TW201039846A

TW201039846A - Anti-FcRH5 antibodies and immunoconjugates and methods of use

Info

Publication number: TW201039846A
Application number: TW099109950A
Authority: TW
Inventors: Kristi Elkins; Andrew Polson; Allen Ebens; Camelia Adams; Bing Zheng; Jagath R Junutula; Jo-Anne Hongo; Yan Wu
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2009-04-01
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2010-11-16
Also published as: EP2414395A1; AU2010232682A1; RU2583270C2; JP2016028052A; US8362213B2; US20130089497A1; RU2016110891A; CN102369218B; WO2010114940A1; SG174930A1; CA2756988A1; CN102369218A; CL2011002418A1; AR076030A1; KR20120003478A; US9017951B2; JP2012522513A; HK1166805A1; MX2011010265A; BRPI1012560A2

Description

201039846 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係針對適用於治療哺乳動物之造血系統腫瘤的相關組合物’且針對使用彼等相關組合物進行該治療之方法。交叉引用相關申請案本案根據Section 119(e)主張2009年4月1曰申請之美國臨時申請案第61/211,754號及2009年4月2曰申請之第〇 61/166,214號之優先權及權益，該等案之全部揭示内容以全文引用的方式併入本文中。序列表之參考本發明之申請案含有已經由EFS-Web提交且以全文引用的方式併入本文中之序列表。該於2〇1〇年3月25曰創建之 ASCII複本命名為GNE〇3 5 lR.txt且大小為的，184位元組。【先前技術】在美國’惡性腫瘤（癌症）繼心臟病之後為死亡之第二主〇要原因（Boring等人 ’ CJ Cawce/ J. 43:7 (1993))。癌症之特徵在於源自正常組織之異常或贅生性細胞之數目增加’該等細胞增殖形成腫瘤塊；該等贅生性腫瘤細胞侵蝕相鄰組織；及產生惡性細胞，該等惡性細胞最終經由血液或淋巴系統擴散至局部淋巴結且經由稱作癌轉移之過程擴散至遠端位點。在癌性狀況下，細胞在正常細胞不能生長之條件下增殖。癌症表現在由不同程度之侵蝕性及侵襲性表徵的多種形式上。 147375.doc 201039846 涉及在造血（產生血液之細胞成分（諸如淋巴細胞、白血球、血小板、紅血球及自然殺手細胞）的過程）期間產生之細胞的癌症稱作造企系統癌症。可存在於血液及淋巴組織中且對免疫反應很關鍵之淋巴細胞分成兩大類淋巴細胞： B淋巴細胞（B細胞）及T淋巴細胞（T細胞），其分別介導體液免疫及細胞介導之免疫。 B細胞在骨髓内成熟，且使骨髓在其細胞表面表現結合抗原之抗體。當天然B細胞首次遇見其膜結合抗體之特異性抗原時’細胞開始快速分裂且其子代分化成記憶B細胞及稱作「漿細胞」之效應細胞。記憶B細胞具有較長壽命且繼續表現與初始親本細胞具有相同特異性之膜結合抗體。漿細胞不產生膜結合抗體，而替代地產生可分泌形式之抗體。分泌之抗體為體液免疫之主要效應分子。 T細胞在胸腺内成熟，胸腺提供不成熟τ細胞增殖及分化之環境。在T細胞成熟期間’ τ細胞進行基因重排，產生τ 細胞受體，且進行有助於確定成熟T細胞之細胞表面表型的正選擇及負選擇。成熟T細胞之特徵性細胞表面標記為 CD3:T細胞受體複合物及共同受體卜〇1^邮〇1>)(：〇4或（：]：)8 —* 〇在發現癌症療法之有效細胞標靶的嘗試中，研究者設法鑑別跨膜或其他膜相關多肽，相較於表現於一或多個正常非癌性細胞上，該等多肽特異性表現於一或多個特定類型之癌細胞表面上。通常，相較於表現於非癌性細胞表面上’ δ亥等膜相關多肽更大量表現於癌細胞表面上。鏗別該 147375.doc 201039846 等腫瘤相關之細胞表面抗原多肽獲得特異性靶向癌細胞以經由基於抗體之療法破壞的能力。在此方面，注意到基於抗體之療法已證實極有效治療特定癌症。舉例而言， HERCEPTIN® 及 RITUXAN®(兩者均來自 Genentech Inc·， South San Francisco，California)分別為已成功用於治療乳癌及非雈奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma)之抗體。更特定言之’ HERCEPTIN®為重組DNA衍生之人類化單株抗體’其選擇性結合於人類表皮生長因子受體 © 2(HER2)原致癌基因之細胞外域。在25-30%原發性乳癌中觀察到HER2蛋白過度表現。RITUXAN⑧為遺傳工程改造之嵌合鼠類/人類單株抗體，其針對存在於正常及惡性B淋巴細胞之表面上的CD20抗原。該等抗體均在Ch〇細胞中重組產生。在發現癌症療法之有效細胞標靶的其他嘗試中，研究者设法鑑別（1)一或多個特定類型之癌細胞相較於一或多個特 Q 定類型之非癌性正常細胞特異性產生之非膜相關多肽、（2) 癌、田胞以顯著鬲於—或多個正常非癌性細胞之表現量產生的多肽或（3)在癌性與非癌性狀況（例如正常前列腺與前列腺腫瘤、’且織）下，表現僅特異性偈限於單一組織類型（或極有限數目之不同組織類型）的多肽。該等多肽可保持位於、、’田胞内或可為由癌細胞分泌。此外，該等多肽可不由癌細月包自身声王目方衣兄’而由產生及/或分泌對癌細胞具有加強或生長促進作用之多肽的細胞表現。該等分泌之多肽通常為向癌細胞提供優於正常細胞之生長優勢的蛋白質，且包括諸 147375.doc 201039846 :。血管生成因子、細胞黏附因子、生長因子及其類似物之物質。預期鑑別該等非膜相關多肽之拮抗劑充當治療該等癌症之有效治療劑。此外，鑑別該等多肽之表現模式將會適用於診斷哺乳動物之特定癌症。儘管哺乳動物癌症療法存在上述確定進展，但仍非常需要分別㊣夠债測哺乳動物之腫瘤存在及有&抑制贊生性細胞生長的其他治療劑。因此’本發明之一目標在於鑑別多肽’即細胞膜相關、分泌之或細胞内多肽，在癌性與非癌性狀況下，該等多肽之表現僅特異性侷限於單一組織類型 (或極有限數目之不同組織類型），即造血性組織，且在於使用彼等多肽及其編碼核酸產生適用於治療性處理及/或伯測哺乳動物之造血系統癌症的相關組合物。在B細胞惡性病症（包括b細胞淋巴瘤及骨趙瘤）中常見染色體lq21之異常，但由該等畸變靶向之基因基本未知。涉及V 1 q21 -q23之染色體異常是B細胞非霍奇金氏淋巴瘤與多發性骨髓瘤兩者中最常見的遺傳病變。在非霍奇金氏淋巴瘤亞型中，Iq21-q23處之易位斷裂點（包括易位及複製）常報導為滤泡性及彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLCL)、邊緣區 B細胞淋巴瘤及伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma)中之單一染色體異常。藉由選殖骨髓瘤細胞株中t(l:14)(q21:q32)_ 色體易位之斷裂點鑑別兩個基因，稱作免疫球蛋白超家族受體易位相關（IRTA)l及IRTA2。IRTA2與鑑別為 BXMASl(Nakayama等人 ’ Biochm. Biophys· Res. Commun. 285:830-7，2001)及 FcRH5(Davis 等人，Proc· Natl. Acad. 147375.doc 201039846

Sci. USA 98:9772-7, 2001)之序列一致。IRTA1 與 IRTA2 均為相關基因（IRTA)家族之成員。

FcRH5(或IRTA2)為與Fc受體家族具有同源性之細胞表面受體。其通常表現於成熟B細胞中，且在外周淋巴器官中具有不同於FcRH4(IRTAl)之分佈。IRTA1表現於邊緣區B 細胞中，而IRTA2亦表現於生髮中心中心細胞及免疫胚細胞中。IRTA2在lq21異常之多發性骨髓瘤及伯基特淋巴瘤細胞株中表現異常（參見Miller等人，Blood 99:2662-2669, 〇 2002)。B細胞惡性病症中涉及lq21結構重排之高頻率表明 IRTA1及IRTA2對於該等疾病之發病機制很關鍵（參見公開之PCT申請案第WO 01/38490號；美國公開之專利申請案第 20080292632號）（亦參見 Poison等人 Int Immunol. 2006年 9 月；18(9):1363-73) 〇假設表現FcRH5，宜產生FcRH5抗原之治療性抗體，當投與患者以尤其進行長期治療時，該等抗體產生極小抗原性或無抗原性。本發明滿足此需要及其他需要。本發明提〇供抗FcRH5抗體，其克服當前治療性組合物之侷限性，且提供將由下述實施方式顯而易見之其他優勢。在癌症治療中，使用抗體-藥物結合物（ADC)(亦即免疫結合物）局部傳遞細胞毒性劑或細胞生長抑制劑（亦即殺滅或抑制腫瘤細胞之藥物）(Lambert，J. (2005) Curr· Opinion in Pharmacology 5:543-549 ; Wu 等人（2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146 ； Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212 ; Syrigos 及 Epenetos (1999) Anticancer 147375.doc 201039846

Research 19:605-614 ; Niculescu-Duvaz及 Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172 ; US 4975278)使得可向腫瘤靶向傳遞藥物部分且在其中進行細胞内積累，其中全身性投與該等未結合藥劑可能對正常細胞以及設法去除之腫瘤細胞產生不可接受程度之毒性（Baldwin等人（1986) Lancet (1986 年 3 月 15 日），第 603-05 頁；Thorpe，（1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」，Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical 入卩卩1卜&1^〇113，八.？111(：116以等人（編），第475-506頁）。改良治療指數（亦即ADC之最大功效及最小毒性）之努力集中於多株抗體（Rowland 等人（1986) Cancer Immunol. Immunother.， 21:183-87)及單株抗體（mAb)之選擇性以及藥物連接及藥物釋放特性（Lambert, J· (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549)。抗體藥物結合物中所用之藥物部分包括細菌蛋白毒素，諸如白喉毒素；植物蛋白毒素，諸如蓖麻毒素；小分子，諸如奥瑞他汀（auristatin)、膠達納黴素 (geldanamycin)(Mandler 等人（2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 ; Mandler 等人（2000) Bioorganic Med. Chem. Letters 10:1025-1028 ; Mandler 等人（2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、類美登素（maytansinoid) (EP 1391213 ; Liu等人（1996) Proc· Natl. Acad. Sci· USA 93:8618-8623)、刺孢黴素（calicheamic in) (Lode 等人（1998) Cancer Res. 58:2928 ; Hinman等人（1993) Cancer Res. 53:3336-3342)、道諾黴素（daunomycin)、小紅莓（doxorubicin)、曱 147375.doc 201039846 胺喋呤（methotrexate)及長春地辛（vindesine)(Rowland 等人 (1986)(前述））p藥物部分可影響細胞毒性及細胞生長抑制機制，包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制。一些細胞毒性藥當結合於大抗體或蛋白質受體配位體時趨向於無活性或活性降低。

奥瑞他汀肽、奥瑞他汀E(AE)及單甲基奥瑞他汀 (monomethylauristatin，MMAE)、多拉司他汀（dolastatin) 之合成類似物（WO 02/088 172)作為藥物部分結合於：⑴嵌合單株抗體cBR96(對癌瘤上之路易斯γ具有特異性（Lewis Y)) ; (ii)對血液惡性病症上之CD30具有特異性的 cAC10(Klussman 等人（2004)，Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773 ; Doronina等人（2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784 ; Francisco 等人（2003) 131〇〇0 102(4):1458-1465 ; US 2004/0018194) ; (iii)抗 CD20 抗體（諸如利妥昔單抗（rituxan)(WO 04/032828))以治療表現CD20之癌症及免疫病症；（iv)抗EphB2R抗體2H9以治療結腸直腸癌（Mao等人（2004) Cancer Research 64(3):781-788) ; (v)E-選擇素抗體（Bhaskar 等人（2003) Cancer Res. 63:6387-6394); (vi)曲妥珠單抗（trastuzumab)(HERCEPTIN®，US 2005/0238649) 及（vi)抗CD30抗體（WO 03/043583)。奥瑞他汀E之變異體揭示於US 5767237及US 6124431中。結合於單株抗體之單曱基奥瑞他汀E揭示於Senter等人2004年3月28日提交之 Proceedings of the American Association for Cancer Research, 第45卷，摘要編號623中。奥瑞他汀類似物MMAE及MMAF 147375.doc 201039846 已結合於各種抗體（US 2005/0238649>。使藥物部分與抗體連接（亦即經由共價鍵連接）之習知方式一般產生分子之非均質混合物，其中藥物部分在抗體之多個位點連接。舉例而言，細胞毒性藥通常經由抗體之通常多個離胺酸殘基結合於抗體，產生非均質抗體-藥物結合混合物。視反應條件而定，非均質混合物通常含有抗體與0至約8個或更多個所連接藥物部分之分佈。另外，可能非均質混合物存在於藥物部分與抗體之比率為特定整數之結合物的各亞群内，其中藥物部分在抗體之多個位點連接。分析及製備方法可能不足以分離及表徵由結合反應產生之非均質混合物中的抗體-藥物結合物質分子。抗體為大型複雜且結構上多樣之生物分子，其通常具有多個反應性官能基。其與連接子試劑及藥物_連接子中間物之反應性取決於諸如pH值、濃度、鹽濃度及共溶劑之因素。此外，多步結合過程可能不可重現，因為難以控制反應條件及表徵反應物及中間物。不同於在接近pH 7時質子化且親核性降低之大多數胺，半胱胺酸硫氫基在中性pH下具有反應性。因為游離硫氫基 (RSH，氫硫基）相對具有反應性，故具有半胱胺酸殘基之蛋白質通常以其氧化形式以二硫基連接之寡聚體形式存在或具有内部橋接之二硫基。細胞外蛋白質一般不具有游離硫氫基（Garman，1997，Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach，Academic Press，London，第 55 頁）。相較於抗體胺或羥基，抗體半胱胺酸硫氫基一般對親電子結 147375.doc -10· 201039846 合試劑更具反應性（亦即更具親核性）。已藉由遺傳工程改造技術將半胱胺酸殘基引入蛋白質中而與配位體形成共價連接或形成新分子内二硫鍵（Better等人（1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650 ; Bernhard 等人（1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132 ; Greenwood 等人（1994) Therapeutic Immunology 1:247-255 ; Tu 等人（1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867 ; Kanno 等人（2000) J"· of Biotechnology， 76:207-214 ; Chmura 等人（2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(l5):8480-8484 ; US 6248564)。然而’藉由使蛋白質之各個胺基酸殘基突變成半胱胺酸胺基酸工程改造半胱胺酸硫氫基具有潛在問題，尤其在未配對（游離Cys)殘基或相對易於進行反應或氧化之殘基的情況下。在蛋白質之濃溶液 (無論大腸桿菌之周質、培養物上清液或部分或完全純化之蛋白質）中，蛋白質表面上之未配對Cys殘基可配對且氧化形成分子間二硫基，且因此形成蛋白質二聚體或多聚體。經由二硫鍵形成二聚體使新Cys對於與藥物、配位體或其他標記結合不具反應性。此外，若蛋白質在新工程改造之Cys與現有Cys殘基之間氧化形成分子内二硫鍵，則兩種Cys硫氫基均不可用於活性位點參與及相互作用。此外，可因摺疊異常或使三級結構喪失使蛋白質無活性或不具特異性（Zhang等人（2002) Anal. Biochetn. 3 11:1 _9)。經半胱胺酸工程改造之抗體已設計為fab抗體片段 (thioFab)形式，且表現為全長IgG單株（thi〇Mab)抗體 (Junutula，J.R.等人（2008) J Immunol Methods 332.41-52 ; 147375.doc -11 - 201039846 US 2007/009294〇，其内容以引用的方式併入本文中）β ThioFab及ThioMab抗體經由連接子在新引入之半胱胺酸硫氫基處與硫氫基反應性連接子試劑及藥物_連接子試劑結合以製備抗體藥物結合物（Thio ADC)。本文所引用之所有參考文獻（包括專利申請案及公開案）均以全文引用的方式併入本文中。【發明内容】本發明提供抗FcRH5抗體或其功能片段及其用於治療造血系統腫瘤之方法。在一態樣中，本發明提供—種較佳特異性結合於任何上述或下述多肽的抗體。視情況，抗體為單株抗體、抗體片段（包括Fab、Fab，、^讣，）2及卜片段）、雙功能抗體、單域抗體、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或競爭性抑制抗 FcRH5多肽抗體結合於其各別抗原性抗原決定基的抗體。本t月之抗體可視情況結合於生長抑制劑或細胞毒性劑，諸如毒素（包括例如奥瑞他汀、類美登素、多拉司他汀衍生物或刺孢黴素）、抗生素、放射性同位素、核分解酶或其類似物。本發明之抗體可視情況在CH〇細胞或細菌細胞中產生，且較佳誘發其所結合之細胞死亡。出於偵測目的，本發明之抗體可進行可偵測地標記、連接於固體支撐物或進行類似處理。在一態樣中，'本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之單價親和力（例如Fab片段形式之抗體孑cRH5之親和力）或一價形式親和力（例如片段形式之 147375.doc •12· 201039846 抗體對FcRH5之親和力）分別實質上等同於、低於或大於鼠類抗體之單價親和力或二價形式親和力（例如Fab片段或 IgG片段形式之鼠類抗體對FcRH5之親和力）或嵌合抗體之單價親和力或二價形式親和力（例如Fab片段或IgG片段形式之嵌合抗體對FcRH5之親和力），該鼠類或嵌合抗體包含圖9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO:20)中所述之輕鏈及重鏈可變域序列，由該等序列組成或基本上由該等序列組成。 ® 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0·4 nM、0_2 nM或0·5 nM。在一態樣中，提供一種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自由以下組成之群的HVR : (i) 包含序列 KASQNVGSNVA(SEQ ID NO: 28)之 HVR-L1 ；

Q (ii) 包含序列 SASYRYS(SEQ ID NO: 29)之 HVR-L2 ; (iii) 包含序列 QQYKTWT(SEQ ID NO: 30)之 HVR-L3 ; (iv) 包含序列 GYTFTNYGMN(SEQ ID NO: 37)之 HVR-H1 ； (v) 包含序列 NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO: 38)之 HVR-H2 ;及 (vi) 包含序列 ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO: 39)之HVR-H3。在一實施例中，HVR-H1殘基編號9在變異HVR-H1中 147375.doc -13- 201039846 為卜在另-實施财，抗體包含具有SEQ ID N〇: 38之序列的議·Η2β在另一實施例中，構架序列之至少一部分為人類共同構架序列。在另-實施例中，抗體包含人類Κ 亞群1共同構架序列。在另—實施财，抗體包含重鏈人類亞群III共同構架序列。在另一實施例中，構架序列包含位置 11、12、13、18、19、20、75、78、82、8=2a、83 及 / 或34處之取代。在另一實施例中，取代為L11v、νΐ2Κ、 V13K、L18V、R19K、L20V、K75V、V78A、N82I、 N82aS、R83K及/或M34I。在另一實施例中，構架序列包含位置12 ' 13、34及/或78處之取代。在另一實施例中，取代為 V12K、V13K、M34I及 / 或 V78A。在另一實施例中，抗體包含與選自SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少90°/。胺基酸序列一致性的輕鏈可變域。在一實施例中，抗體包含與選自SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少90°/。胺基酸序列一致性的重鏈可變域。在另一實施例中，抗體包含與選自SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少9 0 %胺基酸序列一致性的輕鏈可變域。在另一實施例中’抗體包含與選自SEQ ID N0: 21之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。在另一實施例中，抗體包含與選自SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。在另一實施例中，抗體包含與選自SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。在一實施例中，抗體包含含有一個、兩個、三個或四個 147375.doc -14· 201039846 選自SEQ ID NO: 33、34、35及36之構架胺基酸序列的重鏈可變域。在其他實施例中，抗體包含含有一個、兩個、二個或四個選自SEQ ID NO: 24、25、26、27及28之構架胺基酸序列的輕鏈可變域。在另一實施例中，抗體包含含有一個、兩個、三個或四個構架胺基酸序列的重鏈可變域’该等構架胺基酸序列與選自SEq ID no: 33、34、35 及36之胺基酸具有至少9〇%胺基酸序列一致性。在其他實施例中，抗體包含含有一個、兩個、三個或四個構架胺基〇酸序列的輕鏈可變域，該等構架胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 24、25、26、27及28之胺基酸具有至少90%胺基酸序列一致性。在一態樣中，提供一種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含至少一個變異HVR，其中該變異HVR序列包含對 SEQ ID NO: 28、29、30、37、38或39中所述序列之至少一個殘基的修飾。在另一實施例中，修飾為取代、插入或缺失。 ❹ 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對人類FcRH5之單價親和力實質上等同於鼠類抗體之單價親和力，該鼠類抗體包含如圖9(SEq ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)中所述之輕鏈及重鏈可變序列。在一態樣中，本發明提供一種人類化抗FCRH5抗體，其中該抗體對人類FcRH5之單價親和力為大於包含圖9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SeQ ID NO: 20)中所述輕鏈及重鏈可變 147375.doc 15 201039846 序列之鼠類或嵌合抗體之單價親和力至少丨、2、3、4、 5、6、7、8、9或 10倍 ° 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對人類FCRH5之單價親和力為小於包含圖 9(SEQIDNO: 18)及圖10(SEQ IDN〇: 20)中所述輕鏈及重鍵可變序列之鼠類或嵌合抗體之單價親和力至少1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、U、12、13、14、15、16、 17 、 18 、 19 、 20 、 25 、 30 、 35 、 40 、 45 、 50 、 55或60倍。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力實質上等同於鼠類抗體之二價形式親和力，且該鼠類抗體包含如圖 9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)中所述之輕鏈及重鏈可變序列。在一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為大於包含圖 9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)中所述輕鏈及重鏈可變序列之鼠類或嵌合抗體之二價形式親和力至少1、 2'3、4、5、6、7、8、9或10倍° 在另一態樣中，本發明提供人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為小於包含圖 9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)中所述輕鏈及重鏈可變序列之鼠類或嵌合抗體之二價形式親和力至少1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 25 、 30 、 35 、 40 、 45 、 50 、 55或60 147375.doc 16 201039846 倍。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為0.4 nM。在一實施例中’抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為 0.4 nM +/-.04。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為0.2 nM。在一實施例中，抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為 ^ G.2 nM +/-.02。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為0.5 nM。在一實施例中’抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為 0.5 nM +/-_〇i。在所有態樣中，結合親和力表示為Kd值。在另一態樣中’結合親和力藉由Biacore或放射免疫分析法測量。 q 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該人類化抗體在結合於細胞毒性劑時抑制腫瘤細胞生長。在另‘癌樣中’本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該人類化抗體在結合於細胞毒性劑時抑制腫瘤細胞生長。在一實施例中，人類化抗體與嵌合抗體均為單價或二價抗體。在另—實施例中，人類化抗體與嵌合抗體包含連接於FC區之單—Fab區。 147375.doc •17· 201039846 在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含含有圖12 中所述之 HVR1-HC、HVR2-HC 及 / 或 HVR3-HC 序列（SEQ ID NO: 37-39)的重鏈可變域。在一實施例中，可變域包含圖 12 中所述之 FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及 / 或 FR4-HC序列（SEQ ID NO: 3 3-36)。在另一實施例中，抗體包含圖12 中所述之CH1及/或Fc序列（SEQ ID NCh 40及/或41)。在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含含有圖12 中所述之 HVR1-LC、HVR2-LC及 / 或 HVR3-LC 序列（SEQ ID NO: 28-30)的輕鏈可變域。在一實施例中，可變域包含圖 12 中所述之 FIU_LC、FR2-LC、FR3-LC 及 / 或 FR4-LC序列 (SEQ ID NO: 24-27)。在另一實施例中，抗體包含圖12中所述之CL1 序列（SEQ ID NO: 31)。在一態樣中’本發明提供一種多肽，其包含圖11中所述之序列（SEQ ID NO: 21)。在另一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含圖9中所述之序列（SEQ ID NO: 19)。在另一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含圖丨丨中所述之序列 (SEQ ID NO: 22)。在另一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含圖11中所述之序列（SEQ ID NO: 23)。在另一態樣中’本發明提供一種藉由以下方法製備之抗體：（a)培養表現包含本文所述之重鏈可變域及本文所述之輕鏈可變域之抗體的細胞；及（b)自該所培養細胞分離該抗體。在另一態樣中’本發明提供一種包含本文所述之重鏈可變域及本文所述之輕鏈可變域的抗體。在一實施例中，抗 147375.doc •18· 201039846 體為單價抗體且包含Fc區。在一態樣中，本發明提供一種編碼本文所述之抗體的聚核苷酸。在一實施例中，本發明提供一種包含該聚核苷酸之載體。在另一實施例中，本發明提供一種包含該載體之宿主細胞。在一態樣中，本發明包括一種經半胱胺酸工程改造之抗 FcRH5抗體，其包含一或多個游離半胱胺酸胺基酸及選自 SEQ ID NO: 25 1-298之序列。經半胱胺酸工程改造之抗 ® FcRH5抗體可結合於FcRH5多肽。經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體可藉由包含用半胱胺酸置換親本抗FcRH5抗體之一或多個胺基酸殘基的方法製備。在一態樣中，本發明包括一種經半胱胺酸工程改造之抗 FcRH5抗體，其包含一或多個游離半胱胺酸胺基酸，其中該經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體結合於FcRH5多肽，且藉由包含用半胱胺酸置換親本抗FcRH5抗體之一或多個胺基酸殘基的方法製備，其中該親本抗體包含至少一 ❹ 個選自以下之HVR序列： (i) 包含序列 KASQNVGSNVA(SEQ ID NO: 28)之HVR-L1 ； (ii) 包含序列 SASYRYS(SEQ ID NO: 29)之HVR-L2 ; (iii) 包含序列 QQYKTWT(SEQ ID NO: 3 0)之 HVR-L3 ; (iv) 包含序列 GYTFTNYGMN(SEQ ID NO: 37)之 HVR-H1 ； (v) 包含序列 NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO: 38)之 147375.doc -19- 201039846 HVR-H2 ;及 39)之 (vi)包含序列 ARRSIPYYYAMDY(SEQ Π) HVR-H3。經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體可為單株抗體、才二體片段、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或競爭性抑制抗FcRH5多肽抗體結合於其各別抗原性抗原決定基的疒體。本發明之抗體可視情況結合於生長抑制劑或細胞毒2 劑’諸如毒素（包括例如奥瑞他汀或類美登素）。本發明之抗體可視情況在CHO細胞或細菌細胞中產生，且較佳抑制其所結合之細胞生長或增殖或誘發該細胞之死亡。出於冷斷目的’本發明之抗體可進行可偵測地標記、連接於固體支樓物或進行類似處理。在一態樣中，本發明提供製備本發明抗體之方法。舉例而言，本發明提供一種製備FcRH5抗體（如本文所定義其包括全長抗體及其片段）之方法’該方法包含在適合之宿主細胞中表現編碼該抗體（或其片段）之本發明重組載體，及回收該抗體。在另一態樣中，本發明提供一種能夠結合於表現FcRH5 之第一細胞及表現細胞表面標靶抗原之第二細胞的雙特異性抗體。在一實施例中，第二細胞為T細胞。在一實施例中’細胞表面標靶抗原為CD3。在某些實施例中，雙特異性抗體為腔内突起抗體。在一實施例中，雙特異性抗體為無糖基化抗體。在一實施例中，雙特異性抗體在大腸桿菌 (hc/zeWc/n‘a co⑺宿主細胞中產生。在一實施例中，雙特 147375.doc •20- 201039846 異性抗體缺乏一或多個F c效應功能。在一實施例中，雙特異性抗體缺乏ADCC活性。在一態樣中，本發明為一種醫藥調配物，其包含本發明之抗體或本發明之抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之稀釋劑、载劑或賦形劑。在一態樣中，本發明提供一種製品，其包含容器；及該容器内所包含之組合物，其中該組合物包含一或多種本發明FcRH5抗體。在一態樣中，本發明提供一種套組，其包含含有組合物的第一谷器’該組合物包含一或多種本發明fcRH5抗體；及含有緩衝劑之第二容器。在一態樣中，本發明提供本發明FcRH5抗體之用途，其係用於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症）的藥物。在一態樣中’本發明提供本發明製品之用途，其係用於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤及，或細胞增殖病症）的藥物。在一態樣中，本發明提供本發明套組之用途，其係用於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症）的藥物。在一態樣中’本發明提供一種抑制表現FcRH5之細胞生長的方法’該方法包含使該細胞與本發明之抗體接觸，從而抑制該細胞之生長。在一實施例中，抗體結合於細胞毒 ^生劑。在—實施例中，抗體結合於生長抑制劑。 147375.doc 21 · 201039846 在一態樣中，本發明提供一種治療性處理患有包含表現 FcRH5之細胞的癌性腫瘤之哺乳動物的方法該方法包含向該哺乳動物投與治療有效量之本發明抗體，從而有效治療該哺乳動物。在一實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中，抗體結合於生長抑制劑。在一態樣中，本發明提供一種治療或預防與FcRH5表現增加相關之細胞增殖病症的方法，該方法包含向需要該治療之個體投與有效量之本發明抗體，從而有效治療或預防該細胞增殖病症。在一實施例中，該增殖病症為癌症。在一實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中，抗體結合於生長抑制劑。在一態樣中，本發明提供一種抑制細胞生長之方法，其中該細胞之生長至少部分依賴於FcRH5之生長加強作用，該方法包含使該細胞與有效量之本發明抗體接觸，從而抑制該細胞之生長。在一實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中，抗體結合於生長抑制劑。在一態樣中，本發明提供一種治療性處理哺乳動物之腫瘤的方法，其中該腫瘤之生長至少部分依賴於FcRH5之生長加強作用，該方法包含使該細胞與有效量之本發明抗體接觸，從而有效治療該腫瘤。在—實施例中，抗體結合於細胞毒性H實施例中，抗體結合於生長抑制劑。在態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含向患者投與包含本文所述之免疫結合物，可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥調配物。 147375.doc -22- 201039846 在一態樣中，本發明提供一種抑制B細胞增殖之方法，其包含在允許包含本發明抗體之免疫結合物結合於FcRH5 的條件下使細胞暴露於該免疫結合物。本發明之方法可另外包含其他處理步驟。舉例而言，在一實施例中，方法另外包含以下步驟，其中使靶向細胞及/ 或組織（例如癌細胞）暴露於輻射治療或化學治療劑。在一態樣中，本發明提供包含投與有效量之抗FcRH5抗體以及有效量之另一治療劑（諸如抗血管生成劑、另一抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、免疫抑制劑、前藥、細胞激素、細胞毒性放射療法、皮質類固醇、抗〇區吐劑、癌症疫苗、止痛劑或生長抑制劑）的方法。舉例而言，抗FcRH5 抗體或免疫結合物與抗癌劑或抗血管生成劑組合使用以治療各種贅生性或非贅生性病狀。在特定實施例中，抗 FcRH5抗體與以下組合使用：Velcade®(硼替佐米 (bortezomib))、Revlimid®(來那度胺（lenalidomide))、他莫昔芬（tamoxifen)、來曲唾（letrozole)、依西美坦（exemestane)、阿那曲唾（anastrozole)、伊立替康（irinotecan)、西妥昔單抗（cetuximab)、氟維司群（fulvestrant)、長春瑞濱（vinorelbine)、貝伐單抗（bevacizumab)、長春新驗（vincristine)、順舶 (cisplatin)、吉西他濱（gemcitabine)、甲胺°禁呤、長春驗 (vinblastine)、卡波 (carboplatin)、太平洋紫杉醇（paclitaxel)、多西他賽（docetaxel)、培美曲塞（pemetrexed)、5 -敗尿嘴咬、小紅莓、棚替佐米、來那度胺、地塞米松（dexamethasone)、美法侖（melphalin)、潑尼松（prednisone)、長春新驗、沙力 147375.doc -23 - 201039846 度胺（thalidomide)。視欲治療之特定癌症適應症而定，本發明之組合療法可與其他冶療劑（諸如化學治療劑）或其他療法（諸如放射療法或手術）組合。多種已知化學治療劑可用於本發明之組合療法。較佳使用治療特定適應症之彼等標準化學治療劑。欲用於組合中之各治療劑之劑量或頻率較佳等同於或小於當在無其他藥劑的情況下使用時相應藥劑之劑量或頻率。在另一態樣中，本發明提供任何本文所述之抗FcRH^^ 體，其中該抗FcRH5抗體包含可偵測標記。在一態樣中，本發明提供一種判定懷疑含有FcRH5之樣。口中FcRH5之存在的方法，該方法包含使該樣品暴露於本發明之抗體，及測定該抗體與該樣品中之結合，其中該抗體與該樣品中FeRH5之結合指示該樣品中該蛋白質之存在。 ' 在態樣中，本發明提供一種診斷與表現FcRH5之細胞 (諸如B細胞）增加相關之細胞增殖病症的方法’該方法包含使生物樣品中之測試細胞與任何上述抗體接觸；藉由债測抗體與FCRH5之結合敎結合於該樣品中之測試細胞的抗體含量；及比較結合於對照樣品中之細胞的抗體含量，其中結合之抗體含量校正為測試及對照樣品中表現之、”田胞數’且其中測甙樣品中結合之抗體相較於對照樣品的高含量表明存在與表現FeRH5之細胞相關的細胞增殖病症在匕、樣中，本發明提供一種偵測血液或血清中可溶性FCRH5之方法，該方法包含使來自懷疑患有B細胞增瘦 147375.doc 201039846 病症之哺乳動物的血液或血清的測試樣品與本發明之抗 FcRH5抗體接觸，及偵測測試樣品中可溶性FcRH5相對於來自正常哺乳動物之血液或血清的對照樣品的增加。在一態樣中，本發明提供一種使本發明之抗體結合於表現FcRH5之細胞的方法，該方法包含使該細胞與本發明之抗體接觸。在一實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中，抗體結合於生長抑制劑。【實施方式】本發明提供鑑別適用於治療哺乳動物之造血系統腫瘤的組合物的方法、組合物、套組及製品，且提供使用彼等相關組合物進行該治療之方法。本文提供該等方法、組合物、套組及製品之詳情。 I. 通用技術除非另外表明，否則本發明之實踐將採用分子生物學 (包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，該等技術在此項技術之技能範疇内。該等技術在以下文獻中充分說明：諸如「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」，第二版（Sambrook 等人，1989); 「Oligonucleotide Synthesis」（M. J. Gait編，1984);「Animal Cell Culture」（R. I. Freshney 編，1987) ;「Methods in Enzymology」（Academic Press, Inc.) ;「Current Protocols in Molecular Biology」（F. M. Ausubel等人編，1987，且定期更新）；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」，（Mullis等人編，1994) ;「A Practical Guide to Molecular Cloning」 147375.doc -25- 201039846 (Perbal Bernard V.，1988) ;「Phage Display: A Laboratory Manual」（Barbas等人，2001)。 II.定義為說明本說明書，將使用以下定義，且適當時以單數形式使用之術語應亦包括複數形式，且反之亦然。倘若所述任何定義與以引用的方式併入本文中之任何文件相抵觸，則以下述定義為準。本文之「B細胞表面標記」或「B細胞表面抗原」為表現於B細胞表面上之抗原，其可用與其結合之拮抗劑（包括 (但不限於）B細胞表面抗原或B細胞表面抗原之可溶形式的抗體，該等抗體能夠拮抗配位體結合於天然存在之B細胞抗原）靶向。例示性B細胞表面標記包括CD10、CD19、 CD20 、 CD21 、 CD22 、 CD23 、 CD24 、 CD37 、 CD40 、 CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、 CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、 CDw84、CD85及CD86白血球表面標記（關於說明，參見 The Leukocyte Antigen Facts Book,第 2版。1997, Barclay 等人編，Academic Press, Harcourt Brace & Co·，New York)。其他B細胞表面標記包括RP105、FcRH2、B-細胞 CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、 BR3、BAFF、BLyS、Btig、NAG14、SLGC16270、 FcRHl、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、 BCMA及239287。相較於哺乳動物之其他非B細胞組織，備受關注之B細胞表面標記優先表現於B細胞上，且可表 •26- 147375.doc 201039846 現於前驅Β細胞與成熟β細胞上。 Ο

除非另外表明，否則本文所用之術語「以咖」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然FcRH5，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物（例如人類、獼猴 (cynomologus monkey)(cyn〇))及齧齒動物（例如小鼠及大鼠）。人類FCRH5在本文中亦稱作「TAH〇i8」或「PR085143」（SEQ ID NO: 2)，且由在本文中亦稱作「DNA340394」之核苷酸序列（SEQ m N〇: ”編碼。獼猴 FcRH5在本文中亦稱作r cyn〇 FcRH5」。術語「FcRH5」涵蓋「全長」、未處理FcRH5以及由細胞中處理產生之FcRH5 的任何形式。該術語亦涵蓋天然存在之FcRH5之變異體，例如拼接變異體、對偶基因變異體及同功異型物。本文所述之FcRH5多肽可自多種來源（諸如人類組織類型或另一來源）分離或藉由重組或合成方法製備。「天然序列FcRH5多狀」包含具有與源自自然界之相應FcRH5多肽相同之胺基酸序列的多肽。該等天然序列FCRH5多肽可自自然界分離或可由重組或合成方式產生。術語「天然序列FcRH5多肽」特別涵蓋特定FcRH5多肽（例如細胞外域序列）的天然存在截短或分泌形式、該多肽之天然存在之變異形式（例如替代性拼接形式）及天然存在之對偶基因變異體。在本發明之某些實施例中，本文所揭示之天然序列FcRH5多肽為包含附圖所示全長胺基酸序列的成熟或全長天然序列多肽。起始及終止密碼子（若表明）在圖式中以粗體展示且加有下劃線。附圖中以「N」指示之核酸殘基為任何核酸殘 147375.doc -27- 201039846 基。然而，儘管附圖所揭示之FcRH5多肽展示為以甲硫胺酸殘基（在本文之圖式中稱作胺基酸位置1)起始，但可設想且有可能位於圖式中胺基酸位置1之上游或下游的其他甲硫胺酸殘基可用作FcRH5多肽之起始胺基酸殘基。「mu7Dll」或「MA7D11」或「鼠類FcRH5 (7D11)抗體」或「鼠類抗FcRH5 (7D11)抗體」在本文中用於特指以下鼠類抗FcRH5單株抗體，其中該鼠類抗FcRH5單株抗體包含圖9之SEQ ID NO: 18之輕鏈可變域及圖1〇之SEQ ID NO: 20之重鏈可變域。鼠類抗FcRH5單株抗體可購自市售來源。「chl3G9」或 rchMAFcRH5 (13G9)」或「嵌合MAFcRH5 (13G9)抗體」在本文中用於特指以下嵌合抗人類FcRH5 (13G)抗體，其中該嵌合抗FcRH5抗體包含SEQ ID NO:之輕鏈（圖6)，其包含人類IgGl之輕鏈恆定域。嵌合抗FcRH5 (13G9)抗體另外包含SEQ ID NO:之重鏈（圖8)，其包含人類IgGl之恒定域。「抗cynoFcRH5」或「抗cyno FcRH5」在本文中用於指結合於cynoFcRH5之抗體。「13G9移植物」或「移植13G9之『人類化』抗體」或「hul3G9移植物」在本文中用於特指藉由將鼠類13G9抗 FcRH5抗體（MA7D11)之高變區移植於具有R71A、N73T及 L78A之受者人類共同VL κ I(huKI)及人類亞群III共同 VH(huIII)(Carter等人，iVoc. Α/α". Jcad. t/M，89:4285 (1992))(參見實例部分1及圖9-12)中產生的移植物。 147375.doc •28- 201039846 hul3G9 J 或「hul3G9 vl」或「hul3G9 v3」或「hUl3G9 V8」在本文中用於特指人類化13G9抗體。本文所用之對胺基酸殘基/位置之「修飾」係指相較於起始胺基酸序列，主要胺基酸序列的f化，其巾該變化由涉及該等胺基酸殘基/位置之序列變化產生。舉例而言，典型修飾包括用另一胺基酸取代該殘基（或在該位置取代該殘基）（例如保守性或非保守性取代）、鄰近於該殘基/位置插入一或多個（一般少於5個或3個）胺基酸及缺失該殘基/ 位置。「胺基酸取代」或其變化係指用不同胺基酸殘基置換預定（起始）胺基酸序列中之現有胺基酸殘基。一般而言且較佳，相較於包含起始（或「野生型」）胺基酸序列的多狀’修餘使變異多肽之至少一種物理生物化學活性改變。舉例而a，在抗體情況下’改變之物理生物化學活性可為對標靶分子之結合親和力、結合能力及/或結合作用。術§吾「抗體」在最廣泛意義上使用且特別涵蓋例如單一 0 抗FcRH5單株抗體（包括促效劑、拮抗劑、中和抗體、全長或完整單株抗體）；由至少兩個完整抗體形成的具有多抗原決定基特異性之抗FcRH5抗體組合物、多株抗體、多價抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體，只要其展現所需生物活性即可）；單鏈抗FcRH5抗體及抗FcRH5抗體之片段（參見下文）’包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體、單域抗體（sdAb)，只要其展現所需生物或免疫活性即可。術語「免疫球蛋白」（Ig)可與本文之抗體互換使用。抗體可為人類、人類化及/或親和力成熟抗體。 147375.doc -29- 201039846 術語「抗FcRH5抗體」或「結合於FcRH5之抗體」係指抗體能夠以足夠親和力結合FcRH5以使得抗體適用作靶向中之診斷劑及/或治療劑。舉例而言，如放射免疫分析法（RIA)所測量，抗FcRH5抗體結合於不相關非FcRH5蛋白之程度較佳為抗體結合於FcRH5之不到約10%。在某些實施例中，結合於FcRH5之抗體的解離常數（Kd)^l μΜ、 S100 ηΜ、幺10 ηΜ、<1 ηΜ或幺0.1 ηΜ。在某些實施例中，抗FcRH5抗體結合於FcRH5之在不同物種之FcRH5中保守的抗原決定基。「分離之抗體」為已鑑別且自自然環境之組分分離及/ 或回收的抗體。其自然環境之污染組分為將會干擾抗體之治療用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中’抗體將被純化：（丨）至如由勞立法（Lowry method)所測定之大於95重量％抗體，且最佳大於99重量％ ; (2)至足以藉由使用旋杯式定序儀獲得 N末端或内部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或至藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍 (C〇〇massieblue)或較佳銀染色得知之均質性。分離之抗體包括重組細胞内之原位抗體，此係因為抗體之自然環境中之至少-個組分將不會存在。然而，4常將藉由至少一個純化步驟來製備分離之抗體。基本4鏈抗體單元為雜四聚聽蛋白，其由兩條相同卻 ⑹鏈及兩條相同之重（H)鏈構成（响抗體由基本雜四聚體單元以及另-稱作m之多肽5賴成，且因此含有1〇個抗 147375.doc •30- 201039846 原結合位點’而分泌之IgA抗體可聚合形成多價組合，其包含2-5個基本4鏈單元以及J鏈）。在IgG之情況下，4鏈單元一般為約150,000道爾頓（dalton)。各L鏈藉由一個共價二硫鍵連接於Η鏈，而兩條Η鏈視Η鏈同型而定藉由一或多個二硫鍵彼此連接。各Η鏈及L鏈亦具有規則間隔之鏈内二硫橋。各Η鏈在Ν末端具有一個可變域（VH)’繼而三個恒定域（CH)(對於各α及γ鏈）及四個CH域（對於μ及ε同型）。各L鏈在Ν末端具有一個可變域（Vl)，繼而在其另一末端具有一個恆定域（CL)。VL與VH對準，且CL與重鏈之第一恆定域 (CH1)對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。vH與vL —起配對形成單一抗原結合位點。關於不同類別抗體之結構及特性，例如參見Basic and Clinical Immunology, 第 8版，Daniel P. Stites，Abba I.

Terr 及 Tristram G. Parslow (編），Appleton & Lange， Norwalk，CT，1994，第 71頁及第 6章。來自任何脊椎動物物種之L鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而歸屬於兩個明顯不同之類型（稱作尺及λ)中之一。視其重鏈（CH)恆定域之胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸屬於不同類別或同型。存在五類免疫球蛋白：IgA、lgD、 IgE、IgG及IgM ’其分別具有稱作α、δ、ε、γ及μ之重鍵。 γ及α類基於cH序列及功能之相對微小差異進一步分成亞類’例如’人類表現以下亞類：IgG1、IgG2、IgG3、

IgG4、IgAl及igA2。抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈之 147375.doc -31- 201039846 胺基末端域。看处 σ變域可稱作「VH」。輕鏈可變域可稱作1 VL」。今笼0 5 般為抗體之最可變部分且含有抗原結合位點。 ' '13 術語「可. 一」你祛抗體中可變域之某些區段的序列廣泛不同域)1導&原結合且限定特定抗體對其特定抗原之、 …、:而’可變性並非均勻分佈於跨越可變域之i i 〇個胺基酸上。實恃氐 Λ7Γ~丄貝馆為’ V區由相對不變之15_30個胺基酸的 I伸片玟(稱作構架區r FR」）組成，該等延伸片段經具有極大可變性之長度各為9-12個胺基酸的較短區（稱作「高變區」）刀隔。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個主要採用β-摧疊構型且藉由三個高變區連接之FR，該三個高變區形成連接β-摺疊結構且在一些情況下形成卩摺疊結構之一部分的環。各鏈中之高變區藉由FR緊密近接地結合在一起’且與另一鏈之高變區一起促使形成抗體之抗原結合位點（參見 Kabat 專人 Sequences of Proteins of Immunological

Interest，弟 5版 ’ pubiic Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD· (1991))。恆定域並不直接參與抗體與抗原之結合’但展現出各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。「完整」抗體為包含抗原結合位點以及及至少重鏈恆定域（CH1、CH2及CH3)之抗體。恆定域可為天然序列恆定域（例如人類天然序列恆定域）或其胺基酸序列變異體。完整抗體較佳具有一或多種效應功能。出於本文之目的之「裸抗體」為尚未結合於細胞毒性部 147375.doc •32- 201039846 分或放射性標記的抗體。「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab，、 F(ab·)2及Fv片段；雙功能抗體·，線性抗體（參見美國專利第 5,641,870 號’實例 2 ; Zapata #APr〇teinEng.8(10): 1057-1062 [1995]);單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且從而保留結合抗原之能力。〇木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個稱作「Fab」片段之相同抗原結合片段，及殘餘「F c」片段，該名稱反映易於結晶之能力。Fab片段由完整L键以及Η鏈可變區域（vH)及一條重鏈之第一恆定域（CH1)組成。各Fab片段對於抗原結合為單價，亦即其具有單一抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體產生單一大F(ab，）2片段，其大致對應於兩個具有二價抗原結合活性之經二硫基連接之Fab片段且仍能夠交聯抗原。〇 Fab’片段與Fab片段之不同之處在於Ch1域之羧基末端具有少數其他殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸》Fab’-SH為本文中Fab'的名稱，其中恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫氫基。F(ab，)2抗體片段最初係以之間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對形式產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。

Fc片段包含兩條Η鏈之藉由二硫基結合在一起的缓基末端部分。抗體之效應功能由Fc區中之序列決定，該區亦為存在於某些細胞類型上之FC受體（FCR)識別之部分。 147375.doc -33- 201039846 「Fv」為含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片ί又由一個重鏈可變區域與一個輕鏈可變區域緊密非共價結合之二聚體組成。在單鏈Fv(seFv)物質中，一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域可藉由可撓性肽連接子共價連接’以使輕鏈與重鏈可以類似於雙鏈Fv物質中之「二聚」結構結合。此兩個域摺疊產生六個高變環（H鏈及L鏈各3個環），其提供用於抗原結合之胺基酸殘基，且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變域（或僅包含特異於抗原之三個CDR的一半Fv)亦具有識別及結合抗原之能力’但親和力低於完整結合位點。「單鍵Fv」（亦簡寫為「sFv」或「scFv」）為包含連接於單一多肽鏈中之VH及VL抗體域的抗體片段。sFv多肽較佳在VH與VL域之間另外包含使SFV能夠形成抗原結合所需結構之多肽連接子。關於sFv之評述，參見Pluckthun，The

Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York ’ 第 269-315 頁（1994); Borrebaeck 1995(下述）。術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈（VH-VL)中連接於輕鏈可變域（VL)的重鏈可變域（VH)。藉由在Vh域與VL域之間用短連接子（約5-10個殘基）構築sFv片段（參見前段）使得v 域鏈間而非鏈内配對來製備小抗體片段’產生二價片段 (亦即具有兩個抗原結合位點之片段）。雙功能抗體可為二價抗體或雙特異性抗體。雙特異性雙功能抗體為兩個「交 147375.doc -34- 201039846 又」sFv片段之雜二聚體，其中兩個抗體之vH域及Vl域存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體更全面地描述於例如Ep 404,097; WO 93/01161 ; Hudson等人胸Md. 9:129-134 (2003);及 Hollinger 等人 proc. Natl. Acad. Sci· USA， 90:6444-6448 (1993)中。三功能抗體及四功能抗體亦描述於 Hudson等人Λ/e¢/. 9:129-134 (2003)中。如本文所使用之術語「單株抗體」係指獲自一群實質上均質之抗體的抗體，亦即構成該群之個別抗體除可少量存在之可能天然存在之突變以外為相同的。單株抗體為針對單一抗原位點之高度特異性抗體。此外，與包括針對不同決定子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑相比，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。除其特異性以外，單株抗體之有利之處在於其可經合成而未被其他抗體污染。修飾sf「單株」不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言’適用於本發明之單株抗體可藉由最先由 ❹ Kohler等人Nature，256:495 (1975)描述之融合瘤方法來製備，或可使用重組DNA方法在細菌、真核動物或植物細胞中製備（例如參見美國專利第4,816,567號）。「單株抗體」亦可例如使用 Clackson 等人 Nature, 352:624-628 (1991)及 Marks等人，j. Mol. Biol.，222:581-597 (1991)中所述之技術自噬菌體抗體庫（libraries)分離。本文之單株抗體包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之—部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體的相應序列一致或同源，而該（等）鏈之其餘部分與源 I47375.doc -35· 201039846 自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現出所需生物活丨生即了（參見美國專利第4,816,567號；及Morrison等人

Proc. Natl. Acad. Sci· USA，81:6851-6855 (1984))。本文所關注之嵌合抗體包括包含源自非人類靈長類動物（例如舊大陸猴（Old World Monkey)、猿（Ape)等）之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列的「靈長類化」抗體。非人類（例如齧齒動物）抗體之「人類化」形式為含有源自非人類抗體之最小序列的嵌合抗體。人類化抗體大部分為以下人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中接受者之高變區殘基經來自非人種（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物）高變區（供者抗體）之具有所需抗體特異性、親和力及能力的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區（FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含不存在於接受者抗體或供者抗體中之殘基。進行該等修飾以進一步改進抗體之效能。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環’且所有或實質上所有FR為人類免疫球蛋白序列之 FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白值定區（fc)2 至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之恆定區（Fc)之至少一部分。更多詳情參見Jones等人Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人 Nature 332:323-329 (1988);及 Presta，Curr. Op· Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。亦參見 147375.doc -36- 201039846 以下評述文章及其中所引用之參考文獻：Vaswani及 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998) i Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995) ; Hurie及Gross, Cwrr. Op. 5:428-433 (1994)。「Thio」當在本文中用於指抗體時係指經半胱胺酸工程改造之抗體，而「hu」當在本文中用於指抗體時係指人類化抗體。「人類抗體」為胺基酸序列對應於人類所產生之抗體的胺基酸序列及/或已使用本文所揭示之製備人類抗體之任何技術所製備的抗體。此人類抗體之定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之不同技術（包括噬菌體呈現庫）產生。 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:3 81 (1991); Marks等人J. Mo/·价〇/·, 222:581 (1991)。亦可用於製備人類單棟抗體之方法描述於Cole等人Mo/ioc/cma/ J and Cancer Alan R. Liss，第 77 頁（1985);

Boerner 等人 J. /www«o/·，147(1):86-95 (1991)中。亦參見 Dijk 及 van de Winkel, Curr. Op in. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)。可藉由向轉殖基因動物投與抗原來製備人類抗體，其中該轉殖基因動物經修飾以回應於抗原攻毒產生該等抗體，但其内源基因座已失能，例如經免疫異種移植小鼠（xenomice)(關於術例如參見美國專利第6,075,181號及第6，150,5 84號）。關於經由人類1細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦例如參見Li等人iVoc. iVai/. Xcad. 147375.doc -37- 201039846 &ζ·. t/α, 103:3557-3562 (2006)。術語「高變區」、「HVR」或「HV」當在本文中使用時係指抗體可變域中序列高變及/或形成結構明確之環的區域。一般而言，抗體包含六個高變區；三個在VH(H1、 H2、H3)中且三個在VL(L1、L2、L3)中。本文中使用且涵蓋多種高變區描繪。Kabat互補決定區（CDR)係基於序列可變性且最常使用（Kabat等人☆《wewces· ο/' Proie/wj 〇/ Immunological /WereW，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。 Chothia另外指出結構環之位置（chothia及Lesk «/. Mo/. 价〇/. 196:901-917 (1987))。當使用Kabat編號規定編號時，視環長度而定，Chothia CDR-H1環之末端在H32與 H34之間變化（此係因為Kabat編號方案將插入物放置於 H35A及H35B處；若35A與35B均不存在，則環在32處封知，右僅存在35A，則環在33處封端，若35A與35B均存在，則環在34處封端）。AbM高變區表示Kabat CDR與 Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM antibody模擬軟體使用。「接觸」高變區係基於對可用複雜晶體結構之分析。該等南變區各自之殘基如下所示。環 Kabat AbM Chothia 接觸 L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96 147375.doc -38 201039846 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34 H30-H35B (Kabat編號） H1 H31-H35 H26-H3 5 H26-H32 H30-H35 (Chothia編號） H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101 高變區可包含如下「延伸之高變區」：VL中之24-36或 24_34(L1)、46-56 或 50_56(L2)及 89-97(L3)，及 VH 中之 26-O 35B(H1)、50-65、47_65 或 49-65(H2)及 VH 中之 93-102、94-102或95-102(H3)。可變域殘基係根據Kabat等人（前述）編號以用於各個該等定義。「構架」或「FR」殘基為除本文中所定義之高變區殘基以外的彼等可變域殘基。術語「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化係指Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版。Public Health

G

Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)中編譯抗體時用於重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用該編號系統，實際的線性胺基酸序列可含有更少或額外胺基酸，對應於縮短可變域之FR或CDR或插入可變域之FR或CDR中。舉例而言，重鏈可變域可包括H2之殘基52之後的單個胺基酸插入物（根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82之後插入之殘基（例如根據Kabat之殘基 82a、82b及82c等）。可藉由將既定抗體之序列同源區與 147375.doc -39· 201039846 「標準」Kabat編號序列比對而確定該抗體之殘基的Kabat 編號。當提及可變域中之殘基（大致為輕鏈之殘基1-1〇7及重鏈之殘基1 -113)時通常使用Kabat編號系統（例如Kabat等人 SegMewces 〇/ /wmw«o/〇g/ca/ /如,第 5 版，Public

Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (199 1))。當提及免疫球蛋白重鏈怪定區中之殘基時一般使用「EU編號系統」或「EU索引」（例如Kabat等人（前述）中所報導之EU索引）。「如Kabat中之EU索引」係指人類igG1 EU抗體之殘基編號。除非另外說明，否則在本文中提及抗體可變域中之殘基編號意謂藉由Kabat編號系統進行之殘基編號。除非另外說明，否則在本文中提及抗體恆定域中之殘基編ϊ虎，¾明藉由EU編號系統進行之殘基編號（例如參見美國臨時申請案第60/640,323號，EU編號圖）。「親和力成熟」抗體為一或多個HVR中具有一或多個可使抗體對抗原之親和力改良之變化的抗體（相較於不具有彼等變化之親本抗體）。較佳親和力成熟抗體將對標乾抗原具有奈莫耳（nanomolar)或甚至皮莫耳（picorn〇lar)親和力。可藉由此項技術中已知之程序產生親和力成熟抗體。

Marks 等人价10:779-783 (1992)描述藉由 vh 及VL域改組達成之親和力成熟。HVR及/或構架殘基之隨機突變誘發描述於Barbas等人尸roc dead 5^/， 91:3809-3813 (1994) ; Schier 等人 Gae 169:147-155 (1995) ; Yelton 等人 */· 7>www«o/. 155:1994-2004 (1995); 147375.doc -40- 201039846

Jackson等人X /mmw«o/· 154(7):3310-9 (1995);及Hawkins 等人/· Mo/· 226:889-896 (1992)中。「阻斷」抗體或「拮抗」抗體為抑制或降低所結合之抗原生物活性的抗體。較佳阻斷抗體或拮抗抗體實質上或完全抑制抗原之生物活性。如本文所使用之「促效抗體」為模擬所關注多肽之至少一種功能活性的抗體。

❹ 物種依賴性抗體」（例如哺乳動物抗人類IgE抗體）為對來自第一哺乳動物物種之抗原相較於對來自第二哺乳動物物種之該抗原之同源物具有較強結合親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體「特異性結合」於人類抗原（亦即結合親和力（Kd)值為不超過約lxl0-7 M，較佳不超過約ΐχΐ〇-8. Μ)，但對來自第二非人類哺乳動物且最佳不超過約1 X 1 〇·9 物種之該抗原之同源物的結合親和力為其對人類抗原之結合親和力的至少約"50或至少約劃或至少約ι/ι〇〇〇。：種依賴性抗體可為如上所定義之各種抗體中之任—者，但較佳為人類化或人類抗體。「結合親和力」通常係指分子（例如抗體）之單—結合位點與其結合搭配物(例如抗原)間之非共價相互作用的強产總和。除非另外表明，否則如本文所用之「結合親和力又係指反映結合對成員（例如抗體與抗原）之間Η相互作㈣固有結合親和力。分子χ對其搭配物γ之親和力—般可由 =括(Γ)表示。親和力可藉由此項技術中已知之通用 (本文所述方法询量。低親和力抗體-般緩慢地 147375.doc •41- 201039846 結合抗原且趨向於易於解離’而高親和力抗體-般較快地結合抗原且趨向於保持較長時間結合。此項技術中已知多種測量結合親和力之方法，該等方法中之任-者均可用於本發明之目的。下文將描述特定說明性實施例。或更佳」當在本文中用於指結合親和力時係指分子與其結合搭配物之間的更強結合。「或更佳」當在本文中用、於指更強結合時由較小值表示。舉例而言，若抗體對抗原之親和力為「.6樣或更佳」，則該抗體對該抗原之親和力為<·6 ηΜ，亦即·59 ηΜ、·58 ηΜ、·57 ηΜ等，或小於·6 ηΜ之任何值。在貫鉍例中，如藉由在滴定系列之未標記抗原存在下用最小濃度之（125ι)標記之抗原平衡Fab、隨後用塗有抗Fab 抗體之板捕捉結合之抗原來測量Fab對抗原之溶液結合親和力的以下分析法所述，藉由用Fab型式之所關注抗體及其抗原執行經放射性標記之抗原結合分析法（RIA)來測量本發明之「Kd」或「Kd值」（Chen等人（1999) J. Mo/別〇/ 293:865-881)。為建立分析條件，用5〇 mM碳酸鈉（pH 9.6) 中之5 pg/ml捕捉抗Fab抗體（Cappel Labs)塗佈微量滴定板 (Dynex)隔夜，且隨後在室溫下（約23°c )用pBS中之2〇/〇 (w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在無吸附板（Nune #269620)中’將100 pM或26 pM [1251]-抗原與所關注Fab之連續稀釋液混合（例如與抗VEGF抗體Fab-12之評定相一致，Presta等人（1997) 57:4593-4599)。隨後培育所關注之Fab隔夜；然而，培育可持續更長時段（例如約 147375.doc -42- 201039846 65小時）以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉板在室溫下培育（例如1小時）。隨後移除溶液且用PBS中之 0.1% Tween-20洗滌培養板八次。在培養板已乾燥時，每孔添加 150 μΐ 之閃爍體（MicroScint_20; Packard)，且在 Topcount γ計數器（Packard)上對培養板計數十分鐘。選擇獲得小於或等於20%最大結合的各Fab濃度用於競爭性結合分析法。根據另一實施例，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM- f% ^ 3000(BIAcore，Inc·，Piscataway, NJ)，使用表面電漿共振分析法，在25°C下，用約10個反應單位（RU)之經固定抗原 CM5晶片測量Kd或Kd值。簡言之，根據供應商之說明書，用ΛΓ-乙基W-(3-二曱胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽 (EDC)及，羥基丁二醯亞胺（NHS)活化羧基甲基化之聚葡萄糖生物感應器晶片（CM5，BIAcore，Inc.)。用10 mM乙酸鈉（ρH4.8)稀釋抗原至5μg/ml(約0.2μM)，隨後以5μl/min 之流速注射，獲得約1 〇個反應單位（RU)之偶合蛋白。注射 ❹ 抗原之後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應之基團。為進行動力學測量，在25°C下用約25 μΐ/min之流速注射於含 0.05% Tween 20(PBST)之PBS中的Fab之兩倍連續稀釋液 (0.78 nM至500 nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型 (one-to-one Langmuir binding model, BIAcore Evaluation軟體3.2型）藉由同時擬合締合及解離感應圖計算締合速率 (kon)及解離速率。平衡解離常數（Kd)以比率kcff/Ut 算。例如參見 Chen，Υ·等人（1999) ·/. Afo/ 价〇/ 293:865- 147375.doc •43 - 201039846 881。若藉由上述表面電漿共振分析法獲得之缔合速率超過106 S·1 ’則可藉由使用螢光淬滅技術測定締合速率，如光譜儀（諸如具有攪拌式紅色比色管之止流裝備型光譜儀（Aviv lnstruments)或 8〇〇〇系列 SLM Aminc〇分光光度計（ThermoSpectronic))所測量，該螢光淬滅技術測量 25C下，在濃度增加之抗原存在下，pBS(pH 72)中之 nM抗抗原抗體（Fab形式）之螢光發射強度（激發=295 nm ; 發射=340 nm，Ιό nm帶通）的增加或減少。本發明之「締合速率」或「k()n」亦可如上所述用上述相同表面電衆共振技術使用BIAc〇reTM_2〇〇〇或BiAc〇reTM_ 3000(BIAcore，Inc·，Piscataway，NJ)測定。如本文所用之短語「實質上類似」或「實質上相同」表示兩個數值之間足夠高的類似程度（一般一數值與本發明之抗體相關且另一數值與參考/對比抗體相關），使得熟習此項技術者認為兩個值之間的差異在由該等值（例如尺<1值）所估量之生物學特徵情形内具有極小生物學及/或統計顯著性或無生物學及/或統計顯著性。該兩個值之間的差異隨參考/對比抗體之值變化較佳小於約50%，較佳小於約 40%，較佳小於約3〇%，較佳小於約2〇%，較佳小於約 10%。如本文所用之短語「實質上減少」或「實質上不同」表示兩個數值之間足夠高之差異程度（一般一數值與本發明之抗體相關且另一數值與參考/對比抗體相關），使得熟習此項技術者認為兩個值之間的差異在由該等值（例如Kd 147375.doc •44- 201039846 值，HAMA反應）所估量之生物學特徵情形内具有統計顯著性。該兩個值之間的差異隨參考/對比抗體之值變化較佳大於約10°/。’較佳大於約20%，較佳大於約3〇%，較佳大於約40%，較佳大於約50〇/〇。「抗原」為抗體可選擇性結合之預定抗原。標靶抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或另一天然存在或合成之化合物。標靶抗原較佳為多肽。〇出於本文之目的之「受者人類構架」為包含源自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之VL或VH構架之胺基酸序列的構木。源自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之受者人類構架可包含其相同胺基酸序列或其可含有原有胺基酸序列變化。若存在原有胺基酸變化，則較佳存在不超過5個且較佳4個或更少或3個或更少原有胺基酸變化。若VH中存在原有胺基酸變化，則彼等變化較佳僅存在於位置71Η 73Η及78H中之三處、兩處或一處；例如彼等位〇置處之胺基酸殘基可為71八、73ΤΑ/或78Α。在一實施例中，VL受者人類構架的序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。人類共同構架」為代表在人類免疫球蛋白VL或VH構 :序列之選擇中最常存在之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VI-”H序列的選擇係自可變域序列之亞群進行。—般而言，該序列之亞群為如Kabat等人中之亞群。在-實施例中，對於vl，亞群為如κ细等人中之亞群κΐ。在—實施例中，對於vh，亞群為如K细等人 147375.doc -45- 201039846 中之亞群in。「VH亞群III共同構架」包含獲自Kabat等人之可變重鏈亞群III中胺基酸序列的共同序列。在一實施例中，VH亞群III共同構架胺基酸序列包含各以下序列之至少一部分或： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO: 14)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO: 15)-H2-RFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO: 16)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17)。「VL亞群I共同構架」包含獲自Kabat等人之可變輕鏈κ 亞群I之胺基酸序列的共同序列。在一實施例中，VL亞群I 共同構架胺基酸序列包含各以下序列之至少一部分或全部： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 43)-Ll-WYQQKPGKAPK LLIY (SEQ ID NO: 44)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 45)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 46)。「未修飾之人類構架」為具有與受者人類構架相同之胺基酸序列的人類構架，例如受者人類構架中無人類胺基酸取代為非人類胺基酸。出於本文之目的之「改變之高變區」為包含一或多個 (例如1至約16個）胺基酸取代的高變區。出於本文之目的之「未修飾之高變區」為與獲得其之非人類抗體具有相同胺基酸序列的高變區，亦即其中無一或多個胺基酸取代的高變區。「結合」所關注抗原（例如腫瘤相關之多肽抗原標把）之 147375.doc -46· 201039846 t體為以足夠親和力結合抗原以使抗體適用作靶向表柷原之細胞或組織之治療劑且不與其他蛋白質顯著交又應的抗體。在省: Ο 〇 4實關中，如螢光活化細胞分選（FACS) η…射免疫沈澱（RIA)所測定，抗體與「非標靶」蛋白之結合程度應為抗體與其特定絲蛋白之結合的不到 1〇%。對於抗體與㈣分子之結合，術語「特異性結合、或「特異性結合於」或「特異於」特定多肽或特定多二標 =上之抗原岐基意謂顯著不同於非特異性相互作用的: 合。特異性結合可例如藉由測定相較於對照分子（其一般為具有類似結構且不具有結合活性的分子）之結合的分子之結合來測量。舉例而言’特異性結合可藉由用類似於標乾之對照分子（例如過量非標記標乾）競爭來測定。在此情況下，若經標記標靶與探針之結合受過量未標記標靶競； I·生抑亲J貝’j表明特異性結合。本文所用之術語「特異性結合」或「特異性結合於」或「特異於」特定多狀或特定多肽^靶上之抗原決定基可例如由對該標靶之^^為至少約 i〇_4m、或者至少約10-5M、或者至少約ι〇_6μ、或者至少約ιο_7μ、或者至少約10·8Μ、或者至少約1〇-9μ、或者至 >'、力10 Μ、或者至少約10 u Μ、或者至少約10-丨2 Μ或更大的分子展現。在一實施例中，術語「特異性結合」係指如下結合：其中分子結合於特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而不會實質上結合於任何其他多肽或多肽抗原決定基。抑制表現FcRH5多狀之腫瘤細胞的生長」的抗體或 147375.doc •47- 201039846 生長抑制性」抗體為引起表現或過度表現適當多肽之癌細胞可測量之生長抑制的抗冑。FcRH5多狀可為表現於癌細胞表面上之跨膜多肽或可為癌細胞產生及分泌之多肽相較於適當對照組，較佳生長抑制性抗FcRH5抗體使表現FcRH5之腫瘤細胞的生長抑制大於2〇% ,較佳約 20Λ至約50/〇’且甚至更佳大於5〇%(例如約％%至約 1〇〇%)，該對照組通常為未用測試抗體處理之腫瘤細胞。在一實施例中，在約（^至儿^/ml或約〇5 ηΜ至2〇〇 ηΜ2 抗體濃度下細胞培養物中可測量到生長抑制，纟中在使腫瘤細胞暴露於抗體之後Η〇日測得生長抑制。活體内腫瘤細胞之生長抑制可以多種方式敎，諸如下文實驗性實例部分中所述之方式。若投與每公斤體重約i阳至每公斤體重約100 mg抗FcRH5抗體在首次投與抗體約5日至3個月内較佳約5日至30日内使腫瘤尺寸或腫瘤細胞增殖減少，則該抗體在活體内具有生長抑制性。誘心細胞凋亡」之抗體為如藉由磷脂結合蛋白V之結合、DNA之斷裂 '細胞萎縮、内質網之膨脹、細胞破碎及/ 或膜囊（稱作細胞凋亡體）之形成所確定誘發漸進式細胞死亡的抗體。細胞通常為過度表現以]^15多肽之細胞。細胞較佳為腫瘤細胞，例如造血細胞，諸如B細胞、τ細胞、嗜鹼性球、嗜伊紅血球、_中性白血球、單核細胞、血小板或紅血球。各種方法可用於評估與細胞凋亡相關之細胞事件舉例而5，可藉由磷脂結合蛋白結合來測量磷脂醯絲胺酸（PS)易位；可經由DNA梯（DNA iaddering)w估DNA斷 147375.doc •48- 201039846 裂；且可藉由亞二倍體細胞之任何增加評估核/染色質濃縮以及DNA斷裂。較佳地，誘發細胞凋亡之抗體為在磷脂、’、。s蛋白結合分析法中導致磷脂結合蛋白結合之誘發相對於未處理之細胞為約2至50倍、較佳約5至5〇倍且最佳約1〇至50倍的抗體。誘發細胞死亡」之抗體為使活細胞變為非活細胞之抗體。細胞為表現FcRH5多肽且具有特異性表現或過度表現 FCRH5多肽之細胞類型的細胞。細胞可為特定細胞類型之癌性或正常細胞。FcRH5多肽可為表現於癌細胞表面上之跨膜多肽或可為癌細胞產生及分泌之多肽。細胞可為癌細胞，例如B細胞或T細胞。活體外細胞死亡可在無補體及免疫效應細胞的情況下測定以區別抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)或補體依賴性細胞毒性（CDC)誘發之細胞死亡。因此，可使用熱滅活血清（亦即在無補體的情況下）及在無免疫效應細胞的情況下執行細胞死亡分析法。為判定 Q 抗體是否能夠誘發細胞死亡，可相對於未處理細胞評定膜元整性之喪失，膜元整性之喪失係藉由碘化丙錠（pi)、錐蟲藍（trypan blue)(參見 M〇〇re 等人 Cytotechnology 17:1-11 (1995))或7AAD之吸收來評估。較佳誘發細胞死亡之抗體為在PI吸收分析法中誘發BT474細胞中pi吸收的抗體。抗體「效應功能」係指彼等可歸因於抗體之以區（天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區）且隨抗體同型而變化的生物活性。抗體效應功能之實例包括：C1 q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞 147375.doc -49· 201039846 毒性（ADCC);吞噬作用；下調細胞表面受體（諸如B細胞受體）；及B細胞活化。本文之術語「Fc區」係用於定義免疫球蛋白重鏈之c末端區’包括天然序列Fc區及變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區之邊界可能變化，但人類1§0重鏈Fc區通常定義為自Cys226位置處胺基酸殘基或自Pr〇23〇延伸至其叛基末端。Fc區之C末端離胺酸（根據Ευ編號系統之殘基447)例如可在抗體產生或純化期間或藉由重組工程改造編碼抗體重鏈之核酸而移除。因此，完整抗體之組合物可包含移除所有K447殘基之抗體群、未移除K447殘基之抗體群及具有有無K447殘基之抗體混合物的抗體群。「功能性Fc區」具有天然序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括C1 q結合；CDC ; Fc受體結合； ADCC ;吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受體；BCR) 下調等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域（例如抗體可變域）組合且可使用例如本文定義中所揭示之各種分析法評定。「天然序列Fc區」包含與存在於自然界中之Fc區的胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgGl Fc區（非A及A異型）；天然序列人類IgG2 Fc 區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。「變異Fc區」包含由於至少一個胺基酸修飾、較佳一或多個胺基酸取代而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列。較 147375.doc •50- 201039846 佳地，相較於天然序列Fc區或親本多肽之Fcg，變異fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中具有約一個至約十個胺基酸取代，且較佳約一個至約五個胺基酸取代。本文之變異Fc區較佳與天然序列Fc區及/或親本多肽FC區具有至少約8〇0/〇之同源性，且最佳與其具有至少約90%之同源性，更佳與其具有至少約 95%之同源性。「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或r ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中所分泌之結合於某些細胞毒性細胞（例如自然殺手（NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞）上所存在Fc受體（FcR)的Ig使得該等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合於具有抗原之標靶細胞且隨後用細胞毒素殺滅該標靶細胞。抗體「裝備」該等細胞毒性細胞，且絕對為該殺滅所需《介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcYRI、Fcyrii&FcyRIII。FcR在造血細胞上之表現概括於Ravetch and Kinet，Annu. Rev· Immunol. 9.457-92 (1991)之第464頁之表3中。為評定所關注分子的 ADCC活性，可執行活體外ADCC分析法，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述之分析法。該等分析法之有用效應細胞包括周邊血液單核細胞（pBMC)及自然殺手（NK)細胞。或者或另外，例如可在動物模型（諸如 Clynes等人（USA) 95:652_656 (1998)中所揭示之動物模型）中活體内評定所關注分子之ADCC活性。「Fc受體」或「FcR」描述結合於抗體以區之受體。較 147375.doc •51- 201039846 佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體的FcR(y受體）且包括FcyRI、FcyRII及FqRin亞類之受體’包括此等受體之對偶基因變異體及替代性拼接形式。 FcyRII受體包括FcyRIIA(「活化受體」）及FcyRIIB(「抑制受體」）’其具有類似胺基酸序列，主要在其細胞質域不同。活化受體FcyRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體赂胺酸之活化基元（ITAM)。抑制受體fcyRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元（ITIM)。（參見 Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)中之評述）。FcR 評述於 Ravetch 及Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) ; Capel 等人 Immunomethods 4:25-34 (1994) ;及 de Haas 等人 J· Lab. Clin· Med· 126:330-41 (1995) 中。本文之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括有待於將來鑑別出之FcR。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒（Guyer等人J. Immiino丨.117:587 (1976)及 Kim等人 J. Immunol. 24:249 (1994))。舉例而言可在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染人類細胞株中、或在投與具有變異Fc區之多肽的靈長類動物中分析活體内與人類FcRn之結合及人類FcRn高親和力結合多肽之血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述與FcR 之結合經改良或削弱之抗體變異體。亦例如參見Shields等人/.价〇/. C/zem. 9(2):6591-6604 (2001)。「人類效應細胞」為表現一或多個FcR且執行效應功能之白血球。該等細胞較佳至少表現FcyRIII且執行ADCC效 147375.doc •52- 201039846 .應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括周邊血液單核細胞（PBMC)、自然殺手（NK)細胞 '單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球；其中pBMC及NK細胞較佳。效應細胞可自天然來源（例如血液）分離。「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下標靶細胞溶解。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第一組分（C1 q)結合於與其同源抗原結合之（適當亞類）抗體而起始。為評定補體活化，可執行例如如Gazzano_Santoro等〇人 J. Immunol. Methods 202:163 (1996)中所述之 CDC 分析法。具有改變之Fc區胺基酸序列的多肽變異體（具有變異 Fc區之多肽）及增強或降低之c 1 q結合能力的多肽變異體描述於例如美國專利第6,194,55 1 B1號及WO 1999/51642中。亦例如參見 Idusogie 等人《/. 164: 4178-4184 (2000)。術語「含Fc區抗體」係指包含Fc區之抗體。Fc區之C末端離胺酸（根據EU編號系統之殘基447)例如可在抗體純化

U 期間或藉由重組工程改造編碼抗體之核酸而移除。因此，本發明之包含具有Fc區之抗體的組合物可包含具有K447之抗體、移除所有K447之抗體或有無K447殘基之抗體混合物。

FcRH5多肽「細胞外域」或「ECD」係指一種FcRH5多肽形式，其基本上不含跨膜及細胞質域。通常，FcRH5多肽ECD應具有小於1%之該等跨膜及/或細胞質域，且較佳應具有小於0.5%之該等域。應瞭解，對本發明之FcRH5多 147375.doc -53· 201039846 肽鑑別出的任何跨膜域係減此項技射f規用於鑑別此類疏水域之標準鑑別。跨膜域之精確邊界可能改變，但在如本文最初鑑別之域的任—末端很可能改變不肖過約⑽ 胺基酸。因此，視情況’ FcRH5多肽之細胞外域在如實例或說明書中所鑑別出之跨膜域/細胞外域邊界之任一側可含有約5個或更少胺基酸，且本發明涵蓋該等有或無相關 1吕號肽之多肽及編碼該等多肽之核酸。本文所揭示FcRH5多肽之「信號肽」的近似位置可展示於本說明書及/或附圖中。然而，請注意，信號肽之c末端邊界可能改變，但在如本文最初鑑別之信號肽c末端邊界之任一側很可能改變不超過約5個胺基酸，其中信號肽之C 末端邊界可根據此項技術中常規用於鑑別此類胺基酸序列成分的標準鑑別（例如Nielsen等人Pr〇t· Eng. 10:1_6 (1997) 及 von Heinje 等人 Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986))。此外，亦應認識到，在一些情況下，所分泌多肽之信號序列的裂解並不完全均勻，產生一種以上所分泌物質。本發明涵蓋此等成熟多肽，其中信號肽在如本文所鑑別信號肽之C末端邊界的任一側裂解不超過約5個胺基酸，及編碼該等多肽之聚核苷酸。「FcRH5多肽變異體」意謂如本文所定義之與以下具有至少約80°/。胺基酸序列一致性的fcRH5多肽、較佳活性 FcRH5多肽：本文所揭示之全長天然序列Fcrh5多肽序列本文所揭不之無彳s说狀的FcRH5多狀序列、本文所揭示之有或無信號肽的FcRH5多肽細胞外域或本文所揭示之 147375.doc -54- 201039846 全長FcRH5多肽序列的任何其他片段（諸如僅代表全長 FcRH5多肽之完整編碼序列之一部分的核酸所編碼的片段）。該等FcRH5多肽變異體包括例如在全長天然胺基酸序列之N末端或C末端添加或缺失一或多個胺基酸殘基的多肽。通常，：FeRH5多肽變異體應與以下具有至少約80%胺基酸序列一致性，或者至少約8 1 %、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97°/〇、98% 或 99% 胺基酸序列一 ^ 致性：本文所揭示之全長天然序列FcRH5多肽序列、本文所揭示之無信號肽的FcRH5多肽序列、本文所揭示之有或無信號肽的FcRH5多肽細胞外域或本文所揭示之全長 FcRH5多肽序列的任何其他特別確定之片段。通常， FcRH5變異多肽之長度為至少約10個胺基酸，或者長度為至少約 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、 120 > 130 、 140 、 150 、 160 、 170 、 180 、 190 、 200 、 210 、 220 、 230 、 240 、 250 、 260 、 270 、 280 、 290 、 300 ' 310 、〇 320 、 330 、 340 、 350 、 360 、 370 、 380 ' 390 ' 400 ' 410 ' 420 、 430 、 440 、 450 、 460 、 470 、 480 、 490 、 500 、 510 、 520、530、540、550、560、570、580、590、600個胺基酸或更多。視情況，FcRH5變異多肽相較於天然FcRH5多肽序列應具有不超過一個保守性胺基酸取代，或相較於天然FcRH5多肽序列具有不超過2、3、4、5、6、7、8、9或 10個保守性胺基酸取代。相對於肽或多肽序列（亦即本文所鑑別之FcRH5多肽序 147375.doc -55- 201039846 列）之「胺基酸序列一致性百分比（％)」係定義為在序列比對及（若必要）引入間隙以達成最大序列一致性百分比，且不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分之後，候選序列中與特定肽或多肽序列（亦即FcRH5多肽序列）中胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比。為測定胺基酸序列一致性百分比，可以此項技術中熟知之各種方式進行比對，例如使用公用電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN 或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於測量比對之適當參數，包括達成所比較序列全長範圍内之最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性％值，其中下表1中提供ALIGN-2程式之完整原始碼。該ALIGN-2 序列比較電腦程式由Genentech，Inc.設計，且下表1中所示之原始碼已以美國版權局（U.S· Copyright Office, Washington D.C.， 20559)之使用者文件（user documentation)申請，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可公開獲自 Genentech，Inc·, South San Francisco, California或可自下表1中所提供之原始碼編譯。ALIGN·2程式應編譯用於 UNIX操作系統，較佳數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不改變。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下’既定胺基酸序列A與既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性°/。（其或者可表達為具有或包含與既定胺基酸序列B之特定胺基酸序列一致性％的既定胺基酸序列A)如下計算： 147375.doc -56- 201039846 100乘以分數Χ/Υ 其中X為由序列比對程式ALIGN-2在該程式之Α與Β比對中評定為一致匹配的胺基酸殘基數，且其中γ為Β中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列Α之長度不同於胺基酸序列B之長度，則A與B之胺基酸序列一致性％將不等於 B與A之胺基酸序列一致性％。「FcRH5變異聚核苦酸」或「FcRH5變異核酸序列」意謂編碼如本文所定義之FcRH5多肽、較佳活性FcRH5多肽且與編碼以下之核苷酸序列具有至少約8〇%核酸序列一致性的核酸分子：本文所揭示之全長天然序列FcRH5多肽序列、本文所揭示之無信號肽的全長天然序列FcRH5多肽序列、本文所揭示之有或無信號肽的FcRH5多肽細胞外域或本文所揭示之全長FcRH5多肽序列之任何其他片段（諸如僅代表全長FcRH5多肽之完整編碼序列之一部分的核酸所編碼的片段）。通常，FcRH5變異聚核苷酸應與編碼以下之核酸序列具有至少約8 0 %核酸序列一致性，或者至少約 81%、82%、830/〇、840/〇、85%、86%、87〇/〇、88%、89%、 90〇/〇、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%核酸序列一致性：本文所揭示之全長天然序列FcRH5 多肽序列、本文所揭示之無信號肽的全長天然序列FcRH5 多肽序列、本文所揭示之有或無信號序列的FcRII5多肽細胞外域或本文所揭示之全長FcRH5多肽序列之任何其他片段。變異體不涵蓋天然核苷酸序列。通常，FcRH5變異聚核普酸長度為至少約$個核苷酸， 147375.doc -57- 201039846 或者長度為至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75 、 80 、 85 、 90 、 95 、 100 、 105 、 110 、 115 、 120 、 125 、 130 、 135 、 140 、 145 、 150 、 155 、 160 、 165 、 170 、 175 、 180 、 185 、 190 、 195 、 200 、 210 、 220 、 230 、 240 、 250 、 260 、 270 、 280 、 290 、 300 、 310 、 320 、 330 、 340 、 350 、 360 ' 370 、 380 、 390 ' 400 、 410 、 420 ' 430 、 440 、 450 、 460 、 470 、 480 、 490 、 500 、 510 、 520 、 530 、 540 、 550 、 560 、 570 、 580 ' 590 、 600 、 610 ' 620 、 630 、 640 、 650 、 660 ' 670 、 680 、 690 、 700 、 710 ' 720 、 730 ' 740 ' 750 ' 760 、 770 、 780 、 790 、 800 、 810 、 820 、 830 、 840 、 850 、 860、870、880、890 ' 900 ' 910 ' 920、930 ' 940 ' 950 ' 960 、 970 ' 980 、 990 ' 1000 ' 1010 、 1020 、 1030 、 1040 、 1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、 1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、 1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、 1290或13 00個核苷酸’其中在此情形下術語「約」意謂已引用核苷酸序列長度加上或減去該已引用長度之丨〇%。相對於本文所鑑別之編碼FcRH5之核酸序列的「核酸序列一致性百分比（％)」係定義為在序列比對及（若必要）引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，候選序列中與所關注FcRH5核酸序列中之核苷酸一致的核苷酸的百分比。為測定核酸序列一致性百分比’可以此項技術中熟知之各 -58- 147375.doc 201039846 種方式進行比對，例如使用公用電腦軟體，諸如BLAST、 BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)軟體。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生核酸序列一致性％值，其中下表1中提供ALIGN-2程式之完整原始碼。該ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.設計，且下表1中所示之原始碼已以美國版權局（11.3· Copyright Office，Washington D.C·, 20559)之使用者文件申請，其中其以美國版權註冊號TXU5 10087註冊。ALIGN-2 程式可公開獲自 Genentech, Inc.，South San Francisco, California或可自下表1中所提供之原始碼編譯。ALIGN-2 程式應編譯用於UNIX操作系統，較佳數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不改變。在採用ALIGN-2進行核酸序列比較之情況下’既定核酸序列C與既定核酸序列D之核酸序列一致性％(其或者可表達為具有或包含與既定核酸序列D之特定核酸序列一致性 %的既定核酸序列C)如下計算：

100乘以分數W/Z 其中W為由序列比對程式ALIGN-2在該程式之(：與1:>比對中評定為一致匹配的核苷酸數，且其中Z為D中核苷酸之總數。應瞭解，若核酸序列C之長度不同於核酸序列D之長度’則c 與D之核酸序列一致性％將不等於D與C之核酸序列一致性 %。除非另外特別說明’否則如剛好前一段使用ALIGN_2電腦程式所述獲得本文所用之所有核酸序列一致性％值° 147375.doc •59- 201039846 在其他實施例中，FcRH5變異聚核苷酸為編碼fcrh5多肽且能夠較佳在嚴格雜交及洗滌條件下與編碼本文所揭示之全長FcRH5多肽的核皆酸序列雜交的核酸分子。fcrh5 變異多肽可為FcRH5變異聚核苷酸所編碼之多肽。當關於編碼FcRH5多肽之核酸使用時，術語「全長編碼區」係指編碼本發明之全長FcRH5多肽的核苷酸序列（在附圖中，其通常展示於起始密碼子與終止密碼子之間（包括起始密碼子及終止密碼子））。當關於ATCc寄存之核酸使用 %，術#「全長編碼區」係指寄存於ATCc的插入載體中之編碼FCRH5多肽icDNA部分（在附圖（起始密碼子及終止密碼子在圖式中為粗體且加有下劃線）中其通常展示於起始密碼子與終止密碼子之間（包括起始密碼子及終止密碼子））。當用於描述本文所揭示之各種FcRH5多肽時，「分離之」意謂已鑑別且自自然環境之組分分離及/或回收的多肽。其自然環境之污染組分為通常將會干擾多肽之治療用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，多肽將被純化：⑴至足以藉由使用旋杯式定序儀獲得N末端或内部胺基酸序列之至少15 個殘基的私度，或至藉由SDS_pAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或較佳銀染色得知之均質性。分離之多 ^括重組細胞内之原位多⑻，此係因為FcRH5多肽自然環境中之至少-個組分將不會存在。《而，通常將藉由至少一個純化步驟來製備分離之多肽。 147375.doc •60· 201039846 分離之」編碼FcRH5多肽之核酸或編碼另一多肽之核酸為已鑑別且與至少一種污染核酸分子分離的核酸分子，在、扁碼夕狀之核酸的天然來源中，其通常與該至少一種污染核酸分子結合。分離之編碼多肽之核酸分子不為自然界中/、所存在之形式或不處於自然界甲其所存在之環境中。刀離之編石馬多肽之核酸分子不同於天然細胞中所存在之編馬夕狀之特定核酸分子。然而，分離之編碼多肽之 ❹肖酸分子包括通常表現該多肽之細胞中所含的編碼多肽的中例如核酸分子處於不同於天然細胞中之染色體位置。 ^ 控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需的DNA序列。適合於原核生物之控制2例如包括啟動子，視情況存在之操縱子序列及核糖體、，σ 口位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺普酸化信號及增強子。 ◎。當使核酸與另—核酸序列呈-種功能關係時，其經「可操乍地連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之歷表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其可操作地連接於 J夕肽之DNA，若啟動子或増強子影響編碼序列之轉錄，則其可操作地連接於該序列；或若核糖體結合位點定位成可有助於轉譯’則其可操作地連接於編碼序列。一般而言’「可操作地連接」意謂所連接之眶序列為相鄰的，且在分泌前導序列的情況下為相鄰的且在閱讀相— 却6)中。然而，增強子不必為相鄰的。藉由在適當限制 147375.doc 201039846 若°亥專位點不存在，則根據習知實接頭（adaptor)或連接子〇性位點處接合來連接β 踐使用合成之寡核苷酸雜交反應之「嚴格度」可易於由-般技術者確定，且一般為視探針長度、洗㈣度及鹽it度而定的經驗計算值一般而言’較長探針需要較高溫度進行適當#接，而較短探針需要較低溫度。雜交„般取決於變性職當互補股存在純於其熔融溫度之環境中時再黏接之能力。探針與可雜父序列之間的所需同源性程度愈高，可使用之相對溫度愈高。因此可見’較高相對溫度將趨向於使反應條件更嚴格，而較低溫度則趨向於使反應條件不太嚴格。雜交反應嚴格度之其他詳情及說明參見Ausubel等人

Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)。如本文所定義之「嚴格條件」或「高嚴格度條件」可由以下條件鑑別：（1)採用低離子強度及高溫進行洗滌，例如 0.015 Μ氣化鈉/0.0015 Μ擰檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸納，在50 C下’（2)雜交期間在42°C下採用變性劑（諸如曱醢胺，例如50%(v/v)曱醯胺）以及〇· 1 %牛血清白蛋白/〇丨％聚蔗糖（Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50 mM磷酸鈉緩衝液 (pH 6.5)以及750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉；或（3)在 42°C 下在採用 50%甲醯胺、5xSSC(0.75 M Naa、0.075 Μ 擰檬酸鈉）、50 mM磷酸鈉（pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5><登哈特氏溶液（Denhardt's solution)、經音波處理缝魚精子 DNA(50 pg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸聚葡萄糖之溶液中 147375.doc 62· 201039846 雜交隔夜，且在42°C下用0.2xSSC(氣化鈉/擰檬酸鈉）洗滌 10分鐘’繼而在55°C下用由含EDTA之O.lxSSC組成的高嚴格度洗滌液洗滌1 〇分鐘。「中等嚴格條件」可如Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述鑑別，且包括使用相較於上述洗滌溶液及雜交條件（例如溫度、離子強度及％SDS)不太嚴格之洗滌溶液及雜交條件。中等嚴格條件之一實例為在37。〇下在包含以下〇之溶液中培育隔夜：20%曱醢胺、5xSSC(150 mM Naa、 15 mM擰檬酸鈉）、50 mM磷酸鈉（pH 7.6)、5χ登哈特氏溶液、10%硫酸葡聚糖及20 mg/ml變性經煎切缝魚精子 DNA ’繼而在約37-50°C下用lxSSC洗滌濾膜。熟習此項技術者將瞭解如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似因素的因素。術語「經標記抗原決定基」當在本文中使用時係指包含 q 融合於「標籤多肽」的FcRH5多肽或抗FcRH5抗體的嵌合多肽。標籤多肽具有足夠殘基以提供如下抗原決定基，其中可針對該抗原決定基製備抗體，然而仍足夠短以使其不會干擾其所融合之多肽的活性。標籤多肽較佳亦極其獨特’使得抗體實質上不會與其他抗原決定基交叉反應。適合之標籤多肽一般具有至少六個胺基酸殘基，且通常約8 個至50個胺基酸殘基（較佳約丨〇個至2〇個胺基酸殘基）。出於本文之目的之「活性的」或「活性」係指FcRH5多肽之形式保留天然或天然存在之FcRH5的生物及/或免疫活 147375.doc •63. 201039846 起纟物」活性係指由天_天歸在之^娜引 :的生物學功能(抑制或刺激)，而非針對天然或天然存在 C H「5所具有之抗原性抗原決定基誘發抗體產生之能免疫予」活性係指針對天然或天然存在之所具有之抗原性抗原決定基誘發抗體產生之能力。

術-括抗劑」在最廣泛意義上使用，且包括部分或完全阻斷、抑制或中和天訊聰多肽之生物活性的任何分子以‘似之方式，術語「促效劑」在最廣泛意義上使用，且包括模擬天然FcRH5多肽之生物活性的任何分子。適合之促效劑或拮抗劑分子特別包括促效或拮抗抗體或抗體片段、天然FcRH5多肽之片段或胺基酸序列變異體、肽、反義寡核苷酸、小有機分子等。鑑別FcRH5多肽之促效劑或拮抗劑的方法可包含使FcRH5多肽與候選促效劑或拮抗劑分子接觸，及測量通常與FcRH5多肽相關之一或多個生物活性的可偵測變化。純化之」思明分子以含有其之樣品的至少9 5重量％或至少98重量％之濃度存在於該樣品中。「分離之」核酸分子為如下核酸分子，其與例如在其自然環境中通常所結合之至少一種其他核酸分子分離。分離之核酸分子另外包括在通常表現該核酸分子之細胞中所含的核酸分子’但该核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。本文所用之術語「載體j意欲指能夠輸送所連接之另一核酸的核酸分子。一類載體為「質體」，其係指可接合其 147375.doc •64· 201039846 他DNA區段之環狀雙股DNA。另一類載體為噬菌體載體。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合於病毒基因組中。某些載體能夠於引入其之宿主細胞中自主複製 (例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體）。其他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞之後整合於宿主細胞基因組中且從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導與其操作性連接之基因的表現。該等載體在本文中稱作「重組表現載體」（或簡稱為「重組載體」）。-般而言，可用於重組洲八技術中之表現載體通常為質體之形式。由於質體為載體之最常用形式，故在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用。如本文中可互換使用之「聚核苦酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核普酸、核糖核苷酸、經修飾之核普酸或鹼基及/ 或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物巾之任何受質。聚核㈣可包含經㈣之核苦酸’諸如甲基化核苦酸及其類似物。若存在，則可在組裝聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸之序列中可間雜有非核#酸組分。聚核#酸可在合成之後諸如藉由與標記結合而進-步修飾。其他類型之修飾包括例如，一或多種天然存在之核苷酸用類似物「帽」取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯（phosphoamidate)、胺基曱酸酯等）之修飾及具 147375.doc •65· 201039846 有帶電鍵（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）之修飾人有懸垂部分（諸如蛋白質（例如核酸酶、毒素、枋仇體、信號肽、piy-L-離胺酸等）之修飾、具有嵌入劑（例 1 D疋、補以及骨脂素（psoralen)等）之修飾、含有螯合劑（例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等）之修飾、含有烷化劑之修飾、具有經修飾之鍵（例如α變旋異構核酸等）之修飾 / 聚核苷酸之未修飾形式。此外，通常存在於糖中之任何_ 基均可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基保護或經活化以製備與其他核苷酸之其他鍵；或可與固體或半固體支撐物結合。5'及3'末端ΟΗ可經磷酸化或經具有\ 至20個碳原子之胺或有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生為標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中二般已知之核糖或去氧核糖的類似形式，其包括例如2,_〇·甲基-核糖、2，-0-烯丙基_核糖、2，_氟-核糖或2，_疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖（諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、哌喃糖、呋喃糖 '景天庚酮糖）、非環狀類似物及鹼性核苷類似物（諸如甲基核糖苷）。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵基團置換。此等替代性鍵基團包括（但不限於）磷酸酯經P(〇)s(「硫代酸酯」）、 P⑻S(「二硫代酸酯」）、（0)NR2(「醯胺化物」）、 P(〇)R、p(o)〇R·、C0或CH2(「甲縮醛」）置換的實施例，其中各R或R’獨立地為η或視情況含有醚（_〇_)鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基（araldyl)2經取代或未經取代的烷基（1 -20 C)。無需聚核苷酸中之所有鍵均一致。 147375.doc -66· 201039846 上述描述適用於本文中所提及之所有聚核普酸，包括RNA 及 DNA。如本文所用之「寡核皆酸」-般係指-般單股、一般合成之短聚核苦酸，其長度—般（但未必）小於約細個核皆酸。術語「寡核苦酸」及「聚核苦酸」並不互相排斥。上文對於聚核苷酸之描述同樣且完全適用於募核苷酸。術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常以不文调控之細胞生長為特徵之生理狀況。癌症之實例包括 (但不限於）造血系統癌症或血液相關之癌症，諸如淋巴瘤白血病、月知瘤或淋巴惡性病症，以及脾之癌症及淋巴結之癌症，以及癌瘤、胚細胞瘤及肉瘤。癌症之更特定實例包括B細胞相關之癌症，包括例如高度、中度及低度淋巴瘤（包括B細胞淋巴瘤，諸如黏膜相關淋巴組織b細胞淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤（NHl)、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma)、小淋巴細胞性淋巴瘤、 q 邊緣區淋巴瘤、彌漫性大細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma)，及T細胞淋巴瘤）及白血病（包括繼發性白血病、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)(諸如b細胞白血病（CD5+ b淋巴細胞））、骨髓性白血病（諸如急性骨髓性白血病、慢性骨鏈性白血病）、淋巴細胞性白血病（諸如急性淋巴母細胞白血病（all))及脊鑛發育不良）及其他血液及/或B細胞或τ細胞相關之癌症。亦包括其他造金細胞之癌症，該等其他造血細胞包括多型核白血球（諸如嗜鹼性球、嗜伊紅血球、嗜中性白血球及單核 147375.doc 67· 201039846 細胞）、樹突狀細胞、jk小板、紅血球及自然殺手細胞。亦包括選自以下之癌性B細胞增殖病症：淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（All)及套細胞淋巴瘤。B細胞癌症之來源包括如下：來源於邊緣區中之記憶B細胞的邊緣區B細胞淋巴瘤、來源於生髮中心亮區中之中心細胞的濾泡性淋巴瘤及彌漫性大B細胞淋巴瘤、來源於B 1細胞（CD5+)之慢性淋巴細胞性白血病及小淋巴細胞性白血病、來源於套區中之天然B細胞的套細胞淋巴瘤及來源於生髮中心暗區中之中心母細胞的伯基特氏淋巴瘤。在本文中稱作「造血細胞組織」的包括造血細胞之組織包括胸腺及骨髓及周邊淋巴組織，諸如脾、淋巴結、與黏膜相關之淋巴組織（諸如消化道相關之淋巴組織、扁桃體、皮爾氏斑（Peyer's patch)及闌尾）及與其他黏膜（例如支氣管内層）相關之淋巴組織。該等癌症之其他特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、子宮頸癌' 卵巢癌、肝癌（liver cancer)、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌（liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌（hepatic carcinoma)、白血病及其他淋巴細胞增殖病症及各類頭頸癌。 147375.doc -68- 201039846 本文之「B細胞惡性病症」包括非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)，包括低度/濾泡性NHL、小淋巴細胞性（SL)NHL、中度/濾泡性NHL、中度彌漫性NHL、高度免疫胚細胞性 NHL、高度淋巴胚細胞性NHL、高度小型無裂細胞NHL、塊狀病性NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關之淋巴瘤及華氏巨球蛋白血症（Waldenstrom's Macroglobulinemia)、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、淋巴細胞為主型霍奇金氏症（Hodgkin's disease)(LPHD)、小淋巴細胞性淋巴瘤（SLL)、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、惰性NHL(包括復發性惰性NHL及利妥昔單抗（rituximab)難治性惰性NHL);白血病，包括急性淋巴胚細胞性白血病（ALL)、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、毛細胞白血病、慢性骨髓胚細胞性白血病；套細胞淋巴瘤；及其他血液惡性病症。該等惡性病症可用針對B細胞表面標記（諸如FcRH5)之抗體治療。本文中預期該等疾病可藉由投與針對B細胞表面標記（諸如FcRH5)之抗體治療，且該抗體投與包括投與未結合之（「裸」）抗體或結合於本文所揭示之細胞毒性劑的抗體。本文中亦預期該等疾病可藉由組合療法治療，該組合療法包括本發明之抗FcRH5抗體或抗FcRH5抗體藥物結合物以及同時或依次投與之另一抗體或抗體藥物結合物、另一細胞毒性劑、輻射或其他療法。在本發明之例示性療法中，本發明之抗FcRH5抗體與抗CD20抗體、免疫球蛋白或其CD20結合片段組合同時或依次投與。抗CD20抗體可為裸抗體或抗體藥物結合物。在組合療法之一實施例中，抗FcRH5抗體為本發明之抗體 147375.doc -69- 201039846 且抗CD20抗體為Rituxan® (利妥昔單抗）。本文所用之術語「非霍奇金氏淋巴瘤」或「NHL」係指淋巴系統之不為霍奇金氏淋巴瘤的癌症。霍奇金氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤可能一般因霍奇金氏淋巴瘤中存在里-斯二氏細胞（Reed-Sternberg cell)且非霍奇金氏淋巴瘤中無該等細胞而不同。本文所用之術語涵蓋的非霍奇金氏淋巴瘤的實例包括熟習此項技術者（例如腫瘤學家或病理學家）根據此項技術中已知之分類方案（諸如C〇i〇r Atlas of

Clinical Hematology (第 3 版），A. Victor Hoffbrand及 John E. Pettit (編）（Harcourt Publishers Ltd·，2000)中所述之修正之 l 美淋巴瘤（Revised European-American Lymphoma， REAL·)方案）4監別為非霍奇金氏淋巴瘤的任一者。詳言.之，參見圖11.57、11.58及11.59中之清單。更特定實例包括（但不限於）復發性或難治性NHL、一線低度NHL、III/IV期 NHL、化學療法抗性NHL、前驅B淋巴胚細胞性白血病及/ 或淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞性白血病及/或前淋巴細胞性白企病及/或小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞性淋巴瘤、免疫細胞瘤及/或淋巴漿細胞性淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、淋巴結外邊緣區-MALT淋巴瘤、淋巴結邊緣區淋巴瘤、毛細胞白血病、漿細胞瘤及/或漿細胞骨髓瘤、低度/濾泡性淋巴瘤、中度/濾泡性NHL、套細胞淋巴瘤、濾泡中心淋巴瘤（濾泡性）、中度彌漫性NHL、彌漫性大B細胞淋巴瘤、侵襲性NHL(包括侵襲性一線NHL 147375.doc •70- 201039846 及侵襲性復發性NHL)、自體幹細胞移植之後復發之NHL 或自體幹細胞移植難治性NHL、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、高度免疫胚細胞性NHL、高度淋巴胚細胞性NHL、高度小型無裂細胞NHL、塊狀病性 NHL、伯基特氏淋巴瘤、前驅（周邊）大顆粒淋巴細胞性白也病、蕈樣真菌病及/或賽謝症候群（Sezary syndrome)、皮膚淋巴瘤、多形性大細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。 Ο

浆細胞病症係由漿細胞純系不受控制之分裂或繁殖所致。漿細胞產生自活化之B淋巴細胞（亦即B細胞）。各6細胞產生排列於其細胞表面上特異於外來物質（亦即抗原）之獨特受體（稱作B細胞受體）。當B細胞受體結合其同源抗原時，表現该党體之細胞經活化而再進入細胞週期，從而自盯產生多個純系複本。該等純系成熟為漿細胞，該等漿細胞主要存在於骨髓中且專門產生B細胞受體之複本，該等複本釋放於血流中作為抗體。在漿細胞病症中，漿細胞或親本B細胞遭受遺傳損傷，導致抑制對細胞分裂及/或活性之正常約束或對該等正常約束不敏感。源自該等細胞之子漿細胞因可不受抑止地分裂及/或產生過量相同免疫球蛋白(抗體)而為惡性細胞。通常，所產生之免疫球蛋白為不完整的，或具有錯誤構形，此可導致血清、組織或器官 (尤其腎）巾積累該蛋自f(視特定病症而定㈣作單株蛋白、Μ蛋白、副蛋白或㈣樣蛋白），從而引㈣官功能障礙及/或哀竭。漿細胞病症包括意義未明之單株球蛋白症 (MGUS)、多發性骨髓瘤（ΜΜ)、巨球蛋白血症、重鍵病及 147375.doc -71 - 201039846 全身性輕鏈澱粉樣變性病（AL)，其基於純系之增殖性質、涉及骨髓之程度及所表現Μ蛋白之類型區分。其他漿細胞病症為孤立性漿細胞瘤、髓_外漿細胞瘤、多發性孤立性聚細胞瘤、槳細胞白血病、華氏巨球蛋白血症、Β細胞非霍奇金氏淋巴瘤、Β細胞慢性淋巴細胞性白血病。儘管新免疫療法（諸如利妥昔單抗及阿命單抗（alemtuzumab))在一些 B細胞惡性病症中具有改良之無病存活及總存活，但在治療漿細胞病症中該等療法尚未證實有效，部分因為惡性純系漿細胞不能充分表現標把抗原（分別為CD20及CD52)。因此’需要鑑別且開發改良之漿細胞病症療法（參見美國公開申請案第20080166742號及第200803 17745號，該等申請案各以全文引用的方式併入本文中）。先前已展示B細胞、漿細胞及多發性骨髓瘤細胞（包括來自MM患者樣品之細胞）上表現FcRH5(IRTA2)。（參見美國公開申請案第2006025 1662號，該申請案以全文引用的方式併入本文中）。因此，根據多發性骨髓瘤樣品中之FcRH5 表現模式，該分子為哺乳動物之腫瘤（包括漿細胞病症，諸如本文所述之漿細胞病症（亦即多發性骨髓瘤））及與抗體分泌相關之疾病（諸如過敏症或自體免疫疾病）之療法的極佳標靶。「病症」為任何將受益於用本發明之物質/分子或方法治療的病狀。其包括慢性及急性病症或疾病，包括易於使哺乳動物患所述病症的病理學病狀。在本文巾欲治療病症之非限制性實例包括癌性病狀，諸如惡性及良性腫瘤丨非 147375.doc -72- 201039846 白血病及淋巴惡性病症；神經元、膠質、星形膠質細胞 (astrocytal)、下丘腦及其他腺體、巨噬細胞、上皮、基質及囊胚腔病症；及發炎性、免疫學及其他血管生成相關病症。病症另外包括以下癌性病狀：諸如B細胞增殖病症及/ 或B細胞腫瘤，例如淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（Nhl)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病〇 (HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。術語「細胞增殖病症」及「增殖病症」係指與某種程度之異常細胞增殖相關之病症。在一實施例中，細胞增殖病症為癌症。如本文所用之「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增殖 (無論惡性或良性）’及所有癌前及癌性細胞及組織。本文之「自體免疫疾病」為產生自且針對個體自身組織 Q 或器B之疾病或病症或其共分離系（co-segregate)或表現形式或其所致病狀。在許多此等自體免疫及發炎病症中，可存在諸多臨床及實驗室標記，包括（但不限於）高γ球蛋白血症、咼含量之自體抗體、組織中由皮質類固醇或免疫抑制療法所致之抗原-抗體複合物沈積及受影響組織中之淋巴樣細胞凝集物。在不受限於關於Β細胞介導之自體免疫疾病的任一理論之情況下，咸信Β細胞經由多種機械途徑 (mechanistic pathway)顯示在人類自體免疫疾病中之病原作用’該等途徑包括自體抗體產生、免疫複合物形成、樹 147375.doc -73- 201039846 突狀細胞及τ細胞活化、細胞激素合成、直接趨化因子釋放且為異位新淋巴生成提供病灶。此等路徑各自可以不同私度參與自體免疫疾病之病理學。自體免疫疾病」可為器官特異性疾病（亦即免疫反應特異性針對器官系統，諸如内分泌系統、造血系統、皮膚、心肺系統、胃腸及肝系統、腎系統、甲狀腺、耳、神經肌肉系統、中樞神經系統等）或可影響多個器官系統之王身！·生疾病（例如全身性紅斑狼瘡（sle)、類風濕性關節人多肌炎等）。較佳該等疾病包括自體免疫性風濕病（諸如類風濕性關節炎、休格連氏症候群（Sj0gren,s —e)、硬皮病、狼瘡（諸如SLE及狼瘡性腎炎）、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗體症候群及牛皮癬性關節炎）、自體免疫性胃腸及肝病（諸如發炎性腸道疾病（例如潰瘍性 ”-σ腸乂及克羅恩氏症（Cr〇hn's disease))、自體免疫性胃炎及惡性貧血、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽官炎及乳糜瀉）、血管炎（諸如ANC A陰性血官炎及ANC A相關血管炎，包括邱_斯氏血管炎（Churg_ Stmuss vasculitis)、韋格納氏肉芽腫（Wegener，s gr_i〇mat〇sis) 及顯微性多血管炎）、自體免疫性神經病（諸如多發性硬化症、斜視眼陣攣（ops〇cl〇nus)肌陣攣症候群、重症肌無力、視神經脊髓炎、帕金森氏症（Parkins〇n，s disease)、阿茲海默氏症（Alzheimer’s disease)及自體免疫性多神經病變）、腎病（諸如腎小球腎炎、古巴士德氏症候群（G〇〇dpasture,s syndrome)及貝格爾氏症（Berger’s disease))、自體免疫性皮 147375.doc -74· 201039846 膚病（諸如牛皮癬、蓴麻療、風療（hives)、尋常天癌瘡、大皰性類天疱瘡及皮膚紅斑狼瘡）、血液病（諸如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血後紫癜及自體免疫性溶血性貧血）、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自體免疫性聽力疾病（諸如内耳病及喪失聽力）、白塞氏症 (Behcet，s disease)、雷諾氏症候群（Raynaud,s syndr〇me)、器官移植及自體免疫性内分泌病（諸如糖尿病相關之自體免疫疾病，諸如胰島素依賴性糖尿病（IDDM)、阿狄森氏症（Addison’s disease)及自體免疫性甲狀腺病（例如格雷氏症（Graves，disease)及甲狀腺炎））。更佳該等疾病包括例如類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎、ANCM關之血管炎、狼瘡、多發性硬化症、休格連氏症候群、格雷氏症、 IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎及腎小球腎炎。 *如本文所定義之其他自體免疫疾病（其在一些情況下涵蓋上述自體免疫疾病）之特定實例包括（但不限於）關節炎 (急性及慢性關節炎，類風濕性關節性關節炎）及以下各期’諸如類風濕性滑膜炎、痛風= 風性關節炎、急性免疫性關節炎、慢性發炎性關節炎、變性關節炎、II型膠原誘發性關節炎、#染性關節炎、萊姆關節炎（Lyme anhdtis)、if生性關節炎、牛皮癬性關節炎、斯蒂爾氏症（Stnrsdisease)、脊椎關節炎、骨關節，炎、慢性漸進性關節炎、變形性關節I、慢性原發性多關節炎:反應性關節《、絕經期關節炎、雌激素耗竭性關節炎及僵直性脊椎炎/類風濕性脊椎炎）；自體免疫性淋巴細 147375.doc -75- 201039846 胞增殖病；發炎性過度增殖皮膚病；牛皮癬，諸如斑塊牛皮癖、滴狀牛皮癖（gutatte psoriasis)、膿皰型牛皮癬及指甲牛皮癖；異位性（atopy) ’包括異位性疾病，諸如枯草熱及喬布氏症候群（Job’s syndrome);皮炎，包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、剝落性皮炎、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、風疹、疱疹樣皮炎、錢幣狀皮炎、脂溢性皮炎、非特異性皮炎、原發性刺激物接觸性皮炎及異位性皮炎；X聯高 IgM症候群（χ-linked hyper IgM syndrome);過敏性眼内發炎疾病；蓴麻療，諸如慢性過敏性蓴麻療及慢性特發性蓴麻疹，包括慢性自體免疫性蓴麻疹；肌炎；多肌炎/皮肌炎·’青少年皮肌炎；中毒性表皮壞死溶解；硬皮病（包括全身性硬皮病）；硬化’諸如全身性硬化症、多發性硬化症（MS)(諸如脊髓-眼MS(spino-optical MS)、原發性進行性MS(PPMS)及復發緩解性MS(RRMS))、進行性全身性硬化、動脈粥樣硬化、動脈硬化、播散性硬化（scler〇sis disseminata)、共濟失調性硬化、視神經脊髓炎（NM〇);發炎性腸道疾病（IBD)(例如克羅恩氏症、自體免疫介導之胃腸病、胃腸發炎、結腸炎（諸如潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis、colitis ulcerosa)、顯微性結腸炎、膠原性結腸炎、息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎）及自體免疫發炎性腸道疾病）；腸發炎；壞疽性膿皮病；結節性紅斑；原發性硬化性膽管炎；呼吸窘迫症候群（包括成年或急性呼吸窘迫症候群（ARDS));腦膜炎；葡萄膜之全部或部分發炎；虹膜炎；脈絡膜炎；自體免疫性血液 147375.doc -76- 201039846 病症；移植物抗宿主病；血管性水腫，諸如遺傳性血管性水腫；腦神經損傷，如腦膜炎中之腦神經損傷；妊娠疱疹；妊娠性類天疱瘡；陰囊瘙癢（pruritis scr〇ti);自體免疫性卵巢早衰；因自體免疫病狀所致之突發性失聽；介導之疾病，諸如全身性過敏反應及過敏性及異位性鼻炎；腦炎，諸如拉斯姆森氏腦炎（Rasmussen，sencephaiitis) 及邊緣及/或腦幹性腦炎）；葡萄膜炎，諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、後葡萄膜炎或自體免疫葡萄膜炎；有或無腎病症候群之腎小球腎炎（GN)，諸如慢性或急性腎小球腎炎，諸如原發性GN '免疫介導之gn、膜性 GN(膜性腎病變）、特發性膜性gn或特發性膜性腎病變、膜增生性GN(MPGN)(包括I型及η型）及快速進行性 GN(RPGN);增生性腎炎；自體免疫多腺内分泌功能衰竭；龜頭炎’包括侷限性漿細胞性龜頭炎（balanitis circumscripta plasmacellularis)、龜頭包皮炎；遠心性環形

U 紅斑；持久性色素障礙性紅斑；多形紅斑；環狀肉芽腫；光澤苔癣；硬化萎縮性苔癬；慢性單純性苔癬；小棘苔蘚；扁平苔癣；板層狀魚鱗病；表皮鬆解性角化過度症；惡變前角化病；壞疽性膿皮病；過敏病狀及反應；食物過敏，藥物過敏，昆蟲過敏；罕見過敏病症，諸如肥大細胞增多症；過敏反應；濕疹，包括過敏性或異位性濕疹、皮脂缺乏性濕疹、出汗障礙性濕疹及水皰樣掌跛濕疹；哮喘，諸如支氣管哮喘（asthma bronchiale、bronchial 147375.doc -77- 201039846 asthma)及自體免疫性哮喘；涉及τ細胞浸潤及慢性發炎反應之病狀；針對外來抗原（諸如妊娠期間之胎兒Α-Β-Ο血型）之免疫反應；慢性肺發炎疾病；自體免疫性心肌炎；白血球黏附缺陷病；狼瘡，包括狼瘡性腎炎、狼瘡性大腦炎、兒童狼瘡、非腎性狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡及盤狀紅斑狼瘡、脫髮性狼瘡、SLE(諸如皮膚SLE或亞急性皮膚 SLE)、新生兒狼瘡症候群（Nle)及播散性紅斑狼瘡；青少年發作型（I型）糖尿病，包括兒童IDDM;成年發作型糖尿病（II型糖尿病）；自體免疫性糖尿病；特發性尿崩症；糖尿病性視網膜病變；糖尿病性腎病變；糖尿病性結腸炎；糖尿病性大動脈病；與由細胞激素及T淋巴細胞介導之急性及遲發性過敏反應相關的免疫反應；結核病；類肉瘤病；肉芽腫，包括淋巴瘤樣肉芽腫；顆粒性球缺乏症；血管炎（包括大血管血管炎（諸如風濕性多肌痛及巨細胞（高安氏（Takayasu’s))動脈炎）、中血管炎（諸如川崎氏症 (Kawasaki’s disease)及結節性多動脈炎/結節性動脈周炎）、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、壞死性血管炎（諸如類纖維蛋白壞死性血管炎及全身性壞死性血管炎）、ANCA陰性血管炎及ANCA相關之血管炎（諸如謝格-司托司症候群（Churg_Strauss syndr〇me， CSS)、韋格納氏肉芽腫及顯微性多血管炎）；顳動脈炎；再生障礙性貧血；自體免疫性再生障礙性貧血；庫姆陽性貧血（Coombs positive anemia);戴-布二氏貧血（Diam〇nd

Blackfan anemia) ·’溶血性貧血或免疫性溶血性貧血（包括 147375.doc •78- 201039846 自體免疫性溶血性貧血（AIHA));惡性貧血（pernici〇us anemia、anemia perniciosa);阿狄森氏症（Addison's disease)，純红血球貧血或發育不全（prca);因子νίπ缺乏；A型血友病；自體免疫性嗜中性白血球減少症；血細胞減少症，諸如全部血球減少症、白血球減少症、涉及白血球/參出之疾病；CNS發炎性病症；阿茲海默氏症；帕金森氏症’多器官損傷症候群，諸如敗血_病、創傷或出血繼發之疾病；抗原-抗體複合物介導之疾病；抗腎小球基底膜病；抗磷脂抗體症候群；運動神經炎（motoneuritis);過敏性神經炎；白塞氏症/症候群；卡斯特門氏症候群 (Castleman’s syndrome);古巴士德氏症候群；雷諾氏症候群；休格連氏症候群；史蒂芬-強森症候群（Stevens_ Johnson syndrome);類天疱瘡或天疱瘡，諸如大皰性類天疱瘡、瘢痕性（黏膜）類天疱瘡、皮膚類天疱瘡、尋常天疱齋、副腫瘤天癌療、落葉型天疮瘡、天疱瘡性黏膜類天癌 ◎ 瘡（pemphigus mucus-membrane pemphigoid)及紅斑性天疱瘡；後天性大皰性表皮鬆解；眼發炎，較佳過敏性眼發炎’諸如過敏性結膜炎、線狀IgA大皰病、自體免疫誘發之結膜發炎；自體免疫性多内分泌病變；雷特氏症 (Reiter’s disease)或症候群；因自體免疫病狀所致之熱損傷’先兆子癇，免疫複合物病症’諸如免疫複合物性腎炎；抗體介導之腎炎；神經發炎性病症；多發性神經病變；慢性神經病變，諸如IgM多發性神經病變或igM介導之神經病變；血小板減少症（如例如心肌梗塞患者產生之 147375,doc •79- 201039846 J板減v症）’包括血栓性血小板減少性紫癜（T丁p)、輸血後i癒（ptp)、肝素誘發之企小板減少症及自體免疫或免疫介導之血小板減少症（包括例如特發性血小板減少性紫癒（itp)，包括慢性或急性Ιτρ) ;鞏膜炎，諸如特發性角膜鞏膜炎、上鞏膜炎；睪丸及卵巢之自體免疫疾病，包括自體免疫性睪丸炎及_巢炎；原發性甲狀腺功能低下；副甲狀腺機能減退症；自體免疫性内分泌疾病，包括甲狀腺炎，諸如自體免疫性甲狀腺炎、橋本氏症（Hashim〇t〇，s disease)、慢性甲狀腺炎（橋本氏甲狀腺炎 thyroiditis))或亞急性甲狀腺炎；自體免疫性甲狀腺病，，特發性甲狀腺功能低下；格雷氏症；格雷氏眼病（眼病變或甲狀腺相關眼病變）；多腺症候群，諸如自體免疫性多腺症候群，例如I型（或多腺内分泌病變症候群广腫瘤形成徵兆症候群，包括神經性腫瘤形成徵兆症候群，諸如蘭伯特伊頓肌無力症候群（Lambert-Eaton myasthenic syndrome) 或伊頓蘭伯特症候群（Eaton-Lambert syndrome)、僵人症候群；腦脊髓炎，諸如過敏性腦脊髓炎（aUergic encephalomyelitis 或 encephalomyelitis allergica)及實驗性過敏性腦脊髓炎（EAE);重症肌無力，諸如胸腺瘤相關之重症肌無力；小腦變性；神經性肌強直；斜視眼陣攣或斜視眼陣攣肌陣攣症候群（OMS)及感覺神經病變；多灶性運動神經病變；席漢氏症候群（Sheehan's syndrome);自體免疫性肝炎；慢性肝炎；狼瘡樣肝炎；巨細胞肝炎；慢性活動性肝炎或自體免疫性慢性活動性肝炎；肺炎，諸如淋巴 147375.doc -80- 201039846 樣間貝性肺炎（Lip);閉塞性細支氣管炎（非移植）與Nsip ; 林巴氏症候群（Guillain-BarrS syndrome);貝袼爾氏症 (IgA月病變）；特發性¥腎病變；線狀IgA皮膚病；急性考X…、丨生胃中性皮膚病，角膜下膿皰皮膚病；暫時性棘層鬆解性皮膚病，·硬化’諸如原發性膽汁性肝硬化及肺硬化；自體免疫性腸病變症候群；乳糜渴或腹腔病；u炎性腹渴 (麵質腸病變）；難治性口炎性腹瀉；特發性口炎性腹瀉； 0 冷球蛋白血症，諸如混合型冷球蛋白血症；肌肉萎縮性側索更化（ALS ’魯葛瑞格氏症（l〇u Gehrig，s disease));冠狀動脈病，自體免疫性耳病，諸如自體免疫性内耳病 (AIED)、自體免疫性失聽；多軟骨炎，諸如難治性或復發性或復發性多軟骨炎；肺泡性蛋白沉著症；角膜炎，諸如科幹氏症候群（Cogan's syndrome)/非梅毒間質性角膜炎；貝爾氏麻痺（Bell，s palsy);斯維特氏症（Sweet,s 士“⑽匀/症候群；自體免疫性紅斑痤療；帶狀疱疹相關之疼痛；澱粉 Q 樣變性病；非癌性淋巴細胞增多；原發性淋巴細胞增多，其包括單株B細胞淋巴細胞增多（例如良性單株球蛋白症及意義未明之單株球蛋白症’ MGUS);周邊神經病變；腫瘤形成徵兆症候群；通道病變，諸如癲癇症、偏頭痛、心律不整、肌肉性病症、聾、失明、週期性麻痺及CNS之通道病變；自閉症；發炎性肌病變；局灶性或節段性或局灶節段性腎小球硬化（FSGS)，内分泌眼病變；葡萄膜視網膜炎；脈絡膜視網膜炎；自體免疫性血液病；肌肉纖維疼痛；多發性内分泌不足；施密特氏症候群（Schmidt，s 147375.doc • 81 - 201039846 syndrome)，腎上腺炎；胃萎縮；早老性癡呆；脫髓鞘疾病，諸如自體免疫性脫髓鞘疾病及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病變；德雷斯勒氏症候群（Dressier^ syndrome);斑形脫髮，全禿；CREST症候群（鈣質沉著症、雷諾氏現象 (Raynaud’s phenomenon)、食道蠕動異常、指硬皮病及毛細企管擴張）；例如因抗精子抗體所致之男性及女性自體免疫性不孕症；混合型結締組織疾病；恰加斯氏症 (Chagas’ diSease);風濕熱；反覆流產；農民肺（farmer，s lung);多形性紅斑；心臟切開術後症候群；庫興氏症候群 (Cushing’s syndrome);養鳥人肺（bird-fancier’s lung);過敏性肉芽腫性血管炎；良性淋巴細胞性血管炎；阿爾波特氏症候群（Alport’s syndrome);肺泡炎，諸如過敏性肺泡炎及纖維化肺泡炎；間質性肺病；輸血反應；麻風；癔疾’寄生性疾病’諸如利什曼體病（leishmaniasis)、錐蟲病（kypanosomiasis)、血吸蟲病、蛔蟲病、麯黴病；薩姆特氏症候群（Sampter’s syndrome);卡普蘭氏症候群（Caplan's syndrome);登革熱（dengue);心内膜炎；心内膜心肌纖維化；彌漫性間質性肺纖維化；肺間質性纖維化；纖維性縱隔炎；肺纖維化；特發性肺纖維化；囊腫性纖維化；内眼炎；持久性隆起性紅斑（erythema elevatum et diutinum); 胎性紅血球胚細胞症；嗜伊紅血球筋膜炎；舒爾曼氏症候群（Shulman's syndrome);費爾提氏症候群（Felty's syndrome); 絲蟲病（flariasis);睫狀體炎，諸如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎（heterochronic cyclitis)、虹膜睫狀體炎（急性或慢 147375.doc -82· 201039846

性）或弗齊氏睫狀體炎（Fuch's cyclitis);亨-舍二氏紫癜 (Henoch-Schonlein purpura);人類免疫缺乏病毒（HIV)感染；SCID ;後天性免疫缺乏症候群（AIDS);埃可病毒感染 (echovirus infection);敗血症（全身性發炎性反應症候群 (SIRS));内毒素血症；胰腺炎；甲狀腺毒症 (thyroxicosis);小病毒感染；風療病毒感染；疫苗接種後症候群；先天性風疹感染；愛巴病毒感染；腮腺炎；伊萬氏症候群（Evan's syndrome);自體免疫性性腺衰竭；西德納姆氏舞蹈病（Sydenham4 chorea);鏈球菌感染後之腎炎；閉塞性血栓性血管炎（thromboangitis ubiterans);甲狀腺毒症；脊髓癆；脈絡膜炎；巨細胞多肌痛；慢性過敏性肺炎；結膜炎，諸如春季黏膜炎（vernal catarrh)、乾燥性角膜結膜炎及流行性角膜結膜炎；特發性腎炎症候群；微小病變性腎病變；良性家族性及缺血再灌注損傷；移植器官再灌注；視網膜自體免疫；關節發炎；支氣管炎；慢性阻塞性氣管/肺病；矽肺病；口瘡；口瘡性口炎；動脈硬化性病症（大腦jk管機能不全），諸如動脈硬化性腦病及動脈硬化性視網膜病變；精子無法形成；自體免疫性溶血；伯克氏症（Boeck's disease);冷球蛋白血症；杜普宜特朗氏攣縮（Dupuytren's contracture);晶狀體過敏性眼内炎 (endophthalmia phacoanaphylactica);過敏性腸炎；麻風結節性紅斑；特發性面神經麻痒；慢性疲勞症候群；風濕熱；哈-瑞二氏病（Hamman-Rich's disease);感音神經性失聽（sensoneural hearing loss);陣發性血紅素尿；性腺低能 147375.doc -83 - 201039846 症；區域性回腸炎（ileitis regionalis);白血球減少症；傳染性單核細胞增多症；橫貫性脊髓炎；原發性特發性黏液水腫；腎病；眼炎交感神經性眼炎（ophthalmia symphatica， sympathetic ophthalmitis);新生兒眼炎；視神經炎；肉芽腫性睪丸炎；胰腺炎；急性多神經根炎；壞疽性膿皮病；奎凡氏甲狀腺炎（Quervain's thyreoiditis);後天性脾萎縮；非惡性胸腺瘤；淋巴渡泡性胸腺炎；白斑症；中毒性休克症候群；食物中毒；涉及T細胞浸潤之病狀，·白血球黏附缺陷病；與由細胞激素及T淋巴細胞介導之急性及遲發性過敏反應相關的免疫反應；涉及白血球滲出之疾病；多器 s損傷症候群；抗原-抗體複合物介導之疾病；抗腎小球基底膜病；自體免疫性多内分泌病變；卵巢炎；原發性黏液水腫；自體免疫性萎縮性胃炎；風濕性疾病；混合型結締組織疾病；腎病症候群；胰島炎；多内分泌功能衰竭；自體免疫性多腺症候群，包括多腺症候群j型；成年發作型特發性副甲狀腺機能減退症（A0IH);心肌病變，諸如擴張型心肌病變；後天性大皰性表皮鬆解（eba);血色素沉著症；心肌炎；腎病症候群；原發性硬化性膽管炎；化膿性或非化膿性竇炎；急性或慢性竇炎；篩骨 '前額、上頜骨或蝶竇炎；過敏性竇炎；嗜伊紅血球相關之病症，諸如嗜伊紅血球過多、肺浸潤嗜伊紅血球過多、嗜伊紅血球過多-肌痛症候群、呂弗勒氏症候群（L〇ffler，s syndr〇me)、慢性嗜伊紅金球肺炎、熱帶肺嗜伊紅血球增多、支氣管肺炎性麯黴病、麯黴腫或含有嗜伊紅血球之肉芽瘤；全身性過 147375.doc -84- 201039846 敏反應；脊椎關節病變；血清陰性脊椎關節炎；多内分泌 j體免疫疾病；硬化性膽管炎；掌膜炎；上掌膜炎；慢性皮膚黏膜念珠菌病；布魯頓氏症候群(― syndrome);幼兒期暫時性低γ球蛋白灰症；維-奧二氏症候群（―rich syndrome);共濟失調毛細血管擴張症候群；血管擴張；與膠原性疾病相關之自體免疫病症；風濕病，諸如慢性關節風濕病；淋巴腺炎^壓反應減少； Ο 〇血管功能障礙；組織損傷·心品其从丄螂狽楊，〜血管缺血；痛覺過敏；腎缺血；大腦缺血；及伴隨血管生成之疾病；過敏性過敏反應病症；腎小球腎炎（glomerulonephritide);再灌注損傷·缺血性再灌注病症；心肌或其他組織之再灌注損傷；淋巴瘤性氣管支氣管炎；發炎性皮膚病；具有急性發炎組分之皮 1病；多重器官衰竭；大皰病；腎皮質壞死；急性化膿性腦膜炎；或其他中樞神經系統發炎性病症；眼及眼眶發炎性病症；顆粒球輸注相關之症候群；細胞激素誘發之毒性，發作性睡病；急性嚴重發炎；慢性難治性發炎；腎盂炎；動脈内膜過度增生；消化性潰癌；瓣炎及子宮内膜異位本文中預期該專疾病可藉由投與結合於b細胞表面標己（諸如FcRH5)之仏體治療，且該抗體投與包括投與未結合之（「裸」）抗體或結合於本文所揭示之細胞毒性劑的抗體本文中亦預期該等疾病可藉由組合療法治療，該組合療法包括本發明之抗FcRH5抗體或抗FcRH5抗體藥物結合物以及同時或依次投與之另一抗體或抗體藥物結合物、另一細胞毒性劑、輻射或其他療法。 147375.doc -85- 201039846 /台療」或「緩和」係指治療性處理與預防性措施，其中目的在於預防或延緩（減輕）所靶向的病理學病狀或病症。需要治療者包括已患有該病症者以及易於患有該病症者或預防该病症者。若在根據本發明之方法接受治療量之抗FcRH5抗體之後，個體或哺乳動物展示以下中之一或多者可觀察及/或可測量之減少或不存在以下中之一或多者’則成功地「治療」該患者之表現FcRH5多肽的癌症：癌細胞數減少或癌細胞不存在；腫瘤尺寸減小；抑制（亦即在某種程度上延緩，且較佳停止）癌細胞浸潤於周邊器 g中，包括癌症擴散於軟組織及骨中；抑制（亦即在某種程度上延緩’且較佳停止）腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長，及/或在某種程度上緩解一或多個與特定癌症相關之症狀；降低發病率及死亡率，及改良生活品質問喊。就抗FcRH5抗體可阻止所存在之癌細胞生長及/或殺滅所存在之癌細胞而言，該抗FcRH5抗體可具有細胞生長抑制性及/或細胞毒性。患者亦可感覺到此等病徵或症狀之減輕。評定成功治療及改良疾病之上述參數可易於由醫師熟知之吊規程序測量。對於癌症療法’例如可藉由評定疾病進程之時間（TTP)及/或測定反應速率（RR)測量功效。癌轉移可藉由分期測試及藉由骨掃描及鈣含量及其他酶之測試來測定以確定至骨中之擴散。亦可進行CT掃描以尋找於該區域中之骨盆及淋巴結十的擴散。分別使用胸部X射線及藉由已知方法測量肝酶含量尋找於肺及肝中之癌轉移。其他 147375.doc •86- 201039846 監測疾病之常規方法包括經直腸超音波掃描術（Τ R XJ s)及妙直腸針刺活檢（TRNB)。對於較為局部之癌症膀胱癌，確定疾病進程之方法包括精由膀胱鏡檢進行泌尿細胞學評估、監測尿中血液之存在、藉由音波掃描術或靜脈内腎盂照相觀察尿道上皮、電腦斷層攝影法（CT)及磁共振成像（MRI)。相癌轉移之二 =可藉由腹部CT、胸部χ射線或骨路之放射性核素成定。 Ο 〇「長期」投藥係指與短期模式相反以連續模式投劑’以長時間保持初始治療作用（活性）。「間歇式」投藥為並非連續不巾斷地進行而本質上循環進行之療法。乳動::體」=椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為哺型動物、寵物（諸如貓、狗運動咏。在某些實施例中，哺乳動物為人類。鼠及大出於治療癌症、緩和癌症症狀之目的的「指任何歸屬於哺乳動物之動物’包括人類、 2 ΠΓ:動型動物或寵物動物，諸如狗、“ 馬綿平、緒、山羊、兔等卞「與-或多種其他治療劍：L:t較佳為人類。以任何次序連續投藥。 5」投樂包括同時（共同）及如本文所用之「载劑」包括醫藥學形劑或穩定劑，其在所採用之劑 == 之細胞或哺乳動物無毒。 τ對暴路於其生里予上可接受之載劑為 147375.doc •87· 201039846 pH缓衝水溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括缓衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量（小於約10個殘基）多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麵醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合勿匕括葡萄糖、甘4糖或糊精；螯合劑，諸如; 糖醇’諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉，及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN®、聚乙二醇 (PEG)及 PLURONICS®。彳」或固體支撐物J意謂本發明之抗體可黏附或 2之非水性基質。本文所涵蓋之固相之實例包括部分或完全由玻璃(例如可控孔隙玻璃）、多醣(例如瓊脂糖卜聚烯醯胺|苯乙婦、聚乙稀醇及聚石夕氧形成之固相。名某二^施例中，視情況而^，固相可包含分析板之孔；在其他實施例中，其為純化管柱（例如親和層析管柱）。此饰語亦包括離散粒子之不連續固相，諸如美國專 4,275，149號中所述之固相。 /1旨！體」“各類脂質、磷脂及/或界面活性劑掮適用於向哺乳動物傳遞藥物（諸如FcRH5抗體）的小泡 1排=體之組分通常類似於生物膜之脂質排列以雙層形小」分子或於約500道爾頓。有機分子在本文中定義為分子量低 147375.doc •88· 201039846 個體」或「患者」為脊椎動物。在某些實施例中脊椎動物為哺礼動物。嗔乳動*包括（但不限於）農畜（諸如母牛）、運動型動物、寵物（諸如貓、狗„)、t長類(=母小鼠及大鼠。在某些實施例中，哺乳動物為人類。術语「醫藥調配物」係指呈—定形式以使活性成分之生 $活性有效且不含有對將投與調配物之㈣具有不可接受毋！·生之其他組分的製劑。該調配物可為無菌的。「無菌」調配物為滅菌的或不含所有活微生物及其孢子。如本文所揭示之抗體之「有效量」為^以進行特別說明之目的的量。「有效量」可關於所說明之目的，憑經驗且以常規方式確定。術語「治療有效量」係指抗體或其他藥物有效「治個體或哺乳動物之;东、戌七p ^ 之疾@或病症的量。在癌症的情況下，户療有效量之㈣可減少癌細胞數’·減小遽瘤尺寸；抑= 〇 (:即在某種程度上延緩且較佳停止)癌細胞浸潤周邊器 Β ’抑制（亦即在某種程度上延緩且較佳停止）腫瘤轉移；在某種程度上抑制鍾瘤生長；及/或在某種程度上緩解_ 或^固與癌症相關之症狀。參見本文中「治療」之定義。就藥物可阻止所存在$、步纟& & 仔在之癌細胞生長及/或殺滅所存在之癌細胞而言，該藥物可具有細胞生長抑制性及/或細胞毒性。預时效Ϊ」係指在所需劑量下且歷時所需時間有效達成所需預防結果的量。因為預防劑量係在疾病發生之前或在疾病早期用於個體令，故預防有效量通常但未必小 147375.doc -89- 201039846 於治療有效量。抗FcRH5抗體之「生長抑制量」為在活體外或活體內 r 1 月t» 夠抑制細胞（尤其腫瘤，例如癌細胞）生長的量。出於抑制贅生性細胞生長之目的，抗FcRH5抗體之「生長抑制量」可憑經驗且以常規方式確定。抗FcRH5抗體之「細胞毒性量」為在活體外或活體内能夠破壞細胞（尤其腫瘤，例如癌細胞）的量。出於抑制贅生性細胞生長之目的，抗FcRH5抗體之「細胞毒性量」可憑經驗且以常規方式確定。「表現FcRH5之細胞」為在細胞表面上或以分泌形式表現内源或經轉染FcRH5多肽的細胞。「表現FcRH5之癌症」為包含細胞表面上存在FCRH5多肽或產生且分泌FcRH5多肽的細胞的癌症。「表現FcRH5之癌症」視情況在其細胞表面上產生足量之FcRH5多肽，以使抗FcRH5抗體可結合於該FcRH5多肽且對該癌症具有治療作用。在另一實施例中’「表現FcRH5之癌症」視情況產生且分泌足量之FcRH5 多肽’以使抗FcRH5抗體拮抗劑可結合於該fcrh5多肽且對該癌症具有治療作用。對於後者，拮抗劑可為反義寡核. 普酸’其減少、抑制或阻止腫瘤細胞所進行之所分泌 FcRH5多肽的產生及分泌。r過度表現」FcRH5多肽之癌症為相較於相同組織類型之非癌性細胞，細胞表面具有顯著較高含量之FcRH5多肽或產生且分泌顯著較高含量之 FcRH5多肽的癌症。該過度表現可能由基因擴增或由轉錄或轉譯增加引起。可在偵測或預測分析法中，藉由評估細 147375.doc -90- 201039846 胞表面上存在之FcRH5蛋白或細胞分泌之FcRH5蛋白之增加含量（例如經由免疫組織化學分析法，使用針對分離之 FcRH5多肽（其可使用重組DNA技術自編碼FcRH5多肽之分離之核酸製備）製備的抗FcRH5抗體；FACS分析等）來確定 FcRH5多肽過度表現。或者或另外，可例如經由螢光原位雜交使用對應於編碼FcRH5之核酸或其補體的基於核酸的探針（FISH ;參見1998年10月公開之W098/45479)、南方墨點法、北方墨點法或聚合酶鏈反應（PCR)技術（諸如即時定〇量PCR(RT-PCR))測量細胞中編碼FcRH5多肽之核酸或 mRNA的含量。亦可藉由例如使用基於抗體之分析法測量生物流體（諸如血清）中脫落之抗原來研究FcRH5多肽過度表現（亦例如參見1990年6月12日頒佈之美國專利第 4,933,294號；1991 年 4 月 18 日公開之 W091/05264 ; 1995 年 3月28日頒佈之美國專利5,401，638 ;及Si as等人J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990))。除上述分析法以外，熟習此項技術者可使用各種活體内分析法。舉例而言，可使患者體〇内之細胞暴露於視情況用可偵測標記（例如放射性同位素）進行標記之抗體，且可例如藉由外部掃描放射能或藉由分析取自先前暴露於抗體之患者之活檢物來評估患者體内抗體與細胞之結合。本文所用之術語「免疫黏附素」係指組合異源蛋白 (「黏附素」）之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功能的抗體狀分子。在結構上，免疫黏附素包含具有所需結合特異性且不為抗體之抗原識別及結合位點（亦即「異 147375.doc •91 · 201039846 源」）的胺基酸序列與免疫球蛋白十互免疫黏附素分子之黏附素部分通常為體之結合位點的相鄰胺基酸序蛋白恆定域序列可獲自任何 IgG-2、IgG-3 或 IgG-4 亞型、 IgE、IgD 或 IgM。定域序列的融合物。至少包含受體或配位歹】。免疫黏附素中之免疫球免疫球蛋白，諸如、

IgA(包括1gA-Ι 及 IgA-2)、措辭「標記」當在本文中使用時係指直接或間接結合於抗體以產生「標記」之抗體的可偵測化合物或組合物。標記可自身可偵測（例如放射性同位素標記或螢光標記）或在酶標記的情況下，可催化受質化合物或組合物I化學變化，該變化為可偵測的。本文所用之術語「細胞毒性劑」係指一種抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素（例如 At211、I13i、I125、γ9〇、Rel86、Reiss、

Sm153、Bi212、P32及Lu之放射性同位素）、化學治療劑（例如’曱胺喋呤、阿黴素（adriamicin)、長春花生物鹼（vinca alkaloid)(長春新鹼、長春鹼、依託泊苷（et〇p〇side))、小紅每、美法命（melphalan)、絲裂徽素 C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、道諾黴素（daunorubicin))或其他插入劑、酶及其片段（諸如核分解酶）、抗生素及毒素（諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，包括其片段及/或變異體）及下文所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。其他細胞毒性劑如下所述。殺腫瘤劑致使腫瘤細胞破壞。 147375.doc •92· 201039846 「毒素」為任何能夠對細胞之生長或增殖具有不利作用之物質。「化學治療劑」為與作用機制無關適用於治療癌症的化合物。化學治療劑之類別包括（但不限於）烷基化劑、抗代謝物、紡錘體抑制劑、植物鹼、細胞毒性/抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、抗體、光敏劑及激酶抑制劑。化學治療劑包括用於「靶向療法」及習知化學療法之化合物。化學治療劑之實例包括：埃羅替尼（erlotinib) (TARCEVA®， Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛（TAXOTERE®，Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿續咬，5-氟尿》密咬，CAS編號51-21-8)、吉西他濱（GEMZAR®，Lilly)、PD-0325901(CAS 編號 391210-10-9，Pfizer)、順鉑（順雙氯胺鉑（II)，CAS 編號 15 663-27-1)、卡波鉑（CAS編號41575-94-4)、太平洋紫杉醇（TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、曲妥珠單抗（HERCEPTIN®，Genentech)、替莫嗤胺 (16111〇2〇1〇1111(16)(4-曱基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雙環[4.3.0] 壬-2,7,9-三烯-9-曱醯胺，CAS 編號 85622-93-1 ， TEMODAR®，TEMODAL®，Schering Plough)、他莫昔芬 ((Z)_2-[4-(l，2-二苯基丁-1-烯基）苯氧基]二甲基-乙胺，NOLVADEX®，ISTUBAL®，VALODEX®)及小紅每 (ADRIAMYCIN®)、Akti-1/2、HPPD及雷帕黴素（rapamycin)。化學治療劑之更多實例包括奥沙利銘（oxaliplatin) (ELOXATIN®，Sanofi)、硼替佐米（VELCADE®，Millennium Pharm.)、蘇登特（sutent)(SUNITINIB®，SU11248，Pfizer)、 147375.doc -93- 201039846 來曲。坐（FEMARA®，Novartis)、曱石黃酸伊馬替尼（imatinib mesylate)(GLEEVEC®, Novartis)、XL-518(Mek抑制劑， Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek 抑制劑， AZD6244，Array BioPharma，Astra Zeneca)、SF-1126 (PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K 抑制劑，Novartis)、XL-147(PI3K 抑制劑，Exelixis)、 PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟維司群（FASLODEX®、 AstraZeneca)、亞葉酸（leucovorin)(酸葉酸）、雷帕黴素（西羅莫司（sirolimus)，RAPAMUNE®，Wyeth)、拉帕替尼 (lapatinib)(TYKERB®，GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼（lonafarnib)(SARASARTM，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼（sorafenib)(NEXAVAR®，BAY43-9006， Bayer Labs)、吉非替尼（gefitinib)(IRESSA®，AstraZeneca)、伊立替康（CAMPTOSAR®，CPT-11，Pfizer)、替比法尼 (tipifarnib)(ZARNESTRA™ ， Johnson & Johnson)、 ABRAXANE™(無十六醇聚氧乙烯醚）、太平洋紫杉醇之經白蛋白工程改造奈米粒子調配物（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II)、凡德他尼（vandetanib)(rINN， ZD6474 ，ZACTIMA® ， AstraZeneca)、克諾布西 (chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU 5271 ; Sugen)、替羅莫司（temsirolimus)(TORISEL®，Wyeth)、帕。坐帕尼 (pazopanib)(GlaxoSmithKline)、康福胺(canfosfamide) (TELCYTA®，Telik)、塞替派（thiotepa)及環磷醯胺 (cyclosphosphamide)(CYTOXAN®、NEOSAR®);院基石黃 147375.doc -94- 201039846

酸鹽，諸如白消安（busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)及略泊舒凡（piposulfan);氮丙咬（aziridine)，諸如苯嗤多巴 (benzodopa)、卡波酿i(carboquone)、米特多巴（meturedopa) 及尤利多巴（uredopa);伸乙基亞胺（ethylenimine)及甲基密胺（methylamelamine)，包括六甲密胺（altretamine)、三伸乙基密胺（triethylenemelamine)、三伸乙基鱗酿胺 (trietylenephosphor amide)、三伸乙基硫代填醯胺 (triethiylenethiophosph or amide)及三甲基密胺 (trimethylolomelamine);多聚乙醯（acetogenin)(尤其布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮（bullatacinone));喜樹驗 (camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康（topotecan));苔蘚抑素（bryostatin);卡利他汀（callystatin); CC-1065(包括其阿多來新（adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新 (bizelesin)合成類似物）；念珠藻環肽（cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);多拉司他汀；多卡米辛 (duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189 及 CB1-TM1);艾權素（eleutherobin);潘克他 ί丁（pancratistatin);沙考的 ί丁 (sarcodictyin)；海綿抑素（spongistatin);氮芥（nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥（chlornaphazine)、氯填醯胺（chlorophosphamide)、雌莫司 ί丁（estramustine)、異環鱗酿胺（ifosfamide)、甲二氯二乙胺（mechlorethamine)、鹽酸曱二氣二乙胺氧化物（mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法命、新恩比興（novembichin)、苯乙酿膽固醇氮芥（phenesterine)、潑尼莫司汀（prednimustine)、 147375.doc -95- 201039846 曲洛璘胺（trofosfamide)、尿嘴唆氮界（uracil mustard);亞硝基脲，諸如卡莫司汀（carmustine)、氯脲黴素（chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司灯（lomustine)、尼莫司汁 (nimustine)及拉甯司汀（ranimnustine);抗生素，諸如稀二炔抗生素（例如，刺孢黴素、刺孢黴素γΐΐ、刺孢黴素 toIl(Angew, C/iew 五《g/·，（1994) 33: 183-186);達米辛（dynemicin)、達米辛A;雙膦酸鹽，諸如氣屈膦酸鹽 (clodronate);艾斯帕米辛（esperamicin);以及新製癌菌素 (neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團），克拉斯米辛（aclacinomysins) ’ 放線菌素（actinomycin)，奥斯拉米辛（authramycin)，偶氮絲胺酸（azaserine)，博來黴素（bleomycin)，放線菌素C(cactinomycin)，卡拉比辛 (carabicin)，洋紅黴素（carminomycin)，嗜癌菌素 (carzinophilin)，色黴素（chromomycinis)，放線菌素 (dactinomycin)，道諾黴素，地托比星（detorubicin)，6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸，（N-嗎啉基）-小紅莓，氰基（N-嗎啉基）-小紅莓，2-吡咯啉基-小紅莓及去氧小紅莓 (deoxydoxorubicin)，表柔比星（epirubicin)，依索比星 (esorubicin)，依達比星（idarubicin)，麻西羅黴素 (marcellomycin)，絲裂黴素（mitomycin)(諸如絲裂黴素 C)，黴盼酸（mycophenolic acid)，諾拉黴素（nogalamycin)，橄欖黴素（olivomycin)，培洛黴素（peplomycin)，泊非黴素 (porfiromycin)，嘌黴素（puromycin)，奎那黴素（quelamycin)，羅多比星（rodorubicin)，鏈黑菌素（streptonigrin)，鏈脲佐 147375.doc -96- 201039846 菌素（streptozocin)，殺結核菌素（tubercidin)，烏苯美司 (ubenimex)，淨司他丁（zinostatin)，左柔比星（zorubicin); 抗代謝物，諸如曱胺喋呤及5-氟尿嘧啶（5-FU);葉酸類似物，諸如迪諾特呤（denopterin)、甲胺嗓吟、蝶羅呤 (pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate) ; °票呤類似物，諸如氟達拉濱（fludarabine)、6-魏基嘌吟、嘆咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鳥嘌呤（thioguanine);癌咬類似物，諸如安西他濱（ancitabine)、阿紮胞普（azacitidine)、6 -氮尿普、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙去氧尿苷 (dideoxyuridine)、去氧乳尿苦（doxifluridine)、依諾他濱 (enocitabine)、氟尿皆（floxuridine);雄激素，諸如卡普睪酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄院（mepitiost an e)、睪内醋（testolactone);抗腎上腺（anti-adrenal)，諸如胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛司坦 (trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（frolinic acid); 醋葡醒·内 S旨（aceglatone);搭構酿胺苦（aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸（aminolevulinic acid);伊利盧拉（eniluracil);安 °丫。定（amsacrine);倍思塔布（bestrabucil); 比生群（bisantrene);艾達曲克（edatraxate);得弗伐胺 (defofamine);秋水仙胺（demecolcine);地 α丫酿（diaziquone); 艾弗利散（elfornithine);依利醋銨（elliptinium acetate);埃坡黴素（epothilone);依託格魯（etoglucid);硝酸鎵；經基脲；香菇多醣體（lentinan);羅尼達寧（lonidainine);類美 147375.doc -97- 201039846 登素，諸如美登素（maytansine)及安絲菌素（ansamitocin); 米托胍腙（mitoguazone);米托蒽酿（mitoxantrone);莫比達摩（mopidanmol);硝拉維林（nitraerine);噴司他汀 (pentostatin);凡那明（phenamet) ; °比柔比星（pirarubicin); 洛索蒽酿（losoxantrone);足葉草酸（podophyllinic acid); 2-乙基醯肼（2-ethylhydrazide);丙卡巴肼（procarbazine); PSK® 多醣複合物（JHS Natural Products, Eugene，OR);雷佐生（razoxane);根瘤菌素（rhizoxin);西佐鳴（sizofiran); 鍺螺胺（spirogermanium);細交鏈抱菌酮酸（tenuazonic acid);三亞胺酿（triaziquone) ; 2,2’，2’’-三氯三乙基胺；單端抱黴烯族毒素（trichothecene)(尤其T-2毒素、弗納庫林 A(verracurin A)、桿抱菌素 A(roridin A)及胺癸叮 (anguidine));烏拉坦（urethan);長春地辛；達卡巴口秦 (dacarbazine);甘露莫司汀（mannomustine);二演甘露醇 (mitobronitol);二漠，衛矛醇（mitolactol) ; β底泊溴烧 (pipobroman)；甲托辛（gacytosine);阿拉伯糖（「Ara-C」）；環磷醯胺；塞替派；6-硫基鳥嘌呤；巯基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡波鉑；長春鹼；依託泊苷（VP-16);異環磷醯胺（ifosfamide);米托蒽醌 (mitoxantrone);長春新驗；長春瑞濱（NAVELBINE®);諾凡特龍（novantrone);替尼泊苷（teniposide);依達曲沙 (edatrexate);道諾黴素；胺基σ集呤（aminopterin);卡培他濱（XELODA®，Roche);伊班膦酸鹽（ibandronate) ; CPT-11 ;拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟曱基鳥胺酸 147375.doc -98- 201039846 (DMFO);類視黃素，諸如視黃酸；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸及衍生物。「化學治療劑」之定義中亦包括：（i)用於調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑（SERM)，包括例如他莫昔芬（包括 NOLVADEX®;檸檬酸他莫昔芬（tamoxifen citrate))、雷洛昔芬（raloxifene)、曲洛昔芬（droloxifene)、4-經基他莫昔芬、曲沃昔芬（trioxifene)、雷洛昔芬（keoxifene)、 LY117018、奥那司酮（onapristone)及 FARESTON®(檸檬酸托瑞米芬（toremifine citrate)) ; (ii)抑制酶芳香酶之芳香酶抑制劑，其調節腎上腺中雌激素之產生，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE®(乙酸曱地孕酮（megestrol acetate))、AROMASIN®(依西美坦（exemestane) ; Pfizer)、弗米斯坦（formestanie)、法屈唑（fadrozole)、RIVISOR®(伏羅0坐（vorozole))、FEMARA(® 來曲。坐；Novartis)及 ARIMIDEX®(阿那曲坐；AstraZeneca); (iii)及抗雄激素，諸如氟他胺（flutamide)、尼魯胺（nilutamide)、比卡魯胺 (bicalutamide)、亮丙立德（leuprolide)及戈舍瑞林 (goserelin);以及曲沙他濱（troxacitabine)(—種 1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物）；（iv)蛋白激酶抑制劑，諸如MEK抑制劑（WO 2007/044515) ; (v)脂質激酶抑制劑；（vi)反義募核苷酸，尤其抑制與異常細胞增殖有關之信號傳導路徑 (例如PKC-α、Raf及H-Ras)中之基因表現的反義寡核苷酸，諸如奥布莫森（〇blimersen)(GENASENSE®，Genta 147375.doc -99- 201039846

Inc.) ; (vii)核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑（例如 ANGIOZYME®)及HER2表現抑制劑；（viii)疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®、LEUVECTIN®及 VAXID® ; PROLEUKIN®rIL-2 ;拓撲異構酶1抑制劑’諸如 LURTOTECAN® ; ABARELIX® rmRH ; (ix)抗血管生成劑，諸如貝伐單抗（AVASTIN®，Genentech);及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸及衍生物。「化學治療劑」之定義中亦包括治療性抗體，諸如阿侖單抗（卡普斯（Campath))、貝伐單抗（AVASTIN®, Genentech);西妥昔單抗（ERBITUX®, Imclone);盤尼圖單抗（VECTIBIX®，Amgen)、利妥昔單抗（RITUXAN®, Genentech/Biogen Idee)、帕妥珠單抗（pertuzumab) (OMNITARG™，2C4, Genentech)、曲妥珠單抗（HERCEPTIN®， Genentech)、托西莫單抗（tositumomab)(貝克佐（Bexxar), Corixia)及抗體藥物結合物-吉妥珠單抗奥唾米星 (MYLOTARG®，Wyeth)。「生長抑制劑」當在本文中使用時係指抑制活體外或活體内之細胞（尤表現FcRH5之癌細胞）生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著降低S期中表現FcRH5之細胞百分比之藥劑。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程（在除S期外之位置）之藥劑，諸如誘發G1停滞及Μ期停滯之藥劑。經典Μ期阻斷劑包括長春花類（vincas)(長春新鹼及長春鹼）、紫杉烷（taxane)及拓撲異構酶π抑制劑（諸如小紅莓、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及博來黴 147375.doc -100- 201039846 素）。使G1期停滯之彼等藥劑亦使s期停滯，例如，DNA烧化劑，諸如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴嗪、甲二氯二乙胺、順鉑、甲胺喋呤、5_氟尿嘧啶及ara_c。其他資訊可存在於 The Moleciuar Basis of Cancer Mendels〇hn 及。以“ 編’第l章，Murakami等人之題為「Cell cycle reg遍喊〇nC〇genes，and ⑽職…心 drugs」（wb $麵^: Ο

Philadelphia，1995)(尤其第13頁）中。紫杉烷（太平洋紫杉醇及多西他賽）為源自紫杉樹之抗癌藥。源自歐洲紫杉 (E则Pean yew)之多西他賽（tax〇tere⑧，Rh__p〇uienc Κ〇ΙΧΓ)為太平洋紫杉醇（TAX0L®，Bristol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平洋紫杉醇及多西他賽促進自微管蛋白二聚體組裝微管且藉由阻止解聚而使微管穩定從而對細胞有絲分裂產生抑制。「小紅莓」為蒽環黴素抗生素。小紅莓之完整化學名稱為（8S-順叫册胺基_2,3,6_三去氧义心來蘇己㈣基）氧基]-7,8,9，10-四氫_6,8，11-三羥基_8_(經基乙醯基）_1_曱氧基-5，12-幷四苯二酮。術語「細胞激素」為由一個細胞群體釋放之作為細胞間介體作用於另-細胞的蛋白f之通用術語。該等細胞激素之實例為淋巴激素、單核球激素及傳統多肽激素。細胞激素中包括生長激素’諸如人類生長激素、N甲硫胺酿基人類生長激素及牛生長激素；以狀腺激素；Μ腺素；騰島素；前胰島ϋ鬆弛素；前鬆弛素；醣蛋白激素，諸如促;慮泡激素（FSH)、促曱狀腺激素（tsh)及促黃體激素 147375.doc -101 - 201039846 (LH);肝生長因子；纖維胚細胞生長因子；促乳素；胎盤生乳素；腫瘤壞死因子α及腫瘤壞死因子β ;苗勒抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管内皮生長因子；整合素；企小板生成素（ΤΡΟ);神經生長因子，諸如NGF-β ;血小板生長因子；轉型生長因子 (TGF)，諸如TGF_a&TGF_p;胰島素樣生長因子ι及胰島素樣生長因子Π ;紅血球生成素（Ep〇);骨誘導因子；干擾素，諸如干擾素a、干擾素p及干擾素γ ;群落刺激因子 (CSF) ’諸如巨噬細胞_CSF(M_CSF);顆粒球_巨噬細胞-CSF(GM-CSF);及顆粒球-CSF(G-CSF);介白素（IL)，諸如 IL-1、lL_la、IL_2、IL_3、IL 4、IL 5、IL 6 ' il_7、 IL-8、IL-9、IL_u、IL_12 ;腫瘤壞死因子，諸*TNF_a或 ™F_P ;及其他多肽因子（包括UF及kit配位體（KL))。本文所用之術語細胞激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及天然序列細胞激素之生物活性等效物。術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用該等治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/或警告之資訊。術語「細胞内代謝物」係指由細胞内抗體-藥物結合物 (ADC)之代謝過程或反應產生的化合物。代謝過程或反應可為酶促過程’諸如蛋白水解裂解ADC之肽連接子，或水解官能基（諸如腙、酯或醯胺）。細胞内代謝物包括（但不限於）進入、擴散、吸收或輸送於細胞中之後已進行細胞内 147375.doc •102· 201039846 裂解的抗體及自由態藥物。術'「細胞内裂解」係指細胞内抗體_藥物結合物(adc) 之代謝過程或反應’由此藥物部分（D)與抗體（Μ之間的八^貝連接（亦即連接子）斷裂，從而在細胞内產生自抗體解離之自由態藥物。由此ADC之裂解部分為細胞内代謝物。術扣生物可用性J係指向患者投與之既定量之藥物的全身可用性（亦即血液/血製含量）。生物可用性為表明藥物自所投與劑型到達體循環（general eireuUtiGn)之時間（速率）及總量（程度）之量度的絕對項（abs〇lute term)。術語「細胞毒性活性」係指ADC或ADC之細胞内代謝物的殺滅細胞、細胞生長抑制作用或生長抑制作用。細胞毒性活性可以lew值表示，其為一半細胞存活時每單位體積之濃度（莫耳或質量）。本文所用之術語「烷基」係指具有1至12個碳原子 C I2)之飽和直鏈或分支鏈單價烴基，其中烷基可視情況經一或多個下述取代基獨立取代。在另一實施例中，烷基為 1至8個碳原子（CrC8)或1至6個碳原子（Ci_c6p烷基之實例包括（但不限於）甲基（Me、-CH3)、乙基（Et、-CH2CH3)、1_ 丙基（n-Pr、正丙基、_CH2CH2CH3)、2-丙基（i-Pr、異丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基（n_Bu、正丁基、_CH2CH2CH2CH3)、 2-甲基-1-丙基（i-Bu、異丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基（s-Bu、第二丁基、_CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基（t-Bu、第二丁基、-C(CH3)3)、1-戊基（正戊基、_ch2CH2CH2CH2CH3)、 2-戊基〇CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基（-CH(CH2CH3)2)、 147375.doc -103- 201039846 2 -曱基-2 -丁基（_C(CH3)2CH2CH3)、3 -曱基-2 -丁基（-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-曱基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、 2- 甲基-2-戊基（-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3 -甲基-2-戊基 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3) ' 4-曱基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、 3- 甲基-3-戊基（-C(CH3)(CH2CH3)2)、2 -甲基-3-戊基 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二曱基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、 3,3-二甲基-2-丁基（-CH(CH3)C(CH3)3)、1-庚基、1-辛基及其類似基團。術語「烯基」係指具有2個至8個碳原子（C2-C8)之具有至少一個不飽和位點（亦即碳_碳叩2雙鍵）的直鏈或分支鏈單 4貝經基，其中稀基可視情況經一或多個本文所述之取代基獨立取代，且包括具有「順式」及「反式」取向或者 E」及「Z」取向的基團。實例包括（但不限於）乙烯基（-ch=ch2)、烯丙基（_CH2CH=CH2)及其類似基團。術語「炔基」係指具有2個至8個碳原子（C2_C8)之具有至少一個不飽和位點（亦即碳_碳邛參鍵）的直鏈或分支鏈單價烴基，其中炔基可視情況經一或多個本文所述之取代基獨立取代。實例包括（但不限於）乙炔基（_C5CH)、丙炔基（炔丙基、-CH2〇CH)及其類似基團。術語「碳環」及「碳環基」係指具有3至12個碳原子 (q-cy單環形式或7至12個碳原子雙環形式的單價非芳族、飽和或部分不飽和環。具有7至12個原子之雙環碳環 147375.doc •104· 201039846 Ο ❹ 可例如以雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[Μ]系統排列，且具有 9或10個環原子之雙環碳環可以雙環[5,6]或[6,6]系統，或以諸如雙環[2.2」]庚院、雙環[2.2.2]辛燒及雙環[3 2 2]壬烷之橋式系統排列。單環碳環之實例包括（但不限於）環丙基、環丁基、環戊基、環戊小稀基、卜環戊_2_稀基、^ 環戍-3-烯基、環己基、卜環己小稀基、^環己丄締基、 1-環己-3·烯基、環己二稀基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基、環十-烧基、環十二烧基及其類似基團。土、「芳基」意謂具有6-20個碳原子(CVC2。)之單價茅族烴基，，其係藉由自母芳族環系統之單一碳原子移除一個氯原子衍生。一些芳基在例示性結構中表示為「Α。。芳基包括包含稠合至飽和、部分不餘和環或芳族碳環之芳族環= 雙環基團。典型芳基包括（但不限於）衍生自苯（苯基卜經 :代之苯、萘、蒽、聯苯、節基、二氫節基、U2-二氫蔡、1，2,3,4-四氫萘基及其類似基團的基團。芳基視情況經一或多個本文所述之取代基獨立取代。術語「雜環」及「雜環基」在本文t可互換使用且係指具有3至20個環原子之鮮或部分不飽和（亦即環中具有一或多個雙鍵及/或參鍵）碳環基團，其中至少一個環原子為選自氮、t、磷及硫之雜原子，剩餘環原子為c，其中一或多個環原子視情況經一或多個下述取代基獨立取代。雜環可為具有3至7個環成員（2至6個碳原子及…個選自Ν' 及S之雜原子)之早環’或具有7至1〇個環成員(4至9個石厌原子及1至6個選自Ν、〇、Ρ及S之雜原子)之雙環，例 147375.doc 201039846 如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。雜環描述於以下文獻中.Paquette, Leo A.;「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」（W.A. Benjamin, New York, 1968)，尤其第 i章、第3章、第4章、第6章、第7章及第9章；「The Chemistry of

Heterocyclic Compounds, A series of Monographs」（John

Wiley & Sons，New York，1950 至今），尤其第 13卷、第 14 卷、第16卷、第19卷及第28卷；及j. Am. chem. Soc. (1960) 82:5566。「雜環基」亦包括如下基團，其中雜環基團與飽和、部分不飽和環或芳族碳環或雜環稠合。雜環之實例包括（但不限於）吡咯啶基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫哌喃基、二氫哌喃基、四氫硫代哌喃基、N-哌啶基、N-嗎啉基、N_硫代嗎啉基、硫氧雜環己烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基、硫雜環丁烷基、高哌啶基、氧雜環庚烷基、硫雜環庚烷基、噁氮呼基、二氮呼基、噻氮呼基、2_吡咯啉基' 夂吡咯啉基、吲哚啉基、2H_哌喃基、4H_哌喃基、二氧雜環己烧基、U-工氧戊環基…比唾嘛基、二錢基、二硫雜環戊烷基、二氫旅喃基、二氫嗟吩基、二氳吱。南基…比唑啶基咪唑啉基、味唑啶基、3-氮雜雙環[3 1〇]己基、3-氮雜雙環[4.1.0m基、氮雜雙環[2.2.2]己基、3Hj絲喧唤基及N-吡啶基脲。此定義之範疇内亦包括螺部分。2個環碳原子經側氧基（_，=0)部分取代之雜環基之實例為嘴销基及m彳氧基_硫代嗎Μ。本文之雜環基視情況經一或多個本文所述之取代基獨立取代。 147375.doc -106- 201039846 術語「雜芳基」係指具有5員 ^貝、6貝或7貝％之單價芳族基’且包括具有5-20個原子之之稠％糸統（其中至少一者為芳、衣…°亥Λ原子含有-或多個獨立地選自氮、氧及 1之雜原子。雜芳基之實例為㈣基（包括例如2，經基吼咬基）、ϋ米唾基、。米σ坐幷σ比哈技土、〇密0定基（包括例如4-經基嘯咬基卜比唾基、三嗤基”比嗪基、四絲、咬喃基嘆吩基、異W基、料基、㈣基、異㈣基、料基、 ❹ ㈣基、異料基、㈣基、苯并㈣基、苯并咬喃基、碎琳基、❹基、㈣嗪基、敢嗪基、料基、三唤基、異t朵基、㈣基、以基H基、三4基、嗟二唾基噻-哇基、咬咕基、苯并吱咕基、苯并嗟吩基、苯并嗟嗤基、苯#。惡録、啥㈣基、㈣琳基、料基及咬喃幷吼録。雜芳基視情況經―或多個本文所述之取代基獨立取代。雜環或雜芳基可在可能之處經碳（經碳連接）或氮（經氮連鍵結。以實例之方式且並非加以限制，經碳鍵結之雜環或雜芳基係在以下位置鍵結：吡啶之位置2、3、4、5或 6，噠嗪之位置3、4、5或6，嘧啶之位置2、4、5或6，吡唤之位置2、3、5或6，。夫喃、四氫吱口南、嗟吩（thi〇furan、 thl〇phene)、吡咯或四氫吡咯之位置2、3、4或5，嗔唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5，異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5，氮丙啶之位置2或3，氮雜環丁烷之位置2、3 或4，喹啉之位置2、3、4、5、6、7或8或異喹啉之位置 1、3、4、5、6、7或 8° 147375.doc -107- 201039846 以實例之方式且並非加以限制，經氮鍵結之雜環或雜芳基係在以下位置鍵結：氮丙啶、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2_咪唑啉、3 咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2_吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H_吲唑之位置i，異吲哚或異吲哚啉之位置2 ’嗎琳之位置4及叶唾或β _ n卡淋之位置9。「伸烷基」係指具有1_18個碳原子且具有兩個單價基團中心的飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基，該等單價基團中心係藉由自母烷烴之同一個或兩個不同碳原子移除兩個氫原子衍生。典型伸烷基包括（但不限於）亞甲基（_CH2_)、丨，2-乙美 (-CH2CH2-) ^ l53-^^(-CH2CH2CH2-) ^ 1，4-T^(-CH2CH2CH2CH2-) 及其類似基團。 2 「CVCa伸烷基」為式·((：Η2)1_10_之直鏈飽和烴基。c广 C10伸烷基之實例包括亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基及伸癸基。「伸烯基」係指具有2_18個碳原子且具有兩個單價基團中心的不飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基，該等單價基團中心係藉由自母浠烴之同一個或兩個不同碳原子移^兩個氫原子衍生。典型伸烯基包括（但不限於）伸乙基 (-CH=CH-)。土「伸炔基」係指具有2_18個碳原子且具有兩個單價基團中心的不飽和分支鏈或直鏈或環狀烴基，該等單價基團中心係藉由自母炔烴之同一個或兩個不同碳原子移二氫 147375.doc •108- 201039846 原子衍生。典型伸炔基包括（但不限於）伸乙炔基（_c=c-)、诀丙基（-CH2CsC-)及 4-戍炔基（_cH2CH2CH2CeC-)。「伸芳基」為具有兩個共價鍵且可為如以下結構所示之鄰位、間位或對位構型的芳基：

其中苯基可未經取代或經至多四個基團取代，該等基團包

-N(R’）2及-CN;其中各R，係獨立地選自H、_C1_C8烷基及芳基。芳基烧基」係指非環狀燒基，其中鍵結至碳原子（通常為末端或sp3碳原子）之氫原子之一經芳基置換。典型芳〇基烷基包括（但不限於）苯甲基、2-苯基乙_1_基、2_苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙基、2_萘基乙烯+基、萘幷苯甲基（naphthobenzyl)、2-萘幷苯基乙·丨_基及其類似基團。芳基烷基包含6至20個碳原子，例如，芳基烷基之烷基部分（包括烷基、烯基或炔基）具有丨至6個碳原子且芳基部分具有5至14個碳原子。 ’其中鍵結至碳原子一經雜芳基置換。典雜芳基烷基」係指非環狀烷基， (通常為末端或sp3碳原子）之氫原子之型雜芳基烧基包括（但不限於苯并喷。坐基甲基、K喃 147375.doc -109- 201039846 基乙基及其類似基團。雜芳基烷基包含6至2〇個碳原子，例如雜芳基烧基之院基部分（包括院基、烯基或块基）具有工至6個碳原子，且雜芳基部分具有5至丨4個碳原子及丨至3個選自Ν、0、Ρ及S之雜原子。雜芳基烷基之雜芳基部分可為具有3至7個環成員（2至6個碳原子）或具有7至1〇個環成員 (4至9個碳原子及1至3個選自ν、〇、ρ及S之雜原子）之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。本案中所用之術語「前藥」係指醫藥學活性物質之前驅物或衍生形式’其對腫瘤細胞的細胞毒性相較於母體藥物更小且能夠酶促活化或轉化為更具活性之母體形式。例如參見 Wilman，「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」 &〇<:/2請化<3/15〇<^6沙7>««15<^"〇«15，14，第 375_382頁，0151;11

Meeting Belfast (1986)及 Stella等人「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，」D加c/W Dr咕

De/iver；；，Borchardt 等人（編），第 247_267 頁，Humana press (1985)。本發明之前藥包括但不限於：含磷酸根之前藥、含硫代填酸根之前藥、含硫酸根之前藥、含肽之前藥、經 D -胺基酸修飾之如樂、糖基化前藥、含β_内酿胺之前藥、含視需要經取代之苯氧基乙醯胺之前藥或含視情況經取代之苯乙醯胺之前藥、可轉化為更具活性之細胞毒性自由態藥物的5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿苷前藥。可衍生為用於本發明之前藥形式的細胞毒性藥物之實例包括（但不限於）上述彼等化學治療劑。「代謝物」經由指定化合物或其鹽之體内代謝產生的產 147375.doc •110· 201039846 物。可使用此項技術中已知之常規技術鑑別化合物之代謝物且使用測試（諸如本文所述之測試）來測定其活性。該等產物可來自例如所投與化合物之氧化'還原、水解、醯胺化、去醯胺化、酯化、脫酯化、酶促裂解及其類似作用。因此，本發明包括本發明化合物之代謝物，包括藉由包含使本發明之化合物與哺乳動物接觸一段時間以足以產生其代謝產物的方法產生的化合物。「脂質體」為由各類脂質、磷脂及/或界面活性劑構成、適用於向哺乳動物傳遞藥物的小泡囊。脂質體之組分通常類似於生物膜之脂質排列以雙層形式排列。「連接子」係指包含使抗體共價連接於藥物部分之共價鍵或原子鏈的化學部分。在各種實施例中，連接子包括二價基團，諸如烧基二基，芳基二基，雜芳基二基，諸如 _(CR2)nO(CR2)n之部分，絲基之重複單元（例如聚伸乙氧基、PEG、聚亞甲氧基)及烷基胺基(例如聚伸乙基胺基、 Jeffamine，；及〕酸醋及醯胺，包括丁二酸酉旨、丁二酿胺、氧二乙酸酯、丙二酸酯及己醯胺。術語「對掌性」係指具有不可與鏡像搭配物重疊之特性的分子’而術語「非對掌性」係指可與其鏡像搭配物重疊之分子。術語「立體異構體」係指具有相同化學組成，但原子或基團在空間之排列不同的化合物。「非對映異構體」係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且分子不為彼此之鏡像的立體異構體。非對映異構體具有 147375.doc 111 - 201039846 不同物理特性’例如熔點、彿點、光譜特性及反應性。非對映異構體之混合物可根據高解析度分析程序（諸如電泳及層析）分離。「對映異構體」係指化合物之不為彼此之可重疊鏡像的兩種立體異構體。本文所用之立體化學定義及規約一般遵循S. ρ· parker 編，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms⑷

McGraw-Hill Book Company，New Y〇rk ;及 Eliel，E.及

Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc.，New Y〇rk。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即其具有旋轉平面偏光之平面的能力。在描述光學活性化合物時，字首〇及1，或及及^用以表示該分子圍繞其對掌性中心之絕對構型。字首4及丨或（+) 及㈠用以表示化合物旋轉平面偏光之標記，其中㈠或1意謂該化合物為左旋化合物。以（+)或d為字首之化合物為右旋化合物。對於既定化學結構，其立體異構體相同，其例外為其為彼此之鏡像。特定立體異構體亦可稱作對映異構體，且該等異構體之混合物通常稱作對映異構混合物。對映異構體之50:50混合物稱作外消旋混合物或外消旋體，其可在化學反應或製程中無立體選擇性或立體特異性時存在。術語「外消旋混合物」及「外消旋體」係指兩種對映異構物質之等莫耳混合物，其無光學活性。術浯「互變異構體」或「互變異構形式」係指具有不同月b量之結構異構體，其可經由低能量障壁相互轉化。舉例 147375.doc •112· 201039846 而δ，質子互變異構體（亦稱作質子轉移互變異構體）包括經由質子遷移達成之相互轉化，諸如酮-烯醇及亞胺-燦胺異構化。價鍵互變異構體包括藉由__些鍵結電子重組達成之相互轉化。 Ο ❹ 本文所用之短„。「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之醫藥學上可接受之有機或無機鹽。例示性鹽包括 (但不限於)硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、廣化物、填化物、石肖酸鹽、硫酸氯鹽、碟酸鹽、酸式磷酸_異終驗酉楚鹽、乳酸鹽、水揚酸鹽、酸式棒樣酸鹽、酒：酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氯鹽抗壞血酸鹽、丁二酸醋、順丁稀二酸鹽、龍膽酸鹽 (gentmnate)、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、葡萄糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麵胺酸鹽、甲烷續酸鹽厂甲確酸鹽」、乙院續酸鹽、苯績酸鹽、對甲苯峰酸鹽及雙經萘酸鹽（亦即i，广亞曱基_雙（2_經基_3_萃甲酸鹽醫藥學上可接受之鹽可涉及包括另一分子(諸如乙酸根離子、丁二酸根離子或其他相對離子）。相對離子可為穩定母化合物上之電荷的任何有機或無機部分。此外，醫樂學上可接受之鹽之結構中可具有一個以上帶電原子。多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽之一部分的情況下可且有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。右本發明之化合物為鹼，則所需醫藥學上可接受之豳可藉由此項技術中可利用之任何適合之方法製備，例如：用 147375.doc •113- 201039846 無機酸（諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、甲烷磺酸、磷酸及其類似物）或用有機酸（諸如乙酸、三氟乙酸、順丁烯二酸、丁二酸'杏仁酸、反丁烯二酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水揚酸、諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸之哌喃糖酸（pyranosidyl acid)、諸如檸檬酸或酒石酸之α羥基酸、諸如天冬胺酸或麩胺酸之胺基酸、諸如苯甲酸或肉桂酸之芳族酸、諸如對甲苯磺酸或乙烷磺酸之磺酸或其類似物）處理游離鹼。若本發明之化合物為酸，則所需醫藥學上可接受之鹽可藉由任何適合之方法製備，例如用無機或有機鹼（諸如胺 (一級、二級或三級胺）、鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物或其類似物）處理游離酸.適合鹽之說明性實例包括 (但不限於）衍生自以下之有機鹽：胺基酸（諸如甘胺酸及精胺酸），氨’―級、二級及三級胺及環胺（諸如^、嗎琳及略嗓）；及衍生自鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁及鋰之無機鹽。短語「醫藥學上可接受之，# , 」表月物質或組合物必須與構成調配物之其他成分及/或用i、、Λ也> 士〜a &用具冶療之哺乳動物化學上及/ 或毒理學上相容。 |溶劑合物」係指一或多個溶劑分子與本發明之化合的締合物或複合物。形成溶劑合物之溶劑的實例包括( 不限於）水、異丙醇、乙醇、曱醇、蘭0、乙酸乙酷、酸及乙醇胺。術語「水合& r α物」係指溶劑分子為水之複物0 147375.doc 114· 201039846

G 術語「保護基」係、指通常用於阻擔或保護特定官能基而使化合物上之其他功能基反應的取代基。舉例而言，「胺基保護基」為連接於胺基之阻擋或保護化合物中之胺基官能基的取代基。適合之胺基保護基包括乙醯基、三氣乙酿基、第二丁氧羰基（B〇c)、苯甲氧羰基（CBZ)及9_第基亞曱氧基羰基（Fmoc)。類似地，「羥基保護基」係指阻擂或保護羥基官能基的羥基之取代基。適合之保護基包括乙醯基及矽烷基。「羧基保護基」係指阻擋或保護羧基官能基的羧基之取代基。常見羧基保護基包括苯基磺醯基乙基、氰基乙基、2-(三甲基矽烷基）乙基、2_(三曱基矽烷基）乙氧基曱基、2-(對曱苯磺醯基）乙基、2_(對硝基苯基次磺醯基）乙基、2-(二苯基膦基乙基、硝基乙基及其類似基團。關於保護基及其用途之一般描述參見T w Greene，Pr〇tective

Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991。「離去基」係指可經另一官能基取代之官能基。特定離去基為此項技術中所熟知且實例包括（但不限於）S基（例如氯基、溴基、碘基）、甲烷磺醯基（甲磺醯基）、對曱苯磺醯基（甲苯磺酿基）、三氟甲基磺醯基（三氟甲磺酸酯基）及三氟甲基磺酸酯基。縮寫連接子組分： MC=6-順丁烯二醯亞胺基己醯基

Val-Cit或「vc」=纈胺酸_瓜胺酸（蛋白酶可裂解連接子 147375.doc •115- 201039846 中之例示性二肽）瓜胺酸=2-胺基-5-腺基戍酸 PAB =對胺基苯曱氧基羰基（「自我犧牲（self immolative)」連接子組分之一實例）

Me-Val-Cit=N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸（其中連接子肽鍵已經修飾以阻止其因組織蛋白酶B而裂解） MC(PEG)6-OH=順丁烯二醯亞胺基己醯基-?炎乙二醇（可連接於抗體之半胱胺酸）。細胞毒性藥： MMAE=單曱基奥瑞他汀E(MW 718) MMAF=奥瑞他汀E(MMAE)之變異體，其中在藥物之C 末端具有苯丙胺酸（MW 731.5) MMAF-DMAEA=MMAF與DMAEA(二曱胺基乙胺）用鍵聯至C末端苯丙胺酸之醯胺鍵連接（MW 801.5) MMAF-TEG=MMAF與四乙二醇，用與苯丙胺酸成酯之方式連接 MMAF-NtBu=N-第三丁基與MMAF之C末端以醯胺連接 DM1=N(2’）-去乙醯基-N(2')-(3-巯基-1-側氧基丙基）-美登素 DM3=N(2’）-去乙醯基-N2-(4-巯基-1-側氧基戊基）-美登素 DM4=N(2')-去乙醯基-N2-(4-毓基-4-曱基-1-側氧基戊基）-美登素其他縮寫如下：AE為奧瑞他汀E，Boc為(第三丁氧基叛基），cit為瓜胺酸，dap為多拉普因（dolaproine)，DCC為 147375.doc •116- 201039846 1,3-二環己基碳化二亞胺，DCM為二氯甲烷，DEA為二乙胺，DEAD為偶氮二甲酸二乙酯，DEPC為氰基膦酸二乙酯，DIAD為偶氮二甲酸二異丙酯，DIEA為二異丙基乙胺，dil為多拉異白胺酸（dolaisoleucine)，DMA為二甲基乙醯胺，DMAP為4-二甲胺基吡啶，DME為乙二醇二甲基醚（或1,2-二曱氧基乙烷），DMF為二曱基曱醯胺， DMSO為二甲亞颯，doe為多拉苯胺（dolaphenine)，dov為二甲基纈胺酸，DTNB為5,5'-二硫雙（2-硝基苯曱酸）， DTPA為二伸乙基三胺五乙酸，DTT為二硫蘇糖醇，EDCI 為1-(3-二甲胺基丙基）-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽，EEDQ為 2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氫喹啉，ES-MS為電喷霧質譜，EtOAc為乙酸乙酯，Fmoc為iV_(9-苐基曱氧基羰基）， gly為甘胺酸，HATU為0-(7-氮雜苯并三唑-1-基）-况WW-四甲基錁六氟磷酸鹽，HOBt為1-羥基苯并三 °坐，HPLC為高壓液相層析，ile為異白胺酸，lys為離胺酸，MeCN(CH3CN)為乙腈，MeOH為曱醇，Mtr為4-甲氧基苯甲基二苯基甲基（或4-曱氧基三苯甲基），nor為（/叉 2i?)-(+)-降麻黃驗，PBS為填酸鹽緩衝生理食鹽水（pH 7.4)，PEG為聚乙二醇，Ph為笨基，Pnp為對硝基苯基， MC為6-順丁烯二醯亞胺基己醯基，phe為L-苯丙胺酸， PyBrop為六氟填酸溴參D比洛咬鱗，SEC為尺寸排阻層析， Su為丁二醯亞胺，TFA為三氟乙酸，TLC為薄層層析，UV 為紫外線且val為纈胺酸。「游離半胱胺酸胺基酸」係指已工程改造於親本抗體中 147375.doc -117- 201039846 之半胱胺酸胺基酸殘基具有硫氫基官能基（-SH)且尚未以分子内或分子間二硫橋形式配對。術語「硫氫基反應性值」為游離半胱胺酸胺基酸之反應性的定量特徵。硫氫基反應性值為經半胱胺酸工程改造之抗體中與硫氫基反應性試劑反應之游離半胱胺酸胺基酸之百分比且換鼻為农大值為1。舉例而言，經半脱胺酸工程改造之机體上與硫鼠基反應性試劑（諸如與生物素_«順丁稀二醯亞胺試劑反應形成生物素標記之抗體）以1 00%產率反應之游離半胱胺酸胺基酸的硫氫基反應性值為1.0。工程改造於相同或不同親本抗體中與硫氫基反應性試劑以80〇/〇產率反應之另一半胱胺酸胺基酸的硫氫基反應性值為 0 · 8。工程改造於相同或不同親本抗體中完全不能與硫氫基反應性試劑反應之另一半胱胺酸胺基酸的硫氫基反應性值為0。特定半胱胺酸之硫氫基反應性值之測定可藉由 ELIS A分析法、質譜、液相層析、自動放射照像術或其他定量分析測試進行。「親本抗體」為包含如下胺基酸序列的抗體，該胺基酸序列一或多個胺基酸殘基經一或多個半胱胺酸殘基置換。親本抗體可包含天然或野生型序列。親本抗體可相對於抗體之其他天然、野生型或經修飾形式具有前在胺基酸序列修飾（諸如添加、缺失及/或取代）。親本抗體可針對所關注之標靶抗原，例如生物學上重要的多肽。亦涵蓋針對非多肽抗原（諸如腫瘤相關之糖脂抗原；參見US 5091178)之抗體。 147375.doc -118- 201039846 表1 /* * C-C increased from 12 to 15

* Z is average of EQ

* B is average of ND * match with stop is _M; stop-stop = 0; J (joker) match = 0 */ 一 #deflne _M -8 /* value of a match with a stop */ int _day[26][26] = { /* ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ^/ /*A*/ {2,0,-2,0,03,1，-1，-1，0，七2，-1，〇，_从 1，〇，-2,1，1，〇, 〇,6s 0,-3,0}， Λ B V { 0, 3r4, 3,2S-5S 0S 1,-2,0,0,-3,-2,2,_M,-1S 1,0S 0S 0,0,-2,-5,0,-3,1}, !* C */ 丨-2，~4，15，-5,-5，-4，-3，-3，-2, 05-5，~6，-5，-4,一Mj-3,-5,-4,0，-2, 0，-2，-8, 05 0，-5}， /* D */ {0, 3，-5:4, 3，~6,1，1,-2,0,0，-4，-3,2，_H-1，2,1，0,0,0，-2，-7,0，-4,2}， /*BV { 0,2,-5, 3,4,-5, 0sl，-2,0, 0，-3，-2,1 jVt-l，2,-1，0,0, 0，-2，-7, 0,-4, 3}， Λ F */ {_4，-5，-4，-6，-5,9，-5，-2, 1，0，-5,2,0，-4 JVI^-K-3,-3,0，-l，0,0,7，-5}， /*〇*/ {1，0，-3,1，0,-5, 5,-2,3,0，-2,4s-3s0,一1，〇,〇,H〇，-5,0}， Λ H */ {-1 J，-3S U，-2，-2,6,-2,0,0，-2，-2, 2,_H 〇, 3,2，-1,-1，0;-2，-3,0,0,2}， Λ I V {-l，-2，-2，-2,-2, l，-3，-2t 5, 0，-2,2,2,-2，—风-2，-2，-2，-1，0,0,4，-5, 0，-l，-2}， /* J */ Λ K V {-ls〇A 〇Λ-5，-2,〇A 0, H0,3,0,0,0，-2，-3s 0,4,0}，

/* L */ {-2，-3，-6，-4，-3,2，-4，-2,2, 0，-3,6,4，-3,一H-3，-2，-3，-3，-l，0,2,-2,0，-l，-2}， /*M*/ {-1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0,0,4S 6,-2,0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-l}, /* N */ { 0二-4,2 Jr4, (U，-2,0, ]，-3,2s 29_M,-U，0,1，0, 0r2,4, 0，-2= 1}， Λ P V {19-1 ,-3,-1,-L-5,-1,0,-2,0,-1,-3r2s-l5_M, 6, 〇" 0,1,0,0,-1,-6,0s-5,0}, /*Q*/ { 0,1,-5,2,2,-5,-1,3,-2,0, 1,-2,-1, 1,_M, 0,4,1,-1,-1, 0,-2,-5,0,Λ 3}, Λ R */ {·2,0,4，-l，-l，A-3,2，-2,0,3，-3,0S 0，_H 〇, 1，6,0,1，0s-2,2,0;·4,0}， /* S */ { 1，0, 0S 0, 0,-3,1，-1，-1，0, 0，-3，-2,1，_H 1,-1，〇, 2,1，〇，-1，-2, 〇r3, 0}， /* T */ {1，0,-2,0,0，-3, 0，-l，0,0,0，-l，-l，0，_M，0,-1,-1,1，3,0,0，-5,0,-3, 0}， /* U */ {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,一M，0, 0,0,0,0,0,0,0,0, 0,0}， /*V*/ {0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4S 0r2s 2,2,-2}_M,-l ,-2,-2,-1 A 〇, 4,-6,0,-2,-2}, Λ W */ {-6,-5,-8,-7,-7,0,-7,-3,-5, 〇,-3,-2,-4,-4,_M,-6s〇s 2,-2,-5,0,-6,17,0, 0,-6}, Λ X V {0,0,0,0,0,0, 0,0,0,0,0,0,0, OJ^ 0, 0, 0,0,0,0,0,0,0, 0, 0}， Λ Y */ {-3,-3,0,4，-4,7,5,0,-1，0，*4,4，-2，-2，_Η-5，·4，-4，·35-3,0，-2,0,0J0〆}， Λ Z */ {0, l，-5,2, 3，-5,0,2，·2,0,0，-2，-U’一H 〇, 3,0,0,0, 〇，-2，-6,0，Λ 4} }；

119- 147375.doc 201039846 表ι(續） /* */ #include <stdio.h> #include <ctype.h>

#deflne MAX JMP 16 max jumps in a diag */ #define MAXGAP 24 /* don't continue to penalize gaps larger than this " #defme JMPS 1024 /* max jmps in an path */ #deflne MX 4 /* save if tfiene's at least λ4Χ-1 bases since last jmp */ #define DMAT 3 /* value of matching bases */ #define DMS 0 /* penalty for mismatched bases */ #deflne DINSO 8 /* penalty for a gap */ #def!ne DINS1 1 /* penalty per base */ ^define PINSO 8 /* penalty for a gap */ #deflne PINS1 4 /* penalty per residue */ struct jmp { short n[MAX JMP]; I* size of jmp (neg for dely) */ unsigned short x[MAX JMP]; /* base no. of jmp in seq x */ /* limits seq to 2Λ16 -1 */ struct diag { int score; /* score at last jmp */ long offset; /* offset of prev block *1 short ijmp; /* current jmp index */ struct jmp jp; /* list of jmps V struct path { int spc; /* number of leading spaces */ short n[JMPS]; /* size of jmp (gap) */ }； int x[JMPS]; /* loc of jmp (last elem before gap) */ char *ofile; /* output file name */ char *namex[2]; /* seq names: getseqs() */ char *pr〇g； /* prog name for err msgs */ char *seqx[2]; /* seqs: getseqs() */ int dmax; /* best diag: nw() */ int dmaxO; /* final diag */ int dna; /* set if dna: main() */ int endgaps; /* set if penalizing end gaps */ int gapx，gapy; /* total gaps in seqs */ int lenO, lenl; /* seq lens */ int ngapx，ngapy; /* total size of gaps */ int smax; /* max score: nw() */ int *xbm; /* bitmap for matching */ long offset; /* current offset in jmp file */ struct diag *dx; /* holds diagonals */ struct path PP[2]； /* holds path for seqs */ char *calloc()5 *malloc(), *index()3 *strcpy(); char *getseq(), *g_calloc(); -120- 147375.doc 201039846 表ι(續） /* Needleman-Wunsch alignment program * * usage: progs filel file2 * where filel and file2 are two dna or two protein sequences. * The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity * Any lines beginning with V, >' or '< are ignored * Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct)

* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assiimed to be DNA * Output is in the file "align-out" 幸 * The program may create a tnp file in /tmp to hold info about traceback. * Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650 */ #include "nw.h" ^include "day .h" static _dbval[26] = { 1,14,2^3,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,63,8,7,9,0,10,0

K

static _pbval[26] = { 1,2|(1«(,D,-,A,))|(1«(,N,-,A,)X 4, g, 16, 32,64, 128,256, OxFFFFFFF, 1«1〇, 1«11,1«12,1«13,1«14, 1«15,1«16,1«17> 1«18,1«19,1«20,1«21,1«22, 1«23,1«24, 1«25丨(1«(汜，-火))|(1«(，(？-，入_)) Ϊ； main main(ac，av) mt ac; char *av[]; { prog = av[0]; if(ac != 3){ fprintf(stderr»"usage: %s filel ίΉε2\ηΜ, prog); fprintf(stdeir}"where filel and file2 are two dna or two protein sequences,\nH); fprintf(stdeir,"*nie sequences can be in upper- or lower-case\n"); fprintf(stdeir,MAny lines beginning with V or *<* are ignored\n"); fprintifstderr,"Output is in the file \"align.out\"\n"); exit(l); } naniex[0] = av[l]; namexfl] = av[2]; seqx[0] = getseq(namex[0], &len0); seqxflj = getseq(namex[l], &lenl); xbm = (dna)? _dbval: _pbval;

endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps */ ofile = ''align.out"; /* output file */ nw(); /* fill in the matrix, get tlie possible jmps */ readjmps(); /* get the actual jmps */ print(); /* print stats, alignment */ cleanup(0); /* unlink any tmp files */} -121 - 147375.doc 201039846 表ι(續） /* do tlie alignment, return best score: main() * dna: values in Fitch and Smitli, PNAS, 80,1382-1386,1983 * pro: PAM 250 values * When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer * a new gap to extending ail ongoing gap, and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y. */ n\v() X char *px, *py; /* seqs and ptrs */ int ^ndely, *dely; /* keep track of dely */ int ndelx, delx; /* keep track of delx */ int *tmp; /* for swapping ro\\O, rowl *f int mis; /* score for each type */ int insO, insl; /* insertion penalties */ register id； /* diagonal index */ register ij； /* jmp index */ register *col0, *coll; !* score for curr, last row */ register xx, yy; /* index into seqs nw dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags", lenO+lenl+1, sizeof(struct diag)); ndely = (int *)g_calloc("to getndely", lenl+1, sizeof(int)); dely = (int "^g—calloc^’to get dely' lenl+1, sizeofljnt)); colO = (int *)g_calloc("to get colO", lenl+1, sizeol^int)); coll = (int *)g_calloc("to get coll", ]enl+l; sizeoi(int)); insO = (dna)? DINSO : PINSO; iiisl=(dna)?DINSl :PINS1; smax =-10000; if (endgaps) { for (co!0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= lenl; >7++) { col0[yy] = delv[yy] = col0[yy-l] - iiisl; ndely[yy] = yy; } col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ } else for (yy = 1; yy <= lenl; yy++) dely[yy] = -insO; Λ fill in match matrix */ for (px = seqx[0]? xx = 1; xx <= lenO; px++, xx++) { /* initialize first entry in col */ if (endgaps) { if(xx== 1) coll[0] = delx = -(iiisO+insl); else coll[0] = delx = col0[0] - insl; ndelx = xx; } else { co 剛=0; delx = -insO; ndelx = 0; } •122· 147375.doc 201039846 表ι(續） for (py = seqx[l], yy = 1; yy <= lenl; py++, yy++) { mis = colO[yy-l]; if (dna) mis += (xbm[*px-,A']&xbm[*py-'A'])? DMAT : DMIS; else mis += _day[*px-'A'][*py-'A']; /* update penalty for del in x seq; * favor new del over ongong del * ignore MAXGAP if weighting endgaps */ if (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) { if (col0[yy] - insO >= dely[yy]) { dely[yy] = col0[yy] - (ixisCHinsl); ndelyfyy] = 1; } else {

dely[yy] -= insl; ndely[yy]++; } } else { if (col0[yy] - (insO+insl) >= dely[yy]) { dely[yy] = col0[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1; } else ndely[yy]-H-; } /* update penalty for del in y seq; * favor new del over ongong del */ if (endgaps || ndelx < MAXGAP) { if (c〇ll[yy-l] - insO >= delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1; } else { delx -= ins 1; ndelx-H-; }

} else { if (coll[yy-l] - (insO+insl) >= delx) { delx = coll[yy-1] - (insO+insl); ndelx = 1; } else ndelx++; } /* pick the maximum score; we're favoring

* mis over any del and delx over dely V id = xx-yy+ lenl -1; if (mis >= delx && mis >= dely[yy]) coll [yy] = mis; -123 - 147375.doc 201039846 表ι(續） else if (delx >= dely[yy]) { coll [yy] = delx; ij = ic[id].ijmp; if(dx[id]jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP && xx > <£c[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].scorei-DE>iSO)) { dx[id].ijmp++; if(++ij>= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id] .offset = offset; offset+= sizeoi(stnictjmp)+ sizeof(offset); dx[id].jp.n[ij] = ndelx; dx[id].jp.x[ij] = χ?ς dx[id]. score = delx; else { coll[yy] = dely[yy]; ij = dx[id].ijmp; if (dx[id].jp.n[0] && (!c3na || (ndelyfyy] >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].scorei-DINSO)) { dx[id].ijmpH-; if(++ij>= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id] .offset = offset; offset += sizeoi(struct jmp) + $izeof(offset); dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy]; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id].score = dely[yy]; if (xx == lenO && yy < lenl) { /* last col */ if (endgaps) coll[yy] -= insO+insl*(lenl-yy); if (coll [yy] > smax) { smax = coll[yy]; dmax = id; if (endgaps && xx < lenO) coll[yy-l] -= insO+insl *(len0-xx); if(coll[yy-l] > smax) { smax = coll[yy-l]; dmax = id;} tmp = colO; colO = coll; coll = tmp;} (void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); (void) free((char *)col0); (void) free((char *)coll); } 147375.doc 124- 201039846 表ι(續） * print() ~ only routine visible outside this module 孝 * static: * getmat() — trace back best path, count matches: print() * pr_align() - print alignment of described in array p[]: print() * diimpblock() ~ dump a block of lines with mimbers, stars: pr_align() * nuins() — put out a number line: dumpblock() * putline() -- put out a line (name, [num], seq，inum]): dumpbIock() * starsQ · -put a line of stars: dumpblock() * stripname() - strip any path and prefix from a seqname

V

«include "nw.li" #defme SPC 3 #defineP LINE 256 /* maximum output line */ #defineP:SPC 3 /* space between name or mun and seq */ extern _day[26][26]; int olen; /* set output line length */ FILE *fx; print() /* output file */ print int lx, ly, firstgap, lastgap; I* overlap */ if ((fx = fopen(ofile, "w")) == 0) { fprintf(stderr,"%s: can't write %s\n", prog, ofile); cleanup(l); } fprintf(fx, "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[0], lenO); fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = namex[l]5 lenl); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl; firstgap = lastgap = 0; if (dmax < lenl - 1) { /* leading gap in x */ pp[0].spc = firstgap = lenl - dmax -1; ly -= pp[0].spc; } else if (dmax > lenl -1) { /* leading 莒即 in y pp[l].spc = firstgap = dmax - (lenl -1); lx -= pp[l].spc; } 〇 if (dmaxO < lenO - 1){ /* trailing gap in x */ lastgap - lenO - dmaxO -1; lx -- lastgap; } else if (dmaxO > lenO -1) { /* trailing gap in y */ lastgap = dmaxO - (lenO -1): ly -= lastgap; } getmat(lx, ly, firstgap, lastgap); pr_align(); } 125. 147375.doc 201039846 表ι(續） /* * trace back the best path, count matches */ static gettnat(Lx, ly, firstgap, lastgap) int lxsly; int firstgap, lastgap;{ int nm, iO, il char outx[32]; double pet; register nO, nl; register char *p0, *pl; /* get total matches, score */ /* "core" (minus endgaps) */ /* leading trailing overlap */,sizO, sizl; getmat iO = il = sizO = sizl = 0; pO = seqx[0] + pp[l】.spc; pi = seqxjl] + pp[0].spc; nO = ppflj.spc + 1; nl = pp[0].spc+ 1; nm = 0; while ( *p0 && *pl) { if (sizO) { pl++; nl++; sizO-;} elseif (sizl) { P〇++; n0++; sizl··; else { if (xbm[*pO-,A,]&xbm[*pl-,A']) nm-H-; if (nO++ == pp[0].x[i0]) sizO = pp[0].n[i0++]; if (nl-H· == pp[l]-x[il]) sizl = pp[l].n[il++];

/* pet homology: * if penalizing endgaps, base is the shorter seq * else, knock off overhangs and take shorter core */ if (endgaps) lx = (lenO < lenl)? lenO : lenl; else lx = (ί\ < ly)? lx: ly; pct= 100.*(double)nm/(Uouble)lx; fprinlf(fxs "\n"); fprintf(fx, M<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n"5 nm, (nm == 1)? H": "es", lx, pet); 147375.doc 126- 201039846 表ι(續）

fprintf(fxs "<gaps in first sequence: %dM, gapx); if(gapx){ (void) sprintf(outx," (%d %s%s)", ngapx, (dna)? "base":"residue", (ngapx == 1)? fprintf(fx,"%s", outx); fpriiitf(fx,", gaps iii second sequence: %d'\ gapy); if(gapy){ (void) spriiiti(outx," (%d %s%s)", ngapy, (dna)? "base',:"residue",(ngapy == 1)? fprintf(fxa"%s", outx);J if (dna) fprintf(fx, "\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base)\n"s smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1); else fprinti(fx, n\n<score: %d(DayhofFPAM250 matrix, gap penalty = %d + %dperresidue)\n", smax, PINSO, PINS1); if (endgaps) fprintf(&, ”<endgaps penalized, left endgap: %d %s%s，right endgap: %d %s%s\n' firstgap, (dna)? "base": "residue", (firstgap == 1)? "": "s", lastgap, (dna)? "base": "residue", (lastgap == 1)? "": "s"); else fprintf(fx9 "<endgaps not penalized\n"); getmat static ran; /* matches in core — for checking */ static lmax; /* lengths of stripped file names */ static mi /* jmp index for a path */ static nc[2]; /* number at start of current line */ static ni[2]; /* current elem number — for gapping */ static siz[2]; static char *PS[2J; /* ptr to current element */ static char *P〇[2]； I* ptr to next output char slot */ static char out[2][P_LINE]; /* output line */ static char star[P_LINE]; l* set by stars() */

/* * print alignment of described in struct path pp[] */ static pr_align(){ int nn; I* char count */ int more; register i; for (i = 0, lmax = 0; i < 2; i-H-) { nn = stripname(namex[i]); if (nn > lmax) lmax = nn; nc[i]=l; ni[i] = 1； siz[i] = ij[i] = 0; ps[i] = seqx[i]; po[i] = out[i]; J pr一 align 147375.doc -127- 201039846 表ι(續） for (nn = nm = 0, more = 1; more;) { for (i = more = 0; i < 2; i++) { Λ * do we have more of this sequence? *i if〇*ps[i]) continue; more++; if (pp[i].spc) { /* leading space */ *po[i]++ = ''; pp[i].spc-;} else if (siz[i]) { /* in a gap *1 *po[i]++ = siz[i]-;} else { /* ^'e're putting a seq element */ *po[i] = *ps[i]; if (islo\ver(*ps[i])) *ps[i] = tonpper(*ps[i]); po[i]++; ps[i]++; /* * are we at next gap for this seq? *! if(ni[i]==pp[i]-x[ij[i]]){ /* * we need to merge all gaps * at this location */ siz[i] = pp[i].n[ij[i]++]; while (ni[i] == pp[i]-x[ij[i]]) siz[i] +=pp[i].n[ij[i]++];} ni[i]++；}} if (*H-nn == olen 11! more && nn) { dumpblock(); for(i = 0;i<2;i-H-) po[i] = out[i]; nn = 0: .pralign /* * dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align() */ — static dumpblockO{ register i; for(i = 0;i<2;i++) *po[i]--=丨\0，; dumpblock 147375.doc 128- 201039846 表ι(續） (void) putcC^*, ix); for(i = 0;i<2;i++){ if (*oul[i] && (*out[i] !=’_ || *(po[i]) !=’’)）{ if (i == 0) nums(i); if (i == 0 && *out[l]) stars(); putliiie(i); if(i == 0 && *out[l]) 1printf(fx, star), if(i== 1) nums(i); ...dumpblock

i* * put out a number line: dumpblock() */ static nums(ix) int ix; /* index in out[] holding seq line */{ char nline[P_LINE]; register i，j; register char *pn, *px, *py; for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn-H-) *pn =' for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++s pn++) { if(*py=="||*py==’」） *pn =' else { if (i%10 == 0 || (i == 1 && nc[ix] != 1)) { j = (i<0)?-i:i; for (px = pn; j; j /= 1 〇s px~) *px = j%10 + O\ if(i<0) *px =} else *pn = "; nums

*pn = '\0'; nc[ix] = i; for (pn = nline; *pn; pn++) (void) putc(*pn, fx); (void) putc('\n', fx);} I* * put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblock() */ static putline(ix) int Lx; putline 147375.doc -129- 201039846 表ι(續） ...putline int i; register char *px; for (px = namexfix], i - 0; *px && *px != px++, i++) (void) putc(*px, fx); for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc('fx); /* these count from 1: * ni[] is current element (from 1) * nc[] is number at start of current line *1 for (px = out[ix]; *px; px++) (void) putc(*px&6x7F，fic); (void)putc('\n',fx); } I* * put a line of stars (seqs always in out[0], out[l]): dmnpblock() */ static stars() stars { int i; register char #ρ1, cxs *px; if (!*out[0] || (*out[0] = ，&& *(po[0]) == ") || !*out[l] || (*out[l] =='' && *(p〇[l])=='')) return; px = star; for (i = lmax+P_SPC; i; i-) *px++ = 1 for (pO = out[0], pi = out[l]; *p0 && *pl; p〇-H-, pl++) { if (isalph^^pO) && isalpha(*pl)) { if (xbm[*pO-,A,]&xbm[*pl-'A']) { cx = else if (!dna && _day[*pO-'A'][*pl-'A'] > 0) cx = V; else cx = _ Ϊ else cx = *px++ = cx; } *px++ = V; *px = '\0'; •130- 147375.doc 201039846 表ι(續） /* * strip path or prefix from pn, return len: pr_align() */ 一 static stripname(pn) char pn； register char /* file name (may be path) */V、*py; stripname py = 〇； for (px = pn; px++) if(*px== Ϊ) py = px+l; 'f(py) (void) strcpy(pn, py); return(strlen(pn));

❹ 147375.doc • 131 - 201039846 表ι(續） /* * cleanup() - cleanup any tinp file * getseq() - read in seq, set dna, len, maxlen * g_calloc() ~ calloc() wdth error checkin * readjmps() - gettlie goodjmps, from tmp file if necessary * wTitejmpsQ - write a filled array of jmps to a tmp file: nw() */ #include ''nw.h" #include <s>'s/iile.h> char *jname= 'Vtmp/liomgXXXXXX"; /* tmp file for jmps *1 FILE *ij; int cleanup(); /* cleanup tmp file */ long lseek(); /*

* remove any tmp file if we blow V cleanup cleanup(i) int i; { if(Q) (void) imlink(jname); exit(i)； } /* * read, return ptr to seq, set dna, len, maxlen * skip Imes starting with V, or '>' * seq in upper or lower case */ char * getseq(file, len) char int ♦len; /* file name */ /* seq len */ getseq char line[1024]，*pseq; register char #px, *py; int natgc, tlen; FILE *fp; if ((fp = fopen(file，'V，)) == 0) { fprintf(stderr,"%s: can't read %s\ii", prog, file); exit(l)； tlen = natgc = 0; while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line == ;，|| *line: :'<'|| *line =='>') continue; for (px = line; *px != V; px++) if (isupper(*px) || islower(*px)) tlen-H-; if ((pseq = malloc((u!isignedXtlen+6))) == 0) { fpriiitf(stderr,"%s; malloc() failed to get %d bytes for %s\n", prog, tlen+6. file); exit(l);} pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = *\0'; 147375.doc -132- 201039846 表ι(續）

py = pseq + 4; *len = tlen; rewind(fp); while (fgets(lines 1024, fp)) { if (*line == || *line == '<* || *line =='>') continue; for (px = line; *px != '\n'; px++) { if (isupper(*px)) *py++ = *px; else if (islower(*px)) *py++ = toupper(*px); if(index(”ATGCU'*^)y-l))) natgc+屮；}} *py++ = '\〇'; *py =，\0，； (void) fclose(fp); dna = na^c > (tIen/3); return(pseq+4);} char * ...getseq g_calloc(msg3 nx, sz) char *msg; int nx, sz; /* program, calling routine */ /* number and size of elements */ g^calloc char *px, *calloc(); if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) == 0) { if(*msg){ fprintf(stderr, "%s: g callocQ failed %s (n=%d, sz=%d)\n". prog, msg, nx, sz); exit(l);} return(px);

f* * get final jmps from dx[] or tmp file, set pp[], reset dmax: main() V readjmpsQ{ int fd = -1; int siz,i0, il; register ij,xx; (void) fclose(^); if ((fd = open(jname, O_RD0NLY, 0)) < 0) { fprintf(stdeiT, "%s: can't open() %s\n", prog, jname); cleanup 1);}} ·. for (i = iO = il = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO;; i++) { while (1){ for(j = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] >= xx; j-) readjmps 147375.doc 133- 201039846 表ι(續） if (j < 0 && dx[dmax] .offset && tj) { (void) lseek(fd, dx[dmax] .offset, 0); (void) read(fd, (char ♦)&dx[<3max].jp, sizcof(struct jmp)); (void) read(fd, (char #)&ί1χ[^3Χ].οίΓ5βΙ, sizeo<(dx[dmax].oirsel)); dx[di0ax].ijn^) = MAXJMP-l 丨 } else break; } if (i >= 3MPS) { fprinti^stderr, "%s: too many gaps in alignmentV, prog); cleanup 1); } siz = dx[dmax].jp.n[j]; xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax += siz;

if (siz < 0) { /* gap in second seq V pp[l].n[il] = -siz； xx += siz; /* id = xx - yy + lenl · 1 */ pp[l].x[il] = xx- dmax+ lenl -1; gapy-H-; ngapy -= siz; /* ignore MAXGAP \\^hen doing endgaps */ siz = (-siz < MAX GAP || endgaps)? -siz : MAXGAP; il++; } else if (siz > 0) { /* gap in first seq */ pp[0].n[i0] = siz; ρρ[0].χ[ϊ0] = xx; gapx++; ngapx += siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? siz : MAXGAP; i0++; } else break; } /* reverse the order of jmps */ for 〇 = 0, i0-; j < iO; j++s i0-) { i = pp[〇].n[j]； pp[0].n(j] = pp[0].n[i0]; pp[〇].n[iO] = i; i = pp[0]-x[j]; pp[〇].x[j] = pp[〇].x[i〇3； PP[〇].x[i〇] = i； } for (j = 0, il-; j < il; j++s il-) { i = PP[l]-n[j]； PP[l] n[i] = pp[l].n[il]; pp[l].n[il] = i； i = pp[l].x[j]； PP[l]-xLj] = pp[l].x[il]; pp[l].x[il] = i; } if(fd>= 0) (void) close(fd); 刚）{ (void) unlinlc(jname); Q = 〇； offset = 0; 134- readjmps 147375.doc 201039846 表ι(續） * write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw() *1 writejmps(ix) writejmps int ix; { char *mktemp(); 疗(即{ if (mktemp(jname) < 0) { fprintf(stderr, "%s: can't mktemp() %s\n' prog，jname); cleanup(l); } if ((ij = fopen(jnames "w")) == 0) { fprintf(stden·, "%s: can't write %s\n", prog, jname); exit(l); } } (void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, Q); (void) f\vrite((char *)&dx[ix].offset, sizeo^dxtixj.offset), 1, fj); o 5 III.本發明之組合物及方法本發明提供抗FcRH5抗體或其功能片段及其用於治療造血系統腫瘤之方法。在一態樣中，本發明提供一種較佳特異性結合於任何上述或下述多肽的抗體。視情況，抗體為單株抗體、抗體片段（包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段）、雙功能抗體、單域抗體、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或競爭性抑制抗 ❹ 多肽抗體結合於其各別抗原性抗原決定基的抗體。本發明之抗體可視情況結合於生長抑制劑或細胞毒性劑，諸如毒素（包括例如奥瑞他汀、類美登素、多拉司他汀衍生物或刺孢黴素）、抗生素、放射性同位素、核分解酶或其類似物。本發明之抗體可視情況在CHO細胞或細菌細胞中產生，且較佳誘發其所結合之細胞死亡。出於偵測目的，本發明之抗體可進行可偵測地標記、連接於固體支撐物或進行類似處理。 -135 - H7375.doc 201039846 在一態樣中’本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之單價親和力（例如Fab片段形式之抗體對FcRH5之親和力）實質上等同於鼠類抗體之單價親和力 (例如Fab片段形式之鼠類抗體對FcIai5之親和力）或嵌合抗體之單價親和力（例如Fab片段形式之嵌合抗體對FcRH5之親和力），該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖9(SEq ID NO: 18)及圖l〇(SEQ ID NO: 20)中所述之輕鏈及重鏈可變域序列’由該等序列組成或基本上由該等序列組成。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之單價親和力（例如Fab片段形式之抗體對FcRH5之親和力）為小於鼠類抗體之單價親和力（例如 Fab片段形式之鼠類抗體對FcRH5i親和力）或嵌合抗體之單價親和力（例如Fab片段形式之嵌合抗體對卜1?^15之親和力）例如至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、 45、50、55或60倍’該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖 9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID N〇: 2〇)所述之輕鏈及重鏈可變域序列，由該等序列組成或基本上由該等序列組成。在另悲樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之單價親和力（例如Fab片段形式之抗體對FcRH5之親和力）為大於鼠類抗體之單價親和力（例如 Fab片段形式之鼠類抗體對以11115的親和力）或嵌合抗體之單扣親和力（例如Fab片段形式之嵌合抗體對FcRH5的親和 147375.doc 201039846 力）例如至少1、2 ' 3、4、5、6、7、8、9或10倍，該鼠類或嵌合抗體包含如圖9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)所述之輕鏈及重鏈可變域序列，由該等序列組成或基本上由該等序列組成。在一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）實質上等同於鼠類抗體之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）或嵌合抗體之〇二價形式親和力（例如Fab片段形式之嵌合抗體對FCRH5之親和力）’該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖9(SEQ ID NO: 18)及圖l〇(SEQ ID NO: 20)中所述之輕鏈及重鏈可變域序列’由該等序列組成或基本上由該等序列組成。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FeRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為小於鼠類抗體之二價形式親和力 ❹（例如形式之抗體對FcRH5之親和力）或嵌合抗體之二價形式親和力（例如I g G片段形式之嵌合抗體對F c R H 5之親和力）例如至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、 45 50、55或60倍，該鼠類抗體或巍合抗體包含如圖 9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID N〇: 2〇)所述之輕鏈及重鏈可變域序列，由該等序列組成或基本上由該等序列組成。在另態樣中’本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體， 147375.doc -137- 201039846 其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FeRH5之親和力）為大於鼠類抗體之二價形式親和力 (例如IgG形式之抗體對fcRH5之親和力）或嵌合抗體之二價形式親和力（例如IgG片段形式之嵌合抗體對FcRH5之親和力）例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO·· 20)所述之輕鏈及重鏈可變域序列，由該等序列組成或基本上由該等序列組成。在另一態樣中’本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為〇.4 Nm。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對 FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FCRH5之親和力）為 0.4 nM +/ 0.04。

在另一態樣中’本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為〇.3 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.32 ιιΜ或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.36 nM 或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5 抗體’其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG 147375.doc •138· 201039846 形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.4 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對 FcRH5之親和力）為0.44 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.48 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0·5 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）在0.3 nM與0.5 nM之間。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對 FcRH5之親和力）在0.32 nM與0.48 nM之間。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5 之親和力）在0.36 nM與0.44 nM之間。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.2 nM。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對 FcRH5之親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為 0·2 nM +/- 0.02。 147375.doc -139- 201039846

在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如lgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.1 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5 之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為〇. 12 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體’其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力 (例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.14 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體’其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為〇·ΐ6 nM或更佳。在另一態樣中’本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對 FcRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.18 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為〇·2 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH^^ 體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如Ig(}形式之抗體對FcRH5之親和力）為ο υ nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對 FcRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH52 親和力）為0,24 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對以汉出之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5i親和力）為〇 % nM 147375.doc -140. 201039846 或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5 抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為0.28 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FCRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之一價形式親和力（例如IgG形式之抗體對fcrh5 之親和力）為0·30 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRJi5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）在〇.1 nM 與0.3 nM之間。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗 FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如 IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）在0.12 nM與0.28 nM之間。在另一態樣中’本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）在0.14 nM與0.26 nM之間。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如igG形式之抗體對 FcRH5之親和力）在0.16 nM與0.24 nM之間。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對 FcRH5之二價形式親和力（例如igG形式之抗體對fcrh5之親和力）在0_18nM與〇.22nM之間。在另一態樣中’本發明提供一種人類化抗FCRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如igG形式之抗體對FcRH5之親和力）為〇.5 nM。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之二價 147375.doc -141 - 201039846 形式親和力（例如IgG形式之抗體對Fcrh5之親和力）為0 5 ιιΜ +/，〇 · 1 〇在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FCRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為〇.4 nM或更佳。在另一態樣中，本發明k供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對j?crh5 之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對fcRH5之親和力）為0.5 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對卩以出之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）為〇.6 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中 «玄抗體對FcRH5之一價形式親和力（例如igG形式之抗體對 FcRH5之親和力）為0.7 nM或更佳。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）在〇·3 nM與0.7 nM之間。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5抗體’其中該抗體對fcrh5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）在〇·4 nM與0.6 nM之間。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗FcRH5 抗體，其中該抗體對FcRH5之二價形式親和力（例如IgG形式之抗體對FcRH5之親和力）在0.5 nM與0.55 nM之間。在一態樣中，鼠類抗體對FcRH5之單價親和力實質上等同於包含圖9(SEQ ID NO: 18)及圖l〇(SEQ ID NO: 20)之可變域序列的Fab片段之結合親和力。 147375.doc •142· 201039846

Ο η:項：中所公認，配位體對其受體之結合親使用夕種分析法中之任—者測定且表示為多種數量值。因在—實施例中，結合親和力表示為值且反映固有, 親和力^如’具有最小之親和性物。-般而言且i 在活體外測量結合親和力，無論在無細胞或細胞相關之環境下。如本文更詳細描述，結合親和力之倍數差显^ 根據人類化抗體（例如Fab形式）之單價結合親和力值考/對照抗體（例如Fab形式）(例如具有供者高變區序列之鼠類抗體)之單價結合親和力值的比率定量，其中結合親和力值在類似分析條件下測定。因H實施财，結合親#力之七數差異以pab形式之人類化抗體與該參考/對昭 Fab抗體之Kd值的比率形式測定。舉例而言，在一實施：中’若本發明之抗體⑷之親和力&「3倍小於」參考抗體 (M)之親和力，則若AiKd值為3χ，則厘之以值應為卜，且A之Kd與Μ之Kd的比率應為。相反地，在一實施例中，若本發明之抗體（C)之親和力為「3倍大於」參考抗體 (R)之親和力，則若C之Kd值為lx，則尺之〖£1值應為3χ，且 C之Kd與R之Kd的比率應為1:3。可使用此項技術中已知之諸多分析法中之任一者（包括本文所述之分析法）獲得結合親和力測量值，包括例如Biac〇re、放射免疫分析法（riA) 及 ELISA。在一態樣中，提供一種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含： (a)至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自由 147375.doc -143- 201039846 以下組成之群的HVR : (i)包含序列 KASQNVGSNVA(SEQ ID NO: 28)之 HVR-L1 ； (ii) 包含序列 SASYRYS(SEQ ID NO: 29)之HVR-L2 ; (iii) 包含序列 QQYKTWT(SEQ ID NO: 3 0)之HVR-L3 ; (iv) 包含序列 GYTFTNYGMN(SEQ ID NO: 37)之HVR-H1 ； (v) 包含序列 NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO: 38)之 HVR-H2 ； (vi) 包含序列 ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO: 39)之 HVR-H3。在一實施例中，本發明抗體之HVR-L1包含SEQ ID NO: 28之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-L2包含 SEQ ID NO: 29之序列。在一實施例中，本發明抗體之 HVR-L3包含SEQ ID NO: 3 0之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-H1包含SEQ ID NO: 37之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-H2包含SEQ ID NO: 38之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-H3包含SEQ ID NO: 39之序列。在一實施例中，包含此等序列（如本文所述組合）之本發明抗體為人類化或人類抗體。在一態樣中，提供一種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含： (a)至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自由以下組成之群的HVR : 147375.doc •144· 201039846 (i) 包含序列 KASQNVGSNVA(SEQ ID NO: 28)之HVR-L1 ； (ii) 包含序列 SASYRYS(SEQ ID NO: 29)之HVR-L2 ; (iii) 包含序列 QQYKTWT(SEQ ID NO: 30)之HVR-L3 ; (iv) 包含序列 GYTFTNYGMN(SEQ ID NO: 37)之HVR-H1 ; (v) 包含序列 NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO: 38)之 HVR-H2 ； (vi) 包含序列 ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO: 39)之 HVR-H3 ;及 (b)至少一個變異HVR，其中該變異HVR序列包含對 SEQ ID NO: 28、29、30、37、38或39中所述序列之至少一個殘基的修飾。在一實施例中，本發明抗體之HVR-L1 包含SEQ ID NO: 28之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-L2包含SEQ ID NO: 29之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-L3包含SEQ ID NO: 30之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-H1包含SEQIDN0:3 7之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-H2包含SEQ ID NO: 38 之序列。在一實施例中，本發明抗體之HVR-H3包含SEQ ID NO: 39之序列。在一實施例中，包含此等序列（如本文所述組合）之本發明抗體為人類化或人類抗體。在一實施例中，包含此等序列（如本文所述組合）之本發明抗體為人類化或人類抗體。在一態樣中，本發明提供一種包含一個、兩個、三個、 147375.doc • 145- 201039846 四個、五個或六個hvr之抗體，其中各HVR包含選自由 SEQ ID NO: 28、29、30、37、38或 39組成之群的序列，由該序列組成或基本上由該序列組成。本發明抗體之變異HVR可在HVR内具有對一或多個殘基的修飾。在一態樣中，本發明提供—種抗體，其包含圖9_丨2所述 HVR序列中之一個、兩個、三個、四個、五個或全部。用於伤主個體之治療劑較佳在該個體體内引發對藥劑之極少免疫原性反應至對藥劑無免疫原性反應。在一實施例中本發明提供該藥劑。舉例而言，在一實施例中，本發月提供種人類化抗體，其相較於包含SEQ ID NO: 18及 20之序列的抗體在宿主個體體内引發及/或預期引發實質上較低水準之人類抗小鼠抗體反應（HAMA)。在另一實例中’本發明提供一種人類化抗體，其引發及/或預期引發最小人類抗小鼠抗體反應（HAMA)或無人類抗小鼠抗體反應（HAMA)。纟-實财，本發明之抗體引發臨床上可接受水準或低於臨床上可接受水準之抗小鼠抗體反應。本發明之人類化抗體之重鏈及/或輕鏈可變域中可包含或多個人類及/或人類共同非高變區（例如構架）序列。在一些實施例中，一 _ 共同非高變區序列内多個其他修飾存在於人類及/或人類。在一實施例中，本發明抗體之重鏈文域L 3人類共同構架序列’在—實施例中其為亞群III 共同構架序列。在—實施例中，本發明之抗體包含至少一個胺基酸位置處經修娜之變異亞群m共同構架序列。舉例 147375.doc •146- 201039846 而言，在一實施例中，變異亞群ΠΙ*同構架序列可包含位置71、73及/或78中之一或多者之取代。在一實施例中，本發明抗體之輕鏈可變域包含人類共同構架序列，在—實施例中其為κΐ共同構架序列。在—實施例中，本發明之抗體包含至少一個胺基酸位置處經修飾之變異“共同構架序列。如此項技術中已知且如本文在下文中更詳細描述，描繪抗體高變區之胺基酸位置/邊界可視此項技術中已知（下述）之情形及各種定義而改變。可變域中之一些位置可視為雜合之高變位置，此係因為此等位置可根據一組標準而視為屬於高變區，而根據一組不同標準視為在高變區以外。一或多個此等位置亦可存在於延伸之高變區（如下文進一步疋義）中。本發明提供在此等雜合之高變位置中包含修飾的抗體。在一實施例中，此等高變位置包括重鏈可變域中位置 26-30、33-35Β、47-49、57-65、93、94及 1〇1_102 中之一或多者。在一實施例中，此等雜合之高變位置包括輕鏈可變域中位置24_29、35_36、46·49、56及97中之—或多者。在一實施例中，本發明之抗體包含在一或多個雜合之高變位置處經修飾的人類變異人類亞群共同構架序列。本發明之抗體可包含任何適合之人類或人類共同輕鏈構架序列，只要抗體展現所需生物學特性（例如所需結合親和力）即可。在—實施例中，本發明之抗體包含人類κ輕鏈構架序列之至少一部分（或全部）。在一實施例中，本發明之抗體包含人類Κ亞群I構架共同序列之至少一部分（或全 147375.doc •147· 201039846 部）。在一態樣中，本發明之抗體為結合於細胞毒性劑之人類化抗FcRH5抗體。在一態樣中，結合於細胞毒性劑之人類化抗FcRH5抗體抑制異種移植物中之腫瘤進程。在一態樣中，人類化抗體與嵌合抗體均為單價抗體。在一實施例中，人類化抗體與嵌合抗體均包含連接於Fc區之單一 Fab區。在一實施例中，參考嵌合抗體包含圖9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)中所述之連接於人類Fc 區之可變域序列。在一實施例中，人類Fc區為IgG(例如 IgGl、2、3或4)之Fc區。在一態樣中，本發明之抗體包括經半胱胺酸工程改造之抗體，其中如 WO 2006/034488 ; US 2007/0092940(以全文引用的方式併入本文中）所揭示，親本抗體之一或多個胺基酸經游離半胱胺酸胺基酸置換。抗FcRH5抗體之任何形式可如此工程改造，亦即突變。舉例而言，親本Fab抗體片段可經工程改造而形成經半胱胺酸工程改造之Fab，在本文中稱作「ThioFab」。類似地，母單株抗體可經工程改造而形成「ThioMab」。應注意，在ThioFab中單一位點突變產生單一工程改造之半胱胺酸殘基，而在ThioMab中，由於IgG抗體之二聚性質，單一位點突變產生兩個工程改造之半胱胺酸殘基。本發明之經半胱胺酸工程改造之抗 FcRH5抗體包括單株抗體、人類化或嵌合單株抗體及抗體之抗原結合片段、融合多肽及優先結合細胞相關之FcRH5 多肽的類似物。或者經半胱胺酸工程改造之抗體可包含如 147375.doc -148- 201039846 下抗體，其在抗體或Fab之本文所揭示位置處包含半胱胺酸，從而不必改變親本抗體而諸如藉由噬菌體呈現抗體設計及選擇或經由輕鏈及/或重鏈構架序列及恆定區之重新設計（de novo design)進行抗體之序列設計及/或選擇。經半胱胺酸工程改造之抗體包含一或多個游離半胱胺酸胺基酸，其硫氫基反應性值在0.6至1.0 ; 0.7至1.0或0.8至1.0範圍内。游離半胱胺酸胺基酸為已工程改造於親本抗體中且不為二硫橋之一部分的半胱胺酸殘基。經半胱胺酸工程改造之抗體適用於在工程改造之半胱胺酸位點經由例如順丁烯二醯亞胺或鹵基乙醯基連接細胞毒性化合物及/或成像化合物。Cys殘基之硫氫基官能基與順丁烯二醯亞胺基之親核反應性為蛋白質中之任何其他胺基酸官能基（諸如離胺酸殘基之胺基或N末端胺基）的約1000倍。碘乙醯基及順丁烯二醯亞胺試劑中之硫氫基特異性官能基可與胺基反應，但需要較高pH值（>9.0)及較長反應時間（Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London) ° 在一態樣中，本發明之經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5 抗體在任何適合位置包含工程改造之半胱胺酸，其中輕鏈中的位置根據Kabat等人編號（參見Kabat等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest » 第 5版， Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)，且重鏈（包括Fc區）中的位置根據EU編號 (參見Kabat等人，（1991)(前述））。 147375.doc -149- 201039846 在一特定態樣中’本發明係關於一種經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體，其包含與以下具有至少約80%胺基酸序列一致性’或者至少約81%、82%、83%、84%、85%、 860/〇、870/〇、88%、890/〇、90〇/〇、91%、92%、93%、940/〇、 95%、96%、97%、98%、99%或100°/。胺基酸序列一致性的胺基酸序列：本文所揭示之具有全長胺基酸序列的經半胱胺酸工程改造抗體或本文所揭示之無信號肽的經半胱胺酸工程改造抗體胺基酸序列。在另一態樣中’本發明係關於一種分離之經半胱胺酸工程改造抗FcRH5抗體，其包含由與編碼以下之dna分子之補體雜交的核苷酸序列編碼的胺基酸序列：（a)本文所揭示之具有全長胺基酸序列的經半胱胺酸工程改造抗體、0)本文所揭示之無信號肽之經半胱胺酸工程改造抗體胺基酸序列、（c)本文所揭示之有或無信號肽的經半胱胺酸工程改造之跨膜抗體蛋白質的細胞外域、（d)由本文所揭示之任何核酸序列編碼的胺基酸序列或（e)本文所揭示之經半胱胺酸工程改造之全長抗體胺基酸序列的任何其他特別定義之片段。在一特定態樣中，本發明提供一種分離之經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體’其無N末端信號序列及/或無起始甲硫胺酸，且由編碼如…中所述之胺基酸序列的核普酸序列編碼。本文中亦描述產生其之方法，其中彼等方法包含在適用於表現經半胱胺酸工程改造之抗體的條件下培養包含含有適當編碼核酸分子之載體的宿主細胞，且自細胞培 147375.doc •150· 201039846 養物中回收經半胱胺酸工程改造之抗體。本發明之另一態樣提供一種分離之經半胱胺酸工程改造的抗FcRH5抗體’其為跨膜域缺失或跨膜域失活抗體。本文中亦描述產生其之方法，其中彼等方法包含在適用於表現經半胱胺酸工程改造之抗體的條件下培養包含含有適當編碼核酸分子之載體的宿主細胞，且自細胞培養物中回收經半胱胺酸工程改造之抗體。在其他態樣中，本發明提供分離之抗FcRH5嵌合經半胱胺酸工程改造抗體，其包含本文所述之融合於異源（非 FcRH5)多肽的任何經半胱胺酸工程改造抗體。該等嵌合分子之實例包含本文所述之融合於異源多肽（例如抗原決定基標記序列或免疫球蛋白之Fc區）的任何經半胱胺酸工程改造抗體。經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體可為單株抗體、抗體片段、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或競爭性抑制抗FcRH5多肽抗體結合於其各別抗原性抗原決定基的抗體。本發明之抗體可視情況結合於生長抑制劑或細胞毒性劑，諸如毒素（包括例如奥瑞他汀、類美登素、多拉司他汀衍生物或刺孢黴素）、抗生素、放射性同位素、核分解酶或其類似物。本發明之抗體可視情況在CH〇細胞或細菌細胞中產生，且較佳抑制其所結合之細胞生長或增殖或誘發該細胞之死亡。出於診斷目的，本發明之抗體可進行可偵測地標記、連接於固體支撐物或進行類似處理。在本發明之其他態樣中，本發明提供包含編碼本文所述 147375.doc -151 - 201039846 抗FCRH5抗體及抗卜!^^經半胱胺酸工程改造抗體中之任 -：之DNA的載體。亦提供包含任何該載體之宿主細胞。以實例之方式’但主細胞可為CH◦細胞、大腸桿菌細胞或酵母細胞。進一步提供一種產生任何本文所述多肽之方法，且該方法包含在適用於表現所需多肽的條件下培養宿主細胞及自細胞培養物中回收所需多肽。經半胱胺酸工程改造之抗體可適用於治療癌症，且包括特異於細胞表面及跨膜受體及腫瘤相關抗原（TAA)之抗體。該等抗體可以裸抗體（未結合於藥物或標記部分）形式或抗體-藥物結合物（ADC)形式使用。本發明之經半胱胺酸工程改造之抗體可具有位點特異性且與硫氫基反應性試劑有效偶合。硫氳基反應性試劑可為多官能連接子試劑、捕捉標記試劑、螢光團試劑或藥物_連接子中間物。經半胱胺酸工程改造之抗體可用可偵測標記進行標記，固定於固相支撑物上及/或與藥物部分結合。硫氫基反應性可推及於任何抗體’其中可在輕鏈中選自胺基酸範圍Li〇_L20、 L105-L115 ' L109-L119 ' L116-L126 ' L122-L132 ' L163-L173、L200-L210的範圍内；及重鏈中選自胺基酸範圍⑴· H10、H18-H28、H79-H89、H107-H117、H109-H119、 H111-H121的範圍内’及Fc區中選自只270-11280、11366- H376、H391-401的範圍内用反應性半胱胺酸胺基酸取代胺基酸，其中如 W02006034488 ; US 2007/0092940所揭示，胺基酸位置之編號起始於Kabat編號系統之位置l(Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest， 147375.doc 152· 201039846 第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD)且在此後依次延續。硫氫基反應性亦可推及於抗體之特定域，諸如輕鏈恆定域（CL)及重鏈恆定域CHI、CH2及CH3。可分別在完整抗體IgA、IgD、 IgE、IgG及 IgM(包括 IgG亞類 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA及IgA2)之重鏈恆定域οι、δ、ε、γ及μ中進行硫氫基反應性值為0.6及更高之半胱胺酸置換。該等抗體及其用途揭示於 W02006/034488 ; US 2007/0092940 中。

本發明之經半胱胺酸工程改造之抗體較佳保留其野生型親本抗體對應物之抗原結合能力。因此，經半胱胺酸工程改造之抗體能夠較佳特異性結合於抗原。該等抗原包括例如腫瘤相關之抗原（ΤΑΑ)、細胞表面受體蛋白及其他細胞表面分子、跨膜蛋白、信號傳導蛋白、細胞存活調節因子、細胞增殖調節因子、與組織發育或分化相關（例如已知或懷疑在功能上促進組織發育或分化）之分子、淋巴激素、細胞激素、參與細胞週期調節之分子、、參與血小管生成之分子及與血管生成相關（例如已知或懷疑在功能上促進血管生成）之分子。腫瘤相關之抗原可為群分化因子 (cluster differentiation factor)(亦即 CD蛋白，包括（但不限於）FcRH5)。本發明之經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體保留其親本抗FcRH5抗體對應物之抗原結合能力。因此，本發明之經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體能夠較佳特異性結合於FcRH5抗原，包括人類抗FcRH5同功異型物β及/或α，包括當該等抗原表現於細胞（包括（但不限於）B 147375.doc -153- 201039846 細胞）表面上時。在一態樣中’本發明之抗體可與可經由反應性部分、活化部分或反應性半胱胺酸硫氫基共價連接於抗體的任何標 δ己部分結合（Singh等人（2002) Anal. Biochem. 304:147-1 5 ; Harlow Ε·及 Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory

Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ； Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for

Protein Modification，第 2版，CRC Press, Boca Raton, FL)。所連接之標記可用於··⑴提供可偵測信號；（ii)與第二標 δ己相互作用以調節第一或第二標記所提供之可偵測信號，產生FRET(螢光共振能量傳遞）；（丨⑴穩定與抗原或配位體之相互作用或提高與抗原或配位體之結合親和力；（丨^)藉由電荷、疏水性、形狀或其他物理參數影響移動性（例如電泳移動率）或細胞滲透性；或（v)提供捕捉部分以調節配位體親和力、抗體/抗原結合或離子複合。經標記半胱胺酸工程改造抗體可適用於診斷分析，例如偵測特定細胞、組織或血清中所關注抗原之表現。對於診斷應用，抗體通常用可偵測部分標記。可利用多種標記，其一般分成以下類別：放射性同位素（放射性核種），諸如3H、11(：、14(：、18p、 32Ρ、35S、“Cu、68Ga、，、”Tc、⑴Ιη、丨23j、124ι、 1251' mi' 13Hu' 。經放射性同位素標記之抗體適用於受體靶向成像實驗。抗體可使用Current Protocols in lmmunology，卷及第 2 卷，c〇iigen 等人 147375.doc -154- 201039846 編，Wiley-Interscience，New York，NY，Pubs. (1991)中所述之技術用結合、螯合或以其他方式錯合放射性同位素金屬的配位體試劑標記，其中該試劑與抗體之工程改造半胱胺酸硫氫基反應。可錯合金屬離子之螯合配位體包括 DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA及 TETA(Macrocyclics，Dallas， TX)。放射性核種可經由與本發明之抗體-藥物結合物錯合粗向（Wu 等人（2005) Nature Biotechnology 23(9):1 137-1146)。連接子試劑（諸如DOTA-順丁稀二醯亞胺（4-順丁烯二醯亞胺基丁醯胺基苯曱基-DOTA))可根據Axworthy等人 (2000) Proc. Natl· Acad· Sci. USA 97(4):1802-1807之程序藉由使胺基苯甲基-DOTA與用氯甲酸異丙酯活化的4-順丁烯二醯亞胺基丁酸（Fluka)反應製備。DOTA-順丁烯二醯亞胺試劑與經半胱胺酸工程改造之抗體的游離半胱胺酸胺基酸反應且在抗體上提供金屬錯合配位體（Lewis等人（1998) Bioconj. Chem. 9:72-86)。螯合性連接子標記試劑（諸如 DOTA-NHS(1，4,7，10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸單 (N-經基丁二醯亞胺 g 旨））可市售（Macrocyclics, Dallas, TX)。用經放射性核種標記之抗體進行受體標靶成像可藉由偵測及定量腫瘤組織中抗體之進行性積累而提供路徑活化之標記（Albert 等人（1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210)。結合之放射性金屬可在溶酶體降解之後保留在細胞内。揭示適用作抗體標記以用於成像實驗的金屬螯合錯合 147375.doc -155- 201039846 物：US 5342606 ; US 5428155 ; US 5316757 ; US 5480990 ; US 5462725 ； US 5428139 ； US 5385893 ； US 5739294 ； US 5750660 ; US 5834456 ; Hnatowich 等人（1983) J. Immunol. Methods 65:147-157 ; Meares等人（1984) Anal. Biochem. 142:68-78 ; Mirzadeh等人（1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65 ; Meares 等人（1990) J. Cancer 1990，增刊，10:21-26 ; Izard等人（1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350 ; Nikula等人（1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90 ; Camera等人（1993) Nucl. Med· Biol. 20:955-62 ; Kukis 等人（1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110 ; Verel 等人 (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670 ; Camera等人（1994) J. Nucl. Med. 21:640-646 ; Ruegg等人（1990) Cancer Res. 50:4221-4226 ; Verel 等人（2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670 ; Lee 等人（2001) Cancer Res· 61:4474-4482 ; Mitchell 等人（2003) J· Nucl. Med. 44:1105-1112 ; Kobayashi 等人（1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111 ; Miederer 等人（2004) J. Nucl. Med. 45:129-137 ; DeNardo等人（1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90 ; Blend 等人（2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363 ; Nikula等人（1999) J· Nucl. Med. 40:166-76 ; Kobayashi等人（1998) J. Nucl. Med. 39:829-36 ; Mardirossian 等人（1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74 ; Roselli等人（19.99) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20。螢光標記，諸如稀土螯合物（銪螯合物），螢光素類，包括FITC、5-羧基螢光素、6-羧基螢光素；若丹明 (rhodamine)類，包括TAMRA ;丹石黃醯基；麗斯胺 147375.doc -156- 201039846 (Lissamine);花青；藻紅素；德克薩斯紅（Texas Red);及其類似物。瑩光標記可使用例如前述Current Protocols in Immunology中所揭示之技術結合於抗體。螢光染料及螢光標記試劑包括可講自 Invitrogen/Molecular Probes(Eugene, OR)及 Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford, IL)者。可利用或揭示（US 4275 149)各種酶-受質標記。酶一般催化發色受質之化學改變，該改變可使用各種技術測量。舉例而言，酶可催化受質中之顏色變化，該顏色變化可以分〇光光度法測量。或者，酶可改變受質之螢光或化學發光。定量螢光變化之技術如上所述。化學發光受質由化學反應電子激發，且可隨後發射可測量之光（使用例如化學光度計）或向螢光受者提供能量。酶標記之實例包括螢光素酶 (例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；US 4737456)、螢光素、2，3 -二氫酿噪二酮、蘋果酸去氫酶、脈酶、過氧化酶（諸如辣根過氧化酶（HRP))、鹼性磷酸酶（AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶（例如葡萄糖氧化〇酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶）、雜環氧化酶 (諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶）、乳過氧化酶、微過氧化酶及其類似物。酶結合於抗體之技術描述於O'Sullivan等人 (1981)「Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay」，Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis編），Academic Press, New York, 73:147-166 中。酶-受質組合之實例包括例如： 147375.doc -157- 201039846 (0辣根過氧化酶（HRP)與作為受質之過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料前驅物（例如鄰笨二胺（〇pD)或 3,3’，5,5'-四曱基聯苯胺鹽酸鹽（1^8)); (η)驗性磷酸酶（AP)與作為發色受質之對硝基苯基磷酸鹽；及 (1U)卜D_半乳糖苷酶（β-D-Gal)與發色受質（例如對硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶）或螢光受質4甲基香豆素_p_D_半乳糖苷酶。熟習此項技術者可使用多種其他酶-受質組合。關於一般評述參見US 4275 149 及 US 4318980。標s己可與胺基酸側鏈、活化胺基酸侧鏈、經半胱胺酸工程改造之抗體及其類似物間接結合。舉例而言，抗體可與生物素結合，且上述三大類標記中之任一者可與抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合，或反之亦然。生物素選擇性結合於抗生蛋白鏈菌素，且因此標記可與抗體以此間接方式結合。或者’為使標記與多肽變異體間接結合，使多肽變異體與小半抗原（例如地高辛（digoxin))結合，且使上述不同類型標記之一與抗半抗原多肽變異體（例如抗地高辛抗體）結合。因此’可使標記與多肽變異體間接結合 (Hermanson, G. (1996), Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego)。本發明之抗體可用於任何已知分析方法，諸如ELIS A、競爭性結合分析法、直接及間接夾心分析法及免疫沈殿分析法（Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of 147375.doc -158- 201039846

Techniques，第 147-158 頁，CRC Press，Inc.) 〇偵測標記可適用於定位、觀察及定量結合或識別事件。本發明之經標記抗體可偵測細胞表面受體。經可谓測標記之抗體的另一用途為基於珠粒之免疫捕捉方法，其包含使珠粒與經螢光標記之抗體結合，且在結合配位體之後偵測螢光b號。類似結合彳貞測方法利用表面電漿共振（SPR)作用來測量及偵測抗體-抗原相互作用。偵測標記（諸如螢光染料及化學發光染料）(Briggs等人 (1997) Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and

Their Coupling to Amines and Amino Acids」，J. Chem.

Soc·’ Pefkin-Trans· 1:1051-1058)提供可偵測信號且一般適用於標記抗體’較佳具有以下特性：⑴經標記抗體應產生極高信號而背景值較低，使得可在無細胞與基於細胞之分析法中靈敏地偵測少量抗體；及（ii)經標記抗體應對光穩定’使得可觀察、監測及記錄螢光信號而無顯著光致漂白。對於涉及經標記抗體與膜或細胞表面（尤其活細胞）的細胞表面結合的應用’標記較佳（iii)具有優良水溶性以達成有效結合濃度及檢測靈敏度，且（iv)對活細胞無毒以免破壞細胞之正常代謝過程或引起早熟細胞死亡。細胞螢光強度之直接定量及螢光標記事件（例如肽-染料結合物之細胞表面結合）之計數可在使用活細胞或珠粒自動進行混合與讀取型（mix_and-read)非放射性分析法 (Miraglia, 「Homogeneous cell-and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume 147375.doc -159- 201039846 assay technology」，（1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204)之系統（FMAT® 8100 HTS System，Applied Biosystems，Foster City, Calif.)上進行。經標記抗體之使用亦包括細胞表面受體結合分析法、免疫捕捉分析法、螢光連接免疫吸附分析法（fluorescence linked immunosorbent assay，FLISA)、卡斯蛋白酶裂解（Zheng, 「Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo」，（1998) Proc· Natl· Acad. Sci. USA 95:618-23 ; US 6372907)、細胞〉周亡（Vermes, 「A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V」（1995) J. Immunol. Methods 184:39-51)及細胞毒性分析法。可使用螢光測定微體積分析技術鑑別由靶向至細胞表面之分子所產生的上調或下調（Swartzman，「A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology」，（1999) Anal· Biochem. 271:143-51) ° 本發明之經標記抗體適用作如下生物醫學及分子成像之各種方法及技術的成像生物標記及探針：諸如（i)MRI(磁共振成像）；（ii)MicroCT(電腦化斷層攝影術）；（iii)SPECT(單光子發射電腦化斷層攝影術）；（iv)PET(正電子發射斷層攝影術）(Chen等人（2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49) ; (v) 生物發光；（vi)螢光；及（Vii)超音波。免疫閃爍攝影術為如下成像程序，其中向動物或人類患者投與用放射性物質 147375.doc -160- 201039846 標記之抗體且拍攝體内抗體所位於之位點的相片（us 6528624)。成像生物標記可進行客觀測量且作為正常生物過程、病原性過程或對治療介入之藥理學反應的指標來評估。生物標記可具有數種類型：0型為疾病之自然史標記且與已知臨床指標（例如類風濕性關節炎中滑液發炎的MRI 評定）縱向關聯；I型標記根據作用機制捕捉介入之作用，儘管該機制可能與臨床結果不相關；II型標記充當替代終點，其中生物標記之變化或生物標記之信號預測臨床利益以「證實」靶向反應’諸如藉由CT測量之類風濕性關節炎中的骨侵蝕。因此，成像生物標記可提供關於以下之藥效 (PD)治療資訊：⑴標靶蛋白之表現，（ii)治療劑與標靶蛋白之結合，亦即選擇性，及（iii)清除及半衰期藥代動力學資料。活體内成像生物標記相對於基於實驗室之生物標記的優勢包括：非侵襲性處理、可定量、全身評定、反覆給藥及評定（亦即多個時間點）及臨床前（小動物）至臨床（人類）結果之潛在可轉移作用。對於一些應用，生物成像替代臨床前研究中之動物實驗或使動物實驗數減至最低。肽標記法為吾人所熟知。參見Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. I Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2 I Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London ； Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2 ; Glazer 等人（1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. 147375.doc -161 - 201039846 S. Work及E. Work編）American Elsevier Publishing Co” New York ; Lundblad，R. L.及Noyes，C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification,第 I 卷及第 II 卷，CRC Press，New York ； Pfleiderer, G. (1985) 「Chemical Modification of Proteins」，Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche 編，Walter DeGryter, Berlin 及 New York ;及 Wong (1991)

Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.) ; De Leon-Rodriguez 等人（2004) Chem. Eur. J. 10:1149-1155 ; Lewis 等人（2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324 ; Li等人（2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115 ; Mier等人 (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237。用兩個部分（螢光報導基團及淬滅基團）充分近接地標記之肽及蛋白質進行螢光共振能量傳遞（FRET)。報導基團通常為由特定波長之光激發且向受者、或淬滅基團傳遞能量的螢光染料，其在最大亮度發射下具有適當斯托克斯位移 (Stokes shift)。螢光染料包括具有擴展之芳香性的分子，諸如螢光素及若丹明及其衍生物。螢光報導基團可藉由完整肽中之淬滅部分而部分或顯著淬滅。肽由肽酶或蛋白酶裂解之後，可測量到螢光之可偵測增加（Knight, C. (1995) 「Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes」，Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34) ° 本發明之經標記抗體亦可用作親和力純化劑。在此方法中，使用此項技術中熟知之方法將經標記抗體固定於固相 (諸如葡聚糖凝膠（Sephadex)樹脂或濾紙）上。使經固定抗 147375.doc -162- 201039846 體與含有欲純化抗原之樣品接觸，且此後用適合之溶劑洗滌支撐物，該溶劑實質上移除樣品中除欲純化之結合於經固疋多肽變異體之抗原以外的所有物質。最後，用另一適合之溶劑（諸如甘胺酸緩衝液（pH 5 0))洗滌支撐物，該溶劑將自多肽變異體釋放抗原。標記試劑通常具有反應性官能基，其可⑴與經半胱胺酸工程改造之抗體的半胱胺酸硫氫基直接反應以形成經標記抗體，（11)與連接子試劑反應以形成連接子-標記中間物， ... - 或（m)與連接子抗體反應以形成經標記抗體。標記試劑之反應性官能基包括：順丁烯二醯亞胺、鹵基乙醯基、碘乙醯胺丁二醯亞胺酯（例如NHS，N_羥基丁二醯亞胺）、異硫氰酸酯、磺醯氣、2,6-二氣三嗪基、五氟苯酯及胺基磷酸醋，但亦可使用其他官能基。例示性反應性官能基為可偵測標記（例如生物素或螢光染料）之缓基取代基的N-羥基丁二醯亞胺酯（NHS)。標記之 q NHS酯可預先形成、分離、純化及/或表徵，或可當場形成且與抗體之親核基團反應。通常，標記之叛基形式藉由與礙化二亞胺試劑（例如二環己基碳化二亞胺、二異丙基碳化二亞胺）或錁試劑（例如TSTU(;0_(N_ 丁二醯亞胺基 N，N，N'，N、四曱基錁四氟硼酸鹽）、hbTU((0-苯并三唑基）-Ν，Ν，Ν·，Ν’-四甲基錁六氟磷酸鹽）或HATU (0-(7-氮雜笨并三唆-1-基）-N，N，N，，N，·四甲基錁六氟磷酸鹽）、活化劑（諸如1-經基苯并三唑（H〇Bt)及N-羥基丁二醯亞胺）之某組合反應活化以產生標記之NHS酯。在一些情況下，標記及抗 147375.doc -163- 201039846 體可藉由當場活化標記且與抗體反應一步形成標記·抗體結合物而偶合。其他活化及偶合試劑包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基）-1，1，3,3-四甲基錁六氟磷酸鹽）、丁卩？11(]^，1^，1^’，>1’’’-四曱基錁2-氟_六氟磷酸鹽）、？730?(苯并三唑-卜基-氧基-參-(Ν- η比咯啶基）-鱗六氟磷酸鹽）、 EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基_ι,2-二氫-啥啉）、DCCp環己基碳化二亞胺）；DIPCDI(二異丙基碳化二亞胺）、MSNT(1-(均三曱苯-2-磺醯基）-3-硝基三唑）及芳基磺醯基鹵化物（例如三異丙基笨續醢氯）。本發明之白蛋白結合狀- Fab化合物：在一態樣中，本發明之抗體融合於白蛋白結合蛋白。血漿蛋白結合可為改良短暫存在分子之藥代動力學特性的有效方式。白蛋白為血漿中最多之蛋白質。血清白蛋白結合肽（ABP)可改變融合之活性域蛋白之藥效學，包括改變組織吸收、穿透及擴散。此等藥效學參數可藉由特別選擇適當血清白蛋白結合肽序列而調節（US 20040001827)。一系列白蛋白結合狀藉由嗤菌體至現篩選而鑑別（Dennis等人， (2002)「Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins」J Biol Chem. 277:35035-35043 ; WO 01/45746)。本發明之化合物包括以下所教示之 ABP序列：（i)Dennis等人，（2002) J Biol Chem. 277:35035-35043，表 III 及表 IV，第 35038 頁；（ii)US 20040001827， [0076] SEQ ID NO: 9-22 ;及（iii)WO 01/45746，第 12-13 頁，其全部以引用的方式併入本文中。白蛋白結合肽 147375.doc -164- 201039846 (ABP)-Fab藉由使白蛋白結合肽與Fab重鏈之C末端以1:1化學計量比（1 ABP/1 Fab)融合而工程改造。在兔及小鼠體内可展示此等ABP-Fab與白蛋白之締合使抗體半衰期延長超過25倍。因此可將上述反應性Cys殘基引入此等ABP-Fab 中，且用於與細胞毒性藥位點特異性結合，繼而進行活體内動物研究。例示性白蛋白結合肽序列包括（但不限於）SEQ ID NO: 47-51中所列之胺基酸序列： Ο Ο SEQIDNO: 47 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50

CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF

QRLMEDICLPRWGCLWEDDF

QRLIEDICLPRWGCLWEDDF

RLIEDICLPRWGCLWEDD DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 51 抗體-藥物結合物在另一態樣中，本發明提供免疫結合物或抗體-藥物結合物（ADC)，其包含結合於細胞毒性劑（諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素（例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（亦即放射性結合物））之抗體。在另一態樣中，本發明另外提供使用該等免疫結合物之方法。在一態樣中’免疫結合物包含上述共價連接於細胞毒性劑或可偵測試劑之抗FcRH5抗體中之任一者。在一態樣中，本發明之FcRH5抗體結合於FcRH5上與另一 FcRH5抗體所結合相同的抗原決定基。在另一實施例 147375.doc -165- 201039846 中’本發明之FcRH5抗體結合於FcRH5上與另—FcRH5抗體（亦即市售抗FcRH5抗體）所結合相同的抗原決定基。在另一態樣中，本發明之FcRH5抗體結合於FcRH5上不同於另一 FcRH5抗體所結合之抗原決定基的抗原決定基。在另一實施例中，本發明之FcRH5抗體結合於FcRH5上不同於另一 FcRH5抗體（亦即市售抗FcRH5抗體）所結合之 FcRH5上抗原決定基的抗原決定基。在一態樣中’本發明之抗體特異性結合於第—動物物種之FcRH5 ’且不會特異性結合於第二動物物種之fcrh5。在一實施例中，第一動物物種為人類及/或靈長類動物（例如獼猴（Cyn〇m〇lgUS monkey))，且第二動物物種為鼠類（例如小鼠）及/或犬類。在一實施例中，第一動物物種為人類。在一實施例中，第一動物物種為靈長類動物例如獼猴。在一實施例中，第二動物物種為鼠類，例如小鼠。在一實施例中’第二動物物種為犬類。在一態樣中，本發明提供如下組合物，其包含一或多種本發明之抗體及載劑。在—實施例中，載劑為醫藥學上可接受之載劑。在一態樣中，本發明提供編碼本發明FcRH5抗體之核

酸。 X 在一悲樣中，本發明提供包含本發明核酸之載體。在一態樣中，本發明提供包含本發明核酸或載體之宿主細胞。載體可具有任何類型，例如重組載體，諸如表現載體。可使用多種宿主細胞中之任一者。在一實施例中宿 147375.doc -166 - 201039846 主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌。在一實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞。在-態樣中，本發明提供製備本發明抗體之方法。舉例而言’本發明提供一種製備FcRH5㈣（如本文所定義其包括全長抗體及其片段）之方法，該方法包含在適合之宿主細胞中表現編碼該抗體（或其片段）之本發明重組載體及回收該抗體。 0 在-態樣中’本發明提供-種製品，其包含容器；及該容器内所含之組合物，其令該組合物包含一或多種本發明 FcRH5抗體纟一實施例中、組合物包含本發明之核酸。在貫施例中，包含抗體之組合物另外包含載劑，其在一些實施例中為醫藥學上可接受之載劑。在一實施例中，本發明之製品另外包含向個體投與組合物（例如抗體）之說明書。 ◎ 在態樣中，本發明提供一種套組，其包含含有組合物的第谷器，該組合物包含一或多種本發明FcRH5抗體； G 3緩衝悧之苐二容器。在一實施例中，緩衝劑為醫藥 2上可接叉之緩衝劑。在一實施例中，包含拮抗抗體之組〇物另外包含載劑，其在一些實施例中為醫藥學上可接受之載劑。在—實施例中，套組另外包含向個體投與組合物 (例如抗體）之說明書。在癌、樣中’本發明提供本發明FcRH5抗體之用途，其 ’、於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫 147375.doc -167- 201039846 瘤及/或細胞增殖病症）的藥物。在一實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一磕樣中，本發明提供本發明核酸之用途，其係用於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症）的藥物。在一實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性nhl、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病 (HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一態樣中，本發明提供本發明表現載體之用途，其係用於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症）的藥物。在一實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHl、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一態樣中’本發明提供本發明宿主細胞之用途，其係用於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤 147375.doc •168· 201039846 及/或細胞增殖病症）的藥物。在一實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性丽L、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白金病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一態樣中，本發明提供本發明製品之用途，其係用於製備供治療性及/或予員防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症）的藥物。在一實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症係選自淋巴瘤 '非霍奇金氏淋巴瘤（nhl)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性nhl、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病 (HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一態樣中’本發明提供本發明套組之用途，其係用於 Q 製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症）的藥物。在一實施例中，癌症、腫瘤及/或細胞增殖病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、 k襲性NHL、復發性侵襲性nhl、復發性惰性NHL·、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病 (HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一態樣中’本發明提供一種抑制表現FcRH5之細胞生長的方法’該方法包含使該細胞與本發明之抗體接觸，從 147375.doc -169- 201039846 而抑制該細胞之生長。在一實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中，抗體結合於生長抑制劑。在一悲樣中，本發明提供一種治療性處理患有包含表現 FcRH5之細胞的癌性腫瘤之哺乳動物的方法，該方法包含向該哺乳動物投與治療有效量之本發明抗體，從而有效治療該哺乳動物。在一實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中，抗體結合於生長抑制劑。在一悲樣中’本發明提供一種治療或預防與FeRH5表現增加相關之細胞增殖病症的方法，該方法包含向需要該治療之個體投與有效量之本發明抗體，從而有效治療或預防該細胞增殖病症。在一實施例中，該增殖病症為癌症。在貫施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中抗體結合於生長抑制劑。在一態樣中，本發明提供一種抑制細胞生長之方法，其中該細胞之生長至少部分依賴於FcRH5之生長加強作用，该方法包含使該細胞與有效量之本發明抗體接觸，從而抑制該細胞之生長。在一實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中，抗體結合於生長抑制劑。在態樣中’本發明提供一種治療性處理哺乳動物之腫瘤的方法，其中該腫瘤之生長至少部分依賴於FcRH5之生長加強作用，該方法包含使該細胞與有效量之本發明抗體接觸，從而有效治療該腫瘤。在—實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實施例中，抗體結合於生長抑制劑。在一態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含 147375.doc -170- 201039846 向患者投與包含本文所述之免疫結合物，可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥調配物。在一實施例中，癌症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一實施例中，向患者投與細胞毒性劑與抗體-藥物結合化合物之組合。在一態樣中，本發明提供一種抑制B細胞增殖之方法，其包含在允許包含本發明抗體之免疫結合物結合於FcRH5 的條件下使細胞暴露於該免疫結合物。在一實施例中，B 細胞增殖係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（nhl)、侵襲性NHL、復發性侵襲性Nhl、復發性惰性NHL、難治性 NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（Cll)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白jk病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一實施例中’ B細胞為異種移植物。在一實施例中，暴露在活體外進行。在一實施例中，暴露在活體内進行。在一態樣中，本發明提供一種判定懷疑含有fcRH5之樣品中存在FcRH5的方法，該方法包含使該樣品暴露於本發明之抗體，及測定該抗體與該樣品中]pcRH5之結合，其中該抗體與該樣品中FcRH5之結合指示該樣品中存在該蛋白質。在一實施例中’樣品為生物樣品。在另一實施例中，生物樣品包含B細胞。在一實施例中，生物樣品係來自患 147375.doc -171· 201039846 有或懷疑患有如下B細胞病症及/或B細胞增殖病症的哺乳動物：包括（但不限於）淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（all)及套細胞淋巴瘤。在一態樣中’提供一種診斷與表現Fcrh5之細胞（諸如B 細胞）增加相關之細胞增殖病症的方法，該方法包含使生物樣品中之測試細胞與任何上述抗體接觸；藉由偵測抗體與FcRH5之結合測定結合於該樣品中之測試細胞的抗體含罝；及比較結合於對照樣品中之細胞的抗體含量，其中結合之抗體含量校正為測試及對照樣品中表現FcRH5之細胞數，且其中測試樣品中結合之抗體相較於對照樣品的高含量表明存在與表現FcRH5之細胞相關的細胞增殖病症。在一態樣中，提供一種偵測企液或血清中可溶性FcrH5 之方法，該方法包含使來自懷疑患有B細胞增殖病症之哺乳動物的血液或血清的測試樣品與本發明之抗FcRH5抗體接觸，及偵測測試樣品中可溶性FcRH5相對於來自正常哺乳動物之血液或血清的對照樣品的增加。在一實施例中，該偵測方法適用作診斷與哺乳動物之血液或血清中可溶性 FcRH5增加相關之B細胞增殖病症的方法。在一態樣中，提供一種使本發明之抗體結合於表現 FcRH5之細胞的方法，該方法包含使該細胞與本發明之抗體接觸。在—實施例中，抗體結合於細胞毒性劑。在一實 147375.doc -172- 201039846 細*例中，抗體結合於生長抑制劑。可使用本發明之方法影響任何適合之病理狀態，例如與

FcRH5表現相關之細胞及/或組織。在一實施例中，在本發明之方法中靶向之細胞為造血細胞。舉例而言，造血細胞了為L自由淋巴細胞、白血球、血小板、紅血球及自然殺手細胞組成之群的造血細胞。在一實施例中，在本發明之方法中靶向之細胞為B細胞或τ細胞。在一實施例中，在本〇發明之方法中靶向之細胞為癌細胞。舉例而言，癌細胞可為選自由淋巴瘤細胞、白血病細胞或骨髓瘤細胞組成之群的癌細胞。本發明之方法可另外包含其他處理步驟。舉例而言，在 -實施例中’方法另外包含以下步驟，其中使靶向細胞及/ 或組織（例如癌細胞）暴露於輻射治療或化學治療劑。在-態樣中，本發明提供包含投與有效量之抗㈣出抗體與有效量之另一治療劑(諸如抗血管生成劑、另一抗〇體、化學治療劑、細胞毒性劑、免疫抑制劑、前藥、細胞激素、細胞毒性放射療法、皮質類固醇、抗喔吐劑、癌症疫苗、止痛劑或生長抑制劑）之組合的方法。舉例而言，抗FCRH5抗體或免疫結合物與抗癌劑或^管生㈣=合使用以治療各種贅生性或非贅生性病狀。在特定實施例中’抗腿5抗體與以下組合使用：删替佐米）、以‘擔（來那度胺）、他莫昔芬、來曲唾、依西美坦、阿那曲哩、伊立替康、西妥昔單抗、氟維司群春瑞濱、貝伐單抗、長春新驗―）、順銷' 吉西他 I47375.doc •173· 201039846 濱甲胺喋呤（methotrexate)、長春鹼（vinblastine)、卡波太平洋篡杉醇、多西他賽、培美曲塞、氟尿u密α定、小紅莓、硼替佐米 '來那度胺、地塞米松、美法侖、潑尼松、長春新鹼、沙力度胺。視欲/σ療之特定癌症適應症而定，本發明之組合療法可與其他治療劑（諸如化學治療劑）或其他療法（諸如放射療法或手術）組合。多種已知化學治療劑可用於本發明之組合療法。較佳使用治療特定適應症之彼等標準化學治療劑。欲用於組合中之各治療劑之劑量或頻率較佳等同於或小於當在無其他藥劑的情況下使用時相應藥劑之劑量或頻率。如本文所述，多發性骨髓瘤及伯基特淋巴瘤細胞株中已觀察到FcRH5(或IRTA2)表現異常。因此，在本發明方法之貫知例中，所乾向之細胞（例如癌細胞）為如下細胞，其相較於不表現FcRH5之細胞其表現FcRH5。在另一實施例中，靶向細胞為癌細胞，其中相較於相同組織類型之正常非癌細胞，其FcRH5表現增加。在一實施例中，本發明之方法使乾向細胞死亡。在本發明之其他態樣中，本發明提供包含編碼任何本文所述抗體之DNA的載體。亦提供包含任何該載體之宿主細胞。以實例之方式，宿主細胞可為⑽細胞、大腸桿菌細胞或酵母細胞。進一步提供一種產生任何本文所述抗體之方法，且該方法包含在適用於表現所需抗體的條件下培養宿主細胞及自細胞培養物中回收所需抗體。在另一態樣中，本發明係關於一種相關組合物，其包含 147375.doc -174· 201039846 本文所述之抗FcRH5抗體與載劑之組合。視情況，該載劑為醫藥學上可接受之載劑。本發明之另一態樣係針對本文所述之抗FcRH5多肽抗體之用途’其係用於製備適用於治療對抗FcRH5多肽抗體起反應之病狀的藥物。本發明之另一態樣為一種組合物’其包含式I之抗體-藥物化合物之混合物’其中每個抗體之平均藥物負載為約2 個至約5個或約3個至約4個。〇本發明之另一態樣為一種醫藥組合物，其包括式I ADC 化合物、式I ADC化合物之混合物或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。另一態樣提供一種醫藥組合，其包含式I ADC化合物及具有抗癌特性或其他治療作用之第二化合物。另—態樣為殺滅腫瘤細胞或癌細胞或抑制腫瘤細胞或癌 Q 細胞之增殖的方法’其包含用有效殺滅腫瘤細胞或癌細胞或抑制腫瘤細胞或癌細胞之增殖的一定量之式I抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物處理該等細胞。另—態樣為一種治療癌症之方法，其包含向患者投與治療有效量之醫藥組合物，包括式I ADC。另樣包括製品’亦即套組’其包含抗體-藥物結合物、容器及指示治療之包裝插頁或標籤。本發明之—態樣為一種製備式I抗體藥物結合化合物之 147375.doc -175- 201039846 方法，其包含以下步驟：（a)使經半胱胺酸工程改造之抗體的工程改造半胱胺酸基團與連接子試劑反應以形成抗體_ 連接子中間物Ab-L ;及（b)使Ab-L與經活化藥物部分D反應；由此形成抗體-藥物結合物；或包含以下步驟：（c)使藥物部分之親核基團與連接子試劑反應以形成藥物-連接子中間物D-L ;及（d)使D-L與經半胱胺酸工程改造之抗體的工程改造半胱胺酸基團反應；由此形成抗體-藥物結合物。本發明之一態樣為一種偵測癌細胞之分析法，其包含： (a)使細胞暴露於經半胱胺酸工程改造之抗Fcrh5抗體-藥物結合物；及（b)測定該經半胱胺酸工程改造之抗Fcrh5抗體-藥物結合化合物結合於細胞之程度。 A.抗FcRH5抗體在一實施例中，本發明提供可在本文中用作治療劑之抗 FcRH5抗體。例示性抗體包括多株、單株、人類化、雙特異性及雜結合抗體。 1·多株抗體較佳藉由多次皮下（SC)或腹膜内（ip)注射相關抗原及佐劑在動物體内產生多株抗體。宜使相關抗原（尤其在使用合成肽時）結合於在欲免疫物種體内具有免疫原性之蛋白質。舉例而言，抗原可使用雙官能或衍生試劑（例如馬來醯亞胺基苯曱醯基績酸基丁二醯亞胺酯（經由半胱胺酸殘基結合）、N-羥基丁二醯亞胺（經由離胺酸殘基）、戊二酸、丁二酸酐、S0C124R1N=C=NR，其中R及R1為不同烧基）結 147375.doc -176- 201039846 合於匙孔螺錢蛋白(KLH)、灰清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大丑膜蛋白酶抑制劑。藉由將例如100 pg或5 之蛋白質或結合物（分別針對兔或小鼠）與3體積之弗氏完全佐劑⑶叫丨咖 adjuvant)組合且在多個位點皮内注射該溶液而使動物對抗原、免疫原性結合物或衍生物免疫。一個月以後，藉由在多個位點皮下注射用弗氏完全佐劑中之初始量之1/5至ι/ι〇的肽或結合物使動物加強免疫。7至14日之後，使該等動物出血且分析血清之抗體幻賈。使動物加強免疫直至力價平穩。亦可在重組細胞培養物中製備蛋白質融合物形式之結合物。凝集劑（諸如礬）亦適用於增強免疫反應。 2.單株抗體單株抗體可使用由Kohler等人，Nature，256:495 (1975) 首次描述之融合瘤法製備或可藉由重組DNA法（美國專利第4,816,567號）製備。在融合瘤法中，如上所述使小鼠或其他適當之宿主動物 (諸如倉鼠）免疫以誘發淋巴細胞，該等淋巴細胞產生或能夠產生將特異性結合於用於免疫之蛋白質的抗體。或者，可在活體外使淋巴細胞免疫。免疫之後，分離淋巴細胞且

Ik後使用適合之融合劑（諸如聚乙二醇）與骨髓瘤細胞株融 ° 形成融〇瘤細胞（Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第 59_1〇3 頁（―化 p職，1986))。將由此製備出之融合瘤細胞接種且生長於適合之培養基中該培養基較佳含有一或多種抑制未融合親本骨髓瘤細 147375.doc -177- 201039846 胞（亦稱作融合搭配物）之生長或存活的物質。舉例而言’ 若親本骨聽瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤麟酸核糖轉移酶 (HGPRT或HPRT)，貝|J融合瘤之選擇性培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷（HAT培養基），該等物質阻止缺乏HGPRT之細胞的生長。較佳融合搭配物骨髓瘤細胞為有效融合、支持所選抗體產生細胞穩定高含量產生抗體且對針對未融合親本細胞選擇之選擇性培養基敏感的骨髓瘤細胞。較佳骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤株，諸如源自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤 (購自薩克研究院細胞分配中心（Salk Institute Cell Distribution Center)，San Diego，California USA)及 SP-2及衍生物，例如X63-Ag8-653細胞（購自美國菌種保存中心 (American Type Culture Collection)，Manassas, Virginia, USA)的骨髓瘤細胞株。亦已描述人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤（heteromyeloma)細胞株以用於產生人類單株抗體（Kozbor, J. Immunol·，133:3001 (1984);及 Brodeur 等人， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications * 第 51-63 頁（Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。分析生長融合瘤細胞之培養基針對抗原的單株抗體產生。較佳地，藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析法（諸如放射免疫分析法（RIA)或酶聯免疫吸附分析法（ELISA)) 測定融合瘤細胞所產生之單株抗體之結合特異性。單株抗體之結合親和力可例如由Munson等人，Anal. Biochem., 107:220 (1980)中所述之斯卡查德分析（Scatchard 147375.doc -178- 201039846 analysis)來測定 β 在鑑別到產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，該等純系可藉由限制稀釋程序來次選殖且藉由標準方法生長（Goding，Monoc丨onal Antibodies: Principles and Practice，第 59-103 頁（Academic Press, 1986))。適於此目的之培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，融合瘤細胞可例如藉由於小鼠體内腹膜内注射該等細胞而在動物體内在活體内以腹水性腫瘤形式生長。藉由習知抗體純化程序（諸如親和層析（例如使用蛋白A 或蛋白質G-瓊脂糖）或離子交換層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析等）使次純系所分泌之單株抗體與培養基、腹水性流體或血清適合地分離。易於使用習知程序（例如藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針）分離編碼單株抗體之DNA且對其進行測序。融合瘤細胞充當該DNA 之較佳來源。分離之後，可將DNA置於表現載體中，隨後將其轉染於宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞）（否則該等宿主細胞不會產生抗體蛋白質）中以在重組宿主細胞中合成單株抗體。關於在細菌中重組表現編碼抗體之DNA的評述文章包括 Skerra等人，Curr. Opinion in Immunol·, 5:256-262 (1993) and Pliickthun，Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)。在另一實施例中，單株抗體或抗體片段可自使用 McCafferty等人，Nature, 348:552-554 (1990)中所述之技 147375.doc -179- 201039846 術產生的抗體噬菌體庫分離。Ciackson等人，Nature， 352:624-628 (1991)及 Marks等人，j. μ〇1· Biol.，222··581- 597 (1991)分別描述使用噬菌體庫分離鼠類及人類抗體。後續公開案描述藉由鏈改組（Marks等人，Bi〇/Techn〇丨〇gy， 10:779-783 (1992))以及組合感染及活體内重組作為構築極大嗔菌體庫之策略（Waterhouse等人，Nuc· Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))來產生高親和力（nM範圍）人類抗體。因此，此等技術為傳統用於分離單株抗體之單株抗體融合瘤技術的可行替代方法。編碼抗體之DNA可例如藉由以下而修飾以產生嵌合或融合抗體多肽：用人類重鏈及輕鏈恆定域（Ch及cL)序列取代同源鼠類序列（美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，

Proc. Natl Acad. Sci. USA，81:6851 (1984)) ’ 或使免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽（異源多肽）之全部或— 部分編碼序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體之恆定域’或其取代抗體之一個抗原結合位點的可變域以產生包含對一種抗原具有特異性之一個抗原結合位點及對不同抗原具有特異性之另一個抗原結合位點的嵌合二價抗 3·人類及人類化抗體本發明之抗FcRH5抗體可另外包含人類化抗體或人類抗體°非人類（例如鼠類）抗體之人類化形式為含有源自非人類免疫球蛋白之極少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab')2或抗體之其他抗 147375.doc -180- 201039846 原結合子序列）。人類化抗體包括人類免疫球蛋白（接受者抗體）其中„亥接文者之互補決定區（cdr)之殘基已經具有所需特異性、親和力及能力之非人種（諸如小鼠、大鼠或兔）抗體（供者抗體）之(：13尺殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基置換為相應非人類殘基。人類化抗體亦可包含既不存在於接受者抗體中亦不存在於輸入 CDR或構架序列中之殘基。—般而言，人類化抗體包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質 ^ 上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDRg，且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白共同序列之fr區。人類化抗體敢佳亦包含免疫球蛋白怪定區（Fc)之至少一部分’通常人類免疫球蛋白恆定區（Fc)之至少一部分[J〇nes 寺人，Nature，321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人， Nature, 332:323-329 (1988);及 Presta，Curr. Op. Struct.

Biol” 2:593-596 (1992)]。，使非人類抗體人類化的方法為此項技術中所熟知。一般 ❹ 而言，人類化抗體具有一或多個自非人類之來源引入抗體中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱作「輸入」殘基，其通常取自「輸入」可變域。人類化可基本上按照 Winter及同事之方法[Jones等人，Nature，321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，Nature，332:323-327 (1988); Verhoeyen等人，Science, 239:1534-1536 (1988)]’ 藉由用齧齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來執行。因此，該等「人類化」抗體為嵌合抗體（美國專利第 147375.doc •181 201039846

4,816,567號），其中實質上少於完整人類可變域已經非人種的相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為一些CDR 殘基及可能之一些FR殘基經齧齒動物抗體之類似位點的殘基取代的人類抗體。欲用於製備人類化抗體之人類可變域（輕鏈與重鏈）之選擇對於抗體欲用於人類治療用途時降低抗原性及HAMA反應（人類抗小鼠抗體）極其重要。降低或去除HAMA反應為臨床開發適合之治療劑的重要態樣。例如參見Khaxzaeli等人，J· Natl. Cancer Inst. (1988)，80:937 ; Jaffers等人， Transplantation (1986)，41:572 ; Shawler等人，j. Immun〇l. (1985)，135.1530 ’ Sears 等人 ’ J. Biol. Response Mod. (1984)，3:138 ; Miller等人，Blood (1983)，62:988 ; Hakimi 等人 ’ J. Immunol. (1991)，147:1352; Reichmann等人， Nature (1988)，332:323 ; Junghans 等人，Cancer Res (1990)，50:1495。如本文所述’本發明提供人類化抗體以使HAMA反應降低或去除。可使用此項技術中已知之常規方法另外獲得此等抗體之變異體，其中一些在下文中進一步描述。根據所謂「最適合（best-fit)」方法，針對整個已知人類可變域序列庫篩選齧齒動物抗體之可變域序列。鑑別最接近於齧齒動物之人類V域序列，且接受其中之人類構架區（FR)用於人類化抗體（Sims等人，j. immun()1. 151:2296 (1993) ; Chothia等人，J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。另一方法使用源自輕鏈或重鏈之特定亞群的所有人類抗體之共同序列的特定構架區。相同構架可用於數種 182 - 147375.doc 201039846

不同人類化抗體（Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4285 (1992) ; Presta 等人，j. Immun〇1. i5i:2623’ (1993)) 〇舉例而言，如本文所述之抗體的胺基酸序列可充當用於多樣化構架及/或高變序列之起始（親本）序列。起始高變序列所連接之所選構架序列在本文中稱作受者人類構架。雖然受者人類構架可來自或源自人類免疫球蛋白（其v l及/或 VH區），但較佳受者人類構架係來自或源自人類共同構架序列，因為該等構架已顯示在人類患者體内具有極少或無免疫原性。若受者序列源自人類免疫球蛋白’則可視情況選擇人類構架該人賴架序⑽基於其與供者構架序列之同源性藉由將供體構架序列與人類構架序列集合中之各種人類構架相㈣㈣擇’且選擇最同源之構架相作為受杜一貫施例中，本〇 VH亞群in及/或VLk亞群同構架序列一 =蛋:::，構 ::列:包含相對於人類免疫球蛋二:人::= 序列之^胺基酸取代。此等前在取代較佳極少；通常相對於人類免疫球蛋白序列或制構架序列僅四個兩個或一個胺基酸差異。 —個、將非人類抗體之高變區# i μ Trr 门變£殘基併入VL及/或VH受者人類構 147375.doc •183- 201039846 架中。舉例而§，可併入對應於Kabat c〇R殘基、高變環殘基、Abm殘基及/或接觸殘基之殘基。視情況，併入如下延伸之咼變區殘基.24-34(Ll)、50-56(L2)及、 26·35Β(Η1) 、 50-65 、 47-65 或 49-65(H2) 及 93- 102 、 94-102或95-102(H3)。雖然本文中論述「併人」高變區殘基，但應瞭解此可以多種方式達成，例如編碼所需胺基酸序列之核酸可藉由使編碼小鼠可變域序列之核酸突變以使其構架殘基變為受者人類構架殘基，或藉由使編碼人類可變域序列之核酸突變以使高變域殘基變為非人類殘基，或合成編碼所需序列之核酸等來產生。在本文之實例中’移植有高變區之變異體藉由編碼人類受者序列之核酸之康科爾突變誘發（Kunkel mutagenesis)各高變區使用各別寡㈣酸產i。Kunkel等人，似— 154:367_382 (1987)。可使用常規技術於構架及/ 或高變區内引入適當變化以校正及再建立適當之高變區_ 抗原相互作用。可使用嗟菌體（嗟菌粒）呈現（在本文中在一些情形下亦稱作嗤菌體呈現）作為產生及篩選藉由序列隨機化產生之庫中之多種不同潛力變異抗體的便利且快速之方法。然而，熟習此項技術者可使用製備纟篩選改變之抗體的其他方法。嗟菌體（嗜菌粒）呈現技術已提供產生及選擇結合於配位體(諸如抗原)之新穎蛋白質的有效工具。使用噬菌體(噬菌 147375.doc -184- 201039846 粒）呈現之技術使得可產生蛋白質變異體之大庫，可快速分選該大庫中以高親和力結合於標靶分子之序列。編碼變異多肽之核酸一般融合於編碼病毒鞘蛋白（諸如基因III蛋白或基因VIII蛋白）之核酸序列。已產生單價噬菌粒呈現系統，其中編碼蛋白質或多肽之核酸序列融合於編碼基因III 蛋白之一部分的核酸序列。（Bass, S.，/Voiez'w·?，8:309 (1990) ; Lowman及 Wells，Mei/zoc/s.· /1 Compam’o« ίο h 3:205 (1991))。在單價嗔菌粒呈現系統中，表現低含量之基因融合物，且亦表現野生型基因ΠΙ蛋白使得可保留粒子之傳染性。產生肽庫及篩選彼等庫之方法已揭示於多個專利（例如美國專利第5,723,286號、美國專利第 5,432,018號、美國專利第5,580,717號、美國專利第 5,427,908號及美國專利第5,498,530號）中。可以多種方式製備抗體或抗原結合多肽之庫，該等方式包括藉由插入隨機DNA序列而改變單一基因或藉由選殖相關基因之家族。使用噬菌體（噬菌粒）呈現來呈現抗體或抗原結合片段之方法已描述於美國專利第5,750,373號、第 5,733,743 號、第 5,837,242 號、第 5,969,108 號、第 6,172，197號、第5,580,717號及第5,658,727號中。隨後針對具有所需特徵之抗體或抗原結合蛋白之表現筛選庫。將所選胺基酸取代為模板核酸之方法在此項技術中已明確，其中一些描述於本文中。舉例而言，高變區殘基可使用康科爾法（Kunkel method)取代。例如參見Kunkel等人， 154:367-382 (1987)。 147375.doc -185- 201039846 募核苷酸之序列包括欲改變之高變區殘基的一或多個所設計之密碼子組。密碼子組為一組用於編碼所需變異胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。如下文根據IUB編碼所示，密碼子組可使用符號表示以指示特定核苷酸或核苦酸之等莫耳混合物。 1UB編碼 G鳥嘌呤 A腺嘌呤 T胸腺嘧啶 C胞嘧啶 R(A 或 G) Y(C 或 T) M(A或 C) K(G或 T) S(C 或 G) W(A或 T)

H(A或C或T) B(C或G或T) V(A或C或G) D(A或 G 或 T)H N(A或C或G或T) 舉例而言，在密碼子組DVK中，D可為核苷酸A或G或 T; V可為A或G或C;且K可為G或T。此密碼子組可提供18 個不同密碼子，且可編碼胺基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、 147375.doc •186· 201039846

Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、ASp、Glu、吻及〜。可使用標準方法合成寡核苷酸或引子組。寡核苷酸组例如可藉由固相合成來合成，其含有表示該密碼子組所提供之核普酸三聯體之所有可能組合且將編碼所需之胺基酸也的序列。以所選核苦酸「簡併性」在特定位置合成寡核苦酸為此項技術所熟知。該等具有特定密碼子組之核苷酸組可使用市售核酸合成儀（購自例如AppUed則〇叮办抓， F〇ster City，CA)合成或可在商業上（例如由[浪 Technologies，Rockville，MD)獲得。因此，所合成之具有特定密碼子組之寡核苷酸組通常包括具有不同序列之複數個寡核苷酸，該等差異由整個序列内之密碼子組建立。根據本發明使用之寡核苦酸具有使得可與可變域核酸模板雜交且亦可包括用於選殖目的之限制酶位點的序列。在一方法中，編碼變異胺基酸之核酸序列可藉由寡核苷酸介導之突變誘發產生。此技術為此項技術中所熟知如 Zoller等人，10:6487_65〇4(1987)所述。簡言之，編碼變異胺基酸之核酸序列藉由編碼所需密碼子組之寡核苷酸組與DNA模板雜交產生，其中該模板為含有可變區核酸模板序列之質體的單股形式。雜交之後，使用 DNΑ聚合酶合成模板之完整第二互補股，其由此併入募核苦酸引子且含有募核普酸組所提供之密碼子組。

一般而言，使用長度為至少25個核苷酸的寡核苷酸。最佳券核苷酸應具有12至1 5個核苷酸，其與模板在編碼突變之核苷酸的任一側完全互補。此確保募核苷酸與單股DNA 147375.doc -187- 201039846 模板分子正確地雜交。寡核苷酸易於使用此項技術中已知之技術（諸如 Crea等人 ’ Proc. tASVi，75:5765 (1978)所述之技術）合成。 DNA模板係藉由源自噬菌體M13載體（市售M13mpl8及 Ml 3mpl9載體為適合的）之彼等載體或含有單股噬菌體複製起點之彼等載體（如Viera等人，Mei/z. I53:3 (1987)所述）產生。因此，可將欲突變之DNA插入此等載體之一中以產生單股模板。產生單股模板描述於上述 8狂〇1131：〇〇1<;等人之第4.21-4.41章中。為改變天然DNA序列，使寡核苷酸與單股模板在適合之雜交條件下雜交。隨後添加DNA聚合酶（通常T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I之克列諾片段（Klenow fragment))以使用寡核苷酸作為合成之引子來合成模板之互補股。由此形成異雙螺旋分子，以使DNA之一股編碼基因1之突變形式，而另一股（初始模板）編碼基因1之天然未改變序列。隨後將此異雙螺旋分子轉型至適合之宿主細胞（通常為原核生物，諸如大腸桿菌JM101)中。細胞生長之後，將其塗佈於瓊脂糖平板上且使用用32-P(32-Phosphate)放射性標記之寡核苷酸引子篩選以鑑別含有突變DNA之細菌群落。上文方才所述之方法可進行修改使得可產生均雙螺旋 (homoduplex)分子，其中質體之兩個股均含有突變。修改如下：如上所述使單股寡核苷酸黏接於單股模板。使三個去氧核糖核苷酸（去氧核糖腺苷（dATP)、去氧核糖鳥苷 (dGTP)及去氧核糖胸苷（dTT))之混合物與稱作dCTP-(aS)之 147375.doc •188· 201039846 經修飾硫去氧核糖胞,η定（其可獲自Amersham)組合。將此混合物添加至模板-寡核苷酸複合物中。向此混合物添加 DNA聚合酶之後’產生除突變鹼基以外與模板一致之dNA 股。另外，DNA之此新股將含有dCTP-(aS)替代dCTP，其用於保護dCTP免於限制核酸内切酶消化。用適當限制酶切割雙股異雙螺旋之模板股之後，模板股可用Εχ〇ΙΠ核酸酶或另一適當核酸酶穿過含有欲突變誘發位點之區域消化。隨後反應停止而留下僅部分單股之分子。隨後在所有四種去氧核糖核苷酸三磷酸（ΑΤΡ)及DNA連接酶存在下使用DNA聚合酶形成完整雙股DNA均雙螺旋。隨後可將此均雙螺旋分子轉型至適合之宿主細胞中。如先前所表明，寡核苷酸組之序列具有足夠長度以與模板核酸雜交’且亦可（但未必）含有限制位點。DNA模板可由源自噬菌體Μ13載體之載體或含有單股噬菌體複製起點之載體（如Viera荨人，从以六·五似少所0/·, 153:3 (1987)所述）產生。因此，必須將欲突變之DNA插入此等載體之一中以產生單股模板。單股模板之產生描述於前等人之第4.21-4.41章節中。根據另一方法，可在抗體人類化期間經由選擇修復之高變區恢復抗原結合（參見2〇〇5年2月丨8日申請之申請案第 11/061，841號）。該方法包括將非人類高變區併入接受者構架上，且進一步將一或多個胺基酸取代引入一或多個高變區中而不改變接受者構架序列。或者，引入一或多個胺基酸取代可伴隨改變接受者構架序列。 147375.doc 201039846 根據另一方法，可藉由提供上游及下游寡核苷酸組產生庫（library)，各組具有多數不同序列之寡核普酸，該等不同序列由寡核苷酸序列内所提供之密碼子組建立。可在聚合酶鏈反應中使用上游及下游寡核皆酸組以及可變域模板核酸序列以產生PCR產物之「庫」。pcR產物可稱作「核酸卡匣」，因為其可使用已建立之分子生物學技術與其他相關或不相關核酸序列（例如病毒鞘蛋白及二聚域）融合。 PCR引子之序列包括用於高變區中溶劑可達及高度多樣化位置的或夕個没计岔碼子組。如上所述，一密碼子組為一組用於編碼所欲變異胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。符合所需標準經由適當篩選/選擇步驟選擇的抗體選擇物可使用標準重組技術分離及選殖。更重要的是，將抗體人類化而保留對抗原之高結合親和力及其他有利生物特性。為達成此目標，根據一個較佳方法，人類化抗體係藉由一種使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種設想之人類化產物的方法製備。三維免疫球蛋白模型通常可得且為熟習此項技術者所熟悉。可利用電腦程式，其說明且呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能二維構形結構。該等呈現之檢查可分析殘基在候選免疫球蛋白序列作用中之可能角色，亦即分析殘基影響候選免疫球蛋白結合抗原之能力。以此方式，可自接受者及輸入序列選擇FR殘基且組合以獲得所欲抗體特徵，諸如對標靶抗原之親和力提高。一般而言，高變區殘基直接 147375.doc -190- 201039846 且大部分實質上涉及影響抗原結合。涵蓋各種形式之人類化抗FcRH5抗體。舉例而言，人類化抗體可為抗體片段（諸如Fab)，其視情況與一或多種細胞毒性劑結合以產生免疫結合物。或者，人類化抗體可為完整抗體，諸如完整IgGl抗體。作為人類化之替代，可產生人類抗體。舉例而言，現在有可能產生轉殖基因動物（例如小鼠），其在免疫後能夠在無内源性免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體之完整譜系。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠體内之抗體重鏈連接區域（JH)基因之純合子缺失導致内源性抗體產生受到完全抑制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移於該等生殖系突變小鼠中將在抗原攻毒之後產生人類抗體。例如參見 Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) ; Jakobovits 等人，Nature，362:255-258 (1993); Bruggemann等人，Year in Immuno. 7:33 (1993);美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,591，669號（均屬於 ❹

GenPharm)；第 5,545,807號；及 WO 97/1 7852。或者，可使用嗔菌體呈現技術（McCafferty等人，Nature 348:552-5 53 [1990])在活體外自未免疫供者之免疫球蛋白可變（V)域基因譜系產生人類抗體及抗體片段。根據此技術，將抗體V域基因同框選殖於絲狀噬菌體（諸如Ml3或fd) 之主要或次要鞘蛋白基因中，且以功能性抗體片段形式呈現於噬菌體粒子表面上。由於絲狀粒子含有噬菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體之功能特性進行的選擇亦使 147375.doc -191 - 201039846 得可選擇編碼展現彼等特性之抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。可以各種形式執行噬菌體呈現，該等形式評述於例如Johnson，Kevin S.及Chiswell，David J·，Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993) 中。數種來源之V基因區段可用於噬菌體呈現。Ciackson 等人，Nature, 352:624-628 (1991)由源自經免疫小鼠之脾的V基因的隨機組合小庫分離出不同抗噁唑酮抗體陣列。可構築未免疫之人類供者之V基因的譜系且針對不同抗原 (包括自體抗原）陣列之抗體可基本上按照由Marks等人，J.

Mol. Bi〇l. 222:581-597 (1991)或 Griffith等人，EMBO J. 12:725-734 (1993)所述之技術來分離。亦參見美國專利第 5,565,332號及第 5,573,905號。如上所述，人類抗體亦可由活體外活化B細胞產生（參見美國專利 5,567,6 10及 5,229,275)。 4.抗體片段在某些情況下’宜使用抗體片段而非完整抗體。較小尺寸之片段使得可快速清除且可改良與實體腫瘤之接近。已開發各種技術來產生抗體片段。傳統上，經由蛋白水解清化元整抗體獲得此等片段（例如參見Morimoto等人， Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及Brennan等人，Science，229:81 (1985))。然而，現在可由重組宿主細胞直接產生此等片段^ Fab、Fv及ScFv 抗體片段均可表現於大腸桿菌中且由大腸桿菌分泌，由此使得易於產生大量此等片段。可自上述抗體噬菌體庫分離 147375.doc -192- 201039846 抗體片段。或者，可自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段且使其以化學方式偶合以形成F(ab，）2片段（Carter等人， Bio/Technology 10:163-167 (1992))。根據另一方法，可自重組宿主細胞培養物直接分離F(ab，)2片段。美國專利第 5,869,046號中描述具有延長之活體内半衰期的Fab及 F(ab')2片段，其包含結合抗原決定基殘基之救助受體 (salvage receptor)。其他產生抗體片段之技術將為熟習此項技術者顯而易見。在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv 片段（scFv)。參見WO 93/16185 ;美國專利第5,571,894 號，及美國專利第5,587,458號。Fv及sFv為唯一具有完整結合位點而無恆定區之物質；因此，其適合於減少活體内使用期間的非特異性結合。sFv融合蛋白質可經構築以在 sFv之胺基或羧基末端產生效應蛋白之融合物。參見前述 Antibody Engineering編，Borrebaeck。抗體片段亦可例如如美國專利第5,641，870號所述為「線性抗體」。該等線性抗體片段可具有單特異性或雙特異性。 5.雙特異性抗髏雙特異性抗體為對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性之抗體。例示性雙特異性抗體可結合於本文所述之 FcRH5蛋白之兩個不同抗原決定基。其他該等抗體可組合 FcRH5結合位點與另一蛋白質之結合位點。或者，抗 FcRH5臂可與結合於白血球上之觸發分子（諸如τ細胞受體分子（例如CD3);或IgG之Fc受體（FcyR)，諸如fcyri(cD64)、 FqRII(CD32)及FcYRIII(CD16))的臂組合，以便將細胞防禦 147375.doc •193· 201039846 機制集中且定位於表現FcRH5之細胞。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現FcRH5之細胞。此等抗體具有FcRH5結合臂及結合細胞毒性劑（例如，沙泊寧 (saporin)、抗干擾素α、長春花生物鹼、蓖麻毒素A鏈、曱胺喋呤或放射性同位素半抗原）之臂。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製備（例如F(ab’）2雙特異性抗體）。 WO 96/16673描述一種雙特異性抗ErbB2/抗FcyRIII抗體，且美國專利第5,837,234號揭示一種雙特異性抗ErbB2/ 抗FcyRI抗體。WO 98/02463中展示雙特異性抗ErbB2/Fca 抗體。美國專利第5,821，337號及第6,407,213號教示雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。已描述結合CD3抗原上之抗原決定基及第二抗原決定基的其他雙特異性抗體。例如參見美國專利第5,078,998號（抗CD3/腫瘤細胞抗原）；第5,601,819 號（抗 CD3/IL-2R ;抗CD3/CD28 ;抗CD3/CD45);第 6，129,914號 (抗匸〇3/惡性3細胞抗原）；第7,112,324號（抗€〇3/0〇19); 第 6,723,538號（抗CD3/CCR5);第7,235,641號（抗CD3/EpCAM); 第7,262,276號（抗0〇3/卵巢腫瘤抗原）；及第5,731,168號 (抗 CD3/CD4IgG)。製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知。全長雙特異性抗體之傳統產生係基於共表現兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中兩個鏈具有不同特異性（Millstein等人， Nature 305:537-539 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈與輕鏈之隨機分配，故該等融合瘤（四源雜交瘤）產生10種不同抗 147375.doc -194- 201039846 體分子之可能的混合物’其中僅—種具有正確雙特異性結構。通常藉由親和層❹驟進行之正確分子之純化相當繁瑣，且產物產率較低。類似程序揭示於w〇 93/〇8829中及 Traunecker等人，EMBO J. 10:3655_3659 (1991)中。根據-不同方法，使具有所需結合特異性之抗體可變域 (抗體_抗原組合㈣）與免疫球蛋白恆线序列融合。較佳與包含鉸鏈區、Ch2區及Ch3區之至少—部分的㈣鏈怪定域融合。較佳使含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鍵怪定區(CH1)存在於融合物之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鍵融合物及（若冑要）免疫球蛋白輕鏈之DNA插入各別表現載體中，且共轉染至適合之宿主細胞中。當不等比率之用於構築之二個多肽鏈提供所需雙特異性抗體之最佳產率時，此舉提供調節實_中三個多肽片段之相互比例的極大靈活性 '然而，當等比率之至少兩個多肽鏈的表現產生高產率時或當比率對產生所需鏈組合無重要影響時，有可能將兩個或所有：r彳 —個多肽鏈之編碼序列插入單一表現載體中。在，亥方法之-較佳實施例中，雙特異性抗體係由一個臂中具：第一結合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現此不對稱钍谣女_ 轉、、、。構有助於所需雙特異性化合物與非所要之免疫球蛋白鏈組合分離，因為免疫球蛋白輕鏈存在於僅一半雙特異性分子中、 _ 丁甲挺供—種谷易之分離方式。此方法揭不於WO 94/04α〇λ a 4/〇4690 _。對於產生雙特異性抗體之詳 147375.doc •195- 201039846 情’例如參見 Suresh等人，Methods in Enzymoiogy 121:210 (1986)。根據美國專利第5,73^68號中所述之另一方法，可將抗體分子對之間的界面工程改造以使自重組細胞培養物回收之雜二聚體之百分比最大。較佳界面包含Ch3域之至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子界面之一或多個小胺基酸側鏈經較大側鏈（例如酷胺酸或色胺酸）置換。藉由用較小胺基酸側鏈（例如丙胺酸或蘇胺酸）置換大胺基酸側鏈而於第二抗體分子之界面上產生具有與大側鏈相同或類似之尺寸的補償性「空腔」。此提供—種使雜二聚體之產率增加超過其他非所要之終產物（諸如均二聚體）的機制。根據此方法產生之雙特異性抗體在本文中稱作r腔内突起 (protuberance-into-cavity)」抗體。雙特異性抗體包括交聯或「雜結合」抗體。舉例而言，雜結合物中之一種抗體可與抗生物素蛋白偶合，另一者可與生物素偶合。舉例而言，已提出該等抗體使免疫系統細胞靶向非所要之細胞（美國專利第4,676,980號），且用於治療 HIV感染（WO 91/00360、W0 92/200373及 EP 03089)。雜結合抗體可使用任何適宜交聯方法來製備。適合之交聯劑為此項技術中所熟知，且與多種交聯技術一起揭示於美國專利第4,676,980號中。自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。舉例而言’雙特異性抗體可使用化學鍵製備。Brennan 等人’ Science 229:81 (1985)描述一種使完整抗體以蛋白 147375.doc -196- 201039846 水解方式裂解以產生F(ab')2片段之程序。在二硫氫基錯合劑亞砷酸鈉存在下將此等片段還原以使鄰近二硫氫基穩定且阻止形成分子間二硫基。隨後將所產生之Fab’片段轉化為硫代硝基苯曱酸酯（TNB)衍生物。隨後藉由用巯基乙胺還原將Fab'-TNB衍生物之一再轉化為Fab’-硫氫基，且將其與等莫耳量之另一 Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶之試劑。近期之進展有助於自大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段， 0 可以化學方法使該等片段偶合以形成雙特異性抗體。

Shalaby等人，J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)描述完全人類化之雙特異性抗體F(ab’）2分子之產生。自大腸桿菌分別分泌各Fab1片段且使其經受活體外定向化學偶合以形成雙特異性抗體。由此形成之雙特異性抗體能夠結合於過度表現ErbB2受體之細胞及正常人類T細胞，且觸發人類細胞毒性淋巴細胞對人類乳房腫瘤標靶之溶解活性。亦已描述各種直接自重組細胞培養物製備且分離雙特異〇性抗體片段之技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny 等人，J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接於兩個不同抗體之Fab'部分。在鉸鏈區還原抗體均二聚體以形成單體，且隨後再氧化以形成抗體雜二聚體。該方法亦可用於產生抗體均二聚體。Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 90:6444-6448 (1993)所述之「雙功能抗體」技術為製備雙特異性抗體片段提供替代性機制。該 147375.doc -197- 201039846 等片段包含藉由過短而使得同—鏈上之兩個域之間無法配對的連接子連接於W因此，迫使―個片段之^及 VL域與另>1 &之互補、及vH域配對，從而形成兩個抗原結合位點。亦已報導另—藉由使用單鏈FV(SFV)二聚體來製備雙特異性抗體片段之策略。參見Gruber等人，J·

Immunol.，152:5368 (1994) ° 涵蓋具有2以上之價數的抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J. lmmun〇i· 147:60 (1991)。 6 ·雜結合抗體雜結合抗體亦屬於本發明之範疇内。雜結合抗體由兩個共4貝接合之抗體構成。舉例而言’已提出該等抗體使免疫系統細胞靶向非所要之細胞[美國專利第4,676,980號]，且用於治療HIV感染[WO 91/00360 ; WO 92/200373 ; EP 03089]。預期s亥等抗體可在活體外使用合成蛋白質化學中之已知方法（包括涉及交聯劑之方法）製備。舉例而言，可使用二硫基交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。適於此目的之試劑之實例包括亞胺基硫醇鹽（iminothi〇late)及4-酼基丁醯亞胺甲酯（methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美國專利第4,676,980號中所揭示之試劑。 7.多價抗體相較於二價抗體，表現與抗體結合之抗原的細胞可能更快地内化（及/或異化（catabolized))多價抗體。本發明之抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體（其為除IgM類別之外的抗體）（例如四價抗體），多價抗體可易 147375.doc -198· 201039846 於藉由重組表現編碼抗體多肽鏈之核酸產生。多價抗體可包含二聚域及三個或三個以上抗原結合位點。較佳二聚域包3 — Fc區或一鉸鏈區（或由該區組成）。在此情形下，抗體將包含一 Fc區及在Fc區胺基末端之三個或三個以上抗原結合位點。本文之較佳多價抗體包含三至約八個但較佳四個抗原結合位點（或由該等位點組成p多價抗體包含至少一條多肽鏈（且較佳兩條多肽鏈），其中多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n- VD2-(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為一 Fc區之一條多肽鏈，乂1及又2表示胺基酸或多肽，且η為〇或1。舉例而言，多肽鏈可包含VH_CH1-可撓性連接子-VH-CHl-Fc區鏈或VH-CHl-VH-CHl-Fc區鏈。本文之多價抗體較佳另外包含至少兩個（且較佳四個）輕鏈可變域多肽。本文之多價抗體可例如包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情況另外包含CL域。〇 8. 效應功能工程改造可能需要關於效應功能修飾本發明之抗體，例如以便增強抗體之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性（Adcc)及/咬補體依賴性細胞毒性（CDC)。此可藉由在抗體之以區中引入一或多個胺基酸取代來達成。或者或另外，可將半胱胺酸殘基引入Fc區中，從而使得可在該區域中形成鏈間二硫鍵。由此產生之均二聚抗體可具有改良之内化能力及/或增強之補體介導之細胞殺滅及抗體依賴性細胞的細胞毒性 147375.doc •199· 201039846 (ADCC)。參見 Caron等人，J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 及Shopes，B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)。具有增強之抗腫瘤活性的均二聚抗體亦可使用如Wolff等人，Cancer Research 53:2560-2565 (1993)所述之雜雙官能交聯劑來製備。或者，抗體可經工程改造，其具有雙Fc區且從而可具有增強之補體溶解及ADCC能力。參見Stevenson等人， Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)。為延長抗體之jk 清半衰期，可將結合救助受體之抗原決定基併入抗體（尤其抗體片段）中，例如，如美國專利5,739,277所述。如本文所用之術語「結合救助受體之抗原決定基」係指IgG分子（例如IgGi、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區的抗原決定基，其負責延長IgG分子之活體内血清半衰期。 9.免疫結合物本發明亦關於免疫結合物（可互換稱作「抗體-藥物結合物」或「ADC」），其包含結合於細胞毒性劑（諸如化學治療劑、生長抑制劑、毒素（例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（亦即放射性結合物））的抗體。在某些實施例中，免疫結合物包含抗體及化學治療劑或其他毒素。上文已描述適用於產生該等免疫結合物之化學治療劑。可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌 aerwgz·⑽sa))、蓖麻毒素A键、相思豆毒素A 鏈、莫迪素（modeccin)A鍵、α-帚麴菌素（alpha-sarcin)、油 147375.doc -200- 201039846 桐/brc^z)蛋白、康乃馨（dianthin)蛋白、美洲商陸（P/zyio/aca ㈣α)蛋白（pAPi、PAPII 及 PAP-S)、苦瓜（momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒素（curcin)、巴豆毋素（crotin)、肥皂草（sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素（gelonin)、有絲分裂素（mjt〇geiiin)、偏限麵菌素 (restrictocin)、酚黴素（phenomycin)、伊諾黴素（enomycin) 及黴菌毒素（tricothecene)。多種放射性核種可用於產生放射性結合抗體。實例包括212Bi、nij、i3iIn、9〇Y&186Re。 Ο 抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑來製備’ s亥·#蛋白質偶合劑諸如3 _(2-。比η定基二硫氫基）丙酸Ν-丁二醯亞胺酯（SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷（ΙΤ)、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二曱酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛（諸如戊二酿）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯曱醯基）己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙气對重氮苯甲醯基）_乙二胺）、 Q 二異氰酸酯（諸如2,6-二異氰酸甲苯酯）及雙活性氟化合物 (諸如1,5-一氟-2,4-二硝基苯）。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如 Vitetta專人，Science，238: 1098 (1987)所述製備。經碳14標記之1 -異碗氰酸酯基苯甲基_3 _甲基二伸乙三胺五乙酸（MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸結合於抗體之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。本文亦涵盍抗體與一或多種小分子毒素之結合物，該等毒素諸如刺孢黴素、奥瑞他汀肽（諸如單曱基奥瑞他汀 (MMAE)(多拉司他汀之合成類似物））、類美登素（諸如 147375.doc -201 - 201039846 DM1)、單端孢黴烯（trichothene)及CC1065及此等毒素之具有毒素活性之衍生物。例示性免疫結合物-抗體-藥物結合物本發明之免疫結合物（或「抗體—藥物結合物」 (「ADC」））可具有下式I，其中抗體經由視情況存在之連接子（L)結合（亦即共價連接）於一或多個藥物部分（D)。 ADC可包括thioMAb藥物結合物（「TDC」）。

Ab-(L-D)p I 因此，抗體可直接或經由連接子結合於藥物。在式】中，P為每個抗體之藥物部分的平均數，其可介於例如每個抗體約1個至約20個藥物部分的範圍内，且在某些實施例中，母個抗體1個至約8個藥物部分。本發明包括一種組合物，其包含式I之抗體-藥物化合物之混合物，其中每個抗體之平均藥物負載為約2個至約5個或約3個至約4個。 a. 例示性連接子連接子可包含-或多冑連接子組分。命】示性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基（「Mc」）、順丁烯二醯亞胺基丙醯基（「MP」）、纈胺酸_瓜胺酸（「"…仏」或「vc」）、丙胺酸-苯丙胺酸（「^_」）、對胺基苯甲氧基幾基（「PAB」）及由與連接子試劑結合產生者：形成連接子部分4-疏基戊酸之4_(2_Dtbn定基硫基）戍酸队丁二酿亞胺醋（「㈣」）、开）成連接子部分心((2,5_二側氧基料咬_ 1-基)甲基)環己烷甲酸之4，_順丁烯二醯亞胺基甲基)環己 I47375.doc -202- 201039846

烷-1-甲酸N-丁二醯亞胺酯（「SMCC」，本文中亦稱作「MCC」）、形成連接子部分4-巯基丁酸之4_(呢咬_2_基二硫基）丁酸2,5-二側氧基吡咯啶小基醋（「SPDB」）、N_T 二醯亞胺基（4-碘-乙醯基）胺基苯甲酸N_ 丁二醯亞胺酯 (「SIAB」）、作為一或多個重複單元之伸乙氧基_CH2cH2〇_ (「EO」或「PEO」）。其他連接子組分為此項技術中已知且一些描述於本文中。各種連接子組分為此項技術中已知，其中一些如下所述。〇連接子可為有助於在細胞中釋放藥物之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子（例如腙）、蛋白酶敏感性（例如肽酶敏感性）連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫基之連接子（Chari等人，Cancer Research 52:127-131 (1992);美國專利第 5,2〇8〇2〇號）。在某些實施例中，連接子如下式π所示： -Aa-Ww-Yy- „ 〇其中A為延伸子單元，且a為0至1之整數；w為胺基酸單元且〜為〇至12之整數；γ為間隔子單元，且y為0、工或 2，且Ab、D及p如上文對於式〗所定義。該等連接子之例示性實施例描述於Us 2〇〇5_〇238649 ^中，該案以引用的方式明確地併入本文中。在一些實施例中，連接子組分可包含使抗體連接於另— j接子組分或藥物部分的「延伸子單元」。例示性延伸子單元士下所示（其中波形線指示與抗體共價連接之位點）： 147375.doc 201039846

MPEG

ΑΛ 在一些實施例中，連接子組分可包含胺基酸單元。在一該實施例中，胺基酸單元使得可藉由蛋白酶裂解連接子，從而有助於在暴露於細胞内蛋白酶（諸如溶酶體酶）之後自免疫結合物釋放藥物。例如參見Doronina等人（2003) 21:778-784。例示性胺基酸單元包括（但不限於）二肽、三肽、四肽，及五肽。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸（vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸（af或ala-phe); 笨丙胺酸-離胺酸（fk或phe-lys);或N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸 (Me-val-cit)。例示性三肽包括甘胺酸缔胺酸-瓜胺酸（gly-vai-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸（giy-giy-giy)。胺基酸單 147375.doc • 204· 201039846 元可包含天然存在之胺基酸殘基以及微量胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可在其對藉由特定酶（例如腫瘤相關蛋白酶，組織蛋白酶 (cathepsiiOB、C及D，或纖維蛋白溶酶（plasmin)蛋白酶）達成之酶促裂解之選擇性方面進行設計及最佳化。在二貫施例中，連接子組分可包含直接或經由延伸子單兀及/或胺基酸單元將抗體連接於藥物部分之「間隔子」單元。間隔子單元可為「自我犧牲」或「非自我犧牲」間隔子單元。「非自我犧牲」間隔子單元為間隔子單元之为或全部在酶促（例如蛋白水解）裂解ADC之後仍結合於藥物部分的間隔子單元。#自我犧牲間隔子單元之實例包括（但不限於）甘胺酸間隔子單元及甘胺酸_甘胺酸間隔子單S。亦、涵蓋易if受序列特異性酶促裂解之肽間隔子的其他組合。舉例而言，藉由腫瘤_細胞相關蛋白酶酶促裂解含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元之ADC將引起自adc 之其餘部分釋放甘胺酸_甘胺酸_藥物部分。在一該實施例中，隨後甘胺酸-甘胺酸-藥物部分在腫瘤細胞中進行各別水解步驟，從而使甘胺酸·甘胺酸間隔子單元與藥物部分裂解。「自我犧牲」間隔子單元使得可不經各別水解步驟釋放藥物部分。在某些實施例中，連接子之間隔子單元包含對胺基苯甲基單元該實施例中，對胺基苯甲醇經由酿胺鍵連接於胺基酸單元，且在苯甲醇與細胞毒性劑之間生成胺基甲酸醋、甲基胺基甲酸酿或碳酸醋。例如參見 147375.doc -205· 201039846

Hamann 等人（2005) Γ/^ 户攸仙（2〇〇5) 15:1087-1103。在-實施例中，fa1隔子單元為對胺基苯甲氧基羰基（PAB)。在某些實施例中，對胺基苯甲基單元之伸苯基部分經Qm取代，其中（^為―^;8烷基、_〇_((：1_(：8烷基）、-鹵素、_硝基或-氰基，且⑺為範圍為〇_4之整數。自我犧牲間隔子單元之實例另外包括（但不限於）電子學上類似於對胺基苯甲醇之芳族化合物（例如參見us 2005/0256030 A1)，諸如2-胺基咪唾_5-甲醇衍生物（Hay等人，（1999)出⑽rg. Md. C/zem. Ze". 9:2237)及鄰胺基苯甲基縮越或對胺基苯甲基縮醛。可使用醯胺鍵水解之後進行環化的間隔子，諸如經取代及未經取代之4_胺基丁酸醯胺 (Rodrigues等人，方沁/%；；，1995, 2，223);經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統（Storm等人，乂 1972, 94, 5815)·’ 及 2-胺基苯基丙酸醯胺（Amsberry等人，乂 Org. C/zem.，1990，55，5867)。去除在甘胺酸之a位取代之含胺藥物（Kingsbury等人，乂从6乂 C；2ew·，1984，27，1447)亦為適用於ADC之自我犧牲間隔子之實例。在一實施例中，間隔子單元為如下文所述之分支鏈雙 (羥甲基）苯乙烯（BHMS)單元，其可用於併入及釋放多個藥物。 147375.doc -206- 201039846 ο

其中Q為_Ci_C8烧基、-〇-(Ci-C8烧基）、-_素、-石肖基或-氮基；m為介於0-4範圍内之整數；η為0或1 ;且p介於1至約 20範圍内。

2個藥物在另一實施例中，連接子L可為樹突型連接子以經由分支鏈多官能連接子部分將一個以上藥物部分共價連接於抗體（Sun 等人，（2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215 ； Sun 等人，（2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹突狀連接子可增加藥物與抗體之莫耳比，亦即負載，此與ADC之效能有關。因此，當經半胱胺酸工程改造之抗體僅具有一個反應性半胱胺酸硫氫基時，可經由樹突狀連接子連接多個藥物部分。例示性連接子組分及其組合如下在式II ADC之情形下所

Val-Cit 或 VC 147375.doc •207· 201039846

MC-val-cit

MC-val-cit-PAB。連接子組分（包括延伸子、間隔子及胺基酸單元）可藉由此項技術中已知之方法（諸如US 2005-0238649 A1中所述之方法）合成。 b.例示性藥物部分 (X)姜登素及肅美登資在一些實施例中，务滤沾貝丁光疫結合物包含結合於一或多個類美登素分子之抗體。類美昝去氣、、素為藉由抑制微管蛋白聚合發揮作用之有絲分裂抑制劑。美登素最先自東非灌木齒葉美登木（Mayt_s Serrata)分離（美國專利第Μ%，⑴號）。隨後’發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登, 147375.doc -208、 201039846 (1^71&]13丨11〇1)及0：-3美登醇酯（美國專利第4，151，042號）。合成美登醇及其衍生物及類似物揭示於例如美國專利第 4，137,230 號；第 4,248,870 號；第 4,256,746 號；第 4,260,608 號；第 4,265,814 號；第 4,294,757 號；第 4,307,016 號；第 4,308,268 號；第 4,308,269 號 > 第 4,309,428 號；第 4,313,946 號；第 4,315,929 號；第 4,317,821 號；第 4,322,348 號；第 4,331,598 號；第 4,361，650 號；第 4,364,866 號；第 4,424,219 號；第 Ο ο 4,450,254號；第 4,362,663號；及第 4,371，533 中。類美登素藥物部分在抗體-藥物結合物中為具吸引力之藥物部分，此係由於其：⑴相對易於藉由醱酵或醱酵產物之化學修飾或衍生製備；（U)易於用適用於經由二硫基及非二硫基連接子結合於抗體的官能基衍生；（ui)在血漿中穩定；及（iv)有效針對多種腫瘤細胞株。適用作類美登素藥物部分之美登素化合物為此項技術中所熱知，且可根據已知方法自天然來源分離或使用遺傳工程改造及醱酵技術產生（US 0790952 ; US 2005/0170475 ; Yu等人（2002) PNAS 99:7968·7973)。美登醇及美登醇類似物亦可根據已知方法以合成方式製備。例不性類美登素藥物部分包括具有經修飾芳族環之部分，諸如：C-19-去氯（美國專利第4256746號）(藉由安絲菌素（ansamytocin)P2之氫化鋰鋁還原製備）；c_2〇_羥基（或c_ 20-去曱基）+/_C_19_去氯（美國專利第436i65〇號及第〇16號）（藉由使用鏈黴菌（汾repi0W}Ces)或放線菌 147375.doc 201039846 少ca)去甲基化或使用LAH去氯製備）；及c_20_i 曱氧基、C-20-醯氧基（-OC〇R)、+/_去氯（美國專利第 4,294,757號）（藉由使用醯基氯化物來酿基化製備）及其他位置具有修飾之部分。例示性類美登素藥物部分亦包括具有修飾之部分，諸如：C-9-SH(美國專利第4424219號）（藉由美登醇與H2S或 P^5反應製備）；C-14-烷氧基甲基（去甲氧基/Ch2〇r)(uS 4331598)，C-14-經甲基或醯氧基曱基（CH2〇h或 CH2〇Ac)(美國專利第445〇254號）（由奴卡菌（N〇cardia)製備）；C-15-羥基/醯氧基（us 4364866)(藉由鏈黴菌轉化美登醇製備）；C-15-甲氧基（美國專利第43 13946號及第4315929 號）（自滑桃樹（Trewia nudlflora)分離）；C-1 8-N-去曱基（美國專利第4362663號及第4322348號）（藉由鏈黴菌使美登醇去曱基化製備）；及4,5-去氧（US 4371533)(藉由三氣化鈦/LAH 還原美登醇製備）。已知美登素化合物上之多個位置視連接類型而定適用作鍵聯位置。舉例而言，為形成酯鍵，具有羥基之C-3位置、用羥甲基修飾之C-14位置、用羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置均適合（US 5208020 ; US RE39151 ; US 6913748 ； US 7368565 ； US 2006/0167245 ； US 2007/0037972) ° 類美登素藥物部分包括具有以下結構之部分： 147375.doc -210- 201039846

其中波形線指示類美登素藥物部分之硫原子共價連接於 ◎ ADC之連接子。R可獨立地為H*Ci_C6烷基。使醯胺基連接於硫原子之伸烷基鏈可為曱基、乙基或丙基，亦即111為 1、2或 3(US 633410 ; US 5208020 ; US 7276497 ; Chari等人（1992) Cimcer 及认 52:127-131 ; Uu 等人（1996)〜％· TVa". JcaA Scz·仍』93:8618-8623)。本發明之化合物涵蓋類美登素藥物部分之所有立體異構體，亦即D之對掌性碳的Λ及5構型的任何組合。在一實施例中’類美登素藥物部分應具有以下立體化學：

減美登素藥物部分之例示性實施例包括：Dm 1 ; DM3 ; 147375.doc -211 - 201039846 及DM4，其具有以下結構：

CH30

147375.doc -212- 201039846 其中波形線指示藥物之硫原子共價連接於抗體-藥物結合物之連接子（L)。（WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1)。其他例示性類美登素抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫（其中Ab為抗體且p為1至約8): 〇

S

Ab I P NIH

Ab-SPP-DMl H3

s s

Ab I p ν·ιη

Ab-SPDB-DM4 147375.doc •213- 201039846 ο 03 Η c

NIH

Ab

Ab-SMCC-DMl。在一實施例中，形成抗體-藥物結合物，其中DM4經由 SPDB連接子連接於抗體之硫氫基（參見美國專利第 69 13748號及第7276497號，其全部内容係以引用的方式併入本文中）。 DM1經由BMPEO連接子連接於抗體之硫氫基的例示性抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫：

其中Ab為抗體；n為〇、^2;且p為1、2、3或4。含有類美登素之免疫結合物、其製備方法及其治療用途 147375.doc -214· 201039846

揭示於例如 Erickson 等人（2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433 ;美國專利第 5,208,020 號、第 5,416,〇64 號、US 2005/0276812 A1及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，其揭示内容以引用的方式明確地併入本文中。藉由將抗體以化學方式連接於類美登素分子而不顯著降低抗體或類美登素分子之生物活性來製備抗體-類美登素結合物。例如參見美國專利第5,208,020號（該專利之揭示内容以引用的方式明確地併入本文中）。類美登素可藉由已知技術合成或自天然來源分離。適合之類美登素揭示於例如美國專利第5,208,020號中及上文提及之其他專利及非專利公開案中，諸如美登醇及芳族環或美登醇分子其他位置經修飾之美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。此項技術中已知多種連接基團可用於製備抗體-類美登素結合物，包括例如美國專利第5208020號或歐洲專利〇 425 235 Bl ; Chari 等人 Cflwcer 52:127-131 (1992);及US 2005/016993 A1中所揭示之連接基團，該等參考文獻之揭示内容以引用的方式明確地併入本文中。包含連接子組分SMCC之抗體-類美登素結合物可如US 2005/0276812 Al，「Antibody-drug conjugates and Methods」中所揭示製備。連接子包含如以上所確定專利中所揭示的二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團。本文中描述且例示其他連接子。抗體與類美登素之結合物可使用各種雙官能蛋白質偶合 147375.doc -215- 201039846 劑來製備，該等蛋白質偶合劑諸如3_(2_吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酿(SPDP)、4供順丁烯二醯亞胺基甲基) ί衣己烷-1-甲酸丁 —醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷 (IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二曱醋鹽酸鹽）、_(諸如辛二酸二丁二醯亞胺醋）、醛(諸如戊一醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯曱醯基）己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙_(對重氮苯曱醯基乙二胺）、二異氰酸酯（諸如2,6-二異氰酸曱苯酯）及雙活性氟化合物（諸如1，5-二氟-2,4-二硝基苯）。在某些實施例中，偶合劑為提供二硫鍵之3-(2-吡啶基二硫基）丙酸N 丁二醯亞胺醋（SPDP)(Carlsson 等人，扪〇c/jew 丄 n3:723 737 (1 978))或4-(2-°比咬基硫基）戊酸N_ 丁二醯亞胺酯（spp)。連接子可視連接類型而定連接於類美登素分子之各位置處。舉例而言，可藉由使用習知偶合技術與羥基反應形成酯鍵。反應可發生於具有羥基之c_3位置、經羥甲基修飾之C-14位置、經經基修飾之C-15位置及具有經基之c_2〇位置處。在一實施例中，在美登醇或美登醇類似物之C_3位置處形成該鍵。 (1)奥瑞他汀及多拉司他订在一些實施例中，免疫結合物包含結合於多拉司他汀或多拉司他、/丁肽類似物或衍生物（例如奥瑞他汀（美國專利第 563 5483號；第5780588號））之抗體。已展示多拉司他；丁及奥瑞他汀干擾微管動力學、GTP水解及核分裂與細胞分裂 (Woyke 專尺Antimicrob. Agents and Chemother. 147375.doc -216- 201039846 45(12):3580-3584)且具有抗癌活性（美國專利第5,663,149 號）及抗真菌活性（Pettit等人，（1998) jgewis CTzemoAer. 42:2961-2965)。多拉司他汀或奥瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基）末端或C(羧基）末端連接於抗體（WO 02/088172)。例示性奥瑞他汀實施例包括N末端連接之單曱基奥瑞他灯藥物部分DE及DF(US 2005/0238649，揭示於Senter等人〇 2〇〇4 年 3 月 28 日提交之 Proceedings of the Ameriean Association for Cancer Research，第 45 卷，文摘號 623 中，其揭示内容以全文引用的方式明確地併入本文中）。肽藥物部分可選自下式DE& DF :

Dp 其中DEADF之波形線指示與抗體彳體連接子組分之共價連接位點，且在各位置，獨立地： R2係選自h&c1-c8烷基； 1碳環、芳基' C1_C1 R3係選自Η、CVC8烷基、c3-c 烧 147375.doc -217- 201039846 基-芳基、（VC8烧基 '3L8候天衣)、p 基-(C3-C8雜環）；雜環及CVC8炫 R4係選自H、〇1_(：8烷 A ^ I'C3-C8碳環、关 I ^ ^ ^ 基-方基、CVCs烧基、$基、CVCs烧 (C3-C8碳環）、c 基-(C3-C8雜環）； 3，C8雜環及c〗-c8烷 R5係選自Η及甲基；嶮，且具有式_(CRaRb) 1 烷基及C3~C8碳環， n-，其中Ra 且η係選自或R4及R5共同形成石炭及Rb係獨立地選自Η、c 2、3、4、5及 6 ; Κ係選自只及^-^烷基； R7係選自H、cvc8烷基、c3_c· 基-芳基、Cl-c8院基-(CVC8碳環 =基、基 _(C3-C8 雜環）； L3'C8雜環及 Cl_Cf 各R8係獨立地選自H、〇h、Ci_C8燒基、 (C】-C8院基）， 3匚8蚊環及 R9係選自烷基；

Rl〇係選自芳基或c3-c8雜環； ^為=S、NH或NR，其中Ru為CA燒基；係選自Η、CVCm烷基、芳基、c R14 V, I3 3'C8雜環、-fR 】3n、 R 或~(尺〇)m-CH(R15)2 ; °)m- m為介於M000範圍内之整數； R 3為C2-C8烷基；

Rl4為H或C〗-C8烷基；

Rl5在每次出現時係獨立地為 -(CH2)n- 局 H 、 C〇〇h 147375.doc -218- 201039846 N(R16)2、-(CH2)n-S03H或-(CHdn-SOyCrCs烧基； R16在每次出現時係獨立地為Η、CVCs烷基或-(CH2)n_ COOH ； R18係選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、_c(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環）及-c(r8)2-C(r8)2_(C3_c8碳環）；且 η為介於0至6範圍内之整數。在一實施例中，R3、R4及R7係獨立地為異丙基或第二丁基，且R5為-H或甲基。在一例示性實施例中，R3及R4各為異丙基，R5為-H，且R7為第二丁基。在另一實施例中，R2及R6各為甲基，且R9為_H。在另一實施例中，R8在每次出現時為_〇CH3。在一例示性實施例中，尺3及R4各為異丙基，尺2及R6 各為曱基，R5為-Η，R7為第二丁基，R8在每次出現時為-OCH3，且 R9為 _H。在一實施例中，z為。〇在一實施例中，R10為芳基。在一例示性實施例十，尺10為_苯基。在一例示性實施例中，當z為時，Rn為_H、甲基或第三丁基。在實施例中，當z為-NH時，R11為_ch(R15)2，其中R15 為 _(CH2)n-N(R16)，，且 r μ 兔〇、）2 丘K 為 «8烧基或 _(CH2)n C〇〇H。在另實把例巾，當z為_NHa夺，ru為_CH(Ri5)2，其中 R15為-(CH2)n-S〇3H。、式仏之例示性奥瑞他《丁實施例為MMAE，其巾波形線指 147375.doc -219- 201039846 示共價連接於抗體-藥物結合物之連接子（L):

式DF之例示性奥瑞他汀實施例為MMAF，其中波形線指示共價連接於抗體-藥物結合物之連接子（L)(參見US 2005/0238649 及 Doronina 等人（2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124)：

其他例示性實施例包括五肽奥瑞他汀藥物部分之C末端具有苯丙胺酸羧基修飾的單甲基纈胺酸化合物（WO 2007/008848)及五肽奥瑞他汀藥物部分之C末端具有苯丙胺酸側鏈修飾的單甲基纈胺酸化合物（WO 2007/008603)。其他藥物部分包括以下MMAF衍生物，其中波形線指示共價連接於抗體-藥物結合物之連接子（L):

147375.doc -220- 201039846 Ο

147375.doc -221 - 201039846

在態樣中，如上所示，親水性基團（包括（但不限於）三乙二醇醋（TEG))可連接於藥物部分之Rll處。在不受任何特定理論限制的情況下，親水性基團有助於藥物部分之内化及不聚結。包含奥瑞他汀/多拉司他汀或其衍生物之式j A D c之例示性實施例描述於us 2005-0238649及D〇r〇nina等人（2〇〇6) 价卿咖柳CW 17:114-124(其以引用的方式明確地併入本文中）中。包含MMAE或MMAF及各種連接子組分之式 IADC之例示性實施例具有以下結構及縮寫（其中「Ab」為抗體；咖至約8，「Val_Cit」或「vc」為缚胺酸-瓜胺酸二肽；且「S」為硫原子）。應注意在本文之經硫連接之 ADC的某些結構描述中，抗體表示為「抓8」僅指示硫連接特徵且並不指示特定硫原子具有多個連接子-藥物部分。以下結構之左括號可放置於硫原子之左#，在从與§ 147375.doc -222· 201039846 之間，其應為本文通篇所述之本發明ADC之等效說明。

Ab-MC-vc-PAB-MMAE 〇

包含MMAF及各種連接子組分之式I ADC之例示性實施例另外包括Ab-MC-PAB-MMAF及Ab-PAB-MMAF。有趣的是，包含MMAF藉由不可以蛋白水解方式裂解之連接子連接於抗體的免疫結合物已展示具有相當於包含MMAF藉由可以蛋白水解方式裂解之連接子連接於抗體的免疫結合物的活性。參見 Doronina 等人（2006) Chem. 147375.doc -223 - 201039846 17:114-124。在該等情況下，藥物釋放咸信藉由細胞内之抗體降解實現。同前。一般而言，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵而製備。該等肽鍵可例如根據肽化學領域中熟知之液相合成法（參見E. SchrSder及 K. Ltibke，「The Peptides」，第 1卷，第 76-136 頁，1965, Academic Press)製備。奥瑞他汀/多拉司他、汀藥物部分可根據以下中之方法製備：US 2005-0238649 A1 ;美國專利第 5635483號；美國專利第 5780588 號；Pettit等人（1989) ·/. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465 ; Pettit等人（1998) 13:243-277 ; Pettit, G.R.等人办1996，719-725 ; Pettit等人（1996)·/. Soc. jPerh’w 1 5:859-863 ; 及Doronina (2003) iVai. 21(7):778-784。詳言之，式DF之奥瑞他汀/多拉司他汀藥物部分（諸如 MMAF及其衍生物）可使用 US 2005-0238649 A1 及 Doronina 等人（2006)出〇£?〇«_/«容<3/^(7/^所.17:114-124中所述之方法製備。式DE之奥瑞他汀/多拉司他汀藥物部分（諸如MMAE 及其衍生物）可使用Doronina等人（2003) Λ^ί· 5/oiec/z. 21:778-784中所述之方法製備。藥物-連接子部分]^(：-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF 及 MC-vc-PAB-MMAE宜藉由常規方法（例如如Doronina等人（2003) TVai. 价oiec/z. 21:778-784及專利申請公開案第 US 2005/0238649 A1號所述之方法）合成’且隨後結合於所關注之抗體。 (3)刺孢黴素 147375.doc •224· 201039846 在其他實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個刺抱黴素分子之抗體。刺孢黴素抗生素家族能夠於亞皮莫耳 (sub-picomolar)濃度下產生雙股DNA斷裂。對於製備刺抱黴素家族之結合物，參見美國專利第5,712,374、第5,714,586 號、第 5,739,116號、第 5,767,285號、第 5,770,701 號、第 5,770,710 號、第 5,773,001 號、第 5,877,296 號（均屬於 American Cyanamid Company)。可使用之刺胞徽素之結構類似物包括（但不限於）γι1、a/、a?、N-乙醯基-γι1、PSAG 〇及 ekHinman等人，Cawcer 53:3336-3342 (1993),

Lode等人，58:2925-2928 (1998)及上述屬於American Cyanamid之美國專利）。抗體可結合之另一抗腫瘤藥為QFA，其為抗葉酸藥。刺胞黴素與QFA均具有細胞内作用位點且不易穿過質膜。因此，細胞經由抗體介導之内化作用進行之對此等藥劑之吸收大大增強其細胞毒性作用。 c· 其他細胞毒性劑可結合於抗體之其他抗腫瘤劑包括BCNU，鏈脲佐菌素，長春新鹼及5-氟尿嘧啶，美國專利第5,053,394號、第 5,770,710號中所述之統稱為LL-E33288複合物的藥劑家族，以及艾斯帕米辛（美國專利第5,877,296號）。可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（獲自綠膿桿菌）、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII及PAP- 147375.doc -225- 201039846

s)告瓜抑制劑、麻疯樹毒素巴豆I 劑、白樹去… 母常巴丑母素、肥皂草抑制 4分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊嗜衡素例如參見1993年10月28日公開本發明另外涵蓋抗體與具有核分解活性之化人核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，諸如去氧核糖核酸酶： DNA酶）之間所形成的免疫結合物。在某些實施例中’免疫結合物可包含高度放射性原子。可：二種放射性同位素產生放射性結合抗體。實例包括 At 、I131、I125、γ90、t> J86

Re

Re188 > Sm1 53

Bi 212

P 32

Pb212及Lu之放射性同位素。當使用免疫結合物進行偵測時，其可包含用於閃爍攝影術研究之放射性原子，例如 tc99l%iU】23 ;《用於核磁共振（NMR)成像（亦稱作磁共振成像’ md)之自旋標記，諸如碘_123、碘_131、銦-m、氟_ 19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。可以已知方法將放射性標記或其他標記併入免疫結合物中。舉例而言，肽可生物合成，或可藉由使用適合之胺基酸前驅物之化學胺基酸合成（例如涉及用氟_ 19替代氫）來合成。諸如tc或1 3、Re186、Re188及In111之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。纪-90可經由離胺酸殘基連接。可使用 I0D0GEN 法（Fraker 等人（1978)价 oc/zem. £邮咖· 及烈.80. 49-57)併入換-123。「Monoclonal Antibodies in

Immunoscintigraphy」（Chatal，CRC Press 1989)詳細描述其他方法。 147375.doc -226- 201039846 在某些實施例中，免疫結合物可包含結合於將前藥（例如肽基化學治療劑，參見W〇 81/〇 1145)轉化為活性藥物 (諸如抗癌症藥）之前藥活化酶的抗體。該等免疫結合物適用於抗體依賴性酶介導之前藥療法（r adept」）。可結合於抗體之it包括（但不限於）驗性麟酸酶，其適用於將含碟酸酯前藥轉化為自由態藥物；芳基硫酸酯酶，其適用於將含硫酸酯前藥轉化為自由態藥物；胞嘧啶去胺酶，其適用於將無毒5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥5_氟尿嘧啶；蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶（serratia pr〇tease)、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶（subtilisin)、羧基肽酶及組織蛋白酶（諸如組織蛋白酶B及L)，其適用於將含肽前藥轉化為自由態藥物；D-丙胺醯基羧基肽酶，其適用於轉化含有D_胺基酸取代基之刖藥；碳水化合物裂解酶，諸如β_半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶，其適用於將糖基化前藥轉化為自由態藥物；β-内酿胺酶，其適用於將用卜内醯胺衍生之藥物轉化為自由態藥物；及青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶，其適用於將胺氮分別用苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生之藥物轉化為自由態藥物。酶可藉由此項技術中熟知之重組DNA技術共價結合於抗體。例如參見

Neuberger等人，312:604-608 (1984)。 d•藥物負載藥物負載由p(式I分子中每個抗體之藥物部分平均數）表示。藥物負載可介於每個抗體1個至20個藥物部分（D)範圍内。式I之ADC包括與1個至20個範圍之藥物部分結合之抗 147375.doc -227- 201039846 體的集合。炎ή么士人c： + 水目、，、》δ反應之ADC製劑中每個抗體之藥物部刀平均數可由f知方式（諸如質譜、ELISA分析法及HPLC) 表被。亦可測定ADC中p之定量分佈。在一些情況下，p為特疋值之均質ADC與具有其他藥物負載之的分離、純化及表徵可藉由諸如逆相HpLc或電泳之方式達成。因此式I抗體-藥物結合物之醫藥調配物可為抗體連接於卜 2、3、4或更多個藥物部分的該等結合物之非均質混合物0 對於些抗體-藥物結合物’ p可能受抗體上之連接位點數限制。舉例*言’若連接如以上例示性實施例為半胱胺馱&氫基，則抗體可能僅具有一個或數個半胱胺酸硫氫基或可此僅具有一個或數個具有足夠反應性之硫氫基，連接子可經由該等硫氫基連接。在某些實施例中，更高藥 t負載（例如P> 5)可能致使某些抗體_藥物結合物凝集、不溶、呈毒性或喪失細胞渗透性。在某些實施例中，本發明 ADC之藥物負載介於丨個至約8個；約]個至約6個；約3個至约5個範圍内。實際上，已展示對於某些，每個抗體之藥物部分最佳比率可能小於8，且可為約2至約5。參見 US 2005-0238649 A1。在某些實施例中，在結合反應期間少於理論最大值之藥物部分結合於抗體。抗體可能如下所述含有例如不與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應的離胺酸殘基。一般而言’抗體並不含有多個可連接於藥物部分之游離及反應 1·生半胱胺酸硫氫基，實際上抗體中之大多數半胱胺酸硫氫 147375.doc •228 · 201039846 基殘基以二硫橋形式存在。在某些實施例中，可在部分或完全還原條件下用還原劑（諸如二硫蘇糖醇（DTT)或三羰基乙基膦（TCEP))還原抗體以產生反應性半胱胺酸硫氫基。在某些實施例中，使抗體經受變性條件以暴露反應性親核基團（諸如離胺酸或半胱胺酸）。 ADC之負載（藥物/抗體比率）可以不同方式例如藉由以下方式加以控制：（i)限制藥物-連接子中間物或連接子試劑相對於抗體之莫耳過量，（ii)限制結合反應時間或溫度及 (iii)部分或完全限制半胱胺酸硫氫基修飾之還原條件。應瞭解，若一個以上親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑繼而藥物部分試劑反應，則所得產物為ADC化合物之混合物，其具有一或多個藥物部分連接於抗體之分佈。可自混合物藉由雙重ELISA抗體分析法（其特異於抗體且特異於藥物）計算每個抗體之藥物平均數。個別ADC分子可在混合物中藉由質譜鑑別且藉由HPLC(例如疏水性相互作用層析）分離（例如參見McDonagh等人（2006) Prot_ Engr. Design & Selection 19(7):299-307 ; Hamblett等人(2004) Clin. Cancer Res_ 10:7063-7070 ; Hamblett，K.J.等人「Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」，文摘號 624，

American Association for Cancer Research，2004年年會，2004年 3 月 27-31 日，Proceedings of the AACR，第 45卷，2004年3 月； Alley, S.C.等人「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」，文摘號627 , American Association 147375.doc -229- 201039846

載值之均質ADC。 e·製備免疫結合物之某些方法

親核基團與二學反應、條件及試㈣備，包括：⑴使抗體之一饧連接子试劑反應以經由共價鍵形成八匕[，繼而與藥物部分D反應；及⑺使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D_L ,繼而與抗體之親核基團反應。經由後一洋法描述於 US 2005-0238649 種途徑製備式I ADC之例示性方 9 A1中，該專利以引用的方式明確地併入本文中。抗體上之親核基團包括（但不限於）（i)N末端胺基，（Η)側鏈胺基，例如離胺酸，（iii)側鏈硫氫基，例如半胱胺酸，及（iv)糖羥基或胺基，其中抗體為糖基化抗體。胺、硫氫基及經基具有親核性且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等親電子基團包括⑴活性醋，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物； (π)烧基及苯曱基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；（iii)醛、酮、叛基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間二硫基’亦即半胱胺酸橋。可藉由用還原劑（諸如DTT(二硫蘇糖醇）或三羰基乙基膦（TCEP))處理以使抗體完全或部分還原而使抗體對與連接子試劑結合具有反應性。因此，理 147375.doc •230· 201039846 淪上各半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫氫基親核體。可經由例如藉由使離胺酸殘基與2_亞胺基硫雜環戊烷（喬特氏試劑（Traut’s reagent))反應使胺轉化為硫氫基來修飾離胺酸殘基而將其他親核基團引入抗體中。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多半胱胺酸殘基（例如藉由製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體）而將反應性硫氫基引入抗體中。本發明之^几體-樂物結合物亦可藉由抗體上之親電子基〇團（諸如醛或酮羰基）與連接子試劑或藥物上之親核基團反應產生。連接子試劑上之有用親核基團包括（但不限於）醯肼、肪、胺基、肼、硫半卡巴腙、羧酸肼及芳醯肼。在一實施例中，抗體經修飾以引入能夠與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應的親電子部分。在另一實施例中，可例如用過碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體之糖以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基。所得亞胺席夫鹼（Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如藉由硼氫化〇物試劑還原而形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之礙水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過砍酸鈉反應可於抗體中產生可與藥物上之適當基團反應的羰基（醛及酮）（Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體可與偏過碘酸納反應，產生酸而非第一胺基酸（Geoghegan & Stroh， (1992) C/zem. 3:138-146 ; US 5362852)。該路可與藥物部分或連接子親核體反應。 147375.doc -231 - 201039846 藥物部分上之親核基團包括（但不限於）能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵之胺、硫氫基、經基 '醢肼、將、肼、硫半卡巴膝（thiosemicarbazone)、羧酸肼及芳醯肼基，該等親電子基團包括：（i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基曱酸酯及酸鹵化物；（U)烷基及苯曱基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；（iii)醛、酮、羧基及順丁稀二酿亞胺基。本發明之化合物明確涵蓋（但不限於）用如下交聯劑製備之 ADC : BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、 MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、 SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB 及SVSB((4-乙烯砜）苯甲酸丁二醯亞胺酯），該等交聯劑試劑可市售（例如購自 Pierce Biotechnology, Inc·，Rockford, IL.，U.S.A ;參見第 467-498 頁，2003-2004 Applications Handbook and Catalog) ° 包含抗體及細胞毒性劑之免疫結合物亦可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製備，該等蛋白質偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基）丙酸N-丁二醯亞胺酯（SPDP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷-1-曱酸丁二醯亞胺酯（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷（IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺醋）、酸(諸如戊二醒）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯曱醯基）己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙-(對重氮苯甲醯 147375.doc - 232 - 201039846 )—胺）一異氰酸酯（諸如2,6-二異氰酸甲苯酯）及雙活性銳化合物（諸如丨，5-二氟_2,4_二硝基苯卜舉例而言， I麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，238:1〇98 (1987)所述製備。經碳14標記之卜異硫氰酸酯基苯曱基_3_ 甲基二伸乙三胺五乙酸（MX_DTPA)為一種用於使放射性核普酸結合於抗體之例示性螯合劑。參見W094/11026。或者，可例如藉由重組技術或肽合成製備包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白質。重組DNA分子可包含編碼結合物〇之抗體及細胞毒性部分之區域，該等區域彼此相鄰或藉由不破壞結合物之所需特性的編碼連接子肽之區域分隔。在另一實施例中，抗體可結合於「受體」（諸如抗生蛋白鏈菌素）以用於腫瘤預纪向，其中向患者投與抗體-受體結合物’繼而使用清除劑自循環中移除未結合之結合物，且隨後投與結合於細胞毒性劑（例如放射性核苷酸）之「配位體」（例如，抗生物素蛋白）。例示性免疫結合物-Thio-抗體藥物結合物〇 a.製備經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗鱧藉由包括（但不限於）以下之多種方法製備編碼本發明之經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體及親本抗FcRH5抗體之胺基酸序列變異體的DNA ··自天然來源分離（在天然存在之胺基酸序列變異體的情況下）、藉由定點（或寡核苷酸介導之）突變誘發（Carter (1985)等人 Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 ; Ho等人（1989) Gene (Amst.) 77:51-59 ; Kunkel等人（1987) Proc_ Natl. Acad. Sci_ USA 82:488 ; Liu等人（1998) J. 147375.doc -233 - 201039846

Biol· Chem. 273:20252-20260)、PCR突變誘發(Higuchi，（1990), PCR Protocols，第 177-183 頁，Academic Press ; Ito 等人（1991) Gene 102:67-70 ; Bernhard 等人（1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132 ;及Vallette等人（1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733)及卡匣突變誘發（Wells等人（1985) Gene 34:3 1 5-323)先前所製備出之編碼多肽之DNA來製備。突變誘發方案、套組及試劑可市售，例如QuikChange®多定點突變誘發套組 (Stratagene，La Jolla, CA)。單突變亦可藉由寡核苷酸定點突變誘發，使用雙股質體DNA作為模板，藉由基於PCR之突變誘發產生（Sambrook 及 Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 3 版；Zoller 等人（1983) Methods Enzymol. 100:468-500 ； Zoller, M.J.及 Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500)。重組抗體之變異體亦可藉由限制片段操作或藉由重疊延伸PCR用合成募核苷酸構築。突變誘發引子編碼半胱胺酸密碼子置換。可採用標準突變誘發技術產生編碼該等突變之經半胱胺酸工程改造抗體的 DNA(Sambrook 等人 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y·，1989 ;及Ausubel 等人Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993)。可使用嗤菌體呈現技術（McCafferty等人，（1990) Nature 348:552-553)自未免疫供者之免疫球蛋白可變（V)域基因譜系活體外產生抗FcRH5人類抗體及抗體片段。根據此技 147375.doc -234- 201039846 術，將抗體V域基因同框選殖於絲狀噬菌體（諸如M13或fd) 之主要或次要鞠蛋白基因中，且以功能性抗體片段形式呈現於噬菌體粒子之表面上。由於絲狀粒子含有噬菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體之功能特性進行的選擇亦使得可選擇編碼展現彼等特性之抗體的基因。因此，噬菌體模擬一些B細胞特性（Johnson等人（1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 ; Clackson 等人（1991) Nature， 352:624-628 ; Marks 等人（1991) J. Mol. Biol. 222:581-597 ; 〇 Griffith 等人（1993) EMBO J. 12:725-734 ; US 5565332 ; US 5573905 ; US 5567610 ; US 5229275)。抗FcRH5抗體可使用已知寡肽合成方法以化學方式合成或可使用重組技術製備及純化。適當胺基酸序列或其部分可藉由直接肽合成使用固相技術產生（Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969)W.H. Freeman Co., San Francisco, CA ； Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154)。可使用手動技術或藉由自動化活體外合成蛋白質。〇可例如採用t-BOC或Fmoc保護之胺基酸及使用Applied Biosystems肽合成儀（Foster City, CA)使用製造商之說明書自動固相合成。抗FcRH5抗體或FcRH5多肽之各部分可以化學方式分別合成且使用化學法或酶法組合以產生所需抗 FcRH5抗體或FcRH5多肽。已開發各種技術來產生抗體片段。傳統上，此等片段經由蛋白水解消化完整抗體得到（Morimoto等人（1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107- 147375.doc -235 - 201039846 117;及 Brennan 等人（1985) Science, 229:81)或直接藉由重組宿主細胞產生。Fab、Fv及ScFv抗FcRH5抗體片段均可表現於大腸桿菌中且由大腸桿菌分泌，從而使得易於產生大量此等片段。可自本文所論述之抗體噬菌體庫分離抗體片段。或者，可自大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段且使其以化學方式偶合以形成F(ab')2片段（Carter等人（1992) 31〇/丁6(：]111〇1〇§7 10:163-167)或直接自重組宿主細胞培養物分離。抗FcRH5抗體可為（scFv)單鏈Fv片段（WO 93/16185 ; US 5571894 ; US. 5587458)。抗 FcRH5 抗體片段亦可為「線性抗體」（US 5 641870)。該等線性抗體片段可具有單特異性或雙特異性。以下描述主要係關於藉由培養轉型或轉染有含有編碼抗 FcRH5抗體之核酸的載體的細胞產生抗FcRH5抗體。編碼抗FcRH5抗體之DNA可獲自由咸信具有抗FcRH5抗體 mRNA且表現可偵測含量之該mRNA之組織製備的cDNA 庫。因此，人類抗FcRH5抗體或FcRH5多肽DNA宜獲自由人類組織製備之cDNA庫。編碼抗FcRH5抗體之基因亦可獲自基因組庫或藉由已知合成程序（例如自動核酸合成）獲得。本發明之設計、選擇及製備方法使得可獲得經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體，其能與親電子官能基反應。此等方法使得可獲得抗體結合化合物，諸如在指定、所設計、選擇性位點處具有藥物分子之抗體-藥物結合（ADC)化合物。抗體表面上之反應性半胱胺酸殘基使得可經由硫氫 147375.doc -236- 201039846 基反應性基團（諸如順丁烯二醯亞胺或鹵基乙醯基）特異性結合藥物部分。Cys殘基之硫氫基官能基與順丁烯二醯亞胺基之親核反應性為蛋白質中之任何其他胺基酸官能基 (諸如離胺酸殘基之胺基或N末端胺基）的約1000倍。碘乙醯基及順丁烯二醯亞胺試劑中之硫氫基特異性官能基可與胺基反應，但需要較高pH值（>9.0)及較長反應時間 (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London)。蛋白質中之游離硫氫基之量可藉由標準愛爾曼氏分析法（Ellman’s assay)估算。免疫球蛋白Μ為二硫基連接之五聚體的實例，而免疫球蛋白G為内部二硫橋將次單元鍵結在一起之蛋白質的實例。在諸如此類之蛋白質中，需要用試劑（諸如二硫蘇糖醇 (DTT)或石西醇（Singh 等人（2002) Anal· Biochem. 304:147-15 6))還原二硫鍵以產生反應性游離硫氳基。此方法可導致喪失抗體三級結構及抗原結合特異性。 PHESELECTOR(用於選擇反應性硫氫基之噬菌體ELISA) 分析法使得可偵測ELISA噬菌體形式之抗體的反應性半胱胺酸基團，從而有助於設計經半胱胺酸工程改造之抗體 (Junutula，J.R.等人（2008) J Immunol Methods 332:41-52 ; WO 2006/034488 ; US 2007/0092940)。將經半胱胺酸工程改造之抗體塗佈於孔表面上，繼而與噬菌體粒子一起培育，添加經HRP標記之第二抗體且偵測吸光度。呈現於噬菌體上之突變蛋白可以快速、穩固且高通量方式篩選。可使用相同方法產生經半胱胺酸工程改造抗體之庫且進行結 147375.doc -237- 201039846 合選擇以適當地鑑別抗體或其他蛋白質之隨機蛋白質-噬菌體庫之游離Cys併入的反應位點。此技術包括使噬菌體上所呈現之半胱胺酸突變蛋白與亦具有硫氫基反應性之親和力試劑或報導基團反應。 PHESELECTOR分析法使得可篩選抗體中之反應性硫氫基。例示藉由此方法鑑別A121C變異體。可有效搜尋完整 Fab分子以鑑別具有反應性硫氫基之更多ThioFab變異體。採用參數部分表面可及性（fractional surface accessibility) 鑑別及定量溶劑對多肽中胺基酸殘基之可及性。表面可及性可表示為溶劑分子（例如水）可接觸之表面積（A2)。水佔據之空間近似為1.4 A半徑之球體。軟體可以晶體學程式之 CCP4套裝形式自由獲取或得到許可（CCP4之秘書，Daresbury Laboratory，Warrington，WA4 4AD, United Kingdom，傳真： (+44) 1925 603825，或藉由網際網路：www.ccp4.ac.uk/dist/html/ INDEX.html)，該等程式採用算法利用源自已知X射線結晶法之座標計算蛋白質之各胺基酸的表面可及性（「The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography」（1994) Acta. Cryst. D50:760-763)。執行表面可及性計算之兩種例示性軟體模組為基於Β· Lee及F.M. Richards (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400之算法的「AREAIMOL」及「SURFACE」。 AREAIMOL·將蛋白質之溶劑可及表面定義為探針球體（表示溶劑分子）在蛋白質之凡得瓦爾表面（Van der Waals surface)上翻轉時中心之軌跡。AREAIMOL藉由在各原子周圍之延伸球體上產生表面點（距離原子中心之距離等於 147375.doc -238- 201039846 原子及探針半徑之總和）及去除處於與相鄰原子相關之等效球體内的點來計算溶劑可及表面積。AREAIMOL在PDB 座標檔案（PDB coordinate file)中尋找原子之溶劑可及面積，且概述殘基、鏈及完整分子之可及面積。個別原子之可及面積（或面積差異）可寫至偽PDB輸出檔案（pseudo-PDB output file)。AREAIMOL假定各成分之單一半徑，且僅識別有限數目之不同成分。 AREAIMOL及SURFACE報導絕對可及性，亦即埃（A)平方數。部分表面可及性藉由參考多肽内胺基酸之相關標準態計算。參考態為三肽Gly-X-Gly，其中X為所關注之胺基酸，且參考態將為『延伸』構形，亦即如β股之構形。延伸構形使X之可及性達到最大。將計算出之可及面積除以 Gly-X-Gly三肽參考態之可及面積且報導其商，其為部分可及性。可及性百分比為部分可及性乘以100。計算表面可及性之另一例示性算法係基於程式xsae之SOLV模組 (Broger，C.，F_ Hoffman-LaRoche, Basel))，其基於多肽之X 射線座標計算胺基酸殘基對水球體之部分可及性。可使用可用晶體結構資訊（Eigenbrot等人（1993) J Mol Biol. 229:969-995)計算抗體中各胺基酸之部分表面可及性。

易於分離編碼經半胱胺酸工程改造之抗體的DNA且使用習知程序（例如藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針）測序。融合瘤細胞充當該DNA之來源。分離之後，可將DNA置於表現載體中，隨後將其轉染於宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猴COS 147375.doc -239- 201039846 細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或其他哺乳動物宿主細胞，諸如骨髓瘤細胞（US 5807715 ; US 2005/0048572 ; US 2004/02293 10))(否則該等宿主細胞不會產生抗體蛋白質）中以在重組宿主細胞中合成皁株抗體。設計及選擇之後’具有經工程改造高度反應性之未配對 Cys殘基「游離半胱胺酸胺基酸」的經半胱胺酸工程改造之抗體（例如ThioFab)可藉由以下產生：⑴在細菌（例如大腸桿菌）系統（Skerra等人（1993)(：111：1'.0卩11^〇1111111111111111〇1· 5:256-262 ； Pliickthun (1992) Immunol. Revs. 130:15 1-188) 或哺乳動物細胞培養物系統（WO 01/00245)(例如中國倉鼠卵巢細胞（CHO))中表現；及（ii)使用通用蛋白質純化技術純化（Lowman 等人（1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988)。使工程改造之Cys硫氫基與親電子連接子試劑及藥物-連接子中間物反應以形成經半胱胺酸工程改造之抗體藥物結合物及其他經標記半胱胺酸工程改造之抗體。配對及形成鏈間及鏈内二硫鍵的經半胱胺酸工程改造抗體之Cys殘基及親本抗體中所存在之Cys殘基無任何反應性硫氫基（除非用還原劑處理）且不與親電子連接子試劑或藥物-連接子中間物反應。新工程改造之Cys殘基可保持未配對，且能夠與親電子連接子試劑或藥物•連接子中間物（諸如藥物-順丁烯二醯亞胺）反應（亦即結合於親電子連接子試劑或藥物-連接子中間物（諸如藥物-順丁烯二醯亞胺））。例示性藥物-連接子中間物包括：MC-MMAE、MC-MMAF、MC-vc-PAB- 147375.doc •240· 201039846 MMAE、及MC-vc-PAB-MMAF。重鏈及輕鏈中工程改造之 Cys殘基的結構位置根據順序編號系統編號。此順序編號系統與起始於N末端之Kabat編號系統（Kabat等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版， Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD)有關，不同於Kabat編號方案（底列）之處為由a、b、c所註解之插入部分。使用Kabat編號系統，實際線性胺基酸序列可含有更少或其他胺基酸，其對應於可變 0 域之FR或CDR的縮短或於可變域之FR或CDR中插入。藉由順序編號及Kabat編號方案鑑別經半胱胺酸工程改造之重鏈變異位點。在一實施例中，經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體係藉由包含以下之方法製備： (a) 用半胱胺酸置換親本抗FcRH5抗體之一或多個胺基酸殘基；及 (b) 藉由使經半胱胺酸工程改造之抗體與硫氫基反應性試〇劑反應來測定經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體的硫氫基反應性。經半胱胺酸工程改造之抗體相較於親本抗體與硫氫基反應性試劑更具反應性。游離半胱胺酸胺基酸殘基可位於重鏈或輕鏈中或恆定域或可變域中。抗體片段（例如Fab)亦可經工程改造以使一或多個半胱胺酸胺基酸置換抗體片段之胺基酸，而形成經半胱胺酸工程改造之抗體片段。 147375.doc -241 - 201039846 本發明之另一實施例提供一種製備經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體的方法，其包含： (a) 將一或多個半胱胺酸胺基酸引入親本抗FcRH5抗體中以產生經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體；及 (b) 測定經半胱胺酸工程改造之抗體與硫氫基反應性试劑的硫氯基反應性；其中經半胱胺酸工程改造之抗體相較於親本抗體與硫氫基反應性試劑更具反應性。製備經半胱胺酸工程改造抗體之方法的步驟（a)可包含： (0 使編碼經半胱胺酸工程改造抗體之核酸序列突變誘發； (ii) 表現該經半胱胺酸工程改造之抗體；及 (iii) 分離及純化該經半胱胺酸工程改造之抗體。製備經半胱胺酸工程改造抗體之方法的步驟（b)可包含使經半胱胺酸工程改造之抗體表現於選自噬菌體或噬菌粒粒子之病毒粒子上。製備經半胱胺酸工程改造抗體之方法的步驟（b)亦可包含： (0使經半胱胺酸工程改造之抗體與硫氫基反應性親和力試劑反應以產生經親和力標記半胱胺酸工程改造之抗體；及 (i〇測量經親和力標記半胱胺酸工程改造之抗體與捕捉介質之結合。本發明之另一實施例為一種篩選具有高反應性未配對半 147375.doc -242- 201039846 胱胺酸胺基酸之經半胱胺酸工程改造抗體的硫氫基反應性之方法，其包含： (a) 將一或多個半胱胺酸胺基酸引入親本抗體十以產生經半胱胺酸工程改造之抗體； (b) 使經半胱胺酸工程改造之抗體與硫氫基反應性親和力試劑反應以產生經親和力標記半胱胺酸工程改造之抗體；及 (c) 測量經親和力標記半胱胺酸工程改造之抗體與捕捉介質之結合；及 (d) 測定經半胱胺酸工程改造之抗體與硫氫基反應性試劑的硫氬基反應性。篩選經半胱胺酸工程改造抗體之方法的步驟（a)可包含： (i) 使編碼經半胱胺酸工程改造抗體之核酸序列突變誘發； (ii) 表現該經半胱胺酸工程改造之抗體；及 (iii) 分離及純化該經半胱胺酸工程改造之抗體。篩選經半胱胺酸工程改造抗體之方法的步驟（b)可包含使經半胱胺酸工程改造之抗體表現於選自噬菌體或噬菌粒粒子之病毒粒子上。篩選經半胱胺酸工程改造抗體之方法的步驟（b)亦可包含： (i)使經半胱胺酸工程改造之抗體與硫氫基反應性親和力δ式劑反應以產生經親和力標記半胱胺酸工程改造之抗體；及 147375.doc -243 - 201039846 (ii)測量經親和力標記半胱胺酸工程改造之抗體與捕捉介質之結合。 b.半胱胺酸工程改造抗FcRH5 IgG變異體藉由本文所述之半胱胺酸工程改造方法將半胱胺酸在重鏈118(EU編號）（等效於順序編號之重鏈位置U8)(如圖13所示）位點處引入全長嵌合親本單株抗FcRH5抗體中，或在輕鏈205 (Kabat編號）（如圖14所示）位點處引入全長嵌合親本單株抗FcRH5抗體。所產生之重鏈118(EU編號）處具有半胱胺酸的經半胱胺酸工程改造抗體為：（a)具有重鏈序列（seQ ID NO: 60)及輕鏈序列（SEQ ID NO: 59)之 thio-hul3G9-HC-A118C，圖 13 ° 所產生之輕鏈205(Kabat編號）處具有半胱胺酸的經半胱胺酸工程改造抗體為：（a)具有重鏈序列（SEq ID NO: 62) 及輕鏈序列（8丑(）10 1^0:61)之1；1^〇-11111309-1^-\^205(^，圖 14 〇 C.經標記半胱胺酸工程改造之抗以11]^5抗體經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體可具有位點特異性且與硫氫基反應性試劑有效偶合。硫氫基反應性試劑可為多S能連接子試劑、捕捉（亦即親和力）標記試劑（例如生物素-連接子試劑）、偵測標記（例如螢光團試劑）、固相固定試劑（例如SEPHAROSE™、聚苯乙烯或玻璃）或藥物連接子中間物。硫氫基反應性試劑之一實例為N_乙基順丁烯二醯亞胺（NEM)。在一例示性實施例中，ThioFab與生物素- 147375.doc •244- 201039846 連接子試劑反應提供經生物素標記之ThioFab，由此工程改造之半胱胺酸殘基的存在及反應性可偵測及測量。 ThioFab與多官能連接子試劑反應提供具有官能化連接子之ThioFab，其可與藥物部分試劑或其他標記進一步反應。ThioFab與藥物-連接子中間物反應提供ThioFab藥物結合物。本文所述之例示性方法一般可用於鑑別及產生抗體，且更一般經由應用本文所述之設計及篩選步驟而用於其他蛋 Θ 白質。該方法可用於結合其他硫氫基反應性試劑，其中反應性基團為例如順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、吡啶基二硫基或其他硫氫基反應性結合搭配物（Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. ； Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2 ； Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate o

Chem. 1:2 ； Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego,第 40-55 頁，643-671)。硫氫基反應性試劑可為藥物部分；螢光團，諸如螢光染料（如螢光素或若丹明）；用於成像之螯合劑或放射治療金屬；肽基或非肽基標記或偵測標籤；或清除改良劑，諸如聚乙二醇之各種異構體；結合於第三組分之肽；或另一碳水化合物或親脂性試劑。 d.經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體之用途 147375.doc -245 - 201039846 經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體及其結合物可適用作治療劑及/或診斷劑。本發明另外提供預防、控制、治療或改善一或多個與B細胞相關病症相關之症狀的方法。詳言之，本發明提供預防、控制、治療或改善一或多個與以下細胞增殖病症相關之症狀的方法：諸如癌症，例如淋巴瘤 '非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性 NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。本發明另外提供診斷FcRH5相關病症或產生該病症之誘因的方法，以及鑑別優先結合B 細胞相關FcRH5多肽的抗體及抗體之抗原結合片段的方法。本發明之另一實施例係針對經半胱胺酸工程改造抗 FcRH5抗體之用途’其係用於製備適用於治療對b細胞相關病症起反應之病狀的藥物。 e·經半胱胺酸工程改造之抗體藥物結合物 (Thio-抗體藥物結合物（Tdc)) 本發明之另一態樣為一種抗體-藥物結合化合物，其包含經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體（Ab)及奥瑞他汀藥物部分（D) ’其中該經半胱胺酸工程改造之抗體經由一或多個游離半胱胺酸胺基酸藉由連接子部分連接於D ;該化合物具有下式I :

Ab-(L-D)p I 147375.doc -246- 201039846 其中p為1、2、3或4;且其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係藉由包含用一或多個游離半胱胺酸胺基酸置換親本抗 FcRH5抗體之一或多個胺基酸殘基的方法製備β 本發明之另一態樣為一種組合物，其包含式I之抗體-藥物化合物之混合物，其中每個抗體之平均藥物負載為約2 個至約5個或約3個至約4個。經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體藥物結合物的潛在優勢包括改良安全性（治療指數較大）；改良PK參數；保留〇抗體鏈間二硫鍵，此可使結合物穩定且保留其活性結合構形；藥物結合位點受到限定；及藉由使經半胱胺酸工程改造之抗體結合於藥物-連接子試劑製備經半胱胺酸工程改造之抗體藥物結合物產生更多均質產物。連接子「連接子」、「連接子單元」或「連接」意謂包含將抗體共價連接於藥物部分之共價鍵或原子鏈之化學部分。在各〇種實施例中，連接子表示為L。「連接子」（L)為雙官能或多官能部分，其可用於連接一或多個藥物部分（D)與抗體單元（Ab)以形成式I之抗體-藥物結合物（ADC)。抗體-藥物結合物（ADC)宜使用具有用於結合於藥物及抗體之反應性官能基的連接子製備。經半胱胺酸工程改造之抗體（Ab)的半胱胺酸硫氫基可與連接子試劑、藥物部分或藥物-連接子中間物之親電子官能基形成鍵。在一態樣中，連接子具有一反應位點，其具有能與抗體上所存在之親核半胱胺酸反應之親電子基團。抗體之半胱 147375.doc -247- 201039846 胺酸硫氫基能與連接子上之親電子基團反應且形成鍵接於連接子之共價鍵。有用之親電子基團包括（但不限於）順丁烯二醯亞胺及i基乙醯胺基。連接子包括二價基團，諸如烧基二基，伸芳基，伸雜芳基’諸如-(CR2)nO(CR2)n-之部分，烷氧基之重複單元（例如聚伸乙氧基、PEG、聚亞甲氧基）及烷基胺基（例如聚伸乙基胺基、JeffamineTM);及二酸酯及醯胺，包括丁二酸酉曰、丁 —酿胺、氧二乙酸醋、丙二酸醋及己醯胺。經半胱胺酸工程改造之抗體與具有親電子官能基（諸如順丁稀二酿亞胺或α_齒基数基）之連接子試劑或藥物-連接子中間物根據 Klussman 等人（2004)，Bi〇conjugate Chemistry 15(4):765-773第766頁之結合方法反應。連接子可由一或多個連接子組分構成。例示性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基（「MC」）、順丁稀二酸亞胺基丙醯基（「MP」）、纈胺酸-瓜胺酸（r vai_ch」或「vc」）、丙胺酸-苯丙胺酸（「ala-phe」或「af」）、對胺基笨甲氧基羰基（「PAB」）、4-(2-吡啶基硫基）戊酸N_丁二醯亞胺酯（「SPp」）、4_(N•順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷-1-甲酸N-丁二醯亞胺酯（「SMCC」）、（4-碘-乙醯基）胺土本甲酸N -丁一酿亞胺S旨（「SIAB」）、一或多個重複單元形式之伸乙氧基_CH2CH2〇-(「EO」或「PE0j )。其他連接子組分為此項技術中已知且一些描述於本文中。在一實施例中，ADC之連接子L具有下式： —Aa—Ww一Yy- 147375.doc • 248- 201039846 其中： _A-為共價連接於抗體(Ab)之半胱胺酸硫氫基的延伸子單元； a為〇或1 ; 各-W-獨立地為胺基酸單元； w獨立地為介於〇至12範圍内之整數； -Y-為共價連接於藥物部分之間隔子單元；且 y為0、1或2。延伸子單元延伸子單兀（-A-)當存在時能夠將抗體單元連接於胺基酸單元（-W-)。在此情況下，抗體（Ab)具有可與延伸子之官能基形成鍵之官能基。可存在於抗體上之有用官能基（天然存在或經由化學操作而存在）包括（但不限於）氫硫基（_sh)、胺基、羥基、羧基、碳水化合物之變旋異構羥基及羧基。在一態樣中，抗體官能基為氫硫基或胺基。氫硫基可藉由還原抗體之分子内二硫鍵產生。或者，氫硫基可藉由使用 2-亞胺基硫雜環戊烷（喬特氏試劑）或另一氫硫基產生試劑與抗體離胺酸部分之胺基反應產生。在一實施例中，抗體 (Ab)具有游離半胱胺酸硫氫基，其可與延伸子單元之親電子官能基形成鍵。式I結合物中之例示性延伸子單元由式η 及式III描述，其中Ab_、、_γ_、·〇、评及y如上所定義，且R為選自（CH2)r、c3-C8碳環基、〇_(CH2)r、伸芳基、（CHA-伸芳基、-伸芳基 _(CH2)r_、（CH2V(c3_C8碳環基）、（c3-c8碳環基）_(CH2)r、C3_C·環基、（CH2w3_C8 147375.doc -249- 201039846 雜環基）、-(c3-c8雜環基）-((：112;^-、-((：112){(〇州1^((^2：^-' -(CH2CH20)r- ' -(CH2CH20)rCH2- ' -(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-、-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)rCH2-、_(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH2〇V 、-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-及-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2)r-之二價基團；其中Rb*H、C!-C6烷基、苯基或苯曱基；且 r獨立地為介於1-10範圍内之整數。伸芳基包括藉由自芳族環系統移除兩個氫原子衍生的具有6-20個碳原子的二價芳族烴基。典型伸芳基包括（但不限於）衍生自苯、經取代之苯、萘、蒽、聯苯及其類似基團的基團。雜環基包括如下環系統，其中一或多個環原子為雜原子，例如氮、氧及硫。雜環基包含1至20個碳原子及1至3 個選自N、0、P及S之雜原子。雜環可為具有3至7個環成員（2至6個碳原子及1至3個選自N、Ο、P及S之雜原子）之單環，或具有7至10個環成員（4至9個碳原子及1至3個選自 N、Ο、P及S之雜原子）之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、 [5，6]或[6,6]系統。雜環描述於以下文獻中：Paquette, Leo A.;「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」（W.A. Benjamin, New York，1968)，尤其第 1章、第 3章、第 4章、第 6章、第 7章及第 9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs」（John Wiley & Sons, New York, 1950至今），尤其第13卷、第14卷、第16卷、第 19 卷及第 28卷；及 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566。雜環之實例包括（以實例之方式且並不限於）吡啶基、二 147375.doc -250- 201039846 氫吡啶基、四氫吡啶基（哌啶基）、噻唑基、四氫噻吩基、硫氧化之四氫噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、<»比〇坐基、味嗤基、四唾基、苯并吱喃基、售萘基、0引 D朵基、°引11朵琳基（indolenyl)、喧.嚇·基、異啥琳基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、2-吡咯啶酮基、 °比咯啉基、四氫呋喃基、雙-四氫呋喃基、四氫哌喃基、雙-四氫旅喃基、四氫喧淋基、四氫異嗤淋基、十氫啥琳基、八氫異喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1，2,5-噻二唤基、2H，6H-1,5,2-二嘆嗓基、嗟吩基、嘆嗯基、派喃基、異苯并呋喃基、咣烯基、咄基、啡噁噻基、2H-吡咯基、異嗟嗤基、異°惡β坐基、η比唤基、達唤基、,D朵嗪基、異η弓丨 D朵基、3Η-°$ η朵基、1Η-弓丨°坐基、°票吟基、4Η-<#嗪基、吹嗪基、喑啶基、喹喏啉基、喹唑啉基、啐啉基、喋啶基、 4Ah-咔唑基、咔唑基、β_咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋咕基、啡噁嗪基 '異咬烧基、咬院基 '咪唾η定基、咪嗤琳基、D比吐咬基、。比嗤啉基、哌嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉基、喵啶基、嗎啉基、噁唑啶基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基（benzoxazolinyl)及靛紅醯基（isatin〇yi)。碳環基包括具有3至7個碳原子之單環形式或7至12個碳原子之雙環形式的飽和或不飽和環。單環碳環具有3至6個環原子，更通常5或6個環原子。雙環碳環具有例如以雙環 [4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統形式排列的7至12個環原子’或以雙環[5,6]或[6,6]系統形式排列的9或1〇個環原 147375.doc •251 - 201039846 子。單環碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、丨—環戊-1-烯基、1_環戊-2-烯基、卜環戊_3_烯基、環己基、^ 環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、卜環己_3_烯基、環庚基及環辛基。應瞭解’在式I ADC之所有例示性實施例（諸如π_νι) 中，即使並未明確指示，但視工程改造之半胱胺酸殘基數而定，1至4個藥物部分連接於抗體（ρ=1_4)。

Ab——S

,N-R17-C(0)—Ww——Y -D

P

II

Ab—S-

i-R17-C(〇)—Ww-Yv-D

P 说明性式II延伸子單元係衍生自順丁基（MC)，其中以7為_((^2)5_ : III 醯亞胺基-己醯

MC 說明性式II延伸子單元係衍生自基（MP)，其找17 為-(CH2)2-: 順丁烯二酿亞胺基-丙醯 147375.doc 252- 201039846 〇 η

ΜΡ。另一說明性式II延伸子單元為如下，其中R17為 -(CH2CH20)r-CH2-且 r為 2 :

0 另一說明性式11延伸子單元為如下，其中R 17為 -(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-，其中 Rb為 Η且各 r為 2 :

說明性式III延伸子單元如下，其中R17為-(CH2)5-:

在另一實施例中，延伸子單元經由抗體之工程改造半胱胺酸硫原子與延伸子單元之硫原子之間的二硫鍵連接於經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體。此實施例之代表性延 147375.doc -253 - 201039846 γ_、_D、w 伸子單元由式IV描述，其中R17、Ab-、-W 及y如上所定義。

Ab—S

S—R17 C(〇)

Ww——Yy——D

IV 在另一實施例中，延伸子之反應性基團含有硫氫基反應性官能基，其可與抗體之游離半胱胺酸硫氫基形成鍵。硫氫基反應性官能基之實例包括（但不限於）順丁烯二酿亞胺、α-鹵基乙醯基、活性酯（諸如丁二醯亞胺醋、4_硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基醋）、酸奸、酸氣化物、石黃醯氣、異氣酸酯及異硫氰酸酯。此實施例之代表性延伸子單元由式Va及式Vb描述，其中-R17-、Ab-、-W-、-Υ-、-D、 w及y如上所定義，

Ab—S-^C(0)NH一R17—C(O)—Ww—Yy— D ) V / P Va

Ab——S-/c(S)NH一R17—C(O)—Ww一Yy— D ) \ / P Vb 在另一實施例中’連接子L可為樹突型連接子以經由分支鏈多官能連接子部分將一個以上藥物部分共價連接於抗體（Sun等人，（2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215 ; Sun 等人（2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768 ； King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990)。樹突狀連接子可增加藥物與抗體之莫耳 147375.doc -254- 201039846 比，亦即負載，此與ADC之效能有關。因此，當經半胱胺酸工程改造之抗體僅具有一個反應性半胱胺酸硫氫基時，可經由樹突狀連接子連接多個藥物部分。胺基酸單元連接子可包含胺基酸殘基。胺基酸單元（-Ww-)當存在時將抗體（Ab)連接於本發明之經半胱胺酸工程改造之抗體-藥物結合物（ADC)的藥物部分（D)。 -Ww-為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十狀、Η—狀或十二狀單元。包含胺基酸單元之胺基酸殘基包括天然存在之胺基酸以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。各-W-單元獨立地具有以下方括號中所示之式，且w為介於0至12範圍内之整數：

其中R19為氫、曱基、異丙基、異丁基、第二丁基、苯曱基、對羥基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、 -CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、 -(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、 -(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、 _(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、 -(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3- 147375.doc -255- 201039846

當R不為氫時，所連接之碳原子具有對掌性。r19所連接之各碳原子獨立地呈⑻或（r)構型或外消旋混合物。因此胺基酸單元可為對映異構純、外消旋或非對映異構單元。例7F I·生-ww-胺基酸單元包括二狀、三月大、四狀或五狀。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸（VC或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸（af或ala_phe)。例示性三肽包括：甘胺酸绳胺酸― 瓜胺酸（gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸甘胺酸（glygiy_ giy)。包含胺基酸連接子組份之胺基酸殘基包括天然存在之胺基酸以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可由一或多種酶（包括腫瘤相關之蛋白酶）酶促裂解以釋放藥物部分（_D)，在一實施例中，該藥物部分在釋放之後在活體内質子化以提供藥物（D)。胺基酸連接子組分可在其對藉由特定酶（例如腫瘤相關蛋白酶、組織 147375.doc •256· 201039846 蛋白酶B、C及D或纖維蛋白溶酶蛋白酶）達成之酶促裂解之選擇性方面經設計及最佳化。間隔子單元間隔子單元（-Yy-)當存在時（y=1或2)將胺基酸單元卜Ww_) (當胺基酸單元存在時（w=1_12))連接於藥物部分⑴）。或者，當胺基酸單元不存在時，間隔子單元將延伸子單元連接於藥物部分。當胺基酸單元與延伸,子單元均不不存在時 (W y—Ο)，間隔子單元亦將藥物部分連接於抗體單元。間〇㈤子單元具有兩種一般類型：自我犧牲及非自我犧牲型。非自我犧牲間隔子單元為如下間隔子單元，其中間隔子單兀之一部分或全部在胺基酸單元自抗體-藥物結合物或藥物部分·連接子裂解（尤其酶促裂解）之後仍結合於藥物部分。當含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元或甘胺酸間隔子單 7G之ADC經由腫瘤細胞相關之蛋白酶、癌症細胞相關之蛋白酶或淋巴細胞相關之蛋白酶進行酶促裂解時，甘胺酸_ 〇甘胺酸_藥物部分或甘胺酸-藥物部分自Ab-Aa-Ww_裂解。在一實施例中，標靶細胞内進行獨立的水解反應，從而使甘胺酸-藥物部分之鍵裂解且釋放藥物。在另一實施例中，_γ厂為對胺基苯甲基胺甲醯基（pAB) 早疋，其伸苯基部分經Qm取代，其中卩為—匕·。烷基、_〇_ (1 8、元基）_鹵素、-硝’基或-氰基；且!)!為介於〇_4範圍内之整數。非自我犧牲間隔子單元（_Y_)之例示性實施例為_Gly_Gly_ ，-Gly- ; -Aia_phe· ; _Val Cit。 147375.doc -257- 201039846 在實知例中，提供一種藥物部分_連接子或ADc ,其

中不存在間隔子單元（y=〇)，成直駿越與L vy )及具醫樂學上可接受之鹽或溶劑合物。或者’含有自我犧牲間隔子單元之ADC可釋放。在一實施例中，-γ_為經由pAB基團之胺基氮原子連接於U 、二由炭馱自曰、胺基曱酸酯或醚基直接連接於的MB基團，其中ADC具有以下例示性結構：

/

Ab--Aa-Ww—NH 其中Q為-CVC8烷基、-〇_(Cl_C8烷基）、·_素、_硝基或_ 氰基，m為介於〇_4範圍内之整數；且ρ介於1至4範圍内。自我犧牲間隔子之其他實例包括（但不限於）電子學上類似於PAB基團之芳族化合物，諸如2_胺基咪唑_5_甲醇衍生物（Hay 等人（1999) Bioorg. Med. Chem· Lett. 9:2237)、雜環 PAB 類似物（us 2005/0256030)、β-葡萄糖苷酸（w〇 2007/011968)及鄰胺基苯曱基縮醛或對胺基苯曱基縮醛。可使用酿胺鍵水解之後進行環化的間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺（Rodrigues等人（1995) Chemistry Biology 2:223);經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統（8【〇1*111等人（1972)11.人1^1\(：1^111.3〇(；. 94:5815);及2-胺基苯基丙酸醢胺（Amsberry等人（1990) J. 〇rg. Chem. 55:5867)。去除在甘胺酸處經取代之含胺藥物 147375.doc -258 - 201039846 (Kingsbury等人（1984) J. Med. Chem. 27:1447)亦為適用於 ADC之自我犧牲間隔子之實例。例示性間隔子單元（-Yy-)由式X-XII表示：

I —HN—CH2—CO—| ：—nhch2c(〇)-nhch2c(〇)- i « XII。樹突狀連接子在另一實施例中，連接子L可為樹突型連接子以經由分支鏈多官能連接子部分將一個以上藥物部分共價連接於抗體（Sun 等人（2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215 ; Sun 等人（2003) Bioorganic & Medicinal

Chemistry 11:1761-1768)。樹突狀連接子可增加藥物與抗體之莫耳比，亦即負載，此與ADC之效能有關。因此，當經半胱胺酸工程改造之抗體僅具有一個反應性半胱胺酸硫氫基時，可經由樹突狀連接子連接多個藥物部分。分支鏈樹突狀連接子之例示性實施例包括2,6-雙（羥甲基）-對曱酚及 2,4,6-參（羥甲基）-苯酚樹突狀聚合物單元（WO 2004/01993 ; Szalai等人（2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689 ; Shamis 等人（2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731 ; Amir 等人 (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499) 0 147375.doc •259- 201039846 在該實施例中，間隔子單元為具有以下結構之分支鏈雙 (羥曱基）苯乙烯（BHMS)，其可用於併入及釋放多個藥物：

其包含2-(4-胺基苯亞曱基）丙-1，3-二醇樹突狀聚合物單元（WO 2004/043493 ; de Groot 等人（2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494)，其中 Q為-CVC8烷基、-O-CCVCs烷基）' 素、-石肖基或-鼠基，m為介於0 - 4範圍内之整數，η 為0或1 ;且ρ介於1至4範圍内。式I抗體-藥物結合化合物之例示性實施例包括 XIIIa(MC)、Xlllb(val-cit)、XIIIc(MC-val-cit)及 XIIId(MC-val-cit-PAB):

147375.doc -260- 201039846

XHId 式la抗體-藥物結合化合物之其他例示性實施例包括 XIVa-e ：〇

P XIYa P XlVb 〇

O 』II Ab—S+-CH2C-D

P XIVc

O II C-D p XlVd

0、 II , C~J~D P XIYe 147375.doc •261 - —* —1 — — — 201039846 其中x為： -Ο™-,- - ^ •^一 _」丨-「— > γ為： -"或-Ί2)η-; 且R獨立地為只或匚广匕烷基；且η為1至12。在另一實施例中，連接子具有反應性官能基，其具有與抗體上所存在之親電子基團反應的親核基團。抗體上有用之親電子基團包括（但不限於）醛及酮羰基。連接子之親核基團的雜原子可與抗體上之親電子基團反應且與抗體單元形成共價鍵。連接子上之有用親核基團包括（但不限於）醯耕、肪、胺基、肼、硫半卡巴腙、羧酸肼及芳醯肼。抗體上之親電子基團提供連接於連接子之適宜位點。一般而言，肽型連接子可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵而製備。該等肽鍵可例如根據狀化學領域中熟知之液相合成法（E Schr0der及K Liibke (1965) 「The Peptides」’第五卷，第 76_136頁，Academic Press)製備。連接子中間物可以反應物（包括間隔子、延伸 147375.doc -262- 201039846 子及胺基酸單元)之任何組合或順 » B* A JSA 間 Pffil 子、延伸子及胺基駄早兀可採用本質上為親電子、 ^ „ 親核或自由基的反應性g月b基。反應性官能其向基、對硝基本基碳酸酯、異硫氛社姑甘^ 文呢及離去基，諸如〇-甲磧醯基、〇-甲苯磺醯基、_C1、胺。七或順丁婦二酿亞舉例而言’帶電取代基(諸如續酸叫CV)或旬可提高

試劑之水溶性且有助於連接子試劑與抗體或藥物部分之偶合反應，或有助於Ab-L(抗體_連接子中間物）與D或叫藥物-連接子中間物)與Ab之偶合反應，視用於製備就之合成途徑而定。連接子試劑抗體與奥瑞他汀之結合物可使用各種雙官能連接子試劑來製備，該等連接子試劑諸如W定基二硫基）丙酸n_ 丁二酿亞胺醋（SPDP)、4散順丁稀二醯亞⑮基甲基）環己烧-卜曱酸丁二醯亞胺自旨（SMCC)、亞胺基硫雜環戍烧 (IT)、醯亞胺S旨之雙官能街生物（諸如二亞胺代己二酸二甲酿鹽酸鹽）、活性醋（諸如辛二酸二丁二醯亞胺醋）、酸（諸如戊一醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙_(對重氮苯甲醯基）_乙二胺）、二異氰酸酯（諸如2,6-二異氰酸甲苯酯）及雙活性氟化合物（諸如1，5-二氟-2,4-二硝基苯）。抗體藥物結合物亦可用如下連接子試劑製備： BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、 147375.doc -263 - 201039846 MBS、ΜΡΒΗ、SBAP、SIA、SIAB、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB((4-乙烯颯）苯曱酸丁二醯亞胺酯），且包括雙-順丁烯二醯亞胺試劑：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1，8-雙-順丁烯二醯亞胺基二乙二醇（BM(PEO)2)及1,11-雙-順丁烯二醯亞胺基三乙二醇（BM(PEO)3)，其可購自Pierce Biotechnology, Inc.，ThermoScientific, Rockford，IL及其他試劑供應商。雙-順丁烯二醯亞胺試劑使得可以依次或同時方式將經半胱胺酸工程改造抗體之硫氫基連接於含硫氫基藥物部分、標記或連接子中間物。除順丁烯二醯亞胺以外的其他可與經半胱胺酸工程改造抗體、藥物部分、標記或連接子中間物之硫氫基反應的官能基包括碘乙醯胺、溴乙醯胺、乙烯基吡啶、二硫基、吡啶基二硫基、異氰酸酯及異硫氰酸酯。 Ο

0 〇

0 0 bm(peo)2 bm(peo)3 有用之連接子試劑亦可經由其他市售來源（諸如Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO))獲得’或根據Toki 等人（2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872 ; Walker，Μ.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355 ; Frisch等人（1996) Bioconjugate Chem. 147375.doc -264- 201039846 7:180-186 ； US 6214345 ； WO 02/088172 ； US 2003130189 ； US2003096743 ; WO 03/026577 ; WO 03/043583 ;及 WO 04/032828 所述之程序合成。式（Ilia)之延伸子可藉由使以下連接子試劑與胺基酸單元之N末端反應引入連接子中：

〇其中η為介於卜10範圍内之整數且τ為-H或-S〇3Na ;

其中η為介於〇-3範圍内之整數；

〇

-265 - 147375.doc 201039846 Ο

延伸子單元可藉由使以下雙官能試劑與胺基酸單元之Ν 末端反應引入連接子中：

其中X為Br或I。式之延伸子單元亦可藉由使以下雙官能試劑與胺基酸單元之N末端反應引入連接子中：

具有順丁烯二醯亞胺延伸子及對胺基苯甲基胺曱醯基 (PAB)自我犧牲間隔子之例示性纈胺酸-瓜胺酸（val-eh或 vc)二肽連接子試劑具有以下結構： 147375.doc -266 - 201039846

具有順丁烯二醯亞胺延伸子單元及PAB自我犧牲間隔子單元之例不性phe-lys(Mtr，單_4_甲氧基三苯甲基）二肽連接子試劑可根據 Dubowchik 等人（1997) Tetrahedron Letters， 38:5257-60製備且具有以下結構：

ΗΝ—Mtr

Fmoc一N Η ο 製備經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體-藥物結合物式I之ADC可藉由以下數種途徑採用熟習此項技術者已〇知之有機化學反應、條件及試劑製備，包括：（1)使經半胱胺酸工程改造抗體之半胱胺酸基團與連接子試劑反應以經由共價鍵形成抗體-連接子中間物Ab-L，繼而與經活化之藥物部分D反應；及（2)使藥物部分之親核基團與連接子試劑反應以經由共價鍵形成藥物-連接子中間物D_L，繼而與經半胱胺酸工程改造抗體之半胱胺酸基團反應。結合方法 (1)及（2)可用於多種經半胱胺酸工程改造抗體、藥物部分及連接子來製備式I之抗體-藥物結合物。 147375.doc -267- 201039846 抗體半胱胺酸硫氫基具有親核性且能夠與連接子試劑及藥物連接子中間物上之親電子基團經由硫基交換反應形成共價鍵’該等親電子基團包括⑴活性酯，諸如NHS酯、 HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；（ii)烷基及苯曱基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；（iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基；及（iv)二硫基，包括吡啶基二硫基。藥物部分上之親核基團包括（但不限於）：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵的胺、硫氫基、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴腙、羧酸肼及芳醯肼。可藉由用還原劑（諸如DTT(克萊倫德氏試劑（cie丨and，s reagent) ’二硫蘇糖醇）或TCEp(參（2-羧基乙基）膦鹽酸鹽；

Getz 等人，（1999) Anal. Biochem.第 273 卷：73-80; Soltec

Ventures，Beverly，ΜΑ))處理，繼而再氧化再形成鏈間及鏈内二硫鍵（實例5 )而使經半胱胺酸工程改造之抗體對與連接子試劑結合具有反應性。舉例而言，在37。(：下用約50倍莫耳過量之TCEP還原CHO細胞中所表現之經半胱胺酸工程改造之全長單株抗體（ThioMab)3小時以還原半胱胺酸加合物中之二硫鍵，可在新引入之半胱胺酸殘基與培養基中所存在之半胱胺酸之間形成該半胱胺酸加合物。於1〇 mM乙酸鈉（pH 5)中稀釋經還原之ThioMab且負載於HiTrap S管柱上’且用含0.3 Μ氣化鈉之PBS溶離。在室溫下用稀（2〇〇 ηΜ)硫酸銅（CuS〇4)水溶液在親本Mab中所存在之半胱胺酸殘基之間重建二硫鍵隔仪。或者，去氫抗壞血酸（Dhaa) 為在還原裂解半胱胺酸加合物之後重建經半胱胺酸工程改 147375.doc -268. 201039846 造之抗體鏈内二硫基之有效氧化劑。可使用此項技術中已知之其他氧化劑及氧化條件。環境空氣氧化亦有效。此溫寻的。p刀再氧化步驟以高保真度有效形成鏈内二硫基且保持新5丨入之半胱胺酸殘基的硫氫基。添加約10倍過量之藥物-連接子中間物（例如MC-ve-PAB-MMAE)，混合且在室溫下靜置約1小時以實現結合且形成抗FcRH5抗體-藥物結 s物。將結合混合物凝膠過濾且負載且經由HiTrap 8管柱溶離以移除過量藥物-連接子中間物及其他雜質。製備由細胞培養物表現之用於結合的經半胱胺酸工程改造抗體的通用方法如下。當細胞培養基含有半胱胺酸時，可在新引入之半胱胺酸胺基酸與培養基之半胱胺酸之間形成二硫基加合物。此等在圖23(左邊）之例示性ThioMab中描述為圓之半胱胺酸加合物必須經還原產生對結合具有反應性之經半胱胺酸工程改造抗體。用還原劑（諸如tce^還原裂解半胱胺酸加合物（可能連同各鏈間二硫鍵一起）產生抗體之還原形式。在部分氧化條件下，用硫酸銅、DHAa 或暴露於環境氧氣下於配對半胱胺酸殘基之間再形成鏈間二硫鍵。新引入之工程改造且未配對半胱胺酸殘基仍可用於與連接子試劑或藥物-連接子中間物反應以形成本發明之抗體結合物。哺乳動物細胞株中所表現之Thi〇Mab經由形成_s-s·鍵產生與卫程改造之Cys而外部結合的cys加合物。因此’用還原及再氧化程序處理經純化ThioMab以產生反應性Thl〇Mab。使用此等ThioMab與含順丁烯二醯亞胺之細胞毒性藥、螢光團及其他標記結合。 147375.doc -269- 201039846 ίο.免疫脂質體本文中所揭示之抗FcRH5抗體亦可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或界面活性劑構成之適用於向哺乳動物傳遞藥物的小泡囊。脂質體之組分通常類似於生物膜之脂質排列以雙層形式排列。含有抗體之脂質體藉由此項技術中已知之方法製備，該等方法諸如描述於以下中之方法：Epstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 82:3688 (1985) ; Hwang等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);美國專利第 4,485,045號及第 4,544,545號；及1997年10月23日公開之W097/38731。美國專利第 5,013,5 56號中揭示具有延長之循環時間的脂質體。尤其有用之脂質體可藉由使用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺（PEG-PE)的脂質組合物的逆相蒸發法產生。經由限定孔徑之過濾器擠出脂質體以得到具有所需直徑之脂質體。本發明抗體之Fab'片段可經由二硫基交換反應而結合於脂質體（如Martin等人，J· Biol. Chem. 257:286-288 (1982)所述）。該月旨質體中視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人，J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)。 B.製備抗體之特定方法 1.篩選具有所需特性之抗FcRH5抗體產生結合於FcRH5多肽之抗體的技術如上所述。可視需要進一步選擇具有特定生物學特徵之抗體。本發明之抗FcRH5抗體的生長抑制作用可藉由此項技術 147375.doc -270- 201039846 中已知之方法，例如使用内源表現FcRH5多肽或在轉染有

FcRH5基因之後表現FcRH5多肽的細胞評定。舉例而言，可用各種濃度之本發明抗FcRH5單株抗體處理適當腫瘤細胞株及轉染有FcRH5之細胞數日（例如2-7日），且用結晶紫或MTT染色或藉由某另一比色分析法分析。測量增殖之另一方法為藉由比較在有本發明之抗FcRH5抗體時或無本發明之抗FcRH5抗體時經處理細胞的3H-胸苷吸收。處理之後，收集細胞且在閃爍計數器中定量併入DNA中之放射性之量。適當陽性對照組包括用已知抑制所選細胞株生長之生長抑制性抗體處理該細胞株。活體内腫瘤細胞之生長抑制可以此項技術中已知之多種方式測定。腫瘤細胞可為過度表現FcRH5多肽之細胞。在一實施例中，在約〇 5至 pg/ml之抗體濃度下’相較於未處理腫瘤細胞，抗抗體將活體外或活體内表現FcRH5之腫瘤細胞的細胞增殖抑制約25-100%，更佳約30-100%，且甚至更佳約5〇1〇〇%或 70-100%。可在細胞培養物中抗體濃度為約〇5至3〇或約0.5 nM至200 nM下測量生長抑制，其中在將腫瘤細胞暴露於抗體之後1-10日測定生長抑制。若投與每公斤體重約1 pg至每公斤體重約1〇〇 111§抗17(^115抗體在首次投與抗體約5日至3個月内、較佳約5日至3〇日内使腫瘤尺寸減小或腫瘤細胞增殖減少，則該抗體在活體内具有生長抑制性。為選擇誘發細胞死亡之抗FeRH5抗體，可相對於對照組評定如例如碘化丙錠（PI)、錐蟲藍或7八八〇吸收所指示之膜 147375.doc -271 - 201039846 完整性喪失。可在無補體及免疫效應細胞的情況下執行pi 吸收分析法。將表現FcRH5多肽之腫瘤細胞與單獨之培養基或含有適當抗FcRH5抗體（例如約10 pg/ml)之培養基一起培育。將細胞培育3日。每次處理之後，洗滌細胞且於35 mm 過濾器封端之12x75管中分成等份（每管1 ml ’每處理組3 管）以去除細胞團塊。隨後向管添加PI(1 〇 Kg/ml)。可使用 FACSCAN® 流式細胞儀及 FACSCONVERT® CellQuest軟體 (Becton Dickinson)分析樣品。如PI吸收所測定之誘發統計上顯著水準之細胞死亡的彼等抗FcRH5抗體可選作為誘發細胞死亡之抗FcRH5抗體。為篩選結合於所關注抗體所結合的FcRH5多肽上之抗原決定基的抗體，可執行常規交叉阻斷分析法，諸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及David Lane編（198 8)中所述之分析法0 此分析法可用於判定測試抗體是否與已知抗FcRH5抗體結合相同位點或抗原決定基。或者或另外，可藉由此項技術中已知之方法執行抗原決定基定位。舉例而言，可諸如藉由丙胺酸掃描使抗體序列突變誘發以鐘別接觸殘基。首先測試突變抗體與多株抗體之結合以確保正確摺疊。在不同方法中，可在與測試抗體或與測試抗體及具有已表徵或已知抗原決定基之抗體的競爭分析法中使用對應於FcRH5多狀之不同區的狀。 2.特定庫篩選方法本發明之抗FcRH5抗體可藉由使用組合庫以篩選具有所 147375.doc -272- 201039846 需活性之抗體而製備。舉例而言，此項技術中已知多種方法可用於產生嗜菌體呈現庫及篩選該等庫中具有所需結合特徵之抗體。該等方法一般描述於H〇〇genb〇〇m等人 (2001), Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien# 人編，Human Press，Totowa，NJ)中，且在某些實施例中，描述於 Lee等人（2004) J, Mol. Biol. 340:1073-1093 中。原則上，藉由篩選含有呈現融合於噬菌體鞘蛋白之抗體可變區（FV)之各種片段之噬菌體的噬菌體庫來選擇合成之〇抗體純系。藉由針對所需抗原進行親和層析來淘選該等噬菌體庫。表現能夠結合於所需抗原之^片段的純系係吸附於該抗原且因此自庫中非結合性純系分離。隨後將結合性純系自抗原溶離，且可藉由其他抗原吸附/溶離循環進一步富集。本發明抗FcRH5抗體中之任一者可藉由設計適合之抗原篩選程序以選擇所關注之噬菌體純系，繼而使用來自所關注噬菌體純系之FV序列及以下中所述之適合恆定區 ◎ (Fc)序列構築全長抗以汉^^抗體純系來獲得：Kabat等人，

Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版， NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 i_3卷。在某些實施例中，抗體之抗原結合域係由兩個具有約 110個胺基酸之可變（V)區形成，各自分別來自輕鏈（VL)及重鏈（VH)，兩者均呈現三個高變環（HVR)或互補決定區 (CDR)。可變域可以單鏈Fv(scFv)片段形式（其中仰與VL 經由可撓性短肽共價連接）或以Fab片段形式（其中乂^^與VL 各融合於但定域且以非共價方式相互作用）功能性地呈現 147375.doc -273· 201039846 於巫菌體上’如 Winter等人，Ann. Rev· Immunol·，12: 433- 45 5 (1994)所述。如本文所用之編碼seFv之㈣體純系及編碼Fab之噬菌體純系統稱為「Fv噬菌體純系」或「Fv純系」。 VH與VL基因㉟系可藉由聚合酶鏈反應（pcR)分別選殖，且在嗟g體庫中隨機重組，隨後可供搜尋抗原結合純系，如 Winter等人，Ann. Rev. Immunol·, 12: 433-455 (1994)所述。來自經免疫來源之庫提供對於免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖天然譜系以不經任何免疫而提供針對多種非自體抗原以及自體抗原的人類抗體之單一來源，如GHffiths等人，EMB〇】，12: 725 734 (1993) 所述。最後，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之v基因區段且使用含有隨機序狀PCR^子以編碼高度可變之cdr3 區及實現活體外重排來以合成方式得到天然庫，如 H〇〇genboo„^Winter，j M〇1 出〇1，227: 38i 388 (199幻所述。在某些實施例中，使用絲狀嗟菌體藉由融合於次要鞠蛋白—來呈現抗體片段。該等抗體片段可以單鏈Fv片段形式呈現，其中VH域與VL域藉由可撓性多肽間隔子連接於同一多肽鏈上，例如，如Marks等人，；M〇】出〇1，M2 581-597 (1991)所述；或以Fab片段形式呈現，其中—條鏈融合於pill而另-條鏈分泌於細菌宿主細胞周質内，其中藉由置換-些野生型鞘蛋白組裝呈現於噬菌體表面上的 Fab-鞘蛋白結構，例如，如H〇〇genb〇〇m等人，Nuci J47375.doc -274- 201039846

Res.，19: 4133-4137 (1991)所述。一般而言，編碼抗體基因片段之核酸可獲自由人類或動物收集之免疫細胞。若需要偏重於抗FcRH5純系之庫，則用FcRH5使個體免疫以產生抗體反應，且回收脾細胞及/或循環B細胞或其他周邊金淋巴細胞（pbl)進行庫構築。在一較佳實施例中’藉由在攜帶功能性人類免疫球蛋白基因陣列（且缺乏功能性内源抗體產生系統）之轉殖基因小鼠體内產生抗FcRH5抗體反應以使FcRH5免疫生成產生針對〇 FcRH5之人類抗體的B細胞來獲得偏重於抗FcRH5純系之人類抗體基因片段庫。下文描述產生人類抗體之轉殖基因小鼠的產生。可藉由使用適合之篩選程序分離表現FcRH5特異性膜結合抗體之B細胞（例如藉由使用FcRH5親和層析分離細胞，或使細胞吸附於經螢光染料標記之FcRH5，繼而進行流式活化細胞分選（FACS))而獲得對於抗fcrh5反應性細胞群體之額外富集。 ❹ 或者’使用來自未免疫供者之脾細胞及/或B細胞或其他 PBL更好呈現可能之抗體譜系’且使得可使用FcRH5不具抗原性之任何動物（人類或非人類）物種來構築抗體庫。對於併入活體外抗體基因構築之庫而言，自個體收集幹細胞以提供編碼未重排之抗體基因區段之核酸。所關注之免疫細胞可獲自多種動物物種，諸如人類、小鼠、大鼠、兔、狼（luprine)、犬、貓、豬、牛、馬及禽類物種等。

自所關注之細胞中回收編碼抗體可變基因區段（包括VH 147375.doc -275 - 201039846 及VL區段）之核酸且進行擴增。在重排之vh及VL基因庫的情況下’所需DNA可藉由自淋巴細胞中分離基因組DNA 或mRNA ’繼而用與重排VH及VL基因之51端及3,端匹配之引子藉由聚合酶鏈反應（PCR)獲得，如Orlandi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)所述，從而製備用於表現之多樣V基因譜系。v基因可用編碼成熟v域之外顯子之5'端處的後向引子及建於j區段内部的前向引子、自cDNA及基因組DNA擴增，如〇riandi等人，（1989)及 Ward等人 ’ Nature, 341: 544-546 (1989)中所述。然而，為自cDNA擴增，亦可使後向引子建於前導外顯子中，如 Jones等人，Biotechnol.，9: 88-89 (1991)所述，且前向引子可建於恆定區内，如Sastry等人，proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86: 5728-5732 (1989)所述。為使互補性最大化，可將簡併性併入該等引子中，如Orlandi等人，（1989)或 Sastry等人，（1989)所述。在某些實施例中，藉由使用靶向各V基因家族的PCR引子使庫多樣性最大化，以擴增存在於免疫細胞核酸樣品中之所有可利用的VH與VL排列，例如，如Marks等人 ’ J· Mol. Biol·，222: 581-597 (1991)之方法所述’或如 Orum等人，Nucleic Acids Res·, 21: 4491-4498 (1993)之方法所述。為將經擴增之DNA選殖於表現載體中，可將稀少之限制位點引入PCR引子内作為一端之標籤，如Orlandi等人’（1989)所述；或用經標記之引子進一步進行 PCR 擴增，如 Clackson等人，Nature, 352: 624-628 (1991)所述。 147375.doc -276- 201039846 以合成方式重排之v基因譜系可活體外源自v基因區段。大多數人類VH基因區段已進行選殖且測序（報導於 Tomlinson等人，J，Mol. Biol.，227: 776-798 (1992)中），且定位（報導於Matsuda等人，Nature Genet.，3: 88-94 (1993) 中）；可使用該等選殖區段（包括HI及H2環之所有主要構形）以及編碼具有多樣序列及長度之H3環的PCR引子產生多樣VH基因譜系，如Hoogenboom 及 Winter, J. Mol. 227: 381-3 88 (1992)所述。亦可用集中於具有單一長度之〇長H3環中的所有序列多樣性產生VH譜系，如Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)戶斤述。人類Vk及νλ區段已進行選殖且測序（報導於Williams 及 Winter, Eur. J. Immunol.，23: 1456-1461 (1993)中）且可用於產生合成輕鏈譜系。基於一定範圍之VH與VL摺疊及 L3及H3長度的合成V基因譜系將編碼具有相當大結構多樣性之抗體。擴增編碼V基因之DNA之後，生殖系V基因區段可根據 Hoogenboom 及 Winter，J. Mol. Biol., 227: 381-388 Ο W (1992)之方法活體外重排。可藉由以數種方式將VH與VL基因譜系組合在一起來構築抗體片段譜系。各譜系可產生於不同載體中，且該等載體於活體外重組，例如如Hogrefe等人，Gene，128: 119-126 (1993)所述；或活體内藉由組合感染重組，例如， Waterhouse等人，Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993) 所述之ΙοχΡ系統。活體内重組方法利用Fab片段之雙鏈性質來克服大腸桿菌轉型效率對於庫尺寸所施加之限制。分 147375.doc • 277- 201039846 別選殖天然VH及VL譜系’一者選殖於嗤菌粒中而另一者選殖於噬菌體載體中。隨後藉由噬菌體感染含有噬菌粒之細菌來組合兩個庫，以使各細胞含有不同組合且使庫尺寸僅受所存在細胞數（約1〇12個純系）限制。兩個載體均含有活體内重組信號’以使VH與VL基因重組於單個複製子上且共封裝於嗟菌體病毒粒子中。此等大型庫提供大量具有良好親和力（K，1為約ι〇·8μ)之多樣抗體。或者’該等譜系可依次選瘦於同一載體中，例如，如

Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA, 88: 7978-7982 (1991)所述；或藉由pcR組裝在一起且隨後選殖，例如，如Clackson等人，Nature，352: 624-628 (1991)所述。亦可使用PCR組裝將VH及VL DNA與編碼可撓性肽間隔子之 DNA接合在一起以形成單鏈Fv(scFv)错系。在另一技術中’使用「細胞内PCR組裝（in cell PCR assembly)」以藉由PCR將VH與VL基因組合於淋巴細胞内且隨後選殖已連接基因之言醬系，如Embleton等人，Nucl. Acids Res” 20. 3831-3837 (1992)所述。天然庫所產生之抗體（天然或合成抗體）可具有中度親和力（Kd-1為約106至ΙΟ7 M·1)，但親和力成熟亦可藉由構築第二庫及自第二庫中再選擇而在活體外模擬，如前述Winter 專人，（1994)所述。舉例而言’可藉由使用Hawkins等人 ’ J_ Mol· Biol.，226: 889-896 (1992)之方法中或Gram等人，Proc. Natl. Acad· Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)之方法中的易錯（error-prone)聚合酶（報導於Leung等人， 147375.doc -278 - 201039846

Technique，1: 1卜15 (1989)中）在活體外隨機引入突變。此外’可藉由例如使用PCR用攜帶跨越所關注CDR之隨機序列的引子在所選個別Fv純系中隨機突變一或多個CDR且篩選較高親和力純系來執行親和力成熟。WO 9607754(1996 年3月14曰公開）描述一種誘發免疫球蛋白輕鏈之互補決定區突變以產生輕鏈基因庫的方法。另一有效方法係將噬菌體呈現所選擇之VH域或VL域與獲自未免疫供者之天然存在V域#異體譜系重組且在數輪鏈改組中針對較高親和力進行篩選，如Marks等人，Biotechnol., 10: 779-783 (1992) 所述。此技術使得可產生親和力為約1 〇_9 Μ或更少之抗體及抗體片段。可藉由各種此項技術中已知之技術篩選該等庫。舉例而言’可使用FcRH5塗佈吸附板之孔，表現於附著於吸附板上之宿主細胞上或用於細胞分選，或結合於生物素以供塗佈抗生蛋白鍵菌素之珠粒捕捉，或用於任何其他淘選喔菌體呈現庫之方法中。在適合於使嗟滅體粒子之至少一部分與吸附劑結合之條件下，使噬菌體庫樣品與經固定之FcrH5F接觸。通常，選擇包括pH值、離子強度、溫度及其類似條件之條件以模擬生理條件。洗滌結合於固相之噬菌體且隨後由酸溶離，例如，如Barbas等人，Proc Natl Acad· Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)所述；或由驗溶離，例如，如Marks等人，J. Mol· Biol·，222: 581-597 (1991)所述；或藉由 FcRH5 抗原肌爭溶# ’例如，用類似於Ciackson等人，Nature， 147375.doc -279- 201039846 352: 624-628 (1991)之枯；§ 轉至士、本 l 原競肀方法的程序。可在單輪選擇中虽集噬菌體20-1，〇〇〇倍。此外， 1 J优虽集之噬菌體生長於細菌培養物中且進行其他輪之選擇。選擇效率取決於多個因素，包括洗滌期間之解離動力學及單-嗟菌體上之多個抗體片段能否同時與抗原接合。I 有快速解離動力學(及弱結合親和力)之抗體可藉由使用短時間洗滌、多價㈣體呈現及抗原於固相中之高塗佈密度而保留。高密度不僅經由多價相互作用使耗體穩定，且亦有助於使已解離之嗟菌體再結合。具有緩慢解離動力學 (及良好結合親和力）之抗體的選擇可藉由使用長時間洗務及單價噬菌體呈現（如Bass等人，Pr〇teins，8: 3〇9_314 (1990)及WO 92/0969〇所述）及抗原之低塗佈密度（如等人，Biotechnol.，10: 779_783 (1992)所述）而促進。有可能在對FeRH5具有不同親和力、甚至具有略微不同之親和力的噬菌體抗體之間進行選擇。然而，所選抗體之隨機突變（例如，如一些親和成熟技術中所執行）可能產生卉多犬變體’ *中大多數結合於抗原且少數具有較高親和力。使用限制性FcRH5可能會競爭淘汰極高親和力噬菌體。為保留所有具有較高親和力之突變體，可將噬菌體與過量經生物素標記之FcRH5 一起培育，但經生物素標記 FcRH5之濃度具有低於FcRH5之標靶莫耳親和常數的莫耳濃度。隨後可由抗生蛋白鏈菌素塗佈之順磁珠粒捕捉高親和力結合噬菌體。該「平衡捕捉」使得可根據抗體之結合親和力選擇抗體’其靈敏度使得可自大大過量之具有較低 147375.doc -280- 201039846 親和力之噬菌體分離僅兩倍高親和力的突變純系。亦可操控用於洗滌結合於固相之噬菌體中的條件以基於解離動力學進行區分。可基於/舌性選擇抗FcRH5純系。在某些實施例中，本發明提供結合於天然表現FcRH5之活細胞的抗FcRH5抗體。在一實施例中，本發明提供阻斷FcRH5配位體與Fcrh5之間結合但不阻斷FcRH5配位體與第二蛋白之間結合的抗 FcRH5抗體。對應於§亥等抗Fcrh5抗體的Fv純系可藉由如〇下步驟選擇：（1)如上所述自噬菌體庫分離抗FcRH5純系，及視情況藉由使分離之噬菌體純系群於適合之細菌宿主中成長來擴增該群；（2)選擇分別需要阻斷活性及不阻斷活性之FcRH5及第二蛋白；（3)將抗FcRH5噬菌體純系吸附於經固定FcRH5 ; (4)使用過量的第二蛋白溶離任何可識別與第二蛋白之結合決定子重疊或共有之FcRH5結合決定子的非所需純系；及（5)溶離步驟（4)之後仍吸附之純系。視情況，具有所需阻斷/不阻斷特性之純系可藉由將本文中所述之選擇程序重複一或多次而進一步富集。可易於分離編碼本發明之源自融合瘤之單株抗體或噬菌體呈現Fv純系之DNA，且使用習知程序（例如藉由使用經設計以由融合瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增所關注之重鏈及輕鏈編碼區的寡核苷酸引子）進行測序。分離之後，可將DNA置於表現載體中，隨後將其轉染於宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猴cos細胞、中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞或骨髄瘤細胞）（否則該等宿主細胞不會產生免疫球蛋白蛋 147375.doc -281 - 201039846 白）中以在重組宿主細胞中合成所需單株抗體。關於在細菌中重組表現編碼抗體之DNA的評述文章包括Skerra等人 ’ Curr. Opinion in Immunol” 5: 256 (1993)及Pluckthun， Immunol· Revs，130: 151 (1992)。可將編碼本發明Fv純系之DNA與編碼重鏈及/或輕鏈恆定區之已知DNA序列（例如適當之DNA序列可獲自前述 Kabat等人）組合以形成編碼全長或部分長度重鏈及/或輕鏈之純系。應瞭解為達成此目的可使用任何同型之恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恒定區可獲自任何人類或動物物種。源自一種動物（諸如人類）物種之可變域DN A且隨後融合於另一種動物物種之丨互定區DN A 以形成「雜交」全長重鏈及/或輕鏈的編碼序列的Fv純系包括於本文中所用之「嵌合」及「雜交」抗體之定義中。在某些實施例中，源自人類可變DN A的F v純系融合於人類怪定區DNA以形成全長或部分長度人類重鏈及/或輕鏈的編碼序列。編碼源自融合瘤之抗FcRH5抗體的DNA亦可例如藉由用人類重鏈恒定域及輕鏈恆定域編碼序列取代源自融合瘤純系的同源鼠類序列（例如，如Morrison等人，Proc. Natl Acad· Sci· USA，81: 6851-6855 (1984)之方法）修飾。可藉由使非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列共價接合於免疫球蛋白編碼序列來進一步修飾編碼源自融合瘤或以純系之抗體或片段的DNA。以此方式，製得具有本發明之源自Fv純系或融合瘤純系之抗體的結合特異性的「嵌合」或 147375.doc -282- 201039846 「雜交」抗體。 C.抗體依賴性酶介導之前藥療法（adept) 本發明之抗體亦可藉由使抗體結合於將前藥（例如肽基化學治療劑，參見WO81/01145)轉化為活性抗癌藥之前藥活化酶而用於ADEPT中。例如參見w〇 88/〇7378及美國專利第 4,975,278號。免疫結合物中適用於ADEPT之酶組分包括能夠以一定方式作用於前藥以便將其轉化為其更具活性之細胞毒性形式的任何酶。適用於本發明方法之酶包括（但不限於）鹼性磷酸酶，其適用於將含磷酸^旨前藥轉化為自由態藥物；芳基硫酸醋酶，其適用於將含疏酸醋前藥轉化為自由態藥物；胞鳴唆去胺酶，其適用於將無毒5_氟胞♦ 定轉化為抗癌藥5_氣尿嘧啶；蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶及組織蛋白酶（諸如組織蛋白酶B 及L)，其適用”含肽前藥轉化為自由態藥物；d_丙胺酿基羧基肽酶，其適用於轉化含有〇_胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，諸如半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶’其適用於將糖基化前藥轉化為自由態藥物；p_内醯胺酶，其適用於將用β_内醯胺衍生之藥物轉化為自由態藥物’·及青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶或青黴素㈣胺酶，，適用於將胺氮分別用苯氧基乙醯基或苯基乙酿基何生之藥物轉化為自由態藥物。或者’可使用具有酶活性之抗體（在此項技術中亦稱作「抗體酶」）將本發明之前藥 147375.doc 201039846 轉化為自由態活性藥物（例如參見Massey, Nature 328.457_ 458 (1987))。抗體-抗體酶結合物可如本文所述製備以將抗體酶傳遞於腫瘤細胞群。本發明之酶可藉由此項技術中熟知之技術（諸如使用上述雜雙官能交聯試劑）共價結合於抗FcRH5抗體。或者，可使用此項技術中熟知之重組DNA技術（例如參見Neuberger 等人，Nature 312:604-608 (1984))構築包含本發明抗體之至少抗原結合區連接於本發明酶之至少一個功能活性部分的融合蛋白質。 D.抗FcRH5抗體除本文所述之抗FcRH5抗體以外’預期可製備抗FcRh5 抗體變異體。抗FcRH5抗體變異體可藉由將適當核脊酸變化引入編碼DNA中及/或藉由合成所需抗體或多肽來製備。沾習此項技術者應瞭解胺基酸變化可改變抗Fcrh5抗體之轉澤後加工’諸如改變糖基化位點之編號或位置或改變膜錨定特徵。舉例而言，可使用任何例如美國專利第5,364,934號中所述之用於保守及非保守突變之技術及準則產生本文所述之抗FcRH5抗體之變化。變化可為取代、缺失或插入一或多個編碼抗體或多肽之密碼子，該抗體或多肽相較於天然序列抗體或多肽胺基酸序列有變化。視情況，變化係在抗 FcRH5抗體之一或多個域中用任何其他胺基酸取代至少一個胺基酸。可藉由比較抗FCRH5抗體之序列與同源已知蛋白分子之序列且使高同源性區中所產生之胺基酸序列變化 147375.doc -284· 201039846 數減至最小而發現碟定可插入、取代或缺失何種胺基酸殘基而不會不利地影響所需活性的規則。胺基酸取代可為用另一具有類似結構及/或化學特性之胺基酸置換一個胺基酸（諸如用絲胺酸置換白胺酸，亦即，保守胺基酸置換）的結果。插入或缺失可視情況在約1至5個胺基酸範圍内。允許之變化可藉由以下確定：系統地在序列中插入、缺失或取代胺基酸’及測試所得變異體由全長或成熟天然序列所展現之活性。本文提供抗FcRH5抗體片段。該等片段例如當與全長天然抗體或蛋白比較時可在N末端或C末蟑處截短或可缺失内部殘基。某些片段缺失對抗FcRH5抗體之所需生物活性並非必要之胺基酸殘基。抗FcRH5抗體片段可藉由任何多種習知技術製備。所需肽片段可以化學方式合成。替代性方法包括藉由酶促消化產生抗體或多狀片段’例如藉由用已知在由特定胺基酸殘基界定之位點處裂解蛋白質的酶處理蛋白質，或藉由用適合之限制酶消化DNA及分離所需片段。另一適合之技術包括藉由聚合酶鏈反應（PCR)分離且擴增編碼所需抗體或多狀片段之DNA片段。在PCR中在5,及3,引子處採用界定 DNA片段之所需末端的寡核苷酸。抗1^11115抗體片段較佳與本文所揭示之天然抗以尺115抗體共有至少一種生物及/或免疫活性。在特定實施財，所關注之保守性取代以表頭較佳取代展示於表8中。若該等取代引起生物活性變化，則可引入 147375.doc -285 - 201039846 更多實質性變化（表8中稱作「例示性取代」，或如下文參考胺基酸類別進一步描述之變化），且篩選產物。表8 初始殘基例示性取代較佳取代 Ala(A) val ； leu ； ile val Arg(R) lys ; gin ; asn lys Asn(N) gin ； his ； lys ； arg gin Asp(D) glu glu Cys(C) ser ser Gln(Q) asn asn Glu(E) asp asp Gly(G) pro ; ala ala His(H) asn ; gin ; lys ; arg arg Ile(I) leu ; val ; met ; ala ; phe ; 正白胺酸 leu Leu(L) 正白胺酸；ile ; val ; met ； ala ； phe ile Lys(K) arg ; gin ; asn arg Met(M) leu ； phe ； ile leu Phe(F) leu ; val ; ile ; ala ; tyr leu Pro(P) ala ala Ser(S) thr thr Thr(T) ser ser Trp(W) tyr ; phe tyr 147375.doc -286- 201039846 Tyr(Y) trp ； phe ； thr ； ser phe Val(V) ile ； leu ； met ； phe ； ala ;正白胺酸 leu 可藉由選擇取代基來實質上改變抗FCRH5抗體之功能或免疫學一致性，該等取代基在其對維持以下之作用方面顯著不同：a)取代區中多肽骨架之結構（例如呈薄片或螺旋構形）’（b)標靶位點處分子的電荷或疏水性，或（£：)側鏈之大〇小。可基於通用側鏈特性將天然存在之殘基分組： (1) 疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性：cys、ser、thr ; (3) 酸性：asp、glu ; (4) 鹼性：asn、gin、his、lys、arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：giy、pr〇 ;及 (6) 芳族：trp、tyr、phe。非保守性取代需要使該等類別中之一之成員換為另一類〇別。亦可將該等經取代之殘基引入保守性取代位點中或更佳引入其餘（非保守性）位點中。該等變化可使用此項技術中已知之方法（諸如寡核苷酸介導之（定點）突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發）產生。可在選殖之DNA上執行定點突變誘發[Carter等人，

Nucl. Acids Res.，13:4331 (1986) ; Zoller 等人，Nucl. Acids Res·，10:6487 (1987)]、卡匣突變誘發[Wells等人， Gene，34:3 15 (1985)]、限制選擇突變誘發[Wells等人， 147375.doc •287· 201039846

Philos. Trans. R. Soc. London SerA，317:415 (1986)]或其他已知技術以產生抗FcRH5抗體變異DNA。亦可採用掃描胺基酸分析沿相鄰序列鑑別一或多個胺基酸。較佳掃描胺基酸為相對較小中性胺基酸。該等胺基酸包括丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及半胱胺酸。在此群中，丙胺酸通常為較佳掃描胺基酸，因為其去除β_碳之上之側鏈且不太可能改變變異體之主鏈構形[Cunningham and Wells， Science，244:1〇81-1085 (1989)]。丙胺酸通常亦較佳因為其為最常見胺基酸。此外，其通常存在於埋藏及暴露之位置中[Creighton，The Proteins，（W.H. Freeman & Co., N.Y.);

Chothia，J· Mol· Biol·，150:1 (1976)]。若丙胺酸取代未能產生足量變異體，則可使用電子等排胺基酸。亦可一般用絲胺酸取代不參與維持抗FcRH5抗體之適當構形的任何半胱胺酸殘基以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反地’可將半胱胺酸鍵添加至抗FcRH5抗體中以改良其穩定性（尤其在抗體為抗體片段（諸如Fv片段）之情況下）。尤其較佳之取代變異體類型包括取代親本抗體（例如人類化或人類抗體）之一或多個高變區殘基。一般而言，經選擇用於進一步發展之所得變異體應相對於產生其之親本抗體具有改良之生物學特性。產生該等取代變異體之適宜方式包括使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使數個高變區位點（例如6-7個位點）突變以於各位點處產生所有可能之胺基取代。由此產生之抗體變異體係以單價方式自絲 147375.doc «288- 201039846 狀巫菌體粒子以與封裝於各粒子内之M13之基因III產物的 =:物形式呈現。隨後如本文所揭示針對生物活性(例如結合親和力)篩選噬菌體呈現之變異It。為鑑別用於修飾 =候選回變區位點，可執行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別顯者促進抗原結合之高變區殘基。或者或另外，宜分析抗原抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與FcRH5多肽之間的接觸點。根據本文中詳述之技術，該等接觸殘基及相鄰殘基為用於取代之候選者。產生該等變異體之後，如本文所述對變異體組進行篩選，且在一或多個相關分析法中具有優良特性之抗體可選用於進一步發展。編碼抗FcRH5抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子可藉由多種此項技術中已知之方法製備。此等方法包括（但不限於）自天然來源分離（在天然存在之胺基酸序列變異體的情況下）或藉由寡核苷酸介導之（或定點）突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發先前所製備之抗FcRH5抗體之變異或非變異型式製備。

G E.修飾抗FcRH5抗體本發明之範疇内包括抗FcRH5抗體之共價修飾。一類共價修飾包括使抗FcRH5抗體之靶向胺基酸殘基與有機衍生劑反應，該有機衍生劑能夠與抗FcRH5抗體之所選側鏈或 N末端或C末端殘基反應。用雙官能劑衍生適用於例如使抗FcRH5抗體交聯於水不溶性支撐基質或表面以用於純化抗FcRH5抗體之方法，且反之亦然。常用交聯劑包括例如 Μ-雙（重氮基乙醯基）-2-苯基乙烷；戊二醛；N-羥基丁二 147375.doc -289- 201039846 醯亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸形成之酯；同雙官能醯亞胺酯，包括二丁二醯亞胺酯，諸如3,3’-二硫基雙（丙酸丁二醯亞胺酯）；雙官能順丁烯二醯亞胺，諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺基-1,8-辛烷；及諸如3-[(對疊氮基苯基）二硫基]丙醯亞胺曱酯之試劑。其他修飾包括分別將麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基去醯胺化為相應麩胺醯基及天冬胺醯基，脯胺酸及離胺酸之羥基化，絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基的磷酸化，離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co·，San Francisco，第 79-86 頁（1983)]，N末端胺之乙醯化及任何C末端羧基之醯胺化。本發明之範疇内所包括之抗FcRH5抗體之另一類共價修飾包含改變抗體或多肽之天然糖基化模式。出於本文之目的，「改變天然糖基化模式」欲意謂缺失天然序列抗 FcRH5抗體中所存在之一或多個碳水化合物部分（藉由移除潛在糖基化位點或藉由化學及/或酶促方式缺失糖基化）及/ 或添加一或多個不存在於天然序列抗FcRH5抗體中之糖基化位點。另外，該短語包括天然蛋白之糖基化的質變 (qualitative change)，包括所存在之各種碳水化合物部分之性質及比例變化抗體及其他多肽之糖基化通常經N連接或經Ο連接。經N 連接係指碳水化合物部分連接於天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸（其中X為 147375.doc -290- 201039846 除脯胺酸外之任何胺基酸）為碳水化合物部分酶促連接於天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中之任一者的存在產生潛在的糖基化位點。經〇連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖之一連接於羥基胺基酸，該羥基胺基酸最常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。宜藉由改變胺基酸序列以使其含有上述三肽序列中之— 或多者向抗FcRH5抗體中添加糖基化位點（對於經N連接之糖基化位點）。亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至原始抗FcRH5抗體之序列中或用該一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始抗FcRH5抗體之序列來進行改變（對於經Ο連接之糖基化位點）。抗以尺115抗體胺基酸序列可視情況經由DNA層面之變化而改變，尤其藉由使編碼抗 FcRH5抗體之DNA在預選鹼基處突變以便產生轉譯為所需胺基酸之密碼子。增加抗FcRH5抗體上之碳水化合物部分數之另一方式係藉由使醣苷化學或酶促偶合於多肽。該等方法描述於例如 1987 年 9 月 11 日公開之 WO 87/05330 及 Aplin 及 Wriston， CRC Crit. Rev. Biochem”第 259-306 頁（1981)的技術中。可以化學方式或酶促方式或藉由突變取代編碼充當糖基化標乾之胺基酸殘基的密碼子移除抗FcrH5抗體上所存在之碳水化合物部分。化學無糖基化技術為此項技術中已知且描述於例如 Hakimuddin等人，Arch. Biochem. Biophys” 259.52 (1987)及 Edge 等人，Anal. Biochem·, 118:131 147375.doc -291 - 201039846 (1981)中。可藉由使用多種如Thotakura等人，Meth. Enzymol·，138:350 (1987)所述之内切及外切醣苷酶酶促裂解多肽上之碳水化合物部分。抗FcRH5抗體之另一類共價修飾包含使抗體以美國專利第 4,640,835 號；第 4,496,689 號；第 4,301,144 號；第 4,670,417號；第4,791，192號；或第4,179,337號中所述之方式連接於多種非蛋白性聚合物（例如聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇或聚氧伸烷基）之一。抗體亦可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊（分別例如羥甲基纖維素微膠囊或明膠微膠囊及聚_(甲基丙烯酸甲酯）微膠囊）中；包埋於膠態藥物傳遞系統（例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊）中；或包埋於巨乳液中。s亥專技術揭示於 Remjngt()n，s pharmaceutieal

Sciences ’ 第 16版，Oslo, A.編，（1980)中。本發明之抗FcRH5抗體亦可以一定方式修飾以形成包含抗FcRH5抗體融合於另一異源多肽或胺基酸序列之嵌合分子。在一實施例中，該嵌合分子包含抗FcRH5抗體與標籤多肽之融合物，該標籤多肽提供抗標籤抗體可選擇性結合之抗原決疋基。抗原決定基標籤一般置於抗Fcrh5抗體之胺基或羧基末端。可使用針對標籤多肽之抗體偵測抗FcRH5 抗體之抗原決定基經標記形式的存在。提供抗原決定基標籤亦使得抗FcRH5抗體可易於藉由親和力純化使用抗標籤抗體或結合於抗原決定基標籤之另一類親和力基質純化。 147375.doc -292- 201039846 各種標籤多肽及其各自之抗體為此項技術中所熟知。實例包括聚組胺酸（poly-his)或聚組胺酸-甘胺酸（p〇ly-his-gly) 標籤；flu HA標籤多肽及其抗體12CA5[Field等人，Mol. Cell. Bio丨.，8:2159-2165 (1988)] ; c-myc標籤及其抗體 8F9、3C7、6E10、G4、B7及 9E10[Evan 等人，Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)];及疱疹單純型病毒醣蛋白D(gD)標籤及其抗體[Paborsky等人，pr〇tein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]。其他標籤多肽包括 Flag-肽[Hopp 等人，BioTechnoIogy，6:1204-1210 (1988)]; KT3 抗原決定基肽[Martin 等人，Science, 255:192-194 (1992)] ; a-微管蛋白抗原決定基肽[Skinner等人，J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)];及 T7基因 10蛋白肽標籤 [Lutz-Freyermuth等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)] » 在一替代性實施例中，嵌合分子可包含抗FcRH5抗體與免疫球蛋白或免疫球蛋白之特定區之融合物=對於二價形式之嵌合分子（亦稱作「免疫黏附素」），該融合可能為與 IgG分子之Fc區融合。Ig融合物較佳包括用抗FcRH5抗體之可溶性（跨膜域缺失或失活）形式取代Ig分子内之至少一個可變區。在一尤佳實施例中》免疫球蛋白融合物包括IgGl 分子之鉸鏈、CH2及CH3或鉸鏈、CHi、CH2及CH3區。免疫球蛋白融合物之產生亦參見1995年6月27日所頒佈之美國專利第5,428，130號。 F.製備抗FcRH5抗體 147375.doc •293 · 201039846 以下描述主要係關於藉由培養轉型或轉染有含有編碼抗 FeRH5抗體之核酸的載體的細胞產生抗抗體。當然，預期此項技術中所熟知之替代性方法可用於製備抗 FcRH5抗體。舉例而言，適當胺基酸序列或其部分可藉由直接肽合成使用固相技術[例如參見Stewart等人，8〇丨13-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969) ； Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)] 產生。可使用手動技術或藉由自動化活體外合成蛋白質。可例如使用 Applied Biosystems 肽合成儀（Foster City, CA) 使用製造商之說明書自動合成。抗FcRH5抗體之各部分可以化學方式分別合成且使用化學法或酶法組合以產生所需抗FcRH5抗體。

1. 分離編碼抗FcRH5抗體之DNA 編碼抗FcRH5抗體之DNA可獲自由咸信具有抗FcRH5抗體mRNA且表現可偵測含量之該mRNA之組織所製備出的 cDNA庫。因此，人類抗FcRH5抗體DNA宜獲自由人類組織所製備出之cDNA庫。編碼抗FcRH5抗體之基因亦可獲自基因組庫或藉由已知合成程序（例如自動核酸合成）獲得。庫可用經設計以鑑別所關注基因或該基因所編碼之蛋白質的探針（諸如具有至少約20-80個鹼基之寡核苷酸）篩選。可使用標準程序（諸如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述之標準程序）用所選探針篩 147375.doc -294- 201039846 選cDNA或基因組庫。分離編碼抗FcRH5抗體之基因的替代性方式係使用PCR方法[前述Sambrook等人；Dieffenbach 等人，PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)]。篩選cDNA庫之技術為此項技術中所熟知。選用作探針之募核苷酸序列應具有足夠長度且足夠明確以使假陽性 (false positives)減至最低。寡核苷酸較佳經標記以便其可在雜交於所筛選庫中之DNA之後可偵測。標記之方法為此項技術中所熟知，且包括使用放射性標記，如經32P標記之ATP、生物素化或酶標記。前述Sambrook等人提供雜交條件（包括中嚴格度及高嚴格度）。該等庫篩選方法所鑑別出之序列可與寄存於及獲自公用資料庫（諸如GenBank)或其他私人序列資料庫的其他已知序列比較及比對。可使用此項技術中已知及本文所述之方法測定分子限定區域内或全長序列上之序列一致性（胺基酸或核苦酸層面）。具有蛋白質編碼序列之核酸可藉由篩選所選cDNA或基因組庫，使用本文首次揭示之推斷之胺基酸序列，且若必要，使用如前述Sambrook等人所述之習知引子延伸程序以偵測可能不能逆轉錄為cDNA之mRNA的前驅物及加工中間物而獲得。 2.宿主細胞之選擇及轉型將宿主細胞用本文所述之用於產生抗FcRH5抗體之表現或選殖载體轉染或轉型，且培養於視需要改良以誘導啟動 147375.doc -295 - 201039846 子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。培養條件（諸如培養基、溫度、pH值及其類似條件）可由熟習此項技術者無需過度實驗即可進行選擇。一般而言，用於使細胞培養物之生產力最大化之原理、方案及實用技術可見於Mammalian Ce丨丨Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler編（IRL Press, 1991)及前述 Sambrook等人中。真核細胞轉染及原核細胞轉型（其意謂將DNA引入宿主中使得DNA可以染色體外形式或藉由染色體整合複製）之方法為一般技術者所已知，例如CaC〗2法、CaP〇4法、脂質體介導之方法、聚乙二醇/DMSO法及電穿孔法。視所用宿主細胞而定，使用適合於該等細胞之標準技術執行轉型。如前述Sambrook等人所述採用氯化妈之弼處理法或電穿孔法一般用於原核生物。將根癌土壤桿菌感染用於轉型某些植物細胞，如Shaw等人，

Gene，23:3 15 (1983)及 1989年 6月 29 日公開之 WO 89/05859 所述。對於無該等細胞壁之哺乳動物細胞，可採用Graham 及 van der Eb，Virology, 52:456-457 (1978)之磷酸 #5 沈澱法。哺乳動物細胞宿主系統轉染之通用態樣已描述於美國專利第4,399,216號中。通常根據乂&118〇1丨叩611等人，<1.

Bact.，130:946 (1977)及 Hsiao 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)之方法轉型於酵母中。然而，亦可使用其他將DNA引入細胞中之方法，諸如藉由核顯微注射、電穿孔、與完整細胞進行細菌原生質體融合或聚陽離 147375.doc -296- 201039846 子（例如聚凝胺（polybrene)、聚鳥胺酸（polyornithine))法。各種轉型哺乳動物細胞之技術參見Keown等人，Methods in Enzymology，185:527-537 (1990)及 Mansour 等人，Nature, 336:348-352 (1988)。適於選殖或表現本文之載體中之DNA的宿主細胞包括原核生物、酵母或更高級真核生物細胞。 a.原核宿主細胞適合之原核生物包括（但不限於）古細菌（archaebacteria) 及真細菌（eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸内菌科（Enterobacteriaceae)(諸如大腸桿菌）。各種大腸桿菌菌株可公開可得，諸如大腸桿菌K12菌株 MM294(ATCC 31,446);大腸桿菌 X1776(ATCC 31，537); 大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27,325)及K5 772(ATCC 53,635)。其他適合之原核宿主細胞包括腸内菌科，諸如埃希氏菌 (五π/zeWc/zk)，例如大腸桿菌，腸桿菌（五，歐文氏菌（五rwWa)，克雷伯氏菌（尤/eZmW/a)，變形桿菌 (Proiews) ’沙氏桿菌（以/mo邮/M)，例如鼠傷寒沙氏桿菌 (Sa/wowd/a ，沙雷氏菌（Serrorn’a)，例如黏質沙雷氏菌marcesca則），及志賀氏菌（57π·γ//<3)，以及芽胞桿菌（5aci7/〇，諸如枯草芽胞桿菌（β. 及地衣芽抱桿菌（5. 例如，1989年4月12曰公開之DD 266,710中所揭示之地衣芽孢桿菌41P)，假單胞菌 ’諸如綠膿桿菌（ρ· aerwgz·㈣扣），根瘤菌 ’ 透明顫菌（WkeoscH/a)，副球菌（Pflrflcoccws) 147375.doc -297- 201039846 及鏈黴菌（Sirepiomyce·?)。該等實例為說明性的而非限制性的。菌株W3 110為一種尤佳宿主或親本宿主，因為其為重組DN A產物酿酵之常見宿主函株。宿主細胞較佳分泌極少量之蛋白水解酶。舉例而言，菌株\V311〇(；Baehmami5

Cellular and Molecular Biology ’ 第 2卷（Washington，D.C.:

American Society for Microbiology, 1987)，第 1190-1219 頁；ATCC寄存編號27,325)可經修飾以實現編碼宿主之内源蛋白的基因的遺傳突變’該等宿主之實例包括大腸桿菌 W3110菌株1A2,其具有完整基因型;大腸桿菌W3110 菌株9E4，其具有完整基因型iod ;大腸桿菌W3 110 菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整基因型p/H £75 769 (iegP ；大腸桿菌 W3110 菌株37D6，其具有完整基因型？〇«3/?^3户/2〇^(五/5(^1^尸-Mc) "vG 大腸桿菌 W3110 菌株 40B4，其為具有非卡那黴素（kanamycin)抗性degP缺失突變之菌株37D6 ;具有基因型W3110 Δ/ΤζμΧ (Δίοπ為）pir3 /ac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 之大腸桿菌 W3110菌株33D3(美國專利第5,639,635號）及1990年8月7曰頒佈之美國專利第4,946,783號中所揭示之具有突變周質蛋白酶之大腸桿菌菌株。其他菌株及其衍生物（諸如大腸桿菌294(ATCC 31，446)、大腸桿菌B、大腸桿菌人1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌1^308(八丁(：€ 31,608))亦適合。該等實例為說明性的而非限制性的。構築任何上述具有限定基因型之細菌之衍生物的方法為此項技術中已知且描述於例如 147375.doc -298- 201039846

BaSS 等人，Proteins，8:309-314 (1990)中。一般而言，需要^慮細菌細胞中複製子之複製性來選擇適當細菌。舉: 而言’當使用諸如pBR322、pBR325、pACYCm或 PKN410之熟知質體提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌 ^沙氏桿菌種可適用作宿主。通常，宿主細胞應分泌極少量之蛋白水解酶，且宜將其他蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。或者，活體外選殖方法（例如pCR或其他核酸聚合酶反應）為適合的。〇夺可於、、’田菌中產生全長抗體、抗體片段及抗體融合蛋白質，尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時，諸如當治療抗體結合於細胞毒性劑（例如毒素）且免疫結合物自身展示腫瘤細胞破壞之有效性時。全長抗體在循環中具有較長半衰期。在大腸桿菌中產生較快且更成本有效。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，例如參見u s 5,648,237(Carter等人）、U.s. 5,789，199(J〇ly 等人）、及 u.s. 5,840 523(Simm〇ns Q 等人）（其描述轉譯起始區（TIR)及使表現及分泌最佳化之信號序列），此等專利以引用的方式併入本文中。表現之後，將抗體於可溶性部分中自大腸桿菌細胞糊狀物（ceu paste)为離且可視同型而定例如經由蛋白質a或〇管柱純化可類似於純化表現於例如CHO細胞中之抗體之方法進行最終純化。 b·真核宿主細胞除了原核生物之外，真核微生物（諸如絲狀真菌或酵母）亦為適用於編碼抗FcRH5抗體之載體的選殖或表現宿主。 147375.doc -299- 201039846 釀酒酵母（Sacc/mrow少ces cereWike)為常用較低級真核宿主微生物。其他真核宿主微生物包括粟酒裂殖酵母 (tSc/n'zosacc/zaromyces pomZ>e)(Beach及Nurse，Nature, 290: 140 [1981] ; 1985年5月2曰公開之EP 139,383);克魯維拉菌（尺/«>^67"〇»2>^615)宿主（美國專利第4,943,529號；卩1661：等人，Bio/Technology， 9:968-975 (1991))，諸如乳酸克魯維拉菌（尺· /π"··5)(Μλν98-8(：，CBS683，CBS4574 ; Louvencourt 等人，J. Bacteriol·，154(2):737-742 [1983])、脆壁克魯維拉菌/rag//^)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維拉菌（[ Z?w/供ricwsXATCC 16,045)、威克克魯維拉菌（尺· wickeramii) yrCC ❼、瓦提克魯維拉菌（/：· wdn7)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維拉菌（尺.i/r〇"S〇pM/arMm)(ATCC 36,906 ; Van den Berg等人，Bio/Technology, 8:135 (1990))、而寸熱克魯維拉菌（欠· i/iermoio/era?w)及馬克斯克魯維拉菌（尺·》iarx/awws); 耶氏酵母（_yarro>Wa)(EP 402,226);曱醇酵母（Pic/n'a 183,070 ; Sreekrishna等人，J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]);念珠菌（Ca/7 山·ί/α);里氏木徽（TWc/zc^erma reeskXEP 244,234);粗链脈孢菌（iVewrospora crau^XCase等人，Proc. Natl· Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979])；許旺酵母（Sc/zwawn/omyces)，諸如西方許旺酵母 {Schwanniomyces occ/dewia/bX 1990 年 10 月 3 1 曰公開之 EP 394,5 38);及絲狀真菌，諸如脈孢菌（TVewrospora)、青黴菌 (/^m’cz7"ww)、彎頸黴菌（7b/>^oc/aii/wm)( 1 99 1 年 1 月 1 0 曰公開之WO 91/00357)及曲黴菌似）宿主，諸如溝巢 147375.doc 300· 201039846 麯徽（儿則Wa”O(Ballance等人，Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983] ; Tilburn 等人，Gene, 26:205-221 [1983] ; Yelton 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及黑麯黴（儿 m_ger)(Kelly 及 Hynes，EMBO J·, 4:475-479 [1985])。嗜曱醇酵母適用於本文，且包括（但不限於）能夠生長於曱醇上選自由漢森酵母（//amemy/fl)、念珠菌（Candida)、克勒克酵母（尺、畢赤酵母（/*ζ·ί?/π·β)、酵母菌、球擬酵母 (Torulopsis)反乡工酵母（Rhodotorula)組成之屬的酵母。作為此類酵母之實例的一系列特定種可見於C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs，269 (1982)中 ° 適用於表現糖基化抗FcRH5抗體之宿主細胞源自多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括昆蟲細胞（諸如果蠅 S2及夜蛾Sf9)以及植物細胞（諸如棉花、穀類、馬鈴薯、大豆、矮牵牛、番茄及菸草之細胞培養物已鑑別出多種桿狀病毒株及變異體及來自諸如草地黏蟲（办odopiera /Vwgz'peri/a)(毛蟲）、埃及伊蚊少p")(蚊子）、白紋伊蚊（dedei albopictus)(故子）、黑腹果繩（Ζ)Γ〇·5〇_ρ/π7α (果蠅）及家蠶（如m紗;c mori)之宿主的相應允許昆蟲宿主細胞。多種用於轉染之病毒株可公開可得，例如苜蓿銀紋仪蛾核型多角體病毒 NPV)之L-1變異體及家蠶npv之Bm-5病毒株，且該等病毒可用作本發明之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。然而’已極大關注脊椎動物細胞，且在培養物（組織培 147375.doc -301- 201039846 養物）中使脊椎動物細胞繁殖已成為常規程序。有用之哺乳動物宿主細胞株之實例為由SV40轉型之猴腎CV1株 (COS-7，ATCC CRL 1651);人類胚腎株（293細胞或經次選殖以於懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人， Proc· Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));小鼠足細胞 (TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76， ATCC CRL-1587);人類子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅大鼠肝細胞（buffalo rat liver cell，BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2， HB 8065);小鼠乳房腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51); TRI 細胞（Mather 等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤株（Hep G2)。將宿主細胞用上述用於產生抗FcRH5抗體之表現或選殖載體轉型，且培養於視需要經改良以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。 3.選擇及使用可複製之載體為重組產生本發明之抗體，分離編碼該抗體之核酸（例如cDNA或基因組DNA)且插入可複製載體中進行進一步選殖（擴增DNA)或表現。可易於分離編碼抗體之DNA且使用 147375.doc 302· 201039846 習知程序（例如+ 因特異性纟± a藉由使用@夠與編碼抗體4鏈及輕鏈之基體。載體:、1的寡核芽酸探針）進行測序。可使用多種载言，擇部分取決於欲使用之宿主細胞。一般而載體可例如=有核(，乳動物)來源。適當之杪酿* #貝體、病毒粒子或噬菌體形式。使：此頂二列可藉由多種程序插入載體中。-般而言， Ο 切酶位點/中已知之技術將dna插入適當限制性核酸内夕.。载體組分一般包括（但不限於）以下中之一或一 ^序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子兀件啟動子及轉錄終止序列。構築含有此等組分中之一或多者的適合載體採用熟習此項技術者已知之標準接合技術。二cRH5不僅可直接重組產生，且亦可以與異源多狀之融口夕肽形式產生，該異源多肽可為在成熟蛋白質或多肽之 N末端具有肖異性裂解位點之信號序％或其他多月太。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為插入载體中^ 編碼抗FcRH5抗體之DNA的一部分。信號序列可為選自例如以下之群的原核信號序列：鹼性磷酸酶、青黴素酶、 ipp或熱穩定腸毒素π前導序列。對於酵母分泌，信號序列可為例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列（包括酵母囟及克魯維拉菌α因子前導序列，後者描述於美國專利第 5,010，182號中）或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌（(： flWcaws)葡糖澱粉酶前導序列（1990年4月4日公開之 362，179)或1990年11月15日公開之WO 90/13646中所述之 147375.doc 303 · 201039846 信號。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號序列直接分泌蛋白質，諸如來自相同或相關物種之分泌多肽的信號序列以及病毒分泌前導序列。 a.原核宿主細胞可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之多肽組分的聚核苷酸序列。所需聚核苷酸序列可自抗體產生細胞（諸如融合瘤細胞）为離且測序。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技術合成聚核苷酸。獲得之後，將編碼多肽之序列插入能夠在原核宿主中複製及表現異源聚核苷酸之重組載體中。此項技術中可獲得且已知之多種載體可用於本發明之目的。適當載體之選擇主要取決於欲插入載體中之核酸的尺寸及欲用載體轉型之特定宿主細胞。各載體視其功能 (擴增或表現異源聚核苷酸或擴增與表現異源聚核苷酸）及其與其所存在之特定宿主細胞之相容性而定含有各種組分。一般而言，將源自與宿主細胞相容之物種的含有複製子及控制序列的質體載體與此等宿主結合使用。表現载體與選殖載體均含有使得载體可在一或多個所選宿主細胞中複製的核酸序列以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇的標記序列。對於多種細菌、酵母及病毒熟知該等序列。含有編碼胺节料（ampieillin，Amp)及四環素⑽咖灿加，τ⑷ 抗性之基因且因此提供鑑別已轉型細胞之簡易方式的質體 PBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏陰性細菌，恥質體起點適用於酵母，且各種病毒起點(SV4〇、多瘤、腺病 147375.doc •304· 201039846 毋、VSV或BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。 PBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾以含有微生物生物體用於表現内源蛋白可使用之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例詳細描述於Carter等人’美國專利第5,648,237號中。另外，與宿主微生物相容之含有複製子及控制序列的噬菌體載體可與此等宿主結合用作轉型载體。舉例而言，噬菌體（諸如XGEM.TM·-11)可用於製備可用以轉型易感宿主細胞（諸如大腸桿菌LE392)的重組載體。本發明之表現載體可包含編碼各多肽組分之兩個或兩個以上啟動子-順反子對。啟動子為位於順反子上游且調節其表現的非轉譯調節序列。原核啟動子通常分成兩類：誘導型及組成型啟動子。誘導型啟動子為在其控制下響應於培養條件變化（例如營養物之存在或不存在或溫度變化）起始順反子之增加水準之轉錄的啟動子。熟知多種潛在宿主細胞可識別之大量啟動子。所選啟動子可藉由經由限制酶消化自來源DNA移除啟動子且將該經分離啟動子序列插入本發明之載體中而可操作地連接於編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。天然啟動子序列與多種異源啟動子均可用於直接擴增及/或表現標靶基因。在一些實施例中，使用異源啟動子，因為相較於天然標靶多肽啟動子’其一般使表現之標靶基因轉錄更多且產率更高。熟知多種潛在宿主細胞可識別之啟動子。適用於原核宿主之啟動子包括PhoA啟動子、β-半乳聚糖酶及乳糖啟動子 147375.doc -305- 201039846 系統[Chang 等人 ’ Nature, 275:615 (1978) ; Goeddel 等人，Nature, 281:544 (1979)]、鹼性磷酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統[Goeddel, Nucleic Acids Res.，8:4057 (1980); EP 36,776]及雜合啟動子（諸如tac[deBoer等人，Proc. Natl. Acad· Sci· USA，80:21-25 (1983)]或trc 啟動子）。用於細菌系統之啟動子亦應含有可操作地連接於編碼抗Fcrh5抗體之DNA的 >少林-達卡諾（Shine-Dalgarno，S.D.)序列。然而’其他在細菌中具有功能之啟動子（諸如其他已知細菌或嗟菌體啟動子）亦適合。其核苷酸序列已公開，從而使得熟練技術者可操作地使用連接子或接頭提供任何所需限制位點將其接合於編碼標乾輕鏈及重鍵之順反子 (Siebenlist等人 ’（1980) Cell 20: 269)。在本發明之一態樣中，重組載體内之各順反子包含引導所表現多肽易位穿過膜之分泌信號序列組分。一般而言，仏號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中之標靶多肽DNA的一部分。經選擇用於本發明之目的的信號序列應為值主細胞可識別且加工（亦即由信號肽酶裂解）之信號序列。對於不能識別且加工異源多肽之天然信號序列的原核佰主細胞而言，該信號序列經例如選自鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定腸毒素II(STII)前導序列、LamB、 PhoE、PelB、〇mpA及MBp之群的原核信號序列取代。在本發明之一實施例中，用於表現系統之兩個順反子之信號序列為STIIk號序列或其變異體。在另一態樣中，可在宿主細胞之細胞質中產生本發明之 147375.doc -306- 201039846 免疫球蛋白’且因此並不需要各順反子内存在分泌信號序列。在此情況下’表現免疫球蛋白輕鏈及重鏈、摺疊且組裝以於細胞質内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株 (例如大腸桿菌irW菌株）提供有助於二硫鍵形成之細胞質條件’從而使得可正確摺疊且組裝所表現之蛋白質次單元。Proba及 Pluckthun Gewe, 159:203 (1995)。本發明提供一種表現系統’其中表現之多肽組分的數量比率可經調節以使分泌且正確組裝之本發明抗體的產率最大化。至少部分藉由同時調節多肽組分之轉譯強度實現該調節。一種調節轉譯強度的技術揭示於Simmons等人，美國專利第5,840,523號中。其利用順反子内轉譯起始區（TIR)之變異體。對於既定TIR ’可以一定範圍之轉譯強度產生一系列胺基酸或核酸序列變異體，從而提供調節此因素以獲得所需表現量之特定鏈的適宜方式。TIR變異體可藉由引起可改變胺基酸序列之密碼子變化的習知突變誘發技術產生’但核苷酸序列之沉默變化較佳❶TIR改變可包括例如莎林-達卡諾序列之編號或間隔改變以及信號序列改變。一種產生突變信號序列之方法為在編碼序列之起始端產生「密碼子庫」，其不改變信號序列之胺基酸序列（亦即變化沉默）。此可藉由改變各密碼子之第三核苷酸位置實現；另外，一些胺基酸（諸如白胺酸、絲胺酸及精胺酸）具有多個第一及第二位置，此可在產生庫時增加複雜性。此突變誘發方法詳細描述於Yansura等人，（1992) Μ五 147375.doc •307- 201039846 c⑽panion to Methods in Enzym〇! 4151七名中。較佳產生-組載體，其中之各順反子具有一定範圍之 ™強度。此有限組提供各種TIR強度組合下各鏈之表現量以及所需抗體產物之產率的比較。道強度可如sim_s 等美國專利第5,840,523號詳細描述藉由定量報導基因之表見量來測定。基於轉譯強度比較，選擇所需個別丁爪以組合於本發明之表現載體構築體中。 b·真核宿主細胞載體組分一般包括（但不限於）以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。 (Λ)信號序列組分用於真核宿主細胞之載體亦可含有在所關注成熟蛋白質或多肽之N末端具有特異性裂解位點的信號序列或其他多肽所選異源信號序列較佳為宿主細胞可識別且加工（亦即由信號肽酶裂解）之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列（例如疱疹單純型gD信號）。該前驅區之DNA在閱讀框架中接合於編碼抗體之DNA。 (2)複製起點一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分。舉例而言，可通常僅使用sv4〇起點，因為其含有早期啟動子。 (勾選擇基因組分 147375.doc -308- 201039846 表現及選殖載體通常含有選擇基因，亦稱作可選標記。典型選擇基因編碼（a)對抗生素或其他毒素（例如胺苄西林、新黴素（neomycin)、甲胺喋呤或四環素）賦予抗性， (b)補充營養缺陷，或（c)提供不可自複合培養基中獲得之關鍵營養物（例如對於芽胞桿菌為編碼〇_丙胺酸消旋酶之基因）的蛋白質。選擇方案之一實例利用藥物遏止宿主細胞之生長。用異源基因成功轉型之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白質且因此在選擇方案中倖存下|。此顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素（hygromycin)。適用於哺乳動物細胞之可選標記的一實例為使得可鑑別能夠競爭吸收編碼抗FcRH5抗體之核酸的細胞的標記，諸如DHFR或胸苷激酶、金屬硫蛋白1及„(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因）、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶等。當採用野生型DHFR時，適當之宿主細胞為如Urlaub等人，

Proc. Natl· Acad· Sci· USA，77:4216 (1980)所述製備及繁殖之缺乏DHFR活性之CHO細胞株（例如ATCC CRL_9()96)。舉例而言，用DHFR選擇基因轉型之細胞首先藉由將所有轉型體在含有甲胺嗓呤（Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑）之培養基中培養而鑑別。或者，可藉由在含有針對可選標紀之選擇試劑（諸如胺基醣苷抗生素，例如卡那黴素、新徽素或G41 8)的培養基中生長細胞來選擇用編碼抗體、野生型 DHFR蛋白及另一可選標記（諸如胺基醣苷3，_嶙酸轉移酶 (ΑΡΗ))的DNA序列轉型或共轉型之宿主細胞（尤其含有内 147375.doc -309- 201039846 源DHFR之野生型宿主）。例如參見美國專利第4,965，丨％號。適用於酵母之選擇基因為存在於酵母質體YRp7中的^ 基因[Stinchcomb等人，Nature，282:39 (1979); Kingsman 等人 ’ Gene, 7:141 (1979) ; Tschemper等人，Gene，10:157 (1980)]。trpl基因提供在色胺酸中缺乏生長能力的酵母突變株（例如ATCC第44076號或PEP4-1)之選擇標記[jones， Genetics, 85:12 (1977)]。 (4)啟動子組分表現及選殖載體通常含有可操作地連接於編碼抗FcRH5 抗體之核酸序列的啟動子以引導mRNA合成。熟知可由多種潛在宿主細胞識別之啟動子。幾乎所有真核基因均具有位於轉錄起始位點上游約25至 3 0個鹼基處的富AT區。另一於許多基因之轉錄開始處上游 70至80個鹼基處發現的序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。大多數真核基因的3,末端為AATAAA序列，該序列可能為向編碼序列之3’末端添加poly A尾的信號。所有此等序列均適於插入真核表現載體中。適用於酵母宿主之啟動子序列之實例包括3_磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等人，j. Biol. Chem.，255..2073 (1980)]或以下之其他糖酵解酶[Hess等人，J, Adv. Enzyme Reg” 7:149 (1968) , Holland，Biochemistry, 17:4900 (1978)]的啟動子：諸如烯醇酶、甘油醛-3_磷酸去氫酶、己糖激酶、丙酮酸去叛酶、碟酸果糖激酶、葡萄糖_6_鱗酸異構酶、3_ 147375.doc -310- 201039846 磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶及葡糖激酶。作為具有轉錄受生長條件控制之額外優勢之誘導型啟動子的其他酵母啟動子為用於以下之啟動區：醇去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛磷酸去氯酶及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶。適用於酵母表現之載體及啟動子進一步描述於 73,657中。在哺礼動物宿主細胞中自載體轉錄抗FCRH5抗體例如可藉由獲自以下之啟動子控制：病毒（諸如多瘤病毒、禽痘病毒（1989年7月5日公開之敗2,211，5〇4)、腺病毒（諸如腺病毒2)、牛乳突狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒4〇(sv4〇))基因組、異源哺乳動物啟動子（例如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子）及熱休克啟動子，只要該等啟動子與宿主細胞系統相容即可。〇 SV40病毒之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV4〇病毒複製起點之SV4〇限制片段形式獲得。人類細胞巨大病毒之即刻早期啟動子宜以Hindlll E限制片段形式獲得。美國專利第4,419,446號巾揭示—種使科乳突狀瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統。美國專利第4,6〇1，978號中描述该系 '統之改良。_於在危療單純型病#之胸普激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表現人類卜干擾素cDNA，亦參見 Reyes等人，297:598 6〇1 (1982)。或者，可使 147375.doc -311 · 201039846 用勞斯肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。 (5) 增強子元件組分由較尚級真核生物轉錄編碼抗jtcrH5抗體之DNA可藉由將增強子序列插入載體中增強。增強子為DNa之順式作用元件，其通常為約10至300 bp，且作用於啟動子以增強其轉錄。現今已知多種來自哺乳動物基因（球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素）之增強子序列。然而’通常使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括複製起點（bp 100-270)後側之SV40增強子、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、複製起點後側之多瘤增強子及腺病毒增強子。關於活化真核生物啟動子之增強元件亦參見Yaniv, 297:17-18 (1982)。增強子可拼接於載體中抗FcRH5 抗體編碼序列之位置5’或3’處，但較佳位於啟動子之位點5, 處。 (6) 轉錄終止組分用於真核宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞）之表現载體亦含有終止轉錄及穩定mRNA所必需的序列。該等序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA之5'及有時3,非轉譯區。此等區含有轉錄為編碼抗FCRH5抗體之mRNA之非轉譯部分中之聚腺普酸化片段的核㈣片&。_種有用之轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見w〇94/u〇26及其中所揭示之表現載體。 147375.doc -312- 201039846 適用於改適以在重組脊椎動物細胞培養物中合成抗 FcRH5抗體的其他方法、載體及宿主細胞描述於Gething等人 Nature, 293 :620-625 (1981); Mantei 等人，Nature, 281:40-46 (1979) ; EP 117,060 ;及 EP 117,058 中。 4.培養宿主細胞可將用於產生本發明之抗FcRH5抗體的宿主細胞培養於多種培養基中。 a.原核宿主細胞使用於產生本發明多肽之原核細胞在此項技術中已知且適用於培養所選宿主細胞之培養基中生長。適合培養基之貫例包括魯利亞培養液（luria br〇th，LB)加上必需之營養補充d在些實施例中，培養基亦含有基於構築表現載體而選擇的選擇試劑’以選擇性地使得含有表現載體之原核細胞可生長。舉例而言，向培養基中添加㈣西林以使表現胺苄西林抗性基因之細胞生長。亦可包括適當濃度之除碳、氮及無機魏鹽來源以外的任何必*補充劑，其係單獨引人或以與另—補充劑或培養基之奶。物形式（諸如複合氮源）引人。培養基視情況可含有或夕種選自由麵胱甘狀、半脱胺酸、脱胺、魏基乙酸鹽（thi〇glyC〇Uate)、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇組成之群的還原劑。在適合之溫度下典盖；^ r心蚕原核宿主細胞。對於大腸桿菌生長’舉例而言’較伟：田疮 1至，服度介於約20°C至約39°C，更佳約 25°C至約37°C範圍内，i s $ 甚至更佳為約30°C。培養基之pH值 147375.doc -313 < 201039846 主要視宿主生物體而定’可為介於約5至約9之任何pH值。對於大腸桿菌，pH值較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約 7.0。若在本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適用於活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一態樣中，使用PhoA啟動子控制多肽轉錄。因此，在磷酸鹽限制性培養基中培養經轉型宿主細胞以進行誘導。磷酸鹽限制性培養基較佳為C.R.A.P培養基（例如參見simm〇ns等人，/. (2002)，263:133-147)。如此項技術中已知，可根據所用載體構築體使用多種其他誘導劑。在-實施例中，所表現之本發明多肽分泌於宿主細胞之周質中且自周質回收。蛋白質回收通常包括破壞微生物， -般藉由諸如滲透衝擊、音波處理或溶解之方式。細胞破壞之後，藉由離心或過滤移除細胞碎片或全細胞。蛋白質可例如藉由親和力樹脂層析進—步純化。或者，蛋白質可輸送至培養基中且自其中分離。 P 了自培養物中移除細胞且過據培養物上清液，且濃端以4 ^ ，辰縮以進—步純化所產生之蛋白 ^ 。可使用通常已知之方法丨4 去（诸如聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)及西方墨點分析法（We 且鑑別所表現之多肽。 nblGtassay))進—步分離 =發明之一態樣中’藉由酸酵製程大量產生抗體。可楛_1古.，酵耘序產生重組蛋白。大規棋酸酵具有至少1〇〇〇公升之交曰公升之六旦^ ^ 垔，較佳約M00至100,000 △升之合里。此等醱酵史用搜#葉輪分配氧氣及營養 147375. doc -314- 201039846 物，尤其葡萄糖（較佳之碳源/能源）。小規模醱酵一般係指谷S:不超過約100公升且可介於約升至約1〇〇公升範圍内之醱酵罐中之醱酵。在酸酵製程中，誘導蛋白質表現通常在細胞已在適合條件下生長至所需密度（例如〇D55G為約丨8〇_22〇，在此階段細胞處於穩定期初期）之後起始。如此項技術中已知且如上所述，可根據所用載體構築體使用多種誘導劑。細胞可在誘導之前生長較短時段。通常誘導細胞約12-50小時，但 C) 亦可使用較長或較短誘導時間。為改良本發明多肽之生產產率及品質，可改良各種醱酵條件。舉例而言，為改良所分泌抗體多肽之正確組裝及槽疊’可使用過度表現伴隨蛋白（諸如Dsb蛋白（DsbA、 DsbB、DsbC、DsbD及或DsbG)或FkpA(—種具有伴隨蛋白 /舌性之狀基脯胺酿基順，反-異構酶））之其他載體共轉型宿主原核細胞。已顯示伴隨蛋白有助於細菌宿主細胞中所產 ◎ 生之異源蛋白的正確摺疊及溶解。Chen等人，（1999) J C/zem 274:19601-19605 ; Georgiou等人，美國專利第 6,083,715 號；Georgiou等人，美國專利第 6,〇27,888 號；

Bothmann及Pluckthun (2000) J.扣〇/· 275:17100-17105 ; Ramm及Pluckthun (2000) J. CTzew. 275:17106-17113 ; Arie 等人，（2001) Mo/. 39:199-210。為使所表現異源蛋白（尤其蛋白水解敏感性蛋白）之蛋白水解減至最小’缺乏蛋白水解酶之某些宿主株可用於本發明。舉例而言，宿主細胞株可經修飾以實現編碼已知細菌 147375.doc • 315- 201039846 蛋白酶（諸如蛋白酶ΠΙ、0mpT、DegP、Tsp、蛋白酶1、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶¥1及其組合）之基因遺傳突變。可利用一些缺乏大腸桿菌蛋白酶之菌株且其描述於例如前述Joly等人，（1998)，Georgiou等人，美國專利第5 264 365 號·’ Georgia等人，美國專利第5,5〇8，192號；Hara等人，

Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)中。在一實施例中，使用缺乏蛋白水解酶且用過度表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株作為本發明表現系統中之宿主細胞。 b ·真核宿主細胞市售培養基，諸如哈姆氏F10(Ham，s F10)(Sigma)、最低必需培養基（(MEM)，（Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基（Dulbecco，s Mc)dified Eagie，s Medium，（DMEM)，（Sigma))適用於培養宿主細胞。此外 ’ Ham等人，Meth. Εηζ· 58:44 (1979)，Barnes等人， Anal. Biochem. 102:255 (1980)，美國專利第 4,767,7〇4 號’第 4,657,866號；第 4,927,762號；第 4,560,655號；或第 5,122,469號；WO 90/03430 ; WO 87/00195 ;或美國專利參考案30,985中所述之任何培養基亦可用作宿主細胞之培養基。任何此等培養基均可視需要補充激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸如氯化鈉、氣化鈣、氣化鎂及磷酸鹽）、緩衝劑（諸如 HEPES)、核苦酸（諸如腺苦及胸苷）、抗生素（諸如 GENTAMYCIN™藥物）、微量元素（定義為無機化合物，通 147375.doc -316- 201039846 常以在微莫耳濃度範圍内之最終濃度存在）及葡萄糖或等效能源。亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度的任何其他必需補充劑。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為先前用於選用於表現之宿主細胞的條件且應對於一般技術者顯而易見。 5.偵測基因擴增/表現可在樣品中例如藉由習知南方墨點法（Southern blotting)、北方墨點法（Northern blotting)定量mRNA之轉錄[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77:5201-5205 (1980)]，點潰墨法 (DNA分析），或使用適當標記之探針基於本文提供之序列原位雜交而直接測量基因擴增及/或表現。或者，可採用能識別特定雙鏈體（包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體及DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體）之抗體。抗體又可進行標記，且可進行分析，其中雙鏈體結合於表面，使得於表面上形成雙鏈體之後，可偵測結合於雙鏈體之抗體的存在。或者，基因表現可藉由免疫學方法（諸如細胞或組織切片之免疫組織化學染色及細胞培養物或體液之免疫組織化學分析）測量以直接定量基因產物之表現。適用於樣品液之免疫組織化學染色及/或分析的抗體可為單株或多株抗體，且可在任何哺乳動物體内製備。抗體宜經製備而針對天然序列FcRH5多肽，或針對基於本文提供之DNA序列的合成肽，或針對融合於FcRH5 DNA且編碼特異性抗體抗原決定基之外源序列。 147375.doc -317- 201039846 6.純化抗FcRH5抗體可自培養基或宿主細胞溶解物中回收諸多形式之抗 FcRH5抗體。若其與膜結合，則可使用適合之清潔溶液（例如Triton-X 100)或藉由酶促裂解自膜釋放。用於表現抗 FcRH5抗體之細胞可藉由各種物理或化學方法（諸如凍融循環、音波處理、機械破壞或細胞溶解劑）破壞。可能需要自重組細胞蛋白或多肽純化抗FcRH5抗體。以下程序為適合之純化程序的實例：於離子交換管柱上分級分離；乙醇沈澱；逆相HPLC ;二氧化矽層析或陽離子交換樹脂層析（諸如DEAE);層析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨沈澱；使用例如葡聚糖凝膠G-75凝膠過濾；蛋白質A瓊脂糖管柱移除污染物（諸如IgG);及金屬螯合管柱結合抗抗體之抗原決定基經標記形式。可採用各種蛋白純化方法，且該等方法為此項技術中已知且描述於例如 Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ϊ Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)中。所選純化步驟取決於例如所用製造程序及所產生特定抗FcRH5抗體之性質。當使用重組技術時，抗體可於細胞内、周質空間中產生或直接分泌於培養基中。若抗體於細胞内產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾移除微粒碎片（宿主細胞或溶解片段）。Carter等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992)描述一種分離分泌於大腸桿菌周質空間之抗體的程序。簡言之，經約30分鐘在乙酸鈉（pH 3.5)、EDTA及苯基曱基磺醯 147375.doc -318- 201039846 基氟（PMSF)存在下將細胞糊狀物融化。可藉由離心移除細胞碎片。若抗體係分泌於培養基中，則一般首先使用市售蛋白i辰縮過遽器（例如Amicon或Millipore Pellicon超濾、單元）濃縮该4表現系統之上清液。可於任何上述步驟中包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解且可包括抗生素以防止外來污染物生長。由該等細胞所製備之抗體組合物可使用例如羥填灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化，其中親和層析為較佳純化技術。蛋白質A作為親和力配位體之適合性取決於物種及存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域的同型。蛋白貝A可用於純化基於人類、丫2或丫4重鏈的抗體 (Lindmark# 人，j. immun〇1. Meth. 62:1 13 (1983))。蛋白質G推薦用於所有小鼠同型及人類丫3(〇11^等人，EMB〇 J· 5:15671575 (1986))。親和力配位體所連接之基質最常為瓊脂糖，但亦可利用其他基質。相較於使用瓊脂糖可達 Q 成之流速及處理時間，機械穩定基質（諸如可控孔隙玻璃或聚（苯乙稀二乙烯基）苯）可達成更快之流速及更短之處理時間。若抗體包含CH3域，則Bakerb〇nd ΑΒχτΜ樹脂^ 丁· Baker，PhUlipsburg，NJ)適用於純化。視欲回收之抗體而疋’亦可用#❿蛋白質純化技術，諸如離子交換柱上分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLc、二氧化矽層析、肝素 SEPHARQSEtm層析、陰離子或陽離子交換樹脂（諸如聚天冬胺酸管柱）層析、層析聚焦、SDS_PAGE及硫酸銨沈澱。任何初步純化步驟之後，可使用pH值在約2.5-4.5之間的 147375.doc -319· 201039846 溶離緩衝液對包含所關注抗體及污染物之混合物進行低pH 值疏水性相互作用層析，較佳在低鹽濃度（例如約0-0.25 Μ 鹽）下執行。 G.醫藥調配物本發明之抗體-藥物結合物（ADC)可藉由任何適合於欲治療病狀之途徑投與。ADC通常非經腸（亦即輸注、皮下、肌肉内、靜脈内、皮内、鞘内及硬膜外）投與。為治療此等癌症，在一實施例中’抗體-藥物結合物經由靜脈内輸注投與。經由輸注投與之劑量範圍為每劑量約 1 pg/m2至約1 〇,〇〇〇 pg/m2 ,—般每週一次劑量總共一次、兩次、三次或四次劑量。或者，劑量範圍為約i 至約 1000 gg/m2，約 1 μ§/ηι2至約 8〇〇 μ§/ιη2，約}叫化2至約 _ ，約i μβ/ηι2至約4〇〇 pg/m2，約1〇叫化2至約 μβ/π^，約10 pg/m2至約 300 ^/m2,約 10 吒/切2至约 pg/m2 ’及約i μ§/ιη2至約2〇〇 ^/m2。劑量可如下投與：每曰一次，每週-次，每週多次但少於每日—次，每月、多次但少於每曰一次，每月多次但少於每週—次，每月一次或以緩解或緩和疾病之症狀。可以任何所揭示間隔持續技樂，直至所治療之淋巴瘤、白灰病之腫瘤或症狀減輕。可在症狀減輕或緩解之後持續解藉由該持續投藥而延長。 -中錢輕或緩本發明亦提供—種緩和自體免疫罹串、自舻&、广— <万去’其包含向〜免疫疾病之患者投與治療有效任一者之人龆儿人®之刖述實施例中者之人類化⑽抗體-藥物結合物。在較佳實施例 147375.doc -320 - 201039846 中，杬體係靜脈内或皮下投盥。 , 2 ^抗體-樂物結合物係以每則里約1 Mg/m2至約1〇〇 2 θ, g/m粑圍内之劑量靜脈内投盥， =料實施财’劑量為⑽至約50。一心劑曰一下：與’母曰一*，每週-次，每週多次但少於每 :二每月多次但少於每曰-次，每月多次但少於每週

或«投與以緩解或緩和疾病之症狀。可所揭示間隔持續投藥，直至緩解或緩和所治療之自 a I疾病之症狀。可在症狀緩解或緩和之後持續投藥，其中該緩和或緩解藉由該持續投藥而延長。本發明亦提供一種治療3細胞病症之方法，其包含向罹。、’田胞病症（諸如B細胞增殖病症（包括（但+限於）淋巴瘤 :白血病))或自體免疫疾病之患者投與治療有效量之前述實=例中任_者之人類化13G9抗體，該抗體並不結合於細胞毋性分子或可偵測分子。抗體通常以約！盹^2至約1〇〇〇 mg/m之劑量範圍投與。在一態樣中，本發明另外提供如下醫藥調配物，其包含至少一種本發明之抗FcRH5抗體及/或至少一種其免疫結合物及/或至少一種本發明之抗體_藥物結合物。在些實施例中，醫藥調配物包含（丨）本發明之抗體及/或其免疫結合物，及（2)醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中’醫藥調配物包含（1)本發明之抗體及/或其免疫結合物，及視情況存在之（2)至少另一種治療劑。其他治療劑包括（但不限於）下述治療劑。ADC通常非經腸（亦即輸注、皮下、肌肉内、靜脈内、皮内、鞘内及硬膜外）投與。 147375.doc -321- 201039846 根據本發明使用之治療調配物（包含抗FcRH5抗體或 FCRH5免疫結合物）藉由將具有所需純度之抗體或免疫結合物與視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑（Remington’s Pharmaceutic^ Sciences 第16版，〇s〇1 Α·編(1980))混合製備成凍乾調配物或水溶液形式以供儲存。可接欠之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者係無毒的，且包括：緩衝劑，諸如乙酸鹽、 Tds、磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑（諸如氣化十八烷基二甲基苯甲基銨，乳化六烴季錢；氯化苯甲煙键、氣化苯甲㈣ (benzethonium chl〇ride);苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯曱酸烧基醋’諸如對經苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶盼，間苯一盼，環己醇；3_戊醇；及間甲盼低分子量 (小於約10個殘基）多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基魷，諸如甘胺酸、麵胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;張力調節劑，諸如海邊糖及氣化鈉；冑，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；|面活性劑’諸如聚山梨醇酯；成鹽相對離子諸如鈉，金屬錯合物（例如鋅蛋白錯合物）；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEEN⑧、pLUR〇NICS⑧或聚乙二醇（PEG)。欲用於活體内投藥之醫藥調配物一般無菌。此易於藉由經由無菌過濾臈過濾實現。 147375.doc 201039846 本文之調配物亦可含有-種以上所治療之特㈣應症所必需的活性化合物，較佳為具有彼此並無不利影響之互補活性的活性化合物°舉例而言，除抗秘邮體以外，在一種調配物中可能需要包括另-抗體，例如結合㈣出多狀上之不同抗原決定基的第：抗&聰抗體或針對竿另一標無之抗體（諸如影響特定癌症生長之生長因子）。或者或另外’組合物可另外包含化學治療劑、細胞毒性劑、細胞 Ο

激素、生長抑制劑、抗激素劑及/或保心藥。該等分子適合地以有效達成所欲目的之量組合存在。 ί生成刀亦可已埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊（分別例如經甲基纖維素微勝囊或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中；包埋於膠態藥物傳遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中，或包埋於巨乳液中。該等技術揭示於 Remingtons Pharmaceutical Sciences · f 16^ · Osol, A. 編（1980)中。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之S1體疏水性聚合物的半滲透性基質，該等基質呈成型物品（例如膜或微膠囊）形式。持續釋放基質之實例包括聚醋、水凝膠（例如，聚（甲基丙烯酸2_羥乙酯）或聚（乙烯醇））、聚丙交酯（美國專利第3,773,919號）、^麩胺酸與 L-麩胺酸γ乙酯之共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物（諸如LUPR0N DEP0T⑧（由乳酸-乙醇酸共聚物與柳菩林（leuprolide acetate)構成之可注 147375.doc -323 - 201039846 射微球體））及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯_乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能釋放分子歷時超過1〇〇天，但某些水凝膠釋放蛋白質歷時較短時段。當囊封之免疫球蛋白在體内長時間保持時，其可能會因在37^下、暴露於水分而變性或凝集，從而導致生物活性喪失及可能的免疫原性變化。可視所涉及之機制而定設計合理的穩定策略。舉例而a，务發現凝集機制為經由硫基_二硫基互換（化1〇_ disulfide interchange)形成分子間s_s鍵，則可藉由修飾氫硫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成穩定性。抗體可以任何適合形式調配以傳遞至標靶細胞/組織。舉例而言，抗體可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各類脂質、磷脂及/或界面活性劑構成之適用於向哺乳動物傳遞藥物的小泡囊。脂質體之組分通常類似於生物膜之脂質排列以雙層形式排列。含有抗體之脂質體藉由此項技術中已知之方法製備’該等方法諸如描述於以下中之方法：

Epstein等人 ’ iVoc· t/以 82:3688 (1985);

Hwang等人 ’ iVa，/ dead. 5W. 77:4030 (1980); 美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；及1997年10月23 日公開之W097/38731。美國專利第5,〇13,556號中揭示具有延長之循環時間的脂質體。尤其有用之脂質體可藉由使用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-ΡΕ)的脂質組合物的逆相蒸發法產生。經由限定孔徑之過濾器擠出脂質體以得到具 147375.doc -324· 201039846 有所需直徑之脂質體。本發明抗體之Fab1片段可經由二硫基交換反應而結合於如Martin等人，J. B/o/. C/zew. 257··286-288 (1982)所述之脂質體。該脂質體中視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人，*/· Cancer 81(19):1484 (1989)。欲用於活體内投藥之調配物必須無菌。此易於藉由無菌過濾膜過濾實現。 H.用抗FcRH5抗體治療 0 為測定FcRH5在癌症中之表現，可利用各種偵測分析。在一實施例中，可藉由免疫組織化學（IHC)分析FcRH5多肽過度表現。來自腫瘤活檢之經石蠟包埋的組織切片可進行 IHC分析法且遵循如下FcRH5蛋白質染色強度標準：〇分-未觀察到染色，或少於10%腫瘤細胞中觀察到膜染色。 1 +分-超過10%腫瘤細胞中偵測到模糊/勉強可覺察的膜染色。細胞僅在其部分膜中被染色。〇 2+分-超過10%腫瘤細胞中觀察到微弱至中度完整膜染色。 3 +分-超過1 0%腫瘤細胞中觀察到中度至高度完整膜染色。

FcRH5多肽表現為0分或1 +分之彼等腫瘤可表現為非過度表現FcRH5，而2 +分或3 +分之彼等腫瘤可表現為過度表現FcRH5。或者或另外，可對福馬林（formalin)固定、石蠟包埋之 147375.doc -325 - 201039846 腫瘤組織進行FISH分析法（諸如INFORM®(由Ventana, Arizona 出售）或 PATHVISION®(Vysis, Illinois))以測定腫瘤中FcRH5過度表現之程度（若存在）。

FcRH5過度表現或擴增可使用活體内偵測分析，例如藉由投與結合欲偵測分子且標記有可偵測標記（例如放射性同位素或螢光標記）之分子（諸如抗體）且外部掃描患者以將標記定位來評估。如上所述，本發明之抗FcRH5抗體具有各種非治療應用。本發明之抗FcRH5抗體可適用於將表現FcRH5多肽之〇癌症分期（例如用放射成像法）。抗體亦適用於將FcRH5多狀自細胞純化或免疫沈澱，活體外偵測及定量FcRh5多肽 (例如用ELISA或西方墨點法），作為純化其他細胞之一個步驟自混合細胞群殺滅及去除表現FcRH5之細胞。當前’視癌症分期而定，癌症治療包括以下療法中之一者或組合：手術移除癌性組織、放射療法及化學療法。抗 FcRH5抗體療法可尤其適合意地用於不能充分地耐受化學療法之毒性及副作用的老齡患者及放射療法具有有限效用 ϋ 之轉移性疾病。本發明之靶向腫瘤的抗FcRH5抗體適用於在疾病最初診斷之後或在復發期間緩和表現FcRH5之癌症。對於治療應用，抗以^^^抗體可單獨使用，或以與例如激素、抗血官生成劑或放射性標記化合物或與手術、冷凍療法及/或放射療法組合之療法使用。抗以尺^^抗體治療可與其他形式之習知療法結合（與習知療法連續在習知療法之刖或之後）投與。化學治療藥物（諸如τΑχ〇丁ere⑧ 147375.doc -326 - 201039846

Ο (多西他賽）、TAXOL®(太平洋紫杉醇）、雌莫司彡丁及米托蒽酿）用於治療癌症’尤其低風險（good risk)患者之癌症。在本發明之治療或緩和癌症的本發明方法中，可向癌症患者投與抗FcRH5抗體，且與用一或多種前述化學治療劑治療結合。詳言之，涵蓋與太平洋紫杉醇及經修飾衍生物 (例如參見EP0600517)組合之療法。抗FcRH5抗體應與治療有效劑量之化學治療劑一起投與。在另一實施例中，抗 FcRH5抗體與化學療法結合投與以提高化學治療劑（例如太平洋紫杉醇）之活性及功效。Physiciansi Desk Reference(pDR) 揭示此等藥劑用於治療各種癌症之劑量。此等上述化學治療藥物之治療有效給藥方案及劑量取決於所治療之特定癌症、疾病之程度及熟習此項技術之醫師熟知之其他因素且可由醫師確定。在特疋貫施例中，向患者投與包含與細胞毒性劑結合之抗FcRH5抗體的結合物。結合於FcRhk白之免疫結合物較佳被細胞内化，從而增強免疫結合物殺滅其所結合之癌細胞之治療功效。在—較佳實施例中，細胞毒性劑乾向

或干擾癌細胞中之核醅。访發*仏A u #、、，田胞毒性劑之實例如上所述且包括類美登素、刺抽激备 ,. 萍也黴素、核糖核酸酶及DNA核酸内切酶。抗FcRH5抗體或其毒素結合物係根據已知方法（諸如靜脈内投藥，例如快速注射形式或藉由連續輸注一段時間由肌肉内、腹膜内、腦眷曰月自斧髓内（lntracer〇brospinal)、皮下、關節内、滑膜内、稍内、稍鬥經口、局部或吸入途徑）向 147375.doc -327- 201039846 人類患者投與。靜脈内或皮下投與抗體較佳。離體策略亦可用於治療應用。離體策略包括用編碼 FcRH5拮抗劑之聚核苷酸轉染或轉導獲自個體之細胞。隨後將經轉染或轉導之細胞返回個體。該等細胞可為多種類型中之任一者，包括（但不限於）造血細胞（例如骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、T細胞或B細胞）、纖維母細胞、上皮細胞、内皮細胞、角質細胞或肌細胞。舉例而言’若FcRH5拮抗劑為抗體或免疫結合物，則可藉由如下任何適合方式投與拮抗劑，包括非經腸、皮下、〇腹膜内、肺内及鼻内，且若需要用於局部免疫抑制治療，則病灶内投與。非經腸輸注包括肌肉内、靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下投藥。另外，宜藉由脈搏輸注，尤其以遞減劑量之抗體投與拮抗劑。部分視投藥為短期或長期投藥而定’較佳藉由注射、最佳靜脈内或皮下注射進行給藥。在另一實例中’當病症或禮瘤之位置允許時，Fcrh5拮抗化合物係局部投與，例如藉由直接注射局部投與，且注〇射可週期性重複。在手術切除腫瘤之後，FcRH5拮抗劑亦可向個體全身傳遞或直接傳遞於腫瘤細胞（例如腫瘤或腫瘤床）以預防或降低局部復發或癌轉移。組合投與治療劑通常進行限定時段（視所選組合而定，通常為數分鐘、數小時、數日或數週）。「組合療法」意欲涵蓋以依次之方式投與該等治療劑（亦即其中在不同時間投與各治療劑）以及以實質上同時之方式投與該等治療劑 147375.doc -328- 201039846 或該等治療劑中之至少兩者。治療劑可由相同途徑或由不同途徑投與。舉例而士乡合中之抗FcRH抗體或免疫結合物可藉由靜脈内注射投與，而組合中之化學治療劑可經口投與。或者，視特定= 療劑而定，例如，治療劑兩者均可經口投與，或治療者均可藉由靜脈内注射投與。治療劑投與順序亦視特定藥劑而改變。、視疾病之類型及嚴重性而定，無論例如藉由一或多次各別投與或藉由連續輸注，約i pg/kg至100 mg/kg2各治療劑為向患者投與之最初候選劑量。視上述因素而定，^型曰劑量範圍可為約1吨/kg至約100 mg/kg或更多。對:重 Ο 〇複投藥數日或更久，視病狀而定持續治療直至癌症如上述方法所測量得以治療。然而，其他給藥方案亦可能有用。本案涵蓋藉由基因療法投與抗FcRH5抗體。關於使用基因療法產生細胞内抗體，例如參見1996年3月14日公開之 WO96/07321。其他治療方案可與投與抗以尺^^抗體組合。該組合投藥包括使用各別調配物或單一醫藥調配物共投藥及以任一次序連續投藥，其中較佳地存在兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物活性的一段時間。該組合療法較佳產生協同治療作用。亦宜將投與抗FcRH5抗體與投與針對特定癌症相關之另一腫瘤抗原的抗體組合。在另一實施例中，本發明之治療性處理方法包括組合投 147375.doc -329- 201039846 與抗FcRH5抗體與-或多種化學治療劑或生長抑制劑，包括共投與不同化學治療劑或其他細胞毒性劑或其他亦抑制腫瘤生長之治療劑的混合物。化學治療劑包括磷酸雌莫司

汀、潑尼莫司汀、順鉑、5_氟尿嘧啶、美法侖、環磷醯胺、羥基脲及紫杉烷（諸如太平洋紫杉醇及多西他賽）及/戋蒽環黴素抗生素。該等化學治療劑之製備及給藥方案可根據製造商之說明書或由熟習此項技術者憑經驗確定來使用。該化學療法之製備及給藥方案亦描述於chem〇thei^M

Service，M.C_ Perry 編 ’ Williams & Wilkins，Bahim〇re， MD (1992)中。抗體可與如下抗激素化合物組合；例如抗雌激素化合物，諸如他莫昔芬；抗黃體酮，諸如奥那司酮 (參見EP 616 812);或抗雄激素，諸如氟他胺，其劑量為該等分子之已知劑量。若欲治療之癌症為雄激素非依賴性癌症，則患者可預先進行抗雄激素療法，且在癌症不依賴於雄激素之後，可向患者投與抗FcRH5抗體（及如本文所述視情況存在之其他藥劑）。有時，亦宜向患者共投與保心藥（以預防或減少與該療法相關之心肌功能障礙）或一或多種細胞激素。除上述治療方案以外，患者可在抗體療法之前、同時或之後進行癌細胞之手術移除及/或放射療法（例如外束照射或用放射性標記藥劑（諸如抗體）治療）。上述共投與藥劑中之任一者的適合劑量為目前所用劑量且可由於該藥劑與抗FcRH5抗體之組合作用（協同作用）而降低。本發明之抗體組合物應以與良好醫療實踐一致之方式調 »47375.doc -330- 201039846 配、給與及投與。在此情形中所考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床狀況、病症之原因、藥劑傳遞之位點、投藥方法、投藥時程及醫師已知之其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於調配物中所存在的本發明抗體之量、病症或治療之類型及上述其他因素。其通常以與上文所用之相同劑量及投藥途徑使用或以迄今所用劑量之約1%至 ^ 99%使用。為預防或治療疾病，投藥劑量及模式應由醫師根據已知標準選擇。抗體之適當劑量應取決於欲治療疾病之類型 (如上所定義）、疾病之嚴重性及病程、抗體是出於預防性抑或治療性目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。宜一次性地或經一系列治療向患者投與抗體。抗體較佳藉由靜脈内輸注或藉由皮 Q 下注射投與。視疾病之類型及嚴重性而定，無論例如藉由一或多次各別投藥或藉由連續輸注，每公斤體重約i吨至約50 mg(例如，每劑每公斤約〇1_15 mg)抗體可為向患者投與之最初候選劑量。給藥方案可包含投與約4 mg/kg抗 FcRH5抗體之最初起始劑量，繼而約2 ιη§/]ί^λΙ^ΙΙΗ5抗體之每週維持劑量。然而，其他給藥方案亦可能有用。視上述因素而定，典型日劑量範圍可為約i 4§/肖至1〇〇 mg/kg 或更多。就經數曰或更久重複投藥而言，視病狀而定，持續治療直至出現對疾病症狀之所需抑制為止。此療法之進 147375.doc -331 - 201039846 展可易於藉由習知方法及分析法且基於醫師或熟習此項技術之其他人員已知之標準監測。除向患者投與抗體蛋白質以外，本案亦涵蓋藉由基因療法投與抗體。該投與編碼抗體之核酸由表述「投與治療有效量之抗體」涵蓋。關於使用基因療法產生細胞内抗體，例如參見1996年3月14日公開之WO96/07321。存在兩大方法使核酸（視情況包含於載體中）進入患者細胞；活體内及離體。為進行活體内傳遞，將核酸直接注射於患者中，通常在需要抗體之位點處。為進行離體治療，移出患者之細胞，將核酸引入此等經分離細胞中，且將該等經修飾細胞直接投與患者或例如囊封於植入患者體内之夕孔膜内而投與患者（例如參見美國專利第4,892,538號及第5，283,187號）。存在多種可用於引入核酸於活細胞中之技術。該等技術視活體外傳遞核酸於所培養細胞中抑或活體内傳遞於所欲宿主之細胞中而改變。適用於活體外傳遞核酸於哺乳動物細胞中之技術包括使用脂質體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE_聚葡萄糖、磷酸鈣沈澱法等。離體傳遞基因之常用載體為反轉錄病毒載體。當前較佳之活體内核酸傳遞技術包括用病毒載體（諸如腺病毒、疱疹單純型I病毒或腺相關病毒）及基於脂質之系統（用於脂質介導之基因傳遞的脂質為例如DOTMA、 DOPE及DC-Chol)轉染。對於當前已知之基因標記及基因療法方案的評論，參見Anderson等人，Science 256..808-813 (1992)。亦參見w〇 93/25673及其中所引用之參考文 147375.doc - 332 · 201039846 獻。本發明之抗FcRH5抗體可呈本文中「抗體」之定義所涵盍的不同形式。因此’抗體包括全長或完整抗體、抗體片段、天然序列抗體或胺基酸變異體、人類化抗體、嵌合抗體或融合抗體、免疫結合物及其功能片段。在融合抗體中’抗體序列融合於異源多肽序列。抗體可在Fc區中進行修飾以提供所需效應功能。如本文諸部分中更詳細論述，在存在適當Fc區的情況下，結合於細胞表面之裸抗體可例如經由抗體依賴性細胞細胞毒性（ADCC)或藉由使補體補充補體依賴性細胞毒性或某另一機制誘發細胞毒性。或者’右需要去除或減少效應功能以便使副作用或治療併發症減至最小，則可使用某些其他Fc區。在一實施例中，抗體競爭結合或實質上結合於與本發明抗體相同之抗原決定基。亦涵蓋具有本發明抗1?(^115抗體之生物特徵的抗體’該等生物特徵特別包括活體内腫瘤乾向及任何細胞增殖抑制或細胞毒性特徵。產生上述抗體之方法詳細描述於本文中。本發明之抗FcRH5抗體適用於治療哺乳動物之表現 FcRH5之癌症或緩和該癌症之一或多個症狀。該癌症包括 (但不限於）造血系統癌症或血液相關之癌症，諸如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴惡性病症，以及脾之癌症及淋巴結之癌症。該等B細胞相關癌症之更特定實例包括例如尚度、中度及低度淋巴瘤（包括B細胞淋巴瘤，諸如黏膜相關淋巴組織B細胞淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤、套細胞淋 147375.doc - 333 - 201039846 巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、彌漫性大細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤及τ細胞淋巴瘤）及白血_病（包括繼發性白血病、慢性淋巴細胞性白血病（諸如B細胞白血病（CD5+ B淋巴細胞））、骨趙性白血病（諸如急性骨聽性白血病、慢性骨髓性白血病）、淋巴細胞性白血病（諸如急性淋巴母細胞白血病）及脊髓發育不良）及其他血液及/或B細胞或T細胞相關之癌症。癌症涵蓋任何前述各者之轉移性癌症。抗體能夠結合於在哺乳動物中表現FcRH5多肽之癌細胞的至少一部分。〇在一較佳貫施例中’抗體於活體外或活體内，在結合於細胞上之FcRH5多肽之後，有效破壞或殺滅表現FcRh5之腫瘤細胞或抑制該等腫瘤細胞之生長。該抗體包括裸抗 FcRH5抗體（未結合於任何藥劑）。具有細胞毒性或細胞生長抑制特性之裸抗體可另外擁有細胞毒性劑以使其甚至更有效地破壞腫瘤細胞。可藉由例如使抗體與細胞毒性劑結合以形成如本文所述之免疫結合物而賦予抗以尺^^抗體細胞毒性特性。細胞毒性劑或生長抑制劑較佳為小分子。諸◎ 如刺孢黴素或類美登素及其類似物或衍生物的毒素較佳。本發明提供-種組合物，其包含本發明之抗FeRH5抗體及載劑。出於治療癌症之目的，可向需要該治療之患者投與組合物，其中該組合物可包含一或多種呈現為免疫結合物或裸抗體形式的抗FcRH5抗體。在另一實施例中，組合物可包含此等抗體與其他治療劑（諸如細胞毒性劑或生長 P制劑包括化學治療劑）之组合。本發明亦提供包含本 147375.doc 334 · 201039846 發明之抗FcRH5抗體及載劑的調配物。在一實施例中，調配物為包含醫藥學上可接受之載劑的治療調配物。本發明之另一態樣為編碼抗fcRH5抗體之分離之核酸。涵蓋編碼Η鏈與L鏈及尤其高變區殘基之核酸、編碼天然序列抗體以及變異體之鏈、該抗體之修飾及人類化型式。本發明亦提供適用於治療哺乳動物之表現FcRH5多肽之癌症或緩和該癌症之一或多個症狀的方法，其包含向哺乳動物投與治療有效量之抗FcRH5抗體。抗體治療組合物可如醫師所引導短期或長期或間歇式投與。亦提供抑制表現 FcRH5多肽之細胞的生長及殺滅該細胞之方法。本發明亦提供包含至少一種抗FCRH5抗體之套組及製品。含有抗FcRH5抗體之套組可用於例如FcRh5細胞殺滅分析法，將FcRH5多肽自細胞純化或免疫沈澱。舉例而吕，為分離及純化FcRH5，套組可含有偶合於珠粒（例如瓊脂糖珠粒）之抗FcRH5抗體。可提供如下套組，其含有用於〇在例如ELISA或西方墨點法中活體外偵測及定量FcRH5的抗體。該適用於偵測之抗體可具有諸如螢光或放射性標記之標記。 I· 抗體·藥物结合物治療預期本發明之抗體-藥物結合物（ADC)可用於治療各種例如特徵為腫瘤抗原過度表現之疾病或病症。例示性病狀或過度增殖病症包括良性或惡性腫瘤；白血病及淋巴惡性病症。其他疾病包括神經元、膠質、星形膠質細胞、下丘腦、腺體、巨喔細胞、上皮、基質、嚢胚腔、發炎、金管 147375.doc -335 - 201039846 生成及免疫學（包括自體免疫）病症。動物模型及基於細胞之分析法中鑑別出的ADC化合物可進一步在具有腫瘤之更高級靈長類動物及人類臨床試驗中測試。人類臨床試驗可經設計以測試本發明之抗FcRH5單株抗體或免疫結合物在患有包括（但不限於）如下B細胞增殖病症之患者中的功效：淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性NHl、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（all)及套細胞淋巴瘤。臨床試驗可經設計以評估ADC與已知治療方案（諸如輻射及/或涉及已知化學治療劑及/或細胞毒性劑之化學療法）之組合的功效。一般而言，欲治療之疾病或病症為過度增殖疾病，諸如 B細胞增殖病症及/或B細胞癌症。本文中欲治療癌症之實例包括（但不限於）：B細胞增殖病症，其係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL '復發性侵襲性 NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、 ί曼性淋巴細胞性白灰病（cll)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白 ▲病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL) 及套細胞淋巴瘤。癌症可包含表現FcRH5之細胞，以便本發明之ADC能夠結合於癌細胞。為測定癌症中之FcRH5表現，可利用各種診斷/預測分析法。在一實施例中，FcRH5過度表現可藉由 147375.doc -336- 201039846 IHC分析。來自腫瘤活檢之經石躐包埋的組織切片可進行 IHC分析，且關於染色度及占所檢查腫瘤細胞之比例符合 FcRH5蛋白染色強度標準。為預防或治療疾病’ ADC之適當劑量取決於欲治療疾病之類型（如上所定義）、疾病之嚴重性及病程、分子是出於預防性抑或治療性目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷。宜一次性地或經一系列治療向患者投與分子。視疾病之類型及嚴重性而定，無論例如藉由一或多次各別投與或藉由連續輸注，約 1 pg/kg至100 mg/kg(例如0.1-20 mg/kg)之分子為向患者投與之最初候選劑量。視上述因素而定，典型曰劑量範圍可為約1 pg/kg至100 mg/kg或更多。欲向患者投與之ADC之例不性劑量範圍為每公斤患者體重約〇. 1 mg至約丨〇 mg。就經數日或更久重複投藥而言，視病狀而定，持續治療直至出現對疾病症狀之所需抑制為止。例示性給藥方案包 q 含投與約4 mg/kg之初始起始劑量之抗ErbB2抗體，繼而投與約2 mg/kg之每週維持劑量之抗ErbB2抗體。其他給藥方案亦可能有用。此療法之進展易於藉由習知技術及分析法監測。 J.組合療法本發明之抗體-藥物結合物（ADC)可與具有抗癌特性之第二化合物組合於醫藥組合調配物中或組合於組合療法形式之給藥方案中。醫藥組合調配物或給藥方案之第二化合物較佳具有對組合中A D C之互補活性以便其彼此無不利影 147375.doc -337· 201039846 響。第二化合物可為化學治療劑、細胞毒性劑、細胞激素、生長抑制劑、抗激素劑及/或保心藥。該等分子適合地以有效達成所欲目的之量組合存在。含有本發明ADC之醫藥組合物亦可具有治療有效量之化學治療劑，諸如微管蛋白形成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑或DNA結合劑（DNA binder) ° 在一態樣中，第一化合物為本發明之抗FcRH5 ADC，且第二化合物為抗CD20抗體（裸抗體或ADC)。在一實施例中，第二化合物為抗CD20抗體利妥昔單抗（Rituxan®)或 2H7(Genentech, Inc.，South San Francisco, CA)。適用於與本發明抗FcRH5 ADC之組合免疫療法的其他抗體包括（但不限於）抗VEGF(例如Avastin®)。其他治療方案可與投與根據本發明鑑別出之抗癌劑組合，該等方案包括（但不限於）放射療法及/或骨髓及周邊血液移植，及/或細胞毒性劑、化學治療劑或生長抑制劑。在該等實施例之一中，化學治療劑為如下藥劑或藥劑之組合：諸如環填醯胺、經基道諾黴素、阿黴素（adriamycin)、小紅莓、長春新驗（Oncovin™)、潑尼松龍（prednisolone)、 CHOP、CVP或COP，或免疫治療劑（諸如抗CD20(例如 Rituxan®)或抗 VEGF(例如 Avastin®)) 〇組合療法可以同時或依次方案投與。當依次投與時，組合可以兩次或兩次以上投與來投與。該組合投藥包括使用各別調配物或單一醫藥調配物共投與及以任一次序連續投 147375.doc • 338 - 201039846 藥’其中較佳地存在兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物活性的段時間。

在一實施例中，用ADC治療包括組合投與本文鑑別出之抗癌劑與一或多種化學治療劑或生長抑制劑，包括共投與不同化學治療劑之混合物。化學治療劑包括紫杉烷（諸如太平洋紫杉醇及多西他賽）及/或蒽環黴素抗生素。該等化學治療劑之製備及給藥方案可根據製造商之說明書或由熟習此項技術者憑經驗確定來使用。該化學療法之製備及給藥方案亦描述於「Chemotherapy Service」，（1992)M C

Perry編，Williams & Wilkins，Baltimore, Md 中。任何上述共投與藥劑之適合劑量為目前所用劑量且可由於該新鑑別出之藥劑與其他化學治療劑或治療之組合作用 (協同作用）而降低。、·且口療法可提供「協同作用」且證實「具有協同作用」，亦即當同時使用活性成分時所達成之作用大於分別 G =化合物所產生作用之總和。當活性成分⑴共調配及以二：：位劑量調配物同時投與或傳遞；(2)以各別調配物 =父替或同時傳遞；或（3)藉由某另—方案傳遞時，可獲付協同作用。當以交替療法傳遞時，協同作用可在化合物 :次=遞㈣藉由在各別注㈣分別二^ 效劑量之(亦即依續）投與有量而在組合療法中，同時投與有效劑里之兩種或兩種以上活性成分。本發明之組合療法可另外包含一或多種化學治療劑。組 147375.doc •339- 201039846 合投藥包括使用各別調配物或單一醫藥調配物共投藥或同時投藥，及以任-次序連續投藥，其中較佳地存在一段兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物活性的時間。化學治療劑（若投與）通常以其所已知之劑量投與，或視情況以因藥物之組合作用或可歸因於投與抗代謝化學治療劑之不良副作心降低之劑4投與。該等化學治療劑之製備及給藥方案可根據製造商之說明書或由熟習此項技術者憑經驗確定來使用。各種可組合之化學治療劑揭示於本文中。在-些實施例中，欲組合之化學治療劑係選自由以下組成之群：免疫調節劑（IMid)(包括沙力度胺及Reviimid⑧（來那度胺））、蛋白體抑制劑（諸如Velcade(g)(硼替佐米）及 PS342)、紫杉醇（bora taxoid)(包括多西他赛及太平洋紫杉醇）、長春花類（諸如長春瑞濱或長春鹼）、鉑化合物（諸如卡波鉑或順鉑）、芳香酶抑制劑（諸如來曲唑、阿那曲唑戋依西美坦）、抗雌激素（例如氟維司群或他莫昔芬）、依託泊苷、塞替派、環磷醯胺、培美曲塞、曱胺喋呤、脂質小紅莓、聚乙二醇化脂質小紅莓、卡培他濱、吉西他濱、美法侖（melthalin)、小紅莓、長春新鹼、c〇x_2抑制劑（例如塞來昔布（celecoxib))或類固醇（例如地塞米松及潑尼松）^在一些實施例（例如涉及治療多發性骨髓瘤之實施例）中，組合地塞米松與來那度胺，或地塞米松或硼替佐米，或長春新驗、小紅莓與地塞米松’或沙力度胺與地塞米松，或脂質小紅莓、長春新鹼與地塞米松，或來那度胺與地塞米 147375.doc -340- 201039846 松，或硼替佐米與地塞米松，或硼替米松佐米、小紅莓與地塞在一些實施例中，欲組合之化學、干療劑係選自由以下組成之群：Revlimid®(來那度胺）、蛋 } 贪白體抑制劑（諸如 velcad_(蝴替佐米）及PS342)、紫杉醇（包括多西他賽及太平洋紫杉醇）、長春花類（諸如長春瑞濱或長春驗）、始化合物(諸如卡波鉑或順鉑）、芳香酶抑制劑(諸如來曲唑、阿那曲唑或依西美坦）、抗雌激素（例如氟維司群或他莫昔芬卜依託泊[塞替派、環磷醯胺、培美曲塞、甲胺喋呤、脂質小紅每、聚乙二醇化脂質小紅莓、卡培他濱、吉西他濱、吳法俞、小紅每、長春新驗、c〇x_2抑制劑（例如塞來昔布）或類固醇（例如地塞米松及潑尼松）。在一些實施例（例如涉及治療惡性骨髓瘤之實施例）中，組合地塞米松與來那度胺，或地塞米松與删替佐米。在另一實施例中，組合療法包含抗體或免疫結合物及一種以上化學治療劑。舉例而言，抗體或免疫結合物可與以下組合：（1)長春新鹼、小紅莓（脂質或非脂質調配物形式）及地塞米松；（ii)沙力度胺及地塞米松；（iii)Velcade(g)(硼替佐米）、小紅莓及地塞米松；（iv)Velca(Je®(硼替佐米）、沙力度胺及地塞米松；（V)美法侖及潑尼松；（vi)美法侖、潑尼松及沙力度胺；（vii)美法侖、潑尼松及Vekade®(硼替佐米）；（viii)長春新鹼、小紅莓及地塞米松；或（ix)沙力度胺及地塞米松。在一實施例中’組合療法可包含本文所述之抗體或免疫 147375.doc -341 - 201039846 結合物及以下中之一或多者：（i)Velcade®(硼替佐米）、（ii) 地塞米松、（iii)Revlimid®(來那度胺）。在另一實施例中，組合療法包含抗體或免疫結合物及地塞米松與 Revlimid®(來那度胺）或Velcade®(硼替佐米）與地塞米松。在另一實施例中，組合療法包含抗體或免疫結合物及以下中之每一者·· Velcade®(棚替佐米）、地塞米松及Revlimid® (來那度胺）。 K ·製品及套組本發明之另一實施例為一種製品，其含有適用於治療、預防及/或診斷表現FCRH5之癌症的物質。該製品包含容器及容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插頁。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多種諸如玻璃或塑膠之材料形成。該容器容納有效治療、預防及/或診斷癌症病狀之組合物’且可能具有無菌入口（例如，容器可為靜脈内溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞的小瓶）。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗1?以115抗體。標籤或包裝插頁表明該組合物用於治療癌症。標籤或包裝插頁應另外包含向癌症患者投與抗體組合物之說明書。另外，製品可另外包含第二容器，其包含醫藥學上可接又之、，爰衝劑，諸如注射用抗細菌水（BWFI)、構酸鹽緩衝艮皿水林格氏溶液（Ringer’s solution)及右旋糖溶液其可另外包括自商業及使用者觀點出發所需之其他材料，其包括其他緩衝劑、稀釋劑、過滤器、針及注射器。亦提供適用於各種目的之套組，例如用於表現FcR出之 147375.doc -342- 201039846 細胞殺滅分析法，用於FcRH5多肽自細胞純化或免疫沈澱之套組。為分離及純化FcRH5多肽，套組可含有偶合於珠粒（例如瓊脂糖珠粒）之抗FcRH5抗體。可提供如下套組，其含有用於例如ELISA或西方墨點法中活體外偵測及定量 FcRH5多肽的抗體。如製品般，套組包含容器及容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插頁。容器容納包含至少一種本發明之抗FcRH5抗體的組合物。可包括含有例如稀釋劑及緩衝劑、對照抗體之其他容器。標籤或包裝插頁可提供組合物之描述以及所欲活體外或偵測用途之說明。 L. FcRH5多肽之用途本發明涵蓋篩選化合物以鑑別模擬FcRH5多肽之化合物 (促效劑）或阻礙FcRH5多肽之作用的化合物（拮抗劑）的方法。筛選拮抗藥物候選者之分析法經設計以鏗別與本文鑑別出之基因所編碼之FcRH5多肽結合或複合，或以其他方式干擾編碼多肽與其他細胞蛋白之相互作用（包括例如抑制FcRH5多肽自細胞表現）的化合物。該等篩選分析法包括易於高通量篩選化學庫的分析法，以使其尤其適用於鑑別小分子藥物候選者。该等分析法可以此項技術中充分表徵之多種形式執行，包括蛋白質-蛋白質結合分析法、生物化學篩選分析法、免疫分析法及基於細胞之分析法。所有拮抗劑之分析法的共同之處在於其需要使藥物候選者與本文鑑別出之核酸所編碼的FcRH5多肽在足以使此兩種組分可相互作用之條件及時間下接觸。 147375.doc -343- 201039846 在結合分析法中，相互作用為結合且可在反應混合物中分離或偵測所形成之複合物。在一特定實施例中，將本文鑑別出之基因所編碼的FcRH5多肽或藥物候選者藉由共價或非共價連接而固定於固相（例如微量滴定板）上。非共價連接一般藉由用FcRH5多肽之溶液塗佈固體表面且乾燥實現。或者，可使用特異於欲固定之FcRH5#肽的經固定抗體（例如單株抗體）將該FcRH5多肽錨定於固體表面。該分析法藉由向固定組分（例如含有錨定組分之塗佈表面）添加可經可偵測標記進行標記之未固定組分來執行。當反應完成N*，例如藉由洗滌移除未反應組分，且偵測錨定於固體表面上之複合物。當敢初未固定組分攜帶可彳貞測標記時，偵測到固定於表面上之標記表明發生複合。若最初未固定組分不攜帶標記，則可例如藉由使用特異性結合經固定複合物之經標記抗體偵測複合。若候選化合物與本文鑑別出之基因所編碼之特定FcRH5 多狀相互作用但不結合於該特定FcRH5多肽，則其與該多狀之相互作用可藉由熟知用於偵測蛋白質-蛋白質相互作用之方法分析。該等分析法包括傳統方法，諸如經由梯度或層析管柱進行交聯、共免疫沈澱及共純化。另外，蛋白貝-蛋白質相互作用可藉由使用Fields及同事（Fields及s〇ng，

Nature (London), 340:245-246 (1989) ; Chien等人，Proe. Ν“1· Acad. Sci. USA，88:9578-9582 (1991))所述之基於酵母之遺傳系統如 Chevray及Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89: 5789_5793 (1991)所揭示來監測。多種轉錄活化 147375.doc -344- 201039846 因子（諸如酵母GAL4)由兩個實體上不連續之模組域組成，一者充當DNA結合域’另一者充當轉錄活化域。上述公開案中所述之酵母表現系統（一般稱作「雙雜交系統」）利用此特性且採用兩種雜交蛋白，一者中標靶蛋白融合於 GAL4之DNA結合域，且另一者中候選活化蛋白融合於活化域。GAL1‘CZ報導基因在GAL4活化之啟動子的控制下之表現取決於GAL4活性經由蛋白質-蛋白質相互作用而產生之復原。用β-半乳糖苷酶之發色受質偵測含有相互作用多肽之群落。使用雙雜交技術鑑別兩種特異性蛋白質之間的蛋白質-蛋白質相互作用的完整套組（MATCHMAKER1、可購自Clontech。此系統亦可延用於定位參與特異性蛋白質相互作用之蛋白質域以及精確定位對此等相互作用至關重要之胺基酸殘基。干擾本文鑑別出之編碼FcRH5多肽之基因與其他細胞内或細胞外組分相互作用的化合物可如下測試：通常在使基因及細胞内或細胞外組分之產物可相互作用及結合的條件下及時間下製#含有該兩種產物的反應混合物。為測試候選化合物抑制結合之能力，在測試化合物不存在及存在下進行反應。另夕卜，可將可安慰劑添加至第三反應混合物中作為陽性對照組”1合物中所存在之測試化合物與細胞内或細胞外組分之間的結合（複合物形成）如上文所述進行監測。對照反應物而非含有測試化合物之反應混合物中複合物之形成表明測試化合物干擾測試化合物與其反應搭配：之相互作用。 147375.doc -345· 201039846 為分析拮抗劑，可將FcRH5多肽與欲篩選特定活性之化合物一起添加至細胞中，且在FcRH5多肽存在下該化合物抑制所關注活性之能力表明該化合物為FcRH5多肽之拮抗劑。或者，可藉由將FcRH5多肽及潛在拮抗劑與膜結合 FcRH5多肽受體或重組受體在適當條件下組合進行競爭抑制分析法來偵測拮抗劑。FcRH5多肽可諸如藉由放射性標記，以便可使用結合於受體2FcRH5多肽分子數測定潛在拮抗劑之有效性。編碼受體之基因可由熟習此項技術者已知之多種方法鑑別’例如配位體淘選及FACS分選。❹

Coligan等人，Current Protocols in Immun” 1(2):第 5章 (1991)。較佳採用表現選殖，其中自對FcRH5多肽具有反應）·生之細胞製備聚腺苷酸化RNA，且將由此A產生之 cDNA庫分組，且用於轉染c〇s細胞或對1^11]^5多肽不具反應性之其他細豸。將於玻璃載片±生長之經轉染細胞暴露於經標記FCRH5多肽。FcRH5多肽可藉由多種方式標記，包括碘化或包括位點特異性蛋白激酶之識別位點。固定且培月之後，載片進行自動放射照像分析。鑑別陽性組且製◎ 備亞群且使用相互作用亞集合（sub-p〇〇ling)及再篩選方法再轉染，最終產生編碼假定受體之單純系。作為文體鑑別之替代方法，可使經標記FcRH5多肽與表現受體分子之細胞膜或提取製劑光親和連接。藉由pAGE 分解交聯物質，且暴露於X射線膠片（X-ray Him)。可切除含有觉體之經標記複合物，分解為肽片段，且進行蛋白微測量序。使㈣自H則量序之胺基酸序列設計簡併寡核苷 147375.doc -346- 201039846 酉久探針組以篩選cDNA庫來鑑別編碼假定受體之基因。在拮抗劑之另一分析法中，將表現受體之哺乳動物細胞或膜製劑與經標記FcRH5多肽在候選化合物存在下一起培用。可隨後測量化合物提高或阻斷此相互作用之能力。潛在拮抗劑之更特定實例包括結合於免疫球蛋白與 FcRH5多肽之融合物的寡核苷酸，且尤其抗體，包括（但不限於）多株及單株抗體及抗體片段、單鏈抗體、抗遺傳型抗體及該等抗體或片段之嵌合或人類化型式，以及人類抗體及抗體片段。或者，潛在拮抗劑可為密切相關蛋白，例如FcRH5多肽之識別受體但不賦予作用，從而競爭性抑制 FcRH5多肽之作用的突變形式。可以醫藥組合物之形式投與特異性結合本文鑑別之 FcRH5多肽的抗體以及上文所揭示之筛選分析法所鑑別的其他分子以治療各種病症，包括癌症。若FcRH5多肽在細胞内且使用完整抗體作為抑制劑，則 Q 内化抗體較佳。然而，亦可使用脂質轉染法或脂質體將抗體或抗體片段傳遞至細胞中。若使用抗體片段，特異性結合於標靶蛋白之結合域的最小抑制片段較佳。舉例而言，基於抗體之可變區序列，可設計的肽分子應保留結合標靶蛋白序列之能力。該等肽可以化學方式合成及/或藉由重組DNA技術產生。例如參見]viarasco等人，pr〇c Natl

Acad. Sci. USA，90: 7889-7893 (1993)。本文之調配物亦可含有一種以上所治療之特定適應症所必需的活性化合物，較佳為具有彼此並無不利影響之互補 147375.doc •347· 201039846 活性的活性化合物。或者或另外

卜組合物可包含提高其功能之藥劑，諸如細胞毒性劑、細胎崎I 飑破素、化學治療劑或生長抑制劑。該等分子適合地以有 '、喇欢達成所欲目的之量組合存在。 M.抗體衍生物本發明之抗體可進一步經修飾以人士，丨^飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之其他非蛋白性部分。、态刀。適用於衍生抗體之部分較佳為水溶性聚合物。水溶性铲人 ^ σ物之非限制性實例包括 (但不限於）聚乙二醇（PEG)、？ - f , ；乙一醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、 ^ 承乙烯基吡洛。定酮、聚_1，3-二氧戊環、聚-1,3,6-三n亞、p ^ . —μ坑、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸（均聚物或盖楣妓取規共聚物）及聚葡萄糖或聚（η- 乙烯基吡咯啶酮）聚乙二醇、_ ^ 丙—醇均聚物、聚氧化丙烯/ 氧化乙烯共聚物、聚氧乙稀化客； > 邱化夕兀醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙搭因盆 U其於水中之穩定性而可在製造方面具有優勢》聚合物』具有任何分子量，且可有分支鏈或無分支鏈。連接於抗體之聚合物數目可改變，且若連接—個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。-般而言，用於衍生之聚合物之數目及/或類型可基於以下考慮 :素來確定：包括（但不限於）欲改良抗體之特定特性或功能’抗體衍生物是否將用於阳中灯用於限疋條件下之療法等。 Ν·篩選方法本發明之另-實施例係針對—種判定懷疑含仏师多肽之樣WH5多肽之存在的方㈣ 147375.doc -348- 201039846 樣品暴露於結合於Fcrh5多肽之其抗體藥物結合物，且測定其抗體藥物結合物與樣品中FcRH5多肽之結合，其中該結合之存在指示樣品中FcRH5多肽之存在。視情況，樣品可含有懷疑表現FcRH5多肽之細胞（其可為癌細胞）。用於該方法之其抗體藥物結合物可視情況經可偵測標記，連接於固體支撐物或進行類似處理。本發明之另一實施例係針對一種診斷哺乳動物中腫瘤之存在的方法，其中該方法包含（a)使包含獲自哺乳動物之組織細胞的測試樣品與結合於FcRH5多肽之其抗體藥物結合物接觸’及（b)偵測其抗體藥物結合物與測試樣品中FcRH5 多肽之間複合物之形成，其中複合物之形成指示哺乳動物中腫瘤之存在。視情況，其抗體藥物結合物經可偵測標 s己，連接於固體支撐物或進行類似處理，及/或組織細胞之測試樣品獲自懷疑具有癌性腫瘤之個體。 IV.使用抗FcRH5抗體及免疫結合物之其他方法 ◎ A.診斷方法及债測方法在一態樣中，本發明之抗1^尺115抗體及免疫結合物適用於價測生物樣品中FcRH5之存在。本文中所用之術語「價測」涵蓋定量或定性偵測◦在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。在某些實施例中，該等組織包括正常組織及/或相對於其他組織表現較高含量之FcRH5的癌性組織，例如B細胞及/或B細胞相關組織。在悲樣中，本發明提供一種偵測生物樣品中FcRH52 存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使該生物樣品 147375.doc •349- 201039846 與抗FcRH5抗體在使得抗FcRH5抗體可與FcRH5結合的條件下接觸，及偵測抗FcRH5抗體與FcRH5之間是否形成複合物。在一態樣中，本發明提供一種診斷與FcRH5表現增加相關之病症的方法。在某些實施例中，該方法包含使測試細胞與抗FcRH5抗體接觸；藉由偵測抗fcrh5抗體與FcRH5 之結合來測定測試細胞之FcRH5表現量（定量或定性）；及比較測試細胞之FcRH5表現量與對照細胞（例如與測試細胞來自相同組織的正常細胞或與該正常細胞之FcRH5表現量相當的細胞）之FcRH5表現量，其中相較於對照細胞，測試細胞之較高FcRH5表現量表明存在與Fcrh5表現增加相關之病症。在某些實施例中，測試細胞獲自懷疑患有與 FcRH5表現增加相關之病症的個體。在某些實施例中，病症為細胞增殖病症，諸如癌症或腫瘤。

可使用本發明之抗體診斷之例示性細胞增殖病症包括B 細胞病症及/或B細胞增殖病症，包括（但不限於）淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性 NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性nhl、陵淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白金病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（all) 及套細胞淋巴瘤。在某些實施例中，診斷或偵測方法（諸如上述方法）包含偵測抗FeRH5抗體與細胞表面上錢自表面表現㈣出之細胞之膜製劑中所表現的FcRH5的結合。在某些實施例 147375.doc -350- 201039846 _ ’該方法包含使細胞與抗FcRH5抗體在允許抗FcRH5抗體結合於FcRH5之條件下接觸，及偵測抗FcRH5抗體與細胞表面上之FcRH5之間是否形成複合物。偵測抗FcRH5抗體與細胞表面上所表現之FcRH5的結合的例示性分析法為「FACS」分析法。可使用某些其他方法偵測抗FcrH5抗體與FcRH5之結合。該等方法包括（但不限於）此項技術中熟知之抗原_結合分析法，諸如西方墨點法、放射免疫分析法、ELISA(酶聯免疫吸附分析法）、「夾層」免疫分析法、免疫沈澱分析法、螢光免疫分析法、蛋白質A免疫分析法及免疫組織化學（IHC)。在某些實施例中，抗FcRH5抗體經標記。標記包括(但不限於）直接偵測之標記或部分（諸如螢光、發色、電子緻後化學發光及放射性標記），以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分（諸如酶或㈣⑴。例示性

標記包括（但不限於）放射性同位素Up、Uc、、也及 ⑴1 ;螢光® ’諸如稀土螯合㈣螢光素及其衍生物、若丹月及”何生物、丹績醯基、伞酮⑽;螢光素酶，例如螢火蟲螢弁夸赏九常鉍及細菌螢光素酶（美國專利第 4,737,456號）；螢光素；23_-奇秘表 ’虱酞嗪二酮；辣根過氧化酶 (HRP)1性磷酸酶；β_半乳糖替酶；葡糖殿粉酶；溶菌酶’醣乳二’例如葡萄糖氧化酶、+乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷鲅去氫酶；雜環氡化酶，酶诸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶’其與採用過氧化氫氧化毕& 杂枓則驅物之酶（諸如HRP、乳 147375.doc •351 · 201039846 過氧化酶或微過氧化酶）偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。在某些實施例中，將抗FcRH5抗體固定於不溶性基質上。固定可能需要使抗FcRH5抗體與在溶液中保持游離之任何FcRH5分離。此通常藉由以下實現：使抗FcRH5抗體在分析程序之前不溶，諸如藉由吸附於水不溶性基質或表面（Bennich等人，U.S. 3,720,760)，或藉由共價偶合（例如使用戊二醛交聯）；或藉由使抗FcRH5抗體在抗FcRH5抗體與FcRH5之間形成複合物之後不溶，例如藉由免疫沈澱。上述診斷或偵測實施例中之任一者可替代抗FcRH5抗體或在抗FcRH5抗體之外使用本發明之免疫結合物進行。 B.治療方法本發明之抗體或免疫結合物可用於例如活體外、離體及活體内治療方法。在一態樣中，本發明提供活體内或活體外抑制細胞生長或增殖之方法，該方法包含使細胞在允許免疫結合物結合於FcRH5之條件下暴露於抗FcRH5抗體或其免疫結合物。「抑制細胞生長或增痩」意謂使細胞之生長或增殖降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%、95%或100°/。，且包括誘發細胞死亡。在某些實施例中，細胞為腫瘤細胞。在某些實施例中，細胞為B細胞。在某些實施例中，細胞為異種移植物，例如本文所例示之異種移植物。在一態樣中，本發明之抗體或免疫結合物可用於治療或預防B細胞增殖病症。在某些實施例中，細胞增殖病症與 147375.doc • 352· 201039846

FcRH5之表現及/或活性增加相關。舉例而言，在某些實施例中’ B細胞增殖病症與b細胞表面上FcRH5之表現增加相關°在某些實施例中，B細胞增殖病症為腫瘤或癌症。欲藉由本發明之抗體或免疫結合物治療之B細胞增殖病症之實例包括（但不限於）淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHl)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL·、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病 (HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一態樣中，本發明提供治療B細胞增殖病症之方法，其包含向個體投與有效量之抗FcRH5抗體或其免疫結合物。在某些實施例中’治療B細胞增殖病症之方法包含向個體投與有效量之醫藥調配物，其包含抗FcRH5抗體或抗 FcRH5免疫結合物及視情況存在之至少另一種治療劑，諸如下文提供之治療劑。在某些實施例中，治療細胞增殖病症之方法包含向個體投與有效量之醫藥調配物，其包含i) 包含抗FcRH5抗體及細胞毒性劑之免疫結合物；及視情況存在之2)至少另一種治療劑，諸如下文提供之治療劑。在一態樣中，至少一些本發明抗體或免疫結合物可結合來自不為人類之物種的FcRH5。因此，可使用本發明之抗體或免疫結合物結合FcRH5，例如含有FcRH5之細胞培養物中之FcRH5、具有FcRH5(本發明之抗體或免疫結合物可與其交叉反應）之人類或其他哺乳動物（例如黑猩猩、狒狒、絨猴、獼猴及恆河猴、豬或小鼠）中之FCRH5。在一實 147375.doc •353- 201039846 施例中，可使用抗FcRH5抗體或免疫結合物乾向B細胞上之，其係使抗體或免疫結合物與接觸形成抗體或免疫結合物-抗原複合物’以便免疫結合物中結合之細胞毒素可進入細胞内部。在一實施例中，FcRH5為人類 FcRH5。在一實施例中，可在用於結合罹患與FcRH5表現及/或活性增加相關之病症的個體中FcRH5之方法中使用抗fcRH5 抗體或免疫結合物，該方法包含向個體投與抗體或免疫結合物，以便結合個體中之FcRH5。在一實施例中，結合之抗體或免疫結合物内化至表現FcRH5之B細胞中。在―實施例中’ FcRH5為人類FcRH5 ’且個體為人類個體。或者，個體可為表現抗FcRH5抗體所結合之fcrh5的哺乳動物。另外，個體可為已引入FcRH5(例如藉由投與fcrh5或藉由表現編碼FcRH5之轉殖基因引入）之喷乳動物。 4几FcRH5抗體或免疫結合物可向人類投與以用於治療目的。此外’抗FcRH5抗體或免疫結合物可向表現fcrh5(抗體可與該FcRH5交叉反應）之非人類哺乳動物（例如靈長類動物、豬、大鼠或小鼠）投與以用於獸醫用目的或作為人類疾病之動物模型。就後者而言，該等動物模型可適用於平估本發明之抗體或免疫結合物之治療功效（例如測試投藥劑量及投藥時程）。本發明之抗體或免疫結合物可在療法中單獨使用或與其他組合物組合使用。舉例而言，本發明之抗體或免疫結合物可與至少另—種治療劑及/或佐劑共投與。在某些實施 147375.doc -354- 201039846 例中，另一治療劑為細胞毒性劑、化學治療劑或生長抑制劑。在該等實施例之一中’化學治療劑為如下藥劑或藥劑組合，諸如環填醢胺、經基道諾黴素、阿黴素、小紅莓、長春新鹼（Oncovin™)、潑尼松龍、CHOP、CVP或COP，或免疫治療劑’諸如抗CD20(例如Rituxan®)或抗VEGF(例如Avastin®) ’其中組合療法適用於治療癌症及/或^細胞病

症，諸如B細胞增殖病症瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性 NHL、難洽性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（all)及套細胞淋巴瘤。上述該等組合療法涵蓋組合投藥（其中兩種或兩種以上治療劑包括於同一或各別調配物中），及各別投藥，在此情況下’本發明之抗體或免疫結合物之投與可在另一治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後進行。本發明之抗體或免疫結合物亦可與放射療法組合使用。本發明之抗體或免疫結合物（及任何其他治療劑或佐劑）可藉由如下任何適合方式投與，包括非經腸、皮下、腹膜 :、肺内及鼻内投與’且若需要進行局部治療，則病灶内投與。非經腸輪注包括肌肉内、靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下技藥。另外，宜藉由脈搏輸注投與抗體或免疫結合物，尤其遞減劑量之抗體或免疫結合物。部分視投藥為短 / 5長d 4又藥而定，可藉由任何適合途徑（例如藉由注射，諸如靜脈内或皮下注射）給藥。 9 ' 147375.doc •355 · 201039846 本發明之抗體或免疫結合物應以符合良好醫療實踐之方式調配'給與及投與。在此情形中所考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床狀況、病症之原因、藥劑傳遞之部位、投藥方法、投藥時程及醫師已知之其他因素。抗體或免疫結合物無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於存在於該調配物中之抗體或免疫結合物之量、病症或治療之類型及上述其他因素。其一般以相同劑量且用本文所述之投藥途徑使用，或以本文所述劑量之約1至99%，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任何劑量及任何途徑使用。為預防或治療疾病，本發明之抗體或免疫結合物（當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑（諸如化學治療劑）組合使用時）之適當劑量應取決於欲治療疾病之類型、抗體或免疫結合物之類型、疾病之嚴重性及病程、抗體或免疫結合物是出於預防抑或治療目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對抗體或免疫結合物之反應及主治醫師之判斷。宜一次性或經一系列治療向患者投與抗體或免疫結合物。視疾病之類型及嚴重性而定，無論例如藉由一或多次各別投與或藉由連續輸注’約1 gg/kg至100 mg/kg(例如〇· 1 mg/kg-20 mg/kg)之抗體或免疫結合物可為向患者投與之最初候選劑量。視上述因素而定，典型日劑量範圍可為約 1 pg/kg至100 mg/kg或更多。就經數曰或更久重複投藥而言’視病狀而定’一般持續治療直至出現對疾病症狀之所 147375.doc •356- 201039846 而抑制為止。抗體或免疫結合物之一例示性劑量範圍應為約0.05 mg/kg至約1〇 mg/kg。因此，可向患者投與約〇」 mg/kg、2.0 mg/kg、4 〇 mg/kg或 1〇 mg/k以或其任何組合）之或夕種劑量的抗體或免疫結合物。該等劑量可間歇投與，例如每週或每三週投與（例如以便患者接受約2次至約 20次或例如約6次劑量之抗體或免疫結合物）。可投與初始較尚起始劑量，繼而投與一或多次較低劑量。例示性給藥方案包含投與約4 mg/kg之初始起始劑量之抗體，繼而投與約2 mg/kg之每週維持劑量之抗體。然而，其他給藥方案亦可能有用。此療法之進展易於藉由習知技術及分析法監測。 C·活性分析法本發明之抗FcRH5抗體及免疫結合物可藉由此項技術中已知之各種分析法表徵其物理/化學特性及/或生物活性。 1 ·活性分析法在態樣中’提供鑑別具有生物活性之抗FcRH5抗體或其免疫結合物的分析法。生物活性可包括例如抑制細胞生長或增殖之能力（例如「細胞殺滅」活性）或誘發細胞死亡 (包括漸進式細胞死亡（細胞凋亡））之能力。亦提供在活體内及/或活體外具有該生物活性之抗體或免疫結合物。在某些實施例中，測試抗FcRH5抗體或其免疫結合物活體外抑制細胞生長或增殖之能力。抑制細胞生長或增殖之分析法為此項技術中所熟知。某些細胞增殖分析法（由本文所述之「細胞殺滅」分析法例示）測量細胞存活率。一 147375.doc -357· 201039846 種該分析法為CellTiter-GloTMS光細胞存活率分析法，其可購自Pr〇mega(MadiS〇n, WI)。該分析法基於定量所存在之ATP(其為代謝活性細胞之指示）測定培養物中之活細胞數。參見Crouch等人（1993) J_ Immunol. Meth 16〇:81_88, 美國專利第6602677號。該分析法可以96孔或384孔形式進行，使其易於自動高通量篩選（HTS)。參見Cree等人（1995) AntiCancer Drugs 6:398_404。分析程序包括向培養之細胞直接添加單一試劑（CellTiter_Glo®試劑）。此引起細胞溶解及產生由螢光素酶反應產生之發光信號。發光信號與所存在ATP之里（其與培養物中所存在之活細胞數成正比）成正比。可藉由光度計或CCD相機成像裝置記錄資料。發光輸出表示為相對光單位（RLU)。另一細胞增殖分析法為「MTT」分析法，其為一種測量線粒體還原酶氧化溴化3-(4,5-二甲基噻唑_2_基）_2,5_二苯基四峻鏽為甲腊的比色分析法。如CellTiter G1〇TM分析法般，此分析法表明細胞培養物中所存在代謝活性細胞之數目。例如參見M〇Smann (m3) j. Immun〇1 心化 65:55 63，及 Zhang等人（2005) Cancer Res. 65:3877-3882。在一態樣中，測試抗FcRH5抗體誘發活體外細胞死亡之能力。誘發細胞死亡之分析法為此項技術中所熟知。在一二貫施例中，該夺分析法測量例如如由峨化丙鍵（pj)、錐蟲藍（參見 Moore等人，（1995) Cyt〇techn〇i〇gy，ΐ7:ι ⑴或 7AAD吸收所指不之膜完整性喪失。在例示性？1吸收分析法中’將細胞培養於補充有1〇%熱滅活FBS(Hycl〇ne)及2 147375.doc -358· 201039846 mM L-麩胺醯胺之杜爾貝科氏改良伊格爾培養基 (Dulbeceo’s Modified Eagle Medium，D Mem)哈姆氏 F_ IM2)(50:50)中。由此，在不存在補體及免疫效應細胞下執行該分析法。以每培養皿3 χ丨〇6個之密度將細胞接種於100x20 mm培養m中，且使其黏附隔夜。移除培養基，置換為單獨之新鮮培養基或含有各種濃度之抗體或免疫結合物之培養基。將細胞培育3日。處理之後，用pBs 洗蘇單層且藉由胰蛋白酶化作用而脫離。隨後在4。〇下在 1200 rpm下離心細胞5分鐘，將顆粒再懸浮於3 ml冷Ca2+結

合緩衝液（10 mM Hepes(pH 7.4)、140 mM NaCM、2.5 mM

CaCh)中，且於35 mm過濾器封端之ΐ2χ75 mm管中分成等份（每管1 ml ’每處理組3管）以移除細胞團塊。管隨後接受 PI(l〇 Pg/ml)。使用FACSCAN™流式細胞儀及 FACSCONVERT™ CellQuest軟體（Becton Dickinson)分析樣品。由此鑑別出誘發如由PI吸收可測定之統計上顯著水準之細胞死亡的抗體或免疫結合物。在一態樣中，測試抗FcRH5抗體或免疫結合物誘發活體外細胞凋亡（漸進式細胞死亡）之能力。誘發細胞凋亡之抗體或免疫結合物的例示性分析法為磷脂結合蛋白結合分析法。在一例示性磷脂結合蛋白結合分析法中，如前段所論述培養細胞且接種於培養皿中。移除培養基，置換為單獨之新鮮培養基或含有至0.001至10 pg/ml之抗體或免疫結合物之培養基。培育三日之後，用PBS洗滌單層且藉由胰蛋白酶化作用而脫離。隨後將細胞離心，再懸浮於Ca2+結合 147375.doc -359- 201039846 緩衝液中且如前段所論述於管中分成等份。管隨後接受經標記之鱗脂結合蛋白（例如填脂結合蛋白V-FTIC)(；1 gg/ml)。使用 FACSCAN™ 流式細胞儀及 FACSCONVERT™ CellQuest軟體（BD Biosciences)分析樣品。由此鑑別出相對於對照組誘發統計上顯著水準之磷脂結合蛋白結合的抗體或免疫結合物。誘發細胞凋亡之抗體或免疫結合物的另一例示性分析法為偵測核小體間基因組DNA降解的組蛋白 DNA ELISA比色分析法。該分析法可使用例如細胞死亡偵測 ELISA套組（Roche, Palo Alto，CA)執行。用於任何上述活體外分析法之細胞包括天然表現FcRH5 或經工程改造可表現FcRH5之細胞或細胞株。該等細胞包括相對於具有相同組織來源之正常細胞過度表現FcrH5之腫瘤細胞。該等細胞亦包括表現FCRH5之細胞株（包括腫瘤細胞株）及通常不表現FcRH5但已用編碼FcRH5之核酸轉染之細胞株。在一態樣中’測試抗FcRH5抗體或其免疫結合物抑制活體内細胞生長或增殖之能力。在某些實施例中，測試抗 FcRH5抗體或其免疫結合物抑制活體内腫瘤生長之能力。活體内模型系統（諸如異種移植模型）可用於該測試。在一例示性異種移植系統中’將人類腫瘤細胞引入適當免疫功能不全之非人類動物（例如SCID小鼠）中。向該動物投與本發明之抗體或免疫結合物。測量抗體或免疫結合物抑制或減緩腫瘤生長之能力。在上述異種移植系統之某些實施例中’人類腫瘤細胞為來自人類患者之腫瘤細胞。該等適用 147375.doc • 360 - 201039846 於製備異種移植模型之細胞包括人類白血病及淋巴瘤細胞株，其包括（但不限於）BJAB-luc細胞（用螢光素酶報導基因轉染之EBV陰性伯基特氏淋巴瘤細胞株）、Ramos細胞 (ATCC，Manassas，VA，CRL-1923)、SuDHL-4 細胞（DSMZ， Braunschweig, Germany, AAC 495)、DoHH2 細胞（參見 Kluin-Neilemans，H.C.等人，Leukemia 5:221-224 (1991)及 Kluin-Neilemans，H.C.等人，Leukemia 8:1385-1391 (1994))、 Granta-519 細胞（參見 Jadayel, D.M.等人，Leukemia 〇 U 11(1):64-72 (1997))。在某些實施例中，藉由皮下注射或藉由移植於適合位點（諸如乳房脂肪墊）中將人類腫瘤細胞引入適當免疫功能不全之非人類動物中。 2·結合分析法及其他分析法在一態樣中，測試抗FcRH5抗體之抗原結合活性。舉例而言，在某些實施例中，測試抗FcRH5抗體結合於細胞表面上所表現之FcRH5的能力。可使用FACS分析法進行該測試。 ❹ 在一態樣中，可使用競爭分析法鑑別與鼠類13G9抗體 (mul3G9)、人類化13G9抗體及/或人類化13G9.V1及/或人類化13G9.V3及/或人類化13G9.V8抗體競爭結合於FcRH5的單株抗體。在某些實施例中，該競爭抗體結合於鼠類13G9 抗體、人類化13G9.V1抗體及/或人類化13G9.V3抗體及/或人類化13G9.V8所結合之相同抗原決定基（例如線性或構形抗原決定基）。例示性競爭分析法包括（但不限於）常規分析法，諸如 Harlow 及 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory 147375.doc -361 - 201039846

Manual,第 14 章（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)中所提供之分析法。Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology，第 66 卷（Humana Press, Totowa, NJ)中提供定位抗體所結合之抗原決定基的詳細例示性方法。兩種抗體若各將另一者之結合阻斷50%或更多，則稱作結合於相同抗原決定基。在一例示性競爭分析法中，在包含結合於FcRH5之第一經標記抗體（例如鼠類13G9(mul3G9)抗體、嵌合 13G9(chl3G9)及/或人類化13G9(hul3G9)抗體）及測試與第一抗體競爭結合於FcRH5之能力的第二未標記抗體之溶液中培育經固定FcRH5。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照組，在包含第一經標記抗體但無第二未標記抗體之溶液中培育經固定FcRH5。在允許第一抗體結合於 FcRH5之條件下培育之後，移除過量未結合之抗體，且測量與經固定FcRH5結合之標記之量。若相對於對照樣品，測試樣品中與經固定FcRH5結合之標記之量實質上降低，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合於FcRH5。在某些實施例中，經固定FcRH5存在於細胞之表面上或獲自表面表現FcRH5之細胞的膜製劑中。在一態樣中，經純化抗FcRH5抗體可進一步由如下一系列分析法表徵，包括（但不限於）N末端測序、胺基酸分析、非變性尺寸排阻高壓液相層析（HPLC)、質譜、離子交換層析及木瓜蛋白酶消化。 147375.doc - 362- 201039846 在一實施例中，本發明涵蓋一種具有一些但非所有效應功能的改變之抗體，該等功能使其成為諸多應用的適宜候選者，在該等應用中抗體之活體内半衰期很重要，然而某些效應功能（諸如補體及ADCC)為不必要的或有害的。在某些實施例中，測量抗體之Fc活性以確保僅維持所需特性。可進行活體外及/或活體内細胞毒性分析以證實CDC 及/或ADCC活性之降低/耗竭。舉例而言，可進行Fc受體 (FcR)結合分析，以確保抗體缺乏FcyR結合能力（從而可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞即NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、 FcyRII及FcyRIII。FcR在造血細胞上之表現概括於Ravetch 及 Kinet，Annu· Rev. Immunol· 9:457-92 (1991)之第 464 頁之表3中。評定所關注分子之ADCC活性的活體外分析法之一實例描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中。該等分析法之有用效應細胞包括周邊血液單核細胞（PBMC) 及自然殺手（NK)細胞。或者，或另外，例如可在動物模型 (諸如 Clynes 等人，PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型）中活體内評定所關注分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合分析以證實抗體不能結合Clq且因此缺乏 CDC活性。為評定補體活化，可執行例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)中所述之CDC分析法。亦可使用此項技術中已知之方法執行FcRn 結合及活體内清除/半衰期測定。提供以下實例僅為說明之目的，且不欲以任何方式限制 147375.doc -363 - 201039846 本發明之範疇。本說明書中所引用之所有專利及參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。實例除非另外表明，·否則根據製造商之說明書使用實例中所提及之市售試劑。實例中所用之抗體為市售抗體或本文所述之抗體。以下實例及整個說明書中由ATCC寄存編號標識的彼等細胞之來源為美國菌種保存中心（American Type Culture Collection, Manassas，VA)。實例1 :製備結合FcRH5之抗體此實例說明製備可特異性結合FcRH5之單株抗體。產生單株抗體之技術為此項技術中已知且例如描述於前述Goding中。可採用之免疫原包括經純化FCRH5、含有 FcRH5之融合蛋白及細胞表面上表現重組FcRH5之細胞。可由熟習此項技術者不經過度實驗選擇免疫原。用在完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant)中乳化且皮下或腹膜内注射1-1 00微克之量的FcRH5免疫原使小鼠（諸如 Balb/c)免疫。或者，在MPL-TDM 佐劑（Ribi Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化免疫原且注射於動物後部足墊中。隨後10至12日之後，用在所選佐劑中乳化之另一免疫原使經免疫小鼠加強免疫。此後，亦可用其他免疫注射使小鼠加強免疫，歷時數週。可週期性地藉由後眼眶出血自小鼠獲得血清樣品供在ELIS A分析法中測試以偵測抗 FcRH5抗體。 147375.doc -364- 201039846 偵測到適合之抗體力價之後，可最終靜脈内注射免疫原來注射對抗體呈「陽性」之動物。三至四日後，處死小鼠且收集脾細胞。隨後使脾細胞融合（使用35%聚乙二醇）於所選鼠類骨髓瘤細胞株（諸如P3X63AgU.l，可獲自ATCC，編號CRL 1597)。融合物產生融合瘤細胞，其可隨後塗佈於含有Η AT (次黃ϋ票吟、胺基嗓吟及胸苦）培養基之9 6孔組織培養板中以抑制未融合細胞、骨髓瘤雜交物及脾細胞雜交物之增殖。將在ELISA中篩選融合瘤細胞對免疫原之反應性。判定分泌針對免疫原之所需單株抗體的「陽性」融合瘤細胞屬於此項技術之技能範疇内。可於同源Balb/c小鼠中腹膜内注射陽性融合瘤細胞以產生含有抗免疫原單株抗體之腹水。或者，可使融合瘤細胞在組織培養燒瓶或滾瓶中生長。可使用硫酸銨沈澱繼而凝膠排阻層析純化腹水中所產生之單株抗體。或者，可採用基於抗體結合於蛋白質A或蛋白質G之親和層析。可使用此（此等）技術成功產生針對本文所揭示之FcRH5 多肽的抗體。更特定言之，可針對以下本文所揭示之 FcRH5蛋白成功產生能夠識別FcRH5蛋白及結合於FcRH5 蛋白（如由標準ELIS A、FACS分選分析及/或免疫組織化學分析所測量）的功能性單株抗體：PR0820(DNA56041)、 PR052387(DNA257845)。除製備針對本文所述之FcRH5多肽的單株抗體以外，許多單株抗體可成功地結合於細胞毒素以用於將細胞毒素引 147375.doc -365 - 201039846 導於表現（活體外與活體内）.所關注之FcRH5多肽的細胞（或組織）。舉例而言，可成功地產生針對以下本文所述之 FcRH5多肽之含有毒素（例如DM1)的單株抗體: PR0820(DNA56041)、PR052387(DNA257845)。 A.產生 FcRH5/IRTA2(PRO820、PR052387)穩定細胞株為製備篩選FcRH5抗體之細胞株，產生穩定表現經標記及未標記FcRH5/IRTA2之SVT2小鼠纖維母細胞細胞株。自脾細胞庫PCR擴增FcRH5/IRTA2 cDNA且TA選殖 (Invitrogen)於pCR4中。為製備未標記之表現構築體，藉由使用PCR添加限制位點，消化PCR產物且接合於哺乳動物表現載體pCMV.PD.nbe中將開放閱讀框架（ORF)選殖於該載體中。N末端標記之表現構築體藉由擴增無信號序列之FcRH5/IRTA2 ORF且接合PCR產物於含有gD標籤及信號序列（MGGTAA RLGAVI LFVVIVG HGV RGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVL D Q L L)(SEQ ID NO: 1)之pMSCVneo(Clontech)載體中來製備。對於各FcRH5/IRTA2，確定兩個穩定細胞株用於針對FACS特異性反應性及FcRH/IRTA之間的交叉反應性篩選單株抗體。藉由標準 Lipofectamine 2000(Invitrogen; Carlsbad, Ca)方案將經gD標記及未標記之表現載體轉染於 SVT2(在高葡萄糖DMEM+10% FBS+2 mM L-麩胺醯胺細胞中生長）中。將標記gD之轉染物置於0.5 mg/ml遺傳黴素 (Geneticin，Invitrogen; Carlsbad, Ca)選擇下歷時一週，且隨後用gD標籤特異性單株抗體（gD:952，Genentech; South 147375.doc -366- 201039846

San Francisco)進行單細胞FACS分選以獲得最高表現純系。將未標記之轉染物置於5.0 pg/mle票黴素（Calbiochem; La Jolla，Ca)選擇下直至長出可見群落。藉由標準 Trizola(Invitrogen; Carlsbad, Ca)方案及 TaqMana(ABI; Foster City, Ca)試驗分離各群落之RNA以測定最高產生純系。 B.產生針對FcRH5/IRTA2(PRO820、PR052387)之單株抗體製備能夠結合人類FcRH5之鼠類單株抗體。藉由將表現FcRH5/IRTA2之標記His之細胞外域（ECD)的載體短暫轉染於CHO細胞中產生用於使小鼠免疫之蛋白質。在鎳管柱上使經轉染細胞上清液的蛋白質純化，且藉由N末端測序證實蛋白質之身分。用 Ribi佐劑（Ribi Immunochem Research，Inc.，Hamilton, MO)中之標記重組聚組胺酸（HIS6(SEQ ID NO: 69))的蛋白質使 10 隻 Balb/c 小鼠（Charles River Laboratories, Hollister, CA)高免疫。使用類似於前述方案（Kohler及Milstein，1975 ; Hongo等人，1995)之修改方案將藉由直接ELISA顯示針對免疫原之高抗體力價且藉由FACS展示特異性結合於穩定表現所關注FcRH之SVT2小鼠纖維母細胞細胞的小鼠B細胞與小鼠骨髓瘤細胞（X63.Ag8.653 ;美國菌種保存中心， Rockville，MD)融合。10-12日之後，收集上清液且藉由直接ELISA及FACS針對抗體產生及結合進行篩選。將藉由限制稀釋第二輪次選殖之後展示最高免疫結合之陽性純系擴增且培養以進一步表徵，包括FcRHl、FcRH2、FcRH3、 147375.doc -367- 201039846

FcRH4及FcRH5特異性及交叉反應性。藉由親和層析 (Pharmacia快速蛋白質液相層析[FPLC] ; Pharmacia， Uppsala, Sweden)使用類似於前述方案（Hongo等人，1995) 之修改方案純化自各融合瘤譜系收集之上清液。隨後無菌過渡（0.2-μηι孔徑；Nalgene, Rochester NY)經純化之抗體製劑，且在4°C下儲存於磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)中。已針對PR052837(FcRH5c/IRTA2c)成功產生能夠識別且結合於FcRH5蛋白（如由標準ELISA、FACS分選分析及/或免疫組織化學分析所測量）之單株抗體且表示為：抗FcRH5-9E2(本文中稱作犯2或9£2」"（atcc編號PTA_ 7207，寄存於2005年11月9日）、抗FcRH5-lH4(本文中稱作11€4或1H4」1(ATCC編號ρτΑ_ 7208，寄存於2005年11月9日）、抗FcRH5-13G9(本文中稱作13G9或13G9丨描述於本文中）、抗FcRH5-4D10(本文中裤作4〇1〇或4〇10.1.1)(八丁〇(^編號 PTA-7210，寄存於2005年“月9日）、抗FcRH5_6Hl(本文中褲作6H1或6H1 ] ^atcc編號 PTA-7211，寄存於 2005 年 9日）、抗FcRH5-8H6(本文中稱作8H6或8H6] matcc編號 PTA-7212，寄存於2005年11月9曰）、抗FcRH5-7Dll(本文中稱作7D11或7〇11丨描述於本文中）、抗FcRH5-10A8(本文中稱作1〇A8或1〇A8」])(描述於 147375.doc '368- 201039846 2009年4月1曰申請之美國臨時專利申請案第61/211,695 號、2009年4月2日申請之第61/166,217號及2009年12月4曰申請之第61/266,972號中）。 1.親和力測定（Biacore分析) 由使用Biacore 2000表面電聚共振系統（BIAcore, Inc.)測量之締合及解離速率常數計算IgG之FcRH結合親和力。根據供應商之說明書（BIAcore, Inc.)，使用N-乙基-Ν·-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)及Ν-羥基丁二醯〇 ^ 亞胺（NHS)活化生物感應器晶片以共價偶合任一抗鼠類 IgG(BR-1008-338)。簡言之，對於各動力學分析循環，於晶片上捕捉5 μΐ 100 nM IgG，以20 μΐ/min之流速注射各種 FcRH之兩倍連續稀釋液150秒。監測抗原解離180秒，然後再生（regeneration)。藉由用1:1朗缪爾結合模型（Langmuir binding model)擬合數據計算25 C下之平衡解離常數。操作緩衝液為含有0.05% Tween-20之PBS。結果如下表9所示。所有抗體均以足以用作治療劑之親和力結合抗原。表9

鼠類抗體對Hu抗原之親和力 (Biacore) 穩定轉染細胞上之Cyno 交叉反應性(FACS) 1H4 6 nM X* 4D10 3nM 6H1 <0.1 nM X 7D11 6 nM X* 8H6 20 nM X(藉由IHC確定） 9E2 0.2 nM 10A8 N/A X 10F5 N/A .. X 13G9 19nM X *飽和濃度下極微弱 147375.doc .369- 201039846 C·構築嵌合抗人類FcRH5抗體且對其測序 1· 散合抗人類FcRHS抗體7mi(ch7OU) 為構築嵌·合7D11 IgGl，使用Qiagen RNeasy Mini套組 (目錄號74104)及製造商建議之方案自7D11融合瘤細胞提取總RNA。使用為7D11單株抗體之輕鏈及重鏈弄到之N末端胺基酸序列設計特異於各鏈之PCR引子。設計RT-PCR之反向引子以匹配對應於N末端序列之基因家族的構架4。亦設計引子以添加選殖所需之限制位點。對於輕鏈，其為N 末端之EcoRV及構架4之3'末端之ΚρηΙ。對於重鏈，所添加位點為Ν末端之BsiWI及VH-CH1接合點之略下游的Apal。引子序列如下： 7DllLCF_EcoRV(7Dll輕鏈前向引子）： 5'-GATCGATATCYTGCTSACMCARTGTCCAGC-3' (SEQ ID NO: 2) (B=G/T/C，K=G/T，Y=C/T，M=A/C，R=A/G，D=G/A/T. S=G/C，H=A/T/C) C7F7LCR.KpnI(7Dll輕鏈反向引子）： 5'-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3' (SEQ ID NO: 3) (B=G/T/C，K=G/T，Y=C/T，M=A/C，R=A/G，D=G/A/T. S=G/C « H=A/T/C) lDl(IIID-2)HCF.BsiWI(7Dll 重鏈前向引子）： 5'-GATCGACGTACGCTGARGTGCARYTGGTGGARTCTGG-3' (SEQ ID NO: 4) (B=G/T/C，K=G/T，Y=C/T，M=A/C，R=A/G，D=G/A/T. S=G/C，H=A/T/C) 147375.doc -370- 201039846 C7F7HCR.ApaI(7Dll 重鏈反向引子）： 5'-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3' (SEQ ID NO: 5) (B=G/T/C，K=G/T，Y=C/T，M=A/C，R=A/G，D=G/A/T. S=G/C，H=A/T/C) 使用（^&§611—步10'-?«1套組（目錄號210210)及所建議之反應混合物及條件進行輕鏈及重鏈之RT-PCR反應。已預先描述哺乳動物細胞表現IgG之pRK載體（Gorman等人， DNA Prot Eng Tech 2:3-10 (1990)。載體已經修飾且併入某些核酸内切酶限制酶識別位點以有助於選殖及表現 (Shields等人，《/仍C/zew 2⑽0,. 。將經擴增VL選殖於含有人類κ恆定域之pRK哺乳動物細胞表現載體（pRK.LPG3.人類κ)中。將經擴增VH插入編碼全長人類IgG 1恆定域之pRK哺乳動物細胞表現載體（pRK.LPG4.人類HC)中。獲得DNA序列以用於抗人類FcRH5(ch7Dll)之所得鼠類-人類嵌合輕鏈（圖1)及重鏈（圖3)之完整編碼區。該等DNA 所編碼之鼠類-人類嵌合輕鏈及重鏈之編碼多肽分別展示於圖2及圖4中。DNA測序之後，分析質體之表現。將質體短暫轉染於293(腺病毒轉型之人類胚腎細胞株 (Graham等人，J. Wro/·, 36: 59-74 (1977))中。特定言之，使293細胞在轉染前之日分裂，且塗佈於含血清培養基中。次曰，添加以磷酸鈣沈澱物形式製備之雙股DNA，繼而 pAdVAntage™ DNA(Promega，Madison, WI)，且在 147375.doc -371· 201039846 37°C下培育細胞隔夜。於無血清培養基中培養細胞且4曰之後收集。在蛋白質A管柱上純化經轉染細胞上清液的抗體蛋白質，且隨後緩衝液更換為10 mM丁二酸鈉、140 mM NaCl(pH 6.0)且使用 Centricon-lO(Amicon)濃縮。藉由N末端測序證實蛋白質之身分。藉由定量胺基酸分析測定蛋白質濃度。藉由FACS於SVT2細胞中如下所述測試抗體與人類FcRH5之結合。 2. 後合抗人類FcRH5抗體10A8(chl0A8> 得到抗體10A8作為抗人類FcRH5融合瘤組之成員。使用 RT-PCR構築此等抗體之小鼠/人類嵌合體，以使用總 mRNA作為受質擴增融合瘤輕鏈及重鏈之可變域。將輕鍵可變域選殖於含有人類恆定κ域之載體pRK.LPG3.人類κ 中，而將重鏈可變域選殖於編碼全長人類IgGl恆定域之載體PRK.LPG4.人類HC中。DNA測序使得可鑑別可變域之構架區及CDR區。10A8之嵌合及人類化型式描述於2009年4 月1日申請之美國臨時專利申請案第61/211，695號、2009年 4月2日申請之第61/1 66,2 17號及2009年12月4曰申請之第 61/266,972號中，該等專利申請案各以全文引用的方式併入本文中。 3. 欲合抗人類FcRHS抗體13G9(chl3G9) 得到抗體13G9作為抗人類FcRH5融合瘤組之成員。如上所述使用RT-PCR構築此等抗體之小鼠/人類嵌合體，以使用總mRNA作為受質擴增融合瘤輕鏈及重鏈之可變域。將輕鏈可變域選殖於含有人類恆定κ域之载體PRK.LPG3.人類 147375.doc -372- 201039846 κ中，而將重鏈可變域選殖於編碼全長人類IgG 1恆定域之載體PRK.LPG4.人類HC中。獲得DNA序列以用於抗人類 FcRH5(chl3G9)之所得鼠類-人類嵌合輕鏈（圖5)及重鏈（圖 7)的完整編碼區，其使得可鑑別可變域之構架區及CDR 區。該等由DNA所編碼之13G9鼠類-人類嵌合輕鏈及重鏈之編碼多肽分別展示於圖6及圖8中。用於RT-PCR之引子序列如下： 13G9LCF.EcoRV(13G9輕鏈前向引子）：〇 I’ 5'-GGAGTACATTCAGATATCGTGATGACCCARTCTCAGAAAATCATG-3' (SEQ ID NO: 6) (B=G/T/C 、K=G/T、Y=C/T、M=A/C、R=A/G、D=G/A/T_ S=G/C、H=A/T/C) CA1808 RsrII(13G9輕鏈反向引子）： 5'-GGTGCAGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCCACC-3' (SEQ ID NO: 7) MM102hc.f. PvuII(13G9重鏈前向引子）：

G 5'-GGA GTA CAT TCA CAG ATC CAG CTG GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTTAAG AAG-3' (SEQ ID NO: 8) CA2172_ApaI(13G9重鏈反向引子）： 5'-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGASTGWGG TTCC-3' (SEQ ID NO: 9) (B=G/T/C、K=G/T、Y=C/T、M=A/C、R=A/G、D=G/A/T· S=G/C ' H=A/T/C) D.產生人類化抗人類FcRH5抗體13G9 147375.doc -373 - 201039846 殘基編號係根據Kabat(Kabat等人，Segwe/ica o/proiez'Tw of immunological interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))。使用單字母胺基酸縮寫。使用IUB編碼（N=A/C/G/T，D=A/G/T， V=A/C/G，B = C/G/T，H=A/C/T，K=G/T，M=A/C， R=A/G，S = G/C，W=A/T，Y=C/T)表示 DNA簡併性。 1. 人類化抗FcRH5抗體移植物產生各種人類化抗FcRH5抗體。將鼠類FcRH5抗體 (13G9)之VL及VH域與人類共同VLKl(huKI)及人類亞群III 共同VH(huIII)域比對。鼠類13G9(mul3G9)之輕鏈可變域與人類共同序列κΐ之比對展示於圖9中。將13G9之CDR工程改造於含有哺乳動物信號序.列、人類VkI可變域之共同序列及人類恆定κΐ域之哺乳動物表現載體上。使用編碼各 CDR之單一募核苷酸及受者質體之ssDNA根據昆克 (Kunkle)突變誘發方案傳遞CDR。亦將一個鼠類殘基（丙胺酸46，構架2中之Vernier殘基）自供者mAb傳遞至受者質體。移植之殘基及所得人類13G9型式1輕鏈可變域展示於圖9中。同樣，將鼠類13G9之重鏈可變域的CDR工程改造於含有哺乳動物信號序列、人類重鏈亞群m之共同序列及編碼全長人類IgGl恆定域之序列的載體上。因為已知影響CDR構形之數個Vernier殘基處存在鼠類與人類殘基之所述差異，故亦將位置6、69、71、73、76及78處之鼠類構架殘基自供者傳遞至受者質體。鼠類13G9重鏈可變域 '人類亞群 147375.doc -374- 201039846 III可變域及所得人類13G9型式l(hul3G9_vl)重鏈可變域之比對展示於圖1 〇中。如上所述使嵌合體及13G9之型式1表現於293細胞中且純化°所得蛋白質之結合藉由FAC S及斯卡查德分析（參見下文）來分析。13G9型式l(hnl3G9.vl)與表現FcRH5之細胞的結合基本上等效於嵌合體，因此進一步使用型式1進行結合研究。應注意人類化13G9之表現相對較低。鼠類13G9之構架序列與數個人類亞群共同序列之比較展示，相較於人類2 群III’ 13G9更接近地類似亞群VII及I。此表明儘管當13G9 之CDR人類化至亞群m之構架時與FcRH5i親和力較高，但或許蛋白質摆疊並非最佳。因此，改變13G9型式1構架以提高與亞群VII之同源性而改良表現。型式1、型式3及型式8之重鏈可變域的比對展示於圖丨丨中。產生如下取代：對於型式3(hul3G9.v3)，在構架中，V12K、V13K、 q V78A。在CDR HI中，亦產生取代Μ34Ι#改良堆疊。對於型式 8(hul3G9.v8)，取代為 L11V、vi2K、V13K、L18V、 R19K、L20V、K75V、V78A、N82I、N82aS、R83K 及 M34I。 2. IgG產生將λ體短暫轉染於293(腺病毒轉型之人類胚腎細胞株 (Graham等人，X 仏〇/·，36: 59-74 (1977)))中。特定言之，使293細胞在轉染前之日分裂，且塗佈於含血清培養基中。次曰，添加以磷酸鈣沈澱物形式製備之雙股 147375.doc w 201039846 DNA，繼而 pAdVAntage™ DNA(Promega，Madison，WI)，且在37°C下培育細胞隔夜。於無血清培養基中培養細胞且 4曰之後收集。在蛋白質A管柱上自經轉染細胞上清液純化抗體蛋白質，且隨後緩衝液更換為10 mM丁二酸鈉、140 mM NaCl(pH 6·0)且使用 Centricon-lO(Amicon)濃縮。藉由 N末端測序證實蛋白質之身分。藉由定量胺基酸分析測定蛋白質濃度。藉由FACS於SVT2細胞中如下所述測試抗體與人類FcRH5之結合。 3. 結合分析（FACS分析) 為測定FcRH5抗體之交叉反應性，使用FACS分析來分析 IgG變異體與表現人類FcRHl-6之SVT2細胞的結合。簡言之，在100 μΐ中將穩定表現標記gD之huFcRHl-6的 SVT2細胞之1〇6個細胞與1 .〇 μβ鼠類或嵌合Ab[Mu抗gD(陽性對照物）、Mu 抗 FcRH5 (1H4)(「mulH4」）、Mu 抗 FcRH5 (4D10)(「mu4D10」）、Mu抗 FcRH5 (6H1)(「mu6Hl」）、 Mu 抗 FcRH5 (7D11)(「mu7Dll」）、Ch 抗 FcRH5 (7D11)(「ch7Dll」）、Mu 抗 FcRH5 (8H6)(「mu8H6」）、 Mu 抗 FcRH5 (9E2)( 「mu9E2」）或 Mu 抗 FcRH5 (13G9)(「mul3G9」）]一起培育。將穩定表現空載體之 SVT2細胞與相同抗體一起培育且用作陰性對照組。使用結合PE之大鼠抗MuIgGi、大鼠抗MuIgG2a+b或Mu抗HuIgG 作為第二偵測抗體。結果展示於圖15中。所有測試抗體均特異性結合FcRH5，除了 mu6Hl，其與FcRHl交叉反應。藉由FACS分析可知，mu8H6為弱的但FcRH5特異性抗體。 147375.doc • 376- 201039846 為進一步測定小鼠FcRH5抗體之結合，使用FACS分析來分析IgG變異體與表現人類FcRH5之Raji細胞及表現獼猴 FcRH5之293T細胞的結合。簡言之，將約1〇6個穩定轉染有人類FcRH5之Raji細胞及短暫轉染有標記gD的cyno FcRH5之293T細胞與1.0 pg經生物素標記小鼠同型對照物、經生物素標記mu抗gD、經生物素標記mu6Hl、經生物素標記mul3G9或經生物素標記 mu7Dll 在 100 μΐ FACS緩衝液（PBS、0.5% BSA、0.05%疊氮化鈉）中一起培育。使用結合PE之抗生蛋白鏈菌素作為第二偵測試劑。結果展示於圖16及17中。為對FcRH5抗體進一步進行FACS分析，每一百萬個細胞 (穩定表現huFcRH5之BJAB細胞及穩定表現cynoFcRH5之 SVT2細胞）滴定1.0 pg、0.1 pg或〇.〇1 pg抗體。簡言之，在 1 00 μΐ中將約106個細胞與每一百萬個細胞（穩定表現 huFcRH5之BJAB細胞及穩定表現CynoFcRH5之SVT2細胞）變化量（1 ·0 gg、0.. 1 gg 或 0.01 pg)之鼠類 Ab (mulH4、 mu4D10、mu6Hl、mu7Dll、mu9E2、mul0A8、mul0F5 或 mul3G9)—起培育。使用與每106個細胞1.0 pg之適當Mu IgG同型對照物一起培育作為陰性對照組。使用結合PE之大鼠抗MuIgG!或大鼠抗MuIgG2a+b作為第二偵測抗體。結果展示於圖18及19中。藉由FACS分析可知Mu抗FcRH5 (1H4)、Mu抗 FcRH5 (6H1)、Mu抗 FcRH5 (7D11)、Ms 抗 FcRH5 (10A8)、Mu抗 FcRH5 (10F5)或 Mu抗 FcRH5 (13G9) 與獼猴FcRH5交叉反應，且其可用於評定標靶依賴性毒性 147375.doc -377- 201039846 之臨床前安全性研究。 4.親和力測定（斯卡查德分析) 為進一步測定FcRH5鼠類抗體及IgG純系之結合，執行碘化IgG變異體與表現人類FcRH5之OPM2細胞及表現獼猴 FcRH5之SVT2細胞之結合，即斯卡查德分析（表9A)。對於斯卡查德分析，分別使0.5 nM標記I125之鼠類或IgG 純系抗FcRH5與範圍為50至0.02 nM(12步，1:2連續稀釋）之未標記鼠類或IgG純系抗FcRH5在穩定表現人類FcRH5之經轉染OPM2株及穩定表現獼猴FcRH5之經轉染SVT2株存在下競爭。在4°C下培育四小時之後，洗滌細胞且藉由γ計數器（1470 WIZARD自動 γ計數器；Perkin Elmer, Walthem， ΜΑ)讀取細胞顆粒計數。所有點進行三次讀數，且計數1 0 分鐘。使用平均 CPM 用 New Ligand(Genentech, South San Francisco, CA)程式計算Kd。結果展示於表9A中。表9A.斯卡查德分析測定之親和力測定值細胞株 PUR/批號 Ab Kd(nM) St.誤差 BJAB.huFcRH5 48350-22 mul3G9 0.13 0.007 SVT2.cyFcRH5 48350-22 mul3G9 0.54 0.064 OPM2.huFcRH5 MM071207 chl3G9 0.26 0.017 SVT2.cyFcRH5 MM071207 chl3G9 1.08 0.091 OPM2.huFcRH5 PUR 16864 hul3G9.1a(hul3G9.vl) hul3G9.1a 0.20 0.012 SVT2.cyFcRH5 CA51434-50 (hul3G9.vl) 0.56 0.027 BJAB.huFcRH5 50095-53 mu6Hl 0.19 0.007 SVT2.cyFcRH5 50095-93 mu6Hl 0.38 0.027 OPM2.huFcRH5 CA51434-50 hul3G9.1b1 0.30 0.027 SVT2.cyFcRH5 CA51434-50 hul3G9.1b1 0.53 0.012 147375.doc - 378- 1 11111309.113與11111309.13之不同之處在於111113 09.113在輕鏈位置87處用F替代Y(參見圖9)。 201039846 實例2 :產生抗FcRH5抗體藥物結合物（ADC) 用於產生抗人類FcRH5之抗體藥物結合物（ADC)的藥物包括類美登素DM1及DM4及多拉司他汀10衍生物單曱基奥瑞他汀E(MMAE)及單甲基奥瑞他汀F(MMAF)。（參見2005 年5月31日申請之US20050276812及2004年11月5日申請之 US 20 05 023 8649，兩者均以全文引用的方式併入本文中）。不同於MMAE、DM1及DM4，MMAF在中性pH值下具有相對的膜不可滲透性，因此作為自由態藥物具有相對較低活性，但其在細胞中之後極有效。（Doronina等人， Bioconjug. Chem., 17:114-123 (2006))。DM1、DM4、MMAE 及MM AF為有絲分裂抑制劑，其細胞毒性為化學治療法治療NHL所用之長春花生物鹼有絲分裂抑制劑的至少100倍 (Doronina 等人，B/ocoWwg. Chem., 17:114-123 (2006)； Doronina 等人，Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003)； Erickson等人，Cawcer 66: 4426-4433 (2006))。用於產生ADC之連接子對於DM1為SMCC，對於DM4為SPDB，且對於MMAE及MMAF為MC或MC-vc-PAB。對於DM1及 DM4，抗體經由離胺酸之ε-胺基使用穩定硫酯連接子 SMCC(結合之後稱作MCC)連接於DM1及DM4。或者，對於DM4，抗體經由離胺酸之e-胺基使用SPDB連接子連接於 DM4。經由SMCC連接子連接之DM1對還原條件下之裂解具有抗性。此外，SMCC-DM1及SPDB-DM4 ADC在ADC内化且靶向於溶酶體使得釋放離胺酸-Ne-DM1時誘發細胞毒性，離胺酸-Ne-DM1為細胞内之有效抗有絲分裂劑，且當 147375.doc •379- 201039846 自細胞釋放時，離胺酸-N、DM1無毒（Erickson等人， 66: 4426-4433 (2006))。對於 MMAE 及 MMAF，抗體經由半胱胺酸藉由順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸（vc)-對胺基苯甲氧基羰基（MC-vc-PAB)連接於MMAE或MMAF。對於MMAF，替代地，抗體藉由順丁烯二醯亞胺基己醯基（MC)連接子經由半胱胺酸連接於 MMAF。MC-vc-PAB連接子可由細胞間蛋白酶（諸如組織蛋白酶B)裂解，且當裂解時，釋放自由態藥物（Doronina等人，iVai. Bioiec/mo/·，21: 778-784 (2003))，而 MC連接子對細胞内蛋白酶裂解具有抗性。類似於2005年5月31日申請之美國申請案第11/141,344號所述的程序使用SMCC-DM1產生抗人類FcRH5的抗體藥物結合物（ADC)，該申請案以全文引用的方式併入本文中。將抗人類FcRH5純化抗體缓衝液更換為含有50 mM磷酸鉀及 2 mM EDTA(pH 7.0)之溶液。將 SMCC(Pierce Biotechnology， Rockford，IL)溶解於二甲基乙醯胺（DMA)中且添加至抗體溶液中’使最終SMCC/Ab莫耳比為1 〇: 1。使反應在室溫下伴隨混合進行三小時。隨後在平衡於含1 50 mM NaCl及2 mM EDTA 之 35 mM 棒樣酸納（pH 6.0)中的 GE Healthcare HiTrap 去鹽管柱（G-25)上純化經SMCC修飾之抗體《將溶解於 DMA中之DM1添加至SMCC抗體製劑中，使DM1與抗體之莫耳比為10:1。使反應在室溫下伴隨混合進行4-20小時。用20體積PBS使經DM1修飾之抗體溶液透濾以移除未反應之DM 1 ’無菌過濾且儲存在4°C下。通常，經由此方法使 147375.doc -380- 201039846 抗體之產率達40-60%。如凝膠過濾及雷射光散射所評定，該製劑通常具有>95%單體。因為DM1在252 nm下具有最大吸光度，故結合於抗體之藥物量可藉由252 nm及280 nm 下之差異吸光度測量值確定。通常，藥物與抗體之比率為 3至4。為產生每個Ab具有3-4個藥物之抗人類FcRH5 SPDB DM4抗體-藥物結合物，首先用SPDB[4-(2-吡啶基二硫基）丁酸-N-羥基丁二醯亞胺酯]修飾抗體以產生二硫基吡啶基。向抗體添加4-6倍莫耳過量之SPDB，且在室溫下反應 90分鐘。在含50 mM NaCl、2 mM EDTA之50 mM鱗酸斜 (pH 7)中在5-10 mg/ml之抗體濃度下進行反應。SPDB反應之後，添加乙醇至5% V/V之最終濃度，且添加相較於 SPDB 1.7倍莫耳過量之含硫氫基DM4藥物。在室溫下培育 16小時。藉由透遽、凝膠過渡或陽離子交換層析純化結合物。類似於2004年11月5曰申請之美國申請案第10/983,340號中所述之程序使用MC-val-cit(vc)-PAB-MMAE藥物連接子產生抗人類FcRH5之抗體藥物結合物（ADC)，該申請案以全文引用的方式併入本文中。將經純化之抗人類FcRH5抗體溶解於500 mM硼酸鈉及500 mM氯化鈉（pH 8.0)中，且進一步用過量100 MM二硫蘇糖醇（DTT)處理。在37°C下培育約30分鐘之後，藉由經葡聚糖凝膠G25樹脂溶離更換緩衝液，且用含1 mM DTPA之PBS溶離。藉由自溶液在280 nm 下之吸光度測定經還原抗體濃度且藉由與DTNB(Aldrich, 147375.doc -381 · 201039846

Milwaukee，WI)反應及測定412 nm下之吸光度測定硫氫基濃度來檢驗硫氫基/Ab值。於冰上冰凍溶解於PB S中之經還原抗體。將於DMSO中之藥物連接子MC-val-cit(vc)-PAB-MMAE溶解於乙腈及水中，且添加至於PBS中之經冰凍還原之抗體中。培育1小時之後，添加過量順丁烯二醯亞胺以使反應淬滅，且將任何未反應之抗體硫氫基封端。藉由離心超濾濃縮反應混合物，且純化抗體藥物結合物且藉由經由G25樹脂用PBS溶離去鹽，經由0.2 μηι過濾器在無菌條件下過濾，且冷凍以供儲存。實例3:製備經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體如本文所揭示製備經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體。可將半胱胺酸殘基添加至抗體之輕鏈、重鏈或Fc區中以使得可結合於各種藥物。在製備經半胱胺酸工程改造之抗FcRH5抗體13G9中，使編碼輕鏈之DNA突變誘發以如圖 14所示用半胱胺酸取代Kabat位置205處之纈胺酸。使編碼重鏈之DN A突變誘發以如圖13所示用半胱胺酸取代重鏈中 EU位置118(順序位置118，Kabat編號114)處之丙胺酸。可使抗FcRH5抗體之Fc區突變誘發以用半胱胺酸取代重鏈Fc 區中EU位置400(順序位置400 ; Kabat編號396)處之絲胺酸。實例4 :使用鼠類抗FcRH5抗體藥物結合物進行活體内腫瘤細胞殺滅分析 A.異種移植物為測試各種抗FcRH5抗體之功效，使鼠類抗人類抗體結 147375.doc - 382- 201039846 合於DM1，且分析結合之變異體對小鼠腫瘤之作用。特定言之，檢查抗體消退BJAB-螢光素酶細胞（穩定轉染有人類FcRH5之伯基特氏淋巴瘤細胞株）中腫瘤之能力。將pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5轉染於BJAB-螢光素酶細胞中及0票黴素（Calbiochem，San Diego, CA)選擇之後，將存活細胞FACS自動選殖以得到抗FcRH5抗體（7D11)之中級表現者（mid range expresser)。自動選殖後，藉由FACS分析使用抗FcRH5抗體（7D11)選擇如FACS所確定以最密切類似〇於漿細胞表現方式表現FcRH5之BJAB-螢光素酶細胞株。使用以相同方式轉染空載體pRK.CMV.PD.nbe之BJAB-螢光素酶作為陰性對照組。

為分析小鼠抗體之功效，經由注射於雌性CB17 ICR SCID 小鼠（6-8 週齡，來自 Charles Rivers Laboratories;

Hollister，CA)之側腹用2x 107個BJAB-FcRH5細胞皮下接種 CB17 ICR SCID小鼠，且使異種移植腫瘤生長至128 mm3 之平均值。除非下文特別表明，否則第0曰係指腫瘤平均〇 , V 值為100-250 mm3且投與治療之第一/或唯一劑量之曰。腫瘤體積係基於兩個使用測徑規測得之尺寸計算，且根據下式用mm3表示：V=0.5axb2，其中a及b分別為腫瘤之長直徑及短直徑。將自各實驗組收集之數據表示為平均值士SE。用抗FcRH5 ADC或對照抗體-藥物結合物以每平方公尺小鼠400 pg之單次靜脈内（i.v·)劑量的連接抗體的藥物（對應於每公斤小鼠約8-10 mg ADC)處理每組具有8隻小鼠之組。整個實驗期間一週測量腫瘤兩次。整個實驗期間一週 147375.doc -3S3- 201039846 測量小鼠之體重一次（一週兩次中之任一次）。在腫瘤體積達到2000 mm3之前或當腫瘤展示即將發生潰瘍徵兆時使小鼠安樂死。所有動物方案均經實驗動物照護及使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准。對於DM1，抗體與毒素之間所用之連接子為硫醚交聯劑 SMCC。其他連接子可包括二硫基連接子SPP或硫醚交聯劑SMCC(對於DM1)或MC或MC-纈胺酸-瓜胺酸（vc)-PAB或具有順丁烯二醯亞胺組分及對胺基苯甲基胺曱醯基（PAB) 自我犧牲組分的（纈胺酸-瓜胺酸（vc))二肽連接子試劑（對於單曱基奥瑞他汀E(MMAE)或單曱基奥瑞他汀F(MMAF))。所用毒素為DM1。其他毒素可包括MMAE或MMAF。用於此實驗之抗體包括Chang等人，PCT/US2〇04/043514 (WO 2005/063299，其以全文引用的方式併入本文中）中所述之mu7Dll以及本文所述之抗FcRH5(參見實例1B，諸如 mu 7D11，mu6Hll、mul0A8、mul3G9&mu9E2)。陰性對照物包括基於抗gp-120之結合物（SMCC-DM1)。 B. 結果 1. BJAB-FCRH5異種移植物在使用所示藥物結合物及劑量之48日時程中，nm7Dl 1、 mu6Hl、mulOA8、mul3G9&mu9E2 ADC相較於陰性對照物抗gp-120 SMCC-DM1展示抑制具有BJAB-FcRH5腫瘤之 SCID小鼠中的腫瘤生長。對於所有ADC及對照物，在第0日及第7日以兩次劑量（如下表10所示）投與ADC。特 147375.doc -384- 201039846 定言之，所有抗FcRH5 ADC均顯著抑制腫瘤生長（圖 20) ° 此外，在同一研究中，測定前17日中各劑量組中之體重變化百分比。結果（圖21)表明投與此等鼠類抗FcRH5 ADC 並未在此期間引起顯著體重減少或重量減輕。此外，在表10中表明測試總數中展示部分消退（PR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至第〇曰時所測量到之腫瘤體積的50%以下）、完全減輕（CR ;其中投藥之後任何〇時間的腫瘤體積降至0 mm3)之小鼠數目（NA=不適用）； (TI=研究結束時可觀察到之腫瘤數）。表10 所投與之抗體(治療） TI PR CR 藥物-DM1劑量 (μ^ηι2) Ab劑量 (mg/kg) 藥物比 (藥物/Ab) Mu-抗 gp 120 8/8 0 0 — 10.8 ~ Mu-抗 gp 120，mcc-dm 1 8/8 0 0 400 8.4 3.2 Mu-抗FcRH5 (7D11) 8/8 0 0 _ 10.8 - Mu-抗FcRH5 (7Dll)-mcc-dml 8/8 0 0 400 9 3 Mu-抗FcRH5 (6H1 )-mcc-dm 1 6/8 1 2 400 10.8 2.5 Mu-抗FcRH5 (10A8)-mcc-dml 7/8 3 1 400 10 2.7 Mu-抗FcRH5 (13G9)-mcc-dml 7/8 0 1 400 8.4 3.2 Mu-抗FcRH5 (9E2)-mcc-dml 8/8 2 0 400 10.4 2.6 實例5:小鼠抗FcRH5 Mab藥物結合物抑制活體内腫瘤生長之分析 A.異種移植物為測試具有-SPDB-DM4、SMCC-DM1、MC-vc-PAB-MMAE及MC-MMAF之mul3G9藥物結合物之功效，分析 mu 13 G9藥物結合物對小鼠腫瘤之作用。 147375.doc -385 · 201039846 特定言之，檢查抗體消退穩定轉染有人類FcRH5之 OPM2細胞（多發性骨髓瘤細胞株）中腫瘤之能力。將線性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5轉染於OPM2細胞中及 0票黴素（Calbiochem, San Diego, CA)選擇之後，用標記生物素（Pierce Biotechnology, Rockford，II)之抗 FcRH5.7Dll 及MACS抗生物素微珠粒在MACS LS管柱（Miltenyi Biotec, Auburn, Ca)上分離存活細胞中表現FcRH5之細胞。分離後，藉由FACS分析使用抗FcRH5抗體（10A8)及（13G9)及以相同方式轉染空載體pRK.CMV.PD.nbe作為陰性對照組之 OPM2細胞株證實FcRH5表現。為分析具有 SPDB-DM4、SMCC-DM1、MC-vc-PAB-MMAE及MC-MMAF之mul3G9藥物結合物之功效，經由注射於雌性CB17 ICR SCID小鼠（6-8週齡，來自Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)之側腹用 2χ107個 OPM2-FcRH5細胞皮下接種CB17 ICR SCID小鼠，且使異種移植腫瘤生長至21 5 mm3之平均值。除非下文特別表明，否則第0曰係指腫瘤平均值為100-250 mm3且投與治療之第一 / 或唯一劑量之日。腫瘤體積係基於兩個使用測徑規測得之尺寸計算，且根據下式用mm3表示：V=0.5axb2，其中a及b 分別為腫瘤之長直徑及短直徑。將自各實驗組收集之數據表示為平均值土SE。用抗FcRH5 ADC或對照抗體-藥物結合物以每公斤10 mg之單次靜脈内（i.v.)劑量的ADC處理每組具有8隻小鼠之組。整個實驗期間一週測量腫瘤兩次。整個實驗期間一週測量小鼠之體重一次。在腫瘤體積達到 147375.doc - 386- 201039846 3000 mm3之前或當腫瘤展示即將發生潰瘍徵兆時使小鼠安樂死。所有動物方案均經實驗動物照護及使用委員會 (IACUC)批准。陰性對照物包括基於抗gp-120之結合物（SPDB-DM4、 SMCC-DM1、MC-vc-PAB-MMAE及 MC-MMAF)。 B. 1. OPM2-FcRH5異種移植物在使用表11所示之藥物結合物及劑量的50日時程中， mul3G9 SPDB-DM4、SMCC-DM1、MC-vc-PAB-MMAE及 MC-MMAF ADC相較於陰性對照物抗gp-120 SPDB-DM4、 SMCC-DM1、MC-vc-PAB-MMAE及 MC-MMAF ADC展示抑制具有〇PM-FcRH5腫瘤之SCID小鼠中的腫瘤生長。對於所有ADC及對照物，在第0日及第7日以兩次劑量投與 ADC。特定言之，所有抗FcRH5 ADC均顯著抑制腫瘤生長（圖22)。此外，在同一研究中，測定前14曰中各劑量組中之體重變化百分比。結果（圖23)表明投與此等鼠類抗FcRH5 ADC並未在此期間引起顯著體重減少或重量減輕。此外’在表11中表明測試總數中展示部分消退（PR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至第〇曰時所測量到之腫瘤體積的50%以下）、完全減輕（CR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至0 mm3)之小鼠數目（NA=不適用）； (TI=研究結束時可觀察到之腫瘤數）。 147375.doc -387- 201039846 表11. 所投與之抗體(治療） TI PR CR 藥物-DM1 劑量 (Mfi/m2) Ab剤量 (mg/kg) 藥物""比 (藥物 /Ab) 媒劑* 7/7 0 0 n/a — n/a Mu-抗 gp 120-spdb_DM4 7/7 0 0 329 10 3.0 ' Mu-抗 gp 120-smcc-dm 1 7/7 0 0 332 10 3.2 Mu-抗 gp 120-MC-MMAF 7/7 0 0 371 10 3.6 Mu-抗 gp 120-MCvcPAB-MMAE 7/7 0 0 293 10 2.9 Mu-抗FcRH5 (13G9)-spdb-DM4 5/6 5 1 362 10 3.3 Mu-抗FcRH5 (13G9)-smcc-dml 7/7 0 0 363 Ϊ0 3.5 Mu-抗FcRH5 (13G9)-MC-MMAF 7/7 0 0 360 10 3.5 Mu-抗FcRH5 (13G9)-MCvcPAB-MMAE 7/7 0 0 363 10 3.6 *媒劑=20 mM組胺酸乙酸鹽（pH 5.5)、240 mM蔗糖、0.02% PS20 實例6 :抗FcRH5 Mab藥物結合物減少活體外細胞增殖之分析藉由細胞增殖分析法用穩定表現人類FcRH5之經轉染 OPM2 株（OPM2.CMV.PD.FcRH5.SP.2)測量 mul3G9 藥物結合物（包括 mu 抗 FcRH5 (13G9)-裸、mu 抗 FcRH5 (13G9)-SMCC-DM1、mu 抗 FcRH5 (13G9)-SPDB-DM4、mu 抗 FcRH5 (13G9)-MC-vc-PAB-MMAE 及 mu 抗 FcRH5 (13G9)-MC-MMAF)之活體外效能。CellTiter-Glo®發光細胞存活率分析法為一種基於重組表現勒翅目（Coleoptera)螢光素酶 (US 5583024 ; US 5674713 ; US 5700670)之市售（Promega Corp·，Madison，WI)均質分析方法。此細胞增殖分析法基於定量所存在之ATP(代謝活性細胞之指示）測定培養物中活細胞數（Crouch等人，J_ Immunol. Metho.，160: 81-88 (1993); US 6602677)。以 96孔形式進行 CellTiter-Glo® 分析法，使其易於進行自動高通量篩選（HTS)(Cree等人， I47375.doc -388- 201039846

AntiCancer Drugs，6:398-404 (1995))。均質分析程序包括直接向培養於補充血清之培養基中的細胞添加單一試劑 (CellTiter_Glo®試劑）。均質「添加-混合-測量」形式引起細胞溶解且產生與所存在之ATP之量成正比的發光信號。受質（曱蟲（Beetle)螢光素）藉由重組螢火蟲螢光素酶氧化去羧基化，同時伴有 ATP轉化為AMP且產生光子。活細胞以相對發光單位 (RLU)反映。可藉由光度計或CCD相機成像裝置記錄數〇據。發光輸出以RLU呈現，且隨時間測量。％RLU為相較於「非藥物結合物」對照組校正之RLU百分比。或者，可在閃爍體存在下在閃爍計數器中計數發光中之光子。隨後光單位可表示為CPS(每秒計數）。藉由細胞增殖分析法，採用自CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega Corp. Technical bulletin TB288 ; Mendoza等人，Cancer Res.，62: 5485-5488 (2002) ^ 修改之以下方案測量人類化抗體-藥物結合物之功效： 1.將培養基中含有約 75,000個 OPM2.CMV.PD.FcRH5.SP.2 細胞的50 μΐ份之細胞培養物沈積於96孔不透明壁板之各孔中〇 2·將mul3G9 Ab或ADC(50 μΐ)添加至三個實驗孔中達 10000、3333、1111、370、123、41、14、4.6或1.5 1^/1111^ 之最終濃度，其中「非藥物結合物」對照孔接受單獨之培養基，且培育3曰。 3.將培養板平衡至室溫歷時約30分鐘。 147375.doc -389- 201039846 4. 添加 CellTiter-Glo試劑（ΙΟΟμΙ)。 5. 在迴轉式震盪器上混合内容物2分鐘以誘發細胞溶解。 6. 在室溫下培育培養板10分鐘以穩定發光信號。 7. 記錄發光且在曲線中以％RLU(相對發光單位）為單位報導。 8. 作為對照組，同時用不相關非結合小鼠抗GP120 Ab 或 ADC(包括 mu 抗 GP120-裸、mu 抗 GP120-SMCC-DM1、mu 抗 GP120-SPDB-DM4、mu 抗 GP120-MC-vc-PAB-MMAE 及 mu抗GP120-MC-MMAF)對相同細胞株進行試驗。培養基：使 OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2 細胞在 RPMI1640/20%FBS/2 mM麩醯胺酸/1.0 pg/m卜票黴素中生長。小鼠抗體-藥物結合物之功效展示於圖24-25中。此分析結果以IC5〇值用mg/ml為單位加以說明。IC5〇值為抗體或 ADC 50%抑制細胞生長所需之濃度。認為以上書面說明足以使得熟習此項技術者可實踐本發明。本發明之範疇並不限於所寄存之構築體，因為所寄存之實施例僅欲作為本發明之某些態樣的單一說明，且功能等效之任何構築體均屬於本發明之範疇内。本文所寄存之材料並非承認本文含有之書面說明不足以使得可實踐本發明之任何態樣，包括其最佳方式，亦不應視為將申請專利範圍之範疇限於其所代表之特定說明。實際上，熟習此項技術者由上述描述顯而易見除本文所示及所述之外的本發 147375.doc -390 - 201039846 明之各種修改且屬於隨附申請專利範圍之範疇内。實例7 :人類化抗FcRH5藥物結合物及Velcade®抑制活體内腫瘤生長之分析 A.異種移植物為測試具有MC-vc-PAB-MMAE之人類化（13G9)藥物結合物與Velcade®(硼替佐米）之組合的功效，分析單獨之結合抗體及結合抗體與Velcade®之組合對小鼠腫瘤（多發性骨髓瘤OPM2_FcRH5異種移植物）之作用。 ^ 特定言之，檢查抗體及Velcade®消退穩定轉染有人類

FcRH5之OPM2細胞（多發性骨髓瘤細胞株）中腫瘤之能力。將線性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5轉染於OPM2細胞中及嘌黴素（Calbiochem, San Diego, CA)選擇之後，用標記生物素（Pierce Biotechnology，Rockford，II)之抗 FcRH5.7Dll 及 MACS抗生物素微珠粒在MACS LS管柱（Miltenyi Biotec, Auburn, Ca)上分離存活細胞中表現FcRH5之細胞。分離後，藉由FACS分析使用抗FcRH5抗體（13G9)及以相同方式〇轉染空載體pRK.CMV.PD_nbe作為陰性對照組之OPM2細胞株證實FcRH5表現。為分析單獨之與MC-vc-PAB-MMAE結合之hu抗FcRH5 13G9及該抗體與Velcade®之組合的功效，經由注射於雌性 CB17 ICR SCID 小鼠（6-8 週齡，來自 Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)之側腹用 2><107個 OPM2-FcRH5 細胞皮下接種CB17 ICR SCID小鼠，且使異種移植腫瘤生長至33 1 mm3之平均值。除非另外表明，否則第0曰係指腫 147375.doc •391 · 201039846 瘤為m-5u mm3且投與治療之第一㈤难一劑量之日。腫瘤體積係基於兩個使用測徑規測得之尺寸計算，且根據下式用mm3表示：V=：0.5axb2，其巾⑻分別為腫瘤之長直徑及短直徑。將自各實驗組收集之數據表示為平均值+se。將小鼠隨機分為九組(每組具有約9隻小鼠)且進行給藥。第 1組在第0日接受單次靜脈内（IV)注射組胺酸緩衝液，且在第0曰第3曰、第7曰及第10曰每週兩次靜脈内注射〇9 % 氯化鈉（生理食鹽水）歷時兩週作為媒劑對照組。第2組在第〇日接受單次靜脈内注射10 mg/kg Hl^^Her2曲妥珠單抗_ MC-Vc-PAB-MMAE(CNJ 1135)作為結合物對照組。第3組在第〇日、第3日、第7日及第1〇日每週兩次接受靜脈内注射1 mg/kg Velcade®歷時兩週。第4-5組在第〇曰分別接受單次靜脈内注射4 mg/kg或1〇 mg/kg thio hu抗

FcRH5(13G9)-HC-MC-vc-PAB-MMAE(CNJ 1465)。第 6-7組在第〇日分別接受單次靜脈内注射4 mg/kg或10 mg/kg hu抗

FcRH5(13G9)-MC-vc-PAB-MMAE(CNJ 1575)。第 8組在第 0 曰接受單次靜脈内注射4 mg/kg hu抗FcRH5(13G9)-MC-vc-PAB-MMAE(CNJ 1575)，且在第0曰、第3曰、第7曰及第 1 0日每週兩次靜脈内注射1 mg/kg Velcade®歷時兩週。整個實驗期間一週測量腫瘤兩次。前三週一週測量小鼠體重兩次。在腫瘤體積達到3000 mm3之前或當腫瘤展示即將發生潰瘍徵兆時使小鼠安樂死。所有動物方案均經實驗動物照護及使用委員會（IACUC)批准。陰性對照物包括基於抗HER2(HERCEPTIN®)(曲妥珠單 147375.doc -392- 201039846 抗）之結合物（MC-vc-PAB-MMAE)。 B.結果 1. OPM2-FcRH5異種移植物在使用單獨之藥物結合物及藥物結合物與Velcade®之組合的研究結束時，與MC-vc-PAB-MMAE結合之hul3G9與 Velcade®之組合相較於陰性對照物與MC-vc-PAB-MMAE結合之人類化抗Her2(Hu抗Her2曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE)經分析抑制具有〇PM2-FcRH5腫瘤之SCID小鼠中的腫瘤生長。此外，測定前24日中各劑量組中之任何體重變化百分比。亦測定了測試總數中展示部分消退（PR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至第0日時所測量到之腫瘤體積之50°/。以下）、完全減輕（CR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至0 mm3)之小鼠數目（NA=不適用）；（TI= 研究結束時可觀察到之腫瘤數）。實例9 :人類化抗FcRH5藥物結合物抑制活逋内腫瘤生長〇之分析 A、異種移植物為測試具有SPDB-DM4之人類化（13G9)藥物結合物與 Velcade®之組合的功效，分析單獨之結合抗體及結合抗體與Velcade®之組合對小鼠腫瘤（多發性骨髓瘤OPM2-FcRH5 異種移植物）的作用。特定言之，檢查抗體及Velcade®消退穩定轉染有人類 FcRH5之OPM2細胞（多發性骨髓瘤細胞株）中腫瘤之能力。將線性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5轉染於OPM2細胞中及嘌 147375.doc • 393 - 201039846 黴素（Calbiochem，San Diego, CA)選擇之後，用標記生物素（Pierce Biotechnology，Rockford, II)之抗 FcRH5.7Dll 及 MACS抗生物素微珠粒在MACS LS管柱（Miltenyi Biotec， Auburn, Ca)上分離存活細胞中表現FcRH5之細胞。分離後’藉由FACS分析使用抗FcRH5抗體（13G9)及以相同方式轉染空載體pRK.CMV.PD.nbe作為陰性對照組之OPM2細胞株證實FcRH5表現。為分析單獨之結合於-SPDB-DM4之Hu抗FcRH5 13G9及該抗體與Velcade®之組合的功效，經由注射於雌性cb 1 7 ICR SCID小鼠（6-8週齡，來自 Charles Rivers Laboratories. Hollister，CA)之側腹用2><107個〇卩1^2-?^^5細胞皮下接種 CB17 ICR SCID小鼠，且使異種移植腫瘤生長至306 mm3 之平均值。除非另外表明，否則第0日係指腫瘤為197-499 mm3且投與治療之第一 /或唯一劑量之日。腫瘤體積係基於兩個使用測徑規測得之尺寸計算，且根據下式用mm3表示：V=0.5axb2，其中a及b分別為腫瘤之長直徑及短直徑。將自各實驗組收集之數據表示為平均值+SE。將小氣隨機分為六組（每組具有約9隻小鼠）且進行給藥。第1組在第0曰、第3曰、第7曰及第10曰每週兩次接受靜脈内（Iv) 注射1 mg/kg Velcade®歷時兩週。第2組在第0日接受單-欠靜脈内注射組胺酸緩衝液，且在第0日、第3日、第7日及第10日每週兩次靜脈内注射0.9%氣化鈉（生理食鹽水）歷時兩週作為媒劑對照組。第3組在第0日接受單次靜脈内注射 4 mg/kg Hu 抗 Her2 曲妥珠單抗-SPDB-DM4(CNJ 1433)作為 147375.doc -394- 201039846 結合物對照組。第4組在第0日接受單次靜脈内注射4 mg/kg Hu抗FcRH5 13G9 SPDB-DM4(CNJ 1503)。第 5組在第0日接受單次靜脈内注射4 mg/kg Hu抗Her2曲妥珠單抗-SPDB-DM4(CNJ 1433)，且在第0曰、第3曰、第7曰及第10 日每週兩次靜脈内注射1 mg/kg Velcade®歷時兩週。第6組在第〇日接受單次靜脈内注射4 mg/kg Hu抗FcRH5 13G9 SPDB-DM4(CNJ 1 503)，且在第0曰、第3曰、第7曰及第10 日每週兩次靜脈内注射1 mg/kg Velcade®歷時兩週。整個實驗期間一週測量腫瘤兩次。前三週一週測量小鼠體重兩次。在腫瘤體積達到3000 mm3之前或當腫瘤展示即將發生潰瘍徵兆時使小鼠安樂死。所有動物方案均經實驗動物照護及使用委員會（IACUC)批准。陰性對照物包括基於抗HER2(HERCEPTIN®)(曲妥珠單抗）之結合物（SPDB-DM4)。 B.結果 1· OPM2-FcRHS異種移植物在使用單獨之藥物結合物及藥物結合物與Velcade®之組合的研究結束時，與-SPDB-DM4結合之人類化抗FcRH5 (13G9)與Velcade®之組合相較於陰性對照物與SPDB-DM4 結合之人類化抗Her2(Hu抗Her2曲妥珠單抗-SPDB-DM4)經分析抑制具有〇PM2-FcRH5腫瘤之SCID小鼠腫瘤生長。此外，測定前21日中各劑量組中之體重變化百分比。亦測定測試總數中展示部分消退（PR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至第0日時所測量到之腫瘤體積的50%以下）、 147375.doc •395· 201039846 完全減輕（CR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至 0 mm3)之小鼠數目（NA=不適用）；（TI=研究結束時可觀察到之腫瘤數）。實例10:人類化抗FCRH5藥物結合物抑制活體内腫瘤生長之分析 A.異種移植物為測試具有-MC-vc-PAB-MMAE之人類化（13G9)藥物結合物與Revlimid®及Revlimid®加上地塞米松之組合的功效，分析結合之抗體與Revlimid®及Revlimid®加上地塞米松之組合對小鼠腫瘤（多發性骨髓瘤〇PM2-FcRH5異種移植物）的作用。特定言之，檢查抗體與Revlimid®及Revlimid®加上地塞米松之組合消退穩定轉染有人類FcRH5之OPM2細胞（多發性骨髓瘤細胞株）中腫瘤之能力。將線性化 pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5轉染於OPM2細胞中及嘌黴素 (Calbiochem，San Diego, CA)選擇之後，用標記生物素 (Pierce Biotechnology, Rockford, II)之抗 FcRH5.7Dll 及 MACS抗生物素微珠粒在MACS LS管柱（Miltenyi Biotec, Auburn，Ca)上分離存活細胞中表現FcRH5之細胞。分離後，藉由FACS分析使用抗FcRH5抗體（13G9)及以相同方式轉染空載體pRK.CMV.PD.nbe作為陰性對照組之OPM2細胞株證實FcRH5表現。為分析結合於-MC-vc-PAB-MMAE之Hu抗FcRH5 13G9與 Revlimid®及Revlimid®加上地塞米松之組合的功效，經由 147375.doc •396- 201039846 注射於雌性CB17 ICR SCID小鼠（6-8週齡，來自Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)之側腹用 2x 107個 OPM2-FcRH5細胞皮下接種CB17 ICR SCID小鼠，且使異種移植腫瘤生長至446 mm3之平均值。除非另外表明，否則第0日係指腫瘤為263-630 mm3且投與治療之第一/或唯一劑量之曰。腫瘤體積係基於兩個使用測徑規測得之尺寸計算，且根據下式用mm3表示：V=0,5axb2，其中a及b分別為腫瘤之長直徑及短直徑。將自各實驗組收集之數據表示為平均值 + SE。將小鼠隨機分為九組（每組具有約8隻小鼠）且進行給藥。第1組在第0日-第13日每日接受腹膜内（IP)注射DMSO 與MCT緩衝液之混合物作為媒劑對照組。第2組在第0曰接受單次靜脈内（IV)注射6 mg/kg Hu抗Her2曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE(CNJ 1135)作為結合物對照組。第3組在第0 曰接受單次靜脈内注射6 mg/kg Hu抗FcRH5 13G9-MC-vc-PAB-MMAE(CNJ 1672)作為結合物對照組。第4組在第0曰-第13日每曰接受腹膜内注射50 mg/kg Revlimid®。第5組在第0曰-第3曰及第7曰-第10曰每曰接受經口（PO)給與3 mg/kg地塞米松歷時四日繼而停藥三日歷時兩個循環。第6 組在第0日-第13日每日接受腹膜内注射50 mg/kg Revlimid®，且在第0曰-第3曰及第7曰-第10曰每曰經口給與3 mg/kg地塞米松歷時四日繼而停藥三日歷時兩個循環。第7組在第0曰接受單次靜脈内注射6 mg/kg Hu抗Her2 曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE(CNJ 1135)，且在第0曰-第 13日每曰腹膜内注射50 mg/kg Revlimid®，且在第0日第3 147375.doc •397· 201039846 曰及第7日-第10日每日經口給與3 mg/kg地塞米松歷時四曰繼而停藥三曰歷時兩個循環。第8組在第0日接受單次靜脈内注射 6 mg/kg Hu抗FcRH5 13G9-MC_vc-PAB-MMAE(CNJ 1672)，且在第0日-第13日每日腹膜内注射50 mg/kg Re vlimi d®，且在第〇曰-第3曰及第7曰-第10曰每曰經口給與3 mg/kg地塞米松歷時四曰繼而停藥三曰歷時兩個循環。第9組在第0曰接受單次靜脈内注射6 mg/kg Hu抗 FcRH5 13G9-MC-vc-PAB-MMAE(CNJ 1672)，且在第〇日-第 13 日每日腹膜内注射50 mg/kg Revlimid®。整個實驗期間一週測量腫瘤兩次。整個實驗期間一週測量小鼠體重兩次。若小鼠體重相較於其第〇日之體重減輕15%以上，則每曰稱量小鼠直至重量恢復或直至體重減輕達到20%以上。當小鼠體重相較於其第〇曰之體重減輕達到20%以上時，在腫瘤體積達到3000 mm3之前或當腫瘤展示即將發生潰瘍之徵兆時使小鼠安樂死。所有動物方案均經實驗動物照護及使用委員會（IACUC)批准。陰性對照物包括基於抗HER2(HERCEPTIN®)(曲妥珠單抗）之結合物（MC-vc-PAB-MMAE)。結果 1. OPM2-FcRHS異種移植物

在使用藥物結合物與Revlimid®及Revlimid®加上地塞米松之組合的研究結束時，與-MC-vc-PAB-MMAE結合之人類化抗FcRH5 (13G9)結合物與Revlimid®及Revlimid®加上地塞米松之組合相較於陰性對照物與-MC-vc-PAB-MMAE 147375.doc -398- 201039846 結合之人類化抗HER2(Hu抗Her2曲妥珠單抗-MC-vc-PAB-MMAE)經分析抑制具有OPM2-FcRH5腫瘤之SCID小鼠中的腫瘤生長。此外，測定前17曰中各劑量組中之體重變化百分比。亦測定測試總數中展示部分消退（PR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至第0日時所測量到之腫瘤體積的50%以下）、完全減輕（CR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至0 mm3)之小鼠數目（NA=不適用）；（TI=研究結束時可觀察到之腫瘤數）。實例11 : FcRH5雙特異性抗體之產生及表徵構築及產生抗CD3/FcRH5雙特異性抗體。構築FcRH5雙特異性抗體（特定而言抗CD3/FcRH5腔内突起雙特異性抗體）如下所述。先前已描述各種腔内突起雙特異性抗體。例如參見美國專利第 5,731,168號及第7，183,076號；1^{1§^^>^等人，？1^· Eng. 9:617-621 (1996) ; Atwell等人，J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997) ; Merchant 等人，Nat. Biotechn. 16:677-681 (1998)。在某些情況下，將先前由Chamow等人，J. Immunol. 153:4268 (1994)所述之人類化抗 CD3/CD4-IgG 嵌合體之間的CH3界面工程改造以使可自共轉染有表現構築體之哺乳動物細胞株回收的雜多聚體的百分比最大化。如本文所用之「雜多聚體」係指包含至少第一多肽及第二多肽之分子（例如雙特異性抗體），其中第二多肽與第一多肽的胺基酸序列的至少一個胺基酸殘基不同。如前段所引用之文件所述，用於驅使雜多聚體形成之策 147375.doc -399- 201039846 略需要向第一多肽引入一或多個「突起」突變，例如一個抗體Η鍵之Ch3域，且向第二多肽引入一或多個相應「空腔」突變’例如第二抗體Η鏈之CH3域。「突起」突變用較大胺基酸置換小胺基酸，且「空腔」突變用較小胺基酸置換大胺基酸。此外’除突起及空腔突變以外，亦在兩個多肽之界面（例如兩個CH3域）處引入含游離硫氫基之殘基，該等殘基展示可促進雜多聚體形成。已描述在多肽界面處引入之各種例示性腔内突起突變及含游離硫氫基之殘基。例如參見美國專利第號及第7,183,076號；

Ridgway等人 ’ Prot. Eng. 9:617-621 (1996) ; Atwell等人， J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997) ; Merchant 等人，Nat. Biotechn. 16:677-681 (1998)。進行以下步驟以產生抗CD3/FcRH5雙特異性抗體。構築編碼鼠類抗CD3單株Ab UCHT1之人類化抗CD3輕（L)鏈及重（H)鏈變異體的大腸桿菌表現質體（美國專利第5,821,337 號及第 6,407,213號，Shalaby等人，乂五Med. 175: 217 [1992]及 Rodrigues 等人，/价_ j cwcer「增办广：45 [1992])。此項技術中已知多種適合之大腸桿菌表現質體，包括 pAK19。Carter 等人，Bio/Tehcnology 10:163-167 (1992)。舉例而言，藉由定點突變誘發進行向人類化抗 CD3 Η鏈之CH3域（如上所述）中引入突起或空腔的突變。各種定點突變誘發方法為此項技術中所熟知。例如參見

Kunkel等人，Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)。另外，構築編碼人類化抗FcRH5輕鏈及重鏈（諸如本文所述之 147375.doc -400· 201039846 人類化抗FcRH5輕鏈及重鏈）之大腸桿菌表現質體。舉例而言’藉由定點突變誘發進行在人類化抗FcRH5 η鏈之Ch3 域（如上所述）中引入相應空腔（若抗CD3 Ch3域具有突起突變）或相應突起（若抗CD3 CH3域具有空腔突變）之突變。藉由使用此項技術t熟知之方法將上述大腸桿菌表現質體轉型於適當大腸桿菌菌株（例如33B6)中產生雙特異性抗 CD3/FcRH5抗體。例如參見 R〇drigUes 等人，Cancer Res· 55:63-70 (1995)。由在前述i〇 L醱酵罐中生長之經轉型大腸才干囷分泌抗體。Carter等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992)。使用此項技術中已知之程序純化且分析抗體。例如參見 Atwell等人，J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997)。細胞結合分析：為評定抗CD3/FcRH5雙特異性抗體結合 B細胞及T細胞之能力，使用聚蔗糖梯度根據此項技術中已知之標準程序自健康供者之全血分離人類周邊白血球。將約1百萬個細胞與抗CD3/FcRH5雙特異性抗體一起在冰上於含有0.5% BSA及2mM EDTA之PBS溶液的緩衝液中培育。隨後洗滌細胞，且根據製造商之方案（BD Biosciences， San Diego, CA)用結合FITC之山羊（Fab')2抗人類IgG以及抗 CD8-APC 及抗 CD138-PE 及抗 CD38-PerCP-Cy5抗體染色。用基於FACS之分析法，使用FACSCaliburTM流式細胞儀 (BD Biosciences, San Diego, CA)評定結合活性，且使用 Flowjo軟體（Tree Star, Ashland, OR)進行分析。活體外細胞殺滅分析：使用EJM-FcRH5.LSP.2多發性骨髓瘤細胞（EJM細胞，DSMZ ACC-560，穩定轉染有人類 147375.doc -401 - 201039846

FcRH5)作為標靶細胞，且與全人類周邊白血球或CD8+ Τ 細胞共培養。若使用CD8+ Τ細胞’則自人類PBMC藉由陰性分選使用CD8+ Τ細胞分離套組（Miltenyi Biotech, Auburn，CA)在96孔圓底板中純化CD8+ T細胞。在有或無抗匚03/?〇1^5雙特異性抗體的情況下，每孔添加20,000個 EJM-FcRH5.LSP.2細胞，其中標靶：效應細胞之比率 = 1:10。約19小時之後，根據製造商之方案（BD Biosciences, San Diego, CA)將細胞用經標記抗CD38-FITC及抗CD138-PE 染色，且與Fluoresbrite®校準級6.0微米YG微球體 (Polysciences, Inc·，Warrington, PA)混合。藉由閘控前散射/側散射及CD38-CD138染色進行FACS分析。根據標準程序使用碘化丙錠染色去除死細胞。根據以下等式計算抗 CD3/FcRH5雙特異性抗體之特異性殺滅活性：特異性殺滅 %=(1-經處理活 EJM-FCRH5.LSP.2 細胞數 /無抗 CD3/FcRH5 雙特異性抗體的情況下效應細胞及EJM-FCRH5.LSP.2中活 EJM-FCRH5.LSP.2細胞數）χΙΟΟ。活邀冷功效.·將EJM-FcRH5.LSP.2多發性骨髓瘤細胞與周邊血液單核細胞混合，且皮下注射於雌性NOD.CD17-PrA：i/ciCiiVj 小鼠（Charles Rivers Laboratories, Wilmington， MA)之右胸側。隨後將經接種小鼠隨機分成對照組及處理組。向對照組投與媒劑或抗CD3/Her2對照雙特異性抗體。向處理組投與抗CD3/FcRH5雙特異性抗體。雙特異性抗體之投與範圍為0.01 mg/kg至10 mg/kg。細胞接種後1-2小時内靜脈内投與對照組或處理組，且每日重複，連續5曰。 147375.doc -402- 201039846 使用測徑規一週兩次測量腫瘤之兩個尺寸（長度及寬度）。一週兩次臨床上監測小鼠。在實驗結束時，將用對照物處理之動物與用抗CD3/FcRH5雙特異性抗體處理之動物的腫瘤尺寸進行比較以評定抗CD3/FcRH5雙特異性抗體處理之功效。實例12 :人類化抗FcRH5藥物結合物抑制活髏内腫瘤生長之分析 A.異種移植物為測試不同劑量之具有MC-vc-PAB-MMAE之hul3G9藥物結合物的功效，分析結合之抗體對小鼠腫瘤之作用。特定言之，檢查抗體消退穩定轉染有人類FcRH5之EJM 細胞（多發性骨髓瘤細胞株）中腫瘤之能力。 EJM(ACC-5 60)細胞為獲自DSMZ(Germany)之市售人類多發性骨髓瘤細胞株。因為EJM細胞並不内源表現 FcRH5，故用人類FcRH5穩定轉染EJM細胞，得到 EJM.CMV.PD.FcRH5.LSP.2細胞株。為分析具有MC-vc-PAB-MMAE之hul3G9藥物結合物之功效，經由注射於雌性CB17 ICR SCID小鼠（6-8週齡，來自 Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)之側腹用 2xl07個EJM2-FcRH5.LSP.2細胞皮下接種CB17 ICR SCID 小鼠，且使異種移植腫瘤生長至134 mm3之平均值。除非另外表明，否則第0日係指腫瘤平均值為100-250 mm3且投與治療之第一 /或唯一劑量之日。腫瘤體積係基於兩個使用測徑規測得之尺寸計算，且根據下式用mm3表示： 147375.doc -403- 201039846 V=0_5axb2，其中a及b分別為腫瘤之長直徑及短直徑。將自各實驗組收集之數據表示為平均值土SE。用抗FcRH5 ADC或對照抗體-藥物結合物（ADC)以範圍為每公斤約1 mg 至約8 mg之單次靜脈内（i,v·)劑量的ADC處理每組具有隻小鼠之組。整個實驗期間一週測量腫瘤兩次。一週測量小鼠之體重一次歷時2週。在腫瘤體積達到3000 mm3之前或當腫瘤展示即將發生潰瘍徵兆時使小鼠安樂死。陰性對照物包括基於抗HER2(HERCEPTIN®)(曲妥珠單抗）之結合物 (MC-vc-PAB-MMAE)。 B,結果 1. EJM-FcRHS.LSP.2異種移植物在實驗結束時，將用對照物處理之動物與用抗FcRH5 ADC處理之動物的腫瘤尺寸進行比較以評定抗FcRH5 ADC 療法之功效。特定言之，亦測定測試總數中展示部分消退 (PR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至第〇曰時所測量到之腫瘤體積的50%以下）、完全減輕（CR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至0 mm3)之小鼠數目（NA=不適用）；（TI=研究結束時可觀察到之腫瘤數）。實例13:人類化抗FcRH5藥物結合物抑制活體内踵瘤生長之分析 A.異種移植物為測試不同劑量之具有SPDB-DM4之hul3G9藥物結合物之功效，分析結合之抗體對小鼠腫瘤之作用。

特定言之，檢查抗體消退穩定轉染有人類FcRH5之EJM 147375.doc -404· 201039846 細胞（多發性骨髓瘤細胞株）中腫瘤之能力。 EJM(ACC-560)細胞為獲自DSMZ(Germany)之市售人類多發性骨髓瘤細胞株。因為EJM細胞並不内源表現 FcRH5，故用人類FcRH5穩定轉染EJM細胞，得到 EJM.CMV.PD_FcRH5.LSP.2細胞株。為分析具有SPDB-DM4之hul3G9藥物結合物之功效，經由注射於雌性CB17 ICR SCID小鼠（6-8週齡，來自Charles Rivers Laboratories; Hollister，CA)之側腹用 2χ107 個 EJM2-FcRH5.LSP.2細胞皮下接種CB17ICRSCID小鼠，且使異種移植腫瘤生長至134 mm3之平均值。除非另外表明，否則第0曰係指腫瘤平均值為100-250 mm3且投與治療之第一 / 或唯一劑量之日。腫瘤體積係基於兩個使用測徑規測得之尺寸計算，且根據下式用mm3表示：V=0.5axb2，其中a及b 分別為腫瘤之長直徑及短直徑。自各實驗組收集之數據表示為平均值土SE。用抗FcRH5 ADC或對照抗體-藥物結合物 (ADC)以範圍為每公斤約2 mg至約8 mg之單次靜脈内（i.v.)劑量的ADC處理每組具有隻小鼠之組。整個實驗期間一週測量腫瘤兩次。一週測量小鼠之體重一次歷時2週。在腫瘤體積達到3000 mm3之前或當腫瘤展示即將發生潰瘍徵兆時使小鼠安樂死。陰性對照物包括基於抗HER2(HERCEPTIN®) (曲妥珠單抗）之結合物（SPDB-DM4)。 B.結果 1. EJM-FCRH5.LSP.2異種移植物在實驗結束時，將用對照物處理之動物與用抗FcRH5 147375.doc -405- 201039846 ADC處理之動物的腫瘤尺寸進行比較以評定抗FcRH5 ADc 療法之功效。特定言之，亦測定測試總數中展示部分消退 (PR;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至第〇日時所測罝到之腫瘤體積的50%以下）、完全減輕（CR ;其中投藥之後任何時間的腫瘤體積降至〇 mm3)之小鼠數目（NA=不適用）；（TI=研究結束時可觀察到之腫瘤數）。認為以上書面說明足以使得熟習此項技術者可實踐本發明。本發明之範疇並不限於所寄存之構築體，因為所寄存之實施例僅欲作為本發明之某些態樣的單一說明，且功能 4效之任何構築體均屬於本發明之範_内。本文所寄存之材料並非承認本文含有之書面說明不足以使得可實踐本發明之任何態樣，包括其最佳方式，亦不應視為將申請專利範圍之範疇限於其所代表之特定說明。實際上，除本文所示及所述之外的本發明之各種修改應對於熟習此項技術者由上述描述顯而易見且屬於隨附申請專利範圍之範疇内。【圖式簡單說明】圖1描述嵌合抗人類FcRH5 7D11輕鏈（DNA); 圖2描述嵌合抗人類Fcrh5 7D11輕鏈（胺基酸）；圖3描述嵌合抗人類以尺奶7D11重鏈（DNA); 圖4描述嵌合抗人類Fcrh5 7D11重鏈（胺基酸）；圖5描述嵌合抗人類FcRH5(mAbl3(}9)輕鏈（Dna)(SEQ ID NO: 52)；圖6描述嵌合抗人類FcRH5(mAbl3G9)輕鏈（胺基酸）（SEQ ID NO: 53)； 147375.doc -406· 201039846 圖7描述嵌合抗人類FcRH5(mAbl3G9)重鏈（DNA)(SEQ ID NO: 54)；圖8描述嵌合抗人類FcRH5(mAbl3G9)重鏈（胺基酸）（SEQ ID NO: 55)；圖9展示鼠類13G9之可變輕鏈（SEQ ID NO: 18)與人類化 13G9vl之可變輕鏈（SEQ ID NO: 19)的比對。圖9揭示SEQ ID NO: 56之「人類kl」序列；圖10展示鼠類13G9之可變重鏈（SEQ ID NO: 20)與人類化13G9vl之可變重鏈（SEQ ID NO: 21)之比對。圖10揭示 SEQ ID NO·· 58之「人類III」序列；圖11描述人類化13G9vl之可變重鏈（SEQ ID NO: 21)、人類化13G9v3之可變重鏈（SEQ ID NO: 22)及人類化 13G9v8之可變重鏈（SEQ ID NO : 23)之比對；圖12展示本發明抗體（hul3G9vl)之胺基酸序列。圖12按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 24-42 ; 圖13展示本發明之thio-Mab的經半胱胺酸工程改造多肽鏈的胺基酸序列。圖13按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 59及 60 ; 圖14展示本發明之thio-Mab的經半胱胺酸工程改造多肽鏈的胺基酸序列。圖14按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 61 及 62 ; 圖15展示FcRH5抗體之交叉反應性；圖16展示FcRH5抗體之交叉反應性；圖17展示FcRH5抗體之交又反應性； 147375.doc -407- 201039846 圖18展示FcRH5抗體滴定；圖19展示FcRH5抗體滴定；圖20展示本發明之抗體對平均腫瘤體積之作用；圖21展示本發明之抗體對平均體重之作用；圖22展示本發明之抗體對平均腫瘤體積之彳乍用；圖23展示本發明之抗體對平均體重之作用；圖24展示單一化合物劑量反應分析；圖25展示單一化合物劑量反應分析；圖26展示PRO820 cDNA之核苦酸序列（seq id NO: 63) ’其中SEQ ID NO: 63為本文中稱作「DNA56041- 1416」（本文中亦稱作「FcRH5」）之純系。該核苷酸序列編碼FcRH5 ’其中起始及終止密碼子以粗體展示且加有下劃線。（參見Goddard專·人美國專利第7491529號）；圖27展示源自圖26所示之SEQ Π) NO: 63之編碼序列的胺基酸序列（SEQ ID NO: 64)。（參見Goddard等人美國專利第 7491529號）；圖28A-B展示PR052387 cDNA之核苷酸序列（SEQ ID NO : 65)，其中SEQ ID NO : 65為本文中稱作「DNA257845」 (本文中亦稱作「FcRH5」）之純系。該核苷酸序列編碼 FcRH5，其中起始及終止密碼子以粗體展示且加有下劃線 (參見Chang等人美國公開專利申請案第20060251662號）；圖29展示源自圖28A-B所示之SEQ ID NO: 65之編碼序列的胺基酸序列（SEQ ID NO: 66)(參見Chang等人美國公開專利申請案第20060251662號）； 147375.doc -408- 201039846

圖30展示PR0314992 cDNA之核苷酸序列（SEQ ID ΝΟ··67)，其中SEQ ID NO: 67為來自獼猴之本文中稱作「DNA676969」（本文中亦稱作「cynoFcRH5」）之純系；及圖31展示源自圖30所示之SEQ ID NO: 67之編碼序列的胺基酸序列（SEQ ID NO.· 68)。 147375.doc -409- 201039846 序列表 <11〇>美商建南德克公司 <120>抗-FcRHS抗體及免疫結合物及其使用方法 <130> GNE-0351 <140> 099109950 <141> 2010-03-31 <150> 61/166,214 <151> 2009-04-02 <150> 61/211,754 ❹ <151> 2009-04-01 <160> 69 <170> Patentln version 3,5 <210> 1 <211〉 53 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之多肽

Met Gly Gly Thr Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val lie Leu Phe Val Val 15 10 15 lie Val Gly His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser 20 25 30

Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val 35 40 45 147375-序列表.doc 201039846

Leu Asp Gin Leu Leu 50 <210〉 2 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之引子 <400〉 2 gatcgatatc ytgctsacmc artgtccagc 30 <210> 3 <211> 21 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之引子 <400> 3 tttdakytcc agcttggtac c 21 <210〉 4 <211〉 37 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之引子 <400〉 4 gatcgacgta cgctgargtg carytggtgg artctgg 37 <210〉 5 147375·序列表.doc 201039846 <211〉 43 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之引子 <400〉 5 acagtgggcc cttggtggag gctgmrgaga cdgtgashrd rgt 43

<210〉 6 <211> 45 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之引子 <400〉 6 ggagtacatt cagatatcgt gatgacccar tctcagaaaa tcatg 45 <210〉 7 <211〉 44 <212> DNA 〈213>人工序列〇 <220> 〈223>人工序列之描述：合成之引子 <400> 7 ggtgcagcca cggtccgttt gatttccagc ttggtgcctc cacc 44 <210> 8 <211> 51 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> 147375-序列表.doc 201039846 <223〉人工序列之描述：合成之引子 <400> 8 ggagtacatt cacagatcca gctggtgcag tctggacctg agcttaagaa g 51 <210〉 9 〈211〉 48 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之引子 <400〉 9 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gacggtgast gwggttcc 48 <210> 10 <211> 917 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之聚核苷酸 <400〉 10 cactcccagc tccaactgca cctcggttct atcgattgaa ttccaccatg ggatggtcat 60 gtatcatcct ttttctagta gcaactgcaa ctggagtaca ttcagatatc ctgctgacac 120 aatctccagc catcctgtct gtgagtccag gagaaagagt cagtttctcc tgcaggtcca 180 gtcagagcat tggcacaaac atacactggt atcagcaaag aacaaatggt tctcceiaggc 240 ttctcataaa gtttgcttct gagtctctct ctgggatccc ttccaggttt agtggcagtg 300 gatcagggac agattttact cttagcatca atagtgtgga gtctgaagat tttgcagatt 360 actactgtca acaaagtaat agctggccac tcacgttcgg tgctggtacc aaggtggaga 420 -4- 147375-序列表.doc 480 201039846 tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcttctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttaag cttggccgcc atggcccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga

540 600 660 720 780 840 900 917 tcgggaatta attcggc <210〉 11 <211〉 214 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400> 11

Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Gly Thr Asn 20 25 30

He His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu He 35 40 45

Lys Phe Ala Ser Glu Ser Leu Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 147375-序列表.doc 201039846

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Ser Trp Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210〉 12 <211〉 1484 <212> DNA 6- 147375-序列表.doc 60 60

201039846 <213〉人工序列〈220> <223〉人工序列之描述：合成之聚核苷酸 <400〉 12 tcggttctat cgattgaatt ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagcgtacg ctgaagtgca gttggtggag tctgggggag gcttagtgca gcctggaggg tccctgaaac tctcctgtgc agcctctgga ttcactttca gtagctatgg catgtcttgg gttcgccaga ctccagacaa gaggctggag ttggtcgcaa ccattactag aaatggtggt accacctatt atctagacag tgtgaagggc cgattcacca tctccagaga caatgccaag aacaccctgt acctgcaaat gagcagtctg aagtctgagg acacagccat gtattactgt gcaagaggtc ctatctacta tgattacggc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc acagtcacag tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgactgt gccctctagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa ❹ caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt 147375-序列表.doc 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 201039846 gtacaccctg cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct 1200 ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga 1260 gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag 1320 caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat 1380 gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg 1440 agtgcgacgg ccctagagtc gacctgcaga agcttggccg ccat 1484 <210〉 13 <211〉 452 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 13

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45

Ala Thr lie Thr Arg Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val 5〇 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 147375-序列表.d〇c 201039846

Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Pro lie Tyr Tyr Asp Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 o

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175

Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn 195 200 205

G

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 -9- 147375-序列表.doc 201039846

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 -10- 147375-序列表.doc 201039846

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445

Ser Pro Gly Lys 450 <210> 14 <211> 25 <212> PRT 〈213>人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之共同序列 ❹ <400> 14

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210〉 15 〈211〉 13 <212〉 PRT <213〉人工序列

G <220> <223〉人工序列之描述：合成之共同序列 <400> 15

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210〉 16 <211〉 30 <212> PRT <213〉人工序列 147375-序列表.doc - 11 - 201039846 <220> <223〉人工序列之描述：合成之共同序列〈400> 16

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 1 5 l〇 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 17 〈211〉 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之共同序列 <400> 17

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 18 <211〉 106 <212〉 PRT 〈213〉小鼠屬 <400〉 18

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin Lys lie Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Asn Val Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30

Val Ala Trp Tyr His Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45 -12- 147375-序列表.doc 201039846

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Lys Thr Trp Thr Phe 85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105

<210〉 19 〈211〉 106 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 19

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 13- 147375-序列表.doc 201039846

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Lys Thr Trp Thr Phe 85 90 95

Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 20 <211〉 117 <212〉 PRT <213〉小鼠屬 <400> 20

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Phe 65 70 75 80

Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser lie Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 •14· 147375-序列表.doc 201039846

Gly Thr Ser Leu Thr 115 <210> 21 <211〉 119 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> 〈223>人工序列之描述：合成之多肽 <400> 21

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser lie Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 -15- 147375-序列表.doc 201039846

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 22 <211〉 119 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> 〈223>人工序列之描述：合成之多肽 <400> 22

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly He Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser He Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 147375-序列表.doc * 16- 201039846 <210〉 23 <211> 119 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 23

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Lys Lys Pro Gly Gly 15 l〇 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Q 20 25 30

Gly He Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser lie Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 -17- 147375·序列表.doc 201039846 <210> 24 <211〉 23 <212> PRT <213〉人工序列 <220> 〈223>人工序列之描述：合成之肽 <400> 24

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 <210> 25 <211> 15 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400> 25

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 26 <211> 32 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400> 26

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15 -18- 147375-序列表.doc 201039846

Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 〈210〉 27 <211> 11 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400> 27

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg O 1 5 10 <210> 28 <211〉 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉〈223>人工序列之描述：合成之肽 <400> 28

Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Ser Asn Val Ala 1 5 10 o <210〉 29 <211〉 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400> 29 •19· 147375-序列表.doc 201039846

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210〉 30 <211〉 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400> 30

Gin Gin Tyr Lys Thr Trp Thr 1 5 <210> 31 <211〉 106 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 31

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 -20· 147375-序列表.doc 201039846

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

<210〉 32 <211> 106 <212> PRT G <213〉人工序列 <220〉〈223〉人工序列之描述：合成之多狀 <400> 32

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Lys Thr Trp Thr Phe 85 90 95 -21 147375-序列表.doc 201039846

Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 33 <211> 25 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> 〈223>人工序列之描述：合成之肽 <400〉 33

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉〈223>人工序列之描述：合成之肽 <400〉 34

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10 <210〉 35 <211> 30 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 • 11 · 147375-序列表.doc 201039846 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400> 35

Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210〉 36 <211〉 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400〉 36

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 37 〈211〉 10 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400〉 37

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 10 <210> 38 <211〉 15 〈212〉 PRT <213〉人工序列 147375-序列表.doc -23- 201039846 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400> 38

Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 39 〈211〉 13 <212> PRT <213〉人工序列、〈220> <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400〉 39

Ala Arg Arg Ser He Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210〉 40 <211〉 108 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 40

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 -24- 1473 75-序列表.doc 201039846

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 100 105 o <210> 41 <211〉 270 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉〈223>人工序列之描述：合成之多肽 <400> 41

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 ◎ Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 20 25 30

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 35 40 45

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 50 55 60 25- 147375-序列表.doc 201039846

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro 65 70 75 80

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 85 90 95

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 100 105 110

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 115 120 125

Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 130 135 140

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 145 150 155 160

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 165 170 175

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 180 185 190

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 195 200 205

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 210 215 220

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 225 230 235 240 26- 147375-序列表.doc 201039846

Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 245 250 255

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260 265 270 <210〉 42 <211〉 120 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉〈223>人工序列之描述：合成之多肽

G <400〉 42

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser lie Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 -27 147375·序列表.doc 201039846

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 〈210〉 43 <211> 23 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之共同序列 <400〉 43

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 <210> 44 <211〉 15 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之共同序列 <400〉 44

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210〉 45 <211〉 32 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之共同序列 -28- 147375·序列表.doc 201039846 <400> 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 46 <211〉 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220>

<223〉人工序列之描述：合成之共同序列 <400> 46

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 1 5 10 <210> 47 <211〉 30 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400> 47

Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Ser Gin Arg Leu Met Glu Asp 15 10 15 lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp Phe 20 25 30 <210> 48 -29- 147375-序列表.doc 201039846 <211> 20 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400> 48

Gin Arg Leu Met Glu Asp He Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 15 10 15

Glu Asp Asp Phe 20 <210> 49 <211> 20 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400〉 49

Gin Arg Leu He Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 15 10 15

Glu Asp Asp Phe 20 <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之肽 30- 147375-序列表.doc 201039846 <400〉 50

Arg Leu Ile Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15

Asp Asp <210〉 51 <211> 11 <212> PRT 〈213>人工序列 <220〉 0 <223〉人工序列之描述：合成之肽 <400〉 51

Asp He Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210〉 52 <211〉 800 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之聚核苷酸〇 <400〉 52 acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt agcaactgca actggagtac attcagacat tgtgatgacc cagtctcaga aaatcatgtc cacatcagta ggagacaggg tcaacgtcac ctgcaaggcc agtcagaatg tgggttctaa tgttgcctgg tatcaccaga aaccagggca atctcctaaa gcacttattt actcggcatc ctaccggtac agtggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcaatgtgc agtctgaaga cttggcagag tatttctgtc agcaatataa •31 · 60 120 180 240 300 147375-序列表.doc 360 201039846 gacctggacg ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cggaccgtgg ctgcaccatc 420 tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg 480 cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct 540 ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag 600 cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg 660 cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg 720 ttaagcttgg ccgccatggc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 780 caatagcatc acaaatttca 800 <210> 53 <211> 212 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400> 53

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin Lys lie Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Asn Val Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30

Val Ala Trp Tyr His Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 -32- 147375-序列表.doc 201039846

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Lys Thr Trp Thr Phe 85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110

Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125

O

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140

Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser 145 150 155 160

Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 o

Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205

Arg Gly Glu Cys 210 〈210〉 54 〈211〉 1500 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 -33- 147375-序列表.doc 201039846 <220〉 <223〉人工序列之描述··合成之聚核苷酸 <400> 54 cacctcggtt ctatcgattg aattccacca tgggatggtc atgtatcatc ctttttctag 60 tagcaactgc aactggagta cattcagaag ttcagctggt gcagtctgga cctgagctta 120 agaagcctgg agagacagtc aagatctcct gcaaggcttc tgggtatacc ttcacaaact 180 atggaatgaa ctgggtgaag caggctccag gaaagggttt aaagtggatg ggctgggtaa 240 acacctacac tggagagcca acatatactg atgacttcaa gggacggttt gccttctctg 300 tggaaacctc tgccagcact gtctttctgc agatcaacaa cctcaaaaat gaggacacgg 360 ctacatattt ctgtgcaaga agaagtatcc cttattacta tgctatggac tactggggtc 420 aaggaacctc actcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg 480 caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact 540 acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca 600 ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc 660 cctctagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca 720 ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt 780 gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 840 acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 900 aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga 960 caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc 1020 tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc 1080 cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt 1140 -34- 147375-序列表.doc 1200 201039846 acaccctgcc cccatcccgg gaagagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgag tgcgacggcc ctagagtcga cctgcagaag cttggccgcc atggcccaac ttgtttattg

<210〉 55 <211〉 450 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 55

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

G

Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Phe 65 70 75 80

Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys -35- 1260 1320 1380 1440 1500 147375-序列表.doc 201039846 85 90 95

Ala Arg Arg Ser He Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 36- 147375·序列表.doc 201039846 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu 325 330 335

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 375 380

G

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro -37- 147375·序列表.doc 201039846 435 440 445

Gly Lys 450 <210〉 56 <211〉 108 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述·•合成之多肽 <400〉 56

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Leu Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 -38- 147375-序列表.doc 201039846 <210> 57 <211> 117 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 57

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser lie Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr 115 <210〉 58 -39- 147375-序列表.doc 201039846 <211〉 116 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <220〉

<221〉 MOD—RES <222〉（101)._ (101) 〈223>任何胺基酸 <220〉 <221〉 MOD一RES <222〉（103)·.(103) <223〉任何胺基酸 <400〉 58

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val lie Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 •40· 147375-序列表.doc 201039846

Ala Arg Gly Arg Xaa Gly Xaa Gly Gly Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr 115 〈210〉 59 〈211〉 212 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成之多肽 Ο <400〉 59

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Lys Thr Trp Thr Phe 85 90 95

Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 -41 147375-序列表.doc 201039846

Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140

Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser 145 150 155 160

Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190

Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205

Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 60 <211〉 450 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400> 60

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 -42- 147375·序列表.doc 201039846

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 ❹

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser lie Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

G

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 -43 - 147375-序列表.doc 201039846

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365 -44- 147375-序列表.doc 201039846

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 o

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys 450 <210> 61 <211〉 212 <212〉 PRT <213〉人工序列〈220> 〇 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 61

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45 •45 147375-序列表.d〇c 201039846

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Lys Thr Trp Thr Phe 85 90 95

Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110

Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140

Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser 145 150 155 160

Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190

Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205

Arg Gly Glu Cys 210 147375-序列表.doc -46- 201039846 <210> 62 <211〉 450 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400> 62

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Ser lie Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 47- 147375-序列表.doc 201039846

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 •48- 147375-序列表.doc 201039846

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu 325 330 335

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu • 355 360 365

O

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

O

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys 450 <210> 63 <211〉 684 <212〉 DNA <213〉人工序列 -49- 147375-序列表 d〇c 201039846 <220> 〈223>人工序列之描述：合成之聚核苷酸 <400〉 63 gatgtgctcc ttggagctgg tgtgcagtgt cctgactgta agatcaagtc caaacctgtt 60 ttggaattga ggaaacttct cttttgatct cagcccttgg tggtccaggt cttcatgctc 120 tgtgggtgat attactggtc ctggctcctg tcagtggaca gtttgcaagg acacccaggc 180 ccattatttt cctccagcct ccatggacca cagtcttcca aggagagaga gtgaccctca 240 cttgcaaggg atttcgcttc tactcaccac agaaaacaaa atggtaccat cggtaccttg 300 ggaaagaaat actaagagaa accccagaca atatccttga ggttcaggaa tctggagagt 360 acagatgcca ggcccagggc tcccctctca gtagccctgt gcacttggat ttttcttcag 420 agatgggatt tcctcatgct gcccaggcta atgttgaact cctgggctca agtgatctgc 480 tcacctaggc ctctcaaagc gctgggatta cagcttcgct gatcctgcaa gctccacttt 540 ctgtgtttga aggagactct gtggttctga ggtgccgggc aaaggcggaa gtaacactga 600 ataatactat ttacaagaat gataatgtcc tggcattcct taataaaaga actgacttcc 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 684 <210〉 64 <211> 124 <212> PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多狀 <400〉 64

Met Leu Leu Trp Val lie Leu Leu Val Leu Ala Pro Val Ser Gly Gin 1 5 10 15 •50- 147375-序列表.doc 201039846

Phe Ala Arg Thr Pro Arg Pro lie lie Phe Leu Gin Pro Pro Trp Thr 20 25 30

Thr Val Phe Gin Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Gly Phe Arg 35 40 45

Phe Tyr Ser Pro Gin Lys Thr Lys Trp Tyr His Arg Tyr Leu Gly Lys 50 55 60

Glu lie Leu Arg Glu Thr Pro Asp Asn lie Leu Glu Val Gin Glu Ser 65 70 75 80

O

Gly Glu Tyr Arg Cys Gin Ala Gin Gly Ser Pro Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95

His Leu Asp Phe Ser Ser Glu Met Gly Phe Pro His Ala Ala Gin Ala 100 105 110

Asn Val Glu Leu Leu Gly Ser Ser Asp Leu Leu Thr 115 120 <210〉 65 <211〉 5392 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之聚核苷酸 <400〉 65 aattcactaa tgcattctgc tctttttgag agcacagctt ctcagatgtg ctccttggag ctggtgtgca gtgtcctgac tgtaagatca agtccaaacc tgttttggaa ttgaggaaac ttctcttttg atctcagccc ttggtggtcc aggtcttcat gctgctgtgg gtgatattac -51 - 147375·序列表.doc caaggacacc caggcccatt attttcctcc 240 agagagtgac cctcacttgc aagggatttc 300 accatcggta cctcgggaaa gaaatactaa 360 aggaatctgg agagtacaga tgccaggccc 420 tggatttttc ttcagcttcg ctgatcctgc 480 ctgtggttct gaggtgccgg gcaaaggcgg 540 atgataatgt cctggcattc cttaataaaa 600 tcaaggacaa tggtgcatat cgctgtactg 660 ccaatacagt caaaatccaa gtccaagagc 720 ccttccagcc catcagcggg aacccagtga 780 agaggtcaga tgtcccgctc cggttccgct 840 gctggagtct ctccccgaat ttccagatta 900 actggtgtaa ggcagcaaca atgcctcaca 960 tacaggtgca gatccctgca tctcatcctg 1020 attttgaggg aaccaaggtg acacttcact 1080 tgtacaggtt ttatcatgag ggtgtccccc 1140 gagcatccat cagcttctca ctgactacag 1200 acaatggcct tggcgccaag cccagtaagg 1260 ctcatcctgt cctcaacctc agctctcctg 1320 cacttcactg tgaagcccag agaggttcac 1380 atgctgccct ggagcgtagg tcggccaact 1440 tgactgcaga gcattcaggg aactactact 1500 201039846 tggtcctggc tcctgtcagt ggacagtttg agcctccatg gaccacagtc ttccaaggag gcttctactc accacagaaa acaaaatggt gagaaacccc agacaatatc cttgaggttc agggctcccc tctcagtagc cctgtgcact aagctccact ttctgtgttt gaaggagact aagtaacact gaataatact atttacaaga gaactgactt ccatattcct catgcatgtc gatataagga aagttgttgc cctgtttctt catttacacg tccagtgctg agagccagct ccctgacctg tgagacccag ctctctctag tcttcagaga tgaccagacc ctgggattag ctgccatgtg gagtaaagat tcagggttct gcgtcatatc tgacagcccg agatcctgga tcctcactct cagccctgaa aaggctctga gtgaaaccca ggaagattct ctgcgcactt tgaggcacaa gtcagtccgc tgtgaaaggg agaattcagg gaactactac tgcacagctg ctgtgagcct ctcagtcact gttcccgtgt aggacctgat ttttgaggga gccaaggtga tccccatcct gtaccagttt catcatgagg ctgcaggagg agtggccatc agcttctctc 147375·序列表.doc -52- Ο 201039846 gcacagctga caatggcttt ggcccccagc gcagtaaggc ggtgagcctc tccatcactg tccctgtgtc tcatcctgtc ctcaccctca gctctgctga ggccctgact tttgaaggag ccactgtgac acttcactgt gaagtccaga gaggttcccc acaaatccta taccagtttt atcatgagga catgcccctg tggagcagct caacaccctc tgtgggaaga gtgtccttca gcttctctct gactgaagga cattcaggga attactactg cacagctgac aatggctttg gtccccagcg cagtgaagtg gtgagccttt ttgtcactgt tccagtgtct cgccccatcc tcaccctcag ggttcccagg gcccaggctg tggtggggga cctgctggag cttcactgtg aggccccgag aggctctccc ccaatcctgt actggtttta tcatgaggat gtcaccctgg ggagcagctc agccccctct ggaggagaag cttctttcaa cctctctctg actgcagaac attctggaaa ctactcatgt gaggccaaca atggcctagt ggcccagcac agtgacacaa tatcactcag tgttatagtt ccagtatctc gtcccatcct caccttcagg gctcccaggg cccaggctgt ggtgggggac ctgctggagc ttcactgtga ggccctgaga ggctcctccc caatcctgta ctggttttat catgaagatg tcaccctggg taagatctca gccccctctg gaggaggggc ctccttcaac ctctctctga ctacagaaca ttctggaatc tactcctgtg aggcagacaa tggtccggag gcccagcgca gtgagatggt gacactgaaa gttgcagttc cggtgtctcg cccggtcctc accctcaggg ctcccgggac ccatgctgcg gtgggggacc tgctggagct tcactgtgag gccctgagag gctctcccct gatcctgtac cggttttttc atgaggatgt caccctagga aataggtcgt ccccctctgg aggagcgtcc ttaaacctct ctctgactgc agagcactct ggaaactact cctgtgaggc cgacaatggc ctcggggccc agcgcagtga gacagtgaca ctttatatca cagggctgac cgcgaacaga agtggccctt ttgccacagg agtcgccggg ggcctgctca gcatagcagg ccttgctgcg ggggcactgc tgctctactg ctggctctcg agaaaagcag ggagaaagcc tgcctctgac cccgccagga 147375-序列表.doc -53· 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 cctatcacaa tgtaccagcc tgggaagagc 2880 gaggagaaaa tgtggtttac tcagaagtac 2940 tggcctctga ccccaggcat ctcaggaaca 3000 aggtggcgtc aaccccggtt tccggatccc 3060 gagtccacac gtctctccaa ctgctgtttc 3120 gagaagcagc attgaagtgg gaagatttag 3180 tttcacatgt cctcattctc agtctgacca 3240 tttcccagtt aaagccctga ctggcaggtt 3300 cagggcccag cacatctcct ggattcctta 3360 tactgctctc atcacacccc cacagagggg 3420 caggagatgc cgggctggcc taacagctca 3480 gctttgggtg gatgcatttc tcaattgtca 3540 ccaaatggga cagcacacag cctgtgcaca 3600 ctgcatttca cactcctcca cctgtctcaa 3660 acttctctcc tgctcatgtg tcagtgtcta 3720 agtcccaagt tcttcccatc ctaacagaag 3780 ggggtgcaga cagaacacat actggaacac 3840 gactgaatga atgaatgaat gaggaagaaa 3900 agtgcactcc ctaggaaatc cgggaggtat 3960 aggagcttgg atgaggaaac tgttcagcaa 4020 tgtggatcac ctgaggatcc tgtgaaaata 4080 cctgagactg ccattctaac atgttcccag 4140 201039846 gccctccaga ctcggactcc caagagccca tgcaaccagt gtacactaat gcaaatccta ggatcatcca agagaaaaag aaacatgcag agggttcccc tatcatctac tctgaagtta tgttcttggc ttcctcagct cctcacagat agcctctgca ccccaaagtt ccccttgggg gctgccccag accatatcta ctggcctttg gaatgcaggg ccctgctgga ctgtcacctg ttttaatcca gtggcaaggt gctcccactc gtgggcttca gctgtgattg ctgttctgag gtcttaccac acaaagggag agtgggcctt ggtgctccta aactccgaca cagagttcct tcagcctggt ggggctactg cagtgtgctg tgggacatgt gatgggtctc cccacggggg actctaaggt cggcacttga caccaaggta cctgcccaag taagtggctt tcatacacca taacccagca agtcaaggcc aggaggacca aggaggtgct caattactat ttgactgact actgtgggta atcaaactgg cataaaatcc tctggcttcc ctaagaaaca acggaagaga gaggaagggc ttctcacact ttcatgtgct cagatactga ttcagtgggt ctgtgtagag 147375-序列表.doc -54- 201039846 Ο

gggatgctga tgctgctggc cctgggactg cagcagaggc ccatggagag ggaatgtgtg acacggatcg tgctgctccc tggccagcct gagagagctt cttctctgtg acatgttggc agctgccact atctttgttt ccccacctca tgtatataac ctgagccctc tccattcaga ttctgttccg cttttatgat atccatcaca gtacagtgat gacttttaag ccccacggcc agctctctcc acctgaacca tggcttttca agacagggct gactctgctg ccccaacctt agcctgtatg cagcccagtg cagccttgca tacagatatg caactaaaat agacgtggag tttttaggcc tagttgaaag tcaagaagga aaaaaatctg ctcacagttt gttctggagg cagttctgag aaggtggagg caccaggctc agagtaaggt acccccatcc cagaatgata aatgtgggtg gaccccatcc agtctgttga tcctcaagta agggggaact cctgctttgg gcaaactgaa aaatggctct tcttgggtct ctatgctatt ggatctcctg gatctccagc cctctacagt cacaagagct aattcattct cactgcatgc atgtgaagcc ctataggtct gctctggctg cccagggccc aactcggttc ttggccacag caccaccagc tgctgttgct tttcatcagc caccctggga agcggaaagt ggcctcacac tttcccatga aaagggtgaa gttgttctcc catctctgag caatgggatg tcttatcttg atctttgctc ccagtggatt ctgaaataaa atccttccaa gggcattgga tgcttccaag tgtcagggcc ttgcccagat tcaaggagga aaccagacac ctgagacagg gaggacaagg ctggaggcat ttgtcatcac caagagaaat gcattcccac cgaggccgct cagcagcaag cataggctca ggattaaaga tcacatcacc aacaaagctc acgccctatg aaaagaggaa atttagaatt tctcattggg actgcacagt ggcagaacaa actccaccct aggcctgagt gtaacaaaag ggcttattct gctgggacat aagtttttct gctttcagac tgagcttgct ggcatatgga ctgaaagaaa ttgctgactg cagatcttga gatatgtcag aataaaccaa tctttctgta aa 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5392 -55- 147375-序列表.doc 201039846 <210> 66 <211> 977 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400〉 66

Met Leu Leu Trp Val lie Leu Leu Val Leu Ala Pro Val Ser Gly Gin 15 10 15

Phe Ala Arg Thr Pro Arg Pro lie lie Phe Leu Gin Pro Pro Trp Thr 20 25 30

Thr Val Phe Gin Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Gly Phe Arg 35 40 45

Phe Tyr Ser Pro Gin Lys Thr Lys Trp Tyr His Arg Tyr Leu Gly Lys 50 55 60

Glu lie Leu Arg Glu Thr Pro Asp Asn lie Leu Glu Val Gin Glu Ser 65 70 75 80

Gly Glu Tyr Arg Cys Gin Ala Gin Gly Ser Pro Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95

His Leu Asp Phe Ser Ser Ala Ser Leu lie Leu Gin Ala Pro Leu Ser 100 105 110

Val Phe Glu Gly Asp Ser Val Val Leu Arg Cys Arg Ala Lys Ala Glu 115 120 125

Val Thr Leu Asn Asn Thr lie Tyr Lys Asn Asp Asn Val Leu Ala Phe 130 135 140 -56- 147375-序列表.doc 201039846

Leu Asn Lys Arg Thr Asp Phe His lie Pro His Ala Cys Leu Lys Asp 145 150 155 160

Asn Gly Ala Tyr Arg Cys Thr Gly Tyr Lys Glu Ser Cys Cys Pro Val 165 170 175

Ser Ser Asn Thr Val Lys lie Gin Val Gin Glu Pro Phe Thr Arg Pro 180 185 190

Val Leu Arg Ala Ser Ser Phe Gin Pro lie Ser Gly Asn Pro Val Thr 195 200 205 o

Leu Thr Cys Glu Thr Gin Leu Ser Leu Glu Arg Ser Asp Val Pro Leu 210 215 220

Arg Phe Arg Phe Phe Arg Asp Asp Gin Thr Leu Gly Leu Gly Trp Ser 225 230 235 240

Leu Ser Pro Asn Phe Gin lie Thr Ala Met Trp Ser Lys Asp Ser Gly 245 250 255

Phe Tyr Trp Cys Lys Ala Ala Thr Met Pro His Ser Val He Ser Asp 260 265 270

Ser Pro Arg Ser Trp He Gin Val Gin He Pro Ala Ser His Pro Val 275 280 285

Leu Thr Leu Ser Pro Glu Lys Ala Leu Asn Phe Glu Gly Thr Lys Val 290 295 300

Thr Leu His Cys Glu Thr Gin Glu Asp Ser Leu Arg Thr Leu Tyr Arg 305 310 315 320 57· 147375·序列表.doc 201039846

Phe Tyr His Glu Gly Val Pro Leu Arg His Lys Ser Val Arg Cys Glu 325 330 335

Arg Gly Ala Ser lie Ser Phe Ser Leu Thr Thr Glu Asn Ser Gly Asn 340 345 350

Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Gly Leu Gly Ala Lys Pro Ser Lys Ala 355 360 365

Val Ser Leu Ser Val Thr Val Pro Val Ser His Pro Val Leu Asn Leu 370 375 380

Ser Ser Pro Glu Asp Leu lie Phe Glu Gly Ala Lys Val Thr Leu His 385 390 395 400

Cys Glu Ala Gin Arg Gly Ser Leu Pro lie Leu Tyr Gin Phe His His 405 410 415

Glu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Arg Ser Ala Asn Ser Ala Gly Gly Val 420 425 430

Ala lie Ser Phe Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys 435 440 445

Thr Ala Asp Asn Gly Phe Gly Pro Gin Arg Ser Lys Ala Val Ser Leu 450 455 460

Ser lie Thr Val Pro Val Ser His Pro Val Leu Thr Leu Ser Ser Ala 465 470 475 480

Glu Ala Leu Thr Phe Glu Gly Ala Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val 485 490 495 58- 147375·序列表.doc 201039846

Gin Arg Gly Ser Pro Gin He Leu Tyr Gin Phe Tyr His Glu Asp Met 500 505 510

Pro Leu Trp Ser Ser Ser Thr Pro Ser Val Gly Arg Val Ser Phe Ser 515 520 525

Phe Ser Leu Thr Glu Gly His Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp 530 535 540

Asn Gly Phe Gly Pro Gin Arg Ser Glu Val Val Ser Leu Phe Val Thr 545 550 555 560

O

Val Pro Val Ser Arg Pro He Leu Thr Leu Arg Val Pro Arg Ala Gin 565 570 575

Ala Val Val Gly Asp Leu Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Pro Arg Gly 580 585 590

Ser Pro Pro He Leu Tyr Trp Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly 595 600 605

Ser Ser Ser Ala Pro Ser Gly Gly Glu Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu 610 615 620

Thr Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu 625 630 635 640

Val Ala Gin His Ser Asp Thr lie Ser Leu Ser Val lie Val Pro Val 645 650 655

Ser Arg Pro lie Leu Thr Phe Arg Ala Pro Arg Ala Gin Ala Val Val 660 665 670 59 147375-序列表.doc 201039846

Gly Asp Leu Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Ser Pro 675 680 685

He Leu Tyr Trp Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Lys He Ser 690 695 700

Ala Pro Ser Gly Gly Gly Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Thr Glu 705 710 715 720

His Ser Gly He Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Pro Glu Ala Gin 725 730 735

Arg Ser Glu Met Val Thr Leu Lys Val Ala Val Pro Val Ser Arg Pro 740 745 750

Val Leu Thr Leu Arg Ala Pro Gly Thr His Ala Ala Val Gly Asp Leu 755 760 765

Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro Leu lie Leu Tyr 770 775 780

Arg Phe Phe His Glu Asp Val Thr Leu Gly Asn Arg Ser Ser Pro Ser 785 790 795 800

Gly Gly Ala Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly Asn 805 810 815

Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Leu Gly Ala Gin Arg Ser Glu Thr 820 825 830

Val Thr Leu Tyr lie Thr Gly Leu Thr Ala Asn Arg Ser Gly Pro Phe 835 840 845 60- 147375·序列表.doc 201039846

Ala Thr Gly Val Ala Gly Gly Leu Leu Ser lie Ala Gly Leu Ala Ala 850 855 860

Gly Ala Leu Leu Leu Tyr Cys Trp Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Lys 865 870 875 880

Pro Ala Ser Asp Pro Ala Arg Ser Pro Pro Asp Ser Asp Ser Gin Glu 885 890 895

Pro Thr Tyr His Asn Val Pro Ala Trp Glu Glu Leu Gin Pro Val Tyr 900 905 910

O

Thr Asn Ala Asn Pro Arg Gly Glu Asn Val Val Tyr Ser Glu Val Arg 915 920 925 lie lie Gin Glu Lys Lys Lys His Ala Val Ala Ser Asp Pro Arg His 930 935 940

Leu Arg Asn Lys Gly Ser Pro lie lie Tyr Ser Glu Val Lys Val Ala 945 950 955 960

Ser Thr Pro Val Ser Gly Ser Leu Phe Leu Ala Ser Ser Ala Pro His 965 970 975

Arg <210> 67 <211〉 2934 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 -61- 147375-序列表.doc 201039846 <223〉人工序列之描述：合成之聚核苷酸 <400〉 67 atgctgctgt gggtgatact actggtcctg gctcctgtca gtggacagtt tgtaaggaca 60 tacaagtcca ttattttcct ccagcctcca tggaccacag tcttccgagg agagagagtg 120 aatctgactt gcaagggatt tggcttctac tcatcacaaa aaacaaaatg gtactatcgg 180 caccttggga aagaaatatc gagagaaacc caaaaaaata cccttgaggt tcaggaatct 240 ggagagtaca gatgccaggc ccagggctcc cctctcagta gccctgtgtc cttggacttt 300 tcttcagctt cgctgatcct gcaagctcca ctttctgtgt ttgaaggaga ctctgtggtt 360 ctgaggtgcc gggcaaaggc ggaagtaaca ctgaagacta ctatttacaa gaatgaaaat 420 gtcctggcat ttcttaataa atcaactgac ttccatattt ctcatgcaag tctcaaggac 480 aatggtgcat atcgctgtac tggatataag gaaacttgtt gccttgtttc ttccaacaca 540 gtcaaaatcc aagtccaaga gtcatttaca cgtccagtgt tgagagtcag ctccttccag 600 cccatcagcg ggagcccagt gaccctgacc tgtgagaccc agctctctct agagaggtca 660 gatgtcccgc tccagttctg cttcttcaga aatgaccaga tgctgggatc aggctgcagc 720 ctctccccga agttccggat tactgccatg tggagtaaag attcaggatc ctactggtgt 780 aaggcagcaa caatgtgtta tgacaccaca tctaacagct tgagatcctg gatacaggtg 840 ctgatccccg catctcatcc tgtcctcact ctcagccctg aaaaggctct gaattttgag 900 ggaaccaagg tgaaacttca ctgtgaaacc caggaagatt ctctgcgcac tttgtacaag 960 ttttatcatg acggtgttcc cctgaggtac aagtcagtcc gctgtgaaaa gggagcatcc 1020 atcagcttct cactgactac agagcattca gggaactact actgcacagc tgacaatggc 1080 catggtgcca agcccagtga ggctgtaagc ctgtcagtca ctgtccctgt gtctcgccct 1140 gtcctcaccc tcagctctgc agaggacctg atttctgagg gagccaagtt gacacttcac 1200 -62· 147375-序列表.doc 1260 1260 Ο 201039846 tgtgaagccc agagaggttc actccccatc gtgtaccagt ttcatcatga gaatgcctcc ctggggaata ggtcggccca ctctgcagga ggagtggcca tcagcttctc tctgactgca gaccattcgg ggaactacta ctgcacagct aacaatggct ttggccccca gcgcagtgag gcagtgagcc tctccatcac tgtacccgtg tctcgtcctg tcctcaccct cagctctgct gaggccctga cttttgaagg agccacggtg acactttact gtgaggtcca gagaggttcc ccacgaatcc tataccagtt ttatcatgag gacgtgcccc tggggagcaa ctcaacaccc tctgtgggaa aagtgtcctt cagcttctct ctgactgcag cacattcagg gaattactac tgcacagctg acaacggctt tggtccccag cgcagtgagg cggtgagcct ctttgtcact gttccagtgt ctcgccccat cctcaccctc agggttccca gggcccaggc tgtggtgggg gaccttctgg agcttcgctg tgaggccctg agaggctctc ccccgatcat gtactggttt tatcatgagg atgtcaccct ggggagcagc tcagtcccct ctggaggaga agcctctttc aacctctctc tgactgcaga acattctgga aactactcat gtgaggccaa caatggcctg gtggcccagc acagtgatac aatatcactc agtgttatag ttccagtgtc tcgtcccatc ctcaccttca gagctcccag ggcccaggct gtagtggggg acctgctgga gcttcactgt gaggccctga gaggctcctc cccaatcctg tactggtttt atcatgaaga tgtcaccctg ggtaagatct cagccccctc tggaggagga gcctacttca acctctctct gactacagaa cattctggaa tctactcctg tgaggcggac aatggtctgg aggcccagcg cagtgagatg gtgacactga aagttgcagt tccggtgtct cgccccgtcc tcaccctcag ggctcccagg gcccaggttg cggtggggga cctgctggag cttcactgtg aggccctgag aggctctccc ctgatcctgt accagtttta tcatgaggat gtcaccctag gaaatagctc agccctctct ggaggagcgt tcttcaacct ctctctgact gcagaacact ctggaaacta ctcctgtgag gccgacaatg gtctgggggc ccagcgcagt gagacagtga cactttatct cacagggctg 147375-序列表.doc •63- 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 201039846 accgagaaca gaagtggccc tgttgccacg ggtgtcaccg ggggtctgct cagcctagca 2580 ggccttgctg ctgtggcact gctgctctac tgctggctct caagaaaagc agggagagag 2640 cctgcctctg acccctgcag gagcccttca gacttggact cccaggagcc cacctaccac 2700 aatgtaccag cctgggaaga gctgcaacca gtgtacagta atgtgaatcc tagaggagaa 2760 aatgtggttt actcagaagt acggatcatc cgagagaaaa agaaacatgc agtggcctct 2820 aaccccaggc atctcaggaa caagggttcc tgtatcatct actctgaagt gaaggtggca 2880 tcaaccccag cctccagatg cctgttcttg gcttcctcag ctcctcacag atga 2934 <210> 68 <211〉 977 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之多肽 <400> 68

Met Leu Leu Trp Val He Leu Leu Val Leu Ala Pro Val Ser Gly Gin 1 5 10 15

Phe Val Arg Thr Tyr Lys Ser lie lie Phe Leu Gin Pro Pro Trp Thr 20 25 30

Thr Val Phe Arg Gly Glu Arg Val Asn Leu Thr Cys Lys Gly Phe Gly 35 40 45

Phe Tyr Ser Ser Gin Lys Thr Lys Trp Tyr Tyr Arg His Leu Gly Lys 50 55 60

Glu lie Ser Arg Glu Thr Gin Lys Asn Thr Leu Glu Val Gin Glu Ser 65 70 75 80 -64 - 147375·序列表.doc 201039846

Gly Glu Tyr Arg Cys Gin Ala Gin Gly Ser Pro Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95

Ser Leu Asp Phe Ser Ser Ala Ser Leu lie Leu Gin Ala Pro Leu Ser 100 105 110

Val Phe Glu Gly Asp Ser Val Val Leu Arg Cys Arg Ala Lys Ala Glu 115 120 125

Val Thr Leu Lys Thr Thr lie Tyr Lys Asn Glu Asn Val Leu Ala Phe 130 135 140

Leu Asn Lys Ser Thr Asp Phe His lie Ser His Ala Ser Leu Lys Asp 145 150 155 160

Asn Gly Ala Tyr Arg Cys Thr Gly Tyr Lys Glu Thr Cys Cys Leu Val 165 170 175

Ser Ser Asn Thr Val Lys lie Gin Val Gin Glu Ser Phe Thr Arg Pro 180 185 190

Val Leu Arg Val Ser Ser Phe Gin Pro lie Ser Gly Ser Pro Val Thr 195 200 205

O

Leu Thr Cys Glu Thr Gin Leu Ser Leu Glu Arg Ser Asp Val Pro Leu 210 215 220

Gin Phe Cys Phe Phe Arg Asn Asp Gin Met Leu Gly Ser Gly Cys Ser 225 230 235 240

Leu Ser Pro Lys Phe Arg lie Thr Ala Met Trp Ser Lys Asp Ser Gly 245 250 255 65· 147375·序列表.doc 201039846

Ser Tyr Trp Cys Lys Ala Ala Thr Met Cys Tyr Asp Thr Thr Ser Asn 260 265 270

Ser Leu Arg Ser Trp lie Gin Val Leu lie Pro Ala Ser His Pro Val 275 280 285

Leu Thr Leu Ser Pro Glu Lys Ala Leu Asn Phe Glu Gly Thr Lys Val 290 295 300

Lys Leu His Cys Glu Thr Gin Glu Asp Ser Leu Arg Thr Leu Tyr Lys 305 310 315 320

Phe Tyr His Asp Gly Val Pro Leu Arg Tyr Lys Ser Val Arg Cys Glu 325 330 335

Lys Gly Ala Ser lie Ser Phe Ser Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Asn 340 345 350

Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Gly His Gly Ala Lys Pro Ser Glu Ala 355 360 365

Val Ser Leu Ser Val Thr Val Pro Val Ser Arg Pro Val Leu Thr Leu 370 375 380

Ser Ser Ala Glu Asp Leu lie Ser Glu Gly Ala Lys Leu Thr Leu His 385 390 395 400

Cys Glu Ala Gin Arg Gly Ser Leu Pro lie Val Tyr Gin Phe His His 405 410 415

Glu Asn Ala Ser Leu Gly Asn Arg Ser Ala His Ser Ala Gly Gly Val 420 425 430 • 66- 147375-序列表.doc 201039846

Ala lie Ser Phe Ser Leu Thr Ala Asp His Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys 435 440 445

Thr Ala Asn Asn Gly Phe Gly Pro Gin Arg Ser Glu Ala Val Ser Leu 450 455 460

Ser He Thr Val Pro Val Ser Arg Pro Val Leu Thr Leu Ser Ser Ala 465 470 475 480

Glu Ala Leu Thr Phe Glu Gly Ala Thr Val Thr Leu Tyr Cys Glu Val 485 490 495 ❹

Gin Arg Gly Ser Pro Arg He Leu Tyr Gin Phe Tyr His Glu Asp Val 500 505 510

Pro Leu Gly Ser Asn Ser Thr Pro Ser Val Gly Lys Val Ser Phe Ser 515 520 525

Phe Ser Leu Thr Ala Ala His Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp 530 535 540

Asn Gly Phe Gly Pro Gin Arg Ser Glu Ala Val Ser Leu Phe Val Thr 545 550 555 560 ❹

Val Pro Val Ser Arg Pro He Leu Thr Leu Arg Val Pro Arg Ala Gin 565 570 575

Ala Val Val Gly Asp Leu Leu Glu Leu Arg Cys Glu Ala Leu Arg Gly 580 585 590

Ser Pro Pro lie Met Tyr Trp Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly 595 600 605 -67- 147375-序列表.doc 201039846

Ser Ser Ser Val Pro Ser Gly Gly Glu Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu 610 615 620

Thr Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu 625 630 635 640

Val Ala Gin His Ser Asp Thr He Ser Leu Ser Val He Val Pro Val 645 650 655

Ser Arg Pro He Leu Thr Phe Arg Ala Pro Arg Ala Gin Ala Val Val 660 665 670

Gly Asp Leu Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Ser Pro 675 680 685

He Leu Tyr Trp Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Lys He Ser 690 695 700

Ala Pro Ser Gly Gly Gly Ala Tyr Phe Asn Leu Ser Leu Thr Thr Glu 705 710 715 720

His Ser Gly lie Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Leu Glu Ala Gin 725 730 735

Arg Ser Glu Met Val Thr Leu Lys Val Ala Val Pro Val Ser Arg Pro 740 745 750

Val Leu Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ala Gin Val Ala Val Gly Asp Leu 755 760 765

Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro Leu lie Leu Tyr 770 775 780 68- 147375-序列表.doc 201039846

Gin Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Asn Ser Ser Ala Leu Ser 785 790 795 800

Gly Gly Ala Phe Phe Asn Leu Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly Asn 805 810 815

Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Leu Gly Ala Gin Arg Ser Glu Thr 820 825 830

Val Thr Leu Tyr Leu Thr Gly Leu Thr Glu Asn Arg Ser Gly Pro Val 835 840 845

Ala Thr Gly Val Thr Gly Gly Leu Leu Ser Leu Ala Gly Leu Ala Ala 850 855 860

Val Ala Leu Leu Leu Tyr Cys Trp Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Glu 865 870 875 880

Pro Ala Ser Asp Pro Cys Arg Ser Pro Ser Asp Leu Asp Ser Gin Glu 885 890 895

Pro Thr Tyr His Asn Val Pro Ala Trp Glu Glu Leu Gin Pro Val Tyr 900 905 910 〇

Ser Asn Val Asn Pro Arg Gly Glu Asn Val Val Tyr Ser Glu Val Arg 915 920 925 lie lie Arg Glu Lys Lys Lys His Ala Val Ala Ser Asn Pro Arg His 930 935 940

Leu Arg Asn Lys Gly Ser Cys lie lie Tyr Ser Glu Val Lys Val Ala 945 950 955 960 -69- 147375-序列表.doc 201039846

Ser Thr Pro Ala Ser Arg Cys Leu Phe Leu Ala Ser Ser Ala Pro His 965 970 975

Arg <210> 69 <211〉 6 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成之6xHis標籤 <400〉 69

His His His His His His 1 5 70- 1473 75-序列表.doc

Claims

201039846 七、申請專利範圍： 1. 一種抗FcRH5抗體，其包含： (a) 至少一個選自由以下組成之群的HVR序列： (i) 包含序列 KASQNVGSNVA(SEQ ID NO: 28)之 HVR-L1 ； (ii) 包含序列 SASYRYS(SEQ ID NO: 29)之 HVR-L2 ; (iii) 包含序列 QQYKTWT(SEQ ID NO: 30)之HVR-L3 ； O (iv)包含序列 GYTFTNYGMN(SEQ ID NO: 37)之 HVR- H1 ； (V)包含序列 NTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO: 38) 之 HVR-H2 ; (vi)包含序列 ARRSIPYYYAMDY(SEQ ID NO: 39)之 HVR-H3 ;及 (b) 至少一個變異體HVR，其中該變異體HVR包含對 SEQ ID NO: 28、29、30、37、38或39中所述序列之至少 ^ 一個殘基的修飾。 2. 如請求項1之抗體，其中在變異HVR-H1中HVR-H1殘基編號9為I。 3. 如請求項1之抗體，其中構架序列之至少一部分為人類共同構架序列。 4. 如請求項1之抗體，其中該修飾為取代、插入或缺失。 5. 如請求項1之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 38序列的 HVR-H2。 147375.doc 201039846 6· 一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對人類FcRH5之單價親和力實質上等同於包含圖9(SEQ ID NO: 18)及圖 l〇(SEQ ID NO: 20)中所述輕鏈及重鏈可變序列之鼠類抗體之單價親和力。 7. 一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對人類FCRH5之單價親和力為大於包含圖9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)中所述輕鏈及重鏈可變序列之鼠類或嵌合抗體之單價親和力至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 倍。 8. 一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體對人類FcRH5之單價親和力為小於包含圖9(SEQ ID NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)中所述輕鏈及重鏈可變序列之鼠類或嵌合抗體之單價親和力至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10 、 11 、 12 、 13 、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 25 、 30、35、40、45、50、55 或 60倍 ° 9. 一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力實質上等同於包含圖9(SEq id NO: 18)及圖10(SEQ ID NO: 20)中所述輕鏈及重鏈可變序列之鼠類抗體之二價形式之親和力。 10. —種人類化抗FcRH5抗體，該抗體之二價形式對人類 FcRH5之親和力為大於包含圖9(SEq id NO: 18)及圖 10(SEQ ID NO: 20)中所述輕鏈及重鏈可變序列之鼠類或嵌合抗體之二價形式之親和力至少丨、2、3、4、5、6、 7、8、9 或 1 〇倍。 147375.doc 201039846 11 _ 一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為小於包含圖9(SEq ID Ν〇· 及圖 10(SEQ ID NO·· 20)中所述輕鏈及重鏈可變序列之鼠類或嵌合抗體之二價形式之親和力至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19 、 20 、 25 、 30 、 35 、 40 、 45 、 50 、 55或60倍。 12. —種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為〇.4 nM。 13·如請求項12之人類化抗FCRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為〇 4 nM +/-.04。 14· 一種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為〇.2 nM。 15. 如請求項14之人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為〇.2 nM +/-.02。 16. —種人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為0.5 nM。 ❹ 17_如請求項16之人類化抗FcRH5抗體，其中該抗體之二價形式對人類FcRH5之親和力為0.5 nM +/-0.1。 18. 如請求項6至17中任一項之抗體，其中該結合親和力以 Kd值表示。 19. 如請求項6至17中任一項之抗體，其中該結合親和力藉由Biacore或放射免疫分析法測量。 20. 如請求項1之抗體，其包含人類κ亞群1共同構架序列。 21 ·如請求項1之抗體’其包含重鏈人類亞群m共同構架序 147375.doc 201039846 列。 22. 如睛求項21之抗體’其中該構架序列包含取代在位置 11、 12、13、18、19、20、75、78、82、8=2a、83及/或 34 ° 23. 如請求項22之抗體，其中該取代為liiv、V12K、 V13K、L18V、R19K、L20V、K75V、V78A、N82I、 N82aS、R83K及 /或 M34I。 24. 如請求項21之抗體’其中該構架序列包含取代在位置 12、 13、34及/或 78。 25. 如請求項24之抗體，其中該取代為V12K、V13K、M34I 及/或V78A。 26. —種人類化抗FcRH5抗體，其中該人類化抗體結合於細胞毒性劑時抑制腫瘤細胞生長。 27. 如請求項1、6至12、14、16及26中任一項之抗體，其中該人類化抗體與嵌合抗體均為單價或二價。 28. 如請求項1、6至12、14、16及26中任一項之抗體，其中該人類化抗體與嵌合抗體均包含單一 Fab區連接於Fc 區。 29· —種抗體，其包含一個包含圖12中所述之HVR1-HC、 HVR2-HC及 /或 HVR3-HC序列（SEQ ID NO: 37-39)的重鏈可變域。 3 0.如請求項29之抗體，其中該可變域包含圖12中所述之 FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC 及/ 或 FR4-HC 序列（SEQ ID NO: 33-36)。 147375.doc 201039846 3 1.如請求項29或30之抗體，其中該抗體包含圖12中所述之 CH1 及/或 Fc序列（SEQ ID NO: 40及/或 41)。 32. —種抗體，其包含一個包含圖12中所述之H VR1-LC、 HVR2-LC及/或 HVR3-LC 序列（SEQ ID NO: 28-30)的輕鏈可變域。 33. 如請求項32之抗體，其中該可變域包含圖12中所述之 FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC 及 / 或 FR4-LC 序列（SEQ ID NO: 24-27) ° 〇 34. 如請求項32或33之抗體，其中該抗體包含圖12中所述之 CL1 序列（SEQ ID NO: 31)。 35. —種多肽，其包含圖11中所述之序列（SEQ ID NO: 21)。 36. —種多肽，其包含圖9中所述之序列（SEQ ID NO: 19)。 37_ —種多肽，其包含圖11所述之序列（SEQ ID NO: 22)。 38. —種多肽，其包含圖11所述之序列（SEQ ID NO: 23)。 3 9 _ —種抗體，其係藉由以下方法製備： Ο)培養表現包含如請求項29至3 1中任一項之重鏈可變 ◎ 域及如請求項32至34中任一項之輕鏈可變域之抗體的細胞；及 (b)自該培養細胞分離該抗體。 40. —種抗體’其包含如請求項29至31中任一項之重鏈可變域及如請求項32至34中任一項之輕鏈可變域。 41. 如請求項40之抗體，其中該抗體為單價且包含Fc區。 42. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含與選自SEq id NO-19之胺基酸序列具有至少 90%胺基酸序列一致性的輕鏈 147375.doc 201039846 可變域。 43. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。 44. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。 45·如請求項1之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少9〇%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。 46.如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含一個、兩個、三個或四個選自SEQ ID NO: 33、34、35及36之構架胺基酸序列。 47·如請求項1之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含一個、兩個、三個或四個選自SEQ ID NO: 24、25、26、27及28之構架胺基酸序列。 48.如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含一個、兩個、三個或四個與選自SEQ ID NO: 33、34、35及36之胺基酸具有至少90%胺基酸序列一致性的構架胺基酸序列。 49·如請求項1之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含一個、兩個、三個或四個與選自SEQ ID NO: 24、25、26、27及28之胺基酸具有至少90%胺基酸序列一致性的構架胺基酸序列。 147375.doc 201039846 50. 如請求項42之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。 51. 如請求項42之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。 52. 如請求項42之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的重鏈可變域。 53. 如請求項43之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的輕鏈可變域。 54. —種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變域。 55. —種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變域。 5 6. —種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變域。 57. —種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變域。 147375.doc 201039846 5 8. —種結合於FcRH5之抗體’其中該抗體包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變域及與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變域。 5 9. —種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變域及與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變域。 60. —種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變域及與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有至少90°/。序列一致性的輕鍵可變域。 61. —種結合於FcRH5之抗體，其中該抗體包含與選自SEq ID NO: 20之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變域及與選自SEQ ID NO: 18之胺基酸序列具有至少 90%序列一致性的輕鏈可變域。 62. —種結合於FcRH5之抗體’其中該抗體包含與選自SEq ID NO: 13之胺基酸序列具有至少9〇%序列一致性的重鏈可變域及與選自SEQ ID NO: 11之胺基酸序列具有至少 90%序列一致性的輕鏈可變域。 63_ —種聚核苷酸，其編碼如請求項1、4〇、50至52、61或 62之抗體。 64. —種載體，其包含如請求項63之聚核普酸。 65· —種宿主細胞’其包含如請求項64之載體。 147375.doc 201039846 66. —種製備抗FcRH5抗體之方法，其中該方法包含（a)選自包含真核細胞及CHO細胞之群的宿主細胞在適合表現編碼該抗體之聚核苷酸的條件下培養，及分離該抗體。 67. —種抗體，其結合之抗原決定基基本上與一種包含seq ID NO: 21、SEQ ID NO: 22 或 SEQ ID NO: 23所示胺基酸序列或基於該等胺基酸序列之共同或變異體序列之重鍵多肽之抗體結合的抗原決定基相同。 68·如請求項67之抗體，其結合之抗原決定基基本上與一種包含SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列或基於該等胺基酸序列之共同或變異體序列之輕鏈多肽之抗體結合的抗原決定基相同。 69. 如請求項1、40、50至52、61或62之抗體，其中該FcRH5 表現於細胞之表面上。 70. 如請求項69之抗體’其中該細胞為b細胞。 71. 如請求項70之抗體，其中該B細胞與B細胞增殖病症相關。 72. 如請求項71之抗體，其中該B細胞增殖病症為癌症。 73. 如請求項72之抗體’其中該B細胞增殖病症係選自淋巴瘤、非崔奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkins lymphoma， NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性 (indolent) NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（all) 及套細胞淋巴瘤。 147375.doc 201039846 74.如請求項1、40、50至52、61或62之抗體，其中該抗體為早株抗體。 75·如請求項74之抗體，其中該抗體為選自Fab、Fab，-SH、 Fv、scFv或（Fab’）2片段之抗體片段。 76. 如請求項74之抗體，其中該抗體為人類化抗體。 77. 如請求項1、40、5〇至52、61或62之抗體，其中該抗體結合的抗原決定基與一種包含SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22 或 SEQ ID NO: 23 之重鏈可變域及 SEQ ID NO:19 之輕鏈可變域的抗體結合的抗原決定基相同。 78. —種免疫結合物（immunoconjugate)，其包含如請求項1、 40、50至52、61或62之抗體共價連接於細胞毒性劑。 79. 如請求項78之免疫結合物，其中該細胞毒性劑係選自毒素、化學治療劑、藥物部分、抗生素、放射性同位素及核分解酶。 80·如請求項79之免疫結合物，其中該免疫結合物具有式 Ab-(L-D)p，其中：（a) Ab 為如請求項 1、40、50 至 52、 61或62之抗體； (b) L為連接子； (c) D為藥物部分。 81.如請求項80之免疫結合物，其中L係選自6_順丁烯二醯亞胺基己醯基（MC)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基（MP)、绳胺酸-瓜胺酸（val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸（aia_phe)、對胺基苯曱氧基羰基（PAB)、4-(2-°比啶基硫基）戊酸N-丁二醯亞胺醋（SPP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基曱基）環己烷甲 147375.doc -10- 201039846 酸N-丁二醯亞胺酯（SMCC)、4-(2-吡啶基二硫基）丁酸-N-故基丁一酿亞胺醋（SPDB)及（4-蛾-乙酿基）胺基苯甲酸N_ 丁二醯亞胺酯（SIAB)。 82. 如請求項80之免疫結合物，其中d係選自由類美登素 (maytansinoid)、奥瑞他汀（auristatin)及多拉司他汀 (dolastatin)組成之群。 83. —種醫藥組合物’其包含如請求項8〇之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。 84. —種如請求項、61或62中任一項之抗體的用途’其係用於製備供抑制表現FcRH5之細胞生長的藥物。 85. 如請求項84之用途，其中該抗體結合於細胞毒性劑。 86. 如請求項84之用途’其中該抗體結合於生長抑制劑。 87. —種如請求項】、4〇、5〇至52、61或62中任一項之抗體之用途’其係用於製備治療患有癌症之個體的藥物。 88·如研求項87之用途，其中該癌症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性林巴、、田胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病毛、、、田胞白企病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（all) 及套細胞淋巴瘤。士 °月求項87之用途，其中該抗體結合於細胞毒性劑。 90. 如π求項87之用途，其中該抗體結合於生長抑制劑。 91. 種如凊求項1、40、50至52、61或62中任一項之抗體之用途’其係用於製備治療個體之增殖病症的藥物。 147375.doc 201039846 92. 如請求項91之用途’其中該增殖病症為癌症。 93. 如請求項92之用途，其中該癌症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NH]L ' 復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性Nhl、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（All) 及套細胞淋巴瘤。 94. 如請求項9 1之用途’其中該抗體結合於細胞毒性劑。 95 ·如凊求項91之用途’其中該抗體結合於生長抑制劑。 96. —種如請求項1、4〇、5〇至52、61或62中任一項之抗體之用途’其係用於製備供抑制細胞生長的藥物，其中該細胞之生長至少部分依賴於FcRH5之生長加強作用。 97·如晴求項96之用途，其中該抗體結合於細胞毒性劑。 98. 如請求項96之用途，其中該抗體結合於生長抑制劑。 99. 一種如請求項i、4〇、5〇至52、61或62中任一項之抗體之用途’其係用於製備供治療性治療哺乳動物腫瘤的藥物’其中該腫瘤之生長至少部分依賴於FcRH5之生長加強作用。 100. 如凊求項99之用途’其中該腫瘤與以下相關：淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性 NHL、復發性惰性nhl、難治性NHL、難治性惰性 NHL·、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 147375.doc •12- 201039846 101. 如請求項99之用途’其中該抗體結合於細胞毒性劑。 102. 如請求項99之用途，其中該抗體結合於生長抑制劑。 103. —種如請求項81之免疫結合物之用途，其係用於製備供抑制B細胞增殖之藥物。 104. 如請求項1〇3之用途，其中該b細胞增殖係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NIiL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性 NHL、復發性惰性Nhl、難治性NHL、難治性惰性 ◎ NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 105·如請求項1〇3之用途，其中該]5細胞為異種移植物。 106. 如請求項1〇3之用途，其中該暴露在活體外進行。 107. 如請求項1〇3之用途，其中該暴露在活體内進行。 108. —種測定懷疑含有fcRH5之生物樣品中FcRH5之存在的方法’該方法包含使該樣品暴露於如請求項1、4〇、〇至52、61或62中任一項之抗體，及測定該抗體與該樣品中FcRH5之結合，其中該抗體與該樣品中FcRH5之結合指示該樣品中存在該蛋白。 109. 如請求項108之方法，其中該生物樣品係來自懷疑患有B 細胞增殖病症之患者。 110. 如請求項109之方法，其中該B細胞增殖病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性 NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋 147375.doc -13- 201039846 巴瘤、白血病、毛細胞白血病（hcl)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 111•一種使如請求項1、40、50至52、61或62中任一項之抗體結合於表現FcRH5之細胞的方法，該方法包含使該細胞與如請求項1、40、50至52、61或62中任一項之抗體接觸。 112•如請求項111之方法，其中該抗體結合於細胞毒性劑。 113•如請求項111之方法，其中該抗體結合於生長抑制劑。 114•一種經半胱胺酸工程改造（engineered)之抗體，其包含一或多個游離半胱胺酸胺基酸，其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係藉由一種包含用游離半胱胺酸胺基酸置換親本抗體之一或多個胺基酸殘基的方法製備，其中該親本抗體為如請求項1、40、50至52、61或62之抗體。 115·如凊求項114之抗體’其中該一或多個游離半胱胺酸胺基酸之硫基反應值在0.6至1.0之範圍内。 116•如請求項U 4之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該經半胱胺酸工程改造之抗體較該親本抗體與硫反應性（thio-reactive)試劑更具反應性。 117.如請求項114之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該方法另外包含藉由該經半胱胺酸工程改造之抗體與硫氫基反應性（thiol-reactive)試劑反應測定該經半胱胺酸工程改造之抗體的硫氫基反應性；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體較該親本抗體與該硫氫基反應性試劑更具反應性。 147375.doc -14- 201039846 118.如請求項114之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該一或多個游離半胱胺酸胺基酸殘基位於輕鏈中。 119·如請求項114之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該抗體為包含該經半胱胺酸工程改造之抗體共價連接於細胞毒性劑之免疫結合物。 Ο Ο 120. 如請求項119之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該細胞毒性劑係選自毒素、化學治療劑、藥物部分、抗生素、放射性同位素及核分解酶。 121. 如請求項η 4之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該抗體共價連接於捕捉標記、偵測標記或固體載體。 122. 如請求項121之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該抗體共價連接於生物素捕捉標記。 123. 如請求項121之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該抗體共價連接於螢光染料偵測標記。 124·如請求項123之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該螢光染料係選自螢光素類、若丹明（rhodamine)類、丹績醯基（dansyl)、麗斯胺（Lissamine)、花青、藻紅素、德克薩斯紅（Texas Red)及其類似物。 125. 如請求項12丨之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該抗體共價連接於選自 3H、UC、14C、18F、32P、35S、64Cu、 68Ga、，、99Tc、、12”、124i、125l、131l、133χε、 177 Lu、211At及213Bi之放射性核種偵測標記。 126. 如請求項ι21之經半胱胺酸工程改造之抗體’其中該抗體藉由螯合配位體共價連接於偵測標記。 147375.doc •15· 201039846 127. 如請求項126之經半胱胺酸工程改造之抗體，其中該螯合配位體係選自 DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA及TETA。 128. 如請求項1、40、50至52、61或62之抗體，其包含白蛋白結合狀。 129. 如請求項128之抗體，其中該白蛋白結合肽係選自SEQ ID NO: 246-250。 130. —種經半胱胺酸工程改造之抗體，其包含一或多個游離半脱胺酸胺基酸在親本抗體中輕鍵之一或多個根據Kabat 編號規定的位置及重鏈之一或多個根據Kabat編號規定的位置及重鏈之一或多個根據EU編號規定的位置，其中該親本抗體為如請求項1、40、50至52、61或62之抗體。 131 ·如請求項13 〇之抗體’其中該抗體係選自單株抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、人類抗體及人類化抗體。 132. 如請求項13〇之抗體，其為抗體片段。 133. 如請求項132之抗體，其中該抗體片段為Fab片段。 134·如清求項13 0之抗體，其係選自嵌合抗體、人類抗體或人類化抗體。 135. 如請求項13 0之抗體，其產生於細菌中。 136. 如請求項130之抗體’其產生於ch〇細胞中。 137. —種測定懷疑含有FcRH5蛋白之樣品中該蛋白之存在的方法，該方法包含使該樣品暴露於如請求項126之抗體’及測定該抗體與該樣品中該FcRH5蛋白之結合，其中該抗體與該蛋白之結合指示該樣品中存在該蛋白。 138·如請求項137之方法，其中該樣品包含懷疑表現該FcRH5 147375.doc •16- 201039846 蛋白之細胞。 139.如請求項137之方法，其中該細胞為b細胞。 140·如請求項137之方法’其中該抗體共價連接於選自螢光染料、放射性同位素、生物素或金屬錯合之配位體的標記0 141. 一種醫藥調配物’其包含如請求項π〇之抗FcRH5抗體及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。〇 142. 如請求項130之抗體，其中該抗體共價連接於奥瑞他汀或類美登素藥物部分，由此形成抗體藥物結合物。 143•如味求項142之抗體，其中該抗體_藥物結合物包含抗體 (Ab)及奥瑞他汀或類美登素藥物部分⑴），其中該經半胱月女酸工程改造之抗體經由一或多個游離半胱胺酸胺基酸藉由連接子部分（L)連接於D;該化合物具有下式1: Ab-(L-D)p j 其中P為1、2、3或4。 G 其中： t為延伸子單元，共價連接於該料胱胺i程改造之抗體（Ab)之半胱胺酸硫氫基； a為0或1 ; 各W獨立地為胺基酸單元； 144. 如請求項143之抗體，其中p為2。 145. 如請求項143之抗體，其中[具有下式： —Aa—Ww—Y - 147375.doc •17- 201039846 评為範圍為0至12之整數； Υ為間隔單元’共價連接於該藥物部分；及 y為0、1或2。 146.如凊求項145之抗體，其中該抗體藥物結合物具有下

其中PAB為對胺基苯曱基胺曱醯基，r!7為選自以下之二價基團：（CH2)r、03-(：8碳環基、〇_(CH2)r、伸芳基、 (CH2)r-伸芳基、-伸芳基 _(CH2)r_、（CH2)r_(C3_C8 碳環基）、（C3-C8 碳環基）-(CH2)r、（：3-(：8雜環基、（CH2)r-(C3-C8 雜環基）、_(C3-C8 雜環基）-(CH2)r-、-(CH2)rC(〇)N Rb(CH2)r-、-(CH2CH20)r_、-(CH2CH20)r-CH2-、-(CH2)rC (〇)NRb(CH2CH2〇)r- ' '(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-、-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-、-(CH2CH20)rC(0) NRb(CH2CH20)r-CH2-及-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2)r-;其中Rb為H、CrC6烷基、苯基或苯甲基；4蜀立地為範圍為 1至10之整數。 147. 如請求項145之抗體，其中Ww為纈胺酸-瓜胺酸。 148. 如請求項145之抗體，其中R17為（CH2)5或（CH2)2。 149·如請求項145之抗體，其中該抗體-藥物結合物具有下式·· 147375.doc -18- 201039846 Ab—S

N——R17-C—D 150·如請求項149之抗體，其中R17為（CH2)5或（CH2)2。 151.如請求項ι49之抗體，其中該抗體-藥物結合物具有下式：

152. 如請求項143之抗體，其中l為SMCC、SPP、SPDB或 BMPEO 〇 153. 如請求項143之抗體，其中D為MMAE，其具有以下結構： Ο 人

〇

其中波形線表示與該連接子L的連接位點。 154.如請求項143之抗體，其中d為MMAF，其具有以下結構·

147375.doc 19- 201039846 ，、中波形線表示與該連接子L的連接位點。 155.如請求項143之抗體，其中D為DM1或DM4，其具有以下結構： y

H2CH2S-奪 ch3o

DM1 ChU

其中波形線表不與该連接子L的連接位點。 156. 如请求項142之抗體，其中該抗體係選自單株抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、人類抗體、人類化抗體及抗體片段。 157. 如請求項142之抗體’其中該抗體片段為Fab片段。 158. —種抗體-藥物結合化合物，其係選自以下結構： 147375.doc -20· 201039846 Ab-S,

p N ^^^^Aval-Cit-N O O

Ab-MC-vc-PAB-MMAF Ab-S.

P 0 O Ns^^^AVa,.Cit_j^

O Ab-MC-vc-PAB-MMAE

〇

o -3 c

Ab-BMPEO-DMl 147375.doc •21- 201039846 其中Val為纈胺酸；C it為瓜胺酸；p為1、2、3或4 ; Ab為如請求項130之抗體。 159. 如請求項126之抗體，其中該奥瑞他汀為MMAE或 MMAF。 160. 如請求項127之抗體，其中l為MC-val-cit-PAB或MC。 161. —種偵測b細胞之分析法，其包含： (a) 使細胞暴露於如請求項142之抗體-藥物結合化合物；及 (b) 測定該抗體-藥物結合化合物與該等細胞之結合程〇度。 162· —種如請求項142之抗體的用途，其係用於製備供抑制細胞增殖之藥物。 163. 種醫藥調配物’其包含如請求項142之抗體及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。 164. —種如請求項163之醫藥調配物之用途，其係用於製備供治療患者癌症的藥物。 165. 如請求項164之用途，其中該癌症係選自由以下組成之❹ 群·淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL) '小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 6·女明求項164之用途’其中向該患者投與細胞毒性劑合併該抗體-藥物結合化合物。 147375.doc •22- 201039846 I67· —種製品，其包含：如請求項163之醫藥調配物；容器；及包裝插頁或標籤，表明該化合物可用於治療特徵為 FcRH5多肽過度表現之癌症。 168. 如請求項167之製品，其中該癌症係選自由以下組成之群：淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHl、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（Cll)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 169. —種製備包含如請求項bo之抗FcRH5抗體（Ab)及奥瑞他 ί丁或類美登素藥物部分（D)之抗體藥物結合化合物的方法’其中該抗體經由一或多個經工程改造之半胱胺酸胺基酸藉由連接子部分（L)連接於〇 ;該化合物具有下式夏： Ab-(L-D)p I 其中p為1、2、3或4 ;該方法包含以下步驟： (a)使該抗體之經工程改造半胱胺酸基團與連接子試劑反應’形成抗體-連接子中間物Ab-L ;及 (b) 使Ab-L與經活化藥物部分〇反應；由此形成該抗體-藥物結合物；或包含以下步驟： (c) 使藥物部分之親核基團與連接子試劑反應，形成藥物-連接子中間物D-L ;及 147375.doc •23· 201039846 ⑷使D_L與該抗體之經卫程改造半胱胺酸基團反應；由此形成該抗體-藥物結合物。 170.如請求項169之方法，其另外白人丹为外13在中國倉鼠卵巢（CH〇) 細胞中表現該抗體之步驟。 171•如請求項169之方法，另外句冬田、吾力外包3用遏原劑處理該表現之抗體的步驟。 172.如請求項171之方法，其中該還原劑係選自三幾基乙基膦（TCEP)及二硫蘇糖醇（DTT)。 Π3.如請求項171之方法，其另外包含在用該還原劑處理之後’用氧化劑處理該表現之抗體的步驟。 174. 如請求項173之方法，其中該氧化劑係選自硫酸銅、去氫抗壞血酸及空氣。 175. 如請求項130之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 44中任一者的胺基酸序列具有至少9〇%序列一致性的重鏈序列。 176. 如請求項130之抗體，其中該抗體包含與SEQ m N〇: 43 之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈序列及與 SEQ ID NO: 44之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之重鏈序列。 177. 如請求項130之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 46中任一者的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈序列。 178. 如請求項no之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈序列及與 147375.doc • 24- 201039846 SEQ ID N〇: 46之胺基酸序列具有至少9〇%序列一致性之重鏈序列。種、，且合物，其包含如請求項i、4〇、5〇至52 ' 6丨或Μ 中任—項之抗體。 180. 士明求項179之組合物，其中該組合物包含載劑。 181. 如請求項130之抗體，其中半胱胺酸在該輕鏈之位置 205 〇月求項130之抗體，其中半胱胺酸在該重鏈之位置 114 ° 183. 如請求項13〇之抗體，其中半胱胺酸在該重鏈之位置 400 〇 184. 如明求項7〇之抗體，其中該B細胞與漿細胞病症相關。 185. 如請求項184之抗體，其中該漿細胞病症為癌症。 186. 如請求項185之抗體，其中該漿細胞病症係選自意義未明之單株球蛋白症（MGUS)、多發性骨髓瘤（MM)、巨球蛋白血症、重鏈病、全身性輕鏈澱粉樣變性病（AL)、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤、多孤立性漿細胞瘤、漿細胞性白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、b細胞慢性淋巴細胞性白血病。 187·如請求項40之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體。 188. 如请求項187之抗體’其特異性結合CD3。 189. 如請求項188之抗體’其為一種腔内突起（pr〇tuberance-into-cavity)抗體。 190. 如請求項189之抗體，其為無糖基化抗體。 147375.doc •25· 201039846 191·如請求項19〇之抗體，其在大腸桿菌（&c/^wc/n.a〜/〇宿主細胞中產生。 192.如凊求項190之抗體’其缺乏一或多個fc效應功能。 193·如請求項192之抗體，其缺乏ADCC活性。 147375.doc 26-