JP2013523831A - γ−ポリグルタミン酸に基づく眼灌流液 - Google Patents

Abstract

患者の眼組織を灌流するのに十分な量の眼灌流液であって、（ａ）上記液の粘度を増加させるのに有効な量のγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びに（ｂ）上記γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための、眼科的に許容可能な水性賦形剤であって、患者の眼組織の灌流に用いるための水性賦形剤を含む、眼灌流液が開示される。眼科手術中において患者の眼組織に対するストレス誘導性損傷を低減するのに用いるため眼灌流液及び医薬キットもまた開示される。

Description

本発明は、一般に眼科用溶液に関するものであり、より詳細には眼灌流液に関する。

灌流液は、水晶体乳化吸引術、硝子体切除術及び緑内障手術などの眼内手術に広く使用されている。水晶体乳化吸引術は、白内障と呼ばれる混濁を発症している眼の水晶体を除去するための手術である。硝子体切除術は、眼から硝子体液の一部又は全てを除去するための手術である。緑内障手術は、レーザー治療や眼圧を下げるために眼に切り込みを入れることを伴う。台湾中央健康保険局（National Health Insurance Department）の報告によると、台湾では、約１５０，０００件の眼科手術が１年間で行われた。眼内手術の効果は、使用された灌流液と関係がある。不適切な灌流液は角膜や水晶体に損傷を与え、その結果、視力の低下、盲点、さらには失明にさえ至る可能性がある。

所望される灌流液は、房水に近い組成と２９０ｍＯｓｍ〜３２０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有するものとされている。灌流液の主な機能は、内皮細胞の保全、角膜の厚さ及び網膜組織の維持である。さらに、適切な灌流液は、白内障手術中の角膜内皮細胞の生存率を保持し、エネルギー源（即ちグルコース）を提供し、適切な等張性と電解質濃度とを維持し、かつ、ｐＨ値の変動から角膜内皮細胞を保護しなければならない。

眼内灌流には、平衡塩類溶液（Balanced Salt Solution; BSS⁽登録商標⁾）及びBSSプラス(BSS PLUS⁽登録商標⁾)が頻繁に用いられている。BSSプラス(BSS PLUS⁽登録商標⁾)の組成は房水に近い。基本的に、BSSプラス(BSS PLUS⁽登録商標⁾)の組成は、１）適切な緩衝剤（即ち重炭酸塩）、２）エネルギー源（即ちグルコース）、３）７から８の間の安定なｐＨ値（即ちＨＥＰＥＳ）、４）抗酸化物質（即ちグルタチオン）の４つの部分を有する。しかしながら、これらの眼内灌流液は、眼科手術における物理的な損傷を最も受けやすい角膜（内皮）細胞を保護するには十分に有効ではない。複数の研究から、水晶体乳化吸引術のような高度な眼内手術は、合併症を引き起こす可能性があることが示されている。合併症を引き起こす可能性のあるいくつかの原因としては、超音波による機械的な影響、吸引されなかった水晶体の破片によって引き起こされる物理的な外傷、熱の発生及び灌流液によって引き起こされる浸透圧の異常が含まれる。これらは全て、角膜内皮の損傷を引き起こす可能性があり、かつ、不可逆的な水疱性角膜症を引き起こすリスクさえも有する場合がある。

従って、当該分野には、上述の欠点や不備に対処する、これまで取り組まれていないニーズが存在し、とりわけ、眼内組織、特に角膜（内皮）細胞を保護するために向上した機能を有する眼灌流液の開発に関するニーズが存在する。

一の態様において、本発明は、患者の眼組織を灌流するのに十分な量の眼灌流液であって、（ａ）上記液の粘度を増加させるのに有効な量のγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びに（ｂ）上記γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための、眼科的に許容可能な水性賦形剤であって、患者の眼組織の灌流に用いるための水性賦形剤を含む、眼灌流液に関する。

別の態様においては、本発明は、眼灌流液であって、（ａ）上記灌流液の粘度を増加させるのに有効な量のγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びに（ｂ）上記γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための、眼科的に許容可能な水性賦形剤を含む、眼灌流液に関する。

さらに別の態様においては、本発明は、ａ）上述の眼灌流液、並びにｂ）印刷された説明であって、患者の眼組織を灌流するための説明を含む添付文書を含む、医薬キットに関する。

さらに別の対応においては、本発明は、眼科手術中に患者の眼組織を灌流するのに十分な量の眼灌流液であって、（ａ）上記溶液の粘度を増加させるのに有効な量のγ‐ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びに（ｂ）上記γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための、眼科的に許容可能な水性賦形剤であって、眼科手術中において患者の眼組織に対するストレス誘導性損傷を低減するのに用いるための水性賦形剤を含む、眼灌流液に関する。

これらの態様並びにその他態様は、以下の図面を併用した、好ましい態様の以下説明により明らかになるが、本開示の新規概念の精神及び範囲から逸脱すること無く、その変形及び改変を施すことが出来る。

添付の図面は、本明細書と併せて本発明の１以上の実施形態を説明するものであり、本発明の原理を説明するものとなる。一の実施形態の同じ又は類似の構成要素を参照するために、可能な限り、全図面を通して同じ参照番号を用いた。

図１Ａ〜Ｃは、灌流液のオスモル濃度に対するγ−ＰＧＡ濃度及びデキストロース濃度の効果を示す。 図２は、灌流液の粘度に対するγ−ＰＧＡの影響を示すグラフである。 図３は、灌流液の屈折率に対するγ−ＰＧＡの影響を示すグラフである。 図４Ａ、Ｂは、γ−ＰＧＡが細胞増殖に対して有意な影響を及ぼさなかったことを示す。図４Ａはウシ角膜内皮細胞について示す。図４Ｂはヒト網膜色素上皮細胞について示す。 図５Ａ、Ｂは、γ−ＰＧＡが細胞に対して有意な細胞毒性を有しなかったことを示す。図５Ａはウシ角膜内皮細胞について示す。図５Ｂはヒト網膜色素上皮細胞について示す。 図６は、γ−ＰＧＡを加えて又は加えずに培養した後に生存細胞と死細胞とを同時に検出するための色素で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真コレクションである。図６Ａは１日間培養したウシ角膜内皮細胞である。陰性対照はアルミナ（Ａｌ₂Ｏ₃）抽出培地、陽性対照はトリトンＸ−１００（Triton x-100）（０．１％）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地。 図６は、γ−ＰＧＡを加えて又は加えずに培養した後に生存細胞と死細胞とを同時に検出するための色素で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真コレクションである。図６Ｂは３日間培養したウシ角膜内皮細胞である。陰性対照はアルミナ（Ａｌ₂Ｏ₃）抽出培地、陽性対照はトリトンＸ−１００（Triton x-100）（０．１％）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地。 図７は、γ−ＰＧＡを加えて又は加えずに培養した後に生存細胞と死細胞とを同時に検出するための色素で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真コレクションである。図７Ａは１日間培養したヒト網膜色素上皮細胞である。陰性対照はアルミナ（Ａｌ₂Ｏ₃）抽出培地、陽性対照はトリトンＸ−１００（Triton x-100）（０．１％）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地。 図７は、γ−ＰＧＡを加えて又は加えずに培養した後に生存細胞と死細胞とを同時に検出するための色素で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真コレクションである。図７Ｂは３日間培養したヒト網膜色素上皮細胞である。陰性対照はアルミナ（Ａｌ₂Ｏ₃）抽出培地、陽性対照はトリトンＸ−１００（Triton x-100）（０．１％）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地。 図８Ａは、ウサギの眼に挿入した、２本の管装着針を示す。図８Ｂは、ペリスタポンプを使用した、灌流液の灌流を示す。 図９は、眼灌流を行っている間の角膜厚さの変化を示すグラフである。

定義
本明細書で使用される用語は、本発明の背景において、及び各用語が用いられる特定の文脈において、当該分野における通常の意味を一般に有する。本発明を説明するために用いられる特定の用語は、以下で、又は明細書中のその他個所で説明され、本発明の説明に関し、実施者にさらなる指針を提供する。便宜上、例えばイタリック体及び／又は引用符を用いて、特定の用語を強調する場合がある。強調の使用は、その用語の範囲及び意味になんら影響を与えず、強調してもしなくても、その用語の範囲と意味は同じ文脈においては同じである。当然のことながら、同じ事柄を２つ以上の言い回しで記載することができる。従って、本明細書で説明される１以上のいずれかの用語に対して別の言葉や同義語を用いてもよく、本明細書においてある用語が詳細に述べられ又は説明されていてもいなくても、なんら特別な意味をもたない。特定の用語には同義語が提供される。１以上の同義語の詳説は、他の同義語の使用を排除するものではない。本明細書で議論される任意の用語の例を含む、本明細書における例の使用は、説明のためだけのものであり、本発明や例示した用語の範囲及び意味を何ら制限するものではない。同様に本発明は、本明細書で示した様々な実施形態に限定されるものではない。

別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。不一致が生じる場合には、定義を含め、本明細書が規定する。

「前後(around)」、「約(about)」又は「およそ(approximately)」は、本明細書で用いられる場合、通常、与えられる数値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。本明細書で示される数量は，およその数であり、明示されていない場合であっても、「前後」、「約」又は「およそ」の用語が推測できることを意味している。

本明細書において、ある数値又はある範囲が示されている場合には、当業者は、それが本発明に関わる特定の分野の適切で妥当な範囲を包含することを意図していることが理解する。

粘度が０．３２〜５０センチポアズであるとは、この範囲内にある全ての百分の一、十分の一及び整数の単位量が、本発明の一部として具体的に開示されることを意味する。従って、０．３２、０．３３、０．３４・・・及び０．７、０．８、０．９、並びに１、２、３、４・・・４７、４８、４９及び５０センチポアズ単位量が、本発明の実施形態として含まれる。

オスモル濃度が２９０〜３２０ｍＯｓｍであるとは、この範囲内にある全ての整数の単位量が本発明の一部として具体的に開示されることを意味する。従って、２９０、２９１、２９２・・・並びに３１７、３１８、３１９及び３２０ｍＯｓｍ単位量が、本発明の実施形態として含まれる。

屈折率が１．３３０〜１．３４４であるとは、この範囲内にある全ての千分の一の単位量が本発明の一部として具体的に開示されることを意味する。従って、１．３３０、１．３３１、１．３３２・・・並びに１．３４０、１．３４１、１．３４２、１．３４３及び１．３４４単位量が、本発明の実施形態として含まれる。

分子量が１０，０００〜２，０００，０００ダルトンであるとは、この範囲内にある全ての整数の単位量が本発明の一部として具体的に開示されることを意味する。従って、１０，０００、１０，００１、１０，００２・・・並びに１，９９９，９９７、１，９９９，９９８、１，９９９，９９９及び２，０００，０００ダルトン単位量が、本発明の実施形態として含まれる。

０．２〜１％（ｗ／ｖ）とは、この範囲内にある全ての十分の一及び整数の単位量が本発明の一部として具体的に開示されることを意味する。従って、０．２、０．３、０．４・・・並びに０．７、０．８、０．９及び１％単位量が、本発明の実施形態として含まれる。

「γ−ＰＧＡ」は通常、本明細書で用いられる場合、「γ−ポリグルタミン酸及び／又はその塩」或いは「γ−ポリグルタミン酸塩(gamma-polyglutamate)」を意味する。グルタミン酸は、２つのカルボキシル基を有する。それらの内の１つのγ−カルボキシル基はα−アミノ基に結合しており、ＰＧＡが形成される。

γ−ポリ（グルタミン酸）と言う用語と、γ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）と言う用語とは代替可能である。

「灌流液の粘度を増加させるのに有効な量で」と言う用語は、本明細書で用いられる場合、当該灌流液の粘度が、γ−ＰＧＡを含まない灌流液の粘度と比較して、γ−ＰＧＡの存在下において増加されていることを意味する。

架橋ポリグルタミン酸は、分子量が数千万の網目構造をもつ。ＰＧＡと比較して、架橋ＰＧＡは水を吸収する能力が高い。架橋ポリグルタミン酸の分子量は１０，０００，０００を越える。

「水性の生理学的に許容可能な溶液」とは、本明細書で用いられる場合、通常、無菌食塩水又は無菌緩衝液を意味するが、これらには限定されるものではない。

「抗酸化物質」は、本明細書で用いられる場合、他の分子の酸化を遅延させる又は防止することができる分子である。抗酸化物質には、グルタチオン、ビタミンＣ、及びビタミンＥが含まれるが、これらに限定されるものではない。

浸透性とは、二つの側の溶質濃度を均等にすることを目的として、選択的透過性の膜を介して溶媒分子が高い溶質濃度の領域に移動することである。溶媒の正味移動は、より濃度の低い（低張）溶液からより濃度の高い（高張）溶液に向かい、これにより濃度差が減少する傾向にある。この効果は、低張液に対して、高張液の圧力を増加させることによって相殺され得る。浸透圧とは、溶媒の正味移動を伴わず、平衡を維持するのに必要とされる圧として定義される。浸透圧は、溶質のモル濃度に依存するが、溶質が何であるのかには依存しない。浸透性は、多くの生体膜が半透性であるため、生体系において重要である。

オスモル濃度は溶質濃度の指標であり、溶液１リットル（Ｌ）当たりのオスモル（Ｏｓｍ）数として定義される（ｏｓｍｏｌ／Ｌ又はＯｓｍ／Ｌ）。溶液のオスモル濃度は一般に、Ｏｓｍ／Ｌで表される。オスモル濃度は、溶液の単位容積当たりの溶質粒子のオスモル数を測定する。

本発明は、眼科手術によって生じる損傷を低減させるための灌流液における付加成分として粘弾性材料であるポリ−γ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）を発見したことに関する。分散性粘弾性材料は、水晶体乳化吸引術（ＰＥＡ）の間に眼内組織を保護するのにプラスの効果をもたらす。粘弾性材料は、前眼房及び後眼房中の乱流を減少させることができ、眼内で組織断片及び気泡が移動することを生じさせるのを補助する。加えて、そのような種類の粘弾性材料は、水晶体破片の除去を促進し、執刀医が手術道具の先端で破片を追跡するのを容易にし得る。

ポリ−γ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）は、アミノ酸であるグルタミン酸（ＧＡ）の天然ポリマーであり、複数種の細菌（全てグラム陽性）、１種の古細菌及び１種の真核生物によって合成される。

ポリ−γ−グルタミン酸の分子量は、約１０，０００から最大で２００万の範囲である。これらを異なる応用への要求を満たすように製造することができる。食品産業における応用がよく知られている。γ−ＰＧＡは、「納豆」（日本の伝統食品の１つ）の粘液の主成分であるが、１９３７年にイブノビクス(Ivnovics)により初めて、炭疽菌（バチラス・アンスラシス；Bacillus anthracis）の莢膜として発見された。γ−ＰＧＡは、（α−アミノ基とγ−カルボキシル基の間における）γ−アミド結合によって結合したＤ型及び／又はＬ型のグルタミン酸残基から構成される、独特なポリアニオンポリマーである。γ−ＰＧＡは、親水性で、粘性をもち、生分解性で、かつ非毒性の生体材料である。イオン捕捉と高い水分吸収能をもつ独自の性質から、γ−ＰＧＡは、金属キレート、吸収剤、抗凍結剤、劣化防止剤、薬剤担体及び湿潤剤などの多様な応用で用いられている。ここ数年は、γ−ＰＧＡは、高い膨潤能力を有する生体材料として広く用いられている。γ−ＧＰＡの生体適合性は、γ−ＰＧＡを、生体糊（bioglue）、組織工学及び薬剤送達系などの臨床分野において利用可能にする。

本発明は、γ−ＰＧＡが、眼科的に許容可能な灌流液のオスモル濃度及び粘度を調整する能力を有すると言う発見に関するものである。眼灌流液の適切なオスモル濃度及び僅かな粘度は、合併症と角膜の損傷を低減することができる。本発明は、眼科的に許容可能な灌流液又は手術用溶液のための添加剤としてのγ−ＰＧＡの使用であって、該添加剤は灌流を必要とする手術中に前眼房及び後眼房を保護するための添加剤である、上記使用に関する。

γ−ＰＧＡは、オスモル濃度を調整し、かつ組織の浮腫現象を防止するための物質として機能する。γ−ＰＧＡが存在する眼科的に許容可能な灌流液のオスモル濃度は、２９０〜３２０ｍＯｓｍの範囲である。高分子量（１０２０キロダルトン）のγ−ＰＧＡは、灌流液の粘度を調整する能力を有する。最適粘度は、水晶体乳化吸引術によって生じる組織損傷を低減することができる。

γ−ＰＧＡのための様々な種類の賦形剤を用いることができる。しかしながら、賦形剤は好ましくは、電解質、緩衝剤（例えば、重炭酸塩、リン酸塩又はそれらの組合せ）、及びエネルギー源を含有する。これらの薬剤は、手術中の角膜組織の正常な機能の維持を補助し、手術後の迅速な視力の回復を促進する。しかしながら、本発明は、本明細書記載にされている灌流液を生成するために用いられ得る平衡塩類溶液又はその他電解質／栄養溶液に相対して限定されるものではない。

一の態様において、本発明は、患者の眼組織を灌流するための方法に関する。この方法は、患者の眼組織を灌流するのに十分な量の眼灌流液を患者の眼組織に導入することを含み、上記眼潅流液は、ａ）当該眼潅流液の粘度を増加させるのに有効な量のγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びにｂ）γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための眼科的に許容可能な水性賦形剤を含む。

別の態様においては、本発明は、眼潅流液であって、ａ）該灌流液の粘度を増加させるのに有効な量のγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びにｂ）γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための眼科的に許容可能な水性賦形剤を含む、眼灌流液に関する。

さらに別の態様においては、本発明は、（ａ）上記の如き眼灌流液、並びに
（ｂ）印刷された説明であって、患者の眼組織を灌流するための説明を含む添付文書を含む、医薬キットに関する。

本発明の一実施形態では、灌流液の粘度は、０．３２〜５０センチポアズ、又は０．３２〜３０センチポアズ、又は０．３２〜３．９３センチポアズである。

本発明の別の実施形態では、灌流液のオスモル濃度は、１リットル当たり２９０〜３２０ｍＯｓｍである。

本発明の別の実施形態では、灌流液の粘度は、０．３２〜５０センチポアズ、又は０．３２〜３０センチポアズ、又は０．３２〜３．９３センチポアズであり、かつ、オスモル濃度は１リットル当たり２９０〜３２０ｍＯｓｍである。

本発明の別の実施形態では、灌流液の屈折率は、１．３３０〜１．３４４である。

本発明の別の実施形態では、灌流液は、架橋ポリグルタミン酸を含まず、かつ、さらなるポリアミノ酸又はポリマーを含まない。

本発明の別の実施形態では、眼科的に許容可能な水性賦形剤は、電解質と、緩衝剤と、エネルギー源とを含有する平衡塩類溶液を含む。

本発明の別の実施形態では、眼灌流液中のγ−ＰＧＡ濃度は、０．２〜１％又は０．２〜０．８％（ｗ／ｖ）の範囲である。

本発明の別の実施形態では、γ−ＰＧＡの分子量は、１０，０００〜２，０００，０００ダルトン、又は１，０００，０００〜２，０００，０００ダルトンである。

さらに本発明の別の実施形態では、眼科的に許容可能な水性賦形剤は、抗酸化物質をさらに含む。

さらに別の態様において、本発明は、眼科手術中において患者の眼組織に対するストレス誘導性損傷を低減する方法に関する。この方法は、眼科手術中に、患者の眼組織を灌流するのに十分な量の眼灌流液を患者の眼組織に導入することを含み、上記灌流液は、ａ）上記液の粘度を増加させるのに有効な量のγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びにｂ）γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための眼科的に許容可能な水性賦形剤を含む。

本発明の一実施形態においては、眼科手術には、硝子体切除術、白内障摘出術、水晶体吸引術、前眼部再建術、及び水晶体乳化吸引術が含まれる。

本発明の範囲を限定する意図なく、本発明の実施形態による、例示となる器具、装置、方法及びそれらに関連する結果を以下に示す。読み手の便宜のために、本実施例では、表題と副題を用いたが、それらは本発明の範囲を多少なりとも限定するものではないことに留意されたい。さらに、本明細書には、特定の理論が提唱され、開示されているが、それら理論が正しくとも或いは間違っていようとも、特定の理論又は実施計画とは無関係に、本発明が当該発明に従って実施される限り、それら理論は決して本発明の範囲を限定するものでは無い。

材料及び方法
材料及び試薬
特にことわりがない限り、全ての材料と試薬は、シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich, Inc.、セントルイス、ミズーリ、米国）から購入した。ポリ−γ−グルタミン酸塩（分子量１０２０ｋＤａ）は、ベダン・エンタープライズ社(VEDAN Enterprise Corporation)から購入した。浸透圧計用の標準物質は、アドバンスインスツルメンツ社(Advanced Instruments, Inc.、ノーウッド、マサチューセッツ、米国）から入手した。

抗生物質、トリプシン及びウシ胎仔血清は、インビトロジェン社[Invitrogen、カールスバッド(Carlsbad)、カリフォルニア]から入手した。フラスコ及び培養ウェル／培養皿は、オレンジ・サイエンティフィック社[Orange Scientific、ブレーヌ・ラルー（Braine-ｌ'Alleud）、ベルギー]から入手した。クイック・セル・プロリファレーション・アッセイ・キット(Qick Cell Proliferation assay Kit)は、バイオビジョン社(BioVision、カリフォルニア、米国）から入手し、細胞毒性試験(cytotoxicity assay)であるサイトトックス・９６アッセイ・キット（CytoTox 96 assay kit）はプロメガ社(Promega、ウィスコンシン、米国）から購入した。ウシ角膜内皮細胞（ｂＣＥ細胞）及びヒト網膜色素上皮細胞（ｈＲＰＥ細胞）は、台湾国立細胞科学センター(National Center for Cell Sciences)（食品工業研究開発研究所(Food Industry Research and Development Institute）、新竹、台湾）から入手した。

方法
灌流液のオスモル濃度の評価
溶液のオスモル濃度を、アドバンスインスツルメンツ社(Advanced Instrument, Co., Inc)によって製造された３Ｄ３単一試料浸透圧計(3D3 Single-Sample Osmometer)を用いて、ドュプリケート（二重）で測定した。γ−ＰＧＡの効果を調べるために、０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、１％の各濃度でγ−ＰＧＡを含有する灌流液と、対照（γ−ＰＧＡを含まない）とを準備した。校正用の標準物質（１リットル当たり１００ｍＯｓｍ及び１５００ｍＯｓｍ）を使用して、浸透圧計の動作を校正した。γ−ＰＧＡ含有灌流液のｐＨ値は、７．４±０．１であった。ｐＨ緩衝剤としては重炭酸ナトリウムを使用し、灌流液の調製には再蒸留水を使用した。

灌流液の粘度評価
平行板配列形状のハーケ・レオストレス６００(HAAKE RheoStress 600)[サーモフィッシャーサイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific Inc.)、ウォルサム(Waltham)、マサチューセッツ、米国]装置を用いて灌流液の粘度を評価した。制御ユニットを用いて温度を制御した。２種類の使用温度、即ち室温（２５℃）と体温（３７℃）とで評価した。上側ステンレス鋼板（直径３５ｍｍ）と下側ステンレス鋼板との間の間隙高さは１．０５ｍｍに設定した。コントロールド・レート・ローテーション・ランプ・モード(controlled rate rotation ramp mode)を用いて、灌流液の粘度曲線を得た。剪断速度は、１s^-1〜５００s^-1の範囲であった。

灌流液の屈折率評価
ＤＲ−Ａ１屈折計（アタゴ社、日本）を使用して、屈折率（ＲＩ）を測定した。０．２％、０．４％、０．６％、０．８％及び１％（ｗ／ｖ）のγ−ＰＧＡを含有する灌流液を室温で調製し、プリズム上に注意深く置いた。接眼レンズを通して観察しながら、影線が照準線の中央に来るまでコントロール・ノブを回した。屈折率の値はデジタル画面から取得した。

γ−ＰＧＡの生体適合性試験
γ−ＰＧＡを異なる濃度で培地に加え、生体適合性を評価した。上記培地２００μＬを、単層の角膜内皮細胞並びに網膜色素上皮細胞に対して試験した。細胞を、５×１０³細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェル組織培養プレートに播種し、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で一晩接着させた。陰性対照（Ａｌ₂Ｏ₃抽出培地）と陽性対照（０．１％のトリトンＸ−１００(Triton X-100)を含む培地）とを含む群、並びに実験群（０．２％、０．４％、０．６％、０．８％及び１％のγ−ＰＧＡを含む培地）について、６重(ヘキサプリケート；hexaplicate)で試験した。３７℃で２４時間或いは７２時間インキュベートした後、細胞生存率評価及び細胞毒性評価を、クイック・セル・プロリファレーション・キット(Quick Cell Proliferation assay Kit)IIと、サイトトックス96非放射性細胞毒性アッセイ(CYTOTOX 96⁽登録商標⁾Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)により、定量的に検定した。

細胞生存率評価には、７２時間インキュベートした後の試験培地を捨て、０．２ｍＬの水溶性テトラゾリウム−８（ＷＳＴ−８）試験溶液を各ウェルに移した。２時間インキュベートすると、細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によってテトラゾリウム塩が開裂しホルマザンの形成することに起因して、ＷＳＴ−８試験溶液は変色を示した。分光光度計を使用して４５０ｎｍの読取りで測定することにより、角膜内皮細胞及び網膜色素上皮細胞の生存率を定量的に検定した。基準波長は６５０ｎｍとした。

細胞毒性評価には、０．０５ｍＬの培地を９６ウェルＥＬＳＡプレートに移し、０．０５ｍＬの基質混合物と混合し、暗所で３０分間インキュベートした。基質混合物中のテトラゾリウム塩が、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）と反応し、赤いホルマザン生成物を生じる。分光光度計を使用して４９０ｎｍの読み取りで測定することにより、培地中に放出されるＬＤＨを定量的に検定した。培地バックグランドとして、培地（細胞と共にインキュベートは無し）も評価した。全ての角膜内皮細胞と網膜色素上皮細胞とは溶解溶液（１％トリトンＸ−１００（TRITON⁽登録商標⁾X-100））中で溶解し、ＯＤ₄₉₀の値を測定した。パーセント細胞毒性は以下の通り表されるものであった。

蛍光染色
０．２％、０．４％、０．６％、０．８％及び１％（ｗ／ｖ）の濃度でγ−ＰＧＡを含有する培地中で１日又は３日間培養した細胞をそれぞれ、ライブ／デッド染色キット（LIVE/DEAD staining kit）(モレキュラー・プローブ社(Molecular probes)、#L3224、ユージーン(Eugene)、オレゴン、米国）で染色し、エヌアイエス・エレメント・ソフトウェア(NIS Element software）で撮影した。

γ−ポリ（グルタミン酸）に基づく眼灌流液のインビボ試験
ニュージーランドホワイト種のウサギ（２〜３ｋｇ）３羽の眼６個を使用した。ケタラール／カナジン(ketalar/Chanazine)２％（ケタミン：体重１キログラム当たり２２ｍｇ、キシラジン：体重１キログラム当たり４〜６ｍｇ）を筋肉注射し、全身麻酔をかけて手術を行った。手術用顕微鏡下で注意深く、管を装着した針二本を水晶体に接しないようにして角膜を通して挿入した（図８Ａ）。上記管を装着した針のうち１本は、実験用の眼灌流液を満たした容器に接続し、もう１本は空の容器に接続した（図８Ｂ）。ペリスタポンプ（流速５ｍＬ／分）を使用して灌流液を３７℃で６０分間、角膜内皮に灌流させた（図８Ｂ）。右目は０．４％（ｗ／ｖ）のγ−ポリ（グルタミン酸）に基づく眼灌流液で灌流し、左目は生理食塩水で灌流した。灌流を行っている間、５〜１０分の間隔で角膜の厚さを測定した。

角膜の厚さの測定
手動振動子を備えた超音波パキメーターＤＧＨ５５０（ＤＧＨテクノロジー社；DGH Technology）を用いて、角膜中央の厚さを測定した。ＤＧＨ５５０は、エコー・スパイク法（echo spike technique）を用いて角膜の厚さを測定する超音波パキメーターである。灌流を行っている間、５〜１０分の間隔で、超音波パキメーターを用いて角膜の厚さを測定した。

統計分析
統計分析は、少なくとも３重（トリプリケート）で行い、平均±標準偏差（ＳＤ）として結果が報告される。分散解析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、γ−ＰＧＡが生体適合性に及ぼす影響を評価した。ｐ値が０．０５未満の差を統計的に有意であると見なした。

結果
γ−ＰＧＡ含有灌流液のオスモル濃度
灌流液のオスモル濃度に対するデキストロース及びγ−ＰＧＡの影響は、それぞれ、図１Ａ及び図１Ｂに示されている。表１には、デキストロース含有灌流液（図１Ａ）及びγ−ＰＧＡ含有灌流液（図１Ｂ）の組成が示されている

５ｍＭのデキストロース、並びに０．２％、０．４％、０．６％、０．８％又は１％のγ−ＰＧＡを含む灌流液のオスモル濃度は、それぞれ、３０４ｍＯｓｍ、３０９ｍＯｓｍ、３１４ｍＯｓｍ、３１９ｍＯｓｍ及び３２５ｍＯｓｍであった（図１Ｃ）。γ−ＰＧＡの濃度が１％から０．２％に減少すると、５ｍＭデキストロース含有灌流液のオスモル濃度は、３２５から３０４ｍＯｓｍに低下した。しかしながら、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭのデキストロースを含有するがγ−ＰＧＡを含まない灌流液のオスモル濃度はそれぞれ、２９５ｍＯｓｍ、２９６ｍＯｓｍ、２９６ｍＯｓｍ、２９８ｍＯｓｍ、３００ｍＯｓｍであった（図１Ａ）。従って、灌流液のオスモル濃度に対するデキストロースの影響はγ−ＰＧＡの影響より少なかった。

γ−ＰＧＡ含有灌流液の粘度
図２は、γ−ＰＧＡは濃度依存的に灌流液の粘度を上昇させたが、５ｍＭデキストロースの存在は粘度に何ら影響を与えなかったことを示している。５ｍＭデキストロース、並びに０％、０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、又は１％のγ−ＰＧＡを含有する灌流液の粘度はそれぞれ、室温（２５℃）で、０．６２ｃＰ、１．１５ｃＰ、１．７２ｃＰ、２．３９ｃＰ、３．１１ｃＰ、及び３．９３ｃＰ（センチポアズ）であった（表２）。温度を体温（３７℃）まで上げると、灌流液の粘度は低下した。５ｍＭデキストロース、並びに０％、０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、又は１％のγ−ＰＧＡを含有する灌流液の粘度はそれぞれ、３７℃で、０．３２ｃＰ、０．７５ｃＰ、１．２０ｃＰ、１．７３ｃＰ、２．３３ｃＰ、及び２．９６ｃＰであった（表３）。

γ−ＰＧＡ含有灌流液の屈折率
０．２５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）及び１％（ｗ／ｖ）のγ−ＰＧＡを含有する各灌流液の屈折率はそれぞれ、１．３３４６、１．３３５０、１．３３５５及び１．３３６０であった（図３）。灌流液の組成は、１２２ｍＭのＮａＣｌ、５．０８ｍＭのＫＣｌ、１．０５ｍＭのＣａＣｌ₂、０．９８ｍＭのＭｇＣｌ₂、２５．０ｍＭのＮａＨＣＯ₃、３．０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、０〜１％（ｗ／ｖ）のγ−ＰＧＡ、並びにｐＨを７．２〜７．４に調整するためのＨＣｌ又はＮａＯＨを含む。

γ−ＰＧＡの生体適合性
γ−ＰＧＡ含有培地で培養した、ウシ角膜内皮（ｂＣＥ）細胞及びヒト網膜色素上皮細胞（ｈＲＰＥ）の第１日目及び第３日目のものについて、細胞生存率と細胞毒性を、ＷＳＴ−８アッセイ及びＬＤＨアッセイで評価した（図４Ａ〜図４Ｂ、及び図５Ａ〜図５Ｂ）。ＷＳＴ−８アッセイを用いて、生存細胞数を測定した。０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、及び１％（ｗ／ｖ）のγ−ＰＧＡで処理したｂＣＥ細胞由来培地のＯＤ_450nmはそれぞれ、１日目で０．２０±０．０２、０．１９±０．０２、０．２０±０．０２、０．１９±０．０１及び０．１７±０．０４であり、３日目では０．５３±０．０５、０．４７±０．０４、０．４６±０．１０、０．４４±０．０６及び０．４１±０．０３であった（図４Ａ）。０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、及び１％のγ−ＰＧＡで処理したｈＲＰＥ細胞由来培地のＯＤ_450nmはそれぞれ、１日目で０．４７±０．０５、０．５１±０．０５、０．５２±０．０２、０．５１±０．０６及び０．４７±０．０７であり、３日目では０．８８±０．０８、０．８８±０．０３、０．８１±０．０７、０．７８±０．０９及び０．７９±０．１０であった（図４Ｂ）。０．２〜１％の濃度のγ−ＰＧＡは、ｂＣＥ細胞及びｈＲＰＥ細胞の生存率には何の影響も与えなかった。

細胞質膜の損傷又は破裂を定量することにより、細胞死を検定した。ＬＤＨ細胞毒性検出は、死細胞と原形質膜を損傷した細胞を検出するための比色アッセイである。（細胞質膜の損傷に起因して）培地上清に存在するＬＤＨは、黄色のテトラゾリウム塩を赤色のホルマザン類色素に変換する共役反応に関与し、この赤色色素の吸光度を４９２ｎｍで測定する。ホルマザンの量は培地中のＬＤＨ量と正比例し、ＬＤＨの量は、次いで死細胞や損傷細胞の数と正比例する。０．２％、０．４％、０．６％、０．８％及び１％のγ−ＰＧＡを含有する培地におけるｂＣＥ細胞の細胞毒性パーセントはそれぞれ、１日目で７．７７±３．５％、８．９０±３．５％、５．７６±２．８％、１０．８６±２．８％及び１０．６５±２．５％であり、３日目で１６．１１±５．８％、１２．１１±６．６％、８．６６±４．０％、４．６１±３．７％及び２．７６±０．４％であった。ｈＲＰＥ細胞では、０．２％、０．４％、０．６％、０．８％及び１％のγ−ＰＧＡを含有する培地における細胞毒性パーセントはそれぞれ、１日目で２．９７±０．６％、２．７４±０．４％、３．９５±１．０％、２．９９±１．０％及び４．７８±０．９％であり、３日目で２．８５±０．３％、２．７７±１．５％、３．７４±１．５％、８．１１±１．９％及び１０．３７±０．９％であった。γ−ＰＧＡ含有培地と陰性対照群との間に有意な差は認められなかった（図５Ａ〜Ｂ）。細胞毒性パーセントは、死細胞の数を細胞総数で除算した値を表し、以下の式によって算出された。

細胞の蛍光染色
ライブ／デッド染色キット(Live/Dead staining kit)は、カルセイン−ＡＭとエチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）の２種類の蛍光色素を利用するものである。カルセインＡＭは広く使用されている緑色蛍光細胞マーカーであり、膜透過性がある。一旦細胞の中に入り込むと、カルセインＡＭ（非蛍光分子）は、細胞内のエストラーゼによって加水分解され、負に荷電した緑色蛍光カルセインとなる。蛍光カルセインは、生存細胞内では細胞質に保持される。これは細胞生存率を測定するためのエンドポイント・アッセイである。蛍光シグナルは４８５ｎｍの励起波長と５３０ｎｍの放射波長によってモニターされる。アッセイにおいて生成される蛍光シグナルは、試料中の生存細胞の数に比例する。死細胞の膜は損傷している。エチジウムホモ二量体−１（ＥｔｈＤ−１）が損傷した細胞に侵入し、核酸と結合すると蛍光を発する。ＥｔｈＤ−１は、損傷した細胞又は死細胞中で明るい赤色蛍光を生成する。γ−ＰＧＡ含有培地中では、殆ど全てのｂＣＥ細胞及びｈＲＰＥ細胞が生存していた（図６Ａ〜図６Ｂ及び７Ａ〜図７Ｂ）。

角膜の厚さに対するγ−ＰＧＡ含有灌流液の影響
ウサギの眼に挿入した、管が装着された針二本を介して、灌流液を眼内に灌流させている間の角膜の厚さを測定した（図８Ａ）。ペリスタポンプを使用して灌流液を流動させた（図８Ｂ）。灌流を始めた最初の２０分の間に、角膜の厚さが増加した。図９には、γ−ポリ（グルタミン酸）に基づく眼科用溶液を灌流させた群では、生理食塩水を灌流させた群よりも角膜の厚さの変化が有意に小さかったことが示されている。生理食塩水を灌流させた群と、０．４％（ｗ／ｖ）のγ−ポリ（グルタミン酸）含有溶液を灌流させた群とで角膜厚さの変化はそれぞれ、４７μｍと３２μｍであった。最初に起こった角膜厚さの増加は、官が装着された針を挿入したことによって生じた損傷によるものと考えられる。その後、γ−ポリ（グルタミン酸）に基づく眼灌流液を灌流させた角膜の厚さは、残り１時間の潅流で角膜厚さが約３６μｍに膨潤し、ごく僅かに増加した（図９）。一方、生理食塩水を灌流させた角膜厚さは、残り６０分の潅流で連続した増加を示し、１時間灌流させた最後の厚さは約５８μｍに膨潤しており、これはγ−ポリ（グルタミン酸）に基づく眼灌流液を灌流させた群の角膜の厚さと比較して、およそ１．６倍であった。

Claims (20)

1. 患者の眼組織を灌流するのに十分な量の眼灌流液であって、
   （ａ）上記液の粘度を増加させるのに有効な量のγ‐ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びに
   （ｂ）上記γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための、眼科的に許容可能な水性賦形剤であって、患者の眼組織の灌流に用いるための水性賦形剤
   を含む、眼灌流液。
2. 上記灌流液の粘度が、０．３２〜５０センチポアズ、又は０．３２〜３０センチポアズ、又は０．３２〜３．９３センチポアズである、請求項１に記載の眼灌流液。
3. 上記灌流液のオスモル濃度が、１リットル当たり２９０〜３２０ｍＯｓｍである、請求項１に記載の眼灌流液。
4. 上記灌流液が、架橋ポリグルタミン酸を含まず、かつ、さらなるポリアミノ酸又はポリマーを含まない、請求項１に記載の眼灌流液。
5. 上記灌流液の屈折率が、１．３３０〜１．３４４である、請求項１に記載の眼灌流液。
6. 上記眼科的に許容可能な水性賦形剤が、電解質と、緩衝剤と、エネルギー源とを含有する平衡塩類溶液を含む、請求項１に記載の眼灌流液。
7. 眼灌流液であって、
   （ａ）上記灌流液の粘度を増加させるのに有効な量のγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びに
   （ｂ）上記γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための、眼科的に許容可能な水性賦形剤
   を含む、眼灌流液。
8. 上記灌流液の粘度が、０．３２〜５０センチポアズ、又は０．３２〜３０センチポアズ、又は０．３２〜３．９３センチポアズである、請求項７に記載の眼灌流液。
9. 上記灌流液のオスモル濃度が、１リットル当たり２９０〜３２０ｍＯｓｍである、請求項７に記載の眼灌流液。
10. 上記灌流液の屈折率が、１．３３０〜１．３４４である、請求項７に記載の眼灌流液。
11. 上記灌流液が、架橋ポリグルタミン酸を含まず、かつ、さらなるポリアミノ酸又はポリマーを含まない、請求項７に記載の眼灌流液。
12. 上記眼科的に許容可能な水性賦形剤が、電解質と、緩衝剤と、エネルギー源とを含有する平衡塩類溶液を含む、請求項７に記載の眼灌流液。
13. 上記γ−ＰＧＡの分子量が、１０，０００〜２，０００，０００ダルトン、又は１，０００，０００〜２，０００，０００ダルトンである、請求項７に記載の眼灌流液。
14. （ａ）請求項７に記載の眼灌流液、並びに
    （ｂ）印刷された説明であって、患者の眼組織を灌流するための説明を含む添付文書
    を含む、医薬キット。
15. 眼科手術中に患者の眼組織を灌流するのに十分な量の眼灌流液であって、
    （ａ）上記溶液の粘度を増加させるのに有効な量のγ‐ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）及び／又はその塩、並びに
    （ｂ）上記γ−ＰＧＡ及び／又はその塩のための、眼科的に許容可能な水性賦形剤であって、眼科手術中において患者の眼組織に対するストレス誘導性損傷を低減するのに用いるための水性賦形剤
    を含む、眼灌流液。
16. 上記外科手術が、硝子体切除術、白内障摘出術、水晶体吸引術、前眼部再建術、及び水晶体乳化吸引術を含む、請求項１５に記載の眼灌流液。
17. 上記灌流液の粘度が、０．３２〜３．９３センチポアズである、請求項１に記載の眼灌流液。
18. 上記灌流液の粘度が、０．３２〜３．９３センチポアズである、請求項７に記載の眼灌流液。
19. 上記眼科的に許容可能な水性賦形剤が、抗酸化物質をさらに含む、請求項７に記載の眼灌流液。
20. 上記灌流液のオスモル濃度が、１リットル当たり２９０〜３２０ｍＯｓｍである、請求項８に記載の眼灌流液。