TW201111505A - Fermentation process - Google Patents
Fermentation process Download PDFInfo
- Publication number
- TW201111505A TW201111505A TW099126639A TW99126639A TW201111505A TW 201111505 A TW201111505 A TW 201111505A TW 099126639 A TW099126639 A TW 099126639A TW 99126639 A TW99126639 A TW 99126639A TW 201111505 A TW201111505 A TW 201111505A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- promoter
- mannose
- nucleic acid
- host cell
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 128
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims abstract description 109
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 61
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 44
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 38
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 35
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 24
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 24
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 22
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 101100456009 Bacillus subtilis (strain 168) manR gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009172 bursting Effects 0.000 claims description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 4
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 claims description 3
- 101100246031 Bacillus subtilis (strain 168) manP gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 127
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 51
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 22
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 17
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 14
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 7
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 6
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 6
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000005712 elicitor Substances 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- -1 polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 3
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium peroxydisulfate Substances [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 101150107068 gsiB gene Proteins 0.000 description 2
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- VZXTWGWHSMCWGA-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC=NC(N)=N1 VZXTWGWHSMCWGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTKLPBYFCQQJBF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br.OC1=CC=CC=C1Br YTKLPBYFCQQJBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 240000000662 Anethum graveolens Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001508395 Burkholderia sp. Species 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000147019 Enterobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- DNYGXMICFMACRA-XHEDQWPISA-N Gentamicin C2b Chemical compound O1[C@H](CNC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N DNYGXMICFMACRA-XHEDQWPISA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034693 Laceration Diseases 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000048193 Mannose-6-phosphate isomerases Human genes 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100071254 Mus musculus Hnrnpul2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 108010024026 Nitrile hydratase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- FKUYMLZIRPABFK-UHFFFAOYSA-N Plastoquinone 9 Natural products CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCC1=CC(=O)C(C)=C(C)C1=O FKUYMLZIRPABFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 1
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 240000008199 Rhododendron molle Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150044453 Y gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)OOS([O-])=O VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- MGZBPLMGPWELCQ-UHFFFAOYSA-L azanium magnesium sulfuric acid phosphate Chemical compound P(=O)([O-])([O-])[O-].[NH4+].S(=O)(=O)(O)O.[Mg+2] MGZBPLMGPWELCQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 1
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000005285 chemical preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000021438 curry Nutrition 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- ZYBWTEQKHIADDQ-UHFFFAOYSA-N ethanol;methanol Chemical compound OC.CCO ZYBWTEQKHIADDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 108010075125 fructose permease Proteins 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 150000002703 mannose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- CPJSUEIXXCENMM-UHFFFAOYSA-N phenacetin Chemical compound CCOC1=CC=C(NC(C)=O)C=C1 CPJSUEIXXCENMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- FKUYMLZIRPABFK-IQSNHBBHSA-N plastoquinone-9 Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC1=CC(=O)C(C)=C(C)C1=O FKUYMLZIRPABFK-IQSNHBBHSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002795 scorpion venom Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940083575 sodium dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 101150022533 torZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150069452 z gene Proteins 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
201111505 - 六、發明說明： - 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於-發酵方法，其可使細跑之生長獲得改善，且 -可改善職宿主細胞中多胜肽之表現。尤其，本發明係關^述 -之發酵方法，其服培養含-表現載體之原核宿主細胞，該截體 編有一多胜肽之之密碼，且受一可由甘露糖誘發之啟動子之控制。 【先前技術】 培養細胞之發酵方法對製造生物學上及製藥上之有效物Μ -非常重要。尤其’上述之發酵方法應適合於取得足夠數量之所要 物質於實際之用途上’諸如臨床或商業之用途上。 目前已經發展出許多方法，其等藉由培養原核宿主細胞達到 標的多胜肽有效率之表現’該等細胞中含可表現之核酸序列其 編有該_乡祿之㈣。該表狀效耗觀與⑽子有關，其控 制著編有該標的多胜肽密碼之核酸序列之表現。尤其，啟動子被希望 要具備有高度之轉錄率以製造高複製數目之標的多胜狀。 • 此外，於之方法巾’最好係標的纽肽之表現可受控 制。例如經由剪接操作方式將編有該標的多卿^密瑪之核酸序列與一 •可捕狀啟動子連-起’其巾紐動和有於_適#誘發劑之 二 存在下才會開始進行表現，即可達到控制表現。 *. -啟動子係為—猶序列，魏使編有標的多祖密碼之核酸序 ： 列(結構基因)被轉錄。 ·:' t其’本發明侧於-發酵方法，其·新的載體於宿主細胞中 '進行異·之表現，魏觀含甘露轉縱仅_啟動子賴，該啟 、動子區域可經由剪接操作方式與—轉錄單元連接於-起，其包含-編 有-多胜肽密碼之核酸序列’而所述之核酸序列之表現係受所述之甘 - 露糖操縱子之啟動子區域之控制。 201111505 經由適當之誘發，啟動子受活化並能進行結構基因之轉錄。誘發 作用可以負向或正向之控制方式進行。 於負向之控制中’抑制子與啟動子結合並阻止結構基因之轉錄。 右有一適當之誘發劑存在時，則該抑制子即被去活化，且轉錄可開始 進行。 於正向之控制中’啟動子與一活化劑結合時即被活化，其中，活 化劑與敢動子之結合係由一適當之誘發劑居間導引。 典f之誘發劑可為一些受質’其為原核宿主需要作為新陳代謝 之用，例如不同類型之單糖。 本發明係關於陽性可誘發之系統，其中，於一適當之受質， 亦即誘發劑，之存在下，一活化劑與啟動子結合，其啟動可經由 剪接方式與所述啟動子連接之基因之轉錄。 直到目前為止，大多數於原核宿主系統中之異源性基因表現 系統係完全建立於一組數目有限之細菌性啟動子上。因此，可被 作為誘發劑使用之受質數目亦同樣有限。 此外’異源表現系統之產率係取決於可獲得之經轉化原核宿 主細胞之數目多寡而定。因此，需要能生長至高細胞之密度，亦 即係能使細胞快速繁殖而不會於細胞分裂時失去該載體之原核宿 主系統。 【發明内容】 本發明概要 根據本發明，該等及其他目的，正如將於下列說明中顯而易 見，可經由下列之方式所達成，即利用一發酵方法，其用於培養 經由數種新載體所轉化之原核宿主細胞，該等載體包含甘露糖操 縱子之一啟動子區域，該啟動子區域可經由剪接操作方式與一轉錄單 元連接於一起，其包含一與所述之宿主細胞不同源之核酸序列，而所 201111505 述核酸序列之表現係由該甘露糖操縱子所述之啟動子區域所控制。 根據一特殊之面向，本發明提供一用於培養細菌宿主細胞之 方法，其可使細菌宿主細胞生長至高細胞之密度。 本發明亦提供所述之新載體之使用，於一原核宿主細胞中調 控一操縱序列之表現；一經分離及純化，可於宿主中表現之核酸 序列，其包含一甘露糖操縱子之啟動子區域；一經所述之載體或所 述經分離及純化之核酸序列所轉化之原核宿主細胞；一方法，其使用 所述之載體或所述經分離及純化之核酸序列於一宿主中製造一多胜 肽；及使用經由所述之載體或所述經分離及純化之核酸序列所轉化之 原核宿主細胞於發酵’尤其係於高細胞密度之發酵上。 其他之目的及優點’對於彼等習知技藝人士而言，將由審閱下列 針對隨附其後之說明圖式之詳細說明，及依附於其後之申請專利範圍 而變得顯而易見。 本發明之詳細說明 如本文中所使用，茲提供下列定義以利於本發明之瞭解。 「可於宿主中表現之載體」或「表現載體」係為一多核酸之結構 • 體，其係以重組之方式或由合成之方式產生，且具有一系列特定能使 - 一特殊核酸序列於宿主細胞中進行轉錄之核酸元件。通常，此載體包 • 括一轉錄單元，其包含一特定待轉錄之核酸序列，其可以剪接之操作 - 方式與一啟動子相連接。可於宿主中表現之載體例如可為一獨立存在 ；' 或自行複製之質體、黏質體、噬菌體、病毒及反轉錄病毒等。 .. 「宿主」、「宿主細胞」及「重組宿主細胞」等術辭於本文中可彼 - 此相互交替使用，且表示一原核細胞，於該細胞中已被引入一或數種 本發明之載體或經分離及純化之核酸序列。如眾人所暸解，上述之術 • 辭不僅意指特定之受試細胞，而且亦指該種細胞之後代或潛在可能之 • 後代。因有些改變會因突變或環境之影響於後繼之世代中出現，故， 201111505 該等細胞之後代事實上不會與親代之細胞相同，然而卻仍被包括於本 文中所使用之該術辭之範圍内。 「包含」該術辭一般係以包括之意思被使用，此即係說允許一或 數種其他特徵或組成份之存在。 本文中所使用之「啟動子」意思係指一控制轉錄單元進行表現之 核酸序列。一「啟動子區域」係為一具有調控功能之區域，其能於細 胞中與RNA (核酸)聚合酶結合’並啟動一位於下游(3，方向)編碼序列之 轉錄。於該啟動子之區域内可發現數個負責與RNA聚合酶結合之蛋白 質之結合區(共有序列）’諸如推定之-35框盒及Pribnow插盒(_ι〇框 盒）。屿外，該啟動子區域還可包含該等調控性蛋白質之轉錄起始點及 結合位置。 「甘露糖操縱子」之意思係指#罩歹遞斧磨之甘露糖操縱予。 於甘露糖操縱子中被鑑別出三種基因(Kunst F. N. et al.，，，The complete genome sequence of gram-positive bacterium Bacillus subtillis^ Nature 390, pages 249 to 256 (1997))。 ’ 第一個基因，，編有一甘露糖特殊酵素組成(傳輸蛋白)之密 碼，其屬於果糖通透酶家族之成員。第二個基因，，編有一甘露 糖-6-鱗酸鹽異構酶之密碼’而第三個基因，分研，之功能尚不清楚。 位於此三個基因同方向之上游處有一調控性之基因，，其編有 ManR之密碼，為甘露糖操縱子之活化蛋白。 由二個基因(以下通稱為nWimp”)组成之甘露糖操 縱子係由啟動子所控制，其本身受正向之調控。 另一啟動子，啟動子’負貴表現及，其對於與甘露糖有 關之啟動子之誘發十分重要。 wirni?之區域還包含一該/wmi?基因之代謝產物調節蛋白之結合位 置(代謝產物反應元件(ere))。 201111505 「ere序列」係指一位於該等代謝基因上游處(5’方向)之核酸序 .列。該⑽序列與一代謝產物控制蛋白(CCP)結合，其抑制於碳代謝產 物抑制(CCR)中之代謝基因之表現。 甘露糖操縱子之啟動子區域」之意思係為該啟動子區域，其於 有或無撕序列下調控及/mw及等基因之表現。 本文中所提及之「_尸啟動子」至少包含_35區域、pribn〇w框 盒及ManR蛋白之結合位置。 本文中所提及之「waM啟動子」至少包含推定之_35區域、pribn〇w . 框盒、ManR蛋白之結合位置及，可依選擇，一 cre序列。 D_甘露糖，亦可被稱為「甘露糖」，係為葡萄糖之一 2_表異構物， 且存在於甘露聚醣(mannan)及異甘露聚醣(heteromannan)等多醋、醣蛋 白及5午多其他之醋接合物中。 「CcpA」係指「代謝產物控制蛋白A」，其為一總調控蛋白並 能活化或抑制有些代謝操縱子之活化。於甘露糖操縱子之情形中， CcpA係經由與序列結合而扮演一抑制性之角色。 加強子」係指一核酸序列，其之作用在於加強一轉錄單元進行 ' 轉錄，而其與該轉錄單元之特性，該轉錄單元序列之位置或序列之方 向無關。本發明之載體可依選擇將加強子包括在内。 本文中所使用之「轉錄單元」係指一核酸序列，其於正常情況下 ： 被轉錄成一單股之RNA分子。該轉錄單元可含一基因(單順反子)或二 ··個基因(雙順反子)或多個之基因（多順反子），其等編有於功能上相關多 : 胜肽分子之密碼。 ： 一核酸序列「可經由剪接操作方式被連接」，當其被置入另一核酸 ；· 序列之功能關係中時。例如，可經由剪接操作方式將一啟動子與一編 碼序列相連接，若該啟動子能對該序列之轉錄產生作用時；或例如可 經由剪接操作方式將一轉錄起始區域，如核糖體結合位置，與一編有 201111505 一多胜肽密碼之核酸序列相連接，若放置該區域有利於該多胜肽被轉 譯時。核酸序列之連接可於合宜之限制酶剪切位置上經由接合反應完 成之。若沒有此類之剪切位置時，則可依據常用之作法使用合成之由 寡聚核苷酸組成之轉接序列或連結序列。 於本發明中所指之「核酸」或「核酸序列」或「經分離及純化之 核酸或核酸序列」可為DNA、RNA或DNA/RNA之雜交體。若當該 核酸或該核酸序列位於一載體上時，則其通常係為DNA。於本文中所 稱之DNA可為任何之聚去氧核苷酸序列，其例如包括雙股DNA ;單 股DNA ;雙股DNA ’其中一或雙股係由二個或二個以上之片段所組 成；雙胜DNA，其中一或雙股具有一連續磷酸二酯之骨幹結構；DNA， 其含一或數個單股之部分及一或數個雙股之部分；雙股DNA，其中 DNA之雙股完全互補；雙股DNA，其中DNA之雙股僅有部份互補； 圓形DNA;共價閉合式DNA;直線形DNA;共價交聯式DNA; cDNA; 由化學試劑合成之DNA ;半合成之DNA ;生物合成之DNA ;由天然 分離得到之DNA;由酵素分解後得到之DNA;經剪切後得到之DNA ; 經標記之DNA ’如經放射性元素標記之DNA及經螢光染劑標記之 DNA ; DNA ’其含一或數個非自然存在之種類或核酸。DNA序列可 由標準化學反應之技術，如磷酸三酯法，或經由自動化之合成方法及 PCR(聚合酶鏈鎖反應)方法加以合成。而經純化及經分離之DNA亦可 利用酵素之技術加以製備。 於本發明中所指之RNA可例如為單股之rnA ; cRNA ;雙股 RNA ’雙股RNA ’其中一或雙股係由二個或二個以上之片段所組成； 雙股RNA，其中一或雙股具有一連續磷酸二酯之骨幹結構；似入，其 含一或:數個單股之部分及一或數個雙股之部分；雙股⑽入，其中四八 之雙股芫全互補；雙股RNA ’其中j^A之雙股僅有部份互補；共價 交聯式RNA ;由酵素分解後得到之咖入；經剪切後得到之奶八； 201111505 mRNA ;由化學試劑合成之RNA ;半合成之RNA ;生物合成之RNA ;
• 由天然分離得到之RNA;經標記之RNA，如經放射性元素標記之RNA 及經螢光染劑標記之RNA ; RNA，其含一或數個非自然存在之核酸種 ' 類。 ' 「變異型」或「一序列之變異型」之意思係指一核酸序列，其與 參考序列不同之處在於保留核酸被取代，其中一或數個核酸被另外具 有相同特徵之核酸所取代。變異型亦包含退化之序列，具有經刪除或 插入片段之序列，只要該等經改變之序列呈現出與參考序列相同之功 ' 能(功能相等）。 如本文中所使用之術辭「多胜肽」、「胜肽」、「蛋白質」、「多胜肽 類」及「胜肽類」等可彼此相互交替使用，且表示一系列之氨基酸殘 基於二個相鄰殘基之α_氨基及羧基之間彼此藉由胜肽鍵相互連接於一 起。 「經分離及純化之核酸序列」該術辭之意思係指該狀態，其中， 該核酸之序列將與本發明一致。該核酸序列將不含或大體上不含該等 核酸序列於自然狀態下所結合之物質，諸如於其自然環境中所發現與 - 該等核酸序列並存之其他核酸，或製備該等核酸序列之環境(例如細胞 _ 培養），當此製備係以重組技術於活體内或活體外進行時。 「轉化」、「經轉化」或「將一核酸輸入一宿主細胞中」等術辭係 • 表示任何之方法，其中一細胞外之核酸，如一載體，於有或無伴隨物 ··- 質之下進入一宿主細胞。「細胞被轉化」或「經轉化之細胞」等術辭係 表示該細胞或其子代細胞’於其等細胞中已被輸入細胞外之核酸，因 ； 此含該細胞外之核酸。核酸被輸入細胞中，而使該核酸可以與染色體 \ 結合成一體之片段形式或以染色體外之元件之形式進行複製。將適當 之宿主細胞以例如一表現載體之轉化可利用熟知之方法加以完成，諸 如顯微注射法、電穿孔轉化法、粒子撞擊法等，或利用化學方法，諸 201111505 如由磷酸避促成之轉化反應’其被敍述於例如Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory 中或於 Ausubel et al. 1994, Current protocols in molecular biology，John
Wiley and Sons 中。 「異源性核酸序列」或「與宿主細胞不同源之核酸序列」係指一 核酸序列’其例如編有一對於宿主細胞而言為外來之表現產物，如多 胜肽（「異源表現」或「異源產物」）之密碼，亦即係一核酸序列，其 源自於不同於宿主細胞之供應細胞或一以化學方法合成之核酸序列， 其例如編有一對於宿主細胞而言為外來之表現產物，如多胜肽之密 碼’或一源自於該宿主並編有一多胜肽密碼之核酸序列，其於自然情 況下由該宿主所表現，其中，該核酸序列被接進一載體中，並受根據 本發明甘露糖操縱子之啟動子區域之控制。 若當該宿主細胞為一特殊之原核細胞種類時，則該異源性之核酸 序列可源自於一生物不同之屬或科’源自於一生物不同之目或綱，源 自於一生物不同之門或源自於一生物不同之界。 於將異源性核酸序列輸入宿主細胞之前，可利用突變、插入、刪 除或取代該異源性核酸序列之單一核苷酸或數個核苷酸之方式將其改 變，只要該等經改變之序列呈現出與參考序列相同之功能(功能相等）。 本文中所指之異源性核酸序列亦包含源自於不同界之生物，諸如源自 於真核細胞(真核細胞起源）’例如人類之抗體，其已被使用於噬菌體之 展示庫中，且該等抗體之核酸序列之單一核苷酸或數個核苷酸已依據 原核宿主細胞「密碼子之用法」被加以修改。 「轉錄起始區域」係為一訊號區域，其促使轉錄啟動，且其包含 核糖體結合位置之序列，諸如ShineDalgarno序列。 通常’轉錄起始區域位於轉錄起始位置之下游處，且可經由剪接 之操作方式將其與待表現之基因連接於一起。 201111505 「轉錄終止區域」係指一序列，其使RNA聚合酶終止進行轉錄。 • 轉錄終止區域通常係一轉錄單元之部份，其可避免其他鄰近基因不需 要之轉錄或避免從其他潛在可能啟動子之轉錄，且可增加之安 定性。 「抗體」係指一類經抗原刺激後由免疫系統之B細胞所產生之血 漿蛋白質。哺乳動物(即人類)之抗體係為IgG、Μ、a、E及〇等類型 之免疫球蛋白。使用於本發明之術辭「抗體」包括，但不侷限於，多 株抗體、單株抗體、抗獨特型抗體及自體抗體，其存在於自體免疫之 ' 疾病中，例如糖尿病、多發性硬化症及風濕性關節炎，及嵌合抗體等。 於一面向上，本發明係利用一可於宿主細胞中複製之載體， 其包含甘露糖操縱子之一啟動子區域，該啟動子區域可經由剪接操作 方式與一轉錄單元連接於一起，其包含一可與該宿主不同源之核酸序 列，而所述之核酸序列之表現係受所述之甘露糖操縱子之啟動子區域 之控制。 根據本發明之載體較佳者為一具有自主性或自行複製之質體、黏 質體、噬菌體、病毒或反轉錄病毒。有許多宿主/載體之組合體可被使 用於表現本發明之核酸序列。 - 有用之表現載體，例如可由染色體之核酸序列、非染色體之核酸 序列及/或經由人工合成之核酸序列之片段所組成。 適用之載體包括對宿主範圍具專一性之載體，諸如例如分別針對 ·._祜享東廢莽菌'及乂 苈具有專一性之載體，及對宿主範圍具廣 闊性之載體，例如針對於革藍氏陽性細菌及革藍氏陰性細菌有效 ： 之載體。 〉 可被使用者還有「低度複製」、「中度複製」及「高度複製 之質體等。 」 例如’於為草炎敏斧奢中，pAMbetal係為一低度複製之質體， 201111505 pBS72衍生之質體係為中度複製之質體，及pUBU〇係為一高度複 製之質體。 根據本發明，甘露糖操縱子之啟動子區域分別包含啟動子 區域及zwimP啟動子區域。 衿圖一中顯示源自栝享歹應#彦之核酸序列，其包含之 C-端部份，介於及/rnmP間之間隔區域，緊接其後係作為報導基 因之溶i葡萄球菌酶(lysostaphin)基因如。 本發明之核酸序列，其包含w<mp之啟動子區域，較佳者為含圖 一從驗:基對-80至如基因之起譯密碼子之核酸序列(SEq IDN〇丨），及 更佳者為含圖一從驗基對_8〇至包括鹼基對·〗在内，亦即位於驗基對+1 上轉錄起始位置A之上游處之核酸序列(SEq jq N〇.2)。 於圖二及於圖三中顯示源自袷罩多邀岸彦之核酸序列，其包含 啟動子區域，位於鹼基對+1上之轉錄起始位置G，一推定之 序列，介於鹼基對+1及/之間之轉錄起始區域，及之部份， 其中mcm/?被/arcZ所取代。 本發明之減序列，其包含之啟動子區域，触者為含圖
二從鹼基對-122至/flCZ基因之起譯密碼子之核酸序列(SEQ ID N0.3)，更佳者為含圖三從鹼基對_122至鹼基對+7，亦即包含推定之 ⑽序列在内之核酸序列(SEQ ID N〇4)，及尤其含圖三從鹼基對必 至驗基對-1 ’亦即位於驗基對+1上之轉錄起始位置G上游處之核酸序 列(SEQIDN0.5)。 及二者之啟動子區域皆包含ManR之結合位置。本發 明亦包含-與SEQID Ναι至SEQ roN〇 5其中任意一者互補之序列 及其等之變異型。 本發明中所使用之甘露轉縱子之啟動子區域，諸如_尸之啟 動子區域、之啟動子區域(含或不含⑽序列)及依據SEQ仍Ν〇 Λ 12 201111505 =EQ ID N0.5等序列之啟動子區域，一與其等序列互補之序列或其 歹!之變異型通常係源自於於應#彦之甘露糖操縱子或源自 =，原核生物，尤其係芽雜菌科之生物，之於魏上相等之啟動 :區域。其他原核生物於魏上相等之啟動子區域包含__可經由甘露 ，所誘發之啟動子區域’亦即—啟動子區域，其於甘絲之存在下比 無甘露糖之存在下具有更高之表現活性。 於許彡雜生物’諸如厚烟門㈤牆㈣，如應岸磨 中，甘露轉縱子與D.甘錄之嫌代謝有關。 料顏·可將許衫狀單糖作為碳源使用。六碳醣， 如葡萄糖及D-甘露糖，主要係經由磷酸烯醇丙酮酸 (ph〇SPh_lpyruvate):碳水化合物魏轉移酶系統㈣)被細胞所吸 收。於該PTS系統中，每個六碳酶同時被鱗酸化，並於細胞吸收時被 送入細胞巾…特殊之單糖受f之吸收及_係由碳代謝產物抑制 (CCR)所支配。於葡萄糖’择轉鱗雜佳之單糖受質，之存在下， 其他受質之魏及糊之基因，如甘雜操縱子之觸即受抑制。 料顏撕中與葡萄糖有關連之CCR之機制已廣泛地被研 究，並於目前技術水準中為人所熟悉(歸，” Reguiati_f carbon catabolism in BaciUus ^ ^ ^ ^ 2000, pages 849-880)。 $據本發明之轉錄單元财含-轉譯起純域，其位於所述 ，錄單元之轉譯起始點(起譯密碼子)之上游處，其中該轉譯起始區 域可經由剪接操財式與該核酸相相連接。該 位於直接㈣轉鮮元之轉私雜之上游處，其 域= 或 TTG。 ”轉譯（始區域可為甘露糖操縱子中麵尸基因或_^基因 錄單元之轉譯起始區域。 13 201111505 甘露糖操縱子中zwiwP基因或wcrwi?基因之轉譯起始區域可部份 或完全被另一轉譯起始區域所取代。 例如’可使用加/4 (延長因子Tu)及炉诏（壓力蛋白；Jiirgen et al.，1998, Mol. Gen. Genet. 258, 538-545)之轉譯起始區域，二者皆 调、色块枯草芽胞桿菌。 下文中分別呈現如/4及识诏之核酸序列，其具有各基因之轉 錄起始區域及起始點，其中，起譯密碼子以粗體字表示，限制酶 之剪切位置被標示於序列之下方並突顯Shine-Dalgarno序列之位 置。 tufA · S^cttaagGAGGAXTTTAGAATGGCTAAAGAAAAATTCggatcc-^，
4/ΠΙ SD 起譯密碼子 5awHI gsiB ·
S^cttaagAATTAAAGGAGGAATTCAAAATGGCAGACAATAAC
Afl11 SD 起譯密碼子 AAAggatcc-3? ΒαηϊΆΙ t由適當之選擇轉錄起始區域，可增強mj^A之安定性，其 係基因表現中一項重要之特徵。mRNA安定性之特徵係取決其特 殊之半衰期。 除轉錄起始區域外，轉譯起始點及，可依選擇，位於該起始 點後之該基因之數個密碼子，例如5至6個密碼子，亦可分別被 取代，如上文中分別於加抑及识诏之核酸序列中所示。 轉譯起始區域此外還可包含一編有訊號序列密碼之序列，其 可經由剪接操作方式與待表現之核酸序列相連接。該訊號序列通常位 於直接鄰近該轉譯起始點之下游處。 201111505 若使用的係一雙順反子或多順反子轉錄單元之時，則可應用 * 不同或相同之訊號序列，其以剪接操作方式與每個順反子相連接。 較佳者為，於此情形中使用不同之訊號序列。該訊號序列可為一原核 細胞或一真核細胞之訊號序列。通常係使用原核細胞之訊號序列。 於本發明表現載體中所應用編有訊號序列密碼之DNA序列 可由購買方式取得或由化學合成方法製備而得。例如，訊號序列 可依據例如敘述於 Beaucage & Caruthers，1981，Tetrahedron LeHs. 22, 1859-1862 中之固相亞麟酸醯胺三酯(phosphoramidite trimester) - 方法合成而得，如 Van Devanter et al” Nucleic Acid Res. 12:6159-6186 (1984)中所述。寡聚核苷酸可利用非變性聚丙婦醯胺 凝膠電泳或陰離子交換高效能液相層析儀加以純化，其方法如 Pearson & Reanier，J. Chrom. 255:137-149 (1983)中所述。 通常，轉錄單元還包含一轉錄終止區域。 較佳者為，使用強力之轉錄終止區域以避免啟動子從轉錄單 元「讀穿」進入位於其左右二側之質體序列中及從其他質體啟動 子「讀穿」進入該轉錄單元中。此外，於該種轉錄終止區域之存 • 在下亦觀察到mRNA變得比較安定。 . 用於強力轉錄終止區域之範例有源自括享声遞岸廣· 168之 如/4 3’-區域之核酸序列 5’-CGAGACCCCTGTGGGTCTCG-3’，其 ** 可由購買取得。 •二 根據本發明，可使用一異源性之核酸序列，其編有一對於宿 主細胞為外來者之表現產物之密碼。若該宿主細胞為原核細胞種 ： 類’如祜罩穿廣舁苈或大腸样菌時，則該感興趣之核酸序列可更 ·· 偏好源自於另一綱別之細菌，如γ-變形細菌綱 (gamma-proteobacteria)，諸如源自於例如伯克霍爾德氏菌 (Burkholderiasp.)，特別係源自於一不同門之細菌，諸如古菌(archea)， 15 201111505
蛋白」）之N_(胺基)或C儀基獅合蛋白f，諸如綠色榮光 =或其他融合蛋白之密碼。該異源性之鎌序財可編有一轉錄 最特別係源自於-真核細魅物，諸如哺乳動物， 然而，該異源性之核酸序列可依據宿主細胞「 產物H該產物可以RNA之形式，諸如以反義 被使用。 人蛋白質可以-不溶性之聚集物或以—可溶性蛋白質之形式被 合成’其存在於該宿主細胞之細胞質或壁賴社巾，及/或細胞 外之液體基質中。較佳者為，該蛋白質係以—可溶性蛋白質之形 式被合成，其存在於該宿主細胞之壁膜問隙中，及/或細胞外之液 體基質中。 譎感興趣之異源性蛋白質可起源自人類、哺乳動物或原核細 ，。其他之蛋白質係為抗原，諸如源自微生物致病菌，病毒及細 菌二者，及源自腫瘤之醣蛋白及碳水化合物。其他之蛋白質還有 酵素，如凝乳酶、蛋白水解酶、聚合酶、脫氫酶、核酸水解酶、 $聚醣水解酶、氧化酶、α_澱粉水解酶、氧化還原酶、脂肪水解 %、醯胺酶、腈水合酶、酯水解酶或腈水解酶。 於本發明中，訊號序列與該異源性之核酸序列於該表現载體内之 排列順序及距離係可被改變。於一些較佳之實施例中，該訊號序列係 位於編有例如該感興趣多胜肽之密碼之核酸序列之5,端(上游處）。該 訊號序列與該編有例如該感興趣多胜肽之密碼之核酸序列可被零至大 約一千個氨基酸所分隔。於一些較佳之實施例中，該訊號序列與該編 有例如該感興趣多胜肽之密碼之核酸序列彼此直接相鄰，亦即係被零 201111505 個核皆酸所分隔。 較佳者為，本發明之載體包含依據SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO.5 等序列其中任意一序列之甘露糖操縱子之一啟動子區域，與其等序列 互補之序列及其等序列之變異型序列。 於本發明中亦包含使用一根據本發明之載體於本發明之發酵中， 以於一原核細胞宿主中調控一核酸序列之異源性表現。 於又另一面向上，本發明提供一經分離及純化之核酸序列，其包 含一甘露糖操縱子之啟動子區域，佳者為，該經分離及純化之核酸 序列包含甘露糖操縱子之讲⑽户之啟動子及/或历如及之啟動子。更佳 者為，該經分離及純化之核酸序列包含SEQ ID N〇丨至SEQ ID N〇 5 專序列其中任意一序列。 包含一甘露糖操縱子之啟動子區域之核酸序列 可經由剪接操作之方式與-轉錄單元相連接，其包含—編有一多胜狀 密碼之核酸序列，其中，該編有多胜肽密碼之核酸序列之表現係受該 甘露糖操縱子之啟動子區域所控制。 本發明經分離及純化之麵相可舰鮮pCR之實驗方法及 於目前技術水準巾職悉之綠加时離。本發龍分離及純化之 DNA序闕可包含-歧_雕之相，如目賴術水準中所熟 悉，例如-加強子，其通常被使麟加絲現由該紐賴所編碼之 產物。 為挑選可被本發明之載體或經分離及純化之核酸序列成愈龄
蛋白密碼之基因可位於該載體上或位於該經分離 及純化之核酸序列上，十、辟加、、_ 及純化之核酸序列上， 上同時送入宿主細胞中 或可依選擇以分開之形式，例如於分開之載體 可使用之各種具可選擇性之標記蛋白包括彼 17 201111505 等蛋白，其賦予宿主細胞具有抗拒抗生素，如觀黴素(spectin〇mycin)、 潮，素(hygmmycin)、胺苯甲青黴素(ampicillin)及四環黴素(tetracydin) 之能力。抗生素之用量可依需要作調整以創造選擇性之條件。通常使 用一具可選擇性之標記蛋白。 若該載體為一穿梭載體時，則可選用一與該適用宿主細胞共同具 有之標記蛋白。例如，若該載體為一可於乂嚴淨磨及择阜炎敏斧崴中 複製之穿梭載體時，則可使用編有糞腸球菌(及你觀徽 素-腺發醯轉移酶(adenyltransferase)密碼之抵抗性標記蛋白之基因，其 賦予宿主細胞抗拒觀黴素之能力。 此外’報導基因，如螢光蛋白質亦可隨著該感興趣之核酸序列一 起送入宿主細胞中以對轉化之效率進行測定。 適用之報導基因例如有彼等編有加強螢光蛋白(eGF户)密碼之 基因及編有β-半乳糖水解酶密碼之/flcZ基因。此二種報導基因皆 可由購買取得，且廣泛地被使用。 本發明之另一面向係提供一經由本發明之載體所轉化之原核 宿主細胞，其中該載體包含甘露糖操縱子之一啟動子區域。較佳 者為，該載體包含SEQIDN0.1至SEQIDN0.5等序列其中任意一 · 序列，與其等序列互補之序列及其等序列之變異型序列。 多種原核宿主細胞皆有助於被根據本發明甘露糖操縱子之可由 甘露糖誘發之啟動子區域所轉化。此等宿主包括革蘭氏陽性細胞： 菌株’諸如芽胞桿菌(5c^7/⑽)及鏈黴菌你。較佳者為，:: 該宿主細胞係屬於厚壁菌門’更佳者為該宿主細胞係為芽胞桿菌。: 可被使用之芽胞桿菌例如有#样遞#雖―飾）、摩源、 粉芽胞桿菌{β. amyl〇liqUefaciens)、地衣芽胞桿菌③Uchenif〇r_ miS、'納豆芽胞桿菌iB· natt0)、巨大芽胞桿卿' 株。較佳者為’該宿主細胞係為一袷阜麵淖磨，諸如五_嶋 ' 18 201111505 3NA 及 B. subtillis 168。 可被使用之大腸桿菌例如有TG卜W3nG、Dm、心藍色 及Origami等菌株’其等可由購買取得。 射之宿主細關如可向_保存中心、，諸如向位於德國布 *朗施威格(BraUnSChweig)之德國微生物及細胞培養保存股份有限 公司(DSMZ)購買取得。 例如，芽胞桿菌係由芽胞桿菌遺傳庫中心所取得。 宿主細胞可以或不可以代謝甘露糖。一通常能吸收並代謝甘 ' 露糖之宿主細胞，如為阜歹應#廣，可被修改成缺少一或數種與 甘露糖吸收及/或新陳代謝有關之功能。經由例如抑制或阻斷一編 有一蛋白質密碼之基因，例如編有甘露糖_6_磷酸鹽異構酶密碼之 maw/4基因之表現即可實現缺少一或數種與甘露糖吸收及/或新陳 代謝有關之功能。而此種修改可藉由已知之技術被做到，諸如由 跳躍基因所提供之致突變性或基因剔除突變等方式。 通常，原核宿主細胞與所選擇之訊號序列相對應，例如若當 使用芽胞桿菌之訊號序列時，則宿主細胞通常係同芽胞桿菌科之 - 成員，更佳者為該宿主細胞為一芽胞桿菌之菌株。 較佳者為，使用一宿主細胞，其具有一磷酸烯醇丙酮酸：碳水 化合物磷酸轉移酶系統(PTS)。尤其係該具有一 PTS系統之宿主細胞 ， 係為一芽胞桿菌目，尤其係芽胞桿菌屬及更佳者為存草歹游斧磨 .,· 種之微生物’或一腸桿菌目（Enterobacteriales)，較佳者為腸桿菌屬 * 及更佳者為大腸桿菌種之微生物。 ; CCR之主要元件為代謝產物控制蛋白A(CcpA)，其可與cre * 序列相結合，諸如與SEQIDN0.3及SEQIDN0.4等序列中推定之 * ere序列相結合。當CcpA處於結合狀態時，則各基因，此處為 Wflw/?，之轉錄即受壓制。 19 201111505 -甘露糖之存在下時，不會 且經由調控性蛋白(ManR) 置相互結合而啟動甘露糖 當铢乏葡萄糖及於一誘發劑，如D 出現因受CcpA之結合而被抑制之情形， 與甘露糖操縱子啟動子區域各個結合位 操縱子棊因之轉錄。 本發明作者意外發現ManR不僅K啟動子區域之調控性 蛋白，而且也係自己本身之調控因予。 ，本發明所提供者係為-發酵方法，其用於培養含—載體之原 核宿主細胞，該細包含料顧縣讀_縱子之—可經由 甘露糖誘發之啟動子，其可以剪接之操作方式與一含一編有一多胜 肽密碼之嫌序狀轉鮮元树接，其巾於第—頻巾，該原核宿 王細胞轉於首要碳源下，其不同於可誘發啟動子之誘發劑，並於第 二步驟中培養於該誘發劑之下。 不同於該誘發劑之碳源通常係為該宿主細胞之主要碳源，而 該誘發劑通常則係該宿主細胞次要之碳源。 主要之碳源較佳者為該等宿主細胞所消耗，因此有益於在發 酵方法中作為受質。 就大多數之原核宿主細胞而言，葡萄糖係一主要之碳源，且 於該等原核宿主細胞之發酵方法中適合被作為受質使用。 此外，本發明還提供一方法用於在一宿主細胞中製造一多胜 肽，該方法包含下列之步驟： a)建構一載體， b) 以所述之載體轉化一原核細胞宿主， c) 於適當之條件下’使所述之多胜肽於一細胞培養之系統中被表 現， d)從該細胞培養之系統中回收所述之多胜肽。 所使用之載體’與其建構及使原核細胞宿主之轉化皆如上文中 201111505 所疋義，其中該載體所包含之異源性核酸序列編有一多胜肽之密 碼。 於培養試管、搖瓶或細菌發酵槽中可應用作為細胞培養系統之連 續式或非連續式之培養，諸如批次培養或饋料批次培養。 較佳者為，本發明之發酵方法係為一饋料批次發酵。饋料批次發 酵之特徵為於沒有抽離溶液下以限定時間之方式添加受質至培養液 中。饋料可以連續或時間間隔之方式進行.一般而言，馈料批次 培養包含一批次階段，其中，使細胞於初始時生長至所要之濃度。 於此階段中，細胞大量生長，且一般沒有標的多胜肽產生，除非有 添加誘發劑。當達到所要之細胞濃度後，即以添加受質展開饋料階段。 通常，係於饋料階段進行時添加誘發劑。 於培養宿主細胞時，可使用目前技術水準所熟知之常用培養基， 諸如複合培養基，如「營養酵母菌肉汁培養基」、一含甘油之培養基， 其如 Kortz et al.，1995, J· Biotechnol. 39, 59-65 所述、一礦物鹽培養基， 其如 Kulla et al.，1983, Arch. Microbiol, 135,1 所述、一用於栝皐氧敏择 磨發酵之批次培養基，其如 wilms et al，2〇〇1，Bi〇teehn〇l Bi〇eng 73, 95-103 所述或 LB·培養基，其如 Bertram et al，1051，j. Bacteri〇1 62 293-300 所述。 ’ 培養基包含一適當之碳源，例如一單糖，如葡萄糖，作為宿主細 胞生長之受質。作為受質使用之碳源與誘發劑不同。 培養基於適當之情況下可加以改變，例如添加其他成份，諸如緩 衝劑、鹽類、維他命、氨基酸、抗生素或其他之微量營養素，其等一 般為習知技藝人士所熟知。 、 於培養細胞時亦可使用不同之培養基或數種培養基所組合之培養 基0 較佳者為，作為基礎培養基使用之培養基不應含誘發劑以便於達 21 201111505 到對甘露糖操縱子嚴密之調控。 於本發明之發酵方法中，表現係由添加適當之誘發劑後開 始。甘露糖操縱子之誘發劑係甘露糖。甘露糖之衍生物亦可被使 用於誘發甘露糖操縱子之啟動子區域或WiW尸啟動子區域。 此外’表現亦可由該原核宿主細胞所能得到誘發劑之數量而調控。 誘發劑可於培養之細菌達到一測定之參數後才開始添加。該等測 定之參數例如有光密度(OD)，其表示培養細菌之細胞濃度，或不同於 誘發劑’作為之碳源之受質濃度。 例如，於本發明之方法中，誘發劑可於培養之細菌達到適當之〇D 值，其φ該特殊之培養系統所決定，之後才被添加。就於搖瓶中進行 之批次埽養而言，其典型之測定參數〇D6QQ大約為0.3或更高之數值。 根據本發明一饋料批次培養之實施例中，於該批次培養階段中， 當培養基中僅有主要之碳源可取得時，細胞被培養至一介於2〇至3〇 〇D0qQ之細胞濃度，然後將該培養轉換至饋料階段，其中添加由主要碳 源及誘發劑所組成之混合物。於該饋料階段中，可改變主要碳源對誘 發劑之比例’其適用之比例從3: 1至！ ： 3。藉由改變主要碳源對誘 發劑之比例可將表現速率加以控制。 所添加誘發劑之數量可取決於特殊發酵之條件。 誘發劑添加之方式(即誘發制度)可依據特殊培養系統加以選擇。由 添加之方式可進-步雛宿主細胞之生長速率及表現速率。例如 於適當之時間區段以不連續或連續之方式添加誘射卜於不 式(即衝擊㈣發)中，誘發劑可於誘發點上僅僅添加—次，或於 ，間間隔上添加二次或數次。翻之方式係由該培養系統決定， 谷易被習知技藝人士所決定。 誘發劑可簡定之速率撕低/增加之 例如，於連續性之方式中， 速率被添加。 22 2〇Π 11505 . 1性之添域可於—選定之培養時_隔_施，例如於該培 養菌之心數生長期間所選定之時間間隔。 、 此外，亦可合併使用不連續或連續之誘發制度。 若誘發_以二個或更多_份份量之方式郷 崎彻㈣梅#。帛二個_ .===:Γ職之濃度、誘發劑一濃 • 1〇八二誘=核宿主細胞之培養基中之含量被調整至大約為 =么克/公升，較佳者為大約為5公克/公升，更佳者大約為2 开0 於進行饋_所添加紐歉數量可於綱細加以變化。如上 所不’改齡要麵_發狀_柯_表 細胞之密度。 卞J 1 適當之pH值範圍例如從6至8，較佳者為 養溫度介於帆與卿之間，較佳者為 為I·細被培養直至所表現之產物及/或生物質量累積至最大量 =，較佳者騎於Η、時至％天⑽，更转為條 養^生物質量之產率方面，所表現產物之數量亦取決於所使用之培 ，=瓶料巾’通常縣狀錄，其產私q 5公級升培養 •^由以本發明之載體所轉化之宿主細胞製造而得。而當利用發 八t批次及/或馈料批次方式進行培養時，可得到產量通常超過〇·5 2么升鶴液’餘者為㈣丨公祕升，更㈣為舰丨3 /公升之表現產物。 此外’於個本發主細胞之魏方法巾，可得從至少i〇〇D6。。 23 201111505 至30 〇D6〇0 ’尤其至少50 〇D6〇0，介於約5〇 〇d6⑻或更高之數值更 佳者為至少500 〇D6。。及最佳者為至少_ 〇d6。。之高細胞密度。尤 其於-根據树日狀騎減培射，可得條削—线過屬 OD6〇〇之間之細胞密度。 明白地說，1 〇D6〇0相當於平均大約每公升含〇 322公克之乾燥物 質。故，HKH固OD6。。值相當於每公升含32.2公克之乾燥物質，且娜 OD^則相當於每公升含161公克之乾燥物質。 藉由根據本發珊狀誘發财，可雜需求將發酵之重點 改變使分別於生物質量、表現產物之產出及誘發劑之消耗上達到 最大。例如，-合併式之誘發制度，其包括首先為衝擊性之誘發， 然後另外以指數速率供狀誘發劑，產生高度表現㈣於生物質 量濃度《標的多紐，其麟進—步之處理程序，如純化步驟等， 會更加有效率，並且於時間及金錢上會比較節省。 此外，根據本發明之宿主細胞容許高度之複製率而不會失去載 …根據本發明發酵方法之-實施例，培養如枯草芽胞桿菌之 值主細胞’其含-紐’該載賴帶有甘露糖操縱子之-啟動子， PmanR或PmanP ’其以剪接之操作方式與一編有一標的多胜狀密 碼之核酸序列連接於-起。葡萄糖係該枯草芽胞桿菌之—較佳之受 質。此外’甘雜健甘賴操縱子二舰動子切發劑。較佳 者為’發酵反應偏饋料批次培養之方式進行。更佳者為，於進 行批次階段時僅經由添加葡萄糖之方式使宿主細胞生長，直到達 到〇D600大約為20 i 30之細胞密度為止。於進行後續之馈料階段 時’可添加-由葡萄糖及誘發劑，甘露糖，所組成之混合物。 如同上文中所示，於混合物中葡躲與甘露糖之比例可加以 改變，例如比例從3 : 1調整至1 . ^ 冊主1.3。此外m供應甘露糖。 24 201111505 較佳者為，除甘露糖之啟動子之外，該載體還可含該調控基 因之完整或部份之序列。 經發酵及於宿主細胞表現後，所表現之產物，例如一感興趣之多 胜肽可由該宿主細胞之培養液中回收而得。為取得所表現產物之最大 產率’細胞通常於培養縣之時魏集並被畴，例如_溶菌酶處 理’超音波震盪或高壓細胞均質機(French press)等方式溶解細胞。因 此，多胜肽通常首先係以宿主細胞之粗溶解液之形式被取得。然後再 以目前技術水準所熟悉之標準蛋白質純化方法，其中包括不同之沈 殿、分子篩色層分析法、離子交換色層分析法、等電點聚焦法、凝膠 電泳法、親和性及免疫親和性色層分析法，純化該粗多胜肽。此類為 人所熟悉且經常性使用之方法例如於Ausubel et al.，supra.，及Wu et al. (eds.), Academic Press Inc., N.Y. ； Immunochemical Methods in Cell And Molecular Biology中有所敘述。例如，於進行純化以重組方式製成之 免疫球蛋白時，可應用免疫親和性色層分析法進行其等之純化，其方 法係將粗免疫球蛋白通過一含樹脂之管柱，其中，該樹脂上已接合上 許多可專一性結合所表現免疫球蛋白之標的分子。 本發明亦係關於一些用於在原核宿主細胞中進行細胞内異源性表 現一編有例如多胜肽密碼之核酸序列之方法及手段。尤其，本發明亦 關於一些載體及該等載體之用途，其於使用本發明載體之原核宿主細 胞中進行細胞内表現一異源性之多胜肽。 於細胞内之表現中，多胜肽係於細胞質内被表現，且不會從細胞 質被輸送至非細胞質之地方。多胜肽係以包涵體之形式或可溶之形式 被表現於細胞質中。從細胞中，尤其係從細胞萃取液中分離及純化多 胜肽之方法亦係為人所熟悉。 本發明之甘露糖啟動子之優點係其等可被嚴密地調控，並可被一 常見且無毒性，因此對於工業上有用處之化合物所誘發。 25 201111505 此外’本發明之甘露糖啟動子及含該甘露糖啟 =常找，且甚至於細_次之複製後亦不會流失。== 據本發明所轉化之宿主細_進行之高_密度之發酵係可行。 習知技藝人士將評估於本文中所述之發明係容許被改變及修改， 但有特別制者除外，必須要理解的係本發明包括所有該等不 偏離本發明之精神及基本特徵之雜及修改。本㈣亦包括所有於本 說明書中以個別或整體之方式所提及或指示之步驟、特徵、組成及化 合物’及包括任何與所有之組合或任何二種或二種以上所述之步驟或 特徵。本發明之揭細此必馳_胁所有之面向上進行說明，且 並不受限於此說明，本發明之範圍係由所依附之巾請專利範圍所指 明’且所有出現於同等性之含意及範_之改變皆意圖涵蓋於本文 中。所有於本綱書巾所個之參考文獻，皆獅人本文之參考文獻 中作為本說明書之揭示内容。 【實施方式】 依據下列之範例將更加完全之明瞭前述之說明。然而，該等範例 僅用於說明實施本發明之方法，而並無意限縮本發明之範圍。 I)分離及慰別甘露糖操縱子manR致動子及manp啟動子之致動子區 域 若沒有另外說明時，使用到下列之材料及方法： 細菌菌株及生長條件 大腸桿菌 JM109 (Yanisch-Perron C. et al·，Gene 33, 1985, 103-119) 及相岸θ 3NA (Michel J. F· et al” Ji. Appl. Bacteriol. 33，1970， 220-227)被使用作為選殖及表現之主要宿主細胞。令乂廣斧蔚於37°C 下生長於 LB 液體培養基中(Luria S. E. et al.，Virology 12,1960, 348-390) 及生長於被添加每當升100微克ampicillin或spectinomycin之LB遭脂 平板培養基上。此外，令敏斧磨·37°0：下生長於LB液體培養基 26 201111505 中及 C 或 S 之基礎培養基上(Martin-Verstraete I. et alv, J. Mol. Biol. 214, 1990, 657-671)。液體培養基及瓊脂平板培養基分別被添加每毫升loo 微克之spectinomycin，每毫升10微克之kanamycin或每毫升5微克之 erythromycin。於進行誘發甘露糖啟動子時，添加經無菌過濾或經高溫 高壓滅菌之D-甘露糖至末濃度為0.2 % (重量/體積)為止。 材料 所有化學藥品皆向Sigma-Aldrich (德國Taufkrichen)、Fluka (德國 Buchs)或Merck (德國Darmstadt)購買取得。人工合成之DNA寡聚核苷 酸係向Eurofms MWG Operon (德國Ebersberg)購買取得。限制酶及 DNA 修飾酶係向 Roche Applied Science (德國 Mannheim)或 New England Biolabs (德國Frankfiirt am Main)購買取得。PCR係由高保真度 之DNA聚合酶，其係向Fermentas (德國ST. Leon-Rot)購買取得，於一 由Biozyme購買取得之MiniCycler機器上進行。 DNA之製備及轉化 從乂廣岸磨及#阜束敏#苈或從瓊脂凝膠中分離DNA係利用 Qiagen (德國Hilden)或Roche (德國Mannheim)之DNA製備套組試劑 及依據製造商所提供之說明下所完成。於所有本發明之範例中皆使用 標準之分子技術。 乂廣#著係依據 Chung C. T. et al.，Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 1989, 2172-2175中所述之方法由質體DNA所轉化。拍享束趙斧奢則 係依據修改後之「巴黎方法」（Harwood C.R. Molecular Biological Methods for Bacillus, 1990, John Wiley & Sons Ltd.，England)由質體 DNA所轉化。 β-半乳糖水解酶活性之測量 於37°C下，將0.1毫升之待測細胞(其被置於〇.9毫升之Ζ-緩衝溶 液中)以10微升之甲苯處理30分鐘。然後依據Miller之方法(Miller J. H. 27 201111505 1972，experiments in molecular genetics，Cold Spring Harbor，NY),於 22°C 下以鄰-硝基苯-β- 〇比喃半乳糖苦(0_n]tr0phenyi_p_gaiact0pyran0_ side)測定β-半乳糖水解酶之活性。 所使用之寡聚核苷酸 表1· 寡聚 核苷酸 序列 用途 S4693 5’·ΑΑΑ AAA ACG CGT GTT TAA ACT GAA TTT CTG CTG AAT ATACA-3’ 以PCR擴增括享裏磁舁 菌之ma/tR基因 S4694 5'-AAA AAATCTAGAAAGTGTGAA TAA TAA GAT CTT G-3* 以PCR擴增括享束始舁 磨之基因 S4802 5’-AAA AAA ACTAGTGTTTAAACAGGG AAA AAT GCC TTT ATT AC-35 擴增Λ»βηΛ«時所使用之 正向引子 S4833 5，-AAAAAAGTTTAAACCCCTGGCGAA TGG CGAT-3， 從PDG1730質體擴增 spc S4835 5，-AAA AAA GAA TTC ATT AGA ATG AAT ATT TCC CAA AT-3’ 從pDG1730質體擴增 spc S4956 5’-AAT TGC GTC GAG ACC CCT GTG GGT CTC GTT TTT TGG ATC CGG CGC CCA CGT GGC TAG CC-3' 插入終止子 S4957 5，-TTA AGG CTA GCC ACG TGG GCG CCG GAT CCA AAA AAC GAG ACC CAC AGG GGT CTC GAC GC-3' 插入/«/4終止子 S5006 5’-Cy5-TAGCCTTTTTTATAGTTGTTCAGC CAC TGT-3’ 用於引子延長之標記引 子 S5007 5，-Cy5-ATCCACGCCATAATGCATGCCGCC ATT AAT-3’ 用於引子延長之標記引 子 S5097 5,-Cy5-CACTGTACCCTATCTGCGAAA-3, 用於引子延長之標記引 子 S5098 5’-Cy5-ATTGAGATAATCCTCGATCACTT_3’ 用於引子延長之標記引 子 S5203 5,-GATATCCTGCACCATCGTC-3, 用於擴增使用於啟動子 研究之基因之逆 向引子 S5208 5，-GGTACCATTTCTTGCTGAATA-3, 從 pSUN279,2 擴增 Ληα/ι/Γ 區域 S5209 5 ’ -CTTA AGCCTGTC AGTATCTACTTG AG-3 ’ 從 PSUN279.2擴增 尸區域 28 201111505 s5262 5，-AAAAAAGCTAGCGTTTAAACAAAAAGCGATTTTAAT 擴増時所使用之 GAGCTG-31 正向引子 實驗1 : 分離攜帶甘露糖操縱子啟動子區域之DNA片段，並測定 manR啟動子及manP啟動子之轉錄起始點。 利用Qiagen (德國Hilden)之DNeasy血液及組織套組試劑分離 抬享炎敏斧葳168之染色體DNA。 ' 利用PCR及使用s4693/s4694等引子從所取得之DNA上擴增一長 度大約為2300個驗基對，具有含推定啟動子之完整^基因 及介於wim及及尸間之間隔區域之DNA片段。 所取得長度大約為2300個驗基對之DNA片段被用於測定所⑽及 啟動子及户啟動子轉錄起始點之引子延長試驗中。 為分離用於引子延長之mRNA，由乂摩淨^^^pK^OH^Alten- buchner et al.，1992, Methods Enzymol. 216, 457-466)及由#草穿·/敏斧菌 載體 pUBllO (MacKenzie et al.，1986, plasmid 15, 93-103)建構一穿梭因 子。該載體含/只基因為報導基因，其編有模仿葡萄球菌(及叩知/〇_ • 如—⑽)之成熟型溶葡萄球菌酶之密碼(Recsai et al，1987, pr〇e
Natl. Acad. Sci. USA 84, 1127-1131) 〇 將該長度為2300個鹼基對之DNA片段選殖到該高度複製之 ! pUBU0衍生質體位於該溶葡萄球菌酶基因之上游處。所生成之質體被 •“ 命名為PSUN178.4 ’並被送入#享炎敏斧磨'3NA中。 - 使含pSUN178.4質體之栝·#絲岸磨皿生長於含kanamycin之 _ LB培養基中。當達到指數生長期時，以〇 2 %之甘露糖誘發該培之 ：細菌。經過37〇c下生長1小時後，將經誘發及未經誘發之細胞加以收 集°接著利用Qiagen-RNeasy Mini套組試劑分離全部之RNA。 使用於5’-端以Cy5標記之引子s5〇〇6、s5〇〇7、s5〇97及s5〇98。 29 201111505 引子s5006及s5007分別與由溶葡萄球菌酶基因起譯密碼子起算 從鹼基對+21至鹼基對+50之片段及從鹼基對+76至鹼基對+105之片 段進行雜交。引子S5097及S5098則分別與由及基因起譯密碼子起 算從鹼基對+81至鹼基對+101之片段及從鹼基對+131至鹼基對+153 之片段進行雜交。 同樣之引子被使用於pSUN178.4質體DNA之定序反應，其被作 為長度標準品。此外，分別使用由Roche購得之AMV-反轉錄酶及 T7-DNA聚合酶於反轉錄及DNA之定序上。反轉錄及定序之產物然後 被分析幹一變性之聚丙烯醯胺定序凝膠(GE healthcare)上。所有其他試 劑皆由 Amersham Pharmacia Biotech AutoRead Sequencing kit 所提供。 /mmP-啟動子之轉錄起始點係利用引子s5〇〇6所測得。預備相同引 子之pSUNl 78.4質體DNA序列反應，並將其於同樣之變性凝膠上展 開以作為比較。圖一顯示mim尸啟動子周圍之DNA序列，其中，突顯 位於A,(腺嘌呤核苷酸)上之轉錄起始點。被推定之_1〇及_35框盒係以 斜體字表示，基因之尾端及/γ基因之起始端係由箭頭標記所 標示，限制酶5g/II、、4/ΠΙ及M/el之剪切位置被標示於序 列之下方。 /«⑽及啟動子之轉錄起始點係利用RNA分離及DNA定序所測 得，該測定係依據上文中所述之方法進行，即針對於所⑽户_啟動子， 但除使用引子S5098外，其與waM基因結合。 於圖二及圖三中顯示/«⑽及啟動子區域之DNA序列，其中突顯位 於G (鳥糞嘌呤核苷酸)上之轉錄起始點，被推定之_1〇及_35框盒係以 斜體字表示，/y基因及基因之起始端分別由一箭頭標記所 標示。限制酶剪切位置及一經推測之序列被標示於該序列之下 方。 當細胞受甘露糖之誘發時’由洲功及啟動子，尤其係由 201111505 . 啟動子之轉錄會強烈地增加，此可由引子延長試驗中非常強烈之 • 訊號觀察到。 所有使用之引子被呈示於上文表1中。 實驗2 根據實驗1之方法所進行之引子延長試驗定位出啟動子 之轉錄起始點係靠近介於麵基因及_p基因起點間間隔區域 之3，-端。於測定所⑽P之啟動子區域時，以PCR擴增法逐步更精 確地縮短長度為2300個鹼基對之DNA片段，然後將所得不同長度之 序列片段以選殖方式接回到相同之基本表現載體上，接著進行表現之 研究" a)建構基本表現載體 建構一表現載體，其具有不含啟動子之如cz為報導基因。該表現 載體被設計成-穿梭載體之形式，其能於於草彻岸磨及乂腐痒磨中 複製，並且被命名為pSUN272.1。 報導基因/(3cZ係以限綱廳1及為j &質體pLA2上切割出 (服―咖 Α·过 al.，2001，J. Bacterid. 183, 6384_6393)，然後被接進質 體PJOE5531.1巾’該質體係為一可經由鼠李糖(rham_)誘發之表現 載體 pWA21 之衍生載體(Wegerer et al，2〇〇8, BMC愚敗福 8, 2)， : 其於办扣1之位置上含被草·岸廣'轉錄終結子。於此質體中， :於葬n I限制酶之剪切位置之間插入一對寡聚核皆酸 :s4956/4957以於仏z基因之上游處加入相同之輯錄終結子。故， ；該等終結子避免由質體啟動子「讀穿」進入/acZ基因中及由/沉Z基因 谓穿」進入一侧之質體序列中。針對於乂廣岸獻故斧彦二 • 者之抗sPectinomycin基因係以寡聚核苷酸s4S33/4835從質體 PDG1730 上被擴增(Geurout-Fleury et ai” 1996, Gene 180, 57-61)，然後 •被插入前面所得到之質體中。此外，藉由刪除一 之片段 31 201111505 以縮短乂廣斧磨之載體部份，接著將一含#裏尹廢斧磨pMTLBS72複 製原點之五eo/ilA^I 片段(Lag〇dich et al.，2005, Mol. Biol. (Mosk) 39, 345-348)接進該質體中。 ’ 藉由4/πι及之切割及黏接，將實驗1中所取得長度為23〇〇 個鹼基對之DNA片段插進psun272.1中基因前之位置，結果得 到表現載體PSUN279.2，該質體之圖譜如圖四中所示。 所有使用之引子被呈示於上文表1中。 b)測定載體pSUN279.2之表現效率 將上文a)中所取得之質體pSUN279.2及pSUN272丨送入#享襄敏 #^3NA中。後者係作為背景對照。讓攜帶一或另一質體之於莫顏 务奢3NA菌株於添加SpectinomyCin之lb培養基中生長，然後於達到 扣數生長期時將0.2 %之甘露糖、〇.2 %之甘露糖加上0.2 %之葡萄糖或 無單糖(播誘發對照)添加至該等培養之細菌中以進行誘發。經一小時之 誘發後，依據Miller之方法測定該等細胞β_半乳糖水解酶之活性。結 果呈示於圖五及圖七中。 未經誘發，含PSUN279.2之抬享束游#廣之培養菌顯現出一相當 高基礎水準之β·半乳糖水解酶活性。甘露糖之存在造成半乳糖水解 酶之活性又增加4倍，而以甘露糖加上葡萄糖誘發之活性則呈下降， 但仍超過基礎水準相當之幅度。此等結果明確指出於^^_792上所 觀察到之啟動子活性係源自於介於及户間之區域，或源自於 上游之區域或源自於二者。 ' 因此’藉由切除如圖四中所示PSUN279.2介於拆I及价《1間之 2300個鹼基對之DNA片段，讲⑽及之上游區域及历奶及之大部分皆從 PSUN279.2中被刪除，結果得到質體pSUN284.1。 於圖六中顯示所得到pSUN284.1之核酸序列。 將襄應痒邊'3NA以質體PSUN284.1進行轉化，接著依據上述 32 201111505 之方法測定表現效率。該結果呈示於圖五中。由圖五中可見，於存享 歹邀斧廣'3NA中之去除騰禎之載體PSUN284.1，相較於於於享裏敏 岸蘑3NA中之PSUN279.2 ’顯現出僅有大約一半基礎水準之卜半乳糖 水解酶活性，而於甘露糖之誘發下載體pSUN284 1甚至顯現出活性較 強烈之增加，但於葡萄糖之存於下卻又再度顯現出較強烈之下降。此 等結果證明/mwP啟動子位於之間，並顯示出^之 染色體複製體即足以調控所有於該等低度複製質體上之w⑽户啟動子 複製體。 c) /mmP敌動子區域之定位 於進行wimp啟動子區域之定位時，除該經縮短之pSUN284丨之 DNA片段外，由該長度為2300個鹼基對之DNA片段經由於讲伽尸啟 動子之轉錄起始點上游處不同之位置上於如圖六所示之限制酶切割位 置上及限制酶之切割下製備進一步縮短之序列片段。 由mcm户之轉錄起始點上游處往下刪除至鹼基對_81及鹼基對·8〇 產生第二個經刪除之序列，其包含SEq ID N〇.丨^另外一刪除係由所⑽户 之轉錄起始點上游處往下進行至驗基對_4i及驗基對_4〇 (第三個經刪 除之序列）。 以類似於上述2b)中質體PSUN284.1建構之方式建構含第二個經 刪除序列之質體pSUN290及含第三個經刪除序列之質體psuN297.5， 其方法係將由引子對s4802/s5203及引子對s5262/s5203所擴增出之 PCR產物分別插入經由限制酶及及iV/zel切割之pSUN272.1中。 將質體送入#罩篆敏舁菌'3NA中，並依據上文的中所述之方法進 行培養。經一小時之誘發後，依據上文b)中所述之方法測定該等細胞& 半乳糖水解酶之活性。該試驗之結果呈示於圖七中。 如圖七中所示，於含pSUN290及pSUN284.1之菌株當中沒有任 何一者於關於甘露糖誘發/ί^Ζ基因方面顯示出顯著之差異性。然而， 33 201111505 於包含攜帶第三個經刪除序列之PSUN297.5之存享束趁岸磨3NA中， 甘露糖之誘發作用卻完全被消除，且基礎表現水準近乎等於〇。由此 等結果可仔到結論’即wiwiP甘露糖啟動子區域之ManR結合位置位 於由》轉錄起始點算起之驗基對-80及驗基對-35之間。 實驗3丨imiiii?致動子之測定 a) ere序列之鑑別 因大多數之CCR係通過代謝產物控制蛋白A(CcpA)居間導引，故 利用Clone Manager程式中DNA序列對比功能於整個甘露糖操縱子中 進行個別結合位置（ere序列）之研究❶共同序列 5’·胃TGNAARCGNWWWCAWW_3’被作為序列對比使用。 只有在wawi?之啟動子區域中發現到-·如圖二及圖三中所示之推 測ere序列，其位於-10框盒之下游處。 本發明之SEQ ID N0.3包含起自鹼基對_122往下至/如2基因之起 譯密碼子之區域，SEQ IDN0.4包含起自鹼基對_122至鹼基對+7 (包含 在内)之區域，及本發明之SEQ ID N0.5包含起自於圖三所示之序列之 驗基對-122至驗基對-1 (包含在内)之區域。 b) wia/ii?敌動子表現效率之評估 為評估maM啟動子表現之效率，依據上文中所示之方式建構— 表現載體，如PSUN284.卜並被命名為pSUN291。於建構該載體時， 用引子對s5208/s5209及作為模板之線形化質體pSUN279 2擴增—含 推測之啟動子及大約600個位於桃讲认基因上游處之鹼基對 DNA片段，並將其於限制酶尤及却瓜之切割及黏接下插進質體 pSUN272.1之/acZ之前端處。 該DNA之序列呈示於圖三中。 將質體PSUN291送入拍阜雜岸彦皿中，並依據上文於實驗 2b)中所述之方法測定β_半乳糖水解酶之活性。 34 201111505 該試驗之結果呈示於圖五中。於此’基礎表現水準已相當高，且 於添加0.2 %甘露糖後表現又再增加大約3倍。添加葡萄糖造成半乳 糖水解酶之活性被壓制到幾乎為基礎表現水準。 此結果指出WflW啟動子並非一微弱之結構性啟動子，而係會受 •甘露糖及CCR之調控。 θ c) imm及敌動子區域之定位 - 如於實驗2c)中進行waM DNA序列啟動子區域進一步之定位 時’由含藏於pSUN291中之DNA序列經由於wiwP啟動子之轉錄起 始點上游處不同之位置上於如圖三所示之限制酶切割位置上及限制酶 之切割下製備不同長度之序列片段。 經由切除如圖3中所示至轉錄起始點G上游處往下至鹼基對_1〇〇 及鹼基對-99產生第一個經刪除之序列。第二個刪除序列係經由切除轉 錄起始點G上游處往下進行至鹼基對-83及鹼基對-82。 依照實驗2c)之方法，將所得之第一個及第二個刪除序列接進 PSUN272.1中’所生成之質體分別被命名為pSUN384.l及PSUN385.2。 將每種質體送入#享穿龙斧廣'3NA中，並依據實驗2b)中所述之 ‘ 方法進行培養。經一小時之誘發後，依據實驗2b)中所述之方法測定該 • 等細胞β-半乳糖水解酶之活性。該試驗之結果呈示於圖八中。相較於 , PSUN291 ’ pSUN384.1於關於甘露糖誘發torZ基因方面沒有顯著之差 _ 異性。然而，於包含攜帶第二個經刪除序列之pSUN385.2之#享炎敏 '· 岸磨"3NA中，甘露糖之誘發作用卻完全被消除，且基礎表現水準近乎 等於0。由此等結果可得到結論，即啟動子區域之ManR結合位 - 置位於由轉錄起始點算起之鹼基對-99及鹼基對-35之間。 II)使用甘露糖操縱子之啟動子區域於高細胞密度之發酵中 實驗4:轉化作用 - 利用一攜帶本發明啟動子區域之模型宿主於測試其生長及表現之 35 201111505 能力。使用如圖六中所示於質體PSUN284.1中所介紹及於實驗&中所 使用之啟動子區域核酸序列，建構如下文中所示之質髀 PMW168.1，並以轉化之方式將其送入作為宿主之栝皐裏敏岸劈3n^ 中。 a)質髗pMW168.1之建構 如實驗2a)中所示’除不以仏Z而使用eGPP為報導基因外，設計 一能於本·享多游岸彦及乂廣岸葳中複製之穿梭載體。同時之轉 錄起始區域亦以识迅基因(Stress protein; Jttrgen et al.，supra)之轉錄起始 區域取代之。 ° 此外’eGFP之起譯密碼子及緊跟在該起譯密碼子後面之六個密碼 子亦被取代。 所得之啟動子區域及轉錄起始區域之圖式結構呈示於下文中：
Sfif/ll AflU BamHl
所示者為基因（箭頭)及區域(框盒)之排列，及一些有關限制酶 之剪切位置。 大致而T，質體PMW168.1係由下列流程圖中所示之步驟所製 得0 36 201111505
於該流程圖中，所使用之載體DNA、插片DNA及互補性寡 聚核苷酸之名稱皆如框盒中所示；於PCR產物方面，引子對及模 板DNA皆如括號中所示；所使用之限制酶皆示於其各別之位置 上。 所有選殖之步驟係以乂廣#^JM109所進行。 所使用之質體有PUC 18,其為一陽性篩選及PCR產物之選殖 載體’含抗 ampicillin 之能力（Yanosch-Perron et al.，supra); , PWA21，其為一適用於乂I淨磨之表現及選殖載體，含抗 ampicillin 之能力（Wegerer et al” 2008, BMC Biotechnol. 8,2); PSUN202.4 ’其為一由pUB 110所衍生之載體，具有尸啟動子 - 區域及抗⑽(/此////«與«之能力，係為適用於乂|择磨及 - 於芦裏應岸廣之穿梭載體；及pSUN266.卜其為一由puc 18所衍生 之載體’具有介於ter-序列及啊之間之嵌入位置及含抗ampicillin 之能力。 所使用引子對之序列呈示於下表中： 37 201111505 說明 /w/4TI-區域 TI-區域(互補） /Ά 子 PntanP-eGFP /*·引子尸/Wflrt 尸 /•弓\子 repipUBUO) 引子 rep (pUBllO) 名稱 4列S’—3, s5019 ttaagCTCTTAAGGAGGATTTTAGAATGGCTAAAGAAAAATTCg s5020 ttaagGAATTTTTCTTTAGCCATTCTAAAATCCTCCTTAAGAGg
s5139 aaaaaatgatcaTTACTTGTACAGCTCGTC
s5156 aaaaaatgatcaccggtCG ATTGCC AC ATTAAAGG
s5234 aaaaaaccgCTCGTCTTCCTAAGCATCCT
s5235 aaaaaagaatTCGAGATCAGGGAATGAGTTT 55236 ttaagAATTAAAGGAGGAATTCAAAATGGCAGACAATAACAAAg gs/β 77-區域 55237 g马tccTTTGTTATTGTCTGCCATTTTGAATTCCTCCTTTAATTc gsiB TJ-區域(互補) 包括起譯密碼子及於該起譯密碼子後面之密碼子在内之轉錄起 始區域之取代係於使用互補性寡聚核苷酸及經由5g/II、々ni及 等單一限制酶剪切位置下所進行。該載體之建構起始於以 磨之轉譯起始區域分別經由互補性寡聚核苷酸S5ο 19 及 s5020 取代載體 pWA21 (Wegerer et al·，supra)之 T7 基因 10 之轉 錄起始區域。於進一步之選殖步驟中，該轉錄起始區域又被识诏 之轉錄起始區域所取代。最後之質體pMW168.1含rep基因且包 括 pUBll〇<ori+在内。 圖九中呈示PMW168.1之質體圖譜。 b)結構安定性之測定及分離 將於享裏應岸邊"3NA以質體PMW168.1轉化，然後測定細胞分 裂(分離)時質體結構之安定性及質體穩定之增殖。 將經由質體PMW168.1轉化之栝草裏應样苈3ΝΑ先於LBspc_培 養基中培養，然後將其轉移至無選擇壓力之LB〇_培養基中進行培養。 培養係淤取下進行。於絲生仙財時，料個培獅接種至新 鮮之lbq-培養基中。重複此步驟，直到得到1〇〇個世代為止，計算依 據所測得之OD值嚐躲解至鱗之培秘時依_ H_〇d过 38 201111505 al., 1990, Molecular Biological Methods For Bacillus, John Wiley & Sons Ltd.所修改之方法所得到。 結果呈示於圖十中。 經過大約15個世代後，有超過99.9 %之細胞及甚至於經過2〇個 世代後有大約90 %之細胞仍攜帶此載體。只有從大約第25個世代起， 有愈來愈多之細胞流失掉此載體。 於測定質體結構安定性時，由20個經過15個世代之菌落中分離 質體。從每個分離得到之質體取大約0.5微克與從作為對照組之乂| #磨所分離得到之pMW168.1利用瓊脂凝膠電泳進行比較。結果 於質體與對照組之電泳中並未觀察到有差異性之存在，顯示無出 現結構上之變異。 此等結果顯示質體PMW168.1不僅於結構上具有高度之安定 性，而且亦具有穩定之分離，其係為發酵中所需要。 實驗5 :發酵 將經由含eGF尸報導基因之質體所轉化之栝草晃敏 #WNA進行六輪發酵’其中，實施不同之誘發制度，並於線上以觀 察eGFP螢光訊號之方式進行監測。 所使用之發酵培養基係已知使用於乂廣斧磨高細胞密度發酵之 培養基，如於 Wilms et al.，2001，Biotechnol. Bioeng. 73, 95-103 中 所揭露’及如下文中所示。 材料及方法 大致上，使用亦適用於發酵實驗之標準分子技術，若無其他 之說明時。 光密度 使用 Amersham Bi〇science 公司之 ultr〇spec 11〇〇pr〇 型之分 光光度計，依據製造商所提供之使用方法於6〇〇 nm下進行測量光 39 201111505 密度(OD)。 乾燥生物質量濃度之測定 使用Ohaus公司之MB 83 5 Halogen型之濕度測量計測量乾燥 生物質量之濃度Cx。 以分光光度計測量螢光 以TECAN公司之GENios型多功能判讀機分析eGFP之表王見 及螢光，其中使用判讀機軟體X Fluor 4 (version V4.11)，其具有 下列之測量參數： 測量參數 數值 激發過爐片 485 nm 〜 發射過濾片 535 nm 增益(徒手操作） 60 ~ 積分時間 20微秒 ' 閃光數 3 判讀方式 頂部 發酵槽中之線上螢光測量 於發酵進行期間，應用螢光探針(Micropack HPX-2000, High Power Xenon Lightsource of Ocean Optics, Inc.; S2000 fiber optic spectropieter)線上監測eGFP之表現。 測量參數呈示如下：激發過滤片485 nnv發射過滤片535 nm， 過濾片0.6)。使用Ocean Optics SpeetraSuite軟體作為數據之記錄 及儲存。 螢光係以相對螢光單位(RFU)表示。於取得4.000 RFU前不久 之時間，將積分時間由50毫秒改成25毫秒，然後再改成10毫秒。 於此等情形中，測量值分別增加為2倍及5倍。 預培養菌之培養 將一顆菌落置於一 LB瓊脂平板培養基上，並於5毫升含〇.02 A (重量/體積)之酶蛋白胺基酸(CA)及抗生素之Spizizens基礎培養 201111505 基(SMM)中隔夜培養。將 _ 〇.〇2 % («/_)切蛋培養麵加至Μ毫升含 於37〇C下於- 250毫升之^基酸(CA)及抗生素之麵中，並 將10亳井之你益^ 瓶中培養5至6小時(預培養菌D。 將1〇毫狀預培養菌1添加至200毫升含每公升5公克_糖1 5^37〇CT^ 2 (預培養菌2)。於接種至發酵槽時，使用〇D6。。介 培養菌2。 π 發酵 大致上，發酵係依據Wilms et al，2〇〇1，Bi〇techn〇1所〇哪乃， 95-103之原理下進行。 ’ 當作為碳源之葡萄糖完全被用盡時，批次模式即立刻被轉換 成饋料批次模式。 經由於饋料批次階段中以指數方式添加饋料溶液下，可得一 固定之生長速率為μ = 0.10 h·1，同時避免代謝產物經由葡萄糖之抑 制，因為葡萄糖被細胞直接消耗掉。 蛋白質分析 所收集到細胞之粗蛋白萃取物係經由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電 泳方法所分析’其中，聚丙烯醯胺凝膠含3 %之上層凝膠及12 % 之分離凝膠，其等之組成如下··___ 组成 _ 上層凝膠(3 %) 分離凝膠(12 %) 去離子水 3.00毫升 6.70毫升 TRIS 0.5M pH 6.8 1.25毫升 - TRIS 1.5MpH8.8 5.00毫升 SDS 10%(重量/體積） 0.05毫升 0.20毫升 丙烯醯胺30 % (重量/體積） 0.67毫升 8.00毫升 APS 10 % (重量/體積） 0.05毫升 0.10毫升 201111505 TEMED 0.005 毫升 0.01 毫升 此處使用Biometra公司之雙迷你凝膠鑄膠槽鑄造凝膠。 於進行蛋白質變性時’將12微升之蛋白質混合物與3微升之 5 X SDS-應用緩衝溶液混合，並於950C下於一 Eppendorf公司之 Thermomixer 5438 (加熱混合器）中酿釀反應5分鐘。經冷卻至室溫 後，將樣本以離心方式分離，並將其全部放置於凝膠上。 於上層凝膠中進行分離時，所使用之電流為10毫安培，並於 溴酚(bromphenol)之前端抵達上層凝膠後將電流增加至2〇毫安 培。於分離時所使用者有lx SDS-電泳緩衝溶液及R0th公司之長 度標準品ROTI®-Mark。當溴酚之前端完全離開膠體後，電泳即告 結束。為偵測不同之蛋白質色帶，將凝膠及Coomassie染劑溶液 於室溫下酿釀反應30分鐘，接著再以脫色溶液於室溫下繼續處理 30分鐘。為將殘留之淡藍色背景從凝膠中去除，將凝膠置入75% 之醋酸中醞釀數小時。 緩衝溶液之組成與染劑溶液及脫色溶液之組成如下所示: 緩衝溶液/溶液 组成 Cooma$sie染劑溶液 Coomassie R250 Coomassie G250 乙醇 甲醇 冰醋酸 去離子水 2.0公克 0.5公克 425毫升 50毫升 100毫升 加至1.0公升 脫色溶液 乙醇 冰醋酸 去離子水 450毫升 100毫升 45〇毫斗 5 X應用緩衝溶液 TRIS/HC1 (2M, pH 6.8) EDTA SDS(40% (重量/體積)） β-巯基乙醇(純質） 甘油(86 % (體積/體積)） 溴酚藍 去離子水 6.25毫升 0.M6公克 6.25毫升 2.50毫升 29.00亳升 0.05公克 加至5〇秦升 42 201111505 - 10 X電泳緩衝溶液
TRIS 甘胺酸 SDS(20% (重量/體積)） 去離子水 30公克 144公克 50毫升 加至1.0公升 其中，TRIS係為三(經甲基)氨基甲燒(tris(hydroxymethyl)amino-methane) ; SDS 係為十二燒基硫酸納(sodium dodecylsulfate); APS 係為 過硫酸铵(ammonium persulfate) ; TEMED 係為 Ν,Ν,Ν’,Ν’-四甲基乙二 胺(N，N，N’，N’-tetramethylethylenediamine) ; EDTA 係為乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid)。 基因表現之謗發 於謗發基因表現時，有數種添加誘發劑溶液之方式(誘發制度)被進 行評估： 又 1. 於一特定之時間點添加單一份量(衝擊性誘發） 2. 衝擊性誘發結合另外一次經一段時間間隔之謗發，其中， -該額外之添加係以固定之速率逐步增加用量或 -該額外之添加係以指數增加速率之方式進行， 3. 當達到一特定之細胞密度後開始添加誘發劑溶液。 表2 :所使用之培養基 培畚基 组成份 濃度 LB〇-培養基(pH 7.2) ϋ蚕白
硫酸銨 鱗酸二 檸檬酸鈉 ϋΐΐ 硫酸鎂 D-葡萄糠 去離子永
00 於诀枯草芽胞桿菌發 酵之批次培春甚 檸檬酸氫二铵
43 201111505 _硫酸銨 0.50公克/公升 氯化銨 - 0.50公夯./公井 磷酸氫二卸 14_60公克/公升 鱗畴τ氫鈉X結晶水 4.00公杳7公井 25.00公克/公升 硫酸鎂Ππϊ? 2.00毫井/公升 TESWWi^rV— 3.00亳井/公井 1:1分開被滅菌爸滅菌。 微量元素溶液(TES) 氯化鈣X2結晶水 0.50公克/公井 氯化鐵^晶水 16.70公克/公井 幺二四乙酸二制 (Na2-EDTA、 20.10公克/公升 硫酸鋅X 7結晶水 0 18公弃./公并 」硫酸盆X結晶氽 0.10公克/公升 硫酸銅X 5鮭耳水 0 16公夯./公井 氯化亞姑X 6結晶水 0.18公克/公升 分別以2M之氫氧化鈉水溶液及1M之氫氯酸水溶液調整pH 值。於瓊脂平板培養基，另外再添加BD公司之Eur〇agar 15公克/ 公升。所有培養基皆於121。(： 了以滅菌爸減菌大約3〇分鐘。 發酵第1輪：衝擊性謗發 發酵第1輪係於- 3〇公升之反應槽(Bi〇engineering之D598 及D596)内進行。批次體積為g公升。由於取決於〇〇6。。，故接種 200至400毫升之預培養菌2以將起始之〇D6〇〇調整至〇 ι。 於進行批次階段，溫度為脚隔夜，並於經過12小時後， 將溫度增加至37。(：。雜個發酵階段巾，加人％ 氨水將PH值調整至大約7.0。通氣率可上調至3〇公升/分鐘體$ 批次階段開始進行時’通氣率為1Q公升/分鐘。 饋料培養基I及II之組成被呈示於下表3中。 表3 .備料培養基I及；q之如味 组成#科培ϋ srapsir 396.00公克/公^_ ㈣水 201111505 . 去離子水_ 加至4.2公升 去離子水__加至1.0公升 *微量元素溶液 pH 7.0 * 培養基I及II係按其等之與總體積之比例，亦即係4.2:1.0 (相 對應於總饋料F中有80.8 %之培養基1及19·2 %之培養基II)被添 加0 於饋料批次階段開始時之謗發時，0.2 % (重量/體積)之D-甘 露糖係以一次性份量之方式被添加。 圖十一 a及圖十一 b中分別顯示乾燥生物質量之濃度及受監 測之螢光訊號。 ' 於該圖中’乾燥生物質量之濃度Cx係以對數之方式與培養時 間繪製對應點。批次階段及饋料批次階段係以垂直線做分隔。 於535 nm發射波長所監測得到之螢光訊號與培養時間繪製對 應點。箭號表示誘發點。 由圖十一 a’結果得到最大之乾燥生物質量(dm)濃度為82.75 公克之DM /公升’其相對應於大約970公克之DM，以11.7公升 之反應體積計算。 於總共71.5公克之誘發劑中，D-甘露糖於第1次添加中被消 耗掉16公克。 於整個饋料批次階段中，比生長率μ為〇.10小時。 ▲ 如圖十一 b中所示，螢光訊號於第一次添加D_甘露糖後強烈 增加，並於該饋料批次階段之前五個小時達到一大約為2,2〇〇rfu 之最大值。然後，該訊號便持續下降。吾人假設此種表現之降低 -； 係因為謗發劑被消耗及/或因增加細胞量後所造成之遮蔽效應。於 37小時後加人另外-次之〇.5 % (重量/體積)之甘露糖造成勞光訊 -· 號再次增加’其達到2，100RFU之數值。 發酵第2輪：固定速率之合併式誘發 . 重複如第1輪中相同之程序，除添加誘發劑之方式經改變外。 45 201111505 如於第1輪中，0.2 % (重量/體積)之D_甘露糖溶液係於饋料批次 階段之起始時間點以一次性之份量之方式被添加。而第二部份之 «•秀發劑則係於RFU達到第1輪勞光訊號曲線之轉折點，，時 立即開始進行添加。 於進行第二個添加步驟時，20 % (重量/體積)之甘露糖溶液係 以固疋<速率被添加，其逐步增加數量，平均速率為〇 公克/ 分鐘，真到所有第二部份被添加完畢為止。 於圖十二a及圖十二b中呈示結果s其顯示乾燥生物質量濃 度及螢光訊號曲線，誘發方式與圖十一 &及圖十一 b中相同。於 圖十一 b中以㈣tfj±5添加第—個部份之時間點及添加第二個部 份之開始及結束之時間點。 由圖十二&之結果可見’最大之乾燥生㈣量濃度為㈣公 克之DM/公升，其相對應於大約804公克之舰，以u 9公升之 反應體積計算。總共⑼-妓第二次添加)有7()公克之d_甘露糖 被添加。 相輕於第1輪，生物質量之產率減少17 %。此與於進行饋料 批次階段時較低之比生長率，μ = _小時.！，有關，而比生長率 於進行,批次階段時為0.43小時-1。 由圖十一 b之、、果可見，於25小時後達到大約4,9⑽处之 最大螢光訊號，然後持續下降至大約25〇〇Rpu。 相較於第1輪，於第2輪巾表現衬增強12G%，其中生物 量之濃度微微下降。 發酵第3及第4輪：指數速率之合併式兮路 於第3 M 之小型實驗室發酵槽 (Bioengineermg公司之小型實驗室發酵槽）。批次體積(批次培 加上接種液)總共為1.5公升。由於取決於〇D6⑽，故接種⑽至 46 201111505 200毫升之預培養菌2以將起始之〇 整至〇 ι 料批次二階段中之溫度為3?c。於進行發酵時1 Μ 及積锖 ，積)=風水，pH值調整至7.0。於發酵期間，將通氣率固定在2 么升/刀鐘。氧氣之輸入係由攪拌器之旋轉速度做調整。發酵之壓 力於=始時為13巴，然後被增加至丨5巴以增強所需要氧氣之輪 入。當碳源，葡萄糖’完全被消耗完畢後，批次操作 ^ 料批次操作。 不像第2輪，於第3及第4輪中，謗發劑係以指數方式增 加之速率被添加。此外，含葡萄糖之培養基丨與含謗發劑之培 養基II 一同被添加。饋料培養基〗與Η之組成如下表4中所 示： 饋料培養基II ~~ 濃度 2〇〇公及/公IF ' 40毫升/公升 3.85公克/公升 63.36公克/公升 加至0.25公升（第3輪) 加至1公井（第4輪、
_表4 :饋料培養基I及Π之組成 饋料培養基I 成澧庶__组成 D·葡萄糖 200公克/公升 D-甘露糖
TES 40毫升/公升 TES 硫酸鎂 3.85公克/公升 硫酸鎂 磷酸氫銨 63.36公克/公升磷酸氫銨 去離子水 加至1.0公升 去離孚水 所有饋料培養基I及II之組成份皆分開被滅菌釜所滅菌。 因為組成份;谷解度之關係，一種培養基之pH值皆以85 % (體 積/體積)之磷酸調整至3.3。 於時間t之總饋料F係由下列之公式所計算：
Mset ^ * V〇 Cs〇 其中m=維持係數.(0.04公克公克‘1小時-1) Yx/S=生物質量相關於受質之比產率係數(葡萄糖為0.5) F(t) Υχ/s +m 201111505 cx0=於饋料批次階段開始進行時之生物質量濃度 v〇=於饋料批次階段開始進行時之反應槽體積(==批次體積） cs0=於饋料溶液中之葡萄糖濃度 於計算時，假設D-甘露糖以可比較之葡萄糖產率係數Yx/s被 袷皐多處岸崴所消耗。 於小型實驗室發酵槽(KLF)中，培養蕋1及11可分開被供應， 並且可改變其组成之比例。 a)第3輪發酵 於圖十三a及@十三b中顯示生物#量濃度及受監測之勞光 訊號，該等圖示之誘發方式與第丨輪中相同。 、於婦料批㈣段_進行時，加人—份量之G.2%(重量/體積） 《甘露糖溶液(總共16公克甘絲）’且培養基χ與π以指數方式 : % (間隔D之比例開始。當斜率下降時，含甘露糖 〈培養基II讀量被增加至6G %且總斜F ( 加至㈣雨持㈣萄糖為主之生細 ^ : 再度監酬斜衬降，絲培赫π讀量增時 將總饋料F(培養基! 其！、酵持續以提供培養基1之方式進行，其中歸 基1讀饋料比例為100%盼中未顯示卜進仃其中培養 於下列表5巾騎第3輪之進度及數據： 表5 : 間隔[小時I 培養基
總共添加50公克之甘露 糖 RFU 乾燥生物質量 DM/公升I 7000 9000 ---- 22 ' 11000 〜 48 201111505 分別各於第12小時、第20小時及第24小時取樣於SDS凝膠 上進行表現分析，其係依據總共10 〇D6〇G之細胞之可溶性蛋白質 組成部份。 所得SDS-聚丙晞醯胺凝膠電泳之結果顯示如下： kDa
Μ 1 2 3 自左邊起顯示：（Μ)長度標準品(R〇TI®-Mark)，（1)於12小時 後’未經誘發；（2)於20小時後，經8小時之謗發；（3)於24小時 後’經12小時之謗發。 於20及24小時後，清楚之色帶出現於大約27 kDa處，其顯 示有eGFP之表現(箭頭所指）。 b)第4輪發酵 重複如第3輪中相同之程序，除培養基II (甘露糖)饋料體積 被增加至總共1.0公升外。 於^圖十四a及廟 土也 同十二b中顯示生物質量濃度及螢光訊號，其 中，誘發方式與第1輪巾 進度及數據總結於下列表S中： 表6 : μ [小時―1】 RFU 乾燥生物質量 ί公克DM/公升1 0.40 "S隔[小時】 培養基 1: 11_[%1 0-15 —1—— 49 201111505 iJ5-22 50 ： 50 100 3500 II 22-38 50 ： 75 120 10000-7800 HI 38-39 「50 : 100 150 8900 40.4 總共添加200公克之甘露糖。 為補償於發酵大約15小時後所觀察到氮之缺口，故額外以固 定之速率添加鱗酸氫二按。 於間隔II中達到最大之RFU值’ loooo，其然後於間隔 過程中降至7800RFU。 a)第5及第6輪之發酵：無衝擊性之誘發 二者發酵反應皆於一 30公升之發酵槽中進行。 於此二輪中，以葡萄糖指數增加饋料速率讓細胞生長至高細 胞达、度，其中，該饋料速率於達到高細胞密度時被置換成固定速 率供應之甘露糖。 所使用之饋料培養基I、II及ΠΙ顯示於下表7中： 表7 : JBL成价 濃度 組成份 濃度 _饋科培卷甚Τ 組成份 II 濃度 D-葡萄糖•結晶水 654.76公克/公升 边祕ft **杜 ———... 硫酸鎂*7結晶永 23.50公克/公升 ao.UU公弃./公升 D·甘露垅 400.00公克/公升 TES 120.00毫升/公升 ---- 硫酸鎂*7結晶永 23,50公克/公升 去離子水 加至4.2公升 去離子水 pH --—__ SEL 120.00毫升/公升 加至1_0公升Ί 7.0 去雜予水 加至1.0公升 ------ 第5輪之發酵 培養基I及II係按其等與總體積之比例，亦即係以4 2: i 〇 , =數Γ增力Γ速率之方式被添加。當達到高細胞密度時，由培 =!與η組成之倾即被由培養基π與m以比：8 =叙騎關定之職，其㈣應於切培養基 數饋料速率之體積，所取代》 興敢，、，、扣 於圖十五中顯示螢光訊號，其中誘 吾人假設於大約17小時之發酵後於圖十 50 201111505 號最小增加係因為短時間缺少培養基πι之緣故。 第5輪之進度及數據總結於下列表8中： 表8 : 饋料批次 階段丨小時1 培養基【％] T : II : III RFU 最大值 比生長率 乾燥生物質量 [公克DM/公升1 甘露糖總 哥丨公#.1 15-35 80.8 : 19.2 : Π - 0.1 35-39 -:20 : 80 2,800 80 150 b)第6輪之發酵 重複如第5輪中相同之程序，除添加總共600公克之甘露糖， 並於達到高細胞密度時以固定之速率添加由培養基II與III所組成 之饋料前’以0.2 % (重量/體積)之甘露糖溶液(總共16公克甘露糖) 進行衝擊性之謗發外。 於圖十六中顯示螢光訊號，其中謗發方式與第丨輪中相同。 第6輪之進度及數據總結於下列表9中： 表9 : 饋料批次 晻段丨小時1 培養基丨％】 I : II : III RFU 最大值 比生長率 [小時 乾燥生物質量 [公克DM/公井1 甘露糖總 音丨公¢.1 20-40 80.8 : 19.2 :- - 40 0.2 % (重量/ 體積）之甘露 糖溶液 16 42-53 -：80 ： 20 14000 82 600 第1輪至第6輪之評估 有關最大螢光時之評估，乾燥生物質量濃度、反應槽體積 VR、所消耗之甘露糖及從誘發開始所經過之時間等項目被加以測 定並被總結於下表10中： 51 201111505 表ίο : 發酵輪次 勞光*大值 RFU Cx 公克DM公升1 VR 公升 誘發劑 公克甘露糖 表現經過時間 小時 1 2200 16 8.2 Ί 16 5 2 4900 22 8.3 70 8 3 11000 22 1.6 50 10 4 10000 17 1.7 60 13 5 1700 80 12.0 150 5 6 14000 82 14.7 600 12 依據於表10中所顯示每一輪之數據’計算出有關每公升及小 時最大之勞光RFU之生產率。此外，表現效率係由相對勞光所表 示，其係由依據絕對生物質量(公克DM)及誘發劑之濃度(公克甘 露糖/公升)之最大螢光所計算得到。 結果顯示於下表11中： 表11 : 發酵輪次 生產率 RFU公升-1小時-1 相對螢光 RFU (公克 DM)·1 相對螢光 RFU ί甘霞播/公#V1 1 53.7 16.8 1127 5 2 73.8 26.6 S81 0 3 687.5 312.5 0 4 452.5 346.0 5 28.3 1.8 1 π 6 79.4 11.6 343.0 此等結果清楚顯示使用攜帶甘露糖啟動子之質體之本發明< 成功地被使用在高細胞密度之發酵方法，且表現可藉由添加謗發 劑，D·甘露糖，進行正向之調控。 此外，藉由誘發制度，可依據需求將發酵之重點改變成使分 別於生物質量、表現產物之產出及謗發劑之消耗上達到最大。 就經過變得更容易之下游製造工程而言，根據第3輪之合# 衝擊性謗發及指數饋料之誘發劑制度係特別有利。 此處’所產生㈣於生物質量之高度表現絲使得進一步之 52 201111505 會更加有效率，並且於時間及金錢上 處理程序，如純化步驟等， 會比較節省。 【圖式簡單說明】 廿敕H巾細$料細撕之核酸序列，其被使用於綠製 甘:糖2輸蛋白(_户)啟動子之轉錄起始點，並突顯轉錄起始點 ::呤核苦酸上，用斜體字表示經推定之-35及-10之框 ^甘露糖受體(麵雕因之尾端及溶葡萄球菌酶(⑽基因之起始 糸由箭頭標記所標示’限制酶聊、編卜暮及福之剪 切位置被標示於序列之下方； 於圖二中係顯示該啟動子之核酸序列其包含甘露糖受體 咖及)基因之啟動子，並突顯轉錄起難位於4呤核芽酸 ^ ’用斜財表祕較之·1()及_35之框盒，甘露糖受體(卿々 基因之起始端係由—箭記所標示，且關❹滅Π之剪切位 置及經推測之cre序列被標示於該序列之下方；
於圓二巾_示由料$麟雜取得狀賊序列，其包 •H*露㈣體—力㈣啟動子之啟動子區域，分別被包含於 1咖91、的侧4.1及P咖85.2之中，W旅因之起始點係 箭頭標記所標示，且限制酶之剪切位置被標示於序列之下方； 七於圖四中係顯示根據本發明之pSUN 279 2表現載體之質體圖 譜； 於圖五中係顯示泰享f廣岸磨3NA之P-半乳糖水解酶之活 座’其中’該菌株中分別含根據本發明之pSUN 279.2、pSUN 284.1 及pSUN29l之質體； 各於中係顯示由杏料應岸彦所取得到之核酸序列，其包 丧享’游务奢之甘露糖傳輸蛋白(讲仰户)基因啟動子之啟動子區 域’包括#露糖受體(麵取c(幾基)_端，介於甘露糖受體(麵 53 201111505 基因及甘露糖傳輸蛋白(WiW尸)基因之間之基因間隔區域，此處被 一報導:基因/acZ所取代，轉錄起始點，-35及-10框盒由粗體字標 示’ 基因之尾端及kcZ基因之起始點係由一箭頭標記所標 示’且限制酶之剪切位置被標示於序列之下方； 於:圓七中係顯示為·皐穿遞岸磨3NA之β-半乳糖水解酶之活 性，其中，該菌株中含質體pSUN 279.2及其他質體，其等含於圖 六中所示不同長度之核酸序列之片段； 於圖八中係顯示#草歹游擰廣 3NA之卜半乳糖水解酶之活 性，其中，該菌株中含pSUN 291、pSUN 384.1及pSUN 345.2之 載體，其等具有如圖三中所示之核酸序列； 於圖九中係顯示根據本發明之pMW 168丨表現載體之質體 譜； 於圖十中係顯示pMW 168.1於#阜多處淖萝3NA中質體安定 性試驗之絲所賴之鱗_，其巾，㈣係由含f體之: 分比邵份對應世代代數之對應點繪製而成； 於圖十_至_十四中係顯示數個曲線圖，其等以 示乾燥之生物《濃料應發酵第1輪至第4輪之進行時間2 點緣製而紅曲線®，其巾係由螢光減(卿)對應發酵第i 輪至第4輪發酵時間之對應點输製而成；及 於圖十五及®十κ中軸示由勞光訊號對應發酵第 6輪發酵時間之對應點繪製而成之曲線圖。 輪及第 54 201111505 <110> Lonza股份有限公司 <120>發酵方法 <130> 9200-9315 <150> EP09010287.2 <151> 2009-08-10 <160>5 <170>3.5版專利 <210> 1 <211> 143 <212〉DNA <213>枯草芽胞桿菌 <400> 1 tagggaaaaa tgcctttatt accggaacct atggtaaaaa aagcgatttt aatgagctga 60 tttcggtata cagttgagac aagatcttat tattcacact ttctagaaat aattttctta 120 agaaggagat atacatatga cac 143 <210>2 <211>80 <212> DNA <213>枯草芽胞桿菌 <400> 2 tagggaaaaa tgcctttatt accggaacct atggtaaaaa aagcgatttt aatgagctga 60 tttcggtata cagttgagac 80 <210>3 <211> 195
<212〉DNA 201111505 <213>枯草芽胞桿菌 <400> 3 tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag agtataaaaa tcgctttttt 60 ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac 120 ggtttcttat atagtatact tatactatca atttgctcaa gtagatactg acaggcttaa 180 gaaggagata tacat 195 <210>4 <211> 128
<212> DNA <213>枯草芽胞桿菌 <400> 4 tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag agtataaaaa tcgctttttt 60 ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac 120 ggtttctt 128 <210>5 <211> 121 <212> DNA <213>枯草芽胞桿菌 <400〉5 tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag agtataaaaa tcgctttttt 60 ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac 120 g 121
Claims (1)
- 201111505 ' 七、申請專利範圍： J h 一種用縣養—原核宿主細胞之方法，其中，該原核宿主細胞 被一表現載體所轉化， 該載體包含择狩麟磨甘露糖操縱子之一可被謗發之啟動 子其可經由剪接之操作方式與一轉錄單元相連接，該單元包 含一編有一多胜肽密碼之核酸序列， 其中’該可被誘發之啟動子之誘發劑係甘露糖，或其一可誘發 該啟動子之衍生物， - 其中，於第一步驟中，該原核宿主細胞培養在不同於誘發劑之 首要碳源下’且於第二步驟中培養在誘發劑之存在下。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中，該誘發劑係於培養菌 達到一測量參數後才開始添加。 3. 根據申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中，該測量參數 至少為由光密度(OD)及碳源濃度所選出之一者。 4. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中，該測量參數係為6〇〇 nm之光密度。 5. 根據申請專利範圍前述申請項中任一項之方法，其中，該方法 ： 係為一饋料批次培養方法。 6. 根據申請專利範圍前述申請項中任一項之方法，其中，所有气 - 部份之添加劑係於一段時間内以連續之方式添加。 • 7.根據申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中，至 ** 少有部份之謗發劑係以一次份量之方式添加。 8.根據申請專利範園前述申請項中任一項之方法，其中，至少有 55 201111505 部份之謗發劑係於一段時間内以一指數增加速率添加。 9_根據申請專利範圍前述申請項中任一項之方法，其中，於第— 次添加謗發劑後，另一誘發劑於培養菌達到第二測量參數後至 少添加一次。 10.根據申請專利範圍第9項之方法， 其中，該第二測量參數係選擇於光密度OD、誘發劑於溶液中 之濃度、所製造多胜肽之濃度或宿主細胞内報導基因之訊號強 度。 u.根據申請專利範圍第1項至第11項中任一項之方法， 其中，該啟動子係由manP啟動子及manR啟動子中所選出0 根據申請專利範圍第1項至第11項中任一項之方法， 其中，添加一由首要碳源及謗發劑所組成之混合物至發酵培養 基中，其中首要碳源與誘發劑之比例為3 : 1至1 : 3。 根據申請專利範圍前述申請項中任一項之方法’ 其中，該載體包含該調控基因manR之全部或部份序列。 K根據申請專利範圍前述申請項中任一項之方法， 其中，該載體包含一由 SEQIDNCU、SEQIDN0.2、SEQID N0.3、SEQIDN0.4或SEQIDN0.5等所選出之序列’一與該 等序列互補之序列或該等序列之變異型序列。 根據申請專利範圍前述申請項中任一項之方法’ 其中，該不同於誘發劑之碳源係為葡萄糖。 根據申請專利範圍前述申請項中任一項之方法’ 其中，該編有一多胜肽密碼之核酸序列係為一異源性之核酸序 56 201111505 列。 17. —種於原核宿主細胞中製造多胜肽之方法’該方法包含以下步 驟：建構一可於原核宿主細胞中表現之載體，其包含择草穿·應 #磨甘露糖操縱子之一可被謗發之啟動子，其可經由剪接操作 方式與一轉錄單元相連接，該單元包含一編有一多胜肽密碼之 核酸序列；以所述之載體將該原核宿主細胞轉化；根據申請專 ， 利範圍第1項至第16項中任一項之培養條件，培養該經轉化 之宿主細胞以表現所述之多胜肽。 18. 根據申請專利範圍第15項之方法，該方法尚包含從該等細胞 或細胞培養液中回收多胜肽之步驟。 19. 一種重組原核宿主細胞，包含一表現載體，該載體包含於享声 慮斧奢甘露糖操縱子之一可經由甘露糖所誘發之啟動子，或該 甘露糖操縱子可被誘發之啟動子之經分離及純化之核酸序列， 其中，該載體或該甘露糖操縱子可被誘發之啟動子之經分離及 純化之核酸序列可經由剪接操作方式與一轉錄單元相連接，該 單元包含一編有一多胜肽密碼之核酸序列。 20. 根據申請專利範圍第19項之重組原核宿主細胞， 其中’該甘露糖操縱子可被謗發之啟動子係一根據申請專利範 :， 圍第11項至第13項中任一項之啟動子，或 ' 其中’該經分離及純化之核酸係一根據申請專利範圍第14項 之核酸。 21. 一種重組原核宿主細胞，其中，該宿主細胞係由厚壁菌門中所 - 選出。 • 22. 一種根據申請專利範圍第19項至第21項中任一項之重組原核 57 201111505 宿主細胞之使用，其用於一根據申請專利範圍第1項至18項 中任一項之方法中。 58
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09010287A EP2292769A1 (en) | 2009-08-10 | 2009-08-10 | Fermentation process |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201111505A true TW201111505A (en) | 2011-04-01 |
Family
ID=41435285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW099126639A TW201111505A (en) | 2009-08-10 | 2010-08-10 | Fermentation process |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120196323A1 (zh) |
| EP (2) | EP2292769A1 (zh) |
| JP (1) | JP2013501511A (zh) |
| CN (1) | CN102471773A (zh) |
| AU (1) | AU2010283808A1 (zh) |
| CA (1) | CA2770605A1 (zh) |
| IL (1) | IL218026A0 (zh) |
| SG (1) | SG178293A1 (zh) |
| TW (1) | TW201111505A (zh) |
| WO (1) | WO2011018377A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201200628B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI450965B (zh) * | 2009-08-10 | 2014-09-01 | Lonza Ag | 含甘露糖啟動子之載體及甘露糖啟動子 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2011284844B9 (en) * | 2010-07-29 | 2015-10-29 | Lonza Ag | Regulation of inducible promoters |
| CN103998460A (zh) | 2011-10-07 | 2014-08-20 | 隆扎有限公司 | 可调控启动子 |
| MX2023001273A (es) * | 2020-07-28 | 2023-03-03 | Basf Se | Proceso de fermentacion industrial para bacillus mediante el uso de cambio de velocidad de alimentacion. |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003275416A1 (en) * | 2002-10-04 | 2004-05-04 | Embiosis Pharmaceuticals | Compatible host/vector systems for expression of dna |
| BRPI0611112A2 (pt) * | 2005-06-06 | 2010-08-10 | Dow Global Technologies Inc | sistemas promotores induzidos por manitol em células hospedeiras bacterianas |
| PT2284273E (pt) * | 2009-08-10 | 2013-01-14 | Lonza Ag | Vetor compreendendo promotor manose e promotor manose |
-
2009
- 2009-08-10 EP EP09010287A patent/EP2292769A1/en not_active Withdrawn
-
2010
- 2010-08-02 CA CA2770605A patent/CA2770605A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-02 AU AU2010283808A patent/AU2010283808A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-02 US US13/389,913 patent/US20120196323A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-02 EP EP10737584A patent/EP2464732A1/en not_active Withdrawn
- 2010-08-02 JP JP2012524192A patent/JP2013501511A/ja active Pending
- 2010-08-02 WO PCT/EP2010/061195 patent/WO2011018377A1/en active Application Filing
- 2010-08-02 SG SG2012008413A patent/SG178293A1/en unknown
- 2010-08-02 CN CN2010800353751A patent/CN102471773A/zh active Pending
- 2010-08-10 TW TW099126639A patent/TW201111505A/zh unknown
-
2012
- 2012-01-25 ZA ZA2012/00628A patent/ZA201200628B/en unknown
- 2012-02-09 IL IL218026A patent/IL218026A0/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI450965B (zh) * | 2009-08-10 | 2014-09-01 | Lonza Ag | 含甘露糖啟動子之載體及甘露糖啟動子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2011018377A1 (en) | 2011-02-17 |
| EP2464732A1 (en) | 2012-06-20 |
| IL218026A0 (en) | 2012-04-30 |
| AU2010283808A1 (en) | 2012-07-12 |
| ZA201200628B (en) | 2012-09-26 |
| CA2770605A1 (en) | 2011-02-17 |
| CN102471773A (zh) | 2012-05-23 |
| JP2013501511A (ja) | 2013-01-17 |
| US20120196323A1 (en) | 2012-08-02 |
| EP2292769A1 (en) | 2011-03-09 |
| SG178293A1 (en) | 2012-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kawata et al. | Transformation of Spirulina platensis strain C1 (Arthrospira sp. PCC9438) with Tn5 transposase–transposon DNA–cation liposome complex | |
| TWI450965B (zh) | 含甘露糖啟動子之載體及甘露糖啟動子 | |
| US6818752B2 (en) | Synthetic genes for enhanced expression | |
| TW201111505A (en) | Fermentation process | |
| KR20240049306A (ko) | Ruvc 도메인을 갖는 효소 | |
| US11203760B2 (en) | Gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 and the method for obtaining thereof | |
| KR102142255B1 (ko) | Crm197 단백질 발현 방법 | |
| RU2803949C1 (ru) | Способ экспрессии белка crm197 | |
| JP2023139192A (ja) | Ｃｒｍ１９７タンパク質発現方法 | |
| CN113699174B (zh) | 一种自诱导表达系统及其在促进基因表达中的应用 | |
| Kavitha et al. | Cloning and molecular characterisation of resuscitation promoting factor-like gene from Mycobacterium avium subspecies avium | |
| WO2023193837A1 (en) | Expression vector for production of recombinant proteins in prokaryotic host cells | |
| JP2016106620A (ja) | ４−ケト−ｄ−アラボン酸合成用酵素 | |
| Fung et al. | Harnessing xylitol utilization in Escherichia coli for antibiotic-free plasmid and recombinant protein production | |
| CN113736813A (zh) | 重组大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的载体和方法 | |
| JP2022554070A (ja) | 高収量生産のための巨大ベクターおよび方法 | |
| Luo et al. | Molecular cloning and heterologous expression of linoleic acid isomerase gene from Lactobacillus reuteri and Lactobacillus acidophilus | |
| JPS63167789A (ja) | 形質転換体の培養法 | |
| JPS5856687A (ja) | Ｄｎａ配列の増幅発現 | |
| JP2005245320A (ja) | 核酸組換え方法、宿主細胞、及び、発現ベクター | |
| JPS61254191A (ja) | 新規なプラスミド |