TW200927170A - Anti-factor B antibodies and their uses - Google Patents

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200927170 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗因子B抗體及其在預防及治療諸如脈絡 膜新血管生成（CNV)、糖尿病性視網膜病變及年齡相關黃 斑退化（AMD)之補體相關眼睛病狀中之用途。 【先前技術】 .補體系統係一個複雜的酵素流程，其由一系列血清醣蛋 白所完成的，該等醣蛋白通常以非活性酶原形式存在。有 〇 兩種主要路徑（即經典及替代路徑）可以活化補體，該等路 徑在C3級別下合併，其中兩種相似C3轉化酶將C3分裂成 C3a及 C3b 。 巨噬細胞為專家細胞，其已發展識別細胞表面所表現之 鑑別標記結構（所謂分子模式）中之細微差異的先天能力 (Taylor等人，Eur J ImmUnol 33，2090-2097 (2003) ; Taylor 等人，Annu Rev Immunol 23, 901-944 (2005)) ° 雖然直接 識別該等表面結構為先天免疫性之基本態樣，但是調理作 ❹ 用允許通用巨嗟細胞受體介導内包作用，增加效率且多樣 化吞嗟細胞之識別譜（Stuart及Ezekowitz，Immunity 22, . 539-550 (2005)) »吞噬作用之過程涉及多種配位體_受體相 、 互作用，且現已明確，包括免疫球蛋白、收集素 (collectin)及補體組分之各種調理素經由與巨噬細胞細胞 表面受體之相互作用引導病原體内化所需之細胞活性（由

Aderem 及 Underhill, Annu Rev Immunol 17，593-623 (1999) ; Underhill及 Ozinsky，Annu Rev Immunol 20，825- 135639.doc 200927170 852(2002)評論）。雖然藉由生殖系基因編碼之天然免疫球 蛋白可識別多種病原體，但是大多數調理IgG經由適應性 免疫性產生，且因此經由Fc受體之有效清除並非為即刻的 (Carroll，Nat Immunol 5, 981-986 (2004))。另一方面，補 體快速識別病原體表面分子且預致敏粒子用於補體受體吸 收(Brown，Infect Agents Dis 1，63-70 (1991)) 〇 • 補體由超過30種血清蛋白組成，該等血清蛋白調理多種 病原體用於補體受體識別。視級聯之初始觸發器而定，可 區別二種路徑（由 Walport, N Engl J Med 344，1058-1066 (2001)評論）。所有3種路徑共用活化中心組分€3之普通步 驟，但是其根據識別之性質及導致C3活化之初始生物化學 步驟而不同。經典路徑係藉由與病原體表面結合之抗體活 化，該病原體表面又結合Clq補體組分，斷開最終將C3分 裂成其活性形式C3b之絲胺酸蛋白酶級聯。凝集素路徑在 藉由凝集素蛋白質識別碳水化合物基元後活化。迄今為 〇 止，已鑑別出該路徑之3個成員：甘露糖結合凝集素 (MBL)、凝集素之SIGN_R1家族及纖維膠凝蛋白 (fic〇lin)(PyZ等人，Ann Med 38, 242-251 (2006))。MBL及 . 纖維膠凝蛋白均與絲胺酸蛋白酶相關，該等絲胺酸蛋白酶 ' 在經典路徑中起如C1 一樣之作用，活化導致中心C3步驟 之組分C2及C4。替代路徑與經典路徑及凝集素路徑形成 對比，因為其係由於内部C3酯與病原體表面上之識別基元 之直接反應而活化。與活化表面初始C3結合會導致c3b、、尤 積經由替代路徑蛋白酶因子B與因子作用而快速擴 135639.doc 200927170 增。重要地是，藉由經典路徑或凝集素路徑沈積之C3b亦 可導致C3b沈積經由因子B與D之作用擴增。在補體活化之 所有3種路徑中’調理作用中之關鍵步驟為組分C3向C3b 之轉化。C3被補體級聯之酶分裂會使硫酯暴露於親核攻 擊，使得C3b經由硫酯域共價連接至抗原表面上。其為補 體調理作用中之初始步驟。所結合C3b之後續蛋白水解會 產生由不同受體加以識別之iC3b、C3c及C3dg片段（R0SS及

Medof，Adv Immunol 37，217-267 (1985))。該分裂廢除 C3b進一步擴增C3b沈積且活化補體級聯的晚期組分（包括 能夠引導細胞膜損傷之攻膜複合物）之能力。然而，巨嗔 細胞噬菌細胞受體優先識別C3b及其片段；歸因於醋鍵形 成之通用性’ C3介導之調理作用對病原體識別極為重要 (Holers等人 ’ Immunol Today 13，231-236 (1992))，且各 種C3降解產物之受體因此在宿主免疫反應中起重要作用。 C3自身為由13個相異域組成之複合及可撓性蛋白質。分 子之核心由8個所謂巨球蛋白（MG)域構成，該等域構成C3 之緊密填滿α及0鏈。插入該結構中的為cuB(Clr/Cls、 Uegf及骨形態演變蛋白-1)及TED域，後者含有允許C3b與 病原體表面共價締合之硫酯鍵《剩餘域含有C3a或擔當核 心域之連接子及間隔基^ C3b及C3c結構與（：3之比較證 明’分子在各蛋白水解下經歷主要構形重排，其不僅暴露 TED，而且暴露可與細胞受體相互作用之分子其他新表面 (Janssen及 Gros，Mol Immunol 44，3·1〇 (2007)) 〇 年齡相關黃斑退化（AMD)為全世界老年人失明之主要原 135639.doc 200927170 因。AMD之特徵為可歸因於黃斑之退化及新血管改變而產 生的中心視覺之進行性損失，該黃斑為對精細視覺銳度負 責之眼睛視網膜之高度專門化區域。近期估算指示，K4 百萬人由於AMD失明或嚴重視力受損。該疾病對老人群體 之身心健康及其家庭具有巨大影響且變成主要的公共衛生 負擔。 然而，新的發現開始提供與早期AMD相關之相關細胞事 件、遺傳因素及生物化學過程的更明確描述。 〇 因子B為緊密調節、高度特異性絲胺酸蛋白酶。其活化 形式可催化補體活化之中心擴增步驟以引發發炎反應、細 胞溶解、吞噬作用及B細胞刺激（Carr〇u等人，Nat·

Immunol· 5:981-986 (2004))。因子B經由裝配過程活化： 其結合表面-經結合C3b或其液相對應物C3 (H20)，之後， 藉由因子B分裂成片段Ba(殘基^234)及Bb(殘基235_ 739)(Fishelson 等人，j. Immunol. 132:1430-1434 > (1984))。片段Ba自複合物解離，留下替代路徑C3轉化酶 複合物C3b-Bb，其將C3分裂成C3a及C3b。該蛋白酶複合 物内在不穩定。一旦自複合物解離，Bb就可不與C3b再締 合（Pangburn等人，Bochem. J. 235:723-730 (1986))。 酶原因子B由下列結構域組成：3個N末端補體控制蛋白 (CCP)域’其藉由45殘基連接子連接至VWA域；及一個C 末端絲胺酸蛋白酶（SP)域，其帶有催化中心。在因子B之 活性中心中觀察到與其他絲胺酸蛋白酶之顯著差異（XlJ等 人，Immuno丨.Rev. 180: 123-135 (2001))。催化三元體殘 135639.doc 200927170 Ο

基AsP102、His57及Serl95(胰凝乳蛋白酶原編號已用於絲 胺酸蛋白酶域）及3個形成非特異性底物結合位點Ser_Trp_ Gly214-216之殘基具有典型構形。然而，氧陰離子洞呈現 與在某些酶原中觀察到之彼構形相似之非活性構形。其主 要歸因於Argl92之羰基氧之向内定向，該Argl92之主鏈連 同Cysl91、Glyl93及AsP194之彼等主鏈一起適應單迴旋 310螺旋構形。Argl92之羰基氧與Serl95之醯胺基形成H 鍵，因此降低表徵活性氧陰離子洞之正電荷。氧陰離子洞 之該非活性組態與由C3轉化酶所表現之高催化活性不可相 容。因此，導致氧陰離子洞之結構元素之重新對準的構形 改變必須藉由輔因子、底物或兩者來誘導。 因子Β在金漿中之含量相對較高，為約1665 ηΜ，但在 眼睛中較低’為約29 ηΜ。因此’其形成用於抗體療法之 吸引人標靶。本發明提供用於預防及治療AMD及其他補體 相關眼睛病狀之抗因子B抗體。 【發明内容】 本發明至少部分地基於產生抗因子B抗體之融合瘤之鑑 別，該融合瘤係基於其在溶血檢定中之低IC5〇值及其與獼 猴因子B之交又反應性自400種不同純系之篩選中選出。 在一態樣中，本發明係關於一種基本上結合於與抗因子 B抗體1F7相同之抗原決定基的抗因子b抗體。 在一實施例中，抗體為包含抗因子B抗體1F7之輕鏈及/ 或重鏈高變區序列（分別為SEQ ID NOs: 1及2)之抗因子b抗 體。 135639.doc 200927170 在另一實施例中，抗體為包含抗因子B抗體1F7之輕鏈 及/或重鏈可變區序列（分別為SEQ ID NOs: 1及2)之抗因子 B抗體。 在另一實施例中，抗因子B抗體為包含具有SEQ ID NO: 1之輕鏈序列及具有SEQ ID NO: 2之重鏈序列的抗體1F7。 在另一實施例中，抗因子B抗體為抗體片段，其可（例 如）選自由 Fab ' Fab'、F(ab’)2、scFv、（scFv)2、dAb、互補 判定區（CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體 (minibody)、雙功能抗體及自抗體片段形成之多特異抗體 組成之群。 在所有實施例中’抗體較佳為單株抗體，其可（例如）為 嵌合、人化或人類的。 在另一態樣中，本發明係關於一種用於預防或治療補體 相關眼睛病狀之方法，其包含向有需要之個體投與有效量 之因子B拮抗劑。 φ 在各種實施例中’有需要之個體為哺乳動物，諸如人 類，且因子B拮抗劑選自由抗因子b抗體及其片段、結合 多肽、肽及非肽小分子組成之群。 . 在一較佳實施例中，因子B拮抗劑為如上文定義之抗體 - 或抗體片段。 補體相關眼睛病狀包括（例如）年齡相關黃斑退化 (AMD)、脈絡膜新血管生成（CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性 及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、 病理性近視、逢希伯_林道（v〇n HippeNLind叫疾病、眼睛 135639.doc 200927170 之組織漿菌病、中心視網膜靜脈阻塞（CRV0)、角膜新血 管生成、乾眼及視網膜新血管生成。

在另一態樣中，本發明係關於一種套組，其包含因子B 括抗劑及用於投與該拮抗劑以治療補體相關眼睛病狀之說 明書。 在另一態樣中，本發明係關於一種因子B拮抗劑的用 途，其用於製備供治療補體相關眼睛病狀之藥劑。 Ο

在另一態樣中，本發明係關於一種適用於治療補體相關 眼睛病狀之因子B枯抗劑。 定義 術語"因子B"及"補體因子B”可交替使用’且係指天然序 列及變異體因子B多肽。此項技術中已知之補體因子^ 其他名稱包括B-因+、血清滅菌蛋白；C3前加速子 (pr_ceierat〇r) ; 〇前活化子（pr〇activat〇r) ; c3/c5轉化 酶；及甘胺酸富集β醣蛋白。 ”天然序列，，因子3為不管其製備模式而具有與天然來源 之因子Β多肽相同之胺基酸序列的多狀。因此，天然序列 因子Β可自自然界分離或可藉由重組及/或合成方式產生。 除諸如成熟人類因子Β蛋白皙πρη τη χτα 玄臼質(SEQ ID NO: 3)之成熟因子β 蛋白質外’術語"天然序列因子B"特定涵蓋因子以天然存 在前驅物形式（例如’非活性前蛋白質（prep崎in)，其妳 2水解分裂產生活性形式）、因子B之天㈣在變異體形 式（例如’替代f接形式）及天_在對偶基因變異體，以 I35639.doc 12 200927170 及具有與天然來源之因子B多肽相同之胺基酸序列的因子 B分子之結構構形變異體。非人類動物（包括高級靈長類動 物及非人類哺乳動物）之因子B多肽特定地包括在該定義 内。 ”因子B變異體"或”補體因子B變異體"意謂如下文所定義 ‘之活性因子B多肽，其具有與天然序列因子B多肽（諸如 ' SEQ ID NO: 3之天然序列人類因子B多肽）至少約8〇%的胺 基酸序列一致性。通常’因子B變異體將具有與seQ ID NO: 3之成熟人類胺基酸序列至少約80%的胺基酸序列一致 性，或至少約85%的胺基酸序列一致性，或至少約的 胺基酸序列一致性’或至少約95%的胺基酸序列一致性， 或至少約98%的胺基酸序列一致性，或至少約99%的胺基 酸序列一致性。較佳地，最高程度之序列一致性出現在因 子B之活性位點内。 因子B之絲胺酸蛋白酶域之晶體結構係由Jing等人， ❹ EMBO J· 19:164-173(2000)公開；且因子B之晶體結構已 藉由 Milder 等人 ’ Natl. Struct. Mol. Biol. 14(3):224- 8(2007)報導。因子B之"活性位點"係藉由催化三元體殘基 (H57、D102及S195，使用胰凝乳蛋白酶編號）及非特異性 ' 底物結合位點（W215-G216)來定義。 "胺基酸序列一致性百分比（％)"係定義為，在必要時為 達到最大序列一致性百分比將序列進行比對且引入間隙且 不將任何保守取代視為序列一致性之部分後，候選序列中 與參考因子B序财之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基的百 135639.doc 200927170 分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比目的之比對可以 熟習此項技術者之技術内的各種方式實現，例如，使用公 開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BlAST_2、ALIGN或

Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於量 . 測比對之適當參數，包括為實現與所比較之全長序列的最 大比對所需要之任何演算法。隨後相對於較長序列計算序 列一致性，亦即，即使較短序列展示與較長序列之部分之 ❹ ι〇0%序列一致性，但是總序列一致性將小於100%。 "核酸序列一致性百分比（％)”係定義為，在必要時為達 到最大序列一致性百分比將序列進行比對且引入間隙後， 候選序列中與參考因子B編碼序列中之核苷酸相同之核苷 酸的百分比。出於測定核酸序列一致性百分比目的之比對 可以熟習此項技術者之技術内的各種方式實現，例如，使 用公開可獲得之電腦軟體’諸如BLAST、BLAST_2、 ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測 〇 定用於量測比對之適當參數，包括為實現與所比較之全長 序列最大比對所需要之任何演算法。隨後相對於較長序列 计算序列一致性，亦即，即使較短序列展示與較長序列之 部分之100%序列一致性，但是總序列一致性將小於 100% 〇 ，’經分離”核酸分子為一種經鑑別且與至少一種污染核鲮 分子分離的核酸分子，其在該核酸之天然來源中通常與污 染核酸分子締合。經分離核酸分子不同於在自然界中所見 之形式或設定》經分離核酸分子因此與當存在於天然細胞 135639.doc _ 14· 200927170 中時之核酸分子相區別。然而，經分離核酸分子包括通常 表現經編碼多肽之細胞中所包含之核酸分子，其中（例如） 核酸分子之染色體位置不同於在天然細胞中之彼染色體位 置。 經分離的”編碼因子B多 與至少一種污染核酸分子分離的核酸分子，其在該編碼因 子B之核酸之天然來源中通常與污染核酸分子締合。經分 離的編碼因子B多肽之核酸分子不同於在自然中所見之形 式或》又疋。經分離的編碼因子B多狀之核酸分子因此與其 存在於天然細胞中時之編碼核酸分子相區別。然而，經分 離的編碼因子B之核酸分子包括通常表現因子B之細胞中 所包含之編碼因子B的核酸分子，其中（例如）核酸分子之 染色體位置不同於在天然細胞中之彼染色體位置。 術語"拮抗劑"以最廣泛意義來使用，且包括能夠中和、 斷杠部分或完全抑制、廢除、降低或干擾因子B生物活 及刀子。因子B括抗劑包括（而不限於）抗因子B抗體 及其抗原結合片段、立 結合因子B且能夠中：他二多：:肽及非肽小分子’其 降低或干擾因子m °》或70全抑制、廢除、 狀之病理之能力。 —因子Β參與補體相關眼睛病 本文中定義，，小分子” 道爾頓之分子量。 、有低於約600，較佳低於約1000 在本發明之因子吨 或"生物活性，，為對 下文中’ S性的，，或”活性” 刀或完全抑制）因子Β生物活性之能 135639.doc 200927170 力。因子B拮抗劑之較佳生物活性為在諸如補體相關眼睛 病狀之因子B相關疾病或病狀之病況（例如病理）中實現可 量測之改良的能力。活性可在活體外或活體内測試中加以 測定’該等測試包括結合檢定’使用相關動物模型或人類 臨床試驗。 術語"補體相關眼睛病狀"以最廣泛意義使用且包括其病 . 理涉及補體，包括補體之經典及替代路徑及尤其替代路徑 ❹ 之所有眼睛病狀。補體相關眼睛病狀包括（而不限於）黃斑 退化性疾病’諸如年齡相關黃斑退化（AMD)之所有階段， 包括乾性及濕性（非滲出性及滲出性）形式；脈絡膜新血管 生成（CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性及其他局部缺血相關性 視網臈病變；及其他眼内新生血管性疾病，諸如糖尿病性 黃斑水腫、病理性近視、逢希伯_林道疾病、眼睛之組織 漿菌病、中心視網膜靜脈阻塞（CRV〇)、角膜新血管生成 及視網臈新血管生成。補體相關眼睛病狀之較佳群組包括 Ο 年齡相關黃斑退化（AMD)，包括非滲出性（濕性）及滲出性 (乾性或萎縮性）AMD、脈絡膜新血管生成（CNV)、糖尿病 性視網膜病變（DR)及内眼炎。 "治療"為以預防病症之病理發展或改變病症之病理為目 . @執行之介人。因此，，，治療”係指治療性治療及預防手 段。需要治療之彼等者包括已具有病症之彼等者以及欲預 方扃症之彼等者。在免疫相關疾病之治療中，治療劑可直 接改變免疫反應之組分反應之量值，或使疾病對藉由其他 治療劑（例如抗生素、抗真菌劑、消炎劑、化學治療劑等 135639.doc -16- 200927170 等）之治療更為敏感。 諸如補體相關眼睛病狀之疾病之"病理"勺 危害患者之 健康之所有現象。其包括（而不限於）異賫 展或不可控制的細 胞生長（嗜中性細胞、嗜酸性細胞、簞妨 、、 早核細胞、淋巴細 胞），抗體產生，自體抗體產生，補體產 十擾鄰近細 胞之正常功能，以異常含量釋放細胞激素或其他分泌產 物，抑止或惡化任何發炎或免疫學反應，發炎性細胞（嗜

中性細胞、嗜酸性細胞、單核細胞、淋巴細胞）渗入細胞 空間中，等等。 如本文中所使用之術語"哺乳動物，，係指分類為哺乳動物 之任何動物，包括（而不限於）人類、高級靈長類動物家 養及農場動物，及動物園、運動或寵物，諸如馬、豬、 牛、犬、猶及雪紹，等等。在本發明之一較佳實施例中， 哺乳動物為人類。 "與一或多種其他治療劑組合"投藥包括同時（並行）投藥 及以任何順序連續投藥。 "治療有效量"為在諸如補體相關眼睛病狀之標靶疾病或 病狀之病况（例如病理）中實現可量測改良所需要之”因子B 拮抗劑"之量。 術居控制序列”係指對在特定宿主生物體中表現可操作 連接之編碼序列而言所必需之DNA序列。適於原核生物之 控制序列（例如）包括啟動子、視需要之操縱子序列及核糖 體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號 及增強子。 135639.doc •17- 200927170 當將核酸放入斑萁—-kt i* xr ，、另核i序列之功能關係中時，其為 "可操作連接的’’。舉例而言’若前序列或分泌引導子之 雇表現為參與多肽分泌之前蛋白質，則其可操作連接於 多肽之DNA·’若啟動子或增強子影響序列之轉錄，則其可 #作連接於編碼序列；或若核糖體結合位點經定位以便促 進轉繹，則其可操作連接於編碼序列。通常，"可操作連 接"意謂所連接之DNA序列為鄰近的，且在分泌引導子之 &況下’為鄰近的且在閱讀相（reading phase)f。然而， 增強子未必為鄰近的。連接係藉由在適宜限制性位點處接 合而完成。若該等位點不存在，則根據習知實踐使用合成 募核皆酸接附子（adaptor)或連接子。 雜交反應之，，嚴格性"可易於藉由一般技術者加以確定， 且通常視探針長度、洗滌溫度及鹽濃度而定根據經驗計 算。一般而言，較長探針需要較高溫度以用於適當黏接， 而較短探針需要較低溫度。雜交通常視當互補鏈存在於低 〇 於其熔解溫度之環境中時，變性DNA再黏接之能力而定。 探針與可雜交序列之間的所要同源性程度愈高，可使用之 相對溫度愈高。因此得出結論，較高相對溫度將趨向於使 反應條件更嚴格，而較低溫度因此使反應條件較不嚴格。 -對雜交反應之嚴格性之其他細節及解釋，參見Ausube丨等 尺 ’ Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers，（1995)。 如本文中所定義，"嚴格條件"或"高嚴格性條件"可藉由 以下彼等條件加以鑑別：（1)使用低離子強度及高溫用於洗 135639.doc •18- 200927170 滌，例如，0.015 Μ氯化鈉/0.0015 Μ檸檬酸鈉/0.1%十二烷 基硫酸鈉，在50°C下；（2)在雜交期間使用變性劑，諸如甲 醯胺，例如，具有0.1 %牛血清白蛋白之50% (v/v)甲酿胺/ 0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/pH 6·5之具有750 mM氯 化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50 mM碟酸鈉緩衝液，在42°C 下；或（3)在42°C下使用50%甲醯胺、5xSSC(0.75 Μ NaCl、0.075 Μ檸檬酸鈉）、50 mM鱗酸鈉（pH 6.8)、0,1% 焦磷酸鈉、5 x丹哈德（Denhardt)氏溶液、經超音波處理鮭 魚精子DNA(50 pg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，在 42°C下，在0.2xSSC(氣化鈉/檸檬酸鈉）中及在55°C下，在 50%甲醯胺中洗滌，接著在55°C下，在由含有EDTA之O.lx SSC組成之高嚴格性洗滌液中洗滌。 "適度嚴格條件"可如由Sambrook等人，Mo/ecw/ar Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press，1989所述來鑑別，且包括使用上文所述之彼 等較不嚴格洗滌液及雜交條件（例如溫度、離子強度及％ SDS)。適度嚴格條件之實例為在37°C下，在包含以下物質 之溶液中隔夜培養：20%甲醯胺、5xSSC(150 mM NaCl、 15 mM擰檬酸鈉）、50 mM磷酸鈉（pH 7.6)、5χ丹哈德氏溶 液、10%硫酸葡聚糖及20 mg/mL變性經剪切鞋魚精子 DNA ’接著在約37_50°C下，在lxSSC中洗滌過濾器。熟習 此項技術者將認識到如何按需要調整溫度、離子強度等等 以調節諸如探針長度及其類似物之因素。 當在本文中使用時，術語”經抗原決定基標記"係指包含 135639.doc •19- 200927170 與標》己多肽^合之本發明多肽的嵌合多肽。標記多肽具 有足夠殘基以提供抗體可針對其來製得之抗原決定基，但 為足夠短的以便標記多肽不干擾與其融合之多肽的活性。 標記多肽較佳亦為相當獨特的以便抗體大體上不與其他抗 原決定基交又反應。適合標記多肽通常具有至少6個胺基 酸殘基且通常在約8與50個胺基酸殘基之間（較佳，在約1() 與20個胺基酸殘基之間）。

❹ 術語"抗體"以最廣泛意義使用，且特定涵蓋（不限於）單 -抗因子B單株抗體（包括促效劑、拮抗劑及中和抗體）及 具有多抗原決定基特異性之抗因子B抗體組合物。如本文 中所使用之術語"單株抗體"係指自大體上均質之㈣㈣ 獲得的抗體，亦即，構成群體之個別抗體除可以較少量存 在之可能的天然存在突變外均為相同的。 如本文中所使用之術語"單株抗體"係指自大體上均質之 抗體群體獲得的抗體’亦即’構成群體之個別抗體除可以 較少量存在之可能的天然存在突變外均為相同的。單株抗 體針對單k原、位點有面度特異性。此外，與通常包括針 對不同決定子（抗原決定基）之不同抗體之習知（多株）抗體 製劑相反，各單株抗體針對抗原上之單―決^子。修飾語 "單株"指示抗體當自大體上均質之抗體群獲得時的特徵， 且不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉心 言’欲根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由κ。心等 人（1975)Natui：e 256:495描述之融合瘤方法來製得，或可藉 由重組DNA方法製得（參見（例如），美國專利第4,816,567 135639.doc •20· 200927170 號）。"單株抗體"亦可使用（例如）Clackson等人（199l)Nature 352:624-628及 Marks 等人（1991)J. Mol. Biol. 222:581-597 中所述之技術自噬菌體抗體文庫分離。 本文中之單株抗體特定包括"嵌合"抗體（免疫球蛋白）， 其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特 定抗體種類或子類之抗體中之相應序列一致或同源，而鏈 其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體種類或子類之 抗體以及該等抗體之片段中之相應序列一致或同源，只要 ® 其顯示所要生物活性即可（美國專利第4,816,567號；及

Morrison 等人（l984)Proc. Natl. Acad. Sci· USA 81:6851· 6855) ° 非人類（例如鼠）抗體之"人化”形式為含有源自於非人類 免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體。極大部分而言，人化 抗體為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體之高變 區之殘基係經具有所要抗體特異性、親和力及能力之來自 〇 非人類物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長 類動物）之高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫 球蛋白之Fv構架區（FR)殘基係經相應非人類殘基置換。此 外’人化抗體可包含未見於受體抗體或供體抗體中之殘 基。進行該等修飾可進一步改進抗體效能。一般而言，人 化抗體包含大體上所有至少一個及通常是兩個可變域，其 中所有或大體上所有高變環（1〇〇p)係對應於非人類免疫球 蛋白之彼等高變環，且所有或大體上所有FR區為人類免疫 球蛋白序列之彼等FR區。人化抗體視需要亦可包含免疫球 135639.doc -21 200927170 蛋白恆定區（Fc) ’通常為人類免疫球蛋白之彼怪定區之至 少一部分。關於其他細節，參見jones等人（1986)#〇?1^ 321:522-525 ; Riechmann 等人（1988)A^wm 332..323-329 ; 及 Presta (1992) Cwrr. 〇p. Sirwcii. βίο/· 2:593-596。 '•物種依賴性抗體"為一種對來自第一哺乳動物物種之抗 原的結合親和力強於對來自第二哺乳動物物種之彼抗原之 同系物的結合親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體係 ”特異性結合"人類抗原（亦即，具有不超過約1 χ 1 〇·7 Μ，較 佳不超過約1χ10_8 Μ且最佳不超過約1Χ10·9 Μ之結合親和 力（Kd)值），但對來自第二非人類哺乳動物物種之抗原之同 系物具有之結合親和力比其對人類抗原之結合親和力弱至 少約50倍’或至少約500倍，或至少約1〇〇〇倍。物種依賴 性抗體可為任何如上文所定義之各種類型抗體，但較佳為 人化或人類抗體。 如本文中所使用，”抗體突變體"或”抗體變異體"係指物 種依賴性抗體之胺基酸序列變異體，其中物種依賴性抗體 中的一或多個胺基酸殘基係經修飾。該等突變體必定具有 與物種依賴性抗體小於1 00%的序列一致性或相似性。在 一較佳實施例中，抗體突變體具有的胺基酸序列具有與物 種依賴性抗體之重鏈或輕鏈可變域之胺基酸序列至少75% 的胺基酸序列一致性或相似性，更佳至少80%，更佳至少 85%，更佳至少90%且最佳至少95%的胺基酸序列一致性 或相似性。本發明對該序列一致性或相似性定義為，候選 序列與物種依賴性殘基經比對及為達到最大序列一致性引 135639.doc -22- 200927170 若有必要）之後’所得殘基一致（亦即，相同殘基） L硷美亦即’來自基於共有側鏈性質之相同群組之胺基 二:丨參見下文)之胺基酸殘基的百分比。可變域外之 几序歹·】中之N末端、C末端或内部延伸、刪除或插入均 不應解釋為影響序列一致性或相似性。 ❹ ❹ %分離”抗體為已經鑑別且與其自然環境之組分分離及/ 或自自然％境之組分回收之抗體。其自然環境之污染組分 為將干擾抗體之診斷或治療性用途之物質，且可包括酶、 激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，將 抗體⑴如藉由洛利（Lowry)方法所測定，純化至大於95重 量。/〇之抗體，且最佳大於99重量％; (2)純化至足以藉由使 用旋杯式定序儀獲得至少15個殘基之义末端或内部胺基酸 序歹j的程度’或（3)使用考馬斯藍（Coomassie blue)或（較佳 地）銀染劑，在還原條件或非還原條件下，由sdspage純 化至均質性。因為抗體自然環境之至少一種組分將不存 在，所以經分離抗體包括原位處於重組細胞内之抗體。然 而，經分離抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。 如本文中所使用，"抗體可變域，，係指包括互補判定區 (CDR ’·亦即’ CDR1、CDR2及CDR3)及構架區（FR)之胺基 酸序列之抗體分子的輕鏈及重鏈之部分。Vh係指重鏈之可 變域。VL係指輕鏈之可變域。根據用於本發明之方法，分 配給CDR及FR之胺基酸位置可根據Kabat(s^uences

Proteins of Immunol〇gicai Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987及 1991))來定義。抗體或抗原 I35639.doc -23 · 200927170 結合片段之胺基酸編號亦係根據Kabat之彼編號。 如本文中所使用，術語"互補判定區（CDR ;亦即， CDR1、CDR2及CDR3)"係指抗體可變域之胺基酸殘基，其 之存在對抗原結合而言為必要的。各可變域通常具有3個 CDR區，其確認為CDR1、CDR2及CDR3。各互補判定區 可包含如藉由Kabat定義之來自”互補判定區”之胺基酸殘 基（亦即，約為輕鏈可變域中之殘基24-34(Ll)、50-56(L2) 及 89-97(L3)及重鏈可變域中之 31·35(Η1)、50-65(H2)及 95-102(H3) ; Kabat等人，Segwewces o/ZVoiez’似 /«ierew，第 5版。Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))及/或來自"高變環”之彼等 殘基（亦即，約為輕鏈可變域中之殘基26-32(Ll)、50-52(L2)及 91-96(L3)及重鏈可變域中之 26-32(Η1)、53-55(H2)及 96-101(H3) ; Chothia及 Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)。在一些情況下，互補判定區可包括來自根 據Kabat定義之CDR區及高變環之胺基酸。舉例而言，抗 體4D5之重鏈之CDRH1包括胺基酸26至35。 "構架區"（在下文為FR)為不同於CDR殘基之彼等可變域 殘基。各可變域通常具有4個FR，其確認為FR1、FR2、 FR3及FR4〇若CDR根據Kabat來定義，貝ij輕鏈FR殘基定位 於約殘基 1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)及 98-107(LCFR4)處，且重鏈FR殘基定位於重鏈殘基中之約 殘基 1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)及 103-113(HCFR4)處。若CDR包含來自高變環之胺基酸殘基，則 135639.doc -24- 200927170 輕鏈FR殘基定位於輕鏈中之約殘基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)及 97-107(LCFR4)處，且重鏈 FR殘基定位於重鏈殘基中之約殘基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)及 102-113(HCFR4)處。在一些 情況下，當CDR包含來自如藉由Kabat定義之CDR與高變 環之胺基酸時，將因此調整FR殘基。舉例而言，當 CDRH1包括胺基酸H26-H35時，重鏈FR1殘基在位置1-25 處且FR2殘基在位置36-49處。 如本文中所使用，"密碼子組"係指一組用以編碼所要變 異體胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。一組寡核苷酸可 (例如）藉由固相合成來合成，其包括表示由密碼子組所提 供之核苷酸三聯體之所有可能組合且將編碼所要胺基酸群 組的序列。密碼子名稱之標準形式為此項技術已知且本文 描述之IUB密碼之彼標準形式。密碼子組通常藉由3個呈斜 體之大寫字母表示，例如、ΧΚΖ、£^尺及其類 似物。因此，如本文中所使用的"非隨機密碼子組"係指編 碼部分滿足、較佳完全滿足如本文所述之胺基酸選擇標準 之選擇胺基酸的密碼子組。在某些位置處具有所選核苷酸 "簡併"之寡核苷酸之合成在此項技術中熟知，例如TRIM 方法（Knappek 等人（1999)·/. Mo/·价 σ/· 296:57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128:103)。具有某些密碼子組之該 等寡核苷酸組可使用商業核酸合成器（可購自（例 如）Applied Biosystems，Foster City, CA)來合成，或可在商 業上獲得（例如’來自 Life Technologies, Rockville，MD)。 135639.doc -25- 200927170 因此，具有特定密碼子組之所合成寡核芽酸組通常將包括 複數個具有不同序列之寡核普酸，該等差異係由整個序列 内之密碼子組建立。如根據本發明使用之寡核芽酸具有允 許與可變域核酸模板雜交且亦可（但未必）包括適用於（例 如）選殖目的之限制性酶位點的序列。 術-抗體片奴纟本文中以最廣泛意義來使用且包括(而 不限於）Fab、Fab，、F(ab,)2、scFv、（scFv)2、dAb及互補判 定區（CDR)片段、線性抗體、單鍵抗體分子、微型抗體、 雙功能抗體及自抗體片段形成之多特異抗體。

Fv片段為含有完全抗原識別及結合位點之抗體片段。 該區由呈緊密締合之一個重鏈及一個輕鏈可變域之二聚體 組成，該締合可在本質上為共價的，例如呈seFv。在該組 態中，各可變域之3個CDR相互作用以界定vH_vL二聚體表 面上之抗原結合位點。總體而言，6個cdr或其子集賦予 抗體以抗原結合特異性。然而，儘管親和力通常比整個結 〇 合位點更低’然即使單一可變域（或僅包含對抗原特異之3 個CDR之Fv的一半）亦具有識別及結合抗原之能力。 ’’Fab”片段含有輕鏈之可變域及恆定域及重鏈之可變域 及第一恨定域（CH1)。F(ab，)2抗體片段包含一對Fab片段， - 其通常藉由其之間的鉸鏈半胱胺酸在其羧基末端附近共價 連接。此項技術中亦已知抗體片段之其他化學偶合。 ”單鏈Fv"或"SCFv"抗體片段包含抗體之VH及VL域，其中 該等域存在於單一多肽鏈中。通常，Fv多肽另外包含VH域 與乂!^域之間的多肽連接子，其使scFv能形成用於抗原結合 135639.doc -26- 200927170 之所要結構。關於scFv之評論參見Pluckthun in 77ze Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第 113 卷，

Rosenburg 及 Moore 編 Springer-Verlag，New York，第 269- 315 頁（1994)。 術語"雙功能抗體"係指具有2個抗原結合位點之小抗體 片段，該等片段包含與同一個多肽鏈（VH及VL)中之輕鏈可 變域（VL)連接之重鏈可變域（VH)。藉由使用太短以致不允 許在同一個鍵上之2個域之間配對的連接子，迫使該等域 與另一鍵之互補域配對且產生2個抗原結合位點。雙功能 抗體更充分地描述於（例如）EP 404,097 ; WO 93/11161 ;及 Hollinger等人（1993)/νσ〇;. iVa"· Jcad. «Sci. USA 90:6444-6448 中。 表達”線性抗體"係指Zapata等人（1995 Proieh 8(10): 1057-1062)中所述之抗體。簡言之，該等抗體包含 一對串聯Fd片段（VH-CH1-VH-CH1)，其連同互補輕鍵多肽 形成一對抗原結合區。線性抗體可為雙特異或單特異性 的。 如本文中所使用，"文庫"係指複數個抗體或抗體片段序 列（例如，本發明之多肽）或編碼該等序列之核酸，該等序 列在根據本發明之方法引入該等序列中之變異體胺基酸之 組合上不同。 ”噬菌體呈現"為使變異多肽以融合蛋白形式呈現於噬菌 體（例如，絲狀噬菌體）粒子表面上之鞘蛋白之至少一部分 的技術。噬菌體呈現之實用性在於以下事實：可就與標靶 135639.doc -27- 200927170 抗原以高親和力結合之彼等序列而言將隨機化蛋白質變異 體之大文庫快速且有效地分選。狀及蛋白質文庫於噬菌體 上之呈現已用於筛選數百萬多肽中具有特異性結合性質 者。多價嗟菌體呈現方法已用於經由與絲狀噬菌體之基因 III或基因VIII之融合體呈現小隨機肽及小蛋白質。评6丨13及

Lowman (1992) Cwrr. Opk.加⑽.βί·〇/. 3:355-362，及其 中引用之參考文獻。在單價噬菌體呈現中，將蛋白質或肽 文庫與基因III或其部分融合，且在野生型基因Ιπ蛋白質存 在下以低量表現以便噬菌體粒子呈現融合蛋白之一個複本 或不呈現融合蛋白。相對於多價噬菌體而言，親和力效應 降低以致分選係基於固有配位體親和力，且使用使DNA操 作簡單化之嗟菌體質粒載體。Lowman及Wells (1991)

Methods: A companion to Methods in Enzymology 3：205-0216。 么鹵體質粒"為具有例如C ο 1E 1之細菌複製起點及喧菌 體之基因間隔區之複本的質粒載體。噬菌體質粒可用於任 何已知噬菌體’包括絲狀噬菌體及人字形噬菌體。質粒通 常亦應含有用於抗生素抗性之可選擇標記。選殖於該等载 體中之DNA區段可以質粒形式繁殖。當持有該等載體之細 胞具有所有產生噬菌體粒子所必需之基因時，質粒之複製 模式改變為滚環式複製（rolling circle replicati〇n)以產生質 粒DNA之一個鏈之複本且封裝噬菌體粒子。噬菌體質粒可 形成感染性或非感染性噬菌體粒子。該術語包括含有噬菌 體鞘蛋白基因或其片段之噬菌體質粒，該基因或其片段與 135639.doc •28- 200927170 異源多肽基因以基因融合體形式連接以便該異源多肽呈現 於噬菌體粒子表面上。 術語••噬菌體載體”意謂含有異源基因且能夠複製之噬菌 體之雙鏈複製形式。噬菌體載體具有允許噬菌體複製及噬 菌體粒子形成之噬菌體複製起點。噬菌體較佳為絲狀噬菌 體，諸如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物；或人字形 嗟卤體，诸如 λ、21、phi80、phi81、82、424、434 等戈其 衍生物。 〇 如本文中所使用，”溶劑可達位置"係指源抗體或抗原結 合片段之重鏈及輕鏈之可變區中的胺基酸殘基之位置，其 係基於抗體或抗原結合片段之結構、結構之整體及/或模 型化結構確定為潛在地可與溶劑接近及/或與諸如抗體特 異性抗原之分子接觸。該等位置通常可見於CDR中及蛋白 質外部上。如本文中所定義，抗體或抗原結合片段之溶劑 可達位置可使用此項技術中已知之許多算法中之任何算法 Φ 來確疋。較佳地，溶劑可達位置係使用來自抗體之3維模 型之座標，較佳使用諸如Insightn程式（Access， Diego, CA)之電腦程式來確定。溶劑可達位置亦可使用此 • 項技術令已知之算法確定（例如，Lee&Richards (197〗）乂

Mol. Biol. 55, 379^ Connolly (1983) Appl Cryst ^ 548)。溶劑可達位置之確定可使用適於蛋白質模型化之軟 體及自抗體獲得之3維結構資訊來執行。出於該等目的可 利用之軟體包括SYBYL Biopolymer軟體㈣〇s A瓢iates)。通常且較佳地，在算法（程式）需要㈣者輸 135639.doc -29- 200927170 入尺寸參數時，計算中所使用之探針之"尺寸"設定為半徑 約1.4埃或更小。另外，溶劑可達區域之確定及使用個人 電腦軟體之面積法已藉由Paci〇s (1994) ㈤ 18(4): 377-386描述。 實施方式 • 補體在身體㈣中起關鍵仙，且連同免疫㈣之其他 • 組分一起保護個體避免病原體侵入身體。然而，若不適當 活化或控制’補體亦可引起對宿主組織之損傷。補體之不 當活化涉及各種疾病之發病機理，該等疾病稱為補體相關 疾病或病症，諸如免疫複合疾病及自體免疫疾病，及各種 發炎病狀，包括補體介導發炎組織損傷。補體相關疾病之 病理會變化，且可涉及歷時長或短時期之補體活化，完整 級聯、級聯之僅一者（例如經典或替代路徑）、級聯之僅一 些組分之活化，等等。在一些疾病中，補體片段之補體生 物學活性會造成組織損傷及疾病。因此，補體之抑制劑具 φ 有高治療潛力。因為病原體及其他生物體經由經典路徑自 血液之清除將保持完整，所以替代路徑之選擇性抑制劑將 尤其適用。 本發明之因子B拮抗劑適用於預防及治療補體相關眼睛 . 病狀（所有病理涉及補體的眼睛病狀及疾病，包括經典及 替代路徑’且尤其為補體之替代路徑）’諸如黃斑退化性 疾病’諸如年齡相關黃斑退化（AMD)之所有階段，包括乾 性及濕性（非滲出性及滲出性）形式；脈絡膜新血管生成 (CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網 135639.doc 200927170 膜病變、内眼炎；及其他眼内新生血管性疾病，諸如糖尿 病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯_林道疾病、眼睛之 組織漿菌病、中心視網膜靜脈阻塞（Crv〇)、角膜新血管 生成及視網膜新血管生成。補體相關眼睛病狀之較佳群組 包括年齡相關黃斑退化（AMD)，包括非滲出性（濕性）及滲 出性（乾性或萎縮性）AMD、脈絡膜新血管生成（CNV)、糖 尿病性視網膜病變（DR)及内眼炎. AMD為黃斑之年齡相關退化，其為超過6〇歲之個體中之 不可逆視覺功能障礙的主要原因。存在2種類型iAMD， 非滲出性（乾性）及滲出性（濕性）AMD。乾性或非滲出性形 式涉及下伏於中心視網膜（黃斑）之視網臈色素上皮細胞 (RPE)中之萎縮性及肥厚性改變以及RpE上之沈積物（脈絡 膜小疣）。具有非滲出性AMD之患者可進展至AMD之濕性 或參出性形式’其中稱為脈絡膜新生血管薄膜（CNVM)之 異常血管在視網膜下發育，漏出液體及血液，且最終引起 視網膜中及下之致盲盤狀疤痕。通常為滲出性AMD之前驅 物之非滲出性AMD更為普通。非滲出性AMD之表現有變 化；可存在硬脈絡膜小疣、軟脈絡膜小疣、RpE地圖狀萎 縮及色素叢生。在AMD早期，補體組分沈積於RpE上且為 脈絡膜小疲之主要成分。 本發明具體而言係關於治療AMD，包括第3類及第4類 AMD第3類AMD之特徵為在2隻眼睛中沒有脈絡膜新血 管生成，至少一隻眼睛具有2〇/32或更好之視覺銳度並 具有至少一個大晶簇（例如〗25 pm)、廣泛（如藉由脈絡膜小 135639.doc •31 · 200927170 疲面積所量測）中等脈絡膜小疣或不涉及黃斑中心之地圖 狀萎縮（GA) ’或該等者之任何組合。第3類amD(仍視為 ”乾性"AMD)具有轉化成脈絡膜新血管生成（CNV)或地圖狀 萎縮（GA)之高風險。 第4類高風險乾性aMD可分為2類。1.人眼具有CNV。2. 人眼不具有CNV。第一種類獨立於任何病理且若人眼具有 CNV ’則自動預設為高風險乾性amd ^在第二種類中，病 理之特徵為長滿的大脈絡膜小疣及視網膜色素上皮（RpE) 之斑紋。第4類高風險濕性AMD係藉由CNV之存在來確 §忍°在所有第4類患者中，視覺銳度為2〇/32或更差。通 常’若未經治療，則第一類高風險乾性AMd以比第3類（非 高風險）AMD之進程速率高約1〇·3〇倍之速率快速進展成脈 絡膜新金管生成（CNV)。 因子B拮抗劑特定而言適用於預防AMD(尤其，第3類或 第4類AMD)向CNV之進程，及/或預防在未受影響或受較 小影響之人眼中AMD或CNV之發展/進程及/或具有GA之區 域之進程速率。在該情況下，術語"預防"以最廣泛意義使 用以包括完全或部分阻斷及減慢疾病進程以及延遲疾病之 更嚴重形式之發作。冒有發展或進展為高風險（第4 類）AMD或CNV之高風險患者尤其受益於本發明之該態 樣0 抗因子B抗親 本文中之本發明包括抗因子B抗體之產生及用途。用於 產生抗體之示範性方法更詳細地描述於以下部分中。 135639.doc -32- 200927170 抗因子B抗體使用來源於哺乳動物物種之因子b抗原來 選擇。較佳地，抗原為人類因子B。然而，來自其他物種 之因子B’ §#如鼠因子B亦可用作標把抗原。來自各種哺 乳動物物種之因子B抗原可自天然來源分離。在其他實施 例中，抗原係重組產生或使用此項技術中已知之其他合成 方法來製得。 所選抗體將通常具有對因子B抗原之充分強的結合親和 力。舉例而言，抗體可以不超過約5 nM，較佳不超過約2 ® nM且更佳不超過約500 PM之Kd值結合人類因子b。抗體親 和力可藉由（例如）基於表面電漿共振之檢定（諸如，如實例 中所述之BIAcore檢定）；酶聯結免疫吸附檢定（EUSA); 及競爭檢定（例如RIA's)來測定。 同樣’抗體可經受其他生物活性檢定（例如）以評估其作 為治療劑之有效性。該等檢定在此項技術中已知且視標纪 抗原而定且欲用於抗體。實例包括HUVEC抑制檢定（如下 。文實例中所述），腔瘤細胞生長抑制檢定（例如，如W 〇 89/06692中所述）；抗體依賴性細胞毒性（ADCC)及補體介 導細胞毒性（CDC)檢定（美國專利5,500,362);及下文對鑑 別因子B拮抗劑所述之活體外及活體内檢定。 為篩選與所關注抗原上之特定抗原決定基結合之抗體， 可執行常規交叉阻斷檢定，諸如j

Cold Spring Harbor Laboratory，Harl〇w&David

Lane編（1988)中所述之彼檢定。或者，可執行（例如）如

Champe 等人（1995)1 Bb/. C/zew· 270:1388-1394 中所述之 135639.doc •33· 200927170 抗原決定基映射以判定抗體是否結合所關注之抗原決定 基。 在一較佳實施例中，使用獨特噬菌體呈現方法來選擇抗 因子B抗體。該方法涉及基於單一構架模板產生合成抗體 噬菌體文庫，設計可變域内之足夠多樣性，呈現具有多樣 ' 化可變域之多肽，選擇對標靶因子B抗原具有高親和力之 • 候選抗體，及分離所選抗體。 噬菌體呈現方法之細節可見於（例如）2003年12月11日公 ❹ 開之WO 03/102157中。 在一態樣中，抗體文庫可藉由突變抗體可變域中之至少 一個CDR中之溶劑可達位置及/或高度不同之位置來產 生。一些或所有CDR可使用本文中提供之方法突變。在一 些實施例中，可較佳藉由突變CDRH1、CDRH2及CDRH3 中之位置以形成單一文庫或藉由突變CDRL3及CDRH3中之 位置以形成單一文庫或藉由突變CDRL3及CDRH1、 _ CDRH2及CDRH3申之位置以形成單一文庫來產生不同抗 體文庫。 可產生抗體可變域之文庫，（例如），其在CDRH1、 • CDRH2及CDRH3之溶劑可達位置及/或高度不同之位置中 具有突變。可產生另一在CDRL1、CDRL2及CDRL3中具有 突變的文庫。該等文庫亦可連同彼此一起使用以產生具有 所要親和力之結合物（binder)。舉例而言，在就與標把抗 原之結合而言進行一或多輪之重鏈文庫選擇後，輕鏈文庫 可再放入重鏈結合物之群體中用於其他輪之選擇以增加結 135639.doc -34- 200927170 合物之親和力。 較佳地，藉由用變異體胺基酸在重鏈可變區序列之 CDRH3區中取代原始胺基酸來產生文庫。所得文庫可含有 複數個抗體序列’其中序列多樣性主要在重鏈序列之 CDRH3區中。 在一態樣中’在人化抗體4D5序列或人化抗體4D5序列 之構架胺基酸之序列的情況下產生文庫。較佳地，藉由用 由DF尺密碼子組所編碼之胺基酸取代重鏈之至少殘基95_ 100a來產生文庫’其中密碼子組用以編碼每一該等位 置之一組變異體胺基酸。適用於產生該等取代之寡核苦酸 組之實例包含序列。在一些實施例中，藉由用由 尺及iWViC密碼子組所編碼之胺基酸取代殘基95_1〇〇a來產 生文庫。適用於產生該等取代之寡核苷酸組之實例包含序 列（i)KAr)6 。在另一實施例中，藉由用由及八η#尺 密碼子組所編碼之胺基酸取代至少殘基95-1 〇〇a來產生文 庫。適用於產生該等取代之寡核苷酸組之實例包含序列 (£>Π)5 (WA：)。適用於產生該等取代之寡核苷酸組之另一 實例包含序列（iVW尺)6。適合寡核芽酸序列之其他實例可藉 由熟習此項技術者’根據本文中所述之標準來確定。 在另一實施例中’利用不同CDRH3設計以分離高親和力 結合物且分離用於各種抗原決定基之結合物。該文庫中所 產生之CDRH3之長度範圍為丨丨至^個胺基酸，儘管亦可產 生不同於其之長度。H3多樣性以及在N&/*c末端處之更 有限多樣性可藉由使用、DF尺及iVT尺密碼子組擴展。 135639.doc -35· 200927170 多樣性亦可在CDRH1及CDRH2中產生。CDR-H1及H2多 樣性之設計遵循靶向如所述之模擬天然抗體譜之策略，其 中修改集中於比上述設計更緊密匹配天然多樣性之多樣 性。 對CDRH3中之多樣性而言，可用不同長度之h3分別建 構多個文庫且隨後將其組合以選擇標靶抗原之結合物。多 個文庫可經彙集且使用如先前及下文中所述之固體支撐選 擇及溶液分選方法來分豸。可冑用多冑分選策略。舉例而 S，一種變化涉及在與固體結合之標把上進行分選，接著 分選可存在於融合多肽上之標記（例如，抗gD標記）且接著 在與固體結合之標靶上進行另一分選。或者，文庫可首先 在與固體表面結合之標靶上分選，隨後使用液相結合，以 降低濃度之標靶抗原來分選所溶離結合物。利用不同分選 方法之組合最小化僅高度表現序列之選擇且提供許多不同 高親和力純系之選擇。 標靶因子B抗原之高親和力結合物可自文庫分離。 H1/H2區中之有限多樣性降低簡併約1〇4至1〇5·倍且允許對 更咼親和力結合物提供更多H3多樣性。利用具有不同類型 之CDRH3多樣性之文庫（例如利用乃^或提供可與標 把抗原之不同抗原決定基結合之結合物的分離。 在另一實施例中，產生具有CDRH1、CDRH2及CDRH3 區之多樣性之文庫。在該實施例中，使用各種長度之扣區 及主要使用密碼子組义1^及或ATO1來產生CDRH3之多 樣性。文庫可使用個別寡核苷酸形成且經彙集，或可將募 135639.doc -36· 200927170 核苷酸彙集以形成文庫之子集。該實施例之文庫可針對與 固體結合之標靶來分選。可使用ELIS A檢定篩選自多次分 選分離之純系之特異性及親和力。就特異性而言，可針對 所要標靶抗原以及其他非標靶抗原篩選純系。可隨後在溶 液結合競爭ELISA檢定或斑點競爭檢定中，篩選標靶NRP1 抗原之彼等結合物之親和力。可利用如上所述製備之zrz -密碼子組，自文庫分離高親和力結合物。該等結合物可易 於作為抗體或抗原結合片段，以高產率在細胞培養物中產 〇 生。 在一些實施例中，在CDRH3區之長度上產生具有更大多 樣性之文庫可為理想的。舉例而言，用在約7至19個胺基 酸範圍内之CDRH3區產生文庫可為理想的。 自該等實施例之文庫所分離之高親和力結合物易於在細 菌及真核細胞培養物中以高產率產生。可設計載體以容易 地移除諸如gD標記、病毒鞘蛋《白組分序列之序列，及/或 π 增加恆定區序列從而以高產率產生全長抗體或抗原結合片 段。 可將在CDRH3中具有突變之文庫與含有其他CDR(例如 CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1 及/或 CDRH2)之變異體 . 型式之文庫組合。因此，舉例而言，在一實施例中， CDRH3文庫與CDRL3文庫組合，該CDRL3文庫係使用預定 密碼子組，在具有位置28、29、30、31及/或32處之變異 體胺基酸之人化4D5抗體序列的情況下產生。在另一實施 例中，可將具有CDRH3之突變之文庫與包含變異體 135639.doc -37- 200927170 CDRH1及/或CDRH2重鏈可變域之文庫組合。在一實施例 中，CDRH1文庫用在位置2δ、3〇、Μ、32及33處具有變異 體胺基酸之人化抗體4D5序列來產生。CDRH2文庫可使用 預定密碼子組’用在位置50、52、53、54、56及58處具有 變異體胺基酸之人化抗體4D5之序列來產生。 自嗤菌體文庫產生之抗因子B抗體可經進一步修都以產 生具有超過母體抗體之改良物理、化學及/或生物學性質 之抗體犬變體。在所用檢定為生物活性檢定時，抗體突變 體較佳在特別檢定中具有比在彼檢定中之母體抗體之生物 活性好至少約1 0倍、較佳好至少約2〇倍、更佳好至少約5〇 倍且有時好至少約1 〇〇倍或200倍的生物活性。舉例而言， 抗因子B抗體突變體對NRP具有的結合親和力較佳比母體 抗因子B抗體（諸如’圖5中所示之任何抗體且尤其抗體 20D 12)之結合親和力強至少約丨〇倍、較佳強至少約2〇倍、 更佳強至少約50倍且有時強至少約1〇〇倍或2〇〇倍。 為產生抗體突變體，將一或多個胺基酸改變（例如取代） 引入母體抗體之一或多個高變區中。或者或另外，構架區 殘基之一或多個改變（例如取代）可引入母體抗體中，其中 該等改變可產生抗體突變體對來自第二哺乳動物物種之抗 原之結合親和力的改良。欲修飾之構架區殘基之實例包括 直接非共價結合抗原之彼等殘基（Amit等人（1 23 3:747-753);與CDR之構形相互作用/影響cdr之構形之 彼等殘基（Chothia 等人（1987)«/. 196:901-917); 及/或參與VL-VH介面之彼等殘基（Ερ 239 4〇〇βι)。在某些 135639.doc •38- 200927170 實施例中，修飾該等—或多個構架區殘基可產生抗體對來 =第二哺乳動物物種之抗原之結合親和力的增強。舉例而 a，約1至約5個構架殘基可在本發明之該實施财得以改 變有時，其可足以產生適用於臨床前試驗之抗體突變 體，甚至在高變區殘基，-個都沒有改變時亦會如此。然 而通常，抗體突變體將包含其他高變區改變。 所改變之高變區殘基可隨機改變，尤其在母體抗體之起 始結合親和力係如此以致該隨機產生之抗體突變體可易於 篩選的情況下。 一種適用於產生該等抗體突變體之程序稱為"丙胺酸掃 描突變"（Cunningham and Wells (1989) 244:1081- 1085)。在此’ 一或多個高變區殘基係藉由丙胺酸或多丙 胺酸殘基置換以影響胺基酸與來自第二哺乳動物物種之抗 原之相互作用。隨後，藉由在取代位點處或為取代位點引 入其他突變以改進彼等顯示對取代具有功能敏感性之高變 區殘基。因此，雖然已預先確定用於引入胺基酸序列變異 之位點’但是突變之性質本身不必預先確定。如本文中所 述’篩選由該方式產生之ala突變體之生物活性。 通常’以諸如下文在"較佳取代”標題下所示之彼等取代 之保守取代開始。若該等取代造成生物活性（例如結合親 和力）變化’則引入更多實質性改變（下表中命名為”示範性 取代”，或如下文關於胺基酸類別進一步所述），且篩選產 物。較佳取代列於下表中。 135639.doc -39- 200927170 原始殘基 示範性取代 較佳取代 Ala (A) val; leu; ile val Arg(R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; lys; arg gin Asp (D) glu glu Cys(C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly(G) pro; ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg He (I) leu; val; met; ala; phe;正白胺酸 leu Leu (L) 正白胺酸；ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser(S) thr thr Thr(T) ser ser Trp(W) tyr; phe tyr Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala;正白胺酸 leu

抗體生物學性質之甚至更實質修飾係藉由選擇在其對維 持（a)在取代區之多肽主鏈結構，例如作為片狀或螺旋構 形，（b)標靶位點處之分子電荷或疏水性，或（c)側鏈大小 的影響方面顯著不同之取代來完成。可基於共有側鏈性質 將天然存在之殘基分組： (1) 疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性：cys、ser、thr、asn、gin ; (3) 酸性：asp、glu ; (4) 驗性：his、lys、arg ; (5) 影響鏈定向之殘基：gly、pro ;及 (6) 芳族：trp、tyr、phe。 非保守性取代將必然使一個該等類別中之成員換成另一 類別。 135639.doc • 40· 200927170 在另一實施例中，用於你 來親和力成熟化(參見上文)' 點使用喧菌體呈現 編碼胺基酸序列突變體之核酸分子係藉由此項技術中已 :之各種方法製備。該等方法包括(但不限於)母體抗體之 =製備f或非突變雜型式之寡料酸介導（或定點） PC“變及切突變。用於製造突變體之較佳方法 為定點突變（參見（例如）’ Kunkel (1985)祕“

Sci. USA 82:488) 〇 ❹

在某些實施例中，抗體突變體將僅具有經取代之單一高 變區殘基。在其他實施例中，母體抗體之兩個或兩個以上 高變區殘基已經取代，例如約2至約1〇個高變區取代。 通常’具有改良生物學性質之抗體突變體具有的胺基酸 序列具有與母體抗體之重鏈或輕鏈可變域之胺基酸序列至 少75%的胺基酸序列一致性或相似性，更佳至少8〇%，更 佳至少85%，更佳至少90%且最佳至少95%的胺基酸序列 一致性或相似性。本發明對該序列之一致性或相似性之定 義為，候選序列與母體抗體經比對及為達到最大序列一致 性百分比引入間隙（若有必要）後，所得之殘基一致（亦即， 相同殘基）或相似（亦即，來自基於共有側鏈性質之相同群 組之胺基酸殘基，參見上文）之胺基酸殘基的百分比。可 變域外之抗體序列中之N末端、C末端或内部延伸、刪除 或插入均不應解釋為影響序列一致性或相似性。 產生抗體突變體後，測定彼分子相對於母體抗體之生物 活性。如上所述，其係涉及測定抗體之結合親和力及/或 135639.doc 41 200927170 其他生物學活性。在本發明之—較佳實施例中，製備一粗 抗體突變體並筛選其對諸如刪或其片段之抗原之結合 親和力。€自該初始篩選之一或多個抗體突變體視需要可 經受一或多個其他生物活性敎以確認具有增強結合親和 力之抗體突變體實際上適用於（例如）臨床前研究。

❹ 因此所選出之抗體突變體可經受進—步修飾，其常常視 抗體之所欲用途而定。該等修飾可涉及胺基酸序列之進— 步改變、與異源多肽之融合及/或諸如下文闡述之彼等修 飾之共價修飾1於胺基酸序列改變，示範性修飾閣述於 上文中。舉例而言，通常亦可用絲胺酸取代不涉及維持抗 體突變體之適當構形之任何半胱胺酸殘基，以改良分子之 氧化穩定性及防止異常交聯。反之，可將半胱胺酸鍵加入 至抗體中以改良其穩定性（尤其在抗體為諸如Fv片段之抗 體片段時如此另一類型之胺基酸突變體具有經改變糖 基化模式，其可藉由刪除發現於抗體中之一或多個碳水化 合物部分、及/或插入抗體中不存在之一或多個糖基化位 點來實現。抗體之糖基化通常為]^連接或〇連接的連接 係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之侧鏈鍵接。三肽序 列天冬醯胺-Χ_絲胺酸及天冬醯胺_Χ_蘇胺酸（其中χ為除脯 胺酸外之任何胺基酸）為用於碳水化合物部分與天冬醯胺 側鏈之酶促連接之識別序列β因此，多肽中任一該等三狀 序列之存在會產生潛在之糖基化位點。〇連接糖基化係指 糖Ν-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖之一與羥基胺基酸之 鍵接，儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5_羥基離胺酸，但最 135639.doc • 42- 200927170 通常為絲胺酸或蘇胺酸。將糖基化位置點加至抗體中可方 便地藉由改變胺基酸序列來完成，如此該抗體即含有一或 多個上述之三肽序列（對於N連接糖基化位點而言）。亦可 藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基插入至或取代原始抗 體之序列來進行改變（對於0連接糖基化位點而言）。 本發明之抗因子B抗體可使用容易獲得之技術及材料重 組製備。 以抗因子8抗體之重組製備而言，係分離出編碼該抗因 子B抗體之核酸並插入至可複製載體中，以進一步選殖（擴 增DNA)或用於表現。使用習知程序（例如，藉由使用能夠 特異性結合編碼抗體之重鏈及輕鏈之DNA的寡核苷酸探 針）輕易地分離或合成編碼抗體之DNA。許多载體係可採 用的。載體組份通常包括（但不限於）以下一或多者：信號 序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、啟動 子及轉錄終止序列。 (i)信號序列組分 本發明之抗體不僅可直接重組產生，而且可作為具有異 源多肽之融合多肽產生，其較佳為信號序列或在成熟蛋白 或多肽之N末端處具有特異性分裂位點之其他多肽。所選 擇之異源信號序列較佳為藉由宿主細胞識別及處理（亦即 藉由信號肽酶分裂）之信號序列。對於不識別且處理天然 抗體信號序列之原核宿主細胞而言，信號序列經（例如）選 自驗性鱗酸酶、青黴素酶（penieilHnase)、Ipp或熱穩定腸 毒素II引導子之群的原核信號序列取代。對酵母分泌而 135639.doc •43- 200927170 言，天然信號序列可經（例如）酵母轉化酶引導子、α因子 引導子（包括酵母及刻魯維拉菌 因子引導子），或酸性磷酸酶引導子、白 色念珠菌（C. α/δία似）葡糖澱粉酶引導子或w〇 9〇/13646 中所述之信號取代。在哺乳動物細胞表現中，哺乳動物信 號序列以及病毒分泌引導子（例如，單純性疱疹gD信號）為

• 可用的。該前驅區之DNA在閱讀框架中與編碼抗體之DNA 接合。 ® (ii)複製起點組分 表現載體與選殖載體兩者皆含有使載體能在一或多個所 選宿主細胞中複製之核酸序列。通常，在選殖載體内，該 序列為使載體能獨立於宿主染色體DNA複製之序列，且包 括複製起點或自主複製序列。熟知各種細菌、酵母及病毒 之該等序列。來自質粒pBR322之複製起點適於大多數革 蘭氏陰性細菌（Gram-negative bacteda)，2 μ質粒起點適於 〇 酵母，且各種病毒起點（s、多形瘤、腺病毒、vsv或 BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。通常，哺乳動物 表現載體不需要複製起點組分（通常可使用SV4〇起點，僅 ' 因為其含有早期啟動子）。 (iii)選擇基因組分 表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選擇標記。 典型選擇基因編碼如下蛋白質：⑷賦予對抗生素或其他毒 素（例如安比西林（amPieiUin)、新黴素（neomyCin)、甲胺喋 吟（meth〇treXate)或四環素（tetracycline))之抵抗力，㈨補 135639.doc -44- 200927170 充營養缺陷性缺乏或（c)供應不可自複合培養基中得到之關 鍵營養，例如桿菌之編碼D_丙胺酸消旋酶之基 因。 選擇流程之一實例利用藥物使宿主細胞之生長停滞。經 異源基因成功轉形之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白質且 因此在選擇方案中存活。該顯性選擇之實例使用藥物新黴 素、徽盼酸及濕徽素（hygr〇mycin)。 適用於哺乳動物細胞之可選擇標記之另一實例為使得能 夠鑑別有能力吸收抗體核酸之細胞的可選擇標記，諸如 DHFR胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及_Π(較佳為靈長類動物 金屬硫蛋白基因）、腺苷脫胺酶、烏胺酸脫羧酶等。 舉例而s，首先藉由在含有甲胺喋呤（Mtx)(DHFR之競 爭性拮抗劑）之培養基中培養所有轉形體來鑑別經〇111711選 擇基因轉形之細胞。當使用野生型DHFR時，適當宿主細 胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞系。 〇 或者，可藉由在含有可選擇標記之選擇劑（諸如胺基糖 苷抗生素，例如康黴素（kanamycin)、新黴素或G418)的培 養基中細胞生長來選擇經編碼抗體之DNA序列、野生型 . 〇111711蛋白及另一可選擇標記（諸如胺基糖苷3，-磷酸轉移酶 * (APH))轉形或共轉形之宿主細胞（尤其為含有内源DHFR之 野生型宿主）》參見美國專利第4,965，199號。 適用於酵母之選擇基因為存在於酵母質粒YRp7中之i 基因（Stinchcomb 等人（1979)Λ^«μ 282:39)。π〆基因提供 (例如）用於缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母突變株之選 135639.doc -45- 200927170

擇標記，ATCC No. 44076或 PEP4-1. jones (1977) GweiW 85:12。酵母宿主細胞基因組中之（^7?1損害之存在隨後提供 用於藉由在缺乏色胺酸之情況下生長來偵測轉形之有效環 境。相似地，缺乏/^«2酵母菌株（八丁(^ 20,622或38,626)藉 由帶有£ew2基因之已知質粒來補充。 另外，來源於1.6 μπι環形質粒pKDl之載體可用於刻魯維 拉菌酵母之轉形。或者，已報導乳酸刻魯維拉菌（尺 hNb)之用於大規模產生重組小牛凝乳酶之表現系統。Van ❹ den Berg (1990)价8:135。亦已揭示用於藉由 刻魯維拉菌之工業菌株來分泌成熟重組人血清白蛋白之穩 定多複本表現載體。Fleer等人（1991)扪 9:968-975 ° (iv)啟動子組分 表現及選殖載體通常含有藉由宿主生物體識別且可操作 連接於抗體核酸之啟動子《適用於原核宿主之啟動子包括 Q 啟動子、P-内醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸 酶、色胺酸（trp)啟動子系統及雜交啟動子，諸如tac啟動 子。然而，其他已知細菌啟動子為適合的。用於細菌系統 之啟動子亦將含有可操作連接於編碼抗體之DNA的shine_ - Dalgarno(S.D.)序列。 已知用於真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因 均具有位於引發轉錄之位點上游大致25至30個鹼基處之AT 田集區。可見於許多基因之轉錄起始處上游7〇至個鹼基 處的另一序列為CNCAAT區，其中1^可為任何核苷酸。大 I35639.doc • 46· 200927170 多數真核基因之3,端處為AATAAA序列，該序列可為用於 向編碼序列之3,末端插入p〇ly A尾之信號》所有該等序列 均適當地插入真核表現載體中。 適於與酵母宿主一起使用的啟動序列之實例包括3-碟酸 甘油酸激酶或其他糖解酶之啟動子，諸如烯醇酶 '甘油 醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激 酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3_磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸 ❹ ❹ 激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶及葡糖激酶。 作為具有藉由生長條件所控制之額外轉錄優點之可誘導 啟動子的其他酵母啟動子為用於以下各物之啟動子區··醇 脫氫酶2、異細胞色素c、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之降 解酶、金屬硫蛋白、甘油醛_3_磷酸脫氫酶及負責麥芽糖與 半乳糖利用之酶。適用於酵母表現之適合载體及啟動子另 外描述於EP 73,657中。酵母增強子亦有利地與酵母啟動子 一起使用。 自哺乳動物宿主細胞中之載體抗體轉錄係藉由獲自(例 如)以下物質之啟動子控制：諸如多形瘤病毒、禽痘病 毒、腺病毒（諸如腺病毒2)、牛乳頭㈣病毒、禽肉瘤病 ^ 大病毒、逆轉錄病毒、肝炎B病毒且最佳猿病 4〇(SV40)之病毒的基因組、異源哺乳動物啟動子 如’肌動蛋白啟動子或免疫球 1 ^ 丈坏贪白啟動子）、熱休克啟動 子，其限制條件為該等啟動 初十·）興宿主細胞系統相容。 可便利地獲得SV4G病毒之早期及晚期啟動子，其為亦 含有SV40病毒複劁知、.'、亦 複製起點之SV4〇限制片段。可便利地獲得 135639.doc •47· 200927170 人類細胞巨大病毒之立即早期啟動子，其為服E限制 片段。使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表 現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。該系統之 修改描述於美國專利第4,6〇1，978號中。關於在來自單純性 . €疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下，在小鼠細胞中表現人 類β干擾素cDNA亦可參見Reyes等人（1982)Λπ 297:598- 601或者，勞斯肉瘤病毒（rous sarcoma virus)長末端重複 序列可用作啟動子。 ® (v)增強子元件組分 藉由高級真核生物轉錄編碼本發明抗體之DNA常常藉由 將增強子序列插入載體中來增加。現已知許多來自哺乳動 物基因（血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、心胎蛋白及胰 島素）之增強子序列。然而通常’熟習此項技術者將使用 來自真核細胞病毒之增強子。實例包括複製起點（bp 1〇〇_ 27〇)後側上之SV40增強子、細胞巨大病毒早期啟動子增強 ❹ 子、複製起點後側上之多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。 關於用於活化真核啟動子之增強元件亦參見Yaniv，⑺ 297:17·18 (1982)。增強子可在抗體編碼序列之位置5'或3’ • 處剪接至載體中，但較佳地位於啟動子之5'位點。 • (vi)轉錄終止組分 用於真核宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、 人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞）之表現載體亦 將含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。該等序列通 常可來源於真核或病毒DNA或cDNA之5,非轉譯區且偶而3' 13 5639.doc •48- 200927170 非轉譯區。該等非轉譯區含有轉錄為編碼抗體之mRNA之 非轉δ睪部分中的聚腺苷酸化片段之核苷酸區段。一種適用 之轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見W〇 94/11026及其中揭示之表現載體。 (vii)宿主細胞之選擇及轉形 用於在本文中之載體中選殖或表現DNA之適合宿主細胞 為上文所述之原核生物、酵母或高級真核生物細胞。適於 該目的之原核生物包括真細菌（eubaeteria)，諸如革蘭氏陰 性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏桿菌屬（仏例 如’大腸桿菌）、腸桿菌屬、伊文氏桿菌屬 、克雷伯氏桿菌屬（尺、變形桿菌屬 (以0~心）、沙門氏菌屬（Sa/mo«e//a)(例如鼠傷寒沙氏桿菌 、沙雷氏菌屬例如黏 質沙雷氏菌（SerraWci warcesca”·?)）及志賀桿菌屬，以及桿

菌（諸如枯草桿菌（β.心⑽及地衣桿菌（B ，例如，揭示於1989年4月12日公開之DD 266,710中之地衣桿菌41P)，假單胞菌屬（諸如綠膿桿菌（p 及鏈徽菌屬（57repiow^；ceiS)。儘管諸如大腸桿 菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31，537)及大腸桿菌 W3110(ATCC 27,325)之其他菌株為合適的，但是一較佳大 腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294(ATCC 31，446)。該等實例 為說明性的而非限制性的。 除原核生物外’諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為用 135639.doc •49- 200927170 於編碼抗體之載體之適合選殖或表現宿主。釀酒酵母 («Sacc/mrowyces cerevzWae)或普通麵包酵母在低級真核宿 主微生物中最常用。然而，許多其他屬、種及菌株通常可 用且適用於冬文，諸如粟酒裂殖酵母（Schizosacc/iaromyces ;刻魯維拉菌宿主，諸如乳酸刻魯維拉菌、脆壁刻 • 魯維拉菌（[/rag"以)(ATCC 12,424)、保加利亞刻魯維拉 • 菌（尺.6w/garicw5)(ATCC 16,045)、威克海姆刻魯維拉菌（尺· wickeramii){KlCC 24,178)、瓦爾特克刻魯維拉菌（尺· © waltii){ATCC 56,500)、多斯菲拉刻魯維拉菌（/：. drosophilarum)(ATCC 3 6,906)、耐溫亥!I 魯維拉菌（欠· 及馬克斯刻魯維拉菌（AT. warxi'izwws);耶羅 維亞酵母（：yarroiWfl)(EP 402,226);巴斯德畢赤氏酵母 (户/c/z/a /7β·5ίοη··5)(ΕΡ 183,070);念珠菌屬（Ca«山·£/〇〇 ;里氏 木敷{Trichoderma reesia){EV 244,234);粗链脈抱菌 (iVewrowora craiia);許旺酵母屬（《Sc/zwcmwz’om少ces)，諸如 ^ 許旺酵母occWewia/i’iS);及絲狀真菌，諸 ❹ 如紅黴屬（A^wro«s/?c»ra)、青黴菌屬、彎頸黴 (Γο/γροα/β山‘ww)及麴菌屬宿主，諸如構巢麯黴 • (A. nididans)反黑趣徽（A. niger)。 . 適用於表現糖基化抗體之宿主細胞來源於多細胞生物 體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別 出許多來自諸如草地黏蟲(毛蟲）、 埃及伊蚊（ZWei aeg_yp")(蚊子）、白紋伊蚊（deda α/60/^ciws)(蚊子）、黑腹果繩（Drosop/n7fl me/awogaWer)(果 135639.doc -50- 200927170 繩）及家蠶moW)之宿主之桿狀病毒株及變異體及 相應允許之昆蟲宿主細胞。用於轉染之各種病毒株可公開 獲付’例如加州蒼请夜蛾 NPV)之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且該等病毒 可根據本發明用作本文中之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲 細胞。棉花、玉米、馬鈐薯、大豆、矮牵牛、番茄及煙草 之植物細胞培養物亦可用作宿主。 然而，已極大地關注脊椎動物細胞，且脊椎動物細胞在 培養物（組織培養物）中之繁殖已變成常規程序。適用哺乳 動物宿主細胞系之實例為由SV40所轉形之猴腎CV1系 (COS-7，ATCC CRL 1651);人類胚腎系（經次選殖用於在 懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人（1977) 乂 KzW. 36:59);嬰兒倉鼠腎細胞（BHK ATCC CCL 10); 中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人（1980)/Voc. ί/α 77:4216);小鼠赛托利（sertoli)細胞 (TM4，Mather (1980) Bzo/·及叩广❼汰 23:243-251);猴腎細 胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76， ATCC CRL-15 87);人類宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛大鼠肝細胞 (BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤 (MMT 060562，ATCC CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等人 (\9^2)Annals N.Y. Acad Sci. 383:44-68) ； MRC ； FS4 細胞；及人類肝癌細胞系（Hep G2)。 135639.doc -51 - 200927170 宿主細胞係以用於抗體產生之上述表現或選殖載體來轉 形，且在適當時經改質以用於誘導啟動子、選擇轉形體或 擴增編碼所要序列之基因的習知營養培養基中培養。 (viii)培養宿主細胞 可在各種培養基中培養用以產生本發明之抗體之宿主細 胞。市售培養基’諸如漢氏（Ham’s)FlO(Sigma)、最低必需 培養基（MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜伯改良伊格

❹ 爾培養基（Dulbecco’s Modified Eagle's Medium，DMEM) (Sigma)適用於培養宿主細胞。另外，Harn等人（1979)似· 五《ζ. 58:44 ’ Barnes等人（1980)d«a/_ 102:255，美 國專利第 4,767,704 ; 4,657,866 ; 4,927,762 ; ; 或 5，122,469號；WO 90/03430 ; WO 87/00195 ;或美國專 利參考案30,985中所述之任何培養基可用作用於宿主細胞 之培養基。任何該等培養基可視需要補充激素及/或其他 生長因子（諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸 如氣化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、緩衝液（諸如HEpEs)、核苷 酸（諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸如gentamycintm藥 物）、痕量元素（定義為無機化合物，通常以在微莫耳範圍 内之最終濃度存在)及葡萄糖或等效能源。任何其他必要 補充物亦可以熟習此項技術者所知之適當濃度包括。諸如 溫度、PH值及其類似因素之培養條件為先前供所選宿主細 胞表現所使用之彼等條件’且將對一般技術者而言顯而易 見 (ix)抗體純化 135639.doc •52· 200927170 田使用重組技術時，抗體可細胞内產生、在周質間隙中 產生或直接刀必至培養基中。若抗體在細胞内產生，則作 為第步驟，（例如）藉由離心或超濾移除宿主細胞或已溶 解片段之微粒碎片。Carter等人（1992)价〇/7>咖‘办 10:163-167描述用於分離抗體之程序，該等抗體分泌至大 腸桿菌之周質間隙中。簡言之，在乙酸鈉（pH 35)、咖八 .及苯基甲基磺醯基氟化物（PMSF)存在下，經約3〇 min將細 胞糊狀物解凍。可藉由離心移除細胞碎片。在抗體分泌至 〇 培養基中時，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器（例 如，Amicon或Millipore Pellicon超濾單元）濃縮來自該等表 現系統之上清液。上述步驟之任何步驟中可包括蛋白酶抑 制劑（諸如PMSF)以抑制蛋白質水解且可包括抗生素以防止 外來污染物之生長。 自細胞所製備之抗體組合物可使用（例如）經填灰石層 析、凝膠電泳、透析及親和性層析來純化，其中親和性層 g 析為較佳純化技術。蛋白質A作為親和性 配位體之適用性 視物種及存在於抗艎中之任何免疫球蛋白Fc域的同型而 定。蛋白質A可用於純化基於人類γΐ、γ2或γ4重鏈之抗體 (Lindmark 等人（1983)«/. Mei/z. 62:1-13)。推薦蛋 白質G用於所有小鼠同型及人類y3(Guss等人（1986)五M50 ·/_ 5:15671575)。與親和性配位體連接之基質大多數常常為 壤脂糖，但其他基質亦可用。機械穩定性基質（諸如受控 孔徑玻璃或聚（苯乙烯二乙烯基）苯）與可使用瓊脂糖所實現 者相比允許更快流動速率及更短處理時間。在抗體包含 135639.doc -53· 200927170 CH3域時，Bakerb〇nd ΑΒχτΜ樹脂（j τ Β^，抑川如_， NJ)適用於純化。亦可視欲回收抗體而利用其他蛋白質純 化技術，諸如離子交換柱分餾法、乙醇沈澱、逆相 HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSE·™層析、陰離子 或陽離子交換樹脂（諸如聚天冬胺酸管柱）層析、層析聚 焦、SDS-PAGE及硫酸铵沈殿。 •在任何初步純化步驟之後，可使ffipH值為約25_45之間 的溶離緩衝液使包含所關注之抗體及污染物之混合物經受 低pH值疏水性相互作用層析，且較佳在低鹽濃度（例如， 約0-0.25 Μ鹽）下進行。 2.用於鑑別因子Β拮抗劑之篩選檢定及動物模型 可在補體相關疾病或病症之各種基於細胞之檢定及動物 模型中評估因子Β拮抗劑。 因此，舉例而言，重組（轉殖基因）動物模型可藉由使用 用於產生轉殖基因動物之標準技術，將所關注基因之編碼 ρ 部分引入所關注動物之基因組中來工程化。可用作轉殖基 因操作標靶之動物包括（而不限於）小鼠、大鼠、兔、天竺 鼠、綿羊、山羊、豬及非人類靈長類動物，例如狒狒、黑 猩猩及其他猴類。此項技術中已知的將轉殖基因引入該等 動物中之技術包括：原核顯微注射（Hoppe及Wanger，美國 專利第4,873,191號）；逆轉錄病毒介導基因轉移至生殖系 中（例如，Van der Putten等人，Proc. w"· jcarf. Sc|·. 82，6148-615 [1985]);胚胎幹細胞中之基因乾向 (Thompson等人，Ce// 56’ 313-321 [1989]);胚胎之電穿孔 135639.doc -54- 200927170 (Lo, Mof CW/_ J，1803-1814 [1983]);精子介導之基 因轉移（Lavitrano等人，〇// 57，717-73 [1989])。關於評 論可參見（例如）美國專利第4,736,866號。 出於本發明之目的’轉殖基因動物包括僅在其部分細胞 中帶有轉殖基因之彼等動物（”嵌合體動物";^轉殖基因可 以單一轉殖基因或以串連體（例如，頭-頭或頭_尾串連）形 式整合。將轉殖基因選擇性引入特定細胞類型中亦有可能 藉由以下技術來實現’例如Lasko等人，尸roc. TVai/. yicac/ •SW. (75^4 59, 623-636(1992)之技術。 轉殖基因動物中之轉殖基因表現可藉由標準技術來監 視。舉例而言’可使用南方墨點分析或PCR擴增來驗證轉 殖基因之整合^隨後’可使用諸如原位雜交、北方墨點分 析、PCR或免疫細胞化學之技術來分析mRNA表現量。 可另外檢查動物之免疫性疾病病理之徵象，例如藉由組 織學檢查以測定免疫細胞於特定組織中之滲入來檢查。亦 可執行阻斷實驗，其中用候選因子B拮抗劑處理轉殖基因 動物以測定對補體及補體活化（包括經典及替代路徑）或τ 細胞增殖之影響程度。在該等實驗中，將與本發明之多肽 結合之阻斷抗體投與至動物’且監視所關注之生物效應。 或者’由於編碼因子B多肽之内源基因與編碼動物胚胎 細胞中所引入之相同多肽的經改變基因組DNA之間的同源 重組，可建構具有編碼因子B之缺陷型或經改變基因之"敲 除·•動物。舉例而言’根據已建立之技術，編碼因子B之 cDNA可用於選殖編碼因子b之基因組DNA。編碼因子B之 135639.doc -55- 200927170 基因組DNA的部分可刪除或可經另一基因，諸如編碼可用 於監視整合之可選擇標記的基因置換。通常，載體中包括 數千鹼基之未經改變的側接DNA(在5，及3,末端）[關於同源 重組載體之疮述可參見（例如），Thomas及Capecchi，Ce//， 51:503 (1987)]。將載體引入胚胎幹細胞系（例如，藉由電 穿孔）且選擇所引入DNA已與内源DNA同源重組之細胞[參 . 見（例如），Li等人，Ce"，69:915 (1992)]。隨後，將所選細 胞注射至動物（例如，小鼠或大鼠）之胚細胞中以形成聚 嵌 〇 體[參見（例如）’ Bradley 在 reraiocarcz.wowia·? Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J.

Robertson 編（IRL，Oxford，1987)，第 113-152頁中]。隨後 可將喪合胚胎植入適合之假孕雌性培育動物體内，且使胚 胎足月產生"敲除"動物。在其生瘦細胞中持有同源重組 DNA之後代可藉由標準技術來鑑別且用於繁殖動物，其中 動物之所有細胞均含有同源重組DNa。可表徵敲除動物之 φ (例如）其抵禦某些病理性病狀之能力及其病理性病狀歸因 於缺少因子B多肽之發展。 因此’可另外在鼠因子B敲除小鼠中研究可能的因子b • 拮抗劑之生物活性。 年齡相關黃斑退化（AMD)之動物模型由在Cci_2或Ccr-2 基因中具有空白突變（null mutation)之小鼠組成。該等小 鼠顯現AMD之主要特徵，包括視網膜色素上皮（RpE)中之 脂褐質及其下之脈絡膜小疣之積累、感光器萎縮及脈絡膜 新▲管生成（CNV)。該等特徵在超過6個月齡時顯現。可就 135639.doc 56· 200927170 脈絡膜小疣形成、感光器萎縮及脈絡滕鉍&尬， 蜗新血管生成而言測 試候選因子B拮抗劑。 3.醫藥組合物 可以醫藥組合物形式投與本發明之因子B拮抗劑，包括 抗因子B抗體及藉由上文揭示之篩選檢定所鑑別出之其他 ' 分子用於治療補體相關眼睛病狀。 • 藉由將具有所要純度之活性分子與視情況可選的醫藥學 上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑（及⑽以抑A Pkr靡以仙心/ 第16版，〇sol，A.編[198〇])混合來 製備呈經冷凍乾燥調配物或水溶液形式的本發明之因子b 拮抗劑之治療調配物用於儲存。可接受之載劑、賦形劑或 穩疋劑在所用劑量及濃度下對受體無毒且包括：緩衝液， 諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗 壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑（諸如十八燒基二甲基节基氣 化銨；六甲氣銨；氣苄烷銨、苄索氣銨；苯酚、丁醇或苄 ❹ 醇；對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥 基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3_戊醇；及 間甲酚）；低分子量（少於約1〇個殘基）多肽；蛋白質，諸如 血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙 - 烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺 酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化 合物類’包括葡萄糖 '甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA，糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖 醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物（例如Zn-蛋白錯 135639.doc •57· 200927170 合物）；及/或非離子界面活性劑，諸如tweentm、 PLURONICS™ 或聚乙二醇(peg)。

脂染體（LiP〇fecti〇n)或脂質體亦可用以將多肽、抗體或 抗體片段傳遞至細胞。當使用抗體片段時，特異性結合桿 靶蛋白質之結合域的最小片段通常為較佳的。舉例而言， 基於抗體之可變區序列，可設計保留結合標靶蛋白質序列 能力之肽分子。該等肽可以化學方式合成及/或藉由重組 DNA技術產生（參見（例如），Marasc〇等人户π。勤" Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]) 〇 亦可將活性分子俘獲於（例如）藉由凝聚技術或藉由界面 聚合所製備之微膠囊中，例如分別俘獲於羥基甲基纖維素 或明膠微囊及聚基丙烯酸甲酯）微膠囊中，膠狀藥物傳 遞系統（例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子 及奈米囊劑）中或俘獲於巨乳液中。該等技術揭示於 &^_第 16版，〇s〇i，A 編 (1980)中。 欲用於活體内投藥之調配物必須為無菌的。其易藉由經 無菌過濾膜過濾來完成。 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含 有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成 形物品（例如薄膜或微膠囊）形式。持續釋放基質之實例包 括聚酯、水凝膠（例如聚（甲基丙烯酸2_羥乙酯）或聚（乙烯 醇））、聚乳酸交酯（美國專利第3,773,919號）、L-麩胺酸與 γ-乙基-L-麵胺酸之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、 135639.doc -58 · 200927170 諸如LUPRON DEPOT™(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙 立德（leuprolide acetate)組成之可注射微球體）之可降解乳 酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-經基丁酸。雖然諸如乙稀_ 乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能釋放分子歷時超過 100天’但是某些水凝膠釋放蛋白質歷時較短時期。當經 囊封之抗體保留於身體中歷時長時間時，其因暴露於37<t ' 下之濕氣而可能會變性或聚集，造成生物活性損失及可能 β 的免疫原性改變。可設計合理策略用於穩定，其視所涉及 之機制而定。舉例而言，若發現凝集機制為經由硫基-二 硫化物互換形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾硫氫基殘 基、自酸性溶液冷凍乾燥、控制濕氣含量、使用適當插入 劑及開發特定聚合物基質組合物來實現稞定。 用於預防或治療眼睛疾病或病狀之本發明化合物通常藉 由眼睛、眼内及/或玻璃體内注射來投與。亦使用其他投 藥方法，其包括（但不限於）局部、非經腸、皮下、腹膜 Ο Θ、肺内、鼻内及病灶内投藥。非經腸輸液包括肌肉内、 靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下投藥。 用於眼睛、眼内或玻璃體内投藥之調配物可藉由此項技 . 肖巾已知之方法且❹此項技術巾已知之成分來製備。用 • ⑤有效治療之主要要求為適當穿過眼睛。與藥物可局部傳 遞之眼睛前方之疾病不同’視網膜疾病需要更具位點特異 性之方法。滴眼劑及軟膏很少會穿透眼睛後方，且血液· 眼睛障壁會阻礙全身投與之藥物穿透至眼睛組織中。因 此通常用於藥物傳遞以治療諸如八助及CNV之視網膜疾 135639.doc •59. 200927170 病之特別方法為直接玻璃體内注射。玻璃體内注射通常以 —定時間間隔來重複，其視患者之病狀及所傳遞藥物之性 質及半衰期而定。對眼内（例如玻璃體内）穿透而言，通常 具有較小尺寸之分子較佳。 治療諸如AMD或CNV之補體相關眼睛病狀之功效可藉由 常用於評估眼内疾病之各種終點來量測。舉例而言，可評 估視力損失。視力損失可藉由（但不限於）以下方式來評 ❹ 估：量測最佳校正視覺銳度（BCVA)自基線至所要時間點 之平均改變（例如，其中BCVA係基於早期治療糖尿病性視 網膜病變研究（ETDRS)視覺銳度圖表及在4公尺之測試距 離處之評估），量測在所要時間點與基線比較，在視覺銳 度上損失少於15個字母之個體比例，量測在所要時間點與 基線比較，在視覺銳度上得到大於或等於15個字母之個體 Ή量測在所要時間點具有20/2000或更差之視覺銳度 Snellen虽量之個體比例，估量ΝΕΙ視覺功能化問卷，（例 Ο 如）藉由螢光素血管攝影術量測在所要時間點之CNV尺寸 及CNV渗漏量，等彡。可進行眼睛評估，（例如）其包括（但 不限於）’（例如）執行眼睛檢查、量測眼内壓、評估視覺銳 . 度、量測裂隙燈壓力、評估眼内發炎等等。 提供以下實例僅用於說明性目的且不意欲以任何方式 限制本發明之範嘴。 δ月《中引用之所有專利及參考文獻在此明確地以引 用之方式全部併入。 實例 135639.doc 200927170 抗因子B抗«之製儐及測試 除非另外指示，否則實例中提及之市售試劑係根據製造 商之說明書來使用。當前實例中且貫穿說明書以ATCC寄 存編號加以鑑別之彼等細胞來源為American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209。 方法 用於蛋白質分析之玻瑀體液及布魯赫（Bruch)膜之製備 將人類AMD及非AMD屍體眼睛解凍且將前房連同玻璃 體、視網膜及RPE—起移除。將玻璃體收集於微管中，在 乾冰上冷凍且在-70°C下儲存直至進一步處理。將布魯赫 膜-脈絡膜層自後半球剝離（Crabb, J.W.等人Proc Natl Acad Sci U S A” 99:14682-7 (2002))且自黃斑及周圍中心區分離 4 mm或6 mm環鋸樣本用於後續分析（參見表1)。將一個直 徑4 mm之環錯樣本用於分析補體因子B蛋白質含量。在檢 定稀釋劑（PBS/0.5% BSA/0.5% Tween-20)中將樣本超音波 處理10 min且藉由在5000 rpm下離心10 min來分離可溶及 不可溶部份。將可溶部份用於ELIS A檢定。 人類因子B之單株抗體之產生 藉由將存於單磷醯基脂質A/海藻糖二黴菌酸酯佐劑 (trehalose dicorynomycolate adjuvant)(C〇rixa, Hamilton, MT)中之 2 pg 因子 B(Comptech，Taylor，TX)注射於 Balb/c小 鼠腳掌中11次來產生人類因子B之單株抗體。將來自小鼠 之腿窩淋巴結與P3X63Ag.U.l骨髓瘤細胞融合。針對鼠因 135639.doc -61 - 200927170 子B篩選融合瘤細胞之結合親和力。藉由有限稀釋選殖產 生抗體之細胞系。 溶血檢定 對測定替代路徑活性而言，在GVB中將兔紅血球（Er， Colorado Serum)洗務3次且使其再懸浮達到2x1 09/ml。將 抑制劑（50 μΐ)及 20 μΐ 之 Er 懸浮液與 GVB/0.1 M EGTA/0.1M MgCl2 1:1混合。藉由插入Clq耗盡人類血清（Quidel ; 1:3 稀釋於GVB中之30 μΐ)來引發補體活化。在室溫下培養30 分鐘後，插入200 μΐ GVB/10 mM EDTA以終止反應且在 500 g下將樣本離心5 min。在200 1上清液中，藉由量測 412 nm處之吸光率來測定溶血。資料表示為在缺少抑制劑 的情況下誘導之溶血之百分比。為測定CRIg對補體之經典 路徑之影響，除用經IgM塗佈之羊紅細胞（E-IgM, CompTech)置換Er外，按照相似程序，且在存於GVB++中 之因子B缺乏人類血清中執行檢定。

人類因子B ELISA 以 1 pg/mL將鼠抗人類因子Ba mAb(Quidel Corp.，Santa Clara, CA)塗佈於板上，且將800 ng/mL之生物素標記抗因 子B mAb GNE2F12.9.3用作偵測抗體。將在31.25-2,000 pg/mL範圍内之完整因子B蛋白質（Complement Technology, Inc.)用作標準。以1/10,000稀釋將SA-HRP插入至板中。完 整因子B在人類玻璃體液及布魯赫膜溶胞物樣本中之最小 可定量濃度分別為1.56 ng/mL(l/50最小稀釋）及312.5 pg/mL(l/10最小稀釋）。 135639.doc -62· 200927170 單株抗因子B抗髏1F7之分子選殖及重整 使用 RNeasy Mini Kit(Qiagen，Germany)，自產生小鼠抗 人類因子B單株1F7之融合瘤細胞提取總RNA。使用RT-PCR，用以下簡併引物擴增可變輕鏈（VL)及可變重鏈（VH) 域： 輕鏈（LC)前向： 5'GGAGTACATTCAGATATCGTGCTGACCCAATCTCCAG CTTCTTTGGCT3' (SEQ ID NO: 4) 輕鏈反向： 5'GGTGCAGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTG CCTCCACC3，（SEQ ID NO: 5) 重鏈（HC)前向： 5'GGAGTACATTCACAGATCCAGCTGGTGCAGTCTGGA CC3' (SEQ ID NO: 6) 重鍵反向： 5'GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGG TGASTGWGGTTCC3'(SEQ ID NO: 7) 前向引物對VL及VH區之N末端胺基酸序列具有特異 性。分別設計LC及HC反向引物以黏接至恆定輕鏈（CL)及 恆定重鏈域1 (CH1)中之區域，該恆定重鏈域跨越物種得到 面度保存。 將經擴增VL選殖至含有人類κ恆定域之pRK哺乳動物細 胞表現載體中（Shields等人，J Biol Chem 276: 6591-6604 (2001))。將經擴增VH插入編碼全長人類IgGl恆定域之 135639.doc -63· 200927170 pRK哺乳動物細胞表現載體中。因此，將1F7重整為小鼠-人類IgGl嵌合體。 在大腸桿菌中使質粒生長且在中國倉鼠卵巢（CHO)細胞 中表現。

135639.doc -64· 200927170 用於研究中之供體組織

Genentecli 編號 1 1A 年齡 78 78 85 性別 F F AMD階段 3 解剖記錄 中央凹症痕，較少黃斑脈絡膜小疣FS 無脈絡膜小疣跡象 2 Μ 4 地圖狀萎縮GA 2A 85 F 4 無脈絡膜小疣跡象 3 87 F 中央凹中之維管疤痕FS 3A 87 F 無脈絡膜小疣跡象 4 76 M 4 地圖狀萎縮GA 4A 74 M 2個小脈絡膜小疣存在 5 81 F 3+ 中等黃斑脈絡臈小疣MD 5A 81 M 無脈絡膜小疣跡象 6 84 F 3 許多黃斑脈絡膜小疣MD 6A 86 M 無脈絡膜小疣跡象 7 83 F 4 中央凹中之維管疤痕FS 7A 83 M 無脈絡膜小疣跡象 8 72 M 4 中央凹疤痕，中等黃斑脈絡膜小疣FS 8A 71 F 無脈絡膜小疣跡象 9 81 F 4 中央凹疤痕，中等黃斑脈絡膜小疲FS 9A 83 M 無脈絡膜小疣跡象 10 77 M 3 許多黃斑脈絡膜小疣MD 10A 78 M 無脈絡膜小疣跡象 表2 表1用於藉由ELISA來量測補體組分含量之人類供體眼 睛之解剖方法。 表2適用於研究之供體組織。 【圖式簡單說明】 圖1A.自正常及AMD供體眼睛所獲得之玻璃體及布魯赫 膜（Bruch's)中之因子B含量。因子B含量係藉由如所述之因 子B特異性ELISA來量測。B :眼睛中之因子B之總含量係 料由叶算布魯赫膜（Bruch’s membrane)中所表現之因子8之 禅貢獻及可見於玻璃體中之因子B之總量來確定。 圖2在溶血檢定中對補體之替代路徑有選擇性之抗因子B 抗體1F7的表徵。1C50及1C90值指示於上文且如方法部分 135639.doc -66- 200927170 中所述執行檢定。 圖3抗因子B抗體1F7重鏈及輕鏈之多肽序列（SEQ NOS: 1 及 2)。 圖4人類因子B多肽之多肽序列（SEQ ID NO: 3)。

135639.doc -67- 200927170 序列表 <1】0>美商建南德克公司 <120>抗因子B抗體及其用途

<130> GNE-0287 US <140〉 097143224 <141> 2008-11-07 <150> 61/002,648 <151> 2007-11-08 <160> 7 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 217 <2I2> PRT <213>人工序列 <220>

<223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 1

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Ser Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Phe Leu lie Ser Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His 65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Q 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 145 150 155 160

Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 135639.doc 200927170

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 2 <211> 448 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成多肽 <400> 2

Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Mel 35 40 45

Gly Trp He His Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr His Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin lie Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Ser Leu Ser Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Scr Va) Phe Pro 115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Scr Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp 丁yr Phe Pro Glu Pro Va] Thr Val Ser 丁rp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175

Ser Ser Gly Leu 丁yr Ser Leu Ser Ser Val Va】 Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 -2- 135639.doc 200927170

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 250 255

Thr Pro Giu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp 丁yr Val Asp G】y Val G】u Va] His Asn Ala 275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 3 <211> 761 <2I2> PR丁 <213>智人 <400> 3

Met Glu Ser Pro Gin Leu Cys Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Phe Ser 15 10 15

Ser Gly Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Leu Glu Ala Arg Pro Gin Val 20 25 30

Ser Cys Ser Leu Glu Gly Val Glu lie Lys Gly Gly Ser Phe Gin Leu 35 40 45 135639.doc 200927170

Leu Gin Gly Gly Gin Ala Leu GIu Tyr Leu Cys Pro Ser Gly Phe Tyr 50 55 60

Pro Tyr Pro Val Gin Thr Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly Ser Trp Ser 65 70 75 80

Asp Leu Gin Thr Arg Asp Gin Lys He Val Gin Lys Ala Glu Cys Arg 85 90 95

Ala lie Arg Cys Pro Arg Pro Gin Asp Phe Glu Asn Gly Glu Phe Trp 100 ]〇5 Π0

Pro Arg Ser Pro Phe Tyr Asn Leu Ser Asp Gin lie Ser Phe Gin Cys 115 120 125

Tyr Asp Gly Tyr Val Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gin Glu 130 135 140

Asn Gly Arg Trp Asp Gly Gin Thr Ala He Cys Asp Asp Gly Ala Gly 145 150 155 160

Tyr Cys Pro Asn Pro Gly lie Pro lie Gly Thr Arg Lys Val Gly Ser 165 170 175

Gin Tyr Arg Leu Glu Asp lie Val Thr Tyr His Cys Ser Arg Gly Leu 180 185 190

Val Leu Arg Gly Ser Gin Lys Arg Lys Cys Gin Glu Gly Gly Ser Trp 195 200 205

Ser Gly Thr Clu Pro Ser Cys Gin Asp Ser Phe Met Tyr Asp Ser Pro 210 215 220

Gin Glu Va) Ala Glu Ala Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu Thr He Glu 225 230 235 240

Gly Ala Asp Ala Glu Asp Gly His Ser Pro Gly Glu Gin Gin Lys Arg 245 250 255

Lys lie Val Leu Asp Pro Ser Gly Ser Met Asn He Tyr Leu Val Leu 260 265 270

Asp Giy Ser Asp Ser lie Gly Ser Ser Asn Phe Thr Gly Ala Lys Arg 275 280 285

Cys Leu Thr Asn Leu lie Glu Lys Val Ala Ser Tyr Gly Val Arg Pro 290 295 300

Arg Tyr Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Thr Val Pro Lys Val Leu Val Arg 305 310 315 320

Val Ser Asp Glu Arg Ser Ser Asp Ala Asp Trp Vai Thr Glu Lys Leu 325 330 335

Asn Gin He Ser Tyr Glu Asp His Lys Leu Lys Ser Gly Thr Asn Thr 340 345 350 -4- 135639.doc 200927170

Lys Arg Ala Leu Gin Ala Val Tyr Ser Met Met Ser Trp Ala Gly Asp 355 360 365

Ala Pro Pro Glu Gly Trp Asn Arg Thr Arg His Val He lie lie Met 370 375 380

Thr Asp Gly Leu His Asn Met Gly Gly Asn Pro Val Thr Val lie Gin 385 390 395 400

Asp lie Arg Ala Leu Leu Asp He Gly Arg Asp Pro Lys Asn Pro Arg 405 410 415

Glu Asp Tyr Leu Asp Val Tyr Val Phe Gly Val Gly Pro Leu Val Asp 420 425 430

Ser Val Asn He Asn Ala Leu Ala Ser Lys Lys Asp Asn Glu His His 435 440 445 〇

Val Phe Lys Val Lys Asp Met Glu Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Gin 450 455 460

Met Me Asp Glu Thr Lys Ser Leu Ser Leu Cys Gly Met Val Trp Glu 465 470 475 480

His Lys Lys Gly Asn Asp Tyr His Lys Gin Pro Trp Gin Ala Lys lie 485 490 495

Ser Val Thr Arg Pro Leu Lys Gly His Glu Thr Cys Met Gly Ala Val 500 505 510

Val Ser Glu Tyr Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Met Val Asp 515 520 525

Asp Gin Lys His Ser He Lys Val Ser Val Gly Gly Gin Arg Arg Asp 530 535 540

Leu Glu lie Glu Glu Val Leu Phe His Pro Lys Tyr Asn lie Asn Gly 545 550 555 560

Lys Lys Ala Glu G.y .le Pro Glu Phe Tyr Asp Tyr Asp Va, Ala Leu

Val Lys Leu Lys Asn Lys Leu Lys Tyr Gly Gin Thr Leu Arg Pro lie 580 585 590

Cys Leu Pro Cys Thr Glu Gly Thr Thr Arg Ala Leu Arg Leu Pro Gin 595 600 605

Thr Ala Thr Cys Lys Gin His Lys Glu Gin Leu Leu Pro Val Lys Asp 610 615 620

Val Lys Ala Leu Phe Val Ser Glu Gin Gly Lys Scr Leu Thr Arg Lys 625 630 635 640

Glu Val Tyr lie Lys Asn Gly Asp Lys Lys Ala Ser Cys Glu Arg Asp 645 650 655 135639.doc 200927170

Ala Thr Lys Ala Gin Gly Tyr Glu Lys Val Lys Asp Ala Ser Glu Val 660 665 670

Val Thr Pro Arg Phe Leu Cys Thr Gly Gly Val Asp Pro Tyr Ala Asp 675 680 685

Pro Asn Thr Cys Lys Gly Asp Ser Cly Gly Pro Leu He Val His Lys 690 695 700

Arg Ser Arg Pbe He Gin Val Gly Val lie Ser Trp Gly Val Val Asp 705 710 715 720

Val Cys Arg Asp Gin Arg Arg Gin Gin Leu Val Pro Ser Tyr Ala Arg 725 730 735

Asp Phe His lie Asn Leu Phe Gin Val Leu Pro Trp Leu Lys Asp Lys 740 745 750

Leu Lys Asp Glu Asp Leu Gly Phe Leu

755 760 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引物 <400> 4 ggagtacatt cagatatcgt gctgacccaa tctccagctt ctitggct 48 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述··合成引物

<400> 5 ggtgcagcca cggtccgttt gatttccagc ttggtgcctc cacc 44 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成引物 <400> 6 ggagtacatt cacagatcca gctggtgcag tctggacc 38 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213>人工序列 <220> 6- 135639.doc 200927170 <223>人工序列之描述：合成引物 <400> 7 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gacggtgast gwggttcc

135639.doc

Claims (1)

1. 200927170 十、申請專利範圍： 1. 一種抗因子B抗體，其基本上係結合至與抗因子b抗體 1F7相同之抗原決定基。 2. 一種抗因子B抗體’其包含抗因子B抗體1F7之輕鏈及/或 重鏈高變區序列（分別為SEQ ID NOs: 1及2)。 3. —種抗因子B抗體，其包含抗因子B抗體1F7之輕鏈及/或 重鏈可變區序列（分別為SEQ ID NOs: 1及2)。 4. 如請求項3之抗因子B抗體，其為包含SEQ ID NO: 1之輕 © 鏈序列及SEQ ID NO: 2之重鏈序列之抗體iF7。 5. 如請求項1-4中任一項之抗因子B抗體，其為單株抗體。 6. 如請求項5之抗因子B抗體，其為抗體片段。 7，如請求項6之抗因子B抗體，其中該抗體片段係選自由 Fab、Fab’、F(ab')2、scFv、（scFv)2、dAb、互補判定區 (CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體 (minibody)、雙功能抗體及從抗體片段形成之多特異抗 體組成之群。 ❹ 8. 如請求項5之抗因子B抗體，其為嵌合、人化或人類的c 9. 如請求項6之抗因子B抗體片段，其為嵌合、人化或人類 的。 10. —種包含有效量之因子B拮抗劑之醫藥組合物，其係用 於預防或治療個體中與補體相關之眼睛病狀。 11. 如請求項10之醫藥組合物，其中該個體為哺乳動物》 12. 如請求項11之醫藥組合物，其中該個體為人類。 13. 如請求項12之醫藥組合物，其中該因子B拮抗劑係選自 135639.doc 200927170 由抗因子3抗體及其片段結合多肽、肽及非肽小分子 組成之群β 14_如叫求項13之醫藥組合物’其中該因子Β拮抗劑為抗體 或抗體片段。 15. 如叫求項14之醫藥組合物，其中該抗體或抗體片段基本 上結合至與抗因子Β抗體1F7相同之抗原決定基。 16. 如請求項14之醫藥組合物，其中該抗體或抗體片段包含 抗因子Β抗體1F7之輕鏈及/或重鏈高變區序列（分別為 SEQ ID NOs: 1 及 2)。 17. 如請求項14之醫藥組合物，其中該抗體或抗體片段包含 抗因子抗體1F7之輕鏈及/或重鏈可變區序列（分別為SEq ID NOs: 1 及 2” 18. 如請求項14之醫藥組合物，其為包含SEQ ID NO: 1之輕 鍵序列及SEQ ID NO: 2之重鏈序列之抗體1F7。 19. 如請求項14之醫藥組合物，其中該抗體或抗體片段結合 至因子B之活性位點。 20. 如請求項14之醫藥組合物，其中該抗體或抗體片段結合 至包括因子B之活性位點殘基之抗原決定基。 21. 如請求項14之醫藥組合物，其中該抗體片段係選自由 Fab、Fab’、F(ab’）2、scFv、（scFv)2、dAb、互補判定區 (CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙 功能抗體及自抗體片段形成之多特異抗體組成之群。 22. 如請求項21之醫藥組合物，其中該抗體片段為Fab、 Fab'、F(ab')2、scFv 或（scFv)2 片段。 135639.doc 200927170 23. 如請求項l〇之醫藥組合物，其中該補體相關眼睛病狀係 選自由年齡相關黃斑退化（AMD)、脈絡膜新血管生成 (CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性及其他局部缺血相關性視 網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林 道（von Hippel-Lindau)疾病、眼睛之組織聚菌病、中心 視網膜靜脈阻塞（CRV0)、角膜新血管生成及視網膜新血 管生成組成之群。 24. 如请求項23之醫藥組合物，其中該AMD為乾性ΑΜβ。 25. 如請求項23之醫藥組合物’其中該amd為濕性AMD。 26. —種因子B拮抗劑之用途，其用於製備供預防或治療個 體中與補體相關眼睛病狀之藥劑。 27. 如請求項26之用途，其中該個體為哺乳動物。 28. 如請求項27之用途’其中該個體為人類。 29. 如請求項28之用途，其中該因子b拮抗劑係選自由抗因 子B抗體及其片段、結合多肽、肽及非肽小分子組成之 群。 30. 如請求項29之用途，其中該因子B拮抗劑為抗體或抗體 片段。 31. 如請求項30之用途，其中該抗體或抗體片段基本上結合 至與抗因子B抗體iF7相同之抗原決定基。 32. 如請求項30之用途，其中該抗體或抗體片段包含抗因子 B抗體1F7之輕鏈及/或重鏈高變區序列（分別為犯卩ID NOs: 1 及 2)。 33. 如請求項30之用途’其中該抗體或抗體片段包含抗因子 135639.doc 200927170 抗體1F7之輕鏈及/或重鏈可變區序列（分別為SEQ ID NOs: 1 及 2)。 34. 如請求項30之用途，其為包含SEQ ID NO: 1之輕鏈序列 及SEQ ID NO: 2之重鏈序列之抗體1F7。 35. 如請求項30之用途，其中該抗體或抗體片段結合至因子 B之活性位點。 ’ 36·如請求項30之用途’其中該抗體或抗體片段結合至包括 因子B之活性位點殘基之抗原決定基。 ® 37.如請求項30之用途’其中該抗體片段係選自由Fab、 Fab'、F(ab’)2、scFv、（scFv)2、dAb、互補判定區（CDR) 片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙功能抗 體及自抗體片段形成之多特異抗體組成之群。 38·如請求項37之用途，其中該抗體片段為Fab、Fab，、 F(ab’)2、scFv或（scFv)2片段。 39·如請求項26之用途，其中該補體相關眼睛病狀係選自由 Q 年齡相關黃斑退化（AMD)、脈絡膜新血管生成（CNV)、 葡萄膜炎、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病 變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道疾 病、眼睛之組織漿菌病、中心視網膜靜脈阻塞⑴尺乂⑺、 角膜新血管生成及視網臈新血管生成組成之群。 40.如請求項39之用途，其中該AMD為乾性AMD。 4!•如請求項39之用途，其中該ΑΜ〇為濕性amd。 42· -種套組，其包含因子批抗劑及用於投與該抬抗劑以 治療與補體相關眼睛病狀之說明書。 135639.doc 200927170 43. 如請求項42之套組，其中該補體相關眼睛病狀係選自由 年齡相關黃斑退化（AMD)、脈絡膜新血管生成（CNV)、 葡萄膜炎、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病 變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道疾 病、眼睛之組織漿菌病、中心視網膜靜脈阻塞（CRVO)、 角膜新血管生成及視網膜新血管生成組成之群。 44. 如請求項43之套組，其中該補體相關眼睛病狀為AMD或 CNV。 〇

   135639,doc