TW201102081A - TTK peptides and vaccines including the same - Google Patents

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201102081 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於生物科學領域，更特別對於癌症治療領 域。特別是，本發明係關於新穎之胜肽，其當作癌症疫苗 及治療與避免腫瘤之藥物為非常有效。 【先前技術】 已證貫C D 8 +細胞毒殺性T淋巴球辨認來自建造於主要 組織相容性抗原複合體（maj〇r hist〇c〇mpa1：ibility complex’ MHC) class I分子上之腫瘤相關抗原 (tumor-associated antigens，TAAs)的抗原決定位胜肽， 且之後殺死腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原（melan〇ma antigen, MAGE)家族為腫瘤相關抗原之第一個例子，主要 藉由免疫方法，已發現許多其他腫瘤相關抗原（NPL 1/Boon T, Int J Cancer 1 993 May 8, 54(2): 1 77-80; NPL 2/Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9)°這些腫瘤相關抗原的一些目前受到臨床發展為免 疫治療標的。

能誘導有效且專一之抗腫瘤免疫反應的新腫瘤相關抗 原的辨認成為於多種形式癌症中之胜肽疫苗接種策略 (vaccination strategies)之更進一步發展與臨床研究的 根據為正進行著（NPL 3/Harris CC, J Natl Cancer Inst 1 996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4/But ter f i e 1 d LH et al., Cancer Res 1 999 Jul 1, 59(1 3): 3134-42; NPL 201102081 5/Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21). 5554-9; NPL 6/van der Burg SH et al. , J Immunol 1996 May 1, 1 56(9): 3308-1 4; NPL 7/Tanaka F et al. , Cancer Res 1 997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8/Fujie T et a 1., Int J Cancer 1999 Jan 1 8, 80(2): 1 69-72; NPL 9/Kikuchi M et al., Int J Cancer 1 999 May 5, 81 (3): 459-66; NPL 10/0iso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 38 7-94)。不幸地，許多目前癌症疫苗試驗已顯示一低的客 觀反應率（objective response rate) (NPL 11/Belli F ei al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12/Coulie PG et al. , Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13/Rosenberg SA et al. , Nat Med 2004 Sep, 10(9)： 909-1 5)。因此’仍然需要新穎之腫瘤相關抗原作為免疫治 療標的。 為此目的，已於小細胞肺癌（small cell lung cancers， SCLCs)(PTL 1/W02007/013665)與食道癌（PTL 2/W02007/013671 )中鑑定一些向上調控之基因，經由使用 基因體寬度cDNA微陣列之基因表現輪廓的分析。這些基因 已被足地研究，隨著自其中鑑定出為免疫治療標的之好的 候選物的希望。為了於免疫治療中專—以癌細胞為標的， 較佳之腫瘤相關抗原應為主要由癌細胞所表現，而正常健 康組織具有限制或不表現。 作為免疫治療標的之較佳的腫瘤相關抗原係對於癌症 細胞增殖與存活為必須的 々乂肩的那些。此腫瘤相關抗原可將廣為 1 § 201102081 敘述之癌細胞免疫逃脫（i_une escape)的風險最小化，而 癌細胞免疫逃脫為治療性驅使免疫篩選的結果，歸因於腫 瘤相關抗原的刪除、突變或向下調控。 藉由使用含有23, 040個基因之基因體寬度cDNA微陣 列的基因表現輪廓，TTK蛋白質激酶（TTK)被鑑定為在肺 癌中向上調控之基因之一（NPL3/Kikuchi at ai.，匕七；

Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805)。TTK 之表現為於大於 80%之具有肺癌與食道癌之病患中的腫瘤細胞中被向上調 控。同時，TTK不被表現於任何其他正常重要器官中，除 了睪丸。整體而言，這些事實建議ττκ可適用為具有 向上調控之腫瘤之病患的癌症免疫治療的標的。先前已揭 路來自ΤΤΚ之胜肽其具有專一之抗外生表現ττκ與— 0201之標的細胞的細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力（參見 W02008/1 02557CPTL3)，於此重複其結果為第4圖）。 【引用文獻】 專利文獻（Patent Literature) [PTL 1] W02007/013665 [PTL 2] W02007/013671 [PTL 3] W02008/102557 非專利文獻（Non Patent Literature) [NPL 1] Boon T， Int J Cancer 1993 May 8， 54(2). 177-80 201102081 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3)： 725-9 [NPL3] Kikuchi at al., Int J Oncol. 2006 Apr;28(4) ： 799-805 【發明内容】 本發明部分基於發現新穎之胜肽，其可作為免疫治療 之寺示的。由於腫瘤相關抗原（tumor-associated antigens, TAAs)有時被免疫系統感知為“自身”且因此沒有天生的 免疫抗原性（immunogenicity)，所以適合標的的發現極度 重要。如上所提到，已確認TTK (典型胺基酸序列與基因 序列分別被顯示於序列辨識號：40與序列辨識號：39中， 但不限於此’且典型基因序列也可獲自，例如GenBank獲 付編號NM一0 0 331 8 )在包括肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸 癌、膽管細胞癌（cho 1 angi〇ce 11 u 1 ar carei noma)、慢性骨 髓性白血病（chronic myelogenous leukemia, CML)、大腸 癌、子宮内膜異位症（endometriosis)、食道癌、胃癌 '擴 散型月癌（diffused type gastric cancer)、肝癌、非小 細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC)、淋巴瘤、 骨肉瘤（osteosarcoma)、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎 癌、小細胞肺癌（sma 11 ce 11 1 ung cancer，SCLC)、軟組 織腫瘤與睪丸癌的癌症中為向上調控。因此本發明聚焦於 TTK為一癌症/腫瘤免疫治療之標的的候選物。 本發明更關於具有誘導專一於TTK之細胞毒殺性τ淋 201102081 巴球能力之ττκ之基因產物的特定抗原決定位胜肽的確 認。詳細如下所討論，使用HLA (人類白血球組織抗原） -A* 0201與來自TTK之候選胜肽結合來刺激自健康提供者 獲知之周邊血液單核球細胞（peripherai blood mononuclear· cells，PBMCs)。之後以抗經各候選胜肽脈衝 (pulsed)之HLA-A2+目標細胞的專_細胞毒性建立細胞毒 殺性T淋巴球。在那些細胞毒殺性τ淋巴球中，以具有序 列辨識號.3之胺基酸序列之胜肽誘導的細胞毒殺性τ淋 巴球顯著地顯示強而有力而專一之抗表現與 TTK之細胞的細胞毒性。結果證明這些胜肽（特別是具有 序列辨識號：3之胺基酸序列的胜肽）為hla-A2限制的抗 原決定位胜肽，其可誘導強而專一之抗表現ττκ之細胞的 免疫反應。此外，其指出ΤΤΚ為強效致免疫性且其抗原決 定位為癌症/腫瘤免疫治療之有效目標。 因此’本發明本發明一目的為提供與HLA抗原結合之 經分離的胜肽’特別是包括ΤΤΚ (例如，序列辨識號：40 ) 之胺基酸序列或其免疫活性片段的那些。這些胜肽被預期 具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力且因此可被用於e;sr Fi· 誘導細胞毒殺性Τ淋巴球或被投予—個體以誘導抗癌症， 例如肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性 骨髓性白血病、大腸癌、子宮内膜異位症、食道癌、胃癌、 擴散型月癌、肝癌、非小細胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、卵 巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌 '小細胞肺癌 '軟組織腫 瘤與睪丸癌的免疫反應。較佳胜肽為具有序列辨識號：3 201102081 之胺基酸序列的胜肽。 本發明胜肽包括其中被取代、刪除及/或加入一、二或 多個胺基酸的㈣’只要所產生經修飾之胜肽維持最初之 細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力。本發明也提供編碼出本發 明之任何胜肽之經分離的多核苷酸。這些多核苷酸可使用 於誘導或製備具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗原呈 現細胞，或可被投予至-個體以誘導抗癌之免疫反應如本 發明胜肽。 當投予一個體時，本發明胜肽較佳被表現於抗原呈現 細胞之表面以便誘導將分別之胜肽做為目標之細胞毒殺性 τ淋巴球。因此，本發明之之一目標為提供誘導細胞毒殺 H Τ淋巴球之s式劑或組合物，此種試劑或組合物包括一或 夕個本發明胜肽或編碼出此胜肽之多核苷酸。本發明更考 慮包括一或多個本發明胜肽或編碼出此胜肽之多核苷酸之 藥干。式劑或組合物，此藥學試劑或組合物被配製用於癌症 之治療及/或預防，與其手術後復發的避免，此類癌症包 括，但不限於肺癌、膀胱癌、乳癌、+宮頸^、膽管細胞 癌丨曼性骨髓性白血病、大腸癌、子宮内膜異位症、食道 癌胃癌、擴散型胃癌、肝癌、非小細胞肺癌 '淋巴瘤、 月肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、小細胞肺癌、 軟組織腫瘤與睪丸癌。代替本發明胜肽或多核苷酸為活性 成分/除了本發明胜肽或多核苷酸作為活性成分外，本發明 藥子減劑或级合物可包括表現任何本發明胜肽之抗原呈現 細胞或外吐小體。 201102081 本發明之胜肽或多核苷酸可誘導於其表面呈現hla抗 原與本發明胜肽之複合物的抗原呈現細胞，例如，藉由將 來自一個體之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸或將編媽出 本發明之一胜肽的多核苷酸引入抗原呈現細胞。此種抗原 呈現細胞具有高的抗目標胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球誘發 能力且因此提供用途於癌症免疫治療中。因此，本發明考 慮誘導具細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的 方法與藉由此方法獲得之抗原呈現細胞兩者。 本發明也提供誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法，方法 包括將CD8*K細胞與表現一或多個本發明胜肽於其表面之抗 原呈現細胞或外吐小體共培養之步驟或引人包括編碼出具 與本發明胜肽結合之能力之τ細胞受體（T cel 1 recept〇r， TCR)-人單tl多胜肽之多核苷酸之基因的步驟。藉由此種方 法獲得之細胞毒殺性T淋巴球也於癌症之治療及/或避免 中提供用it ’癌症之例子包括，但不限於肺癌、膀肤癌、 乳癌、子宮頸癌1管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸 癌、子宮内膜異位症、食道癌、胃癌、擴散型胃癌、肝癌、 非小細胞肺癌、淋巴瘤' 骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列 腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腔瘤與筆丸癌。因此， 本發明包括藉由本發明方法獲得之細胞毒殺性T淋巴球。 本發明另一目標提供於一需要之個體中誘導抗癌症之 免疫反應的方法’此方法包含投予-包括-TTK多胜肽或 其免疫活性片段、編碼出一ΪΤΚ多胜肽之多核苷酸，與 呈現ΤΤΚ多胜狀之外吐小體或抗原呈現細胞之試劑或組合 10 201102081 物的步驟。 本發明之應用性擴展至關於或起因於ττκ過度表現的 一些疾病，例如癌症，示範之癌症包括，但不限於肺癌、 膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨鑛性白血 病、大腸癌、子宮内膜異位症、食道癌、胃癌、擴散型胃 癌、肝癌、非小細胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、印巢癌、姨 臟癌、前列腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤與睪丸 癌。 具體地，本發明提供下列[1 ]至[21 ]; [1 ] 一種經分離的胜肽’包括序列辨識號：3之胺基 酸序列。 [2 ] —種經分離的胜肽’具有細胞毒殺性τ淋巴球誘 發能力，其中該胜肽係包括序列辨識號：3之胺基酸序列， 其中1、2或數個胺基酸被取代、刪除或加入。 [3] 如[2]之經分離的胜肽，其中該胜肽具有一或兩者 之下列特徵： (a) 自N端之第二個胺基酸為，或經修飾為一胺基 酸，其係擇自由白胺酸與曱硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) C端胺基酸為，或經修飾為一胺基酸，其係擇自 由纈氨酸與白胺酸所組成之群組。 [4] 如[1]至[3]之任一項之經分離的胜肽，其為九胜 肽。 [5] —種經分離之多核苷酸，其編碼出π]至[4]之任 一項的該胜肽。 11 201102081 [6] —種誘發細胞毒殺性τ淋巴球之試劑，其中該試 劑匕括[1]至[4]之任-項的—或多個胜肽，或[5]之一或多 個多核苷酸。 ' [7 ] 一種藥學试劑，用於癌症之治療及/或預防，及/ 或避免其手術後復發，其中該試劑包括π]至[4]之任一項 的一或多個胜肽，或[5]之一或多個多核苷酸。 [8 ]如[7 ]之藥學試劑，其被配製來用以投予一個體， 其人類白血球組織抗原為人類白血球組織抗原_Α2。 9 ]如[7 ]之藥學試劑，其中該人類白血球組織抗原 -Α2為人類白血球組織抗原—Α* 〇2〇1。 [1 〇 ]如[7 ]或[8 ]之藥學試劑，其中該試劑被配製來用 於癌症之治療。 [11 ] 一種誘導具有細胞毒殺性Τ淋巴球誘發能力之 抗原呈現細胞的方法，其包括一步驟係擇自由下列所組成 之群組： ^ (a) & 、以以叩或“ F/>〇將一抗原呈現細 I /、申5月專利範圍第1至4項之任一項之該胜肽接觸；以 及 (b) 將編碼出[1 ]至[4 ]之任一項之該胜肽的一多核苦 酸引入一抗原呈現細胞。 [12] —種誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，包括一步 驟’其擇自由下列所組成之群組： (a)將CD8 + T細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原呈現 細胞表現一人類白血球組織抗原與[1 ]至[4 ]之任一項之該 12 201102081 胜肽的複合物於其表面上； (b) 將CD8 + T細胞與外吐小體共培養，外吐小體表現 一人類白血球組織抗原與[丨]至[4 ；]之任一項之該胜肽的複 合物於其表面上；以及 (c) 將一包括編碼出_ τ細胞受體次單元多胜肽之多 核苷酸的基因引入一 T細胞，該τ細胞受體次單元多胜肽 具有與[1]至[4]之任一項的該胜肽結合的能力。 [1 3 ] —種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血 球組織抗原與[丨]至[4]之任一項之該胜肽的複合物於其表 面上。 [14]如[13]之抗原呈現細胞，其藉由[η]之方法來誘 導。 ° [15 ] —種經分離之細胞毒殺性τ淋巴球，其以[1 ]至 [4 ]之任一項之該胜肽為標的。 [16]如[15]所述之細胞毒殺性τ淋巴球，其藉由[12] 之方法來誘導。 曰 、 間一種於一個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方 法’其中該方法包括投予該個體一試劑，該試劑包括一或 多個[1 ]至[4 ]之任一 jg少Μ . 仕項之胜肽、一或多個其免疫活性片 段、或-或多個編碼出該胜肽或該片段之多核普酸。 Π8] —種抗體或其片段，其抗π]至[4]之任一項之該 胜肽。 、以 之任一項之該胜 [1 9 ] 一種載體，包括編碼出[丨]至[4 ] 肽的一核苷酸序列。

13 201102081 [20] —種宿主細胞，其被以[19]之一表現載體所轉形 或轉染。 [21] —種診斷套組，包括[。至^]之任一項之該胜 狀、[5]之該核苷酸或[18]之該抗體。 需要瞭解的是’本發明之前述發明内容與下列詳細敘 述兩者為做為例子之實施例，並不限制本發明或本發明之 其他替代實施例。 除了上述，當以下詳細說明被閱讀並結合伴隨之圖式 與實施例，本發明之其他目的與特徵會變的更完全地明 白。然而，可瞭解的是，上面之本發明内容與以下之詳細 說明兩者為示範之實施例’並不限制本發明或本發明其他 替代實施例。特収，當關於—些特定實施例於此敘述之 本發明，可以瞭解的是，敘述為本發明之說明，且並不建 構為本發明之限制。各種修飾與應用可被熟悉此技藝人士 想到’而&背離本發明精神與㈣，如所附申請專利範圍 所述。同樣地’本發明之其他㈣、特徵、好處與優點自 此内容與下述之特定實施例，為清楚的，且對於熟悉此技 藝人士而言可立即明白。此種目#、特徵、好處與優點自 上述結合伴隨實施例、資料、圖式與所有要被自其單獨或 隨著考慮引人於此之參考文獻而描述的所有合理推論為清 楚的。 【實施方式】 可使用相似或等 雖然於本發明實施例之實施或測试中 14 201102081 同於在此敘述之那此的杜h + 社 —的任何方法與材料’但是現在敘述較 佳之方法、元件與材料。妙 ^ …、、而在敘述本發明材料與方法 前，需瞭解的是，本菸明廿丁师 〈 x月並不限於敘述於此之特定大小、 形狀、尺寸、材料、方法與 、 叶方法學、步驟等，例如按照慣例實驗 法及/或最佳化可將其變、 欠更也吊瞭解的是，於此敘述中佶 用之專門用語僅是為了私、+, & ^ 疋為了敘述特別之變化形式或實施例 不傾向限制僅會受限於所 。 &限於戶斤附上之申請專利範®的本發明範 圍。 所有於本說明書中蔣 扣及之各刊物、專利或專利申 此以其内容被具體引入為 、 為/考文獻。然而，於此並沒有被 解釋為承認本發明由於| 1 〇 乃由於先則發明之效力不被給予先於這虺 揭露之權力。 I.定義 興除非特別定義，於此使用屬與本發明之所有技術或科 子用s吾為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。如果 發生抵觸，本發明說明書，包括定義，將會控制。 於此使用之單字“ _，，與“該，，意#‘‘至少—，，除 以別的方式明確指出。 μ ，於此可替換使用之用語“多胜肽”、“胜肽，，與“蛋 互白質”意指胺基酸殘基之一聚合物。此用語適用於胺基酸 β σ物’於其中一或多個胺基酸殘基為經修飾之殘基或非 自然發生之殘基’例如對應自然發生胺基酸之人工化學模 仿物，與自然發生胺基酸聚合物。 、

ί II 201102081 於此使用之用語“胺基酸”意指自然發生與合成之胺 基酸’及胺基酸類似物與胺基酸模仿物，其與自然發生之 胺基酸起相似作用。胺基酸可為L_胺基酸或D-胺基酸。自 然發生胺基酸為基因密碼所編碼的那些與於細胞中在轉譯 後被修飾的那些（例如經脯胺酸（hydroxyproline)、 缓基谷胺酸（gamma-carboxyglutamate)與 0_磷絲.胺酸 (Ο-phosphoserine))。措辭“胺基酸類似物”意指具有與 自然發生胺基酸相同之基礎化學結構（一 α碳鍵結至一 虱、一敌基、一胺基與一 R基）的化合物，但具有一經修 飾之R基或經修飾之骨架（例如，同絲胺酸（homoserine)、 降亮胺酸（norleucine)、甲硫胺酸（methionine)、亞颯 (sulfoxide)、甲基硫氨磺（methionine methyl sulfonium))。措辭“胺基酸模仿物”意指化學化合物其 與一般胺基酸具有不同結構，但有相似的功能。 可藉由由 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature

Commission所建議之其一般所知的三字母符號或一字母符 來·ί曰出於此處之胺基酸。 於此可替換使用用語“基因”、“多核苷酸”、“核 苷酸”與“核酸”，且除非以別的特別方式指出，其與胺 基酸相似藉由其一般接受的單一字母編碼來指出。 此處使用之用語“組合物，’意指包括一產物，其包括 於特定量中特定成分’與任何產物其直接或間接來自於特 定量之特定成分的組合。此用語與藥學組合物相關，意指 包括一產物，其包括一活性成分與形成載體的惰性成分， 16 201102081 及任何產物其直接或間接來自任兩個或多個成份之組合、 複合或聚集，或來自一或多個成分之解離，或來自一或多 個成分之反應或相互作用的其他形式。因此，在本發明内 谷中，措辭藥學組合物”包括藉由混合本發明化合物與 藥學上或生理上可接受之載體所製成的任何組合物。如此 處所使用之措辭“藥學上可接受之載體”或“生理上可接 受之载體，，意指藥學上或生理上可接受之材料、組合物、 物質或載劑’包括，但不限於一液體或固體填充料、稀釋 劑、賦形劑、溶劑或套膜材料，其與自一器官或身體之一 部分攜帶或運輸活性成分至另一器官或身體之一部分相 關。 除非以別的方式定義，用語“癌症”意指過度表現ττκ 基因之癌症或腫瘤，其例子包括，但不限於肺癌、膀胱癌、 乳癌子呂頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸 癌、子宮内膜異位症、食道癌、胃癌'擴散型胃癌、肝癌、 非小細胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列 腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤與睪丸癌。 除非以別的方式定義，於此可替換使用且以別的方式 特別指出用語“細胞毒殺性τ淋巴球，’、“細胞毒殺性τ 細胞與CTL”以意指Τ淋巴球之次族群，且除非以別的 方式指出，意指τ淋巴球之次群組（sub_group)可辨認非自 身細胞（例如，腫瘤/癌症細胞、被病毒感染之細胞），且 誘導這些細胞死亡。 除非特別定義，用語“HLA-A2”如此處所使用代表性 17 201102081 意指次型，例如HU-A*020i與HLA- A*〇2〇6。 ,除非特別定義，於此使用之用語“套組，’被使用於關 :忒劑與其他材料之組合。與此考慮之套組包括微陣列、 杯〜等。並無打算使用語套組”限制於試劑及/ 或材料之特定組合。 ，，本發明之方法與組合物之範圍提供用途於癌症之“治 療與“預防”之内容中，一治療被視為“有效”，若其 導致臨床優點，例如於ττκ基因之表現中的減少、或於個 體中癌症之大小、普遍程度（prevalence)或轉移潛力的減 :。當治療為預防性(帅—t i ca 1 i y )提供時，“有效” 。扣咸緩或避免癌症形成，或避免或減輕癌症之臨床症 狀。有效性被確認於相關之診斷或治療特定腫瘤形式的任 何已知方法。 ，，本發明之方法與組合物之範圍提供用途於癌症之“避 、預防之内令中，此類用詞為與此交替使用意指 任何活性’其減少死亡率之負載或來自疾病之死亡率。避 免與預防可發生於“初期 '第二期與第三期避免層級”。 初』避免與預防避免了疾病之發展而第二期與第三期層 、及之避免與預防包括藉由恢復功能與減少疾病相關併發 症’以疾病之發展與症狀之浮現及減少已建立之疾病之負 向發展的避免與預防為曰& , 马目的。或者’治療或避免可包括一 Η範圍之預防疾病/Q療，其以減緩特別疾病之嚴重度為目 標，例如減少腫瘤之増殖與轉移。 在本發明内谷中，癌症之治療及/或預防，或，及/或 18 201102081 其手術後復發的避免包括任何下列步驟，例如癌細胞之手 術移除 '似癌細胞之生長抑制、腫瘤之衰退或退化'癌發 =之減緩與㈣的料、腫錢化與血管新生抑制㈣ ¥。癌症之有效治療及7或預防減少致死率與改善具有癌症 之個體的預後、減低癌症標記於血液中的程度與減緩伴隨 者癌症之可偵測症狀。例如，症狀之減輕或改善構成有效 治療及/或預防’其包m 20%、30%或更加減輕， 或穩定疾病。 在本發明内容中，用語“抗體”意指免疫球蛋白與其 片段，其專一與選定蛋白質或其片段反應。一抗體可包括 人類抗體、靈長類抗體、嵌合抗體（chimeric anti比dy)、 雙專一抗體（bi specific antibody)、人源化抗體、與其他 蛋白質或放射標誌融合之抗體，與抗體片段。此外，此處 之抗體被使用於最大效用且特別包含完整單株抗體、多株 抗體、形成自至少兩個完整抗體之多專一抗體 (multispecific antibody)(例如雙專一抗體）與抗體片 段，只要其存在所需生物活性。一“抗體”意指所有之種 類（例如，IgA、IgD、IgE、IgG 與 IgM)。 除非特別定義，於此使用屬與本發明之所有技術或科 學用語為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。 11.胜肽 為了證明來自TTK之胜肽作用如一被細胞毒殺性T淋 巴球（CTLs)所辨認之抗原，分析來自TTK之胜肽（序列避

tt SB 19 201102081 識號：40 )以確定是否其為由一般遇到HLA對偶基因 (a 11 e 1 e)之HLA-2 (人類白血球組織抗原）所限制之抗原 決定位（Date Yei a/.，Tissue Antigens 47: 93-101，1996. Kondo A et al. , J Immunol 155: 4307-12, 1 995； Kubo RT 3/.，J Immunol 1 52: 391 3-24，1994)。 確s忍來自TTK之HLA-A2結合胜狀的候選物，根據甘對 HLA-A2之結合親和力。在藉由以這些胜肽脈衝（載有）之 樹突細胞刺激T細胞後，使用下列各胜肽成功建 立細胞毒殺性Τ淋巴球： ΤΤΚ-Α02-9-462 (序列辨識號：1)、 ΤΤΚ-Α02-9-630 (序列辨識號：2)、 ΤΤΚ-Α02-9-593 (序列辨識號：3)、 ΤΤΚ-Α02-9-719 (序列辨識號：6)、 ΤΤΚ-Α02-9-142 (序列辨識號：15)與 ΤΤΚ-Α02-10-462 (序列辨識號：22)。 這些被建立的細胞毒殺性Τ淋巴球顯示強而專一之抗 經分別之胜肽脈衝之目標細胞的細胞毒殺性Τ淋巴球活 性。此處這些結果證明ΤΤΚ為一由細胞毒殺性Τ淋巴球所 辨認之抗原，且被測試之胜肽為由HLA-A2限制之ΤΤΚ的抗 原決定位胜肽。 此外’以ΤΤΚ-Α02-9-593 (序列辨識號：3)建立之細 胞毒殺性Τ淋巴球顯示相較於先前所報導更強而專一之抗 表現HLA-A# 020 1與ΤΤΚ之目標細胞的細胞毒殺性Τ淋巴球 20 201102081 活性。這些結果證明TTK-A02-9-593 (序列辨識號：3 )為 適合之胜肽以誘導強而專一之抗過度表現TTK之細胞的細 胞毒殺性T淋巴球活性。 由於TTK基因於癌症細胞與組織，包括，但不限於肺 癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性 白血病、大腸癌、子宮内膜異位症、食道癌、胃癌、擴散 型月癌、肝癌、非小細胞肺癌、·淋巴瘤、骨肉瘤、印巢癌、 胰臟癌、前列腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤與睪 丸癌之中被過度表現’且不在大部分正常器官中，所以其 為一良好之免疫治療標的。因此，本發明提供對應於來自 TTK之細胞毒殺性T淋巴球辨認之抗原決定位的九胜肽（胜 狀由九個胺基酸殘基所組成）與十胜肽（胜肽由十個胺基 酸殘基所組成）。或者，本發明提供經分離之胜肽，其與 HLA抗原結合且誘導細胞毒殺性τ淋巴球活性，其中胜肽 由序列辨識唬：40之胺基酸序列所組成或為一其免疫活性 片奴。特別是，本發明九胜肽與十胜肽之較佳實施例包括 具有序列辨識號：3之胺基酸序列的胜肽。 通常可使用現今於例如網路可得之軟體程式，例如於 Parker KC et al. , J Immunol 1994 Jan 1, 152(1)： 163-75 與 Nlelsen m 以 W·， protein Sci 2〇〇3; 12: 1〇〇717 中所敘述的那些，來計# & 〜介於各種胜狀與肌 抗原間之結合親和力。例如，如於概述於，例如，心如 EM et al., Current Pharmaceutica 3209-3220 中之 parker KC ei j 15,

1 Design, 2009, Immunol 1994 Jan 21 201102081 152(1): 163-75, KuzushimaKeia7. , Blood 2001, 98(6): 1872-81，Larsen MV 以3人 BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424，BuusSeia人 Tissue Antigens·, 62:378-84, 2003， Nie 1 sen M et al. , Protein Sci 2003； 12: 1007-17 ’ 與 Nielsen M a人 PLoS ONE 2007; 2: e796 中所述可測量與HLA抗原之結合親和力。測量親和力之方 法敘述於’例如於 journal of Immun〇l〇gical Methods， 1 995，185: 181-190;與 Protein Science, 2000，9: 1838-1846中。所以使用此種軟體程式可選擇來自TTK的 片段，其具有與HLA抗原之高結合親和力。因此藉由此類 已知程式本發明包括由來自TTK之任何片段所組成之胜 肽，其與HLA結合。此外，此類胜肽可包括由全長之ττκ 所組成之胜肽。 本發明之九胜肽與十胜肽可於側面具有額外之胺基酸 殘基，只要所產生之胜肽維持它們的細胞毒殺性τ淋巴球 誘發能力。額外之胺基酸殘基也可包括任何種類之胺基 酸，只它們不減少原始胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球誘發能 力。因此，本發明包含具有對HLA抗原之結合親和力的胜 肽’其包括來自ττκ之胜肽。此種胜肽，例如小於約4〇個 胺基酸，時常小於約20個胺基酸，通常小於約15個胺基 酸0 一般而言’於一胜肽中一、二或容彻 及夕個胺基酸之修飾， 不會影響胜肽的功能，且在一虺例子中 一⑺卞Τ ’甚至增強Ε始| 白質所需之功能。事實上，已知經修飾之胜肽（即，當與 22 201102081 原始參考序列比較時，包括胺基酸序列之胜肽，其中一、 二或多個胺基酸殘基已被修飾（即，取代、加入、刪除或 插入））維持原始胜肽的生物活性（Mark ei a/.，proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith,

Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500;

Da 1 badie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1 982, 7 9 : 6 4 0 9 -1 3)。因此’於一實施例中，本發明胜肽具有細 胞毒殺性T淋巴球誘發能力與序列辨識號：3胺基酸序列 兩者，其中加入、刪除及/或取代一、二甚至更多個胺基酸。 熟悉此技藝人士認定改變一單一胺基酸或一小百分比 之胺基酸的個別加入、刪除或取代至一胺基酸序列傾向產 生保存原始胺基酸支鏈的特性。因此’它們常被意指為“保 守取代（conservative substitutions)，’ 或“保守修飾 (conservative modifications)” ，其中一蛋白質之改變 導致一具有類似原始蛋白質之功能的經修飾蛋白質。提供 功能相似胺基酸之保守取代表已為本技術領域所熟知。所 需保守之胺基酸支鏈的特徵的例子包括，例如疏水胺基酸 (A，I，L，M’ F’ P，W，Y，V)、親水胺基酸（R，D，& c， E，Q，G’ H，K’ S’ T)與具有下列共同官能基或特徵之支 鏈：一脂肪族支鏈（G，A，V，L，丨，p); 一含經基支鏈（s， Τ’ Y);含硫原子支鏈（C，Μ);含羧酸與胺基支鏈（D，N, E， Q);含驗支鏈（R，K，H);以及含芳香族支鏈（H，F，γ，w)。 此外，下列八個族群各包含於本技術領域中被接受為保守 取代之胺基酸： 201102081 1) 丙胺酸（A)、甘胺酸（G); 2) 天門冬胺酸（D)、麩胺酸（E); 3) 天門冬醯胺（N)、麩胺醯胺（Q); 4) 精胺酸（R)、離胺酸（K); 5) 異白胺酸（I)、白胺酸（L)、甲硫丁胺酸（M)、纈 胺酸（V); 6) 苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸（W); 7) 絲胺酸（S)、蘇胺酸（T);以及 8) 半胱胺酸（C)、甲硫丁胺酸（M)(參見Creighton, Proteins 1984)。 此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而， 本發明之胜肽並不限於此，且可包括非保守修飾，只要經 修飾之胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能 力。更進一步而言，經修飾之胜肽不排除多形變體 (polymorphic variant)之細胞毒殺性T淋巴球誘發的胜 肽、種間同質體（interspecies homologues)與TTK對偶基 因（alleles)。 為了維持必須之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，可修 掷（插入、加入 '刪除及/或取代）一小數目（例如一、二 或數個）或小百分比之胺基酸。此處用語“數個，，指5或 更少個胺基酸’例如4個、3個或更少。被修飾之胺基酸 之百分比較佳為20%或更少，例如，15%或更少，且甚至 更佳為，10%或更少或1至5%。 當使用於文中之免疫治療時，本發明之胜肽應被表現 24 201102081 於一細胞或外吐小體之表面上，較佳作為一具有hla抗原 之複合物。因此，較佳為選擇胜肽其不止誘導細胞毒殺性 τ淋巴球也具有對HLA抗原之高親和力。為達此目的，胜 肽可藉由胺基酸殘基之取代、插入及/或加入來修飾以產生 具經改善之結合親和力的經修飾之胜肽。除了自然表現之 胜肽外，由於已知藉由結合至HLA抗原表現之胜肽序列的 規則（J Immunol 1 994，1 52: 391 3; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994，155: 4307)，可將基於此規則 之修飾引入本發明之致免疫性胜肽。 例如，為了增加HLA-A2結合親和力，可需要以白胺酸 或曱硫丁胺酸取代N端的第二個胺基酸，及/或以纈胺酸或 白胺酸取代位於C端之胺基酸。因此，本發明也包括具有 序列辨識號：3之胺基酸序列的胜肽，其中n端的第二個 胺基酸被白胺酸或曱硫丁胺酸取代，及/或其中C端胺基酸 被纈胺酸或白胺酸取代。

可將取代引入不止於末端胺基酸，也可於胜肽之潛在 TCR辨認位置。一些研究已證實於一具有胺基酸取代之胜 肽可具有等於或比原來更好的功能，例如CAP1、p53 e 2 6 4 - 27 2 ), Her —2/neu (369-377)或 gpl 00 (209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J

Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology,

Immunotherapy (2004) 53， 307-314)。 25 201102081 本發明也考慮一、二個或數個胺基酸也可被加至本發 明胜肽之N及/或C端。本發明也包括具有高HLA抗原結合 親和力且維持細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之此種經修飾 的胜狀。 然而，當胜肽序列與一具有不同功能之外生或内生蛋 白質之胺基酸序列的一部份相同時，可能誘導副作用，例 如自體免疫疾病或抗特定物質之過敏症候群。因此，較佳 為使用可得之資料庫執行同源搜尋以避免胜肽之胺基酸序 列符合其他蛋白質之胺基酸序列的情況。當與目標胜肽比 較％不只存在具有一或兩個胺基酸不同之胜肽的同源搜尋 變得清楚時，為了增加其與HLA抗原之結合親和力，及/ 或增加其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力而不具副作用之任 何危險，可修飾目標胺基酸。 雖然如上述之具有對HLA抗原高結合親和力的胜肽被 預期為向效能’但根據作為指示之高親和表現而被選擇之 候選胜肽，更進一步被測試細胞毒殺性T淋巴球誘發能力 的表現。此處措辭“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”意指 當表現於抗原呈現細胞時，胜肽誘導細胞毒殺性τ淋巴球 的能力。此外’ “細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力”包括胜 肽誘導細胞毒殺性τ淋巴球活化、細胞毒殺性τ淋巴球增 殖、促進細胞毒殺性τ淋巴球分解目標細胞與增加細胞毒 殺性Τ淋巴球IFN- τ產生的能力。 藉由誘導攜帶人類MHC抗原之抗原呈現細胞（例如Β_ 淋巴球 '巨噬細胞與樹突細胞）或更專一地來自人類周邊 26 201102081 血液單核細胞之樹突細胞，並在以胜肽刺激之後與CD8 +細 胞混合，且之後測量由抗目標細胞之細胞毒殺性T淋巴球 產生並釋放之IFN- 7來達成細胞毒殺性T淋巴球誘發能力 的確定。如此反應系統，可使用已被產生來表現人類HLA 之基因轉殖動物（例如，於BenMohamed L，Krishnan R， Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) response中的描述）。例如可以51 Cr放射標示目標細胞， 且可從自目標細胞釋放出的放射活性計算細胞毒殺活性。 或者在攜帶經固定之胜肽之抗原呈現細胞存在下，藉由測 量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放的IFN- τ，且使用抗 IFN- r單株抗體來使於培養基上之抑制區可見來分析細胞 毒权性T淋巴球誘發能力。 由於如上述測試胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能 力，發現由序列辨識號：3所指出之胺基酸序列所組成之 九胜肽顯示特別高之細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力與對 HLA抗原之高結合親和力。因此此類胜肽為本發明之較佳 不範貫施例。 此外，同源分析之結果顯示這些胜肽不與來自任何其 他已知人類基因產物之胜肽有顯著之同源性。因此當用於 免疫&療時，降低了未知或不需要之免疫反應提高的可 21

I 201102081 性。因此，也來自此態樣，具有序列辨識號：3之胺基酸 序列的胜肽提供在癌症病患中引起抗m免疫反應的用 途口此本發明之胜肽較佳為具有序列辨識號：3之胺基 酸序列的胜肽。 除了上述修飾之外，本發明胜肽也可連接其他胜肽， 只要所產生之經連接的胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性τ 淋巴球誘發旎力。適合胜肽的例子包括：來自τκκ之其他 細胞毒殺性τ淋巴球誘導胜肽（例如，具有擇自序列辨識 號1 2、6、15與22中之胺基酸序列的胜肽）或來自其

他腫瘤相關抗原之細胞毒殺性τ淋巴球誘發胜肽。適合之 胜肽内（inter-peptide)連結器為被本技術領域所熟知與 包括，例如 ΑΑΥ (Ρ· M. Daftarian 以 a/·，j Trans Med 2007, 5:26) > AAA ^ NKRK (R. P. M. Sutniuller et al. , J

Immunol. 2000, 1 65: 7308-731 5)或 K (S. Ota 以 ，Can

Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura ei a/. , J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)。 例如’也可實質同時使用非TTK腫瘤相關抗原胜肽以 增加經由HLA class I及/或class II之免疫反應。其已 相當確認，癌症細胞可表現多於一個腫瘤相關基因。因此， 其為在對於熟悉此技藝人士例行實驗之範圍中以確認是否 一特定個體表現額外腫瘤相關基因，且之後包括來自此類 基因之表現產物的HLA c 1 ass I及/或c 1 ass 11結合胜肽 於根據本發明之TTK組合物或疫苗中。 HLA class I與HLA class 11結合胜肽之例子對於熟 28 201102081 悉此技藝人士而S為已知（例 參見 Coul ie，stem Cel Is 1 3:393-403，1 995 )，且可以— 如此處所揭露之那些的類 似方式被使用於發明中。因壯，技ω、 ^ 此使用分子生物之標準程序， 熟悉此技藝人士可立即製備句紅 侑匕括一或多個ττκ胜肽與一或 多個非ΤΤΚ胜肽的多胜肽，或 乂編碼出此類多胜肽的核酸。 上述此類連結胜肽於.声立 肌Κ此處思指為“多面體 (polytope)’’即’兩個或多個紙Α 夕徊'曰在免疫原性（immunogenic) 或免疫反應刺激胜肽的群組，胜肽可互相連接以多種排列 (例如，連成一串或部分重疊）。多面體（或編碼出多面 體的核酸）可以一標準免疫步驟被投予，例如至動物，以 測試多©體於錢、增強及/或料—免疫反應之功效。

胜肽可被直接連接或經由使用位於側面之序列以形成 多面體，且多面體為疫苗之用途為本技術領域所熟知（參 見，Thomson 〆 W.， Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature

Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997； Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996； Tarn et al.y j gxp Med. 1 71 ( 1 ):299-306, 1 990 )。製備並含有抗原決定位之 不同數目與組合的多面體並為了藉由細胞毒殺性T淋巴球 的辨認與為了於增加免疫反應中之功效將其進行測試。 本發明之胜肽可被連接至其他物質，只要所產生之連 結維持原始胜肽之必不可少之細胞毒殺性T淋巴球誘發能 力。適合之物質的例子包括，胜肽、脂質、糖與糖鍵、乙 醯基，天然與合成之聚合物等。本發明胜肽可包含修飾， IS1 29 201102081 例如醣基化、支鍤β 始胜肽之生物酸化，其提供修飾不損壞原 如目標功能與傳逆功处、— 卞額外之功月b(例 得运功托）或穩定多胜肽。 例如，A ?« . . 匈了 增加多胜肽之籍中痒 域已知引入Dm 夕胜肽之穩疋度，本技術領 馱、胺基酸模仿物或非天然胺基酸；此 適合本發明之多胜肽。可以一些方法分析—多胜狀 的穩疋度。例如，可使用肽酶與多種生物培養基，例如人 類血裝與血清’來測試穩定度（參見，例如Verhoef…人， Eur J Drug Metab pharmac〇kin 1 986，⑴ 29卜繼）。 .此外，如上所提到，在藉由一、二或數個胺基酸殘基 取代、刪除及/或加入之經修飾的胜肽中，可篩選或選擇與 原始胜肽相較具有相同或較高之活性的那些。因此本發明 也提供一篩選或選擇與原始相較具有相同或較高之活性的 經修飾胜肽的方法。說明之方法包括下列步驟： a:將至少一個本發明胜肽之胺基酸殘基取代、刪除或 加入， b *確定於步驟（a)中所產生之胜肽的活性，與 c :選擇與原始相較具有相同·或較高之活性的胜肽。 此處’要被分析之活性可包括MHC結合活性、抗原呈 現細胞或細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與細胞毒性活性。 較佳為要被分析之活性為細胞毒殺性T淋巴球誘發能力且 使用敘述於“實施例，，中方法可分析此種活性。 此處’本發明之胜肽也可被描述為“ TTK胜肽”或 “ TTK多胜肽”。 30 201102081 111. TTK胜肽之製備 使用熟知之技術可製備本發明之胜肽。例如，使用重 組DNA技術或化學合成可以合成方法地製備胜肽。本發明 胜肽可單獨合成或包括兩或多個胜肽之較長多胜肽。之後 可分離此胜肽，即純化或分離以使其實質上無其他自然發 生之宿主細胞蛋白質與其片段或任何其他化學物質。 本發明胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化或鱗 酸化，其提供修飾不損壞原始胜肽之生物活性。其他修飾 包括可用來’例如增加胜肽之血清半衰期之D_胺基酸或其 他胺基酸模仿物的合併。 藉由根據經選擇之胺基酸序列的化學合成可獲得本發 明之胜肽。適合此合成之一般胜肽合成方法的例子包括， 但不限於： (i) 胜肽合成（Peptide Synthesis) Interscience， New York, 1966; (ii) 蛋白質（The Proteins), Vol. 2， Academic Press, New York, 1976; (iii) 胜肽合成（Peptide Synthesis)(in Japanese), Maruzen Co.，1 975; (iv) 胜肽合成之基礎與實驗（BasiCs and Experiment of Peptide Synthesis) (in Japanese), Maruzen Co., 1 985; (v) 藥學的發展（Development of Pharmaceuticals) 31 201102081 (second volume) (in Japanese), Vo 1. 14 (peptide synthesis), Hi rokawa, 1991; (vi) W099/67288 ;以及 (vii) Barany G. & Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis* , Academic Press, New York, 1980， 100-118。 或者’藉由適應任何已知產生胜肽之基因工程方法可 獲得本發明之胜肽（例如’ Morris〇n j，j Bac1;eri〇l〇gy 1977, 132: 349-51； Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu 以 W.) 1983, 101: 347-62)。 例如，首先製備一適合之載體，其懷有一多核苷酸其編碼 出目k胜肽於一可表達的形式中（例如，調控序列之下游 相當於啟動子序列），並將載體轉殖進入適合之宿主細胞。 此種載體或宿主細胞也由本發明所提供。之後培養宿主細 胞以產生感興趣之胜肽。使用一 “轉譯系統可^ 產生胜肽。 IV.多核苷酸 本發明也提供一多核苦酸，其編碼出任何本發明上述 之胜肽。這些包括來自自然發生之基因（ Accession No. ΝΜ_0〇3318 (序列辨識號：39))的核苦酸 序列與具有其之保守修飾之核苷酸序列的那些。此處措辭 “保守修飾之核苦酸序列，，㈣列其編碼出相同或實質上 相同之胺基酸序列。由於基因密碼的退化，一大份之功能 32 201102081 相同之核酸編碼出任何已知蛋白質。例如，密碼、GcC、 GCG與GCU皆編碼出胺基酸丙胺酸。因此，於藉由一密碼 具體指定丙胺酸之每個位置，可改變密碼成為任何上述不 會改變編碼出之胜肽的對應密碼。此核酸變化為“沈默變 化（silent variation)” ，其為保守修飾變化的一種。此 處編馬出胜肽之母個核酸序列也描述核酸之每種可能的 沈默變化。熟悉此技藝人士明白於一核酸中各密碼（除了 AUG，其原本為甲硫胺酸之唯—密碼 '與tgg其原本為色胺 酸之唯―密碼）可被修飾以產生—功能相同分子。因此編 碼出-胜肽之核酸的纟沈默變化係為各所㈣之序列中 被暗示性描述。 本發明之多核苷酸可由DNA、RNA或其衍生物所組成。 如本技術領域所熟知，麗》子由驗基所組成，例如自然 發生之驗基Α、T、〇與G，* 7於驗中為U所取代。熟 悉此技藝人士可瞭解非自然發生驗基也被包含於本發明 中0 本發明之多核苦酸可編碼出本發明之多個胜狀，宜包 含一本發明胜肽與其他抗原決定位胜肽，具有或不具有介 於中間之胺基列。例如介於中間之胺基酸 多核芽.酸或經轉譯之胜肽—裂解位（例如酵素辨認序列 步而έ，多㈣酸可包括任何額外之序列至編碼出 本發明胜肽之編碼序列。例如，多核苦酸可為—重組多核 苷酸，其包括胜肽表現所需之 〜π徑序列，或可為一 誌基因與此類之表現載體（質 一 、不、 “…製備 33 201102081 重組多核苷酸，藉由經由使用一般重組技術，例如聚合酶 與内切酶之多核苷酸操作。 可使用重組與化學合成技術兩者以產生本發明之多核 苷酸。例如，藉由插進入一適合之載體可產生一多核芽酸， 當轉染進入一勝任細胞時’其可被表現。或者，使用pcR 技術或表現於適合的宿主可將一多核苷酸放大（參見，例 如 Sambrook 以 5/.， Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)。或者’使用固態技術如於BeaucageSL& iyerRp Tetrahedron 1992, 48: 2223-311； Matthes et al.y EMBO J 1984，3: 801-5中所敘述，可合成多核苷酸。 V.外吐小體（exosomes) 本發明進一步地提供稱為外吐小體的胞間囊泡 (intracel lular vesicles)，其呈現形成於本發明之胜肽 與人類白血球抗原表面之間的複合物。利用例如“卯此“

Patent Application Kohyo Publications Nos Hei 11-5刪7與则/〇3499所詳述的方法以及從接受治療和 /或預防之病人所得的抗原表現細胞可製備外吐小體。本發 月之外吐小體可如疫苗般地接種’以類似於本發明的胜肽 之方式。 包含在複合物中的人類白血球抗原形式必須盘需要八 療和/或預防之個體的人類白血球抗原形式相符。例如，： 日本族群中，HLA_A2，待別是hu—a*g2qi與m⑽ ώ 34 201102081 為普遍且因此對於曰本人病患的治療而言為適合的。高度 表現於曰本人與高加索人之中的A24型或A2型之使用有助 於獲得有效的結果，且次型A*0201與A*0206也提供用 途—般在臨床上，需接受治療之病患的人類白血球抗原 形式係進行預先的研究’這可適當地選擇對此抗原具有高 度結合親合力的胜肽或經由抗原表現具有細胞毒性τ淋巴 、'田胞誘發性的胜肽。此外，為了獲得具有高度結合親合力 /、、、’田胞毒性Τ淋巴細胞誘發性兩者的胜肽，可以天然產生 之ΤΚΚ部分胜肽的胺基酸序列為基礎，然後進行1、2或數 個胺基酸的取代、插入、刪除及/或添加。 於本發明中，較佳可使用具有序列辨識號：3之胺基 酉文序列的胜肽為要被外吐小體所呈現之胜肽，且此種胜肽 具有對HLA-A2’例如HLA-A* 0201的高結合親和力。因此， 於較佳貫施例中，本發明之外吐小體呈現形成於具有序列 辨識號：3之胺基酸序列的胜肽與Hu抗原間的複合物於 其表面。 VI ·抗原呈現細胞

本發明也提供抗經分離之原呈現細胞，其表現以HLA 抗原與本發明胜肽形成的複合物於其表面。抗原呈現細胞 可來自受到治療及/或避免之病患，且藉由其本身或與包括 本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性τ淋巴球之其他藥 物結合可被投予如一疫苗。 抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突 I S1 35 201102081 細胞、蘭格罕細胞（Langerhans cel1)、巨嗜細胞、B細胞 與活化之T細胞’已知其表現蛋白質（Pr〇teinaceous)抗原 於其細胞表面以被淋巴球所辨認。由於樹突細胞為一典型 抗原呈現細胞，其於抗原呈現細胞中具最強之細胞毒殺性 T淋巴球誘導作用，樹突細胞供給使用如本發明之抗原呈 現細胞。 例如，藉由誘導來自周邊血液單核細胞之樹突細胞與 之後/刀、ex 或7·77 Η·%»以本發明胜肽接觸（刺 激）其可獲得一抗原呈現細胞。當本發明之胜肽投予至一 個體，於個體身體内誘導表現本發明胜肽之抗原呈現細 胞。因此，藉由在將本發明胜肽投予至一個體後，自此個 體收集抗原呈現細胞可獲得本發明之抗原呈現細胞。或 者，藉由將自個體收集之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸 可獲得本發明之抗原呈現細胞。 可將本發明之抗原呈現細胞投予至一個體以誘導於個 體中之抗癌免疫反應’藉由其本身或與包括本發明之脸 肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球之其他藥物結合。例 如，F/⑺投予可包括步驟： a :自一第一個體收集抗原呈現細胞， b :以胜肽接觸步驟a之抗原呈現細胞，以及 c :將步驟b之抗原呈現細胞投予一第二個體。 第一個體與第二個體可為相同個體或可為不同個體。 或者’根據本發明’提供本發明胜肽於製造一誘導抗原呈 現細胞之藥學組合物的用途。此外，本發明提供製造誘導 36 201102081 抗原呈現細胞之藥學組合物的方法或製程。更進一步，本 發明也提供用於誘導抗原呈現細胞之本發明胜肽。自步驟 b獲得之抗原呈現細胞可做為疫苗被投予以治療及/或預防 癌症，癌症包括，但不限於，肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮 頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、子宮内 膜異位症、食道癌、胃癌、擴散型胃癌、肝癌、非小細胞 肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎 癌 '小細胞肺癌 '軟組織腫瘤與睪丸癌。 根據本發明一方面，本發明之抗原呈現細胞具高程度 細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。在用語“高程度細胞毒殺 性τ淋巴球誘發能力”中，高程度相對於藉由抗原呈現細 胞沒有與胜肽接觸或與無法誘導細胞毒殺性T淋巴球之胜 狀接觸的程度。藉由包括/π 將編碼出本發明胜肽之 多核苦酸轉移至抗原呈現細胞的步驟的方法與上述之方 法’可製備此種具高程度細胞毒殺性Τ淋巴球誘發能力之. 抗原呈現細胞。此經引入之基因可為DNA或RNA形式。引 入方法的例子包括’並無特別限制，可使用各種於此領域 一般被執行的方法，例如可使用脂質體轉染

Oipofecti on)、電穿孔法（eiectr〇p〇rati〇n)或填酸辦方 法。更特別地’可執行其如Cancer Res 1 996, 56: 56 72-7; J Immunol 1998, 161： 5607-13; J Exp Med 1996, 184： 465 72; Published Japanese Translation of

International Publication No. 2000-509281 中所述。 藉由轉移基因進入抗原呈現細胞，基因遭遇轉錄、轉譯與 37 201102081 此類於細胞中，且之後所獲得之蛋白質藉由mhc ciass ι 或Class II處理，並經由一呈現途徑進行以與呈現胜肽。 在較佳實施例中，本發明之姑居g招A ^ 个\ a之机席里現細胞可為呈現形 成於HLA抗原與具有序列辨識號：3之私― J ^ ^ 0乏胺基酸序列的胜肽 之間的複合物於其表面的那些。更佳為，抗原呈現細胞攜 帶HLA-A2抗原，例如HLA_A*〇2〇1，並呈現以Hu_A2抗原

與本發明胜狀（例如，具有庠列辨罐跋.Q 八另汁〜π A現.3之胺基酸序列 的胜肽）所形成之複合物於其表面。 V11 ·細胞毒殺性τ淋巴球 抗任何本發明胜肽誘導之細胞毒殺性τ淋巴球增強^ 以癌症細胞為標的之免疫反應，且因此就其本身而 言，可使用為疫苗以相似於胜肽之方式。因此本發明提供 經分離之細胞毒殺性τ淋巴球其藉由任何本發明之胜肽專 一地被誘導或活化。 可獲得此種細胞毒殺性Τ淋巴球，藉由（1)將本發明 胜肽投予至一個體；或（2)將來自個體之抗原呈現細胞與 CD8 +細胞或周邊血液單核淋巴球與本發明之胜肽/万以⑺ 接觸（刺激）且之後分離細胞毒殺性丁淋巴球或（3)將CD8 + 細胞或周邊血液單核淋巴球與表現HU抗原與胜肽之複合 物於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體接觸或（4 )引入 包括編碼出與具與本發明胜肽結合之能力之τ細胞受體次 單元多胜肽的多核苷酸的基因。藉由上述方法可製備此類 抗原呈現細胞或外吐小體，且（4)之方法之詳細被敘述於下 38 201102081 方“VIII. T細胞受體（TCR)，，的段落中。 、本發明細胞毒殺性τ淋巴球可來自—受到治療及/或 避免之病患，且藉由其身或與包括本發明之胜肽或為了調 節作用之外吐小體的其他藥物結合可被投予。所獲得之細 胞毒殺性Τ淋巴球起專—抗目標細胞的作用，而目標細胞 其表現本發明胜肽’例如用於誘導之相同胜肽。目標細胞 可為細胞其内生性表現ττκ，例如癌細胞，或被以ττκ基 因轉殖之細胞；且由於藉由胜肽刺激表現本發明胜肽於細 胞表面之細胞，也可做為經活化之細胞毒殺性τ淋巴球攻 擊的目標。 VI11. τ細胞受體（TCR) 本發明也提供一組合物其包括由編碼出可形成Τ細胞 受體之次單位之多胜肽的核酸，與其使用方法。本發明之 Τ細胞受體之次單位具有能力形成τ細胞受體，其授與專 一性至抗腫瘤細胞的τ細胞，腫瘤細胞表現ττκ。藉由使 用本技術領域所知的方法可確認編碼出構成細胞毒殺性Τ 淋巴球中之Τ細胞受體次單位的α-與/3 -支鏈之核酸，而 細胞毒叙性Τ淋巴球以一或多個本發明之胜狀所誘導 (W02007/032255 and Morgan et al. , J Immunol, 171, 3288

SI (2003))。例如，喜好以聚合酶鏈鎖反應方法來分析編碼出 T細胞受體次單元的核苷酸。用於分析之聚合酶鏈鎖反應 引 子可為 ，例如 5’ -R 引子 (5， -gtctaccaggcattcgcttcat-3’ ）為 5’ 端引子（序 39 201102081 列 辨識號 ：41 ) 與 3-TRa-C 引 子 (5，-tcagctggaccacagccgcagcgt-3，)專一於 T 細胞受 體alpha鏈C區（序列辨識號：42 ) 、3-TRb-Cl引子 (5’ -tcagaaatcctttctcttgac-3’ ）專一於 T 細胞受體 beta鏈C1區（序列辨識號：43)或3-TRbeta-C2引子（5，- ctagcctctggaatcctttctctt-3’ ）專一於 T 細胞受體 beta 鍵C2區（序列辨識號：44 )為3’ 端引子，但不被限制。 引出之T細胞受體可以高親合力結合表現TTK胜肽之目標 細胞’且視需要κ/κσ與i’/7 κ/ίΓσ居中有效殺死表現 ΤΤΚ之目標細胞。 編碼出Τ細胞受體次單位的核酸序列可合併進入適合 之載體’例如反轉錄病毒載體❶這些載體為本技術領域所 熟知。通常包含其之核酸或載體可被轉移至一 Τ細胞，例 如一來自一病患之τ細胞。有用地，本發明提供一現成 (off-the-shelf)的組合物允許快速修飾病人所擁有之τ 細胞（或其他哺乳動物之那些）以快速簡單產生具有優秀 之癌症細胞殺死特性的經修飾T細胞。 特定之T細胞受體可專一地辨認本發明之一胜肽與 HLA分子之複合物，當τ細胞受體於τ細胞表面時，給予τ 細胞抗目標細胞之專一活性。藉由任何已知方法可確認上 述複合物之專一辨認’其較佳例子包括包括使用HLa分子 ”本發月胜肽之夕聚體染色（mulHmer staining)分析’與 ELISPQT分析。藉由執行Eusp()T分析，其可確認是否以 編碼出τ細胞文體次單元之核酸轉導（“抓以此…之τ細胞 40 201102081 辨認一表現HLA分子與TTK之細胞，及將訊息傳送於細胞 内。其也可確認是否藉由本技術領域已知的方法引入τ細 胞之Τ細胞受體可給予細胞細胞毒性。較佳方法包括，例 如’使用HLA-A2 +與ΤΤΚ過度表現之細胞的鉻（chr〇mium) 釋放分析。 本發明也提供細胞毒殺性T淋巴球，其藉由以編碼出 T細胞受體次單元的核酸來轉導（i〇n)來製備，τ 細胞受體次單元與形成於本發明胜肽與HLA-A2分子，例如 HLA-A 0201之間的複合物結合。 經轉導之細胞毒殺性T淋巴球可7./7 自引導至癌 症細胞，且可藉由熟知的培養方法/乃擴張（例如，

Kawakami a/·， J Immunol.， 142， 3452-3461 (1989))。 本發明細胞毒殺性T淋巴球也可用來形成一致免疫組合 物，其於一需要治療或保護之病患中治療及/或避免癌症為 有效（W02006/031221 )。 IX.藥學試劑或組合物 由於與正常組織相較，ΤΤΚ表現於癌症中特別被提高， 癌症的例子包括，但不限於肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸 癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、子宮内膜 異位症、食道癌、胃癌、擴散型胃癌 '肝癌、非小細胞肺 癌、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、 小細胞肺癌、軟組織腫瘤與睪丸癌，本發明之胜肽或編碼 出此類胜肽之多核苷酸可用來癌症之治療及/或預防及/ 41 201102081 或用來避免其手術後之復發。因此，本發明提供一藥學試 劑或組合物用來癌症之治療及/或避免其手術後之復發，此 類試劑或組合物包括作為活性成分之一或多個本發明胜狀 或多核普酸。或者，本發明之胜肽可表現於任何前述外吐 小體或細胞表面，例如抗原呈現細胞，以用來作為藥學試 劑或組合物。此外，上述以本發明任何胜狀為標的之細胞 毒殺性τ淋巴球也可用來作為本發明藥學試劑或組合物之 活性成分。 本發明之藥學試劑與組合物也提供使用如一疫苗。在 本發明内文中’措辭“疫苗”（也指一致免疫組合物）意 指一物質，其藉由接種至動物具有誘導抗腫瘤免疫力。 本發明之藥學試劑或組合物可用於治療及/或避免癌 症或腫瘤，及/或其手術後復發的避免於一個體或病患中， 個體或病患包括人類與任何其他哺乳動物，其包括，但不 限於小鼠'大鼠、天竺鼠、兔子、猶、狗、綿羊、山羊、 豬、牛、馬、猴子、狒狒與黑猩猩，特別是一商業上重要 動物或被馴養了的動物。 在另一實施例中，本發明也在製造用以治療或避免癌 症或腫瘤之樂學試劑或組合物中提供一活性成分的使用， 其擇自： (a )本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 42 201102081 外吐小體；以及 (d)本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者，本發明更提供一用以治療或避免癌症或腫瘤的 活性成分擇自： (a )本發明胜肽； ⑻於-可表現之形<，編碼出#此處揭露之此種胜 肽的核酸； (。）表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d)本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者，本發明更提供-製造用以治療或避免癌症或腫 瘤之樂學試劑或組合物的方法或製程，其中方法或製程包 括將一藥學上或生理上 心戰體與一活性成分一起配 製的步驟，活性成分擇自： (a)本發明胜肽； ⑻於-可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明一胜肽於其表 衣囬上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球， 為活性成分。 在另一實施例中，本發明也提供一· 货 I迈用以治療或避 免癌症或腫瘤之藥學試劑或組合物的方法或製程，其中方 法或製程包括將一藥學上或生理上可接 /、 S1 J丧又之載體與一活性 43 201102081 成分一起混合的步驟，其中活性成分擇自： (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 狀的核酸；

外吐小體 表現本發明-胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 ;以及 (d)本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 根據本發明，已發現具有序列辨識號：3之胺基酸序 列的胜肽為HLA_A2限制之抗原決定位胜肽或候選物，其可 誘導強而專-之免疫反應。因此包括至少—具有序列辨識 號：3之胺基酸序列之胜肽的本發明藥學試劑或組合物特 別適合投予HLA抗原為HLA-A2之個體。相同的實施至包括 編碼出任何這些胜肽之多料酸（即，本發明之多核普酸） 的藥學試劑或組合物。 由本發明藥學組合物治療之癌症不限於且包括其中關 於TTK (例如，為過度表現）之任何種類之癌症，包括， 例如肺癌、膀胱癌、乳癌、+宮頸癌、It管細胞癌、慢性 骨髓性白血病、大腸癌、子宮内膜異位症、食道癌、胃癌、 擴散型胃癌'肝癌、非小細胞肺癌'淋巴瘤、骨肉瘤、印 巢癌、胰臟癌、前列腺癌、冑癌、小細胞肺癌、軟組織腫 瘤與睪丸癌。 本發明藥學試劑或組合物可包括除了上述活性成分 外具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗似癌細胞之能力的其 他胜肽、編碼出此其他胜肽之其他多核苷酸、其他表現此 44 201102081 他胜狀之細胞或此類。於此，具有誘導細胞毒殺性τ淋 癌細胞之能力的其他胜肽由癌症專—抗原所例示 (心丨如、座弋義之腫瘤相關抗原），但不限於此。 士本發明之藥學試劑或組合物可視 他治療物質為-活性成分，只要此物質不抑制活= =腫瘤功效，活性成分例如任何本發明胜肽。例如，配方 可包括抗發炎試劑、止痛劑、化學治療與其類似。除了其 他治療物質於藥劑其本身 身t也了將本發明之藥劑與一或 八 生理組合物相繼或同時投予。擧^ 4 署 〜j才子又卞樂劑與生理試劑的 a，例如使用何種生理試 計晝與方式。 要〜療之疾病與投藥的 應瞭解的是’除了此處特別提 藥學铽劑a 〈成刀外’本發明之 具有關於討論中之配方形式。 如之其他成劑，其 在本發明一實施例中，本發 被包含於製造之商σ樂予忒劑或組合物可 病，例二,與套組，其包含對於要被治療之疾 J如癌症的病理情況有用之材料 具有一^ 商品可句； 軚織之任何本發明藥學物f 的容器包括航、小瓶（vlal)與試管。容=的谷器。適合 料，例如破瑪或塑膠。於容器上之:形成自各種材 物為用來、、厶电 戴而才曰出物質或έ且人 巧用朿冶療或避免疾病之—或多 貝I且口 投藥指示等。 滑，兄。標籤也可指出 除了上述容器外，套組包括本發明 可現需要更進—步包括一第 。千蜮劑或組合物 W ’其儲藏—藥學上可接 45 201102081 需要之其他材 、注射器與具 受之稀釋液。其可更包括商業或使用者觀點 料，包括其他緩衝溶液、稀釋液、濾器、針 有使用說明之包裝插入物。 μ藥學組合物若需要可被呈現於—包（pack)或一分配 益’其可包含含有活性成分之一或多單位劑量形式。包裝 可例如包括金屬或塑勝落’例如—泡棉箱（bush pack)。包或分配器可伴隨著投藥指示。 (1)藥學試劑或組合物包含胜肽作為活性成分 可直接投予本發明胜肽為一藥學試劑或組合物，若需 要的話’其已被-般配方方法所配製。在之後的例子，除 了本發明胜肽外、若適合可包括載體、賦形劑與原始做為 藥物使用之此類而無特別限制。上述載體的例子為滅菌水 生理食鹽水、磷酸緩衝溶液與培養液體（culture 與此類。更進-步而言，若必須，藥學試劑或組合物可含 安定劑、懸液劑、防腐劑、界面活性劑與此類。本發明之 藥學試劑或组合物可用來抗癌目的。 可將本發明之胜肽製備為一組合，其由兩或更多個本 發明之胜肽與其他抗原決定位胜肽（例如，來自其他腫瘤 相關抗原的胜肽）所組成’以誘導細胞毒殺性τ 淋巴球。胜肽組合可以雞尾酒形式執行或可使用標準技術 彼此結合。例如，胜肽可被化學連接或表現如一單一融合 多胜肽序列’其可具有一或數個胺基酸為連接器（例如，

Lysine linker： K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002 46 201102081 168: 5709-5715 ) °結合之胜肽可為相同或不同。藉由投 予本發明之胜肽’藉由HLA抗原’高密度呈現胜肽於抗原 呈現細胞上’之後對形成於呈現胜肽與HLA抗原之間的複 合物專一反應之細胞毒殺性T淋巴球被誘導。或者，抗原 呈現細胞（例如’樹突細胞）自一個體移出且之後以本發 明胜肽刺激以獲得表現任何本發明之胜肽於其細胞表面之 抗原呈現細胞。將這些抗原呈現細胞再投予至該個體以於 該個體中誘導細胞毒殺性T淋巴球，且因此可增加朝向腫 瘤相關内皮的侵犯。 治療及/或避免癌症之藥學試劑或組合物，其包括一本 發明之胜肽為活性成分，也可包含一已知為有效建立細胞 免疫力之佐劑。或者藥學組合物可與其他活性成分一起被 投予，或可以配製成細粒被投予。佐劑指一任何化合物、 物質或組合物，當與具有免疫活性之蛋白質一起投予（或 依次）時’其增強抗蛋白質之免疫反應。於此考慮之佐劑， 包括於文獻（Clin Microbiol Rev 1994，7: 277-89)中所 描述的那些。適合之佐劑的例子包括，但不限於磷酸鋁、 虱氧化紹、明礬、霍礼毒素、沙門氏菌毒素、佛氏不完全 佐劑（Incomplete Freund’s adjuvant, IFA)、佛氏完全佐 劑（Complete Freund’s adjuvant, CFA) 、 ISCOMatrix 、 GM-CSF、CpG、0/W乳劑與其類似物。 此外’於微脂體（1 i P〇S〇me )配方與細粒配方中，胜肽 連結至幾個微米直徑之小珠，且於配方中，可便利地使用 連結至胜狀之脂質。 II m 47 201102081 在本發明另一實施例中，本發明胜肽也可以一藥學上 可接又之鹽類被投予。如此處所使用“藥學上可接受之鹽 類意指維持化合物生物有效性與特性及獲得自與無機酸 或驗例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、頌酸、填酸、曱基項酸 (methanesulfonic acid)、乙基磺酸（ethanesulf〇nic acid)對甲本績酸（p-t〇luenesul fonic acid)、水楊酸 C sa 1 i cy 1 i c ac i d)與其類似物反應的那些。較佳鹽類之例 子包括具有驗金屬之鹽、具金屬之鹽、具有機鹼之鹽、具 有機酸之鹽與具無機酸之鹽。 在一些實施例中’本發明之藥學試劑或組合物可更包 括成为其啟動細胞毒殺性T淋巴球。已定義脂質為可^ H 啟動抗病毒抗原之細胞毒殺性τ淋巴球的試劑。例 如’可將棕櫚酸殘基黏附至離胺酸殘基之£ _與α -胺基， 且之後連結至本發明之一胜肽。之後脂質胜肽可被直接投 予於微胞或顆粒中、併入微脂體或乳化於一佐劑中。如脂 質啟動細胞毒殺性τ淋巴球反應之另一例子，昃•脂 蛋白，例如三軟脂酸-S甘油半胱氨酰-絲氨酰基絲氨酸 (tripalmi toyl-S-glyceryiCySterny卜sery1-serine)可 使用來啟動細胞毒殺性T淋巴球，當共價附加至一合適之 胜肽（參見’例如 Deres et al.，Nature 1 989, 342: 56 卜 4)。 投藥之方法可為口服、皮膚内、皮下、靜脈内注射或 此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域。 可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。本發明之胜肽劑量 48 201102081 可適合地調整根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥 方法、與此類’且本發明之胜肽劑量一般為0. 〇〇1 mg至 1 000 mg，例如 〇· 〇〇1 mg 至 1 000 mg，例如 〇. 1 mg 至 μ mg， 且可於數天至數個月投藥一次。熟悉此技藝人士可適合地 選擇一合適的劑量。 (2)藥學試劑或組合物包含多核苷酸為活性成分 本發明之藥學試劑或組合物也可包括編碼出此處揭露 之胜肽的核酸於一可表達之形式中^此處措辭“於一可表 達之形式中 意指多核苦酸’當引入一細胞，_//7 FO會 被表現成一誘導抗腫瘤免疫力之多胜肽。在一代表實施例 中’感興趣之多核苷酸的核酸序列包括對於表現多核苷酸 而吕必須之調控要素。可裝配多核苷酸以達到穩定插入目 標細胞之基因體（參見’例如敘述同源重組盒式載體 (cassette vector)的 Thomas KR & Capecchi MR，Cell 1987， 51: 503-12。也參見’例如 Wolff et ai.，Science ι99〇， 247: 1465-8; U. S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,1 18; 5,736,524; 5,679,647; and WO 98/04720 ) °DNA輸送技術的例子包括“裸DNA ”、經促進 (bupivacaine、聚合物、胜肽居中之）之輸送、陽離子脂 質複合物與顆粒居中之（“基因搶”）或壓力居中之傳送 (參見’例如 U. S. Patent No. 5, 922, 687 )。 本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體來表現。表現 載體的例子包括減弱病毒宿主，例如牛痘或禽痘。此方法 ί S3 49 201102081 包括使用牛痘病毒，例如為一載體以表現編碼胜肽之核苷 酸序列。藉由引人-宿主，&重組之牛痘病毒表現致免疫 胜肽且□此引起-免疫反應。於免疫步驟中為有效之牛癌 載體與方法敘述於，例如U.S. Patent N〇. 4, 722, 848。 另載體包括 BCG (Baci 1 le Calmette Guerin)。BCG 載體 敘述於 Stover et al·,. Nature 1991，351: 456-60 中。 對於治療投藥或免疫有用之其他多種載體，例如腺與腺病 毋相關之載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhi)載體、經解毒之炭疽毒素載體與其類 似為明顯的。參見，例如 Shata et al.，M〇1 Med T〇day 2〇()()， 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al.， In Vivo 2000， 14: 571-85。 輸送多核苷酸進入一個體可為直接，於其例子中，病 患直接暴露於一攜帶多核苷酸之載體，或為間接，於其例 子中，細胞首先/· π h ί厂〇以感興趣之多核苷酸轉形，之後 將細胞轉殖進入病患。此兩方法分別為已知，為W叩 基因治療之方法之大體回顧，參見Goldspiel以a/.， Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505； Wu and Wu,

Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev

Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11 (5) : 155-215)。也可用於本發明之於重組DMA技術中一 50 201102081

般熟知的方法如於eds. Ausubel et aJ. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wi 1 ey & Sons, NY, 1993; and Krieger, Gene Transfer and Expression, A

Laboratory Manual，Stockton Press, NY, 1990 中所述。 投藥之方法可為口服、皮膚内、皮下、靜脈内注射或 此類’以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域提 供使用。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。於適合載 體中或於以編碼出本發明之胜肽的多核普酸轉形之細胞中 的多核苷酸的劑量可適合地調整，根據要治療之疾病、病 患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量 一般為 0· 001 mg 至 1 000 mg，例如 〇. 001 mg 至 1〇〇〇 mg， 例如0. 1 mg至1 〇 mg，且可於每數天一次至每數個月一 次投藥。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。 X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性 T淋巴球的方法 可使用本發明之胜肽與多核苷酸來製備或誘導抗原呈 現細胞與細胞毒殺性T淋巴球。也可使用本發明之外吐小 體與抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球。胜狀、多 核苷酸、外吐小體與抗原呈現細胞可與任何其他化合物2 合使用，只要化合物不抑制其細胞毒殺性τ 杯巴球誘發能 力。因此，任何上述之本發明藥學物質或組合物可用來誘 導細胞毒殺性Τ淋巴球，且除此之外，包括胜狀與多核苦 酸的那些也可用來誘導抗原呈現細胞’如下所解釋 I S1 51 201102081 (1)誘導抗原呈現細胞的方法 本發明提供使用本發明之胜肽或多核苷酸來誘導具有 咼細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法。 本發明之方法包括//7 FyF〇或^ 將 抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸的步驟。例如，θ 或iT? F/將抗原呈現細胞與胜肽接觸的方法可包括步 驟： a :自一個體收集抗原呈現細胞；以及 b :將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸。 抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突 細胞、蘭格罕細胞（Langerhans cel 1)、巨嗜細胞、b細胞 與活化之τ細胞，已知其表現蛋白質（pr〇teinace〇us)抗原 於其細胞表面以被淋巴球所辨認。較佳為可使用樹突細 胞，由於它們於抗原呈現細胞中具有最強的細胞毒殺性τ 淋巴球誘發能力。可使用本發明任何胜肽以它們本身或與 本發明其他胜肽一起。 另一方面，當投予本發明一胜肽至一個體時，抗原呈 現細胞7 77 F7 與胜肽接觸，因此可於個體之體内誘導具 有高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因 此’本發明包括投予本發明胜肽至一個體。相似地當本 發明之多核苷酸投予至一個體於一可表達之形式中時，本 發明一胜肽被表現且如與抗原呈現細胞接觸，以因 此於個體之體内誘導具有高細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力 之抗原呈現細胞。因此’本發明也包括投予本發明多核苷 52 201102081 酸至—個體。“可表達之形式’，被定義於上述段落“ ιχ_ 藥千°式劑或組合物、（2)藥學試劑或組合物包含多核苷酸 為活性成分，，中。 本發明包括將本發明一多核苷酸引入一抗原呈現細胞 以誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細 胞。例如方法可包括步驟： a :自—個體收集抗原呈現細胞；以及 b ·將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入。 可如前述段落“ v丨.抗原呈現細胞”中所述來執行步 驟b。 或者本發明提供一製備一專一誘導抗TTK之細胞毒殺 性T淋巴球活性的抗原呈現細胞的方法，其中該方法可包 括下列步驟之一： (a )將抗原呈現細胞與本發明一胜肽仏α f/印或/77 r/FO接觸；以及 (b )將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入抗原呈現 細胞。 (2)誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法 本發明也提供使用本發明胜肽、多核苷酸、外吐小體 或抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法。 本發明也提供使用編碼出一多胜肽之多核苷酸來誘導 細胞毒殺性T淋巴球的方法，此多胜肽具形成〆T細胞受 體次單位的能力’而此T細胞受體次翠位辨認/本發明胜 〜 f $ 53 201102081 肽與HLA抗原之複合物。較佳為，誘導細胞毒殺性τ淋巴 球的方法可包括至少一步驟擇自由下列所組成之群組： a) 將一 CD8+ Τ細胞與一抗原呈現細胞及/或一外吐小 體接觸，該抗原呈現細胞及/或該外吐小體表現一 Hu抗原 與本發明胜肽之複合物於其表面，以及 b) 將一多核苷酸引入一 CD8+ τ細胞，其中該多核苷 酸編碼出一多胜肽，該多胜肽具形成一 T細胞受體次單位 的能力，而該τ細胞受體次單位辨認一本發明胜肽與HU 抗原之複合物。 §本發明之胜狀、多核苦酸、抗原呈現細胞或外吐小 體被投予至一個體時，於個體體内誘導細胞毒殺性τ淋巴 球’且以癌細胞為目標之免疫反應的強度增強。因此，本 發月方法包括將本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞 或外吐小體投予至一個體的步驟。 或者’藉由ez r/ fo或//? 使用它們，也可誘導 細胞毒殺性τ淋巴球，且在誘導細胞毒殺性Τ淋巴球後， 經活化之細胞毒殺性Τ淋巴球可返回至個體。例如，方法 可包括步驟： a :自—個體收集抗原呈現細胞； b ·將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸；以及 c ·將步驟b之抗原呈現細胞與CD8 +細胞共培養。 於上述步驟c中要與CD8+細胞共培養之抗原呈現細胞 也可藉由將一包括本發明多核苷酸之基因轉移進入抗原呈 現細胞’如於前述段落“ VI ·抗原呈現細胞”中所述來製 54 201102081 * 備’然而’本發明並不限於此’且包括任何有效表現一 HlA 抗原與本發明胜肽之複合物於其表面的抗原呈現細胞。 代替此種抗原呈現細胞’也可使用呈現一 HLA抗原與 本發明胜肽之複合物於其表面的外吐小體。換句話說，本 發明也包括’與呈現一 HLA抗原與本發明胜肽之複合物於 其表面的外吐小體共培養之步驟。此種外吐小體可藉由前 述於段落“ V.外吐小體，，中之方法來製備。 此外’藉由將一包括編碼出與本發明一胜肽結合之τ 細胞文體次單元的多核苷酸的基因引入CD8 +細胞也可誘導 細胞毒殺性T淋巴球。如於前述段落“ v〗丨〗.τ細胞受體 (TCR)”中所述可執行此轉導。 此外’本發明也提供製造一誘導細胞毒殺性Τ淋巴球 之藥學物質或組合物的方法或製程，其中該方法包括將本 發明之胜肽與藥學上接受之載體一起混合或配製的步驟。 (3 )誘導免疫反應的方法 又’本發明提供誘導抗ΤΤΚ相關疾病之免疫反應的方 法適σ的疾病包括癌症，其例子包括，但不限於肺癌、 膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血 病、大腸癌、子宮内膜異位症、食道癌、胃#、擴散型胃 癌肝癌非小細胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、印巢癌、騰 臟癌、别列腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤與睪丸 癌。 本發明方法可包括投予含任何本發明胜肽或編碼出 55 201102081 之多核苷酸的試劑或组合物的步驟。本發明方法也考慮投 予表現任何本發明胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞。細節 參見“π.藥學試劑或組合物，，之項目，特別是敘述本發 明試劑或組合物為疫苗之用途的部分。此外，可被使用於 本發明誘導免疫反應之方法的本發明外吐小體與抗原呈現 細胞，被詳細描述在前之於“v.外吐小體”、抗 原呈現細胞，，肖“X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞 與細胞毒殺性T淋巴球的方法，，之⑴與⑵的項目。 本發明也提供製造-誘導免疫反應之藥學試劑或組合 物的方法或製程’I中該方法包括將本發明之胜肽與藥學 上接受之載體一起混合或配製的步驟。 或者，本發明方法可0括和·； j匕栝技予一疫苗或藥學組合物的 步驟’疫苗或藥學組合物包含： (a)本發明胜肽； ⑻於-可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c)表現本發明一胜肽於其 、上之抗原呈現細胞或 外吐小體；或 (d )本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 在本發明中，以這些活性忐於 成伤可治療過度表現TTK之 癌症。此類癌症的例子包括，但不 _ 丨『於肺癌' 膀胱癌、乳 癌、子宮頸癌 '膽管細胞癌、慢 1又注月如性白血病、大腸癌、 子宮内膜異位症、食道癌、胃癌、 , 把'散i月癌、肝癌、非 小細胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、 外果癌、胰臟癌、前列腺 56 201102081 癌腎癌+細胞肺癌、軟组織腫瘤與睪丸癌。因此，在 包括活性成分之疫苗$藥學f式劑或組合物的投丨前，其較 佳為確認與相同^•一 τλ 』器S之正常組織相較，ΤΤΚ之表現程产於 要被治療之細胞κ織中是否被提高。m —實二例 中’本發明提供治療於需要之病患中的（過度）表現ττκ 的方法，此種方法可包括步驟： 〇測定獲得自具有癌症要治療之個體的細胞或組織 中的ΤΤΚ表現程度； 11)與正常控制組比較ττκ表現程度；以及 in)投予擇自由上述（3)至（(1)所組成之群組的至少 一成份至與正常控制組相較具有過度表現m之癌症的個 體。 或者，本發明也可提供包含擇自由上述（a)至（d)所組 成之群纽的至少一成份的疫苗或藥學試劑或組合物要被 於投予至具有過度表現™之癌症的個體。換句話說，本 發明更提供鑑定要被以本發明m多胜肽治療之個體的方 法，此類方法包括測定來自個體之癌細胞或組織中的 表現程度的步驟，其中與基因之正常控制組相較，此程度 增加指出個體可具有可以本發明ττκ多胜肽治療之癌症。 本發明之治療癌的方法於以下更詳細敘述。 可將任何源自個體之細胞或組織用於表現之測 疋’只要其包括ΤΤΚ之目標轉錄或轉譯.產物。適合樣本的 例子包括，但不限於身體組織或液體、例如血液、唾液與 尿液較佳為，生物樣本包含一細胞族群，其包括一上 57 201102081 細胞’更佳為源自個體之細胞或組織包含一細胞族群，其 包括一上皮細胞’更佳為一癌症上皮細胞或一來自被懷疑 癌化之組織的上皮細胞。此外，若需要，細胞可自所獲得 之身體組織或液體被純化，且之後使用為源自個體之樣本。 本發明之内容中，測定自已知為非癌症之生物樣本的 控制組程度被意指為一 “正常控制組程度”。另一方面， 控制組程度測定自一癌的生物組織，其意指為一“癌的控 制組程度”。可將介於樣本表現程度與控制組程度間的不 同標準化至控制核酸的表現程度，例如管家基因 (housekeeping gene) ’根據細胞之癌症與非癌程度已知其 表現程度並無不同。示範之控制基因包括，但不限於万肌 動蛋白（beta aCtin)、甘油醛—3_磷酸去氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydr〇genase)與核糖蛋 白P1。 要藉由本發明治療之個體較佳為一哺乳類動物。示範 之哺乳類動物包括，但不限於，例如，人類、非人類靈2 類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬與牛。 根據本發明，測定獲得自一個體之癌症細胞或組織中 的TTK表現程度。使用本技術領域已知方法可於轉錄（核

酸）產物程度測定表現程度。例如，藉由雜 X V /2Γ k例如， 北方雜合）使用探針可將ττκ的mRNA定量。 ^ j於一晶片、 一陣列如此類或執行偵測。陣列之使用 干又证马用於偵測 若Μ TTK表現程度。利帛ττκ的序列資訊，熟悉此技藝人士。 製備此種探針。例如，ττκ的CDNA可被使用 可 58 201102081 要，可以適合之標就來桿社 針’例如染劑、螢光物質與 同位素，且基因的表現链痒-Pl t 長度可被谓測為雜合標誌的強度。 此外’藉由擴大偵測 J ^ ^amP11f1 cat 1 on-base detectin method)(例如，RT_p iu PCR )使用引子可將TTK (序 列辨識號：39)的轉錄產物淮—曰 座物進订疋$。根據基因之可獲得 序列資訊可製備此種引子。 .特別疋用於本方法之探針或引子於嚴厲 ingent)適度嚴厲、低嚴厲條件下雜合至ττκ的 讀。如此處使用，措辭“嚴厲（雜合）條件，，意指在此 在條件下探針或引子會雜合至其目標序列，而不是其他序 列。嚴厲條件為序列依賴（seQuence_dependen〇，且在不 同％境下會不同。比起較短之序列，於較高溫度下觀察到 較長序列之特定雜合。一般而言，在一定義之離子強度與 PH下所選擇之嚴格條件的溫度為低於一特定序列之熔點 (Tm)約5C。以為溫度（在一定義之離子強度與pH與核酸 濃度下），於其下在平衡下5〇%之互補至目標序列的探針 雜合至目標序列。由於目標序列通常存在過量，所以於Tm, 在平衡下5 0 %之探針被佔據。一般而言，嚴苛條件為於其 中鹽濃度低於1·〇 Μ鈉離子，一般約〇.〇1至1.〇 Μ鈉離 子（或其他鹽）於pH 7· 0至8_ 3，且對於短探針或引子（例 如’ 10至50個核苷酸）而言溫度為至少約30〇C，對於較 長探針或引子而言溫度為至少約6(TC。也可以添加去穩定 物質（destabilizing substances)，例如曱酿胺 (formamide)來達到嚴苛條件。 59 201102081 或者，為了本發明之診斷可偵測轉譯產物。例如，可 偵測TTK蛋白質（序列辨識號：4〇)或其免疫片段之量。 測定作為轉錄產物之蛋白質的量的方法包括免疫分析方 法，其使用一抗體專一辨認此蛋白質。抗體可為單株或多 株。此外，抗體之任何片段或修飾（例如嵌合型抗體 (chlmeric antibody) 、 scFv 、 Fab 、 F(ab’ ）2 、 FV 等）可 被用來偵測，只要片段或經修飾之抗體維持對TTK蛋白質 的結合能力。本發明也提供此類抗本發明胜肽與其片段之 抗體這些用於蛋白質偵測之這些種類的抗體的製備方法 為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發明中以 製備此種抗體與其等同物（equivalent)。 如根據TTK基因轉譯產物偵測ττκ基因之表現程度的 另一方法，使用抗ΤΤΚ蛋白質之抗體經由免疫組織化學 (immunohistochemical)分析可測量到染色強度。即，於此 測1中，強的染色指出蛋白質/程度之增加的存在且同時 TTK基因之高表現程度。 可確認於癌症細胞中包括TTK基因之目標基因的表現 程度為被提升，若其相較於目標基因之控制組程度（例如， 於正常細胞中的程度）增加，例如10%、25%、或5〇%， 或增加大於1.1倍、大於丨.5倍、大於2〇倍、大於5 〇 倍、大於10.0倍或更多。 藉由使用先前自一個體/其疾病階段（癌的或非癌的） 為已知的個體收集並儲存的樣本控制組織程度可與癌細胞 同時測定。此外，獲得自具有癌症要被治療之一器官的非 60 201102081 癌&域的正常細胞被使用為正 ,_ 吊控制組。或者，根據獲得 自刀析先别測定之來自其疾病 TT. A ^ , 丙度已知之個體之樣本中之 TTK基因的表現程度的結果， L ^ 稽田統计方法，可測定控制 此外’控制組程度可為來自自先前測試細胞之 =輪料庫。並且’根據本發明-方面於-生物樣 ^中之m基因的表現程度，可與多個控制組程度比較， ^制組程度被測定自多個參考樣本。較佳為使用一控制 組程度測定自一參考樣本，复來一 _ 八灰自.、且織形式相似於源自 個體生物樣本之組織形式。此 G y卜較佳為使用具有已知疾 病階段之群組中的ττκ基 u的表現程度的標準值 (如dam value)。標準值可獲得自本技術領域任何已知 的方法。例如，平均值+ /_2辦；隹Μ々τ τ』值十/ 2標準差或平均值+/_3標準差， 可被使用為標準值。 . 當與正常控制組程度相較ττκ基因的表現程度被增加 或相似/等同於癌控制組程度’可診斷個體為具有癌症要被 治療。 本發明也提供（i ) 療之癌症，及/或（i i ) 方法包括步驟： 診斷是否-個體被懷疑$有要被治 選擇要癌症治療之個體的方法，其 a) 測定在癌症細胞或組,織巾，m的表現程度癌症 細胞或組織獲得自被懷疑具有要被治療之癌症的個體； b) 與正常控制組比較TTK之表現程度； 〇若TTK之表現程度與正常控制組程度相較被增 加，則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及 [[§]] 61 201102081 幻若個體於步驟c)中被診斷為具有要被治療之癌 ’症’則選擇要癌症治療之個體。 或者，此種方法包括步驟·· a) 洌定在癌症細胞或組織中，ττκ的表現程度，癌症 細胞或纽織獲得自被懷疑具有要被治療之癌症的個體； b) 與癌症控制組比較ττκ之表現程度； ^ C)右ΤΤΚ之表現程度相似或等於癌症控制組程度，則 少斷個體為具有要被治療之癌症；以及 d)，若個體於步驟c)中被診斷為具有要被治療之癌 ;正，則選擇要癌症治療之個體。 本發明也供一診斷奈έ日ΙΛί今献· +、a 套組以钐斷或測定一個體其為或 皮ill疑遭受可被以本$肖 七明ττκ多胜狀治療之癌症，其也在 砰估癌症之預後（prognos 適用性中為有用的，較佳以乂癌症治療的功效與 明例子包括車乂佳為癌症免疫治療。適合癌症之說 膽― ~限於肺癌、膀胱癌'乳癌、子宮頸痔' 4細胞癌、慢性骨髓 …' 症、含遺病、％ 炳大腸癌、子宮内膜異位 淋、、月；、擴散型胃癌、肝癌、非小细胞肺、席 淋巴瘤、骨_ 1 ^ ^，讀肺癌、 細皰肺癌^ 癌、前列腺癌、腎癌、小 〜軟、及織腫瘤與筆丸 包括至少一用以梢， 旯将別的疋’套組較佳 偵測來自個體癌細胞令之TTK其田 程度的試劑，此類試劑可擇自：。中之ττκ基因的表現 (a) 一 5劑用以偵測ΤΤΚ基因的mRNA; (b) —試劑用，、， 片段；以及 偵測TTK基因的蛋白質或其免疫活性 62 201102081

一試劑用以偵測TTK基因之蛋白質的生物活性。 適合用以偵測ΤΤΚ基因之鈍懸之試劑的例子可包括核 、、° σ或辨認TTK ，例如，具有對於TTK mRNA '互補的序列的暴核苷酸。這些種類之寡核苷酸以 專於TTK inRNA之引子與探針為例子。根據本技術領域所 熟知的方法可製備這些種類之寡核苷酸。若需要，用以伯 測TTK mRNA之試劑可被固定於固體基質（matrix)上。此 ；個之用以偵測TTK mRNA的試劑可被包含於套組 中。 &另—方面，適合用以偵測ττκ蛋白f或其免疫活性片 段之試劑的例子可包括對於TTK蛋白質或其免疫活性片段 的抗體。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片段或 Ο 飾（例如嵌合型抗體（chimeric antibody)、scFv、Fab、 (ab )2、Fv等）可被用來作為試劑，只要片段或經修飾 之抗體維持對TTK蛋白質或其免疫活性片段的結合能力。 k二用於蛋白質偵測之這些種類的抗體的製備方法為本技 術項域所热知，且任何方法可被使用於本發明中以製備此 種抗體與其等同物（equivalent)。另外，可以訊號產生分 子經由直接連接或一間接標誌技術來將抗體進行標誌。標 忒與標誌抗體之方法與偵測抗體對其目標的結合為本技術 領域所熟知，且任何標誌與方法可被使用於本發明。另外， ；個之用於偵測TTK蛋白質的試劑可被包括於套組 中。 ’ 套組可包含多於一個之前述試劑。套組可更包括用以 63 201102081 結合對於TTK基因之摆斜斗、ι 質與試劑、用以⑽胜狀之抗體的固體基 試劑與用以偵測二之培養基與容器、正與負控制組 古, K胜狀之抗體的二次抗體。例如， 獲付自》又有癌症或；翁总 次纪又癌症之個體的組織樣本 的控制組試劑。太狢ΗΒ 士 个』忭马有用 本發明之套組可更包括商業或使用去岛存 所需之其他材料，包衽々一 者角度 注射器與具有使用之椹&4t + 恩态庄射針、 使用之知作指南的包裳插 磁帶或 CD-ROM #u W ® 之容号、商人 這些试劑或此類可保持於-具有標認 之合益。適合之容器包括瓶 管。宏j玻璃瓶（vial)與試驗試 …形成自多樣化之材料，例如破璃或塑膠。 在本發明—實施例中， 時，續制-T -木 w X ^马抗TTK ιηΚΝΑ之探針 、°式月丨可被固定於一固體基f· i^ 々

*1Ρ)以形成至少一偵測 P xj_ ^ ’ U 1求t /別里或偵測區可包 括複數個位置，各含有一 T〇 有倉 ^ ^ (探針）。一測試條也可含 測試條分離之一你 4次者’控制組之位置可位於與 同旦夕_ 條。視需要而定’不同之偵測位可包含不 Q里之經固定之核酸， 尔人θ 孕Χ阿里於弟一偵測位中且一較 低3 1於隨後之位置中。藉 測訊號之一此位… 本的加入’顯示可债 ...二位置k供一於樣本中m_A存在之量的定 ::二備測位可被設置於任何適合之可偵測形狀且-般 為在松跨-测試條之寬度的條狀物或點的形狀中。 本。藉2月之套組可更包括一正控制組樣本或m標準樣 曰收集m正之樣本可製備本發明之正控制組樣本 “析它們的m程度。或者，可將經純化之瓜蛋 64 201102081 之細胞以形成正樣本 。於本發明中，經純化 白質或多核苷酸加至不表現ττκ (positive sample)或 ΤΤΚ 標準樣本 之TTK可為重电各&折 x _ ’蛋白貝。正控制組樣本之ττκ程度為，例 如，大於臨界值（cut off value)。 在一實施例中，本發明更提供一診斷套組，包括一蛋 白質或其一部份蛋白暂 刀蛋白質專一辨認本發明抗體或其片段之 能力。 此處所考慮之本發明之蛋白質之部分胜狀與免疫活性 片段的例子包括多胜肽’其係由在本發明蛋白質之胺基酸 序列中之至少8個’較佳15個、更佳2()個連續胺基酸所 組成。使用本發明之一蛋白質或一胜肽（多胜肽），藉由 偵測於樣本（例如，血液、組織）中之一抗體可診斷癌 症。製備本發明胜R或蛋白質的方法如上所述。 上所述，藉由測定介於抗ττκ抗體與其在對應控帝 、、且中之的里的差異可執行本發明診斷癌症之方法。若個德 之細胞或組織含有抗基因之表現產物（ττκ)抗體且抗Η; 抗體的量被測定大於在相較於其在正常控制組之程度中的 截斷值時，被體被懷疑遭受癌症。 在另Λ施例中，本發明之診斷套組可包括本發明之 胜肽與結合至其之HLA分子。使用抗原胜肽與HLA分子積 測抗原專-細胞毒殺性τ淋巴球的適合方法已被建立（例 如，ΑΠ幽 JD et al.，1 996, 274(5284): 94-6)。因此，本發明之胜肽與動分子的複合物可應用 至偵測腫瘤抗原專一細胞毒殺性τ淋巴球的偵測方法，藉 65 201102081 此使早期偵測癌症之復發 s汉/及轉移為可能。此外，苴可祐 用來個體之篩選，個體適合 '、 t —仏 本發明胜肽為一活性成分 的樂物，或藥物治療功效的評估。 特別是，根據已知方法（來 万法（參見，例如Altman JDet al

Science. 1996， 274(5284). Q4 fi、 ’ 94-6)，可製備放射標誌之 HLA分子與本發明胜肽之宸哿 肌t券求複合物，例如四聚體。可使 用複合物來對來自被懷疑遭受癌症之個體的周邊血液淋巴 球（penpheral bl00d lymph〇cytes)中之抗原胜肽專一細 胞毒殺性T淋巴球進行定量。 本發明更提供藉由使用此處敘述之胜狀抗原決定位， 用以評估免疫反應之診斷試劑。在本發明一實施例中，如 上述之HLA限制胜肽被使用來評估或預測一個體之免疫反 應。藉由將免疫抗原（immun〇gen)與免疫活性細胞 (immunocompetent)/"以’叩或//7 接觸可誘導要被 砰估之免疫反應。在特定實施例中，使用為試劑之物質或 組合物可為組合物其可導致抗原專—細胞毒殺性τ淋巴球 的產生’細胞毒殺性Τ淋巴球辨認與結合至胜狀抗原決定 位。胜肽試劑必須不被使用為免疫抗原。用於此類分析之 刀析糸統包括相當新近之技術發展，例如四聚體，對細胞 内淋巴激素（lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或 EL I SPOT分析。在較佳實施例中’要與胜肽試劑接觸之免 疫活性細胞可為包括樹突細胞之抗原呈現細胞。 例如’本發明胜肽可使用於四聚體染色分析以評估為 了抗原專一細胞毒殺性T淋巴球存在之周邊血液單核細 66 201102081 胞’在暴露至腫瘤抗原或一免疫抗原後。HLA四聚體複合 物可被使用來直接顯現抗原專一細胞毒殺性τ淋巴球（失 見，例如 〇gg et al‘，Science 279 : 2103-21 06, 1 998 . and Altman et al’ Science 174 : 94-96，1 996 )，並蜊 定於周邊血液單核細胞之樣本中的抗原專一細胞毒殺性1 淋巴球族群的頻率。使用本發明胜肽之四聚體試劑可如下 被產生。 在對應之HLA重鏈與/5 2-微球蛋白存在下重新折疊結 合至HLA之胜肽，以產生三分子複合物。在複合物中，重 鏈之縮端為經生物素化於一預先設計進入蛋白質之位置。 將卵白素加至複合物以形成由三分子複合物與卵白素 (streptavidin)所組成之四聚體。藉由以螢光標誌卵白 素，可使用四聚體來對抗原呈現細胞染色。之後可鑑定細 胞，例如藉由流式細胞技術。此類分析可被用於診斷與預 後（prognostic)目的。藉由此程序之細胞鑑定也可備用於 治療目的。 本發明也提供評估免疫收回反應（immune recaU responses)之試劑（參見，例如 Bert〇ni etaL，ciin.

Invest. 100 ： 503-513, 1997 and Penna et aL, J Exp. Med· 1 74 : 1 565-1 570, 1 991 )，其包括本發明之胜肽。 例如，為了抗原-專一細胞毒殺性τ淋巴球，使用特定專一 胜肽，可分析來自具有要被治療之癌症之個體的病患pBMc 樣本藉由培養PBMC與以本發明胜肽刺激細胞可評估含單 核細胞之血液樣本。在適合之培養期間後，例如為了細胞 67 201102081 毒殺性τ淋巴球活性’分析經擴張之細胞族群。 胜肽也可使用為評估一疫苗功效之試劑。使用例如上 述方法可分析獲自一以一免疫抗原接種之病患的PBMC。病 患為經HLA分型，且選擇辨認表現於病患中之對偶基因 (a 11 e 1 espec 1 f ic)分子的胜肽抗原試劑以分析。藉由於 PBMC樣本中之抗原決定位_專一細胞毒殺性τ淋巴球的存 在’可才曰出疫之免疫抗原性（immun〇genici )。本發明 之胜肽也可用來製造抗體，使用本技術領域已熟知的技術 (參見，例如，CURRENTPR0T0C0LSINIMMUN0L0GY， Wiley/Greene, NY ； and Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 9 8 9 )，其可有效作為診斷或監測癌症之試劑。此類抗體 可包括辨涊於HLA分子内容中之胜肽的那些，即，結合至 胜肽-MHC複合物的抗體。 本發明胜肽或組合物具有一些額外之用途，其之一些 為此處所述。例如’本發明提供診斷或偵測以ττκ免疫活 性胜肽之表現為特徵的一疾病。此類方法包含測定於一生 物樣本中之TTK HLA結合胜肽的表現或TTK HLA結合胜肽 之一複合物與HLA class I分子。藉由以對於胜肽或複合 物之結合伙伴（binding partner)分析可測定或偵測一胜 肽之表現或胜肽與HLA class I分子之複合物。在一較佳 實施例中，對於胜肽或複合物之結合伙伴為一抗體其辨認 且專一結合至胜肽。藉由使用TTK引子之標準PCR放大步 驟也可測試於一生物樣本，例如一腫瘤切片中之ττκ的表 68 201102081 現。腫瘤表現之例子於此被呈現且示範之用於ττκ放大的 條件與引子的更進一步揭露可被發現於w〇2〇〇3/27322中。 較佳診斷方法包含將分離自一個體的生物樣本與專一 於TTK HLA結合胜肽之一試劑接觸以偵測於生物樣本中之 TTK HLA結合胜肽的存在。如此處所使用“接觸，，意指以 有效接近試劑方式放置生物樣本且在適合之例如，濃度、 溫度、時間、離子強度條件下，以允許介於試劑與存在生 物樣本中之TTK HLA結合胜肽的專一互相作用。一般而言， 將試劑接觸生物樣本之條件為熟悉此技藝人士所知之條件 父促進"於分子及於生物樣本中之其同類物（c〇g此te)(例 如，一蛋白質與其受體同類物、一抗體與其蛋白質抗原同 類物、一核酸與其互補序列同類物）之間的專一互相作用。 促進介於分子與其同類物之間的專一互相作用的示範條件 敘述於 Low et al 所提出之 u. s. Patent N〇. 5, 1〇8, 921。 可在/77以>〇或之一或兩者執行本發明之診 斷方法。因此，在本發明中生物樣本可位於//? 叩或如 中。例如，生物樣本可為一 組織且專—於 τκ免疫活性多胜肽的試劑可被用來偵測於組織中此類分 子的存在。或者，可//7 收集或分離生物樣本（例如 血液樣本、腫瘤切片、組織萃取物）。在一特別較佳實施 例中，生物樣本可為一含細胞樣本，更佳為—樣本含有收 集自要被診斷或測試之個體的腫瘤細胞。 或者，藉由一方法可執行診斷，此方法藉由以螢光素 (uorescein)標魂HLA多聚複合物染色允許抗原專—τ [S3 69 201102081

細胞的直接定量（例如，Altman, J, D. et al.， 1 996, Science 274 : 94; Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330 )。也已提供細胞内淋 巴激素（lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT 分析。多聚體染色、細胞内淋巴激素染色與ELI SPOT分析 皆顯露比一般分析靈敏至少多1〇倍。（Murali-Krishna, K. et al. , 1998, Immunity 8: 177; La 1 van i, A. et al. , 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al. , 1 998, Curr. Biol. 8: 413)。也可使用五聚體（例如，US 2004-209295A ) '右聚體（dextramer)(例如，WO 02/072 631 )、鏈聚體（streptamer)(例如，Nature medicine 6. 631-637 (2002))。 XI.抗體 本發明提供抗體其結合至本發明胜肽。較佳抗體專一 結合至本發明胜肽且不會結合（或微弱結合）至非本發明 胜肽。或者抗體結合本發明胜肽與其同源物（h〇m〇1〇gs)。 抗本發明胜肽之抗體可提供用途於癌症診斷與預後分析及 成像方法（imaging methodologies)。相似地，對於在癌症 病患中也表現或過度表現ττκ程度而言，此類抗體可提供 使用於其他癌症之治療、診斷，及/或預後。此外，細胞内 表現之抗體（例如，單鏈抗體）可提供治療用途於治療關 於ΤΤΚ之癌症中，其例子包括，但不限於，肺癌、膀胱癌、 礼癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病 '大腸 70 201102081 癌、子宮内膜異位症、食道癌、胃癌、擴散型胃癌、肝癌、 非小細胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列 腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤與睪丸癌。 本發明也提供TTK蛋白質（序列辨識號：40)或其片 段之偵測或定量的各種免疫活性分析，ττκ蛋白質（序列 辨識號·· 40)或其片段具有由擇自由序列辨識號：1、2、3、 6、15與2 2所組成之群組之胺基酸序列。此類分析可包括 一或多個具辨認及結合ΤΤΚ蛋白質或其片段之能力之抗 ΤΤΚ抗體為適當的。在本發明内容中，與ττκ多胜肽結合 之抗ΤΤΚ抗體，較佳為辨認多胜肽，多胜肽由擇自由序列 辨識號：1、2、3、6、15與22所組成之群組的胺基酸序 列所組成。以抑制測試（inhibiti〇n 44)可確認抗體之結 合專一性。其為，在由序列辨識號：1、2、3、6、μ與22 之胺基酸序列所組成之任何片段多胜肽存在下，當介於要 被分析之抗體與全長之TTK胜肽之間的結合被抑制時，其 顯示此抗體專一結合至片段。在本發明内容中，在包括， 但不限於放射免疫分析（radi〇i_Un〇aSSays)、免疫色屏分 析技術（immuno-chromatgraph technique)、酵素連結免疫 吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assays ELISA)、酵素連結免疫螢光分析（enzyme_ immunofluorescent assays，ELIFA)等之多種本技術領域 熟知之免疫分析形式中執行此類免疫分析。 本發明之關於免疫’但非抗體分析也可包括τ細於致 免疫性分析（immunogenicity assay)(抑制或刺激）與 71 201102081 要組織相谷性複合物（major his tocompatibi 1 ity complex) 、结合分析。此外’本發明考慮具偵測表現TTK之癌症之能 力的免疫成像分析’其例子包括，但不限於使用本發明之 '經標鍵、的抗體的放射顯像成像（radio scintigraphic lmaging)方法。此類分析在TTK表現之癌症偵測、監控與 預後的為臨床有效的，ΤΤΚ表現之癌症，其例子包括，但 不限於，肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、 k性骨髓性白血病、大腸癌、子宮内膜異位症、食道癌、 胃癌、擴散型胃癌、肝癌、非小細胞肺癌、淋巴瘤、骨肉 瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟 組織腫瘤與睪丸癌。 本發明也提供結合至本發明胜肽。本發明胜肽可使用 於任何形式中’例如單株或多株抗體，且可更包括獲得自 將動物’例如兔子’以本發明胜肽進行免疫之抗血清、所 有類型之多株或單株抗體、人類抗體與由基因重組產生之 人源化抗體。 使用為一抗原以獲得一抗體之本發明胜肽可來自任何 動物種類，但較佳為來自哺乳動物，例如，人類、老鼠或 大鼠，更佳為一人類。人類來源胜肽可獲得自此處揭露之 核苷酸或胺基酸序列。 根據本發明，使用為免疫抗原之胜肽可為一完整之蛋 白貝或部分胜肽之蛋白質。部分胜肽可包括，例如，本發 明之一胜肽之胺基（N)端或羧基（C)端片段。 此處，一抗體被定義為—蛋白質其與ττκ胜肽之全長 72 201102081 * 或片段反應。在一較佳實施例中，本發明之抗體辨認ττκ 片段胜狀’其擇自由序列辨識號：1、2、3、6、15與22 所組成之群組的胺基酸序列所組成。合成寡胜肽的方法為 本技術領域所熟知。在合成後，.在使用為免疫抗原 (immunogen)前，胜肽可視需要被純化。在本發明内容中， 寡胜肽（例如9或10員）可與載體結合或連結以增強致免 疫性。鑰孔血藍蛋白（Keyh〇le_Hmpet hemc>cyanin， 被熟知為載體。結合鑰孔血藍蛋白與胜肽的方法為本技術 領域所熟知。 或者，可將編碼出本發明一胜肽或其片段的一基因插 入一已知的表現載體，其之後被轉形至一宿主細胞，如於 此所敘述。藉由任何標準方法，所需之胜肽或其片段可自 宿主細胞之外部或内部被重新獲得，且之後可被使用為一 抗原。或者’可將表現胜肽之整個細胞或其細胞萃出物或 一化學合成胜肽使用為抗原。 可以抗原將任何哺乳動物進行免疫，但較佳為考慮與 用來細胞融合之親代細胞的相容性。一般而言，使用餐齒 目（Rodentia)、兔形目（Lag〇m〇rpha)或靈長目 (Primates)。,齒目的動物包括，例如小鼠、大鼠與倉鼠。 兔形目的動物包括，例如兔子。靈長目的動物包括，例如 狹鼻類（舊世界猴）猴子，例如馬來猴（Macaea fascicularis)、獼猴（rhesus monkey)、聖狒狒（Sacre(j baboon)與黑猩猩（Chimpanzees)。 以抗原免疫動物之方法為本技術領域所熟知。抗原之 ' ί鮮 73 201102081 腹腔内注射（intraperitoneal injection)或皮下注射 (subcutaneous in jection)為免疫哺乳動物之一標準方 法。更特別地’可將抗原稀釋或懸浮於一適合量的填酸鹽 緩衝溶液、生理食鹽水等。若需要，可將抗原懸浮液與適 合量之標準佐劑，例如佛氏完全佐劑（Freund，s c〇mplete ad juvant)混合，製成乳狀液（emu 1 s丨〇n)並且之後投予至哺 乳動物。較佳為其之後投予與適合量之佛氏不完全佐劑 (Freund s incomplete adjuvant)混合的抗原每 4 至 21 天也可使用一適合之載體來免疫。於上述免疫後，藉由 為了增加所需之抗體量標準方法可檢驗血清。 藉由自被檢驗以增加於血清中之抗體量的經免疫動物 收集血液解藉由以任何一般方法自血液分離血清，可製備 抗本發明胜肽之多株抗體。多株抗體包括含多株抗體的血 清，與可自血清分離含多株抗體的部分（fracti〇n) ^例如 使用與本發明胜肽結合之親合管柱且更進一步使用蛋白質 A或蛋白質G管柱純化此部分，可自僅辨認本發明胜肽之 部分純化免疫球蛋白G或μ。 為了製備單株抗體，自如上所述經以抗原免疫並確認 於血清中戶斤需抗體之增加程度的哺乳㈣收集t疫細胞且 使免疫細胞遭遇細胞融合。用來細胞融合之免疫細胞，較 佳為獲自脾臟。其他要被與上述免疫細胞融合之親代細胞 〇括例如，哺礼動物之骨髓瘤（myei〇ma)，且較佳為具有 以藥物篩選之融合細胞之獲得特性的骨髓瘤細胞。 根據已知方法 例如 Milstein et al. (Galfre and 201102081

Milstein，Methods Enzymol 73: 3-46 (1981 ))的方法， 可將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞融合。 獲自細胞融合之產生的融合瘤，藉由將它們培養於標 準篩選培養基，例如 hat培養基（含亞黃°票吟 (hypoxanthine)、氨蝶吟（amin0pterin)和胸腺嗜咬 (thymidine)之培養基），可被篩選。通常持續細胞培養於 HAT培養基數天至數週，時間為允許除了所需融合瘤外之 其他細胞（非融合細胞）死亡。之後，可執行標準限制稀 釋以篩選並複製產生所需抗體之融合瘤。 除了於其中為了製備融合瘤、以一抗原免疫一非人類 動物的上述方法，可以胜肽、表現胜肽之細胞或其細胞萃 取物F/ fro免疫人類淋巴細胞，例如被EB病毒感染的 那些。之後’將經免疫之淋巴細胞與具不明確分裂能力之 來自人類之骨髓瘤，例如U266融合，以產生一產生所需人 類抗體之融合瘤’所需之人類抗體可與可被獲得之胜肽結 合（Unexamined Published Japanese Patent Application No. (JP-A) Sho 63-17688)。 將所獲得之融合瘤之後轉植進入小鼠之腹腔且萃取腹 水可純化所獲彳于之單株抗體，藉由例如硫酸録沉澱、一 蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換色層分析或一與 本發明胜肽結合之親和管柱。本發明抗體不只可被使用來 純化偵測本發明胜肽，士 I& &丄# 也了作為本發明胜肽之促進劑與拮 抗劑的候選物。 或者，一產生抗體之免疫細胞，例如一經纟疫之淋巴

I S 201102081 細胞可藉由一致癌基因以永生或被使用來製備單株抗體。 也可使用基因工程技術來重組製備因此獲得之單株抗 體（參見’例如 Borrebaeck and Larrick，Therapeutic

Monoclonal Anti bodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD ( 1 990 ))。例如， 一編碼出抗體的DNA可自一免疫細胞，例如產生抗體之一 融合瘤或一經免疫的淋巴細胞被複製，直入一適合之載 體’且引入一宿主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如 上述製備之重組抗體。 此外，本發明抗體可為一抗體之片段或經修飾之抗 體’只要其結合一或多個本發明之胜肽。例如，抗體片段 可為Fab、F(ab’）2、Fv或單鏈Fv (scFv)，於其中來自重 與輕鏈的Fv片段藉由合適的連結器來連接（Hust〇n et al.，

Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 ( 1988))。更特別 是’藉由以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體可產生 抗體片段。或者’編碼出抗體之基因可被構築、插入一表 現載體且表現於一適合的宿主細胞中（參見’例如C〇 ea人， J Immunol 152: 2968-76 (1994)； Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)； Pluckthun and

Skerra， Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi，

Methods Enzymol 1 21 : 652-63 (1 986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991))。 藉由與各種分子’例如聚乙二醇（p〇lyethyiene 76 201102081 * 結合可修飾抗體。本發明提供此類經修飾之 抗體。藉由化學修飾-抗體可獲得經修飾之抗體。這些修 飾方法為本技術領域中所常見。 或者，本發明之抗體可被獲得為嵌合抗體，介於來自 非人抗體之可變區與來自人類抗體之固定區之間，或為人 源化抗體，包括來自非人抗體之互補決定區、架構作用區 (frame work regi〇n，FR)與來自人類抗體之固定區。根據 已知方法可製備此類抗體。藉由齧齒類互補決定區之序列 取代人類抗體對應之互補序列可執行人源化（參見，例如 Verhoeyen et al.，Science 239:1 534 1536 (1988”。 因此，此類人源化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整 之人類可變區已被以來自非人種類之對應序列取代。 也可使用包括人類可變區、架構作用區與固定區的全 人類抗體。使用各種本技術領域所知的技術可產生此類抗 體。例如，in vitro方法包括呈現於噬菌體上之人類抗體 片的重組 > 料庫的使用（例如，H〇〇genb〇〇m & winter, J.

Mol. Biol· 227:381 ( 1 991 ))。相似地，藉由將人類免疫 求蛋白基因座（l〇ci)引入轉殖動物，例如於其中内生免疫 球蛋白基因已被部分或完全去活化的小鼠，可製造人類抗 體。此方法被敘述，例如於u. s. Patent Nos. 6,15〇, 584, 5,545,807; 5, 545, 806 ； 5, 569, 825 ; 5, 625, 126； 5, 633, 425; 5, 661，016。 獲自上述之抗體可被純化至同質（h〇m〇genei ty)。例 如’根據用於一般蛋白質的分離與純化方法可執行抗體之 77 201102081 分離與純化。例如，藉由合適地選擇與結合管柱色層分析、 過濾、超過濾、鹽析、透析、對鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙 烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamide gel electrophoresis)、等電焦集法（is〇electric f〇cusing) 的使用可分開與分離抗體（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1.988))，但不限於此。蛋白質A管柱與蛋白 質G*r柱A可被使用為親合管柱。要被使用之示範的蛋白 質 A 官柱包括’例如 Hypei· d ' p〇R〇s 與 Sepharose F. F. (Pharmacia) ° 除了親合，示範之色層分析包括，例如離子交換色層 分析、疏水色層分析、膠體過濾、逆向色層分析、吸附色 層分析專（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboiratory press ( 1 996))。藉由液相色層分析，例如HpLC 與FPLC可執行色層分析步驟。 例如’可使用吸收之測量、酵素連結免疫吸附分析 (ELISA)、酵素免疫分析（EIA)、放射免疫分析及/或免疫螢 光以測量本發明抗體之抗原結合活性。在酵素連結免疫吸 附分析中’本發明抗體為固定於一培養盤上，提供本發明 胜狀至一培養盤’且之後提供含所需抗體之樣本，產生抗 體之細胞的培養懸浮液或經純化的抗體。之後’提供辨認 第一抗體且被標誌酵素，例如鹼性磷酸酶之第二抗體，且 78 201102081 之後培養培養盤。在清洗後’將酵辛香晳 i又質例如對硝基苯 填酸（p-nitrophenyl phosphate)，加 $ 士立墓抓 玍立口養盤，並測量吸 收以評估樣本之抗原結合活性。胜肽之片段， 又 彳如C端或 N端之片段可被使用為抗原以評估抗原結人 σ ’『生。根據本 發明’可使用 BIAcore (Pharmacia)來缉 士 ·ι丄 ε 木汁怙抗原結合活性。 上述方法允許本發明胜肽之偵測或測量，藉由露出 發明抗體至假定含本發明胜狀之樣本並该測或測量Ζ抗^ 與胜肽之免疫複合物。 & 由於根據本發明之偵測或測量方法可專一偵測或測量 胜肽，方法在使用胜肽之各種實驗中為有用的。 X π.載體與宿主細胞 本發明也提供載體與宿主細胞，於其中將編碼出本發 明胜肽之核普酸引入。本發明之載體可用於維持本發明核 苷酸’特別是DNA於宿主細胞中以表現本發明胜肽，或為 基因治療以投予本發明本發明核苷酸。 當E. coli為宿主細胞且載體被放大且大量製造於e coli (例如，JM109、DH5 alpha、HB101 或 XLlBlue)中時， 載體具有要被放大於E. coli中之“〇ri，，且篩選轉形e coli之標誌基因（例如，藉由安比西林（ampiciiu㈧、四 環黴素（tetracycline)、卡那黴素（kanamycin)、氣黴素 (chloramphenicol )或類似物篩選之一抗藥基因）。例如， 可使用M13-系列載體、pUC_系列載體、pBR322、 pBluescript、pCR_Script 等。此外，pGEM_T、pDiREcT 與 79 201102081 PT7也可被用來次複製與萃取cDNA與上述載體。當載體被 用來產生本發明蛋白質時，一表現載體可提供使用。例如， 要被表現於E. coli中之一表現載體應具有上述特徵以被 放大於E. col 1中。當使用E. c〇1 i，例如JM1〇9、抓5 alpha、HB101或XLlBlue為宿主細胞時，載體應具有啟動 子（promoter)，例如 lacZ 啟動子（Ward et al.，Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)) 、araB 啟動子（Better et al·, Science 240: 1041-3 (1988))、 T7啟動子或類似物，其可有效表現所需基因於E. c〇H. 中。基於那方面，可使用，例如pGEXHi (pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen)、pEGFP 與 pET(於此例子， 伯主較佳為BL21 ’其表現T7 RNA聚合酶），取代上述載 體。另外，載體也可含用於胜肽分泌之訊號序列。一引導 要被为/必之胜狀至E· coli的胞膜間區（peripiasm)的示範 之訊7虎序列為pelB訊號序列（Lei etal.，JBacteriol 169: 4379 (1 987))。將載體引入目標宿主細胞的方式包括，例 如’氣化約方法’與電穿孔（electroporation)方法。 除了 E. co 1 i，例如來自哺乳動物之表現載體（例如 pcDNA3 (Invitrogen)與 pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 1 8( 1 7): 5322 ( 1 990 ))、pEF、pCDM8)、來自昆蟲細胞之 表現載體（例如、”Bac-to-BAC桿狀病毒表現系統 (baculovirus expression system)" (GIBCO BRL) ' pBacPAK8)、來自植物之表現載體（例如，pMHi、pMH2)、 來自動物病毒之表現載體（例如、pHSV、pMV、pAdexLcw ) ' 80 201102081 來自反轉錄病毒之表現載體（例如，pZIpne〇)、來自酵母 菌之表現載體（例如，”Pichia Expressi〇n Kit" (Invi trogen)、pNVU、SP_Q〇1 )與來自枯草桿菌（Μ。i ius siibtUls)之表現載體（例如，ppL6〇8，pKTH5〇)可被用 來產生本發明之多胜肽。 為了在於動物細胞，例如CH〇、c〇s或NIH3T3細胞中 表現載體，載體應具有表現於此類細胞中所必須的啟動 子，例如 SV40 啟動子（Mulligan et ai.，Nature 277: 1 08 ( 1 979 ))、MMLV-LTR 啟動子、EF1 alpha 啟動子（Mizushima et al·， Nucleic Acids Res 18: 5322 (199〇)) 、 CMV 啟 動子等，與筛選轉形物的標誌基因（例如藉由藥物篩選（例 如，新黴素（neomycin)、G418之抗藥基因）較佳。具又這 些載體特徵的已知載體的例子包括，例如pMAM、pDR2、 pBK-RSV 、 pBK-CMV 、 pOPRSV 與 p0P13 。 呈現下列實施例以說明本發明與以協助熟悉此技藝人 士製造與使用本發明。實施例並不傾向於在其他方面限制 本發明乾圍任何方式中。 【實施例】 材料與方法 細胞株 T2(HLA-A2)、人類 β 淋巴母細胞株（lyjjjphobiastoid cell line)、C0S7與非洲綠猴腎細胞株為自ATCC所購得。 HLA-A2 +與TTK +腫瘤細胞株，H1 650為自ATCC所購得。 81 201102081 HLA-A2-與TTK+細胞株’ PC-3與TE-l為分別自JCRB細胞 銀行（JCRB Cel 1 Bank)與 RIKEN 細胞銀行（rikEN Cel 1 Bank) 所購得。 來自TTK之胜肽的合成 根據對HL A - A * 0 2 G1分子之結合親和力預測來設計來 自TTK之9-員與10員胜肽（序列辨識號：卜38)。胜肽 係根據一標準固相合成方法由SIGMA(Sapporo，Japan)或 Biosynthesis Inc.(Lewisville，TX)來合成且藉由逆相高 效能液體層析（reversed phase high performance liquid chromatography, HPLC)來純化。分別藉由分析型HLPC與 質譜分析確認這些胜肽之純度（> 90 % )與身份 (identity)。 將胜肽溶解於二曱基亞颯 (dimethylsulfoxide， DMS0)中於 20 mg/ml 且儲存於 -80〇C。 /;? F/iro細胞毒殺性τ淋巴球誘導 使用來自單核白血球之樹突細胞做為抗原呈現細胞以 誘導抗表現於人類白血球組織抗原（HLA )上之胜肽的細胞 毒殺性T淋巴球反應^ /万〖/·〇產生樹突細胞如別處所述 (Nakahara S et al.， Cancer Res 2003 Jul 15， 63(14)· 4112-8)。特別地，由 Fic〇i i _piaqUe (pharmacia)溶液分 離自一正常自願者（HL A-A* 0201 + )之周邊血液單核細胞，藉 由貼附至一塑膠組織培養盤（Bect〇I1 Dickinson)來分離以 82 201102081 豐富其如一單核白jk球部分。將經豐富單核白血球之族群 培養在1 0 0 0 U / m 1之人類顆粒-巨嗟細胞群落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) (R&D System)與 1 000 U/ml 之白細胞介素 (interleukin, IL)-4 (R&D System)存在下於含 2% 之熱 去活性自身取得血清（autologous serum, AS)之AIM-V培 養基（Invi trogen)中。培養7天後，於AIM-V培養基中， 於 3 /zg /ml 之 /3-2 微球蛋白（beta 2-microglobulin) 存在下以20 Ag/ml之各合成胜肽脈衝（pulsed)細胞激素 誘導之樹突細胞3小時於37°C。所產生之細胞顯示表現樹 突細胞相關分子，例如CD80、CD83、CD86與HLA Class II 於其細胞表面（資料未顯示）。之後以X-射線（20 Gy)將 這些胜肽脈衝之樹突細胞去活性且將其以1 : 20之比例與 自身取得CD8 + T細胞混合，CD8 + T細胞藉由以CD8 Positive Isolation Kit (Dynal)正選擇獲得。這些培養物設置於 48孔盤（Corning);各孔含1_ 5 X 104胜肽脈衝之樹突細胞、 3 X 105 CD8+ T 細胞與 10 ng/ml 之 IL-7 (R&D System)於 0.5ml之AIM-V/2%自身取得血清培養基中。三天之後，以 1[-2((：[111?〇1^)添加至培養物至終濃度為20 111/1111。第7天 與第14天更以自身取得胜肽脈衝之樹突細胞進一步刺激T 細胞。以與上述相同之方法每次製備樹突細胞。於第21 天，第三輪之胜肽刺激後，將細胞毒殺性T淋巴球進行抗 胜肽脈衝之T2細胞測試（Tanaka H ei aA，Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al. , Br J Cancer [[多ί 83 201102081 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7； Uchida N et aj., ciin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。 細胞毒殺性T淋巴球擴張步驟 使用與由 Riddell et al. (Walter EA et al.，N Engl J Med 1 99 5 Oct 1 9, 333( 1 6): 1 038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1 996 Feb, 2(2): 216-23)敘述之相似方法於培養 中擴張細胞毒殺性T淋巴球。全部5 X 1 04細胞毒殺性τ 淋巴球懸浮於25 ml之含有由MMC去活化之兩種人類β類 淋巴母細胞株之AIM-V/5%自身取得血清培養基，在40 ng/ml之抗-CD3單株抗體（Pharmingen)存在下。在開始培 養1天後，120IU/ml之IL-2加入培養中。於第5、8、11 天以新鮮之含30 IU/ml之IL-2的AIM-V/5。/◦自身取得血清 培養基提供給培養物（Tanaka H ei a厶，Br J Cancer 2001 Jan 5, 84( 1 ): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8)： 1052-7; Uchida N et al. , Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al. , Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。 細胞毒殺性T淋巴球複製的建立 稀釋以使細胞毒殺性τ淋巴球以0. 3、1與3細胞毒

84 201102081 殺性T淋巴球/孔的含量於96 round-bottomed微效價盤 (^&186?'11111(：1111：61'11&1：1〇1131)中。細胞毒殺性1'淋巴球與 1 X 104細胞/孔之2種兩種人類B類淋巴母細胞株、30 ng/ml 之抗-CD抗體與125 U/ml之IL-2於全部150 //1 /孔之含 5%自身取得之血清的AIM-V培養基中一起培養。1〇天後將 50 " 1/孔之IL-2加入培養基中以達到125 U/ml IL-2之 終濃度。於第14天測試細胞毒殺性τ淋巴球之活性，且使 用上述相同方法擴張細胞毒殺性T淋巴球複製（Uchida N et a 1. , Clin Cancer Res 20 04 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et aJ., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;

Watanabe T et aJ., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。 專一之細胞毒殺性T淋巴球活性 為了測試專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，執行 IFN-r酵素結合免疫斑點（ELISP0T)分析與IFN-r酵素結 合免疫吸附（ELISA)分析。特別地，製備胜肽脈衝之HQ χ 1 〇 /we 11)為刺激細胞。培養之細胞於48孔中做為應答細 胞。在製造商步驟下執行IFN_ ^酵素結合免疫斑點分析與 IFN-r酵素結合免疫吸附分析。 強有力地表現目標基因或HLA-A02或兩者的細胞的建 立 藉由PCR將編碼出目標基因之開放讀框或HLA-A* 0201 ί S3 85 201102081 之cDNA放大。將pcr放大產物複製進載 % 11 °使用 lipofectamine 2000 (Invitrogen)，根據製造商建議卉驟 將質體轉染進C0S7，其為一目標基因與hla~A* Π9ηι η υ z u ~細胞 株。於自轉染後2天’以versene (Invitrogen)收集經轉 染的細胞且使用為細胞毒殺性T淋巴球活性分析之目彳严、細 胞（5 X 1 〇4/wel 1)。 結果 以HLA- A* 0201限制之來自TTK之預測胜肽誘導細胞 毒殺性T淋巴球與 根據敘述於“材料與方法”之步驟產生對於那些來自 TTK之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IFN- 7酵素結合 免疫斑點分析測定胜狀專一細胞毒殺性T淋巴球活性（第 la-j圖）。與控制組扎洞相較，下列孔洞編號顯示強的 IFN- r產生··以TTK-A0 2-9-462 (序列辨識號：1 )刺激之 #1與#4 (a)、以TTK-A02-9-630 (序列辨識號：2)刺激之 #7 (b)、以 TTK-A0 2-9-593 C 序列辨識號：3 )刺激之#5 (c)、 以TTK-A02-9-719 (序列辨識號：6)刺激之#4、#5、#6與 #7 (d)、以TTK-A02-9-1 42 (序列辨識號：15)刺激之#5 與#7 (e)、以TTK-A0 2-9-146 (序列辨識號：19)刺激之 #7 (f)、以TTK-A0 2-9-5 64 (序列辨識號：20 )刺激之#5、 #7與#8 (g)、以TTK-A02-10-462 (序列辨識號：22)刺激 之#卜#2 與 #5(h)、以 TTK-A02-10_542 (序列辨識號：34) 刺激之#2 (i)及以TTK-A02-1 0-661 (序列辨識號：35)刺 86 201102081 激之# 2 (j )。 抗TTK特定胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球細胞株與複製 的建立 藉由IFN- 7 酵素結合免疫斑點分析偵測，於以 TTK-A02-9-462 (序列辨識號：1 )刺激之孔洞編號#1 (a)、 以TTK-A02-9-630 (序列辨識號：2 )刺激之#7 (b)、以 TTK-A02-9-593 (序列辨識號：3 )刺激之#5 (c)、以 TTK-A02-9-719 (序列辨識號：6 )刺激之#5 (d)、以 TTK-A02-9-142 (序列辨識號：15)刺激之#5 (e)、及以 TTK-A02-1 0-462 (序列辨識號：22 )刺激之#2 ( f)中顯示 胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性的細胞被擴張，並藉由 限制稀釋來建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株，於“材料與 方法”中所述。藉由IFN- r酵素結合免疫吸附分析來測定 那些細胞毒殺性T淋巴球細胞株的細胞毒殺性τ淋巴球活 性（第2a-f圖）。與無胜肽脈衝之目標細胞相較’所有細 胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗以對應胜肽脈衝之目 標細胞的IF N - γ產生。 此外’如於‘材料與方法”所述藉由來自細胞毒殺性 T淋巴球細胞株的_稀釋建立細胞毒殺性τ淋巴球複 製，且藉由IFN-γ酸冬 ’呼京結合免疫吸附分析測定來自抗經胜 月太脈衝目標細胞之么田妝主χ < 胞努殺性Τ淋巴球複製的IFN- r產 生。測定強的IFN- T, τ產生來自以ΤΤΚ-Α02-9-593 (序列辨 識5虎· 3 )刺激之細妝生 之、，、田胞母殺性Τ淋巴球複製（第2g圖）。 87 i? 201102081 抗表現TTK與HLA-A* 0 20 1之目標細胞的專一細胞毒殺 性Τ淋巴球活性

測試經提升抗各胜肽之所建立的細胞毒殺性Τ淋巴球 細胞株其對於辨認表現ΤΤΚ與HLA-A* 0 20 1分子之目標細胞 的能力。使用由對應之胜肽提升的細胞毒殺性T淋巴球細 胞株與複製做為影響細胞來測試抗C0S7細胞的專一細胞 毒殺性T淋巴球活性’而c〇S7細胞經全長之TTK與HLA-A

* 0201基因轉染（對於外生表現ττκ與HLA-A* 020 1基因之 目標細胞的特定模式）^ C0S7細胞以全長TTK基因或HLA-A * 0 20 1轉染製備為控制組。於第3圖中，以TTK_a〇2_9__593 (序列辨識號：3 )刺激之細胞毒殺性τ淋巴球細胞株與細 胞毒殺性T淋巴球複製顯示強的抗表現ττκ與HLA-A* 0201 兩者之COS7細胞的能力（& :細胞株、b :複製）。另—方 面’沒有债測到抗控制組之顯著專一的細胞毒殺性T淋巴 球活性。以TTK-A02-9-593 (序列辨識號：3 )建立之細胞 毒殺性T淋巴球複製也顯示抗外生表現TTK與HLA-A* 〇2〇1 兩者之腫瘤細胞株：Η1650細胞的專一之細胞毒殺性τ淋 巴球活性（c) °另一方面，沒有偵測到抗控制組：ΤΕ1細胞 與PC3細胞之顯著專一的細胞毒殺性τ淋巴球活性。因此， 這些資料清楚證明ττκ_α〇2_9_593 (序列辨識號：3)之胜 狀被外生地處理與表現於具有HU_A*〇2〇1分子之目標細 胞上。且之後此胜肽-HLA複合物由細胞毒殺性T淋巴球所 辨認。這些結果顯示TTK-A02-9-593 (序列辨識號：3 )為 88 201102081 •q"適合為具表現TTK之腫瘤之病患的癌症疫苗。 抗原胜肽之同源分析 以ΤΤΚ-Α02-9-593 (序列辨識號：3 )刺激之細胞毒殺 性Τ淋巴球顯示顯著且專一之細胞毒殺性τ淋巴球活性。 此結果可能起因於ΤΤΚ-Α02-9-593 (序列辨識號：3)之序 列為與源自已知使人類免疫系統敏感之其他分子的胜肽同 源的事實。為了排除此可能性，對於使用為關鍵字向BLAST 演算法（http://www. nebi.nlm.nih. gov/blast/blast, cgi) 查詢之這些胜肽序列執行同源性分析，而BLAST演算法顯 示沒有序列顯示顯著之同源性。同源性分析之結果指出 ΊΤΚ-A02-9-593 (序列辨識號：3 )之序列為獨特的，且因 此只有很小可能性分子會對於一些非相關分子提高非傾向 之免疫反應。 因此’確認新穎之來自TTK之HLA-A02抗原決定位胜 狀。此外證明使用TTK之抗原決定位胜肽的疫苗可應用於 癌症免疫治療。 【參考實施例】 申請人之先前申請案’公開為W02008/1 02557，揭露 來自TTK之胜肽之抗外生表現ττκ之HLA-A* 0201的目標細 胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性誘導活性（第4明） 測試經提升抗各胜肽之所建立的細胞毒殺性τ淋巴球 細胞株其對於辨認表現ΤΤΚ與HLA-A* 020 1之目標細胞的妒 111 89 201102081 力。使用由 ΤΤΚ-Α2-9-462(序列辨識號：1 )、TTK-A02-9-547 (序列辨識號：5) 、TTK-A2-9-719 (序列辨識號：6)與 TTK-A2_10-462 (序列辨識號.22)提升的細胞毒殺性τ淋 巴球細胞株與複製做為影響細胞來測試抗C0S7細胞的專 一細胞毒殺性T淋巴球活性，而C0S7細胞經全長之TTK基 因與HLA-A* 0201分子兩者轉染’其為對於外生表現ττκ 與HLA-A* 0201之目標細胞的特定模式。將c〇S7細胞經全 長之TTK而非全長之HLA-A* 0201轉染、將c〇S7細胞經 HLA-A 0201而非全長之TTK (或置換為全長之基因） 轉^與將COS7細胞經HLA-A 020 1轉染並以不同之抗原決 定位胜肽脈衝製備為控制組。結果顯示經提升抗那些胜肽 的細胞毒殺性T淋巴球複製具有抗以TTK與HLA-A* 0201 兩者轉染之COS7的專一細胞毒殺性τ淋巴球活性（第4 圖，對應於於W02008/102557中之第8b、c、d與e圖，於 此引入其内容為參考文獻）。 與那些胜肽相較，確認於本發明中之TTK-A02-9-593 (序列辨識號：3 )具有一明顯之功效活性，其在〗FN_丨 產生中以-或二等級的量增加。因此，本發明胜肽似乎為 癌症之治療、預防及/或避免之有前途之目標，癌症包括， 但不限於肺癌、膀胱癌、乳癌、+宮頸癌、膽管細胞癌' 慢性骨髓性白血病、大腸癌、子宮内膜異位症、食道癌、 胃癌、擴散型胃癌、肝癌、非小細胞肺癌、淋巴瘤、骨肉 瘤 '印巢癌、胰臟癌 '前列腺癌、腎癌、小細胞肺癌、軟 組織腫瘤與睪丸癌。 90 201102081 產業利用性 此本發明㈣新的腫瘤相關抗原，肖別是纟自TTK的那 二，其可誘導強且專一的抗腫瘤免疫反應，且對於癌症形 式之廣泛種類而言具有應㈣。此腫瘤相關抗原可提供效 用為抗與™相關之疾病的胜肽疫苗，與TTK相關之疾病， ❹癌症，更特別是肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽 s細胞癌、&性骨趙性白血病、大腸癌、子宮内膜異位症、 食道癌、胃癌、擴散型胃癌、肝癌、非小細胞肺癌、淋巴 瘤月肉瘤、印巢癌、騰臟癌、前列腺癌、腎癌、小細胞 肺癌、軟組織腫瘤與睪丸癌。 當於此詳述本發明與提及其特定實施例時，需瞭解的 是，前述敘述本質為示範與解釋且意為說明本發明與其較 佳實施例。於例行實驗之中’熟悉此技藝人士可立即瞭解 在不脫離本發明之精神下其可實行各種改變與修飾。因此 本發明不被前述所定義，而被下列申請專利範圍與其等同 物所定義》 【圖式簡單說明】 第1圈由-系列照片⑷至⑴所組成，其顯示於以來 自ΓΤΙ(之胜肽誘導之細胞毒殺性τ淋巴球上之iFN_ r酵素 結合免疫斑點分析（ELISPOT)的結果。與控制組孔洞相較， 於下列孔洞編號中之細胞毒殺性T淋巴球顯示強的iFN— ^ 產生：以TTK-Α02-9-462 (序列辨識號：丨）刺激之#1與#4 91 201102081 (a) 、以ΤΤΚ-A02-9-630 (序列辨識號：2)刺激之#7 (b)、 以TTK-A02-9-593 (序列辨識號：3)刺激之#5 (c)、以 TTK-A02-9-719 (序列辨識號：6)刺激之#4、託、#6與#7 (d) 、以TTK-A02-9-142 (序列辨識號：15)刺激之#5與#7 (e) 、以 TTK-A02-9-1 46 C 序列辨識號：19)刺激之 #7 (f)、 以TTK-A02-9-564 (序列辨識號：20 )刺激之#5、#7與#8 (g)、以TTK-A02-1 0-462 (序列辨識號：22)刺激之#1、 #2與#5 (h)、以TTK-A02-1 0-542 (序列辨識號：34)刺激 之#2 (i)及以TTK-A02-1 0-661 (序列辨識號：35)刺激之 #2 (j)。以矩形盒狀所指出於孔洞中之細胞被擴張來建立 細胞毒殺性T淋巴球細胞株。於圖中，“ 指出抗以適合 之胜肽脈衝的目標細胞的IFN- r產生，而“”指出抗未 以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN- T產生。 第2圈由一系列線圖（a )至（g)所組成，顯示IF N - r酵 素結合免疫吸附分析彳貞測的結果，其顯示以T T K - A 0 2 - 9 - 4 6 2 (序列辨識號：1) (a)、TTK-A02-9-630 (序列辨識號：2) (b) 、TTK-A02-9-593 C 序列辨識號：3) (c)，TTK-A02-9-719 (序列辨識號：6) (d)、TTK-A02-9-142 (序列辨識號：15) (e)與TTK-A02-10-462 (序列辨識號：22 ) (f)刺激之細胞 毒殺性 T 淋巴球細胞株的 IFN-7 產生與自以 TTK-A02-9-593 (序列辨識號：3 )刺激之細胞毒殺性τ淋 巴球細胞株藉由相同胜肽刺激所建立之細胞毒殺性T淋巴 球複製的IFN- τ產生。結果顯示與控制組相較，藉由以特 定TTK胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株與自此 92 201102081 細胞毒殺性τ淋巴球細胞株所建立之細胞毒殺性τ淋巴球 複製顯示強而有力之IFN- τ產生。於圖中，“ 指出抗 以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN- τ產生，而“指 出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN- τ產生。 第3圈由一系列線圖（a)至（c)所組成，顯示抗外生表 現TTK與HLA-A* 0 201之目標細胞及HLA-A2 +與TTK過度表 現之腫瘤細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。將以hla-A * 020 1與全長之ττκ基因轉染之C0S7細胞製備為目標細 胞，而將以HLA-A* 0201或以全長之TTK基因轉染之C0S7 細胞製備為控制組，（幻與⑶）。再者，H165〇，一腫瘤細胞 株，其為HLA-A2 +與ΤΤκ過度表現，被製備為目標細胞， 而PC-3與TE-1，腫瘤細胞株，其為HLA_A2—與ττκ過度 表現，被製備為控制組（c)。以TTK_A〇2_9_593 (序列辨識 ° )之胜肽建立之細胞毒殺性Τ'淋巴球細胞株（a)與自 此’、田I毋杈性τ淋巴球細胞株建立之細胞毒殺性τ淋巴球 複製⑻顯示抗以ττκ與HLA_A* 0201兩者（黑色菱形）轉 染之COS7、’.®胞的專—細胞毒殺性τ淋巴球活性。另—方 又有债测到顯著專一之細胞毒殺性τ淋巴球活性，盆 抗表現 HLA-A* r ^ 、 、 ,201(三角形）或ττκ(圓形）之目標細 細胞毒殺性τ .，社 >巴球複製也顯示抗腫瘤細胞株（HLA-A2 + 11K ) * H1650 Ηίι zjl ^ '匕的專一之細胞毋殺性τ淋巴球活性（） (黑色盒狀）。其一 + 方面，沒有偵測到顯著專一之細胎主 殺性ΐ淋巴球、壬批 有号又、，，田胞t 角形：PC-3,圓形 。 ’ ™ )(二 93 201102081 第4圖由一組線圖所組成，其顯示來自TTK之胜肽之 抗外生表現ΤΤΚ之HLA-A* 020 1的目標細胞的專一細胞毒殺 性Τ淋巴球活性誘導活性（内分（endo)析結果）。這些圖 對應至提出於申請人之WO2008/1 02557中的第8b、c、d與 e圖。 【主要元件符號說明】 無 94 201102081 序列表 <110> 腫瘤療法·科學股份有限公司 <120〉 TTK胜肽及其疫苗 <130〉 0NC-A0908-TW <150〉 US 61/216,017 <151> 2009-05-11 <160〉 44 <170〉 Patent In version 3. 5 <210〉 1 <211> 9 <212〉 PRT 〈213〉 人工 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 〈400〉 1

Tyr Met Ser Cys Phe Arg Thr Pro Val 1 5 <210〉 2 <211〉 9 <212〉 PRT <213> 人工 <220> <223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 2

Asn Met Leu Glu Ala Val His Thr lie 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213〉 人工 <220〉 〈223> 人工合成胜肽序列 〈400> 3 201102081

Ile Thr Asp Gin Tyr lie Tyr Met Val 1 5 <210> 4 〈211〉 <212> <213> 9 PRT 人工 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 4

Gin Met Gin Pro Asp Thr Thr Ser Val <210〉 5 <211〉 <212〉 <213〉 9 PRT 人工 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 5

Lys Gin Me Tyr Ala Me Lys Tyr Val 1 5 <210〉 6 <211> <212〉 <213〉 9 PRT 人工 <220> <223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 6

Ser Leu Gly Cys lie Leu Tyr Tyr Met <210〉 7 <211〉 <212> <213〉 9 PRT 人工 2 201102081 • <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 7

Tyr Val Leu Gly Gin Leu Val Gly Leu <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 8

Tyr Val Gin Me Gin Thr His Pro Val 〈210〉 9 <211> 9 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 9

Leu lie Val Asp Gly Met Leu Lys Leu <210〉 10 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 10

Thr lie Asp Ser lie Met Asn Lys Val 〈210〉 11 201102081 > > > 12 3 11 1 2 2 2 < < <

9mA <220> <223〉人工合成胜肽序列 ,<400> 11

Met Leu Lys Leu Ile Asp Phe 6ly lie <210> 12 <211> 9 <212〉 PRT 〈213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 12

Ser Leu Leu Ala Lys Leu Glu Glu Thr 1 5 <210〉 13 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工 〈220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 13 lie Leu Ala Thr Pro Leu Gin Asn Leu 1 5 <210〉 14 <211> 9 〈212〉 PRT <213〉人工 〈220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 14

Leu lie Me Thr Asp Ser lie Thr Leu 4 201102081 5 0 12 3 1— 1— i— 2 2 2 2 /\ /\ /\ < PRT^ <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 15

Phe Ala Phe Val His lie Ser Phe Ala <210> 16 <211> 9 〈212〉 PRT 〈213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 16

Ala lie lie Asp Pro Asn His Glu lie 〈210〉 17 <211〉 9 〈212〉 PRT <213〉人工 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 17

Lys Leu Me Gly Arg Tyr Ser Gin Ala 〈210〉 18 <211> 9 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 [【乐]] 5 201102081 <400〉 18

Leu Leu Ala His Pro Tyr Val Gin lie <210〉 19 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 19

His lie Ser Phe Ala Gin Phe Glu Leu 〈210〉 20 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 20

Thr Leu Asp Ser Tyr Arg Asn Glu lie <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213〉人工 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 21

Tyr Met Val Met Glu Cys 6ly Asn lie

<210> 22 <211〉 10 <212〉 PRT 6 201102081 ' <213〉 人工 〈220〉 <223> 人工合成胜肽序列 <400> 22

Tyr Met Ser Cys Phe Arg Thr Pro Val Val 1 5 10 <210〉 23 <211〉 <212〉 〈213> 10 PRT 人工 <220> <223〉 人工合成胜肽序列 <400> 23

Phe Leu lie Val Asp Gly Met Leu Lys Leu 1 5 10 <210〉 <211> <212〉 〈213> 24 10 PRT 人工 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 24

Gly Met Leu Lys Leu lie Asp Phe Gly lie 1 5 10 <210〉 25 <211> <212> <213> 10 PRT 人工 <220〉 〈223> 人工合成胜肽序列 <400> 25

Phe Leu Tyr Gly Glu Asn Met Pro Pro Gin 1 5 10 [S3 7 201102081 <210〉 10PRT人 <211〉 <212〉 <213〉 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 26

Lys Leu lie Gly Arg Tyr Ser Gin Ala lie 1 5 10 <210〉 27 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 27

Thr Thr Phe Glu Gin Pro Val Phe Ser Val 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 28

Gin Met Gin Pro Asp Thr Thr Ser Val Val 1 5 10 > > > > 0 12 3 1— 1— .^1 2 2 2 2 < < < < 〈220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 29 201102081

Met Val Met Glu Cys Gly Asn lie Asp Leu 1 5 10 <210〉 30 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 30

Asn Leu Ser Ala Ser Thr Val Leu Thr Ala 1 5 10 <210> 31 <211〉 10 〈212〉 PRT <213〉人工 〈220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 31

Leu Thr lie Asp Ser lie Met Asn Lys Val 1 5 10 〈210〉 32 <211> 10 <212> PRT <213〉 人工 <220〉 <223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 32 Lys 11 e Ile Arg Leu Tyr Asp Tyr Glu lie 1 5 10 <210〉 33 <211〉 10 <212〉 PRT 〈213〉 人工 201102081 <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 33

Met Met Ala Asn Asn Pro Glu Asp Trp Leu 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213〉 人工 <220〉 <223> 人工合成胜肽序列 <400> 34

Val Leu Asn Glu Lys Lys Gin lie Tyr Ala 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213〉人工 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 35

Lys Leu lie Asp Phe Gly lie Ala Asn Gin 1 5 10 <210〉 36 <211> 10 <212〉 PRT <213〉人工 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 36

Leu Leu Leu Lys Leu Glu Lys Asn Ser Val 1 5 10 <210> 37 10 201102081 10PRT人 <211〉 <212> <213〉 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 37

Gin Met Ala Lys Gly Thr Thr Glu Glu Met 1 5 10 <210> <211〉 <212> <213〉 <220〉 〈223> 人工合成胜肽序列 <400> 38

Gin lie Tyr Ala lie Lys Tyr Val Asn Leu 1 5 10 <210〉 39 <211> 2984 〈212〉 DNA <2〗3>人類 <400> 39 ggaaattcaa acgtgtttgc ggaaaggagt ttgggttcca tcttttcatt tccccagcgc 60 agctttctgt agaaatggaa tccgaggatt taagtggcag agaattgaca attgattcca 120 taatgaacaa agtgagagac attaaaaata agtttaaaaa tgaagacctt actgatgaac 180 taagcttgaa taaaatttct gctgatacta cagataactc gggaactgtt aaccaaatta 240 tgatgatggc aaacaaccca gaggactggt tgagtttgtt gctcaaacta gagaaaaaca 300 gtgttccgct aagtgatgct cttttaaata aattgattgg tcgttacagt caagcaattg 360 aagcgcttcc cccagataaa tatggccaaa atgagagttt tgctagaatt caagtgagat 420 ttgctgaatt aaaagctatt caagagccag atgatgcacg tgactacttt caaatggcca 480 gagcaaactg caagaaattt gcttttgttc atatatcttt tgcacaattt gaactgtcac 540

600i SJ aaggtaatgt caaaaaaagt aaacaacttc ttcaaaaagc tgtagaacgt ggagcagtac ll 201102081 cactagaaat gctggaaatt gccctgcgga atttaaacct ccaaaaaaag cagctgcttt 660 cagaggagga aaagaagaat ttatcagcat ctacggtatt aactgcccaa gaatcatttt 720 ccggttcact tgggcattta cagaatagga acaacagttg tgattccaga ggacagacta 780 ctaaagccag gtttttatat ggagagaaca tgccaccaca agatgcagaa ataggttacc 840 ggaattcatt gagacaaact aacaaaacta aacagtcatg cccatttgga agagtcccag 900 ttaaccttct aaatagccca gattgtgatg tgaagacaga tgattcagtt gtaccttgtt 960 ttatgaaaag acaaacctct agatcagaat gccgagattt ggttgtgcct ggatctaaac 1020 caagtggaaa tgattcctgt gaattaagaa atttaaagtc tgttcaaaat agtcatttca 1080 aggaacctct ggtgtcagat gaaaagagtt ctgaacttat tattactgat tcaataaccc 1140 tgaagaataa aacggaatca agtcttctag ctaaattaga agaaactaaa gagtatcaag 1200 aaccagaggt tccagagagt aaccagaaac agtggcaatc taagagaaag tcagagtgta 1260 ttaaccagaa tcctgctgca tcttcaaatc actggcagat tccggagtta gcccgaaaag 1320 ttaatacaga gcagaaacat accacttttg agcaacctgt cttttcagtt tcaaaacagt 1380 caccaccaat atcaacatct aaatggtttg acccaaaatc tatttgtaag acaccaagca 1440 gcaatacctt ggatgattac atgagctgtt ttagaactcc agttgtaaag aatgactttc 1500 cacctgcttg tcagttgtca acaccttatg gccaacctgc ctgtttccag cagcaacagc 1560 atcaaatact tgccactcca cttcaaaatt tacaggtttt agcatcttct tcagcaaatg 1620 aatgcatttc ggttaaagga agaatttatt ccattttaaa gcagatagga agtggaggtt 1680 caagcaaggt atttcaggtg ttaaatgaaa agaaacagat atatgctata aaatatgtga 1740 acttagaaga agcagataac caaactcttg atagttaccg gaacgaaata gcttatttga 1800 ataaactaca acaacacagt gataagatca tccgacttta tgattatgaa atcacggacc 1860 agtacatcta catggtaatg gagtgtggaa atattgatct taatagttgg cttaaaaaga 1920 aaaaatccat tgatccatgg gaacgcaaga gttactggaa aaatatgtta gaggcagttc 1980 acacaatcca tcaacatggc attgttcaca gtgatcttaa accagctaac tttctgatag 2040 ttgatggaat gctaaagcta attgattttg ggattgcaaa ccaaatgcaa ccagatacaa 2100 caagtgttgt taaagattct caggttggca cagttaatta tatgccacca gaagcaatca 2160 12 201102081 φ aagatatgtc ttcctccaga gagaatggga aatctaagtc aaagataagc cccaaaagtg 2220 atgtttggtc cttaggatgt attttgtact atatgactta cgggaaaaca ccatttcagc 2280 agataattaa tcagatttct aaattacatg ccataattga tcctaatcat gaaattgaat 2340 ttcccgatat tccagagaaa gatcttcaag atgtgttaaa gtgttgttta aaaagggacc 2400 caaaacagag gatatccatt cctgagctcc tggctcatcc ctatgttcaa attcaaactc 2460 atccagttaa ccaaatggcc aagggaacca ctgaagaaat gaaatatgtt ctgggccaac 2520 ttgttggtct gaattctcct aactccattt tgaaagctgc taaaacttta tatgaacact 2580 atagtggtgg tgaaagtcat aattcttcat cctccaagac ttttgaaaaa aaaaggggaa 2640 aaaaatgatt tgcagttatt cgtaatgtca aataccacct ataaaatata ttggactgtt 2700 atactcttga atccctgtgg aaatctacat ttgaagacaa catcactctg aagtgttatc 2760 agcaaaaaaa attcagtaga ttatctttaa aagaaaactg taaaaatagc aaccacttat 2820 ggtactgtat atattgtaga cttgttttct ctgttttatg ctcttgtgta atctacttga 2880 catcatttta ctcttggaat agtgggtgga tagcaagtat attctaaaaa actttgtaaa 2940 taaagttttg tggctaaaat gacactaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2984 <210> 40 <211〉 857 <212〉 PRT 〈213〉人類 <400〉 40

Met Glu Ser Glu Asp Leu Ser Gly Arg Glu Leu Thr lie Asp Ser lie 15 10 15

Met Asn Lys Val Arg Asp lie Lys Asn Lys Phe Lys Asn Glu Asp Leu 20 25 30

Thr Asp Glu Leu Ser Leu Asn Lys lie Ser Ala Asp Thr Thr Asp Asn 35 40 45

Ser Gly Thr Val Asn Gin Ile Met Met Met Ala Asn Asn Pro Glu Asp 50 55 60 i Si «- *-r _f 13 201102081

Trp Leu Ser Leu Leu Leu Lys Leu Glu Lys Asn Ser Val Pro Leu Ser 65 70 75 80

Asp Ala Leu Leu Asn Lys Leu lie Gly Arg Tyr Ser Gin Ala lie Glu 85 90 95

Ala Leu Pro Pro Asp Lys Tyr Gly Gin Asn Glu Ser Phe Ala Arg Ile 100 105 110

Gin Val Arg Phe Ala Glu Leu Lys Ala lie Gin Glu Pro Asp Asp Ala 115 120 125

Arg Asp Tyr Phe Gin Met Ala Arg Ala Asn Cys Lys Lys Phe Ala Phe 130 135 140

Val His lie Ser Phe Ala Gin Phe Glu Leu Ser Gin Gly Asn Val Lys 145 150 155 160

Lys Ser Lys Gin Leu Leu Gin Lys Ala Val Glu Arg Gly Ala Val Pro 165 170 175

Leu Glu Met Leu Glu lie Ala Leu Arg Asn Leu Asn Leu Gin Lys Lys 180 185 190

Gin Leu Leu Ser Glu Glu Glu Lys Lys Asn Leu Ser Ala Ser Thr Val 195 200 205

Leu Thr Ala Gin Glu Ser Phe Ser Gly Ser Leu Gly His Leu Gin Asn 210 215 220

Arg Asn Asn Ser Cys Asp Ser Arg Gly Gin Thr Thr Lys Ala Arg Phe 225 230 235 240

Leu Tyr Gly Glu Asn Met Pro Pro Gin Asp Ala Glu lie Gly Tyr Arg 245 250 255

Asn Ser Leu Arg Gin Thr Asn Lys Thr Lys Gin Ser Cys Pro Phe Gly 260 265 270 14 201102081

Arg Val Pro Val Asn Leu Leu Asn Ser Pro Asp Cys Asp Val Lys Thr 275 280 285

Asp Asp Ser Val Val Pro Cys Phe Met Lys Arg Gin Thr Ser Arg Ser 290 295 300

Glu Cys Arg Asp Leu Val Val Pro Gly Ser Lys Pro Ser Gly Asn Asp 305 310 315 320

Ser Cys Glu Leu Arg Asn Leu Lys Ser Val Gin Asn Ser His Phe Lys 325 330 335

Glu Pro Leu Val Ser Asp Glu Lys Ser Ser Glu Leu lie lie Thr Asp 340 345 350

Ser lie Thr Leu Lys Asn Lys Thr Glu Ser Ser Leu Leu Ala Lys Leu 355 360 365

Glu Glu Thr Lys Glu Tyr Gin Glu Pro Glu Val Pro Glu Ser Asn Gin 370 375 380

Lys Gin Trp Gin Ser Lys Arg Lys Ser Glu Cys Ile Asn Gin Asn Pro 385 390 395 400

Ala Ala Ser Ser Asn His Trp Gin lie Pro Glu Leu Ala Arg Lys Val 405 410 415

Asn Thr Glu Gin Lys His Thr Thr Phe Glu Gin Pro Val Phe Ser Val 420 425 430

Ser Lys Gin Ser Pro Pro lie Ser Thr Ser Lys Trp Phe Asp Pro Lys 435 440 445

Ser lie Cys Lys Thr Pro Ser Ser Asn Thr Leu Asp Asp Tyr Met Ser 450 455 460

Cys Phe Arg Thr Pro Val Val Lys Asn Asp Phe Pro Pro Ala Cys Gin 465 470 475 480 15 201102081

Leu Ser Thr Pro Tyr Gly Gin Pro Ala Cys Phe Gin Gin Gin Gin His 485 490 495

Gin lie Leu Ala Thr Pro Leu Gin Asn Leu Gin VaI Leu Ala Ser Ser 500 505 510 .

Ser Ala Asn Glu Cys lie Ser Val Lys Gly Arg lie Tyr Ser Me Leu 515 520 525

Lys Gin lie Gly Ser Gly Gly Ser Ser Lys Val Phe Gin Val Leu Asn 530 535 540

Glu Lys Lys Gin lie Tyr Ala lie Lys Tyr Val Asn Leu Glu Glu Ala 545 550 555 560

Asp Asn Gin Thr Leu Asp Ser Tyr Arg Asn Glu lie Ala Tyr Leu Asn 565 570 575

Lys Leu Gin Gin His Ser Asp Lys lie lie Arg Leu Tyr Asp Tyr Glu 580 585 590 lie Thr Asp Gin Tyr Ile Tyr Met Val Met Glu Cys Gly Asn Ile Asp 595 600 605

Leu Asn Ser Trp Leu Lys Lys Lys Lys Ser lie Asp Pro Trp Glu Arg 610 615 620

Lys Ser Tyr Trp Lys Asn Met Leu Glu Ala Val His Thr lie His Gin 625 630 635 640

His Gly lie Val His Ser Asp Leu Lys Pro Ala Asn Phe Leu lie Val 645 650 655

Asp Gly Met Leu Lys Leu lie Asp Phe Gly lie Ala Asn Gin Met Gin 660 665 670

Pro Asp Thr Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Gin Val Gly Thr Val Asn 675 680 685 16 201102081

Tyr Met Pro Pro Glu Ala Me Lys Asp Met Ser Ser Ser Arg Glu Asn 690 695 700

Gly Lys Ser Lys Ser Lys lie Ser Pro Lys Ser Asp Val Trp Ser Leu 705 710 715 720

Gly Cys lie Leu Tyr Tyr Met Thr Tyr Gly Lys Thr Pro Phe Gin Gin 725 730 735 lie lie Asn Gin Me Ser Lys Leu His Ala lie lie Asp Pro Asn His 740 745 750

Glu lie Glu Phe Pro Asp lie Pro Glu Lys Asp Leu Gin Asp Val Leu 755 760 765

Lys Cys Cys Leu Lys Arg Asp Pro Lys Gin Arg Me Ser lie Pro Glu 770 775 780

Leu Leu Ala His Pro Tyr Val Gin lie Gin Thr His Pro Val Asn Gin 785 790 795 800

Met Ala Lys Gly Thr Thr Glu Glu Met Lys Tyr Val Leu Gly Gin Leu 805 810 815

Val Gly Leu Asn Ser Pro Asn Ser Ile Leu Lys Ala Ala Lys Thr Leu 820 825 830

Tyr Glu His Tyr Ser Gly Gly Glu Ser His Asn Ser Ser Ser Ser Lys 835 840 845

Thr Phe Glu Lys Lys Arg Gly Lys Lys 850 855 <210〉 41 <211〉 22 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220〉 ί ii <223〉人工合成核苷酸序列 17 201102081 <400> 41 gtctaccagg cattcgcttc at 22

<210〉 42 <211〉 24 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成核苷酸序列 <400〉 42 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 43 <211> 21 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉人工合成核苷酸序列 <400〉 43 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210〉 44 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成核苷酸序列 <400〉 44 24 ctagcctctg gaatcctttc tctt 18

Claims (1)

1. 201102081 七、申請專利範圍： 1. 一種經分離的胜肽，包括序列辨識號：3之胺基酸 序列。 2. —種經分離的胜肽，具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發 能力’其中該胜肽係包括序列辨識號：3之胺基酸序列， 其中1、2或數個胺基酸被取代、刪除或加入。 3. 如申請專利範圍第2項所述之經分離的胜肽，其中 §玄胜肽具有一或兩者之下列特徵： (a) 自N端之第二個胺基酸為’或經修飾為一胺基 酸，其係擇自由白胺酸與曱硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) C端胺基酸為’或經修飾為一胺基酸，其係擇自 由纈氨酸與白胺酸所組成之群組。 4. 如申請專利範圍第！至3項之任一項所述之經分離 的胜肽’其為九胜肽。 5. —種經分離之多核苦酸，其編碼出申請專利範圍第 1至4項之任一項的該胜肽。 6. -種誘發細胞毒殺性T淋巴球之試劑中該試劑 包括申請專利範圍第…項之任—項的一或多個胜肽， 或申請專利範圍第5項之一或多個多核苷酸。 7. 種藥學試劑，用於癌症之治療及/或預防，及/或避 免其手術後復發，纟中該試劑包括中請專利範圍第i至4 項之任-項的-或多個胜肽’或申請專利_ 5項之一 或多個多核苷酸。 8. 申請專利範圍第7項所 t之藥學試劑，其被 1 201102081 用以投予一個體，其人類白血球組織抗原為人類白血球組 織抗原-A2。 9. 申請專利範圍第8項所述之藥學試劑，其中該人類 白血球組織抗原-A2為人類白血球組織抗原-A* 〇2〇1。 10. 申請專利範圍第7或8項所述之藥學試劑，其中 該試劑被配製來用於癌症之治療。 11 ·種誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原 呈現細胞的方法，其包括一步驟係擇自由下列所組成之群 組： U)』/7 ΗίΓΟ、F/FO或J./7叩將一抗原呈現細 胞與申請專利範圍第1至4項之任一項之該胜肽接觸；以 及 (b)將編碼出申請專利範圍第1至4項之任一項之該 胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。 12. —種誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法，包括—步 驟’其擇自由下列所組成之群組： (a) 將CD8 + T細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原呈現 細胞表現一人類白血球組織抗原與申請專利範圍第丨至4 項之任一項之該胜肽的複合物於其表面上； (b) 將CD8 + T細胞與外吐小體共培養，外吐小體表現 —人類白血球組織抗原與申請專利範圍第1至4項之任_ 項之該胜肽的複合物於其表面上；以及 (c) 將一包括編碼出一 T細胞受體次單元多胜肽之多 核普酸的基因引入一 T細胞，該T細胞受體次單元多胜狀 2 201102081 具有與申s月專利範圍第1至4項之任-項的該胜肽結合的 能力。 一種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血 球組織抗原與申請專利範圍第1纟4項之任一項之該胜肽 的複合物於其表面上。 一 I4.如申請專利範圍第13項所述之抗原呈現細胞，其 藉由申响專利範圍第11項所述之方法來誘導。 15. 一種經分離之細胞毒殺性τ淋巴球，i申請專 利範圍第1至4項之任一項之該胜狀為標的。申 申明專利範圍第15項所述之細胞毒殺性τ淋巴 球，其藉由申請專利範圍第12項所述之方法來誘導。 、、I7. 一種於一個體中誘導一抗癌症之免疫反應的方 法’其中該方法包括投予該個體一試劑，該試劑包括一或 多個申請專利範圍第i i 4項之任一項之胜肽、一或多個 其免疫活性片段、或—或多個編碼出該胜肽或該片段之多 18'種抗體或其片段，其抗申請專利範圍第i至 項之任一項之該胜肽。

   1Θ項所 9 ·種载體，包括編碼出申請專利範圍第 之任一項之該胜肽的一核苷醆序列。 20.—種宿主細胞，其被以申請專利範圍第 述之一表現载體所轉形或轉染。 -種診斷套組，包括申請專利範圍第 任-項之該胜肽、f請專利範㈣5項之該核 201102081 專利範圍第18項之該抗體。 4