TW201029584A - Prevention and treatment of rotavirus diarrhoea - Google Patents

Description

201029584 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種預防及治療輪狀病毒引起之腹满，尤 其針對嬰兒及幼兒。 【先前技術】 腹瀉疾病仍係嬰兒及兒童生存之主要全球性威脅，且在 開發中國豕及工業化國豕，輪狀病毒感染係該群體罹患嚴 重性脫水胃腸炎之主要原因。在西方世界，輪狀病毒感染 之管理成本（估計僅美國每年之成本就超過億美元）係負 擔曰盈增加之健保預算的主要開支。近期開發的兩種新型 輪狀病毒疫苗帶來希望’但即使可獲得有效的疫苗，其使 用亦可能受開發中國家之財政拮据的限制。此外，其對具 有營養不良及免疫缺陷之兒童的功效仍值得懷疑。 在最近幾十年内，以益生菌作為治療胃腸疾病之安全及 可利用形式已受到極大關注。已被利用於治療由病毒引起 之腹?寫之細菌屬於乳酸桿菌屬及雙岐桿菌 屬。已認為抵抗輪狀病毒引起之胃腸炎 之某種益生菌之治療能力歸因於該等安定及增強胃黏膜障 • 壁、產生抗微生物物質及刺激局部抗原特異性與非特異性 • 免疫效應之能力。亦應注意與不同菌株有效性及作用模式 相關之顯著差異。 例如，在1990年代初期，Saavedra等人觀察到：投與乳 雙岐桿菌（Bifidobacterium lactis)與嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)之組合會使在美國醫院慢性照 145037.doc 201029584 護病房中達18個月之29個兒童的腹料生率及輪狀病毒釋 放降低，相較未接受任何益生菌者則為26個兒童（s^vedra 等人，The Lancet 344 ’ 1〇46 : 1994)。然而，在利用雙岐 桿菌的其他試驗中並未獲得明確結果。例如，對ι〇〇〇名法 國兒童之預防研究並未顯示腹瀉發生率或持續時間的降低 (Thibault專人，j pe(j Gastro Nutr 39，147 : 2004)。 最近，W〇〇1/10453描述廣泛篩選之26〇種不同細菌菌株 之結果，其中僅4種顯示基本抑制輪狀病毒複製。已發現 所有這四種菌株均屬於本發明者推斷之長雙岐桿菌 (5/〇叹謂）或青春雙岐桿菌（Β·α办/απ«沿）種，該等菌種 對預防及治療輪狀病毒引起之腹瀉特別有效。青春雙峽桿 菌之一種特定菌株，青春雙岐桿菌CNCM 1-2168係特別強 調其預防輪狀病毒感染人類細胞之能力。然而，據稱已從 成人糞便中單離該菌株，使其較不適合包含於為嬰兒設計 之產品中。 由上文可見：仍然需要具有有效抗輪狀病毒活性，且適 合併入嬰兒及幼兒食用產品中之其他益生菌。 【發明内容】 本發明者已出乎意料地發現，與先前推測相反的，益生 菌雙岐桿菌之抗輪狀病毒活性並非根據該菌種可預測。更 特定言之，本發明者已發現最初自人乳中單離之短雙岐桿 菌的特定菌株’短雙岐桿菌CNCM 1-3865，對於預防及治 療輪狀病毒引起之腹瀉極為有效，且即使在呈非複製形式 時，仍可保持該活性。 145037.doc 201029584 因此，在第一態樣中，本發明提供一種短雙岐桿菌 CNCM 1-3865。 在第二態樣中，本發明提供一種適用於預防或治療輪狀 病毒引起之腹瀉之組合物，其包含短雙岐桿菌cncm 1-3865。 在第三態樣中，本發明提供一種以短雙歧桿菌CNCM 1 3865於製造用於預防或治療輪狀病毒引起之腹瀉之藥物 或治療性營養組合物中之用途。

W 在第四態樣中，本發明提供一種預防或治療輪狀病毒引 起之腹瀉之方法，其包含對有此需要之嬰兒或幼兒投與治 療量之短雙岐桿菌CNCM 1-3 865。 已知年齡為2至4週之健康、經陰道分娩、接受母乳哺育 之嬰兒的腸道微生物群（可將其視為此年齡組的最佳微生 物群）主要為雙岐桿菌屬，而配方食品餵養的嬰兒擁有較 複雜的微生物群，其通常同時存在雙岐桿菌、擬桿菌 ❹ （5aciero淡4、梭®體⑹⑽”·而α)及鏈球@ (加辦OC0CC/)。 已假設：由於母乳哺育之嬰兒比配方食品餵養之嬰兒較少 罹患腹瀉感染，因此以雙岐桿菌為主之微生物群必定提供 •抗輪狀病毒感染之保護作用。然而，由美國疾病控制中心 (US Centers for Disease Control)在孟加拉進行的一系列研 究並未證實母乳哺育之嬰兒比配方食品餵養之嬰兒較少罹 患輪狀病毒感染（Glass等，八(^卩&6€^化8〇311£1.75，713-718 ; 1986)。因此，流行病學數據並不支持雙岐桿菌大體 上抗輪狀病毒引起之腹瀉的保護作用。本發明者已證實儘 145037.doc 201029584 管已於數種雙咬桿菌屬中發現抗輪狀病毒活性，但其並非 物種專一性特徵。此表示：儘管尚未闡明針對所觀察到之 作用之機制，但媒介抗輪狀病毒性質之基因可能不屬於該 菌種之共享核心基因組部份。 【實施方式】 在本說明書中，以下術語具有以下定義： 「嬰兒」意指年齡12個月以下之兒童； 益生菌」意指有益宿主健康及福利之微生物細胞製劑 或微生物細胞組分（§alminen s.、Ouwehand A.、Benno Y. 等人’ Pr〇bioties: how should they be deHned」Trends

Food Sci. Technol. 1999:10 107-10)； 幼兒」意指一至六歲年齡之兒童。 除非另外說明’否則所有百分比係重量比。 該益生菌短雙歧桿菌CNCM 1-3 865可作為藥物投與嬰兒 或幼息，例如以相當於丨〇e丨〇 cfu之每日劑量溶解於水中並 以一延投與。或者，其較方便可以嬰兒配方食品、較大嬰 兒配方食或成長奶品中，以等同⑺㈡至cfu/g(基於 乾重）’更佳10e7至l〇el2 cfu/g之量投與。術語「等同量」 〇括下列可此性·細菌係活的、非複製的或死的或甚至以 片段形式（如DNA或細胞壁物質）存在。換言之，細菌數量 係以假如所有細菌均活的時該數量之細菌的菌落形成能力 表而不謂其等疋否真正係活的、非複製的或死的、呈 片段的或任何或所有該等狀態之混合物。 根據本發明嬰兒配方合〇 令食οσ之蛋白質源含量可不超過2.0 145037.doc 201029584 g/100㈣，較佳uuo g/keale雖然較佳為以乳清作為 超過50重量％之蛋白質源，但只要能滿足必需胺基酸之最 基本需求並可確保令人滿意之生長’蛋白質之種類並不認 為係本發明之關鍵。因此，可使用以乳清、路蛋白及其混 合物為主之蛋白質源及以大豆為主之蛋白質源。至於所關 注之乳清蛋白，該蛋白質源係以酸乳清或甜乳清或其混合 物為主，且可包括依所需任何比例之^乳清蛋白及卜乳球 蛋白。 該等蛋白質係完整或水解的蛋白f或完整蛋白質與水解 蛋白質之混合物。希望提供部份水解的蛋白質（水解度係2 至2〇%之間），以（例蝴於據信具有發展成牛奶過敏症之 風險的嬰兒。若f要水解蛋自，則水解過程可按所需方式 進打，且其係㈣技術巾已知。例如，乳清蛋白水解物可 依一或多個㈣，料水純㈣份製得。若料起始材 料之乳清部份實質上不含乳糖，料現在水解難期間， 該蛋白質較不受到離胺酸封阻。其能使離胺酸封阻之程度 從約15重量％之總離胺酸減少至低於約重量％之離胺 馱’例如’約7重量％之離胺酸可極大改善蛋白源之營養 品質。 該嬰兒配方食品可包含碳水化合物來源^儘管較佳碳水 化合物來源係乳糖，但仍可使用任何常見^嬰兒配方食品 中之慣用碳水化合物來源’例如乳糖、蔗糖、麥芽糖： 精、殿粉及其混合物。較佳地，該碳水化合物來源提供該 配方食品總能量之35至65%。 145037.doc 201029584 嬰兒配方食品可包含脂質來源。該脂質來源可係適用於 嬰兒配方食品之任何脂質或脂肪。較佳的脂肪來源包括棕 櫊油精、高油酸向日葵油及高油酸紅花油。亦可添加必需 脂肪酸（亞油酸及α-亞麻酸）及少量含有大量預形成花生四 烯酸及二十二碳六烯酸的油，例如魚油或微生物油。總體 言之，該脂肪含量較佳可提供該配方食品總能量之3〇至 55%。該脂肪來源中η-6對η_3脂肪酸之比例較佳為約至 約15 :1，例如約8:1至約1 〇: 1。 該嬰兒配方食品亦可含有所有被認為係每天膳食所必需❹ 及營養上有效量之維生素及礦物質。已針對某些維生素及 礦物質建立最低需求。礦物質、維生素及視需要存在於嬰 兒配方食品中之其他營養素之實例包括維生素A、維生素 B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素£、維生 素K、維生素C、維生素D、葉酸、肌醇、於驗酸、生物 素、泛酸、膽鹼令亞磷、碘、鐵、鎂、銅、鋅、錳、 氯、卸、納、砸、鉻、翻、牛續酸、及L_肉毒驗。礦物質 通常係以鹽形式添加。特定礦物質及其他維生素之存在及© 量將依計畫投與之嬰兒族群而變化。 若須要，該I兒配方食品可含有乳化劑及安㈣，如， 大豆卵磷脂、單-及二-檸檬酸甘油酯，等。 該嬰兒配方食品可視需要含有其他可能具有有益作用之. 物質：如：纖維、乳鐵蛋白、㈣酸、㈣、及類似物。 上述嬰兒配方食品可藉由任何合適的方法製備。例如， 可由蛋白質、碳水化合物來源、及脂肪來源依合適比例混 145037.doc -8- 201029584 合在起而製備。若使用乳化劑，則可在此時添加。維生 素及礦物質可在此時添加，但通常係稍後添加，以避免熱 降解。可在混合之前，先將任何親脂性維生素、乳化劑及 類似物溶解於脂肪來源中。然後可將水，較佳係已接受逆 渗透處理之水’混合至其中，形成液體混合物。水溫宜約 50C至約80C，以輔助該等成分分散。可使用市售的液化 劑形成液體混合物。然後（例如）以兩個階段使該液體混合 物均質化。 然後可藉由（例如）在約5秒至約5分鐘内，將該液體混合 物快速加熱至約8n： 圍内之溫度來熱處理該 液體混合物，以減少細菌量。可藉由蒸汽喷射'高壓滅菌 器或藉由熱父換器（例如’平板熱交換器）進行此過程。 然後可藉由（例如）閃蒸冷卻，將該液體混合物冷卻至約 60 C至約85 C 〇接著’可（例如）以兩個階段再次使該液體 混&物均質化，第_ P皆段係於約i 压至約3〇 下且 第二階段係於約2 MPa至約1G咖下m —步冷卻 該均質化混合物，以添加熱敏組分，例如：維生素及礦物 質。此時’適宜調整該均質化混合物之pH及固體含量。 將該均質化忍合物轉移至合適的乾燥裝置（例如喷霧乾 燥器或冷綠燥器），並轉化為粉末。該粉末應具有少於 約5重量％之水分含量。 短雙岐桿菌CNCM Ι·3865可根據任何合適方法培養並藉 由(例如)冷凍乾燥器或噴霧乾燥器製備，以添加至嬰兒配 方中。 145037.doc 201029584 現將參考以下實例進一步闡述本發明： 實例1 根據本發明嬰兒配方之組合物實例如下所示。此組合物 僅以舉例方式給出。 營養素 每100千卡 每升 能量(kcal) 100 670 蛋白(g) 1.83 12.3 脂肪(g) 5.3 35.7 亞油酸(g) 0.79 5.3 α-亞麻酸(mg) 101 675 乳糖(g) 11.2 74.7 益菌助生質(70% FOS， 30% 菊糖)(g) 0.64 4.3 礦物質(g) 0.37 2.5 Na (mg) 23 150 K(mg) 89 590 Cl (mg) 64 430 Ca (mg) 62 410 P(mg) 31 210 Mg (mg) 7 50 Mn(pg) 8 50 Se㈣ 2 13 維生素A (μ§ RE) 105 700 維生素D(pg) 1.5 10 維生素E(mgTE) 0.8 5.4 維生素ΚΙ (μ§) 8 54 維生素C (mg) 10 67 維生素B1 (mg) 0.07 0.47 145037.doc -10- 201029584 維生素B2 (mg) 0.15 1.0 於驗酸(mg) 1 6.7 維生素B6 (mg) 0.075 0.50 葉酸㈣ 9 60 泛酸(mg) 0.45 3 維生素Β12(μΕ) 0.3 2 生物素(pg) 2.2 15 膽驗(mg) 10 67 Fe (mg) 1.2 8 I(Kg) 15 100 Cu (mg) 0.06 0.4 Zn (mg) 0.75 5 短雙岐桿菌CNCM I-3865 2.107cfb/g 粉末 實例2 該實例比較短雙岐桿菌之三種不同菌株在小鼠中對抗輪 狀病毒感染之效力。基於三種原因選擇特定老鼠模式。首 先，在該模式中，類人猿輪狀病毒不僅引起腸道輪狀病毒 Φ 感染，亦引起輪狀病毒腹瀉。其次，輪狀病毒對於鼠科腸 粘膜之影響的組織病理學類似於感染輪狀病毒之幼兒。第 三，該模式已再現不同益生菌菌株於臨床試驗中所獲得之 較大及較小作用。 •懷孕14天BALB/c小鼠係購丹麥M0llegard。小鼠分別安 置於瑞典胡丁格市卡羅林斯卡大學醫院（Karolinska University Hospital, Huddinge，Sweden)之動物設施。自由 取用寢具及巢穴材料、標準顆粒膳食及水。保持12:12小 145037.doc 11 201029584 時之光：暗循環。小動物係於懷孕i 9至2〇天後出生。同胎 之小動物先隨機挑出後再重新分配至不同實驗組，每組7 至10隻^ 4組4天大之小動物係用於研究（三組實驗組及一 組對照組）。從第一天開始每天一次對小動物投與丨〇 體 積之細菌並持續至第3天。新鮮培養之細菌係依l〇el〇 cfu/ml之濃度再懸浮於PBS中（該pBS培養基已事先於相同 模式動物中測試’並未發現該培養基影響腹瀉結果）。三 組實驗組分別接受短雙岐桿菌CNCM 1-3 865(亦指定為内參 考物NCC 295 0)、短雙歧桿菌NCC 2791及短雙歧桿菌NCC 458。對照組僅接受卩8；5培養基。 第0天，經口使用2.10e7 FFU類人猿輪狀病毒RRV引起感 染。整個研究僅使用一批RRV。記錄腹瀉之發生率直到第 4天。於第4天時，經腹膜内使用戊巴比妥使小動物安樂 死。 根據糞便之黏稠度評估小動物之腹渴。水分多的腹萬得 到2分’稀便得到丨分，及無糞便或普通糞便得到〇分。藉 由費希爾精確測試（Fisher’s exact test)，每曰比較處理組之間 疋否出現腹;寫’並在圖表中以腹渴％表示。嚴重度之定義 為實驗過程期間針對各小動物之腹瀉分數之總和（嚴重度 =Σ腹瀉值（第一天+第二天+第三天+第四天））及持續時間之 定義為腹瀉總天數。嚴重度及持續時間亦藉由克-瓦二氏 (Kruskal-Wallis)測試法及鄧恩測試法（Dunn test)分析。用 曼-惠特尼檢驗法（Mann-Whitney test)測試實時PCR，評估 腸道病毒載量之差異。 145037.doc •12· 201029584 感染率、嚴重度及持續時間示於下表2中。 表2

間及腹瀉症狀得分方面都顯著減少（圖1}。反之，短雙岐桿 菌NCC 2791顯示有限之保護作用，同時來自短雙歧桿菌 NCC 458之結果類似於彼等對照組中之結果。 實例3 該實例採用以上實例2中描述之模式，在小鼠體内比較 φ 短雙歧桿菌CNCM 1-3865之兩種不同製劑對抗輪狀病毒感 染之效果。在該實例中，有兩組實驗組及一組對照組。一 組實驗組接受依l〇el〇 cfu/ml(NCC 29S0 L)濃度再懸浮於 ’ PBS中之活細菌。另一實驗組接受相似細菌製劑，但在投 • 與之前’該配製物先於9〇t：加熱處理30分鐘（NCC 2950 H)。對照組動物僅接受PBS培養基。結果示於表3及圖2 中。自其中可見，對照組動物獲得高感染率，其中第2天 100°/。動物腹瀉。相較於對照組動物，兩組實驗組均減少 腹瀉症狀。 145037.doc -13· 201029584 表3 NCC 2950 Η NCC 2950 L 對照組 數據數量 7 7 6 持續時間平均值 1.429 1.143 2.167 持續時間SE 0.2974 0.4592 0.3073 平均嚴重度 1.429 1.429 4 【圖式簡單說明】 圖1係隨時間比較感染類人猿輪狀病毒並接受不同益生 菌治療之四組小鼠之腹篇症狀.的程度。 圖2係隨時間比較感染類人猿輪狀病毒及接受呈未處理 及經熱處理形式之相同益生菌治療之三組老鼠之腹瀉症狀 的程度。 145037.doc 14-

Claims (1)

1. 201029584 七、申請專利範圍： 1. 一 種短雙歧桿菌6reve)CNCM 1-3865。 2. 一種適合用於預防或治療輪狀病毒引起之腹瀉之組合 物，其包含短雙歧桿菌CNCM 1-3865。 3. 如請求項2之組合物，其係嬰兒配方食品、較大嬰兒配 方食品或成長奶品。 4. 如請求項3之組合物，其包含基於乾重計等同於10e3至 10el2 cfu/g之量之短雙歧桿菌CNCM 1-3865。 ® 5.如請求項3或4之組合物，其包含等同10e7至10el2 cfu/g 之量之短雙岐桿菌CNCM 1-3 865。 6. 如請求項3至5中任一項之組合物，其進一步包含至少一 種益菌助生質，其含量佔該組合物之0.3至6重量％。 7. 如請求項2之組合物，其係補充品且每單位劑量包含1〇4 至1012 cfu之短雙岐桿菌CNCM 1-3865。 8. —種如請求項1至7中任一項之組合物之用途，其係用於 製造預防或治療輪狀病毒引起之腹瀉之藥物或治療性營 攀 養組合物。 145037.doc