TW201019953A - RAB6KIFL/KIF20A epitope peptide and vaccines containing the same - Google Patents

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201019953 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於生物科學之領域，更具體為癌症治療之領 域。特定地說，本發明關於新穎的募胜肽及其使用。 【先前技術】 CD8陽性殺手T淋巴細胞（CTLs)已證實可辨識主要組織 相容性複合物（MHC)第I型分子上的腫瘤相關抗原（TAAs)所 衍生之抗原決定位胜肽’並殺死腫瘤細胞。自從發現TAAs 的第一例---MAGE族，起初以免疫方法發現許多其他的 TAAsCNPLl:Boon T. Int J Cancer 54: 177-180, 1993； NPL2:Boon T, and van der Bruggen P. J Exp Med 183： 72 5-729, 1996)，其中一些目前正臨床發展為免疫療法的 標的。 可引發有效及特異的抗腫瘤免疫反應之新穎TAAs的鑑 別，可進一步作為各種癌症的胜肽免疫策略的臨床使用及 發展的依據（NPL3:Harris CC，J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL4:Butterfield Lfl et al.,

Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL5:Vissers JL et al. , Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21 ): 5554-9; NPL6:van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL7:Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL8:Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL9:Kikuchi M el al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL10:0iso 201019953 M et al.， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3): 387-94)。 至今多篇臨床試驗報告使用這些腫瘤相關抗原衍生的胜 肽。不幸地目前在這些癌症疫苗試驗中僅觀察到低的目標 反應率（objective response rate) (NPLll:Belli F et al.， J Clin Oncol 2002 Oct 15， 20(20)： 4169-80 ; NPL12:Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15)。 近來已發展預測人類白血球抗原（HLA)第I類-連接胜 肽序列的規則系統（NPL14:Journal of Immunological Methods, (1995)， Vol.185， pp. 181-190, NPL15:J.

Immunol., (1994), Vol.152, pp.1 63-175, NPL16:protein science, (2000)，Vol. 9, pp. 1838-1846)。然而難以確信 預期的抗原決定位胜狀可在目標細胞中自然地進行修飾及 在目標細胞表面經HLA分子表現。而且，該規則系統，例 ® 如 BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_park er_comboform) (NPL17: Parker KC, et al., (1994) J Immunol. ;152(1):163-75. ； NPL18:Kuzushima K, et al., (2001) Blood. ;98(6):1872-81.))可推測 HLA 分子連接胜 肽’但是該推測的胜肽較不精密（NPL1: Bach in sky MM, et. al.，Cancer Immun. 20 0 5 Mar 22 ;5:6.)。因此，篩選抗 原決定位胜肽仍然具有挑戰性及困難。 胰臟癌的診斷效果差’整體5年的存活率為約5%(1)。 201019953 手術切除仍然是長期存活的唯一選擇，但是具有可切除的 胰臟癌患者為少數（9-22%)(NPL 20: Sener S F，ei； ai j Am Coll Surg 1999;189:1-7. , NPL 21 ： Eloubeidi M A, et al. Am J Surg 2006;192:322-9., NPL 22： Goonetilleke K S’et al. Int J Surg 2007;5:147-51.)。即使是這些患 者，儘管有治療目的的手術，他們的5年存活率仍然為約 20%(NPL 23: Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103., NPL 24: Yeo C J, et al. Ann Surg 1995;221:721-31.)。高達80%的患考存在局部末期的或惡 性腫瘤的疾病’存活的中間值約6-9個月（NPL 25 : Lockhart A C, et al· Gastroenterology 2005;128:1642-54.)。因 此’新穎的治療形式的發展為非常重要的議題，而免疫療 法法可為具有潛力的肤臟癌治療方法。 RAB6KIFL(KIF20A)首先被確認，在高基氏髏（G〇igi apparatus)的動態（dynamics)中扮演一角色，直接與Rab6 小 GTP 酶作用（NPL 26: Echard A， et al. Sci ence 1998;279:580-5. )°RAB6KIFL 屬於運動蛋白（motor protein) 的驅動蛋白超族（kinesin superfamily)，在分子及胞器的 移動中具有重要功能（NPL 26: Echard A，et al. Science 1998;279:580-5., NPL 27: Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73., NPL 28: Allan VJ, and Schroer TA· Curr Opin Cell Bi〇i 1999;11:476-82·)。 目前Taniuchi K等人報導RAB6KIFL在胰臟癌組織中過度 表現（NPL 29: Taniuchi K, et al. Cancer Res 201019953 2005;65:105-12.)。他們發現RAB6KIFL在胰臟致癌作用中 的重要角色的證據。 經過基因表現輪廓分析，使用具有23, 040個基因的全 基因體 cDNA 微陣列（genome-wide cDNA microarray)， RAB6KIFLCKIF20A)目前‘示在數種癌症中為向上調節 (up-regulated)，例如在膀胱癌（PTL 1: W02006/085684)、 小細胞肺癌（SCLO (PTL 2: W02007/013665)及贺爾蒙頑固 型前列腺癌（HRPC) (PTL 3: W020 0 8M 02906 )，此述之文獻 ❹ 的揭露併入本文作為參考。而且，基因產物的一些 抗原決定位胜肽也被證實（PTL 4: W02008/1 02557)。 [引用文獻] [非專利文獻] [NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3)： 725-9 ❹[NPL 3] Harris CC， J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16， 88(20): 1442-55 [NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 [NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1 996 May 1, 156(9): 3308-14 [NPL 7 ] Tanaka Fetal., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 201019953 4465-8 [NPL 8] Fujie T et al. , Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 [NPL 9] Kikuchi M et a.l. , Int J Cancer 1 999 May 5, 81(3) 459-66 [NPL 10] Oiso M et al.', Int J Cancer 1 999 May 5, 81(3): 387-94 [NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 [NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 [NPL 13] Rosenberg SA et al. , Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 [NPL 14] Jounal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190

[NPL 15] J. Immunol., (1 994), Vol.152, pp. 163-175 [NPL 1 6] protein science, (2000), Vol.9, pp.1 838-1846 [NPL 17] Parker KC, et a 1. , ( 1 994) J

Immunol. ; 1 52( 1 ):1 63-75.

[NPL 18] Kuzushima K, et a 1. , (2001 )

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[NPL 19] Bachinsky MM, et. al. , Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6.

[NPL 20] Sener S F, et al. J Am Coll Surg 1 999;189:1-7. 201019953 [NPL 2006; 21] Eloubeidi Μ 192:322-9. A, et al. Am J Surg [NPL 22] Goonet i11 eke K S，et al. Int J Surg 2007;5:147-51.

[NPL 23] Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103.

[NPL 24] Yeo C J, et al. Ann Surg 1995;221:721-31.

[NPL 25] Lockhart A C, et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54.

[NPL 26] Echard A, et al. Science 1998;279:580-5.

[NPL 27] Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73.

[NPL 28] Allan VJ, and Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82.

[NPL 29] Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12. φ [專利文獻] [PTL 1] W02006/085684 [PTL 2] W02007/013665 [PTL 3] W02008/102906 [PTL 4] W02008/102557 【發明内容】 本發明部分基於發現免疫療法的新穎目標。因為TAAs 通常沒有引發免疫（immunogen i city )，適當目標的發現是 非常重要的。本發明特別目標RAB6KIFL(KIF20A)(序列識 9 201019953

別號2) ’編碼於基因銀行編號（GenBank Aceessic)r〇NQ AF1 53329或CR598555的基因’亦稱為nm_〇〇5733 (序列識 別號1)，由於RAB6KIFL已被證實在數種癌症中為向上調 節，例如膀胱癌、乳癌、惡性膽管細胞癌 (cholangiocellular Carcinoma)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌 (SCLC)。本發明提供似基因產物，包含抗原決定位 胜肽，該抗原決定位胜肽引發對相關分子特異地驚人強烈 的CTL反應。使用本發明之胜肽刺激獲自健康捐贈者的週 邊血液單核細胞（PBMCs)。本發明更提供特異性辨識以前述 胜肽衝擊的陽性目標細胞所建立的ctLs， 及本發明提供HLA-限制抗原決定位胜肽，可誘 發有效及特異的免疫反應對抗腫瘤上表現的RAB6KIFl。此 結果證實RAB6KIFL為強的致免疫性’及其抗原決定位為腫 瘤免疫療法法的有效標的。 因此’本發明之一目的為提供具有CTL誘發性之募胜 肽’選自由序列識別號3、4及5所組成之群的胺基酸序列。 本發明之一實施例為修飾的上述寡胜肽，可有1、2或數個 胺基酸被取代、缺少、插入及/或加入，但該修飾寡胜肽仍 保留原始胜肽的上述CTL誘發性。 當投予個體時，本發明之寡胜肽被表現於抗原表現細 胞的表面’然後引發CTLs目標其對應的胜肽。因此，本發 明之一目的為提供表現任一前述存在胜肽之抗原表現細胞 (antigen-presenting cells)及外吐小體（exosomes)，及 201019953 提供誘發抗原表現細胞之方法。 抗腫瘤免疫反應是由投予本發明之RAB6KIFL寡胜肽 或編碼該寡胜肽之多核苷酸'及表現該RAB6£IFL寡胜肽的 外吐小體及抗原表現細胞所誘發。因此，本發明之另一目 的為提供醫藥劑或醫藥組合物，包含前述之寡胜肽或編碼 該寡胜肽之多核普酸、及前述外吐小體及抗原表現細胞為 其活性成分。本發明之醫藥劑或醫藥組合物可作為疫苗用 途。 ❹ 本發明之另一目的為提供治療及/或預防癌症（腫 瘤）、及/或預防其術後復發之方法，以及.誘發CTLs之方 法、誘發抗腫瘤免疫之方法，前述之方法包括投予RAB6kifl 寡胜肽、編碼RAB6K丨FL募胜肽之多核普酸、表現rab6k〗fl 募胜肽之外吐小體或抗原表現細胞、或本發明之醫藥劑的 步驟。而且本發明之CTLs 4發現可作為抗癌疫苗之用途。 標的癌症例如膀‘胱癌、乳癌、惡性膽管細胞癌 _ (cholangiocellularcarcinoina)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌 (SCLC)，但不限於此。 刚述之本發明摘要及後述之詳細說明了解為例示的實 施例’不限制|發明或本發明之其他替代的實施例。 【實施方式】 雖然任何相似或相等於此述之方法及材料，可用於本 發明實施例的實施或測試，以下描述較佳方法、裝置、及 材料。然而，在說明本發明材料及方法前，應了解本發明 11 201019953 不限於此述之特定的體積、形狀、㈣、材料 驟等然而這些可根據慣例試驗及理想值化而異。亦應了 解此述之專有名詞僅作為描述特定說明方式或實施例之目 的’不意圖限制本發明範圍，本發明範圍將僅限於後述的 申請專利範圍。 本說明中逑及的公開文獻、專利案、或專利申請案皆 全文併入本文作為參考。然而，未有任何此述之文獻憑藉 先前技術使本發明在未有標題下提早被揭露。 如果有矛盾情形，依本說明書，包括定義，說明。而❹ 且以下材料、方法、實施例僅用於說明，不用於限制。 I.定義 除非有特別說明，本文中所使用的 個’’ ‘該”或“該等”係指“至少一種”。 夕胜肽、“胜肽”或“蛋白晳，，I 4：t 0^ 質係指胺基酸殘基 的聚。物，該等名詞在本文中 ❹ 拱便用。該等名詞應用 於含有一個或以上的胺基酸殘基經修飾的殘基或非天铁產 生的殘基之胺基酸聚合物，例如對應之㈣胺基酸的人工 化學模擬物質’以及應用於天然產生的胺基酸聚合物。 =出現於本說明中的“募胜肽，，，係指本發明之胜 肽為20個殘基或以下的長度，血型兔 ^ Η ^ 又，、型為丨5個殘基或以下 的長度，通常為約8至u個殘基，較 吊馬9或10個殘基。 本文中的“胺基酸”係指夫然 及胺其舱缸 生與合成的胺基酸以 物。天紗… 大纥胺基酸的胺基酸模擬 ，、、、的絲酸係麵的胺基酸及在細 12 201019953 胞中轉譯後被修飾的胺基酸（例如：經膽胺酸 (hydroxyproline)、r -羧基谷胺酸（carboxyglutamate) 與0-磷絲胺酸（phosphoserine))。“胺基酸類似物”係指 與天然胺基酸具有相同之基本化學結構（連接氫、羧基、胺 基與R基團的α碳）’但具有一修飾的R基團或修飾的骨架 (例如：高絲胺酸（homoserine)、正白胺酸（norleucine)、 甲硫胺酸（methionine)、亞硬（sulfoxide)、曱硫胺酸曱基 ❹ 鏑·（methi〇Tiine methyl sulfonium))的化合物。“胺基酸 模擬物係指與一般胺基酸具有相似功能但結構不同的化 學化合物。 本文中的胺基酸可用一般所知的3個字母表示或以 IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議的單一字母表示。 除非特別說明，本文中的“基因”、“多核苷酸”、 核苷酸與“核酸”可交互使用，這些名詞與胺基酸相 似並且以其常用接受的單一字母密碼表示。 β 除非另外定義’ ”癌症”係指過度表現似抑基因 的癌症。過度表現基因的癌症例如·膀胱癌、乳 癌、惡性膽管細胞癌（cholangiocel lular carcinoma)、食 道癌、非小細胞肺癌（NSCLC)、胰臟癌、前列腺癌、腎癌 (renal carcinoma)、及小細胞肺癌（SCLC)。 除非另外定義，”細胞毒性T淋巴細胞”、，，細胞毒 性T細胞”及，’ CTL”在本文中可交互使用，代表可辨識非 我細胞（例如腫瘤細胞、病毒感染細胞）及誘發前述細胞死 亡之T淋巴細胞的亞群（SUb-gr〇Up)。 13 201019953 除非另外定義，本文中所使用的技術與科學名詞皆與 本發明所屬之技術領域人員所了解。 11.胜肽 為了證明衍生自RAB6KIFL的胜肽功能為被細胞毒性τ 淋巴細胞（CTL)辨識的抗原，分析衍生自RAB6KIFL的胜肽 (序列識別號2) ’以確定其是否為HLA-A26i抑限制的 抗原決定位’ HLA-A2為常見的HLA對偶基因（Date Y et al., Tissue Antigens 47： 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 1 55: 430 7-1 2, 1 995; Kubo RT et al. , J Immunol 152 : 3913-24，1994)。衍生自 RAB6KIFL 的 HLA-A2 連接胜 肽之候選物’使用其對HLA-A2的結合親和力的資訊而確 認。以載有這些胜肤的樹狀細胞（DC)在體外（//7 刺 激T細胞之後，使用該胜肽成功地建立CTL，特別是下列 胜肽： RAB6KIFL-A2-9y2 (序列識別號 3)、 RAB6KIFL-A2-9-^9(序列識別號 4)及 RAB6KIFL-A2-10-284(序列識別號 5)。 這些已建立的CTL顯示有效及特異的CTL活性，對抗 以各別胜肽衝擊（pulse)的目標細胞。此述結果證實 RAB6KIFL為CTL辨識的抗原，而前述之胜肽可能為 HLA-A264抑別"限制的RAB6KIFL抗原表現位胜肽。 由於//Z基因在大部分癌症組織中過度表現，例 如膀胱癌、乳癌、惡性膽管細胞癌（ch〇langi〇cellular carcinoma)、食道癌、非小細胞肺癌（NSCL〇、胰臟癌、前 201019953 列腺癌、腎細胞癌（renal carcinoma)、及小細胞肺癌 (SCLC)’因此為免疫療法的良好標的。因此，本發明提供 對應CTL辨識的RAB6KIFL抗原決定位之募胜肽，例如九胜 狀（由9個胺基酸殘基組成的胜狀）及十胜狀（由個胺基 酸殘基組成的胜肽）。本發明的募胜肽之特定較佳實施例， 包括具有選自序列識別號3、4及5之胺基酸序列的胜肽。 大體而言’在網際網路上可獲得的軟體程式，例如 ©Parker KC et al. , J Immunol 1994 Jan 1, 152(1)： 163-75 所述的程式’可經由電腦模擬（/π y cc>)計算各種胜肽與 HLA抗原之間的結合親和力。與hla抗原的結合親和力可 利用例如 Parker KC et al.，J Immunol 1994 Jan 1，152(1): 1 63-75 與 Kuzushima K ef 3人，Blood 2001, 98(6): 1872-81所述的方法來測量。確定結合親和力的方法描述 於例如 Journal of Immunological Methods, 1995，185: 181-190.與 Protein Science, 2000， 9: 1838-1846» 因 ❹此’本發明包含由該已知程式確認與HLA抗原連接之 RAB6KIFL 胜肽。 本發明之胜肽的兩侧可為額外的胺基酸殘基，只要該 胜肽保留其CTL誘發性即可。具有CTL誘發性的胜肽為， 例如少於約40個胺基酸’經常少於約20個胺基酸，通常 少於約15個胺基酸*位於前述由選自序列識別號3、4及 5之胺基酸序列所組成的胜肽兩侧的胺基酸序列沒有限 制，只要未減損原始胜肽的CTL誘發性，該胺基酸序列可 由任何胺基酸組成。因此，本發明也提供具有CTL誘發性 15 201019953 的胜肽’該胜肽包含選自序列識別號3、4及5之胺基酸序 列。 一般而言，蛋白質中一個、二個或數個胺基酸的修飾 並不會影響該蛋白質的功能，在一些情況下甚至會促進原 始蛋白質之期望的功能。事實上，已知經修飾的胜肽（即相 較於原始的參考序列，由經修飾的1個、2個或數個胺基 酸殘基之胺基酸序列組成的胜肽（即具有取代、缺少、增加 或插入））能保持原始胜肽的生物活性.(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1 984, 81: 5662-6; Zoller and Smith,參 Nucleic · Acids Res 1982, 10: 6487-500；

Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13)。因此，本發明的一實施例中，本發明之寡 胜肽可具有CTL誘發性及選自序列識別號3、4及5之胺基 酸序列，該胺基酸序列中可增加、插入、缺少及/或取代1 個、2個或以上的胺基酸。 此技術領域中之人士了解改變單一胺基酸或小比例的 ⑬ 胺基酸之胺基酸序列的個別增加或取代，傾向造成原始胺 基酸侧鏈的保留（conservation)性質。通常稱為“保留性 取代作用（conservative substitution)” 或“保留性修 飾作用（conservative modification)” ，其中，蛋白質的 改變造成具有與原始蛋白質相似性質及功能的修飾蛋白 質。提供功能上相似胺基酸的保留性取代作用表 (Conservative substitution tab 1 es)已為該技術領域周 知。較佳保留的胺基酸側鏈特性，例如疏水性胺基酸（A、I、 16 201019953 1>、1«^、¥、1〇、親水性胺基酸（1?、1)11、£：、9、 G、Η、K、S、T)以及具有以下官能基或共同特性的侧鏈： 脂肪族側鏈（G、Α、V、L、I、Ρ):含有羥基的側鏈（s、τ、 Y);含有硫原子的側鏈（c、Μ);含有羧酸與醯胺的侧鏈（D、 N、E、Q);含有鹼基的側鏈（R、κ、H);以及含有芳香族的 側鏈（H、F、Y、W)。而且以下8個基團，每一基團含有該 技術領域中可接受的互作保留性取代的胺基酸：

1)丙胺酸（A)，甘胺酸（G); 2) 天冬胺酸（D)、麩胺酸（E); 3) 天門冬胺酸（N)、麩醯胺酸（q); 4) 精胺酸（R)、離胺酸（K); 5)異白胺酸（I)、白胺酸（L)、甲硫胺酸<^)、纈胺酸 (V)； 6) 苯丙胺酸（F)、酷胺酸（Y)、色胺酸（w); 7) 絲胺酸（S)、羥丁胺酸（T);以及 φ 8)半胱胺酸（c)、甲硫胺酸（M)(參考例如：Creighton，

Proteins 1984)。 前述之保留性的修飾胜肽也包'含在本發明的胜肽。然 而’本發明之胜肽並不限定為此類胜肽，可包含非保留性 的修飾，只要修飾的胜肽保留原始胜肽的CTL誘發性。再 者，修飾的胜肽不應該排除CTL誘發性的胜肽的多形態變 異體（polymorphic variants)、種間同系物（interspecies homologues)、及 RAB6KIFL 對偶基因（alleles) 〇 為了保留必要的CTL誘發性，可修飾（增加或取代）少 17 201019953 數（例如1個、2個或數個）或小比例的胺基酸。此處的“數 個”係指5個或以下的胺基酸，例如3個或以下。可修改 的胺基酸比例較佳為2〇%或以下，更佳為15%或以下，再更 佳為10%或以下，或者為1%至5%。 當用於免疫療法時，本發明之胜肽應該被表現在細胞 或外吐小體的表面’較佳與HLA抗原形成複合物。、因此， 較佳選擇可誘發CTL且對HLA抗原具有高結合親和力的胜 肽。為了達到此目的，該胜肽可由胺基酸殘基取代、插入、 缺少、及/或增加而修飾，以形成具有改良的結合親和力之 鬱 修飾胜肽。除了被自然表現的胜肽之外，由於已知結合至 HLA抗原而表現的胜肽序列的規則性（j immun〇1 ι 994, 1 52: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178； J Immunol 1994, 155 : 4307) ’以此規則性為基礎的修飾作用可用於本發明 的致免疫性（immunogenic)胜肽上。例如，具有 HLA-A2 次似夕/)高度結合親和力的胜肽，具有其n端的第 二胺基酸被白胺酸（leucine)或甲硫胺酸（methionine)取 ❹ 代，及C端的胺基酸被綠胺酸（vaiine)或白胺酸（ieucine) 取代。因此’具有序列識別號3、4或5之胺基酸序列的胜 狀’其中其N端的第二胺基酸被白胺酸（ieucine)或曱硫胺 酸（methionine)取代及/或其c端的胺基酸被纈胺酸 (vali ne)或白胺酸（leucine )取代之胜肽，皆包含於本發 明。取代作用不只發生在末端胺基酸，也會發生在胜肽之 可能的T細胞受體（TCR)識別區。數個研究證明胜肽中胺基 酸的取代作用可與原始的例如CAPl、p53(264-2⑴、Her-2/neu 18 201019953

( 3 6 9 - 3 77)或 gplOO ( 2 0 9 - 2 17)相同或更多（Zaremba et al. Cancer Res. 57，4570-4577，1 997，Τ· K. Hoffmann et al. J

Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53， 307-314)。 本發明也包括在此述序列上增加胺基酸。例如也可在 本發明胜肽的N端及/或C端增加1個、2個或數個胺基酸。 此修飾胜肽具有南度HLA抗原結合親和力及保留ctl誘發 性，也包含於本發明中。

然而，當該胜肽序列與具有不同功能之内源性 (endogenous)或外源性（ex〇genous)蛋白質的部分胺基酸 序列相同時，可能會引起對抗特定物質而產生的副作用， 例如，自體免疫疾病及/或過敏症狀。因此，，較佳先利用現 有的資料庫進行同源性搜尋，以避免胜肽的序列與另一蛋 白質的胺基酸序列相符的情況。當同源性搜尋清楚地證明 不存在與目標胜肽有小至i或2個胺基酸差異的胜肽時， 則可修飾該目標胜肽以增加其與HLA抗原的結合親和力及 /或增加其CTL誘發性’而不會有任何產生副作用的風險。 雖然預期上述對HLA抗原具有高度結合親和力的胜狀 具有高效力’以高度結合親和力為指標選出的候選胜版， =然被進-步地檢視是否具冑m誘發性。此處所述的 士 CTL誘發性’係指當該胜肽被表現在抗原表現細胞上 %’該胜肽誘發細胞毒性τ淋巴細胞(CTLs)的能力。再者， 19 201019953 “ CTL誘發性”包括胜肽誘發CTL活化、CTL增生、促進目 標細胞的CTL胞溶（lysis)及增加CTL的IFN- 7產生的能 力。 CTL誘發性的確認是由該胜肽刺激誘·發載有人類MHC 抗原的抗原表現細胞（例如，B淋巴細胞、巨嗤細胞與樹狀 細胞（dentri tic cell, DC))，或更具體地為衍生自人周邊 血液單核白血球的DCs，經過以上述胜肽刺激後，與CD8 陽性細胞混合，之後測量對抗目榛細胞的CTL所產生及釋 放的IFN- r而完成。作為反應系統，可使用為了表現人類 HLA抗原的轉殖基因動物（例如：BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immuno 1 2000 Aug, 61(8): 764-79'Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response)。舉例來說，可利用51cr這類物質放射標記目標 細胞，然後由目標細胞釋出的放射性蚪算細胞毒性活性。 或者可在有胜肽固定的抗原表現細胞（APC)的存在下，經由 測量CTL產生與釋出的IFN- r以及檢視使用抗IFN- r單株 抗體的培養基上的抑制區，來評估CTL誘發性。 如上所述評估上述胜肽的CTL誘發性的結果發現，對 HLA抗原具有高度結合親和力的胜肽不必然具有高度匸孔 誘發性。然而’前述確認及評估的胜肽中，發現具有選自 具有序列識別號3、4及5之胺基酸序列的胜肽之九胜肽或 20 201019953 十胜狀顯示特別高的CTL誘發性及高度HLA抗原結合親和 力。因此’前述胜肽為本發明的較佳實施之例示。 除上述之修飾外，本發明胜肽也可連接至其他物質， 只要所得的連接胜肽保留原始胜肽的必需CTl誘發性。適 當的物質例如包括胜肽、脂質、糖與糖鏈、乙醯基、天然 與合成的聚合物等，但不限於此。該胜肽可包含修飾作用 例如糖化作用、侧鏈氧化作用或磷酸化作用等，前提為該 φ 修飾作用未破壞原始胜肽的生物活性。這些修飾作用可給 予額外的功能（例如：標的功能舆遞送功能）或用以安定該 多胜肽。 例如，為了增加多胜肽的體内（/乃安定性，此技 術領域中已知可使用D-胺基酸、胺基酸模擬物或非天然的 胺基酸；此概念也可應用於本發明之多胜肽。多胜肽的安 定性可利用數種方法分析。例如，可用肽酶（peptidases) 與各種生物介質’例如人類血漿與血清，測試安定性（參考 φ Verhoef ei a/. , Eur J Drug Metab Pharmacokiη 1 986, 1 1： 291-302) 〇 而且’本發明之胜肽可經由間隔物（spacer)或連接物 (linker)連接至其他胜肽。其他胜肽例如衍生自其他taa 的CTL誘發胜肽’但不限於此，或者本發明的兩個或以上 的胜肽可經由間隔物（spacer)4連接物（linker)連接。經 由間隔物或連接物連接的胜肽可彼此相同或相異。間隔物 或連接物沒有特別限定’但較佳為胜肽，更佳為具有1個 或以上可被例如肽酶（peptidase)、蛋白酶（protease)及蛋 21 201019953 白解體（proteasome)等酵素切割的切割位（cleavage site)。間隔物或連接物例如 AAY (P. M. Daitarian et al.， J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al·，J Immunol. 2000，1 65: 73.08-7315)或 1 至數個 離胺酸（lysine)殘基（S. Ota et al.，Can Res. 62， 1471-1476, K. S. Kawamura et al. , J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)，但不限於此。本發明之胜肽包含此述經間隔 物或連接物連接至其他胜肽之胜肽。 此述本發明之胜肽也可描述為” RAB6KIFL胜肽，，、，， ® RAB6KIFL多胜肽”或” RAB6KIFL募胜肽”。 III. RAB6KIFL胜肽的製備 本發明之胜肽可利用已知的技術製備。例如，可利用 重組DNA技術或化學合成方法合成該胜肽。本發明之胜肽 可個別地合成或合成為包含2個或以上之胜肽的較長多胜 肽。該胜肽可被分離’即純化或分離而實質上無其他天然 產生的宿主細胞蛋白質及其片段、或其他任何的化學物質。 ❹ 本發明之胜肽可基於選擇的胺基酸序列經化學合成而 獲得。例如’可採用習知的胜狀合成方法來合成，包括以 下之方法，但不限於此： (i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ； (ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976 ； (iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975 ； 22 201019953 (iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co. , 1 985 ； (v) Deve1opment of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ; (vi) W099/67288 ;以及 (vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, “Solid Phase Peptide Synthesis” ， Academic Press,

New York, 1980， 100-118。 或者，本發明之胜肽可利用任何已知用以製造胜肽的 基因工程法來獲得（例如：Morrison J，J Bacteriology 1977, 132: 349-51 ； Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu ei a/,) 1983， 101: 347-62)。 例如，首先製備一表現形式（eXpressible form)(例如，對 應於啟動子（promoter)序列的調節序列的下游）的具有編 ❹ 碼目的胜肽的多核苷酸之適當載體，將該載體轉形至適當 的宿主細胞内。然後培養該宿主細胞，產生感興趣的胜肽。 該胜肽也可利用體外（r/汁〇」轉譯系統在體外（", 製造。 IV.多核苷酸 本發明提供一種多核苷齪’其編碼任何上述之本發明 的胜肽◊該多核苷酸包括衍生自天然產生之

基因（GenBank Accession No. NM (序列識別號1))的多核苷酸及具有其保留修飾之核苦酸序 23 201019953 列（conservatively modified nucleotide sequence)的多 核苷酸。此處所述之“保留修飾之核苷酸序列”係指編碼 完全相同或大體上相同之胺基酸序列的序列。因為基因密 碼退化（degeneracy)，大量功能性相同的核酸編碼任何特 定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG與GCU皆編碼胺 基酸丙胺酸。因此’在一密碼子指定丙胺酸的每一位置上， 該密碼子可改變成上述的任何對應的密碼子而不改變編碼 的多胜肽。此種核酸變異體係“寂靜的變異體（sil variations)” ，其為保留修飾的變異體的一種，本文所述 的每一種編碼胜肽的核酸序列也說明每一種核酸寂靜變異 體。熟知此技術之人將了解到一核酸（除了 AUG之外，AUG 通常為甲硫胺酸的唯一密碼子，以及除了 TGG之外，TGG 通常為色胺酸的唯一密碼子）的每一密碼子可經過修飾而 產生功能性相同的分子。因此’編碼胜肽之核酸的每一寂 靜變異體隱含地描述於每一揭露的序列中。

本發明之多核普酸可由DNA、RNA及其衍生物組成。DNA 適‘地由驗基，例如A、T、C及G組成’RNA中T被U取 代。 本發明之多核苷酸可利用或不利用介於中間的間隔胺 基酸序列（intervening amino acid sequences)編碼多種 本發明的胜肽。例如，該間隔胺基酸序列可提供多核苷酸 或轉譯胜肽的切割位置（例如：酶識別序列）。而且該多核 苷酸可在編碼本發明胜肽的編碼序列包含任何額外的序 列。舉例來說，該多核苷酸可為一重組多核苷酸，其包括 201019953 表現胜肽所需的調節序列或可為一具有標誌基因與類似物 質的表現載體（質體）。該重組多核苷酸一般可經由習知的 重組技術使用例如聚合酶與内核酸酶（end〇nuclease)等進 行多核苷酸的調控而製備。 重組技術與化學合成技術皆可用以〃製造本發明的多核 苷酸。例如，多核苷酸可經由插入一適當的載體，當該多 核苷酸轉染入一適當細胞時表現而製得。或者多核苷酸可

Φ利用聚合酶鏈鎖反應（PCR)技術放大或在適當的宿主中表 現（參考 Sambrook 以 5厶，Molecular n〇ning: A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New

York，1 989)。或者，多核苷酸可利用固相技術來合成，例 如 Beaucage SL & Iyer Rp，Tetrahedr〇n 1 992，48: 2223-311; Matches m/., EMBO J 1 984，3: 801-5。 包含本發明之多核苷酸的載體及包含該載體的宿主細 胞也可包含於本發明中。 ❷ V.外吐小體（exosome) 本發明進一步地提供稱為外吐小體的胞間囊泡 (intracellular vesicles)，在其表面表現形成於本發明 胜肽與HLA抗原之間的複合物。外吐小體的製造可利用例 如日本專利申請公開案平所詳述 的方法及使用從接受治療及/或預防之病人所得的Apc來 製備。本發明之外吐小體可以類似於本發明胜肽的形式如 疫苗般接種。 包含在該複合物中的HLA抗原形式必須與接受治療及 25 201019953 /或預防之個體的HLA抗原形式相符。例如，使用高度表現 於日本人與高加索人的HLA-A2型有助於獲得有效的結 果，而HLA-A2 64抑別/)與HLA-A2“等亞型也可使 用。在臨床上’通常先對需接受治療之病患的ULA抗原型 進行研究，這可適當地選擇對此特定抗原具有高度結合親 和力的胜肽或經由抗原表現具有CTL誘發性的胜肽。而 且’為了獲得具有尚度結合親和力與CTL誘發性的胜肽， 可基於天然產生之RAB6KIFL部分胜肽的胺基酸序列，進行 1、2或數個胺基酸的取代或增加。 Φ 當使用HLA-A2 64次久抗原為外吐小體時，可使用具 有選自序列識別號3、4及5的胺基酸序列的胜肽。 VI.抗原表現細胞（APCs) 本發明也提供分離的抗原表現細胞（APC)，該抗原表現 細胞於其表面表現形成於HLA抗原與本發明胜肽之間的複 合物。經由接觸本發明之胜肽或載入表現形式之編碼本發 明胜狀之核苷酸而獲得的Ape ’可衍生自接受治療及/或預 ❹ 防的病患’並且該抗原表現細胞可如疫苗般單獨地投予或 與其他藥物’包括本發明的胜肽、外吐小體或細胞毒性τ 細胞，同時投予。 該APC不限於特定種類的細胞，其包括樹狀細胞 (DC)、蘭格罕細胞（Langerhans ce us)、巨嗟細胞、B細 胞、與活化的T細胞’已知這些細胞在其細胞表面存在蛋 白質的抗原（Proteinaceous antigens)以便於被淋巴細胞 辨識°由於Dc係抗原表現細胞當中具有最強CTL誘發活性 26 201019953 的代表性APC，因此DC可作為本發明的APC。 舉例來說’從週邊血液單核細胞誘發DC，然後以本發 明之胜肽在體外（J/7以斤〇)、活體外（叩）或活體内（^ 以叩）接觸（刺激）這些DC可得到APC。當將本發明之胜肽 投予至個體時，表現本發明之胜肽的Apc便在個體體内被 誘發 誘發APC包括以本發明之胜肽或編碼本發明之 胜肽的核苦酸接觸（刺激）_細胞，以在細胞表面上表現HU φ 抗原與本發明之胜肽之間所形成的複合物。或是在將本發 明之胜肽載入APC使得該APC表現該胜肽之後，可將該Apc 如疫田般地投予至個體。例如，活體外（以叩）的投予可 包括以下步驟： a:從第一個體收集apc ; b:以胜肽接觸步驟a的APC ;以及 c:投予載有該胜肽的apc至第二個體。 第個體與第二個體可為同一個體或不同個體。或者，本 粵發明提供本發明胜肽的用途，用來製造誘發抗原表現細胞 之醫藥組合物。另外’本發明也提供製造誘發抗原表現細 胞之醫藥組合物之方法或過程，該方法包括混合或調配本 發明之胜肽及醫藥容許載劑之㈣。或者，本發明提供製 造治療膀胱癌、乳癌、惡性膽管細胞癌、食道癌、非小細 胞肺癌（嶋〇、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、及小細胞肺癌 (sac)之醫藥組合物之方法或過程，其中該方法包括混合 或調配本發明之胜肽及醫藥容許載劑之步驟。而且，本: ''提供本發明之胜肽以誘發抗原表現細胞。步驟b所得 27 201019953 的APC可如疫苗般地投予至個體。或者，本發明提供治療 膀胱癌、乳癌、惡性膽管細胞癌、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、騰臟癌、前列腺癌、腎癌、及小細胞肺癌（sclc ) 之胜肽。 * 根據本發明觀點，本發明之APC具有高度的CTL誘發 性。“高度的CTL誘發性”的高度係與未以胜肽接觸或以 未能誘發CTL之胜狀接觸的APC相互比較的程度β該具有 咼度CTL誘發性的APCs可經由在體外（//? 移含有 編碼本發明胜肽的多核苷酸之基因至APC的步驟而製造。 該載入的基因可為DNA或RNA形式。載入的方法包括此技 術領域一般所使用的各種方法，例如：脂質體轉染 (1 ipofection)、電穿孔法（electroporation)與鱗酸妈法 等’但不限於此。更具體地說’可使用Cancer Res 1 996, 56·· 5672-7 ; J Immunol 1 998, 161: 5607-13 ; J Exp Med 1996, 184: 465-72 » Published Japanese Translation of

International Publication No. 2000-509281 所述的方 法。將基因轉移至APC内，該基因在細胞内進行轉錄、轉 譯與類似作用，所得的蛋白質經由MHC第I類或第11類處 理’然後經過表現途徑來表現胜肽。 在較佳實施例中’本發明之APCs在表面表現HLA抗原 及包含選自序列識別號3、4及5之胺基酸序列的寡胜肽之 複合物。本發明之APCs表面較佳載有HLA-A2抗體，特別 是HU-A2 (Οί抑烈"。或者，與HLA抗原形成複合物的募胜 狀可為包含選自序列識別號3、4、5的胺基酸序列之寡胜 201019953 肽’其中有1個、2個或數個胺基酸被取代、插入、缺少 及/或增加’例如N端的第二胺基酸被白胺酸（leucine)或 曱硫胺酸（methionine)取代及/或其C端的胺基酸被纈胺 酸（valine)或白胺酸（ieucine)取代之胜肽。 VII.細胞毒性T細胞（CTL) 被誘發而抵抗任何本發明之胜肽的細胞毒性T細胞， 加強了活體内標的腫瘤相關之内皮細胞層（end〇the 1 ia)的 免疫反應’因此該細胞毒性T細胞可作為類似於該胜肽本 身的疫苗。因此，本發明提供分離出來的細胞毒性Τ細胞， 該細胞毒性Τ細胞被本發明之任一胜肽專一地誘發或活 化。 前述細胞毒性τ細胞可獲得自（1)投予本發明之胜肽 至一個體’然後自該個體收集細胞毒性Τ細胞；或（2)在體 外以本發明之胜肽接觸（刺激）個體衍生的apc 與CD8陽性細胞或週邊血液單核白血球，然後分離細胞毒 ❹ 性T細胞。 由表現本發明胜肽之APC刺激而誘發的細胞毒性τ細 胞，可衍生自接受治療及/或預防.的病患，並且可因應調節 功效的目的而單獨投予或與其他包括本發明胜肽或外吐小 體（exosome)的藥物共同投予。所獲得的細胞毒性τ細胞專 一地產生作用抵抗表現本發明胜肽的目標細胞或同樣用以 產生誘發作用之胜肽的目標細胞。換句話說，該細胞毒性 T細胞可在具有T細胞受體的目標細胞表面辨識（即連接至） 一形成於HLA抗原及本發明胜肽之間的複合物，之後攻擊 29 201019953 該目標細胞，誘發該目標細胞死亡。該目標細胞可為内源 性表現RAB6KIFL的細胞或為以基因轉染的細 胞；由於被本發明之胜肽刺激，在細胞表面表現本發明之 胜肽的細胞也可作為活化的CTL攻擊的目標。在較佳實施 例中’該目標細胞表面載有HLA-A2抗原，特別是 HLA-A2 64抑之幻。 VIII.T細胞受體（TCR) 本發明也提供一種包含編碼可形成T細胞受體（TCR) 次單位的多胜肽之核酸序列的組合物以及使用該組合物的 方法。該TCR α及冷有能力形成TCR，該TCR對於對抗表 現RAB6KIFL的腫瘤細胞之τ細胞真有專一性。利用此技術 中已知的方法’以本發明之一個或以上胜肽誘發之CTL中 表現的TCR之α與/5鏈的核酸序列可被分離，且用於構築 可媒介高效率基因轉入初級人淋巴球的適當載體 .(W02007/032255 及 Morgan et al., J Immunol, 171， 3288 (20 0 3))。例如，該載體為反轉錄載體。更有利地， 本發明提供可立即使用（off-the_seif)的組合物，允許患 者自體的T細胞（或其他哺乳動物的τ細胞）快速修飾，以 快速及輕易地產生具有優良殺死癌細胞性質之修飾T細 胞。 同時，本發明提供以編碼連接至RAB6KIFL胜肽的TCR 次單位多胜肽之核酸轉導（transduct)而製備的細胞毒性τ 細胞，該RAB6KIFL胜肽例如HLA-A2 64抑中的序列識 別號3、4及5。該被轉導的CTL在活體内（ii f/叩）能夠 201019953 返回癌細胞，並且可藉由周知的體外培養方法進行擴增（例 如：Kawakami et al.， J Immunol.， 142， 3452-3461 ( 1 989))。本發明之T細胞可用以形成能有效治療或預防需 接受治療或預防之病患之癌症的致免疫組合物 (W02006/031221)。 IX.醫藥劑或組合物 預防（prevention)” 及”預防（prophylaxis)，，可 ® 交替使用表示任何降低因疾病所造成之死亡或發病的活 動。預防可發生在“初級、第二級與第三級的預防”。初 級預防避免了疾病的發展’第二級與第三級的預防活動便 著重於預防疾病的惡化與症狀顯現，以及經由恢復功能與 降低疾病相關的併發症來降低已發生之疾病的負面影響。 或者，預防包括一廣泛的預防治療，其目的在減緩特定疾 病的嚴重性，例如減少腫瘤的增生與轉移。 癌症的治療及/或預防'、及/或其術後復發的預防，包 粵括任何下列的步驟，例如手術移除癌細胞、抑制癌細胞的 生長腫瘤的衰退或退化、誘發癌症發生的緩解與抑制作 用腫瘤緩解以及轉移的減少或抑制。有效治療及/或預防 :疒會減夕死亡率與改善患癌病患的預後、減少腫瘤標記 在血液中的含量以及減緩因癌症造成的可查覺症狀。例 如’症狀的減輕或改善係指有效地治療及/或預防包括 20/β、30%或以上的減輕，或指病況穩定。 與正常的組織相比較之下，RAB6KIFL的表現在數種癌 症中為向上調節，因此本發明之胜肽或編碼該胜狀的多核 31 201019953 苷酸可用來治療及/或預防癌症、及/或預防其術後復發。 因此，本發明提供一種醫藥劑或組合物，用來治療及/或預 防癌症、及/或預防其術後復發，該醫藥劑或組合物包括— 種或以上之本發明胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸作為活性 成分。或者’本發明之胜肽可在任何前述之外吐小體或細 胞（例如APC)的表面被表現，作為醫藥劑或組合物使用。 而且’前述之目標任何本發明胜肽之細胞毒性T細胞也可 作為本醫藥劑或組合物的活性成分。在本發明中，”目標 胜狀係指辨識（即連接至）形成於具有T細胞受體的目標 ® 細胞表面上的HLA抗原與胜肽之間的複合物，之後攻擊該 目標細胞，誘發該目標細胞死亡。 一實施例中，本發明亦提供一活性成分的使用，用於 製造治療癌症之醫藥組合物或醫藥劑，該活性成分選自： (a) 本發明之胜肽； (b) 以表現形式編碼前述胜肽之核酸； (c) 本發明之APC ;及 ▲ ❹ (d) 本發明之細胞毒性τ細胞。 另—實施例中’本發明更提供一活性成分用於治療癌 症’該活性成分選自： (a) 本發明之胜肽； (b) 以表現形式編碼前述胜肽之核酸； (c) 本發明之Apc ;及 (d) 本發明之細胞毒性τ細胞。 另—實施例中’本發明更提供一治療癌症之醫藥組合 32 201019953 物或醫藥劑之製造方法或過程，該方法或過程包括調配醫 學或生理學容許載劑及活性成分，該活性成分選自： (a) 本發明之胜肽； (b) 以表現形式編碼前述胜肽之核酸； (c) 本發明之apc ;及 (d) 本發明之細胞毒性τ細胞。 另實施例中，本發明更提供一治療癌症之醫藥組合 ❹物或醫藥劑之製造方法或過程，該方法或過程包括混合活 性成分與醫學或生理學容許載劑，該活性成分選自： (a) 本發明之胜肽； (b) 以表現形式編碼前述胜肽之核酸； (c) 本發明之apc ;及 (d) 本發明之細胞毒性τ細胞。 另一實施例中，本發明之醫藥組合物或醫藥劑可用於 預防癌症或其術後復發或兩者。 _ 本發明之醫藥齊！或組合物可作為疫苗。在本發明中， 疫苗（也稱為致免疫組合物）係指接種至動物體内後具 有引發抗腫瘤免疫性功能的物質。 本發明之醫藥劑或組合物可用以治療及/或預防個體 或病患癌症、及/或預防其術後復發，該個體或病患包括人 任何其他的哺乳動物’包括小鼠、大鼠、天竺鼠、兔 子貓狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子、狒狒與黑 獲特別疋經濟上重要的動物或畜產動物，但不只限於 此類。 33 201019953 根據本發明發現，具有選自序列識別號3、4及5之胺 基酸序列的寡胜肽為HLA-A2 限定的抗原表現位胜 肽，其可誘發有效且特異的免疫反應。因此，包含任何具 有選自序列識別號3、4及5之胺基酸序列的募胜狀之本發 明醫藥劑或組合物，特別適合投予至HLA抗原為 HLA-A2 64次久的個體。含有編碼任何前述寡胜肽之多核 苷酸的醫藥劑或組合物也可作相同的應用。 以本發明之醫藥劑或組合物治療的癌症未受限定，包 括W万沒#//^相關的所有形式的癌症，例如膀耽癌、乳癌、❹ 惡性膽管細胞癌（cholangioce 11 ular carcinoma)、食道 癌、非小細胞肺癌（NSCLC)、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌 及小細胞肺癌（SCLC)。本發明之醫藥劑或組合物特別較佳 應用於胰臟癌。 除了前述的活性成分之外，本發明之醫藥劑或組合物 還可包含其他具有誘發CTL對抗癌細胞的胜肽、編碼該其 他胜肽的其他多核苷酸、表現該其他胜肽的其他細胞、或 ❹ 同類物。此處所述之能夠誘發CTL抵抗癌細胞的其他胜 肽’例如癌特異的抗原（例如，經鑑定的TAAs)，但不因此 受到限制。 本發明之醫藥劑或組合物可視需要，選擇性地包含其 他治療物質作為活性成分，只要該物質未抑制如任何本發 明之活性成分（例如任何本發明之胜肽）的抗腫瘤效應。例 如’配方可包括抗發炎劑或組合物、止痛劑、化學治療劑、 及此等類似物。除了包含藥物本身的其他治療物質以外， 34 201019953 =發明之藥物也可與-個或以上的其他藥學製劑連續或同 ㈣予。該藥物或藥學製劑或組合物的量，依據例如使用 的藥學製劑形式、所治療疾病及投予時程與途徑而定。 應當了解除了此處特別提及的成分之外，本發明之醫 藥劑或組合物可包括在該技術領域中習知的因調配形式而 使用的其他藥劑。 在本發明之-實施例中，本發明之醫藥劑或組合物可 ❹包括在含有有效治療疾病(例如癌症)病理症狀之物質的商 品與套組中。該商品可包括一任何本發明醫藥劑或組合物 的谷盗與-標籤。適當的容器包括瓶子、小玻魏與試管。 該容器可為各種材質，例如玻璃或塑膠。該容器上的標籤 應標明該藥劑係用以治療或預防該疾病的一個或以上的症 狀。該標籤也可標明投予方式等資訊。 除了上述的容器之外，包含本發明之醫藥劑或組合物 的套組可選擇性地更包含一第二個容器，貯存醫藥容許稀 嚳釋劑。該套組可進-步地包含商業上或使用者觀點所認可 的其他原料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、 針筒及使用指示的仿單。 該醫藥組合物可視情況存在於一包裝或配藥裝置 、Penser device)中’該包裝或配藥裝置中可包含—個 或以上含有該活性成分的單位㈣形式。該包裝可例如包 括金屬或塑料膜，例如罩板包裝（bHsterpack)。該包裝 或配藥裝置可具有投藥指示。 (1)含有該胜肽作為法，w』、、 桂·成为的醫藥劑或組合物 35 201019953

或組合物可為抗癌目的使用。

上的胜肽組成，以在活體内广 合’由本發明之兩個或以 〇 以誘發CTL。該胜肽組 合可為雞尾酒形式或利用標準技術相互結合。例如，該胜 肽可化學連結或表現成單一融合多胜肽序列 fusion polypeptide seqUence)。該組合 t 的胜肽可為相 同或不同《經由投予本發明之胜肽，該胜肽由APC上的肛八 抗原高密度地表現，然後誘發對形成於該被表現的胜肽與 該HLA抗原間的複合物特異性反應之CTL。或者，表面表 現本發明胜肽之APC可獲自經由移除個體的Apc(例如 DC) ’該APC以本發明胜肽刺激，藉由再次投予這些ApC於 該個體中使該個體的CTL被誘發，結果，增加對癌細胞的 侵略性’該癌細胞例如膀胱癌、乳癌、惡性膽管細胞癌 (cholangiocel lular carcinoma)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌及小細胞肺癌 (SCLC)。 該用以治療及/或預防癌症的醫藥劑或組合物，包含本 36 201019953 發明胜肽為活性成分’也可包含習知有效於細胞免疫的佐 劑。或者該醫藥劑或組合物可舆其他活性成分一起投予或 調配成顆粒（granules)配方投予。佐劑係指當與具有免疫 活性的蛋白質共同（或連續地）投予時能夠增加對抗該蛋白 質的免疫反應之化合物。此述可使用的佐劑包括文獻（Clin

Microbiol Rev 1994，7: 277-89)中所述的佐劑。適當佐 劑的例子包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明釁 '霍亂毒素、沙門 氏菌毒素及其類似物，但不因此受限制。 參 而且’該胜肽連接至數毫米直徑小珠的微脂體 (liposome)配方、顆粒配方及脂質連接至該胜肽的配方也 便於使用。 在一些實施例中，本發明之醫藥劑或組合物可進一步 包含啟動（prime)CTL的成分。已確定脂質為能夠在活體内 啟動CTL對抗病毒抗原的製劑。舉例來說，棕櫚 酸殘基可連接至離胺酸（17^116)殘基的£-與〇;_胺基，然 ❹ 後連接至本發明的胜肽。該脂類胜肽可以之後合併至微脂 體以微膠粒（micelle)或顆粒（part icle)直接投予，或在佐 劑中乳化而直接投予。另一個脂質啟動CTL反應的例子， 例如大腸桿菌脂蛋白，當該大腸桿菌脂蛋白共價地連接至 一適當的胜肽時，使用三棕櫚醢基_S-甘油基半脱胺酸離胺 酸基-絲胺酸（P3CSS)啟動CTL(見例如Deres et al.，

Nature 1989， 342: 561-4)。 投予的方法可為口服的、皮膚内的、皮下的、靜脈内 注射投予或這類方式以及全身性的投予或局部投予至目標 37 201019953 位置的鄰近區域。投予可為單次投予或增加為多次投予。 本發明之胜肽的劑量可根據治療的疾病、病患的年紀、體 重、投予的方式與這類狀態而適當地調整，其一般劑量為 0. 0 01 mg 至 10 0 0 mg，例如 〇. 〇 〇 1 mg 至；[〇 〇 〇 或 〇 丄 mg 至10 mg’並且可數天至數月投予一次。熟悉此技術的人 員可適當選擇一適當劑量。 (2)含有多核苷酸為活性成分的醫藥劑或組合物 本發明之醫藥劑或組合物也可包含以表現形式編碼本 發明胜肽之核酸。此處所稱之“表現琅式，，係指當多核苷 〇 酸導入細胞時，該多核苷酸將在活體内（//7以>〇)表現成誘 發抗腫瘤免疫性的多胜肽。在一實施例中，感興趣的多核 苷酸之核酸序列包括表現該核苷酸所需要的調節子 (regulatory elements)。該多核苷酸可如此裝置以達到穩 定地插入在該目標細胞的基因體（例如Thomas KR &

Capecchi MR，Cell 1987，51: 503-1 2)。例如 Wolff et al.， Science 1 990，247: 1465-8 ;美國專利案號 5, 580, 859 ; ❹ 5,589,466； 5,804,566； 5,739,118； 5, 736, 524； 5, 679, 647 與WO 98/04720。以DN A為基礎的遞送（deli very)技術例 如“裸 DNA(naked DNA) ” 、加速的（布比卡因 (bupivacaine)、聚合物、胜肽媒介的）遞送、陽離子脂質 複合物、及顆粒媒介的遞送（“基因搶（genegun)，，）或壓 力媒介的傳送（如美國專利案號5, 922, 687)。 本發明之胜肽也可經由病毒或細菌的載體表現。表現 載體的例子包括減弱的病毒宿主，例如牛痘或禽痘。此方 38 201019953

法與牛痘病毒的使用有關，例如表現編碼該胜肽的核苷酸 序列之載體。該重組的牛瘦病毒在載入一宿主後表現致免 疫的胜肽，因此引發免疫反應。有效用於免疫過程之牛痘 載體與方法的例子可見美國專利案號4, 722, 848。另一載 體例子為卡介苗（BCG，BacHle Calmette Guerin)。BCG 載體描述於 Stover et al.，Nature 1991，351: 456-60。 其他各種用於治療投予或免疫的多種載體，例如腺病毒載 φ 體及腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、沙門氏菌傷寒載 體、解毒的炭疽熱毒素載體及其類似物，顯然也可使用。 例如 Shata et al.，Mol Med Today 2000，6: 66-71 ; Shedlock et al.， J Leukoc Biol 2000， 68: 793-806; Hipp el: al.，In Vivo 2000，14: 571-85。 多核苷酸遞送入個體可為直接遞遂，使個體直接暴露 於多核苷酸-運送載體（p〇lynucle〇tide_carrying vector) ’或可為非直接遞送，先在體外以目的多核苷酸轉 # 形QransforiD)細胞，然後將該細胞移植入個體内。這兩種 方式分別為已知的活體内（_?/7 η fc〇與活體外（e;sr η·叩）基 因治療。 基因治療的方法一般觀點，可參考Goldspiel ei aA， Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505 ； Wu and Wu,

Biotherapy 1991, 3: 87-95 ； Tolstoshev, Ann Rev

Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96 *» Mulligan, Science 1993, 260： 926-32； Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 1 1 (5)： 39 201019953 155-215。可用於本發明之一般已知的重組DNA技術，也描 述於 Ausubel 以 a人，Current Protocols in Molecular

Biology，John Wi】ey&Sons，NY，1 993 與 Krieger，Gene

Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, l99〇 〇

投予的方法可為口服的、皮膚内的、皮下的、靜脈内 注射投予或這類方式以及全身性的投予或局部投予至目標 位置的鄰近區域。投予可為單次投予或增加為多次投予。 在適當載體中或以編碼本發明胜肽之多核苷酸轉形的細胞 中的多核苷酸的劑量可根據治療的疾病、病患的年紀、體 重、投予的方式及這類狀態而適當地調整，其一般劑量為 O.OOlmg 至 l〇〇〇mg，例如：〇 〇〇lmg 至 1〇〇〇邶或 〇 】呢 至10邶，並且可每數天至數月投予一次。熟悉此技術的 人員可適當選擇適當劑量。 X.使用該胜肽、外吐小體、APCs及CTLs的方法 本發明之胜肽與編碼該胜肽的多核苷酸可用以誘發 APCs及CTLs。本發明之外吐小體與Apc也可用以誘發ctl。 ❹ 該胜肽、多核苦酸、外吐小體與Apc可與任何其他化合物 組。使用’只要該等化合物未抑制它們的ctl誘發性。因 此’任何上述之本發明醫藥劑或組合物皆可用以誘發CTL， 而且，含有該胜肽及多核苷酸的上述醫藥劑或組合物也可 如下述用以誘發APC。 (1)誘發抗原表現細胞（APC )的方法 利用本發明之胜肽或編 本發明提供誘發APC的方法 40 201019953 碼該等胜肽之多核苷酸。APC的誘發可依循前述“νι.抗原 表現細胞”段落中所述的方法進行。本發明也提供一種誘 發具有高度CTL誘發性之APC的方法’該誘發作用也描述 於前述的“VI.抗原表現細胞”段落中。 誘發APC的方法較佳包括至少—步驟選自： a :使APCs舆本發明之胜肽接觸；及 b:將本發明之多胜肽的表現形式導入ApC中。 ❹ 此誘發APC的方法較佳在體外•汴〇)或活體外（打 以>〇)進行。當此方法在體外F/ir〇)或活體外（以 進行時，被誘發的APC可獲自經處理的個體或獲自具有與 該個體相同HLA抗原的其他物質。在較佳實施例中，以本 方法誘發的APCs表面載有HLA_A2抗原，特別是 ^Lk-kl(A*0201)= (2)誘發CTL的方法 本發明更提供誘發CTL的方法，使用本發明之胜肽、 Φ 編碼該胜肽之多核苷酸、或表現該胜肽之外吐小體或APCs。 本發明亦提供誘發CTL的方法，利用編碼可形成τ細 胞受體（TCR)次單位的多胜肽之多核苷酸，該tcr辨識（即 連接至）細胞表面上本發明胜肽與HLA抗原形成的複合 物°該誘發CTLs的方法較佳包括至少一步驟選自： a :使CD-8陽性T細胞與表面表現HLA抗原及本發明 胜肽之複合物的抗原表現細胞及/或外吐小體接觸，及 b :將編碼可形成TCR次單位之多胜肽的多核苷酸導入 CD8陽性T細胞，該TCR次單位辨識本發明胜肽與HLA抗 41 201019953 原形成的複合物。 當投予本發明之胜肽至一個體時，CTL·在個體體内被 誘發’目標腫瘤相關之内皮細胞層的免疫反應的強度被促 進。或者，該胜肽與編碼該胜肽的多核苷酸可用於活體外 (a W叩）的治療法，在此方法中，在體外（以以.疗0)以本 發明胜肽接觸（刺激）由個體衍生的Apc與CJ)8陽性細胞或 週邊血液單核白血球，誘發CTL後，將該活化CTL細胞植 回該個體。例如，該方法可包括以下步驟： a:收集個體APC， _ b:以該胜肽接觸步驟&的APC， c:將步驟b的APC與CD8+ T細胞混合，並且共同培養 以誘發CTLs，以及 d:從步驟c的共同培養物收集C])8+ τ細胞。 或者，本發明提供本發明之胜肽的使用，用於製造誘 發CTL的醫藥組合物。而且，本發明提供製造誘發ctl之 醫藥劑或組合物的方法或過程，該方法包括混合或調配本 發明之胜肽與醫藥容許載劑的步驟。而且，本發明也提供 ® 誘發CTL的本發明胜肽。 步驟d所得之具有細胞毒性的CD“ τ細胞可如疫苗投 予至個體。在步驟c中與CD8+ T細胞混合的APC也可如“ v】 抗原表現細胞’’段落所述之方法，將編碼本發明胜狀的基 因轉移入該APC，但此方法並不受限於此。任何有效表現 本發明胜肽至T細胞的APC或外吐小體皆可用於本發明之 方法中。 42 201019953 雖然相似或相等於此述之方 法及材料，可用於本發明 之實施或測試，以下描述較佳方法及材料。本說明中述及 的公開文獻、專利#、或專利申請案皆全文併入本文作為 參考。如果有矛盾情形’依本說明書（包括定義）說明。而 且此述之材料、方法及實施例僅用於說明，不意圖限制。 以下的實施例將說明本發明 並協助具有一般技術的人 員製造及使用。這些實施例並不以其他任何方式限制本發 明的範圍。

❿ 實施例 材料舆方法 cDNA微陣列分析 以cDNA微陣列分析進行基因表現的輪廓描述，如先前 文獻說明（Naka瞻a τ’ et al 〇則_ 2004;23:2385-_)。由手術樣本中獲得胰臟癌及其相鄰的 正常胰臟組織之組織樣本，所有患者均提供參與此項研究 的書面說明同意書。如第1C圖所顯示的相對表現比例，係 計算以似mRNA的表現值除以正常的表現值而得。 如第1B圖顯不的正常組織之相對表現比例，係計算以每一 正常組織之W從J//7： mRNA的表現值除以對照RNA中 似仰mRNA的表現值，對照RNA為取自第1B圖中4〇 個正常組織的RNA樣本等量混合之混合物。 小鼠 HLA-A2.1 (HHD) Tgm; mDb-’-ySZnf"雙重剔除鼠， 有導入 λ Θ 2in-HLA-A2.1 (α1，α 2)_H_2Db (α3 穿 43 201019953 細胞質；HHD)單鏈構築基因，由 Department SIDA-Retrovirus, Unite d’ Immuni te Cellulaire Antivirale, Institute Pasteur, France(Pascolo S, et al. J Exp Med 1997;185:2043-51, Firat H, et al. Eur J Immunol 1 999;29:3112-21)生產，Dr. F.A. Lemonnier 提供。此小鼠飼養於熊本大學（Kumamoto university)動物 資源中心及部門，根據熊本大學動物照顧指導手冊照料。 細胞株及HLA-表現 人胰臟癌細胞株PANC1、人大腸癌細胞株CaCo-2及 TAP-缺陷與HLA-A264抑烈·/)-陽性細胞株T2購買自Riken Cell Bank (Tsukuba，Japan)。人胰臟癌細胞株PK8由東 北大學老化及癌症、發展生醫研究機構之細胞資源中心 (Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku

University)(Sendai，Japan)提供。人肝癌細胞株 SKHepl 由久留米大學（Kurume Uni’versity)(Kurume，Japan) Dr. Kyogo Ito提供。HLA-A2的表現使用抗-HLA-A2的單株抗 體（mAb) BB7.2 (One Lambda， Inc.， Canoga Park， CA) 之流式細胞儀’以選擇HLA-A2-陽性血液捐贈者及目標細 胞株，進行細胞毒性分析。這些細胞保持於體外（y/? vi tr〇) 之添加10%FCS的RPMI 1640或DMEM培養基，在5%C〇2、 37°C下培養。 患者、血液樣本及腫瘤组織 使用捐贈者PBMCs的臨床研究由熊本大學機構評論委 201019953 員 會(Institutional Review Board of Kumamoto University, Kumamoto, Japan)證明。血液樣本及癌症與 相鄰的非癌化組織取得自熊本大學醫院例行診斷的過程中 之患者，患者皆獲得正式的書面同意書。丘液樣本也獲得 自健康的捐贈者，也取得捐贈者的書面通知的同意。所有 樣本不記名，隨意編號，儲存於-80 °C至使用時。所有患者 及健康捐贈者為日本籍。 反轉錄PCR及北方點潰分析（Northern blot analysis) ® 進行正常及癌症組織及細胞株的反轉錄PCR(RT-PCR) 分析，評估RAB6KIFL的mRNA表現程度。引子序列為 似抑///7：，順向股 5’ - CTACAAGCACCCAAGGACTCT -3’ （序 列識別號 6)，反向股 5’ - AGATGGAGAAGCGAATGTTT-3’ （序 列識別號 7) ; yS -肌動蛋白，順向股 5’ - CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’ （序列識別號 8)，反向股 5’ - TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’ （序列識別號 9)，使 φ 用的RT-PCR反應由起始的變性反應為94°C、5分鐘，經 32-35次擴增循環，黏合溫度為58°C。以冷-肌動蛋白的 mRNA為常態，作為對照。比較組織及細胞株中U mRNA的表現。 西方點潰分析（Western Blot analysis)及免疫组織檢査 (immunohistochemical examination) RAB6KIFL蛋白的西方點潰分析及免疫組織染色根據先 前文獻所述進行（Nakatsura T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2001;281:936-44. Yoshitake Y, et al. Clin 45 201019953

Cancer Res 2004 ; 10 : 643 7-48.)。人正常組織之西方點潰 分析，使用預先製備的成人正常組織點潰（Biochain， Hayward, CA)。此處使用之初級抗體為抗-RAB6£IFL多株 抗體及單株抗b-肌動蛋白抗體，分別購買自Bethyl Laboratories， Inc. (Montgomery, TX, USA)及 Sigma (Steinheim, Germany)。HLA-A2.1 (HHD) Tgm 的組織樣本 中CD4或CD8的免疫組織染色，以RAB6KIFL-A2-10-284胜 肽產生免疫，如先前文獻所述進行（Matsuyoshi H, et al. 2004:172:776-86)。 慢病毒（Lentivirus)基因轉移（gene transfer) 如先前文獻所述，進行慢病毒载體媒介的基因轉移 (Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Tahara-Hanaoka S, et al. Exp Hematol 2002; 30:11-7)。 簡單地說，將攜帶 RAB6KIFL cDNAs及 l〇#g的 pCMV-VSV-G-RSV-Rev 及 pCAG-HIVgp 的 \Ί μ g 的 CSII-CMV-RfA 及 CSIIEF-RfA 自體不活化載體（MiyoshiH， et al. J Virol 1998; 72: 8150-7)轉染（transfected) 至293T細胞’該293T細胞生長於含有Lipofeci:amine 2000 試劑（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA，USA)的 10-cm培養盤中。在60分鐘的轉染之後，恢復培養基，病 毒顆粒經離心（50，000 X g, 2 hr)形成顆粒沉澱（pe 11 et)。 將該顆粒沉澱物（pel let)懸浮於50 μ L的RPMI 1640培養 基，在平底的96孔盤上，每孔中加入lOgL的的病毒懸浮 液及5 X 1〇4的SKHepl細胞。轉染的RAB6KIFL基因表現 201019953 以西方點潰分析確認。 RAB6KIFL-反應性的小鼠CTLs的誘發及IFN- τ酵素連接的 免疫分析 使用 BIMAS 軟體程式（Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Center for information Technology, NIH，Bethesda，MD)筛選帶有編碼 HLA-A2 (A*0201 )分子 的連接結構（binding motif )之人RAB6KIFL衍生的胜肽（純 度>95%)’及合成36種胜狀（Am eri can Peptide Company, CA， USA)。以HLA-A2-限制的HIV胜肽（SLYNTYATL)(序列識別 號10)作為不相關胜肽。以胜肽使小鼠產生免疫如先前文 獻所述進行（Nakatsura T, et al.. Bioche.m Biophys Res Commun 2003 ; 306 :1 6-25)。以銓過每一胜肽衝擊或不經過 衝擊的異體BM-DC (1 X l〇V孔）刺激而使細胞產生 IFN-r· /1 X 105 CD4 -脾細胞的頻率，根據先前文獻所述 之酵素連接的免疫斑點（ELI SPOT)分析法分析（Komori H， ❹ et al. Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-97)。 RAB6KIFL-反應性的人CTLs的誘發 使用 BIMAS 軟體程式（Biolnformatics and Molecular Analysis Section, Center for information Technology, NIH，Bethesda，MD)篩選帶有編碼 HLA-A2 分子 的連接結構（binding motif)之人RAB6KIFL衍生的胜肽（純 度 >95%)’及合成 36 種胜肽（American Peptide Company，CA, USA)(表1A及表1B)。使用單核球衍生的DCs作為抗原表 現細胞，誘發CTL反應對抗被HLA表現的胜肽。DCs如先 47 201019953 前文獻所述產生於體外（iy? hfro)培養基（Yoshitake Υ， et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48, Harao M, et al. Int J Cancer 2008; in press. , Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press.)。簡旱地說，分離自正常自 願者、經 Ficoll-Plaque (GE Healthcare UK, Ltd.，

Buckinghamshire, UK)溶液對 HLA-A2 呈陽性之 PBMCs，以 \

微珠（microbeads)(Miltenyi Biotec，BergischGladbach， Germany)分類成CD8 +群及CD 14+群。為了產生DCs，將上述 CD 14+群培養於含有2%熱去活化的自體血漿的 _ AIM-V(Invitrogen)中，該培養基中存在100叫/吐粒性 細胞-巨嗟細胞群洛刺激因子（GM-CSF; PeproTec Inc , NJ USA)及 10 ng/mL· 介白素（IL)-4 (PeproTec)。培養 5 天後， 在此盤中加入OK-432，使DCs成熟。從開始培養細胞激素 產生的DCs算起7天，該培養物在37t：、有4 M g/mL的冷 2-小球蛋白（microglobulin) (Sigma-Aldrich，St. L〇uis, MO，USA)存在的AIM-V中以20 ng/mL的HLA-A2-連接胜肽❹ 衝擊2小時。這些經過胜肽衝擊的DCs之後經過輻射照射 (40 Gy)’以1:50比例與自體CD8+T細胞混合，經過抗⑶8 微珠（Miltenyi Biotec)的PMC陽性篩選而獲得。這些培 養物移至24孔盤，每孔含有i x 1〇5個經胜肽衝擊的dCs、 2 X 106 個 CD8+ T 細胞、及 5 ng/inL 的人重組 lL — 7(Wak〇

Osaka，Japan)於含有2%自體血漿之2fflL的 加入人重組IL-2 (PeproTec Inc )於這些培養物中，終農 度為2〇舰。再於第7、14天進行上述相同的過程、:以 48 201019953 載有胜肽的自體DCs再刺激兩次。最後一次刺激後的6天， 以51Cr釋放分析及IFN- 7 ELISP0T分析，調查誘發的CTLs 的抗原特異性反應。 CTL對抗癌細胞株的反應 將上述CTL與作為目標細胞（5 χ〗ό3/孔）的上述的每 一癌細胞或經胜肽衝擊的Τ2細胞在具指標性的效應物/目 標物比例下共同培養，並進行如先前文獻所述之5iCr釋放 析（Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;1 0:6437-48. Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press.)。簡單地說’目標細胞以3. 7 KBq的Na2 51Cr4 (Perkin Elmer Life Sciences)在 37〇C、C〇2 培養箱中進 行標記1小時。將標記的目標細胞潤濕3次，將該細胞與 20仁g/mL的胜肽在37°C下培養3小時，製造胜肽衝擊的目 標細胞。該目標細胞與效應細胞（effect〇r ce]_is)以终濃 度為200//L在平底微滴定盤中混合及培養。經過6小時培 φ 養之後，收集每孔中的50"L的上清液，使用迦瑪計數器 定量其放射性。特異性的細胞毒性以計算特異的5iCr釋放 比例而評估。 第Ϊ類HLA或HLA-DR的阻斷根據先前文獻所述進行 (Yoshitake Y, etal. Cl in Cancer Res 2004;10：6437-48 Imai K，et al. Clin Cancer Res 2008; in press.)。簡 單地說’在CTLs與癌細胞株在51Cr釋放分析及 IFN-γ ELISP0T分析中共同培養之前，先將該目標細胞與 10 # g/mL 的抗第 I 類 mAb、 W6/32，或與 i〇M g/mL 的 49 201019953 抗-HLA-DR mAb、Η-DR-l培養1小時，之後檢查前述mAb 的CTL細胞毒性效應或IFN-7的生成效應。 统計分析 使用兩端去除的 Student’ s t-test評估獲得自 ELIS0P分析的數據及處理群間的腫瘤體積之統計上顯著差 異。Ρ<〇· 05值被視為有顯著差異。統計分析使用商業上的 統計軟體包裝（SPSS for Windows, version 11.0, Chicago IL，USA)進行 e 結果 根據cDNA微陣列，確認尤基因在胰贜癌及多種惡 性腫瘤中向上調節 使用含有27, 648個基因的全基因組cDNA微陣列，6 個胰臟癌組織及其相鄰的正常組識的基因表現輪廓先行檢 查。經分析後，選擇6個基因。這些基因的相對表現比例 在胰臟癌組織中的表現為正常組織中的5倍（第1A圖） (Imai K， et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95)。 這些基因的表現使用cDNA微陣列分析其在29種正常組織 (包含4種胚胎組織）中的表現（第π圖）。因此， RAB6KIFL/KIF20A被庄目作為騰臟癌的新穎μα。似洲 基因在胰臟癌組織中的表現，在所有6個測試患者中顯著 增加（相對表現比例的平均值為32,〇〇〇，範圍 而且’歷⑽基因只在睪丸及胸腺中微弱 表現（第1B圖）。根據cDNA微陣列的分析，基因 的表現程度也在肺癌及膀脱癌中升高（第lc 201019953 T, et al. Oncogene 2004;23:2385-400, Kitahara 0, et al. Cancer Res 2001; 61： 3544-9, Hasegawa S, et al. Cancer Res 2002; 62: 701 2-7, Kikuchi T, et al.

Oncogene 2003; 22: 2192-205, Obama K, et al.

Hepatology 2005; 41: 1339-48)。 在正常器官、癌細胞株、及胰臟癌組織中mRNA 及蛋白質的表現 以RT-PCR分析基因在正常組織中的mRNA 程度的表現。正常組織中的W的半定量RT-PCR分 析顯示，^洲只在睪丸中表現（第2A圖）。使用RT-PCR 分析顯示，^万基因的表現在幾乎所有胰臟癌細胞株 及其他HLA-A2陽性癌細胞株中被偵測到（第2B圖）。

之後，篡因在胰臟癌組織及其相鄰的正常組 織中的表現使用RT-PCR分析，該組織係取自手術性切除。 以及以7/7；基因的表現在8件胰臟癌組織中有5件被债測 ❹到，在正常組織中幾乎未偵測到^的表現（第2C 圖）。而且’见4万的表現在皮膚及腹膜的轉移病兆中 偵測到》 RAB6KIFL蛋白在癌化組織及數種正常組織中的表現也 經由西方點潰檢查（第3A、3B圖）。RAB6KIFL蛋白在8種 正常組織中未被偵測到，在睪丸中形成非常微弱的帶 (band) ’與PANC1細胞的胞溶物中觀察到的帶有類似的移 動（第3A圖）。另一方面，RAB6KIFL蛋白在兩位檢查的患 者的胰臟癌組織中被偵測到，但是在相鄰的正常組織中未 51 201019953 被偵測出來（第3B圖）。 為了確認RAB6KIFL蛋白的腫瘤相關的過度表現i許多 以石蠟包埋的胰臟癌組織樣本之後以免疫組織染色分析法 檢查。強染色的RAB6KIFL主要觀察到在胰臟癌的癌細胞的 細胞質中，而非常弱的染色在其正常相鄰的胰臟組織的腺 泡細胞（aci ner ce 11 s )及正常管壁上皮細胞中觀察到（第 4A圖）。而且，相似的強染色在腹膜的轉移病兆中觀察到（第 4A圖）。沒有染色出現在腫瘤形成的膜臟炎（tumor-forming pancreat i t i s )的組織樣本中（第4A圖）。RAB6KIFL未在正 常的腦、肺、肝、腎、胃、小腸、大腸、脾、骨骼肌、皮 膚、胸腺及睪丸中染色（第4B圖）。 衍生自RAB6KIFL的HLA-A2 64抑連接胜肽的預測 表1A及表1B顯示RAB6KIFL蛋白的HLA-A2 64卹之以） 連接胜肽，以預期的高結合親合力的分數排列。總共選擇 36個具有潛力的HLA-A2連接活性的胜肽。 表1A衍生自RAB6KIFL的HLA-A264屻連接的九胜肽 設計 起始位置 序列 分數 序列識別號 204 LLSNEVIWL 459 RAB6KIFL-A2-9-12 12 LLSDDDVVV 199 序列識別號3 715 KMLEPPPSA 191 750 KLGESLQSA 164 300 SIWISFFEI 131 38 NLLSDCSVV 106 688 QLQEVKAKL 88 695 KLQQCKAEL 75 RAB6KIFL-A2-9-809 809 CIAEQYHTV 59 序列識別號4 11 GLLSDDDVV 52 201019953 436 TLGRCIAAL 49 179 ILPRSLALI 41 183 SLALIFNSL 41 625 KLNILKESL 37 781 ILIKQDQTL 36 231 GLQEEELST 31 494 TLHVAKFSA 29 556 SMYGKEELL 24 788 TLAELQNNM 20 209 VIWLDSKQI 20 起始位置表示由RAB6KIFL的N端胺基酸編號。連接分數來 ® 自如材料與方法中所示。 表1B衍生自RAB6KIFL的HLA-A2 64抑別/)連接的十胜肽 設計 起始位置 序列 分數 序列識別號 654 LLQEARQQSV 485 788 TLAELQNNMV 285 742 RLLRTELQKL 182 39 LLSDCSVVST 119 11 GLLSDDDVVV 106 400 KISELSLCDL 97 573 LLLKERQEKL 66 97 VLQAPKDSFA 46 RAB6KIFL-A2-10-284 284 AQPDTAPLPY 29 序列識別號5 132 GQASFFNLTV 27 625 KLNILKESLT 26 382 SIFSIRILHL 25 203 PLLSNEYIWL 22 455 NLVPFRDSKL 21 506 QLVHAPPMQL 21 98 LQAPKDSFAL 21 66 KVYLRVRPLL 21 53 201019953 起始位置表不由RAB6KIFL的N端之胺基酸編號。連接分數 來自如材料與方法中所示。 使用HLA-A2.1(MD)轉瘦基因良確篇]衍生的及 HLA-A2-限制的鼠CTL抗原決定位 為了確認RAB6KIFL衍生的及HLA-A2-限制的CTL抗原 決定位，選擇36個不同的候選胜肽。每一胜肽由g或1〇 個胺基酸組成，對HLA-A2 6^以^7)具有高度預測的連接分 數’根據NIH BIMAS提供的IILA胜肽連接的預測演算法（表 ® 1A及表IB)，為全世界最常見的奶對偶 基因產物。為了確認哪一胜肽可誘發胜肽反應性的CTLs， 以選自該36個胜肽中的3種胜肽的混合物的12組衝擊 BM-DCs，將該 BM-DCs 腹腔内投予使 HLA-A2. l(HHD)Tgm 產 生免疫兩次，從其中分離出CD4-脾細胞，該CD4-脾細胞再 以每一胜肽衝擊的BM-DCs刺激。結果顯示該CD4—脾細胞， 以 RAB6KIFL-A2_9-12 、 RAB6KIFL-A2-9-809 及 @ RAB6KIFL-A2-10_284胜肽刺激者，在ELIS0PT分析中以胜 肽特異性狀態產生顯著量的IFN- r (第5A圖）。以 RAB6KIFL-A2-9-12胜肽衝擊的BM-DCs的反應中，這些CD4-脾細胞（2 X 104)顯示149.0±22.2斑點計數/孔，但是在未 經胜肽衝擊的BM-DCs存在下，顯示32.6±9.9斑點計數/ 孔（P<0. 01)。類似地，以RAB6KIFL-A2-9-809胜肽衝擊的 BM-DCs刺激之CD4 —脾細胞顯示117. 2±23. 4斑點計數/孔， 但是在未經胜肽衝擊的BM-DCs存在下，顯示51·4±7.8斑 54 201019953 點計數 / 孔（P<0. 01)。而且，以 RAB6KIFL-A2-10-284 胜肽 衝擊的BM-DCs刺激之CD4_脾細胞顯示141. 2±5.5斑點計數 /孔，但是在未經胜肽衝擊的BM-DCs存在下，顯示19.2±5.2 斑點計數/孔（P<0. 01)。以其他胜肽刺激中沒有觀察到顯著 的胜肽特異性反應。此結果推測RAB6KIFI^-A2-9-12、 RAB6KIFL-A2-9-809 及 RAB6KIFL-A2-10-284 胜肽可為 HLA-A2.1(HHD)Tgm中HLA-A2-限制的CTL抗原決定位胜 Φ 肽，且這些胜肽預期為人CTLs的抗原決定位》 在 HLA-A2· l(HHD)Tgm 中沒有由 RAB6IHFL-A2-9-809 抗屌決 定位胜肽的免疫反應11發的J Μ免疫現象 調查以RAB6KIFL胜肽的免疫反應是否誘導自體免疫 反應非常重要。我們因此進行在以RAB6KIFL-A2-9-809胜 肽接種兩次後，HLA-A2. l(HHD)Tgm中抗CD4及抗CD8的mAb 的數種重要器官的免疫組織分析，其中RAB6KIFL-A2-9-809 胜肽的胺基酸序列為人及小鼠的RAB6KIFL之完全保留性 參 （compl etely conserved)。因此，沒有推測發生自體免疫 的致病性改變，例如淋巴球的浸潤或組織損壞（第5B圖）。 通常在遭受自體免疫疾病的中觀察到的異常，例如頭髮及 皮膚的異常、下痢及體重減輕，也未在這些小鼠中觀察到。 這些結果指出，以RAB6KIFL-A2-9-809胜肽刺激的淋巴球 未攻擊正常組織，至少在HLA-A2 Tgm中是如此。 來自 HLA-A2 6^似醑性健康捐贈者的 PBMCs之 1^861：1?1-反應性CTL的杨發性 RAB6KIFL-特異性 CTL 的產生可能來自以 55 201019953 RAB6KIFL-A2-9-12 (序列識 別 號 3) 、 RAB6KIFL-A2-9-809C 序 列 識 別 號 4)及 RAB6KIFL-A2-10-284C序列識別號 5)姓肽刺激對 HLA-A2以抑陽性的健康捐贈者的PBMCs。PBMCs分離自 HLA-A2 64屻別/)陽性的健康捐贈者，由該-PBMCs分離出的 CD8+T細胞與經過每個胜肽衝擊的自體單核球衍生的DCs — 起培養。經過3次刺激後，對抗該胜肽衝擊的T2細胞之細 胞毒性以51Cr釋放分析法（第6A圖）及IFN-r ELISP0T分析 (數據未顯示）檢查。由兩名健康捐贈者的PBMCs誘發的 CTLs，對 RAB6KIFL-A2-9-12 (序列識別號 3)、 RAB6KIFL-A2-9-809C 序 列 識 別 號 4)或 RAB6KIFL-A2-10-284(序列識別號5)胜肽衝擊的T2細胞顯 示細胞毒性，但是對於以無關的HLA-A2-限制的HIV胜肽 衝擊的T2細胞、或未加入胜肽者，未顯示細胞毒性。類似 的反應在其他捐贈者中觀察到（數據未顯示）。這些結果指 出這些CTLs具有胜肽特異的細胞毒性。 隨後調查這些CTLs是否可殺死表現RAB6KIFL及 HLA-A2 (A*0201 )的人癌細胞株。如第6B圖所示，以 RAB6KIFL-A2-9-12 (左圖）、RAB6KIFL-A2-9-809 (中圖） 及RAB6KIFL-A2-1 0-284 (右圖）胜肽刺激的RAB6KIFL-反應 性 CTLs 顯示對 PANC1(RAB6KIFL+，HLA-A2 + )、CaCo-2 (RAB6IHFL+，HLA-A2 + )的細胞毒性，但是未對健康捐贈者中 的 PK8 (RAB6KIFL+，HLA-A2 —)產生細胞毒性。 而且，以RAB6KIFL基因轉染的SKHepl (RAB6KIFL低， 201019953

HLA_A2 + )細胞（第 2B 圖），稱為 SKHepl/RAB6KIFL(RAB6KIFL * , HLA-A2 + )，作為目標細胞，以確認這些胜肽在癌細胞中 自然地從RAB6KIFL蛋白進行修飾。如第6C圖所示，以 RAB6KIFL-A2-9~12(左圖）、RAB6ίΠFL-A2-9-809 (中圖） 及RAB6KIFL-A2-10-284 (右圖）胜肽刺激而誘發的CTLs， 展現對抗SKHepl/RAB6KIFL的細胞毒性，但是不對抗 SKHepl/Mock。此結果推測這些胜肽可自然地進行修飾，且 表現在癌細胞表面的HLA-A2分子上。 為了喊認誘發的CTLs以第I類HLA限制形式辨識目標 細胞’使用對抗第I類HLACW6/32)的mAb進行第丨類HU 阻斷分析’以阻斷CTLs對癌細胞的辨識（第6D圖）。因此， 在以RAB6KIFL-A2-9-12(左圖）、RAB6KIFL-A2-9-809 (中 圖）及RAB6KIFL-A2-10-284 (右圖）胜肽刺激而產生CTLs 的ELISP〇T分析中，該抗第I類HLA的抗體可顯著地抑制 經PANC1細胞刺激的I FN_ r生成，具有統計學上顯著性（第 _ 6D圖，P<〇. 01)。此結果清楚指出這些誘發的CTLs以第夏 類HLA限制形式辨識表現RAB6KIFL的目標細胞。 討論 根據此述實施例，顯示rAB6KIFL為一種taa，為胰臟 癌的抗癌免疫療法中有前景的標的物。為了建立抗癌免疫 療法’確認TAA在腫瘤細胞中高度表現但不在正常細胞中 高度表現是重要的。CDNA微陣列分析顯示似万從//7： mRNA 在胰臟癌細胞株中過度表現（Imai K，Hirata s，Irie A， Senju S, IkutaY, Yokomine K, Harao M, Inoue M, Tsunoda 57 201019953 T, Nakatsuru S, Nakagawa H, Nakamura Y, et al Clin Cancer Res 2008 ; 14·· 6487-95) ’但在對應的正常組織及 許多正常成人組織中幾乎未表現，除了在睪丸及胸腺（第 1B圖）中。而且，似万αν凡基因也在肺癌及膀胱癌及胰臟 癌中過度表現（第1C圖）。在RT-PCR分析中證實似從 mRNA通常在數種癌細胞株及胰臟癌組織中表現，但是不在 成人正常組織（包括骨髓）中表現，除了睪丸以外（第2 圖）。類似地，西方點潰分析及免疫組織分析顯示RAB6KIFl 蛋白在胰臟癌細胞中被偵測到，但是未在其正常組織及正 參 常的成人組織（包括胸腺）中表現，除睪丸以外（第3、4 圖）°這些觀察支持RAB6KIFL之一特徵為，在蛋白質的層 級作為癌症的類睪丸（testis-like) TAA。 為了確認TAA為抗癌免疫療法的有效標的，另一關鍵 點為選擇抗原’該抗原為癌細胞增殖、侵入、轉移及存活 時所必須的。最近’ Taniuchi K等人報導rAB6kifl與騰 臟致癌作用有關（Taniuchi K，et al. Ceneei· Res 2005; q 65:1 05-1 2)，且先前已描述rAB6KIFL在膜移動（Echard A， et al. Science 1998;279:580-5)及質胞分裂（Fontijn RD， et al. Mol Cell Biol 2001;21:2944-55, Hill E, Clarke M, Barr FA. EMBO J 2000; 19:5711-9)中的角色。這些顯 示内源性RAB6KIFL因小干擾RNA在胰臟癌細胞中的向下調 節’經由與RAB6KIFL的運輸蛋白之圓盤狀的大同源5(disc， large homologue 5; DLG5)作用，導致癌細胞成長的急遽 減少（Taniuchi K，et al. Cancer Res 2005; 65:1 05-12)， 58 201019953 推測RAB6KIFL因此在胰臟致癌作用中扮演重要角色，且因 此有潛力作為抗癌免疫療法的標的。 RAB6KIFL作為免疫療法標的的潛力，在此經破認 HLA-A2-限制的抗原決定位胜肽及評估其致免疫性而證 實。該實驗使用HLA-A2(HHD)Tgm確認三種HLA-A2-限制的 RAB6KIFL抗原決定位胜肽，該胜肽可刺激HLA-A2-限制的 小鼠CTLs的產生，藉由以 BIMAS演算預期具有 HLA-A2 64抑結合親和力的36個候選胜肽接種，沒有造 成自體免疫現象，例如淋巴球浸潤或組織損壞（第5圖）。 而且，RAB6KIFL-反應性CTLs可產生自三個獨立健康捐贈 者中以該三種胜肽刺激的PBMCs (第6圖）。這些CTLs不只 殺死以其相關的胜肽衝擊的T2細胞，也殺死表現RAB6KIFL 及HLA-A2的癌細胞株。對這些胜肽的CTLs抗原特異性， 由這些CTLs顯示對以人RAB6KIFL基因轉染的SKHepl細胞 的細胞毒性、但不對mock轉染的SKHepl產生細胞毒性之 φ 發現而確認。這些數據推測，這些 RAB6KIFL胜肽 (RAB6KIFL-A2-9-12 、 RAB6KIFL-A2-9-809 、 及 RAB6KIFL-A2-1 0-284)在癌細胞中自然從RAB6KIFL蛋白質 中進行修飾，與HLA-A2分子一起表現於細胞表面，被CTLs 辨識。而且，RAB6KIFL-A2-9-809胜肽可能為癌細胞中從 RAB6KIFL 蛋白質中較有效進行修飾者（相較於 RAB6KIFL-A2-9-12 及 RAB6KIFL-A2-1 0-284 胜肽），因為 RAB6KIFL-A2-9-809胜肽誘發的CTLs顯示較強的細胞毒性 對抗表現RAB6KIFL及 HLA-A2的癌細胞，相較於由 59 201019953 MB6KIFL-A2-9-12 或 RAB6KIFL-A2-1 0-284 胜肽刺激誘發 的CTLs媒介的細胞毒性。 HLA-A2. 1 (HHD)Tgm缺少表現内源性小鼠H-2b-編碼的 第I類分子，用於確認RAB6KIFL的HLA-A2-限制的CTL抗 原決定位胜肽。已有報導HLA-A2. 1 (HHD)Tgm為多方面的動 物模式’作為胜肽為主的免疫療法之前的臨床性評估（Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12:2689-97, Harao M, et al. Int J Cancer 2008; 123: 2616-25, Pascolo S, etal. ® J Exp Med 1997; 185: 2043-51, Firat H, et al. Eur J Immunol 1999; 29: 3112-21)。 為避免因TAAs接種引發的副作用，選擇RAB6KIFL作 為標的，其在成人正常組織中幾乎不表現。然而，非常重 要的是’確認RAB6KIFL的接種是否可引發自體免疫疾病， 不論是在抗癌免疫療法期間或之後。此處，該三個抗原決 定位胜肽中的兩個之胺基酸序列，在人及小鼠之間並未存 ❹ 在保留性（RAB6KIFL-A2-9-12，人：LLSDDDVVV(序列識別號 3) ’小鼠：LLSDEDVVD(序列識別號 u); RAB6KIFL-A2-10-284，人：AQPDTAPLPV(序列識別號 5)， 小鼠：AQPDTVPVSV)(序列識別號12)。因此，在以 RAB6KIFL-A2-9-809胜肽兩次接種之後，調查HLA-A2. lTgm 中的自體免疫現象’ RAB6KIFL_A2_9-809胜狀的胺基酸序 列在人及小鼠中有高度的保留性。使用HLA-A2. lTgm的好 處之一是其自體免疫現象可在活體内（//7 調查。當 60 201019953 然’因為在此調查的正常組織數量有限，可能不能排除在 某些此處未調查的正常組織中RAB6KIFL的可能表現。因 此’當利用RAB6KIFL胜肽作為癌症免疫療法時，關於自體 免疫疾病的誘發必須要非常小心。 總結來說，目前的結果推測RAB6KIFL為包含可引發 CTLs對表現RAB6KIFL及HLA-A2兩者之癌細胞反應的抗原 決定位胜肽之TAA。由於RAB6KIFL在大範圍的人類惡性腫 瘤中高度表現，RAB6KIFL因此為治療大範圍惡性腫瘤（特 別是胰臟癌）的胜肽基礎之免疫療法所期望的標的。因此， 對於RAB6KIFL-特異性CTLs在胰臟癌患者中的誘發的進一 步調查，仍然為臨床應用上的重要議題。 產業上利用性 本發明描述新穎的TAAs，特別是衍生自RAB6KIFL的 TAAs，RAB6KIFL誘發有效及特異的抗腫瘤免疫反應，可應 用於大範圍的癌症類型。此述TAAs成為進一步發展為對抗 粵 RAB6KIFL相關疾病的胜肽疫苗之依據，例如膀脱癌、子宮 頸癌、惡性膽管細胞癌（cholangiocellular carcinoma)、 食道癌、胃癌、非小細胞肺癌（NSCLC)、骨肉瘤 (oseosarcoma)、胰臟癌、腎細胞癌（renal carcinoma)及 軟組織瘤（soft tissue tumor)。 雖然本發明在此詳細陳述及引用參考文獻以具體化本 發明實施例，但應了解前述說明本質上為例示及解釋，意 圖說明本發明及較佳實施例。經由慣例實驗，此技術領域 中具有通常知識者將可容易了解在不背離本發明精神及範 61 201019953 =對此述内谷有各種變化及改良，本發明之界限及範圍 自當以後附之申請專利範圍為準。 【圖式簡單說明】 ^發明之各方面及應用，根據圖式之簡單說明及本發 月之詳細說明，將使熟知該技術領域之人士清楚了解，其 較佳實施態樣如下： 第1圖顯不cDM微陣列分析中胰臟癌的心及mRNA 的顯著及頻繁地升高表現。第u圖顯示姨臟癌細胞中向上 調節的基因。相較於正常者，這些基因在腫瘤細胞中過度❿ 表現。胰臟癌細胞中^方祕“的表現在所有的6位 姨臟癌患者中顯著增加。帛1B圖顯示cDNA微陣列分析中 正常組織的基因的相對表現率^ ^万從//7;基因只 有在睪丸及胸腺中微弱表現，第lc圖顯示如前述⑸^微 陣列分析中^方5J//X基因的表現程度亦在許多肺癌及膀胱 癌及胰臟癌中升高。 第2圖顯示在人正常組織、癌細胞株、癌組織中❹

表現的分析。第2A圖顯示以RT—pCR分析調 查WmRNA在不同正常組織中的表現bmRNA 只有在睪丸中微弱表現。第2B圖顯示似仰#/凡mRNA在不 同癌細胞株中的表現之RT-PCR分析。第2C圖顯示心方沒//// 鉉NA在胰臟癌組織（T)及其正常組織（N)中的表現之RT_pcR 分析。7/Z基因的表現在8件胰臟癌組織中有5件被 偵測到。相反地’對應的正常組織中幾乎未偵測到該表現。 第3圖顯示西方點潰分析（Westernbl〇ttinganalysis) 62 201019953 偵測之RAB6KIFL蛋白的胰臟癌特異性過度表現。第3A圖 顯示RAB6KIFL·蛋白未在8件正常組織中被偵測到，但是在 睪丸組織中出現微弱的帶（band)，與在PANC1細胞胞溶物 中觀察到帶具有相似的移動。第3B圖顯示在兩位胰臟癌患 者中，RAB6KIFL蛋白在癌組織（τ)中被偵測到，但是未在相 鄰的正常組織（N)中被偵測到。也進行抗冷_肌動蛋白 (actin)點潰法，監測等量加入的蛋白。 φ 第4圖顯示RAB6KIFL蛋白在胰臟癌（A)及多種正常組 織（B)中的免疫組織分析。第4A圖顯示RAB6KIFL的強染色 主要出現癌細胞的細胞質及核，在9件癌細胞中有6件， 但疋在相鄰的正常胰臟組織之腺泡細胞（acjner ceiis)及 正常管壁上皮細胞中觀察到非常微弱的染色。類似的強染 色在腹膜的轉移病兆中觀察到。在腫瘤形成的胰臟炎 (•tumor-forming pancreatitis)中幾乎未觀察到染色。第 4B圖顯示RAB6KIFL未在正常的腦、肺、肝、腎、胃、小腸、 Φ 大腸、脾、骨骼肌、皮膺及胸腺中染色。可能的微弱染色 在睪丸中觀察到。陽性的染色訊號以棕色顯示。比例尺以 100 # m顯示。

第5圖顯示使用HLA-A2. 1 (HHD)Tgm確認人RAB6KIFL 的HLA-A2-限制鼠的CTL抗原決定位。第5A圖顯示以選自 36個候選胜肽的3種胜肽混合的12組衝擊的5 X 1〇5異體 BM-DCs ’使HLA-A2.1(HHD)Tgm在第7天及第14天活體内 產生免疫。在第21天由產生免疫的老鼠分離出CD4-脾細 胞’以經過每個胜肽衝擊的BM-DCs刺激6天。使用EL I SPOT 63 201019953 分析偵測產生CTL的IFN-7。RAB6KIFL-A2-9-12 (序列識 別號 3) 、RAB6KIFL-A2-9-809C序列識別號 4)及 RAB6KIFL-A2-10-284(序列識別號5)胜肽顯示誘發胜肽反 應性CTLs。這些分析分別進行兩次，產生相似結果。第5B 圖顯示以 RAB6KIFL-A2-9-809 胜肽產生免疫的 HLA-A2(HHD)Tgm組織樣本中抗CD4或抗CD8mAb的免疫組織 染色。在兩次接種之後，切除及分析這些樣本。 第6圖顯示來自HLA-A2-陽性健康捐贈者PBMCs的 RAB6KIFL-特異性人CTL的誘發性。第6A圖顯示由HLA-A2- w 陽性健康捐贈者的PBMCs產生RAB6KIFL胜肽-反應性CTL。 在以 RAB6KIFL-A2-9-12 、 RAB6KIFL-A2-9-809 及 RAB6KIFL-A2-10-284衝擊的自體單核球衍生之DCs三次刺 激後，以標準51Cr釋放分析法偵測對抗T2細胞（HLA-A2+，

缺少TAP)、每一胜肽衝擊的T2細胞、或未經過胜肽衝擊的 T2 細胞之 CTLs 細胞毒性。這些 CTLs 對於以 RAB6KIFL-A2-9-12 (左圖）、RAB6KIFL-A2-9-809 (中圖）及 ❹ RAB6KIFL-A2-10-284 (右圖）胜肽衝擊的T2細胞顯現細胞 毒性，但是對以無關的HI V胜肽衝擊及未經過胜肽衝擊的 T2細胞未產生細胞毒性。第6B圖顯示這些CTLs對於 RAB6KIFL+ HLA-A2 (A*0201 ) +人胰臟癌細胞株 PANC1 及大 腸癌細胞株CaCo-2產生細胞毒性，但是對RAB6KIFL+ HLA-A2 (A*020 1 )'人胰臟癌細胞株PK8。第6C圖顯示這些CTLs的 細胞毒性為 RAB6KIFL 特異性。這些 CTLs 殺死 SKHepl/RAB6KIFL ， SKHepl/RAB6KIFL 為 RAB6KIFL 64 201019953 HLA-A2+的人肝癌細胞株SKHepl經人RAB6KIFL基因轉染戶斤 形成’但是這些CTLs不殺死SKHepl/Mock。第6D圖顯示以 抗HLA-第I類mAb對細胞毒性的抑制。在目標細胞pANC1 分別以抗 HLA-第 I 類 mAb(W6/32，IgG2a)或抗 HLA-DR mAb (H-DR-1，IgG2e)培養 1 小時，加入來自以 RAB6KIFL_A2_9_12 (上圖）、RAB6KIFL-A2-9-809 (中圖）及 RAB6KIFL-A2-10-284 (下圖）胜版刺激健康捐贈者的pBMCs所產生的CTLs。IM_ r ❹的產生明顯由W6/32所抑制，但是未因工所抑制。 【主要元件符號說明】 無 65 201019953

SEQUENCE LISTING <110〉腫瘤療法科學股份有限公司(ONOOTHERAPY SCIENCE, INC·) <120〉RAB6KIFL/KIF20A抗原決定位胜肽及含此胜肽的疫苗

<130> ONC-A0824-TW <150> US61/197.106 <151> 2008-10-22 <160> 12 <170〉Patent In version 3.5 <210> 1 © <211> 3471

<212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221〉 CDS <222〉 （497)..(3169) <400> 1 tttttcccct taagacaaag caagcaccct aaaccagtta ccctgtgcac tcctgttaag 60 attgttgcta aggaaggaca ggagttggct gctgaagcct caagatttcc tttaggctct 120 ❹ taggtaagaa atgtctaagg ttcaaggaaa aaggttaagt tggaagaatc ccaggcaaaa 180 taagtgcgaa tccacgacag ttggtaaccc ggacccacat tagaactcag aggtcaagca 240 gaagcgaacg actggaattc cagtcaggcc cgcccccttt ccttacgcgg attggtagct 300 gcaggcttcc ctatctgatt ggccgaacga acgcagcgcg taatttaaaa tattgtatct 360 gtaacaaagc tgcacctcgt gggcggagtt gtgctctgcg gctgcgaaag tccagcttcg 420 gcgactaggt gtgagtaagc cagtatccca ggaggagcaa gtggcacgtc ttcggaccta 480 ggctgcccct gccgtc atg teg caa ggg ate ett tet ccg cca geg ggc ttg 532

Met Ser Gin Gly lie Leu Ser Pro Pro Ala Gly Leu l 580201019953 ίο ctg tcc gat gac gat gtc gta gtt tct ccc atg ttt gag tcc aca get Leu Ser Asp Asp Asp Val Val Val Ser Pro Met Phe Glu Ser Thr Ala 15 20 25 gca gat ttg ggg tct gtg gta ege aag aac ctg eta tea gac tgc tct Ala Asp Leu Gly Ser Val Val Arg Lys Asn Leu Leu Ser Asp Cys Ser 30 35 40 gtc gtc tct acc tcc eta gag gac aag cag cag gtt cca tct gag gac Val Val Ser Thr Ser Leu Glu Asp Lys Gin Gin Val Pro Ser Glu Asp 45 50 55 60 628 676

agt atg gag aag gtg aaa gta tac ttg agg gtt agg ccc ttg tta cct Ser Met Glu Lys Val Lys Val Tyr Leu Arg Val Arg Pro Leu Leu Pro 65 70 75 724 tea gag ttg gaa ega cag gaa gat cag ggt tgt gtc cgt att gag aat Ser Glu Leu Glu Arg Gin Glu Asp Gin Gly Cys Val Arg lie Glu Asn 80 85 90 gtg gag acc ett gtt eta caa gca ccc aag gac tct ttt gcc ctg aag Val Glu Thr Leu Val Leu Gin Ala Pro Lys Asp Ser Phe Ala Leu Lys 95 100 105 772 820 age aat gaa egg gga att ggc caa gcc aca cac agg ttc acc ttt tcc Ser Asn Glu Arg Gly lie Gly Gin Ala Thr His Arg Phe Thr Phe Ser φ 110 115 120 cag ate ttt ggg cca gaa gtg gga cag gca tcc ttc ttc aac eta act Gin lie Phe Gly Pro Glu Val Gly Gin Ala Ser Phe Phe Asn Leu Thr 125 130 135 140 868 916 gtg aag gag atg gta aag gat gta etc aaa ggg cag aac tgg etc ate Val Lys Glu Met Val Lys Asp Val Leu Lys Gly Gin Asn Trp Leu lie 145 150 155 tat aca tat gga gtc act aac tea ggg aaa acc cac aeg att caa ggt Tyr Thr Tyr Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys Thr His Thr He Gin Gly 160 165 170 acc ate aag gat gga ggg att etc ccc egg tcc ctg geg ctg ate ttc Thr lie Lys Asp Gly Gly He Leu Pro Arg Ser Leu Ala Leu lie Phe 964 1012 2 1060 201019953 175 180 185 aat age etc caa ggc caa ett cat cca aca cct gat ctg aag ccc tt£ 1108

Asn Ser Leu Gin Gly Gin Leu His Pro Thr Pro Asp Leu Lys Pro Leu 190 195 200 etc tee aat gag gta ate tgg eta gac age aag cag ate ega cag gag 1156

Leu Ser Asn Glu Val lie Trp Leu Asp Ser Lys Gin lie Arg Gin Glu 205 210 215 220 gaa atg aag aag ctg tee ctg eta aat gga ggc etc caa gag gag gag 1204

Glu Met Lys Lys Leu Ser Leu Leu Asn Gly Gly Leu Gin Glu Glu Glu 225 230 235 ctg tee act tee ttg aag agg agt gtc tac ate gaa agt egg ata ggt 1252

Leu Ser Thr Ser Leu Lys Arg Ser Val Tyr lie Glu Ser Arg lie Gly 240 245 250 acc age acc age ttc gac agt ggc att get ggg etc tet tet ate agt 1300

Thr Ser Thr Ser Phe Asp Ser Gly lie Ala Gly Leu Ser Ser lie Ser 255 260 265 cag tgt acc age agt age cag ctg gat gaa aca agt cat ega tgg gca 1348

Gin Cys Thr Ser Ser Ser Gin Leu Asp Glu Thr Ser His Arg Trp Ala 270 275 280 cag cca gac act gee cca eta cct gtc ccg gca aac att ege ttc tee 1396

Gin Pro Asp Thr Ala Pro Leu Pro Val Pro Ala Asn He Arg Phe Ser 285 290 295 300 ate tgg ate tea ttc ttt gag ate tac aac gaa ctg ett tat gac eta 1444 lie Trp lie Ser Phe Phe Glu lie Tyr Asn Glu Leu Leu Tyr Asp Leu 305 310 315 tta gaa ccg cct age caa cag ege aag agg cag act ttg egg eta tgc 1492

Leu Glu Pro Pro Ser Gin Gin Arg Lys Arg Gin Thr Leu Arg Leu Cys 320 325 330 gag gat caa aat ggc aat ccc tat gtg aaa gat etc aac tgg att cat 1540

Glu Asp Gin Asn Gly Asn Pro Tyr Val Lys Asp Leu Asn Trp lie His 335 340 345 201019953

gtg caa gat get gag gag gee tgg aag etc eta aaa gtg ggt cgt aag Val Gin Asp Ala Glu Glu Ala Trp Lys Leu Leu Lys Val Gly Arg Lys 350 355 360 aac cag age ttt gee age acc cac etc aac cag aac tee age ege agt Asn Gin Ser Phe Ala Ser Thr His Leu Asn Gin Asn Ser Ser Arg Ser 365 370 375 380 cac age ate ttc tea ate agg ate eta cac ett cag ggg gaa gga gat His Ser lie Phe Ser lie Arg lie Leu His Leu Gin Gly Glu Gly Asp 385 390 395 ata gtc ccc aag ate age gag ctg tea etc tgt gat ctg get ggc tea lie Val Pro Lys lie Ser Glu Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser 400 405 410 gag ege tgc aaa gat cag aag agt ggt gaa egg ttg aag gaa gca gga Glu Arg Cys Lys Asp Gin Lys Ser Gly Glu Arg Leu Lys Glu Ala Gly 415 420 425 aac att aac acc tet eta cac acc ctg ggc ege tgt att get gee ett Asn lie Asn Thr Ser Leu His Thr Leu Gly Arg Cys lie Ala Ala Leu 430 435 440 cgt caa aac cag cag aac egg tea aag cag aac ctg gtt ccc ttc.cgt Arg Gin Asn Gin Gin Asn Arg Ser Lys Gin Asn Leu Val Pro Phe Arg 445 450 455 460 gac age aag ttg act ega gtg ttc caa ggt ttc ttc aca ggc ega ggc Asp Ser Lys Leu Thr Arg Val Phe Gin Gly Phe Phe Thr Gly Arg Gly 465 470 475 cgt tee tgc atg att gtc aat gtg aat ccc tgt gca tet acc tat gat Arg Ser Cys Met lie Yal Asn Val Asn Pro Cys Ala Ser Thr Tyr Asp 480 485 490 gaa act ett cat gtg gee aag ttc tea gee att get age cag ett gtg Glu Thr Leu His Val Ala Lys Phe Ser Ala lie Ala Ser Gin Leu Val 495 500 505 cat gee cca cct atg caa ctg gga ttc cca tee ctg cac teg ttc ate His Ala Pro Pro Met Gin Leu Gly Phe Pro Ser Leu His Ser Phe He 510 515 520 1588 1636 1684 1732 1780 1828 1876 1924 1972 2020 2068 4 201019953 aag gaa cat agt ctt cag gta tcc ccc age tta gag aaa ggg get aag 2116

Lys Glu His Ser Leu Gin Val Ser Pro Ser Leu Glu Lys Gly Ala Lys 525 530 535 540 gca gac aca ggc ctt gat gat gat att gaa aat gaa get gac ate tec 2164

Ala Asp Thr Gly Leu Asp Asp Asp lie Glu Asn Glu Ala Asp lie Ser 545 550 555 atg tat ggc aaa gag gag etc eta caa gti gtg gaa gee atg aag aca 2212

Met Tyr Gly Lys Glu Glu Leu Leu Gin Val Val Glu Ala Met Lys Thr 560 565 570 ctg ctt ttg aag gaa ega cag gaa aag eta cag ctg gag atg cat etc 2260

Leu Leu Leu Lys Glu Arg Gin Glu Lys Leu Gin Leu Glu Met His Leu 575 580 585 ega gat gaa att tgc aat gag atg gta gaa cag atg caa cag egg gaa 2308

Arg Asp Glu lie Cys Asn Glu Met Val Glu Gin Met Gin Gin Arg Glu 590 595 600 cag tgg tgc agt gaa cat ttg gac acc caa aag gaa eta ttg gag gaa 2356

Gin Trp Cys Ser Glu His Leu Asp Thr Gin Lys Glu Leu Leu Glu Glu 605 610 615 620 atg tat gaa gaa aaa eta aat ate etc aag gag tea ctg aca agt ttt 2404

Met Tyr Glu Glu Lys Leu Asn He Leu Lys Glu Ser Leu Thr Ser Phe 625 630 635 tac caa gaa gag att cag gag egg gat gaa aag att gaa gag eta gaa 2452

Tyr Gin Glu Glu lie Gin Glu Arg Asp Glu Lys lie Glu Glu Leu Glu 640 645 650 get etc ttg cag gaa gee aga caa cag tea gtg gee cat cag caa tea 2500

Ala Leu Leu Gin Glu Ala Arg Gin Gin Ser Val Ala His Gin Gin Ser 655 660 665 ggg tet gaa ttg gee eta egg egg tea caa agg ttg gca get tet gee 2548

Gly Ser Glu Leu Ala Leu Arg Arg Ser Gin Arg Leu Ala Ala Ser Ala 670 675 680 tec acc cag cag ctt cag gag gtt aaa get aaa tta cag cag tgc aaa 2596

Ser Thr Gin Gin Leu Gin Glu Val Lys Ala Lys Leu Gin Gin Cys Lys 685 690 695 700 201019953 gca gag eta aac tet acc act gaa gag ttg cat aag tat cag aaa atg Ala Glu Leu Asn Ser Thr Thr Glu Glu Leu His Lys Tyr Gin Lys Met 705 710 715 2644 tta gaa cca cca ccc tea gee aag ccc ttc acc att gat gtg gac aag Leu Glu Pro Pro Pro Ser Ala Lys Pro Phe Thr lie Asp Val Asp Lys 720 725 730 2692 aag tta gaa gag ggc cag aag aat ata agg ctg ttg egg aca gag ett Lys Leu Glu Glu Gly Gin Lys Asn lie Arg Leu Leu Arg Thr Glu Leu 735 740 745 2740

cag aaa ett ggt gag tet etc caa tea gca gag aga get tgt tgc cac Gin Lys Leu Gly Glu Ser Leu Gin Ser Ala Glu Arg Ala Cys Cys His 750 755 760 age act ggg gca gga aaa ett cgt caa gee ttg acc act tgt gat gac Ser Thr Gly Ala Gly Lys Leu Arg Gin Ala Leu Thr Thr Cys Asp Asp 765 770 775 780 2788 2836 ate tta ate aaa cag gac cag act ctg get gaa ctg cag aac aac atg lie Leu He Lys Gin Asp Gin Thr Leu Ala Glu Leu Gin Asn Asn Met 785 790 795 2884 gtg eta gtg aaa ctg gac ett egg aag aag gca gca tgt att get gag Val Leu Val Lys Leu Asp Leu Arg Lys Lys Ala Ala Cys lie Ala Glu 800 805 810 2932

cag tat cat act gtg ttg aaa etc caa ggc cag gtt tet gee aaa aag Gin Tyr His Thr Val Leu Lys Leu Gin Gly Gin Val Ser Ala Lys Lys 815 820 825 2980 ege ett ggt acc aac cag gaa aat cag caa cca aac caa caa cca cca Arg Leu Gly Thr Asn Gin Glu Asn Gin Gin Pro Asn Gin Gin Pro Pro 830 835 840 3028 ggg aag aaa cca ttc ett ega aat tta ett ccc ega aca cca acc tgc Gly Lys Lys Pro Phe Leu Arg Asn Leu Leu Pro Arg Thr Pro Thr Cys 845 850 855 860 3076 caa age tea aca gac tgc age cct tat gee egg ate eta ege tea egg Gin Ser Ser Thr Asp Cys Ser Pro Tyr Ala Arg lie Leu Arg Ser Arg 865 870 875 3124 6 201019953 cgt tcc cct tta etc aaa tet ggg cct ttt ggc aaa aag tac taa 3169

Arg Ser Pro Leu Leu Lys Ser Gly Pro Phe Gly Lys Lys Tyr 880 885 890 ggctgtgggg aaagagaaga gcagtcatgg ccctgaggtg ggtcagctac tctcctgaag 3229 aaataggtct etittatget ttaccatata tcaggaatta tatccaggat gcaatactca 3289 gacactagct tttttctcac ttttgtatta taaccaccta tgtaatetea tgttgttgtt 3349 tttttttatt taettatatg atttctatgc acacaaaaac agttatatta aagatattat 3409 tgttcacatt ttttattgaa ttccaaatgt agcaaaatca ttaaaacaaa ttataaaagg 3469 ga 3471 <210> 2 <211> 890 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ser Gin Gly lie Leu Ser Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ser Asp Asp 15 10 15

Asp Val Val Val Ser Pro Met Phe Glu Ser Thr Ala Ala Asp Leu Gly 20 25 30

Ser Val Val Arg Lys Asn Leu Leu Ser Asp Cys Ser Val Val Ser Thr 35 40 45

Ser Leu Glu Asp Lys Gin Gin Val Pro Ser Glu Asp Ser Met Glu Lys 50 55 60

Val Lys Val Tyr Leu Arg Val Arg Pro Leu Leu Pro Ser Glu Leu Glu 65 70 75 80 201019953

Arg Gin Glu Asp Gin Gly Cys Val Arg lie Glu Asn Val Glu Thr Leu 85 90 95

Val Leu Gin Ala Pro Lys Asp Ser Phe Ala Leu Lys Ser Asn Glu Arg 100 105 110

Gly lie Gly Gin Ala Thr His Arg Phe Thr Phe Ser Gin lie Phe Gly 115 120 125

Pro Glu Val Gly Gin Ala Ser Phe Phe Asn Leu Thr Val Lys Glu Met 130 135 140 ❹

Val Lys Asp Val Leu Lys Gly Gin Asn Trp Leu He Tyr Thr Tyr Gly 145 150 155 160

Val Thr Asn Ser Gly Lys Thr His Thr He Gin Gly Thr lie Lys Asp 165 170 175

Gly Gly lie Leu Pro Arg Ser Leu Ala Leu lie Phe Asn Ser Leu Gin 180 185 190 ^ Gly Gin Leu His Pro Thr Pro Asp Leu Lys Pro Leu Leu Ser Asn Glu 195 200 205

Val He Trp Leu Asp Ser Lys Gin lie Arg Gin Glu Glu Met Lys Lys 210 215 220

Leu Ser Leu Leu Asn Gly Gly Leu Gin Glu Glu Glu Leu Ser Thr Ser 225 230 235 240

Leu Lys Arg Ser Val Tyr lie Glu Ser Arg lie Gly Thr Ser Thr Ser 245 250 255 8 201019953

Phe Asp Ser Gly lie Ala Gly Leu Ser Ser lie Ser Gin Cys Thr Ser 260 265 270

Ser Ser Gin Leu Asp Glu Thr Ser His Arg Trp Ala Gin Pro Asp Thr 275 280 285

Ala Pro Leu Pro Val Pro Ala Asn lie Arg Phe Ser lie Trp lie Ser 290 295 300

Phe Phe Glu lie Tyr Asn Glu Leu Leu Tyr Asp Leu Leu Glu Pro Pro 305 310 315 320

G

Ser Gin Gin Arg Lys Arg Gin Thr Leu Arg Leu Cys Glu Asp Gin Asn 325 330 335

Gly Asn Pro Tyr Val Lys Asp Leu Asn Trp lie His Val Gin Asp Ala 340 345 350

Glu Glu Ala Trp Lys Leu Leu Lys Val Gly Arg Lys Asn Gin Ser Phe 355 360 365

Ala Ser Thr His Leu Asn Gin Asn Ser Ser Arg Ser His Ser lie Phe 370 375 380

Ser lie Arg lie Leu His Leu Gin Gly Glu Gly Asp lie Val Pro Lys 385 390 395 400 lie Ser Glu Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser Glu Arg Cys Lys 405 410 415

Asp Gin Lys Ser Gly Glu Arg Leu Lys Glu Ala Gly Asn lie Asn Thr 420 425 430 9 201019953

Ser Leu His Thr Leu Gly Arg Cys He Ala Ala Leu Arg Gin Asn Gin 435 440 445

Gin Asn Arg Ser Lys Gin Asn Leu Val Pro Phe Arg Asp Ser Lys Leu 450 455 460

Thr Arg Val Phe Gin Gly Phe Phe Thr Gly Arg Gly Arg Ser Cys Met 465 470 475 480 lie Val Asn Val Asn Pro Cys Ala Ser Thr Tyr Asp Glu Thr Leu His 485 490 495

Val Ala Lys Phe Ser Ala lie Ala Ser Gin Leu Val His Ala Pro Pro 500 505 510

Met Gin Leu Gly Phe Pro Ser Leu His Ser Phe He Lys Glu His Ser 515 520 525

Leu Gin Val Ser Pro Ser Leu Glu Lys Gly Ala Lys Ala Asp Thr Gly 530 535 540 參 Leu Asp Asp Asp lie Glu Asn Glu Ala Asp lie Ser Met Tyr Gly Lys 545 550 555 560

Glu Glu Leu Leu Gin Val Val Glu Ala Met Lys Thr Leu Leu Leu Lys 565 570 575

Glu Arg Gin Glu Lys Leu Gin Leu Glu Met His Leu Arg Asp Glu lie 580 585 590

Cys Asn Glu Met Val Glu Gin Met Gin Gin Arg Glu Gin Trp Cys Ser 595 600 605 10 201019953

Glu His Leu Asp Thr Gin Lys Glu Leu Leu Glu Glu Met Tyr Glu Glu 610 615 620

Lys Leu Asn He Leu Lys Glu Ser Leu Thr Ser Phe Tyr Gin Glu Glu 625 630 635 640

He Gin Glu Arg Asp Glu Lys He Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu Gin 645 650 655

Glu Ala Arg Gin Gin Ser Val Ala His Gin Gin Ser Gly Ser Glu Leu 660 665 670

Ala Leu Arg Arg Ser Gin Arg Leu Ala Ala Ser Ala Ser Thr Gin Gin 675 680 685

Leu Gin Glu Val Lys Ala Lys Leu Gin Gin Cys Lys Ala Glu Leu Asn 690 695 700

Ser Thr Thr Glu Glu Leu His Lys Tyr Gin Lys Met Leu Glu Pro Pro 705 710 715 720

Pro Ser Ala Lys Pro Phe Thr He Asp Val Asp Lys Lys Leu Glu Glu 725 730 735

Gly Gin Lys Asn He Arg Leu Leu Arg Thr Glu Leu Gin Lys Leu Gly 740 745 750

Glu Ser Leu Gin Ser Ala Glu Arg Ala Cys Cys His Ser Thr Gly Ala 755 760 765

Gly Lys Leu Arg Gin Ala Leu Thr Thr Cys Asp Asp He Leu He Lys 770 775 780 11 201019953

Gin Asp Gin Thr Leu Ala Glu Leu Gin Asn Asn Met Val Leu Val Lys 785 790 795 800

Leu Asp Leu Arg Lys Lys Ala Ala Cys lie Ala Glu Gin Tyr His Thr 805 810 815

Val Leu Lys Leu Gin Gly Gin Val Ser Ala Lys Lys Arg Leu Gly Thr 820 825 830

Asn Gin Glu Asn Gin Gin Pro Asn Gin Gin Pro Pro Gly Lys Lys Pro 835 840 845 參

Phe Leu Arg Asn Leu Leu Pro Arg Thr Pro Thr Cys Gin Ser Ser Thr 850 855 860

Asp Cys Ser Pro Tyr Ala Arg lie Leu Arg Ser Arg Arg Ser Pro Leu 865 870 875 880

Leu Lys Ser Gly Pro Phe Gly Lys Lys Tyr 885 890

<211〉 9 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223〉人工胜肽序列 <400> 3

Leu Leu Ser Asp Asp Asp Val Val Val 1 5 <210> 4 <211〉 9 12 201019953 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工胜肽序列 <400> 4

Cys He Ala Glu Gin Tyr His Thr Val 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> 人工 <220〉 <223〉 人工胜肽序列 <400> 5

Ala Gin Pro Asp Thr Ala Pro Leu Pro Val 1 5 10 <210〉 6 <211> 21 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223> PCR人工合成引子 <400〉 6 21

ctacaagcac ccaaggactc t <210〉 7 <211〉 20 <212> DNA <213>人工 13 <220> 201019953 <223〉PCR人工合成引子 <400〉 7 agatggagaa gcgaatgttt 20 <210〉 8 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工 人工合成引子 <220> <223〉 <400〉 8 catccacgaa actaccttca act 23 <210〉 <211> <212> 23 <213〉人工 <220> <223〉PCR人工合成引子 <400> 9 tctccttaga gagaagtggg gtg 23

<210> 10 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人工 <220> <223> PCR人工合成引子 <400〉 10

Ser Leu Tyr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu 1 5 14 201019953 <210> 11 <211> <212〉 9 PRT <213> mouse <400> 11

Leu Leu Ser Asp Glu Asp Val Val Asp 1 5 <210〉 12 <211> <212〉 10 PRT <213> mouse 赢 ❿ <400〉 12

Ala Gin Pro Asp Thr Val Pro Val Ser Val 1 5 10

Q 15

Claims (1)

1. 201019953 七、申請專利範圍： 1. 一種單離的寡胜肽’包括選自序列識別號3、4及5 所組成之群的胺基酸序列。 2. 如申請專利範圍第1項所述之寡胜肽，其中該寡胜 肽中有1個、2個或數個胺基酸被取代、缺少、插入及/或 增加，該募胜肽具有細胞毒性T淋巴球（CTL)誘發性。 3. 如申請專利範圍第2項所述之寡胜肽，其中該寡胜 肽具有至少一個取代選自下列組成之群： ® (a)N端的第二胺基酸為白胺酸（leucine)或甲硫胺酸 (methionine)；及 (b)C端的胺基酸為綠胺酸（vaiine)或白胺酸 (leucine)。 4. 一種治療及/或預防癌症及/或預防其術後復發之醫 藥劑’其中該醫藥劑包括醫學容許載劑及1個或以上的申 請專利範圍第1-3項任一項所述之募胜肽或編碼該募胜肽 φ 之多核苷酸。 5. 如申請專利範圍第4項所述之醫藥劑，其中該醫藥 劑係調配投予個體，該個體的HLA抗原為HLA-A2。 6. 如申請專利範圍第4項所述之醫藥劑，其中該癌症 為選自膀胱癌、乳癌、惡性膽管細胞癌（cholangiocel lular carcinoma)、食道癌、非小細胞肺癌（nscLC)、胰臟癌、前 列腺癌、腎細胞癌（renal carcinoma)及小細胞肺癌（SCLC)。 7. 如申請專利範圍第4項所述之醫藥劑，其中該醫藥 劑為疫苗。 201019953 8· -種外吐小體（exQSQine)，其中該外吐小體的表面表 現-包括申料㈣㈣卜3替—項料之隸肽及心 抗原之複合物。 9. 如申晴專利範圍第8項所述之外吐小體，其中該_ 抗原為HLA-A2。 10. 一種誘發抗原表現細胞之方法，係使用如申請專利 範圍第1-3項任一項所述之寡胜肽。 11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該方法 包括選自下列組成之群之步驟： (a) 使抗原表現細胞與申請專利範圍第1-3項任一項所 述之寡胜肽接觸；及 (b) 將編碼申請專利範圍第1-3項任一項所述之募胜肽 的多核苷酸載入抗原表現細胞。 12. —種誘發CTL的方法，係使用如申請專利範圍第1 _ 3 項任一項所述之寡胜狀。 13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該方法 包括選自下列組成之群之步驟： (a) 使CD8陽性T細胞與抗原表現細胞及/或外吐小體 接觸’該抗原表現細胞及/或外此小體的表面表現如申請專 利範圍第1-3項任一項所述之募胜肽；及 (b) 將編碼可形成τ細胞受體（TCR)次單元連接至抗原 表現細胞表面的申請專利範圍第1-3項任一項所述之募胜 肽及HLA抗原之複合物的多胜肽之多核苷酸，載入CD8陽 性T細胞。 201019953 14. 一種單離的CTL，其中該CTL自標申請專利範圍第 1-3項任一項所述之募胜肽。 15. 如申請專利範圍第14項所述之CTL，其中該CTL可 連接至抗原表現細胞表面之申請專利範圍第項任一項 所述之寡胜肽及HLA抗原的複合物。 16·—種單離的CTL，其中該CTL係申請專利範圍第1-3 項任一項所述之寡胜肽所誘發。 ❹ I7·如申請專利範圍第16項所述之CTL，其中該CTL係 由申請專利範圍第13項所述之方法所誘發。 18. —種單離的抗原表現細胞，其中該抗原表現細胞表 面表現HLA抗原及申請專利範圍第卜3項任一項所述之募 胜肽的複合物。 19. 如申請專利範圍第18項所述之抗原表現細胞其 係由申s青專利範圍第10或11項所述之方法誘發。 20. —種誘發個體内抗癌症的免疫反應之方法，包括投 ® 予該個體疫苗之步驟，該疫苗包括至少一個活性成分選自 下列所組成之群： (a) —個或以上的如申請專利範圍第1-3項住—項所述 之募胜肽或其免疫活性片段； (b) —個或以上的編碼如申請專利範圍第卜3項任一項 所述之寡胜肽的多核苷酸或其免疫活性片段； (c) 一個或以上的如申請專利範圍第14_17項任一項所 述之單離的CTLs ;及 ' (d) —個或以上的如申請專利範圍第18或19項所述之 3 201019953 早離的抗原表現細胞。 21. —種誘發CTL之醫藥劑，其中該醫藥劑包括醫學☆ 許載劑及一個或以上的如申請專利範圍第1_3 $饪—項所 述之募胜肽、編碼前述募胜肽之多核苷酴、式 -尺如肀請專利 範圍第18或19項所述之单離的抗原表現細胞。 22. —種活性成分的使用，其係用於製造治療癌症之醫 藥組合物或醫藥劑，其中該活性成分係選自下列組成之群. (a)—個或以上的如申請專利範圍第1_3項任—項所述之募 胜肽； (b) —個或以上的以表現形式編碼如申請專利範圍第 1-3項任一項所述之寡胜肽的多核苷酸； (c) 一個或以上的表現申請專利範圍第i_3項任一項所 述之募胜肽的抗原表現細胞；及 (d) —個或以上的CTLs，該CTL可連接至抗原表現細胞 表面之申請專利範圍第1-3項任一項所述之募胜肽及jjla 抗原的複合物。 23. —種多核苷酸，其編碼申請專利範圍第項任一 項所述之募胜肽。