TW201138861A - Gamma-polyglutamic acid-based ocular irrigating solutions - Google Patents

Description

201138861 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種眼科手術溶液，尤指一種眼科手術 沖洗液。 【先前技術】 沖洗液常被廣泛用於如晶體乳化術 (phacoemulsification)、玻璃體切除術（vitrectomy surgery) 及青光眼手術（glaucoma surgery)之眼科手術過程中。晶體 乳化術係一種摘除眼内混濁晶體（稱之為白内障）之手術。玻 璃體切除術係一種將部份或全部玻璃狀液（vitreous humor) 從眼睛移除之手術。青光眼手術則涉及雷射治療或於眼球 中形成切口，以降低眼壓。根據中央健康保險局報導指出， 台灣每年進行約150,000次的眼科手術。眼科手術之效果與 所使用的沖洗液息息相關。不適宜的沖洗液可能會對角膜 或晶體造成傷害，因而導致視力變差、產生盲點、甚至失 明。 理想的沖洗液應當具有接近水樣液（aqueous humor)之 組成及290 mOsm至500 mOsm間之渗透壓（osmolarity)。沖 洗液的主要功能係用來維持内皮細胞完整性、角膜厚度及 視網膜組織。此外，適宜的沖洗液應可於白内障手術期間 保存角膜内皮細胞活性，提供能量來源（即葡萄糖），維持適 當機能及電解質濃度，並保護角膜内皮細胞避免pH值波動。 201138861 平衡鹽溶液（BSS®)及BSS PLUS®已常用於眼内沖洗β BSS PLUS®的組成與水樣液組成相近jsS PLUS®基本上具 有四部份組成：1)足量緩衝劑（即碳酸氫鈉），2)能量來源（即 葡萄糖），3)於7至8間之穩定PH值（即HEPES)，4)抗氧化劑（即 麵耽甘肽，glutathione)。然而，該些眼内沖洗液無法對眼 科手術中最容易受到物理性傷害的角膜（内皮）細胞提供有 效充分的保護。研究指出，複雜的眼科手術（如晶體乳化術） 可能會導致嚴重的併發症。導致併發症之部分可能因素包 括：超音波的機械性作用、未吸出之晶體碎片導致的物理 性傷害、沖洗液導致熱產生甚至滲透不正常。這些因素皆 可能對角膜内皮細胞造成傷害，甚至有導致不可回復之水 泡性角膜病變（bullous keratopathy)的風險。 因此’本領域迄今仍有上述缺失及不足尚須解決，尤 需發展一種對眼内組織，尤其是角膜（内皮）細胞，具有較佳 保護功能之眼科手術沖洗液。 【發明内容】 本發明之一態樣係關於一種含量足以沖洗患者眼部組 織之眼科手術沖洗液’其包括：a)增加該沖洗液黏度之有 效量γ-聚麩胺酸（γ-PGA)及/或其鹽類；以及b) —用於 γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接受水性載體，用以沖洗患者 之眼部組織》 本發明之另一態樣係關於一種眼科手術沖洗液，其包 括：a)增加該沖洗液黏度之有效量γ·聚麵胺酸（γ-PGA)及/ 或其鹽類；以及b) —用於γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接 201138861 受水性載體。 本發明之再一態樣係關於一種醫藥套組，其包括：a) 如上述之眼科手術沖洗液；以及b) —說明書（package insert) ’其包含印製成的使用指南，以說明沖洗患者眼部組 織之用法。 本發明之更一態樣係關於一種含量足以於眼科手術期 間沖洗患者眼部組織之眼科手術沖洗液，其包括：a)增加 該沖洗液黏度之有效量γ-聚麩胺酸（γ-PGA)及/或其鹽類； 以及b) —用於γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接受水性載 趙’用以眼科手術期間降低壓力對患者眼部組織所引發之 傷害。 下述較佳實施例配合隨附圖式可使該些及其他態樣更 為清楚，但亦可於不悖離該揭露之新穎概念精神及範疇下 進行變化及修飾。 隨附圖式可說明本發明一種以上具體實施例，且配合 文字敘述，可解釋本發明原則。全部圖式盡可能使用相同 元件符號來代表一具體實施例中相同或相似元件。 【實施方式】 基於本發明背景及每一用詞使用之特定背景使用於 本案說明書之用詞通常具有本領域中之一般涵義。用於描 述本發明之某些用詞會於下文或說明書其他地方敘及以 額外引導實施者瞭解本發明内容。為求方便起見，文中會 使用如斜體及/或引號來標顯某些用詞。使用該些標顯並不 會對用詞範圍及涵義造成影響，無論用詞是否被標顯出 201138861 來，相同背景下之用詞範圍及涵義是相同的。相同事物可 藉由一種以上的方式來敛述。因此，此處所敘及之一或多 個用詞可能會使用另一種語言及同義詞來表示，無論是否 對用詞加以闡述或討論’其也不會有任何特別的含意。本 文會提供某些用詞的同義詞。舉出的一或多種同義詞並不 排除使用其他同義詞之可能。本案說明書任何地方所舉出 的舉例’包含此處敘及的任何用詞’只是作為說明用，不 應侷限本發明或示例性用詞之範嘴或涵義。同樣地，本發 明並不限於本案說明書所舉的各種具體實施例。 除非有其他定義，否則此處所使用之技術及科學用詞 涵義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般理解之 涵義相同。若有所差異，則本文（包括定義）會載明。 此處使用之「大約」、「大略」或「接近」一般意指 所提供值或範圍之20%内，較佳為10%内，更佳為5%内。 此處所提供的數值為接近值，亦即，若未特別載明，則表 示其為「大約」、「大略」或「接近」。 當敘及數值或範圍時，本領域具有通常知識者可瞭 解’其意指包含對本發明相關特定領域而言適當合理之範 圍。 就0.32至50厘泊黏度而言，其代表本發明已具體揭露 該範圍中之所有百分之一、十分之一及整數單位值。因此， 0-32、0.33、0.34 . . ·、〇_7、0.8、0.9、1、2、3、4 . 47、 48、49及50厘泊單位值皆包含於本發明之具體實施例中。 就290至320 mOsm滲透壓而言，其代表本發明已具 201138861 體揭露該範圍中之所有整數單位值》因此，290、291、 292 . . .、317、318、319及320 mOsm單位值皆包含於本 發明之具體實施例中。 就1.330至1.344折射率而言’其代表本發明已具體揭 露該範圍中之所有千分之一單位值。因此，i 33〇、1 331、 1.332 ·..、1.340、1.341、1.342、1.343 及 1.344 單位值皆 包含於本發明之具體實施例中。 就10,000 to 2,00〇,〇〇〇道爾頓（Daltons)分子量而言，其 代表本發明已具體揭露該範圍中之所有整數單位值。因 此，10,000、10,001，10,002 、1 999 997、1 999 998、 1，999,999及2,00〇,〇〇〇道爾頓單位值皆包含於本發明之具 體實施例中。 就0.2〜1% (重量/體積，w/v)而言，其代表本發明已具 體揭露該範圍中之所有十分之一及整數單位值。因此，〇2、 〇·3、0·4 . . .、〇.7、0.8、0.9及1%單位值皆包含於本發明 之具體實施例中。 在此所使用之「γ-PGA」一般意指「γ-聚麵胺酸及/或 其鹽類」或「γ-聚麵胺酸醋（gamma-polyglutamate)」。聚楚 胺酸具有2個羧基。其中一個羧基係與α—胺基連接，形 成 PGA。 可交替使用γ-聚（麩胺酸）及γ-聚麩胺酸（γ-PGA)用詞。 在此所使用之「增加沖洗液黏度之有效量」一般意指， 相較於未添加γ-PGA之沖洗液黏度，γ-PGA之存在使沖洗 液黏度增加。 201138861 交聯聚麩胺酸係由數千萬分子量之網狀結構所組成。 相較於PGA ’交聯PGA具有較高的吸水力。交聯聚麵胺酸 分子量大於10,000,000。 在此所使用之「水性生理可接受溶液」一般意指，但 不限於，無菌食鹽或無菌緩衝溶液。 在此所使用之「抗氧化劑」一般意指，可減緩或避免 其他分子氧化之分子。抗氧化劑包括，但不限於，麩胱甘 肽（glutathione)、維他命c及維他命E。 滲透作用係溶劑分子穿過選透膜進入高溶質濃度區域 之移動’俾使兩側的溶質濃度相等。溶劑的淨移動方向係 由較低濃度溶液（低滲透溶液）往較高濃度溶液（高滲透溶 液）。可藉由使高滲透溶液之壓力相對於低滲透溶液來的 兩’以逆轉該作用。渗透壓係指維持平衡之壓力，使溶劑 無淨移動現象。滲透壓係取決於溶質的莫耳濃度而非溶質 本身。滲透作用於生物系統中是極為重要的，許多生物膜 具有半透性。 滲透壓（osmolarity)為溶質濃度之度量單位，其定義為 每公升（L)溶液之溶質滲透莫耳數（〇sm〇is, 〇sm)(即

osmol/L 或Osm/L)。溶液的滲透壓通常表示為〇sm/l^滲透壓係測 量每單位體積溶液之溶質滲透莫耳數。 本發明發現，使用黏彈性材料聚_了_麩胺酸（Y_pGA)作 為沖洗液中之額外成分，可減少眼部手術所造成的傷害。 於as體乳化及吸除（PEA)期間，分散性黏彈性材料可對眼内 組織發揮保護的正面效果^彈性材料可降低眼睛前房及 201138861 後房内之擾動，協助控制眼内組織碎片及氣泡移動❶此外， 此類黏彈性材料有助於移除晶體碎片，使外科醫生更易藉 由外科手術用手持用具之尖端找到碎片。 聚-7*-麵胺酸（γ-PGA)’ 一種麩胺酸（GA)胺基酸之天然 聚合物’可藉由數種細菌、古菌（archaea)及真核生物 (eukaryote)來合成。

聚-7 -麩胺酸具有約1〇,〇〇〇至2百萬範圍之分子量。 其可被製成符合不同應用之條件。已知有食品工業上的應 用。γ-PGA是納豆（一種日本傳統食物）黏液之主要組成份， 其於1937年首次被Ivnovics發現存在炭疽桿菌（BaciUus anthracis )的莢膜中β γ_ρ〇Α係一種特有的聚陰離子性聚合 物，其係由透過γ-醯胺鍵（於α_胺基與γ_羧基之間）連接之D form及/或L form麩胺酸殘基所構成。其為具有親水性、 黏滯性、生物可降解性及無毒的生物材料。基於其特有的 離子捕獲及高吸水特性，其已被廣泛用於各種應用中如 金屬螯合劑、吸收劑、防凍劑、老化抑制劑、藥物載體及 保濕劑。過去幾年，Y_PGA已被廣泛使用作為生物材料， 其具有細微膨脹性。其生物相容性增加於臨床領域上之實 用性’如生物膠、組織工程及藥物傳輸系統。 201138861 本發明發現γ-PGA可調整眼部可接受沖洗液之滲透壓 及黏度°眼科手術沖洗液之適當滲透壓及微黏性可降低併 發症及角膜傷害。本發明係關於使用γ_Ρ〇Α作為眼部可接 受沖洗液或手術溶液添加劑之用途，俾於需要沖洗之手術 期間保護眼睛前房及後房。 γ-PGA係作為調整滲透壓並避免組織水腫之用劑。含 有tPGA之眼部可接受沖洗液滲透壓範圍為290〜320 mOsm 〇 高分子量（1020k道爾頓）Y-PGA可調整沖洗液黏度。理 想黏度可降低晶體乳化術造成的組織傷害。 目前有許多種不同的γ-PGA載體。然而，本發明之沖 洗液載體具有較佳性質係包括電解質、緩衝劑（如碳酸氫 鹽、磷酸鹽或其組合）及能量來源。該些試劑有助於手術期 間維持角膜組織之正常功能，促進術後視力快速回復。然 而，本發明對於平衡鹽溶液或可能用來形成沖洗液之其他 電解質/營養物溶液種類並無限制。 本發明之一態樣係關於一種沖洗患者眼部組織之方 法。該方法包括下述步驟：將足量之眼科手術沖洗液引至 患者的眼部組織，以沖洗患者眼部組織，其中該沖洗液包 括·· a)增加該沖洗液黏度之有效量7_聚麩胺酸（γ_ραΑ)及/ 或其鹽類；及b)—用於γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接受水 性載體。 本發明之另一態樣係關於一種眼科手術沖洗液，其包 括：a)增加該沖洗液黏度之有效量7聚麩胺酸G 及/ 201138861 或其鹽類；及b)—用於γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接受水 性載體。 本發明之再一態樣係關於一種醫藥套組，其包括：a) 如上述之眼科手術沖洗液；及b) —說明書（packageinsert)， 其包含印製成的使用指南’以說明沖洗患者眼部組織之用 法。 於本發明之一態樣中，該沖洗液具有〇.32至5〇、或 0.32至30、或0.32至3.93厘泊之黏度。 於本發明之另一態樣中，該沖洗液具有每升290至320 mOsm之滲透壓。 於本發明之另一態樣中，該沖洗液具有〇·32至5〇、或 0.32至30、或0.32至3.93厘泊之黏度，及每升29〇至32〇 mOsm之渗透壓。 於本發明之另一態樣中，該沖洗液具有L330至1 344 之折射率。 於本發明之另一態樣中，該沖洗液不包含交聯聚麩胺 酸’且不具額外的聚胺基酸或聚合物。 於本發明之另一態樣中，該眼部可接受水性載體包括 一含有電解質之平衡鹽溶液、緩衝劑及能量來源。 於本發明之另一態樣中，γ-PGA於該眼科手術沖洗液 中之濃度範圍為0.2〜1%或0.2〜0.8% (w/v)。 於本發明之另一態樣中’ γ-PGA具有ι〇,〇〇〇至 2’000’000道爾頓或1，〇〇〇,〇〇〇 to 2,000,000道爾頓之分子 量。 201138861 於本發明之再一態樣中，該眼部可接受水性載體更包 括一抗氧化劑。 於本發明之又一態樣中，該發明係關於一種降低眼科 手術中壓力對患者眼部組織造成傷害之方法。該方法包括 下述步驟：將足量之眼科手術沖洗液引至患者的眼部組 織，以沖洗患者眼部組織，其中該沖洗液包括：a)增加該沖 洗液黏度之有效量7-聚麩胺酸（γ-PGA)及/或其鹽類；及b) 一用於γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接受水性載體。 於本發明之另一態樣中，該眼科手術包括玻璃體切除 術（surgical vitrectomy)、白内障摘除術（cataract extraction)、晶體吸除術（lens aspiration)、眼前段重建術 (anterior segment reconstruction)及晶體乳化術 (phacoemulsification) 〇 實施例 本發明具體實施態樣之示例性儀器、設備、方法及其 相關結果如下所述，其並不侷限本發明之範疇。需留意的 是，為方便讀者理解，實施例可能會使用標題或副標題， 但皆不應侷限本發明之範疇。此外，在此提出及揭露的某 些理論，無論對錯與否，皆不應侷限本發明之範疇，只要 本發明可據以實施即可，無需探討任何特定理論或作用機 制。 材料及方法 材料及試劑 若未特別註明，所有材料及試劑皆購自 12 201138861

Sigma-Aldrich公司（美國密蘇里州聖路易市）。聚-χ-麵胺 酸（分子量為1020k Da)係購自VEDAN企業股份有限公司。 滲透壓儀標準品係由Advanced Instruments公司（美國麻州 諾伍德市）提供。 抗生素、騰蛋白酶及胎牛血清係由Invitrogen (美國 加州卡爾斯巴市）提供。細胞培養盤及培養槽係由Orange Scientific(比利時布賴恩拉勒）提供。快速細胞增生分析套組 係購自BioVision (美國加州），而細胞毒性分析係購自 Promega (CytoTox 96 Assay kit,美國威斯康辛州）》牛角膜 内皮細胞（bCE cel丨s)及人類視網膜色素上皮細胞（hRPE cells)係來自細胞科學國家中心（台灣新竹食品工業發展研 究所）。 方法 沖洗液滲透壓評估 使用Advanced Instrument公司所生產之3D3單次樣 品渗透壓儀（3D3 Single-Sample Osmometer)測量溶液渗透 壓。製備含有不同濃度 7 -PGA(0.2%，0.4%，0.6%，0·8%，1%) 之沖洗液及不含7* -PGA之控制組，以評估r -PGA的影響。 使用校正標準品（每升1〇〇及1500 mOsm)，對滲透壓儀進 行校正。含有T -PGA之沖洗液pH值為7.4±0.1。使用碳酸 氫鈉作為pH緩衝劑，並使用二次蒸餾水來製備沖洗液。 沖洗液黏度評估 使用具有平行板（parallel plate geometry)配件的旋轉 流變儀之 HAAKE RheoStress 600 (Thermo Fisher Scientific 13 201138861

Inc., Waltham, MA, USA)儀器評估沖洗液黏度。藉由控制單 元來控制溫度。於室溫（25°C)及體溫（37°C)兩種工作溫度下 進行評估。將上部不鏽鋼板（直徑為35mm)及底部不鏽鋼板 間之間隔高度調整為1.05 mm。藉由速控旋轉斜面模式 (controlled rate rotation ramp mode)，測得沖洗液的黏度曲 線。剪切率範圍係由Is·1至500s·1。 沖洗液折射率評估 使用DR-A1折射儀（日本ATAGO)測量折射率（RI)。 於室溫下製備含有0.2、〇.4、0.6、0.8及1%(重量/體積， w/v)«r -PGA之沖洗液，並小心置放於棱鏡上。當透過接目 鏡察看時’轉動控制鈕直到陰影線位於十字準線中心。再 由數位螢幕得知折射率。 T -PGA生物相容性評估 將不同濃度的r -PGA加至細胞培養液中，以評估生 物相容性。以200毫升的細胞培養液對單層角膜内皮細胞 及視網膜色素内皮細胞作測試。以5 X1 〇3細胞/孔之細胞密 度，將細胞接種於96孔組織培養盤上，於37。(：立5%二氧 化碳培養條件下’使細胞貼附於培養盤底部隔夜後，對負 控制組（以Ah。3萃取的細胞培養液）、正控制組（含〇. 1 % Triton X-100之細胞培養液）及實驗組（含〇 2%，〇 4%，0.6%， 0.8¾及1 % γ -PGA之細胞培養液）之測試組進行六重複測 試。於37。<：下培養24小時及72小時後，使用快速細胞增 生分析套組 II(Quick Cell Proliferation Assay Kit II)及 CYTOTOX 96®非放射性細胞毒性分析（CYT〇T〇x 96® 201138861

Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)，對細胞存活率及細胞 毒性進行定量分析。 於培養72小時後，將測試培養液換掉，且每孔改換 成0.2 ml水溶性四哇氣鹽_8(tetrazolium-8，WST-8)工作溶 液，以進行細胞存活率評估。於培養2小時後’由於細胞 線粒體脫氫酶（cellular mitochondrial dehydrogenases)會使 四嗤氮鹽裂解形成甲膜（formazan)，故WST-8工作溶液之 顏色會改變。藉由光譜儀，讀取450 nm位置上的訊號，以 對角膜内皮細胞及視網膜色素内皮細胞之存活率進行定量 分析》參考波長為65〇 nm。 將0·05 ml培養液移入96孔ELSA盤中，並與0.05 ml 的基質混合液（substrate mix)混合，再避光培養30分鐘，以 進行細胞毒性評估。基質混合液（substrate mix)中的四峻氮 鹽會與乳酸脫氣酶（lactate dehydrogenase, LDH)反應，以形 成紅色甲賸（formazan)產物。藉由光譜儀，讀取450 nm位 置上的訊號’對釋入培養液中之LDH進行定量評估。另外 也對未培養細胞的培養液進行分析，以作為培養液的背景 值。使用細胞溶解液（1% TRITON® X-100)，對角膜内皮細 胞及視網膜色素内皮細胞進行細胞溶解，並讀取OD490值。 細胞毒性百分比如下所示：

細胞毒性（％)=(培養液O.D.-空白O.D.)/(總溶解 O.D.-空白 OD.kWO 螢光染色

對於含有0.2、0.4、0.6、0.8及1%(重量/體積）γ-PGA 15 201138861 之細胞培養液中的細胞進行1天及3天的染色，分別使用 LIVE/DEAD 染色套組（Molecular Probes # L3224, Eugene， Oregon，USA)染色，並使用NIS Element軟體拍攝。 7 -聚（麩胺酸）類眼科手術沖洗液之體内研究 對三隻紐西蘭白兔（2〜3 kg)的六隻眼睛進行試驗。肌肉 注射 ketalar/Chanazine 2% (Ketamine : 22 mg/kg BW ; Xylazine : 4-6 mg/kg BW)進行全身麻醉後，執行手術。於 手術顯微鏡下，將兩支靜脈留置針（vein detained needle)小 心穿過角膜而不碰到晶體（圖8A)»將其中一支靜脈留置針 與填滿試驗眼科沖洗液的瓶子連接，而另一支則與空瓶連 接（圖8B)。使用蠕動幫浦（流速為5mL/min)，於37°C下用 沖洗液對角膜内皮進行灌注60分鐘（圖8B)。右眼使用 0.4%(重量/體積）之r -聚（麩胺酸）類眼科手術沖洗液沖洗， 而左眼使用生理食鹽水沖洗。於灌注期間，每隔5至10分 鐘測量角膜厚度。 角膜厚度測量 使用具有手控變換器之超音波角膜厚度測量儀 (ultrasonic pachymeter) DGH 550 (DGH Technology)，測量 中心處的角膜厚度。DGH 550係使用回音突波技術（echo spike technique )測量角膜厚度之超音波角膜厚度測量儀。 於灌注期間，超音波角膜厚度測量儀每隔5至10分鐘會測 量角膜厚度。 統計分析 至少作三次統計分析，其結果以平均值±標準差（SD) 201138861 來表示。藉由變異數分析（analysis of variance，簡稱ANOVA) 來評估γ-PGA於生物相容性上的影響。值小於0.05表示 有統計學上的明顯差異。 結果 含γ-PGA沖洗液之滲透壓 右旋糖（dextrose)及γ -PGA對沖洗液滲透壓的影響 分別如圖1Α及1Β所示。表1則顯示含右旋糖之沖洗液組成 (圖1A)及含τ -PGA之沖洗液組成（圖1B)。 表1 組成份 (mM) 含右旋糖之沖洗液 含y -PGA之沖洗液 NaCl 122 122 KC1 5.08 5.08 CaCl2 1.05 1.05 MgCl2 0.98 0.98 NaHC03 25.0 25.0 Na2HP04 3.0 3.0 HCi 或 NaOH 調整pH值至7.2〜7.4 調整pH值至7.2〜7.4 左旋糖 0〜1 - 7 -PGA - 0 〜1(0/〇) 含 5mM右旋糖及0.2、0.4、0.6、0.8及 1% «τ -PGA之 沖洗液滲透壓分別為304、309、314、3 19及325 mOsm(圖 1C)。當τ -PGA濃度由1%降至0.2%時，含5mM右旋糖之沖 洗液滲透壓由325降至304 mOsm。然而，含1、2、3、4、 17 201138861 5mM右旋糖但不含r _PGA之沖洗液滲透壓分別為295、 296、296、298、300 mOsm (圖1A)。因此，右旋糖對沖洗 液滲透壓的影響小於Y-pGA。 含r -PGA之沖洗液黏度 圖2顯示γ-PGA會使沖洗液黏度呈濃度依賴型增加， 而5 mM右旋糖並不會對黏度造成影響。含5mM右旋糖及〇, 0.2、0.4、0.6、0.8或1% r -PGA之沖洗液黏度於室溫下（25。〇 分別為0.62、1.15、1_72、2.39、3.11及3.93厘泊（〇?)(表2)。 當溫度提高至體溫（37°C)時’沖洗液黏度會下降。含5mM 右旋糖及〇、0.2、0.4、0.6、0.8或1% γ-PGA之沖洗液黏度 於37。(：下分別為0.32、0.75、1.20、1.73、2.33及2.96 cP(表 3)。 含γ-PGA之沖洗液折射率 含0_25、0.5、0.75及1% (w/v)y-PGA之沖洗液折射率 分別為1.3346、1.3350、1.3355及1.3360(圖3)。沖洗液之組 成包括 122 mM NaC卜 5.08 mM KC卜 1.05 mM CaCl2、0.98 mM MgCl2、25·0 mM NaHC03、3.0 mM Na2HP04、0〜1% (w/v)γ-PGA、及用來將pH值調至7.2〜7.4之HCl或NaOH。 表2 25°C下之黏度（cP) γ-PGA (%) 右旋糖濃度 0 mM 5 mM 0 0.59 0.62 201138861 0.2 1.11 1.15 ' 0.4 1.71 1.72 0.6 2.39 2.39 0.8 3.16 3.11 1.0 3.98 3.93 表3 37°C下之黏度（cP) γ-PGA (%) 右旋糖濃度 0 mM 5 mM 0 0.48 0.32 0.2 0.70 0.75 0.4 1.26 1.20 0.6 1.84 1.73 0.8 2.36 2.33 1.0 3.01 2.96 γ-PGA生物相容性 於含γ-PGA之培養液中培養牛角膜内皮細胞（bcE cells)及人類視網膜色素上皮細胞（hRPE cells)，並於第1天 及第3天時，使用WST-8及LDH分析評估細胞存活率及細胞 毒性（圖4A-B及圖5A-B)。WST-8分析係用來測量存活細胞 的數量。以 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%及 l%(w/v)y-PGA處理 bCE細胞，且於第1天測得取自bCE細胞之培養液〇]〇45<)謂分 別為 0.20 ± 〇.〇2、0.19 土 0.02、0.20 ± 0.02、0.19 ± 0.01 及 0.17 土 0.04 ;而第 3天分別為 0.53 ± 0.05、0.47 ± 0.04、0.46 19 201138861 ±0.10、0.44±0.(^0.41±0·03(^Α)〇α〇2%、〇4〇/〇、 0·6〇/。、0.8%及 l〇/〇(w/v)Y_PGA處理hRpE細胞，且於第1天測 得取自hRPE細胞之培養液〇D45〇nm分別為〇 47 土 〇 〇5、〇 5 i ± 0.05、0.52 ± 0.02、0.51 ± 〇.〇6及0.47 ± 〇.〇7，而第 3天分別 為 0.88 ± 0.08、0.88 ± 0.03、0.81 ± 〇.〇7、0.78 ± 0.09及 0.79

± 0.10(圖 4B)。濃度為 0.2 至 1〇/〇2γ_ρ〇Α 對 bCE 細胞及 hRpE 細胞存活率沒有影響。 對細胞膜損害或破裂進行定量分析，以測定細胞死 亡狀況。LDH細胞毒性測試係一種測定死亡及細胞膜損害 細胞之比色測定法。因細胞膜損害而存在培養上清液中之 LDH會參與偶合反應，將黃色四唑氮鹽轉變成紅色的甲臢 型染料’其可於492 nm處測得吸收峰。曱牘含量會與培養 液中之LDH含量呈正比，進而與死亡或損害細胞數量呈正 比。第 1 天所測得之0.2%、0.4%、0.6%、0.8%及 1% γ-PGA 培養液中bCE細胞毒性百分比分別為7.77 士 3.5%、8.90 士 3.5%、5.76 士 2,8%、10.86 ± 2.8°/〇及 10.65 士 2.5¾ ;而第 3天 分別為 16.11 ± 5.8%、12.11 ± 6.6%、8.66 ± 4.0%、4.61 ± 3.7〇/〇 及2.76 ± 0.4%。第 1天所測得之〇.2〇/0、〇.40/0、0.6%、0.8% 及1% γ-PGA培養液中hRPE細胞毒性百分比分別為2.97 土 0.6%、2.74 ± 0.4%、3.95 ± 1.0〇/〇、2.99 ± 1.0%及 4.78 ± 0.9% ; 而第 3天分別為 2.85 ± 0.3%、2.77 ± 1.5%、3.74 土 1.5%、8.11 ± 1.9%及10.37 ± 0.9%。含γ-PGA培養液與負控制組間並無 明顯差異（圖5A-B)。細胞毒性百分比，以死亡細胞數量除 以總細胞數量來表示，其係如下式算得：細胞毒性（％)=(培 20 201138861 養液O.D.-空白O.D.)/(總溶解O.D.-空白〇.D_)xlOO。 細胞螢光染色 存/亡細胞染色套組（Live/Dead staining kit)係使用妈黃 綠素-AM(calcein-AM)及乙鍵（ethidium homodimer，EthD-1) 兩種螢光染劑。鈣黃綠素-AM係一種廣泛使用之綠色螢光 細胞標記且具有可透膜性。一旦鈣黃綠素·ΑΜ(非螢光分子） 進入細胞中，就會被細胞内的酯酶水解成帶負電的綠色螢 光妈黃綠素。勞光#5黃綠素會留在活細胞的細胞質中。此 為細胞存活率終點測定。藉由485 nm激發波長及530放光 波長來觀察螢光訊號。測定時所產生的螢光訊號會與樣品 中存活細胞數量呈比例關係。死亡細胞具有損害的細胞 膜。乙錠（EthD-Ι)會進入損害細胞，且與核酸鍵結時會放出 螢光。EthD-1會於損害或死亡細胞中產生亮紅色螢光。結 果顯示，含γ-PGA培養液中之bCE及Hrpe細胞幾乎全部 存活（圖6A-B及7A-B)。 含γ-PGA之沖洗液對角膜厚度的影像 透過兩支穿入兔眼之靜脈留置針進行沖洗液眼内灌 注，並於灌注期間測量角膜厚度（圖8A) ^藉由蠕動幫浦來 驅動沖洗液之流動（圖8B)。於開始灌注2〇分鐘期間，角膜 厚度增加。圖9顯示，相較於生理食鹽水測試組，使用含丫_ 聚（麩胺酸）類眼部溶液沖洗測試組之角膜厚度變化明顯較 小。生理食鹽水沖洗測試組及含〇4%(w/vh聚（麩胺酸）溶 液沖洗測試组之角膜厚度變化分別為47叫及32 μπι。插入 靜脈留置針所導致的傷害可能是_厚度—開始增加的原 21 201138861 因。之後，使用γ-聚（麩胺酸）類眼科手術沖洗液持續灌注角 膜1小時期間’角膜厚度只些微增加約36μηι(圖相反的， 使用生理食鹽水持續灌注角膜6〇分鐘期間，角膜厚度呈現 持續增加的狀況’灌注1小時後，角膜厚度增加約58 μπι， 與使用γ-聚（麩胺酸）類眼科手術沖洗液沖洗之測試組比 較’其大約增加到1.6倍。 【圖式簡單說明】 圖1Α至1C係顯示γ-PGA及右旋糖濃度對沖洗液滲透壓之影 響。 圖2係γ-PGA影響沖洗液滲透壓之圖式。 圖3係γ-PGA影響沖洗液折射率之圖式。 圖4A-4B顯示γ-PGA對細胞生長無顯著的影響’（A)牛角膜 内皮細胞，（B)人類視網膜色素上皮細胞。 圖5A-5B顯示γ-PGA對細胞無顯著的毒害影響，（A)牛角膜 内皮細胞，（B)人類視網膜色素上皮細胞。 圖6-7顯示染劑染色細胞之顯微照片，於螢光顯微鏡下同時 觀察含有或未含γ-PGA培養後之存活細胞及死亡細胞，（6a) 培養1天之牛角膜内皮細胞，（6B)培養1天之牛角膜内皮細 胞’（7A)培養1天之人類視網膜色素上皮細胞，（7B)培養3 天之人類視網膜色素上皮細胞，負控制組：氧化鋁（Al2〇3) 萃取培養液；正控制組：含Triton X-100 (0,1%)之DMEM/F12 培養液。 圖8A顯示兩支靜脈留置針插入兔眼中。 22 201138861 圖8B顯示藉由蠕動幫浦進行沖洗液灌注。 圖9顯示眼部沖洗期間之角膜厚度變化圖。 【主要元件符號說明】 無。 23

Claims (1)

1. 201138861 七、申請專利範圍： 1. 一種含量足以沖洗患者眼部組織之眼科手術沖洗 液，包括： a) 增加該冲洗液黏度之有效量丫_聚麵胺酸（γ_ρ〇Α)及/ 或其鹽類；以及 b) —用於γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接受水性載 體，用以沖洗患者之眼部組織。 2. 如申請專利範圍第1項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該沖洗液具有0.32至50、或0.32至30、或〇32至3 93厘 泊之黏度。 3. 如申請專利範圍第1項所述之眼科手術沖洗液其 中，該沖洗液具有每公升290至320 m0sm之滲透壓。 4. 如♦請專利範圍第1項所述之眼科手術沖洗液其 中，該沖洗液不含交聯聚麵胺酸且不具有額外的聚胺基酸 或聚合物》 5. 如申請專利範圍第丨項所述之眼科手術沖洗液其 中’該沖洗液具有1.330至1.344之折射率。 6. 如申請專利範圍第1項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該眼部可接受水性載體包括一含有電解質之平衡鹽溶 液、—緩衝劑及一能量來源。 7· —種眼科手術沖洗液，包括： a) 増加該冲洗液黏度之有效量γ_聚麵胺酸（γ — PGA)及/ 或其鹽類；以及 b) —用於γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接受水性載體。 24 201138861 8. 如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該沖洗液具有0.32至50、或0.32至30、或〇32至3 93厘 泊之黏度。 9. 如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該沖洗液具有每公升290至320 m0sm之滲透壓。 10. 如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液，其 中’該沖洗液具有1.330至1.344之折射率。 11. 如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該沖洗液不含交聯聚麩胺酸且不具有額外的聚胺基酸 或聚合物。 12. 如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液其 中，該眼部可接受水性載體包括一含有電解質之平衡鹽溶 液、一緩衝劑及一能量來源。 13 ·如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該γ-PGA具有1〇，_至2,000，_道爾頓或1〇〇〇，_ t〇 2,〇〇〇,〇〇〇道爾頓之分子量。 H 一種醫藥套組，其包括： a) 如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液；以及 b) —說明書（package insert)，其包含印製成的使用指 南，以說明沖洗患者眼部組織之用法。 15. —種含量足以於眼科手術期間沖洗患者眼部組織 之眼科手術沖洗液，包括： a)增加該沖洗液黏度之有效量聚麩胺酸（γ·ρ(3Α)及/ 或其鹽類；以及 25 201138861 b) —用於γ-PGA及/或其鹽類之眼部可接受水性載 體’用以眼科手術期間降低壓力對患者眼部組織所引發之 傷害。 16. 如申請專利範圍第15項所述之眼科手術沖洗液，其 中’該眼科手術包括玻璃體切除術（surgical vitrectomy)、白 内障摘除術（cataract extraction)、晶體吸除術（lens aspiration)、眼前段重建術（anterior segment reconstruction) 及晶趙乳化術（phacoemulsification)。 17. 如申請專利範圍第1項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該沖洗液具有0.32至3.93厘泊之黏度》 18. 如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該沖洗液具有0.32至3.93厘泊之黏度》 19. 如申請專利範圍第7項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該眼部可接受水性載體更包括一抗氧化劑。 20. 如申請專利範圍第8項所述之眼科手術沖洗液，其 中，該沖洗液具有每公升290至320 mOsm之滲透壓。 八、圖式（請見下頁）： 26