TW201204391A - IL-1ra-polymer conjugates - Google Patents

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201204391 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於本說明書中所述之蛋白質_聚合物共扼物。 本七月亦揭不一種製備蛋白質_聚合物共軛物及使用該共 扼物治療各種免疫病症之方法。 【先前技術】 <、·田月匕生物學及重組蛋白質技術之進步已引起蛋白質治療 劑之開發。然而，許多蛋白質治療劑（諸如r L _ i受體括抗劑 (IL- i ra))易於蛋白水解降冑，因此在循環系統中具有較短的 半衰期。其他缺點包括低生物活性。因此需要半衰期延長 且具有令人滿意的生物活性之有效蛋白質治療劑。 【發明内容】 本土月係基於發現聚合物_IL_lra*軛物在人類血液中具 有較長的半衰期（例如，超過丨2小時、48小時或小時）而可 同時保留蛋白質活性。 本务明之一態樣係關於一種共軛物，其包括（丨）化_丨ra部 分、（2)藉由硫醚鍵共價鍵結於該IL_lra部分之間隔基及（3) 共價鍵結於該間隔基之聚合物部分，該間隔基為含有卜2〇 個妷原子及1-10個雜原子之烴部分，且該聚合物部分具有 、力1 00千道爾頓（kD)之分子量（例如，25-90 kD及30-80 kD) 。该共桄物可具有〗個以上的聚合物部分（例如2_5個聚合物 部分）。 術6吾「間隔基」係指鍵結於聚合物部分及蛋白質部分之 夕知（例如一 f貝或二價）C〗_2〇煙基。間隔基的烴主鏈中可取代 150465.doc 201204391 或插入一或多個官能基。官能基之實例包括（但不限於）-〇-、-s-、羧酸酯、羰基、碳酸酯、醯胺、胺基曱酸酯、脲、 石黃st基、亞續醯基、胺基、亞胺基、經胺基、膦酸醋或碟 酸酉旨基。 術語「聚合物部分」係指由線性、分支或星形線性或分 支聚合物或共聚物衍生之單價基圑。該聚合物之實例為聚 氧化烯，諸如聚氧化乙烯、聚乙二醇、聚氧化異丙烯、聚 氧化伸丁烯及其共聚物。聚氧化烯部分可經取代或未經取 代。舉例而言，其可為曱氧基加蓋之聚乙二醇（mPEG)。諸 如葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺或以碳水化合物為主之 聚合物之其他聚合物亦可用以替換聚氧化烯，只要其不具 有抗原性、毒性或引發免疫反應。 術語「IL-lra」係指人類IL-lra及自其衍生且保留其生物 功能之突變體或變異體。人類IL-lra之序列（SEQ ID ΝΟ:1) 如下所示：

MRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLG

IHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGW

FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE 在一實施例中，該聚合物-蛋白質共I厄物具有如下所示之 式：

式⑴

其中X、Y及Z各獨立地為Ο、NH或經去除；S-IL-lra為IL-lra 蛋白質，其中之硫原子與式（I)中之丁二醯亞胺基環連接；P 150465.doc 201204391 為線性或分支聚合物部分；且r及q各獨立地為〇、1、2、3 、4 或 5 〇 爹看式（I) ’共軛物之子集可具有一或多個以下特徵· q 為2，r為3，X經去除且γ為〇4nh，X為〇或NH且Y經去除 ，Z經去除或為〇，且p具有5_4〇kD或2〇-60kD之莫耳質量。 一種共軛物之實例如下所示··

PEG Η

/fhlL-1ra 其中s亥PEG部分具有約30 kD或約40 kD之莫耳質量。於另 一實例中’該共軛物具有以下結構：

其中該PEG具有約40 kD之莫耳質量。

於適當的情況下，上述蛋白質-聚合物共軛物可呈游離形 式或鹽形式。例如可在陰離子與本發明蛋白質_聚合物共軛 物上帶正電之基團（例如胺基）之間形成 括氣離子.、料子、㈣子、錢根、_根、^^ 檸檬酸根、甲烷磺酸根、三I乙酸根及乙酸根。相同地， 亦可在陽離子與本發明蛋白質_聚合物共輛物上帶負電之 基團（例如緩酸根）之間形成鹽。合適的陽離子包括鈉離子、 鉀離子、鎂離子、鈣離子及銨陽離子(諸如四曱銨離子)。 本發明之另-態樣係關於-種治療免疫病症之方法。該 150465.doc 201204391 方法包括向有需要之個體投與有效量剛才提及之共軛物。 免疫病症之實例包括急性及慢性發炎、糖尿病（包括〗型及η 型糖尿病）、關節炎（包括類風濕性關節炎、幼年型類風濕性 關節炎、骨關節炎及牛皮癖性關節炎）、強直性脊椎炎、多 發性硬化、腦脊髓炎、重症肌無力、全身性紅斑狼瘡、自 體免疫曱狀腺炎、皮炎(包括異位性皮炎及濕疹性皮炎）、皮 肌尺、^發性肌炎、牛皮癖（例如斑塊狀牛皮癬）、修格蘭氏 症候群（Sj0gren，s Syndrome)、克隆氏病（Cr〇hn，s以“犯约、 口瘡性潰瘍、虹膜炎、結膜炎、角膜結膜炎、發炎性腸疾 病、潰瘍性結腸炎、哮喘、過敏性哮喘、皮膚性紅斑狼瘡 、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥物疹、麻風逆行反應（lepr〇sy reversal reaction)、麻風結節性紅斑、自體免疫葡萄膜炎、 過敏性腦脊髓炎、急性壞死出血性腦病、特發性雙耳進行 性感覺神經聽力喪失、再生不全性貧血、純紅血球貧血、 特發性血小板減少症、多軟骨炎、韋格納氏肉牙腫病 (Wegener's granui〇matosis)、慢性活動性肝炎、史蒂芬瓊 森症候群（Stevens-Johnson syndrome)、特發性脂肪湾 (idiopathic sprue)、扁平苔癖、葛瑞夫茲氏症（(^νΜ disease)、肉狀瘤病、原發性膽汁性肝硬化、後葡萄膜炎、 肺間質纖維化、移植物抗宿主病、移植病例（包括使用同種 異體組織或異種組織之移植，諸如骨髓移植、肝臟移植或 任何益g或組織之移植）、過敏症（諸如特異性過敏症）、 AIDS、T細胞贅瘤（諸如白血病或淋巴瘤）、急性肝炎、血管 生成相關疾病（諸如類風濕性關節炎及癌症)及心血管疾病。 J50465.doc 201204391 用於任何上述病症之含有該共軛物之組合物以及該治療 用途及該共軛物用於製造用以治療該等病症中之一者之藥 物的用途亦屬於本發明之範B壽内。 下文之描述係用於闡述本發明之一或多個實施例之詳細 内各本發明之其他特徵、標的及優點可自該描述及申請 專利範圍輕易推知。 【實施方式】 本發明之聚合物-蛋白質共軛物至少含有丨ra部分、聚 合物部分及間隔基部分。 IL-1 ra係作為IL-1天然抑制劑之人類蛋白質，其中1為 由巨嗤細胞/單核細胞系細胞產生之細胞因子。其藉由與 IL-1受體之結合，以阻止比^結合至相同的受體，來抑制由 IL-1所引起之生物活性。比“受體主要表現於發炎部位及淋 巴細胞。 可用於本文中所描述之共輕物的IL-ira包括人類 IL-lra(SEQ ID ΝΟ:1)及其功能等效物。IL_lra功能等效物為 IL-lra(SEQ ID ΝΟ:1)之多肽衍生物。其實質上具有虬·！^ 之活性’亦即例如會與IL-1受體結合且阻止il- 1結合至相同 的受體。IL-lra及其功能等效物含有至少一個介白素—丨受體 拮抗劑結構域’其係指能夠與IL_i受體家族成員特異性結 合，且阻止細胞受體對IL-1及其家族成員的活化作用之結 構域。IL-1受體家族含有若干受體成員。因此，亦有若干 不同IL-1家族促效劑及拮抗劑的存在。該等IL_丨拮抗劑可無 需結合至相同的IL-1受體家族成員。本文中iL-lra用以表示 150465.doc 201204391 所有結合於IL-受體家族成員及/或中和IL-1家族成員活性 之IL-1拮抗劑。 IL-lra功能等效物含有介白素-1受體拮抗劑結構域。該結 構域係指能夠與IL-1受體家族成員特異性結合，且阻止細 胞受體對IL-1及其家族成員的活化作用之結構域。實例包 括11^1^(美國專利第6,〇96,728號）、11-111丫1或11^1家族成 員5(美國專利第6,541,623號）、IL-lHy2或IL-1家族成員1〇( 美國專利第 6,365,726號）、IL-lra p(US6,3 99,573)、其他IL-1 拮抗劑成員及其功能等效物，亦即衍生自IL-1 ra之多肽，例 如具有一或多個點突變、插入、缺失、截斷或其組合之蛋 白質。其實質上保留與IL-1受體特異性結合且阻止細胞受 體對IL-1的活化作用之活性。其可含有SEq no: 1或SEQ ID N0:1之片段。IL-1 ra較佳為糖基化哺乳動物多肽。介白 素-1叉體拮抗劑之活性可使用IL_〖依賴型D10細胞藉由基 於細胞之1L_ 1中和分析（參見下文實例2)及其他IL- 1家族成 員中和分析來測定。 SEQ ID N〇:l之功能等效物係指衍生自SEQ m Ν〇:ι之多 肽，例如具有一或多個點突變、插入、缺失、截斷或其組 &之融合多肽或多肽。其與SEQ ID N〇j至少(例如， 75%、80%、85%、9〇%、95%、99%或1〇〇%)相同且具有上 述保守性介白素]受體拮抗劑結構域。變異體包括以下不 消除催化活性之生物學活性片段：其序列與本文中所描述 之IL-lra之不同處在於—或多個保守性胺基酸被取代或— 或多個非保守性胺基酸被取代、缺失或插人。所有的功能 I50465.doc 201204391 等效物實質上均具有IL-1 ra活性。 兩個胺基酸序列之「一致性百分數」係使用如Karlin及

Altschul /Voc· Α/αί/. iSW. USA 90:5873-77，1993 及

Karlin及 Altschul Pr〇c. dcac/. W. USA 87:2264-68, 1990所改進之演算法測定。該演算法併入AltschlU等人，^ Mo/· 5z.〇/. 215:403-10，1990之NBLAST及 XBLAST程式（2·0 版本）中。可使用XBLAST程式、分數=50、字長=3來進行 BLAST蛋白質搜尋，獲得與本發明之蛋白質分子同源的胺 基酸序列。當兩個序列之間現存間隙時，可使用如Aitschul 等人，iVwc/eic 25(17):3389-3402, 1997 中所述之 間隙BLAST。當利用BLAST及間隙BLAST程式時，可使用 各別程式（例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。 IL_ 1 ra之胺基酸組成物可被改變而不破壞IL-1 ra活性。例 如’該變異體可含有一或多個保守性胺基酸取代。「保守性 胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基 置換的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技 術中有所定義。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸（例如 離胺酸、精胺酸、組胺酸）、具有酸性側鏈之胺基酸（例如天 冬胺酸、麩胺酸）、具有不帶電極性側鏈之胺基酸（例如甘胺 酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、 半胱胺酸）、具有非極性側鏈之胺基酸（例如丙胺酸、纈胺酸 、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、曱硫胺酸、色 胺酸）、具有β-分支鏈側鏈之胺基酸（例如蘇胺酸、纈胺酸、 異白胺酸）及具有芳族側鏈之胺基酸（例如酪胺酸、笨丙胺酸 150465.doc 201204391 肽中經預測為非必需之胺基 中之另一胺基酸殘基置換。 分可為衍生自20-100 kD莫 、色胺酸、組胺酸）。因此，多 酸殘基較佳係經相同側鏈家族 本發明共輛物中之聚合物部 耳質量聚合物的基團。 該聚合物部分可為具有下式之線性⑺腦部分： 〆〇卜七、 其中a係選自使遠聚合物部分之最終分子量在⑽印至湖 kD範圍内之數字。 «亥聚。物。P么亦可為具有一個下式之分支部分：

其中a1、a2、a3、a4及a5係獨立地選自共同使該聚合物部分 之最終分子量在20 kD至100 kD範圍内之數字；bi、b2、b3 150465.doc -10- 201204391 、b及b係獨立地選自〇 選自由幾基u/，、R、R9HR"係獨立地 烷叛基及赵烷基組成 哪，")、戰12、、 '、㈣係獨立地選自由 ^ 〇及S組成之群；且R12及R13係獨立地 選自由鼠、南素、垸氧基'烧基 及經炫基組成之群。分支觸部分^例基

其中每一 P獨立地為250-700 每一 η獨立地為50-1000。 每一 m獨立地為250-1000， 且 該聚合物部分亦可為具有下式之共聚物mPEG.·

其中a1、a2及a3各獨立地選自使該聚合物部分之最終分子量 在2〇印至100也範圍内之數字；b1、b2及b3係獨立地選自 0-6;E及 F 係獨立地選自 *Si(Ru)(Rl5)、c(Rl4)(Rl5)、n(rU) 、◦及S組成之群；且r14及ri 5係獨立地選自由氫、鹵素、 烧氧基、録、經基、&氧幾基、"基及經燒基組成之 群。 本發明之蛋白質-聚合物共軛物可藉由習知合成法來製 150465.doc •11 - 201204391 備。舉例而言’吾人首先可使連接基團（間隔基）分子與聚合 物分子鍵結，隨後使IL-1 ra鍵結至連接基團-聚合物以形成本 發明之IL-1 ra-連接基團-聚合物共輛物，或反之亦然。 為使連接分子能與聚合物分子鍵結，該連接分子需要具 有對該聚合物分子上之官能基具有反應性的官能基。反應 性基團可為離去基、親核性基團或親電子基圑。 為使該連接分子鍵結至IL-lra，該連接分子需要具有對 rhlL-lra 之半胱胺酸殘基（Cys 66、Cys 69、Cys 116 或 cys 122)的硫醇基具有反應性之官能基（例如親電子基團）來形 成本發明之蛋白質-聚合物共軛物。 術語「離去基」係指在直接置換或電離時，可伴以其一 個共價鍵之電子對脫離之官能基（參見例如F A.匸訂巧及 R.J. Sunberg，Advanced Organic chemistry，第 3版 Plenum

Press，1990)。離去基之實例包括（但不限於）甲磺酸酯基、 三IL甲續酸酷基、對甲苯確酸_基、雄離子（ic>dide)、漠離 子（bromide)、氯離子（chl〇ride)、三氟乙酸略、丁二酿亞胺 基（「Su」）、對硝基苯氧基及β比啶_2基-氧基。 術#「親核性基團」係指藉由捐出電子對與諸如親電子 劑之電子接收基團反應之電子增濃的官能基。 術語「親電子基團」係指藉由接受電子對與諸如親核試 劑之電子捐出基團反應之電子缺乏的官能基。含有α，β-不飽 和嗣部分或乙稀基硬部分之邁克爾受體⑽一⑽㈣ 為親電子基團之子集。其一曰接 一接觸親核试劑即進行邁克爾 反應（Michael reaction)。盆仙钼Φ工甘m ；其他親電子基團包括（但不限於） 150465-doc 12 201204391 醛及順丁烯二醯亞胺基。 上述合成法可包括添加或去除合適保護基之步驟。另外 ，可以替代的次序或順序進行合成步驟以得到所需蛋白質_ 聚合物共軛物。適用於合成可用蛋白質_聚合物共軛物之合 成化學轉化法、保護基方法（保護及去除保護）及反應條件為 此項技術中已知且包括例如R Lar〇ck，

Organic Transformations, VCH Publishers (1989) ； T.W. Greene 及 RG.M. Wuts，0—心 第 2版，John Wiley and Sons (1991) ; L 仏如及

Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic 办—John Wiley and S〇ns (1994);及L 編，

Encyclopedia of Reagents f〇r Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)及其後續版本中所述者。 可藉由諸如離子交換層析、凝膠過濾層析、電泳、透析 、超濾或超速離心之方法進一步純化由此合成之比-丨⑺聚 合物共輛物。 本發月之蛋白貝-聚合物共輛物保留化化-1 ra之活性且在 人類血液中具有較長半衰期。因此’本發明亦關於一種藉 由向有而要之個體投與有效共軛物來治療rhiL_ 1 η介導之 ;、病（諸如免疫疾病）之方法。該個體可由健康護理專業人員 根據任何合適診斷法之結果來確定。 ，如本文中所使用之術語「治療」定義為在治癒、緩和、 … 矯正或改善某—病症、該病症症狀、繼發於該病症 疾病或病症、或趨向該病症之傾向的目的下，向具有該 150465.doc 13· 201204391 病症、該病症症狀、繼發於 外产〆 天娜或病症、或趨仓 j病症之傾向的個體（人類或㈣ 治療效果之蛋白質：人：文里」係指對所治療個體賦予 的（亦即可St4。該治療效果可為客觀 -..^八、'忒或裇4、罝測）或主觀的（亦即個體表 =感覺到有效果)。如膽項技術者所認可，有效= 將視例如蛋白質_聚合 了里 類型，途徑1形劑::及::他連!广療疾病之 用之可能^變化。 帛及…、他 >=療性處理共用使 為實施本發明之方法戈 物可非經腸、唾口、"戈夕種上述化合物之組合 文 ，「經鼻、直腸、局部或經頰投與。如本 、n I 指皮下、皮内 '靜脈内、肌内 關即内、動脈内、滑膜 膜内、洛# h 4 扪月内、勒内、病灶内、腹

Lr内注射以及任何合適的輸注技術。 °射、’且合物可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或 =:=懸:液，諸—二醇中之溶液」 液包括在7 Μ。氏冷液（Rlnger,s solution)及等張氣化鈉溶 用習知作用之可接受媒劑及溶劑内。另外，可採 用I知作為溶劑戎縣、、至人# 油醋或二甘油㈤:；肪::二不揮發性油(例如合成單甘 如尤其呈聚氧乙稀化：酸)及其甘油醋衍生物， 如撖俨油劣# /j之天然醫藥學上可接受之油（諸 板/由或蓖麻油）適用於P供 浮液亦可含有县/ 可注射劑。該等油溶液或懸 似八㈣釋劑或分散劑或幾甲基纖维素或類 刀“〃他常用界面活性劑（諸如TWEENS或Spans)或 I50465.doc 201204391 其他常用於製造醫藥學上可接受之固體、液體或其他劑型 之類似乳化劑或生物可用性增強劑亦可用於調配目的。

用於口服之組合物可為任何經σ可接受之劑型，包括膠 囊劑、乳液及水性懸浮液、分散液及溶液。就鍵齊^ 吕，常用載劑包括乳糖及玉米殿粉。通常亦添加諸如硬脂 酸鎂之潤滑劑。對於膠囊形式之口服投藥而言，適用之稀 釋劑包括乳糖及乾燥玉米澱粉。當經σ投與水性懸浮液或 乳液時，活性成份可合併乳化劑或懸浮劑懸浮或溶解於油 相中。若需要’則可添加某些甜味劑、調味劑或著色劑。 可根據醫樂調配技術中熟知之技術製備經鼻氣溶膠或吸 入組合物。舉例而言’該組合物可使料醇或其他合適防 腐劑、增加生物可用性之吸收促進劑、碳氣化合物及/或此 項技術中已知之其他增溶劑或分散劑於鹽 。具有-或多種上述化合物之組合物亦可喝 直腸投與。 醫樂學上可接受之載劑通常與—或多種上述活性化合物 -起使用。醫藥組合物中之載劑必須「可接受」，亦即：與 該組合物之活性成份相容（且較佳能夠穩定活性成份對 所治療之個體無害。可使用—或多種增溶劑作為醫藥賦形 劑’用於傳遞上述化合物。其他載劑實例包括膠態二氧化 石夕、硬脂酸鎮、纖維素、月桂基硫酸納及〇&(： Ye丨丨㈣⑽。 下文之實例應僅解釋為例示性的，而非以任何方式限制 本發明之其餘部分。益靈推 半> '"、而進步坪細描述，咸信熟習此項 技術者可根據本文之描述以最大程度地利用本發明。本文 150465.doc 15 201204391 中所引用之所有公開案全文係以引用的方式併入本文中。 實例1 :化學合成 (1)合成以下IL-lra共輛物：

DCBpdiOOl 在4°C下，使1 mg/mL於填酸鹽緩衝鹽水（pbs, pH 7.5)中 之 RhIL-lra(4 mg, 0·26 μιηοΐ)與 mPEG-丁 二醯基-N-羥基丁 二醯亞胺（rhlL-lra與PEG之莫耳比：1/1〇; PEG之莫耳質量 :5 kD)混合 12 小時。使用 HiTrap CM FF 5x1 ml(GE Healthcare)純化反應混合物。使用5管柱體積PBS隨後使用5 管柱體積緩衝液（卩^18.2/磷酸鹽/5〇111]^川3+)以11111^111丨11之 流動速率（蠕動泵）洗滌管柱。用緩衝液溶離共軛物。使用蛋 白質分析套組（BIO-RAD)分析溶離液，以測定共軛物結合 於管柱之量。 (2)合成以下IL-lra共軏物：

DCBpdi002 除了使用30 kD分子量之mPEG代替5 kD分子量之mPEG 之外，藉由與上述相同之方法合成該共輕物。 (3)合成以下IL-lra共軛物： 150465.doc -16- 201204391

JL-1RA (MW = 5,000) 順丁烯二酸酐 〇

g Ν，Ν-二環己基碳化二亞胺 Ζ 〇 °V η,ν^οη —[Tn-ch,ch,c-o-n Ί DMF 〇 〇 將β-丙胺酸（1.00當量）添加至順丁烯二酸酐（1.00當量）之 無水二曱基曱醯胺溶液中。在胺基酸溶解後攪拌懸浮液1.0 小時。冷卻所得溶液至0°C。添加Ν-羥基丁二醯亞胺（1.25 當量），隨後添加二環己基碳化二亞胺（2.00當量）。5.0分鐘 後移除冰浴且再攪拌溶液1 8小時。以二氯曱烷萃取反應混 合物且以水洗滌。經無水硫酸鈉乾燥有機層，在減壓下濃 縮且在乙鍵中再結晶。

將3-順丁烯二醯亞胺基丙酸丁二醯亞胺基酯（5.00當量） 溶解於無水二氣曱烷中，接著添加胺基丙基-mPEG( 1.00當 量，MW=5000，購自NOF)及三乙胺（5.00當量）。在室溫下攪 拌反應物48小時。移除溶劑且以丙酮替換。溫熱溶液以溶 解固體，隨後冷卻至〇°C。在真空下獲得聚合物之白色沈澱。 在 4°C 下，使1 mg/mL 於 PBS(pH 6.5)中之 RhIL-lra(4 mg, 0.26 μιηοΐ)與經活化之PEG(rhIL-lra與PEG之莫耳比為1/10) I50465.doc •17- 201204391 共軛 12小時。使用 HiTrap CM FF 5x1 ml(GE Healthcare)純 化含有PEG-IL-lra之反應混合物。使用5管柱體積PBS隨後 使用5管柱體積緩衝液（pH4.3/乙酸/5 0mM/Na+)以lmL/min 之流動速率（蠕動泵）洗滌管柱。用缓衝液溶離共軛物。使用 蛋白質分析套組（BIO-RAD)分析溶離液，以測定結合於管 柱之量。 (4)合成以下IL-lra共輛物：

DCBpdi004 (MW = 20,000) 除了使用20 kD分子量之mPEG代替5 kD分子量之mPEG 之外，藉由與上述相同之方法合成該共軛物。 (5)合成以下IL-lra共輛物：

DCBpdi005 (MW - 30,000) 除了使用30 kD分子量之mPEG代替5 kD分子量之mPEG 之外，藉由上述方法合成該共扼物。 (6)合成以下IL-lra共輛物：

DCBpdi006 150465.doc -18- 201204391 除了使用40 kD分子量之mPEG代替5 kD分子量之mPEG 之外，藉由與上述相同之方法合成該共軛物。 (7)合成以下IL-lra共辆物：

(MW = 40,000) 除了使用40 kD分子量之二分支mPEG代替5 kD分子量之 mPEG之外，藉由與上述相同之方法合成該共輛物。 (8)合成以下IL-lra共輛物：

(MW = 60,000) 除了使用60 kD分子量之二分支mPEG代替5 kD分子量之 mPEG之外，藉由與上述相同之方法合成該共軛物。

(9)合成以下IL-lra共輛物：

除了使用80 kD分子量之二分支mPEG代替5 kD分子量之 mPEG之外，藉由與上述相同之方法合成該共軛物。 (10)合成以下IL-lra共軛物： 150465.doc -19- 201204391

(MW = 40,000) 除了使用具有40 kD分子量之四分支mPEG代替5 kD分子 量之mPEG之外，藉由與上述相同之方法合成該共扼物。 (11)合成以下IL-lra共軛物：

在〇°C下，將#-(乙氧羰基）順丁烯二醯亞胺（0.53 g, 3_1 mmol)添加至#-(第三丁氧獄基）-乙二胺（0·40 g, 2.5 mmol) 之飽和碳酸氫鹽水溶液（15 mL)中。在0°C下攪拌反應混合 物30分鐘，隨後在室溫下再攪拌1.0小時。以二氣曱烷（30 mL)萃取水層三次。合併之有機層以無水硫酸錯乾燥且在真 空下濃縮。 150465.doc -20- 201204391

在至溫下於三氟乙酸（4.0 mL)及苯甲醚（0.15 mL，1.39 mmol)之溶液中攪拌#-(2-((第三丁氧羰基）胺基）乙基）_順丁 烯二醯亞胺（〇 3 g，1 25 mmol)1.0小時。在真空下移除三氣 乙酸後’以無水乙醚處理殘餘物產生呈白色晶體狀之三氣 乙酸之W-(2-胺基乙基）順丁烯二醯亞胺鹽。

,0>p^oj^OH CH2C12

TsCI, KOH

(MW = 5000)

在〇 C下’將對曱苯石黃酸氯（0.76 g，4.0 mmol)添加至單甲 氧基聚乙一醇（MW=5000，1 〇·〇 g，2.00 mmol)之二氣甲烧 (40 mL)溶液中。在〇°C下攪拌反應混合物3〇分鐘後，添加 KOH(0.90 g，16.0 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物6.〇小時 。隨後過濾混合物移除KOH。以二氣甲烷萃取濾液且以水 及鹽水洗滌兩次。經MgS〇4乾燥有機層且過濾。移除溶劑 且以丙酮替換。溫熱溶液以溶解固體，隨後在〇。〇下添加乙 _。在真空下獲得白色聚合物沈澱。

(MW = 10000) 使單曱氧基聚乙二醇曱苯磺酸酯（MW=5000，0.345 g， 0.07 mmol)、3,5-二經基苯甲酸曱酯（5 mg, 〇·〇3 mmol)及 K2CO3(0.041 g，0.3 mmol)之丙酮（8 mL)溶液回流48小時。 150465.doc 201204391 過濾混合物以移除K2C〇3。移除溶劑且以丙酮替換。溫熱溶 液以溶解固體，隨後在o°c下添加乙醚。在真空下獲得白色 聚合物沈澱。

向3，5-雙-曱氧基聚乙二醇苯曱酸曱酯（0.25 g, 0.25 mmol) 之MeOH(3 mL)溶液中添加2.4 MNaOH(3 mL)。在室溫下攪 拌反應混合物48小時。移除^^〇11且用6.0>^：«(：1酸化至？玨2 。以二氯甲烷（30 mL)萃取水相三次。經MgS04乾燥有機層 且過濾。移除溶劑且以丙酮替換。溫熱溶液以溶解固體， 隨後在〇°C下添加乙醚。在真空下獲得白色聚合物沈澱。

、。卜t (MW = 10000) 向3,5-雙-甲氧基聚乙二醇苯曱酸（0.25 g, 0.02 mmol)及 HOBt(0.027 g，0.2 mmol)之 CH2C12(3 mL)溶液中添加 N，N，-二異丙基碳化二亞胺（0.031 mL, 0.2 mmol)及三氟乙酸之 /V-(2-胺基乙基）順丁稀二酷亞胺鹽（0.0 1 5 g, 0.06 mmol)。隨 後添加三乙胺（0.1 5 mL)且在室溫下攪拌反應混合物48小時 。以二氣曱烷萃取混合物且以水及鹽水洗滌兩次。經MgS04 乾燥有機層且過濾。移除溶劑且以丙酮替換。溫熱溶液以 溶解固體，隨後在〇°C下添加乙醚。在真空下獲得粉紅色聚 150465.doc -22· 201204391 合物沈澱。使用bio Gel P1 OO(Bio-red)管柱（1 ·6 χ 80 cm)且使 用水作為溶離劑藉由凝膠過濾層析純化二分支mPEG-順丁 烯二醯亞胺。 (12)合成以下IL-lra共輒物：

除了使用24 kD分子量之二分支mPEG(每一 mPEG分支具 有12 kD分子量）代替10 kD分子量之mPEG之外，藉由與上 述相同之方法合成該共軛物。 (13)合成以下IL-lra共輛物：

,IL-1RA (MW = 40,000) 除了使用40 kD分子量之二分支mPEG(每一 mPEG分支具 有20 kD分子量）代替10 kD分子量之mPEG之外，藉由與上 述相同之方法合成該共軛物。 (14)二分支 m-PEG 之 SEC-HPLC 分析： 使用SEC-HPLC偵測用於製備共軛物11、12及13之二分支 mPEG之純度。m-PEG(WM=10 kD)之流動速率為0.5 mL/min 且m-PEG(MW=24及40 kD)之流動速率為0.3 mL/min。如圖 1(A)-(C)中所示，該三種mPEG皆純。 150465.doc -23- 201204391 (15) PEG-IL-lra 共扼物之 SEC-HPLC 分析： 藉由離子交換管柱及尺寸排阻管柱純化DCBpdi007。使 用配備有Waters 6 00控制器、Waters 717 plus自動取樣器、 Waters 486可調吸光度偵測器及Waters empower pro之 SEC-HPLC系統偵測其純度。在等濃度條件（is〇cratic condition)下，使用0.1 Μ硝酸鈉或1倍PBS作為溶離劑在0.4 mL/min或0.5 mL/min之流動速率下運作Waters Ultrahydrogel 250(7.8x300 mm)。將樣品稀釋至0.2 mg/ml 。注射1 0微升稀釋樣品且在280 nm下偵測。如圖2中所示， DCBpdi007具有99%之系屯度。 (16) 定量蛋白質（PEG-IL-IRa) 使用二辛可寧酸蛋白質分析套組按照製造商（Thermo Scientific)推薦之方案定量蛋白質或聚乙二醇化蛋白質。 實例2 :生物分析 材料及方法 (1)IL-1RI結合分析 將含有.IL-1RI之塗佈緩衝液以1 pg/mL之濃度塗佈於培 養盤上（100微升/孔）。密封培養盤且在4°C下儲存隔夜直至 使用。隨後吸出塗佈緩衝液且用300微升/孔PBS洗滌各孔3 次。隨後使用阻斷緩衝液（含有1%BSA之PBS，300微升/孔） 培育各孔。在37°C下培育培養盤2小時後，移除阻斷缓衝液 且用300微升/孔PBST(0.05% Tween20)洗滌各孔3次。添加 (100微升/孔）藉由用PBS-1%BSA 2倍連續稀釋之樣品至各 孔中。密封培養盤且在37°C下培育2小時。以上述相同方式 150465.doc -24· 201204391 用400微升/孔PBST(0.05% Tween20)洗滌各孔3次。隨後將 於PBS-1%BSA中之抗-IL-Ira-生物素（1:300)添加至各孔中 (100微升/孔）’接著密封培養盤且在37〇c下培育2小時。在 用300微升/孔PBST(0.05% Tween20)洗滌各孔6次後，將於 PBS-1%BSA中之抗生蛋白鏈菌素_HRP(1:4000)添加至各孔 (100微升/孔）且在37°C下培育2小時。隨後，添加TMB至各 孔（100微升/孔）且在至溫下培育5_ι〇分鐘用於顯色。藉由添 加100 μΐ IN HC1停止顯色。隨後使用微定量板式讀取器讀 取培養盤且獲得在45 0-65 5下之吸光度。 (2)活體外穩定性分析 活體外穩定性分析 為量測血漿濃度，在人類血清中培育IL-lra及PEG-IL-Ira 。在不同時間點下收集血漿樣品直至24(或72)小時且藉由酶 聯免疫吸附分析（ELISA)以上述方式量測其IL_lra或 PEG-IL-lra濃度。 蛋白酶抑制劑分析 在37 C下，在蛋白酶抑制劑（HaltTM蛋白酶抑制劑混合物 套組，PIERCE)存在或不存在下，在人類血清中培育IL_lra 〇 、2、4、8或24小時。在不同時間點下收集血清樣品且藉由 ELSIA以上述方式量測IL_lra濃度。將捕捉抗體轉移至 EUSA培養盤（1〇〇微升/孔，在PBS中稀釋至2 pg/mL漢度） 且在室溫下培育隔夜。隨後以洗滌緩衝液（300 μΐ)洗滌各孔 三次’在室溫下用300 μΐ含有1%BSA之PBS阻斷1小時。以 同樣方式再次洗滌各孔後，添加100 μΐ於適當稀釋劑中之樣 150465.doc •25· 201204391 品或IL-1 ra標準物至各孔中且在室溫下培育2小時。洗滌三 次後，添加生物素標記之偵測抗體（稀釋於含1% BSA之相 同稀釋劑中）至各孔（1〇〇微升/孔）且在室溫下培育2小時。再 次洗滌後，在室溫下用1 00 μΐ抗生蛋白鏈菌素HRP培育各孔 1小時。在室溫下使用1〇〇 μΐ受質溶液進行顯色30分鐘，隨 後藉由用1〇〇 μΐ IN HCL培育停止顯色。使用微定量板式讀 取器以上述相同方式在30分鐘内測定各孔之光密度 (0.D.)450-655 nm。 (3) IL-1之細胞增殖分析 將一式兩份人類IL-ip(R&D)連續稀釋液與固定數目之 D10細胞混合於96孔分析培養盤中之補充有L-麩醯胺酸及 2ME之 5% T-STIM ConA、10% FBS、RPMI-1640培養基中 ，每孔總體積為200微升。亦包括細胞僅存於培養基中之背 景孔用於分析。在37°C及5% C02培育箱之含濕氣腔室中培 育分析培養盤3天。在培育結束時，添加MTS分析溶液 (PROMEGA)至分析培養盤之各孔中。再培育分析培養盤4-5 小時用於顯色。在板式讀取器中在490-655 nm下讀取分析 培養盤各孔之O.D.，其與孔中活細胞的總數成正比。用O.D. 相較於IL-1濃度（ng/mL)繪製細胞增殖曲線。 (4) 受體拮抗劑之IL-1中和分析 將一式兩份IL-1受體拮抗劑（IL-lra及PEG-IL-lra)連續稀 釋液與固定數目之D10細胞混合於96孔分析培養盤中之補 充有L-麩醯胺酸及2ME之5% FBS、RPMI-1640培養基中。 在37°C下預培育分析培養盤1小時。添加固定濃度之人類 150465.doc -26· 201204391 IL-la至分析培養盤之各孔中，使得hIL-ia之最終濃度為1 ng/ml。亦包括僅具有細胞及hIL-1 a( 1 ng/mL)之對照孔用於 分析。在37°C及5% C02培育箱之含濕氣腔室中培育每孔總 體積為200微升之分析培養盤3天。如上所述進行 MTS(PROMEGA)分析且分析。用O.D.相較於受體拮抗劑濃 度（ng/mL)繪製中和曲線。 (5)PEG-IL-lra之活體内藥物動力學 自 BioLASCO(Taipei，Taiwan)獲得史-道二氏（SD)雄性大 鼠（每隻約為300-350 g)。在研究期間個別圈養大鼠且飼喂 Laboratory Autoclavable Rodent Diet(PMI® Nutrition International, Inc., MO.，USA)。所有活體内研究經IACUS 動物研究方案批准。 在給藥之前，所有動物稱重且觀察臨床病徵。自研究中 移除任何顯示疾病病徵之動物。根據其體重等級將最後16 隻動物隨機分配至四組中。在該研究中使用3 mg/kg之給藥 量。總共使用四種試樣：KINERET、DCBpdi005、DCBpdi006 及DCBpdi007。所用給藥量、體積及濃度示於表I中。經由 靜脈内途徑（iv)投與所有試樣。 在給藥前及靜脈内投與後15分鐘、1、2、4、6、8、24 及32小時自尾靜脈收集血液樣品（約0.25 mL/動物）。在給藥 後48、72、96及120小時自尾靜脈收集血液樣品（約0.5 mL/ 動物）。在給藥後第六天（144小時），自所有動物抽出充足血 液。使用EDTA作為抗凝劑，將所有血液樣品保存於冰上或 保留在4°C下。為獲得血漿，在4°C下以1000 G離心血液樣 150465.doc -27- 201204391

品15分鐘。在分析前，將血漿樣品儲存於_8〇<t冷凍機中。 表I 給藥體積 2 DCBpdi005 3 j ^ 4 3 DCBpdi006 3 j - 4 4 DCBpdi007 3 }___^ ^ 結果 發現IL-lra在血清中具有較差穩定性，其係由蛋白酶降解 引起。如上所述’在37°C下在含有或不含有蛋白酶抑制劑 之人類血清樣品中培育IL_lra 〇、2、4、8、Μ小時。在不 同時間點收集樣品直至24小時且藉由ELISA量測IL_lra濃 度"發現ILl-ra在人類血清中之半衰期為約4小時（圖3)。亦 發現不同濃度（1倍或1()倍，PIERCE)之蛋白酶抑制劑混合物 可增加ILl-ra在人類血清中之穩定性。該結果證明江_1^至 少部分由於血液中之蛋白水解而迅速降解。 為增加IL-lra之血清穩定性，將卜分子用於之c端 來增加分子大小。結果表示增加分子大小並不增加iL_ira 在血清循環巾之半衰nb，僅增加分子大小並不足夠 ’必須解決蛋白酶消化之問題。 一種增加IL-lra血清半衰期之方法為防止或減少對於 IL-lra之蛋白水解過程。聚（乙二醇χρΕ⑺鏈與治療性肽共 軛且蛋白質在防止存在於血液及組織令之各種蛋白酶的蛋 白水解降解方面起重要作用。為形成具有il]^性及半衰 ，故長之蛋白質’產生各種具有不同分子量之pEG_Hra。 更特定言之’設計-系列聚乙二醇化IL_lra。首先，將 150465.doc •28- ,外. 201204391 mPEG-丁二醯基-NHS連接至IL-lra離胺酸殘基，產生2種具 有不同分子量之聚乙二醇化IL-lra蛋白質。實例包括 DCBpdi001(MW=5,000)及 DCBpdi002(MW=20,000)(表 1)。 其次，聚乙二醇化IL-lra經設計以使PEG分子連接於半胱胺 酸殘基且具有不同分子量。使用不同類型之PEG分子合成 該等PEG-IL-lra蛋白質。其包括線性mPEG-順丁烯二醯亞胺 (例如 DCBpdi003(MW=5,000)、DCBpdi004 (MW=20,〇〇〇)及 DCBpdi005(MW=30,000) ; DCBpdi006 (MW=40,000)) ; 2分 支 mPEG-順 丁烯二醯亞胺（例如 DCBpdi007(MW=40,〇〇〇); DCBpdi008(MW=60,000) ； DCBpdi009(MW=80,0〇〇); DCBpdi011(MW=10,000) ； DCBpdiO 12(MW=24,0〇〇)； DCBpdi013(MW=40,000))及 4 分支 mPEG-順 丁烯二醯亞胺（ 例如 DCBpdi010(MW=40,000))。 在4 °C下使IL-lra及PEG在條件緩衝液（PBS， ρΗ6·5/ρΗ7·5)中共軛12小時且藉由離子交換HiTrap管柱（GE Healthcare)自條件緩衝液純化PEG-IL-lra。藉由BCA蛋白質 分析測定聚乙二醇化IL-lra蛋白質濃度且藉由SDS-PAGE分 析（圖4)。使用ELISA檢驗各種形式之PEG-IL-lra以測定其 結合於重組可溶性人類IL-1 I型受體（IL-1RI)之能力。IL-1 I 型受體（IL-1RI)複合物似乎介導所有已知IL-1生物反應。 IL1-RI與其配位體之複合物形成為觸發所有後續生物反應 之第一個步驟。 發現IL-lra蛋白質及未在離胺酸殘基上選擇性聚乙二醇 化之IL-lra蛋白質（DCBpdiOOl及DCBpdi002)完全喪失其對 150465.doc •29- 201204391 於IL1-RI之結合活性（圖4及5，表2)。 表2 聚乙二醇化 IL-lra 結合親和力 穩定性 中和活性 Kd5〇改良為相較於IL-lra之Kd5之倍 數 IL-1RA (tm/J、日夺 ) ， Ε〇50 比 (=PEG-IL-1RA/IL-1RA) DCBpdiOOl 不可偵測 3 ΝΑ DCBpdi002 不可偵測 3.8 ΝΑ DCBpdi003 5.2 3.85 7.4 DCBpdi004 8.6 7.28 20.9 DCBpdi005 3.24 >72 12.2 DCBpdi006 1.36 >72 26.8 DCBpdi007 1.45 >72 28.3 DCBpdi008 1.03 >72 ΝΑ DCBpdi009 0.39 >72 ΝΑ DCBpdiOlO >1 3.2 39 DCBpdi012 1.33 >72 ΝΑ DCBpdi013 1.51 >72 ΝΑ IL-lra 1.0* 3.5 - NA :未獲得 *比值1.0相當於1070±320 ng/ml之結合親和力/Kd5〇 如表2中所示，當IL-Ira蛋白質與分子量低於60 kD之PEG 共軛（例如〇€3卩以003-008、010、012-013)時，其展現出比 得上或優於天然IL-lra之對於IL-1RI之結合活性（圖5B及 5C)。 為評估PEG-IL-lra在人類血清中之穩定性，用人類血清 培育上述IL-lra PEG共軛物至72小時且藉由ELISA在各時 間點量測其濃度。結果展示於上表2中。 發現與天然IL-lra類似，兩種Lys-聚乙二醇化IL- Ira(亦即 DCBpdiOOl及DCBpdi002)快速降解且在24小時内不可偵測 (圖6)。相比之下，008卩以005-09及012-013(其中？£0在0丫8 殘基共軛且具有大於20 kD之分子量）似乎比天然IL-lra對 人類血清中之蛋白水解降解更具抗性。如表2中所示，該7 150465.doc -30- 201204391 種共輛物在人類血清中之半衰期（ti/2)超過72小時（表2)。具 有4分支PEG(其各鏈小於1〇 kD)之DCBpdi〇1〇具有與天然 IL-Ira類似之半衰期。 由於DCBPdi005及DCBpdi007結合於IL1_RI之活性不受 聚乙二醇化影響，故使用IL-lra中和分析檢驗〇(：313(11〇〇5及 DCBpdi007之生物活性。 簡言之，兩種PEG-IL-lra的生物活性各藉由其抑制鼠類 輔助T細胞株D10.G4.1細胞增殖之能力來量測，該細胞株之 生長為IL 1依賴型。IL-1 ra能夠以高親和力與1競爭結合 於細胞表面IL-1受體且阻斷比-丨誘導之細胞增殖。 發現在Cys殘基選擇性聚乙二醇化似乎減少IL_lra對於 IL-Ιβ之中和能力，然而其僅部分影響IL_lra之此生物活性（ 表 2)。IL-lra 之 EC50 值為 27 ng/mL，而 DCBpdi〇〇5 及 DCBpdi007 之 EC50 值分別為 346 ng/mL 及 720 ng/mL(圖 7)。 Cys選擇性 PEG-IL-lra蛋白質 DCBpdi〇〇5及 DCBpdi007之中 和活性為約10-30倍小於iL-ira(表2)。 由於IL-lra尺寸較小且對蛋白水解降解敏感故自血清循 %中快速清除而使其在人類中之治療用途極大受限1 m 之固有性質引起ANAKINRA以及每日給藥方案之開發，其 不可避免地引起不利副作用。小尺寸IL_lra可藉由與不同尺 寸的PEG共耗來克服。然而，聚乙二醇化難以減少或防止 IL-lra在血清中之蛋白水解降解而不犧牲其結合及中和活 性。 迄今為止，許多研究嘗試改良IL_lra在血清中之穩定性而 150465.doc -31 · 201204391 以有利含量用於醫學使用，但失敗了。舉例而言，無一研 究可成功延長血清半衰期多至24小時。上述DCBpdi005-008 及DCBpdi012-013為首先具有72小時以上人類血清半衰期 之實例，同時保留結合IL1-RI之生物有效性（圖5_7及表2)。 全部該等PEG-IL-lra共軛物具有mPEG·順丁烯二醯亞胺（24 至60 kD)在Cys殘基共輛。 上述結果證明PEG大小及聚乙二醇化位點對改良IL_ J ra 在人類血清中之穩定性且保留其生物活性至關重要。用於 共耗之線性或分支PEG大小較佳應大於20 kD，以便有效抑 制IL-lra之蛋白酶消化，但應小於6〇 kD，以保留對iliri 之結合能力。 除大小之外，聚乙二醇化位點同樣重要。半胱胺酸殘基 (Cys 66、Cys 69、Cys 116 或Cys 122)上之聚乙二醇化對 IL-lra之穩定性及活性起重要作用。可能形成分子内鍵之半 胱胺酸殘基通常被視為對於蛋白結構及由此產生之生物活 性至關重要。提出在Cys 69與Cys 116之間形成分子内鍵結 ，但一些跡象表明不同。出乎意料的是，至少使用一些形 式之PEG藉由PEG化在半胱胺酸上進行化學修飾並不消除 IL-1 ra之結合活性及生物活性。 最後’上述結果亦證明不同形式之peg對於IL_lra之穩定 性及生物活性至關重要，其係藉由線性及2分支mPEG順丁 烯一醯亞胺而非4分支mPEG-順丁烯二醯亞胺可改良乩-lra 穩疋性之觀察結果來證實（表2)。 其他實施例 I50465.doc •32· 201204391 本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合來組合。本 說明書中所揭示之各特徵可經用於相同、等效或類似目的 之替代特徵替換。因此’除非另有明確說明，否則所揭示 之每一特徵僅為一連串通用等效或類似特徵之一實例。 熟習此項技術者自上述說明可容易地確定本發明之基本 特徵，且在不悖離其精神及範疇之情況下可對本發明作出 各種改變及修正以使其適於各種用途及條件。因此，其他 實施例亦在以下申請專利範圍的範疇内。 【圖式簡單說明】 圖1(A)-(C)為展示二分支m-PEG之HPLC分析結果之圖： (A)10 kD、（B)24 kD及（C)40 kD。 圖2為展示DCBpdi007之HPLC分析結果之圖。 圖3為展示以蛋白酶抑制劑處理之〗!^lra增加IL-Ira在人 類血清中之穩定性之結果之圖。 圖4為展示PEG共輛及PEG-IL-Ira純化結果之相片。 圖5(A)-(C)為展示IL-lra及PEG-IL-lra與IL-1RI之受體結 合活性結果之圖，表明DCBpdi005(B)及DCBpdi007(C)(但非 DCBpdiOOl 及 DCBpdi002(A))之 IL-1RI結合活性相比 IL-lra 之IL-1RI結合活性較佳。 圖6為展示聚乙二醇化之IL-lra增加其在人類血清中之穩 定性之圖。 圊 7(A)及 7(B)為展示 PEG-IL-lra(例如 DCBpdi005(A)及 DCBpdi007(B))保留對IL-ip的中和活性之圖，其可對D10 細胞進行分析。 150465.doc •33·

Claims (1)

1. 201204391 七、申請專利範圍： 1. 一種式⑴共軛物，

   式⑴ 其中 X、Y及Z各獨立地為〇、NH或經去除； S-IL-lra為IL-lra蛋白質，其中之硫原子與式^^中之 '—酿亞胺基壤連接； P為線性或分支聚合物部分；且 r及q各獨立地為〇、1、2、3、4或5。 2. 如请求項1之共軛物，其中p具有5i〇〇kD之莫耳質量。 3. 如清求項2之共扼物，其中p為線性聚乙二醇部分。 4. 如凊求項3之共軛物，其中p具有2〇_6〇 kD之莫耳質量。 5. 如請求項2之共軛物，其中p為分支聚乙二醇部分。

   6. 如請求項5之共輛物，其中p具有以下結構： 其中各m獨立地為250-1000。 如请求項5之共軛物’其中P具有以下結構：

   其中各P獨立地為250-700。 150465.doc 201204391 8. 如請求項1之共軛物，其中q為2。 9. 如明求項8之共軛物’其中X經去除且γ為〇或nh。 10. 如請求項9之共軛物，其中r為3且z經去除。 11. 如请求項1 0之共軛物’其中P為線性聚乙二醇部分。 12. 如睛求項11之共軛物’其中P具有5-40 kD之莫耳質量 13_如睛求項9之共軛物，其中r為^且乙為〇。 14.如請求項13之共輕物，其中p具有以下結構：

   其中各m獨立地為250-1000。 15·如請求項8之共軛物，其中X為〇或NH且Y經去除。 16.如請求項15之共軛物，其中p為

   其中各p獨立地為250-700。 17.如請求項1之共軛物，其中該共軛物具有下式：

   其中該PEG部分具有約30 kD之莫耳質量。 18·如請求項1之共軛物，其中該共軛物具有下式

   I50465.doc -2- 201204391 其中忒PEG部分具有約4〇 kD之莫耳質量。 PEG. PEG* 19.如請求項1之共軛物1中該共輛物具有下式: S*

   /rtilL-1ra 〇 其中該等PEG部分各具有約20 kD之莫耳質量。 期為12小時以 22_如請求項丨之共軛物，其中該共輛物在人類血清中之半衰 上0 23·如請求項22之共扼物，其中該共輛物在人類血清中之半 农期為4 8小時以上。 24.=請求項23之共輛物，其中該共輛物在人類血清中之半 展期為72小時以上。 25·-種醫藥组合物，其包含醫藥學上可接受之載劑及如請 I50465.doc 201204391 求項1之共軛物。 26. —種如請求項1之共軛物的用途，其用於製造用以治療免 疫病症之藥物。 27. 如請求項26之用途，其中該免疫病症為類風濕性關節炎。 150465.doc