TWI737032B - Ｄｎａ分子大小量測方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供一種DNA分子大小量測方法，包括下列步驟：提供一DNA分子大小量測裝置，包括：一覆蓋基板；一基板，設置於覆蓋基板上且包括一第一孔洞及一第二孔洞；以及一第一狹縫型流道，設置於覆蓋基板與基板間，其中第一狹縫型流道的兩端分別與第一孔洞及第二孔洞連接；透過第一孔洞加入包括一DNA分子的一樣品於第一狹縫型流道，其中DNA分子由第一孔洞朝第二孔洞的方向移動；偵測及記錄DNA分子的分布的強度及面積；以及分析強度及面積，以得到DNA分子的大小。
Description
本揭露關於一種DNA分子大小量測方法。特別是，本揭露關於一種可量測具有千鹼基對(base pair)至百萬鹼基對的DNA分子大小的方法。
DNA分子大小量測為目前分子生物研究的重要及常見的步驟；特別是，對於DNA指紋分析(DNA fingerprinting)、限制酶定位法(restriction mapping)、流行病基因型分型(epidemiologic genotyping)及次世代定序的使用而言為必需的步驟。然而，目前各種分離步驟對於長度約1,000~10,000,000鹼基對(kbp~10Mbp)的大DNA片段的分子大小量測，仍存在有許多挑戰。
凝膠電泳(Gel electrophoresis)及脈衝場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis(PFGE))分別為分離分子量小的DNA(<kbp)及大的DNA(>kbp)的標準方法。雖然PFGE可使用隨時間變化的驅動電壓，以隨著長的DNA移動而展開DNA來分離DNA，但此方法須14小時以分離50kbp的DNA，故相當耗時；且若100kbp的DNA，則須耗費數日。毛細管電泳(Capillary Electrophoresis(CE))使用聚合物溶液而非厚的凝膠，其可使用較高的電壓且同時縮短分離時間。然而，CE仍需1小時以分離50kbp的DNA。
因此，目前亟需發展一種新的方法，其可以簡便且快速的方式量測高達百萬鹼基對DNA分子的大小。
本揭露關於一種DNA分子大小量測方法，其可用於量測大的DNA分子(千鹼基對至百萬鹼基對)的大小。
本揭露的方法包括下列步驟：提供一DNA分子大小量測裝置，包括：一覆蓋基板；一基板，設置於覆蓋基板上且包括一第一孔洞及一第二孔洞；以及一第一狹縫型流道，設置於覆蓋基板與基板間，其中第一狹縫型流道的兩端分別與第一孔洞及第二孔洞連接；透過第一孔洞加入包括一DNA分子的一樣品於第一狹縫型流道，其中DNA分子由第一孔洞朝第二孔洞的方向移動；偵測及記錄DNA分子的分布的強度及面積；以及分析強度及面積，以得到DNA分子的大小。
脈衝場凝膠電泳(PFGE)及毛細管電泳(CE)為商用的大的DNA分子的大小量測方法。PFGE可分離百萬鹼基對的DNA分子，但此方法相當耗時。CE用聚合物溶液而非凝膠，故其分離時間較PFGE短。然而，可使用CE分離的DNA分子最大尺寸僅約50千鹼基對。於本揭露的方法中，包括DNA分子的樣品是為緩衝溶液，故本揭露的方法的分離時間可大幅縮短。此外，能夠以本揭露的方法偵測的DNA分子大小可高達百萬鹼基對，故可擴大本揭露的方法的應用。
於本揭露的方法中，DNA分子的分布的強度及面積可以下式(I-1)進行分析：
S=A×(I-I 0 )/m (I-1)
其中，I 0 為強度的一平均強度的一最小值，m為強度及面積的圖的線性擬合的斜率，A為面積，I為平均強度，而S為DNA分子的有效大小。在此，DNA分子的有效大小與DNA分子的大小成正比。
於本揭露的方法中，DNA分子大小量測裝置可更包括一第二狹縫型流道，設置於覆蓋基板與基板間，其中第二狹縫型流道的兩端分別與基板的一第三孔洞及一第四孔洞連接。在此，第一狹縫型流道可與第二狹縫型流道實質上平行。
當DNA分子大小量測裝置包含第一狹縫型流道與第二狹縫型流道時，包括DNA分子的樣品與包括參考DNA分子的DNA梯狀條帶可同時加入DNA分子大小量測裝置，而DNA梯狀條帶作為一參考標準。因此，於此情形下，本揭露的方法可更包括下列步驟：於加入包括DNA分子的樣品時，透過第三孔洞加入包括參考DNA分子的DNA梯狀條帶於第二狹縫型流道，其中參考DNA分子由第三孔洞朝第四孔洞的方向移動；偵測及記錄DNA梯狀條帶中的參考DNA分子的分布的強度及面積；以及分析DNA梯狀條帶中的參考DNA分子的分布的強度及面積。
當包括DNA分子的樣品與包括參考DNA分子的DNA梯狀條帶同時以本揭露的方法分離時，DNA梯狀條帶中的參考DNA分子的強度及面積與樣品中的DNA分子的分布的強度及面積，可分別以下式(I-1)進行分析：
S=A×(I-I 0 )/m (I-1)其中，I 0 為參考DNA分子的強度的平均強度的最小值或DNA分子的強度的平均強度的最小值，m為參考DNA分子的強度及面積的圖的線性擬合的斜率或DNA分子的強度及面積的圖的線性擬合的斜率，A為參考DNA分子的面積或DNA分
子的面積，I為參考DNA分子的強度的平均強度或DNA分子的強度的平均強度，而S為參考DNA分子的有效大小或DNA分子的有效大小。
在得到DNA梯狀條帶中參考DNA分子的有效大小及樣品中DNA分子的有效大小後，DNA分子的有效大小可與參考DNA分子的有效大小進行比較。由於DNA分子的有效大小與DNA分子的大小成正比，而DNA梯狀條帶中參考DNA分子的大小已知，故可透過將DNA分子的有效大小與參考DNA分子的有效大小進行比較，而可得到樣品中DNA分子的大小。
在本揭露的方法中，DNA分子大小量測裝置可更包括複數貯液槽，設置於基板上且分別與第一孔洞及第二孔洞連接。此外，DNA分子大小量測裝置可更包括複數貯液槽，設置於基板上且分別與第三孔洞及第四孔洞連接。
於本揭露的方法中，DNA分子及參考DNA分子可溶於一緩衝溶液(例如，用於PFGE的緩衝溶液，如TAE緩衝溶液或TBE緩衝溶液)中或溶於水中。因此，分離DNA分子及參考DNA分子的時間可大幅縮短。
於本揭露的方法中，移動DNA分子及參考DNA分子的動力並無特殊限制，只要DNA分子可由第一孔洞朝第二孔洞移動而參考DNA分子可由第三孔洞朝第四孔洞移動。例如，DNA分子及參考DNA分子可透過毛細流動、電場或流場(flow field)移動。
於本揭露的方法中，第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的深度可分別介於100nm至10μm之間，且較佳介於500nm至3μm之間。當第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的深度在此範圍外時，可能會產生影響DNA分子及參考DNA分子亮度的離焦問題。因此，當第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的深度
在此範圍內時，DNA分子及參考DNA分子的強度基本上是與DNA分子及參考DNA分子本身有關。
於本揭露中，第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的長度並無特殊限制。例如，第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的長度可分別介於500μm至1cm之間。
於本揭露中，第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的寬度並無特殊限制。例如，第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的寬度可分別介於50μm至1mm之間。
於本揭露的方法中，透過第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的深度設計，第一狹縫型流道及第二狹縫型流道可稍微的將樣品中的DNA分子及DNA梯狀條帶中的參考DNA分子限制在垂直方向，而不在橫向方向(即，第一狹縫型流道及第二狹縫型流道的長度或寬度方向)。此時，樣品中的DNA分子及DNA梯狀條帶中的參考DNA分子可在一平衡狀態，而樣品中的DNA分子及DNA梯狀條帶中的參考DNA分子是球狀或扁平狀；因此，樣品中的DNA分子及DNA梯狀條帶中的參考DNA分子的大小與有效大小成正比。
於本揭露的方法中，樣品中的DNA分子及DNA梯狀條帶中的參考DNA分子可分別以螢光標記。在此，用於標記DNA分子及參考DNA分子的染料並無特殊限制。當DNA分子及參考DNA分子以螢光標記時，DNA分子及參考DNA分子的分布可使用螢光顯微鏡偵測，且使用如CCD或CMOS照相機來記錄。
於本揭露的方法中，DNA分子大小量測裝置的基板可為一玻璃基板、一二氧化矽基板、一聚甲基丙烯酸甲酯(poly(methyl methacrylate),PMMA)
基板、或一塑膠基板，但本揭露並不僅限於此。於本揭露的一實施態樣中，基板為一熔凝二氧化矽基板(fused silica substrate)。
於本揭露的方法中，DNA分子大小量測裝置的覆蓋基板可為一硼矽玻璃(borosilicate glass)基板，但本揭露並不僅限於此。
於本揭露的方法中，覆蓋基板可透過熱連接而不使用任何塗佈以貼附於基板上。或者，覆蓋基板可為一塗佈有聚合物(例如，聚矽倍半氧烷(polysilsesquioxane))的玻璃，而覆蓋基板可透過一聚合物連接技術而貼附在基板上。然而，本揭露並不僅限於此。
本揭露的其他特徵將透過詳細說明並參考圖式而更加清楚。
11‧‧‧基板
111‧‧‧第一狹縫型流道
112‧‧‧第一孔洞
113‧‧‧第二孔洞
114‧‧‧第二狹縫型流道
115‧‧‧第三孔洞
116‧‧‧第四孔洞
12‧‧‧覆蓋基板
131,132‧‧‧貯液槽
15‧‧‧遮罩
D‧‧‧深度
L‧‧‧長度
W‧‧‧寬度
圖1A至圖1E為本揭露一實施例的DNA分子大小量測裝置的製備流程剖面示意圖。
圖2為本揭露一實施例的DNA分子大小量測裝置的上視圖。
圖3為本揭露測試例1的DNA梯狀條帶的參考DNA分子的分布圖。
圖4為本揭露測試例1的分子面積及平均強度數值的散佈圖。
圖5為本揭露測試例1的DNA梯狀條帶中參考DNA分子的有效分子大小分布直方圖。
圖6為本揭露測試例1的DNA梯狀條帶中參考DNA分子的長度與以線性擬合的擬合點中心的圖。
圖7為本揭露測試例2的樣品中的DNA分子及DNA梯狀條帶中的參考DNA分子有效分子大小分布的直方圖。
圖8為本揭露測試例2的樣品中DNA分子的預測長度及DNA梯狀條帶中參考DNA分子的長度與以線性擬合的擬合點中心的圖。
圖9為本揭露測試例3的DNA梯狀條帶中的參考DNA分子有效分子大小分布的直方圖。
圖10為本揭露測試例3的DNA梯狀條帶中參考DNA分子的長度與以線性擬合的擬合點中心的圖。
以下係藉由具體實施例說明本揭露之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本揭露之其他優點與功效。本揭露亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可針對不同觀點與應用，在不悖離本創作之精神下進行各種修飾與變更。
再者，說明書與請求項中所使用的序數例如”第一”、”第二”等之用詞，以修飾請求項之元件，其本身並不意含及代表該請求元件有任何之前的序數，也不代表某一請求元件與另一請求元件的順序、或是製造方法上的順序，該些序數的使用僅用來使具有某命名的一請求元件得以和另一具有相同命名的請求元件能作出清楚區分。
此外，本說明書和請求項所提及的位置，例如”之上”、”上”、”上方”、”之下”、”下”或”下方”，可指所述兩元件直接接觸，或可指所述兩元件非直接接觸。
同時，當一數值介於一第一數值至一第一數值間時，該數值可為該第一數值、該第二數值、或該第一數值與該第二數值間的另一數值。
樣品製備
包含兩種長度(3kbp及6kbp)片段的樣品，為以限制酶切割的質體DNA。
DNA梯狀條帶(Lambda DNA-HindIII Digest,NEB)及λ-DNA單切割梯狀條帶(λ-DNA Mono Cut ladder)等樣品均以YOYO-1螢光染料(Invitrogen)染色，而染色比例為1：5染料/鹼基對。將DNA梯狀條帶(Lambda DNA-HindIII Digest,NEB)及λ-DNA單切割梯狀條帶等樣品，先以0.5×TBE緩衝溶液(Sigma)配製成濃度為0.1μg/ml，其中，緩衝溶液含有2.5%(w/w)聚(n-乙烯吡咯烷酮)(poly(n-vinylpyrrolidone),PVP,Sigma)(用於抑制電滲透流(electro-osmotic flow))、30%(w/v)蔗糖(J.T.Baker)、50μg/mL及10%(w/v)葡萄糖(Sigma)(用以增加溶液黏度及減緩DNA分子動態，以幫助造像)。緩衝溶液黏度經黏度計(Toki Sangyo)量測後為4.1cP。使用含有0.5%(v/v)β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,BME,Sigma)、50μg/mL葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,Sigma)及10μg/mL過氧化氫酶(catalase,Roche)的除氧系統，以減少光致褪色(photobleaching)。
顯微鏡及影像分析
以螢光顯微鏡系統觀測DNA分子，其中，螢光顯微鏡系統由倒置顯微境(Leica DMI6000)、100×油浸泡或40×透鏡(Leica,N.A.1.35)、及等效像素解析度(equivalent pixel resolution)為130nm之EMCCD照相機(IXon-888,Andor Technologies)所組成。以1frame/sec的速度擷取影像。以MATLAB(The Mathworks,Natick,MA)從CCD影像分析DNA移動。
DNA分子大小量測裝置的製備
圖1A至圖1E為本揭露一實施例的DNA分子大小量測裝置的製備流程剖面示意圖。
如圖1A所示，提供一基板11，其為一熔凝二氧化矽基板。基板11的尺寸為1.4cm2及500μm厚。將以光阻製備的遮罩15置於基板11上。如圖1B所示，以一般黃光顯影製程及蝕刻製程，形成第一狹縫型流道111及第二狹縫型流道(圖未示)。第一狹縫型流道111及第二狹縫型流道(圖未示)是以電感耦合等離子體(ICP)蝕刻形成，其是使用CHF3/CF4/Ar/O2混合氣體，在偏壓/RF功率為700/300W下進行1分鐘。如圖1C所示，使用不鏽鋼遮罩，從裝置的背面進行噴砂機鑽孔，而裝置的正面以光阻保護，以形成第一孔洞112、第二孔洞113、第三孔洞(圖未示)及第四孔洞(圖未示)，而後以丙酮移除光阻，並清洗。第一孔洞112及第二孔洞113與第一狹縫型流道111相連，而第三孔洞(圖未示)及第四孔洞(圖未示)與第二狹縫型流道(圖未示)相連。如圖1D所示，第一狹縫型流道111及第二狹縫型流道(圖未示)同時透過氧電漿表面處理而與聚矽倍半氧烷(PSQ)塗佈的覆蓋基板12連接，其中覆蓋基板12為一硼矽玻璃基板。如圖1E所示，貯液槽131,132透過快速固化黏著劑貼附至基板11上，且分別與第一孔洞112、第二孔洞113、第三孔洞(圖未示)及第四孔洞(圖未示)連接。藉此，可得到本實施例的DNA分子大小量測裝置。
圖2為本實施例的DNA分子大小量測裝置的上視圖。如圖1E及圖2所示，DNA分子大小量測裝置包括：一覆蓋基板12；一基板11，設置於覆蓋基板12上且包括一第一孔洞112、一第二孔洞113、一第三孔洞115及一第四孔洞116；以及一第一狹縫型流道111及一第二狹縫型流道114，設置在覆蓋基板12與基板11間，其中第一狹縫型流道111的兩端分別與第一孔洞112及第二孔洞113連
接，第二狹縫型流道114的兩端則分別與第三孔洞115及第四孔洞116連接。此外，本實施例的DNA分子大小量測裝置更包括：貯液槽131,132，設置於基板11上且分別與第一孔洞112及第二孔洞113連接。即便圖未示，其他貯液槽亦可設置於基板11上且分別與第三孔洞115及第四孔洞116連接。
於本實施例中，第一狹縫型流道111及第二狹縫型流道114深度D分別為500nm或3μm，寬度W分別為100μm，而長度L分別為100μm。此外，第一狹縫型流道111與第二狹縫型流道114實質上平行。
測試例1
於本測試例中，使用如圖1E及圖2所示的DNA分子大小量測裝置。DNA梯狀條帶(Lambda DNA-HindIII Digest,NEB)中的參考DNA分子以嵌入染料YOYO-1螢光標記。將DNA梯狀條帶加入與第一孔洞112連接的貯液槽131中，並透過毛細流動驅動DNA梯狀條帶至第一狹縫型流道111。第一狹縫型流道111的深度D為500nm。而後，以100×油浸泡或40×倍率(數值孔徑(numerical aperture)：1.35及0.6)的螢光顯微鏡偵測DNA梯狀條帶中的參考DNA分子的分布，並以CCD照相機(Andor)紀錄。接著，使用適用於本揭露的軟體(Matlab,The MathWorks,Natick,MA)處理影像，並使用Python 3進行統計分析，最後得到105個別DNA分子。
DNA梯狀條帶中的參考DNA分子的分布影像如圖3所示，其中，矩形表示DNA梯狀條帶的單一視場(field of view)的追蹤分析(tracking analysis)。
於影像處理後，可得到下述特徵：平均強度(I，每單位面積的總強度)、投射面積(projected area)(A)、主軸長度(major axis length)(R g )及最小軸長度(minima axis length)。其中最重要的兩個特徵為平均強度及投射面積。然而，所
得的平均強度及投射面積的分布包含3及4個特徵點，分別對應至樣品中的6個DNA分布(DNA population)。令人注意的是，平均強度及面積的座標散點圖，比僅顯示平均強度或面積的圖，可展現較佳的分布，且與樣品中特徵點的數目相同。根據標準Flory半徑(standard Flory radius)R g =(πbwa 3/4)1/5 N 3/5，DNA大小是介於80nm至810nm之間(1kb~48kb分子)，其中b為持續長度(persistence length)，w為寬度，a為單體尺寸，而N為單體總數。如圖1E及圖2所示，第一狹縫型流道111可將DNA分子稍微限制在垂直方向(R g 
D(如圖1E所示))，但不會限制在航向方向(R g ≪W(如圖2所示))。因此，在一平衡狀態下，DNA分子為球狀或扁平狀。以聚合物於毛細狹縫(例如，圖1E及圖2的第一狹縫型流道111)中穩定流體流動的動作而言，在y方向的拋物線速度梯度會拉伸並使聚合物遠離平衡狀態。如圖4所示，無論DNA聚合物如何拉伸，聚合物球體的結構會反應至較大的投影面積及y方向較低的比率，而有較小的平均強度。因此，由於如分子量、電荷、及緩衝溶液與表面的摩擦力等因素，多數的方法都根據分子的遷移率，但本揭露僅需考慮分子大小特徵即可。
為了減少數據尺寸並得到適當的DNA特徵，在此可使用主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)以得到分子的新特徵。首先，先以標準化預處理數據，而後進行PCA轉換。如圖5及圖6所示，其展現了第一主要特徵的數據合併(data collapse)統計圖。在此，可得到與樣品中6個DNA分布對應的6個特徵值(分子數目：4×104)。於本揭露，此新穎特徵稱之為有效大小(S)。同時，簡單將A與(I-I 0 )相乘，可得到可區別的大小(S)；其中I 0 為平均強度的最小值，m為如圖4所示的圖的線性擬合的斜率。
S=A×(I-I 0 )/m (I-1)
以多高斯函數(multi-Gaussian function)擬合曲線，並析取平均有效大小(<S i >,i 
[0,5])及不同分布的標準偏差，如圖5所示，其為各個分布的曲線以多高斯函數擬合結果。可繪製出平均有效大小對應至DNA分布的預測長度關係圖，如圖6所示，其中線性相關為R 2 =0.9899。平均有效大小與長度的關係呈現線性，且兩相鄰分布間的平均解析度為1.36。此線性關係為提供未知樣品的預測及大小量測的一有效方案。
基於參考數據，無論在相同或不同分類的樣品，均可預測其大小。為了判斷在與梯狀條帶相同分布的DNA分子的大小，在此使用K鄰近演算法(K-nearest neighborhood classification,KNN)，其為監督式學習(supervised learning)的一種。在此，訓練前70%的數據，並測試剩餘數據的分類結果。以手肘法(Elbow method)選擇出最佳K值。下表1顯示分類報告，其顯示此模型可提供一良好的分類結果。
表1
測試例2
為了定量量測未知樣品的大小，將含有DNA分子的樣品及作為標準品的包含參考DNA分子的DNA梯狀條帶(Lambda DNA-HindIII Digest,NEB)分別加入兩個平行的狹縫型流道(如，圖2所示的第一狹縫型流道111及第二狹縫型流道114)。包含兩種長度(3kbp及6kbp)片段的樣品，是以限制酶切割一質體DNA所得。將包含DNA分子的樣品加入第一狹縫型流道111，而DNA分子會從第一孔洞112朝第二孔洞113的方向移動。將DNA梯狀條帶加入第二狹縫型流道114，而DNA梯狀條帶中的參考DNA分子會從第三孔洞115朝第四孔洞116方向移動。而後，偵測及記錄樣品及DNA梯狀條帶的分布影像。在進行與測試例1相同的分析後，可得到樣品及DNA梯狀條帶的直方圖。
圖7為含DNA分子的樣品及含參考DNA分子的DNA梯狀條帶之有效分子大小分布的直方圖，其中深色矩形是指樣品中所含的DNA分子，而淺色矩形是指DNA梯狀條帶中所含的參考DNA分子，每兩個淺色特徵點的平均解析度為1.37。圖8為樣品中DNA分子的預測長度及DNA梯狀條帶中參考DNA分子的長度與以線性擬合的擬合點中心的圖，其中，淺色較小點是指DNA梯狀條帶中參考DNA分子的擬合有效大小與預測梯狀條帶長度，虛線是指強度與千鹼基對長度轉換的線性擬合，而深色較大點是指樣品中兩個偵測點。
如圖8所示，當樣品中的兩個偵測點的位置(即，樣品中DNA分子的有效大小)與DNA梯狀條帶的偵測點的位置(即，DNA梯狀條帶中參考DNA分子的有效大小)相比，可得到樣品數據位在參考梯狀條帶中(1-25kbp)。經由線性回歸，可量測出樣品DNA長度為2,784bp及5,432bp，此與預測長度(2430bp及6743bp)接近。
測試例3
為了評估本揭露方法的能力，在此展現不同標準參考DNA梯狀條帶(從kbp至Mbp)的線性相關。本測試例所使用的方法與測試例1相同，除了下述不同點。
在此使用的DNA梯狀條帶為λ-DNA單切割梯狀條帶(λ-DNA Mono Cut ladder)。
在進行與測試例1相同的分析後，可得到如圖9及圖10所示的結果。圖9為λ-DNA單切割梯狀條帶的有效大小直方圖，其中每個分布的曲線係以多高斯函數擬合。圖10為預測長度與平均有效大小的關係圖，其線性相關為R 2 =0.97。
綜上所述，本揭露提供一種簡易的方法，其可在數分鐘內量測樣品中DNA分子的大小。傳統的PFGE需耗時14小時以分離50kbp的DNA梯狀條帶，而毛細電泳則須耗費1小時，但本揭露的DNA分子大小量測裝置可快速偵測，且可減少樣品體積及分子數量。此外，本揭露的方法提供一種量測較大的大分子(macromolecule)大小的選擇，例如基因體DNA或染色體。
雖然本揭露已結合實施例說明，但應當理解在不脫離本揭露下述的申請專利範圍的精神和範圍的情況下，可以進行許多其他可能的修改和變化。
11‧‧‧基板
111‧‧‧第一狹縫型流道
112‧‧‧第一孔洞
113‧‧‧第二孔洞
12‧‧‧覆蓋基板
131,132‧‧‧貯液槽
D‧‧‧深度
Claims (16)
- 一種DNA分子大小量測方法，包括下列步驟：提供一DNA分子大小量測裝置，包括：一覆蓋基板；一基板，設置於該覆蓋基板上且包括一第一孔洞及一第二孔洞；以及一第一狹縫型流道，設置於該覆蓋基板與該基板間，其中該第一狹縫型流道的兩端分別與該第一孔洞及該第二孔洞連接，且該第一狹縫型流道的深度介於100nm至10μm之間；透過該第一孔洞加入包括一DNA分子的一樣品於該第一狹縫型流道，其中該DNA分子由該第一孔洞朝該第二孔洞的方向移動；偵測及記錄該DNA分子的強度及面積；以及分析該強度及該面積，以得到該DNA分子的大小。
- 如請求項1所述的方法，其中該DNA分子的強度及面積是以下式(I-1)進行分析：S=A×(I-I 0 )/m (I-1)其中，I 0 為該強度的一平均強度的一最小值，m為該強度及該面積的圖的線性擬合的斜率，A為該面積，I為該平均強度，而S為該DNA分子的有效大小。
- 如請求項2所述的方法，其中該DNA分子的有效大小與該DNA分子的大小成正比。
- 如請求項1所述的方法，其中該DNA分子大小量測裝置更包括一第二狹縫型流道，設置於該覆蓋基板與該基板間，其中該第二狹縫型流道的兩端 分別與該基板的一第三孔洞及一第四孔洞連接，且該第二狹縫型流道的深度介於100nm至10μm之間，而該方法包括下列步驟：於加入包括該DNA分子的該樣品時，透過該第三孔洞加入包括參考DNA分子的一DNA梯狀條帶於該第二狹縫型流道，其中該參考DNA分子由該第三孔洞朝該第四孔洞的方向移動；偵測及記錄該DNA梯狀條帶中的該參考DNA分子的強度及面積；以及分析該DNA梯狀條帶中的該參考DNA分子的強度及面積。
- 如請求項4所述的方法，其中該參考DNA分子的強度及面積與該DNA分子的強度及面積，分別以下式(I-1)進行分析：S=A×(I-I 0 )/m (I-1)其中，I 0 為該參考DNA分子的強度的平均強度的最小值或該DNA分子的強度的平均強度的最小值，m為該參考DNA分子的強度及面積的圖的線性擬合的斜率或該DNA分子的強度及面積的圖的線性擬合的斜率，A為該參考DNA分子的面積或該DNA分子的面積，I為該參考DNA分子的強度的平均強度或該DNA分子的強度的平均強度，而S為該參考DNA分子的有效大小或該DNA分子的有效大小。
- 如請求項5所述的方法，更包括下列步驟：比較該DNA分子的有效大小與該參考DNA分子的有效大小，以得到該DNA分子的大小。
- 如請求項4所述的方法，其中該第一狹縫型流道與該第二狹縫型流道實質上平行。
- 如請求項1所述的方法，其中該DNA分子大小量測裝置更包括複數貯液槽，設置於該基板上且分別與該第一孔洞及該第二孔洞連接。
- 如請求項1所述的方法，其中該DNA分子透過毛細流動、電場或流場移動。
- 如請求項4所述的方法，其中該DNA分子及該參考DNA分子透過毛細流動、電場或流場移動。
- 如請求項1所述的方法，其中該第一狹縫型流道的長度介於500μm至1cm之間。
- 如請求項4所述的方法，其中該第一狹縫型流道及該第二狹縫型流道的長度分別介於500μm至1cm之間。
- 如請求項1所述的方法，其中該第一狹縫型流道的寬度介於50μm至1mm之間。
- 如請求項4所述的方法，其中該第一狹縫型流道及該第二狹縫型流道的寬度分別介於50μm至1mm之間。
- 如請求項1所述的方法，其中該DNA分子以螢光標記。
- 如請求項4所述的方法，其中該DNA分子及該參考DNA分子分別以螢光標記。
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