.doc •32- 201217338 向聯苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[〇/〇_2·羥基_2_(8_羥 基-2-側氧基-1，2 - 一風啥嚇*-5-基）乙胺基]甲基}苯胺甲酿基） 丁基]曱胺甲醯基}乙基）〇底。定-4-基酉旨（1 ·0 g，1 27 mmol)於 MeOH(19 mL)中之攪拌溶液中逐滴添加草酸二水合物（16〇 mg，1.269 mmol)於水（ΐ·〇 mL)中之溶液。立即形成黏性帶 黃色的沈澱物。在40°C下加熱反應混合物隔夜且隨後超音 波處理5 min。隨後在4〇°C下加熱反應混合物18 h，冷卻至 〇°C，藉由過濾收集沈澱物。乾燥沈澱物得到標題化合物 (1.05 g，93%產率，大於99%純度）。 實例17 暴露形式2至高相對濕度 在乾燥器底部製備過飽和氯化鉀水溶液（在廣泛旋渦之 後保持固體KC1)。將聯苯-2-基胺基曱酸1-(2-{[4-(4-丨 2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基_丨，2_二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱 基}苯胺甲酿基）丁基]甲胺甲醯基}乙基）哌啶_4_基酯草酸 鹽水合物（500 mg ’ 0.569 mmol ;來自實例16)鋪於稱量紙 中且將稱量紙置放於乾燥器中之KC1溶液頂上之多孔塑料 板上且封閉乾燥器。由於KC1溶液之平衡蒸氣壓，乾燥器 内之相對濕度維持於84% RH。在3、5及10天之後得到部 分草酸鹽之PXRD圖譜。pxRD圖譜展示草酸鹽之結晶度改 良了南達5天°結晶度之變化在5至10天為可忽略的。 實例18 製備結晶聯苯_2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{【(1?)-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基4,2-二氫喹啉_5_基）乙胺基】甲基}苯胺甲醯 158525.doc •33- 201217338 基）丁基〗甲胺甲醯基}乙基）派啶-4-基酯草酸鹽水合物鹽（形 式2) 向聯苯-2-基胺基曱酸1-(2-{[4-(4-{[(Λ)-2-經基_2-(8-經 基-2·側氧基-1，2·二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基}笨胺甲醯基） 丁基]曱胺曱醯基}乙基）哌啶-4-基酯（11.0 g，13.9 mmol)於 MeOH(400 mL)中之攪拌溶液中逐滴添加草酸二水合物 (1.758 g，13.9 mmol)於水（22 mL)中之溶液。立即形成黏 性沈澱物。在室溫下攪拌反應混合物隔夜且隨後超音波處 理5 min。隨後在室溫下攪拌反應混合物48 h且隨後在4〇〇c 下加熱8 h。使反應混合物緩慢冷卻至周圍溫度且隨後在 30°C下加熱約72 h。藉由過濾收集沈澱物、以Me〇H(5〇 mL，1次）洗滌且在高真空下乾燥隔夜得到標題化合物 (11.6 g’ 94%產率，大於99%純度）。 實例19 製備結晶聯苯-2-基胺基甲酸[(及)_2羥基_2(8_ 羥基-2_側氧基-l，2-二氫喹啉_5_基）乙胺基1甲基}苯胺甲醯 基）丁基】甲胺甲醯基}乙基）娘啶_4_基酯草酸鹽異丙醇溶劑 合物鹽（形式1) 將結晶聯苯-2-基胺基曱酸經基_2_(8_ 羥基-2-側氧基十^二氫噎琳_5_基）乙胺基]曱基丨苯胺甲酿 基）丁基]甲胺曱II基丨乙基）派。定_4基自旨草酸鹽水合物（約⑽ mg)懸浮於5 %(v/v)水於異丙醇（4⑷中之溶液中且在室溫 三天之後，藉由抽吸過濾來 得到標題化合物（36 mg)。 下以200 rpm攪拌所得漿液。 過渡渡液且在空氣中乾燥固體 158525.doc -34、 201217338 此物質之PXRD、DSC及TGA光譜分別展示於圖1、2及3 中〇 實例20 粉末X射線繞射 使用Rigaku MiniFlex X射線繞射儀執行粉末X射線繞射 分析。X射線源為Cu-A：a輻射（λ=1.5405 1 A)，輸出電壓為 20 kV且電流為15 mA。以Bragg-Brentano幾何學運行儀 器，設定入射、發散及散射狹縫以使樣品之強度達到最 大❶為了量測’將少量粉末（5至25 mg)平緩地壓至單晶矽 樣品夾上形成平滑表面且使其經受X射線曝光。以20_2Θ模 式自2。至40。掃描樣品，2Θ步長為0.03。且掃描速度為每分 鐘2.0。》資料擷取由Rigaku標準測定軟體（版本〖2.0.0)控 制且藉由Jade軟體（版本7.5.1)分析。 形式1及形式2之代表性原始未加工之pxrd圖譜分別展 不於圖1及圖4中。觀察到的形式1及形式2之Pxrd 2Θ峰位 及d間距分別展示於表1及2中（僅列出具有約2〇0/〇或更大之 相對峰高（H%)之峰）。 表1-形式1之PXRD資料 峰號 2-Θ d(A) 高度1 H%2 1 6.44 13.72 519 43.8 2 11.15 7.93 253 21.3 3 11.66 7.58 959 80.9 4 12.92 6.85 434 36.7 5 15.75 5.62 230 19.4 6 17.84 4.97 326 27.5 158525.doc •35- 201217338 峰號 2-Θ d(A) 尚度1 H%2 7 19.19 4.62 653 55.1 8 19.55 4.54 786 66.3 9 23.00 3.86 738 62.3 10 23.45 3.79 1185 100 11 25.61 3.48 263 22.2 距基線之峰高。 與最高峰相比之峰高％。 表2-形式2之PXRD資料 峰號 2-Θ d(A) 1¾度1 H%2 1 7.10 12.44 420 33.6 2 12.68 6.98 704 56.4 3 13.15 6.73 303 24.2 4 13.68 6.47 244 19.6 5 15.32 5.78 1249 100 6 16.58 5.34 465 37.2 7 16.90 5.24 750 60.1 8 17.93 4.94 305 24.4 9 19.25 4.61 839 67.2 10 19.61 4.52 422 33.8 11 20.34 4.36 265 21.2 12 20.93 4.24 301 24.1 13 22.64 3.92 285 22.8 14 23.15 3.84 657 52.6 15 23.73 3.75 1007 80.7 16 25.76 3.46 257 20.6 17 29.78 3.00 309 24.7 距基線之峰高。 與最高峰相比之峰高％。 158525.doc -36- 201217338 實例21 差示掃描熱量測定 使用具有熱分析控制器之TA儀器Q-1 〇〇型模組執行差示 掃描熱量測定（DSC)。收集資料且使用TA儀器熱溶液軟體 • 進行分析。將約2 mg之樣品精確稱入有蓋鋁盤Φ。使用 10°C /min之線性加熱斜坡自周圍溫度至約3〇〇°c評估樣 品。在使用期間以乾氮氣淨化DSC室。形式1及形式2之代 表性DSC跡線分別展示於圖2及圖5中。 DSC跡線證明形式1及形式2具有極好熱穩定性同時熔點 在約162°C至164。(：之範圍内。 實例22 熱解重量分析 使用配備有高解析能力之TA儀器q_5〇〇型模組執行熱解 重量分析（TGA)。收集資料且使用TA儀器熱溶液軟體進行 分析。將重量為約1〇 mg之樣品置於鉑盤上且以高解析-加 熱速率自周圍溫度至3〇〇t掃描。在使用期間以氮氣流淨 化天平及爐腔。形式丨及形式2之代表性TGA跡線分別展示 於圖3及圓6中。 • 實例23 . 動態吸濕評估 使用SGA-10〇系統之ντϊ大氣微量天平（vti c〇rp， eah，FL 33016)執行形式2之樣品之動態吸濕（dms)評 估（亦稱為吸濕-脫濕型態）。使用約1〇 mg2樣品量且在開 始刀析時將濕度设定為周圍值。典型的圓s分析在相 158525.doc •37· 201217338 對濕度（RH)/步驟之掃描速率下由三種掃描組成：周圍濕 度至 5% RH、5% RH至 90% RH、90% RH至 5% RH » 每兩 分鐘量測質量且當5個連續點之樣品質量穩定在在0.01 %之 内時將RH變為下一值（+/-5% RH)。形式2之代表性DMS跡 線展示於圖7中。 圖7之DMS跡線顯示形式2在5% RH至90% RH之濕度範 圍内具有約為1.6重量％之可忽略之重量增加。可逆吸濕/ 脫濕型態顯示形式2擁有可接受之吸濕性且不易潮解。鹽 之PXRD型態在DMS實驗前後類似，其表明在吸濕及脫濕 製程期間物質形式未發生變化。

生物檢定及製備 實例A 自表現人類Μ!、M2、M3&M4蕈毒鹼受體之細胞培養細胞 及製備膜 分別穩定表現選殖人類hM!、hM2、hM3及hM4蕈毒鹼受 體亞型之CHO細胞株在補充有10% FBS及250 pg/mL遺傳黴 素（Genetic in)之Hams F-12培養基中生長至近乎融合。細胞 在5% C02，3 7°C培育箱中生長且以2 mM EDTA於dPBS中 提昇。藉由在65〇xg下離心5分鐘收集細胞，且在-80°C下 冷凍儲存細胞集結粒或立即製備膜以供使用。 為了製備膜，將細胞集結粒再懸浮於溶解緩衝液中且以 Polytron PT-2100組織破碎機（Kinematica AG ; 20秒鐘 x2脈 衝）勻化。在4°C下在40,000xg下離心粗產物膜15分鐘。隨 後以再懸浮緩衝液再懸浮膜集結粒且再次以Polytron組織

158525.doc -38- S 201217338 破碎機勻化。 藉由 Lowry 等人，1951，0/·5ι·〇—_， 265中所描述之方法測定膜懸浮液之蛋白質濃度。所有膜 在-8 0 C下以專分試樣冷;東儲存或立即使用。 等分試樣之所製備之hMs受體膜係購自PerkinEimer，

Inc.(Wellesley，ΜΑ)且在-8(TC下儲存直至使用。

實例B 蕈毒鹼受體之放射性配位體結合檢定 在96孔微量滴定盤中以丨00 之總檢定體積執行選殖蕈 毒驗受體之放射性配位體結合檢定。將穩定表現、 hM2、hMs、hW或hMs蕈毒鹼受體亞型之CHO細胞膜在檢 定緩衝液中稀釋至以下特定目標蛋白質濃度（微克/孔）： hM丨 10 pg、hM2 10至 15 pg、hM3 10至 20 pg、hM4. 10至 20 pg且I1M5 10至12 pg以得到類似信號（cpm)。在添加至檢定 盤之前，膜使用Polytron組織破碎機短暫勻化（1〇秒）。 在0.001 nM至20 nM範圍之濃度下使用乙-[#-甲基_3开]莨 菪鹼氣代曱烷（[3H]-NMS)(TRK666, 84.0 Ci/mmol，Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire，England)執行用於測 定放射性配位體之K/)值之飽和結合研究。 以1 ηΜ之[3H]-NMS及11種不同測試化合物濃度執行用 於測定測試化合物之K,·值之移位檢定。測試化合物最初在 稀釋緩衝液中溶解至濃度為400 μΜ且隨後以稀釋緩衝液連 續稀釋5倍至最終濃度範圍介於1〇 ρΜ至100 μΜ»添加順 序及添加至檢定盤之體積如下：25 pL放射性配位體、25 158525.doc •39- 201217338 叫稀釋測試化合物及50 μί膜。在37°c下培育檢定盤6小 時。結合反應藉由經於1% BSA中預處理之GF/B玻璃纖維 濾板（PerkinElmer，Inc.)快速過濾來終止。將濾板以洗滌緩 衝液（10 mM HEPES)沖洗3次以移除未結合之放射性。隨 後將盤風乾且添加50 pL Microscint-20液體閃爍流體 (PerkinElmer，Inc.)至各孔。隨後在PerkinElmer Topcount 液體閃爍計數器（PerkinElmer，Inc.)中計數盤。 以 GraphPad稜鏡軟體套件（GraphPad Software, Inc.，San Diego，CA)使用單位點競爭模型藉由非線性回歸分析來分 析結合資料。使用Cheng-Prusoff方程式（Cheng Y; Prusoff WH. (1973) Biochemical Pharmacology, 22(23):3099-108) 自觀察到之IC5 q值及放射性配位體之κ ο值計算測試化合物 之K,.值。將Κί值轉化為pK,.值以測定幾何平均值及95%信賴 區間。隨後將此等概括統計量轉換回Κ,·值以供資料報導。 在此檢定中，較低Κ,.值意謂測試化合物對受體具有較高 結合親和力。在此檢定中聯苯_2基胺基甲酸^(2-(14-(4-{[(及)-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉-5-基）乙胺 基]甲基}苯胺曱醯基）丁基]甲胺甲醯基}乙基）派啶_4_基酯 二（二氟乙酸）鹽在I1M3下具有〇. 1 nM(資料捨入至最接近之 0.1 nM)之 K,值。

實例C 自表現人類P!、P2或β3腎上腺素激導性受體之細胞培養細 胞及製備膜 穩定表現選殖人類β〗及β2腎上腺素激導性受體之人類胚 158525.doc .40 -

S 201217338 腎（HEK-293)細胞株或穩定表現選殖人類β3腎上腺素激導 性受體之中國倉鼠卵巢（CHO)細胞株在500 pg/mL遺傳黴素 存在下在含有10% FBS之DMEM或Hams F-12培養基中生長 至近乎融合。以2 mM EDTA於PBS中提昇細胞單層。藉由 在1，000 rpm下離心使細胞集結，且細胞集結粒在-80°C下 冷凍儲存或立即製備膜以供使用。 為了製備表現受體之膜，將細胞集結粒再懸浮於 溶解緩衝液（10 mM HEPES/HC1，10 mM EDTA，在 4°c 下 pH 7.4)中且在冰上使用緊密裝配之Dounce玻璃勻化器（30 衝程）勻化。 為製備更多表現蛋白酶敏感性β3受體之膜，將細胞集結 粒在每 50 mL 緩衝液（Roche Molecular Biochemicals， Indianapolis，IN)補充有一個錠劑之「具有2 mM EDTA之 完全蛋白酶抑制劑混合物錠劑」之溶解缓衝液（10 mM Tris/HCl，pH 7.4)中勻漿。將勻漿在20,000xg下離心，且 所得集結粒以溶解缓衝液藉由如本文中所描述之再懸浮及 離心洗滌一次。隨後將最終集結粒再懸浮於冰冷結合檢定 緩衝液（75 mM Tris/HCl pH 7.4，12.5 mM MgCl2，1 mM EDTA)中。 藉由 Lowny 專尺，1951, Journal of Biological Chemistry, 193, 265 ； A Bradford, Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-54中所描述之方法測定膜懸浮液之蛋白質濃度。所有 膜在-80°C下以等分試樣冷凍儲存或立即使用。

實例D 158525.doc -41 - 201217338 測定腎上腺素激導性受體促效劑效能之檢定 根據製造商說明書’使用具有[125i]-cAMP(NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc·，Boston, ΜΑ)之閃 爍板腺苷醢環化酶活化檢定系統以放射免疫檢定格式執行 cAMP檢定。對於此檢定，穩定表現選殖人類βι或β2受體之 ΗΕΚ-293細胞株在補充有10% FBS及遺傳黴素（500 pg/mL) 之DMEM中生長至近乎融合；或穩定表現選殖人類β3腎上 腺素激導性受體之CHO-K1細胞株在補充有10% FBS及遺 傳黴素（250 pg/mL)之Hams F-12培養基中生長至近乎融 合。細胞以PBS沖洗且在含有2 mM EDTA之dPBS(達爾伯 克氏碌酸鹽緩衝鹽水（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)，無CaCl2及MgCl2)或胰蛋白酶-EDTA溶液（0.05%胰 蛋白酶/0.53 mM EDTA)中脫離。在Coulter細胞計數器中計 數細胞之後，藉由在1，〇〇〇 rpm下離心使細胞集結且再懸浮 於預升溫至室溫之含有IBMX(PerkinElmer Kit)之螢光放射 增強緩衝液中至濃度為丨.6><106至2.8xl〇6個細胞/毫升。在 此檢定中每孔使用約40,〇〇〇至80,000個細胞。將測試化合 物（10 mM於DMSO)稀釋至含有0.1% BSA之PBS於Beckman Biomek-2000中且在11種不同的介於1〇〇 μΜ至1 pM範圍内 之濃度下測試。在37°C下培育反應1 〇 min且藉由添加含有 [125I]-cAMP(NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA)之100 μί冷偵測缓衝液終止。如製造商使用者 手冊中所述，基於所觀察到之樣品及c AMP標準之計數計 算所產生之cAMP之量（pmol/孔）。 158525.doc -42·

201217338 以 GraphPad棱鏡軟體套件（GraphPad Software，Inc., San Diego，CA)以S形方程式藉由非線性回歸分析來分析資 料。使用 Cheng-Prusoff 方程式（Cheng Y 及 Prusoff WH.， 价oc/zew/ca/ 1973，22, 23，3099-108)計算 EC5〇 值。 在此檢定中，較低EC5g值意謂測試化合物對測試之受體 具有較高功能活性。在此檢定中聯苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(i〇-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基-1,2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基}苯胺甲醯基）丁基]曱胺甲醯基}乙基）哌啶-4-基酯二（三氟乙酸）鹽在Ιιβ2下具有1 nM(資料捨入至最接 近之1 nM)之EC5Q值。

實例E

Einthoven 檢定 此檢定量測測試化合物在大鼠中提供保護支氣管免於乙 醯曱膽驗（methacholine ; MCh)誘發之支氣管收縮之能力。 重量在200 g與350 g之間之雄性Sprague Dawley大鼠 (Harlan，Indianapolis, IN)用於所有研究。 測試化合物或媒劑（無菌去離子水）使用5 mL給藥溶液在 銘餅狀吸入腔室（R+S Molds, San Carlos, CA)中藉由吸入 (IH)歷時10 min時期給藥。將大鼠暴露於氣溶膠，該氣溶 膠在22 psi之壓力下自Bioblend(5% C02/95%大氣）所驅動 之 LC 星形喷霧器組 22F51型（PARI Respiratory Equipment， Inc· Midlothian，VA)產生。除非另外指示，否則大鼠用loo pg測試化合物給藥。 158525.doc • 43- 201217338 在預定時點，腹膜内（IP)注射120 mg/kg仲丁硫巴比妥 (inactin)(仲丁硫巴比妥鈉（thi〇butabarbital))使大鼠麻醉。 若動物對物理刺激起反應（例如腳趾夾緊），則投與補充劑 量（40 mg/kg，IP)。削刮手術部位且產生1至2 cm頸腹面之 中線切口。分離頸靜脈且以填充鹽水之聚乙烯導管（PE-50) 插套管以使MCh靜脈内輸液。自由切開氣管且以14號針 (#NE-014，Small Parts，Miami Lakes，FL)插套管》置放氣 管套管之後，使用設定在1 mL/100 g體重（但不超過2.5 mL 體積）之心搏出量及每分鐘90衝程之速率之呼吸器（683型， Harvard Apparatus, Inc.，MA)使各大鼠通氣。沿著呼吸器 呼氣管置放T形連接器以允許使用與Bi〇pac(TSD 137C)前 置放大器連接之Biopac傳感器來量測通風壓力（vp)之變 化。使用加熱墊使體溫維持於37°C。 使用Acknowledge資料收集軟體（Santa Barbara, CA)記錄 VP之變化。收集基線值至少2.5 min。隨後以非累積靜脈 内（IV)40及80 pg/kg MCh輸液攻擊大鼠。以2 mL/kg/min之 速率自注射泵（sP210iw，World Precision Instruments, Inc， Sarasota，FL)靜脈内輸注MCh 2.5分鐘，MCh兩種劑量之間 的時間間隔為2分鐘。處理動物中通風壓力（cm H2〇)之變 化表示為相對於對照動物之MCh反應的抑制。/0。 在此檢定中可使用其他支氣管收縮劑（諸如組織胺及乙 醯膽鹼）代替MCh。另外，可使用天竺鼠代替大鼠。 在此檢定中，MCh反應之較高抑制％表明測試化合物提 供較大支氣官保護作用。在24 h時大於或等於3〇%之抑制 •44- 158525.doc

201217338 指示長作用持續時間。在此檢定中聯苯-2-基胺基曱酸1 -(2-{[4-(4-{[(i〇-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉_ 5-基）乙胺基]曱基}苯胺曱醯基）丁基]曱胺曱醯基}乙基）哌 唆-4-基酯二（三氟乙酸）鹽在24 h時提供至少約40抑制〇/〇。 【圖式簡單說明】 圖1展示聯苯-2-基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(/〇-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基}苯胺曱 醯基）丁基]甲胺甲醯基}乙基）哌啶_4_基酯之結晶草酸鹽異 丙醇溶劑合物鹽（形式1)之粉末X射線繞射（PXRD)圖譜。 圖2展示聯苯_2_基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(及)-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基丨苯胺曱 酿基）丁基]曱胺甲醢基}乙基）哌啶·4-基酯之結晶草酸鹽異 丙醇溶劑合物鹽（形式丨）之差示掃描熱量測定（DSC)跡線。 圖3展示聯苯-2-基胺基曱酸ΐ-(2-{[4-(4-{[(/〇·2-羥基-2-(8·羥基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基}苯胺曱 醯基）丁基]曱胺甲醯基}乙基）哌啶_4-基酯之結晶草酸鹽異 丙醇溶劑合物鹽（形式1)之熱解重量分析（TGA)跡線》 圖4展示聯苯_2-基胺基曱酸1_(2-{[4-(4-{[(幻-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基}苯胺甲 酿基）丁基]曱胺曱醯基}乙基）哌啶_4-基酯之結晶草酸鹽水 合物鹽（形式2)之粉末X射線繞射（pxrd)圖譜。 圖5展示聯苯-2-基胺基曱酸1-(2-{[4-(4-{[(及)-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基-ΐ，2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基}苯胺曱 酿基）丁基]曱胺曱醯基}乙基）旅咬_4_基酯之結晶草酸鹽水 158525.doc -45 · 201217338 合物鹽（形式2)之差示掃描熱量測定（DSC)跡線。 圖6展示聯苯_2_基胺基甲酸1-(2-{[4-(4-{[(Λ)-2-羥基_2_ (8-羥基·2-側氧基-1,2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]曱基}苯胺甲 醯基）丁基]曱胺曱醯基}乙基）哌啶-4-基酯之結晶草酸鹽水 合物鹽（形式2)之熱解重量分析（TGA)跡線。 圖7展示聯苯-2-基胺基曱酸1-(2-{[4-(4-{[(幻-2-羥基-2-(8-羥基-2-側氧基-1,2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]甲基}苯胺甲 醯基）丁基]甲胺甲醯基}乙基）哌啶-4-基酯之結晶草酸鹽水 合物鹽（形式2)之動態吸濕（DMS)跡線。 158525.doc 46·

Claims (1)

1. 201217338 七、申請專利範圍： 1. 一種聯苯-2-基胺基甲酸卜(2_{[4_(4_{[(/〇_2_羥基2_(8•羥 基-2-側氧基-1，2-二氫喹啉-5-基）乙胺基]甲基}笨胺甲醯 基）丁基]曱胺曱醯基}乙基）哌啶_4_基酯之結晶草酸鹽； • 其中該結晶草酸鹽係選自： ⑷異丙醇溶劑合物，其特徵在於11.66i〇,20、 15·75±0.20、19.55±0.20、23.00±0·20 及 23·45±〇·2〇 之 2Θ 值處包含繞射峰之粉末X射線繞射圖譜；及 (b)水合物，其特徵在於15 32±〇 2〇 ' 16 9〇±〇 2〇、 19.25±0.20及23.73±0.20之2Θ值處包含繞射峰之粉末父射 線繞射圖譜。 2·如請求項1之結晶草酸鹽，其中該結晶草酸鹽為異丙醇 溶劑合物，其特徵在於11.66±0.20、15.75d:〇.2〇、 19.55±0.20、23.00±0.20 及 23.45±0,20 之 2Θ 值處包含繞射 峰之粉末X射線繞射圖譜。 3.如請求項2之結晶草酸鹽，其中該結晶草酸鹽特徵在於 峰位置實質上與圖1中所示圖譜之峰位置一致的粉末x射 線繞射圖譜。 - 4·如請求項2之結晶草酸鹽，其中該結晶草酸鹽特徵在於 , 在約162°C至約164°C之範圍内之熔點。 5. 如請求項2之結晶草酸鹽，其中該結晶草酸鹽特徵在於 實質上與圖2中所示者一致的差示掃描熱量測定跡線。 6. 如請求項1之結晶草酸鹽，其中該結晶草酸鹽為水合 物，其特徵在於 15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20及 158525.doc 201217338 23·73±0_20之2Θ值處包含繞射峰之粉末父射線繞射圖譜。 7_如請求項6之結晶草酸鹽，其中該結晶草酸鹽特徵在於 峰位置實質上與圖3中所示圖譜之峰位置一致的粉末乂射 線繞射圖譜。 8. 如請求項6之結晶草酸鹽，其中該結晶草酸鹽特徵在於 在約162 C至約164°C之範圍内之熔點。 9. 如請求項6之結晶草酸鹽，其令該結晶草酸鹽特徵在於 實質上與圖4中所示者一致的差示掃描熱量測定跡線。 10. —種醫藥組合物，其包含： (a) 如睛求項1至9中任一項之結晶草酸鹽；及 (b) 醫藥學上可接受之載劑。 11. 一種醫藥組合物，其包含： (a) 如睛求項1至9中任一項之結晶草酸鹽； (b) 類固醇消炎劑或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合 物；及 (c) 醫藥學上可接受之載劑。 12. 一種如請求項丨至9中任一項之結晶草酸鹽之用途，其用 於製造供治療肺病症之藥劑。 13. —種組合之用途，其用於製造供治療肺病症之藥劑，其 中該組合包含⑷如請求項i至9中任一項之結晶草酸鹽； 及（b)類固醇消炎劑或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合 物。 14·如請求項12或13之用途，其中該肺病症為慢性阻塞性肺 病或哮喘。 158525.doc

   201217338 15. —種如請求項1至9中任一項之結晶草酸鹽之用途，其用 於製造在哺乳動物中產生支氣管擴張之藥劑，其中該藥 劑藉由吸入投與。 16. 如請求項1至9中任一項之結晶草酸鹽，其用於治療。 17. 如請求項1至9中任一項之結晶草酸鹽，其用於治療肺病 症。 18·如請求項⑴中任一項之結晶草酸鹽，其用於治療慢性 阻塞性肺病或哮喘。 158525.doc