TW201022445A - Method for preparing ε-caprolactam from N-acyl-6-aminocaproic acid - Google Patents

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201022445 六、發明說明： C發明所屬^_技術領域3 本發明係關於用於製備ε-己内醯胺（本文之後代表「己内醯 胺」）之方法。本發明進一步關於可用於本發明之方法的宿 主細胞。本發明進一步關於用於製備聚醯胺之方法。 t先前技冬好3 己内醯胺係一種可用於生產聚醯胺，例如耐綸-6或耐綸 -6,12之内醯胺。各種由大量化學品製備己内醯胺之方式係 於該技藝中所習知且包括由環己酮、甲苯、酚、環己醇、 苯或環己烷製備己内醯胺。這些中間化合物一般係獲自礦 物油。考慮到使用更適合的科技以製備材料之逐漸增加的 需求，提供一方法，其中己内醯胺係由一可獲自生物上可 再生的來源之中間化合物或至少一使用生化方法轉換成己 内醯胺之中間化合物而製備係所欲的。此外，提供一較利 用來自石化來源的大量化學品之傳統化學方法需要較少能 量的方法係為所欲的。 由6-胺己酸(本文之後亦代表「6-ACA」）製備己内醯胺 係為習知，如。5-八6，194,572中所述。如〜0 2005/068643 中所揭露，6-ACA可在具有a:，y5-烯醇還原酶活性的酵素存 在下藉由轉換6-胺己基-2-烯酸(6-AHEA)而生化地製備。 6-AHEA可由離胺酸製備，如生化地或藉由純化學合成。雖 然藉由WO 2005/068643中所揭露的方法，經由6-AHEA之生 物催化還原反應而製備6-ACA係可行的，發明人發現-在還 原反應條件下-6-AHEA可自發性地且實質上不可逆地環化 201022445 而形成-Μ職的副產物，高脯紐。此環化 作用可為生產6-ACA中的瓶頸，且可導致相當的產量喪失。 【發明内容】 本發明之-目標係提供—用於自6趟製備己㈣胺之新 賴方法，尤其是己⑽胺可用於製備聚醯胺，其可作為習 知方法之另一選擇。 進一步目標係提供-可克服上述一或多個缺點之新賴 方法。 致而被解決之—或多個進 興奉發明 步目標將接 續本說明如下。 已發現由一特定化合物製備己内醯胺或6-ACA係可能 的，該化合物係生物上可得的。 據此，本發明係關於用於製備ε-己内醯胺之方法，包 含去醯化Ν-醯基_6_胺己酸及形成己内醯胺。

Ν-醯基-6-胺己酸(其在本文之後可表示為「ΝϋΑ」） 可特別地選自天然可得的N_Ae_ACA 乙酿基_6-胺己酸-乙酿基斜該化合物係:= 的’如來自蘇鐵’特別是來自雙印蘇鐵⑽油⑷，如來 自其種子。 本發明進一步關於由N-Ac-ACA製備6-ACA之方法，包 3去醯化Ae_ACA’特別是包含在生物催化劑催化諸如去 酿化作用之存在下去乙驢他·乙醢基ACA。6 可 受到環化仙反應㈣紅内醢胺。 本發明進一步關於用於製備聚醯胺之方法，包含聚合 201022445 根據本發明之方法所獲得的己内醯胺。 本發明進一步關於一宿主細胞，其包含一包含核酸序 列之重組載體，該核酸序列編碼一具有自N_Ac_ACA至 6-ACA形式之催化活性的酵素，特別是自N_乙醯基_ACA。 當本文表示羧酸或幾酸鹽，如N-乙醯基_aca時，這些 用語係意指包括中性（質子化）羧酸基、相對應的羧酸鹽（其 共辆鹼）以及其鹽類。當本文表示胺基酸，如^^^八時，此

用語意指包括於其兩性離子形式（其中胺基係質子化形式 且羧基係於去質子形式）之胺基酸或其中胺基係於質子化 形式且羧基係於其中性形式之胺基酸或其中胺基係於其中 性形式且羧基係於去質子形式之胺基酸以及其鹽類。 與本發明一致’關於不為所欲的中間產物環化作用而 導致產量喪失’如當形成6_ACA及選擇性地己内酿胺時， 不為所欲的環化作用而形成縣㈣，沒有這_題被發 現到。 本發明之方法相較於WO 2005/68643中所述的方法能 夠有一相當或甚至較佳的產量係被設想到 。本發明之方法 右使用活生物可特別地為有利的係被設想到。 於本發明之—實施例中，本發明之-方法中6-ACA的 生產性(g/l.h形成的)可改善係被進—步設想到。 如本文所使用， 有明確說明。 該用語「或」意指 「及/或」’除非另 該用語「一 如本文所使用， 個」’除非另有明確說明。 或「一」意指「至少— 5 201022445 當表不—名詞（如一化合物、一添加物等等）於單數時， 其複數亦意指被包括。 當表示一存在有立體異構物之化合物時，該化合物可 為任何這_立體異構物或其之組合。因此，當表示如一 存在有鏡像異構物之胺級時，職基酸可為1_鏡像異構 物、d-鏡像異構物或其之組合。假使存在有天社體異構 物，該化合物係較佳地為天然立體異構物。 當酵素係以括號間關於酵素分類(EC)提及時，酵素分 類係-種分類’其中以由國際生物化學暨分子生物學聯合 會（International Union of Biochemistry and Molecular

Biology)之命名委員會(NC IUBMB)所提供的酵素命名為美 礎’酵素係分類或可分類，該命名可= hUp://Www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/找到。其他（尚） 未分類於特定分類但可如此分類之適合的酵素係意指被包 括。 若本文藉由參照一存取號碼表示一蛋白質或一基因， 此號碼特別係用於表示一具有如2〇〇8年1〇月9日在 中找到的序列之蛋白質或基因，除非另有明確說明。 該用語「同系物」係用於本文中特別對於具有序列相 同性至少30%，較佳地至少40%，更佳地至少6〇%，更佳地 至少75%，更佳地至少80%，特別是至少85%，更特別是至 少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至+ 95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少妁％之多核^ 酸或多胜肽。該用語同系物亦意指包括因為基因密碼之重 201022445 : 複性而與另一核苷酸序列不同且編碼相同多胜肽序列之核 酸序列。 本文中序列相同性或相似性係定義為兩或多個多胜肽 序列或兩或多個核酸序列間之關係，如藉由比較該等序列 而決定。通常’序列相同性或相似性係比較該等序列之整 體長度，然而亦可僅比較彼此排列之一部分序列。於該技 藝中，「相同性」或「相似性」亦意指多胜肽序列間或核酸 序列間序列相關性之程度，如該案例可為，如藉由這類序 ® 列間之配對而決定。決定相同性或相似性之較佳方法係設 _ 計為給與所測試的序列間最大的配對。在本發明之内容 中，決定兩序列間之相同性及相似性之較佳的電腦程式方 法包括BLASTP及BLASTN (Altschul，S. F. et al.，J. Mol Biol. 1990，以5’ 403-410，自 NCBI及其他來源（BLast

Manual, Altschul，S·，et al” NCBI NLM NIH Bethesda’ MD 20894)公開地可得）。對於使用BLASTP比較多胜肽序列較 佳的參數係間隔開放10.〇、間隔延伸0.5、Blosum62母體。 對於使用BLASTN比較核酸序列較佳的參數係間隔開放 10.0、間隔延伸0.5、DNA完整母體(DNA相同性母體）。 於本發明之一方法中，生物催化劑可被使用。因此， 於這樣的方法中至少該方法中之一反應步驟係藉由生物材 料或衍生自生物來源之部份，例如衍生自其之生物或生物 分子所催化。生物催化劑可特別包含一或多種酵素。 生物催化劑可以任何形式使用。於一實施例中，分離 自天然環境（分離自其所產生的生物中）之一或多種酵素係 7 201022445 ^為’例如-溶液、—乳化液、—分散液…懸浮液(如懸 v東乾燥生物催化劑）、_溶菌液、—無細胞萃 固定於一固持件上。 飞 於實知例中，—或多種酵素形成活生物(諸如活全細 胞)之箱酵素可於細胞内實行催化功能。亦可能為該酵 素可分泌至騎基巾，其巾該域係存在。 活細胞可為生長細胞、休止或休眠細胞(如孢子）或於靜 止期之細胞。亦可能使用形成部份之通透細胞(如造成對餅

於酵素之物f或對於酵素之物質的前驅物《素為可通透 的）的酵素。 用於本發明之方法中的生物催化劑可原則上為任何生 物，或獲自或衍生自任何生物。生物可為真核或原核。特 別是，生物可選自於動物（包括人類）、植物、細菌、古細菌、 酵母菌及真菌。適合用於催化去醯化作用之生物催化劑可 特別選自於包含一酵素之生物催化劑群組，該酵素係催化 源自於選自於由念珠菌屬山·、分枝桿菌屬

、產驗桿菌屬(A/ca/kenes)所組成的群组， 更特別疋選自於由圓柱念珠菌cy/MdVacea)、皺摺 假絲酵母菌rwgoia)、新金分枝桿菌 {Mycobacterium 狀⑽wn/m)及糞產鹼桿菌 /ακα沿)所組成的群組之生物的該去醯化作用。 生物催化劑可為異源性生物催化劑，特別是異源性細 胞。異源性生物催化劑係包含異源性蛋白質或異源性核酸 (通常為細胞之部份DNA或RNA)之生物催化劑。該用語「異 8 201022445 源性」當關於核酸序列（DNA或RNA)或蛋白質而使用時代 表其中其係存在之非天然地存在為生物、細胞、基因體或 DNA或RNA序列之部份，或與天然中發現之細胞或位置或 基因體或DNA或RNA序列中不同的細胞或位置或基因體或 DNA或RNA序列之核酸或蛋白質。已瞭解異源性生物中之 異源性DNA係該異源性生物之基因體的部份。在細胞中其 係引入之異源性核酸或蛋白質並非為内源性的，而是獲自 另一細胞或合成地或重組地產生。一般而言，雖然非必然 地，這類核酸編碼非正常地藉其中DNA係轉錄或表現的細 胞產生之蛋白質。類似地，異源性RNA編碼非正常地表現 於其中異源性RNA係存在的細胞之蛋白質。異源性核酸及 蛋白質亦可表示為外來核酸或蛋白質。任何熟習此藝者可 認知為對其中其係表現之細胞為異源性或外來的核酸或蛋 白質係於本文中包含於該用語異源性核酸或蛋白質中。 當表示來自第一生物’但實際上於(基因改造）第二生物 中生產之一酵素或另一來自特定來源之生物催化部份、重 組酵素或其他重組生物催化部份時，係特別地意指包括來 自該第一生物之酵素或其他生物催化部份。 與本發明一致，係可能將Ac_AC八轉換為己内酸⑽ 不需要生物催化劑或另-催化劑。己賴胺可藉由水解 用（以移除乙賴基)及環化_，在高溫壓力下化學 備。水解作用及環化作用兩者可於相同的反應器内， 若為所欲。 特別是，N_Ac_ACA至己内醯胺之(熱)化學轉換作用。 201022445 於所謂的高壓環化作用方法中實施。於此方法中， ‘ N-Ac-ACA之水性混合物係加熱至2〇〇至35〇 γ之溫度範圍 中、較佳地於270至330。(：之範圍及最佳地該溫度係高於 280 °C或更高。 壓力較佳地係於5與20 Mpa之間。通常此壓力將會高於 或等於所使用的溫度下液體反應混合物之結果的壓力。進 一步的反應條件，諸如適當的N-Ac-ACA進料濃度及反應停 留時間可藉熟習此藝者基於一般普遍知識及本揭露内容而 例行性地最佳化。 @ 於一進一步特定實施例中，己内醯胺係使用所謂的無 溶劑環化作用方法而自N-Ac-ACA製備。本文中N-Ac-ACA 之一融熔體，通常進一步包含足夠的水以使得水解作用能 ， 夠進行，否則一般地不含有任何溶劑，係使得於溫度自25〇 至400。(：之範圍中及較佳地於自270至350 °C之範圍中能夠 進行反應。相較於高壓環化作用，其壓力係大大地較低且 係典型地於自0.5至2 MPa。所形成的己内醯胺通常係自該 反應混合物中蒸氣汽提。蒸氣可如此地加入及/或可自存在 Θ 於進料中的水原位（MWiM)地產生。在離開反應區之後，含 有己内醯胺的蒸氣產物混合物係經濃縮。爲最佳化反應速 率及冷凝液中己内醯胺的濃度，所加入的蒸氣及/或水之量 可例行地藉由熟習此藝者而最佳化。 在無溶劑環化作用方法及高壓環化作用方法兩者中， 未轉換的中間產物可再循環。無溶劑環化作用方法超乎高 壓環化作用方法的優點係非常高的一次己内醯胺產量係輕 10 201022445 易地獲得、未轉換的中間產物之再循環可為非必要的及產 物回收可為較便宜。 於一特定實施例中，N-Ac-ACA首先係去醯化藉以形成 6 ACA，之後6-ACA可於不同的方法步驟中環化。這使得 在％化6-ACA之前、在去醯化方法之中或之後，作為去醯 化作用（或更明確地，假使N-乙醯基胺己酸係去醯化，藉移 除乙酸之去乙醯化作用）以形成6 aca之結果所形成的酸能 夠被移除。如此之移除可為所形成的酸(諸如

乙酸)與6-ACA 之實際分離，或假使全細胞生物轉形作用或類似者係使用 時，4酸可作為用於細胞之碳源，且因此可作為生物轉換 作用之結果而被移除。酸之移除，特別是乙酸，係被認為 具有優點的，因係考量猶可有害地干擾環化作用方法， 或至少可對總產量具有有害的影響，因水解作用係一平衡 反應藉由移除在環化作用之前在去醯化作用中所形成的 酸，在環化作用中6-ACA與酸之酯化作用係被避免，或至 v實貝上被降低。原則上，係可能連續地移除酸，以保持 水解作用之平衡去對的方向。 進-步考量到的是酸，特別是乙酸，可較自己内酿胺 移除更有效率地自6-ACA移除。 於本發明之-具有優點的方法中，去酿化作用係經生 物催化。特別是，具有關於N如ACA之去酿化作用，更特 別是關於N-乙酿基_ACA之去乙醯化作用之催化活性的水 解酶(EC 3)可被使用。水解酶較佳地係選自於作用在醋鍵上 之水解酶(脂酶、_)(EC 3.1}、作用在胜肽鍵上之胜狀水 201022445 解酶(胜狀酶、蛋白酶）(EC 3.4)及作用在C_N鍵而非胜肽鍵 上之水解酶(EC 3.5)之群組。 特別是’作用在C-N鍵而非胜肽鍵上之水解酶可選自於 作用在直鏈狀酿胺之醯胺酶(EC3.5J)的群組，特別是選自 胺基醯胺酶的群組，更特別是選自來自分枝桿菌屬 (Mycokcienim)之胺基醯胺酶的群組，更特別是選自來自 新金分枝桿菌（均仙〇/所)之胺基醯胺酶。 特別疋’作用在C-N鍵而非其他胜肽鍵上之水解酶可選 自於作用在直鏈狀醯胺之醯胺酶(EC 3 5 1}的群組，特別是 ❹ 轉特別疋盤尼西林酿姆（亦命名為盤尼西林酿胺酶），更 特別疋來自產驗桿菌屬之盤尼西林醯酶，更特 别疋來自糞產驗桿菌之盤尼西林G醯 ’ 酶。 特別是’可以包含一酵素之生物催化劑達成良好的結 甲 & χ ’該酵素包含如序列ID 2之胺基酸序列或其同系物。 可使用一宿主細胞，其能夠生產用於催化去醯化作用 之酵素。 Θ 根據本發明之宿主細胞包含一重組載體，該重組載體 匕3編竭具有關於由N-醯基-6-胺己酸形成6-己胺酸，特別 疋由乙醯基-6-胺己酸之催化活性的酵素之核酸序列。該 酵素可特別包含如序列ID 2之胺基酸序列或其同系物。更 特別是該酵素可由如序列ID 1之核酸序列或其同系物所編 瑪。 對於本發明之内文中的任何生物催化步驟之反應條件 12 201022445 * 可依對於該生物催化劑，特別是酵素，已知的條件、本文 所揭露的訊息及選擇性地某些例行實驗而選擇。 原則上，所使用的反應培養基之pH值可於寬廣的限制 中選擇，只要該生物催化劑在該pH條件下係具活性的。鹼 性、中性或酸性條件可被使用，依該生物催化劑及其他因 素決定，如矸為熟習此藝者所瞭解。假使該方法包括微生 物之使用，如用於表現催化本發明之方法的酵素，pH值係 m 經選擇致使該微生物能夠實行其意欲的功能或功能。pH值 可特別的於低於中性pH值4個pH單位及高於中性？11值2個 pH單位之範園中選擇，如假使在25 χ時實質上水性系統中 於ρίί 3與pH 9之間。若水係僅有的溶劑或主要的溶劑（> 5〇 wt. %’特別是>9〇wt. %，基於總液重），則一系統係被認 為為水性的，其中如少量之乙醇或另一溶劑（< 5〇 wt %， 特別是< 10 wt. %，基於總液重）可溶解（如作為碳源）於一 農度致使可能存在的微生物維持活性。特別是假使在基於 _ 25 C時實質上水性系統中，酵母菌及/或真菌係、使用時， 酸性條件可為較佳的，制是該PH值可在pH 3至pH 8之範 圍。若為職，pH值可使㈣及/級而難或赠與驗之 適合的組合而緩衝。 原則上，定溫培養條件可在寬廣的限制中選擇，只要 該生物催化劑顯示出足夠的活性及/或生長。這包括有氧、 微有氧、限氧及無氧條件。 …、氧條件係在本文中界定為無任何氧氣或其中實質上 係沒有錢被該生物催化劑，_是微生物，消耗之條件， 13 201022445 ^通常符合氡少於5_lh 心讀上，或少於imm〇iA h。 、—紘1祕件係其中祕非限制生長之減的氧氣係 ♦;培養基中之條件，其能夠支持氡祕速率至少10 二/Lh ’更佳地高於2G m_ h，甚佳地高於5G mmol/l.h 及最佳地高於l〇〇mm〇l/l.h。 j氧條件係、界定為其中氧氣消軸藉由自氣體至液體 氧氣傳輸而限制之條件。躲限氧條件之下限係藉由用

純氧條件之域而決定，如通常至少丨_動，且特別 是至少2 · 5 mmol/l.h，或最特別是至少5贿副上。用於限氧 條件之上限補由用於#氧條件之下限而蚊，如少於励 匪〇隐、少於50 mmol/Lh、少於2〇 _動或少於1〇 mmol/l.h 〇 不論條件為有氧、無氧或限氧係視該方法係在其下實 行之條件而定，特別是藉由進人的氣體流之量及組成、所

使用的設備之實際混合/質量傳輸性質、所使用的微生物種 類及微生物密度。 原則上，所使用的溫度係非關鍵的，只要生物催化劑， 特別是酵素，顯示出實質的活性。一般地，溫度可為至少〇 。(：，特別是至少15 °C’更特別是至少2〇义。所欲的最大溫 度係視該生物催化劑而定。一般而言這類最大溫度係於該 技藝中所習知，如指示於一商業上可得的生物催化劑之產 品資料單中，或可例行性地基於—般普遍知識與本文所揭 露的訊息而決定。溫度係通常為90。(：或較低，較佳地為％ 14 201022445 c或較低’特別是5QC>C或較低，更特別是⑽。。或較低。 特別是’若生物催化反應係在宿主生物外實行，包含 有機'合劑之反應培養基可於高濃度（如高於50 wt·%或高於 90 wt· % ’基於總液重)使用’假使酵素係使用且在這樣的 培養基中維持足夠的活性。 7 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 本發明現在將藉由下列示例說明。 示例 化學品： N-乙醯基冬胺己酸（N-乙醯基-ACA)係獲自Acros

Organics (純度99% ;目錄編號 186570250)。 示例1 :藉高壓環化作用由N-Ac-ACA形成己内醯胺 1 · 1.用於偵測N-Ac-ACA、CAP、6-ACA及寡聚體之 HPLC-UV分析方法 用於HPLC分析，一 250 X 3 mm之Zorbax SB-C18管柱(5 μιη，8〇A，溫度40 °C)係施加夾層注射（2 μΐ甲酸區-3 μΐ樣 本-2 μΐ甲酸區）而使用。流動相，A : 10 mM Η3Ρ〇4，pH 2.6 (NaOH)，B ·乙猜，梯度’〇 min. 99% A-1% B ’ Ϊ36 min. 68% A-32% B。流速，0.51 ml/min。UV偵測於λ = 200及220 nm。 在i3imin.時250 μΐ曱酸之梯度後注射。使用下列反應劑做管 柱後反應偵測：38 g四硼酸鈉，3 g氫氧化鈉及1 ml之3-巯丙 15 201022445 酸溶於1 1的水，其中係加入有於20 ml甲醇中之0.8 g正苯二 曱酸。管柱後流速，0.25 ml/min ;聚二醚酮(PEEK)毛細管 0.25 mm X 3 m。在330 nm (λεχ= 330 nm)激發及在420 nm aem= 420 nm)發射應用螢光偵測。在i31min.注射250 μΐ之甲 酸以清除固定相。 工·2藉高壓環化作用由N-Ac-ACA形成己内醯胺 高壓環化作用方法係使用以將N-乙醯基-ACA轉換成 己内醯胺「卡芮士(Carius)」管。 用於卡芮士管的兩個58 ml玻璃嵌件每一者係以大約 23克之含有5.1 wt% N-乙醯基-ACA(藉HPLC分析）的水性 广液填滿。在以氮氣鈍化之後，該管之内容物係加熱至細 C之所欲的方法條件。在此溫度，溶液上之平衡壓力成為 大約91巴。兩管係、在_ °C_1小時。在i小時後，切 *、係冷部《冷康」平衡產物混合物。起始溶液及產物 溶液係藉HPLC分析。 各孜與由兩試管之樣本於反應後之 4=^_+編物溶液在實驗 譜·== 於實驗中水之蒸發)，LC色層 的==:“CA及「正常」N6寡聚體之㈣ 、° 慎不欲_產物之存在無任何指示。 表1 分析結果(於 mol/1) N-乙酿 基-aca

201022445 __起始溶液 0.294~~ 0 0 0 0 Λ驗1 0.0428 ~~~0264^ 0.029 a 0.006 1 ^αόόό~ 75 0.000 14 實驗2 氺is唉•夏X ja*方 ^ 0.0382 ------ 0.285 ----- U 0.028 1 0.005 4 ^αόόο- 65 0.000 12 高於偵測極限。 ——^---—I____ i 4 __oj I 1 *環寡聚體系低於读測極限。在直鍵狀寡聚體中只有s 4之寡聚體係

示例2:由N-Ac-ACa生物摧化合成6 ACA 2.1用於偵測形成於酵素水解作用中之6_胺己酸的LC-MS 分析方法 樣本製備： 樣本係以1 : 1與洗滌劑A稀釋。

實驗係在來自 Applied Biosystems的 SCIEX API150 MS 上實行。 LC條件： • 管枉： 管枉溫度： 洗滌劑： 梯度‘· 50 x 4.6 mm Nucleosil Cl8, 5 μπι (Machery & Nagel)預管柱偶合至一 5〇 x 4 6 mm id.普遍Cl8, 5 μιη (Alltech)。 室溫 A :含有0.1%曱酸之水 B :含有0.1%甲酸之乙腈 梯度係起始於95% (v/v) A，在1.8分鐘内改 變成70 % (v/v) B，在0.1分鐘内改變成95 % (v/v) A (t = 1.9分鐘）。自1.9至4分鐘，梯度 17 201022445 係維持在95 % (v/v) B。 流速： L8 ml/min，在進入MS之前流迷係分為1:5 注射體積： 1 μΐ MS條件： 離子化： 正離子渦輪離子噴灑

來源條件：：離子喷灑電壓：5kV :溫度：350°C :去片段化電位：16V :聚焦電位：140V 掃描模式. 選擇性離子模式：m/z 132.1 (暫留時間2〇〇 毫秒） 在所使用的條件下’ 6-ACA於0.87分鐘時洗滌出來。 2.2生物催化劑之製備 下列生物催化劑係使用以催化N_乙醯基_ACA成 6-入0八之轉換作用.八)生產於大腸桿菌（£^心也知.〇£：><^)中 來自糞產驗桿菌（A/ca%enei介⑽㈣之重組盤尼西林醯酶 的冷凍乾燥無細胞萃取物，及B)新金分枝桿菌 «eoawn/m)冷洗乾燥細胞。 生物催化劑A係藉來自糞產驗桿菌（^Cfl如⑼a /fleca/i··?) (ATCC19018)染色趙DNA的野生型基因（序列id 1) 之PCR增幅作用、複製入一表現載體及於大腸桿菌 (仏c/ienc/^ cW)中重組表現該酵素(序列ID 2)而獲得，如 18 201022445 於「Applied and Environmental Microbiology 1997, 63(9)， 3412-3418」及EP0453047 中所報導。 生物催化劑B係藉新金分枝桿菌（均 之ATCC 25795株在下列條件下生長而獲得。一升 之Mycomed培養基，其含有4.8g/l三乙酸基氮(NTA)、4g/1 尿素、6 g/1 萄糖、2〇 g/1酵母碳基（來自Difco之YCB)、1.55 g/Ι ΚΗΡΟ4及0.85 gd NaH2P〇4.H2〇，係調整至pH 7且以甘 油庫存培養的新金分枝桿菌rMm)之 ATCC 25795株接種。預培養液係在37t3(：^New Brunswick Scientific G53搖動器上（150 rpm，幅度4公分）搖動168小 時。當光學密度(ODmonm)3.45係達到時，500毫升之預培養 液係使用以接種9升之Mycomed培養基。醯胺酶表現係藉由 存在於Mycomed培養基中之NTA所誘導。發酵培養液係在 充氣速率0.5-2升/分鐘下以375-750 rpm攪拌。藉由添加 HJO4及NaOH，pH值係保持悝定在7。培養溫度係370C。 在44小時之培養後，培養液係藉由添加10 g/Ι之YCB而進 料。在68小時之培養後，培養液係藉由添加1〇 g/丨之葡萄糖 而進料。在94小時之培養後，培養液係藉由在12 〇〇〇克離 心10分鐘而收獲。細胞沉殿物係於2〇 mM HEPES/NaOH緩 衝液、pH 7之下清洗且接續冷凍乾燥以供儲存。

2.3由N-Ac-ACA生物催化合成6-ACA 生物轉換作用係於96孔微孔盤規格中完成。生物催化 劑係以冷凍乾燥形式存在且在使用前係懸浮於1〇〇 μ1 5〇 19 201022445 mM填酸鉀緩衝液、ρΗ7·5中，產生最終濃度40 mg/well (生 · 物催化劑A)或2 mg/well (生物催化劑。 酵素反應係藉由添加15〇 01之133 mM N_乙醯基_ACA 溶液於50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5中其開始。反應混合物之 pH值係藉由添加15 μΐ之1 μ KOH而調整至pH 7.5。該混合 物係於28 °C定溫培養過夜同時在IKA迴旋搖動器上以500 rpm搖動。其後’反應係終止且藉由添加75〇 μ1之含有〇 5% 甲酸之水/乙腈的50/50混合物而稀釋4倍。反應混合物係在 4000rpm離心30分鐘且藉由LC-MS之方法分析。 ❹ 6-ACA係在生物催化劑存在於濃度〇 97 mmolA(酵素A) 及0.09mmol/l(酵素B)下偵測。 生物催化所形成的6-ACA可以就其本身已知的方式環 · 化而形成己内醯胺。 【圖式簡單說明3 (無） 【主要元件符號說明】 (無） ® 20 201022445 序列表 <110> DSM IP 資產 B.v. 5 <120>由N-乙醯基-6-胺己酸製備ε-己内醯胺之方法 <130> P85292PC00 10 <160> 2 <170〉Patentln 版本 3.3 <210〉 1 <211〉 2448 <212> DNA <213> 糞產鹼桿菌（Alcaligenes faecalis) 20 <220〉 <221> CDS <222〉 （1)..(2448) <400〉 1 25 atg cag aaa ggg ctt gtt cgt acc ggg ctt gtg gcc get ggt ttg ate Met Gin Lys Gly Leu Val Arg Thr Gly Leu Val Ala Ala Gly Leu lie 15 10 15 ttg ggt tgg geg ggg gca ccg acc cac geg caa gtg cag teg gta gag 30 Leu Gly Trp Ala Gly Ala Pro Thr His Ala Gin Val Gin Ser Val Glu 20 25 30 gtg atg egg gac agt tat ggc gtg ccg cac gtc ttt gcc gac age cac Val Met Arg Asp Ser Tyr Gly Val Pro His Val Phe Ala Asp Ser His 35 35 40 45 tat ggc ttg tat tac ggc tat ggt tat geg gtc gcc caa gac cgt ctg Tyr Gly Leu Tyr Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gin Asp Arg Leu 50 55 60 48 96 144 192 ttc cag atg gac atg geg cgt ege tee ttt gtc ggc aca acc gcc gcc Phe Gin Met Asp Met Ala Arg Arg Ser Phe Val Gly Thr Thr Ala Ala 65 70 75 80 1 240 40 288 -2-201022445 gtc tta ggc cct ggt gag caa gat gcc tac gtc aag tac gac atg cag Val Leu Gly Pro Gly Glu Gin Asp Ala Tyr Val Lys Tyr Asp Met Gin gtg egg cag aac ttc acc ccg get tee ata cag egg cag ate geg gcc Val Arg Gin Asn Phe Thr Pro Ala Ser lie Gin Arg Gin lie Ala Ala 100 105 110 10 ttg tee aag gat gag ege gat att ttt cgt ggc tat gcc gat ggc tat Leu Ser Lys Asp Glu Arg Asp He Phe Arg Gly Tyr Ala Asp Gly Tyr 115 120 125 336 384 aac gcc tat ctg gag cag gtg egg cgt ege cct gag ttg ctg ccc aaa 15 Asn Ala Tyr Leu Glu Gin Val Arg Arg Arg Pro Glu Leu Leu Pro Lys 130 135 140 432 gaa tat gtg gat ttt gat ttc cag ccc gag ccg ctg acc gac ttt gat Glu Tyr Val Asp Phe Asp Phe Gin Pro Glu Pro Leu Thr Asp Phe Asp 20 145 150 155 160 480 25 gtg gtc atg ate tgg gtg ggc tee atg gcc aat ege ttc tee gac aeg Val Val Met lie Trp Val Gly Ser Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Thr 165 170 175 aat ctg gaa gtg aeg gca ctg gcc atg cgt cag tet ctg gag aaa cag Asn Leu Glu Val Thr Ala Leu Ala Met Arg Gin Ser Leu Glu Lys Gin 180 185 190 528 576 624 © 30 cac ggc ccg gaa ega ggc cgt gcc ttg ttt gat gag ctg ctg tgg ate ' His Gly Pro Glu Arg Gly Arg Ala Leu Phe Asp Glu Leu Leu Trp lie 195 200 205 672 aat gac aca aca get ccc act aeg gtt ccg gcc ccc get gcc gag cac 35 Asn Asp Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Pro Ala Pro Ala Ala Glu His 210 215 220 720 aag ccg cag gca caa gca ggg aeg cag gat ctg get cat gtt tee teg

Lys Pro Gin Ala Gin Ala Gly Thr Gin Asp Leu Ala His Val Ser Ser 40 225 230 235 240 cca gta ctg get acc gag eta gag ege cag gac aag cac tgg ggc ggc

Pro Val Leu Ala Thr Glu Leu Glu Arg Gin Asp Lys His Trp Gly Gly 245 250 255 2 768 201022445 5 10 ❿ 15 20 25 Φ 30 35 cgt ggc ccg gac ttc gcg ccc aag get age aac ctg tgg age act ege 816 Arg Gly Pro Asp Phe Ala Pro Lys Ala Ser Asn Leu Trp Ser Thr Arg 260 265 270 ccc gag ega gtg cag gag ggc teg acc gta ctg ate aac ggc cca cag 864 Pro Glu Arg Val Gin Glu Gly Ser Thr Val Leu lie Asn Gly Pro Gin 275 280 285 ttt ggc tgg tac aac ccg gee tac acc tat ggc att ggc ttg cat ggc 912 Phe Gly Trp Tyr Asn Pro Ala Tyr Thr Tyr Gly lie Gly Leu His Gly 290 295 300 gee ggc ttc gat gtg gtg ggt aat aeg cct ttt gee tat ccg ate gta 960 Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr Pro Phe Ala Tyr Pro lie Val 305 310 315 320 ctg ttt ggc acc aat age gag att gee tgg ggg gcg act get ggc ccg 1008 Leu Phe Gly Thr Asn Ser Glu lie Ala Trp Gly Ala Thr Ala Gly Pro 325 330 335 caa gat gtg gtg gac ata tat cag gaa aaa ttg aac ccc teg cgt gee 1056 Gin Asp Val Val Asp lie Tyr Gin Glu Lys Leu Asn Pro Ser Arg Ala 340 345 350 gat cag tac tgg ttc aac aat gee tgg ege aeg atg gag cag ege aag 1104 Asp Gin Tyr Trp Phe Asn Asn Ala Trp Arg Thr Met Glu Gin Arg Lys 355 360 365 gaa cgt ate cag gta ege ggt cag get gat egg gaa atg aeg ate tgg 1152 Glu Arg lie Gin Val Arg Gly Gin Ala Asp Arg Glu Met Thr lie Trp 370 375 380 ege acc gtg cac ggc cct gtg atg cag ttt gat tac gat cag ggc gcg 1200 Arg Thr Val His Gly Pro Val Met Gin Phe Asp Tyr Asp Gin Gly Ala 385 390 395 400 gcg tac age aag aaa ege age tgg gat ggc tat gag gtg cag tee ttg 1248 Ala Tyr Ser Lys Lys Arg Ser Trp Asp Gly Tyr Glu Val Gin Ser Leu 405 410 415 eta gee tgg ttg aac gtg gee aag gee ege aac tgg aeg gag ttt ctg 1296 Leu Ala Trp Leu Asn Val Ala Lys Ala Arg Asn Trp Thr Glu Phe Leu 420 425 430 3 40 1344 4-201022445 gat caa gcc age aag atg geg att teg ate aac tgg tac tac gee gac Asp Gin Ala Ser Lys Met Ala lie Ser lie Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp 435 440 445 5 aag cac ggc aat att ggt tat gtc teg ccg gcc tie ctg ccc cag cgt Lys His Gly Asn lie Gly Tyr Val Ser Pro Ala Phe Leu Pro Gin Arg 450 455 460 10 cct gcc gat cag gac ate cgt gtc cct gcc aag ggg gat ggc age atg Pro Ala Asp Gin Asp He Arg Val Pro Ala Lys Gly Asp Gly Ser Met 465 470 475 480 gag tgg ctg ggc ate aag agt ttc gac geg att ccc aaa gcc tac aat 15 Glu Trp Leu Gly lie Lys Ser Phe Asp Ala lie Pro Lys Ala Tyr Asn 485 490 495 cca ccc cag ggc tat ctg gtc aac tgg aac aac aag cct geg ccg gac Pro Pro Gin Gly Tyr Leu Val Asn Trp Asn Asn Lys Pro Ala Pro Asp 20 500 505 510 aaa acc aat aeg gat act tac tat tgg acc tat ggc gac ege atg aat Lys Thr Asn Thr Asp Thr Tyr Tyr Trp Thr Tyr Gly Asp Arg Met Asn 515 520 525 25 gaa ctg gtc agt cag tac cag cag aaa gac etc ttc agt gtg cag gag Glu Leu Val Ser Gin Tyr Gin Gin Lys Asp Leu Phe Ser Val Gin Glu 530 535 540 30 ate tgg gag ttc aat caa aaa gcc tee tat age gat gtg aac tgg ege He Trp Glu Phe Asn Gin Lys Ala Ser Tyr Ser Asp Val Asn Trp Arg 545 550 555 560 tac ttc ege cca cat ctg gaa aag ctg geg caa cag ctg ccg gcc gac 35 Tyr Phe Arg Pro His Leu Glu Lys Leu Ala Gin Gin Leu Pro Ala Asp 565 570 575 gat age age aag geg geg ctg aeg atg ttg etc gcc tgg gat gga atg Asp Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr Met Leu Leu Ala Trp Asp Gly Met 40 580 585 590 gaa cag gat cag gga ggg caa aat gcc gga ccg geg egg gtg etc ttc Glu Gin Asp Gin Gly Gly Gin Asn Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu Phe 595 600 605 1392 1440 1488 1536 . 1584 1632 1680 ❹ 1728 1776 1824 4 201022445 5 10 0 15 20 25 φ 30 35 aag acc tgg ctg gaa gaa atg tac aag cag gtc ttg atg ccg gtg gtg 1872 Lys Thr Trp Leu Glu Glu Met Tyr Lys Gin Val Leu Met Pro Val Val 610 615 620 cct gaa teg cat ege gee atg tat age cag act ggt ttt gee aeg cag 1920 Pro Glu Ser His Arg Ala Met Tyr Ser Gin Thr Gly Phe Ala Thr Gin 625 630 635 640 caa ggt ccc aac ccc ggt tee ate aac ttg age atg ggc acc aag gtc 1968 Gin Gly Pro Asn Pro Gly Ser lie Asn Leu Ser Met Gly Thr Lys Val 645 650 655 ttg ttg cgt gee ttg gtg ctg gaa gee cat ccc gat ccc aag cgt gtg 2016 Leu Leu Arg Ala Leu Val Leu Glu Ala His Pro Asp Pro Lys Arg Val 660 665 670 aat gtc ttt ggt gag cgt teg tet cag gaa ate atg cac aca get ttg 2064 Asn Val Phe Gly Glu Arg Ser Ser Gin Glu lie Met His Thr Ala Leu 675 680 685 caa aat geg cag gee ege ttg age cag gag cag ggc get cag atg geg 2112 Gin Asn Ala Gin Ala Arg Leu Ser Gin Glu Gin Gly Ala Gin Met Ala 690 695 700 ege tgg acc atg ccg acc tee gtg cat cgt tie age gac aag aac ttc 2160 Arg Trp Thr Met Pro Thr Ser Val His Arg Phe Ser Asp Lys Asn Phe 705 710 715 720 aeg gga acc ccg cag aeg atg cct ggc aat acc ttt gee ttt acc ggc 2208 Thr Gly Thr Pro Gin Thr Met Pro Gly Asn Thr Phe Ala Phe Thr Gly 725 730 735 tat cag aat ega ggc aeg gaa aat aac ege gtg gtg ttt gat gee aag 2256 Tyr Gin Asn Arg Gly Thr Glu Asn Asn Arg Val Val Phe Asp Ala Lys 740 745 750 ggc gtg gag ttc tgc gac gee atg ccg ccc ggc caa age ggt ttc acc 2304 Gly Val Glu Phe Cys Asp Ala Met Pro Pro Gly Gin Ser Gly Phe Thr 755 760 765 gac ege aat gga gtg ege age ccg cat tat gag gat cag ctg aag ttg 2352 Asp Arg Asn Gly Val Arg Ser Pro His Tyr Glu Asp Gin Leu Lys Leu 770 775 780 5 40 -6- 201022445 tac gag aac ttc gag tgc aag acg atg gat gtg acg cat gcg gac att 2400

Tyr Glu Asn Phe Glu Cys Lys Thr Met Asp Val Thr His Ala Asp He 785 790 795 800 cgt cgt aat gcg caa age age acg atg ctg ttg att cag cct cag cct 2448

Arg Arg Asn Ala Gin Ser Ser Thr Met Leu Leu lie Gin Pro Gin Pro 805 810 815 10

<210> 2 <211> 816 <212> PRT

<213> 糞產驗桿菌（Alcaligenes faecalis) 15 <400〉 2

Met Gin Lys Gly Leu Val Arg Thr Gly Leu Val Ala Ala Gly Leu lie 15 10 15

Leu Gly Trp Ala Gly Ala Pro Thr His Ala Gin Val Gin Ser Val Glu 20 25 30 25

Val Met Arg Asp Ser Tyr Gly Val Pro His Val Phe Ala Asp Ser His 35 40 45

30 Tyr Gly Leu Tyr Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gin Asp Arg Leu 50 55 60

Phe Gin Met Asp Met Ala Arg Arg Ser Phe Val Gly Thr Thr Ala Ala 35 65 70 75 80

Val Leu Gly Pro Gly Glu Gin Asp Ala Tyr Val Lys Tyr Asp Met Gin 85 90 95

Val Arg Gin Asn Phe Thr Pro Ala Ser He Gin Arg Gin He Ala Ala 100 105 110 6 40 -7201022445

Leu Ser Lys Asp Glu Arg Asp lie Phe Arg Gly Tyr Ala Asp Gly Tyr 115 120 125 5

Asn Ala Tyr Leu Glu Gin Val Arg Arg Arg Pro Glu Leu Leu Pro Lys 130 135 140 10

Glu Tyr Val Asp Phe Asp Phe Gin Pro Glu Pro Leu Thr Asp Phe Asp 145 150 155 160 參 15

Val Val Met He Trp Val Gly Ser Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Thr 165 170 175

Asn Leu Glu Val Thr Ala Leu Ala Met Arg Gin Ser Leu Glu Lys Gin 180 185 190 20

His Gly Pro Glu Arg Gly Arg Ala Leu Phe Asp Glu Leu Leu Trp lie 195 200 205 25

Asn Asp Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Pro Ala Pro Ala Ala Glu His 210 215 220 參30

Lys Pro Gin Ala Gin Ala Gly Thr Gin Asp Leu Ala His Val Ser Ser 225 230 235 240 35

Pro Val Leu Ala Thr Glu Leu Glu Arg Gin Asp Lys His Trp Gly Gly 245 250 255

Arg Gly Pro Asp Phe Ala Pro Lys Ala Ser Asn Leu Trp Ser Thr Arg 260 265 270

Pro Glu Arg Val Gin Glu Gly Ser Thr Val Leu He Asn Gly Pro Gin 275 280 285 7 40 201022445

Phe Gly Trp Tyr Asn Pro Ala Tyr Thr Tyr Gly He Gly Leu His Gly 290 295 300 5

Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr Pro Phe Ala Tyr Pro He Val 305 310 315 320 10 Leu Phe Gly Thr Asn Ser Glu lie Ala Trp Gly Ala Thr Ala Gly Pro 325 330 335

Gin Asp Val Val Asp lie Tyr Gin Glu Lys Leu Asn Pro Ser Arg Ala 15 340 345 350 0

Asp Gin Tyr Trp Phe Asn Asn Ala Trp Arg Thr Met Glu Gin Arg Lys , 355 360 365 20

Glu Arg lie Gin Val Arg Gly Gin Ala Asp Arg Glu Met Thr He Trp 370 375 380 25

Arg Thr Val His Gly Pro Val Met Gin Phe Asp Tyr Asp Gin Gly Ala 385 390 395 400 30 Ala Tyr Ser Lys Lys Arg Ser Trp Asp Gly Tyr Glu Val Gin Ser Leu 參 405 410 415

Leu Ala Trp Leu Asn Val Ala Lys Ala Arg Asn Trp Thr Glu Phe Leu 35 420 425 430

Asp Gin Ala Ser Lys Met Ala lie Ser He Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp 435 440 445 40

Lys His Gly Asn lie Gly Tyr Val Ser Pro Ala Phe Leu Pro Gin Arg 450 455 460 8 -9201022445

Pro Ala Asp Gin Asp lie Arg Val Pro Ala Lys Gly Asp Gly Ser Met 465 470 475 480 5

Glu Trp Leu Gly lie Lys Ser Phe Asp Ala lie Pro Lys Ala Tyr Asn 485 490 495 10

Pro Pro Gin Gly Tyr Leu Val Asn Trp Asn Asn Lys Pro Ala Pro Asp 500 505 510 ❹15

Lys Thr Asn Thr Asp Thr Tyr Tyr Trp Thr Tyr Gly Asp Arg Met Asn 515 520 525

Glu Leu Val Ser Gin Tyr Gin Gin Lys Asp Leu Phe Ser Val Gin Glu 530 535 540 20 lie Trp Glu Phe Asn Gin Lys Ala Ser Tyr Ser Asp Val Asn Trp Arg 545 550 555 560 25

Tyr Phe Arg Pro His Leu Glu Lys Leu Ala Gin Gin Leu Pro Ala Asp 565 570 575 ❿30

Asp Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr Met Leu Leu Ala Trp Asp Gly Met 580 585 590 35

Glu Gin Asp Gin Gly Gly Gin Asn Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu Phe 595 600 605

Lys Thr Trp Leu Glu Glu Met Tyr Lys Gin Val Leu Met Pro Val Val 610 615 620

Pro Glu Ser His Arg Ala Met Tyr Ser Gin Thr Gly Phe Ala Thr Gin 625 630 635 640 9 40 -10- 201022445

Gln Gly Pro Asn Pro Gly Ser lie Asn Leu Ser Met Gly Thr Lys Val 645 650 655 5

Leu Leu Arg Ala Leu Val Leu Glu Ala His Pro Asp Pro Lys Arg Val 660 665 670 10 Asn Val Phe Gly Glu Arg Ser Ser Gin Glu lie Met His Thr Ala Leu 675 680 685

Gin Asn Ala Gin Ala Arg Leu Ser Gin Glu Gin Gly Ala Gin Met Ala 15 690 695 700

Arg Trp Thr Met Pro Thr Ser Val His Arg Phe Ser Asp Lys Asn Phe 705 710 715 720

Thr Gly Thr Pro Gin Thr Met Pro Gly Asn Thr Phe Ala Phe Thr Gly 725 730 735 25

Tyr Gin Asn Arg Gly Thr Glu Asn Asn Arg Val Val Phe Asp Ala Lys 740 745 750 30 Gly Val Glu Phe Cys Asp Ala Met Pro Pro Gly Gin Ser Gly Phe Thr 參 755 760 765

Asp Arg Asn Gly Val Arg Ser Pro His Tyr Glu Asp Gin Leu Lys Leu 35 770 775 780

Tyr Glu Asn Phe Glu Cys Lys Thr Met Asp Val Thr His Ala Asp He 785 790 795 800

Arg Arg Asn Ala Gin Ser Ser Thr Met Leu Leu lie Gin Pro Gin Pro 805 810 815 10

Claims (1)

1. 201022445 ' 七、申請專利範圍： i· 種用於製備ε-己内醯胺之方法’包含去酿化队醯基 -6-胺已酸及形成ε_己内醯胺。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，包含化學性地去醯化Ν_ 醯基-6-胺己酸。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，包含生物催化性地去醯 化Ν_醯基-6-胺己酸，藉以形成6-胺己酸，及環化6-胺己 φ 酸’藉以形成ε-己内醯胺。 4. 如申凊專利範圍第3項之方法，其十該生物催化性去醯 1 化作用係於包含一水解酶之生物催化劑存在下實行，該 V 水解酶係選自作用在酯鍵上之水解酶(EC 3.1)、作用在 胜肽鍵上之胜肽水解酶(EC 3.4)及作用在C-N鍵而非胜 肽鍵上之水解酶(EC 3.5)，特別是，在一包含一作用在 線性醯胺上之醯胺酶(EC 3.5.1)的生物催化劑存在下， 更特別是一盤尼西林醯酶(EC 3.5.1.11)。 _ 5.如申請專利範圍第3或4項之方法，其中該生物催化性去 醯化作用係於包含一酵素之生物催化劑存在下實行，該 酵素係催化源自於選自於由念珠菌屬'分枝 桿菌屬（Mycokcier/wm)及產驗桿菌屬（A/ca/Zge/ie*?)所組 成的群組，特別是選自於由圓柱念珠菌（CimAWa 、鈹摺假絲酵母菌rwgosa)、新金 分枝桿菌及糞產驗桿菌 (AicaZigenes /aecWs)所組成的群組之生物的該去醯化 作用。 1 201022445 6·如申請專利範圍第3至5項任一項之方法，其中該生物催 化劑包含一包含如序列Π) 2之胺基酸序列或其同系物 的酵素。 7. 如申請專利範圍第1至6項任一項之方法，其中己内醯胺 之形成係藉由在自0.5至2 MPa範圍之壓力及在自250至 400 °C範圍之溫度中以無溶劑環化作用反應的方式，或 藉由在5與20 MPa之間的壓力及在自200至350 °C範圍 之溫度以高壓環化作用反應的方式而實行。 8. 如申請專利範圍第1至7項任一項之方法，其中該N_酿 基-6-胺己酸係N-乙醯基_6_胺己酸。 9. 如申請專利範圍第1至8項任一項之方法，其中該N-醢 基-6-胺己酸係獲自生物性來源。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該生物性來源係蘇 鐵’特別是雙卵蘇鐵⑷。 11. 一種製備聚醯胺之方法，包含聚合獲自如前述申請專利 範圍任一項之方法的ε-己内醯胺。 12. —宿主細胞’包含一包含核酸序列之重組載體該核酸 序列編碼一能夠催化由Ν-醯基-6-胺己酸形成6-胺己酸 之酵素。 13. 如申請專利範圍第12項之宿主細胞，其中該編碼一能夠 催化由Ν-酿基_6_胺己酸形成6_胺己酸之酵素的核酸序 列係一編碼能夠催化由Ν-乙醯基-6-胺己酸形成6-胺己 酸之酵素的核酸序列。 14·如申請專利範圍第12或13項之宿主細胞，其中該酵素係 201022445 一如申請專利範圍第6項所界定之酵素。 15.如申請專利範圍第14項之宿主細胞，其中該酵素係由一 如序列ID 1或其同系物之核酸序列所編碼。

   3 201022445 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。（無) (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無） 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：