TW200909794A - Integrated nucleic acid analysis - Google Patents

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200909794 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於核酸分析之微流體學領域。 本申請案根據35 U.S.C. § U9(e)規定主張以下申請幸之 申請曰期之權利·· 2007年4月4日申請之美國臨時申二第 r 咖，802號；2007年8月13曰申請之美國臨時申靖案第 60/964,502號；及謂年2月12日中請之美國臨時中請案第 61/028,073號，該等中請案之各者之全文以引用的方式併 入本文中。亦將以下兩個美國專利申請案之全文以引用之 方式併入本申請案中，該等申喑 寸甲明案在冋一天申請：第一個 名為”Methods for Rapid ,. P Multiplexed Amplification of

Target Nucleic Acids”，代理人檔案號碼 〇8_3i8_us ;及第 一個名為"Plastic Microfliii.y

Microfluidic separation and detection platf❶rms" ’代理人檔案號碼G7_865_us。 【先前技術】 對能允許完全整合（亦即揭σλ s β + P樣。口進入至結果輸出）之集中核 酸分析（其定義為對給定人類、動物、植物或病原體基因 組之子集之快速識別（藉由核酸測序或片段大小測定））的儀 器及技術之研發存在去、、丈p 在未滿足之需要。集中核酸測序將使最 終使用者能作出即時矽忠 ㈠寻臨床判定、法醫判定或其他判定。例 如’ &午多常見人類疾症·^甘^ 、，Τ基於131^^序列之少於1000個的鹼 基對（小於產生完聲人# ^ 土因組所需之數量級）加以診斷。 類似地’藉由短串聯番… 重馒序列分析產生的對少於20個之特 異性DNA片段之隼人 ^ 。之大小的精確測定足以識別給定個 13I622.doc 200909794 體視應用而疋，可在各種配置下，包括醫院實驗室、醫 師辦公室、臨床(bedside)，或在法醫學應用或環境應用之 情況下，在實地進行集中核酸分析。 對改良之DNA測序及片段大小測定系統存在若干未滿足

之需要。首先對易於使用且不需要高度受訓操作員之DNA 測序及片段大小測定用儀器存在未滿足之需要。其次，對 可/肖除所有手動處理之系統存在未滿足之需要。因此，僅 需要最低限度之操作員訓練且系統應易於由受限於諸如 〇 (例如）穿戴防護服（haz，t suit)之第一反應者所將面臨之 挑戰性環境的個體操作。 第二，對於不會犧牲對完整、精確及可靠資料之需要的 超I·夬刀析存在未滿足之需要。對於人類識別應用而言，產 生結果之適當時間為45分鐘或小於45分鐘比使用習知技 術所高之數天至數週少很多。對於臨床應用而言，諸如對 感染物測序以確定適當之治療療法，90分鐘或小於90分鐘 4合理之應答時間’從而使得用抗細g及抗病毒藥物治療 、 可在患者抵達急診室後即刻開始。不管應用如何，對產生 即時有用之資料存在未滿足之需要。較短之應答時間亦允 許樣品處理量之伴隨增加。 第四’對小型化存在未滿足之需要。許多DNA分析系統 需要整個實驗室及相關支持。例如，高處理量 Sequencer FLX(R〇che Diagnostics Corp, Indianapolis, )DNA測序系、統就安裝而言僅需要王作台，但需要大型 實驗至進行所需文庫構建。小型化對於實驗室與現場即時 131622.doc 200909794 其對於 …蔓（point.of谓e)之用卩及實地操作均為重要的 每個樣品之成本降低亦為重要的。

j五’對堅固耐用存在未滿足之需要。對於許多應用’ 儀：彼等在法醫學、軍事及國防中之應用而言，DNA分析 益：須：在實地操作。相應地’不論由士兵揹運、由警 車運达還疋由直升機空投到戰場上，該儀器都必須能夠被 輸送類似地’該儀器必須能夠耐受包括溫度、濕度及* 浮粒子(例如砂粒)之極限環境且能夠在該等極限環：下： 第六’對能接受多種樣品類型且能並行進行高度多重分 析之系統存在未滿足之需要。對大多數應用而t，分析來 自単重反應中單-樣品類型之DNA之能力對於進行有意義 之DNA分析為不可接受的。 尋求將複雜之實驗室操作系列濃縮於生 體㈣稱作微全分析系寧s)或晶片實驗 chip)技術，參見Manz等人，^紙心⑽_方i99〇, i 244-248)研發者已明確認識到此等未滿足之需要，但至今 尚未能設計出能進行所有可使微流體核酸分析滿足此等需 要所必需或理想之生物化學與物理過程的整合生物晶片及 儀器。因此，集中核酸分析在當今社會尚未進入廣泛使 用0 微流體系統之研發包括將微型裝配組件（諸如微量分 離、反應 '微型閥及泵）及各種偵測機制整合於全功能裝 置内（參見，例如Pa】等人，2005, 5, 1024-1032)。 131622.doc 200909794 自Manz等人（上述）在上個世紀90年代早期展示晶片上之毛 細管電泳現象以來，其他人已尋求將其改良。若干群組已 展示DNA處理功能與生物晶片分離及偵測之整合。已報導 呈玻璃-PDMS(聚二曱基矽氧烷）混合結構之整合裝置 (Blazej等人，Proc TVa" dead J 2006，103，7240- 5 ； Easley 等人，/Voc. A^a". 5W. USA 2006, 103, 19272-7 ;及 Liu等人，Jna/. 2007, 79, 1881-9)。Liu 藉由短串聯重複（STR)大小測定將多重聚合酶鏈反應 (PCR)、分離及四染料偵測法結合起來用於人類識別。 Blazej將桑格測序反應（Sanger sequencing reaction)、桑格 反應淨化、電泳分離及四染料偵測法結合用於pUC 1 8擴增 子（amplicon)之DNA測序。Easley將DNA之固相萃取、 PCR、電泳分離及單色偵測結合以識別血中細菌感染之存 在。由Burns(Pal，2005，/d.)展示結合PCR、電泳分離及單 色偵測之整合矽玻璃裝置。Huang報導將PCR之玻璃-PDMS部分與電泳分離之聚（甲基丙烯酸甲酯）(PMMA)部分 及單色偵測結合用於識別細菌DNA之存在的混合裝置 (Huang等人，五/ecirop/zoresb 2006，27，3297-305)。

Koh等人報導使PCR與生物晶片電泳分離及單色偵測結 合用於識別細菌DNA之存在的塑料裝置（Koh等人， C/zew. 2003，75, 4591-8)。Asogawa報導結合 DNA萃取、 PCR擴增、生物晶片電泳分離及單色偵測之矽基裝置 (Asogowa M, Development of portable and rapid human DNA Analysis System Aiming on-site Screening, 18th 131622.doc 200909794

International Symposium on Human Identification, Poster, 2007 年 i〇 月 1-4 日，Hollyw〇〇d，CA，USA)。美國專利第 7’3 3 2,126號（Tooke等人）描述使用離心力來實現核酸分離 及循環測序所需之微流體操作。然而，此方法係基於小樣 品體積（約一至幾μΕ之彼等者）。因此，其裝置並不適用於 尤其以高度並行之方式處理供分離及分析核酸用的大量樣 品’此係因為必須在靜止時將流體樣品施加於該裝置，即 盤必須能夠在離心前含有操作所需之所有流體（對於高度 並行裝置而言可能達數百爪]^。其次，該裝置受限於細菌 純系之樣品製備及循環測序（例如質體DNA)。 在嘗試將DNA處理與生物晶片電泳分離整合之彼等裝置 中存在若干缺陷。首先，偵測受到每一檢定資訊含量（大 多數使用單色偵測器，不過有些具有達四色之偵測系統） 或處理量（單樣品或兩樣品處理能力）之限制。第二，此等 裝置不體現完整之樣品-應答整合，例如Blazej之裝置在循 環測序前需要模板DNA之板外（off_b〇ard)擴增，而其他者 使用需要某種前處理之樣品（例如Easley及T〇〇ke需要將樣 品在添加之前溶解）。第三，針對此等裝置作出之某些處 理選擇對時間·應答產生負面影響：例如Blazej之基於雜交 之方法需要超過20分鐘來淨化循環測序產物。第四，許多 此等裝置部分或完全由玻璃切製造。使用此等基板及相 關製造技術使得其固有地較費成本（Gardeniers等人，Lab_ on-a-Chip (〇osterbroeck RE，van den Berg A，編），

Elsevier: London’第37_64頁（2〇〇3))且使其受限於必須進 131622.doc 10 200909794 行該等裝置之再使用之應用；對於許多應用（諸如人類ID) 而言此導致樣品污染之風險。最後，所展示之技術對於兩 種應用而言為不適合的，即經由STR分析及測序進行人類 識別。例如，Easley及Pal裝置均遇到不良解析之問題，其 比單一鹼基解析差得多。片段大小測定應用（例如，藉由 短串聯重複概況分析進行之人類識別）及測序均需要單— 驗基解析。 除就微流體整合而言的先前技術之偈限性以外，關於螢 光偵測之問題亦限制核酸分析在習知實驗室研究以外之廣 泛應用。最廣泛使用之市售測序套組（BigDyeTM a」 [Applied Bi0systems]及 DYEnamicTM ET [GE 出31如咖 Biosciences Corp，Piscataway, NJ])係基於存在二十年之四 色偵測方法（參見，例如美國專利第4,855,225號；第 5,332,666 號；第 5,800,996 號；第 5,847，162 號；第 5,847,162號）。此方法係基於將染料標記之核苷酸之發射 信號解析為四種不同顏色，每一種顏色表示四種鹼基中之 各者。此等四色染料系統具有若干缺點，包括螢光染料之 低效激發、顯著之光譜重疊及發射信號之低效收集。該等 四色染料系統尤其有問題，此係因為其限制可自測序產物 之給定電泳（或其他）分離獲得之資訊量。 對於旎夠以電泳系統基於DNA片段之分離及偵測藉由片 段大小及藉由顏色（染料波長）獲得高資訊含量檢定的系統 存在未滿足之需要。可藉由電泳辨別之DNA片段之最大數 目係由襞置之分離及解析之讀取長度決定。可偵測之顏色 131622. doc 200909794 之最大數目係部分決定於螢光染料之可用性及偵測系統之 波長辨別力。儘管已報導達四色之偵測，但通常現有生物 晶片偵測系統限於單色。

用於人類識別之STR分析為基於顏色多重性測DNA片段 大小之實例且允許同時分析達16個位點（AmpFiSTR

Identifiler套組 ’ Applied Biosystems, Foster City, CA ;及 PowerPlexl6套組，promega Corporation，Madison，WI)。 使用四種或五種螢光染料，單一分離通道可辨別各位點之 許多對偶基因變異體之大小。若干測片段大小應用將需要 在單一道（lane)上分離及偵測超過1 6個片段。例如，藉由 才曰紋硪別病原體（亦即分離及偵測大量特有DN A片段）及藉 由測量整個人類基因組診斷非整倍體可藉由分別著眼於數 打或數百個位點來達成。 增加可在單一分離通道中偵測之位點之數目的一種方法 為部分藉由增加額外位點之片段大小使所產生之片段大小 I巳圍變寬。然而，對於額外位點使用較長片段為非理想 的此係因為較大片段之擴增對抑制劑及DNA降解更敏 感，從而導致較長片段相對於較短片段之產量低。此外， 較長片段之產生亦需要擴展時間之增加且因此增加總檢定 時間。對於藉由增加可同時偵測之染料顏色之數目來増加 給定分離通道中可偵測之位點之數目存在未滿足之需要。 對於藉由增加在單一分離通道中可分析之〇]^人序列之數 目來增加桑格測序分離能力（且因此縮減該方法之成本、 勞動力及空間）存在未滿足之需要。此外，在某些應用 131622.doc •12· 200909794 中，對多個DNA片段測序產生難以讀取之”混合序列資 料，需要開發一種可正確解釋混合序列之方法。 增加桑格分離通道之能力且開發解釋混合序列之能力之 一種方法為增加測序反應中使用之染料顏色之數目。在 DNA測序及片段大小測定中，可同時偵測用不同染料標記 之多個片段。一般而言，相鄰染料之峰值發射波長之間的 分離相對於染料之峰寬而言必須足夠大。因此，各分離通 C之處理量可（例如）藉由在兩個獨立測序反應中使用兩套* ί 種染料且合併產物並在I一通道上將其分離而加倍。此方 法而要使用總共8種染料顏色’其中第一測序反應使用一 套適用於払§己二脫氧核苷酸終止子之4種染料顏色且第 二反應使用另一套適用於標記該等終止子之4種染料顏 色，各套染料顏色為獨立的以便在兩個序列之解釋中可能 無重壁。使用此相同方法，可使用一套丨2種染料以允許在 單一通道中同時分析三個DNA片段之序列，一套16種染料 , 允許分析四個序列，等等，此顯著增加桑格分離之資訊 V， 量 0 本申明案之新穎儀器及生物晶片滿足許多未滿足之需 要’包括以上所列之彼等者。 【發明内容】 本發明提供完全整合微流體系統以進行核酸分析。此等 過紅包括樣品收集、DNA萃取與純化、擴增（其可為高度 夕重化）、測序及DNA產物之分離與偵測。 本發明之分離及偵測模組係加固型且能夠比單一鹼基解 131622.doc 200909794 析更好。其能夠偵測六種或六種以上顏色，且就此而論適 用於自測序及測片段大小應用產生高資訊含量。 生物晶片上之高度多重化快速PCR為在同一天申請、具 有代理人檔案號碼MBHB 08-3 1 8-US且題為"METHODS FOR RAPID MULTIPLEXED AMPLIFICATION OF TARGET NUCLEIC ACIDS"之美國專利申請案的主題，該專利申請 案之全文以引用之方式明確地併入本申請案中。此外，可 在如題為"PLASTIC MICROFLUIDIC SEPARATION AND DETECTION PLATFORMS'，、代理人檔案號碼 07-865-US之 美國專利申請案中所述之生物晶片内分離且偵測PCR產 物，該專利申請案之全文以引用之方式明確地併入本申請 案中。 因此，在第一態樣中，本發明提供光學偵測器，其包含 一或多個經定位用以照明一基板上之一或複數個偵測位置 的光源；一或複數個經定位用以收集且引導自該基板上之 該等偵測位置發出之光的第一光學元件；及一經定位以接 收來自該等第一光學元件之光的光偵測器，其中該光偵測 器包含一波長色散元件，其用於根據光波長分離來自該等 第一光學元件之光且經定位以將一部分經分離之光提供至 偵測元件，其中該等偵測元件之各者與一用於同時自該等 偵測元件之各者收集偵測資訊之第一控制元件連通，且其 中該光偵測器偵測來自標記一或多個生物分子之至少6種 染料之螢光，各染料具有獨特之峰值發射波長。 在第二態樣中，本發明提供用於分離及偵測生物分子之 131622.doc -14- 200909794 系統，玟句人.ζ /、 3.一組件，其用於在一基板上之一或複數個 通道中同時分離複數個生物分子，其中各通道包含一偵測 "^立 _晋 J π____ 十夕 / — 或夕個經定位用以照明該基板上之該等偵測位置 署2;—或複數個經定位用以收集且引導自該等偵測位 一、，與之光的第一光學元件；及-經定位以接收自該等第 光學兀件引出之光的光偵測器，其中該光偵測器包含一 散元件’其用於根據光波長分離來自該等第一光學 r κ :件：光且經定位以將一部分經分離之光提供至偵測元 件之：中°亥等偵測70件之各者與一用於同時自該等偵測元 者收㈣測資訊之第一控制元件連通，且其中該光 债測器1貞測.. 恶上 來““己一或多個生物分子之至少6種染料之 螢光，各染料具有獨特之峰值波長。 八2第三態樣中’本發明提供用於分離及制複數個生物 :之方法’其包含：將一或複數個分析樣品提供於一基 之一或複數個微流體通道中，其中各微流體通道包含 ，則位置，且各分析樣品獨立地包含複數個生物分子， 且=物分子獨立地經至少6種染料中之—種標記，各染料 有獨特之峰值波長；同時在 备微々丨L體通道中分離該等複 數個經標記之生物分子；及藉 ,, 精由以下程序在各微流體通道 中偵測該等複數個經分離之目標 -Ή., ^ 刀啊物.用一光源照明各 谓測位置，·收集自各摘測位置發 , ,u 疋，將所收集之光引 °光偵測器，·及⑴根據光波長分ϋ H # n . f ^ A 故负刀離所收集之光；及（ii) 5夺Ί貞測來自標記一或多個生物分不+ . 物刀子之至少ό種染料之螢 光’各染料具有獨特之峰值波長。 131622.doc •15· 200909794 在第四態樣中’本發明提供整合生物晶片系統，其包含 ⑷一生物晶μ，其包含一或複數個微流體系統，其中各微 流體系統包含一與一分離室形成微流體連通之第一反應 室，其中該第-反應室經調適用於核酸萃取、核酸純化、 核酸擴增前淨化、核酸擴增、核酸擴增後淨化、核酸測序 前淨化、核酸測序、核酸測序後淨化、反轉錄、反轉錄前 淨化、反轉錄後淨化、核酸接合、核酸雜交或定量，且該 分離室包含-偵測位置；及⑻一分離與偵測系統，其包含

V ⑴-用於在該等分離室中同時分離複數個目標分析物之分 離元件；（丨"-或多個經定位用以照明該生物晶片上之該 等偵測位置的光源；（出)一或複數個經定位用以收集且引 導自該等偵測位置發出之光的第—光學元件；及㈣一經 定位以接收自該等第一光學元件引出之光的光偵測器，其 中該光㈣器包含-波長色散元件，#用於根據光波長分 離來自該等第-光學元件之光且經定位以將—部分經分離 之光提供至至少六個伯測元件’1中該等情測元件之各者 與一用於同時自該等偵測元件之各者收㈣測資訊之第— 控制元件連通，且其中該光偵測器偵測來自標記一或多個 生物刀子之至夕6種染料之螢光，各染料具有獨特之峰值 波長。 在第五態樣中，本發明提供整合生物晶片系統，其包含 ⑷-生物晶片’其包含_或複數個微流體系統，其中各微 流體系統包含一與—分離室形成微流體連通之第一反應 室，其中該第-反應室經調適用於核酸萃取、核酸純化、 131622.doc -16· 200909794 核酸擴增辄淨化、核酸擴增、核酸擴増後淨化、核酸測序 前淨化、核酸測序、核酸測序後淨化、反轉錄、反轉錄前 淨化、反轉錄後淨化、核酸接合、核酸雜交或定量，且該 分離室包含-偵測位置；及⑻一分離與偵測系统，其包含 ⑴-用於在該等分離室中同時分離複數個包含靡序列之 生物分子之分離元件；⑼-或多個經定位用以照明該生 物晶片上之該等偵測位置的光源；（叫_或複數個經定位 r 用以收集且引導自該等偵測位置發出之光的第一光學元 件；及㈣一經定位以接收自該等第—光學元件引出之光 的光偵測器…該光偵測器包含_波長色散元件，其用 於根據光波長分離來自該等第—光學元件之Μ經定位以 將-部分經分離之光提供至至少六則貞心件其中該等 偵測元件之各者與一用於同時自該等偵測元件之各者收集 資訊之第-控制元件連通，且其中該光她積測來 自標記-或多個DNA序列之至少8種染料之螢光，各半料 具有獨特之峰值波長，料染料為至少兩個含有4種=料 之子集之成員，以使該等染料集合能夠在一單—通道" 測至少兩種DNA序列，其中染料數目為四的倍數，且、 測之DNA序列之數目等於該倍數，以使該等不同染料二各 者存在於僅~個子集中。 【實施方式】 I.整合及整合系統 整合之一般描述 單一生物晶片上製造發揮— 種以上 利用微流體學允許在 131622.doc 200909794 之功此的特徵。該等功能中 _ _ 靶中之兩種或兩種以上功能可呈微 合。 心遲躓處理旎夠實現；此結合稱為整 儘管對於任何給定之應用而言並非必須實施所有過程， 但存在一系列必須加以整合以達成任何給定之應用的可能 功能或組成過程。因此’所選擇之整合方法必須適用於以 不同順序有效地聯螌甚+ x R 1 α 右十不叼組成過程。可整合之過程包 括（但不限於）以下項： 1.樣品插入；

2. 移除外來物質(例如諸如粉塵、纖維之大顆粒）； 3. 細胞分離（亦即，移除除含有欲分析之核酸之彼等細胞 以外的細胞，諸如自含有欲分析之微生物核酸的臨床樣 品中移除人類細胞（且相應地移除人類基因組DNA)” 4_濃縮含有所關注之核酸之細胞； 5 ·溶解細胞且萃取核酸； 6.純化來自溶胞物之核酸；同時有可能將核酸濃縮至較 小體積； 7. 擴增前核酸淨化； 8. 擴增後淨化； 9. 測序前淨化； 10. 測序； 11. 測序後淨化（例如用以移除會干擾電泳的未合併之經 染料標έ己之終止子及離子）； 12. 核酸分離； 131622.doc •18· 200909794 13 ·核酸偵測； 14· RNA之反轉錄； 15.反轉錄前淨化； 16·反轉錄後淨化； 17. 核酸接合； 18. 核酸定量； 19 ·核酸雜交；及 2〇·核酸擴增（例如PCR、滾環擴增、鏈置換擴增及多重 置換擴增）。 可將某些此等過程組合之許多方法中之一種方法為藉由 STR分析進行人類識別的整合系统。此類系統可需要結合 DNA萃取、人類特異性DNA定量、添加定量dna至pcR反 應中 '多重PCR擴增及分離與偵測（視情況亦可併人用以移 除反應成分或引子之淨化步驟）。可藉由諸如擦拭之技術 收集全金、乾血、面頰内表面、指紋、性攻擊、接觸或其 他法醫學上相關之樣品的—或多種樣品（參見Sw⑽等人， X心⑽☆版1997,仏32〇_2)。暴露於溶胞物（視情況 在授動存在下）自拭子釋放DNA至試管中。 B.整合組件及其用途之一般描述 X，樣品收集及初始處理 曰對於許多應用而t，將以下離散組件有利地整合至生物 晶片中：樣品插入、移除外來物質、移除干擾性核酸及濃 縮所關注之細胞。-般而言’生物晶片之預處理組件接受 樣品，進行顆粒及含有外來核酸之細胞的初始移除，且= 131622.doc 19 200909794 .注t細胞至較小體積。—種方法為使用可容納拭子 歹^類似Q·尖端"）且充滿溶解溶液之樣品管來進行溶解 二卒取步驟。可將拭子與若干含細胞之位點(包括血跡、 曰、’文水、空氣過濾器）或臨床位點（例如頰部拭子、傷口 栻子、鼻栻子）接觸放置。此等管與生物晶片之其他組件 之界面可包括用於移除外來物質之過濾器。另—方法為使 :大體積之血或環境樣品採集濾筒，其處理M〇〇仏樣 在血液之情況下，當通過含有所關注之核酸之微生物 :白血球減少介質可移除人類白血球及干擾DNA。對於環 境樣品而言’可使用大網眼過據器來移除粉塵及汗跡，而 小網眼過濾器(例如<20 μιη、q 〇，、<5 ,、<2 5叫、 <1 μιη、<〇·5 μηι、<0.2 μπι、<〇」μηι之過遽器）可用來來捕 集微生物，將其濃縮成小體積。此等預處理組件可為獨立 消耗品或在製造時附著於整合晶片上。或者可將生物晶片 加以設計以進行差異溶解，從而根據類型分離細胞（例如 來自陰道上皮細胞之精子或來自細菌之紅血球）。 溶解及萃取 "Τ使用各種浴解及萃取方法。例如，一種典型程序包括 在將樣tm與小置降解扭（諸如蛋白酶_尺，其分解細胞壁且 釋放核酸）混合後施加熱。其他可用之方法為音波處理及 超音波處理，其中之任一者或兩者有時均在珠粒存在下進 行。 例如，可對含有1 06個細胞或1 〇6個以下之細胞之樣品進 行溶解及萃取。視應用而定，可在本發明之生物晶片及方 131622.doc -20- 200909794 法中使用較小數目之起始細胞，少於1 〇5個、少於1 〇4個、 少於103個、少於102個、少於10個，且在當欲分析多複本 序列之情況下，少於丨個。 3.核酸之純化 核酸純化之一種形式可藉由將純化介質插入輸入通道與 輸出通道之間而獲得。此純化介質可基於二氧化矽纖維且 使用離液-鹽試劑（chaotropic-salt reagent)來溶解生物樣 品，暴露DNA(及RNA)且使DNA(及RNA)與該純化介質結 ( 合。接著將溶胞物經由輸入通道傳遞通過純化介質以結合 核酸。將經結合之核酸藉由基於乙醇之緩衝液洗滌以移除 污染物。此舉可藉由使洗滌試劑經由輸入通道流經純化膜 而實現。接著將經結合之核酸藉由合適之低鹽緩衝液之流 動自該膜溶離（例如Boom美國5,234,809)。此方法之一種變 體包括使用不同組態之固相。例如，可使用矽膠來結合核 酸。可使用順磁性二氧化矽珠粒，且在結合、洗滌及溶離 步驟期間利用其磁性將其固定於通道或室壁上。亦可使用 非磁化二氧化矽珠粒，其被裝填於緻密，管柱，（在該處其係 以玻璃料所固持）内（通常被製造於裝置之塑料中，但此等 者亦可在裝配過程中插入），或在其操作之特定階段期間” 游離”。可將游離珠粒與核酸混合且接著使之在裝置中相 對於玻璃料或堪流動以將其捕集，以使其不干擾下游過 程。其他形式包括分布於凝膠介質中的具有二氧化矽顆^ 之溶膠-凝膠及具有包括二氧化矽顆粒之聚合物單體，其 中為了較大機械穩定性使載體交聯。基本上，在習知配置 131622.doc •21 - 200909794 下起作用之任何核酸純化方法均可適用於本發明之整合生 物晶片。 4. 核酸擴增 可使用各種核酸擴增方法，諸如PCR及反轉錄PCR，其 在至少兩個溫度且更通常為三個溫度之間需要熱循環。可 使用諸如鏈置換擴增之等溫方法，且對於全基因組擴增可 使用多重置換擴增。在同一天申請之題為”METHODS FOR RAPID MULTIPLEXED AMPLIFICATION OF TARGET i NUCLEIC ACIDS”之美國專利申請案（代理人檔案號碼08- 3 18-US)的教示之全文以引用之方式併入本文中（如上所 述）。 5. 核酸定量 以微流體格式定量之一種方法係基於即時PCR。在此定 量方法中，在輸入通道與輸出通道之間製造一反應室。將 該反應室與熱循環器耦接，且將光學激發與偵測系統耦接 至該反應室以允許來自反應溶液之螢光得以量測。樣品中 、 DNA之量與來自每一循環之反應室之螢光強度有關。參 見，例如Heid等人，Genome /iesearc/z 1996，6, 986-994 〇 其他定量方法包括在擴增前或後使用諸如picoGreen、 SYBR或溴化乙鍵之插入染料，接著可使用螢光或吸光度 偵測該等染料。 6. 二次純化 對於STR分析，可直接將經多重擴增及經標記之PCR產 物用於分析。然而，可藉由純化產物以移除PCR所必需但 131622.doc •22· 200909794 广 會干擾分離或其他後續步驟之離子而極大地改良電泳分離 效旎。類似地’繼循環測序或其他核酸處理後的純化可為 適用的。總體而言，繼核酸之初始萃取或純化後之任何純 化步驟可視為二次純化。可使用各種方法，包括超音處 理其中驅使小離子/引子/未併入之染料標記通過過濾 器，使所要之產物留於過濾器上，該產物隨後可被溶離且 直接應用於分離或後續模組中。超濾介質包括聚醚颯及再 生纖維素"編織”過濾器，以及執跡侵蝕膜（其中在極薄（1_ 10 μπι)之臈中形成高度均一大小之孔）。後者具有收集大 小大於過濾器表面上之孔大小之產物而非捕集表面下一些 冰度之產物的優點。亦可使用與上述相同之方法(亦即， 典型之二氧化矽固相純化)來純化經擴增之核酸。其他方 法包括使用水凝膠、具有孔大小可變性之性質的交聯聚合 物’亦即孔之大小響應於諸如熱及阳值之環境變量而^ 化。在-種情況下’該等孔為緻密的且pCR產物不能通 °田孔膨大時，產物之水動力或電泳流可能穿過該等 孔。另-方法為使用雜交，產物非特異性雜交至固定於一 表面（諸如珠粒之表面）上之隨機顯或特異性雜交（其中產 物上之序列標籤之補體係位於固體表面上）。在此方法 I物：所關注之產物經由雜交固定且藉由洗務移除不想要 句質’隨後加熱炫化雙鏈體且釋放經純化之產物。 猶環測序反應 2型之循環測序需要熱循環，與PCR幾乎一樣。較佳方 /為彼等使用經染料標記之終止子 々忒以使各延伸產 131622.doc -23- 200909794 物帶有對應於延伸反應之最終鹼基之單一螢光標記。 8.注入、分離及偵測 可以各種方式進行電泳通道中之經標記之核酸片段之注 入、分離及偵測，此已在同一天申請之題為"PLASTIC MICROFLUIDIC SEPARATION AND DETECTION PLATFORMS'，（給定之代理人檔案號碼為07-865-US)之美國 專利申請案中描述，該案之全文以引用之方式併入本文 中。首先，如其中所討論之交叉注入器可用於注入樣品之 一部分。在一替代實施例中，可使用電動注入（"ΕΚΓ)。在 任一種情況下，在載入通道（在交叉注入情況下）或分離通 道（在EKI情況下）之開口端附近之測序產物的進一步濃縮 可藉由電極近旁靜電濃縮產物來進行。在圖14中展示在晶 片之電泳部分上之兩電極樣品孔。兩個電極均塗覆有一滲 透層，其阻止DNA與電極金屬接觸，但允許離子及水進入 樣品孔與電極之間。該等滲透層可由交聯聚丙烯醯胺形成 (參見美國專利申請公開案US 2003-146145-A1)。距通道開 口最遠之電極為分離電極，而距通道開口最近之電極為反 電極。藉由對反電極相對於分離電極通正電，會將DNA吸 至反電極且在接近分離通道之開口處濃縮。藉由使反電極 浮動且在分離通道之遠端使用分離電極及陽極注入，電動 注入濃縮之產物。 C.整合方法 生物晶片亦含有用於整合功能性模組之若干不同構件。 此等構件涉及自生物晶片上之一點至另一點輸送液體、對 131622.doc -24- 200909794 於具流速依賴性 之過私（例如’某些洗滌步驟、顆 及溶離）控制流動 顆杻分離 „ 動速车、閘控生物晶片上之流體運動_ 間及間隔(例如經 運動之時 由使用某些形式之閥），及流體之混合。 各種方法用於流體運輸及受控流體流動。— 法為正置換泵送，1中 種方 ”中在運動過程中，與流體或介入裹辦 或流體接觸之；(；*金gr * + ^ ^ 柱塞驅動流體移動一精確距離，該距 於由柱塞置換之鲈接^ 離你丞 換之體積。此類方法之一實例為注射泵。另一 f

V 方法，使用氣動、磁力致動或其他方式致動之整合彈性 膜。单獨而言，此等膜可用作閥以使流體容納於界定之空 間中及/或阻止流體之過早混合或傳遞。然而，當串聯: 用時，此等膜可形成類似於蠕動泵之泵。藉由膜之同步、 連續致動’流體可自其後側”推出"，此係因為在前側之膜 被打開以接受移動流體（且排空裝置之通道中的任何置換 空氣）。用於致動此等膜之較佳方法為氣動致動。在該等 裝置中，生物晶片由流體層構成，該等流體層中之至少一 者具有膜，該等膜之一側暴露於裝置之流體通道及室中。 膜之另一側暴露於垂直於壓力源之氣動歧管層。藉由應用 壓力或真空使該等膜打開或閉合。可使用通常為打開或通 常為閉合之閥’在壓力或真空之應用下改變狀態。注意到 任何氣體均可用於致動，此係因為氣體不與分析下之流體 接觸。 驅動流體及控制流動速率之另一方法為藉由改變流體之 前彎月面、後彎月面或兩彎月面處之壓力而在流體自身上 直接施加真空或壓力。施加適當之壓力（通常在〇.〇5_3 psig I31622.doc •25· 200909794 範圍内）。流動速率亦可藉由使流體通道之大小合適來控 制’此係因為流動速率與流體兩端之壓差及水力直徑之四 次方成正比，且與通道或液體塞之長度及其黏度成反比。 Λ 可使用各種主動閥達成流體閘控。前述者可包括壓電閥 或電磁閥，其可直接併入晶片中，或施加於生物晶片以使 主晶片體上之埠與該等閥連通，引導流體進入該等閥，且 隨後返回晶片t。此等類型之閥之一缺點為對於許多應用 而言，其可能難於製造且對於併入拋棄式整合裝置而言過 於昂貴。如上所述，較佳方法為使用膜作為閥。例如可使 用由10 psig致動之膜來成功地容納經受PCR之流體。 在某些應用中，毛細管微型閥（其為被動閥）可為較佳 的。基本上，微型閥係流動路徑中的緊縮。在微型閥中， 當施加於流體之壓力低於稱為破裂壓力之臨界值時，表面 能及/或諸如尖銳邊緣之幾何特徵可用於阻止流動，其中 3亥破裂壓力常由以下關係式給出： na (Y/dH)*sin(ec)， 其中γ為液體之表面張力，閱之水力直徑(定義為私(截 面積）/截面周長），且1為液體與閥表面之接觸角。 使得被動閥對於某些應用為較佳之性質包括：極低之死 體積(通常在皮升(pic〇mer)範圍内）及+的物理範圍 ㈣咖extent)(各者僅略A於通向閥及離開閥之通道）。 小的物理範圍允許在生物晶片之认 L t 夂、0疋表面上有高密度之 閥。此外，某些毛細管閥非常易於製 丹基本上由經表 面處理或未經表面處理之塑料片中 ’、札，、且成。毛細管閥 131622.doc -26- 200909794 之恰當使用可減少所需膜閥之總數，簡化總體製造及形成 穩固系統。 在本發明裝置中建構之毛細管閥有兩種類型：平面内 閥，其中閥之小通道及尖銳角落係藉由在一層中形成”槽,， 且將此層接合至無特徵蓋子（通常為裝置之另一層）而形 成，及通孔閥，其中在裝置之兩個流體載運層之間的中間 層中製造小（通常25〇 或mo μπι以下）孔。在兩種情況 下，可使用氟聚合物處理來增大流體與閥接觸之接觸角。 圖7展不在氟聚合物處理之情況下此等閥對於所關注之 液體（即去離子水及循環測序試劑）之閥調效能與閥大小的 函數關係。在兩種情況下，觀測到閥調壓力對閥尺寸之預 期依賴性（壓力約丨/直徑）。通孔閥具有顯著優於平面内閥 之優點。首先’其易於製造，此係因為小通孔可易於在製 造闊層後藉由繞柱成形（m〇lding a_d p〇st)、打孔、模 切鑽孔或雷射鑽孔在塑料片中形成。平面内閥需要相當 月、製&且極精細之閥（具有高閥調壓力）必需使用微 影技術來製造所需成型或麼印工具。其次，通孔閥可在 了斤有側"上較為完全地以氟聚合物塗覆。將低表面張力之 氟聚σ物☆液應用於孔導致藉由毛細管作用完全塗覆該孔 之内壁。塗覆平面内閥之所有側需要將氟聚合物應用於閥 、密封於閥上之匹配層之區域。因此，在閥之，，頂部"盔 塗覆之情況下形成典型平面内閥。 在經機械加I > κ Λι| & 々 ,、孓中，通孔閥既易於實施又展現較大 閥調壓力，如圖7中所示。 131622.doc •27- 200909794 可以各種方式達成混合。首先，可藉由將兩種流體共注 入單一通道中利用擴散來混合流體，其中該通道通常具有 小的橫向尺寸及足夠的長度以使得在給定流動速率下滿足 擴散時間： tD=(寬度）2/(2x擴散常數） 不幸的是，此類混合對於快速混合大的體積通常不夠，此 係因為擴散或混合時間與通道寬度之平方成比例。混合可 以多種方式增強，諸如層壓，其中流體液流被分開且重組 (Campbell A Grzybowski Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 2004, 362，1069-1086);或經由使用精細微結構在流動通道内形 成紊亂平流（Stroock 等人，C/zem. 2002, 74，5306-53 12)。在使用主動泵及閥之系統中，混合可藉由多次循 環裝置上之兩點之間之流體而達成。最後，後者亦可在使 用毛細管閥之系統中達成。安置於兩個通道或室之間的毛 細管間充當流體流之枢轴；當流體經由毛細管自一通道流 入另一通道時，若使用足夠低之壓力抽吸流體，則後彎月· 面被截獲。壓力之逆轉驅使流體返回至第一通道中，且再 次使其阻止於毛細管處。可使用多次循環來有效地混合成 分。

以微流體格式分離及偵測之方法描述於同一天申請之題 為 ”PLASTIC MICROFLUIDIC SEPARATION AND DETECTION PLATFORMS”（代理人檔案號碼 MBHB 07-865-US)之美國專利申請案中，該案之全文以引用之方式 併入本文中（參見例如其中之段落68-79，94-98)。 131622.doc -28- 200909794 圖〗3之上半部分展示自兩個組件構建整合生物晶片 (1301)，該等兩個組件在製造中或製造期間接合。第—組 件為將圖1之生物晶#之溶解、擴增及測序特徵與圖11之 生物晶片之測序產物純化特徵結合的16_樣品生物晶片 (1302) ’且第：組件為16_道塑料分離生物晶片（侧）。亦 可在分離前電動注入純化測序產物。 D.製造方法 /.

本發明之裝置可主要由塑料構成。可用之塑料類型包括 (但不限於）：環稀烴聚合物（c〇p);環烯烴共聚物（c〇c); (田具有足夠分子量時’兩者均具有極佳光學性質、低吸 ",、！·生及同操作,皿度），聚（甲基丙烯酸甲醋）(PMMA)(易於加 且可獲传具極佳光學性質者厂及聚碳酸醋（PC)(高度可 :形且具有良好抗衝擊性及高操作溫度)。關於材料及製 k方法之更多身訊包含於題為，，meth〇ds阳R RAPID MULTIPLEXED amplification of target nucleic (代理人檔案號碼08_318_us)之美國專利申請案 。案之王文以引用之方式併入本文中（如上所述）。 ° 各種方法來製造生物晶片之個別零件且將其裝配 於最終裝置中。因為生物晶片可由一或多種類型之塑料構 成如有可能包括插入組件，戶斤關注之方法係關於個別零件 之I造、繼之以零件之後處理及裝配。 嬙:η右干方式製造塑料組件，包括射出成形、熱壓印及 、，a 2 成形零件可由總體特徵（諸如流體儲集器） 以及精細特徵（諸如 毛、e閥）構成。在某些情況下，較佳 131622.doc •29· 200909794 在一套零件上製造精細特徵且在另 此係因為此等不同尺寸的特徵之射 >較大特徵， 對於大型儲隼射出成形之方法可變化。 i儲集為(在_側上量測為 深度為若干毫米（約 50 mm)毫米且 丁宅木（約1-10 mm)且能夠容 可使用加工型射出成形工置十M '數百微升）而言， 成/工具或藉由借用 其他金Ji Φ &制、a ’墨電極燒進鋼或 、他金屬中而製造之卫具來使用習知成形 = 極已經加工成該工具之負極。 Ί亥石墨電 對於精細特徵，工且製造乃忐 所關…此 ▲及成形製程均可變化。通常在 列，或=板上使用微影製程（例如’玻璃之各向同性钱 且接从t深度反應性離子姓刻或其他製程）製造工 /、。接者可用鎳電鍍基板（通常在鉻 尤積後以促進黏 例如藉由在酸中蝕刻來移除基板。此鎳，，子體” 射出成形工具。該成形製程亦可補不同於上述者。對於精 細、狹窄特徵而言，已發現壓縮射出成形(其中該模具‘ 塑料注入空腔後略經物理壓縮）比標準射出成形在逼真 度' 精確度及重現性方面更佳。 對於熱壓印而言，關於如上所述之總體及精細特徵之類 似問題需控制’且可如上所述製造工具。在熱麼印中，可 將塑料樹脂以球粒形式，或作為經由成形或壓印製造之材 料之預成形坯施加於工具表面或一平坦基板上。接著可在 精確控制之溫度及壓力下接觸第二工具以將塑料溫度提高 超過其破璃轉移溫度且導致材料流動以填充該（等）工具之 空腔。在真空下之壓印可避免空氣捕集於工具及塑料之間 的問題。 131622.doc -30- 200909794 亦可使用機械加工來製造零件。可使用高速電腦數控 (CNC)機每日自成形、擠壓或溶劑澆鑄塑料製造許多個別 零件。鈇床、操作參數及切割工具之合理選擇可獲得高表 面品質（在COC之咼速銳削下，可獲得50 nm之表面粗梭度 (Bundgaard等人，/Voceec/kgs 0//Mec；z£ C: j 办 五《发· Scr 2006，220,1625-1632))。亦可使用銑削來製造可 能難於以成形或壓印獲得之幾何形狀且容易地混合單一零 件上之特徵尺寸（例如可將大的儲集器及精細毛細管閥加 工於同一基板中）。銑削優於成形或壓印之另一優點為無 需使用脫模劑自成形工具中脫出所製成之零件。 個別零件之後處理包括光學檢驗（其可為自動的）、用以 移除諸如毛邊或懸掛塑料之缺陷的清潔操作，及表面處 理。若在加工塑料中需要光學品質表面，可利用適於塑料 之溶劑蒸氣拋光。例如，對於PMMA，可使用二氯甲烷， 而對於COC及COP，可使用環己烷或甲笨。 在裝配如，可應用表面處理。可進行表面處理以促進或 咸 >、門/"，、（亦即改變零件之親水性/疏水性）；抑制微流體結 構内氣泡之形成；增加毛細管閥之閥調壓力；及/或抑制 蛋白吸附至表面。減少可濕性之塗層包括氟聚合物及/或 具有氟部分之分子，其中當分子被吸附或結合於裝置之表 面時I部分可暴露於液體中。塗層可被吸附或者沈積 其可共價鍵接 主 钱至表面。可用於製造該等塗層之方法包括浸 2佈溋由裝配之裝置之通道傳遞塗佈試劑、上墨、化 广〜積及嘴墨沈積。在塗佈分子與表面之間的共價鍵 131622.doc 200909794 可藉由用氧或其他電漿或uv_臭氧處理而形成以形成活性 表面，且隨後使表面處理分子沈積或共沈積於表面上（參 見 Lee 等人，五2〇〇5，％，18〇〇18〇6 ;及

Cheng等人，Se/uou 万 2〇〇4, 99, 186 196)。 可以各種方式進行組件零件於最終裝置中之裝配。諸如 過濾器之插入裝置可被模切且接著用取置機放置。 熱擴散接合可用於（例如）相同材料之兩層或兩層以上之 接合，其中各層為均一厚度。一般而言，可將零件堆疊， 且將該堆疊置於熱壓機中，#中溫度可提高至包含心零 件之材料之玻璃轉移溫度附近，以導致零件之間的界面融 口此方法之一優點在於該接合為”一般的”，亦即，不論 層之内部結構怎樣，皆可使具大致相同尺寸之層的任何兩 個堆疊接合’此係因為可將熱及壓力均一地施加於該等層 熱擴散接合亦可藉由使用特定製造之接合托架用於接合 更複雜之零件’諸如在接合或相反表面上不為平面之彼等 者。該等托架與欲接合之層之外表面一致。 -他接合變體包括溶劑輔助熱接合，其中諸如甲醇之溶 劑P刀a解塑料表面，從而在較低之接合溫度下增強接合 又另變體為使用低分子量材料之旋轉塗佈層。例 可將與基板成分化學結構相同但較低分子物 旋轉塗佈於欲接人夕$ , 匕物 接〇之至少一個層上，裝配該等組件， ^擴散接合將接合所得之堆疊。在熱擴散接合過程中，: 分子量成分可在比兮·耸 低 社比4 4成分低之溫度下經歷玻螭轉移溫 131622.doc -32- 200909794 度’且擴散至基板塑料中。 I使用黏著劑及環氧樹脂來接合不同材料且㈣劑及環 氧树脂很可能在以不同方式製造接合組件時使用。黏著劑 膜可被模切且放置於相杜μ + -Τ* 、、‘牛 亦可經由旋轉塗佈塗覆液體 黏者劑。可成功地制黏著劑於結構化零件^上 如在：米接觸印刷中)將黏著劑塗覆於結構化表面而不需 將黏著劑”引導”至特定區域上。

在-實例中’本發明之生物晶片可如圖6中所示裝配。 層1及2可藉由所包括之特徵（例如銷及插座）對準·分別 地，層3及4可類似地藉由所包括之特徵對準。層丨加層2之

堆疊可被倒置並施加於層3加層4之堆疊，且接著可結合成 整個堆疊。 ° D E.實例 實例1 用於核酸萃取及擴增之整合生物晶片 圖1中展示用於DNA萃取及PCR擴增之整合生物晶片 試劑分配及計量；試劑與樣 此4 ·樣品裝置整合以下功能 及熱循環。 對於楯環測 該等4 ' 0.38 品之混合；樣品至晶片之熱循環部分之傳遞； 在下文之實例2中使用相同之生物晶片且具有 序效能而言額外之結構。 性塑料構建。 _、1.9 mm 生物晶片如圖2-5中所示由4層熱塑 層為經加工之PMMA且分別具有〇.76 mm及0.76 mm之層厚度’且生物晶片之側尺 丁馬 12 4 mmx60 mm。一般而言’三層或三層以上之哇铷 王初日日片允許 131622.doc -33- 200909794 使用在多個檢定之間分配的不定數目之常見試劑：兩個流 體層及一至少含有通孔之層’使得外層中之流體通道能夠 彼此父又’。（應認識到存在特殊情況_諸如在多個樣品中使 用僅一種常見試劑-使三層構造並不為必需卜選擇4層使其 與用於其他功能（諸如超音處理，實例3)之晶片構建相容^ 完全整合（實例4)。 生物晶片之通道之截面尺寸在127 μιηχ127 ^出至4〇〇 μπιχ400 μηι範圍内，而儲集器之截面在4〇〇 μηιχ4〇〇 至 1.9x1.6 mm範圍内；通道及儲集器延伸之距離為〇5爪爪至 數十毫米紐。在生物晶片中使用之毛細管閥為："平面内" 閥之尺寸為127 μπιχ127 μηι且通孔毛細管閥之直徑為1〇〇 μηι。 將四個加工層之某些通道、儲集器及毛細管閥用疏水/ 心油材料PFC 502A(Cytonix，Beltsville，MD)處理。藉由用 濕潤之Q-尖端塗佈，隨後藉由在室溫下空氣乾燥來進行表 面處理。乾燥之氟聚合物層藉由光學顯微鏡術測出厚度小 於10 μιη。表面處理用於兩種目的：阻止液體内氣泡之形 成，尤其在諸如循環測序試劑之低表面張力液體内（當液 體快速潤濕通道或室之壁時此可能會出現（且在空氣可被 置換鈿封閉，氣泡））；及在毛細管閥抵抗液體流動處增強 毛細官破裂壓力。未處理之區域為pCR及循環測序之熱循 環室。 在表面處理後，如圖6中所示連接該等層。使用熱擴散 連接進行連接’其中在壓力下加熱組件之堆疊至接近塑料 131622.doc •34· 200909794 之玻璃轉移溫度(Tg)之溫度。在由 M. S 1 -3 Λ 〇〇 . ’ 鐘内自環境溫度上 出勒、130C下保持7.5分鐘以及快速冷卻至室、”且 成之熱連接概況過程中在整個^平 且 辦（lbs)之力達15分鐘。 物曰曰片上施加 開發氣動儀器用於驅動本發明之生物 個小螺動粟提供壓力及真空。正麼 /體兩 .^ m 刀叛出在具有約0.05-3

= (:)PSig之輸出真空的調節器。將第四、較高之壓 :自N融或者自高容量果傳至另—調節器。將正或負屢 力施加於-系列8個壓力選擇器模組。各模組裝備有電磁 閥，该專閥可自5個輸入中選擇欲傳輸至生物晶片之輸出 壓力。輸出壓力管線終止於至少一個氣動界面。此界面用 位於日曰片之輸入側上之晶片谭上的〇型環夹持於晶片上（該 埠沿該等特徵之頂部）。 接受來自壓力選擇器模組之輸出壓力管線的額外電磁閥 (亦即閘閥；每界面8個）恰好在生物晶片埠上。非常接近於 晶片的此等閥在壓力管線與晶片之間提供低死體積之界面 (約13 μί)。當施加壓力以移動其他液體時低死體積之界 面可阻止生物晶片上之某些流體之無意運動（例如，當施 加壓力時由於氣體之壓縮，在液體塞與關閉閥之間之小氣 體體積決定塞可移動之最大限度）。所有壓力選擇器閥及 閘閥係使用基於指令之LabView顶程式在電腦控制下操 作。此系統之一重要特徵為短壓力循環時間為可能的。可 執行一些流體控制事件，其需要短至30毫秒之壓力脈衝， 131622.doc -35- 200909794 且/或可使用複雜 一值變換（亦即一 過10-20毫秒）。 壓力概況，其中壓力可快速自一值至另 調即器至另一調節器亦即時間滯後不超 樣由約1 〇個細胞/mL之藉由pGEM測序質體插入 (PUC18測序目標）轉型之大腸桿菌⑷DH5的細菌懸浮 液組成。PCR試劑由dNTP K〇D Taq聚合酶（N〇vagen， Madison，WI)(濃度(Μ μΜ)組成。 將1·23 pL細菌懸浮液之樣品添加至四個埠1〇4之各者， 各自在層1及2中分別構成通孔2〇2及336。接著樣品存在於 層2中之樣品通道303中。接著，將1〇 pcR試劑添加至

埠105，其構成在層中之通孔217及3〇6。接著試 劑存在於層2中之室307中（參見圖8a)。用於排空針對pcR 試劑而言之置換空氣之埠為埠1〇7，其構成1〇9及通孔 203+305 ° 在操作中，由樣品及下游過程（諸如試劑之計量、流體 之混合）置換之空氣經由晶片之輸出端上之埠1〇8排出，該 埠由通孔227構成。PCR反應之終體積可如所希望增加或 減少。 將生物晶片置於上述氣動歧管中。執行以下之自動化壓 力概況’其中在步驟之間無延遲。除非另有說明，否則氣 動界面閥（對應於沿晶片之輸入側之埠）在所有步驟過程中 為關閉的。 將0.12 psig之壓力施加於埠1〇4上達15秒以將樣品沿著 通道303驅至通孔304。樣品通過通孔304且出現於層1之樣 131622.doc -36- 200909794 口口至204中之層2的另一側上且被驅至第一混合接合點 205。在第一混合接合點，將樣品藉由毛細管閥21〇持留 (參見圖8b-c)。 將〇·12 psig之壓力施加至埠1〇5達1〇秒以驅使pcR試劑通 過通孔320。PCR試劑出現於分配通道2〇8中之層2的另一 側上，且移動至計量室2〇9中，其限定試劑體積等於樣品 體積，其中其藉由毛細管閥211持留於混合接合點2〇5處。 (參見圖8d)。 將0.12 psig之壓力施加至埠1〇7(由通孔203及3〇5構 成）（其中埠105對大氣開放）達3秒以使通道2〇8排空（參見圖 8e)。 將〇,8 psig之壓力施加至埠1〇7及1〇5達〇 〇3秒且同時將 〇·7 psig之壓力施加至埠104達〇.〇3秒而藉由使液體頂破毛 細管閥210及211並通過該等閥來將樣品與Pcr試劑初始混 合（參見圖8f)。 將0.12 psig之壓力施加至埠1〇4及1〇7達1 〇秒以將樣品及 PCR試劑泵送至混合通道214中，且滯留於毛細管閥21〇及 211處。通過混合球形物212進入收縮部分213構成對液流 之額外水力阻力’從而減低由上述高壓脈衝賦予之高速 度。 將0·7 psig之壓力施加至埠1〇4及1〇7達0.03秒以將液體自 毛細管閥210及211中分離（參見圖8g)。 將0.12 psig之壓力施加至埠1〇4及107達3秒以經由混合 通道214將液體泵送至毛細管閥219，液體在其中持留（象 I3i622.doc -37· 200909794 見圖8h)。 將0.7 psig之壓力施加至埠104及107達0,1秒以將樣品與 PCR試劑之混合物經由通孔315及402且經由層2及3之主體 驅至PCR室502中（參見圖8i)。 將0.12 psig之壓力施加至埠104及107達3秒以達成將樣 品與PCR試劑之混合物泵送至室502中。接著使樣品與PCR 試劑之混合物之前緣通過通孔403及316，出現於層1中， 且在毛細管閥220處阻止（參見圖8j)。 接著將生物晶片加壓至30 psig N2且經由帕耳帖效應 (Peltier)使用氣囊（gas bladder)壓縮機制使其熱循環以進行 PCR擴增，此如與本案同時申請之題為”METHODS FOR RAPID MULTIPLEXED AMPLIFICATION OF TARGET NUCLEIC ACIDS，'（代理人檔案號碼08-31 8-US)之美國專利 申請案及2008年2月6曰申請之題為"DEVICES AND METHODS FOR THE PERFORMANCE OF MINIATURIZED IN VITRO ASSAYS"之國際專利申請案第 PCT/US08/53234 號（代理人檔案號碼07-084-WO)中所述，該等申請案之各 者之全文以引用的方式併入本文中。 選擇之樣品、試劑體積及PCR室大小使得液體填充閥 219與閥220之間的區域。因此，小截面積（通常127 μηι><127 μιη)之液體/蒸氣界面位於距層4之熱循環底面約3 mm處。在熱循環期間施加壓力抑制樣品中溶解之氧之脫 氣。液體/蒸氣界面之小截面積及距Peltier表面之距離均抑 制蒸發。 131622.doc •38· 200909794 在循環過程中所觀測到之生物晶片頂部之溫度從不超過 6(TC，且因此液體/蒸氣界面處之蒸氣壓比若該等界面在 PCR室中所將具有之蒸氣壓顯著較低。對於2 ，i

中14卟在室502中且其餘者在通孔及毛細管閥中^pcR 40次循環中所觀測到之1發量小於〇 …W置』、於υ·2 μΐ。未循環之流體 體積（在此情況下為0.6 pL)可藉由選擇較小直徑之通孔來 減小。 使用以下溫度概況執行PCR : •在98°C下將細菌熱溶解3分鐘 •以下項之40次循環： 〇在98°C下變性5秒 〇在65°C下退火15秒 〇在72°C下延伸4秒 〇在72°C下最終延伸（2分鐘） PCR產物係藉由用約5 pL去離子水沖洗室5〇2回收且藉由 平板凝膠電泳分析。PCR產量高達4〇 ng/反應，比隨後之 測序反應所需之量多得多。在本申請案中，僅藉由溶解細 菌產生細菌核酸。可使核酸經受所需之純化，亦即可改良 擴增、測序及其他反應之效率之過程。 實例2 用於循環測序試劑分配、與PCR產物之混合及循環測序之 整合±物晶片 使用如實例1中所述之生物晶片。將使用實例1中所述之 方案於試管中產生之PCR產物添加至如上所述生物晶片之 131622.doc •39- 200909794 樣品及PCR試劑埠中。將5〇 循環測序試劑 (BigDye M3.1/BDX64，MCLab，San Francisco)添加至埠 106(由通孔215及308構成）及室309。在安裝兩個氣動界面 (一者用於晶片輸入端且一者用於晶片輸出端）後，將pCR 產物如實例1中所述處理直至PCR室，但無pcR熱循環步 驟。流體在晶片中之處置如圖9a中所示。 使用氣動系統軟體執行以下壓力概況；除非另有說明， 否則所有對應於晶片埠之電磁閥均被關閉： 1. 將0.1 psig之壓力施加至埠106(其中埠1〇9對大氣開放） 達10秒以將循環測序試劑泵入通道31〇中（參見圖9b)。 2. 將0.7 psig之壓力施加至埠1〇6及1〇8上達〇_2秒（由通孔 216及314構成）’以驅使循環測序試劑自通道3〇4經由通孔 311、經由層2之主體且進入層i上之循環測序試劑計量室 218中（參見圖9c)。 3·將0.1 psig2壓力施加至埠1〇6(其中埠對大氣開 放）’將循環測序試劑驅至毛細管閥221，循環測序試劑在 其中持留（參見圖9d)。 4. 將0.1 psig2壓力施加至埠1〇8(其中埠1〇6對大氣開放） 達1私以驅使過量循環測序試劑返回室1 〇1中，使通道 310為空（參見圖9e)。 5. 將0.7 psig2壓力施加至埠1〇4及1〇7達〇 1秒（其中埠 十大氣開放）’以驅使PCR產物通過毛細管閥22〇且進入 I孔317，通過層2之主體及層3中之通孔4〇4，且進入層4 之循環測序室503中（參見圖9f)。 131622.doc -40- 200909794 6. 將0.1 psig之壓力施加至埠l〇9(其中埠i〇4及i〇7對大氣 開放）達5秒’以驅使PCR樣品返回通孔。毛細管作用將液 體持留於通孔之入口處，防止PCR產物與室503之間出現 捕集之空氣泡（參見圖9g)。 7. 將0·7 psig之壓力施加至埠108(其中埠ι〇9對大氣開放） 達0.2秒，以將循環測序試劑驅至室503中，而同時將〇 1 psig施加至埠1〇4及107 ’以使PCR產物與測序試劑接觸（參 見圖9h)。 8. 將0.1 psig之壓力施加至埠1〇4、及108達1〇秒（其中 埠109對大氣開放），以將PCR產物及桑格試劑驅入室中。 PCR產物之後考月面及測序試劑之後彎月面被阻止於毛細 管閥220及221(參見圖9i)。 9. 將0.2S psig真空及持續期間〇.丨秒之5個真空脈衝施加 至埠1 〇8(其中埠1 〇9對大氣開放），以將兩種液體部分吸回 試劑計量室218中（參見圖9j) 〇 10. 將0.1 psig之壓力施加至埠1〇4、1〇7及1〇8(其中埠1〇9 對大氣開放）達10秒以將混合物泵回至室5〇3，其中後彎月 面被阻止於如步驟8中之毛細管閥（參見圖9 k) ^ 再額外重複步驟9-1 0兩次以實現測序試劑與pcR產物之 混合。 接著將生物晶片加壓至30 psig N2且使用以下溫度概況 執行熱循環： • 9 5 °C /1分鐘初始變性 〇以下項之3 〇次循環 131622.doc ，41 · 200909794 0在95°c下變性5秒 〇在50°C下退火10秒 〇在60°C下延伸1分鐘 樣品（參見圖91)係藉由乙醇沈澱回收且純化並藉由如下文 (部分II，實例5)中所述以GenebenchTM儀器電泳分離及雷 射誘發螢光偵測加以分析。Phred品質分析產生4〇8 +/_ 57 QV20驗基/樣品。 實例3 在4-樣品生物晶片中之超滅 如實例1中所述’構建四層適於測序產物純化之效能之 4-樣品生物晶片’且展示於圖11中。在構造中之一額外元 件為超濾（UF)過濾器1116，其在熱連接前被切割成合適大 小且置於層3與4之間。圍繞UF過濾器之良好連接的形成必 需使用層3。層3及4圍繞過濾器形成不間斷周邊，此係因 為所有通向過淚器及離開過遽器之通道均在層2之底部（（例 如）在通道越過過滤器之狀況下，直接在層2與4之間之連 接導致對過濾器之不良連接）。在此實例中，使用分子量 截留（MWCO)為30 kD之再生纖維素（RC)過濾器（Sartorius, Goettingen, Germany)。當具有交替材料聚醚石風（pall Corporation, East Hills，NY)時，已檢驗多種其他 MWCO(10 kD、50 kD及 100 kD)。 1.將使用pUC18模板及KOD酶在試管反應中產生之四種 10 μΐ^循環測序產物樣品添加至第一層中之埠1104且經由 第二層中之通道1105將其驅至第二層中之室11〇6。將200 131622.doc •42· 200909794 此去離子水添加至埠1120(第一層中之通孔）至第二層中之 儲集S 1121。接著將生物晶片安裝於兩個氣動界面之間。 使用氣動系統軟體執行以下之壓力概況。除非另有說 明’否則所有對應於生物晶片璋之電磁閥均被關閉。 2·將〇·09 Psig之壓力施加至埠1104(其中埠1119對大氣開 放）達5秒將測序產物驅至層1中之毛細管閥1108，測序產 物在其中持留。 3.將〇.6 Psi§之壓力施加至埠1104(其中埠1119對大氣開 放）達〇· 1秒以使樣品膨脹通過層！中之毛細管閥1108且將其 經層2中之通孔1111傳遞入層2中之UF輸入室1112。 4_將0.09 psig之壓力施加至埠u〇4(其中埠1119對大氣開 放）達10-30秒（在不同實驗中使用不同時間）以完成測序產 物至室1112之傳遞。測序產物藉由層2中之毛細管閥1113 持留（參見圖12a及12b)。 5. 將0.8 pSig之壓力施加至埠1124(其中埠1119及11〇4對 大氣開放）達0.5秒，以驅動測序產物經由閥1113進入過濾 室1115中。此亦清除保持之液體之輸入毛細管閥1108。 6. 將0.09 psig之壓力施加至埠1124(其中埠1119對大氣開 放）達10-30秒以完成測序產物至室1115之傳遞。測序產物 保持於閥1113處（參見圖12c)。 7. 將7.5 psig之壓力緩慢施加於用於超濾之晶片之所有 埠。在超濾期間，當經由過濾器1116驅動液體時，測序產 物彎月面保持在1113受阻止而液體之前緣"回縮"。1〇 測 序產物需要約120秒用於過濾。在過濾後壓力得以釋放（泉 131622.doc -43- 200909794 見圖12c及12d)。 8. 將0.09 psig之壓力施加至埠1120(其中埠1124對大氣開 放）達3秒以驅使水進入通道112 2 (層4中）且部分填充溢流室 1123(參見圖 1 2e)。 9. 將0.8 psig之壓力施加至埠1120及1124(其中埠1119對 大氣開放）以驅使水經由通道1122中之通孔毛細管閥mo進 入室1112。 10_將0·09 psig之壓力施加至埠1120(其中埠1119對大氣 開放）達10-30秒以完成液體至室1112之傳遞，該液體藉由 閥1113保持於其中（參見圖12f)。 11.將0·09 psig之壓力施加至埠1124(其中埠1120開口）以 驅使室1123及通道1122中之水返回室1121(參見圖I2g)。 12·將0.8 psig之壓力施加至埠1124(其中槔1119及1104對 大氣開放）達0.5秒以將水經由閥1113驅至過濾室1115中。 此亦清除保持之液體之輸入毛細管閥1108。 13.將0_09 psig之壓力施加至槔1124(其中崞1119對大氣 開放）達10-30秒以完成水至室1115之傳遞。測序產物保持 於閥1113(參見圖12h)。 如以上之步驟6，驅使水通過UF過濾器，完成第一洗 滌。將步驟8-13額外重複一次。 重複步驟8-12以部分填充室1115，其中水之最終體積用 於溶離（參見圖12k)。 將1.6 psig之真空施加至埠11〇4，其中所有其他埠被關 閉1秒，自室1115吸取一些水至室m2中（最大運動由與液 131622.doc -44· 200909794 體之彎月面與對應於埠1119之電磁閥之間的死空間之相同 數量級之真空形成所決定）（參見圖121)。 使埠1104對大氣開放達1秒，由於在液體與對應於埠 Π19之閥之間產生的部分真空使液體移回至室nl5(參見圖 12m)。 將16-17重複50次以產生5〇次溶離循環。 將0.09 psig之壓力施加至埠1124達10秒（其中埠1119對大 氣開放）以驅動液體使其後彎月面在1113處受阻。 將0.7卩8丨呂/0.05秒之壓力施加至埠1124(其中埠1119對大 氣開放）以分離溶離物（參見圖12n)。 回收樣品且直接用如所述之GenebenchTM運行，產生多 達479 QV20個鹼基。 實例4 用於核酸萃取、模板擴增、循環測序、測序產物純化及純 化產物之電泳分離與偵測的完全整合生物晶片 圖13說明16-樣品生物晶片1301之實施例，其結合圖1之 生物晶片之溶解及卒取、模板擴增及循環測序功能；圖1 1 之晶片之超濾、；及電泳分離及偵測。藉由子組件1302進行 超濾過程且可如實例1、2及3中所述進行；使1302之底面 上之輸送點1304對準分離子組件1303上之輸入孔1305。 使用反電極以預濃縮步驟電動執行注入。圖1 4中所說明 之輸入孔1305由液體接收孔1401、主要分離電極14〇2及反 電極1403組成。分離通道1306通向孔儲集器1401之底部。 分離電極通常經鉑或金塗覆，且較佳為平面鍍金電極，其 131622.doc -45- 200909794 大體上覆蓋1401之内表面之1、3或4。反電極為薄金、鋼 或始導線（通常直徑為0.25 mm)，其已經一薄層（約1〇 父聯I丙稀醯胺塗覆。此在電極上形成水凝膠保護層。在 面板d上，可將純化之測序產物（14〇1中之黑點）轉移至孔 中。在1402與1403之間施加正電位，帶負電之測序產物被

V 引至1403，如面板c-d中一樣。1403上之水凝膠層防止測 序產物與金屬電極接觸且因此防止測序產物之電化學及損 害。接著使反電極1403相對於1402浮動。接著在主要分離 電極1402與分離通道1306之遠端的陽極（未圖示）之間施加 正電位。此允許產物注入（面板e)且沿著13〇6電泳以供分離

及偵測（面板f)。如圖14中所示，此流程允許測序產物在通 道1306之端附近之濃度相對於自超濾傳遞之測序產物顯著 增加。雖然此濃度對於一些應用而言為理想的，但在所有 情況下並非為必需。在該等情況下，可使用不具有反電極 1403之圖14之孔來直接進行EKI。或者，在載入孔中之單 一電極可為交又-T或雙倍-T注入器之二分之一（參見，例 如與本案同時申請之題為"PLASTIC MICROFLUIDIC SEPARATION AND DETECTION PLATFORMS”、代理人檔 案號碼07-865-US之美國專利申請案）。 分離在分離通道1306中發生，且偵測經由雷射誘發之螢 光在偵測區1307中發生。在此生物晶片中，提供凹處13〇8 以使（例如）帕耳帖塊（未圖示）匹配13〇1之低面以提供PCR 及循環測序之熱循環。在儀器内之氣動界面（未圖示）夾持 於晶片端部以提供微流體控制。 13I622.doc -46- 200909794 II.分離（DEPARATION)及偵測系統 A.分離與偵測組件及其用途之詳細描述 1.分離儀器 用如美國專利申請公開案第US 2006-0260941-A1號中所 述之生物晶片及儀器進行DNA分離。分離晶片可為玻璃 (參見美國專利申請公開案第US 2006-0260941-A1號）或塑 料（與本案同時申請之題為"Plastic Microfluidic separation and detection platforms"、代理人槽案號碼 07-865-US 之美 國專利申請案），該等案之全文以引用之方式併入本文 中〇 2·激發及偵測儀器 該儀器包含激發及偵測子系統用於與樣品相互作用且對 樣品作訊問。樣品通常包括一或多個經染料（例如螢光染 料）標記之生物分子（包括（但不限於）DNA、RNA及蛋白 質）°激:發子系統包含激發源及激發光束路徑，其中光學 元件包括透鏡、針孔、鏡及物鏡，以調節並聚焦激發/偵 測窗口中之激發源。樣品之光學激發可藉由一系列雷射器 類型來完成，其中發射波長在400至650 nm之間的可見區 Θ °固態雷射器可提供約460 nm、488 nm及532 nm之發射 波長 此等雷射器包括（例如）來自Coherent (Santa .Clara, CA)之c〇mpass、sapphire及Verdi產品。氣體雷射器包括發 射約 48 8 nm、514 nm、543 nm、595 nm及 63 2 nm之可見波 長的氣離子及氦氖雷射器。具有可見區發射波長之其他雷 射器可自CrystaLaser(Reno，NV)購得。在一實施例中，可 131622.doc -47- 200909794 使用 488 nm固態雷射器 Sapphire 488 2〇〇(c〇herent，santa

Clara，CA)。在另一實施例中，可使用波長超過可見光範 圍之光源來激發具有超過可見光範圍之吸收及/或發射光 譜的染料（例如，紅外或紫外發射染料）。或者可藉由使用 具有適於染料激發之發射波長之非雷射器光源（包括發光 一極體及燈）獲得光學激發。 偵測子系統包含一或多個光學偵測器、波長色散裝置 (其進行波長分離）及一或一系列光學元件，該或該等光學 兀件包括（但不限於）透鏡、針孔、鏡及物鏡以自在激發/偵 測窗口處存在之經螢光團標記之DNA片段收集發射之螢 光。所發射之螢光可來自單一染料或染料組合。為辨別信 號以確定其來自發射染料之貢獻，可使用螢光之波長分 離。此可藉由使用二向色鏡及帶通過濾器元件（可自包括 ❿咖，R〇Ckingham，VT及 Omega Optical Brattleb〇r〇, ντ 之眾多供應商購得）達成。在此組態中，發射之榮光通過 -系列一向色鏡，纟中波長之一部分將被鏡反射以繼續沿 著路㈣進’而其他部分將通過。一系列離散光❹:器 (各者定位於二向色鏡之末端）將偵測特定範圍波長之光。 可將—帶通過攄以位於二向色鏡與光㈣器之間以在偵 測前進-步使波長範圍變窄。可用以㈣波長-分離信號 之光學制器包括光電二極體、崩潰光電二極體、光電J 增管模組及CCD攝影機。此等光學偵測器可購自諸如

Hamamatsu(Bridgewater，NJ)之供應商。 在—實施例中，藉由使用二向色鏡及帶通m分離波 131622.doc -48- 200909794 長成分，且用光電倍增管（PMT)偵測器（H7732-10, Hamamatsu)偵測此等波長成分。可選擇二向色鏡及帶通組 件以使PMT之各者上之入射光由對應於螢光染料之發射波 長之窄波長帶組成。該帶通通常經選擇以具有波長範圍在 1與50 nm之間之帶通的螢光發射峄為中心。該系統能夠進 行八種顏色偵測且可經設計具有八個ΡΜτ及相應之一套二 向色鏡與帶通過濾器以將發射之螢光分成八種不同顏色。 藉由應用額外之二向色鏡、帶通過濾器及pMT可偵測八種 以上染料。圖15展示離散帶通過濾器及二向色過濾器實施 例之光束路徑。此波長辨別及偵測組態之一種整合形式為 H9797R，Hamamatsu，Bridgewater，NJ。 辨別構成螢光信號之染料之另一方法包括使用諸如 鏡、繞射光柵、透射光柵（可自包括Th〇rLabs，Newt〇n， NJ;及Newport，Irvine，CA之眾多供應商購得）；及攝譜儀 (可自包括Hcmba J0bin-YV0n，Edis〇n，犯之眾多供應商購 得）之波長色散元件及系統。在此操作模式中，螢光之波 長成分分散於物理空間。沿此物理空間置放之偵測器元件 偵測光且使偵測器元件之物理位置與波長具相關性。適用 於此功能之m為基於陣列的且包括多元件光電二極 體、CCD攝影機、後㈣⑽_職、多陽極驗。孰 習該項技術者將能夠應収長色散元件及光學偵測器元件

之組合以產生能約辨別爽自备& 士 β I ㈣來自系統中所使用之染料之波長的 糸統。 在另一實施例中 使用攝§普儀替代二向色及帶通過濾器 131622.doc -49- 200909794 自激發螢光分離波長成分。攝譜儀設計之細節可在John James, Spectrograph Design Fundamental, Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2007 中獲得。在本申請案 中使用具有凹面全像光柵，光譜範圍為505-670 nm之攝譜 儀 P/N MF-34(P/N 532.00.570)(HORIBA Jobin Yvon Inc， Edison，NJ)。可用線性32-元件ΡΜΤ偵測器陣列（Η7260-20, Hamamatsu，Bridgewater，NJ)完成摘測。收集之營光在針 孔上成像、反射、色散、及藉由凹面全像光柵成像於線性 PMT侦測器上，該偵測器安裝於攝譜儀之輸出端口處。基 於PMT之偵測器之使用利用PMT偵測器之低的暗雜訊、高 敏感性、高動態範圍及快速響應特徵。用於偵測激發螢光 之攝谱儀及多元件PMT偵測器之使用允許可應用於該等系 統中及道中之染料數目及染料之發射波長之彈性，無需物 理重組態儀器之偵測系統（二向色、帶通及偵測器）。自此 組態收集之資料為橫越對於各道之各掃描而言可見波長範 圍之波長依賴性光譜。每掃描產生之完整光譜提供根據染 料發射波長及可存在於樣品中之染料數目之染料彈性。此 外’當陣列中所有PMT元件平行讀出時，光譜儀及線性多 兀件PMT偵測器之使用亦允許極快讀出速率。圖w展示多 元件PMT及攝谱儀實施例之光束路徑。 、，儀器可使用操作之起始模式，㈣時偏測多道且同時伯 測多波長。在一組態中，激發光束同時衝擊於所有道上。 =自，之螢光藉由諸如CCD攝影機或陣列之：㈣測器收 ’、此收集之起始模式中，使用波長色散元件。偵測器 I31622.doc •50· 200909794 之一維表示物理波長分離，而另一維表示空間或道-道分 離。 對於多樣品之同時激發及偵測而言，使用掃描鏡系統 (62)(P/N 6240HA, 67124-H-0 及 6M2420X40S100S1，

Cambridge technology, Cambridge MA)以控制激發及偵測 光束路徑以使生物晶片之道之各者成像。在此操作模式 中’掃描鏡控制光束路徑，自道至道自第一道至最後道連 續掃描’且再次自第一道至最後道再重複該過程。使用諸 如美國專利申請公開案第US 2006-026094 1-A1號之尋找道 之演算法來識別道之位置。 用於同時多道及多種染料偵測之光學偵測系統之實施例 展示於圖1 6中。螢光激發及偵測系統40藉由經由一部分微 通道之各者掃描能源（例如雷射器光束）來激發藉由DNA樣 品（例如含有在一套STR位置擴增後之DnA片段）之電泳分 離之成分’同時收集並傳遞來自染料之誘發螢光至一或多 個光偵測器用於記錄，且最終分析。 在一實施例中，螢光激發及偵測總成4〇包括一雷射器 6〇、一掃描器62、一或多個光偵測器64及各個鏡68、攝譜 儀及用於經由開口 42將自雷射器6〇發出之雷射光束傳遞至 測忒模組55且返回至光偵測器64之透鏡72。掃描器62將入 射田射光束移動至相對於測試模組55之各種掃描位置。特 疋s之，掃描器62將雷射光束移動至測試模組％中之各微 通道之有關部分以偵測各別分離成分。多元件pMT 64收集 來自測試模組ss之資料（例如來自變化長度之DNA片段之 131622.doc •51 - 200909794 螢光彳§號）且將該資料經由連接至埠75之電纜電子提供至 位於保護層50外之資料獲得及儲存系統。在一實施例中， 貝料獲得及儲存系統可包括可購自〇pti〇n C〇mputers(13 audreuil_D〇ri〇n，Quebee，Canada)之加固電 腦。 在另實把例中（"起始模式"），激發源同時入射至所有 偵測點上，且來自所有偵測點之螢光經同時收集。同時可 經兩維偵測器陣列進行光譜色散（偵測螢光之波長光譜）及 空間色散（偵測點）。在此組態中，該2維偵測器陣列定位於 "亥系、”先中以使光谱成分橫越陣列偵測器之一維（列）成像並 偵測’而$間成分橫越陣列情測器之另__ _成像並偵測。 較佳儀器使用操作之掃描模式，而非，，起始"模式。在掃 描杈式中，當掃描器與欲訊問之道符合且在其入射在另一 通道上之前，各通道之信號需要被收集、整合、及讀出。 具有快速讀出之㈣器允許最佳光收集及整合，轉譯成較 高之信號-雜訊效能。理想地’偵測器之讀出時間應顯著 小於掃描器與通道符合之總時間。多元件ρΜτ可在小於 ms之日守間4出且此讀出時間遠小於各個別通道之偵測的整 合時間。 、 上之螢光入射光可經光栅根據其波長組成色散且聚 焦於線性多陽極P朗貞測器陣列上。該偵測器提供Μ個電 流輸出’陣列中每元件中之一者對應於入射於元件上之光 子之數目。在多樣品(或道)偵測過程中，當雷射器在適當 位置激發所選擇之道，積分電路將整合ρΜτ輸出電流至產 131622.doc •52· 200909794 生與整合PMT電流成比例之輸出電壓。同時，使用Anal〇g

Devices(Norw〇〇d，MA)微分驅動器 IC(p/N 8讀2142)將單 一端輸出電壓轉換成微分模式。在整合時間（藉由掃描速 率及道之數目確定）結束時，資料獲得系統將讀出微分信 號且在其緩衝器中保存資料。當保存資料後，系統將移動 掃描器以將雷射光束轉移至另一選擇之道，同時重設積分 電路。 各單一元件PMT模組具有其自身之積分電路。對於8顏 色偵測系統而言，存在8個PMT模組及8個積分電路。使用 相應數目之PMT模組及積分電路可添加額外顏色。 由於 PMT 元件（H77260-20, Hamamatsu，Japan)之各者具 有與單一PMT管（H7732-10, Hamamatsu，japan)類似或更快 之仏號反映，且平行讀出，因此能夠非常快速地操作此偵 測器。當與光譜儀耦合時，此光譜儀及多陽極偵測器系統 月匕ki、杈越可見光譜（450 nm至65 0 nm)之完全光譜掃描， 讀出時間小於0.1 。 提供快速更新率之能力允許將此光譜儀/债測器系統應 用於在單-運#中連續須測多道之掃描模式實施例。基於 之偵測器之使用提供低雜訊、高敏感性及高動態範圍 及快速響應。具有凹面全像光柵（Horiba Jobin-Yvon)及多 陽極PMT偵測器之14〇 mm光譜儀為H726〇_2〇偵測器 (Hamamatsu，Japan)。其他光譜儀組態及多陽極pMT偵測 益亦可用於本申請案。 使用信號處理演算法修正、㈣及分析資料來獲得測定 131622.doc -53- 200909794 電泳圖之核*酸鹼基。此過程由定位一可呼叫信號、修正 ^號基線、過滤雜訊、移除顏色串擾kwss—ulk)、識別信 號峰及測疋相關之驗基。進行定位可呼叫信號以自信號 #幵1始與束移⑨無關資料且藉由使目㉟限值來完成。接 著’ Ms號移除背景’因此該信號料所有㈣之顏色具 有通用基線。最終’應用低通濾波器以自信號移除高頻雜 訊。 為消除偵測之顏色歧義，計算一加權矩陣且應用於信號 以擴增核苷酸·染料光譜之顏色_空間。此顏色分離矩陣之 口十算使用Li等人，£/6£^0户六0^以、1999，2〇，1433 1442之 方法几成。在此適應中，自相關之檢定中所使用之染料數 目”m"及偵測器元件數目之，v，計算、χη”顏色分離矩陣。 來自偵測器空間（ΡΜΤ元件）之信號轉化成染料空間係藉由 如下所述之矩陣運算來進行：d=cSMxPMT，其中D為m染 料之各者之染料空間中之信號，CSM為顏色分離矩陣，且 PMT為具有來自偵測器之η元件之各者之信號之矩陣。 其次’使用零交又濾波器及頻率分析之組合識別顏色分 離信號中之峰。最終’對於測片段大小之應用，修正之迹 線為等位基因-對應的（allele_called)以識別各片段且基於 測大小標準分配片段大小。對於DNA測序應用而言，修正 之迹線為驗基-對應的（base-called)以將四種核苷酸之一者 與迹線中各峰相關聯。鹼基對應之詳細描述可在Ewing等 人，Gwome 及wearc/z，1998，8，175-1 85，及 Ewing等人， 1998, 8，186-194，該等揭示案之全文以 131622.doc -54- 200909794 引用之方式併入本文中。 3.染料標記 連接於寡核苷酸及經修飾之募核苷酸上之染料標記可為 合成的或購買的（例如〇per〇n Bi〇techn〇丨〇gies、

HuntsvHle、Alabama)。大量染料（大於5〇種）可應用於螢光 激發應用中。此等染料包括彼等來自螢光素、若丹明

AlexaFluor、Biodipy、Coumarin及Cyanine染料家庭。此 外，亦可使用抑止劑用於標記寡序列以最小化背景螢光。 可購得且可使用具有41〇 nm(casca(je Blue)至775 nm(Alexa

Fluor 750)之發射最大值的染料。在5〇〇 11111至7〇〇 nm範圍 之間之染料具有在可見光譜中且可使用習知光電倍增管偵 測之優點。可購得之染料之廣泛範圍允許選擇具有發射波 長遍及偵測範圍之染料組。已報導能夠辨別許多染料之偵 測系統用於流式細胞儀應用（參見Perfett〇等人， /m则⑽/· 2004, 4，648-55 ;及 R〇binson 等人，〇/ 5戶/五 2005, 5692, 359-365)。 螢光染料具有自其峰發射波長藍移通常20至50 nm之峰 激發波長《因此，使用大範圍發射波長之染料可需要使用 多重激發源，其中在發射波長範圍内激發波長達成染料之 有效激發。或者，可使用能量轉移染料以使具有單一發射 波長之單一雷射器適用於激發所關注之所有染料。此藉由 將能量轉移部分連接至染料標記而達成。此部分通常為另 一螢光染料，其具有與光源（例如雷射器）之激發波長相容 之吸收波長。非常接近於發射器之此吸收器之放置使得吸 131622.doc -55· 200909794 收能量自吸收器轉移至發射器，允許長波長染料之更有效 激發（Ju等人 ’ /Voc dciirf Sc，· i7 j 1995, 92, 4347- 51)。 經染料標記之二脫氧核苷酸可購自Perkin Elmer， (Waltham, ΜΑ)。 Β,實例 t m核酸之六色分離及偵測

以下實例說明經6種螢光染料標記之核酸片段之分離及 偵測，且展示光譜儀/多元件激發/偵測系統之顏色解析能 力。藉由在多重PCR擴增反應中應用經螢光標記之引子以 6-FAM、VIC、NED、PET染料標記DNA片段。在此反應 中，在根據製造商所推薦之條件下使1 ng人類基因DNA (9947A)在25 μΙ_ν反應中擴增（AmpFlSTR Identifiler，Applied Biosystems)。移除 2.7 pL PCR 產物且與 0.3 pL GS500-LIZ 測大小標準物（Applied Biosystems)及 〇·3 HD400-ROX測 大小^準物相混合。添加HiDi(Applied Biosystems)至總共 1 3 pL且將樣品插入分離生物晶片之樣品孔中且經受電 泳。 使用由一系列四操作組成之Genebench進行DNA之電泳 分離.預電泳、載入、注入及分離。此等操作在微流體生 物晶片上進行，將該生物晶片加熱至5〇。〇之均一溫度。生 物晶片含有1 6通道系統用於多次分離及偵測，各由注入器 通道及分離通道組成。用於分析之DNA藉由DNA之電泳輸 送經由篩分基質沿分離通道分離。生物晶片之分離長度在 131622.doc -56- 200909794 160至180 mm範圍内。 第-步驟為預電泳’其藉由沿通道長度施加i6〇 v/c_ 達六⑹分鐘來實現。將分離緩衝液（ττΕιχ)注人陽極、陰 極及廢物孔中，於分析之樣品注入樣品孔中且自樣品 孔向廢物孔施加175 V達18秒，隨後橫越樣品及廢物孔施 加175 V，且在陰極施加39〇 ¥達72秒，將樣品載入分離通 道中。樣品之注入藉由沿分離通道長度施加16〇 v/cm場完 成，同時分別橫越樣品及廢物孔施加5〇 v/cm及4〇 v/cm之 場。用注入電壓參數30分鐘來繼續分離，其中在該3〇分鐘 期間，光學系統偵測DNA之分離帶。此資料收集速率為5 Hz且PMT增益設置為_8〇〇 V。 載入含有擴增DNA之16個樣品用於同時分離及偵測。收 集來自32-元件PMT之各者之信號作為時間之函數以產生 電泳圖。所得電泳圖（圖丨7)展示對應於丨6道之一者的激發/ 偵測窗口處之DNA片段之存在的峰。此外，對於各峰而 言’ 32-元件PMT之各元件的相對信號強度對應於與dNA 片段相關之染料之光譜含量（或染料，若一種以上染料存 在於偵測窗口）。圖1 8展示所偵測之染料的發射光譜，及 基板之背景光譜。將基板背景光譜自該光譜中減去得到峰 之各者。進行此實踐導致識別6種不同染料光譜。6種染料 之光譜在相同曲線上疊置。將此資料與實際公開之染料光 譜的相比較顯展示該等染料之相對值類似於公開之資料。 此實例展示說明該系統能偵測且分辨反應溶液中之6種染 料。此之光譜輸出用於產生顏色修正矩陣且將信號自偵測 131622.doc -57- 200909794 器空間轉換至染料空間表示（圖1 9及20)。 f核酸之八色分離及偵測 在此實例中，展示經螢光染料標記之酸的8種染料分離 及偵測。對於8位點之前向引子及反向引子對序列係自公 開之序列中選擇（Butler 等人，Fore/iy/c 5ci 2003，48 1054-64)。 雖然文件中所述之任何位點及因此之引子對亦可用於本 實例’但所選擇之位點為CSF1P0、FGA、TH01、TPOX、 vWA、D3S 13 58、D5S818及D7S820。對於引子對而言，前 向引子之各者係經獨立之螢光染料標記（〇per〇n Biotechnologies，Huntsville，Alabama)。所選擇之用於連接 至引子之染料包括 Alexa Fluor Dyes 488、430、555、 5 68、5 94、63 3、647及Tamra。眾多其他染料為可購得的 且亦可用作標記。各位點係根據（Butler, 20〇3，/J·)之pcr 反應方案獨立地擴增以產生具有經相應染料標記之片段之 反應溶液。PCR反應之模板為1 ng人類基因dna(來自

Promega，Madison WI之類型 9947A)。 各PCR反應物係藉由經PCr淨化管柱淨化而純化，其中 將引子（經標記及經染料標記之引子）及酶移除且藉由以溶 離劑交換PCR緩衝液。淨化之所得產物為DI水中經標記 DNA片段之溶液。使用MinEluteTM管柱（⑺吨⑶， CA)根據Smith方案進行經染料標記之產物之淨化。共進行 八次反應。將八次淨化之PCR反應物以產生相等信號強度 之峰之比率混合在一起，從而產生含有經8種不同染料標 131622.doc -58- 200909794 °己之片段的混合物。或者，可將8個位點之引子混合在一 起以形成主要引子混合物以供多重擴增。 用如實例1中所述之儀器及方案分離及偵測此溶液。調 即攝4儀之光栅以使8種染料之發射落於偵測器元件之32 像素範圍内。調節所裝載以供分析之樣品數量以使所偵測 之k號屬於偵測系統之動態範圍。 ’例T ·光譜儀/多元件pMT系統 以下實例說明用圖1 6之光譜儀/多元件pMT系統對經標 。己DNA片段之分離/偵測’特定言之用於識別〇να模板之 序列。在此反應中’根據所推薦之反應條件用GE Amersham BigDyeTM測序套組使0」pm〇1 DNA模板M13及 M13測序引子擴增。藉由乙醇沈澱且再懸浮於13 pL 〇1水 中來淨化反應混合物。在如實例5中所述之電泳分離條件 下分離樣品。改變樣品裝載條件且藉由將175 v越過樣品 孔施加至廢物扎達丨05秒來進行。圖2丨展示DNA序列之電 泳圖’其中有色迹線表示對應於所使用之4種染料各者之 光譜最大值的偵測器元件。所獲得之序列為519個鹼基的 對應於Phred品質分數>2〇之鹼基及435個鹼基之QV30(圖 22)= 實例8.兩種測序反應產物之同時分離及偵測 在此實例中，同時在單一分離通道中進行來自兩個dna 模板循環測序之片段之分離及偵測。可藉由如下所述之經 染料標記之終止子反應或經染料標記之引子反應製備循環 測序反應： 131622.doc -59- 200909794 對於經染料標記之終止子反應： 準備各模板片段之循環 傾環/則序反應，其中模板片段由以下 各物組成：適用於所M 下 m二 模板序列之測序引子；及用於 進仃DNA測序之試劑，句 L括循％測序緩衝劑、聚合酶、募 核皆H氧核«及經標記之二脫氧核«。使用Γ 種不同染料用於標記。…循環測序反應中，使用一組 經4種染料標記之二脫負妨过缺 脫氧核苷酸。在第二循環測序反應 r

，使用另-組經4種染料標記之二脫氧核苦酸（其中發射 波長不同於彼等在第-循環測序反應中所使用之四種毕 料根據使各反應多次熱循環之方案獨立進行各循環測 序反應。各熱循環包括變性、退火及延伸步驟，其中溫度 及次數遵循桑格方案(參見’桑格等人，户_…⑽ W M W977’ 74’ 5463_7)。合併來自兩反應之循環測序 產物以形成來自兩個DNA模板之各者的由經總共八種獨特 之染料標記之DNA片段組成的樣品。 對於經染料標記之引子反應： 或者，用於分離及偵測之樣品可藉由使用經引子標記之 循環測序製造。對於各DNA模板進行四個循環測序反應。 各反應為由經標記之測序引子及進行DNA測序之試劑（包 括循環測序緩衝劑、聚合酶、募核苦酸）所組成之循環測 序反應。此外，各反應將包括二脫氧核苷酸（ddATp、 cidTTP、ddCTP或ddGTP)及一經標記引子中之一者。各與 引子締合之染料具有獨特之發射波長且與循環測序溶液中 之二脫氧核苷酸之類型（ddATP、ddTTP、ddCTp或ddGTp) 131622.doc -60- 200909794 相關。根據使各反應多次熱循環之方案獨立進行各循環測 序反應。各熱循環包括變性、退火及延伸步驟，其中溫声 及次數遵循桑格方案（參見，桑格，1977,从）。對於= 測序第二DNA模板，使用另一組4種染料（其中發射波長不 同於在第一循環測序反應中所使用之四種染料）。將所有 八個反應（各具有不同染料）之產物混合在一起以形成由來 自兩種DNA模板之各者之DNA片段組成的樣品。 用於分離及偵測之樣品： 藉由乙醇沈殿淨化測序反應之各者。樣品之分離及偵測 遵循實例8之方案。分離及㈣之結果為生成兩種不同 DNA序列’對應於兩種模板DNA片段之各者。 本實例之方法可經改良以允許使用四之倍數之染料來偵 測單一分離通道中成該倍數之D N A序列（例如用於同時偵 測3種序列之丨2種染料、用於同時偵測4種序列之16種染 料、用於同時偵測5種序列之20種染料，等等）。最終，經 標記片段之分離不需受限於電泳。 實例9 在單一通道中之500個或500個以上的位點之分離及偵測 存在若干種可應用於臨床診斷之核酸分析之應用，包括 DNA及RNA測序及片段大小測定。在此實例中，同時偵測 1〇種顏色之使用使得訊問多達5〇〇個位點。例如，可使用 大量片段之大小分析來識別病原體或表徵個體基因組内之 許多位點。在產前及胚胎植入前遺傳診斷之背景下，目前 藉由核型及藉由螢光原位雜交（FISH)診斷非整倍體。在 I3I622.doc -61 - 200909794 FISH研究中，每細胞兩個信號之存在表明在該細胞中存& 給定位點之兩複本，一個信號表明單體性或部分單體性， 且三個信號表明三體性或部分三體性。FISH通常使用約j 〇 個探針以分析細胞是否含有正常染色體補體。然而此方法_ 不允許對整個基因組之詳細檢視，且由FISH得知表現為正 常之細胞很可能具有不能為該技術所偵測之主要異常。 本發明之教示使用多色分離及4貞測以允許約5 00個染色 體位點廣泛分散遍及所有欲分析之染色體，從而允許對染 色體結構更詳細之分析。在此實例中，自公開之序列中選 擇約500個位點之引子對序列，其中各位點作為每單倍體 基因組之單一複本存在。此外，選擇1 0組50個引子對以使 各組界定相應之DN A片段組，以使該等片段中無相同大小 者。對於各組而言，將引子對之前向引子以一種螢光染料 標記，且無兩組共有相同染料。所選擇之用於連接至引子 之染料為 Alexa Fluor Dyes 488、430、555、568、594、 633、647、680、700及Tamra。眾多其他染料為可購的且 亦可用作標記《位點可在一或若干平行PCR反應中擴增， 此如上述"METHODS FOR RAPID MULTIPLEXED AMPLIFICATION OF TARGET NUCLEIC ACIDS"中所述。 使用本文中所述之方法分離及偵測經擴增之引子。在單一 分離通道中，可根據大小精確識別所有500個片段，每十 種染料識別50個片段。 位點、染料及分離通道之數目可基於所想要之應用變 化。若需要可藉由使用較小數目之染料標記或每標記產生 131622.doc -62- 200909794 f 加 車义少DNA片段來谓測較小數目之片段；因此，小於、 小於4〇〇、小於300、小於2〇〇、小於1〇〇、小於75、小於 小於4〇、j、於3〇或小於2〇個片段可如所希望㈣測。 每道可識別之位點之最大數目係基於分離系統之讀出長度 及解析（例如⑽至】驗基對範圍内之崎片段之單一驗 基對解析導致數百片段）乘以可偵測之不同染料之數目（如 上所述’可獲得數打)。因此，在單一分離通道中可識別 數以千計之位點，且當開發額外之染料時，該數目將增 圖式簡單說明】 圖1為針對4個個別樣品之溶解及模板擴增而言的整合生 物日a片之實施例的圖示。 圖2為圖1之生物晶片的第一層之實施例的圖示。 為圖1之生物晶片的第二層之實施例的圖示。 圖4為圖1之生物晶片的第三層之實施例的圖示。 圖5為圖1之生物晶片的第四層之實施例的圖示。 之生物晶片的裝配及連接之實施例的圖示。 子==對兩種間(平面内間及通孔間)而言的去離 :序試劑之閥的毛細管閥㈣力與反 仅之函數關係的圖。 且 圖8為展示針對PCR模板擴增而 體步驟之實施例的圖示。 之生物曰曰片的流 片試劑裝載於本發明之生物晶 131622.doc -63- 200909794 圖8b為展示經由通道至樣品室 士羊。、S、苦、丨 遞樣DO之圖示（盆係 樣。4道以不同位置展示以說明流動路徑)。 圖8c為展示樣品室中之樣品的“。 圖8d為展示將PCR試劑傳遞至試劑室之圖示。 圖8e為展示將過量pcR試劑抽出之圖示。不。 圖8f及8g為展示藉由筮 , 合步驟及滞留之圖Γ 管間進行液體之初始混 圖8h至8j為展示將混合液體傳遞至pcR室之圖示，其中 在该點處開始熱循環。 、 圖9為展示整合生物曰y 0生物阳片之流體步驟之實施例的圖示。 圖至％為展不將循環測序試劑傳遞至層1中之計量官 且自該等室附近移除過量試劑的圖示。 圖9f及9g為展示將PCR產物引人桑格反應 圖91"处為展示藉由往復運動將桑格試劑與PCR產物混合 之圖示。 圖91為展示循環產物可加以移除以供分析之圖示。 圖10為對圖1之生物晶片t產生之產物測序的測序迹線 (電泳圖）。 圖11為展示針對循環測序產物之超濾效能而言的整合生 物::片之實施例的圖示。除在層3與4之間添加超濾㈣過 濾器1116外’该晶片裝配類似於生物晶片1之裝配。 圖12為展示在測序產物之純化期間圖11之生物晶片之流 體步驟的圖示。 圖123及1213為展示將桑格產物傳遞至UF輸入室之圖示。 131622.doc -64- 200909794 圖1 2c為展示已將測序產物傳遞至過遽室之圖示 圖12d為展示測序產物幾乎完全過據之圖示。 圖126至12§為展示將洗滌劑傳遞至111?輸入室且接著自傳 遞通道移除過量洗滌劑之圖示。 圖12h為展示第一洗滌循環開始之圖示；其後為如圖 中之過濾及隨後之洗滌循環。 圖12ι及12j為展不傳遞至UF輸入室之溶離液體（與洗滌 劑相同之液體）的圖示。 《 圖12k到12m為展示對UF輸入室加壓且關閉輸出埠並接 著釋放壓力導致往復運動之單一循環的圖示。 圖12η為展示為進一步處理或移除而準備之純化產物的 圖示。 圖13為展示針對模板擴增、循環測序、測序產物淨化、 藉由電泳分離及藉由雷射誘發螢光偵測之效能而言的整合 生物晶片之實施例的圖示。 圖14為展示藉由反電極使經標記之核酸片段濃縮且注入 ν 分離通道的圖示。 圖15為展示激發及偵測系統之實施例的圖示。 圖16為展示激發及偵測系統之實施例的圖示。 圖17為分離及偵測6-染料樣品所產生之電泳圖。圖中各 迹線表示來自32-陽極光電倍增管（ρμτ)232個元件中之各 者的信號。各迹線相對於彼此偏移以允許資料易於被檢 視。 圖18為展示自電泳圖提取的6種染料之各者之染料光譜 131622.doc -65- 200909794 的圖；亦展示背景螢光光譜。 圖19為展示6-FAM、VIC、NED、PET及LIZ染料之染料 發射光譜的圖。 圖20為展示5-FAM、JOE、NED及ROX染料之染料發射 光譜的圖。 圖21為分離及偵測4種染料樣品所產生之電泳圖。圖中 各迹線表示來自32-陽極PMT之32個元件中之各者的信 號。各迹線相對於彼此偏移以允許資料易於被檢視。 圖22為測序迹線。 【主要元件符號說明】 40 螢光激發及偵測總成 42 開口 50 保護層 55 測試模組 60 雷射器 62 掃描器/掃描鏡系統 64 光偵測器/多元件PMT 68 鏡 72 透鏡 75 埠 101 室 104 埠 105 埠 106 埠 131622.doc -66 - 200909794 107 埠 108 埠 109 埠 202 通孔 203 通孔 204 樣品室 205 第一混合接合點 208 分配通道 209 計量室 210 毛細管閥 211 毛細管閥 212 混合球形物 213 收縮部分 214 混合通道 215 通孑L 216 通孑L 217 通孔 218 循環測序試劑計量室 219 毛細管閥 220 毛細管閥 221 毛細管閥 227 通孔 303 樣品通道 304 通孔/通道 131622.doc •67- 200909794

305 通孔 306 通孔 307 室 308 通孔 309 室 310 通道 311 通孔 314 通孔 315 通孔 316 通孔 317 通孔 320 通孔 336 通孔 402 通孔 403 通孔 404 通孔 502 PCR室 503 循環測序室 1104 埠 1105 通道 1106 室 1108 毛細管閥 1110 通孔毛細管閥 1111 通孔 131622.doc -68- 200909794 1112 UF輸入室 1113 毛細管閥 1115 過濾室 1116 超濾（UF)過濾器 1119 埠 1120 埠 1121 儲集器/室 1122 通道 1123 溢流室 1124 埠 1301 整合生物晶片 1302 16-樣品生物晶片/子組件 1303 1 6-道塑料分離生物晶片/分離子組件 1304 輸送點 1305 輸入孔 1306 分離通道 1307 偵測區 1308 凹處 1401 液體接收孔/孔儲集器 1402 主要分離電極 1403 反電極 131622.doc -69-

Claims (1)

1. 200909794 十、申請專利範圍： 1 · 一種光學偵測器，其包含： -或多個光源，其經定位用以照明一基板上之一或複 數個偵測位置； 或複數個第一光學元件，其經定位用以收集且引導 自該基板上之該等偵測位置發出之光；及 “光偵測器，其經定位以接收來自該等第一光學元件 “其中該光偵測器包含一波長色散元件，該波長色 ’ 政兀件用於根據光波長分離來自該等第一光學元件之光 且經疋位以將一部分經分離之光提供至偵測元件，其中 該等债測7〇件之各者與一用於同時自該等侦測元件之 各^收集_資訊之第-控制元件連通，且其中該光偵 測态偵测來自標記-或多個生物分子之至少6種染料之 螢光，各染料具有獨特之峰值發射波長。 2. 如請求項丨之光學谓測器，其中該等生物分子為核酸。 3. 士咐求項2之光學偵測器，其中該核酸為。 、4.如哨求項3之光學偵測器，其中該光偵測器偵測來自至 少8種不同染料之螢光，各染料為至少兩個含有4種染料 之子集之成員，以使該等子集能夠在該基板上之—單一 福測位置處區別至少兩種題序列，其中染料數目為四 的倍數，且欲偵測之DNA序列之數目等於該倍數以致 該等不同染料之各者僅存在於一個子集中。 5·如請求項！之光學偵測器，其中該等生物分子為蛋白 13I622.doc 200909794 6_如請求項1之光學偵測器 器。 其中至少 一個光源為一雷射 7.如請求項丨之光學偵測器，其 外光、可8本Λ , 侦測元件能夠偵測紫 了見先、紅外光或其組合。 8·如請求項丨之光學偵測器，其進一 於在遴叙加从、， 步包含一鏡，該鏡用 、在後數個偵測位置之間連續 〇 J.〇 κ ^ Τ ^田该光源。 9. 士印未項1之光學偵測器，其 測哭开批, 逍步包含一二維光學偵 、丨“件，該元件包含用於偵

   1由 工予九譜的至少兩列， 兵中—弟一列偵測一第一獨立f 自獨立道之光學光譜且該第二列 偵测一第二獨立道之光學光譜。 10. 如請求項1之光學偵測器，其中： 各偵測元件為一單陽極光電倍增管，且 該波長色散元件包含-或複數個二向色鏡，該（等）二 向色鏡經定位以將來自該等第―光學元件之光之一部分 提供至該等偵測元件之各者，其中各二向色鏡反射一獨 立預疋波長之光。 11 _如請求項1 〇之光學偵測器，其進一步包含一帶通過濾 器’其中各獨立預定波長之光基本上對應於存在於該等 積測位置之至少一者中的螢光染料之螢光發射最大值。 12. 如請求項10之光學偵測器，其中該波長色散元件為一棱 鏡、繞射光柵、透射光柵、光譜儀或全像繞射光柵。 13. —種用於分離及偵測生物分子之系統，其包含： 一組件，其用於在一基板上之一或複數個通道中同時 分離複數個生物分子，其中各通道包含一偵測位置； 131622.doc 200909794 一或多個光源，其經定位用以照明該基板上之兮 測位置； q寻谓 厂戈複數個第一光學元件，其、經定位用以收集且引導 自该等偵测位置發出之光，·及 -光偵測器’其經定位以接收自該等第一光學元❹ 出之光，其中該光偵測器包含一波長色散元件，該波長 色散元件用於根據光波長分離來自該等第一光學元件之 , *且經，位以將一部分經分離之光提供到貞測元件，其令 2等谓測凡件之各者與一用於同時自該等谓測元件 集谓測資訊之第一控制元件連通，且其中該光 =谓測來自標記一或多個生物分子之至少6種染料 之螢光，各染料具有獨特之峰值波長。 14. 如清求項13之系統’其中該等生物分子為核酸。 15. 如請求項14之系統’其中該核酸為DNA。 16. 如請求項15之系統，i 染料之螢光，…偵測來自至少8種 警先以染料為至少兩個含有4種染料之子集 少兩致該等染料集合能夠在—單一通道中制至 之DNA；?· A序列，其中染料數目為四的倍數，且欲偵測 A序列之數目等”倍數 者僅存在於一個子集中。 文^不同木枓之各 ::二=項13之系統’其中該生物分子為蛋白質。 料且各：：之糸統其中各生物分子獨立地包含螢光染 二=之:學光譜包含獨特之螢先最大值· 求項13之“，其中該組件為-電泳敦置„ 131622.doc 200909794 2〇_如請求項13之系統’其中該光源為一雷射器。 21. 如請求項13之系統，其中各偵測元件能夠制紫外光、 可見光、紅外光或其組合。 22. 如請求項1 3之系統’其 — 运步包含一鏡，該鏡用於在複 數個偵測位置之間連續掃描該光源。 23. 如請求項13之系統，其中： 各偵測元件為一單陽極光電倍增管，且 f 該波長色散元件包含-或複數個二向色鏡，該(等)二 向色鏡經定位以將來自該等第—光學元件之光之一部分 提供至該等^件之各者，其中各二向色鏡反射-獨 立預疋波長之光。 24. 如。月求項23之系統’其進一步包含一帶通過滤器，其中 各獨立預定波長之光基本上對應於存在於該等摘測位置 之至少一者中的螢光染料之螢光發射最大值。 25. 如請求項23之系統，其中—線性多陽極光電倍增管構成 該等偵測元件。 26. 士 „月求項23之系統，其中該波長色散元件為一棱鏡、繞 射光柵、透射光柵、光譜儀或全像繞射光栅。 27_ —種用於分離及偵測複數個生物分子之方法，其包含： 將一或複數個分析樣品提供於一基板上之一或複數個 微流體通道中，其中各微流體通道包含一偵測位置，且 各分析樣品獨立地包含複數個生物分子，各生物分子獨 立地經至少6種染料中之一者標記，各染料具有獨特之 峰值波長； 131622.doc 200909794 同時在各微流體通道中分 分子；及 離該等複數個經標記 之生物 經分 離在各微流體通道中編等複數個 (i)用一光源照明各偵測位置； (11)收集自各偵測位置發出之光； (iH)將所收集之光引向一光偵測器； Ον)根據光波長分離所收集之光·及 Ο)同時偵測來自標記一或多個生物分子之至少6種染 料之螢光，各染料具有獨特之峰值波長。 如月长貝27之方法，其中该分離係藉由在該等複數個微 流體通道之兩端施加一電位來實現。 29. 如請求項27之方法，其中各偵測位置被連續照明。 30. 如請求項27之方法，其中各偵測位置被同時照明。 3!•如請求項27之方法，其中該等染料各自獨立地具有在約 450 nm至約1500 nmi波長範圍内的螢光最大值。 32.如請求項27之方法，其中該等目標分析物包含核酸片 段。 33·如請求項32之方法，其中該等核酸片段為一或多個核酸 擴增反應之產物且該等螢光染料係連接至引子。 34.如請求項32之方法，其中該等核酸片段為―或多個桑格 (Sanger)測序反應之產物且該等登光染料係連接至二脫 氧核苷酸終止子。 3 5.如請求項27之方法，其中各指、'目丨丨吳-,, T合1貝7則盗兀件適用於偵測該等 131622.doc 200909794 螢光染料中之一者。 3 6. —種整合生物晶片系統，其包含： (a) —生物晶片，其包含一或複數個微流體系統，其中各 微流體系統包含一與一分離室形成微流體連通之第一反 應室，其中 該第一反應室係經調適用於： (i) 核酸萃取； (ii) 核酸純化； ’ (iii) 核酸擴增前淨化； (iv) 核酸擴增； (v) 核酸擴增後淨化； (vi) 核酸測序前淨化； (vii) 核酸測序； (viii) 核酸測序後淨化； (ix) 反轉錄； (X)反轉錄前淨化； (xi) 反轉錄後淨化； (xii) 核酸接合； (xiii) 核酸雜交；或 (xiv) 定量；且 該分離室包含一偵測位置； 及 (b) —分離與偵測系統，其包含： (i) 一分離元件，其用於在該等分離室中同時分離複數 131622.doc 200909794 個目標分析物； ⑼一或多個光源，其經定位用以照明該生物晶片上 之該等偵測位置； ㈣-或複數個第—光學元件，其經定位用以收集且 引導自該等偵測位置發出之光；及 (iv)-光制H ’其經定位以接收自該等第—光學元 件引出之光，纟中該光偵測器包含一波長色散元件， 該波長色散元件用於根據光波長分離來自該等第一光 學元件之光且經定位以將一部分經分離之光提供至至 少六個偵測元件，其中 該等偵測元件之各者與—用於同時自該等債測元件 之各者收集偵測資訊之第一控制元件連通；且其中 該光偵測器偵測來自標記一或多個生物分子之至少 6種染料之螢光’各染料具有獨特之峰值波長。 37. —種整合生物晶片系統，其包含：

   (a)—生物晶片，其包含一或複數個微流體系統，其中各 微流體系統包含一與一分離室形成微流體連通之第—反 應室，其中 該第一反應室係經調適用於： ⑴核酸萃取； (ii) 核酸純化； (iii) 核酸擴增前淨化； (iv) 核酸擴增； (v) 核酸擴增後淨化； 131622.doc 200909794 (vi) 核酸測序前淨化； (vii) 核酸測序； (viii) 核酸測序後淨化； (ix) 反轉錄； (X)反轉錄前淨化； (xi) 反轉錄後淨化； (xii) 核酸接合； (xiii) 核酸雜交；或 (xiv) 定量；且 該分離室包含一偵測位置； 及 (b)—分離與偵測系統，其包含： (1)一分離元件，其用於在該等分離室中同時分離複數 個包含DNA序列之生物分子； (π) —或多個光源，其經定位用以照明該生物晶片上 之該專彳貞測位置； (iii) 一或複數個第一光學元件，其經定位用以收集且 引導自該等偵測位置發出之光；及 (iv) —光偵測器，其經定位以接收自該等第一光學元 件引出之光’其中該光偵測器包含一波長色散元件， 該波長色散元件用於根據光波長分離來自該等第一光 學元件之光且經定位以將一部分經分離之光提供至至 少六個偵測元件，其中該等偵測元件之各者與一用於 同時自該等偵測元件之各者收集偵測資訊之第一控制 131622.doc 200909794 元件連通；且 其中該光偵測器偵測來自標記一或多個0]^八序列之至 少8種染料之螢光，各染料具有獨特之峰值波長，該等 染料為至少兩個含有4種染料之子集之成員，以致該等 染料集合能夠在一單一通道中偵測至少兩種峨序列， 其中染料數目為四的倍數 數且欲读測之囊序列之數目 =該倍數’錢該等*同_之各者僅存在於一個子 38:=項36之整合生物晶片系統，其中該第-反應室係 、，二5周適用於核酸萃取。 I月求項36之整合生物晶片系統，其中該第—反應室係 經調適用於核酸純化。 ’、 ' :求項36之整合生物晶片系統，其中該第—反應室係 經s周適用於核酸擴增。 士_ :求項36之整合生物晶片系統，其中該第—反應室係 經調適用於淨化。 :求項36之整合生物晶片系統，其中該第—反應室係 經调適用於核酸測序。 _月求項36之整合生物晶片系統，其中該第一反應室係 經調適用於反轉錄。 月求項36之整合生物晶片系統，其中該第—反應室係 經調適用於核酸接合。 月求項3 6之整合生物晶片系統，其中該第一反應室係 經調適用於核酸雜交。 131622.doc 200909794 46.如請求項36之整合生物晶片系統，其中該第一反應室係 經調適用於定量。 131622.doc -10-