TW201210612A - Humanised antigen binding proteins - Google Patents

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TW201210612A
TW201210612A TW100119304A TW100119304A TW201210612A TW 201210612 A TW201210612 A TW 201210612A TW 100119304 A TW100119304 A TW 100119304A TW 100119304 A TW100119304 A TW 100119304A TW 201210612 A TW201210612 A TW 201210612A
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TW
Taiwan
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seq
antigen binding
kabat
variable region
binding protein
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TW100119304A
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Claire Ashman
Stephen Ashman
Paul Andrew Hamblin
Alan Peter Lewis
Martin Anibal Orecchia
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
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Description

201210612 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋白 (諸如抗體）、編碼該等抗原結合蛋白之聚核苷酸、包含該 ， 冑抗原結合蛋白之醫藥組合物及製造方法》本發明亦係關 • 力該等人類化抗原結合蛋白之用途，其係用於治療或預防 與低肌肉質量、肌力及肌肉功能中之任—者或其組合㈣ 之疾病。 【先前技術】 肌肉抑制素亦稱為生長分化因子（Gr_h and賺刪tiad〇n Factor ; GDF-8)，其為轉型生長因子_β(ΤΓ&—§
Growth Factor-beta ; TGF_p)超家族之成員且為肌肉質量之 負性調節因子。肌肉抑制素在進化中高度保守，且人類、 雞、小鼠及大鼠之序列在成熟c端域中1〇〇%一致。肌肉抑 制素合成為含有信號序列、前肽域及⑽域之前驅蛋白 質。肌肉抑制素之分泌、循環形式包括活性成熟C端域及 包含處於與前肽域及/或其他抑制蛋白質相關之潛伏複合 物中之成熟C端域的非活性形式。 . 存在多種與低肌肉質量、肌力及肌肉功能相關之不同疾 、 #、病'症及病狀。增加運動及良好營養為治療該等疾病之 當前療法的主要方式。不幸的是，對於部分患者，增加身 體活動由於難以堅持及適應而很少實現其益處。同時，運 動對於-些患者可能有困難、痛苦或無法進行。此外，與 運動相關之肌肉運用可能不足以對肌肉產生任何有益影 156287.doc 201210612 響。營養介入僅在存在根本飲食缺乏且患者具有足夠食慾 的情況下有效。由於此等限制，因此雖然治療與肌肉質 量、肌力及肌肉功能中之任一者或其組合降低相關之疾病 可獲得更廣泛益處，但該需要實質上未得到滿足。 已描述針對肌肉抑制素之抗體（WO 2008/030706、WO 2007/047112 ' WO 2007/044411 ' WO 2006/1 16269、WO 2005/094446、WO 2004/037861、WO 03/027248 及 WO 94/21681)。同時，Wagner等人（Ann Neurol· (2008) 63(5): 561-71)描述當使用一種所描述抗肌肉抑制素抗體時，在成 人肌肉萎縮症（muscular dystrophies)(貝克爾肌肉萎縮症 (Becker muscular dystrophy)、顏面肩月甲肢骨型萎縮症 (facioscapulohumeral dystrophy)及肢帶型肌肉萎縮症 (limb-girdle muscular dystrophy))中肌力及功能之探測端點 未獲得改良。 因此，仍需要治療或預防與肌肉質量、肌力及肌肉功能 中之任一者或其組合降低相關之疾病的更有效療法。 【發明内容】 本發明提供特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋 白。該抗原結合蛋白可用於治療或預防與低肌肉質量 '肌 力及肌肉功能中之任一者或其組合相關之疾病。 本發明提供人類化抗原結合蛋白，其特異性結合肌肉抑 制素且在溶液相親和力檢定中具有強於150 pM之親和力。 本發明亦提供特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋 白，其中該抗原結合蛋白具有至少100小時之pK。 156287.doc 201210612 本發明提供特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋 白，且其中該抗原結合蛋白包含重鏈可變區且其中該重鍵 可變區包含SEQ ID NO: 90之CDRH3(F100G_Y變異體）；或 該CDRH3之變異體；其中該抗原結合蛋白進一步包含 Kabat 28位之絲胺酸殘基；及以下殘基中之至少一者或其 組合或所有以下殘基：Kabat 66位之離胺酸殘基；Kabat 67位之丙胺酸殘基；Kabat 71位之纈胺酸殘基；及Kabat 73位之離胺酸殘基。 本發明提供特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋 白’且其中該抗原結合蛋白包含輕鏈可變區，該輕鍵可變 區包含以下CDR序列中之一者、兩者或三者： (a) SEQ ID NO: 4之 CDRL1或該 CDRL1之變異體； (b) SEQ ID NO: 5之CDRL2或該CDRL2之變異體；及 (c) SEQ ID NO: 109 之 CDRL3(C91S變異體）或該 CDRL3 之變異體；其中該抗原結合蛋白進一步包含Kabat 71位之 路胺酸殘基，及以下殘基中之至少一者或兩者：Kabat 46 位之蘇胺酸殘基；及Kabat 69位之麩醯胺酸殘基。 本發明提供特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋 白，其包含： (a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 90之CDRH3 (F100G_Y變異體）；或該CDRH3之變異體；其中該抗原結 合蛋白進一步包含Kabat 28位之絲胺酸殘基；及以下殘基 中之至少一者或其組合或所有以下殘基：Kabat 66位之離 胺酸殘基；Kabat 67位之丙胺酸殘基；Kabat 71位之纈胺 156287.doc 201210612 酸殘基；及Kabat 73位之離胺酸殘基；及 視情況包含以下序列中之一或兩者：SEQ ID NO: 2之 CDRH2 或該 CDRH2 之變異體；及CDRH1 (SEQ ID NO: 1) 或該CDRH1之變異體；及 (b)輕鏈可變區，其包含以下CDR序列中之一者、兩者或 三者：SEQ ID NO: 4之CDRL1或該CDRL1之變異體；SEQ ID NO: 5 之 CDRL2 或該 CDRL2之變異體；及SEQ ID NO: 109之CDRL3(C91S變異體）或該CDRL3之變異體； 其中該抗原結合蛋白進一步包含Kabat 71位之酿胺酸殘 基；及以下殘基中之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇胺 酸殘基；及Kabat 69位之銹醯胺酸殘基。 本發明亦提供人類化抗原結合蛋白，其特異性結合肌肉 抑制素且包含： 選自 SEQ ID NO: 112、113、114、115、119、120或 121 之 重鏈可變區；及/或選自SEQ ID NO: 116、117或118之輕 鏈可變區；或與該序列具有75%或75%以上序列一致性之 變異型重鏈或輕鏈可變區； 其中 CDRH3為 SEQ ID NO: 90 ; CDRH2為 SEQ ID NO: 2或 95 ; CDRH1 為 SEQ ID NO: 1 ; CDRL1 為 SEQ ID NO: 4 ; CDRL2為 SEQ ID NO: 5 ;且 CDRL3為 SEQ ID NO: 109 ;且 其中重鏈可變區進一步包含Kabat 28位之絲胺酸殘基；及 以下殘基中之至少一者或其組合或所有以下殘基：Kabat 66位之離胺酸殘基；Kabat 67位之丙胺酸殘基；Kabat 71 位之纈胺酸殘基；及Kabat 73位之離胺酸殘基；且 156287.doc 201210612 其中輕鏈可變區進一步包含Kabat 71位之酪胺酸殘基；及 以下殘基中之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇胺酸殘 基；及Kabat 69位之麵醯胺酸殘基。 本發明亦提供人類化抗原結合蛋白，其特異性結合肌肉 抑制素且包含： (a) SEQ ID NO: 112之重鏈可變區及SEq ID N〇: u6之輕 鏈可變區； (b) SEQ ID NO: 112之重鏈可變區及SEQ ID NO: 117之輕 鏈可變區； (c) SEQ ID NO: 112之重鏈可變區及SEq m NO: 118之輕 鏈可變區； (d) SEQ ID NO: 113之重鏈可變區及SEQ ID NO: 116之輕 鏈可變區； (e) SEQ ID NO: 113之重鏈可變區及SEQ ID NO: 117之輕 鏈可變區； ⑺SEQ ID NO: 113之重鏈可變區及SEQ ID NO: 118之輕 鏈可變區； (g) SEQ ID NO: 114之重鏈可變區及SEQ ID NO: 116之輕 鏈可變區； (h) SEQ ID NO: 114之重鏈可變區及SEQ ID NO: 117之輕 鏈可變區； ⑴ SEQ ID NO: 114之重鏈可變區及SEQ ID NO: 118之輕 鏈可變區； (j) SEQ ID NO: 115之重鏈可變區及SEQ ID NO: 116之輕 156287.doc 201210612 鍵可變區； (k) SEQ ID NO: 115之重鏈可變區及SEQ ID NO: 117之輕 鏈可變區； (l) SEQ ID NO: 115之重鏈可變區及SEQ ID NO: 118之輕 鏈可變區； (m) SEQ ID NO: 119之重鏈可變區及SEQ ID NO: 116之輕 鏈可變區； (n) SEQ ID NO: 11 9之重鏈可變區及SEQ ID NO: 117之輕 鏈可變區； (〇) SEQ ID NO: 119之重鏈可變區及SEQ ID NO: 118之輕 鏈可變區； (P) SEQ ID NO: 120之重鏈可變區及SEQ ID NO: 116之輕 鏈可變區； (q) SEQ ID NO: 120之重鏈可變區及SEQ ID NO: 117之輕 鏈可變區； (r) SEQ ID NO: 120之重鏈可變區及SEQ ID NO: 118之輕 鏈可變區； (s) SEQ ID NO: 121之重鏈可變區及SEQ ID NO: 116之輕 鏈可變區； (t) SEQ ID NO: 121之重鏈可變區及SEQ ID NO: 117之輕 鏈可變區；或 (u) SEQ ID NO: 121之重鏈可變區及SEQ ID NO: 118之輕 鏈可變區。 本發明亦提供人類化抗原結合蛋白，其特異性結合肌肉 156287.doc 201210612 抑制素且包含：選自SEQ ID NO: 123、125、127或138-144之重鏈序列；及/或選自SEQ ID NO: 145、146、147之 輕鏈序列；或與該序列具有75%或75°/。以上序列一致性之 變異型重鏈或輕鏈序列， 其中 CDRH3為 SEQ ID NO: 90 ; CDRH2為 SEQ ID NO: 2或 95 ; CDRH1 為 SEQ ID NO: 1 ; CDRL1 為 SEQ ID NO: 4 ; CDRL2為 SEQ ID NO: 5 ;且 CDRL3為 SEQ ID NO: 109 ;且 其中重鏈進一步包含Kabat 28位之絲胺酸殘基；及以下殘 基中之至少一者或其組合或所有以下殘基：Kabat 66位之 離胺酸殘基；Kabat 67位之丙胺酸殘基；Kabat 71位之纈 胺酸殘基；及Kabat 73位之離胺酸殘基；且 其中輕鏈進一步包含Kabat 71位之酪胺酸殘基；及以下殘 基中之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇胺酸殘基；及 Kabat 69位之麩醯胺酸殘基。 本發明亦提供編碼特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原 結合蛋白之核酸分子，其包含： SEQ ID NO： 122、124、126、128-131、135-137之重鏈 DNA序列；及/或選自Seq ID NO: 132、133或134之輕鏈 DNA序列；或 變異型重鏈或輕鏈DNA序列，其編碼SEQ ID NO: 123、 125、127 或 138-144之重鏈序列；及/或 SEQ ID NO: 145、 146或147之輕鍵序列。 本發明亦提供編碼如本文所定義之人類化抗原結合蛋白 之核酸分子。本發明亦提供包含如本文所定義之核酸#子 156287.doc •9- 201210612 8月亦、提供包含如本文所定義之表現載體 本發明亦提供產生如本文所定義之人類 之表現載體。本發 之重組宿主細胞。 化抗原結合蛋白之方法該 宿主細胞及回收抗原結合蛋 組合物，其包含如本文所定 藥學上可接受之載劑。 方法包含培養如上文所定義之 白之步驟。本發明亦提供醫藥 義之人類化抗原結合蛋白及醫 本發月亦提供^。療罹患降低肌肉質量、肌力及/或肌肉 功能之疾病之個體的方法，該方法包含投與如本文所定義 之人類化抗原結合蛋白之步驟。 本發明提供治療罹患以下疾病之個體的方法：少肌症、 心病質肌肉萎縮（muscle_wasting)、不用性肌肉萎縮症、 HIV AIDS、癌症、外科疾病、_、_ # κ # @ t 創傷或損#肥胖症、糖尿病(包括π型糖尿病）' 關節 炎、慢性腎衰竭（CRF)、纟期腎_SRD)、充血性心臟衰 竭（CHF)、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、選擇性關節修復 (elective joint repair)、多發性硬化症⑽）、中風肌肉萎 縮症、運動神經元神經病變、肌肉萎縮性側索硬化 (ALS)、帕金森氏病（ρ3Γ|^η3〇η,8 disease)、骨質疏鬆症、 骨關節炎、脂肪酸肝病（fatty acid liver disease)、肝硬 化、艾迪森氏病（Addison's disease) '庫欣氏症候群 (Cushing’s syndrome)、急性呼吸窘迫症候群、類固醇誘發 之肌肉萎縮、肌炎或脊柱側彎，該方法包含投與治療有效 量之如本文所述之人類化抗原結合蛋白之步驟。 本發明提供在患者中增加肌肉質量、增強肌力及/或改 156287.doc -10- 201210612 善肌肉功能的方法，該方法包含投與如本文所述之人類化 抗原結合蛋白之步驟。 本發明提供如本文所述之人類化抗原結合蛋白，其係用 於治療羅患降低肌肉質量、肌力及肌肉功能中之任一者或 其組合之疾病的個體。 本發明提供如本文所述之人類化抗原結合蛋白，其係用 於’台療少肌症、惡病質、肌肉萎縮、不用性肌肉萎縮症、 HIV、AIDS、癌症、外科疾病、灼傷、肌肉骨路或神經之 創傷或損傷、肥胖症、糖尿病（包括π型糖尿病）、關節 炎、慢性腎衰竭（CRF)、末期腎病（ESRD)、充血性心臟衰 竭（CHF)、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、選擇性關節修復、多 發性硬化症（MS)、令風、肌肉萎縮症、運動神經元神經病 變、肌肉萎縮性側索硬化（ALS)、帕金森氏病、骨質疏鬆 症、月關節炎、脂肪酸肝病、肝硬化、艾迪森氏病、庫欣 氏肌肉萎縮（Cushing’s muscle wasting)、肌炎或脊柱側 彎。 本發明提供如本文所述之人類化抗原結合蛋白，其係用 於在個體中增加肌肉質量、增強肌力及/或改善症候群、 心)生呼吸窘迫症候群、類固醇誘發之肌肉功能之方法中。 本發明提供如本文所述之人類化抗原結合蛋白之用途， :係用於製造用以治療罹患降低肌肉質量、肌力及肌肉功 月b中之任一者或其組合之疾病之個體的藥劑。 本發明提供如本文所述之人類化抗原結合蛋白之用途， 其係用於製造用以治療以下疾病之藥劑：少肌症、惡病 156287.doc 201210612 質、肌肉萎縮、不用性肌肉萎縮症、HIV、aids、癌症、 外科疾病、灼傷、肌肉骨骼或神經之創傷或損傷、肥胖 症、糖尿病（包括π型糖尿病）' 關節炎、慢性腎衰蝎 (CRF)末期腎病（ESRD)、充血性心臟衰竭（cHF)、慢性 阻塞性肺病（C0PD)、選擇性關節修復、多發性硬化症 (MS)中風、肌肉萎縮症、運動神經元神經病變、肌肉萎 縮性側索硬化（ALS)、帕金森氏病、冑f疏鬆症、骨關節 炎、脂肪酸肝病、肝硬化 '艾迪森氏病、庫欣氏肌肉萎 縮、肌炎或脊柱側彎。 本發明提供如本文所述之人類化抗原結合蛋白之用途， 其係用於製造用於在個體中增加肌肉質量、增強肌力及/ 或改善肌肉功能之方法中的藥劑。 【實施方式】 本發明提供特異性結合肌肉抑制素（例如均二聚成熟肌 肉抑制素）之抗原結合蛋白。該抗原結合蛋白可結合及中 和肌肉抑制素’例如人類肌肉抑制素。抗原結合蛋白可為 抗體，例如單株抗體。 肌肉抑制素與GDF-8均指以下任一者：肌肉抑制素之全 長未經加工前驅體形式；由c端域轉譯後裂解產生之成熟 肌肉抑制素’其呈潛伏及非潛伏（活性）形式。術語肌肉抑 制素亦指保留一或多種與肌肉抑制素相關之生物活性的肌 肉抑制素之任何片段及變異體。 肌肉抑制素之全長未經加工前驅體形式包含前肽及〇端 域，該C端域在有或無信號序列下形成成熟蛋白質。肌肉 156287.doc -12- 201210612 抑制素前肽加上c端域亦稱為聚合蛋白f。肌肉抑制素十 驅體可以單體或均二聚體形式存在。 、則 成熟肌肉抑制素為自肌肉抑制素前驅蛋白之C端（亦稱為 c端域)裂解之蛋白質。成熟肌肉抑制素可以單體、均二聚 體：式存在，或存在於肌肉抑制素潛伏複合物中。視條件 而定’成熟肌肉抑制素可在此等不同形式之組合之間建立 平衡。人類'#、小鼠及大鼠肌肉抑制素之成紅端 列100。/。-致（參見例如SEQIDN〇: 1〇4)。在一實施例中， 本發明之抗原結合蛋白結合SEQ ID N〇: 1〇4中所示之均二 聚成熟肌肉抑制素。 一 肌肉抑制素前肽為在信號序列裂解後自肌肉抑制素前驅 蛋白質之N端域裂解之多狀。前狀亦稱為潛伏相關狀 (LAP)。肌肉抑制素前肽能夠非共價結合於成熟肌肉抑制 素上之前肽結合域。人類前肽肌肉抑制素序列之一實 供於 SEQ ID NO: 1〇8 中。 肌肉抑制素潛伏複合物為成熟肌肉抑制素與肌肉抑制素 前狀或其他肌肉抑❹結合蛋白之間所形成的蛋白質複合 物舉例而吕，兩個肌肉抑制素前肽分子可與兩個成孰肌 肉抑制素分子締合形成非活性四聚潛伏複合物。肌肉抑制 素潛伏複合物可包括其他肌肉抑制素結合蛋白替代一或兩 個肌肉抑制素前肽或除一或兩個肌肉抑制素前狀之外亦包 括其他肌肉抑制素結合蛋白。其他肌肉抑制素結合蛋白之 實例包㈣泡抑素⑽listatin)、㈣抑素相關基因（MG) 以及生長分化因子相關血清蛋白。 156287.doc •13- 201210612 肌肉抑制素抗原結合蛋白可結合肌肉抑制素之前驅體形 式、成熟形式、單體形式、二聚形式、潛伏形式及活性形 式中之任一者或其任何組合。抗原結合蛋白可結合呈單體 形式及/或二聚形式之成熟肌肉抑制素。當肌肉抑制素與 前肽及/或卵泡抑素形成複合物時，抗原結合蛋白可能結 合或可能不結合肌肉抑制素。或者，當肌肉抑制素與卵泡 抑素相關基因（FLRG)及/或生長分化因子相關血清蛋白 l(GASP-l)形成複合物時，抗原結合蛋白可能結合或可能 不結合肌肉抑制素。舉例而言，抗原結合蛋白結合成熟二 聚肌肉抑制素。 如本文所用之術語「抗原結合蛋白」係指能夠與肌肉抑 制素結合之抗體、抗體片段及其他蛋白質構築體（諸如結 構域）。 術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用以指具有免疫 球蛋白樣結構域之分子，且包括單株抗體、重組抗體、多 株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體及異源結 合抗體；單可變域、域抗體、抗原結合片段、免疫有效片 段、單鏈Fv、雙功能抗體、Tandabs™等（關於替代性「抗 體」格式之概述’參見Holliger及Hudson，Nature
Biotechnology，2005，第 23卷，第 9期，1 126-1 136)。 片語「單可變域」係指獨立於不同可變區或可變域特異 性結合抗原或抗原決定基之抗原結合蛋白可變域（例如 Vh、VHh、Vl)。 「域抗體」或「dAb」可視為與能夠結合抗原之「單可 156287.doc ,4 ' 201210612 變域」相同《單可變域可為人類抗體可變域，但亦包括來 自其他物種之單抗體可變域，諸如齧齒動物（如例如w〇 00/29004中所揭示）' 護士鯊（nurse shark)及駱駝科動物 (CamWW)VHH dAb。駱駝科動物Vhh為自包括駱駝 (camel)、美洲駝（ilama)、羊駝（alpaca)、單峰駝（dr〇medary) 及原駝（guanaco)之物種得到之免疫球蛋白單可變域多肽， 該4物種產生天然缺乏輕鍵之重鏈抗體。可根據此項技術 中可用之標準技術對該等vHH域進行人類化，且將該等結 構域視為「域抗體」。如本文中所用之Vh&括駱駝科動物 VHH 域。 如本文中所用之術s吾「域/結構域」係指具有獨立於蛋 白質其餘部分之三級結構的摺疊蛋白質結構。通常，結構 域負責蛋白質之離散功能性質，且在許多情況下可將其添 加、移除或轉移至其他蛋白質而不損失蛋白質其餘部分及/ 或結構域之功能。「單可變域」為包含抗體可變域所特有 之序列的摺疊多肽域。因此，其包括完整抗體可變域及經 修飾可變域（例如其中一或多個環已由不為抗體可變域所 特有的序列置換），或已截短或包含N端或C端延伸之抗體 可變域’以及至少保留全長結構域之結合活性及特異性的 可變域之摺疊片段。結構域可獨立於不同可變區或可變域 結合抗原或抗原決定基。 抗原結合片段可藉助於在非抗體蛋白質骨架（諸如結構 域）上排列一或多個CDR來提供。非抗體蛋白質骨架或於 構域為已進行蛋白質工程改造以便能夠與除其天然配位體 156287.doc •15- 201210612 以外之配位體結合者，例如作為選自以下之骨架之衍生物 的結構域：CTLA-4(Evibody);脂質運載蛋白（lip0Calin); 蛋白質A來源之分子’諸如蛋白質a之Z域（親和抗體 (Affibody)，SpA)、A域（高親和性多聚體（Avimer)/最大抗 體（Maxibody));熱休克蛋白，諸如〇Γ〇Ει及GroES ;運鐵 蛋白（transferring轉運體（trans-body));錨蛋白重複蛋白 (ankyrin repeat protein)(DARPin);肽適體；C型凝集素域 (C-type lectin domain)(四連接素（Tetranectin));人類γ-晶 狀體球蛋白（γ-crystallin)及人類泛素（ubiqUitin)(阿夫林 (affilins)) ; PDZ域；人類蛋白酶抑制劑之蠍毒素孔尼茲型 域（scorpion toxinkunitz type domain);及纖維結合蛋白 (fibronectin)(黏附蛋白（adnectin));其已進行蛋白質工程 改造以便能夠與除其天然配位體以外之配位體結合。 CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)為主要表現於 CD4+T細胞上之CD28家族受體。其細胞外域具有可變域 樣Ig摺疊。與抗體之CDR對應之環可經異源序列取代以賦 予不同結合性質。經工程改造以具有不同結合特異性之 CTLA-4分子亦稱為Evibody。更多詳情請參見journai of
Immunological Methods 248 (1-2)，31-45 (2001) ° 脂質運載蛋白為轉運諸如類固醇、後膽色素（bilins)、類 視黃素（retinoids)及脂質之小疏水性分子的細胞外蛋白質 家族。其具有剛性β片二級結構’該二級結構在典型結構 之開放末具有多個環’該典型結構可經工程改造以結合 不同目標抗原。抗運載蛋白（anticalins)之尺寸介於160-180 •16· 156287.doc 201210612 個胺基酸之間，且來源於脂質運載蛋白。更多詳情請參見 Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000) ' US 7250297B1 及 US 20070224633 ° 親和抗體為自金黃色葡萄球菌（iSiapAy/ococcw·? at/rews)之 蛋白質A獲得之骨架，其可經工程改造以結合抗原。該結 構域由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘 基之隨機化產生文庫。更多詳情請參見Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)及 EP1641818A1。 高親和性多聚體為自A域骨架家族獲得之多結構域蛋白 質。具有約35個胺基酸之天然結構域採用明確二硫鍵鍵結 之結構。藉由對A域家族所展現之天然變化進行改組產生 多樣性。更多詳情請參見Nature Biotechnology 23(12)， 1556 -1561 (2005)及 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909-917 (2007年 6 月）。 轉鐵蛋白為單體血清轉運醣蛋白。可藉由將肽序列（諸 如一或多個CDR)插入容許表面環中來對運鐵蛋白進行工 程改造以結合不同目標抗原。經工程改造之轉鐵蛋白骨架 之實例包括轉運體（Trans-body)。更多詳情請參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。 所設計之錨蛋白重複蛋白（DARPin)來源於錨蛋白，錨蛋 白為介導整合膜蛋白質連接至細胞骨架的蛋白質家族。單 一錨蛋白重複為由2個a螺旋及1個β轉角組成之具有33個殘 基之基元。其可藉由以下進行工程改造以結合不同目標抗 原：隨機化各重複之第一 α螺旋及β轉角中之殘基；或插入 156287.doc 17· 201210612 肽序列（諸如一或多個CDR)。其結合界面可藉由增加模組 數而增加（一種親和力成熟方法）。更多詳情請參見J. Mol· Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及 J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及US 20040132028A1。 纖維結合蛋白為可經工程改造以結合抗原之骨架。黏附 蛋白（Adnectins)由III型人類纖維結合蛋白（FN3)之15個重 複單元的第1 〇結構域之天然胺基酸序列之主鏈組成。位於 β夾層之一端的三個環可經工程改造以使黏附蛋白能夠特 異性識別相關治療目標。更多詳情請參見Protein Eng. Des. Sel. 18，435-444 (2005)、US 20080139791、WO 2005056764及US 6818418B1 。 肽適體為由恆定骨架蛋白質組成之組合識別分子，該恆 定骨架蛋白質通常為含有在活性位點處插入之受限可變肽 環的硫氧還蛋白（thioredoxin ; TrxA)。更多詳情請參見 Expert Opin. Biol· Ther. 5, 783-797 (2005)。 微體（microbody)來源於含有3-4個半胱胺酸橋且長度為 2 5-50個胺基酸的天然存在之微蛋白（microprotein);微蛋 白之實例包括KalataBl及芋螺毒素（conotoxin)及打結素 (knottins)。微蛋白具有可經工程改造以包括多達25個胺基 酸而不影響微蛋白之整體摺疊的環。經工程改造之打結素 域的更多詳情請參見WO 2008098796。 其他結合域包括已用作工程改造不同目標抗原結合性質 之骨架的蛋白質，包括人類γ-晶狀體球蛋白及人類泛素（阿 夫林）、人類蛋白酶抑制劑之孔尼茲（kunitz)型結構域、 156287.doc -18- 201210612
Ras-結合蛋白AF-6之PDZ域、蠍毒素（卡律蠍毒素 (charybdotoxin))、C型凝集素域（四連接素），評述於治療 性抗體手冊（Handbook of Therapeutic Antibodies)(2007， Stefan Dubel編）之第 7章-非抗體骨架（Non-Antibody Scaffolds) 及Protein Science 15:14-27 (2006)中。本發明之結合域可 來源於任何該等替代性蛋白質域及本發明CDR移植至結構 域上之任何組合。 抗原結合片段或免疫有效片段可包含部分重鏈或輕鏈可 變序列。片段長度為至少5個、6個、8個或10個胺基酸。 或者，片段長度為至少15個、至少20個、至少50個、至少 75個或至少100個胺基酸。 如本說明書通篇關於抗原結合蛋白所用之術語「特異性 結合」意謂抗原結合蛋白與肌肉抑制素結合而不或不顯著 結合其他（例如無關）蛋白質。然而，該術語並不排除抗原 結合蛋白亦可與密切相關分子（例如生長分化因子-11)交叉 反應之事實。本文所述之抗原結合蛋白可以其與密切相關 分子（諸如GDF-11)結合之親和力的至少2、5、10、25、 50、100或1000倍大之親和力結合肌肉抑制素。 抗原結合蛋白-肌肉抑制素相互作用之結合親和力或平 衡解離常數（KD)可為100 nM或100 nM以下、10 nM或10 nM以下、2 nM或2 πΜ以下或1 nM或1 nM以下。或者，KD 可介於5 nM與10 nM之間；或介於1 nM與2 nM之間。KD可 介於500 pM與1 nM之間或介於1 pM與500 pM之間或介於1 pM與200 pM之間或介於1 pM與100 pM之間。抗原結合蛋 156287.doc -19- 201210612 白之結合親和力藉由缔合速率常數（ka)及解離速率常數（^) 進行測定（KD=Kd/Ka)。結合親和力可利用BiAcoreTM，例如 藉由用經由一級胺偶合而偶合至CM5晶片上之肌肉抑制素 進行抗原捕捉及於此表面上進行抗體捕捉來量測。實例 2.3中所述之BIAc〇re™方法可用於量測結合親和力。或 者，結合親和力可利用FORTEbio，例如藉由用經由一級 胺偶合而偶合至CM5針上之肌肉抑制素進行抗原捕捉及於 此表面上進行抗體捕捉來量測。然而，由於本發明抗原結 合蛋白與肌肉抑制素之結合性質，故結合親和力可用於= 級目的。在一實施例中，可根據溶液相親和力檢定量測親 和力（諸如在實例17中）。 kd可為 lxio-3 S.1 或 lxl0-3 ^以下，lxi〇_4 s、ixi〇 4 s 】 以下:或1X10-5 S-1或lx10-5 s-】以下。kd可介於ΐχΐ〇·5 1Χ10-4 S.1之間；或介於lxl〇-4〆與1χΐ〇.3 y之間。緩慢、 可使抗原結合蛋白-配位體複合物緩慢解離且使配位體之 中和得到改良。 如本說明書所用之術語「中和」意謂在活體外或活體 内，與不存在抗原結合蛋白時肌肉抑制素之活性相比，肌 肉抑制素之生物活性在如本文所述之抗原結合蛋白存在下 ^低。中和可歸因於以下_或多纟：阻斷肌肉抑制素與其 又體之結合、阻止肌肉抑制素活化其受體、下調肌肉抑制 素或其受體、或影響效應功能性。中和可歸因於阻斷肌肉 抑制素與其受體之結合W而阻止肌肉抑制素活化其受 156287.doc 201210612 肌肉抑制素活性包括與活性肌肉抑制素相關之生長活 性、調節活性及形態發生活性中之一或多者，例如調節肌 肉質量、肌力及肌肉功能。其他與活性肌肉抑制素相關之 活性可包括調節肌肉纖維數目、肌肉纖維尺寸、肌肉再 生、肌肉纖維化、肌母細胞增殖速率、肌原性分化；衛星 細胞之活化、衛星細胞之增殖、衛星細胞之自我更新；肌 肉生長及功能中所涉及之蛋白質的合成或分解代謝。肌肉 可為骨骼肌。 生物活性之降低或抑制可為部分或完全的。與不存在抗 原結合蛋白時之肌肉抑制素活性相比，中和抗原結合蛋白 可中和肌肉抑制素之活性達至少20%、30% 40%、50%、 55%、60%、65%、70%、75% ' 80%、82%、84%、86%、 88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%。在功能檢定（諸如以下所述之中和檢定）中，IC50為 使生物反應降至其最大值之50%的濃度。 可使用熟習此項技術者已知或如本文所述之一或多種檢 定來測定或量測中和作用。舉例而言，可在夾心ELISA 中、藉由BIAcore™、FMAT、FORTEbioTM4類似活體外檢 定（諸如表面電漿子共振）評估抗原結合蛋白與肌肉抑制素 之結合。 可使用基於ELISA之受體結合檢定藉由量測在抗原結合 蛋白存在下肌肉抑制素與固定於板上之可溶性ActRIIb受 體之結合來測定抗原結合蛋白之中和活性（更多詳情請參 見實例2.5)。受體中和檢定為可用於基於效能區分IC50低 156287.doc -21 201210612 於1 nM之分子的靈敏方法。然而，該檢定本身對勝任結合 之生物素化肌肉抑制素之精確濃度敏感。因此可獲得 0.1 nM至5 nM範圍内之1〇5〇值，例如〇」心至3爾，或〇 1 nM至 2 nM，或 0.1 nM至 1 nM。 . 或者，可使用基於細胞之受體結合檢定藉由量測對受體 結合、下游信號傳導及基因活化之抑制作用來測定抗原結 合蛋白之中和活性。舉例而言，中和抗原結合蛋白可根據 在用編碼受PAI-1特異性啟動子控制之螢光素酶基因之構 築體轉染的橫紋肌肉瘤細胞（A2〇4)中抑制肌肉抑制素誘導 之螢光素酶活性的能力進行鑑別，亦稱為肌肉抑制素反應 性報導基因檢定（更多詳情請參見實例1.2)。 活體内中和作用可在顯示肌肉質量、肌力及肌肉功能中 之任一者或其組合之變化的動物中使用多種不同檢定進行 測疋。舉例而言’可單獨或組合使用體重、肌肉質量（諸 如瘦肌肉質量）、肌肉收縮性（例如強直力）、握力、動物使 自身懸吊之能力及游泳測試來評估肌肉抑制素抗原結合蛋 白之中和活性。舉例而言，可測定以下肌肉之肌肉質量： 排腸肌、四頭肌、三頭肌、伸趾長肌（edl)、脛骨前肌 (TA)及比目魚肌。 熟習此項技術者將顯而易知，術語「來源」不僅意欲定 義在作為材料之實體起源之意義上的來源，而且亦定義結 構上與該材料相同但並非起源於參考來源之材料。因此， Γ供體抗體中發現之殘基」未必需要自供體抗體純化得 到。 156287.doc 22· 201210612 分離意謂諸如抗原結合蛋白之分子係自在自然界中可發 現其之環境中移除。舉例而言，分子可經純化與自然界中 通常與之一起存在之物質分離。舉例而言，對於含有抗原 結合蛋白之培養基，可將抗原結合蛋白純化為至少95% 純、96%純、97%純、98%純或99%純或99%純以上。 「嵌合抗體」係指一種類型之經工程改造之抗體，其含 有來源於供體抗體的天然存在之可變區（輕鏈及重鏈）以及 來源於接受體抗體的輕鏈及重鏈怪定區。 「人類化抗體」係指一種類型之經工程改造之抗體，其 具有一或多個來源於非人類供體免疫球蛋白之Cdr，該分 子之其餘免疫球蛋白衍生部分來源於一或多個人類免疫球 蛋白。此外，可改變構架支撐殘基以保留結合親和力（參 見例如 Queen 等人 proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029· 10032 (1989) ’ Hodgson 等人.Bio/Technology, 9:421 (1991))。適當人類接受體抗體可為根據與供體抗體之核苷 酸及胺基酸序列之同源性自例如KABAT®資料庫、Los Alamos資料庫及Swiss Protein資料庫之習知資料庫選擇的 人類接受體抗體。根據與供體抗體構架區之同源性（以胺 基酸為基礎）表徵的人類抗體可適於提供用於插入供體 CDR之重鏈恆定區及/或重鏈可變構架區。可以類似方式 選擇能夠提供輕鏈恆定區或可變構架區之合適接受體抗 體。應注意，接受體抗體重鏈及輕鏈無需來源於相同接受 體抗體。先前技術描述若干種產生該等人類化抗體之方 式，參見例如 EP-A-0239400及EP-A-054951。 156287.doc -23- 201210612 術語「供體抗體」係指向第一免疫球蛋白搭配物貢獻該 供體抗體之可變區、一或多個CDR或其他功能片段或其類 似物之胺基酸序列的抗體。因此，供體提供經改變之免疫 球蛋白編碼區及由此產生的具有供體抗體所特有之抗原特 異性及中和活性的所表現之經改變抗體。 術語「接受體抗體」係指與供體抗體異源之抗體，其向 第一免疫球蛋白搭配物貢獻編碼該接受體抗體之重鏈及/ 或輕鏈構架區及/或其重鏈及/或輕鏈恆定區的胺基酸序列 之全部（或任何部分）。人類抗體可為接受體抗體。 術語「VH」及「VL」在本文中用於分別指抗原結合蛋 白之重鍵可變區及輕键可變區。 「CDR」定義為抗原結合蛋白之互補決定區胺基酸序 列。此等CDR為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之高變區。在免疫 球蛋白之可變部分中存在三個重鏈CDR及三個輕鏈 CDR(或CDR區）。因此，如本文所用之「CDR」係指所有 三個重鏈CDR、所有三個輕鏈CDR、所有重鏈及輕键CDR 或至少兩個CDR。 在本說明書中，除非另外說明，否則可變域序列及全長 抗體序列中之胺基酸殘基係根據Kabat編號規定進行編 號。類似地，實例中所用之術語「CDR」、「CDRL1」、 「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、 「CDRH3」遵循Kabat編號規定。關於其他資訊，請參見 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 4版，U.S. Department of Health and Human 156287.doc -24- 201210612
Services, National Institutes of Health (1987)。舉例而言， 圖20及21分別展示序列HO (SEQ ID NO: 12)及L0 (SEQ ID NO: 15)之可變重鏈及輕鏈之Kabat編號。 熟習此項技術者將顯而易知，存在用於可變域序列及全 長抗體序列中之胺基酸殘基的替代性編號規定。亦存在用 於CDR序列之替代性編號規定，例如Chothia等人（1989) Nature 342: 877-883中所述之編號規定《抗體之結構及蛋 白質摺疊可意謂其他殘基視為CDR序列之部分且熟習此項 技術者將如此理解。因此，術語「相應CDR」在本文中用 於指使用任何編號規定之CDR序列，例如表1中所述之編 號規定。 熟習此項技術者可用之其他CDR序列編號規定包括 「AbM」（University of Bath)及「接觸」（University College London)方法。可確定使用 Kabat、Chothia、AbM 及接觸方法中之至少兩者的最小重疊區以提供「最小結合 單元」。最小結合單元可為CDR之子部分。 以下表1表示一種使用各編號規定對各CDR或結合單元 進行之定義。Kabat編號方案在表1中用於對可變域胺基酸 序列進行編號。應注意，一些CDR定義可視所使用之個別 出版物而變。 156287.doc -25- 201210612 表1
Kabat CDR Chothia CDR AbM CDR 接觸CDR 最小結合 早兀 H1 31-35/35A/35B 26-32/33/34 26-35/35A/35B 30-35/35A/35B 31-32 H2 50-65 52-56 50-58 47-58 52-56 H3 95-102 95-102 95-102 93-101 95-101 L1 24-34 24-34 24-34 30-36 30-34 L2 50-56 50-56 50-56 46-55 50-55 L3 89-97 89-97 89-97 89-96 89-96 如本文所用之術語「抗原結合位點」係指抗原結合蛋白 上能夠特異性結合抗原之位點。其可為單一域（例如抗原 決定基結合域）或單鏈Fv(ScFv)域，或其可為如標準抗體上 可見之成對VH/VL域。 如本文所用之術語「抗原決定基」係指抗原中與抗原結 合蛋白之特定結合域接觸之部分。抗原決定基可為線性抗 原決定基，包含來自抗原之基本上呈線性的胺基酸序列。 或者，抗原決定基可為構形或不連續抗原決定基。舉例而 言，構形抗原決定基包含需要結構約束元件之胺基酸殘 基。不連續抗原決定基包含由其他序列隔開（亦即在抗原 一級序列中不處於連續序列中）之胺基酸殘基。在抗原三 級結構及四級結構之情形中，不連續抗原決定基之殘基彼 此足夠接近以由抗原結合蛋白結合。 對於核苷酸序列及胺基酸序列，術語「一致」或「序列 一致性」指示兩個核酸序列或兩個胺基酸序列之間的一致 性程度，且必要時屆時藉由適當插入或缺失而進行最佳比 對及比較。 156287.doc -26· 201210612 兩個序列之間的一致性百分比為在考慮兩個序列進行最 佳比對所需引入之空隙數及各空隙長度下，該等序列所共 有之相同位置數的函數（亦即一致性％=相同位置數/總位置 數X100)。如下所述，可使用數學演算法來完成兩個序列 之間的序列比較及確定一致性百分比。 可使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NwSgapdna.CMP 矩陣及空隙權數40、50、60、70或80及長度權數！、2、
3、4、5或6來蜂定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。 亦可使用已併入ALIGN程式（2.0版本）中之e. Meyers及W
Miller之演算法（Comput. Appl_ Biosci.，4:1 1-17 (1988))， 使用PAM120權數殘基表、空隙長度處罰12及空隙處罰4來 確定兩個核苷酸序列或胺基酸序列之間的一致性百分比。 此外，可使用已併入GCG套裝軟體中之GAP程式中的
Needleman及Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))演算 法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及空隙權數μ、 14、12、10、8、6或4及長度權數1、2、3、4' 5或6來確 定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。 在一種方法中’聚核苷酸序列可與如本文所述之參考聚 核音酸序列（參見例如SEQ ID NO: 41-55) —致，亦即1〇〇% 一致’或其與參考序列相比可包括多達某一整數之核苷酸 變化，諸如至少 50%、60%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、98%或99 %—致。該等變化選自至少一個核苷 酸缺失、取代（包括轉換及顛換）或插入，且其中該等變化 可在參考核苷酸序列之5·端或3'端位置或該等末端位置之 156287.doc -27- 201210612 間的任何地方發生，個別地散佈於參考序列之核苷酸之間 或以一或多個毗連群組散佈於參考序列中。核苷酸變化之 數目藉由以如本文所述之參考聚核苷酸序列（參見例如SEQ ID NO: 41 -55)中核苷酸之總數乘以各別一致性百分比之數 值百分比（除以100)且自如本文所述參考聚核苷酸序列（參 見例如SEQ ID NO: 41-55)中之該核苷酸總數減去該乘積來 確定，或者： nn S xn-(xn · y)，其中nn為核苷酸變化數，Xn為如本文所 述之參考聚核苷酸序列（參見例如SEQ ID NO: 41-55)中核 苷酸之總數’且y為0.50(對於50%)、0.60(對於60%)、 0.70(對於 70。/。）、0.75(對於 75%)、0.80(對於 80%)、〇_85(對 於 85%)、0.90(對於 90%)、0.95(對於 95%)、〇·98(對於 98%)、0.99(對於99%)或1.00(對於1〇〇%)，·為乘法算子符 號’且其中xn&y之任何非整數乘積在自〜減去之前向了捨 入至最接近整數。 類似地’多肽序列可與如本文所述之多肽參考序列（參 見例如 SEQ ID NO: 7-40、98或 99)一致，亦即 1〇〇%一致， 或其與參考序列相比可包括多達某一整數之胺基酸變化使 得一致性百分比小於100%，諸如至少50%、60%、7〇〇/。、 75%、80%、85%、90%、95%、98%或 99%—致。該等變 化係選自由至少一個胺基酸缺失、取代（包括保守及非保 守取代）或插入組成之群，且其中該等變化可在參考多狀 序列之胺基或叛基端位置或該等末端位置之間的任何地方 發生，個別地散佈於參考序列中之胺基酸之間或以多 156287.doc -28- 201210612 個毗連群組散佈於參考序列中。指定一致性百分比下之胺 基酸變化數藉由以由如本文所述之多肽參考序列（參見例 如SEQ ID NO·· 7-40、98或99)編碼之多肽序列中的胺基酸 總數乘以各別一致性百分比之數值百分比（除以丨〇 〇)且接著 自如本文所述之多肽參考序列（參見例如SEQ ID N〇: 74〇 或82-108、98或99)令之該胺基酸總數減去該乘積來確定， 或者： na< xa-(xa · y)，其中na為胺基酸變化數，心為如本文所 述之參考多肽序列（參見例如SEq ID N〇: 7 4〇、98或9幻中 之胺基酸總數，且y為〇.50(對於5〇%)、〇 6〇(對於6〇%)、 0.70(對於 70%)、〇.75(對於 75%)、〇.8〇(對於 8〇%)、〇 85(對 於 85%)、0.90(對於 90Q/。）、〇·95(對於 95%)、〇 %(對於 98%)、0.99(對於99%)或1.00(對於1〇〇%)，·為乘法運算子 符號，且其中〜及丫之任何非整數乘積在自心減去之前向下 捨入至最接近整數》 一致性百分比可在序列全長或其任何片段上及在有或無 插入或缺失下確定》 術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」各指包含兩個或兩 個以上胺基酸殘基之分子。肽可為單體肽或聚合肽。 在此項技術中公認，某些胺基酸取代視為「保守性」。 基於常見側鏈性質將胺基酸分組，且維持抗原結合蛋白之 所有或實質上所有結合親和力的組内之取代視為 代，參見下表2 : 156287.doc -29- 201210612 表2 側鏈 成員 疏水性 met、ala、val、leu、ile 中性親水性 cys、ser、thr 酸性 asp、glu 鹼性 asn、gin、his、lys、arg 影響鏈定向之殘基 gly、pro 芳族 trp、tyr、phe 本發明提供特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋 白質。本發明亦提供特異性結合肌肉抑制素且具有至少 100小時之pK的人類化抗原結合蛋白。 本發明提供人類化抗原結合蛋白重鏈序列，其結合肌肉 抑制素且包含SEQ ID NO: 90之CDRH3 ;或其變異型 CDRH3(例如 SEQ ID NO: 3、82-89、91 或 92 中之任一者）， 其中該抗原結合蛋白進一步包含Kabat 28位之絲胺酸殘 基；及以下殘基中之至少一者或其組合或所有以下殘基： Kabat 66位之離胺酸殘基、Kabat 67位之丙胺酸殘基、 Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離胺酸殘基。抗 原結合蛋白亦可中和肌肉抑制素活性。 舉例而言，本發明提供人類化抗原結合蛋白重鏈序列， 其結合肌肉抑制素且包含SEQ ID NO: 90之CDRH3 ;或該 CDRH3之變異體，其中該抗原結合蛋白進一步包含： (a) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 48位之異白胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基及Kabat 69位之白胺酸殘 基； 156287.doc •30- 201210612 (b) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 71位之纈胺酸殘基 及Kabat 73位之離胺酸殘基； (c) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 48位之異白胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基、Kabat 69位之白胺酸殘 基、Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離胺酸殘 基；或 (d) Kabat 20位之異白胺酸殘基、Kabat 28位之絲胺酸殘 基、Kabat 48位之異白胺酸殘基、Kabat 66位之離胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基、Kabat 69位之白胺酸殘 基、Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離‘胺酸殘 基。 上述人類化抗原結合蛋白重鏈序列可進一步包含SEQ ID NO: 2之CDRH2 ;或該CDRH2之變異體。上述人類化抗原 結合蛋白重鏈序列可進一步包含CDRH1 (SEQ ID NO: 1)或 該CDRH1之變異體。 本發明提供人類化抗原結合蛋白輕鏈序列，其特異性結 合肌肉抑制素且包含以下CDR序列中之一者、兩者或三 者： (a) SEQ ID NO: 4 之 CDRL1 或該 CDRL1之變異體； (b) SEQ ID NO: 5之CDRL2或該CDRL2之變異體；及 (c) SEQ ID NO: 109 之 CDRL3 或該 CDRL3之變異體； 其中該抗原結合蛋白進一步包含Kabat 71位之路胺酸殘^ 基，及以下殘基中之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇胺 酸殘基及Kabat 69位之麵醯胺酸殘基。 156287.doc -31 201210612 舉例而言，本發明提供人類化抗原結合蛋白輕鏈序列， 其特異性結合肌肉抑制素且包含SEQ ID NO: 109之 CDRL3 ;或該CDRL3之變異體，其中該抗原結合蛋白進一 步包含： (a) Kabat 69位之麩醯胺酸殘基及Kabat 71位之酷·胺酸殘 基； (b) Kabat 46位之蘇胺酸殘基及Kabat 71位之赂胺酸殘 基；或 (c) Kabat 46位之蘇胺酸殘基、Kabat 69位之Μ醯胺酸殘 基及Kabat 71位之酪胺酸殘基。 上述人類化抗原結合蛋白輕鏈序列可進一步包含SEQ ID NO: 5之CDRL2 ;或該CDRL2之變異體。上述人類化抗原 結合蛋白輕鏈序列可進一步包含CDRL1 (SEQ ID NO: 4)或 該CDRL1之變異體。 本發明提供特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋 白，其包含： (a)重鏈序列，其包含SEQ ID NO: 90之CDRH3，或該 CDRH3之變異體，其中該抗原結合蛋白進一步包含Kabat 28位之絲胺酸殘基，及以下殘基中之至少一者或其組合或 所有以下殘基：Kabat 66位之離胺酸殘基，Kabat 67位之 丙胺酸殘基，Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離 胺酸殘基；及 視情況包含以下序列中之一或兩者：SEQ ID NO: 2之 CDRH2或該CDRH2之變異體；及CDRH1 (SEQ ID NO: 1) 156287.doc ·32· 201210612 或該CDRH1之變異體；及 (b)輕鏈序列，其包含以下CDR序列中之一者、兩者或三 者：SEQ ID NO: 4 之 CDRL1 或該 CDRL1之變異體；SEQ ID NO: 5 之 CDRL2 或該 CDRL2 之變異體；及 SEQ ID NO: 109 之CDRL3或該CDRL3之變異體； 其中該抗原結合蛋白進一步包含Kabat 71位之路胺酸殘 基，及以下殘基中之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇胺 酸殘基及Kabat 69位之麩醯胺酸殘基。 上述人類化抗原結合蛋白除CDRH3序列以外可進一步包 含選自以下之一或多個CDR之任何組合或所有CDR : CDRH1 (SEQ ID NO: 1) ' CDRH2 (SEQ ID NO: 2) > CDRL1 (SEQ ID NO: 4)、CDRL2 (SEQ ID NO: 5)及CDRL3 (SEQ ID NO :6或109);或其變異體（例如CDRH2變異體SEQ ID NO: 93-97、110 中之任一者）。 舉例而言，上述人類化抗原結合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO: 90)及 CDRH1 (SEQ ID NO: 1)或其變異體（例 如CDRH3變異體3、82-89、91、92中之任一者）。人類化 抗原結合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO: 90)及CDRH2 (SEQ ID NO: 2)或其變異體（例如CDRH3變異體SEQ ID NO: 3、82-89、91、92 中之任一者；或 CDRH2變異體 SEQ ID NO: 93-97、110中之任一者）。人類化抗原結合蛋白可 包含CDRH1 (SEQ ID NO: 1)及 CDRH2 (SEQ ID NO: 2)及 CDRH3 (SEQ ID NO: 90)或其變異體（例如CDRH3變異體 SEQ ID NO: 3、82-89、91、92 中之任一者；或 CDRH2變 156287.doc -33- 201210612 異體 SEQ ID NO: 93-97、110 中之任一者）。 人類化抗原結合蛋白可包含CDRL1 (SEQ ID NO: 4)及 CDRL2 (SEQ ID NO: 5)或其變異體。人類化抗原結合蛋白 可包含CDRL2 (SEQ ID NO: 5)及CDRL3 (SEQ ID NO: 6或 109)或其變異體。人類化抗原結合蛋白可包含CDRL1 (SEQ ID NO: 4)、CDRL2 (SEQ ID NO: 5)及 CDRL3 (SEQ ID NO: 6或109)或其變異體。 人類化抗原結合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO: 90)及 CDRL3 (SEQ ID NO: 6或109)或其變異體（例如CDRH3變異 體SEQ ID NO: 3、82-89、91、92中之任一者）。人類化抗 原結合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO: 90)、CDRH2 (SEQ ID NO: 2)及CDRL3 (SEQ ID NO: 6或109)或其變異體（例如 CDRH3 變異體 SEQ ID NO: 3、82-89、92、92 中之任一 者；或CDRH2變異體SEQ ID NO: 93-97、110中之任一 者）。人類化抗原結合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO: 90)、CDRH2 (SEQ ID NO: 2)、CDRL2 (SEQ ID NO: 5)及 CDRL3 (SEQ ID NO: 6或109)或其變異體（例如CDRH3變異 體 SEQ ID NO: 3、82-89、91、92 中之任一者；或 CDRH2 變異體SEQ ID NO: 93-97、110中之任一者）。 人類化抗原結合蛋白可包含CDRH1 (SEQ ID NO: 1)、 CDRH2 (SEQ ID NO: 2或 95)、CDRH3 (SEQ ID NO: 90)、 CDRL1 (SEQ ID NO: 4)、CDRL2 (SEQ ID NO: 5)及 CDRL3 (SEQ ID NO: 6或109)。舉例而言，人類化抗原結合蛋白可 包含 CDRH1 (SEQ ID NO: 1) ' CDRH2 (SEQ ID NO: 95)、 156287.doc ·34· 201210612 CDRH3 (SEQ ID NO: 90)、CDRL1 (SEQ ID NO: 4)、 CDRL2 (SEQ ID NO: 5)及 CDRL3 (SEQ ID NO: 109)。 CDR變異體包括經至少一個胺基酸修飾之胺基酸序列， 其中該修飾可為胺基酸序列之化學或部分變化（例如不超 過10個胺基酸），該修飾允許變異體保留未經修飾序列之 生物學性質。舉例而言，變異體為與肌肉抑制素結合之功 能變異體。CDR胺基酸序列之部分變化可為一至若干個胺 基酸之缺失或取代，或一至若干個胺基酸之添加或插入， 或其組合（例如不超過10個胺基酸）。CDR變異體可在胺基 酸序列中含有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代、添加或缺 失之任何組合。CDR變異體可在胺基酸序列中含有1、2或 3個胺基酸取代、插入或缺失之任何組合。CDR變異體可 在胺基酸序列中含有1個胺基酸取代、插入或缺失。胺基 酸殘基之取代可為保守性取代，例如用一個疏水性胺基酸 取代一替代性疏水性胺基酸。舉例而言，白胺酸可經纈胺 酸或異白胺酸取代。 CDR LI、L2、L3、H1及H2傾向於在結構上呈現有限數 目之主鏈構形之一。CDR之特定典型結構類別係由CDR長 度與環填充（loop packing)定義，由位於CDR與構架區中之 關鍵位置處的殘基（結構決定殘基或SDR)決定。Martin及 Thornton(1996; J Mol Biol 263:800-815)已產生了一種定義 「關鍵殘基」典型模板之自動方法。使用叢集分析來定義 CDR組之典型顏別，且接著藉由分析内埋式疏水物（buried hydrophobics)、氫鍵結殘基及保守性甘胺酸及脯胺酸來鑑 156287.doc -35- 201210612 別典型模板。可藉由將序列與關鍵殘基模板進行比較且使 用一致性或相似性矩陣對各模板進行評分來將抗體序列之 CDR歸類於典型類別》 典型CDR之實例（其中Kabat編號前之胺基酸為SEQ ID NO: 14或24之原始胺基酸序列且Kabat編號後端之胺基酸 序列為所取代之胺基酸）包括： 典型 CDRH1 : Y32I、Y32H、Y32F、Y32T、Y32N、 Y32C、Y32E、Y32D、F33Y、F33A、F33W、F33G、 F33T、F33L、F33V、M34I、M34V、M34W、H35E、 H35N、H35Q、H35S、H35Y、H35T ; 典型 CDRH2 : N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、 N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A ' I51L、I51V、 I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、 Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N、N54S、 N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、 V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、N58S、 N58D、N58R、N58G、N58F、N58Y ; 典型 CDRH3 : V102Y、V102H、V102I、V102S、V102D、 V102G ； 典型 CDRL1 ： D28N、 D28S、 D28E、 D28T、 I29V、 N30D 、N30L 、 N30Y、 N30V、 N30I、 N30S、 N30F、 N30H 、N30G、 N30T、 S31N、 S31T、 S31K、 S31G、 Y32F 、Y32N 、 Y32A、 Y32H、 Y32S 、 Y32R ' L33M、 L33V 、L33I 、 L33F、 S34A、 S34G 、 S34N、 S34H 、 156287.doc -36- 201210612 S34V、S34F ; 典型 CDRL2 : A51T、A51G、A51V ; 典型 CDRL3 : L89Q、L89S、L89G、L89F、Q90N、 Q90H、S91N、S91F、S91G、S91R、S91D、S91H、 S91T、S91Y、S91V、D92N、D92Y、D92W、D92T、 . D92S、D92R、D92Q、D92H、D92A、E93N、E93G、 E93H、E93T、E93S、E93R、E93A、F94D、F94Y、 F94T、F94V、F94L、F94H、F94N、F94I、F94W、 F94P、F94S、L96P、L96Y、L96R、L96I、L96W、 L96F。 每個CDR、每個重鏈或輕鏈可變區、每個重鏈或輕鏈及 每個抗原結合蛋白中可存在多個變異型CDR典型位置，且 因此本發明之人類化抗原結合蛋白中可存在取代之任何組 合，其限制條件為維持CDR之典型結構。 CDR變異體之其他實例包括（使用Kabat編號方案，其中 Kabat編號前之胺基酸為SEQ ID NO: 14或24之原始胺基酸 序列且Kabat編號後端之胺基酸序列為所取代之胺基酸）： H2 : G55D、G55L、G55S、G55T、G55V ; H3 : Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、 • P100B I、W100E F、F100G N、F100G S、F100G Y、 — «Μ — V102N、V102S ; L3 : C91S 。 舉例而言，結合肌肉抑制素之本發明人類化抗原結合蛋 白可包含SEQ ID NO: 90之CDRH3。人類化抗原結合蛋白 156287.doc -37- 201210612 可進一步包含SEQ ID NO: 2、93-97中任一者之CDRH2。 詳言之，CDRH2可為SEQ ID NO: 95。人類化抗原結合蛋 白亦可包含SEQ ID NO: 109之CDRL3。人類化抗原結合蛋 白可進一步包含以下序列中之任一者或其組合或所有以下 序列：CDRH1 (SEQ ID NO: 1)、CDRL1 (SEQ ID NO: 4)及 CDRL2 (SEQ ID NO: 5)。人類化抗原結合蛋白亦可中和肌 肉抑制素活性。 包含CDR之人類化抗原結合蛋白可顯示10B3或10B3嵌合 體（重鏈：SEQ ID NO: 7 或 25，輕鏈：SEQ ID NO: 8)所顯 示效能之10倍以内或5倍以内之結合肌肉抑制素之效能（如 由EC5〇所顯示）。如EC5〇所顯示，結合肌肉抑制素之效能可 利用ELISA檢定測得。 如上文所討論，CDR之特定典型結構類別係由CDR長度 與環填充定義，由位於CDR與構架區中之關鍵位置處的殘 基決定。因此，除如上所述之SEQ ID NO: 1-6、SEQ ID NO: 82-97、SEQ ID NO: 109及 110 中列舉之CDR外，本發 明抗原結合蛋白之典型構架殘基亦可包括（使用Kabat編 號）： 重鏈：2位之V、I或G ; 4位之L或V ; 20位之L、I、Μ或 V ; 22位之C ; 24位之Τ、A、V、G或S ; 26位之G ; 29位之 I、F、L或S ; 36位之W ; 47位之W或Y ; 48位之I、Μ、V 或L ; 69位之I、L、F、M或 V; 78位之A、L、V、Y或 F; 80位之L或Μ ; 90位之Y或F ; 92位之C ;及/或94位之R、 Κ、G、S、Η或Ν ;及/或 156287.doc •38· 201210612 輕鏈：2位之I、L或V; 3位之V、Q、L或E; 4位之Μ或 L ; 23位之C ; 35位之W ; 36位之Υ、L或F ; 46位之S、L、 R或V ; 49位之Υ、H、F或Κ; 71位之Υ或F; 88位之C;及/ 或9 8位之F。 本發明之人類化抗原結合蛋白中可存在上述構架位置中 之任一者、其任何組合或所有上述構架位置。每個重鏈或 輕鏈可變區、每個重鏈或輕鏈及每個抗原結合蛋白中可存 在多個變異型構架典型位置，且因此本發明之人類化抗原 結合蛋白中可存在任何組合，其限制條件為維持構架之典 型結構。 舉例而言，重鏈可變構架可包含2位之V、4位之L、20 位之V、22位之C、24位之A、26位之G、29位之F、36位之 W、47位之W、48位之Μ、69位之Μ、78位之A、80位之 Μ、90位之Y、92位'之C及94位之R。舉例而言，輕鍵可變 構架可包含2位之I、3位之Q、4位之Μ、23位之C、35位之 W、36位之F、46位之S、49位之Υ、71位之Υ、88位之C及 9 8位之F。 人類化重鏈可變域可在與SEQ ID NO·. 10中之人類接受 體可變域序列在構架區中具有75%或75%以上、80%或80% 以上、85%或85%以上、、90%或90%以上、95%或95%以 上、、98%或98%以上、99%或99。/〇以上或100%—致性之 接受體抗體構架内包含如上文所述SEQ ID NO: 1-3 ; SEQ ID NO: 82-97及110中所列之CDR。人類化輕鏈可變域可在 與SEQ ID NO: 11中之人類接受體可變域序列在構架區中 156287.doc -39- 201210612 具有75%或75%以上、80%或80%以上、85%或85%以 上、、90%或90%以上、95%或95%以上、、98%或98%以 上、99%或99%以上或100%—致性之接受體抗體構架内包 含如上文所述SEQ ID NO: 4-6 ;及SEQ ID NO: 109中所列 之 CDR。在 SEQ ID NO: 10 及 SEQ ID NO: 11 中， CDRH3/CDRL3之位置由 X表示。SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 11中之10個X殘基為CDR位置之佔位符且不為各CDR 中胺基酸序列數目之量度。 本發明亦提供人類化抗原結合蛋白，其結合肌肉抑制素 且包含選自 SEQ ID NO: 112、113、114、115、119、120 或121中任一者之重鏈可變區。抗原結合蛋白可包含選自 SEQ ID NO: 116、117或118中任一者之輕鏈可變區。任何 重鏈可變區可與任何輕鏈可變區組合。抗原結合蛋白亦可 中和肌肉抑制素。
人類化抗原結合蛋白可包含以下重鏈及輕鏈可變區組合 中之任一者：H3L4 (SEQ ID NO: 112及 SEQ ID NO: 116)、 H3L5 (SEQ ID NO: 112及 SEQ ID NO: 117)、H3L6 (SEQ ID NO: 112及 SEQ ID NO: 118)、H4L4 (SEQ ID NO: 113及 SEQ ID NO: 116)、H4L5 (SEQ ID NO: 113及 SEQ ID NO: 117)、H4L6 (SEQ ID NO: 113及 SEQ ID NO: 118)、H5L4 (SEQ ID NO: 114及 SEQ ID NO: 116)、H5L5 (SEQ ID NO: 114及 SEQ ID NO: 117)、H5L6 (SEQ ID NO: 114及 SEQ ID NO: 118)、H6L4 (SEQ ID NO: 115及 SEQ ID NO: 116)、 H6L5 (SEQ ID NO: 115及 SEQ ID NO: 117)、H6L6 (SEQ 156287.doc -40- 201210612 ID NO: 115及 SEQ ID NO: 118)、H7L4 (SEQ ID NO: 119及 SEQ ID NO: 116)、H7L5 (SEQ ID NO: 119及 SEQ ID NO: 117)、H7L6 (SEQ ID NO: 119及 SEQ ID NO: 118)、H8L4 (SEQ ID NO: 120及 SEQ ID NO: 116)、H8L5 (SEQ ID NO: 120及 SEQ ID NO: 117)、H8L6 (SEQ ID NO: 120及 SEQ ID NO: 118)、H9L4 (SEQ ID NO: 121 及 SEQ ID NO: 116)、 H9L5 (SEQ ID NO: 121 及 SEQ ID NO: 117)或 H9L6 (SEQ ID NO: 121 及 SEQ ID NO: 118)。 抗體重鏈可變區可與SEQ ID NO: 112、113、114、 115、119、120或121中之任一者（其中存在如本文所定義 之CDRH1、CDRH2及CDRH3或變異體）具有75%或75%以 上、80%或80%以上、85%或85%以上、90%或90%以上、 95%或95〇/〇以上、98%或98%以上、99%或99%以上或100% 一致性；且其中重鏈可變區進一步包含Kabat 28位之絲胺 酸殘基；及以下殘基中之至少一者或其組合或所有以下殘 基：Kabat 66位之離胺酸殘基、Kabat 67位之丙胺酸殘 基、Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離胺酸殘 基。舉例而言，CDRH3為 SEQ ID NO: 90 ; CDRH2為 SEQ ID NO: 2或 95 ; CDRH1 為 SEQ ID NO·· 1。 舉例而言，重鏈可變區可進一步包含： (a) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 48位之異白胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基及Kabat 69位之白胺酸殘 基； (b) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 71位之纈胺酸殘基 156287.doc -41 - 201210612 及Kabat73位之離胺酸殘基； (c) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 48位之異白胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基、Kabat 69位之白胺酸殘 基、Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離胺酸殘 基；或 (d) Kabat 20位之異白胺酸殘基、Kabat 28位之絲胺酸殘 基、Kabat 48位之異白胺酸殘基、Kabat 66位之離胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基、Kabat 69位之白胺酸殘 基、Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離胺酸殘 基。 抗體輕鏈可變區可與SEQ ID NO: 116、117或118中之任 一者（其中存在如本文所定義之CDRL1、CDRL2及CDRL3) 具有75%或75%以上、80%或80%以上、85%或85%以上、 90%或90%以上、95%或95%以上、98%或98%以上、99% 或99%以上或100% —致性；且其中輕鏈可變區進一步包含 Kabat 71位之酪胺酸殘基；及以下殘基中之至少一者或兩 者：Kabat 46位之蘇胺酸殘基及Kabat 69位之麵醯胺酸殘 基。舉例而言，CDRL1 為 SEQ ID NO: 4 ; CDRL2為 SEQ ID NO: 5 ;且 CDRL3為 SEQ ID NO: 109。 舉例而言，輕鏈可變區可進一步包含： (a) Kabat 69位之麩醯胺酸殘基及Kabat 71位之酪胺酸殘 基； (b) Kabat 46位之蘇胺酸殘基及Kabat 71位之酪胺酸殘 基；或 156287.doc -42- 201210612 (C) Kabat 46位之蘇胺酸殘基、Kabat 69位之麩醯胺酸殘 基及Kabat 71位之酪胺酸殘基。 任何重鏈可變區可與任何輕鍵可變區組合。 可在序列全長上確定SEQ ID NO: 112-121之序列之一致 性百分比。 抗體重鏈可變區可為SEQ ID NO: 112、113、114、 115、119、120或121中任一者之變異體，其含有30、25、 20、15、1〇、9、8、7、6、5、4、3、2或 1 個胺基酸取 代 '插入或缺失。抗體輕鏈可變區可為SEQ ID NO: 116、 117或118中任一者之變異體，其含有3〇、25、2〇、15、 10 ' 9 、 8 、 7 、 6 、4、3、2或1個胺基酸取代、插入或 缺失。 舉例而言，上述典型CDR及典型構架殘基取代亦可存在 於作為至少75% —致或含有至多3〇個胺基酸取代之變異型 序列的變異型重鏈或輕鏈中。 任何重鏈可變區可與適合人類悝定區組合。任何輕鏈可 變區可與適合恆定區組合。 本發月亦提t、人類化抗原結合蛋白，其結合肌肉抑制素
一者：H3L4 (SEQ ID N〇: 1 3以下重鏈及輕鏈組合中之任 138及 SEQ ID NO: 145)、 156287.doc -43- 201210612 (SEQ ID NO: 138及 SEQ ID NO: 146)、H3L6 (SEQ ID NO: 138及 SEQ ID NO: 147)、H4L4 (SEQ ID NO: 139及 SEQ ID NO: 145)、H4L5 (SEQ ID NO: 139及 SEQ ID NO: 146)、 H4L6 (SEQ ID NO: 139及 SEQ ID NO: 147)、H5L4 (SEQ ID NO: 140及 SEQ ID NO: 145)、H5L5 (SEQ ID NO: 140及 SEQ ID NO: 146)、H5L6 (SEQ ID NO: 140及 SEQ ID NO: 147)、H6L4 (SEQ ID NO: 141 及 SEQ ID NO: 145)、H6L5 (SEQ ID NO: 141 及 SEQ ID NO: 146)、H6L6 (SEQ ID NO: 141 及 SEQ ID NO: 147)、H7L4 (SEQ ID NO: 142及 SEQ ID NO: 145)、H7L5 (SEQ ID NO: 142及 SEQ ID NO: 146)、 H7L6 (SEQ ID NO: 142及 SEQ ID NO: 147)、H8L4 (SEQ ID NO: 143及 SEQ ID NO: 145)、H8L5 (SEQ ID NO: 143及 SEQ ID NO: 146)、H8L6 (SEQ ID NO: 143及 SEQ ID NO: 147)、H9L4 (SEQ ID NO: 144及 SEQ ID NO: 145)、H9L5 (SEQ ID NO: 144及 SEQ ID NO: 146)、H9L6 (SEQ ID NO.-HA 及 SEQ ID NO: 147)、 H7 失能 L4 (SEQ ID NO: 123 及 SEQ ID NO: 145)、H7 失能 L5 (SEQ ID NO: 123 及 SEQ ID NO: 146)、H7 失能 L6 (SEQ ID NO: 123 及 SEQ ID NO: 147)、H8 失能 L4 (SEQ ID NO: 125 及 SEQ ID NO: 145)、H8 失能 L5 (SEQ ID NO: 125 及 SEQ ID NO: 146)、H8 失能 L6 (SEQ ID NO: 125 及 SEQ ID NO: 147)、H9 失能 L4 (SEQ ID NO: 127 及 SEQ ID NO: 145)、H9 失能 L5 (SEQ ID NO: 127 及 SEQ ID NO: 146)或 H9 失能 L6 (SEQ ID NO: 127 及 SEQ ID NO: 147)。 156287.doc -44 - 201210612 抗體重鏈可與如本文所定義存在CDRHl、CDRH2及 CDRH1或變異體之SEQ ID NO:中之任一者具有75%或 75%以上、80%或80%以上、85%或85%以上、90%或90% 以上、95%或95%以上、98%或98%以上、99%或99%以上 或100%—致性；且其中重鏈進一步包含Kabat 28位之絲胺 酸殘基；及以下殘基中之至少一者或其組合或所有以下殘 基：Kabat 66位之離胺酸殘基、Kabat 67位之丙胺酸殘 基、Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離胺酸殘 基。舉例而言，CDRH3為 SEQ ID NO: 90 ; CDRH2為 SEQ ID NO: 2或 95 ; CDRHl 為 SEQ ID NO: 1。 舉例而言，重鏈可進一步包含： (a) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 48位之異白胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基及Kabat 69位之白胺酸殘 基； (b) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 71位之纈胺酸殘基 及Kabat 73位之離胺酸殘基； (c) Kabat 28位之絲胺酸殘基、Kabat 48位之異白胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基、Kabat 69位之白胺酸殘 基、Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離胺酸殘 基；或 (d) Kabat 20位之異白胺酸殘基、Kabat 28位之絲胺酸殘 基、Kabat 48位之異白胺酸殘基、Kabat 66位之離胺酸殘 基、Kabat 67位之丙胺酸殘基、Kabat 69位之白胺酸殘 基、Kabat 71位之纈胺酸殘基及Kabat 73位之離胺酸殘 156287.doc -45- 201210612 基。 抗體輕鏈可與如本文所定義存在CDRLl、CDRL2及 CDRL3或變異體之SEQ ID NO:中之任一者具有75%或 75%以上、80%或80%以上、85%或85%以上、90%或90% 以上、95%或95%以上、98%或98%以上、99%或99%以上 或100%—致性；且其中輕鏈進一步包含Kabat 71位之酪胺 酸殘基；及以下殘基中之至少一者或兩者：Kabat 46位之 蘇胺酸殘基及Kabat 69位之麵酿胺酸殘基。舉例而言， CDRL1 為 SEQ ID NO: 4 ; CDRL2 為 SEQ ID NO: 5 ;且 CDRL3為 SEQ ID NO: 109。 舉例而言，輕鏈可進一步包含： (a) Kabat 69位之麩醯胺酸殘基及Kabat 71位之酪胺酸殘 基； (b) Kabat 46位之蘇胺酸殘基及Kabat 71位之酪胺酸殘 基；或 (c) Kabat 46位之蘇胺酸殘基、Kabat 69位之麩醯胺酸殘 基及Kabat 71位之酪胺酸殘基。 可在序列全長上確定SEQ ID NO:之序列之一致性百分 比。 抗體重鏈可為SEQ ID NO:中任一者之變異體，其含有 30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或 1個胺 基酸取代、插入或缺失。抗體輕鏈可為SEQ ID NO:中任 一者之變異體，其含有30、25、20、15、10、9、8、7、 6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、插入或缺失。 156287.doc • 46· 201210612 舉例而言，上述典型CDR及典型構架殘基取代亦可存在 於作為至少75%—致或含有至多30個胺基酸取代之變異型 序列的變異型重鏈或輕鏈中。 如上文所述之抗原結合蛋白，例如藉由化學修飾及/或 插入、缺失或取代一或多個胺基酸殘基而具有序列部分變 化之變異體，或與任何上述序列具有75%或75%以上、 80%或80%以上、85%或85%以上、90%或90%以上、95% 或95%以上、98%或98%以上或99%或99%以上之一致性的 變異體可如EC5G所示，顯示在10B3或10B3嵌合體（重鏈： SEQ ID NO: 7或25，輕鏈：SEQ ID NO: 8)所示效能的10倍 以内或5倍以内的與肌肉抑制素結合之效能。如EC50所 示，與肌肉抑制素結合之效能可利用ELISA檢定測得。 本發明之抗原結合蛋白可經Fc失能。一種達成Fc失能之 方式包含取代重鏈恆定區之235位及237位（EU索引編號）處 之丙胺酸殘基。舉例而言，抗原結合蛋白可經F c失能且包 含 SEQ ID NO: 123(人類化重鏈：H7_G55S-F100G_Y Fc 失 能）；或 SEQ ID NO: 125(人類化重鏈：H8_G55S-F100G_Y Fc 失能）；或 SEQ ID NO: 127(人類化重鏈：H9_G55S-F100G—Y Fc失能）之序列。或者，抗原結合蛋白可經Fc賦 能且不包含235位及237位之丙胺酸取代。 本文所述之人類化抗原結合蛋白所結合之肌肉抑制素之 抗原決定基可為構形或不連續抗原決定基。本文所述之人 類化抗原結合蛋白可能不與肌肉抑制素上之線性抗原決定 基結合，例如該抗原結合蛋白可能不與還原或變性之肌肉 156287.doc -47- 201210612 抑制素樣品結合。該構形或不連續抗原決定基可能與肌肉 抑制素受體結合位點相同、類似或重疊。當肌肉抑制素呈 成熟形式且為與另一肌肉抑制素分子之二聚體（均二聚體) 之一部分時’抗原決定基可為可接近的。當肌肉抑制素呈 成熟形式且為與所述其他肌肉抑制素結合分子之四聚體之 一部分時，抗原決定基亦可為可接近的。抗原決定基可分 佈於兩個肌肉抑制素多肽上。此類型之不連續抗原決定基 可包含各肌肉抑制素分子之序列。在二聚體之三級及四級 結構中，該等序列可彼此足夠接近以形成抗原決定基且由 抗原結合蛋白結合。構形及/或不連續抗原決定基可由例 如CLIPSTM(Pepscan Systems)之已知方法鑑別。 使用肽掃描（pepscan)，骨架上之化學鍵聯免疫原性肽 (Chemically Linked Immunogenic Peptides on Scaffolds » CLIPS)技術對1〇33(：之肌肉抑制素結合位點的後績分析表 明肌肉抑制素t「PRGSAGPC：C：TPTKMS」胺基酸序列可 能為叙合抗體之結合位點。肽掃描方法使用限制性狀。 在人類中或鼠類動物模射，人類化抗原結合蛋白之活 體内半衰期可為至少6小時、至少】天、至少2天至少3 天、至少4天、至少5天、至少7天或至少9天。 人類化抗原結合蛋白所結合之肌 多肽。肌肉抑制素可於溶液中或可 而言，肌肉抑制素可附著於珠粒， 肉抑制素多肽可為重組 附者於固體表面。舉例 諸如磁性珠粒。肌肉抑 制素可經生物素化 子藉由與固體表面 。可使用與肌肉抑制素結合之生物素分 上之生物素-抗生蛋白鏈菌素偶合來使 156287.doc •48· 201210612 肌肉抑制素固定於固體表面上。 人類化抗原結合蛋白可來源於大鼠、小鼠、靈長類動物 (例如食蟹獼猴（cynomolgus monkey)、舊世界猴（Old World monkey)或大猿（Great Ape))或人類。抗原結合蛋白可為人 類化抗體或嵌合抗體。 人類化抗原結合蛋白可包含恆定區，其可具有任何同型 (isotype)或子類。怪定區可為IgG同型，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4或其變異體。抗原結合蛋白恆定區可為 IgGl。 抗體之Fc效應部分之突變改變可用於改變FcRn與抗體之 間相互作用的親和力以調節抗體週轉（turnover)。可延長抗 體之活體内半衰期。此有益於患者群體，因為藉由維持活 體内IC50較長時段可達成最大劑量及最大給藥頻率。因為 肌肉抑制素為可溶性目標，所以可整體或部分移除抗體之 Fc效應功能。此移除可使安全性概況增加。 包含恆定區之人類化抗原結合蛋白可具有降低之ADCC 及/或補體活化或效應功能性。恆定域可包含IgG2或IgG4 同型之天然失能恆定區或突變型IgGl恆定域。適合修飾之 實例描述於EP0307434中。一種達成Fc失能之方式包含取 代重鏈恆定區之235位及237位（EU索引編號）處之丙胺酸殘 基。 人類化抗原結合蛋白可包含一或多個選自突變型恆定域 之修飾以使抗體具有增強之效應功能/ADCC及/或補體活 化。適合修飾之實例描述於Shields等人J. Biol. Chem 156287.doc -49- 201210612 (2001) 276:6591-6604，Lazar等人PNAS (2006) 103:4005, 4010 及 US 6737056、WO 2004063351 及 WO 2004029207 中ο 人類化抗原結合蛋白可包含具有改變之糖基化概況的恆 定域以使該抗原結合蛋白具有增強之效應功能/ADCC及/ 或補體活化。產生具有改變之糖基化概況之抗原結合蛋白 的合適方法之實例描述於WO 2003/01 1878、WO 2006/014679及 ΕΡ1229125 中。 本發明亦提供編碼如本文所述之人類化抗原結合蛋白之 核酸分子。該核酸分子可包含編碼以下之序列：（i) 一或多 個CDRH、重鏈可變序列或全長重鏈序列；及（Π)—或多個 CDRL、輕鏈可變序列或全長輕鏈序列，其中⑴及（ii)在同 一核酸分子上。或者，編碼本文所述之人類化抗原結合蛋 白之核酸分子可包含編碼以下之序列：（a) —或多個 CDRH、重鏈可變序列或全長重鏈序列；或（b) —或多個 CDRL、輕鏈可變序列或全長輕鏈序列，其中（a)及（b)在各 別核酸分子上。 編碼重鏈之核酸分子可包含SEQ ID NO: 122、124、 126、128-131、135-137中之任一者。編碼輕鏈之核酸分子 可包含SEQ ID NO: 132、133或134中之任一者。 或者，編碼重鏈之核酸分子可包含變異型重鏈DNA序 列，其編碼 SEQ ID NO: 123、125、127 或 138-144 之重鏈 胺基酸序列。編碼輕鏈之核酸分子可包含變異型輕鏈DNA 序列，其編碼SEQ ID NO: 145、146或147之輕鏈胺基酸序 156287.doc -50· 201210612 列。 編碼抗原結合蛋白之核酸分子可包含以下重鏈及輕鏈組 合中之任一者：H3L4 (SEQ ID NO: 128 及 SEQ ID NO: 132) ' H3L5 (SEQ ID NO: 128及 SEQ ID NO: 133)、H3L6 (SEQ ID NO: 128及 SEQ ID NO: 134)、H4L4 (SEQ ID NO: 129及 SEQ ID NO: 132)、H4L5 (SEQ ID NO: 129及 SEQ ID NO: 133)、H4L6 (SEQ ID NO: 129及 SEQ ID NO: 134)、 H5L4 (SEQ ID NO: 130及 SEQ ID NO: 132)、H5L5 (SEQ ID NO: 130及 SEQ ID NO: 133)、H5L6 (SEQ ID NO: 130及 SEQ ID NO: 134)、H6L4 (SEQ ID NO: 131 及 SEQ ID NO: 132)、H6L5 (SEQ ID NO: 131 及 SEQ ID NO: 133)、H6L6 (SEQ ID NO: 131 及 SEQ ID NO: 134)、H7L4 (SEQ ID NO: 135及 SEQ ID NO: 132)、H7L5 (SEQ ID NO: 135及 SEQ ID NO: 133)、H7L6 (SEQ ID NO: 135及 SEQ ID NO: 134)、 H8L4 (SEQ ID NO: 136及 SEQ ID NO: 132)、H8L5 (SEQ ID NO: 136及 SEQ ID NO: 133)、H8L6 (SEQ ID NO: 136及 SEQ ID NO: 134)、H9L4 (SEQ ID NO: 137及 SEQ ID NO: 132)、H9L5 (SEQ ID NO: 137及 SEQ ID NO: 133)、H9L6 (SEQ ID NO: 137 及 SEQ ID NO: 134)、H7 失能 L4 (SEQ ID NO: 122 及 SEQ ID NO: 132)、H7 失能 L5 (SEQ ID NO: 122 及 SEQ ID NO: 133)、H7 失能 L6 (SEQ ID NO: 122 及 SEQ ID NO: 134)、H8 失能 L4 (SEQ ID NO: 124 及 SEQ ID NO: 132)、H8 失能 L5 (SEQ ID NO: 124 及 SEQ ID NO: 133)、H8 失能 L6 (SEQ ID NO: 124 及 SEQ ID NO: 134)、H9 失能 L4 156287.doc -51 - 201210612 (SEQ ID NO: 126 及 SEQ ID NO: 132)、H9 失能 L5 (SEQ ID NO: 126 及 SEQ ID NO: 133)或 H9 失能 L6 (SEQ ID NO: 126 及 SEQ ID NO: 134)。 本發明亦提供包含如本文所述之核酸分子的表現載體。 亦提供包含如本文所述之表現載體的重組宿主細胞。 本文所述之人類化抗原結合蛋白可在合適宿主細胞中產 生。產生如本文所述之抗原結合蛋白的方法可包含培養如 本文所述之宿主細胞及回收抗原結合蛋白之步驟。經轉 型 '轉染或轉導之重組宿主細胞可包含至少一個表現卡 匡’其中該表現卡匣包含編碼本文所述之抗原結合蛋白之 重鏈的聚核苷酸且進一步包含編碼本文所述之抗原結合蛋 白之輕鏈的聚核苷酸。或者，經轉型、轉染或轉導之重組 宿主細胞可包含至少-個表現卡m第—表現卡£包 含編碼本文所述之抗原結合蛋白之重鏈的聚核普酸’且該 宿主細胞進-步包含含有編碼本文所述之抗原結合蛋白之 輕鏈之聚核苷酸的第二卡匣。錄 h ^ 經穩定轉型之宿主細胞可包 含含有-或多個編碼本文所述之抗原結合蛋白之重鍵及/ 或輕鏈之表現卡㈣_。舉例心，料宿主細胞可包 含編碼輕鏈之第-載體及編碼重鍵之第二載體。 宿主細胞可為真核細胞，例
J如甫乳動物細胞。該等細胞 株之實例包括CHO或NS0。浍士 A —1 但主細胞可為非人類宿主細 胞。佰主細胞可為非胚胎宿 类a卜 伯主細胞。宿主細胞可培養於培 養基中’例如無血清培養基。 人類化抗原結合蛋白可由宿 主細胞为泌至培養基中。對於人 、3有抗原結合蛋白之該培養 156287.doc -52. 201210612 基，可將人類化抗原結合蛋白純化為至少95%純或95%純 以上（例如98%純或98%純以上）。 可提供包含人類化抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載 劑之醫藥組合物。可提供包含醫藥組合物以及使用說明書 的分裝部分之套組（kit-of-parts)。為方便起見，套組可包 含預定量之試劑及使用說明書。 抗體結構 完整抗體 基於恆定區之胺基酸序列，來自大多數脊椎動物物種之 抗體之輕鏈可歸類為兩種稱作κ及λ之類型之一。視該等抗 體之重鏈之恆定區的胺基酸序列而定，人類抗體可歸類為 五種不同類別，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA可 進一步細分為子類，IgGl、IgG2、IgG3及IgG4 ;及IgAl.及 IgA2。小鼠及大鼠中存在物種變異體，至少具有IgG2a、 IgG2b ° 可變區之更保守部分稱為構架區（FR)。完整重鏈及輕鏈 之可變域各自包含由三個CDR連接之四個FR。各鏈中之 CDR由FR區極接近地保持在一起且與來自另一鏈之CDR-起幫助形成抗體之抗原結合位點。 恆定區不直接參與抗體與抗原之結合，而是展現各種效 應功能，諸如參與抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、經由與FcY受體結合參與吞噬作用、經由新生兒 Fc受體（FcRn)參與半衰期/清除率及經由補體級聯之Clq組 分參與補體依賴性細胞毒性。 156287.doc -53- 201210612 已報導人類IgG2恆定區基本上缺乏藉由經典路徑活化補 體或介導抗體依賴性細胞毒性之能力。已報導IgG4恆定區 缺乏藉由經典路徑活化補體之能力且僅微弱地介導抗體依 賴性細胞毒性。基本上缺乏該等效應功能之抗體可稱為 『非溶解性』抗體。 人類抗體 人類抗體可藉由熟習此項技術者已知的許多方法產生。 可使用人類骨髓瘤或小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株藉由融 合瘤方法製備人類抗體，參見Kozbor (1984) J· Immunol 133, 3001 及 Brodeui^ Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)。替代性方法包括使用噬菌體文庫或轉殖基因小 鼠，兩者均利用人類可變區譜系（參見Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455 ； Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 1 1-23) ° 現可獲得轉殖基因小鼠之若干品系，其中其小鼠免疫球 蛋白基因座已經人免疫球蛋白基因區段置換（參見 Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727 ； Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14: 845-851 ； Mendez (1997) Nature Genetics，15: 146-156)。抗原攻毒時，該等小鼠能夠產生 可自其中選擇相關抗體之人類抗體譜系。 可使用噬菌體呈現技術產生人類抗原結合蛋白（及其片 段），參見McCafferty (1990) Nature 348: 552-553及Griffiths 等人（1994) EMBO 13: 3245-3260。 156287.doc -54- 201210612 親和力成熟技術（Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783) 可用於改良結合親和力，其中初級人類抗體之親和力藉由 用天然存在之變異體依序置換Η鏈及L鏈可變區且基於改 良之結合親和力進行選擇進行改良。該技術之變體現亦可 獲得，諸如「抗原決定基印記」，參見例如WO 93/06213 ; Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 〇 嵌合抗體及人類化抗艘 嵌合抗體通常使用重組DNA方法產生。使用習知程序， 例如藉由使用能夠與編碼抗體之Η鏈及L鏈之基因特異性 結合的寡核苷酸探針，分離編碼抗體之DNA(例如cDNA) 且對其進行定序。融合瘤細胞用作該DNA之典型來源。分 離後，將該DNA置於表現載體中，隨後將該等表現載體轉 染至不會以其他方式產生免疫球蛋白之宿主細胞（諸如大 腸桿菌（五· co/〇、COS細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞）中以 合成抗體。DNA可藉由用人類L鏈及Η鏈之編碼序列取代 相應非人類（例如鼠類）11及L恆定區來修飾，參見例如 Morrison (1984) PNAS 81: 6851。 可藉由僅將非人類（例如鼠類）抗體（「供體」抗體）之 CDR移植於人類構架（「接受體構架」）及恆定區上以產生 人類化抗體來達成免疫原性之大幅降低（參見Jones等人 (1986) Nature 321: 522-525 ;及 Verhoeyen 等人（1988) Science 239: 1534-1536)。然而，CDR移植本身可能不能 完全保留抗原結合性質且經常發現若將恢復顯著抗原結合 親和力，則需要在人類化分子中保留供體抗體之一些構架 156287.doc -55- 201210612
殘基（有時稱為「回復突變」）（參見Queen等人（1989) PNAS 86. 10,029-10,033: Co 等人（1991) Nature 351: 501-502)。 在此情況下’自資料庫中選擇與非人類供體抗體顯示最大 序列同源性之人類可變區以提供人類構架（FR)。可自人類 共同抗體或個別人類抗體選擇人類FR。必要時，可將來自 供體抗體之關鍵殘基取代至人類接受體構架中以保持Cdr 構形》可使用抗體之電腦模型化來幫助鑑別該等結構上重 要之殘基，參見WO 99/48523。 或者，可由「面飾（veneering)」方法達成人類化。獨特 人類及鼠類免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區之統計分析揭示 人類抗體與鼠類抗體中暴露殘基之精確型態不同且大部分 個別表面位置極傾向於少數不同殘基（參見Padlan等人 (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498 ;及 Pedersen等人（1994) J. Mol. Biol. 235: 959-973)。因此，可藉由置換非人類Fv 之構架區中與人類抗體中通常所發現不同之暴露殘基來降 低非人類Fv之免疫原性。因為蛋白質抗原性可能與表面可 接近性有關’所以置換表面殘基可足以使得小鼠可變區為 人類免疫系統「不可見」（亦參見Mark等人（1994)，
Handbook of Experimental Pharmacology 第 113 卷：The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134)。此人類化程序稱為「面飾」，因為僅改變抗體 表面而支撑殘基保持原狀》其他替代性方法包括 W004/006955 中所述之方法及 HumaneeringTM(Kalobios)之 程序’該程序利用細菌表現系統且產生序列接近於人類生 156287.doc -56- 201210612 殖系之抗體（Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics， 2007年 1 月，San Diego, California)。 雙特異性抗原結合蛋白 雙特異性抗原結合蛋白為對至少兩個不同抗原決定基具 有結合特異性之抗原結合蛋白。製備該等抗原結合蛋白之 方法在此項技術中已知。傳統上，雙特異抗原結合蛋白之 重組產生係基於兩個免疫球蛋白Η鏈-L鏈對之共表現，其 中兩個Η鏈具有不同結合特異性，參見Millstein等人（1983) Nature 305: 537-539 ; WO 93/08829 ;及 Traunecker 等人 (1991) EMBO 10: 3655-3659。由於Η鏈及L鏈之隨機分 配，可能產生10種不同抗體結構之混合物，其中僅1種具 有所需結合特異性。替代性方法涉及使具有所需結合特異 性之可變域與包含至少一部分鉸鏈區、CH2區及CH3區之 重鏈恆定區融合。含有輕鏈結合所必需之位點的CH1區可 存在於至少一種融合體中。將編碼該等融合體之DNA及L 鏈（若需要）插入各別表現載體中且接著共轉染至合適宿主 生物體中。然而，有可能將兩個或全部三個鏈之編碼序列 插入一個表現載體中。在一種方法中，雙特異性抗體由Η 鏈（在一臂中具有第一結合特異性）及Η鏈-L鏈對（在另一臂 中提供第二結合特異性）構成，參見W0 94/04690。亦參見
Suresh等人（1986) Methods in Enzymology 121: 210 〇 抗原結合片段 缺乏恆定區之片段缺乏藉由經典路徑活化補體或介導抗 體依賴性細胞毒性之能力。傳統上，該等片段係藉由例如 156287.doc •57· 201210612 利用木瓜蛋白酶消化對完整抗體進行蛋白水解消化而產生 (參見例如WO 94/29348)，但亦可由經重組轉型之宿主細 胞直接產生。關於產生ScFv’參見Bird等人（1988) Science 242: 423-426。此外’可使用如下文所述之多種工程改造 技術產生抗原結合片段》 與Fab片段相比，Fv片段之兩個鏈似乎具有較低相互作 用能。為穩定VH域與VL域之締合，使其與肽等人 (1988) Science 242: 423-426 ; Huston 等人（1988) PNAS 85(16): 5879-5883)、二硫橋（Glockshuber 等人（1990)
Biochemistry 29: 1362-1367)及「孔中丘型（knob in hole)」 突變（Zhu 等人（1997) Protein Sci.，6: 781-788)連接。ScFv 片段可藉由熟習此項技術者熟知之方法產生，參見
Whitlow 等人（1991) Methods Companion Methods Enzymol， 2. 97-105及Huston專人（1993) Int. Rev. Immunol 10: 195_ 217。ScFv可在細菌細胞（諸如大腸桿菌）或真核細胞中產 生。ScFv之一缺點在於該產物為單價（此阻礙藉由多價結 合使親合力增加）及其短暫半衰期》克服該等問題之嘗試 包括藉由化學偶合自含有額外c端半胱胺酸之ScFv(Adams 等人（1993) Can. Res 53: 4026-4034;及 McCartney 等人 (1995) Protein Eng· 8: 301-314)或藉由含有不成對c端半胱 胺酸殘基之ScFv之自發位點特異性二聚作用（參見
Kipriyanov等人（1995) Cell. Biophys 26: 187-204)產生二價 (ScFv’)2。或者’可藉由縮短肽連接子至3至12個殘基來迫 使ScFv形成多聚體以形成「雙功能抗體」，參見H〇iiiger 156287.doc -58- 201210612 等人（1993) PNAS 90: 6444-6448。進一步縮短連接子可產 生ScFv三聚體（「三功能抗體」，參見Kortt等人（1997) Protein Eng 10: 423-433)及四聚體（「四功能抗體」，參見 Le Gall等人（1999) FEBS Lett，453: 164-168) » 亦可藉由與 蛋白質二聚基元遺傳融合來構築二價ScFv以形成「微小抗 體（miniantibody)」（參見 Pack等人（1992) Biochemistry 31: 1579-1584)及「微型抗體（minibody)」（參見Hu等人（1996) Cancer Res. 56: 3055-3061)。亦可藉由利用第三肽連接子 連接兩個ScFv單元來產生ScFv-Sc-Fv串聯（（ScFv)2) ’參見 Kurucz等人（1995) J. Immol. 154: 4576-4582。可經由兩個 單鏈融合產物（由來自一抗體之VH域經由短連接子連接至 另一抗體之VL域組成）之非共價締合來產生雙特異性雙功 能抗體，參見Kipriyanov等人（1998) Int. J. Can 77: 763-772。可藉由引入如上文所述之二硫橋或「孔中丘型」突 變或藉由形成單鏈雙功能抗體（ScDb)(其中兩個雜交ScFv 片段經由肽連接子連接）來增強該等雙特異性雙功能抗體 之穩定性，參見 Kontermann 等人（1999) J. Immunol. Methods 226:179-188。四價雙特異性分子可藉由例如經由 絞鏈區使ScFv片段融合至IgG分子之CH3域或Fab片段來獲 得，參見 Coloma 等人（1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163。或者，藉由雙特異性單鏈雙功能抗體之融合產生四 價雙特異性分子（參見Alt等人（1999) FEBS Lett 454: 90-94)。亦可藉由具有含有螺旋·環-螺旋基元之連接子之 微小抗體，參見Muller等人（1998) 156287.doc •59· 201210612 FEBS Lett 432: 45-49)或在一個方向上包含四個抗體可變 域（VH及Vl)從而防止分子内配對之單鏈分子（串聯雙功能 抗體’參見Kipdyanov等人（1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56) 之二聚作用形成較小四價雙特異性分子。可藉由Fab，片段 之化學偶合或藉由經由白胺酸拉鏈之異二聚作用產生雙特 異性 F(ab')2片段（參見 Shalaby 等人（1992) J. Exp. Med. 175: 217-225;及 Kostelny 等人（1992)，J. Immunol· 148: 1547_ 1553)。亦可獲得經分離之Vh域及Vi^(D〇mantis pic)，參 見 US 6,248,516 ; US 6,291,158 ;及 US 6,172,197。 異結合抗鱧 異結合抗體由使用任何便利交聯方法形成之兩個共價連 接之抗體構成。參見例如U S 4，6 7 6，9 8 0。 其他修飾 本發明之抗原結合蛋白可包含其他修飾以增強或改變其 效應功能。咸彳§抗體Fc區與各種Fc受體（FcyR)之間的相互 作用介導該抗體之效應功能，該等效應功能包括抗體依賴 性細胞毒性（ADCC)、補體固定、吞噬作用及抗體之半衰 期/清除率。可視所需性質對抗體之Fc區進行各種修飾。 舉例而言’在Fc區中進行特定突變從而使本身具溶解性之 抗體不具溶解性詳細描述於EP 0629 240及EP 0307 434 中，或可將救助受體結合抗原決定基併入抗體中以增加血 清半衰期，參見US 5,739,277。人類FcY受體包括FcyR ⑴、FcyRIIa、FqRIIb、FCYRIIIa及新生兒 FcRn。Shields 等人（2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604證明一組共用 156287.doc -60- 201210612
IgGl殘基參與結合所有FcyR，而FcyRII及FcyRIII利用除該 組共用殘基以外的不同位點。一組IgGl殘基在變為丙胺酸 降低與所有 FcyR之結合：pro_238、Asp-265、Asp-270、 Asn-297及Pro-239。該等殘基全部位於IgG CH2域中且在 聯接CH1與CH2之鉸鏈附近形成叢集。儘管FcYRI僅利用該 組共用IgGl殘基進行結合，但FcyRII及FcyRIII與除該組共 用殘基以外的不同殘基相互作用。改變一些殘基僅降低與 FcyRII(例如Arg-292)或FcyRIII(例如Glu-293)之結合。一些 變異體展示與FcyRII或FcyRIII之結合改良但不影響與其他 受體之結合（例如Ser-267Ala改良與FcyRII之結合但與 FcyRIII之結合不受影響）。其他變異體展現與FcyRII或 FcyRIII之結合改良且降低與其他受體之結合（例如Ser-298Ala改良與FcyRIII之結合且降低與FcyRII之結合）。對 於FcyRIIIa，最佳結合IgGl變異體具有Ser-298、Glu-333 及Lys-334之組合丙胺酸取代。咸信新生兒FcRn受體參與 抗體清除及跨組織之轉胞吞作用（參見Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57 ;及 Ghetie等人（2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766)。經確定與人類FcRn直接發生相互 作用之人類IgGl殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、 Thr307、Gln311、Asn434及His435。在此部分所述之任何 位置進行取代能夠增加抗體之血清半衰期及/或改變抗體 之效應性質。 其他修飾包括抗體之糖基化變異體。已知抗體在其怪定 區中保守位置處之糖基化對抗體功能具有深遠影響，尤其 156287.doc -61 - 201210612 效應功能’諸如上文所述之效應功能，參見例如Boyd等人 (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318。涵蓋抗體或其抗原 結合片段之糖基化變異體’其中添加、取代、缺失或修飾 一或多個碳水化合物部分。引入天冬醯胺_χ_絲胺酸或天 冬醯胺-X-蘇胺酸基元產生酶促連接碳水化合物部分之潛 在位點且因此可用於操縱抗體糖基化。在Raju等人（2001)
Biochemistry 40: 8868-8876 中，使用 β·ι，4-半乳糖基轉移酶 及/或α，2,3唾液酸基轉移酶經由再半乳糖苷化及/或再唾液 酸化過程增加TNFR-IgG免疫黏附素之末端唾液酸化。咸 信增加末端唾液酸化會增加免疫球蛋白之半衰期。與大多 數醣蛋白相同，抗體通常產生為糖型（glyC0f0rm)之混合 物。當在真核細胞、尤其哺乳動物細胞中產生抗體時，此 混合物尤其明顯。已發展多種方法來製造確定糖型，參見
Zhang 等人（2004) Science 303: 371: Sears 等人（2001) Science 291: 2344 ; Wacker 等人（2002) Science 298: 1790; Davis 等人（2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang 等人 (2001) Acc. Chem. Res 34: 727。如本文所述之抗體（例如 IgG同型（例如IgGl)之抗體）可包含確定數目（例如7個或7個 以下，例如5個或5個以下，諸如2個或1個）之糖型。 抗體可與諸如聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇或聚環氧烷之 非蛋白質性聚合物偶合。蛋白質與PEG結合為增加蛋白質 半衰期以及降低蛋白質之抗原性及免疫原性的既定技術。 已利用完整抗體以及Fab'片段研究不同分子量及類型（線性 或分支）之聚乙二醇化之使用，參見Koumenis等人（2000) I56287.doc -62· 201210612
Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95 〇 產生方法 抗原結合蛋白可在轉殖基因生物體中產生，諸如山羊 (參見 Pollock 等人（1999) J. Immunol. Methods 231: 147- 157)、雞（參見 Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55)、小鼠（參見Pollock等人），或植物（參見Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11： 199-204 ； Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606; Baez等人（2000) BioPharm 13: 50-54;
Stoger等人（2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590)。 亦可藉由化學合成產生抗原結合蛋白。然而，通常使用 熟習此項技術者熟知的重組細胞培養技術產生抗原結合蛋 白。分離編碼抗原結合蛋白之聚核苷酸且插入可複製載體 (諸如質體）中以用於進一步選殖（擴增）或表現。一種表現 系統為麵胺酸合成酶系統（諸如Lonza Bi〇i〇gics所出售）， 尤其在宿主細胞為CH0或NS0之情況下。編碼抗原結合蛋 白之聚核苷酸容易使用習知程序（例如募核苷酸探針）分離 及定序。可使用之載體包括質體、病毒、噬菌體、轉座 子、微型染色體，其中通常使用質體。通常，該等載體進 -步包括信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化 子元件、啟動子及轉錄終止序列可操作地連接於抗原結合 蛋白聚核普自文以促進表現。可將編碼輕鏈及重鏈之聚核苦 酸插入各別裁體中且同時或依序引入（例如藉由轉型、轉 染、電穿孔或轉導）同一宿主細胞中，或必要時在該引入 之前可將重鏈與輕鏈插入同一載體中。 156287.doc -63- 201210612 可使用密碼子最佳化，意圖使得用經密碼子最佳化之基 因轉染時宿主細胞所產生之蛋白質的總含量相較於用野生 型序列轉染時之含量較高。已公開若干種方法（Nakamura 專人（1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215 I W098/34640 ; W097/1 1086)。由於遺傳密碼之冗餘，本文 所揭示聚核苷酸（尤其經密碼子最佳化以供在特定宿主細 胞中表現之聚核苷酸）之替代性聚核苷酸亦可編碼本文所 述之抗原結合蛋白。可修改本發明抗原結合蛋白之密碼子 使用以適應宿主細胞之密碼子偏好，諸如以增加轉錄物及/ 或產物產率（例如Hoekema 等人 Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24)。密碼子之選擇可基於與用於表現之宿主細胞之 合適相容性。 信號序列 抗原結合蛋白可產生為具有異源信號序列之融合蛋白， 該融合蛋白在成熟蛋白之N端具有特定裂解位點。信號序 列應由宿主細胞識別及加工。對於原核宿主細胞，信號序 列可為例如驗性鱗酸酶、青黴素酶（penicillinase)或熱穩定 性腸毒素II前導序列。對於酵母分泌，信號序列可為例如 酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列或酸性磷酸酶前導 序列，參見例如WO90/13646。在哺乳動物細胞系統中， 諸如單純疱疹gD信號之病毒分泌性前導序列及原生免疫球 蛋白信號序列可為合適的。通常，信號序列在閱讀框架中 連接於編碼抗原結合蛋白之DNA。可使用諸如SEQ ID NO: 9中所示之信號序列。 156287.doc •64- 201210612 複製起點 複製起點在此項技術中已為熟知，其中pBR322適於大 多數革蘭氏陰性細菌（gram-negative bacteria)，2μ質體適 於大多數酵母，且諸如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或 BPV之各種病毒起點適於大多數哺乳動物細胞。通常，哺 乳動物表現載體無需複製起點組分，但可使用SV40，因為 其含有早期啟動子。 選擇標記 典型選擇基因編碼如下蛋白質，其（a)賦予對抗生素或其 他毒素（例如安比西林（ampicillin)、新黴素（neomycin)、甲 胺0禁吟（methotrexate)或四環素（tetracycline))之抗性，或 (b)補充自養不足（auxiotrophic deficiency)或供應複合培養 基中不可獲得之營養物，或（c)兩者之組合。選擇方案可涉 及遏止宿主細胞生長。已經編碼抗原結合蛋白之基因成功 轉型之細胞由於例如共同傳遞之選擇標記所賦予之耐藥性 而存活。一實例為DHFR選擇標記，其中轉型體在曱胺喋 呤存在下培養。可在遞增量之曱胺喋呤存在下培養細胞以 擴增相關外源基因之複本數。對於DHFR選擇，CHO細胞 為尤其適用之細胞株。另一實例為麩胺酸合成酶表現系統 (Lonza Biologies)。用於酵母之選擇基因之一實例為trpl基 因，參見Stinchcomb等人（1979)Nature 282:38。 啟動子 適於表現抗原結合蛋白之啟動子可操作地連接於編碼抗 原結合蛋白之DNA/聚核苷酸。用於原核宿主之啟動子包 156287.doc -65- 201210612 括ph〇A啟動子、β_内醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸 酶、色胺酸及雜交啟動子（諸如Tac)。適於酵母細胞中之表 現的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他醣解酶，例如稀 醇酶、甘油醛3磷酸去氫酶、己醣激酶、丙酮酸去竣酶、 磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸異構酶、3_磷酸甘油酸變位 酶及葡萄糖激酶。誘導性酵母啟動子包括醇去氫酶2、異 細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白及負責氮代謝或麥 芽糖/半乳糖利用之酶。 用於哺乳動物細胞系統中之表現之啟動子包括病毒啟動 子諸如^瘤病毒、禽癌病毒及腺病毒（例如腺病毒2)、牛 乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒（尤其直接早 期基因啟動子）、反轉錄病毒、B型肝炎病毒、肌動蛋白、 勞氏肉瘤病毒（rous sarcoma virus ; RSV)啟動子及早期或 晚期猿病毒40。當然，啟動子之選擇係基於與用於表現之 宿主細胞之合適相容性。第一質體可包含RSV及/或sv4〇 及/或CMV啟動子、編碼輕鏈可變區（Vl)、kC區以及新黴 素及安比西林抗性選擇標記之DNA，且第二質體包含Rsv 或SV40啟動子、編碼重鏈可變區（Vh)2DNA、編碼口恆定 區、DHFR及安比西林抗性標記之DNA。 強化子元件 適當時，例如對於在高等真核細胞中表現，可使用可操 作地連接於載體中之啟動子元件之強化子元件。哺乳動物 強化子序列包括來自血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、胎 蛋白及膝島素之強化子元件。或者，可使用來自真核細胞 156287.doc -66 - 201210612 病毒之強化子元件，諸如SV40強化子（位於bp 100-270)、 細胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子、桿狀 病毒強化子或鼠類IgG2a基因座（參見W004/009823)。強化 子可位於載體上啟動子上游之位點。或者，強化子可位於 別處’例如在非轉譯區内或聚腺苷酸化信號下游。強化子 之選擇及定位可基於與用於表現之宿主細胞之合適相容 性。 聚腺苷睃化/终止 在真核系統中，聚腺苷酸化信號可操作地連接於編碼抗 原結合蛋白之DNA/聚核苷酸。該等信號通常置於開放閱 璜框架之3’端。在哺乳動物系統中，非限制性實例包括來 源於生長激素、延伸因子_1α及病毒（例如SV4〇)基因或反 轉錄病毒長末端重複序列之信號。在酵母系統中，聚腺苷 酸化/終止信號之非限制性實例包括來源於磷酸甘油酸激 酶（PGK)及醇去氫酶1(ADH)基因之信號。在原核系統中， 通常不需要聚腺普酸化信號且通常改為採用較短且更明確 之〜止子序列。聚腺苷酸化/終止序列之選擇可基於與用 於表現之宿主細胞之合適相容性。 用於增加產率之其他方法/元件 除上述元件以外，可用於增加產率之其他特徵包括染色 質重塑元件、内含子及宿主細胞特異性密碼子修飾。 宿主細胞 用於選殖或表現編媽抗原結合蛋白之載體之合適宿主細 胞為原核細胞、酵母細胞或高級真核細胞。合適原核細胞 156287.doc -67- 201210612 包括真細菌（eubacteria)，例如腸桿菌科（enterobacteriaceae) ，諸如大腸桿菌屬（五·scAericAia)，例如大腸桿菌（例如 ATCC 31,446 ; 31,537 ; 27,325);腸内桿菌屬（Enterobacter) ;伊文氏桿菌屬;克雷伯氏菌屬（A7e6he//a);變 形桿菌屬;沙門氏菌屬（*Sa/mo«e//a)，例如鼠傷寒 沙門氏菌;沙雷氏菌属（iSerraiia) ，例如黏質沙雷氏菌（Serrcti/ct ;及志賀桿菌屬 (以;以及芽胞桿菌屬，諸如枯草芽孢桿菌 (5.抑6〇·/⑷及地衣芽抱桿菌（凡HcAewi/ormz··?)(參見DD 266 710);假單胞菌屬（尸，諸如綠膿桿菌（户. aerwg^wosiz);及鏈黴菌。在酵母宿主細胞 中，亦涵蓋酿酒酵母（SaccActrowyces cereWhae)、粟酒裂 殖酵母（•Sc/n'zosaccAaromyces /?omZ?e)、克魯維酵母 (i^w^yverom^yca)(例如 ATCC 16,045 ; 12,424 ; 24178 ; 56,500)、耶氏酵母（yarrowia)(EP402，226)、甲醇酵母 (尸 zc/ntzpaWorziKEP 183 070，亦參見Peng 等人（2004)】· Biotechnol. 108: 185-192)、念珠菌屬（Can山·ί/α)、里氏木黴 (7Vz_c/i〇i^rwa ;-eeha)(EP 244 234)、青黴素（Penicillin)、彎 頸黴厲（r〇(yp〇c/ai/iwm)及麴菌（/ί·5尸ergiZ/ws)宿主，諸如構 巢麯黴（丄Wi/w/aws)及黑麯徽（儿niger)。 高級真核宿主細胞包括哺乳動物細胞，諸如COS-1(ATCC 第 CRL 1650號）、COS-7(ATCC CRL 1651)、人類 胚腎細胞株293、幼倉鼠腎細胞（BHK)(ATCC CRL.1632)、 BHK570(ATCC 第 CRL 10314 號）、293(ATCC 第 CRL 1573 156287.doc -68- 201210612 號）、中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO-Kl、ATCC第CCL 61號、DHFR-CHO細胞株，諸如DG44(參見Urlaub等人 (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556)，尤其適於懸 浮培養之CHO細胞株）、小鼠足細胞、猴腎細胞、非洲綠 猴腎細胞（ATCC CRL-1587)、海拉細胞（HELA cell)、犬腎 細月包（ATCC CCL 34)、人類肺細月包（ATCC CCL 75)、Hep G2及骨髓瘤或淋巴瘤細胞，例如NS0(參見US 5,807,715)、Sp2/0、Y0 ° 該等宿主細胞亦可進一步工程改造或改適以改良抗原結 合蛋白之品質、功能及/或產率。非限制性實例包括表現 特定修飾（例如糖基化）酶及蛋白質摺疊伴隨蛋白。 細胞培養方法 經編碼抗原結合蛋白之載體轉型之宿主細胞可藉由熟習 此項技術者已知的任何方法培養。宿主細胞可在旋轉燒 瓶、滾瓶或中空纖維系統中培養，但對於大規模生產，特 別使用攪拌槽反應器以便懸浮培養。攪拌槽可適於使用例 如喷嘴、導流板或低剪切力葉輪進行通氣。對於氣泡塔及 氣升反應器（airlift reactor)，可使用空氣或氧氣泡直接通 氣。當在無血清培養基中培養宿主細胞時，培養基補充有 細胞保護劑（諸如普朗尼克F-68(pluronic F-68))以幫助防止 由通氣過程引起之細胞損壞。視宿主細胞特徵而定，可使 用微載體作為固著依賴性細胞株之生長基質或細胞可適合 懸浮培養（其為典型的）。宿主細胞（尤其無脊椎動物宿主細 胞）之培養可利用多種操作模式，諸如分批補料、重複分 156287.doc -69· 201210612 批處理（參見Drapeau 等人（1994) Cytotechnology 15: 103-109)、擴展分批處理或灌注培養。儘管可在含有血清之培 養基（諸如胎牛血清（FCS))中培養重組轉型之哺乳動物宿主 細胞，但該等宿主細胞亦可在例如合成無血清培養基t培 養’諸如 Keen 等人（1995) Cytotechnology 17: 153-163 中所 揭示之培養基或市售培養基，諸如pr〇CHO-CDM或 UltraCHOTM(Cambrex NJ，USA)，必要時補充有諸如葡萄 糖之能量源及諸如重組胰島素之合成生長因子。宿主細胞 之無血清培養可能需要使該等細胞適於在無血清條件下生 長。一種適應方法為在含有血清之培養基中培養該等宿主 細胞且重複地將培養基之80%換為無血清培養基以使宿主 細胞學習適應無血清條件，（參見例如Scharfenberg等人 (1995), Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery等人編，619-623，Kluwer Academic publishers))。 可回收分泌至培養基中之抗原結合蛋白且使用多種技術 進行純化以得到適於預定用途之純化程度。舉例而言，使 用抗原結合蛋白治療人類患者通常要求純度為至少95%， 更通常純度為98%或99%或99%以上（與粗培養基相比）。通 常使用離心分離自培養基移除細胞碎片（cell debris)，接著 使用例如微濾、超濾及/或深度過濾進行上清液之澄清步 驟。可利用多種其他技術，諸如透析及凝膠電泳及層析技 術，諸如羥基磷灰石（HA)、親和層析（視情況涉及親和力 標籤標記系統，諸如聚組胺酸）及/或疏水性相互作用層析 156287.doc • 70· 201210612 (HIC ’參見US 5,429,746)。在各種澄清步驟後，可使用蛋 白質A或G親和層析來捕捉抗體。其他層析步驟可遵循諸 如離子交換及/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排 阻層析及硫酸銨沈澱。亦可使用各種病毒移除步驟（例如 使用例如DV-20過濾器進行奈米過濾在該等各種步驟 後’得到包含至少75 mg/ml或75 mg/ml以上、或1〇〇 mg/mi 或1〇〇 mg/ml以上之抗原結合蛋白的經純化（例如單株）製 劑。該等製劑實質上不含抗原結合蛋白之聚集形式。 可使用細菌系統來表現抗原結合片段。該等片段可位於 細胞内之周質中或分泌至細胞外。可根據熟習此項技術者 已知的方法萃取不溶性蛋白質且進行再摺疊以形成活性蛋 白質，參見 Sanchez 等人（1999) J. Biotechnol. 72: 13-20; 及 Cupit等人（1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277。 脫醯胺作用為移除醯胺官能基之化學反應。在生物化學 中，該反應在蛋白質之降解中較重要，因為其破壞胺基酸 天冬醯胺及麩醯胺酸之含醯胺側鏈，咸信脫醯胺反應為可 限制蛋白質之有效壽命的因素之一，其亦為在製造治療性 蛋白質期間所發生之最常見轉譯後修飾之一。舉例而言， 已報導重組人類DNAse及重組可溶性CD4之活體外或活體 内生物活性降低或損失，而其他重組蛋白質似乎未受影 響。在誘導脫醯胺作用之應力條件下，本文所述抗原結合 蛋白與肌肉抑制素結合之能力似乎未受影響。因此，本文 所述抗原結合蛋白之生物活性及其有效壽命不太可能受脫 醯胺作用影響。 156287.doc •71 _ 201210612 醫藥組合物 術語疾病、病症及病狀可互換使用。如本文所述之人類 化抗原結合蛋白之經純化製劑可併入醫藥組合物中以用於 治療本文所述之人類疾病。醫藥組合物可用於治療肌肉抑 制素造成疾病或中和肌肉抑制素之活性將有益之疾病。包 含治療有效量之本文所述人類化抗原結合蛋白之醫藥組合 物可用於治療對中和肌肉抑制素有反應之疾病。 醫藥製劑可包含人類化抗原結合蛋白與醫藥學上可接受 之載劑的組合。人類化抗原結合蛋白可單獨投與或作為醫 藥組合物之部分投與。 通常該等組合物包含根據可接受之醫藥實踐已知且需要 之醫藥學上可接受之載劑’參見例如Remingtons Pharmaceutical Sciences,第 16版（1980) Mack Publishing Co。該等載劑之實例包括經滅菌載劑，諸如鹽水、林格氏 溶液（Ringers solution)或右旋糖溶液，視情況經適當緩衝 劑緩衝至pH 5至8。 醫藥組合物可藉由注射或連續輸注（例如靜脈内、腹膜 内、皮内、皮下、肌肉内或門脈内）投與。該等組合物宜 不含可見顆粒物質。醫藥組合物可包含1 mg至10 g之間的 抗原結合蛋白，例如5 mg與1 g之間的抗原結合蛋白。或 者，組合物可包含5 mg與500 mg之間，例如5 mg與50 mg 之間的抗原結合蛋白。 熟習此項技術者已熟知製備該等醫藥組合物之方法。醫 藥組合物可在單位劑型中包含1 mg至10 g之間的抗原結合 156287.doc •72- 201210612 蛋白，視情況連同使用說明書。醫藥組合物可凍乾（冷凍 乾燥）以供在投與前根據熟習此項技術者熟知或顯而易知 之方法復原。當抗體具有IgGl同型時，可添加銅之螯合劑 (諸如檸檬酸鹽（例如檸檬酸鈉）或EDTA或組胺酸）至醫藥組 合物中以降低銅介導之該同型抗體降解之程度，參見 EP0612251。醫藥組合物亦可包含增溶劑，諸如精胺酸 鹼；清潔劑/抗聚集劑，諸如聚山梨醇酯8〇 ;及置換小瓶 頂空氧氣之惰性氣體，諸如氮氣。 投與抗原結合蛋白之有效劑量及治療方案一般憑經驗確 定’且可取決於諸如患者之年齡、體重及健康狀況以及所 治療疾病或病症之因素。該等因素在主治醫師之考慮範圍 内。選擇適當劑量之準則可見於例如Smith等人，（1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York中。因此，可以治療有效量投與本發明之抗原結 合蛋白。 投與個體之抗原結合蛋白之劑量通常介於每公斤個體體 重1 pg至150 mg之間，介於每公斤個體體重〇1 mg與1〇〇 mg之間’介於每公斤個體體重〇 5 mg與50 mg之間，介於 每公斤個體體重1 mg與25 mg之間或介於每公斤個體體重1 mg與10 mg之間。舉例而言，劑量可為1 〇 mg/kg、30 mg/kg或60 mg/kg。抗原結合蛋白可非經腸（例如皮下、靜 脈内或肌肉内）投與。 必要時’治療性组合物之有效日劑量可以2個、3個、4 個、5個、6個或6個以上依適當時間間隔分開投與之次劑 I56287.doc •73· 201210612 量視情況以單位劑型投與。舉例而言，劑量可在每個投藥 日時以多個次劑量之形式’每14天或28天丨次皮下投與/、 可藉由靜脈内輸注投與劑量，通常歷經15分鐘至24小時 之時期’諸如2至12小時或2至6小時。此可降低毒性副作 必要時劑量之投與可重複一或多次 天-次、每兩天一次、每週一次、兩週一次、一個月一 次、每三個月一次、每六個月一次或每十二個月―次。广 原結合蛋白可藉由維持療法投與，例如每週一次 几 =或6個月以上之時期。抗原結合蛋白可藉由間歇;法 1隨=!3至6個月之時期，且接著停止給藥3至6個 環。< X技與抗原結合蛋白歷時3至6個月等，如此循 體==用广向抗肌肉抑制素抗原結合蛋白之抗個 體基因型抗體量測生物樣品中投藥後循環抗肌肉抑制 原結合蛋白之量來確定杏$敏 ^ 可利用確L整劑量之 其他方法’包括(但不限於)藥 齊丨量之 記」）、肌肉質晋及… 予之生物““己（「生物標 」）肌内質量及/或功能之指標、安全性、耐 a :反f。抗原結合蛋白可以有效下調個體之肌肉抑制素:： 性之量及持續時間投與。 仰制素活 可以使療法免向特定位點之方式向個體 白。舉例而言’可將抗原結 K合蛋 骨絡肌）中。 蛋白局^主射至肌肉（例如 人類化抗原結合蛋白可與用於治療本文所述疾病之—或 156287.doc 201210612 多種其他治療活性劑組合使用，例如米氮平（Mortazapine) (瑞美隆（Remeron)、茲斯平（Zispin) : Organon)、乙酸曱地 孕酮（Megestrol acetate)(梅格施（Megace) : BMS)、屈大麻 紛（Dronabinol)(麻林紛（Marinol) : Solvay Pharmaceutical Inc.)、氧甲氫龍（Oxandrolone)(奥沙得林（Oxandrin): Savient)、睾固酮（testosterone)、重組生長激素（例如促生 長激素（Somatropin)(雪蘭思定（Serostim) : Serono)、路歐 平（Nutropin)(Genentech)、優猛茁（Humatrope)(Lilly)、鍵 豪寧（Genotropin)(Pfizer)、健高靈（Norditropin)(Novo)、思 真（Saizen)(Merck Serono)及歐尼派（〇mnitrope)(Sandoz))、 賽庚0定（Cyproheptadine)(安清敏（Periactin) ·· Merck)、鳥胺 酸酮戊二酸（ornithine oxoglutarate)(塞特蘭（Cetornan))、0底 曱酉旨（Methylphenidate)(利他林（Ritalin) : Novartis)及莫達 非尼（Modafinil)(莫待芬寧（Provigil) ·· Cephalon)、羅氏鮮 (orlistat)(艾麗（alii) : GSK)、諾美婷（sibutramine)(美瑞達 (Meridia)、雷度替爾（Reductil))、利莫那班（rimonabant) (阿克立亞（Acomplia)、苗絲麗（Monaslim)、斯立苗那 (Slimona))。該等組合可用於治療肌肉抑制素造成疾病或 中和肌肉抑制素之活性將有益之疾病。 當人類化抗原結合蛋白與其他治療活性劑組合使用時， 個別組分可以各別或組合醫藥調配物藉由任何適當途徑， 一起或分開、依序或同時投與。若分開或依序投與，則抗 原結合蛋白及治療活性劑可以任何次序投與。 以上所提及之組合可以包含如上文所定義之組合，視情 156287.doc •75- 201210612 況連同醫藥學上可接受之载劑 形式提供以供使用。载咖形劑之單-醫藥調配物 此一調配物中時，應瞭解，組分必須穩定且彼 此及，、調配物之其他組分相容且可經調配以供投藥。當分 開調配時，其可提供於任 、刀 項技術…—結合蛋 炎當與具有針對相同疾病之活性之第二治療劑組合時，各 ，…劑量可與單獨使用抗原結合蛋白時的劑量不同。孰 者可容易地瞭解合適劑量。人類化抗原結合蛋 蛋白性劑可協同作用。換言之，組合投與抗原結合 活性劑對本文所述之疾病、病症或病狀的作用 可大於各樂劑單獨作用之總和。 八：：：α物可包含人類化抗原結合蛋白連同其他藥劑之 刀裝h之套組’視情況連同❹說明書。為方便起見， 套組可包含預定量之試劑及使用說明書。 =個體」及「患者」在本文中可互換使用。個體通 常為人類。個體亦可為㈣動物，諸如小鼠、 類動物(例如賊猿或狼Η固體可為非人類動物。抗原結合 蛋白亦可具有獸醫學用途。待治療之個體可為農畜，例如 母牛或公牛、綿羊、豬、閹牛、山羊或馬；或可為家畜， :如大或貓。動物可為任何年齡之動物或成熟成年動物。 田個體為實驗動物（諸如小鼠、大鼠或靈長類動物）時，可 1動物進仃處理以誘發與肌肉萎縮' 肌病或肌肉損失相關 之疾病或病狀。 156287.doc • 76- 201210612 處理可為治療性、防治性或預防性處理》個體可為有此 需要者。需要處理者除將來可能發展疾病者以外亦可包括 已罹患特定醫學疾病之個體。 因此’本文所述之人類化抗原結合蛋白可用於防治性或 預防性處理。在此情況下，將本文所述之抗原結合蛋白投 與個體以預防或延缓疾病之一或多種態樣或症狀之發作。 個體可能無症狀。個體可能具有疾病之遺傳素因。將防治 有效量之抗原結合蛋白投與此種個體。防治有效量為預防 或延緩本文所述疾病之一或多種態樣或症狀發作之量。 本文所述之人類化抗原結合蛋白亦可用於治療方法。術 語「治療」涵蓋緩和、減輕或預防疾病之至少一種態樣或 症狀。舉例而言，本文所述之抗原結合蛋白可用於改善或 減輕本文所述疾病之一或多種態樣或症狀。 本文所述之人類化抗原結合蛋白以有效量使用以用於治 療性、防治性或預防性處理。本文所述抗原結合蛋白之= ，有效量為有效改善或減輕疾病之—或多種態樣或症狀: 量。本文所述之抗原結合蛋白亦可用於治療、預防或治癒 本文所述之疾病。 本文所述之人類化抗原結合蛋白對個體健康可具有一般 有益之作用，例如其可增加個體之預期壽命。 又 本文所述之人類化抗原結合蛋白無需實現完全治癒或根 除疾病之各種錄構成可行㈣療㈣理。如相 關領域中所公認，用作治疼逾丨 夕。… 廢劑之樂物可降低指定疾病病況 之嚴重度’但無需消除疾症夕々仏± 、 156287.doc -77- 201210612 劑。類似地，防治性投與之處理無需完全有效地預防疾病 發作即構成可行的防治劑。僅僅降低疾病之影響（例如降 低其症狀之數目或嚴重度，或增加另一治療之有效性’或 產生另-有ϋ作用）或降低個體發生疾病（例如延緩疾病發 作）或疾病惡化之可能性即足矣。 病症、疾病或病狀包括少肌症、惡病f、肌肉萎缩、不 用性肌肉萎縮症、HIV、娜、癌症、外科疾病、灼傷、 肌肉骨路或神經之創傷或損傷、肥胖症、糖尿病（包括_ 糖尿病）、關節炎、慢性腎衰竭（CRF)、末期腎病（esrd)、 充血性心臟衰竭（CHF)、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、選擇性 關節修復、多發性硬化症（MS)、中風、肌肉萎縮症、運動 神經元神經病變、肌肉萎縮性側索硬化（ALS)、帕金森氏 病、骨質疏鬆症、骨關節炎、脂肪酸肝病、肝硬化、艾迪 森氏病、庫欣氏症候群、急性呼吸窘迫症候群、類固醇誘 發之肌肉萎縮、肌炎及脊柱側脊。 年齡相關之肌肉萎縮（亦稱為肌病）或少肌症為隨著年齡 發生之肌肉質量及肌力的進行性降低。認為此病狀為肌肉 合成及修復減少加上肌肉分解增加之結果。在年齡相關之 肌肉萎縮中’肌纖維束因個別纖維損失而縮減。此外，由 於該等個體之不用性肌肉萎縮症，肌纖維亦變小。治療可 逆轉此肌肉萎縮症。因此，本文所述之抗原結合蛋白可用 於治療少肌症。 年齡相關之肌肉萎縮始於中年且在整個生命之剩餘時間 加速發展。該病狀之最常用定義為附肢骨骼質量/身高2 156287.doc -78- 201210612 (kg/m2)低於年輕成人之平均值兩個標準差。此病症可導致 活動性減少、功能性失能及獨立性降低。 不用性肌肉萎縮症可與許多不同病狀、疾病或病症相 關，例如固定、術後外科疾病、透析、重症護理（例如灼 傷、ICU)、肌肉或骨骼之創傷或損傷。不用性萎縮症可由 導致肌肉長期不使用之眾多原因或事件所致。肌肉萎縮症 涉及肌纖維之尺寸及/或數目及/或功能降低。 惡病質為在並未主動試圖減輕.重量之個體中與體重減 輕、肌肉質量降低、肌肉萎縮症、疲勞、衰弱及食慾減退 中之任一者或其組合相關之病狀。惡病質可與各種其他病 症（包括本文所提及之任一疾病）相關。舉例而言，惡病質 可與癌症、感染（例如HIV或AIDS感染）、腎衰竭、自體免 疫性及藥物或酒精成癮相關。此外，在例如已經歷心肌梗 塞之患者或患有充血性心臟衰竭之患者中，可使用本文所 述之抗原結合蛋白治療心臟惡病質。因此，可利用本文所 述之抗原結合蛋白治療癌症惡病質患者。 慢性阻塞性肺病（COPD)患者可顯示該疾病之輕度、中 度或重度症狀。COPD包括患有肺氣腫及支氣管炎之患 者。肺氣腫患者一般極瘦或虛弱，且其疾病一般視為不可 逆轉。因此，本文所述之抗原結合蛋白可用於治療肺氣腫 患者’因為較難以改善患者之基本肺功能。支氣管炎串者 一般較健壯，但其亦可能缺乏肌肉，且認為其疾病具有一 定程度的可逆性。因此，本文所述之抗原結合蛋白可用於 治療支氣管炎患者，視情況與治療患者之基本肺功能組 156287.doc -79- 201210612 β。用本文所述之抗原結合蛋白治療對改善肺氣腫或支氣 管炎患者之呼吸中所涉及之肌肉的功能可具有直接作用。 癌症患者常常顯示可能導致住院治療、感染、脫水、锻 部骨折及最終死亡之肌肉萎縮。舉例而言，肌肉質量損失 10%可能與癌症患者之顯著較差之預後相關。用本文所述 之抗原結合蛋白治療可改善癌症患者之表現狀況，例如使 得化學療法全面或化學療法的使用更具侵入性且改善患 者之生活品質n本文所述之抗原結合蛋白可用於治 療癌症惡病質。 癌症包括例如前列腺癌、騰臟癌、肺癌、頭頸癌、結腸 直腸癌及淋巴瘤。舉例而言’在前列腺癌中，個體可具有 轉移性前列腺癌及/或可正經歷雄激素去除療法（ADT)。患 有癌症之個體可能具有局部晚期癌症或轉移性癌症，例如 早期轉移性録。因，匕，可利用本發明之抗原結合蛋白治 療前列腺癌後經歷ADT之患者。 可用本文所述之抗原結合蛋白治療患有慢性腎衰竭 (CRF)或末期腎病(ESRD)之患者。料⑽，可對患者進 行透析前治療以延遲透析開始時間。或者，可用本文所述 之抗原結合蛋白治療已透析1年或丨年以上、2年或2年以上 或3年或3年以上之患者。本文所述之抗原結合蛋白可用於 短期預防或治療肌肉萎縮，或經由長期使用抗原結合蛋白 來進行長期預防或治療。 肌肉、骨路或神經之創傷或損傷之實例包括競部骨折及 急性膝損傷。體部骨折患者在骨折之前通常患有肌肉萎縮 156287.doc -80- 201210612 症’且在許多患者中肌肉萎縮為髖部骨折之關鍵促因。髖 部骨折後，肌肉及肌力因不使用而損失，且髖部骨折患者 之行走或功能通常不會恢復至骨折前水準《此外，許多體 部骨折患者亦罹患諸如COPD、ESRD及癌症之病狀，該等 病狀可能促成顯著肌肉萎縮且使該等患者易發生體部骨 折。因此，可用本文所述之抗原結合蛋白治療具有髖部骨 折風險之患者。髖部骨折患者有相當之治療緊急性，因為 此等患者必須即刻動手術。因此，用本文所述之抗原結合 蛋白進行術後治療可藉由減少肌肉質量及肌力損失及/或 改良肌肉質量及肌力之恢復而幫助髖部骨折患者康復。可 利用本發明之抗原結合蛋白治療具有髖部骨折風險之個體 或患有髖部骨折之個體。 本文所述之抗原結合蛋白可有助於治療選擇性手術 (elective surgery)患者以在手術之前建造患者之肌肉。 肌肉萎縮症（dystrophy)係指一群引起進行性肌肉衰弱之 基因遺傳性肌肉疾病。肌肉萎縮症之特徵為進行性骨骼肌 衰弱、肌肉蛋白質缺乏以及肌細胞及组織死亡。肌肉萎縮 症之實例包括杜興氏（Duchenne)肌肉萎縮症（DMD)、貝克 爾肌肉萎縮症、肢帶型肌肉萎縮症（LGMD)、先天性肌肉 萎縮症、顏面肩胛肱骨型肌肉萎縮症（FSHD)、肌緊張性肌 肉萎縮症（myotonic)、眼咽型肌肉萎縮症、遠端型肌肉萎 縮症及埃-德氏（Emery-Dreifuss)肌肉萎縮症。舉例而言， 本文所述之抗原結合蛋白可用於治療杜興氏肌肉萎縮症、 貝克爾肌肉萎縮症或肢帶型肌肉萎縮症。同樣，非局部萎 156287.doc -81 - 201210612 縮症之彌漫性肌肉萎縮症可用本文所述之抗原結合蛋白治 療。肌緊張性萎縮症特別可用本文所述之抗原肖合蛋白治 療，因為該疾病較局竈性肌肉萎縮/功能障礙及骨骼/骨及 心臟問題之角色。 肥胖症為過量體脂肪已積累至可對健康ϋ貞面影響程 度的病狀。其通常定義為身體質量指數（ΒΜΙ=；體重/身高％ 為30 kg/m或30 kg/m2以上。此將肥胖症與超重區分超 重定義為BMI介於25_29.9 kg/m2之間。肥胖症可與包括二 血管疾病、II型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停、癌症及骨 關即炎之各種疾病相_。因此，已發現肥胖症會縮短預期 壽命。肥胖症之典型治療包括節食、身體運動及手術。肥 胖症可利用本文所述之抗原結合蛋白治療，該等抗原結合 蛋白增加肌肉質量且從而可增加基礎代謝率。舉例而言， 該治療可改良血清化學及胰島素敏感性。 肌肉質量、肌力及肌肉功能降低之典型態樣或症狀包括 全身無力、疲勞、身體活動減少、易摔傷、功能性失能、 自主性降低、活動性減少所致之抑營症、食慾減退、營養 不良及體重異常減輕中之任一者或其任何組合。 疾病可能與高肌肉抑制素含量相關。本文所述之抗原結 合蛋白可用於調節肌肉抑制素之含量及/或肌肉抑制素之 活性。 多個端點可用於顯示肌肉質量、肌力及肌肉功能之變 化。該等端點包括短期生理表現評估量表（sh〇rt physic^ ormance Battery)、腿推舉（Leg press)、直接生活品質 156287.doc -82- 201210612 調查（directed quality of life survey)、每日生活活動性 (activities of daily living ; ADLs)、功能獨立性指標 (FIM)、功能測試及量表（例如行走測試、樓梯攀爬、蹬車 運動）、力量測試及量表（例如握力測試、手肌力測試量 表）、生物阻抗分析、肌電圖、測力計、雙能χ光吸收分 析、電腦斷層攝影測試、磁共振成象、肌肉活組織檢查、 肌肉組織學、血液/生物化學測試、人體測量、皮膚厚度 量測、身體質量指數評估及體重監測。肌力可使用雙側肢 體肌肉、頸部肌肉或腹部肌肉來評估。 短期生理表現評估量表（SPPB)為根據站立平衡、行走速 度及自椅子起立之能力的指標評估之下肢功能的多組分指 標（以0-4標度分級）。行走測試為下肢功能之評估，其量測 患者行走某一距離所需之時間。腿推舉使用重量及力評估 來量測腿力。在此項技術中使用多値量表及系統來定性評 估患者之生活品質。雙能X光吸收分析（DEXA)為估計骨骼 肌質量之指標。 許多動物檢定亦可用於顯示肌肉質量及肌力及肌肉功能 之變化。舉例而言’握力測試量測動物反向拉動握力計之 力量。斜面測試量測動物自我懸吊之能力。游泳測試經由 代表性活動（例如游泳）來量測功能性能力，且與人類之行 走測試類似。下肢發力測試（Hindlimb Exertion Force Test ’ HEFT)里測施加尾部刺激後所發揮之最大力。動物 之其他身體表現測试包括行走速度及轉輪。該等測試/模 型可單獨使用或以任何組合使用。 156287.doc -83 · 201210612 可使用高脂肪飲食（HFD)誘發之胰島素抗性小鼠模型作 為肥胖症模型。 糖皮質激素通常用於治療一大系列之慢性發炎性疾病， 諸如全身性紅斑狼瘡症、肉狀瘤病、類風濕性關節炎及支 氣管哮喘。然而，投與高劑量之糖皮質激素會導致人類及 動物之肌肉萎縮症。類似地，皮質醇增多症在庫欣氏病 (Cushing's disease)之肌肉萎縮症中起主要作用。地塞米松 (dex)誘發之肌肉萎縮症與肌肉之肌肉抑制素mRNA及蛋白 質表現之劑量依賴性顯著誘導相關（Ma K等人，2003 Am J Physiol Endocrinol Metab 285:E363-E371)。亦已在若干種 肌肉萎縮症模型（諸如固定及灼傷損傷）中報導肌肉抑制素 表現增加，其中糖皮質激素起重要作用（Lalani R等人，
2000 J Endocrinol 167:417-428 ; Kawada S等人，2001 J
Muscle Res Cell Motil 22:627_633 ;及 Lang CH等人，2〇〇ι FASEB J 15:NIL323-NIL338)。因此，糖皮質激素誘發之 肌肉萎縮的小鼠模型可用於研究本發明之抗原結合蛋白。 人類不用性肌肉萎縮症通常與諸如關節之慢性骨關節炎 或用於治療骨折之石膏固定的矯形外科病症相關聯地發 生，且在出於其他醫學或手術原因而長期臥床休息之情況 下發生。不用性肌肉萎縮症會導致肌力降低及失能。身體 復原仍然為唯一治療選擇，且此通常需要較長時間且並不 總是會使肌肉恢復至正常尺寸或力量。因此，擠壓坐骨神 經以誘發肌肉萎縮症之小鼠模型可用於研究本發明之抗原 結合蛋白。 156287.doc -84 · 201210612 大部分癌症患者因脂肪組織之進行性萎縮及肌肉萎縮而 導致體重減輕。據估計約20%之癌症死亡係由肌肉損失引 起。肌肉萎縮一般為許多疾病病狀中死亡率之良好預測因 子。來自AIDS、鐵餓及癌症研究之資料表明損失超過個 體疾病刖瘦體質量之30%-40%為致命的（DeWye WD..， C/Wc·? h Caiman KC及 fearon KCH編.London:
Saunders，1986,第 5卷，第 2期，第 251-261 頁；Kotter DP 等人，1990 J Parent Enteral Nutr 14:454-358 ;及 Wigmore SJ等人，1997 Br J Cancer 75:106-109)。因此，可能經由抑 制肌肉萎縮所涉及之信號傳導路徑來緩解肌肉萎縮症極具 吸引力。因此，帶有C-26腫瘤之小鼠模型可用於研究本發 明之抗原結合蛋白。 在臨床中，腱切除術係指因肌腱單元之先天及/或後天 變形而對腱進行手術橫切，但在創傷或退化性肌肉骨胳疾 病中亦可能發生腱連續性之喪失。腱切除術引起靜止張力 直接喪失、肌節縮短以及肌肉質量及力產生能力之後續降 低（Jamali等人2000 Muscle Nerve 23: 851-862)。因此，誘 發骨骼肌萎縮症之小鼠腱切除術模型可用於研究本發明之 抗原結合蛋白。 所述抗原結合蛋白可用於急性、慢性及/或防治性療 法。急性療法可快速增進力量且使患者之功能性能力恢復 至適當程度，隨後可藉由運動或慢性療法來維持❶慢性療 法可用於隨時間維持肌力或緩慢增進肌力。防治性療法可 用於預防所述患者群體中通常隨時間發生之肌肉質量及肌 156287.doc •85- 201210612 力的下降。肌肉功能之改良並不總是為定義成功治療所必 需’因為對較不嚴重之肌肉萎縮的早期介入僅需要肌肉功 能之維持。 所述人類化抗原結合蛋白亦可具有用於增強肌力、質量 及功能之化妝用途。所述人類化抗原結合蛋白亦可用於宇 航員之航天及訓練練習。 所述人類化抗原結合蛋白可對肌肉（諸如骨骼肌）具有直 接生物作用。或者’所述人類化抗原結合蛋白可對肌肉 (諸如骨骼肌）具有間接生物作用。 舉例而言’人類化抗原結合蛋白可對肌肉組織結構、肌 肉質量、肌肉纖維數目、肌肉纖維尺寸、肌肉再生及肌肉 ’·戴、准化中之一或多者具有作用。舉例而言，可增加肌肉質 量詳5之’可增加個體之瘦質量（lean mass)。可增加以 下肌肉中之任一者或其組合之質量：四頭肌、三頭肌、比 目魚肌、脛骨前肌（TA)及伸趾長肌（EDL)。所述人類化抗 原結合蛋白可增加肌肉纖維數目及/或肌肉纖維尺寸。所 述人類化抗原結合蛋白可增強肌肉再生及/或降低肌肉纖 、准化所述人類化抗原結合蛋白可增加肌母細胞之增殖速 率及/或活化肌性分化，舉例而言，人類化抗原結合蛋白 可增加肌肉前驅細胞之增殖及/或分化。 所述人類化抗原結合蛋白對衛星細胞可具有以下作用之 一或其組合：活化、增加增殖及促進自我更新。所述人類 化抗原、纟。合蛋白可調節肌肉抑制素含量。所述人類化抗原 結合蛋白可增加個體體重。所述人類化抗原結合蛋白可增 156287.doc •86· 201210612 加肌肉收縮性及/或改善肌肉功能。人類化抗原結合蛋白 可增加骨密度。 本文所述之人類化抗原結合蛋白可調節肌肉生長、功能 及收縮性所涉及之蛋白質之合成及/或分解代謝。舉例而 言，可藉由使用本文所述之抗原結合蛋白來上調諸如肌凝 蛋白（myosin)、肌縮蛋白（dystr〇phin)、肌漿蛋白（町叫如⑷ 之肌肉相關蛋白質的蛋白質合成。舉例而言，可藉由使用 本文所述之人類化抗原結合蛋白來下調諸如肌凝蛋白、肌 縮蛋白、肌漿蛋白之肌肉相關蛋白質的蛋白質分解代謝。 所用診斷方法 本文所述之人類化抗原結合蛋白可出於診斷目的用於活 體外或活體内偵測生物樣品中之肌肉抑制素。舉例而言， 抗肌肉抑制素抗原結合蛋白可用於偵測培養細胞、組織或 血清中之肌肉抑制素。可首先自人體或動物體中移出組織 (例如活組織檢查）。可採用習知免疫檢定，包括Eusa' 西方墨點法（Western blot)、免疫組織化學或免疫沈澱。 藉由使肌肉抑制素之存在或含量與疾病相關聯，熟習此 項技術者可診斷相關疾病。此外，在個體中偵測到肌肉抑 制素之含量增加可指示將會對本文所述之抗原結合蛋白治 療起反應之患者群體《在經本文所述之抗原結合蛋白治療 之個體中偵測到肌肉抑制素之含量降低可指示肌力、肌肉 質量及肌肉功能增強之生物作用。 抗原結合蛋白可提供於包含一或多種抗原結合蛋白、可 偵測標記及套組使用說明書之診斷套組中。為方便起見， 156287.doc •87· 201210612 該套組可包含預定量之試劑及使用說明書。 可向有需要之個體投與編碼本文所述之人類化抗原結合 蛋白之核酸分子。核酸分子可於適當骨架或結構域、可變 域或全長抗體中表現CDR »核酸分子可包含於允許在人類 或動物細胞中表現的載體中。核酸分子或載體可經調配以 供與醫藥學上可接受之賦形劑及/或一或多種如上文所討 論之治療活性劑一起投與。 實例 1·產生重组蛋白質 1.1純化成熟二聚肌肉抑制素 在CHO分泌系統中表現HexaHisGBlTev/(D76A)小鼠肌 肉抑制素聚合蛋白質序列（SEQ ID NO: 1〇1)。gbi標籤 (SEQ ID NO: 102)描述於W0 2006/127682中且發現其與使 用Fc標籤之構築體相比允許肌肉抑制素以較高含量表現且 允許肌肉抑制素適當摺疊。使用小鼠聚合蛋白質序列（SEQ ID NO: 103)產生成熟肌肉抑制素序列（SEQ m Ν〇: 1〇4)， 因為人類成熟肌肉抑制素序列與小鼠成熟肌肉抑制素序列 100%—致。為降低肌肉抑制素之任何可能降解，在區域 「DVQR却SSD」中用D76A突變對小鼠聚合蛋白質序列進 行工程改造。 於含0·5 M NaCl之50 Tds-HCl緩衝液（pIi 8 〇)中使用Ni_ NTA瓊脂糖（Qiagen)自CH0培養基中捕捉扣除信號序列之 所表現HexaHisGB lTeW(D76A)小鼠肌肉抑制素聚a蛋白 質。將Ni溶離液之緩衝液交換為弗林蛋㈣（Fu叫㈣缓 156287.doc •88· 201210612 衝液（50 mM HEPES，pH 7.5，0.1 M NaC 卜 0.1% Triton X-100，1 mM CaCl2)，隨後在室溫下以1:25(V/V)之弗林蛋 白酶/蛋白質比率利用弗林蛋白酶（内部（in-house)表現，弗 林蛋白酶之序列示於SEQ ID NO: 105中）裂解隔夜。弗林 蛋白酶使聚合蛋白質在前肽與成熟肌肉抑制素之間 (「TPKRSRR」與「DFGLDCD」之間）裂解，產生前肽及 成熟肌肉抑制素。 將弗林蛋白酶裂解反應之混合物整體置於6 M Gdn-HCl 中以使聚集體解離。在60°C下使用C8 RP-HPLC(Vydac 208TP，Grace，Deerfield，IL，USA)利用 40分鐘内 15%-60% 之緩衝液B梯度（C8 RP-HPLC缓衝液A:含0.1% TFA之 H20，緩衝液B :含0.1% TFA之100%乙腈）自混合物分離成 熟肌肉抑制素。彙集峰前部含有成熟肌肉抑制素之溶離份 且用於後續活體外檢定。圖1展示成熟肌肉抑制素之 LC/MS分析且圖2展示具有經還原及未經還原肌肉抑制素 樣品之NuP AGE凝膠。 1.2重組肌肉抑制素之活體外生物活性 使用肌肉抑制素反應性報導基因檢定（Thies等人，（2001) Growth Factors 18(4) 25 1-259)評估橫紋肌肉瘤細胞（A204) 中肌肉抑制素之活體外活性。使A204細胞（LGC Promochem HTB-82)於不含酚紅之高葡萄糖DMEM(Invitrogen)、5%木 炭貧化 FCS(Hyclone)及 IX Glutamax(Invitrogen)中生長。 接著以胰蛋白酶處理細胞以產生懸浮液且用含有受PAI_1 啟動子之12x CAGA盒控制的螢光素酶基因之pLG3質體， 156287.doc -89- 201210612 使用Gemini轉染試劑（内部試劑，描述於專利W〇 2006/053782中）轉染。細胞以40,000個細胞/孔接種於96孔 Fluoronunc板（VWR)中且靜置並生長隔夜。第二天，藉由 連續稀釋將重組成熟肌肉抑制素（R&D Systems肌肉抑制素 (788-G8-010/CF)或内部肌肉抑制素（如上文1.1所述），兩者 均具有SEQ ID NO: 104中所示之序列）添加至各孔之培養 基中且再培育細胞6小時，隨後添加SteadyLite(Perkin Elmer LAS)，在室溫下培育20分鐘且用SpectraMax M5讀 取器（Molecular Devices)進行讀取。顯示細胞信號傳導被 肌肉抑制素活化，從而引起螢光素酶表現之劑量反應曲線 展示於圖3A中。清楚可見，R&D Systems與内部成熟二聚 肌肉抑制素物質均以劑量依賴性方式活化A204細胞，從而 產生螢光素酶信號。内部經純化肌肉抑制素相較於R&D Systems肌肉抑制素在檢定中顯示較佳的較低本底及改良 之動態範圍。 在替代性方法中，使A204細胞（LGC Promochem HTB-82)於McCoys培養基（Invitrogen)及10%熱不活化FBS (Invitrogen)中生長。接著用凡爾生（versene)(Invitrogen)與 TrypLE(Invitrogen)之1:1混合物分離細胞且使其再懸浮於 不含酚紅之高葡萄糖DMEM、5%木炭貧化血清（Hyclone) 及2 mM glutamax(Invitrogen)(檢定培養基）中。藉由於懸 浮液中將18.2 μΐ pLG3質體（含有受PAI-1啟動子之12x CAGA盒控制的螢光素酶基因）與182 μΐ 1 mM Gemini轉染 試劑（内部試劑，描述於專利W〇 2006/053782中）混合來轉 156287.doc -90· 201210612 染14x106個細胞。將細胞轉移至T175培養瓶中且培育隔 夜。第二天，藉由連續稀釋或在測試抗體之連續稀釋液存 在下以丨亙定濃度（最終體積20 μ 1)將重組肌肉抑制素（R&D Systems肌肉抑制素（788-G8-010/CF)或内部肌肉抑制素（如 上1.1所述））添加至96孔黑色FluoroNUNC檢定板（VWR) 中。預培育肌肉抑制素抗體混合物30分鐘》用凡爾 生：TrypLE自燒瓶分離經轉染細胞，且以2.2 xlO5個細胞/毫 升再懸浮於檢定培養基中’且以18〇微升/孔分配至檢定板 中。再培育板6小時，隨後添加5〇 μι steadyLite試劑 (Perkin Elmer LAS) ’在室溫下培育20分鐘且用SpectraMax M5讀取器（Molecular Devices)進行讀取。顯示細胞信號傳 導被成熟二聚肌肉抑制素活化，從而引起螢光素酶表現之 劑量反應曲線展示於圖3B中。内部肌肉抑制素物質以劑量 依賴性方式且如不同日期所獲得之資料所示在不同測試時 刻可再現地活化A204細胞，從而產生發光素酶信號。 2.產生單株抗趙及表徵小鼠單株抗體1〇B3 2.1單株抗體 藉由各自腹膜内注射成熟肌肉抑制素（如實例1中所述製 備）免疫SJL/J小鼠（Jackson Laboratories)。免疫前，使肌肉 抑制素與小隱孢子球菌（C. parVMW)結合，且用結合物（2.5 pg肌肉抑制素結合於10 小隱孢子球菌）及另外7 5 可 溶性肌肉抑制素免疫小鼠。自小鼠移除脾細胞且在 PEG1500(Boehringer)存在下使β淋巴細胞與來源於 P3X63BCL2-13細胞（内部產生，參見Kilpatrick等人，1997 156287.doc -91- 201210612
Hybridoma 16(4)第38 1 -389頁）之小鼠骨髓瘤細胞融合以 產生融合瘤。藉由限制稀釋法選殖個別融合瘤細胞株（使 用E Harlow及D Lane中所述之方法）。以顯微鏡鑑別含有單 一群落之孔且測試上清液之活性。 最初，以FMAT夾心檢定格式，針對對重組肌肉抑制素 之結合活性來篩選融合瘤上清液。使用BIAcore™方法對 此等陽性物質進行二次篩選以偵測與重組肌肉抑制素 (R&D Systems，788-G8-010/CF)及内部表現之經純化肌肉 抑制素（參見上述1 · 1)的結合性。 藉由限制稀釋法次選殖肌肉抑制素結合檢定所鑑別之陽 性物質以產生穩定單株細胞株。使用經固定之蛋白質A管 柱自在無血清條件下於細胞工廠中生長之此等融合瘤純化 免疫球蛋白。接著藉由ELISA及BIAcore™針對肌肉抑制素 結合性再韩選此等經純化單株抗體。 單株抗體10B3鑑別為與重組肌肉抑制素結合之有效抗 體。 2.2單株抗體10B3之定序及10B3嵌合體之選殖 自10B3融合瘤細胞萃取總RNA且使用前導序列特異性引 子及與預定同型（IgG2a/K)—致之抗體恆定區藉由反轉錄來 產生重鏈及輕鏈可變域之cDNA。接著將可變重鏈及輕鏈 域之cDNA選殖至質體中以供定序。10B3 VH區胺基酸序列 展示於SEQ ID NO: 7中。10B3 VL區胺基酸序列展示於 SEQ ID NO: 8中。10B3之Kabat CDR序列展示於表3及表4 中〇 156287.doc -92- 201210612 表3 :重鏈CDR序列 抗通 CDRH1 CDRH2 CDRH3 10B3 GYFMH (SEQ ID NO: 1) NIYPYNGVSNYNQRFKA (SEQ ID NO: 2) RYYYGTGPADWYFDV (SEQ ID NO: 3) 表4 :輕鏈CDR序列 抗體 CDR LI CDRL2 CDRL3 10B3 KASQDINSYLS (SEQ ID NO: 4) RANRLVD (SEQ ID NO: 5) LQCDEFPLT (SEQ ID NO: 6) 藉由自10B3鼠類單株抗體（VH : SEQ ID NO: 7 ; VL : SEQ ID NO: 8)獲取可變區且將此等可變區移植至人類 IgGl/k野生型恆定區來構築嵌合抗體。在此等構築體之構 築中使用信號序列（如SEQ ID NO: 9中所示）。 簡言之，藉由PCR擴增所選殖之鼠類可變區以引入選殖 至哺乳動物表現載體（Rld_Efl及Rln_Efl)中所需之限制位 點。Hind III及Spe I位點設計成框住vH域且允許選殖至含 有人類γΐ野生型恆定區之載體（Rld_EH)中》Hind III及 BsiW I位點設計成樞住vL域且允許選殖至含有人類κ恆定 區之載體（Rln_Efl)中。鑑別具有正確Vh(Seq ID NO: 25) 及VL(SEQ ID NO: 8)序列之純系且製備質體（使用標準分子 生物學技術）以便在CHOK1細胞上清液中表現。使用經固 定之蛋白質A管柱自細胞上清液純化抗體且藉由在280 nm 下讀取吸光度來定量。 所得嵌合抗體稱為10B3嵌合體（10B3C或HCLC)。10B3 嵌合抗體具有如SEq ID NO: 26中所述之重鏈胺基酸序 156287.doc -93· 201210612 列。10B3嵌合抗體具有如SEQ ID NO: 27中所述之輕鏈胺 基酸序列。 2.3與重組肌肉抑制素之結合 在夾心ELISA中，10B3及10B3嵌合體（10B3C)結合肌肉 抑制素（R&D Systems，788-G8-010/CF)。用肌肉抑制素以 10奈克/孔塗佈板且用阻斷溶液（PBS、0.1% TWEEN及1 % BSA)阻斷。洗滌（PBS、0.1〇/。TWEEN)之後，在37°C下經 連續稀釋培育抗體2小時且再次洗滌板，隨後在37°C下與 抗小鼠HRP或抗人類HRP(分別為Dako，P0161及Sigma， A-8400) —起培育1小時。再次洗滌板且添加OPD受質 (Sigma，P9187)直至發生比色反應，且藉由添加H2S04終 止反應。在490 nm之吸光度下對板進行讀取且測定EC50 (參見表5)。 表5.親本10B3及嵌合10B3抗體之EC50 抗體 平均ECse (ng/ml) 95%信賴等級(ng/ml) 10B3 69 46-102 10B3嵌合體 49 33-73 藉由BIAcore™(表面電漿子共振）分析來評估小鼠親本 10B3及10B3C對重組肌肉抑制素之親和力。藉由使用捕捉 表面進行分析：對於小鼠親本10B3，藉由一級胺偶合使抗 小鼠IgG與C1晶片偶合；且對於10B3嵌合體，藉由一級胺 偶合在C1晶片上產生蛋白質A表面。 捕捉後，使 64 nM、16 nM、4 nM、1 nM、0.25 nM及 0.0625 nM之重組肌肉抑制素流經表面，且注射缓衝液（亦 156287.doc -94- 201210612 即0 nM)用於雙重參考。在各次分析物注射之間存在再生 步驟，其後在下次注射肌肉抑制素之前進行新的抗體捕捉 事件。使用T100機器分析軟體所固有之1:1模型及二價模 型來分析資料（參見表6)。兩個捕捉表面均可使用100 mM 磷酸再生，該工作係使用HBS-EP作為操作緩衝液且使用 25°C作為分析溫度來進行。 表6·親本10B3及嵌合10B3與肌肉抑制素結合的T100資料
動力學模型 10B3嵌合體之平衡常數(KD) 小鼠親本10Β3之平衡常數(KD) 所有曲線1:1模型 88 pM 1 nM 所有曲線二價模型 3.6 nM 5.9 nM 為進一步分析10B3之結合能力，進行基於ELISA之檢定 以判定結合是否對純的成熟肌肉抑制素具有特異性或是否 仍可與其他肌肉抑制素抗原（包括潛伏複合物及在肌肉抑 制素前肽之Arg 75與Asp 76之間發生BMP-1裂解後自潛伏 複合物釋放之成熟肌肉抑制素）發生結合（Wolfman等人 (2003) PNAS 100:第 15842-15846頁）。 使用HexaHisGB ITev/人類肌肉抑制素前肽序列（SEQ ID NO: 106)進行人類肌肉抑制素前肽之純化。此序列表現於 CHO分泌系統中，且藉由Ni-NTA(GE Healthcare，NJ)自 CHO培養基捕捉所表現之蛋白質。藉由Tev蛋白酶（内部表 現，序列展示於SEQ ID NO: 107中）裂解HexaHisGBl標 籤。Tev蛋白酶在標籤與SEQ ID NO: 106之前肽之間 (「ENLYFQ」與「ENSEQK」之間）裂解以產生SEQ ID Ν 0: 10 8之序列。 156287.doc •95- 201210612 在6 Μ鹽酸胍存在下將經裂解標籤及未裂解之 hexaHisGB 1 Tev/人類肌肉抑制素聚合蛋白質捕捉於Ni-NTA上，其中標籤經裂解之人類肌肉抑制素聚合蛋白質處 於未結合流過物中。將該流過物於lxPBS缓衝液中施加於 Superdex 200管柱（GE Healthcare, NJ)上，且在管柱上分離 聚集之二聚體及單體形式。人類肌肉抑制素前肽（SEQ ID NO: 108)二聚體形式用於形成潛伏複合物。 藉由在室溫下於6 Μ鹽酸胍中將經純化之人類肌肉抑制 素前肽（SEQ ID NO: 108)與成熟肌肉抑制素（SEQ ID NO: 1 04)以3:1 (w/w)之比率混合2小時來製備肌肉抑制素潛伏複 合物，隨後在4°C下透析至lxPBS中隔夜，且於lxPBS緩衝 液中加載至Superdex 200(GE Healthcare, NJ)上。彙集含有 肌肉抑制素前肽與成熟肌肉抑制素兩者之峰中的溶離份。 藉由LC/MS與SDS-PAGE確認潛伏複合物（資料未圖示）。 對於BMP-1消化，150 μΐ人類肌肉抑制素潛伏複合物（1.5 mg/ml)與 225 μΐ BMP-1(0.217 mg/ml)、75 μΐ 25 mM HEPES(pH 7.5)及150 μΐ以下物質一起培育：20 mM CaCl2、4 μΜ ZnCl2 及 0.04% Brij 35。在 30〇C 下培育反應物 隔夜。使用CHO分泌系統内部表現BMP-1蛋白質（序列展示 於 SEQ ID NO: 111 中）。 在4°C下將肌肉抑制素抗原於PBS中以100奈克/孔塗佈於 EIA/RIA板（Costar)之孔上隔夜，隨後在室溫下阻斷（PBS、 3% BSA)30分鐘。洗滌（PBS、1% BSA及 0.1% Tween20) 板，隨後添加10B3於洗滌緩衝液中之連續稀釋液且在室溫 156287.doc -96- 201210612 下培育2小時。再次洗滌板，隨後添加於洗滌緩衝液中以 1:10,000稀釋之結合過氧化酶之Affinipure F(ab')2片段驢抗 小鼠 IgG(Jackson Laboratories，目錄號 715-036-151)且在 室溫下培育1小時。最終洗滌步驟之後，添加TMB受質且 發生色度變化，用硫酸終止，且在450 nm下對板進行讀 取。圖4展示10B3能夠結合成熟二聚肌肉抑制素、潛伏複 合物（四聚體）及在BMP-1裂解後自潛伏複合物釋放之肌肉 抑制素。亦發現10B3不與前肽二聚體結合（資料未圖示）。 2.4肌肉抑制素上10B3結合抗原決定基之粗定位 基於肌肉抑制素胺基酸序列來合成重疊10個胺基酸（偏 移4個胺基酸）之生物素化14聚體肽（14 mer peptide)以定位 由10B3(由Mimotopes，Australia供應）識別之結合抗原決定 基之位置。 利用SRU BIND讀取器（SRU Biosystems)進行工作。洗滌 抗生蛋白鏈菌素生物感測器板，取基線讀數，且將生物素 化肽捕捉於塗有抗生蛋白鏈菌素之生物感測器板上。再次 洗滌板，且取新的基線讀數，接著添加抗體且監測結合。 重疊10個胺基酸（偏移4個胺基酸）之14聚體定製設計人 工肽序列之詳情提供於表7中 表7:肌肉抑制素人工肽 肽編號 N端 序列 C端 氫 MWt 1 H- DFGLDCDEHSTESRGSG (SE〇 ID NO: 56) -nh2 -0.045 2164.84 3 生物素- SGSGDCDEHSTESRCCRY (SEQ ID NO: 57) -nh2 0.118 2217.09 156287.doc -97- 201210612 5 生物素- SGSGHSTESRCCRYPLTV (SE〇 ID NO: 58) -nh2 0.346 2165.17 7 生物素- SGSGSRCCRYPLTVDFEA (SEQ ID NO: 59) -nh2 0.394 2173.18 9 生物素- SGSGRYPLTVDFEAFGWD (SEQ ID NO: 60) -nh2 0.456 2229.16 11 生物素- SGSGTVDFEAFGWDWIIA (SEQ ID NO: 61) -nh2 0.646 2183.13 13 生物素- SGSGEAFGWDWIIAPKRY (SEQ ID NO: 62) -nh2 0.505 2265.28 15 生物素- SGSGWDWIIAPKRYKANY (SEQ ID NO: 63) -nh2 0.416 2337.39 17 生物素- SGSGIAPKRYKANYCSGE (SEQ ID NO: 64) -nh2 0.183 2113.11 19 生物素- SGSGRYKANYCSGECEFV (SEQ ID NO: 65) -nh2 0.286 2182.15 21 生物素- SGSGNYCSGECEFVFLQK (SEQ ID NO: 66) -nh2 0.436 2180.17 23 生物素- SGSGGECEFVFLQKYPHT (SEQ ID NO: 67) -nh2 0.447 2211.21 25 生物素- SGSGFVFLQKYPHTHLVH (SEQ ID NO: 68) -nh2 0.593 2279.36 27 生物素- SGSGQKYPHTHLVHQANP (SEQ ID NO: 69) -nh2 0.279 2183.14 29 生物素- SGSGHTHLVHQANPRGSA (SEQ ID NO: 70) -nh2 0.218 2037.94 31 生物素- SGSGVHQANPRGSAGPCC (SEQ ID NO: 71) -nh2 0.297 1909.85 33 生物素- SGSGNPRGSAGPCCTPTK (SEQ ID NO: 72) -nh2 0.238 1901.87 35 生物素- SGSGSAGPCCTPTKMSPI (SEQ ID NO: 73) -nh2 0.468 1905.96 37 生物素- SGSGCCTPTKMSPINMLY (SEQ ID NO: 74) -nh2 0.582 2115.27 39 生物素- SGSGTKMSPINMLYFNGK (SEQ ID NO: 75) -nh2 0.39 2157.27 41 生物素- SGSGPINMLYFNGKEQII (SEQ ID NO: 76) -nh2 0.504 2193.28 156287.doc •98- 201210612 43 生物素- SGSGLYFNGKEQIIYGKI (SEQIDNO: 77) -nh2 0.434 2199.26—_ 45 生物素- SGSGGKEQIIYGKIPAMV (SEQIDNO: 78) -nh2 0.416 2060.17 47 生物素- SGSGIIYGKIPAMWDRC (SEQ ID NO: 79) -nh2 0.558 2091.25 _ 49 生物素- SGSGGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO: 80) -OH 0.396 1950.02 _ 14聚體肽結合資料之分析表明10B3不能結合肌肉抑制素 内之任何線性抗原決定基。然而，對照抗肌肉抑制素抗體 顯示結合該組肽内之抗原決定基（資料未圖示）。 使用肽掃描，骨架上之化學鍵聯免疫原性肽（CLIPS)技 術對10B3C之肌肉抑制素結合位點進行後續分析，表明肌 肉抑制素之「PRGSAGPCCTPTKMS」胺基酸序列可為嵌 合抗體之結合位點（資料未圖示）。 2.5中和肌肉抑制素ActRIIb受體結合性 在 4°C 下將 1 pg/ml 重組可溶性 ActRIIb(R&D Systems 339-RBB)於碳酸酯緩衝液中塗佈於ELISA板之孔中隔夜。 阻斷板（參見以上2.3中之阻斷溶液）且根據標準ELISA方案 進行洗滌。同時，2 nM生物素化肌肉抑制素（内部，如1.1 中所描述，生物素化物質）與由10B3、10B3C及陰性對照 (IgGl同型對照）組成之抗體系列稀釋液一起在37°C下預培 育2小時》接著在37°C下經1小時向ActRIIb塗佈之板中添 加生物素化肌肉抑制素：抗體反應物。進行標準洗條程 序，接著添加以1:1000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物 (Dako P0397)且再在37°C下培育1小時。再次洗滌板，且在 OPD受質（Sigma)及酸終止溶液處理後於490 nm之吸光度下 156287.doc -99· 201210612 進行檢定。抑制肌肉抑制素活性之抑制曲線及ic50值分別 展示於圖5及表8中。 表8. ActRIIb受體中和之IC5e 抗體 平均IC50 (ng/ml) 95%信賴等級(ng/ml) 10B3 132 99-176 10B3嵌合體 138 97-196 受體中和檢定為可用於基於效能區分IC5〇低於1 nM之分 子的最靈敏方法。然而，該檢定本身對勝任結合之生物素 化肌肉抑制素之精綠濃度敏感。因此，在不同情況下，已 使用相同方法測得10B3之其他IC50值，例如（M3 nM、 0.108 nM、0.109 nM 或 0.3 84 nM(注意，在表 8 中，132 ng/ml=0.88 nM) ° 2.6活趙外抑制肌肉抑制素之生物活性 使用以上1.2所述之肌肉抑制素反應性報導基因檢定來 評估抗肌肉抑制素抗體對肌肉抑制素活性之活體外作用。 對該檢定進行改進以在37t下將濃度為2 8 nM(等效於細 胞活化檢定中之ed7。）之肌肉抑制素與不同濃度之聰3或 10B3C抗nM) 一起預培育，隨後添加至經轉染之 A204細胞中。對螢光素酶進行讀取，由此產生圖6中所示 之抑制曲、線。表9展不在3次重複檢定及AN〇VA分析後測 得之抗體之IC5。值。資料清楚顯示對人2〇4肌細胞株之肌肉 抑制素活化的劑量依賴性抑制’而對照抗體顯示對肌肉抑 制素活性無抑制作用。 156287.doc •100· 201210612 表9.活趙外肌肉抑制素反應性報導基因檢定之ics〇(a2 〇4 細胞） 抗體 平均 IC5〇(nM) 95%信賴等級(nM) 10B3 10.0 6.5-15.5 10B3嵌合體 6.2 3.9-9.9 2·7 10B3之活體内功效 為證明親本10B3之功效，在8週齡雌性CB17 SCID小鼠 中進行為期5週之35天研究。第1天、第4天、第8天、第15 天、第22天及第29天藉由腹膜内注射3、1〇或3〇 mg/kg 10B3對處理組（每組1〇隻動物）進行給藥，而對照組接受 PBS或同型對照抗體（igG2a)。研究結束時，分別藉由對動 物稱重及QMRI分析來測定動物之總體重（A)及總瘦肌肉質 量（B)(圖7)。淘汰完動物時（第35天）’自動物解剖出個別 肌肉（腓腸肌（A)、四頭肌（B)及伸趾長肌（EDL)(C))用於進 行質量測定（圖8)。為測定對肌肉功能之作用，對edl肌肉 進行離體收縮性測試（圖9)，其中測定肌肉之強直收縮力 (圖9A)及每毫克肌肉質量之強直收縮力（圖9b)。 在30 mg/kg劑量下在處理組中觀測到對丨〇B3之明顯劑量 依賴性反應，表明35天研究後體重及瘦肌肉質量有最顯著 改良（分別為8%及8.5%)。肌肉質量之分析顯示腓腸肌、四 頭肌及EDL具有相同趨勢’皆展示質量之劑量依賴性增 加’此外30 mg/kg給藥組展示最大顯著性。 此外’研究（未描述）亦已顯示在較早時間點（諸如35天） 不能觀察到握力有顯著改良。然而，離體收縮性測試顯示 156287.doc -101 - 201210612 在EDL之強直收縮力指標方面可顯示顯著改良。此外，顯 示改良與肌肉質量無關。因此，10B3展現改良現有肌肉質 量之功能的能力。 3. 10B3之人類化 3.1序列分析 在1 0B3可變區之序列與其他鼠類及人類免疫球蛋白序列 之間進行比較。使用FASTA及BLAST程式及藉由目視檢查 來進行此比較。 鑑別10B3 VH之合適人類接受體構架（IGHV1_18及JH3人 類J區段序列）：SEQ ID NO: 10。鑑別10B3 VL之合適人類 接受體構架（IGKV1_16及JK2人類J區段序列）：SEQ ID NO: 11。在SEQ ID NO: 10中，存在接受體構架之CDRH1 及 CDRH2且 CDRH3 由 XXXXXXXXXX表示。在 SEQ ID NO: 11中，存在接受體構架之CDRL1及CDRL2且CDRL3由 XXXXXXXXXX表示。（10個X殘基為CDR位置之佔位符且 不為各CDR中胺基酸序列數目之量度）。 在CDR移植中，通常需要一或多個來自所包括供體抗體 之構架殘基替代其在接受體構架中之直系同源物以獲得令 人滿意的結合。10B3中之以下鼠類構架殘基經鑑別在抗體 之CDR移植（人類化）型式之設計方面可能重要（位置係根據 Kabat等人之編號規定）： 156287.doc •102· 201210612
位置（Kabat) 小鼠10B3 VH 人類V 20 I V 28 S τ 48 I Μ 66 K R 67 A V 69 L Μ 71 V Τ 73 κ Τ 105 τ Q 位置（Kabat) 小鼠10Β3 Vl 人類V 16 R G 46 Τ S 69 Q Τ 71 Y F 100 A Q 設計三個具有不同回復突變之人類化vH構築體以獲得具 有令人滿意之活性的人類化抗體。將此等構築體編號為H0 至 H2。使用 CDR之 Kabat 定義，HO (SEQ ID NO: 12)由 10B3 VH CDR移植至指定接受體序列中之cdr移植體組 成。HI (SEQ ID NO: 13)與H0—致，但具有回復突變，其 中105位之胺基酸為蘇胺酸而非麩醯胺酸β H2 (SEQ ID NO: 14)與H0—致，但具有回復突變，其中28位之胺基酸 為絲胺酸而非蘇胺酸。 應注意’對於所有人類化VH區（及相應重鏈），已對構架 156287.doc 201210612 4(WGQGTMVTVSS)之序列進行修飾，藉以用甲硫胺酸胺 基酸殘基（Kabat 108位）取代白胺酸胺基酸殘基。此藉由在 編碼人類化VH區之DNA序列中包括Spel選殖位點而產生。 設計四個具有不同回復突變之人類化VL構築體以獲得具 有令人滿意之活性的人類化抗體。將此等構築體編號為L0 至 L3。使用 CDR之 Kabat定義，L0 (SEQ ID NO: 15)由 10B3 Vl CDR移植至指定接受體序列中之CDR移植體組成。L1 (SEQ ID NO: 16)與L0—致，但具有回復突變，其中16位 之胺基酸為精胺酸而非甘胺酸。L2 (SEQ ID NO: 17)與L0 一致，但具有回復突變，其中71位之胺基酸為酪胺酸而非 苯丙胺酸。L3 (SEQ ID NO: 18)與L0—致，但具有回復突 變，其.中100位之胺基酸為丙胺酸而非麩醯胺酸。 設計5個具有不同回復突變之其他人類化VH構築體以獲 得具有令人滿意之活性的人類化抗體。將此等構築體編號 為 H0及 H3 至 H6。使用 CDR之 Kabat定義，HO (SEQ ID NO: 12)由10B3 VH CDR移植至指定接受體序列中之CDR移植體 組成。H3 (SEQ ID NO: 112)與H0—致，但具有以下回復 突變：28位之胺基酸為絲胺酸而非蘇胺酸，48位之胺基酸 為異白胺酸而非甲硫胺酸，67位之胺基酸為丙胺酸而非纈 胺酸且69位之胺基酸為白胺酸而非曱硫胺酸。H4 (SEQ ID NO: 11 3)與H0—致，但具有以下回復突變：28位之胺基酸 為絲胺酸而非蘇胺酸，71位之胺基酸為纈胺酸而非蘇胺酸 且73位之胺基酸為離胺酸而非蘇胺酸。H5 (SEQ ID NO: 114)組合 H3 及 H4 回復突變。H6 (SEQ ID NO: 115)與 H5 — 156287.doc •104- 201210612 致，但具有以下回復突變：20位之胺基酸為異白胺酸而非 纈胺酸且66位之胺基酸為離胺酸而非精胺酸。此外，H3至 H6 VH構築體在CDRH3中存在單一點突變，其中位置 100G(Kabat編號）處之胺基酸為酪胺酸而非苯丙胺酸。 應注意，對於所有人類化VH區（及相應重鏈），已對構架 4(WGQGTMVTVSS)之序列進行修飾，藉以用曱硫胺酸胺 基酸殘基（Kabat 108位）取代白胺酸胺基酸殘基。此藉由在 編碼人類化VH區之DNA序列中包括Spe 1選殖位點而產生。 設計三個具有不同回復突變之其他人類化VL構築體以獲 得具有令人滿意之活性的人類化抗體。將此等構築體編號 為L0 及 L4 至 L6。使用 CDR 之 Kabat 定義，L0 (SEQ ID NO: 15)由10B3 VL CDR移植至指定接受體序列中之CDR移植體 組成。L4 (SEQ ID NO: 116)與L0—致，但具有回復突變， 其中69位之胺基酸為麩醯胺酸而非蘇胺酸且71位之胺基酸 為酪胺酸而非苯丙胺酸。L5 (SEQ ID NO: 117)與L0—致， 但具有回復突變，其中71位之胺基酸為酪胺酸而非苯丙胺 酸且46位之胺基酸為蘇胺酸而非絲胺酸。L6 (SEQ ID NO: 118)組合[4及15回復突變。此外1^4至[6在€01^3中存在 單一點突變，其中91位之胺基酸為絲胺酸而非半胱胺酸。 10B3之輕鏈在CDRL3中之Kabat 91位具有半胱胺酸（C)殘 基。在抗體加工發展期間，未配對半胱胺酸可具有化學反 應性從而產生修飾，由此可能使產物具有異質性且可能使 親和力發生變化。此外，此殘基可能能夠因與可變區中產 生免疫球蛋白摺疊所必需之其他半胱胺酸發生錯誤配對而 156287.doc -105- 201210612 促使錯誤摺疊或聚集。因此，具有C91之人類化抗體取代 為絲胺酸（S)。 3.2 10B3之人類化 H0-H2及L0至L3 :藉由從頭合成包括用於選殖至Rid ΕΠ 及Rln Efl哺乳動物表現載體中之限制位點以及信號序列的 重疊寡核苷酸來製備人類化VH& VL構築體。引入Hind III 及Spe I限制位點以框住含有信號序列（SEQ ID NO: 9)之VH 域以供選殖至含有人類IgGl野生型恆定區之Rid Efl中。 引入Hind III及BsiW I限制位點以框住含有信號序列（SEQ ID NO: 9)之VL域以供選殖至含有人類κ恆定區之Rln Efl 中。此舉基本上如WO 2004/014953中所述。 H3-H6及L4-L6 :藉由包括用於選殖至PTT表現載體 (National Research Council Canada，具有經修飾之多選殖 位點（MCS))之限制位點以及信號序列中的重疊寡核苷酸之 定點突變誘發及從頭合成來製備人類化VH及VL構築體。引 入Hind III及Spe I限制位點以框住含有信號順序（SEQ ID NO: 9)之VH域以供選殖至含有人類IgGl野生型恆定區之 pTT中。引入Hind III及BsiW I限制位點以框住含有信號順 序（SEQ ID NO: 9)之VL域以供選殖至含有人類κ恆定區之 pTT 中。 4·人類化抗趙之可發展性分析（dev elopability analysis) 10B3嵌合體與人類化抗體之重鏈及輕鏈中之潛在脫醢胺 位點的電腦分析（in silico analysis)鑑別出重鏈CDRH2中 Kabat 54位之天冬醯胺（N54)具有高度脫醯胺可能性。為進 156287.doc -106- 201210612 一步表徵此殘基，產生10B3嵌合抗體及人類化H2L2抗 體，其中用N54取代天冬胺酸（D)或麩醯胺酸（Q)胺基酸殘 基。 10B3嵌合體及人類化抗體之輕鏈在CDRL3中之Kabat 91 位具有半胱胺酸（C)殘基。在抗體加工發展期間，未配對 半胱胺酸可具有化學反應性從而產生修飾，由此可能引起 產物具有異質性及親和力可能發生變化。此外，此殘基可 能能夠因與可變區中產生免疫球蛋白摺疊所必需之其他半 胱胺酸發生錯誤配對而促使錯誤摺疊或聚集。為進一步表 徵此殘基，產生10B3嵌合抗體及人類化H2L2抗體，其中 用C91取代絲胺酸（S)胺基酸殘基。 此外，亦將重鏈CDRH2中進行之脫醯胺取代與輕鏈 CDRL3中91位之取代組合。作為此等分析之一部分所產生 之抗體在表10中說明。 表10:所產生之用於可發展性分析之人類化抗髏變異體 抗體分子名稱 重鏈可 變區： SEQID NO: 輕鏈可 變區： SEQID NO: 重鏈：胺基酸 SEQ ID NO: (DNA SEQ ID NO:) 輕鏈：胺基酸 SEQ ID NO: (DNA SEQ ID NO:) 10B3 嵌合體N54D(HCLC-N54D) 19 8 35(50) 27(42) 10B3 嵌合體 N54Q(HCLC-N54Q) 20 8 36(51) 27(42) 10B3嵌合體N54D及 C91 S(HCLC-N54D-C91S) 19 21 35(50) 37(52) 10B3嵌合體N54Q及 C91 S(HCLC-N54〇-C91S) 20 21 36(51) 37(52) 1083嵌合體〇913(11(：1^- C91S) 25 21 26(41) 37(52) 156287.doc -107- 201210612 H2L2 N54D(H2L2-N54D) 22 17 38(53) 33(48) H2L2 N54Q(H2L2-N54〇) 23 17 39(54) 33(48) H2L2 N54D 及 C91S(H2L2-N54D-C91S) 22 24 38(53) 40(55) H2L2 N54Q 及 C91 S(H2L2-N54Q-C91S) 23 24 39(54) 40(55) H2L2C91S(H2L2-C91S) 14 24 30(45) 40(55) 5. CDRH3變異型人類化抗體 5.1構築CDRH3變異型人類化抗體 使用抗體H2L2-C91S(可變序列分別為：SEQ ID NO: 14 及24 ;全長序列分別為：SEQ ID NO: 30及40)作為基礎分 子進行CDRH3 (SEQ ID NO: 3)中各殘基之定點突變誘發以 突變為替代性胺基酸殘基。使用pTT載體（National Research Council Canada，具有經修飾之多選殖位點（MCS))產生包 括H2及L2-C91S(分別為SEQ ID NO: 45及55)之基礎序列之 人類恆定區的全長DNA表現構築體。 產生約300個CDRH3變異體且在後續分析中測試約200個 變異體（參見5.2及5.3)。 5.2 HEK 293 6E細胞中之CDRH3變異體表現 將分別編碼約200個CDRH3變異體之重鏈及輕鏈的pTT 質體短暫共轉染至ΗΕΚ 293 6Ε細胞中且小規模表現以產生 抗體。如上所述，重鏈具有Η2之基礎序列及變異型 CDRH3序列，且輕鏈具有L2-C91S之基礎序列。直接評估 來自組織培養上清液之抗體。 5.3對組織培養上清液進行初始掃描-ProteOnXPR36 用 ProteOn XPR36(Biorad Laboratories)對 CDRH3篩選物 156287.doc -108 - 201210612 進行初始動力學分析。對於殘基R95至PI 0 0_B ’使用蛋白 質A/G捕捉表面（Pierce 21186)進行分析，且對於殘基 八100_(：至\^102，使用抗人類IgG表面（Biacore/GE Healthcare BR-1008-39)。使用一級胺偶合將捕捉分子固定於GLM晶 片（Biorad Laboratories 176-5012)上來類似地製備兩種捕捉 表面。CDRH3變異體直接自由表現相關特定變異體之短暫 轉染獲得之組織培養上清液捕捉於蛋白質A/G表面或抗人 類IgG表面上（視所突變之殘基而定）。捕捉後，使用256 nM、32 nM、4 nM、0.5 nM及0.0625 nM之内部重組人類 肌肉抑制素（參見以上1.1)作為分析物，且使用單獨緩衝液 注射（亦即〇 nM)作為結合曲線之雙重參考。在肌肉抑制素 結合事件後，使捕捉表面再生：對於蛋白質A/G捕捉表 面，使用100 mM磷酸使捕捉表面再生；且對於抗人類IgG 表面，使用3 M MgCl2使捕捉表面再生；該再生移除先前 所捕捉之抗體以準備用於捕捉及結合分析之另一循環。接 著擬合資料與ProteOn分析軟體所固有之1:1模型（具有質量 輸送）。使用 HBS-EP(Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69) 進行操作且分析溫度為25°C。 結果因相互作用之性質而難以解釋，此係因為1:1模型 不太可能充分描述相互作用 '然而，藉由判斷感測器圖譜 有可能選擇相較於基礎分子具有改良之親和力的構築體。 判斷篩選物具有所鑑別之11種CDRH3變異體，其相較於基 礎分子似乎具有較佳動力學概況。11種CDRH3變異體之重 鏈描述於下表11中（使用Kabat編號）。所有變異體均具有輕 156287.doc -109- 201210612 鏈L2-C91S(可變序列：SEQ ID NO: 24 ;全長序列：SEQ ID NO: 40，全長DNA序列SEQ ID NO: 55)。經鑑別相較於 基礎分子具有較佳動力學概況之另一 CDRH3變異體為 F100G_S(SEQ ID NO: 110)，但未對其作進一步分析。 表11. CDRH3變異體序列 名稱 CDRH3之序列 H2L2-C91S RYYYGTGPADWYFDV(SEQ ID NO: 3) H2L2-C91S_Y96L RLYYGTGPADWYFDV(SEQ ID NO: 82) H2L2-C91S_G99D RYYYDTGPADWYFDV(SEQ ID NO: 83) H2L2-C91S 一G99S RYYYSTGPADWYFDV(SEQ ID NO: 84) H2L2-C91S_G100A_K RYYYGTKPADWYFDV(SEQ ID NO: 85) H2L2-C91S_P100B_F RYYYGTGFADWYFDV(SEQ ID NO: 86) H2L2-C91S_P100B_I RYYYGTGIADWYFDV(SEQ ID NO: 87) H2L2-C91S _W100E_F RYYYGTGPADFYFDV(SEQ ID NO: 88) H2L2-C91S _F100G_N RYYYGTGPADWYNDV(SEQ ID NO: 89) H2L2-C91S_F100G_Y RYYYGTGPADWYYDV(SEQ ID NO: 90) H2L2-C91S_V102N RYYYGTGPADWYFDN(SEQ ID NO: 91) H2L2-C91S_V102S RYYYGTGPADWYFDS(SEQ ID NO: 92) 利用編號提及抗體（亦即H2L2-C91 S_Y96L)意謂在合適 細胞株中共轉染及表現編碼輕鏈及重鏈之第一質體及第二 質體（例如含有pTT5_H2_Y96L序列之質體及含有PTT5_L2-C91S序列之質體）所產生的抗體。 5.4表現一組所選CDRH3變異體 在HEK 293 6E細胞中表現表11中所述之11種CDRH3變 異體之重鏈及輕鏈（如5.2所述），使用經固定之蛋白質a管 156287.doc •110- 201210612 柱（GE Healthcare)進行親和純化且藉由在280 nm下讀取吸 光度來定量。 5.5藉由BIAcoreTM分析與重組肌肉抑制素之結合 為判斷利用ProteOn XPR36自初始篩選物選擇構築體是 否成功，對經純化之重組抗體進行解離速率分級實驗。藉 由一級胺偶合將肌肉抑制素（内部重組肌肉抑制素，參見 以上1.1)以三種不同密度（低、中及尚）共價固定於CM5晶 片（Biacore/GE Healthcare BR-1000-14)上，產生對於所用 抗體濃度分別得到約60個共振單位（RU)、250 RU及1000 RU之最大結合信號的表面。使用單一濃度（256 nM)之抗體 及緩衝液注射作為結合相互作用之雙重參考。針對所有抗 體對各種密度之肌肉抑制素表面的相互作用’使用Biacore 3000機器所固有之軟體計算初始解離速率（解離速率）。藉 由使用100 mM磷酸進行再生，且在25°C下使用HBS-EP緩 衝液進行檢定。 發現所測試之所有構築體相較於基礎分子（H2L2 C91S) 均顯示較佳之解離速率（解離速率常數），其中解離速率與 H2L2 C91S相比較慢。在高密度表面上，除1〇B3嵌合體以 外的前 5 種構築體為1121^2-0913_?1〇〇8_1、1121^2- C91S W100E F ' H2L2-C91S F100G Y ' H2L2-C91S_G99S ~~ »__ — 及H2L2-C91S_P100B_F。 5.6藉由BIAcore™對與重組肌肉抑制素之結合進行完全 動力學分析 將低、中及高密度之肌肉抑制素（内部重組肌肉抑制 156287.doc -111 - 201210612
素’參見以上1.1)固定於Series S CM5晶片（Biacore/GE
Healthcare BR-1006-68)上，產生分別得到約 15 RU、37 RU及500 RU之最大結合信號的表面。使256 nM、64 nM、 16 ηΜ、4 ηΜ、1 ηΜ之CDRH3變異體流經所有三個表面， 且使用緩衝液注射（亦即〇 ηΜ)作為雙重參考，使用1 〇〇 mM 磷酸進行再生。擬合資料與T100 ^。⑶“機器所固有之二 價模型且在25°C下使用HBS-EP進行操作。 通常’在所有三種密度表面上’基礎H2L2-C91 S相較於 CDR變異體擬合較差，以致難以獲得精確基線值。在三種 表面中，最高密度表面在基礎抗體與CDR變異體之間得到 最佳分離，但此外基礎H2L2-C91S分子之擬合較差。然 而’預期此表面可能在構築體之間得到最大分離，且該表 面最有可能提供用於真實二價結合之最佳表面，此係因為 親合力結合及再結合事件可能較為頻繁且因此可「放大」 親和力之小差異。通常’所有CDR變異體相較於基礎 H2L2-C91 S似乎皆較佳，此主要因為解離速率優良（亦即較 慢）’在咼密度表面上尤其如此。 由於此檢定中所涉及之方法，故在目標抗原與生物感測 器晶片表面之共價偶合中’所得實際親和力可能不會反映 活體内可觀察到的親和力。然而，此資料適用於達成分級 目的。使用此檢定之高密度表面之資料，基於總體親和力 (平衡常數KD)但排除嵌合體10B3以外的前5位構築體為 F100G一Y、P100B一I、Pl〇〇B_F、F100G_1^W100E—F » 然 而，所有其他構築體親和力均在F100G_Y之兩倍以内。 156287.doc -112· 201210612
5.7肌肉抑制素捕捉ELISA 在肌肉抑制素捕捉ELISA中亦分析11種經親和純化之 CDRH3變異體的結合活性。 在4°C下，用2.5 pg/ml針對肌肉抑制素之多株抗體（R&D Systems，AF788)塗佈96孔ELISA板隔夜。接著用洗條緩衝 液（PBS、0.1 % Tween-20)洗滌此板3次且在室溫下用阻斷 溶液（PBS、0_1% Tween-20 + 1%牛血清白蛋白[BSA])阻斷 1小時。接著，在1小時内添加含1 pg/ml肌肉抑制素之阻斷 緩衝液，隨後用洗滌緩衝液洗滌3次。接著，將抗體滴定 至合適濃度範圍（約10至0.01 gg/ml)，添加至板中且在室 溫下培育1小時。接著用洗滌緩衝液洗滌板3次。使用抗人 類κ輕鏈HRP結合抗體（Sigma A7164，根據製造商之說明 書使用）偵測人類化抗體或嵌合抗體（諸如10B3嵌合體 (HcLc)或H0L0)之結合。接著用洗滌缓衝液洗滌板3次，且 用OPD受質（根據製造商之說明書）進行顯色且在490 nm下 於板讀取器上進行讀取。 實驗說明於圖10中，其中H2L2-C91S、H0L0、HcLc (10B3嵌合體）及陰性對照單株抗體用作對照抗體。在此 ELIS A中，所有11種CDRH3變異型抗體均與重組肌肉抑制 素結合。與基礎H2L2-C91S及H0L0相比，H2L2-C91S_ P100B_I、H2L2-C91S_V102N、H2L2-C91S_G100A_K ' H2L2-C91S_P100B_F& H2L2-C91S_F100G_Y 傾向於對肌 肉抑制素具有較佳結合活性。
5.8肌肉抑制素競爭ELISA 156287.doc -113 - 201210612 在二種不同肌肉抑制素競爭ELISA中進一步研究CDRH3 變異體。分析經純化之抗體與1〇B3鼠類mAb競爭的能力。 5.8.1使用多株Ab作為捕捉方法 使用5.7中所述之方案，但向各孔中添加1〇B3(最終濃度 為〇·3 gg/ml)並與滴定至合適濃度範圍（約1〇至〇 〇1 yg/ml) 之抗體混合。使用抗小鼠HRP結合抗體（DAK〇 P0260，根 據製造商之說明書使用）偵測丨0B3抗體之結合。自ELISa 資料獲得之分級展示於表12中。 5.8.2使用生物素化肌肉抑制素作為捕捉方法 使用5.7中所述之方案，但起初在下用5 μ§/ϊη1抗生蛋 白鍵菌素塗佈板隔夜。經1小時添加含〇 3 pg/mi生物素化 肌肉抑制素之阻斷緩衝液，接著用洗滌緩衝液洗滌3次。 添加10B3(最終濃度為〇.2 μ§/ηι1)至各孔中且與滴定至合適 濃度範圍（約10至0.01 pg/ml)之抗體混合。使用抗小鼠HRP 結合抗體（DAKO P0260，根據製造商之說明書使用）偵測 10B3抗體之結合。自ELISA資料獲得之分級展示於表12 中。 5.8.3使用肌肉抑制素作為捕捉方法（直接捕捉） 使用5.7中所述之方案，但起初在4。〇下用〇 2 μ8/ιη1肌肉 抑制素（内部重組肌肉抑制素’參見以上1 ·丨）塗佈板隔夜。 添加10B3(最終濃度為0.3 pg/mi)至各孔中且與滴定至合適 濃度範圍（約10至0.01 pg/ml)之抗體混合。使用抗小鼠1^尺？ 結合抗體（DAKO P0260，根據製造商之說明書使用）偵測 10B3抗體之結合》自ELISA資料獲得之分級展示於表12 156287.doc -114- 201210612 中。 所有CDRH3變異體均能夠與10B3競爭。5種來自各不同 競爭ELISA之最有效分子列於表12中。 表12 : 5種最有效CDRH3變異型分子之等級次序首位（1)至 末位（5)
肌肉抑制素競爭ELISA 生物素化肌肉抑制素 多株Ab 直接捕捉 H2L2-C91S —V102S H2L2-C91S _P100B_F H2L2-C91S_P100B_F H2L2-C91S _F100G_Y H2L2-C91S—V102N H2L2-C91S _F100G_Y H2L2-C91S _P100B_I H2L2-C91S_V102S H2L2-C91S_V102N H2L2-C91S _V102N H2L2-C91S_F100G_Y H2L2-C91S 一V102S H2L2-C91S _Y96L ------- H2L2-C91S _G99D H2L2-C91S_P100B_I 基於該部分之分析及先前部分5.6及5.7中之BIAcore資
料’選擇變異體H2L2-C91S P100B F、H2L2-C91S P100B I —» — ·— 、H2L2-C91S-〜Fl〇〇G_Y、H2L2-C91S-_V102N 及 H2L2· C91S-—V102S用於進一步分析。 5.9肌肉抑制素生物活性之活體外抑制 在肌肉抑制素反應性報導基因檢定（參見以上1.2)中測試 5_8之5種所選CDRH3變異體以評估活體外功效。在37°C 下’將濃度為5 nM之肌肉抑制素與不同濃度之抗體一起預 培育’隨後添加至經轉染之A204細胞中。在37。(：下再培育 細胞6小時’隨後根據發光來測定相對螢光素表現。所得 IC50展示於表13中。 156287.doc •115· 201210612 表13 : A204活體外活性檢定中人類化抗體之IC50 抗體 平均 IC5()(iiM) 下部95% Cl (nM) 上部95% Cl (nM) 10B3嵌合體 3.534 1.941 6.435 H2L2-C91S 5.137 2.350 11.230 H2L2-C91S_P100B_F 4.235 2.295 7.818 H2L2-C91S_P100B_I 4.525 1.837 11.140 H2L2-C91S_F100G_Y 3.639 1.908 6.940 H2L2-C91S_V102N 5.514 3.023 10.060 H2L2-C91S—V102S 4.221 2.234 7.975 資料顯示，在此檢定中所測試之所有抗體以與10B3嵌合 體類似之效能中和肌肉抑制素，其中H2L2-C91S_F100G_Y 具有最高效能，儘管並不顯著。 6.構築及表現FC失能之恆定區變異鱧 因為抗肌肉抑制素之活體内作用模式為簡單結合及中和 肌肉抑制素，所以分子可能未必需要保留其引發ADCC及 CDC反應之Fc功能。此外，使Fc功能失能可能有助於降低 輸注相關之免疫反應的可能性。使Fc功能失能之突變涉及 以下取代（使用EU編號系統）：Leu 235 Ala ;及Gly 237 Ala。 使用標準分子生物學技術，將編碼CDRH3變異體 H2_F100G_Y2可變重鏈區之序列的基因自現有構築體轉 移至含有hlgGl Fc失能恆定區之表現載體中。使用pTT載 體產生編碼重鏈（SEQ ID NO: 98 H2_F100G_Y_Fc失能）及 輕鏈（SEQ ID NO: 40 L2-C91S)之全長DNA表現構築體。重 156287.doc -116- 201210612 鏈之詳情展示於表14中。 表14. CDRH3變異髏Fc失能之序列 名稱 全長蛋白質序列ID ~ H2L2-C91S _F100G_Y Fc失能 98 在肌肉抑制素反應性報導基因檢定（如上1.2所述）中分析 經Fc失能之恆定區之影響。所得ICso資料展示於表丨5中。 表15.活體外活性檢定中A204中CDRH3變異體Fc失能抗 體之ICS0 抗體 平均ic50 下部 95°/〇CI 上部95%CI (nM) (nM) (nM) H2L2-C91S 4.083 1.319 12.640 H2L2-C91S _F100G_Y Fc 失能 1.239 0.524 2.932 該等資料顯示如上所述使「H2L2-C91S_F100G_Y Fc失 能」之Fc功能失能對抗體中和肌肉抑制素之效能無顯著影 響。 7· CDRH2變異型人類化抗體 7.1構築CDRH2變異型人類化抗體 如以上實例4所述，重鏈CDRH2中Kabat 54位之天冬醯 胺（N54)可能脫醯胺《為降低此潛在風險，使序列之G55突 變以產生H2_F100G_Y之多個CDRH2變異體。所有該等變 異體均在CDRH2 (SEQ ID NO: 2)中有所不同且使用編碼 H2_F100G_Y重鏈之PTT載體藉由定點突變誘發產生。輕 鏈（SEQ ID NO: 40 L2-C91S)與各重鏈一起表現。未使該等 構築體之Fc區失能。 156287.doc -117· 201210612 7.2 HEK293 6E細胞中之CDRH2變異馥表現 如以上5.2所述，將分別編碼重鏈及輕鏈之pTT質體短暫 共轉染至HEK 293 6E細胞中。此外，表現H2L2-C91S_F100G一Y作為陽性對照。藉由BIAcore分析HEK293 細胞上清液中所產生之抗體與重組肌肉抑制素之結合。 CDRH2變異體之篩選指示所有變異體均與重組肌肉抑制素 結合。 使用所獲得之親和力資料及潛在脫醯胺作用風險之電腦 分析，選擇一組5種CDRH2變異體（列於表16中）進行較大 規模表現、純化及進一步分析。 表16. CDRH2變異體序列 名稱 CDRH2之序列 H2L2C91S NIYPYNGVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 2) H2L2 C91S_G55D F100G_Y NIYPYNDVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 93) H2L2 C91S_G55L F100G_Y NIYPYNLVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 94) H2L2 C91S_G55S F100G_Y NIYPYNSVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 95) H2L2 C91S_G55T F100G_Y NIYPYNTVSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 96) H2L2 C91S_G55V F100G_Y NIYPYNWSNYNQRFKA(SEQ ID NO: 97) 7.3表徵CDRH2變異體 在肌肉抑制素結合ELISA中分析所有5種抗體之結合活 性。在4°C下，用10奈克/孔重組肌肉抑制素塗佈96孔 ELISA板隔夜。接著用洗滌緩衝液（PBS、0.1% Tween-20) 洗滌此板3次。在室溫下用阻斷溶液（PBS、0.1% Tween-20+1%牛血清 白蛋白 [BSA]))對孔進行阻斷 1小時， 隨後用 洗滌緩衝液洗滌3次。接著，將抗體滴定至合適濃度範圍 156287.doc -118- 201210612 (約10至0.01 pg/ml)，添加至板中且在室溫下培育1小時。 接著在洗滌緩衝液中洗滌板3次。使用抗人類κ輕鏈HRP結 合抗體（Sigma Aldridge供應之A7 164，根據製造商之說明 使用此試劑）偵測人類化抗體或嵌合抗體（諸如10B3嵌合體 或H0L0)之結合。接著在洗蘇緩衝液中洗滌板3次且用OPD 受質（來自Sigma，根據製造商之說明使用）進行顯色且在 490 nm下用板讀取器進行讀取。 圖 11 展示 H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2 C91S、HcLc (10B3C)及陰性對照mAb以及所有5種CDRH2變異型抗體之 結果。CDRH2變異體相較於H2L2-C91S_F100G_Y具有較 佳或類似之肌肉抑制素結合活性。 7.4 CDRH2變異趙BIAcore分析 亦藉由BIAcore測試CDRH2變異體以測定肌肉抑制素結 合親和力之任何變化。將蛋白質A固定於Cl Biacore生物 感測器晶片上，以低密度捕捉經純化之抗體，使得肌肉抑 制素之最大結合產生小於30個共振單位。僅使濃度為256 nM之肌肉抑制素流經經捕捉之抗體表面；使用緩衝液注 射（亦即0 nM)作為結合資料之雙重參考。使用100 mM磷酸 使蛋白質A表面再生。擬合資料與T100 Biacore分析軟體 所固有之二價模型及兩態模型。然而，因為肌肉抑制素為 二聚體，所以二價模型資料較為重要。使用HBS-EP且在 25°C之溫度下進行操作。 所用模型可能不會反映真實活體内結合且模型本身可能 不會精確反映相互作用，因此計算值僅用於分級。資料表 156287.doc -119- 201210612 明與H2L2-C91S_F100G_Y相比，CDRH2變異體不會太過 顯著地影響親和力，根據二價模型，最差構築體（H2L2 0918_0551^1000_丫）顯示總體親和力低6.8倍。 7.5肌肉抑制素生物活性之活體外抑制 亦使用A204螢光素檢定（部分1·2中所描述）分析CDRH2 變異體對活體外中和檢定之作用。抑制曲線之IC5〇值提供 於表17中。 表17. A204活體外活性檢定中抗體變異體之IC50 抗體 平均ic50 (nM) 下部95%CI (nM) 上部95%CI (nM) 10B3嵌合體 3.570 1.473 8.654 H2L2-C91S_F100G_Y 11.070 3.686 33.230 H2L2 C91S_G55D F100G_Y 5.530 1.649 18.540 H2L2 C91S—G55L F100G一Y 5.581 1.601 19.460 H2L2 C91S_G55S F100G_Y 4.425 1.730 11.310 H2L2 C91S_G55T F100G_Y 6.892 2.452 19.370 H2L2 C91S_G55V F100G一Y 3.840 1.044 14.130 資料表明在此檢定中所有CDRH2變異型抗體均以與 H2L2-C91S_F100G_Y類似之效能抑制肌肉抑制素誘導之 A 2 0 4細胞活化。 7.6 Fc失能型CDRH2變異鱧 在A204檢定中具有最高表觀效能之可發展性增強分子 H2L2 C91S_G55S F100G_Y進行Fc失能（藉由進行以下取 代，使用EU編號系統：Leu 235 Ala ;及Gly 237 Ala)，如 SEQ ID NO: 99中所例示。使用受體結合檢定（實例2.5)證 明此新穎分子H2L2 C91S_G55S F100G_Y-Fc失能相較 156287.doc -120- 201210612 H2L2 C91S_G55S F100G_Y具有輕微改良之效能（參見表 18)。 表18. ActRIIb受體結合檢定中抗體變異體之ICS0值 mAb 平均ic50 (nM) 下部95%CI (nM) 上部95%CI (nM) 10B3 0.161 0.087 0.295 H2L2 C91S_G55S F100G_Y 0.786 0.326 1.898 H2L2 C91S_G55S F100G_Y-Fc失能 0.518 0.206 1.298 8· 10B3處理減輕帶有C-26腫瘤之小鼠之肌肉萎缩 在本研究中，在帶有結腸-26腫瘤之小鼠（此為癌症惡病 質研究廣泛使用之臨床前模型）中研究10B3處理對體重變 化、肌肉質量及肌肉功能之影響。 將38隻8週齡雄性CD2F1小鼠隨機分成4組：mIgG2a (n=9)、10B3(n=9)、mIgG2a+C-26(n=10)及 10B3+C-26(n=10)。 將結腸-26(〇26)腫瘤細胞以1><106個細胞/小鼠皮下植入20 隻小鼠中。若干小時後，動物開始接受抗體注射。在第0 天、第3天、第7天、第14天、第21天向小鼠腹膜内注射30 mg/kg劑量之小鼠IgG2a對照抗體或10B3。在整個實驗期間 監測體重及脂肪質量。在第25天臨處死前，藉由在對大腿 中部坐骨神經電刺激時量測收縮力來評估下肢肌力。實驗 結束時測定腫瘤重量及個別肌肉質量及附睾脂肪墊質量。 圖12展示第0天至第25天帶有C-26腫瘤之小鼠中抗體處 理對體重之影響。在腫瘤植入後第21天帶腫瘤小鼠之體重 開始顯著降低。用10B3處理有效緩解帶腫瘤小鼠的體重減 輕。經10B3處理之帶腫瘤小鼠之平均體重比經mIgGa2a對 156287.doc -121 - 201210612 照抗體處理之帶腫瘤小鼠高8%。在10B3處理組與mIgG2a 對照處理組之間腫瘤尺寸並無顯著差異（IgG2a為2.2 g對比 10B3為 1.9 g)。 圖13展示抗體處理對帶有C-26腫瘤之小鼠之總體脂肪 (A)、附睾脂肪墊（B)及痩質量（C)的影響。帶腫瘤小鼠之總 體脂肪顯著較少（圖13 A)。經10B3及mIgG2a對照處理之帶 腫瘤小鼠的附睾脂肪墊幾乎完全消失（圖13B)，表明1 0B3 並不保護帶腫瘤動物免於體脂肪減少。 如圖13C所示’ 10B3處理在正常動物以及帶腫瘤小鼠中 引起瘦質量顯著（p<0.01)增加。在移除腫瘤之後，經對照 IgG2a處理之帶腫瘤小鼠之痩質量顯著較低。相比之下， 經10B3處理之帶腫瘤小鼠之痩質量顯著（p<〇 〇丨）高於經 IgG2a處理之帶腫瘤小鼠》實情為，經1〇B3處理之帶腫瘤 小鼠與正常動物之間瘦質量並無顯著差異。 表19展示抗體處理對肌肉質量之影響。如所預期，帶腫 瘤小鼠之TA、EDL、四頭肌、比目魚肌及腓腸肌顯著損失 (表19) » 10B3處理增加正常動物之肌肉質量。最重要的 是，10B3處理減少帶腫瘤小鼠之肌肉損失。在經⑺…處 理之帶腫瘤小鼠巾，TA、EDL、四祕、比目魚肌及排腸 肌之重量分別比經IgG2a對照處理之帶腫瘤小鼠高178〇/〇、 Π.3%、16.9%、13.4% 及 14.6%。 156287.doc •122- 201210612 表19 : 10B3處理減少帶腫瘤小鼠之肌肉損失。資料為平均 肌肉質量（mg)+/-SEM。根據史都登氏T檢驗（Student T tests)，帶有上標*及#之平均值分別指示與IgG2a組及C-26+IgG2a組顯著（p<0.05)不同。 組 四頭肌 腓腸肌 TA EDL 比目魚肌 IgG2a 216+/-2.1 159+/-2.2 51+/-0.5 11.1+/0.5 8.0+/-0.4 10B3 244+/-4.7 * 173+/-4.8 58+/-1.2* 12.6+/0.6 * 8.5+/-0.2 C-26 + IgG2a 174+/-3.7 * 123+/-4.5 · 40+/-1.6 * 8.9+/-0.3 * 6.9+/-0.3 * C-26+ 10B3 204+/-8.6 # 140+/-5.8# 47+/-1.8 # 9.9+/-0.6 7.9+/-0.5 圖14展示抗體處理對下肢肌力之影響，此係藉由在對大 腿中部坐骨神經電刺激時量測收縮力來評估。腫瘤植入25 天後，在對照抗體組中下肢肌肉收縮力顯著（p<〇.〇〇1)降低 20°/。。與對照組相比，在健康動物及帶腫瘤小鼠中1〇B3處 理分別使最大收縮力增加10.2%及17.5%(ρ<0·05)。在經 10Β3處理之帶腫瘤小鼠與健康對照組之間最大力量測值並 無顯著差異。因此’ 10Β3處理改良健康小鼠與帶腫瘤小鼠 之肌肉功能》 該等資料指示10Β3或其人類化抗體處理可減少與癌症惡 病質相關之肌肉損失及功能下降。 9·在小鼠腱切除模型中10Β3處理對骨骼肌萎缩症的作用 此處’測定小鼠腱切除模型中肌肉抑制素抗體1〇Β3對肌 肉質量之影響。 將幼年雄性C57BL小鼠隨機分為migG2a或10Β3處理組 (n-6隻/組）且在第！天 '第4天、第8天及第15天以3〇 腹媒内給藥°在給藥前的早晨（第〇天），所有小鼠接受以下 156287.doc -123- 201210612 外科手術方案：使左腿中之脛骨前肌（ΤΑ)腱在其末端插入 處分離（腱切除術），同時暴露所有右ΤΑ腱但保持完整 (假）。3週後（第21天）’對小鼠實施安樂死以評估τα肌肉質 量之變化。 在對小鼠進行假手術與腱切除手術之後，3週1 〇Β3處理 顯者增加ΤΑ肌肉質量（圖15)。有趣的是，與完整假狀況 (+14%)相比’在腱切除術存在下1〇Β3之作用較為明顯 (+21%)。 該等資料指示10Β3或其人類化抗體處理可減少與創傷/ 損傷相關之肌肉損失及功能下降。 10. 10Β3在糖皮質激素誘發之肌肉萎缩中之功效 糖皮質激素通常用於治療許多慢性發炎性疾病，諸如全 身性紅斑狼瘡症、肉狀瘤病、類風濕性關節炎及支氣管哮 喘。然而’投與高劑量之糖皮質激素會導致人類及動物之 肌肉萎縮症。類似地’皮質醇增多症對庫欣氏病（Cushing，s disease)之肌肉萎縮症中起主要作用。地塞米松（dex)誘發 之肌肉萎縮症與肌肉之肌肉抑制素mRNA及蛋白質表現之 顯者劑里依賴性誘導相關（Ma K等人，2003 Am J Physiol
Endocrinol Metab 285:E363-E371)。亦已在若干種肌肉萎
縮症模型（諸如固定及灼傷損傷）中報導肌肉抑制素表現增 加，其申糖皮質激素起主要作用（Lalani R等人，2000 J
Endocrinol 167:417-428 ; Kawada S 等人，2001 J Muscle Res Cell Motil 22:627-633 ;及 Lang CH 等人，2001 FASEB J 15:NIL323-NIL338) ° 156287.doc •124- 201210612 在本研究中，研究10B3處理是否可預防小鼠中類固醇誘 發之肌肉損失。 50隻10週齡C57BL小鼠分為3個組且在第〇天、第3天、 第7天、第14天、第21天及第28天腹膜内給與PBS(n=l〇)、 30 mg/kg mIgG2a(n=20)或 30 mg/kg 10B3(n=20)。接著在第 28天將各抗體處理組進一步分為兩個子組：mlgGaa.媒劑 (n=10)、10B3+ 媒劑（n=l〇)、mIgG2a+ 地塞米松（n=l〇)、 10B3 +地塞米松（n=10)。在第29天至第42天，每天一次向 小鼠皮下注射含0.1% DMSO之PBS作為媒劑（PBS +媒劑、 mIgG2a+媒劑、10B3 +媒劑）或以1毫克/公斤/天皮下注射地 塞米松（mIgG2a+地塞米松、i〇B3 +地塞米松）。在此期間， 在第35天小鼠再一次接受PBS、mIgG2a或10B3腹膜内注 射。在42天實驗結束時’藉由qnmr掃描量測總體脂肪及 瘦質量。對小鼠實施安樂死且解剖個別骨骼肌並進行稱 重0 圖16展示第0天至第42天之處理時程期間之體重變化。 在第29天開始地塞米松處理。歷時13天之地塞米松處理在 經對照抗體預先處理之動物中引起體重減輕。用丨〇B3預先 處理減弱地塞米松誘發之體重減輕。 表20展不用10B3或對照抗體預先處理對地塞米松誘發之 肌肉損失之影響。經對照抗體預先處理之動物在注射地塞 米松13天後展示在伸趾長肌（EDL)、脛骨前肌（TA)及腓腸 肌中發生明顯肌肉萎縮症（p<〇 〇5)。地塞米松處理後，對 照抗體處理組中之四頭肌質量降低7%。然而，其在統計 1562S7.doc •125· 201210612 上並不顯著。有趣的是，地塞米松處理不引起比目魚肌之 顯著肌肉損失。相比之下，在經10B3預先處理之動物中， 地塞米松處理未在TA、EDL、四頭肌及腓腸肌引起明顯萎 縮症（10B3 +媒劑相對於10B3 +地塞米松，p>0.05，因此不 顯著）。 表20 10B3處理對地塞米松誘發之肌肉損失之影響。資料 為平均值+/-SEM。具有不同上標之平均值指示顯著不同 (p<0.05) 組 TA EDL 四頭肌 腓腸肌 比目魚肌 PBS+媒劑 37+/-0.79c 8.5+/-0.25ab 176+/-2.8 bc 119+/-2.6 b 8.1+/-0.29 mIgG2a+媒劑 38+/-0.37bc 8.8+/-0.373 176+/-1.8 bc 121+/-2.0b 7.6+/-0.29 mIgG2a+地塞 米松 34+/-0.83 d 7.7+/-0.16 b 164+/-2.8c 109+/-2.3c 7.5+/-0.24 10B3+媒劑 42+/-0.64a 9.3+/-0.16a 194+/-4.5a 131+/-2.3a 8.1+/-0.35 10B3+地塞米松 41+/-0.32ab 8.7+/-0.32ab 187+/-3.2ab 124+/-1.9ab 8.4+/-0.35 圖17展示用10B3或對照抗體進行預先處理對地塞米松誘 發之體脂肪積累之影響。經對照抗體預先處理之動物展示 體脂肪積累顯著增加（P<〇.〇5)。然而，在經10B3預先處理 之動物中，地塞米松處理後體脂肪百分比未顯著增加 (10B3 +媒劑相對於10B3 +地塞米松，p>0.05，因此不顯著 (NS))。 該等結果表明10B3或其人類化抗體可用於治療糖皮質激 素誘發之肌肉萎縮。舉例而言，在經受糖皮質激素療法之 患者中防治性處理肌肉萎縮可為有利的。 11. 10B3處理減輕坐骨神經擠壓模型之肌肉萎縮症 人類不用性肌肉萎縮症通常與諸如關節之慢性骨關節炎 156287.doc -126· 201210612 或用於治療骨折之石膏固定的矯形外科病症相關聯地發 生，以及在出於其他醫學或手術原因而長期臥床休息之情 況下發生。不用性肌肉萎縮症引起肌力降低且導致失能。 身體復原仍然為唯一治療選擇’且此通常需要較長時間且 並不總是會使肌肉恢復至正常尺寸或力量。 此處使用神經損傷模型來評估1〇Β3在預防小鼠之不用性 萎縮症方面的功效。 39隻8週齡雄性C57BL小鼠隨機分為4個組：mIgC}2a+假 手術（n=9)、10B3 +假手術（n=l〇)、mIgG2a+坐骨神經擠壓 (n=10)及10B3+坐骨神經擠壓（η=ι〇)。在第〇天、第3天、 第7天、第14天、第21天及第28天向小鼠腹膜内給與3〇 mg/kg mIgG2a對照或10B3抗體。抗體處理3週後，用異氟 烧（isoflurane)使小鼠麻醉且使右腿之大腿中部坐骨神經暴 露並保持完整（假手術組）或藉由使用止血劑鉗擠壓1〇秒來 損傷（神經擠壓組）。手術1週後（第28天），小鼠接受最後一 次抗體注射。神經擠壓手術後第1 〇天對小鼠實施安樂死且 評估後肢之肌肉質量。 圖18展示經對照抗體處理之組中坐骨神經擠壓對肌肉質 量之影響（mIgG2a+假手術，及mIgG2a+坐骨神經（SN)擠 壓）。與假手術對照相比，坐骨神經擠壓損傷分別引起伸 趾長肌（EDL)、脛骨前肌（TA)、腓腸肌及比目魚肌之質量 顯著（p<0.01)降低達22°/。、37%、41%及29%。坐骨神經損 傷不影響四頭肌質量（資料未圖示）。 圖19A展示假手術操作腿中1〇B3及對照抗體處理對骨骼 156287.doc -127- 201210612 肌質量之影響。在假手術組中，與IgG2a對照組相比， 10B3處理分別使TA、EDL、腓腸肌及四頭肌之質量顯著 增加7%、10%、12%及13%。然而，10B3處理不引起比目 魚肌之明顯質量變化。 圖19B展示坐骨神經擠壓腿中10B3及對照抗體處理對骨 骼肌質量之影響。經10B3處理之動物與經IgG2a對照處理 之動物相比保留顯著更多肌肉。經10B3處理之神經損傷動 物之TA、EDL、腓腸肌及比目魚肌顯示質量高於（分別為 11%、16%、9%及10%)IgG2a對照組之質量。10B3處理亦 增加假手術操作及神經擠壓動物之總體重（資料未圖示）。 此等結果顯示10B3或其人類化抗體可具有預防及/或治 療人類不用性肌肉萎縮症之潛力。 實例12 : H2L2變異體之活體内功效 使用3、10及30 mg/kg之劑量在7至8週齡雄性SCID小鼠 中比較具有完整功能WT Fc域或Fc失能突變之H2L2抗肌肉 抑制素變異體對肌肉生長之影響。鼠類親本分子10B3用作 陽性對照且亦以3、10及30 mg/kg給與且無關鼠類IgG2a同 型對照以30 mg/kg給與。每劑量組有10隻動物。在第0 天、第3天、第7天、第14天及第21天藉由腹膜内注射投與 分子。在研究之第28天，處死動物且解剖並測定以下肌肉 之重量：脛骨前肌（TA)、四頭肌、伸趾長肌（EDL)及腓腸 肌（圖29)。 應注意，與對照動物相比，10B3陽性對照組顯示肌肉質 量增加大於10%，而兩種H2L2變異體對所量測之肌肉組織 156287.doc -128- 201210612 顯示顯著較少之影響，但觀測到劑量依賴性增加肌肉質量 之趨勢，在一些肌群中觀測到一些統計上顯著之效果。 13.表現及表徵人類化抗體 製備抗體 在pTT哺乳動物表現載體中製備人類化VH構築體（H3、 H4、H5及H6)及人類化VL構築體（L4、L5及L6)。作為該等 分析之部分產生之抗體說明於表21中。使用293費克汀 (293fectin)(Invitrogen，12347019)將編碼圖 20 中之抗體之 重鏈及輕鏈表現質體共轉染至HEK 293 6E細胞中。24小時 後，添加膜化蛋白（tryptone)進料至各細胞培養物中且48至 72小時後收集細胞。使用蛋白質A管柱純化抗體，隨後在 結合檢定中進行測試。 人類化抗體之重鏈及輕鏈兩者中潛在脫醯胺位點之電腦 分析鑑別出重鏈CDRH2中Kabat 54位（N54)處之天冬醯胺具 有高脫醯胺可能性。為減少此潛在風險，藉由定點突變誘 發將Kabat 55位（G55)處之胺基酸取代為絲胺酸。 產生3種人類化VH構築體。該等構築體編號為H7 (SEQ ID NO: 119)、H8 (SEQ ID NO: 120)及 H9 (SEQ ID NO: 121)。H7、H8及H9分別與H4、H5及H6—致，但具有點突 變，其中55位之胺基酸為絲胺酸而非甘胺酸。 156287.doc -129- 201210612 表21 :所產生之用於可發展性分析之人類化抗體 10B3 VH人類化 :為禁艘 .s 所存在之突奶Kab#磘號)= ..' ... · · .·.：'·：·.：·' .... v ... : . * ·. '.···.. . · · · .··... · · ·' * · . · 可鸯區 SiEOIDNO. SE〇 ID NO. :轉_:::;: .ΐ SEO^mNO. H0 無 12 43 28 H1 O105T 13 44 29 H2 T28S 14 45 30 H3 T28S、M48I、V67A、M69L、 F100G Y 112 128 138 H4 T28S、T71V、T73K、F100G_Y 113 129 139 H5 T28S、M48I、V67A、M69L、 T71V、T73K、F100G_Y 114 130 140 H6 T28S、M48I、V67A、M69L、 T71V、T73K、V20I、R66K、 F100G Y 115 131 141 H7 T28S 、T71V 、Τ73Κ 、 F100G一Υ、G55S 119 135 142 H8 T28S、Μ48Ι、V67A、M69L、 T71V、Τ73Κ、F100G_Y、G55S 120 136 143 H9 T28S、M48I、V67A、M69L、 T71V、T73K、V20I、R66K、 F100G一Y、G55S 121 137 144 10B3 VL人類化 構築體 所存在之突凌 (Kab.at 編號）.. f變區? (蛋白 •. · SEOIDNO； 可變皞(〇NA). SEQIDNO. * . . · .-:V >長序对 StOiDNO. L0 無 15 46 31 LI G16R 16 47 32 L2 F71Y 17 48 33 L2 + C91S F71Y ' C91S 24 55 40 L3 Q100A 18 49 34 L4 F71Y、T69Q、C91S 116 132 145 L5 F71Y、S46T、C91S 117 133 146 L6 F71Y、T69Q、S46T、 C91S 118 134 147 156287.doc -130· 201210612 14.肌肉抑制素中和檢定 14.1重組可溶性ActRIIb 在 4°C 下將 1 pg/ml 重組可溶性 ActRIIb(R&D Systems 339-RBB)於碳酸酯緩衝液中塗佈於ELISA板之孔中隔夜。 用含有0.1% tween 20及0.1 % BS A之PBS對板進行阻斷且根 據標準ELISA方案洗滌。同時，2 nM生物素化肌肉抑制素 (内部試劑，如上所述）與表21及22抗體之系列稀釋液一起 在37°C下預培育30分鐘。接著在37°C下經1小時向ActRIIb 塗佈之板中添加生物素化肌肉抑制素：抗體反應物（50微升/ 孔）。進行標準洗滌程序’接著以每孔添加50微升以1:200 稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物（R&D Systems ’ #890803)，接著再在37°C下培育1小時。再次洗滌板且在 受質（R&D Systems，#DY999)及酸終止溶液處理後在490 nm吸光度下進行檢定。結果展示為至少3次重複檢定之平 均IC50值且信賴區間展示於下表23中。 表23 :人類化抗體之ActRIIb肌肉抑制素中和 抗體 平均 IC5〇(nM) 下部 95% CI(nM) 上部 95% CI(nM) 10B3 0.172 0.132 0.225 H2L2-C91S_F100G_Y 1.246 0.916 1.696 H3L4 1.307 0.476 3.587 H3L5 1.076 0.505 2.291 H3L6 3.037 0.937 9.842 H4L4 0.395 0.290 0.539 H4L5 0.336 0.213 0.530 H4L6 0.273 0.196 0.381 156287.doc -131 - 201210612 H5L4 0.211 0.211 0.245 H5L5 0.149 0.118 0.189 H5L6 0.166 0.143 0.192 H6L4 0.225 0.184 0.274 H6L5 0.211 0.240 0.428 H6L6 0.320 0.240 0.428 H7L4 0.038 0.020 0.073 H7L5 0.028 0.013 0.059 H7L6 0.031 0.020 0.047 H8L4 0.079 0.068 0.093 H8L5 0.101 0.068 0.152 H8L6 0.101 0.068 0.152 H9L4 0.141 0.110 0.179 H9L5 0.140 0.101 0.193 H9L6 0.129 0.094 0.176 該等資料顯示對肌肉抑制素與ActRIIb-Fc蛋白質之結合 之中和的IC50範圍。效能主要利用重鏈進行測定，其中 H7、H8及H9得到最低IC5〇值。 14.2報導細胞生物檢定 使用肌肉抑制素反應性報導基因檢定（Thies等人，（2001) Growth Factors 18(4) 25 1-259)評估橫紋肌肉瘤細胞（A204) 中肌肉抑制素之活體外活性。A204細胞（LGC Promochem HTB-82)在含有10%胎牛血清（Gibco)之RPMI 1640培養基 (Hyclone)中生長。細胞用膜蛋白酶處理以產生懸浮液且使 用FuGene 6(Roche)用含有受PAI-1啟動子之12x CAGA盒控 制的螢光素酶基因之pLG3質體轉染。24小時後，收集細 胞，洗滌，以2xl07個細胞/毫升再懸浮於20% DMSO、 156287.doc •132- 201210612 80%胎牛血清中，等分且在-80°C下冷凍。 使A204細胞之冷凍小瓶解凍且懸浮於50 ml溫暖培養基 (具有HEPES及L-麩醯胺酸之高葡萄糖DMEM [Invitrogen， 12430-047]，含有 1%胎牛血清[Invitrogen，16000-044]) 中。使細胞集結且以1·3xlO6個細胞/毫升再懸浮於含有30 ηΜ肌肉抑制素之10 ml培養基中。添加細胞至96孔板 (Greiner，655083)中，每孔50微升。在含有1%胎牛jk清及 2 ηΜ肌肉抑制素之DMEM/高葡萄糖培養基中連續稀釋表 21及22中所述之抗體且轉移100 μΐ測試樣品至檢定板中。 在37°C下培育檢定板5小時。接著添加100 μΐ SteadyGlo試 劑（Promega)至各孔中。培育板10分鐘，隨後使用Viewlux 板讀取器（Perkin Elmer)進行螢光量測。結果展示於表24 中〇 表24:肌肉抑制素反應性報導基因中和檢定 抗體 IC5〇(M) 10B3 1.0e-8 H2L2-C91S_F100G_Y 2.3e-8 H4L4 7.9E-09 H4L5 6.5E-09 H4L6 6.9E-09 H5L5 6.1E-09 H6L5 6.0E-09 H7L5 6.3E-09 H8L5 5.0E-09 H9L5 4.0E-09 該等資料表明，以上測試之所有抗肌肉抑制素人類化抗 體根據其在報導基因轉染之A204細胞中刺激螢光素酶反應 156287.doc -133- 201210612 之能力均能夠中和肌肉抑制素。 15. 結合特異性 進行ELISA以判定H8L5是否可結合任何其他生長因子及 尤其TGFP家族中已知與所提出之抗原決定基序列共有一 定程度之同源性的其他成員。藉由用各種生長因子以0.5 μg/ml塗佈ELISA板且在標準EUSA條件下在H8L5中進行滴 定，斷定在所測試之其他因子中H8L5僅可與GDF-11結 合，其中得到50%結合所需之濃度為肌肉抑制素的1/3倍 (圖22)。SPR資料表明H8L5結合於活化素B，但親和力較 弱（比其對肌肉抑制素之親和力低超過12倍）。 16. 在報導基因檢定中活化素b之中和 A204細胞用含有受PAI-1啟動子之12x CAGA盒控制的螢 光素酶基因之pLG3質體轉染且培育隔夜。 製備含有不同濃度之H8L5及40 nM活化素B(20倍其最終 檢定濃度）之溶液且預培育30分鐘。接著將20 μΐ該等測試 溶液置於檢定板中且添加180 μΐ每毫升含2.22x 105個經轉 染細胞之檢定培養基。在37°C下培育細胞6小時。接著添 加50 μΐ SteadyLite(Perkin Elmer)試劑。在室溫下在振動下 (450 rpm)培育板20分鐘且用Tecan Ultra板讀取器以榮光模 式讀取。顯示H8L5為活化素B之極弱抑制劑，其中 IC50>1.5 μΜ(圖 23)。 17. 藉由ΚΙΝΕΧΑ方法測定結合親和力 使用Kinexa(Sapidyne Instruments)溶液相親和力測定一 定範圍之抗肌肉抑制素分子之總體親和力。藉由吸附（聚 156287.doc -134- 201210612 曱基丙烯酸甲酯珠粒-PMMA)或胺偶合（NHS活化之瓊脂糖 凝膠珠粒）製備肌肉抑制素珠粒。所研究抗肌肉抑制素分 子之範圍需要產生經不同濃度之肌肉抑制素塗佈之珠粒。 對於檢定之溶液相部分，固定濃度之抗體與廣泛範圍濃度 之肌肉抑制素一起培育且藉由在室溫下培育至少2小時使 其達到平衡，隨後進行分析。接著使用肌肉抑制素珠粒藉 助於游離抗體與肌肉抑制素珠粒基質之結合，接著使用經 螢光染料標記之適當二次抗體（視所測試之構築體而定為 抗人類或抗小鼠抗體）偵測來測定溶液相樣品中所存在游 離抗體之量。使用機器固有之Kinexa Pro分析軟體擬合結 合曲線。接著彙編使用不同起始濃度之抗體進行多次測定 獲得之結果且使用η曲線分析軟體進行分析以得到更精確 的親和力測定。 表25使用Kinexa測定與肌肉抑制素之結合的溶液相親和力 分子 Κ〇(ρΜ) 上部95% Cl 下部95% Cl 10B3.C5 205 251 166 10B3嵌合體 548 722 402 H2L2-C91S—F100G_Y 3680 6160 2130 H8L5 50 79 28 18.構築及表現FC失能型恆定區變異體 因為抗肌肉抑制素之活體内作用模式為簡單結合及中和 肌肉抑制素，所以分子可能未必需要保留其引發ADCC及 CDC反應之Fc功能。此外，使Fc功能失能可能有助於降低 輸注相關之免疫反應的可能性。使Fc功能失能之突變涉及 以下取代（使用EU編號系統）：Leu 235 Ala ;及Gly 237 156287.doc •135- 201210612
Ala。 使用標準分子生物學技術，將編碼人類化VH構築體 H7、H8及H9之可變重鏈區之序列的基因自現有構築體轉 移至含有hlgGl Fc失能型恆定區之表現載體。作為該等分 析之部分所產生之抗體說明於表26中。 表26. Fc失能型構築體之序列 抗體 全長DNA序列SEQ ID NO: 全長蛋白質序列SEQ ID NO: H7 Fc失能 122 123 H8 Fc失能 124 125 H9 Fc失能 126 127 任何失能重鏈可與任何輕鏈配對。 19.抗體與Fc受體及Clq之結合 使用ProteOn XPR36進行FcyR及Clq之結合分析。藉由 一級胺偶合使測試抗體（H8L5及Fc失能型H8L5)固定於GLC 生物感測器晶片上。FcYR以2048 nM、512 nM、128 nM、 32 nM 及 8 nM使用，而 Clq 以 512 nM、128 nM、32 nM、8 nM及2 nM使用。使用緩衝液注射（亦即0 nM)作為結合感 測器圖譜之雙重參考。由於相互作用之性質（亦即快速結 合/快速解離），因此無需再生且使用20分鐘解離時間及後 續緩衝液注射使結合感測器圖譜返回至基線。擬合資料與 ProteOn分析軟體所固有之平衡模型，對各受體組及Clq結 合使用全局R-max(亦即FcyR2a His及Arg多形現象在一起 分析且FcyR3a Phe及Val多形現象在一起分析，而單獨分 析Clq)。表27中提供之該等資料表明與無失能突變之相同 156287.doc -136- 201210612 抗體相比，所述Fc失能突變有效削弱失能型抗體與Fc受體 及C1 q之結合。 20. CH50EIA檢定中Fc功能之表徵 為研究抗體對Clq之親和力的此變化對抗體固定補體之 能力的影響，使用CH50 Eq EIA套組。該等實驗表明H8L5 在暴露於人類血清時能夠以濃度依賴性方式產生末端互補 複合物（TCC)。當結合於重組肌肉抑制素時顯然能夠產生 更多TCC且亦比Fc失能型等效物多（在存在或不存在肌肉抑 制素下；圖24)。圖24A展示利用15%人類血清獲得之結果 且圖24B展示利用25%人類血清獲得之結果。由此可斷 定，若需要補體介導之免疫複合物清除機制，則H8L5應 優於其Fc失能型等效物。 21 : H8L5變異體之活體内功效 在第0天、第3天、第7天、第14天及第21天向體重為約 24 g之11週齡雄性C.B-17 SCID小鼠腹膜内給與（給藥量為 20 ml/kg)以下抗體：30 mg/kg hlgGl對照抗體；30 mg/kg 10B3 ; 3、10、30及 60 mg/kg 10B3H8L5 或 10B3H8L5 Fc失 能。經4週每週2次向一些小鼠腹膜内給與30 mg/kg hlgGl，或 1、3、10 及 30 mg/kg AMG745。使用 WO 2007/067616 A2中公開之序列製備AMG745。第28天，解 剖個別骨骼肌（TA、腓腸肌、四頭肌及EDL)且記錄其重 量。圖28 (A-D)展示處理對所研究肌肉之質量的影響。用 10B3進行處理引起TA、四頭肌、EDL之質量顯著增加 (p<0.05)及腓腸肌之不顯著增加（p>0.05)。用任一人類化抗 156287.doc •137- 201210612 體（H8L5或H8L5-失能）進行處理對個別肌肉質量產生影 響’其中一些劑量組中出現顯著增加。AMG745處理在除 最低劑量1 mg/kg以外之所有劑量下均引起四頭肌、排腸 肌之質量顯著增加。 參見圖28。 22.使用磁共振成像測定在肌肉反應之縱向研究中1〇幻之 作用 此研究由3組動物組成’ 2個10B3處理組（3及30 mg/kg)及 1個同型匹配對照組（3〇 mg/kgp在初始3週時期内對動物 進行5次給藥，且在第〇天（第一次給藥）進行腓肌體積之 MRI測定且在隨後12週内每週測定一次。與同型對照組相 比’在給藥期期間觀測到經3〇 mg/kg 10B3處理之動物之 排肌體積及體重顯著增加；30 mg/kg劑量組及3 mg/kg劑量 組與對照組之間的腓肌體積差異百分比分別為約15%及 <5°/。（圖25)。然而，重要的是，整個歷時9週之洗淨期内大 劑量組與對照組之間肌肉體積保持顯著差異（p<〇 〇5)，而 停止給藥後4週時兩個組之體重之間不存在統計差異。亦 在第3週（最後一次給藥）及第4週在3 mg/kg 1〇b3組中觀測 到與對照組相比腓肌體積顯著增加（儘管隨後不存在）。應 注意’整個研究過程中經低劑量1〇B3處理之動物與對照動 物之間不存在體重之顯著差異。 23 SCID小鼠中H8L5之劑量反應研究 在8週齡SCID小鼠中評估一定劑量範圍之H8L5之效能以 定義劑量反應。在第0天、第3天、第7天、第14天及第21 156287.doc -138· 201210612 天藉由腹膜内注射向動物給與30 mg/kg 10B3或0.1、0.3、 1.0、3.0或10.0 mg/kg H8L5。在第28天處死動物。切除肌 肉及其他組織且進行稱重。在低劑量（0.1及0.3 mg/kg)下， H8L5顯著增加附睾脂肪墊質量（p<0.05)(圖26A)。當劑量 超過1 mg/kg時，H8L5引起個別骨骼肌質量之顯著增加（圖 26B)。與經1-10 mg/kg劑量之H8L5處理之對照組相比，藉 由後肢坐骨神經之電刺激原位測得之聲強直力增加19%-24%(ρ<0·05)(圖 26C)。 此研究表明在此模型中H8L5為有效同化劑。基於所稱 重之所有肌肉之質量顯著增加及血清中游離肌肉抑制素之 中和，最低有效劑量為1 mg/kg。重要的是，藉由活體内 收縮性量測，肌肉質量增加引起最大力產生之顯著增加， 在1 mg/kg劑量下觀測到與對照動物相比得到顯著改良。
24. SCID小鼠中腹膜内給藥時H8L5之PK 在雌性C.B-17 SCID小鼠中在單次腹膜内（IP)注射0.1、1 及10 mg/kg後測定H8L5之藥物動力學特性。根據以下收集 時程在每一收集時間點時根據交替稀疏取樣設計自3隻動 物收集血清樣品：2、6、12、24、48、72、192、336、 5 04及672小時。使用Gyro la平台（生物素化肌肉抑制素捕捉 試劑及Dylight Alexa標記之山羊抗人類IgG偵測抗體）針對 H8L5對樣品進行分析。使用WinNonLin，4.1企業版藉由 非隔室藥物動力學分析進行PK分析。 腹膜内投與SCID小鼠0.1、1.0及10 mg/kg之目標劑量後 自血清濃度-時間資料獲得之H8L5之藥物動力學參數的概 156287.doc -139- 201210612 述提供於表29中。 表29.腹膜内給與0.1、1.0及10 mg/kg之目標劑量後， SCID小鼠中H8L5之PK參數的概述 劑量(毫 克/公斤） AUC〇.t (小時X微克/ 毫升） Cmax (微克/毫升） Tmax (小時） Τ-Λ (小時） CL_F (毫升/小時/ 公斤） Vz_F (毫-升/ 公斤） 0.1 87.6 0.727 6 184 0.787 209 1 2040 8.42 6 202 0.444 130 10 20500 95.4 6 292 0.384 162 序列 SEQ ID NO: 1 (CDRH1)
GYFMH SEQ ID NO: 2 (CDRH2)
NIYPYNGVSNYNQRFKA SEQ ID NO: 3 (CDRH3)
RYYYGTGPADWYFDV SEQ ID NO: 4 (CDRL1)
KASQDINSYLS SEQ ID NO: 5 (CDRL2)
RANRLVD SEQ ID NO: 6 (CDRL3)
LQCDEFPLT SEQ ID NO: 7 (小鼠單株 10B3 VH)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYNGVSNYN
QRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYVCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTTVTV
SS SEQ ID NO: 8(小鼠單株10B3及10B3嵌合體VL) 156287.doc -140- 201210612
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRF
SGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQCDEFPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO: 9 (人工信號序列）
MGWSCIILFLVATATGVHS SEQ ID NO: 10 (VH之人類接受體框架）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNY
AQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARXXXXXXXXXXWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 11 (VL之人類接受體框架）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYVCXXXXXXXXXXFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 12 (人類化VH : HO)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTL
VTVSS SEQ ID NO: 13 (人類化VH : HI)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTL
VTVSS SEQ ID NO: 14 (人類化VH : H2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTL
VTVSS SEQ ID NOM5 (人類化VL : L0)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 16 (人類化VL : LI)
DIQMTQSPSSLSASVRDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 17 (人類化VL : L2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 18 (人類化VL : L3) -141 - 156287.doc 201210612
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEIK SEQ ID NO: 19 (10B3 嵌合體 VH ·· N54D)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYDGVSNYN
QRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTV
SS SEQ ID NO: 20 (10B3嵌合體VH : N54Q) ΕνΟΙΛΟεΘΡείνΚΡΟΑβνΚΙβίϊΚΑβΟΥβπΘΥΡΜΗνννΚΟεΗσΝΙΙ^ννίΟΝΙΥΡΥΟΟνεΝΥΝ
QRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTV
SS SEQ ID NO: 21 (10B3嵌合體VL : C91S)
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRF
SGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQSDEFPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO: 22 (人類化VH : H2 : N54D)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYDGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTL
VTVSS SEQ ID NO: 23 (人類化VH : H2 : N54Q)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYQGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTL
VTVSS SEQ ID NO: 24 (人類化 VL : L2 : C91S)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 25 (10B3 嵌合體 VH)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYNGVSNYN
QRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTV
SS SEQ ID NO: 26 (10B3嵌合體重鏈）
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGVFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYNGVSNYN
QRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST •142- 156287.doc 201210612
YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN
QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 27 (10B3嵌合體輕鏈）
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRF
SGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQCDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQL
KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 28 (人類化重鏈：HO)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN ·* . .
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTL
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 29 (人類化重鏈：HI)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTL
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 3 0 (人類化重鏈：H2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHVWRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTL
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV7VSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 31 (人類化輕鏈：L0) -143 156287.doc 201210612
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK
SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 32 (人類化輕鏈：LI)
DIQMTQSPSSLSASVRDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK
SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 33 (人類化輕鏈：L2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGQGTKLEIKRTVMPSVFIFPPSDEQL
KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKWACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO·· 34 (人類化輕鏈：L3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQCDEFPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK
SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
KHKWACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 35 (10B3 嵌合體 N54D 重鏈）
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYDGVSNYN
QRFKAKATLTVDKSSSTAYM ELRS LTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSW7VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN
QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 36 (10B3嵌合體N54Q重鏈）
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGNILDWIGNIYPYQGVSNYN
QRFKAKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGTGTLVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN
QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK -144- 156287.doc 201210612 SEQ ID NO: 37 (10B3 嵌合體 C91S 輕鏈）
DIKMTQSPSSMYASLRERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRF
SGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQSDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQL
KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 38 (人類化重鏈：H2 N54D)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYDGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH 丁 FPAVL·
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 3 9 (人類化重鏈：H2 N54Q)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYQGVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYFDVWGQGTL
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL (^ΟΙ^Ι^νντνΡΒβείΘΤΟΤΥΙΟΝνΝΗΚΡΒΝΤΚνΟΚΚνΕΡΚΒΟΟΚΤΗΊΌΡΡΟΡΑΡΕϋ^
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLN0KEYKCKVSNKALPAP 旧 KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYmPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 40 (人類化輕鏈：L2 C91S)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK
SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 41 (10B3嵌合體重鏈，DNA序列）
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGA
GGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATAT
CCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTAC7TCATGCACTGGGTGAAGCAGAGC
CATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACAATGGTGTTTCTAACTACA
ACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGAeTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTAC
ATGGAGCTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATOCTGTGCAAGACGCTAT
TACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGT
GACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAG -145- 156287.doc 201210612
CAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCC
GAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCA
GCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC
CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCC
TGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTA
AGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG
CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAT
GCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGC
TGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
MGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCMGGCCAAGGGCCAGCCCAGAG
AGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC
CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
MCGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCA
GCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGT
GTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGA
GCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 42 (10B3嵌合體輕鏈，DNA序列）
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGA
CATCAAGATCBACCCAGTC丁CCATCTTCCATGTATGCATCTCTACGAGAGAGAGTCACTAT
CACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTMGCTGGTTCCAGCAGAAACCAG
GGAAATCTCCTAAGACCCTAATCTATCGTGCAMCAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAA
GGTTCAG 丁 GGCAGTGGATC 丁 GGCBCAAGAUATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTAT
GAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTGTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGGTGCT
GGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCC
CCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTT
CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAA
CAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGC
ACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGA
CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA SEQ ID NO: 43 (人類化重鏈：HO，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCC
AGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAG
TGAGCTGCMGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCA
GGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGC
AACTACAACCAGAGGTTCMGGGCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCAC
CGCCTACATG
GMCTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACT ahacggcaccggacccgccgattggtacttcgacgtgtggggacaggggacactagt -146- 156287.doc 201210612
GACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAG
CAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCC
GAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCeTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTG
GGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACM
GAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCC
GAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGA
TGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCC
TGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTG
GCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATC
GAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGC
CCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGMGGG
CTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCA
CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGA
CAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG
CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 44 (人類化重鏈：HI，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCC
AGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAG
TGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCA
GGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGC
AACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCAC
CGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACT
ATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGAACGGGGACACTAGT
GACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAG
CAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCC
GAACCGGTGACCGTGTCCTGGMCAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTG
GGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA
GAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCC
GAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGA
TGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCC
TGAGGTGAAG -147- 156287.doc 201210612
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTG
GCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATC
GAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGC
CCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGG
CTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCA
CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGA
CAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG
CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 45 (人類化重鏈：H2，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCC
AGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAG
TGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCA
GGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGC
AACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCAC
CGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACT
ATTACGGCACCGGACCCGCCGAnGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGT
GACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAG
CAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCC
GAACCGGTGACCGTGTCCTGGMCAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTG
GGCACCCAGACCTACATCTGTMCGTGMCCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA
GAAGGTGGAGCCCMGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCC
GAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGA
TGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCC
TGAGGTGMG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTG
GCTGMCGGCMGGAGTACAAGTGTMGGTGTCCMCMGGCCC 丁 GCCTGCCCCTATC
GAGAAAACCATCAGCMGGCCMGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGC
CCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGG
CTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCA
CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGA
CMGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG
CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 46 (人類化輕鏈：L0，DNA序列） -148- 156287.doc 201210612
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCG
ACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGAC
CATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGC
CCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGAJCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCC
TAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGC
AGCCCGAG
GACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACC7TCGGCCAGG
GCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGnCATGTTCCCCCC
CAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTC
TACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACA
GCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCAC
CCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCC
TGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA SEQ ID NO: 47 (人類化輕鏈：LI，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCG
ACATTCAGATGAeCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGCGCGATAGGGTGAC
CATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGC
CCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCC
TAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGC
AGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTC
GGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCT
TCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAA
CAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGC
GGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGA
GCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCC
TGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA SEQ ID NO: 48 (人類化輕鏈：L2，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCG
ACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGAC
CATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGC
CCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCC
TAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTG
CAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTT
CGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC
TTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGA
ACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAG
CGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTG
AGCAGCACCCTGACCCTG -149- 156287.doc 201210612
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCC
TGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA SEQ ID NO: 49 (人類化輕鏈：L3，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCG
ACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGAC
CATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGC
CCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCC
TAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGC
AGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTGCGACGAGTTCCCCCTGACCTTC
GGCGCGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCT
TCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAA
CAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGC
GGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGA
GCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCC
TGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA SEQ ID NO: 50 (10B3嵌合體N54D重鏈，DNA序列）
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGA
GGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATAT
CCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGC
CATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACGATGGTGTTTCTMCTACA
ACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTAC
ATGGAGCTCCGCAGCCTTACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCTAT
TACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGT
GACCGTGTCCAGCGCCAGCACCMGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAG
CAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGMGGACTACTTCCCC
GAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCA
GCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC
CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCC
TGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCMGCCTA
AGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG
CCACGAGGACCCTGAGGTGMGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAT
GCCMGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGC
TGACCG 丁 GCTGCACCAGGAUGGCTGAACGGCAAGGAGTACMGTGTAAGGTG 丁 CCAAC
AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAG
AGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC
CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCA -150- 156287.doc 201210612
GCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGT
GTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGA
GCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 51 (10B3嵌合體N54Q重鏈，DNA序列）
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGA
GGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATAT
CCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTTCATGCACTGGGTGAAGCAGAGC
CATGGCAATATCCTCGATTGGATTGGAAATATTTATCCTTACCAAGGTGTTTCTAACTACA
ACCAGAGATTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGTACAGCCTAC
ATGGAGCTCCGCAGCCHACATCTGAGGACTCTGCAGTCTAHACTGTGCAAGACGCTAT
TACTACGGTACCGGACCGGCTGATTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACTGGGACACTAGT
GACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAG
CAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCC
GAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCA
GCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC
CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCC
TGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTA
AGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAG
CCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAAT
GCCMGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGC tgaccgtgctgcAccaggattggctgaacggcaaggagtacmgtgtaaggtgtccaac
AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAG
AGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTC
CCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCA
GCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCMCGT
GTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGA
GCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 52 (10B3嵌合體 C91S輕鏈，DNA序列）
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGA
CATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTACGAGAGAGAGTCACTAT
CACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAG
GGAAATCTCCTAAGACCCTAATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAA
GGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTAT
GAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTCTGATGAATTTCCGCTCACGTTCGGTGCT
GGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCC
CCAGCGATGAGCAGCTGMGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTT
CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAA
CAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGC -151 - 156287.doc 201210612
ACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGA
CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA SEQ ID NO: 53 (人類化重鏈：H2 N54D，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCC
AGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAG
TGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCA
GGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACGACGGCGTCAGC
AACTACAACCAGAGGnCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCAC
CGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACT
ATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGT
GACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAG
CAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCC
GAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTG
GGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA
GAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCC
GAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGA
TGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCC
TGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCMGACCAAGCCCAGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTG
GCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATC
GAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGC
CCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGG
CTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCA
CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGA
CAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG
CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 54 (人類化重鏈：H2 N54Q，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCC
AGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAG
TGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCA
GGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACCAGGGCGTCAGC
AACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCACCGACACCTCTACCAGCAC
CGCCTACATG
GAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGTACT
ATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACnCGACGTGTGGGGACAGGGGACACTAGT -152- 156287.doc 201210612
GACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAG
CAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCC
GAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC
CCGCCGTGCTG
CAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTG
GGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA
GAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACMGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCC
GAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTMGGACACCCTGA
TGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCC
TGAGGTGAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCMGCCCAGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTG
GCTGAACGGCMGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATC
GAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGC
CCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGG
CTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACMCTACAAGACCA
CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGA
CAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG
CACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGA SEQ ID NO: 55 (人類化輕鏈：L2 C91S，DNA序列）
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCG
ACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGAC
CATCACCTGCMGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGC
CCGGCAAGGCTCCCAAGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGCC
TAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCTG
CAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACCTT
CGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC
TTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGA
ACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAG
CGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTG
AGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTG
AGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTG
CTGA SEQ ID NO: 56 (人工肌肉抑制素線性肽1)
DFGLDCDEHSTESRGSG SEQ ID NO: 57 (人工肌肉抑制素線性肽3)
SGSGDCDEHSTESRCCRY -153- 156287.doc 201210612 SEQ ID NO: 5 8 (人工肌肉抑制素線性肽5)
SGSGHSTESRCCRYPLTV
SEQ ID NO: 59 (人工肌肉抑制素線性肽7) SGSGSRCCRYPLTVDFEA
SEQ ID NO: 60 (人工肌肉抑制素線性肽9) SGSGRYPLTVDFEAFGWD
SEQ ID NO: 61 (人工肌肉抑制素線性肽11) SGSGTVDFEAFGWDWIIA
SEQ ID NO: 62 (人工肌肉抑制素線性肽13) SGSGEAFGWDWIIAPKRY
SEQ ID NO: 63 (人工肌肉抑制素線性肽15) SGSGWDWIIAPKRYKANY
SEQ ID NO: 64 (人工肌肉抑制素線性肽17) SGSGIAPKRYKANYCSGE SEQ ID NO: 65 (人工肌肉抑制素線性肽19)
SGSGRYKANYCSGECEFV SEQ ID NO: 66 (人工肌肉抑制素線性肽21)
SGSGNYCSGECEFVFLQK SEQ ID NO: 67 (人工肌肉抑制素線性肽23)
SGSGGECEFVFLQKYPHT SEQ ID NO: 68 (人工肌肉抑制素線性肽25)
SGSGFVFLQKYPHTHLVH SEQ ID NO: 69 (人工肌肉抑制素線性肽27)
SGSGQKYPHTHLVHQANP -154- 156287.doc 201210612 SEQ ID NO: 70 (人工肌肉抑制素線性肽29)
SGSGHTHLVHQANPRGSA
SEQ ID NO: 71 (人工肌肉抑制素線性肽31) SGSGVHQANPRGSAGPCC SEQ ID NO: 72 (人工肌肉抑制素線性肽33)
SGSGNPRGSAGPCCTPTK
SEQ ID NO: 73 (人工肌肉抑制素線性肽35) SGSGSAGPCCTPTKMSPI SEQ ID NO: 74 (人工肌肉抑制素線性肽37)
SGSGCCTPTKMSPINMLY SEQ ID NO: 75 (人工肌肉抑制素線性肽39)
SGSGTKMSPINMLYFNGK
SEQ ID NO: 76 (人工肌肉抑制素線性肽41) SGSGPINMLYFNGKEQII
SEQ ID NO: 77 (人工肌肉抑制素線性肽43) SGSGLYFNGKEQIIYGKI
SEQ ID NO: 78 (人工肌肉抑制素線性肽45) SGSGGKEQIIYGKIPAMV
SEQ ID NO: 79 (人工肌肉抑制素線性肽47) SGSGIIYGKIPAMWDRC SEQ ID NO: 80 (人工肌肉抑制素線性肽49)
SGSGGKIPAMWDRCGCS
SEQ ID NO: 81 (人工肌肉抑制素線性肽） CCTPTKMSPINMLY -155- 156287.doc 201210612 SEQ ID NO: 82 (CDRH3 變異體 Y96L)
RLYYGTGPADWYFDV SEQ ID NO: 83 (CDRH3 變異體 G99D)
RYYYDTGPADWYFDV SEQ ID NO: 84 (CDRH3 變異體 G99S)
RYYYSTGPADWYFDV SEQ ID NO: 85 (CDRH3變異體G100A_K)
RYYYGTKPADWYFDV SEQ ID NO: 86 (CDRH3 變異體 P100B_F)
RYYYGTGFADWYFDV SEQ ID NO: 87 (CDRH3 變異體 P100B_I)
RYYYGTGIADWYFDV SEQ ID NO: 88 (CDRH3 變異體 W100E_F)
RYVYGTGPADFYFDV SEQ ID NO: 89 (CDRH3 變異體 F100G_N)
RYYYGTGPADWYNDV SEQ ID NO: 90 (CDRH3變異體F100G_Y)
RYYYGTGPADWYYDV SEQ ID NO: 91 (CDRH3變異體 V102N)
RYYYGTGPADWYFDN SEQ ID NO: 92 (CDRH3變異體 V102S)
RYYYGTGPADWYFDS SEQ ID NO: 93 (CDRH2變異體 G55D)
NIYPYNDVSNYNQRFKA 156287.doc -156- 201210612 SEQ ID NO: 94 (CDRH2變異體G55L)
NIYPYNLVSNYNQRFKA SEQ ID NO: 95 (CDRH2變異體G$5S)
NIYPYNSVSNYNQRFKA SEQ ID NO: 96 (CDRH2 變異體 G55T)
NIYPYNTVSNYNQRFKA SEQ ID NO: 97 (CDRH2變異體 G55V)
NIYPYNWSNYNQRFKA SEQ ID NO: 98 (人類化重鏈：H2_F100G_Y Fc失能）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN
YNQRFKARVTMHDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTL
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH 丁 FPAVL
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAG
APSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 99 (人類化重鏈：H2_G55S-F100G_Y Fc失能）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSN
YNQRFKARVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTL
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAG
APSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTiSKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTrPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 100 (VL之人類接受體框架）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKF
SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPXXXXXXXXXXFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 101 (HexaHisGBlTev/(D76A)小鼠肌肉抑制素 聚合蛋白質） 157- 156287.doc 201210612
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAWGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQ
YANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQEGSEREENVEKEGLCNACAWRQNTRYS
RIEAIKJQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPF5APPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTE
TIITMPTESDFLMQADGKPKCCFFKFSSKIQYNKWKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPM
KDGTRYTGIRSLKLDMSPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPG
PGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRY * N \
KANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPA
MWDRCGCS SEQ ID NO: 102 (GB1標籤）
DTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEVmDDATKTFTVTE SEQ ID NO: 103 (小鼠肌肉抑制素聚合蛋白質（D76A))
EGSEREENVEKEGLCNACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPRAPPLR
ELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQADGKPKCCFFKFSSKIQYNKV
VKAQLWIYLRPVKTPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMSPGTGIWQSIDVKTVLQN
WLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHS
TESRCCRYPL7VDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAG
PCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMWDRCGCS SEQ ID NO: 104 (成熟肌肉抑制素）
DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWilAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLV
HQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMWDRCGCS SEQ ID NO: 105 (弗林蛋白酶表現構築體）
MELRPWLLWWAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIF
GDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQ
QWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIWSILDDGIEKNHPDLAGNVDPGASFDVNDQDP
DPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAVNARIGGVRMLDGEVTDAVEARS
LGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGRE
HDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCT
ESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLWQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSH
SYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLE
HAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSG
EWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACENLYFQG SEQ ID NO: 106 (HexaHisGBITev/人類肌肉抑制素前肽）
MAAGTAVGAWVLVLSLWGAWGTHHHHHHDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQ
YANDNGVDGEmYDDATKTFTVTEGSENLYFQENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSR
IEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETII
TMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKWKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKD -158- 156287.doc 201210612
GTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTYLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPG
EDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR
SEQ ID NO: 107 (Tev蛋白酶表現構築體） MHGHHHHHHGESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGT LLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQT KSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQC
GSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWG
GHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNE SEQ ID NO: 108 (人類肌肉抑制素前肽）
ENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLR
ELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKV
VKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQN
WLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRR SEQ ID NO: 109 (CDRL3變異體C91S)
LQSDEFPLT SEQ ID NO: 110 (CDRH2變異體F100G_S)
RYYYGTGPADWYSDV SEQ ID NO: 111 (BMP-1 表現構築體）
MPGVARLPLLLGLLLLPRPGRPLDLADYTYDLAEEDDSEPLNYKDPCKAAAFLGDIALDEEDL
RAFQVQQAVDLRRHTARKSSIKAAVPGNTSTPSCQSTNGQPQRGACGRWRGRSRSRRAA
TSRPERVWPDGVIPFVIGGNFTGSQRAVFRQAMRHWEKHTCVTFLERTDEDSYIVFTYRPC
GCCSWGRRGGGPQAISIGKNCDKFGIWHELGHWGFWHEHTRPDRDRHVSIVRENIQPG
QEYNFLKMEPQEVESLGETYDFDSIMHYARNTFSRGIFLDTIVPKYEVNGVKPPIGQRTRLSK
GDIAQARKLYKCPACGETLQDSTGNFSSPEYPNGYSAHMHCVWRISVTPGEKIILNFTSLDLY
RSRLCWYDYVEVRDGFWRKAPLRGRFCGSKLPEPIVSTDSRLWVEFRSSSNWVGKGFFAV
YEAICGGDVKKDYGHIQSPNYPDDYRPSKVCIWRIQVSEGFHVGLTFQSFEIERHDSCAYDY
LEVRDGHSESSTLIGRYCGYEKPDDIKSTSSRLWLKFVSDGSINKAGFAVNFFKEVDECSRP
NRGGCEQRCLNTLGSYKCSCDPQYELAPDKRRCEAACGGFLTKLNGSITSPGWPKEYPPN
KNCIWQLVAPTQYRISLQFDFFETEGNDVCKYDFVEVRSGLTADSKLHGKFCGSEKPEVITS
QYNNMRVEFKSDN7VSKKGFKAHFFSEKRPALQPPRGRPHQLKFRVQKRNRTPQENLYFQ
GWSHPQFEKGTDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATK
TFTVTE SEQ ID NO: 112 (人類化VH : H3)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNY nqrfkaratutdtststaymelrslrsddtavyycarryyygtgpAdwyydvwgqgtlv
TVSS -159- 156287.doc 201210612 SEQ ID NO: 113 (人類化 VH : H4)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN
YNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTL
VTVSS SEQ ID NO: 114 (人類化VH : H5)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNY
NQRFKARATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLV
TVSS SEQ ID NO: 115 (人類化VH : H6)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNY
NQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLV
TVSS SEQ ID NO: 116 (人類化 VL : L4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 117 (人類化 VL : L5)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 118 (人類化VL : L6)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 119 (人類化 VH : H7)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSN
YNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTL
VTVSS SEQ ID NO: 120 (人類化VH : H8)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIVPYNSVSNY
NQRFKARATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLV
TVSS SEQ ID NO: 121 (人類化 VH : H9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNY
NQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLV
TVSS -160- 156287.doc 201210612 SEQ ID NO: 122 (人類化 HC : H7 Fc失能，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA
GTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGC
AGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAG
CAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCGTGGACAAGTCTACCAGCA
CCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC
CAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAG
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGG
CCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG
ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGT
GCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTG
ACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGC
CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACAC
CTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCGCC
CCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGG
TGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG
GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTA
AGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAG
AACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG
AGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGA
CAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAG
CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCA
GAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 123 (人類化 HC : H7 Fc 失能）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSN
YNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTL
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAG
APSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 124 (人類化 HC : H8 Fc 失能，DNA序列） CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA GTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGC AGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAG CAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGC -161 - 156287.doc 201210612
ACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCG
CCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACA
GGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG
GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAG
GACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG
TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACMGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA
CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCC
CCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTG
GTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG
AGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGT
GGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGT
AAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGG
GCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAA
GAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTG
GAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACMGACCACCCCCCCTGTGCTGG
ACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCA
GCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC
CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 125 (人類化 HC : H8 Fc 失能）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNY
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NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 126 (人類化 HC : H9 Fc失能，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA
ATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCA
GGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAGC
AACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGCAC
CGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGtACTACTGCGCC
AGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGG
GGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGC
CCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGA
CTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTG
CACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGA -162- 156287.doc 201210612
CCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCC
CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACC
TGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGGCCGGAGCCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCC
CCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGT
GGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG
GTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGG
TGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGAHGGCTGAACGGCMGGAGTACMGTGTM
GGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGC
CAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGA
ACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA
GTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGAC
AGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGC
AGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACMTCACTACACCCAG
AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 127 (人類化 HC : H9 Fc 失能）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNY
NQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLV
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VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 128 (人類化 HC : H3，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA
GTGAGCTGCMGGCCAGGGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGC
AGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAG
CAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGCCACCCTGACCACCGACACCTCTACCAGCA
CCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC
CAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAG
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGG
CCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG
ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGT
GCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTG
ACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGC
CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACAC
CTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCC
CCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGG
TGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG -163- 156287.doc 201210612
GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTA
AGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAG
AACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG
AGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGA
CAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAG
CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCA
GAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 129 (人類化 HC : H4，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA
GTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGC
AGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAG
CAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCGTGGACAAGTCTACCAGCA
CCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC
CAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAG
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGG
CCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG
ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGT
GCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTG
ACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGC
CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACAC
CTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCC
CCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGG
TGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG
GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTA
AGGTGTCCMCAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAG
AACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG
AGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGA
CAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAG
CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCA
GAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 130 (人類化 HC : H5，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA
GTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGC
AGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAG
CAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGC
ACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCG -164- 156287.doc 201210612
CCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACA
GGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG
GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAG
GACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG
TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTMCGTGAACCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA
CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCC
CCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTG
GTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG
AGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGT
GGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGT
AAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGG
GCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAA
GAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTG
GAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGG
ACAGCGATGGCAGCHCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCA
GCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC
CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQIDNO:131(人類化HC:H6，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA ATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCA GGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACGGCGTCAGC AACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAAGGCCACCCTGACCGTGGACMGTCTACCAGCAC CGCCTACATGGMCTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCC AGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGG GGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGC CCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGMGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGA . CCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCC
CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACC TGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCC CCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGT GGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGG TGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAA GGTGTCCAACMGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGC CAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGA ACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA -165- 156287.doc 201210612
GTGGGAGAGCMCGGCCAGCCCGAGMCAACTACAAGACCACCCCCCCTQTGCTGGAC
AGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGC
AGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG
AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 132 (人類化 LC : L4，DNA序列）
GACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGA
CCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAG
CCCGGCAAGGCTCCCMGAGCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGC
CTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCCAGGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCT
GCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACC
TTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCA
TCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCT
GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAG
AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC
CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCT
GTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA
GTGC SEQ ID NO: 133(人類化 LC : L5，DNA序列）
GACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGA
CCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAG
CCCGGCAAGGCTCCCAAGACCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGC
CTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCT
GCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACC
TTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCA
TCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCT
GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACMTGCCCTGCAG
AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC
CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCT
GTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA
GTGC SEQ ID NO: 134 (人類化 LC : L6，DNA序列）
GACATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATAGGGTGA
CCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAGCTACCTGAGCTGGTTCCAGCAGAAG
CCCGGCAAGGCTCCCAAGACCCTGATCTACAGGGCCAACAGGCTCGTGGACGGCGTGC
CTAGCAAGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGCCAGGACTACACCCTGACCATCAGCTCCCT
GCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCGACGAGTTCCCCCTGACC
TTCGGCCAGGGCACCAAACTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCA
TCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCT
GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAG -166- 156287.doc 201210612
AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC
CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCT
GTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGA
GTGC SEQ ID NO: 135 (人類化 HC : H7，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA
GTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGC
AGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAG
CAACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAGGGTGACCATGACCGTGGACAAGTCTACCAGCA
CCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGC
CAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAG
GGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGG
CCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG
ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGT
GCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTG
ACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGC
CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACAC
CTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCC
CCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGG
TGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTG
GTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTA
AGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGG
CCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAG
AACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG
AGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGA
CAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAG
CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCA
GAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCMG SEQ ID NO: 136 (人類化 HC : H8，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA
GTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGC
AGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAG
CAACTACAACCAGAGGTTCMGGCCAGGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGC
ACCGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCG
CCAGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACA
GGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTG
GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGMG
GACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG
TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGT -167- 156287.doc 201210612
GACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA
CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCC
CCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTG
GTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG
AGGTGCACAATGCCMGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGT
GGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGMCGGCAAGGAGTACAAGTGT
MGGTGTCCAACMGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGG
GCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAA
GAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTG
GAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGG
ACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCA
GCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC
CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 137 (人類化 HC : H9，DNA序列）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAA
ATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTACTTCATGCACTGGGTGAGGCA
GGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCTACAACAGCGTCAGC
AACTACAACCAGAGGTTCAAGGCCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGTCTACCAGCAC
CGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCC
AGGAGGTACTATTACGGCACCGGACCCGCCGATTGGTACTATGACGTGTGGGGACAGG
GGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGC
CCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGA
CTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACGAGCGGCGTG
CACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGA
CCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCC
CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACC
TGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCC
CCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGT
GGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCMCTGGTACGTGGACGGCGTGGAG
GTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGG
TGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTM
GGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAMCCATCAGCAAGGCCAAGGGC
CAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGA
ACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGA
GTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGAC
AGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGC
AGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAG
AAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG SEQ ID NO: 138 (人類化重鏈：H3) •】68· 156287.doc 201210612
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NQRFKARATm'DTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLV
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NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 139 (人類化重鏈：H4)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNGVSN
YNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTL
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QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 140 (人類化重鏈：H5)
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SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 141 (人類化重鏈：H6)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNGVSNY
NQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLV
TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 142 (人類化重鏈：H7) -169- 156287.doc 201210612
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGNIYPYNSVSN
YNQRFKARVTMTVDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTL ντνεβΑετκορενρρίΑΡββκβτββοτΜί^οΛ/ιωγρρερντ^ννΝβοΑυ'εΘνΗττΡΑνί·
QSSGLYSLSSWrVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 143 (人類化重鏈：H8)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNY
NQRFKARATLTVDKSTSTAYMELRSLRSDbTAVYYCARRYYYGTGPADWYYDVWGQGTLV
TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHVTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 144 (人類化重鏈：H9)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVRQAPGQGLEWIGNIYPYNSVSNY NQRFKAKATLTVDKSTSTAYMELRSl^RSDDTAVYYCARRYYYG 丁 GPADWYYDVWGQGTLV ΤνεεΑεΤΚΟΡΒνΡΡίΑΡεβΚβΤβσΟΤΜΙΟΟΛ/ΚΟΥΡΡΕΡντνεννΝβΟΑΙΤεονΗ 丁 FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 145 (人類化輕鏈：L4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL
KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 146 (人類化輕鏈：L5)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK
SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE
KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 147 (人類化輕鏈：L6) -170- 156287.doc 201210612
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSKF
SGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSDEFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL
KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 【圖式簡單說明】 圖1展示經純化成熟肌肉抑制素之LC/MS分析：預測分 子量（MW)為 12406.25 Da，實測MW 為 24793.98 Da，此指 示具有9對二硫鍵之二聚分子，與具有9個半胱胺酸殘基之 預測肌肉抑制素單體相匹配。 圖2展示使用MOPS緩衝液之4-12% NuPAGE Bis_Tris凝 膠。泳道1 :經DTT還原之成熟肌肉抑制素。泳道2 :未經 DTT還原之成熟肌肉抑制素。泳道3 :標記12蛋白質標準 物。 圖3A展示劑量反應曲線，其顯示肌肉抑制素（R&D Systems及内部肌肉抑制素物質）在A204細胞中以劑量依賴 性方式誘導細胞信號傳導之活化，從而在6小時後引起螢 光素酶表現。圖3B展示劑量反應曲線，其顯示如在不同曰 期所獲得之資料所表示，在不同測試時刻，内部肌肉抑制 素在A204細胞中以劑量依賴性方式誘導細胞信號傳導之活 化，從而引起螢光素酶表現》 圖4展示藉由ELISA所測定的10B3與成熟肌肉抑制素、 潛伏複合物及自潛伏複合物釋放之成熟肌肉抑制素的結 合。 圖5展示10B3及10B3嵌合體對肌肉抑制素與ActRIIb之結 合的抑制。 圖6展示10B3及10B3嵌合體抑制肌肉抑制素誘導的細胞 156287.doc •171- 201210612 信號傳導之活化，從而降低A204細胞中之螢光素酶表現。 圖7展示小鼠中10B3對體重（A)及痩質量（B)之活體内影 響。 圖8展示在小鼠之腓腸肌（A)、四頭肌（B)及伸趾長肌 (EDL)(C)中10B3對肌肉質量之活體内影響。 圖9展示在EDL中10B3對肌肉收縮性之離體影響，展示 強直力（A)及根據肌肉質量校正之強直力（B)。 圖10展示在肌肉抑制素捕捉ELISA中，11種經親和純化 之 CDRH3 變異體；以及 H2L2-C91S、H0L0、HcLc(10B3 欲 合體）及陰性對照單株抗體之結合活性。 圖11展示在肌肉抑制素結合ELISA中，5種經親和純化 之CDRH2變異體；以及用作對照抗體之H2L2-C91S_ F100G_Y、H2L2-C91S、HcLc(10B3 嵌合體）及陰性對照單 株抗體之結合活性。 圖12展示第0天至第25天10B3及對照抗體處理對具有C-26腫瘤之小鼠之體重的影響。 圖13展示10B3及對照抗體處理對具有C-26腫瘤之小鼠之 總體脂肪（A)、附睾脂肪墊（B)及瘦質量（C)的影響。 圖14展示10B3及對照抗體處理對下肢肌力之影響，其由 在對具有C-26腫瘤之小鼠之大腿中部的坐骨神經進行電刺 激時的收縮力量測。 圖15展示在假手術及腱切除術手術中，10B3及對照抗體 處理對小鼠脛骨前肌（TA)之影響。 圖16展示第0天至第42天類固醇誘導之處理程序期間的 156287.doc -172- 201210612 體重變化。第29天開始對經10B3或對照抗體預先處理之小 鼠進行地塞米松（Dexamethasone)處理。 圖17展示在小鼠中10B3或對照抗體預先處理對地塞米松 誘導之體脂肪積累之影響。 圖18展示在經對照抗體處理之組中之小鼠中坐骨神經擠 壓對肌肉質量之影響（mIgG2a+假手術；及mIgG2a+坐骨神 經（SN)擠壓）。 圖19展示在假手術腿（A)及坐骨神經擠壓腿（B)中10B3及 對照抗體處理對骨骼肌質量之影響。 圖20展示可變重鏈HO (SEQ ID NOM2)之Kabat編號。 圖21展示可變輕鏈L0 (SEQ ID NO: 15)之Kabat編號。 圖22展示H8L5與一組生長因子之結合以確定與肌肉抑 制素結合之特異性之圖示。 圖23使用報導基因檢定比較A204細胞之肌肉抑制素與活 化素B(ActivinB)刺激之中和。 圖24展示利用15%人類血清（A)及25%人類血清（B)獲得 之 CH50 Eq EIA結果。 圖25藉由MRI測得的相對於基線之總下肢體積變化百分 比。第1組以30 mg/kg IgG2a同型對照處理，第2組以3 mg/kg 10B3處理且第3組以30 mg/kg 10B3處理（根據先前描 述之時程藉由腹膜内注射投與）。箭頭指示劑量投與。符 號表示以下比較之統計顯著性（P<0.05):第1組對比第3 組，第1組對比第2組，及第2組對比第3組。 圖26顯示（A)處理對附睾脂肪墊質量之影響。誤差條表 156287.doc -173- 201210612 示SEM。（*)指示與對照之顯著差異（Ρ<0·05)。（B)不同劑量 之hlgGl對照、10B3.C5及H8L5對腓腸肌質量之影響，在 研究終止時稱重，及（C)所測試之組的平均峰值力產生之 圖示。 圖27以0.1、1.0及10 mg/kg之目標劑量腹膜内投與後 H8L5在SCID小鼠中之血清當量濃度。 圖28圖A-D分別表示10B3、H8L5、H8L5失能及AMG745 與IgGl對照之顯著（P<0.05)差異。 圖29在研究（A)脛骨前肌（B)四頭肌（C)伸趾長肌及（D)腓 腸肌肌肉質量之第0、3、7、14及21天藉由腹膜内注射投 與SCID小鼠之不同劑量之BPC1036及BPC1049在第28天處 死時的作用。 156287.doc -174-

Claims (1)

  1. 201210612 七、申請專利範圍： 1. 一種人類化抗原結合蛋白，其特異性結合肌肉抑制素 (My 〇 statin)且在溶液相親和力檢定中具有強於150 pM之 親和力，且其中該抗原結合蛋白具有至少100小時之 pK。 2. 如請求項1之人類化抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋 白包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 90之CDRH3 ;或該CDRH3之變異體；其中該抗原結合蛋 白進一步包含絲胺酸殘基在Kabat 28位；及以下殘基之 至少一者，或组合，或全部：Kabat 66位之離胺酸殘 基；Kabat 67位之丙胺酸殘基；Kabat 71位之纈胺酸殘 基；及Kabat 73位之離胺酸殘基。 3. 如請求項2之人類化抗原結合蛋白，其進一步包含SEQ ID NO: 2之CDRH2 ;或該CDRH2之變異體。 4. 如請求項2或3之人類化抗原結合蛋白，其進一步包含 CDRH1 (SEQ ID NO: 1)或該 CDRH1之變異體。 5. 如請求項1之人類化抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋 白包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含以下CDR序 列之一者、兩者或三者： (a) SEQ ID NO: 4 之 CDRL1 或該 CDRL1之變異體； (b) SEQ ID NO: 5之CDRL2或該CDRL2之變異體；及 (c) SEQ ID NO: 109 之 CDRL3 或該 CDRL3之變異體； 其中該抗原結合蛋白進一步包含Kabat 71位之酪胺酸 殘基；及以下殘基之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇 156287.doc - 1 · 201210612 胺酸殘基；及Kabat 69位之麩醯胺酸殘基。 6. 如請求項1之人類化抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋 白包含： (a) 重鏈序列，其包含SEQ ID NO: 90之CDRH3 ;或該 CDRH3之變異體；其中該抗原結合蛋白進一步包含 Kabat 28位之絲胺酸殘基；及以下殘基之至少一者或組 合或全部：Kabat 66位之離胺酸殘基；Kabat 67位之丙胺 酸殘基；Kabat 71位之纈胺酸殘基；及Kabat 73位之離胺 酸殘基；及 視情況以下序列之一或兩者：SEQ ID NO: 2之CDRH2或 該CDRH2之變異體；及SEQ ID NO: 1之CDRH1或該 CDRH1之變異體；及 (b) 輕鏈序列，其包含以下CDR序列之一者、兩者或 三者：SEQ ID NO: 4之CDRL1或該CDRL1之變異體； SEQ ID NO: 5 之 CDRL2 或該 CDRL2 之變異體；及 SEQ ID NO: 109之CDRL3或該CDRL3之變異體； 其中該抗原結合蛋白進一步包含Kabat 71位之酪胺酸殘 基；及以下殘基之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇胺 酸殘基；及Kabat 69位之麩醯胺酸殘基。 7. 如請求項2、3及6中任一項之人類化抗原結合蛋白，其 中該變異型CDRH3 ⑴為SEQ ID NO: 3、82-89、91 或 92 之任一者；或（ii)含有任一以下Kabat取代：V102Y、 V102H、V102I、V102D 或 V102G。 8. 如請求項3之人類化抗原結合蛋白，其中該變異型CDR 156287.doc 201210612 H2 (i)為SEQ ID NO: 93-97或110之任一者；或（ii)含有任 一以下 Kabat 取代：N50R、N50E、N50W、N50Y、 N50G、N50Q、N50V、N50L、N50K、N50A、I51L、 I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、 Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、Y53T、Y53N ' N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、 V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、N58T、 N58S、N58D、N58R、N58G、N58F或 N58Y。 9.如請求項5或6之人類化抗原結合蛋白，其中該變異型 CDRL3⑴為SEQ ID NO: 6 ;或（ii)含有任一以下Kabat取 代：L89Q、L89S、L89G、L89F、Q90N、Q90H、 S91N、S91F、S91G、S91R、S91D、S91H、S91T、 S91Y ' S91V、 D92N ' D92Y、 D92W ' D92T 、 D92S 、 D92R、 D92Q > D92H、 D92A、 E93N、 E93G、E93H、 E93T、 E93S、 E93R、 E93A、 F94D、 F94Y 、 F94T 、 F94V、 F94L、 F94H、 F94N、 F94I、 F94W、F94P、 F94S、L96P、L96Y、L96R、L96I、L96W或 L96F。 10. 如請求項6之人類化抗原結合蛋白，其中CDRH3為SEQ ID NO: 90 ; CDRH2為 SEQ ID NO: 2或 95 ; CDRH1 為 SEQ ID NO: 1 ; CDRL1 為 SEQ ID NO: 4 ; CDRL2為 SEQ ID NO: 5 ;及CDRL3為 SEQ ID NO: 109。 11. 如請求項6或10之抗原結合蛋白，其進一步包含選自以 下之Kabat胺基酸殘基之任一者或組合： (a)以下任一者或組合：重鏈之2位之V、I或G ; 4位之 156287.doc 201210612 L或V ; 20位之L、I、Μ或V; 22位之C ; 24位之Τ、A、 V、G或S ; 26位之G ; 29位之I、F、L或S ; 36位之W; 47位之W或Y ; 48位之I、Μ、V或L ; 69位之I、L、F、M 或V ; 78位之A、L、V、Y或F ; 80位之L或M ; 90位之Y 或F ; 92位之C ;及94位之R、K ' G、S、H或N ;及/或 (b)以下任一者或組合：輕鏈之2位之I、L或V ; 3位之 V、Q、L或E ; 4位之Μ或L ; 23位之C ; 35位之W ; 36位 之Y、L或F; 46位之S、L、R或V; 49位之Y、H、F或 Κ ; 88位之C ;及98位之F。 12.如請求項1之人類化抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋 白包含： 選自 SEQ ID NO: 112、113、114、115、119、120 或 121之重鏈可變區；及/或選自SEQ ID NO: 116、117或 118之輕鏈可變區；或與該序列具有75%或75%以上序列 一致性之變異型重鏈或輕鏈可變區； 其中 CDRH3為 SEQ ID NO: 90 ; CDRH2為 SEQ ID NO: 2或 95 ; CDRH1 為 SEQ ID NO: 1 ; CDRL1 為 SEQ ID NO: 4 ; CDRL2 為 SEQ ID NO: 5 ;及 CDRL3 為 SEQ ID NO: 109 ;及 其中該重鏈可變區進一步包含Kabat 28位之絲胺酸殘 基；及以下殘基之至少一者或組合或全部：Kabat 66位 之離胺酸殘基；Kabat 67位之丙胺酸殘基；Kabat 71位之 纈胺酸殘基；及Kabat 73位之離胺酸殘基；及 其中該輕鍵可變區進一步包含Kabat 71位之赂胺酸殘 156287.doc -4- 201210612 基；及以下殘基之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇胺 酸殘基；及Kabat 69位之麩醮胺酸殘基。 13 ·如請求項1之人類化抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋 白包含： (a) SEQ ID NO: 112 之重鍵可變區及 SEQ ID NO: 116 之 輕鏈可變區； (b) SEQ ID NO: 112 之重鍵可變區及 SEQ ID NO: 117 之 輕鏈可變區； (c) SEQ ID NO: 112 之重鍵可變區及 SEQ ID NO: 118 之 輕鏈可變區； (d) SEQ ID NO: 113 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 116 之 輕鏈可變區； (e) SEQ ID NO: 113 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 117 之 輕鏈可變區； (f) SEQ ID NO: 113 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 118 之 輕鏈可變區； (g) SEQ ID NO: 114 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 116 之 輕鏈可變區； (h) SEQ ID NO: 114 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 117 之 輕鏈可變區； ⑴SEQ ID NO: 114之重鏈可變區及SEQ ID NO: 118之 輕鏈可變區； ⑴SEQ ID NO: 115之重鏈可變區及SEQ ID NO: 116之 輕鏈可變區； 156287.doc 201210612 (k) SEQ ID NO: 輕鏈可變區； (l) SEQ ID NO: 輕鍵可變區； (m) SEQ ID NO: 輕鏈可變區； (n) SEQ ID NO: 115之重鏈可變區及SEQ ID NO: 115之重鏈可變區及SEQ ID NO: 119之重鏈可變區及SEQ ID NO: 119之重鏈可變區及SEQ ID NO: 117之 118之 116之 117之 輕鍵可變區； (〇) SEQ ID NO: 119之重鏈可變區及SEQ ID NO: 118之 輕鍵可變區； (p) SEQ ID NO: 120之重鏈可變區及SEQ ID NO: 116之 輕鍵可變區； (q) SEQ ID NO: 120 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 117 之 輕鍵可變區； (r) SEQ ID NO: 120 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 118 之 輕鍵可變區； (s) SEQ ID NO: 121 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 116 之 輕鍵可變區； (t) SEQ ID NO: 121 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 117之 輕鍵可變區；或 (u) SEQ ID NO: 121 之重鏈可變區及 SEQ ID NO: 118 之 輕鍵可變區。 14_如請求項13之人類化抗原結合蛋白，其中該等可變重鍵 及輕鍵區與適合人類丨亙定區組合。 156287.doc 201210612 15·如請求項1之人類化抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋 白包含：選自 SEQ ID NO: 123、125、127或 138-144之重 鏈序列；及/或選自SEQ ID NO: 145、146、147之輕鏈序 列；或與該序列具有75%或75%以上序列一致性之變異 型重鏈或輕鏈序列， 其中 CDRH3為 SEQ ID NO: 90 ; CDRH2為 SEQ ID NO: 2或 95 ; CDRH1 為 SEQ ID NO: 1 ; CDRL1 為 SEQ ID NO: 4 ; CDRL2 為 SEQ ID NO·· 5 ;及 CDRL3 為 SEQ ID NO·· 109 ;及 其中該重鏈進一步包含Kabat 28位之絲胺酸殘基；及 以下殘基之至少一者或組合或全部：Kabat 66位之離胺 酸殘基；Kabat 67位之丙胺酸殘基；Kabat 71位之纈胺酸 殘基；及Kabat 73位之離胺酸殘基；及 其中該輕鏈進一步包含Kabat 71位之酪胺酸殘基；及 以下殘基之至少一者或兩者：Kabat 46位之蘇胺酸殘 基；及Kabat 69位之麩醯胺酸殘基。 16. 如請求項14或15之人類化抗原結合蛋白，其中該重鏈為 Fc失能。 17. —種核酸分子，其編碼如請求項1至16中任一項之人類 化抗原結合蛋白。 18. —種編碼特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋白 之核酸分子，其包含： SEQ ID NO: 122、124、126、128-131、135-137之重 鏈DNA序列；及/或選自SEQ ID NO: 132、133或134之輕 156287.doc 201210612 鏈DNA序列；或 變異型重鏈或輕鏈DNA序列，其編碼5£卩1〇]^0: 123、125、127或 138-144之重鏈序列；及/或 SEQ ID NO: 145、146或147之輕鍵序列。 19. 一種編碼特異性結合肌肉抑制素之人類化抗原結合蛋白 之核酸分子’其包含：SEQ ID NO: 122 ' 124或126之重 鍵DNA序列及/或選自SEQ ID NO: 132、133或134之輕鍵 DNA序列或編碼SEQ ID NO: 145、146或147之輕鏈序列 的變異型輕鏈DNA序列。 20. —種表現載體，其包含如請求項丨7至丨9中任一項之核酸 分子。 21 · —種重組宿主細胞，其包含如請求項2〇之表現載體。 22. —種產生如請求項1至16中任一項之抗原結合蛋白的方 法，該方法包含培養如請求項21之宿主細胞及回收該抗 原結合蛋白之步驟。 23. —種醫藥組合物，其包含如請求項1至16中任—項之抗 原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。 24. —種如請求項i至16中任—項之抗原結合蛋白或如請求 項23之組合物之用途，其係用於製造用以治療罹患I肉 質量、肌力及肌肉功能降低之任—者或組合之疾^之個 體的藥劑。 ' 25. —種如請求項丨至16中任—項之抗原結合蛋白或如靖求 項23之組合物之用途，其係用於製造用以治療罹串°乂 ’ 個體的藥劑：少肌症、惡病質、肌肉萎缩 156287.doc 201210612 wasting)、不用性肌肉萎縮症、Hiv、AIDS、癌症、外 科手術、灼傷 '肌肉骨骼或神經之創傷或損傷、肥胖 症、糖尿病（包括II型糖尿病）、關節炎、慢性腎衰竭 (CRF)、末期腎病（ESRD)、充血性心臟衰竭（CHF)、慢性 阻塞性肺病（COPD)、選擇性關節修復（elective joint repair)、多發性硬化症（Ms)、中風、肌肉萎縮症 (muscular dystrophy)、運動神經元神經病變、肌肉萎縮 性側索硬化（ALS)、帕金森氏病（Parkinson's disease)、骨 質疏鬆症、骨關節炎、脂肪酸肝病（fatty acid liver disease)、肝硬化、艾迪森氏病（Addison’s disease)、庫 欣氏症候群（Cushing’s syndrome)、急性呼吸奢迫症候 群、類固醇誘發之肌肉萎縮、肌炎或脊柱側彎。 26. 種如清求項1至16中任一項之抗原結合蛋白或如請求 項23之組合物之用途，其係用於製造用以增加肌肉質 量、增強肌力及/或改善肌肉功能之藥劑。 156287.doc
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