TW201107749A - Field-effect-transistor-based bio-sensor and the bio-signal amplification method thereof - Google Patents

Description

201107749 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一種生物感測器及其生物訊號放大 方法，特別是有關一種結合恆溫核酸放大技術之場效電 晶體式之生物感測器及其生物訊號放大方法。 【先前技術】 Φ 生物感測器是指利用生物感測元件（如酵素、抗體…· 等）來將系統中的化學物質（如葡萄糖、血漿濃度、鉀離 子濃度、膽固醇）改變量，轉換成電子訊號或光學訊號的 一種可測定微量成份的分析装置。而其應用則可以期望 符合某些及重要量測的需求，特別是在藥品、代謝物、 血液中特定蛋白質如癌症指標，或是特定病原如病毒、 細菌與其他生物分子間交互作用的測定上，且其可晶片 型微小化無須螢光或是酵素標定的特性可利於病人隨身 •，帶量測以及及時檢測，相當方便。在臨床檢驗上，極 需利用這樣的特性以加速檢體的測試，而給醫師一個迅 速確實的結果報告，達到患者病情治療的效果。 生物感測器由兩個主要關鍵部份所構成，一為來自 於生物體分子、組織部份或個體細胞的分子辨認元件， 此元件為生物感測器k號接收或產生部份，另一為屬 於硬體儀器元件部份，主要為物理信號轉換元件。因此， 如何以生化方法分離、純化甚或設計合成特定的生物活 性分子，結合精確而且回應快速的物理換能器 201107749 (transducers)組合成生物感測器反應系統，實為研究生物 感測器的主要目的。目前生物感測器的發展，雖然不至 於到成熟應用的階段，但已經研發出許多感測方法能夠 檢測出臨床醫學或藥物中物質的微小改變量，而如何使 生物感測器具有更高穩定性與靈敏度已成為現今研究人 員主要之一研究目標。 在發展檢測專一性蛋白質方法上，實驗室最常用的 是酵素免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)，藉由與標定酵素的二次抗體之結合可將第一抗 體訊號放大，然而此方法受到立體空間障礙與在第一抗 體上有限之二次抗體辨識位置（epitopes)的影響，放大倍 率有限。另一方面，為了有效放大蛋白質檢測信號，乃 結合傳統之聚合鏈反應與免疫分析法，遂使免疫聚合鏈 反 應技術(immuno-polymerase chain reaction, Immuno-PCR)因應而生。免疫聚合鏈反應係結合PCR 核酸放大的優勢及抗體專一性之辨識，能將蛋白質的檢 測進一步經PCR放大。然而，常用之PCR反應須經三 次溫度重複升降的精密溫控系統，無形中增加高靈敏生 物感測器在設計上的困難，尤其是利用電性量測的生物 感測器（如電化學生物感測器或奈米線場效電晶體生物 感測器），若重複升降溫將明顯影響生物感測器的穩定 性。例如：美國專利US 7，160,997即揭示生物感測器係 將PCR方法與場效電晶體整合製造得。在此系統下，需 要一個短時間急遽升降溫裝置，易導致電性量測的不穩 201107749 【發明内容】 有鑑於上述習知技藝之問題，本發明之目的就是在 提供一種場效電晶體（field-effect transistor, FET)式之生 物感測器及其生物訊號放大方法，係利用恆溫核酸放大 的方法如滾動環形放大（rolling circle amplification，RCA) 的技術放大生物訊號，以增進場效電晶體式之生物感測 器的靈敏度。 * 根據本發明之目的，提出一種場效電晶體式之生物 感測器，其主要構件可包括場效電晶體式晶片、生物分 子固定層及至少一引子（primer)。其中，場效電晶體式晶 片包括至少一源極（source)、至少一汲極（drain)及至少一 閘極（gate)，生物分子固定層可設置於此至少一閘極表面 上或與閘極連接之外接元件表面上，而所選用之引子再 固定化於生物分子固定層上。此外，引子可利用DNA聚 合酶，而與待測物所形成之單股環狀DNA模板進行恆溫 • 核酸放大反應，藉由核酸序列延長可直接或間接誘導增加 場效電晶體閘極表面感應的電性’使得檢測訊號放大’可 有效增加場效電晶體式之生物感測器的靈敏度。 根據本發明之目的，提供一種場效電晶體式之生物 感測器之生物訊號放大方法，係提供包括至少一源極、 至少一汲極及至少一閘極之場效電晶體式晶片，並於此 至少一閘極表面上或與閘極連接之外接元件表面上形成 一生物分子固定層，再將至少一引子藉由與生物分子固 201107749 定層鍵結，而固定化於場效電晶體式晶片之閘極表面或 外接元件表面。藉由DNA聚合酶參與，此至少一引子可 與待測物所形成之單股環狀DNA模板進行恆溫核酸放 大反應。 承上所述，依本發明之場效電晶體式之生物感測器 及其生物訊號放大方法，係可具有下述優點： (1) 本發明係結合恆溫核酸放大與場效電晶體技術，可 以在室溫（不需外加加熱系統）或恆溫（如37°C)下反 應，即達到在場效電晶體表面放大DNA核酸訊號之 目的，取代傳統PCR技術需精密三個溫度循環控 制，且恆溫裝置比PCR溫控裝置更適合精密電性量 測，設計上也更容易。 (2) 此外，相較於傳統PCR定量的方法，可於檢測反應 的早期利用反應速率變化及早檢測待測物濃度，不 需待至足量DNA合成後再利用電泳方法得知待測 物訊號。 (3) 本發明之恆溫核酸放大技術的發展將提供蛋白質感 測器更佳選擇，可一方面與抗體末端相接的單股 DNA，進行DNA聚合反應放大DNA訊號，另一 方面又能在室溫或恆溫（如37°C)環境下反應，不需 精密溫度控制，可解決原本發展PCR核酸放大生物 感測器於溫控需求的挑戰。 (4) 本發明之場效電晶體式之生物感測器，亦可做成微 陣列型，可比傳統蛋白質陣列與DNA微陣列晶片放 201107749 大訊號的效果更佳，並解決晶片上動態量測生物分 子反應的挑戰。 (5) 本發明結合蛋白質（如抗體、適體（aptamer))接合 DNA的技術，可將原本應用於DNA感測廣泛的應 用於蛋白質、藥物、有機小分子等。未來應用領域 可擴及快速診斷檢測、居家照護、癌症篩檢、病毒 檢測、捐血檢測。 (6) 本發明提供之場效電晶體式之生物感測器具有不需 酵素或螢光標定、不需將DNA平行設置於FET、不 需雙股DNA合成、可即時檢測、直接判讀等特性， 若加上適體分子可廣泛應用於DNA、RNA、蛋白質 及其他領域。 (7) 本發明與即時(real-time) PCR定量的方法同，可及 早檢測待測物靈敏度。同時又比即PCR具有不需螢 光標定的優勢，且不需昂貴的螢光分析儀。 【實施方式】 本發明將藉由下述之較佳實施例及其配合之圖示， 做進一步之詳細說明。 請參閱第1圖，其係為本發明之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法之流程圖。圖中，其步驟 可包括：步驟S11，提供一包括源極、汲極及閘極之場 效電晶體式晶片。步驟S12，設置一生物分子固定層於 場效電晶體式晶片之閘極上或與閘極連接之外接元件表 201107749 面上。步驟S13，將至少一引子（primer)固定化於生物分 子固定層上，以及步驟S14，將DNA聚合酶及待測物所 形成之單股環狀DNA模板加入生物分子固定層上，使引 子可利用DNA聚合酶而與單股環狀DNA模板進行恆溫 核酸放大反應。因核酸序列延長放大而可增加場效電晶 體閘極表面感應的電性，使得生物訊號放大，進而增加場 效電晶體式之生物感測器的靈敏度。此外，此核酸放大 反應因可於室溫或恆溫環境下進行反應，可解決溫度變 化導致的電性量測不穩定之問題。 承上述，場效電晶體式晶片可視不同需求選用奈米 線場效電晶體（nanowire FET，NWFET)晶片、碳奈米管場 效電晶體（carbon nanotube FET，CNTFET)晶片、離子感 測場效電晶體（ion-sensitive FET，ISFET)晶片、氧化半導 體場效電晶體（oxide-semiconductor FET，OSFET)晶片或 經半導體製程如互補式金屬氧化半導體（complementary metal-oxide-semiconductor, CMOS)製程所製作的場效電 晶體晶片。此外，閘極表面或與閘極連接之外接元件表 面由包括含石夕之材料所構成。生物分子固定層係由能形 成生物分子鍵結之材料所組成，且恆溫核酸放大反應可 包括滾動環形放大反應。所選用之引子可包括DNA片 段、RNA片段、適體（aptamer)或抗體，且此些引子均包 含一能夠引發核酸放大反應的特殊序列，而可檢測之待 測物可包括DNA序列、RNA序列、蛋白質、小分子、 藥物等。 利用本發明所製備之場效電晶體式之生物感測器， 201107749 可大大放大待測物之DNA序列，例如可將18mer DNA 複製放大至3000mer DNA ’因DNA序列本身可帶負電， 序列變長之DNA必然帶有更大的負電電性，而能誘發場 效電晶體式晶片之閘極表面相對產生更大的正電電性， 使得檢測訊號亦隨之變大，可有效增加場效電晶體式之生 物感測器的靈敏度。 請參閱第2圖’其係為本發明之場效電晶體式之生 物感測器之場效電晶體式晶片之一實施例之配置圖，係 • 利用η-阱（n-well)互補式金屬氧化半導體（CMOS)製程製 備出之場效電晶體晶片。圖中，場效電晶體晶片包括多 個閘極21、多個没極22、多個源極23，及用於拉出各 電極之電極接觸位（contact) 24,而虛線圓形狀25係為生 物感測器之感測區域26，為增加其敏感度，係將位於感 測區域26之閘極氧化層（gate-oxide)上的所有材料均移 除，以形成開放閘極（open-gate)之場效電晶體結構，且 閘極氧化層上的位能變化係直接轉換為通道電流之變 • 化，即汲極22與源極23之間的流動。此外，此場效電 晶體晶片結構在其特定之感測區域26可執行最大之跨 導（transconductance) ° 請參閱第3圖，其係為第2圖之post-CMOS製程之 流程示意圖，用以製得晶粒等級之場效電晶體。首先’ 第3(A)圖中，利用標準TSMC 0.35μιη CMOS製程製造 p-通道場效電晶體（p-channel FET)，其中金屬層係用於 界定出感測區域。接著，第3(B)圖中’藉由”Piranha”之 濕式蝕刻方法於85°C下移除金屬層’以將場效電晶體之 201107749 多閘極（poy-gate)暴露出，並施予反應式離子蝕刻法 (reactive-ion etching, RIE)五分鐘以去除多閘極上之薄矽 化物層（thin silicide layer)。之後，第3(C)圖中，利用氫 氧化鉀：去離子水=1 : 2於80°C下濕式蝕刻多閘極20秒 以暴露出閘極氧化層。最後，第3(D)圖中，使用一部分 石夕晶圓（silicon wafer)作為影光罩（shadow mask)，且藉由 RIE方式將位於焊塾（bonding pad)上護層（passivation)暴 露出。 在post-CMOS製程後，可將製得之場效電晶體式晶 片電線接合至印刷電路板上’且將一玻璃〇型環（glass O-ring)貼附於其上而形成一槽狀，如第4圖所示，且整 個場效電晶體式晶片表面除了場效電晶體區域外均塗有 工業環氧樹脂（epoxy) ’可防止於槽内裝入溶液時發生短 路。此外 ’ Keithley 2602 Series SourceMeter 可用於施加 偏壓與測量場效電晶體式之生物感測器，再透過電腦軟 體’’Tab Tracer”計算出測量結果。當場效電晶體的閘極材 料已由玻璃0型環内之溶液所代替，則使用銀/氧化銀電 極以提供溶液之交流偏壓（DC-bias)。其中，可藉由將汲 極（drain，D)與溶液之電壓維持在〇伏特，且源極%〇urce， S)之電壓則以母次增加50耄伏特從〇伏特增至3伏特， 而測得場效電晶體之通道電流。另，DNA進行合成放大 之不同階段的電流_電壓關係可被測量出並經由 IEEE488電纜傳送至電腦計算結果。 請參閱第5目，其係為本發明之場效電晶體式之生 物感測器執行DNA序列放大之—實施例之示意圖。圖 201107749 中’檢測物之單股DNA奈米模板51 (ssDNA nanotemplate) ' 係位於第3圖所製得之場效電晶體晶片之一場效電晶體 52之閘極53的表面54上，與固定於生物分子固定層（圖 未示）上之DNA引子55進行原位（in situ)滾動環形放大 反應。其中，生物分子固定層可為自組裝單分子層 (self-assembly monolayer，SAM)，係作為 DNA 引子 55 與閘極之氧化石夕表面的共價黏合劑（covalent linker)，而 使檢測物可更靠近感測閘極，甚至直接鍵結於閘極上。 • 此實施例中，本發明之滾動環形放大（RCA)反應中可具 有三個主要技術，包括： (1) 可被血小板衍生性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF)誘導發生構形變化之PDGF適體 (PDGF aptamer)。如第6A圖所示，PDGF適體61可辨 識出PDGF蛋白質62，而誘導PDGF適體發生形變63， 形成一單股環形DNA模板51 ; (2) 藉由滚動環形放大反應複製放大單股DNA奈米 • 模板。如第6B圖所示，環狀化PDGF適體（即單股DNA 奈米模板51)係加入第4圖所示之場效電晶體式之生物 感測器的溶液中，此適體係與固定化於閘極表面64之 DNA引子55配對互補，接著，藉由phi29 DNA聚合酶 65及T4 gene-32蛋白質66的參與，係啟動單股DNA奈 米模板51與DNA引子55發生滾動環形放大反應。其 中，phi29 DNA聚合酶65係具有促使發生DNA聚合與 單股 DNA 移位（ssDNA displacement)的作用，而 T4 gene-32蛋白質66係作為單股DNA鍵結蛋白質；以及 11 201107749 (3)藉由單股DNA奈米模板發生聚合放大後，誘發 場效電晶體之感測電性變大，而增加生物感測器之靈敏 度。 其中，此實施例之自組裝單分子層可由3-氨基丙基 三乙氧基石夕院（3-aminopropyl triethoxysilane，APTES)藉 由矽烷化反應形成於場效電晶體之閘極表面上。 詳細實驗方式如下： 首先，利用酒精溶液清洗場效電晶體之蓋玻璃基板 以去除汙染物，再將此基板置於2.0% APTES酒精溶液 中約三十分鐘，並於120°C下加熱十分鐘以除去多餘酒 精。 接著，將此基板置於含有 2.0%戊二醛 (glutaraldehyde)與 4 mM 氰基硼氫化納（sodium cyanoborohydride)之溶液中一個半小時後再用清水清 洗0 最後，將 5〇〇 nM 5，-氨基化修飾之引子 φ (5’-aminomodified primer)與基板置於4°C環境下隔夜， 而使引子搞接於基板上之自組裝單分子層。 其中，此實施例之DNA引子接於場效電晶體晶片上 之自組裝單分子層後所測得之電流-電壓關係圖，係如第 7圖所示。圖中，可發現DNA引子固定化於自組裝單分 子層上後，其電流-電壓曲線圖係較未加有DNA引子時 之電流-電壓曲線圖向左偏移。由於P-通道電晶體的電流 係隨其電壓增加而增加，因此此向左偏移係表示場效電 12 201107749 晶體表面累積有較多的負電荷。此結果係符合DNA引子 ' 係帶負電的事實，亦說明本發明之場效電晶體之生物感 測器係具有偵測到DNA引子是否固定化之能力。 另外，所使用之適體可為具有三維結構之人工合成 單股DNA分子，具有辨認標的蛋白質PDGF的能力，且 於辨視過程可被轉換成環狀形式。其實驗方式係為： 將5 nM PDGF與40 nM PDGF適體進行培養，使其 進行核酸接合（ligation)反應，再藉由於95°C下加熱5分 ® 鐘，以終止核酸接合反應。 接著，所得環狀單股DNA即可被加入場效電晶體晶 片之RCA反應槽中，以啟動進行RCA反應，而其反應 後所測得之電流-電壓關係圖，係如第8圖所示。圖中， 可發現單股DNA模板經過滾動環形放大反應後，其所得 之電流電壓曲線圖係向左偏移，係說明單股DNA模板 的確被複製放大，而使場效電晶體感應到更多的電性。 I 因此，藉由本發明之場效電晶體式之生物感測器， 可使待測物所形成之單股DNA模板達到聚合放大的目 的，進而可大大提高場效電晶體式之生物感測器檢測之 準確性。 以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫 離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變 更，均應包含於後附之申請專利範圍中。 13 201107749 【圖式簡單說明】 第1圖係為本發明之場效電晶體式之生物感測器之生 物訊號放大方法之流程圖； 第2圖係為本發明之場效電晶體式之生物感測器之場 效電晶體式晶片之一實施例之配置圖； 第3圖係為第2圖之post_cMOS製程之流程示意圖； 第4圖係為本發明之場效電晶體式之生物感測器之一 實施例之示意圖； 第5圖係為本發明之場效電晶體式之生物感測器執行 DNA序列放大之一實施例之示意圖； 第6A圖係為本發明之待測物形成單股dnA奈米模板 之一實施例之配置圖； 第6A圖係為本發明之場效電晶體式之生物感測器執行 DNA序列放大之一實施例之示意圖； 第7圖係為本發明之DNA引子固定化於場效電晶體上 之前與之後之電流-電壓關係曲線圖；以及 第8圖係為本發明之單股DNA模板於場效電晶體上進 行RCA反應之前與之後電流·電壓關係曲線圖。 201107749 【主要元件符號說明】 S11-S14 :流程步驟； 21 :閘極； 22 :汲極； 23 :源極； 24 :電極接觸位； 25 :虛線圓形狀； 26 :感測區域， 51 :單股DNA奈米模板； 52 :場效電晶體； 53 :閘極； 54 :表面； 55 :引子； • 61 : PDGF 適體； 62 : PDGF蛋白質； 63 :誘導PDGF適體發生形變； 64 :閘極表面； 65 : phi29 DNA聚合酶；以及 66 : T4 gene-32 蛋白質。 15

Claims (1)

1. 201107749 七、申請專利範圍： l 一種場效電晶體式之生物感測器，其包括： 一場效電晶體式晶片，係包括至少一源極、至少 一汲極及至少一閘極： 生物分子固定層，係設置於該至少一閘極之一 表面上或與該閘極連接之一外接元件表面上； 以及 至少一引子，係固定化於該生物分子固定層上， 該至少一引子係藉由一 DNA聚合酶，而與一待測 物所形成之一單股環狀DNA模板進行一恆溫核酸 放大反應。 2. 如申s青專利範圍第1項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其令該場效電晶體式晶片包括奈米線場 效電晶體晶片、碳奈米管場效電晶體晶片、離子感 測場效電晶體晶片、氧化半導體場效電晶體晶片或 經一半導體製程所製作的場效電晶體晶片。 3. 如申請專利範圍第丨項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其令該半導體製程包括一互補式金屬氧 化半導體（CMOS)製程。 4. 如申請專利範圍第1項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其令該至少一閘極之該表面或與該閘極 連接之該外接元件表面係由包括含矽之材料所構 成0 201107749 5·如申請專利範圍第4項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其中該生物分子固定層係為一自組裝單 分子層。 6_如申請專利範圍第5項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其中該自組裝單分子層之材料包括3_ 氨基丙基三乙氧基矽烧。 7.如申請專利範圍第6項所述之場效電晶體式之生 φ 物感測器，其中該自組裝單分子層係包括藉由一矽 烧化反應形成於該至少一閘極之表面或該外接元 件表面上。 8·如申請專利範圍第丨項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其中該生物分子固定層係由能形成生物 分子鍵結之材料所組成。 9.如申請專利範圍第1項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其中該恆溫核酸放大反應包括一滾動環 φ 形放大反應。 ι〇.如申請專利範圍第1項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其中該DNA聚合酶包括phi29 DNA聚 合酶。 11. 如申請專利範圍第丨項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其中該至少一引子係包括DNA片段、 RNA片段、適體或抗體。 12. 如申請專利範圍第丨項所述之場效電晶體式之生 物感測器，其中該待測物係包括DNA序列、RNA 17 201107749 序列、蛋白質、小分子或藥物。 13*種場效電晶體式之生物感測器之生物訊號放大 方法，其步驟包括： 提供一場效電晶體式晶；I，該場效電晶體式晶 片係包括至少一源極、至少一汲極及至少一閘極； 設置一生物分子固定層於該至少一閘極之一表 面上或與δ亥閘極連接之一外接元件表面上； 將至少一引子固定化於該生物分子固定層上； 以及 加入一 DNA聚合酶及一待測物所形成之一單股 環狀DNA模板於該生物分子固定層上，使該至少 一引子藉由該DNA聚合酶而與該單股環狀DNA模 板進行一恆溫核酸放大反應。 14. 如申请專利範圍第13項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該恆溫核酸放 大反應包括一滾動環形放大反應。 15. 如申請專利範圍第13項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該場效電晶體 式Ba片包括奈米線場效電晶體晶片、碳奈米管場效 電a曰體晶片、離子感測場效電晶體晶片、氧化半導 體場效電晶體晶片或經一半導體製程所製作的場 效電晶體晶片。 16. 如申請專利範圍第15項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法’其中該半導體製程 201107749 包括一互補式金屬氧化半導體（CM〇s)製程。 π如申請專利範圍第13項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該至少一閘極 之该表面或與該閘極連接之該外接元件表面係由 包括含矽之材料所構成。 1如申請專利範圍第17項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該生物分子固 定層係為一自組裝單分子層。 19.如申請專利範圍第18項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該自組襄單分 子層之材料包括3 -氨基丙基三乙氧基石夕烧。 2〇.如申請專利範圍第19項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該自組裝單分 子層係包括藉由一矽烷化反應形成於該至少一閘 極之該表面或該外接元件表面上。 21·如申請專利範圍第13項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該DNA聚合 酶包括phi29 DNA聚合酶。 22.如申請專利範圍第13項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該至少一引子 係包括DNA片段、RNA片段、適體或抗體。 23·如申請專利範圍第13項所述之場效電晶體式之生 物感測器之生物訊號放大方法，其中該待測物係包 括DNA序列、RNA序列、蛋白質、小分子或藥物。 19