TW200909587A - Methods of identifying agents that modulate methylation of VEGFR1 by SMYD3 - Google Patents

Methods of identifying agents that modulate methylation of VEGFR1 by SMYD3 Download PDF

Info

Publication number
TW200909587A
TW200909587A TW097122119A TW97122119A TW200909587A TW 200909587 A TW200909587 A TW 200909587A TW 097122119 A TW097122119 A TW 097122119A TW 97122119 A TW97122119 A TW 97122119A TW 200909587 A TW200909587 A TW 200909587A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
peptide
vegfr1
smyd3
amino acid
leu
Prior art date
Application number
TW097122119A
Other languages
English (en)
Inventor
Yusuke Nakamura
Yoichi Furukawa
Ryuji Hamamoto
Shuichi Nakatsuru
Original Assignee
Oncotherapy Science Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncotherapy Science Inc filed Critical Oncotherapy Science Inc
Publication of TW200909587A publication Critical patent/TW200909587A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91005—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • G01N2333/91011—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

200909587 . 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本1明與轉錄調控相關，特別是在於調節甲基轉換酶 (methyl transferase)活性之試劑的鑑定，例如藉由 SMYD3C也稱為“ZNFN3A1”）來調節VEGFR1甲基化之試 劑。當在多種癌細胞中向上調控（up_regulate)SMYD3時， 也確認SMYD3調節子可證明於治療癌症上有用，包括，例 士大腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌（b 1 a d d e r c a n c e r )與乳 癌。 【先前技術】 對於轉錄、端粒（te 1 ornere)保持、DNA複製與染色體 分離（chromosome segregation)之調控而言，組蛋白尾端 (histone tail)之修倚扮演一重要角色（K〇uzarides T, Cell 2007，128(4): 693-705·)。此種修飾的例子包括乙 ( 稀化（acety 1 at ion)、石粦酸化（phosphory 1 at i on)、甲基化 (methylation)及 / 或泛素化（ubiquitination)。共價修飾 不只特別調控染色質結構，也調控與染色質結合蛋白之互 相作用（Kouzarides T， Cell 2007, 128(4): 693-705.; Strahl BD and Allis CD, Nature 2000, 403 ( 6765 ): 41 -5.; Jenuwein T and Allis CD, Science 2001, 293(5532): 1 0 74-80.)。此外，H3K4、H3K36與H3K79之曱基化與常染 色質（euchromatin)結構相關，而 H3K9、H3K27 與 H4K20 之 甲基化與異染色質（heterochromatin)相關（Strahl BD and 2125-9739-PF;Daphne 5 200909587
Allis CD, Nature 2000, 403(6765): 41-5.; Jenuwein T and Allis CD, Science 2001, 293(5532): 1074-80·)。 染色質之結構為轉錄之關鍵調控子之一；未轉錄之基 因被緊壓於異染色質中’而轉錄之基因則於常染色質中， 其中，轉錄複合物容易受目標DNA影響（Li B et al.，Cell 2007，128(4): 707-19.)。此外，組蛋白殘基之修倚促進 與其結合蛋白之互相作用，而影響於其他組蛋白尾端上之 接下來的修飾（Strahl BD and Allis CD, Nature 2000, 403(6765): 41-5.; Jenuwein T and Allis CD, Science 2001, 293(5532): 1074-80.; Li B et al., Cell 2007, 128(4): 707-19.; Zhang Y and Reinberg D, Genes & deve 1 opmeni: 200 1，1 5 ( 1 8 ): 2343-60·)。例如，H3 絲胺 酸10(113310)之磷酸化抑制1131[9之曱基化。相對地，1131(9 之甲基化抵抗H3S10之磷酸化。H3S10之碟酸化藉由GCN5 促進 H3K14 的乙烯化（Zhang Y and Reinberg D，Genes &
development 2001， 15(18): 2343-60.)。 H3K9之曱基化牵涉於於HP1至清楚的染色體區域 (distinct chromosomal area)之運輸中，其對於建立與維 持異染色質區為重要的（Nakayama J et ai.，Seienee 292(5514): 110-3.; Lachner M et al., Nature 2〇〇1> 41 0 ( 6824): 1 1 6-20. ; Bannister AJ et al., Nature 200 1 41 0 ( 6824): 1 20-4.)。補充HP1蛋白質於基因體之特定位 置需要與染色質之多個成份互相作用（Nieisen SJ et al Nature 20 0 1，41 2 ( 6846): 56 1 -5，）。此補充被認為抑 β 2125-9739-PF;Daphne 200909587 • H3K4 ( —蛋白質其對於轉錄活化為重要的）之曱基化。這些 資料指出組蛋白修飾（其為藉由不同修飾間之互相作用來 調控）之複雜本質。更確切地，數目增加中之這些蛋白質經 由其組蛋白甲基轉換酶活性促進或抑制腫瘤發生 (tumourigenesis)(Varambally S et al., Nature 2002, 419(6907)： 624-9.; Hamamoto R et al., S Nature cell biology 2004, 6(8): 731-40. ; Gibbons RJ, Human molecular genetics 2005， 14 Spec No 1: R85-92·)。 雖然已集中研究組蛋白尾端之曱基化，然而非組蛋白 蛋白質之曱基化仍然不清楚。最近研究報導，SET7/9，一 組蛋白H3K4曱基轉換酶催化TAF10與p53如受質 (Kouskouti A et al., Mol Cell 2004, 14(2): 175-82.; Chuikov S et al., Nature 2004, 432(701 5) ： 353-60·)° 血管内皮成長因子受體-l(Vascular endothelial growth factor receptor-1, VEGFR1)(Accession No. : NM_0020 1 9 ) 【為一受體型酪胺酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK)，其於受體二聚化之内容及與其配體交互作用中扮演 生理學與病理學之血管新生的角色（Shibuya M et al Oncogene 1990, 5(4): 519-24.; Rahimi N, Experimental eye research 2006， 83(5): 1005-16)。 VEFRF1與FMS/KIT/PDGRF家族共有結構相似性，包含 一細胞外區、七個類免疫球蛋白序列與一具有長激酶插入 (long kinase insert)之細胞質酪胺酸激酶區。vefrfi被 表現成兩種形式，如全長酿胺酸激酶受體，與一可溶开> 式， 2125-9739-PF;Daphne 7 200909587 其只攜帶細胞外區。藉由與其他受體型酿·胺酸激酶，例如 VEGFR2 與 VEGFR3’ 之同二聚體化（homodimerization)或異 二聚體化（heterodimerizat ion) ’全長形式之VEFRF1在與 其配體結合上正向調節。然而’可溶形式之VEFRF1藉由阻 止配體而扮演一抑制劑且抑制血管新生（Shibuya M， Journal of biochemistry and molecular biology 2006, 3 9 ( 5 ): 4 6 9 - 7 8.)。這些相反功能之調控機制仍未明確。 雖然一 VEGFR配體’血官内皮成長因子_A(Vascular
endothelial growth factor-A, VEGFA)與 VEFRF1 與 VEFRF2 兩者相關，然而VEGFA對VEFRF1之親合力至少比對VEFRF2 之親合力高一等級（Sawano A et al., Cell Growth Differ 1996，7(2): 213-21.)。另一方面，與 VEFRF2 相較，VEFRF 1 之内生酪胺酸激酶活性極低。關於與VEGFA結合，這些受 體引人注目地增加其自體叾粦酸化（autophosphorylation) 程度’且誘導内皮細胞之生長、内皮細胞前驅之補充 (recruitment of EC progenitors)、自然殺手細胞 (natura 1 ki 11 er ce 11 s)對内皮細胞的吸附與單核球移動 (monocyte migration) (Shibuya M et al. , Oncogene 1 990, 5(4): 519-24.; Rahimi N, Experimental eye research 2006， 83(5): 1005-16.; Shibuya M, Journal of biochemistry and molecular biology 2006, 39(5)： 46 9 - 78·)。雖然許多VEFRF1酪胺酸磷酸化位與其潛在之互 相作用伙伴已描述於不同之表現模型中（Shibuya M, Journal of biochemistry and molecular biology 2006, 2125-9739-PF;Daphne 8 200909587 3 9 (5): 4 6 9 - 7 8.)，仍然描述下游訊號，首先歸因於此受體 之低生物活性。 本發明之發明人先前報導SMYD3(Accessi〇n No,: AB057595)具有雙與三甲基轉換酶活性於組蛋白H3之離胺 酸4(H3-K4)(WO 2005/0711020)。此外，先前之報導證明 提咼之SMYD3表現於大腸直腸癌與肝細胞癌細胞之增生扮 演一重要角色（W0 2003/027143; Hamamoto，R. eta 1·，Nat Cell Biol 6, 731-40 (2004) and Hamamoto R et al., Cancer Sci 200 6，97(2): 113-8.)。特別是過度表現 SMYD3 顯示導致NIH3T3細胞之成長增進而在許多癌細胞内將内 生SMYD3表現剔除顯示誘導這些細胞之成長抑制與細胞凋 亡（apoptosis)。本發明之發明人也顯示藉由與SMYD3之 SET區互相作用將視網膜母細胞瘤蛋白質（ret i nob 1 as toma protein, RBI)甲基化，且//7 與//7 此種曱基
化藉由CDK2/細胞週期素E(cyclinE)或CDK6/細胞週期素 D3(cyclinD3)複合物促進RB1在蘇胺酸821 /826與絲胺酸 807/81 1 之磷酸化（W02007/004526)。 [專利引用1] W02003/027143 (JP 2005-511023) [專利引用2] W02004/076623 (JP 2006-519009) [專利引用3 ] W02005/071102 (JP 2007-519391) [專利引用4] 2125-9739-PF;Daphne 9 200909587 _ WO 2006/092958, A1 [專利引用5] WO 2007/004526, A2 [非專利引用1 ]
Kunizaki, et al. Cancer Res. 2007 Nov 15； 67 (22): 10759-65 【發明内容】 在尋找SMYD3甲基轉換酶之其他受質中，發明人發現 SMYD3於/77與//? r/iro將VEGFR1之離胺酸831曱 基化’且此種VEGFR1曱基化增進其激酶活性。這些發現會 使VEGFR1之调控機制與人類癌化（carcin〇genesis)有更 清楚的瞭解。 因此’本發明是基於（至少一部份）發現藉由Smyd3甲 基化離胺酸831來調控VEGFR1的新機制。也已知SMYD3的 基因名為“ZNFN3A1” ，為組蛋白U3甲基轉換酶，不但在 大部分大腸直腸癌與肝細胞癌中被正向調控（參見，例如 W020 03/0 2741 3，如上所提及），而且在膀胱癌及乳癌中也 是（參見，例如 W0 20 0 6/085684 與 W0 2006/092958)。 如此處所證明，VEGFR1與SMYD3之SET區互相作用。 此互相作用導致VEGFR1之曱基化，如此處所示，其引起 a Fiiro激酶活性增強。這些發現提供了對SMYD3之生物 角色與VEGFR 1之調控機制更深的瞭解。此外，本發現提供 癌發生（carcinogenesis)的更加暸解，尤其是大腸直腸 2125-9739-PF;Daphne 10 200909587 癌、肝細胞癌、膀胱癌以及乳癌，也因此提供了對這些腫 瘤發展新的治療策略。 因此，一種鑑定試劑的方法，該試劑藉由SMYD3調整 VEGFR1的甲基化，包括：（a)將一具有甲基轉換酶活性之 SMYD3多胜肽與一要被曱基化的VEGFR1胜肽及一辅助因子 (〇〇丨&〇1:〇1')在該試劑存在的情形，於適合曱基化該冗61^1 胜肽的條件下進行接觸；（b)偵測該VEGFR1胜肽之甲基化 私度，以及（c )比較步驟（b)與缺少試劑情況下之控制組所 债測到的甲基化程度，其中與控制組之程度比較，一甲基 化耘度i曰加或減少表示該試劑藉由⑽調整Vegfri之甲 基化。 本發明更進一步提供一套組，其用以制一測試化合 物調控VEGFIM之甲基化的能力，包括：⑷―具有甲基轉 換酶活性之SMYD3多胜肽；（b)— VEGFR1月生肽，其具有被 SMYD3多胜狀甲基化之能力；以菸〆、 此刀以及（c)—對於該VEGFR1胜 肽甲基化之輔助因子。 本發明更進一步提供__插益、西m 乂杈仏種師選用以治療癌症之化合物 的方法，癌症例如大腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌與乳癌， 其步驟包括：⑷根據上述方法來鐘定—测試化合物，其調 整甲基化；以及（b)選擇出該測試 ^ # λ ^ A , V冗口物’將其與在沒有該 化合物時之控制組甲基化程度 ^ %仃比較時，其降低了要被 甲基化之受質的曱基化程度。 本發明還提供一種測量一多 Α 夕胜肽之子基轉換酶活性的 方法，該方法包括： 2125-9739-PF;Daphne 11 200909587 ， （a)將一多胜肽與要被曱基化之一VEGFR1胜肽與一輔 助因子接觸，在能使該VEGFR1胜肽甲基化的情況下，該多 胜肽係擇自下列所組成之群組： i· 一多胜狀其包含序列辨識號：2之胺基酸序列 (SMYD3)； i i. 一多胜肽其包含序列辨識號：2之胺基酸序列，其 中一個或多個胺基酸被替換、刪除或插入，又其中該多胜 肽鉍由序列辨識號.2之胺基酸序列所組成的多胜肽具有 相同的生物活性； iii. 一多胜肽其包含之胺基酸序列至少與序列辨識 號：2具有8 0 %的同源性； 1 v. —多胜肽其由一聚核苷酸所編碼，該聚核苷酸於嚴 可條件下與由序列辨識號：丨之核苷酸序列所組成的聚核 苷酸進行雜交，其中該多胜肽與對應於序列辨識號· 2之 胺基酸序列的多胜肽具有相同的生物活性；以及 ί」 V. 一多胜肽其包含序列辨識號：2之位置1丨7至246 的胺基酸序列，其中該多胜肽與具有序列辨識號：2之胺 基酸序列的多胜肽具有相同的甲基轉換酶活性； (b)偵測該VEGFR1胜肽之甲基化程度；以及 (〇藉由使步驟（b)之甲基化程度與該曱基轉換酶活性 互相關連來測量該該甲基轉換酶活性。 或者，本發明也提供一種測量SMYD3之甲基轉換酶活 性的套組，包括：（a)__ VEGFR1胜肽，藉由SMYD3其有被 甲基化的能力；（b)一對於VEGFR1胜肽甲基化之辅助因 2125-9739-PF;Daphne 12 200909587 • 子；以及（c)—债測甲基化之離胺酸831的谓測試劑。 為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更 明顯易懂’下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳 細說明如下： 【實施方式】 从/似cDNA由1 622個核苷酸所組成，其包括1 284個 核苷酸之開放讀碼區（〇pen reading frame)如之後確定於 序列辨識唬.1 (SEQ. ID. NO. : 1)。開放讀碼區編碼_ 428 個胺基I之蛋白質其包括一鋅指（zinc H nger)區與一 SET 區域，如於序列辨識號：2(SEQ. ID. Ν〇· :2)中顯示。鋅指 區域（MYND)從胺基酸49延伸至胺基酸87以及SET(Su 3-9, Enhancer-of-zeste，Trihorrax)區域從胺基酸 ι17 延伸至 胺基酸246。 改變SMYD3蛋白質之細胞内定位（subceUular localization)於細胞週期發展與藉由培養的細胞之密 度。當細胞處於S期（Sphase)之中期至晚期或培養於稀疏 的環i兄條件時，SMYD3蛋白質累積於細胞核。然而當細胞 處於細胞週期的其他期或生長於密集的環境條件時，§Μγ⑽ 蛋白質位於為於細胞質與位於細胞核一樣好。 本發明提供測定用以甲基化VEGFR1受質之SMYD3的曱 基轉換酶活性的方法。藉由將SMYD3多胜肽或其具有曱基 轉換酶活性之功能等同物與VEGFR1蛋白質接觸，以及分析 接觸之SMYD3或其功能等同物之甲基轉換酶活性可實施本 2125-9739-PF;Daphne 13 200909587 .方$在此内容中’SMYD3的曱基轉換酶活性對應於VEGFR1 甲基化之程度。因此，可藉由偵測VEGFR1受質之甲美化浐 ，來測量甲基轉換酶活性。更特別地，在本發明之：容中: :由與參考樣本之關連，可將要被測量之甲基轉換酶活性 ，準化成VEGFR1胜肽之甲基化程度。於本發明之内容中， 可將任何具有已知之甲基轉換酶活性的生物樣本做為參考 樣本。例如，藉由純化之SMYD3月生狀的連續稀釋可獲得必 須之標準曲線（calibration curve)。 此外，也提供一篩選甲基轉換酶活性之調節子 (_dulat〇r)的方法。本發明因此提供一筛選方法，其筛選 一试劑可調整SMYD3曱基轉換酶活性。上 麵多胜肤或具有曱基轉換酶活性之其功能上=與 1 EGFR1蛋白質進行接觸，以及分析經接觸後的SMYD3或其 功能上等同物之曱基轉換酶活性。因此確定可調整SMYD3 或其功能上等同物之甲基轉換酶活性的試劑。 、⑥本發明之内容中，「功能等同」代表實驗之蛋白質 或胜肽具有s_之與相同或實質上相同甲基轉換酶活 性。特別是該蛋白質催化VEGFR1蛋白質或包含離胺酸831 =VEGm蛋白質片段的甲基化。藉由本發明可例行地確認 實驗蛋白質是否具有標的活性。那就是可確認甲基轉換酶 活性藉由（a)將一胜肽與一受質（例如VEGFR1蛋白質或一 片段包括離胺酸831)—輔助因子（例如s一腺核普甲硫胺酸 (S-Adenosyl L-Methionine))進行接觸，於適合甲基化受 質的情況下，與（b)偵測受質之曱基化程度。 2125-9739-pf；Daphne 14 200909587 此處使用之「VEGFR1胜肽」意指全長之VEGFR1蛋白 質（例如序列辨識號：4(SEQ. ID. NO. :4))與其功能性突變 及片段。功能性片段的例子包括（但不限制為端片段， 例如由序列辨識號.4 (S E Q. ID · N 0. : 4 )之胺基酸8 〇 〇至 841所组成。較佳的片段包括離胺酸殘基於位置 (positi〇n)83卜功能性突變的例子包括（但不限制為）下列 RB1突變’其保留全長之VEGFR1蛋白質的甲基化能力：胺 基酸序列第819的位置由離胺酸替換為丙胺酸（K81gA)、胺 基酸序列弟81 9的位置由離胺酸替換為麩胺酸（κ g 1 9 e )與 胺基酸序列第81 9的位置由離胺酸替換為精胺酸（K8丨9R)。 準備一供給蛋白質之功能等同蛋白質的方法，對於此 技術領域而言已非常熟知，包括引進突變於蛋白質中之常 見方法。例如熟悉此技藝人士可準備人類SMYD3蛋白質之 功能等同蛋白質藉由引進一適當的突變於人類SMYD3蛋白 質之胺基酸序列，利用定點突變（site_direci;ed mutagenesis)(Hashimot〇-Gotoh, T. etal. ( 1 995), Gene 152，271 -275; Zoller, MJ, and Smith, M. (1 983) Methods Enzymol. 100, 468-500； Kramer, W. et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ. (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367·
Kunkel, TA (1985)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 4 8 8 - 4 9 2 )。胺基酸突變也可自然發生。於本發明中使用的 SMYD3多胜肽包括具有人類SMYD3蛋白質之胺基酸序列之 蛋白質，其中一或多個胺基酸突變，提供發生突變之蛋白 2125-9739-PF;Daphne 15 200909587 • 質為人類SMYD3蛋白質之功能性等同物，更特別的是其保 留了人類SMYD3蛋白質之甲基轉換酶活性。在這種突變 中，胺基酸突變的數目通常為2〇個胺基酸或更少，典型為 1 〇個胺基酸或更少，較佳為6個胺基酸或更少，更佳為3 個胺基酸或更少。為了保持甲基轉換酶活性，SET區域 NHSCXXN”與“GEELXXXY”於突變蛋白質之胺基酸序列 中保持不變較佳（“ X”指任何胺基酸）^因此於本發明内容 中SMYD3多胜肽包括序列辨識號：2之胺基酸序列，其中 一個或多個胺基酸被替換、刪除或插入，又其中該多胜肽 與包括序列辨識號：2之胺基酸序列的多胜肽具有相同的 甲基轉換酶活性，又其中SET區域“NHSCXXN”與 “GEELXXXY”保持不變。更特別的是，序列辨識號：2之 位置11 7至246的胺基酸序列較佳為保持不變。 突變或經修飾的蛋白質，例如蛋白質具有胺基酸序列 藉由刪除增加及/或取代特定胺基酸序列之一或多個胺基 (,酸殘基，已被認為可保留原始蛋白質之生物活性（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et aj.,
Science (1 984) 224, 1431-1 433, Da 1 badie-McFar1 and, G. et a1，，Proc· Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 640 9-641 3)。例如，期待SMYD3多胜肽維持其甲基轉換酶 活性，其維持SET區。因此可使用包含序列辨識號·· 2之 位置11 7至2 4 6之胺基酸序列的多胜肽來執行本發明之方 2125-9739-PF/Daphne 16 200909587 法’例如一多胜肽包括序列辨識號：2之位置丨i 〇至250 之胺基酸序列，如實施例所示。 將要突變的胺基酸殘基，突變成可使胺基酸側鏈 (side-chain)之特性保持不變之不同胺基酸較佳（一步驟 已知為保守胺基酸替換（conservatiVe amino acid subst i tut i on))。胺基酸側鏈之特性的例子包括下列群組： 親水性胺基酸（A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、
疏水性胺基酸（R，D，N，C，E，Q，G, Η, K, S，T)。 或者側鏈一般具有下列官能機與特色： 一脂肪族側鏈（G, A, V，L，I，P); 一包含氳氧基（hydroxyl group)之侧鏈（S，T，Y); 一包含硫原子之側鏈（C, Μ); 一包含羧酸與氨基之侧鏈（D, N, E, Q); 一包含鹼之側鏈（R, Κ，H);以及 一包含芳香族之側鏈（F, H，Y，W)。 更進一步而言’例如胺基酸之分類也已熟知如變化矩 陣（1111^31^〇1^111^计1又）（丁871〇1'1 986,]，1^6〇1\61〇1· 119, 205-218, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 3rd ed. A7.6-A7.9, Cold Spring Harbor Lab. Press, 200 1 )。可統整此種分類如下： 脂肪族胺基酸：L，I，V 芳香族胺基酸：H, W，Y, F 帶電胺基酸：D, E，R, Κ，Η 帶正電胺基酸：R，Κ, Η 2125-9739-PF;Daphne 17 200909587
帶負電胺基酸：D，E
疏水性胺基酸·· H，W，Y，F, M，L，I，V，c a G T, K
極性胺基酸：T，S，N, D, E，Q，R，K，w y 小胺基酸：P，V，C, A，G, T，S，N，D 微小胺基酸：A, G, S 大胺基酸（非小胺基酸）：Q，E，R，K，H，W，γ F M, L， I 。 ，， f
附註，括號内之英文字母代表胺基酸之—個字母的縮 寫。 加入一個或多個胺基酸的殘基於人類SMYD3蛋白質之 胺基酸序列序列辨識號：2(SEQ. Ν〇_··2)的蛋白質的例 子是一融合（fusion)蛋白質包含人類SMYD3蛋白質。融合 蛋白質包括人類SMYD3蛋白質與其他胜肽或蛋白質H 合，以及其在本實驗中被使用。藉由熟悉此技藝人士使用 热知技術可製造融合蛋白質，例如藉由將可編碼出本發明 人類SMYD3蛋白質之DNA與編碼出其他胜肽或蛋白質之 進行連接，之後讀碼吻合（frames match)、插入融合之Ο· 於—表現載體（Vector)以及將其表現於_宿主。關於胜狀 或蛋白質融合至本發明的蛋白質沒有限制。 已知可被用來融合於漏3蛋白質之胜狀包括，例如 (Hopp, T. p. et al^ Biotechnology (1988) β 1204-1210)、6xHis 包+ 6 個组胺酸（histidine)殘基、 1〇XHiS、流感凝集素（InfluenZa agglutinin)(HA)、人 2125-9739-PF;Daphne 18 200909587 c-myc 片段、VSP-GP 片段、pl8HIV 片段、T7-tag、HSV-tag、 E-tag、SV40T 抗原片段、lck tag、alpha-tubulin 片段、 B tag、Protein C片段與相似物。可被融合於本發明蛋白 質之蛋白質的例子包括麵胱胺酸-s_轉移酵素（GST) (glutathione-S-transferase)、流感凝集素（Influenza agglutinin)(HA)、免疫球蛋白固定區域（immun〇gl〇buUn constant region)、半乳糖甘酶（beta-galactosidase)、 麥芽糖結合蛋白（MBPXmaltose-binding protein)與諸如 此類。 融合蛋白之準備可藉由將商品化DNA(其編碼出上述融 合之胜肽或蛋白質）與編碼出本發明蛋白質之DNA進行融 合’之後表現融合之DNA。 於本技術領域已知一替代方法來分離功能等同蛋白 質，其利用雜交（hybridization)技術鑑定同源性 (ho.ologous)^ ..J (Sambrook, j. , Molecular
Clomng 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab.
Press, 1989)。孰来士卜姑蔽/ , ，、、、，u此技藝人士可立即分離一 DNA，其與 t部或部分DNA床而丨丨j· + , WA序列（例如序列辨識號：1(SEQ ID N〇: 1))(其編碼出人類ς Μ v n q疋a 、 頰SMYD3蛋白質）具有高度同源性，以及從 分離DNA來分離與人類 5貝i>MYD3蛋白質之功能等同蛋白質。 使用於本發明$ I 、 蛋白貝包括人類SMYD3蛋白質之功等同 物’其由DNA編碼，此Μα nMA 此DNA與編碼出人類SMYD3蛋白質之 DNA的全部或部分山 _ ' 對庳至乂。廷些蛋白質包括哺乳類同源 對應到的蛋白質其夾 、 類或小鼠（例如一蛋白質其由猴 2125-9739-pf；Daphne 19 200909587 • 子、大鼠、兔子與牛的基因所編碼）。在從動物分離一 cDNA， 其對編碼出人類SMYD3蛋白質具高度同源的步驟中，特別 疋使用從骨骼肌肉、睪丸、肝細胞癌（HCC)或大腸直腸 (colorectal)腫瘤之組織較佳。 藉由熟悉此技藝人士可慣例地選擇對於分離編碼出人 類SMYD3蛋白質之功等同物之DNA的雜交條件。例如可實 行雜父’藉由貫施預雜交（？1_4丫|;)1^(^2&1^〇11)於68。〇，3〇
刀崔里或更久’利用 “Rapid_hyb buffer” （Amersham LIFE SCIENCE)、加入一標定探針以及加溫於68。〇，1小時或更 久。可實行下列的清洗步驟，例如於低嚴格（stringency) 的條件。低嚴格的條件為，例如4rc，2XSSC，〇. 1%SDS ; 或較佳為5(TC，2XSSC，O.USDS。使用高嚴苛條件更佳。 於本發明中，一高嚴苛條件包括，例如於2X SSC、0. 01% SDS 中在室溫下20分鐘’清洗3次，之後於lxSSC、〇. 1%SDS 在37C下20分鐘，清洗3次，以及於1χ SSC、0. 1% SDS ί 在50 C 2 0刀知，清洗2次。然而一些因子，例如溫度與 風類/辰度可衫響雜交的迫切（stringency)與熟悉此技藝者 可適當地選出因子來達到需要的迫切。 代替雜交，一基因擴大方法，例如聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction)(PCR)方法，可被利用來分 離一編碼出人類SMYD3蛋白質之功等同蛋白質之DM，使 用引子（primer)是基於編碼出人類SMYD3蛋白質（序列辨 識说.2(SEQ ID NO: 2))之 DNA(序列辨識號：i(sEQ ID NO: 1))的序列資訊來合成。 2125-9739-PF;Daphne 20 200909587 . 人類SMYD 3蛋白質之功能等同蛋白質，其藉由上述雜 交技術或藉由基因擴大技術進行編碼，一般與人類SMYD3 蛋白貝之胺基酸序列具有尚同源性。「高同源性」（H i homology)(也可稱為「高相同度」（high identity))，一 般指於兩個理想排列的序列（不論是多胜肽或是聚核酸）之 間的相同程度。通常高同源性或相同度指4〇%的同源性或 更局’ 60%較佳或更高，80%更佳或更高，85%、9〇%、95%、 98%、99%又更佳，或者再更高。根據於“ wnbur，w. j. and Lipman, D. J. pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730”所述之演算法，可決定兩個多胜肽或是聚核酸之 間的同源性或相同度。 於本發明有用的蛋白質可具有多變性於胺基酸序列、 分子1、等電點、有/無糖鏈（sugar chains)或是種類，根 據製造其之細胞或是宿主或是所利用的純化方法。雖然其 為一人類SMYD3蛋白質（序列辨識號：2(SEQ ID N0: 2)) 《 之功能等同物，但其對於本發明有助益。 可準備在本發明内容所述之有用蛋白質，如重組蛋白 貝或自然的蛋白質，藉由本技術領域中已知之方法。可準 備一重組蛋白質’藉由插入編碼出本發明蛋白質之DNA(例 如DNA與序列辨識號：USEQ ID NO: 1)之核苷酸序列相同） 於一適合的表現載體’將載體引入適合的宿主細胞，得到 萃取物以及藉由將萃取物用層析（chromatography)處理 以純化蛋白質’層析例如，離子交換層析（i on exchange chromatography)、逆向層析（reverse phase 21 2125-9739-PF；Daphne 200909587 .chromatography)、膠體過濾（gel mtrati〇n)、或親和層 析（affinity chromatography)(其為利用一管柱具有抗本 發明蛋白質之抗體固定於該管柱上），或結合多於一個上述 之管柱。 此外’當於本發明有用之蛋白質表現於宿主細胞中（例 如動物細胞或cW/)時’如一融合蛋白質具有麵胱胺酸 S 轉私酵素蛋白質（giUfathi〇ne—s-transferase protein)或如一重組蛋白質增加多個組胺酸，表現的重組 蛋白質可用麩恍胺酸管柱或鎳管柱來進行純化。 於純化融合蛋白之後可排除目標蛋白質之外的區域， 藉由以凝血S#(thrombin)或因子-Xa(factor_Xa)來剪除。 可分離自然蛋白質藉由本技術領域人士熟知的方法， 例如藉由將一親性管柱（其中於管柱中結合具有可鍵結 SMYD3蛋白質之抗體如下所述）與表現本發明蛋白質之組織 或細胞的萃取物進行接觸。抗體可為多株抗體（p〇lycl〇nal 『 antibodies)或單株抗體（monoclonal antibodies)。 於本發明中’可以本技術領域習知的方法測量SMYD3 多胜肽之甲基轉換酶活性。例如在適合分析的條件下，可 將一 SMYD3多胜肽及一 VEGFR1胜肽受質與一經標定之甲基 提供者（labeled methyl donor)—起培養。較佳的甲基提 供者包括’但不限制為S-腺核苷-[甲基—14c]甲硫胺酸 (S-aden〇sy 卜[methy：l-14C]-L-methionine)與為 S-腺核苷 -[曱基-3H]甲硫胺酸（S-adenosyl-[methyl-3H]-L-methionine)。可偵測轉移至VEGFR1胜肽之放射標定 2125-9739-PF;Daphne 22 200909587 . (radiolabel)，例如藉由SDS_PAGE電泳與螢光 (fluorography)。另外，於反應之後可萨 曰ty過〉慮 (filtration)將VEGFR1胜肽與曱基提供者進行分離，藉由 閃爍计數（sc inti 1 lat ion count ing)定量保留於濾膜上之 放射標定。其他可黏附於甲基提供者之適合標定例如顯色 (chromogenic)與螢光（fiuorescen1;)標定，以及偵測轉移 至VEGFR1胜肽的這些標定的方法，已熟知於本技術領域。 或者可使用一未標定的甲基提供者（例如S —腺核苷甲 硫胺酸（S-adenosyl-L-methionine))以及選擇性辨識曱其 化VEGFR1胜肽的試劑，來測量SMYD3之甲基轉換酶活性。 例如於SMYD3培養之後，要被曱基化之受質與甲基提供 者，在適合曱基化受質的條件下，可以使用常見的免疫方 法來偵測曱基化之受質。使用一抗體來辨認一甲基化受質 之任何免疫方法可用於偵測。例如，可使用一抗甲基化 VEGFR1(離胺酸831即抗K831me2)之抗體做為上述之抗 」體。此種抗體辨認VEGFR1之曱基化，特別是，藉由本發明 提供之於VEGFR1之離胺酸831之甲基化。使用於EUSA或 免疫墨點分析之辨認甲基化之VEGFR1之離胺酸831的抗 體’其可適用於本發明。 如此處所證明，VEGFR1於離胺酸831之甲基化增強 VEGFR1之磷酸化。因此，於其他實施例中VEGFR1曱基化 的耘度，經由VEGFR1之鱗酸化可被估計。使用放射標定之 碭酸提供者可偵測VEGFR1之磷酸化。或者辨認yEGFR1之 磷酸化位的抗體可用來估計VEGFR1之磷酸化程度。 2125-9739-PF;Daphne 23 200909587 根據本發明，上述藉由SMYD3來磷酸化VEGFR1胜肽之 特色，可被用來測量SMYD3與H3K4曱基轉換酶之甲基轉換 酶活性。此種測量一胜肽之曱基轉換酶活性的方法包括： (a)將一 H3K4曱基轉換酶與要被曱基化之一 VEGFR1胜 肽與一輔助因子接觸，在能使該VEGFR1胜肽曱基化的情況 下； (b) 偵測該VEGFR1胜肽之甲基化程度；以及 (c) 藉由使步驟（b )之曱基化程度與該甲基轉換酶活性 互相關連來測量該甲基轉換酶活性。 此處’ H3K4甲基轉換酶可為任何胜肽，只要其具有轉 換於VEGFR1胜肽上之曱基之能力，其包括但不限於上述之 SMYD3多胜肽。使用相同VEGFR1胜肽、反應條件（輔助因 子促進劑的加入等）、偵測方法與例如以上解釋之鑑定一可 調整藉由SMYD3之VEGFR1甲基化之化合物的方法可執行此 方法之步驟。 本發明更提供一種篩選用以治療癌症之化合物的方 法，其中癌症為過度表現SMYD3，該方法包括：使用上述 之鑑定試劑的方法來鑑定一測試化合物，其調整甲基化盥 選擇出該測試化合物，將其與在沒有該化合物時之控制組 甲基化程度進行比較時，其降低了要被曱基化之受質 基化程度。 、 也可藉由（a)在一允許VEGFR1胜肽與smyd3 合且在一測試化合物存在的情況τ，# ^ ° 牡町閒况下，將一包括SMYD3結合 區之vegfR1胜肽或片段與包括mm結合區之一 s咖 2125-9739-ΡΓ;Daphne 24 200909587 、 多胜肽或片段接觸；以及（b)選擇該測試化合物，其抑制包 括SMYD3結合區之VEGFR1胜肽或片段與包括VEGFR1結合 區之一 SMYD3多胜肽或片段之間的結合，做為治療癌症之 一候選化合物，來執行篩選。於本發明中其顯示出抑制藉 由SMYD3之VEGFR1甲基化或VEGFR1與SMYD3之間的結合 減少了細胞生長。因此藉由篩選測試化合物，其抑制藉由 SMYD3之VEGFR1的結合或曱基化，可鑑定出候選化合物其 具有潛力以治療或避免癌症。這些候選化合物治療或避免 f ' 癌症之潛力可藉由第二及/或更進一步篩選來評估以鑑定 初對於癌症之治療劑。 在本發明内容中，過度表現SMYD3之癌症包括癌症其 與癌症之相同器官之正常部分相較，SMYD3的表現程度為 高。例如，本發明已顯示在許多癌症中SMYD3之過度表現， 例如大腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌與乳癌（W0 2003/027143， W0 2006/085684 與 W0 2006/092958)。因此， € 於本發明較佳實施例中，過度表現SMYD3之癌症可擇自由 ' 下列所組成之群組：大腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌與乳 癌。 藉由將VEGFR1胜肽與SMYD3多胜肽之結合程度與無此 化合物存在時被偵測之VEGFR1胜肽與SMYD3多胜肽之結合 程度進行比較與選擇一測試化合物其減少VEGFR1胜肽與 SMYD3多胜肽之結合程度，可確認一化合物可抑制VEGFR1 胜肽與SMYD3多胜肽之結合。任何包括其等同物之VEGFR1 胜肽與SMYD3多胜肽可被用來此篩選，只要其維持其彼此 2125-9739-PF;Daphne 25 200909587 ί 之結合能力。例如，包括VEGFR1胜肽之SMYD3結合區的片 段’可被用來做為對於VEGFR1胜肽之胜肽等同物。在本發 明中，對於VEGFR1胜肽之胜肽等同物較佳可包括序列辨識 號：4之位置800至1 000的胺基酸序列。相同方式，包括 SMYD3胜肽之VEGFR1結合區的片段，可被用來做為對於 SMYD3胜肽之胜肽等同物。例如，對於SMY])3胜肽之胜肽 等同物可包括序列辨識號：2之位置1〇〇 i 25〇的胺基酸 序列。在本發明之内容中，於兩蛋白質間之“抑制結合” 指，至少減少兩蛋白質間之結合。因此，在一些例子中， 與一適合之控制組（例如沒有被處理測試化合物或從一非 癌症樣本或從-癌症樣本）相較，在一樣本中之結合對 (binding pair)百分比會降低。與在控制組樣本之結合對 相較，蛋白質結合量的降低可為，例如至少小於_、8〇%、 7(U、6(U、50%、4。%' 25%、10%、5%、1%或更少(例如 〇%)。 通常而言，測定—測試化合物干擾此種結合之能力的 任何方法，適合與本發明—叔
、 之使用。例如，可利用於ELISA 形式中之競命·與非競爭抑制八此 / 刀析。應執行控制實驗以測定 糸統之最大結合能力（例如脾纟士人 J如將結合之VEGFR1胜肽與SMYD3 多胜肽接觸，且測定結合 D主VEGFR1胜肽之蛋白質的量，或 反之亦然）。如本發明之雜… ^ m疋抑制結合的化合物的方法，可 使用熟悉此技藝人士之耸夕 ^ 之斗夕熟知的方法。可實施此種鑑定 方法於一 1 n v i t r η令 k么从 、、、，’例如於—細胞系統（ce 11 uiar system)。更特別的是，首 不疋VEGFR1胜肽就是SMYD3 夕胜肽伙伴結合至一支持 且另一蛋白質與一測試化合 2125-9739-PF;Daphne 26 200909587 物接觸。再央，+立莫# 混合物 且偵測及/或測量結 丹木，培養並清洗此 合於支持物之另一蛋白質。 j用术.結合蛋白質 * 、支持物的例子包括多醣體，例如 瓊膠（agarose)、纖雉去⑧并#
Rt 准素與匍甸聚糖（dextran);盥人志丹 脂’例如聚丙烯肱L , ，、口成树 月女（polyacrylamide)、聚芏 7 祕 (polystyrene)與矽；較井為 ' 啟佺為可使用由上述材料所製備之市 ^传的珠子與盤（例如多孔盤、生物感測晶片等）。當使 m:: ’可將它們填入—管柱中。或者，本技術領域也 …°用磁珠，且經由磁性其可快速分離結合於珠 之蛋白質。 、+ T工 根據-般方法，可引導蛋白質至支持物之結合，例如 化學鍵結與物理吸附。或者，經由抗體專一辨認蛋白質， 可將-蛋白質與一支持物結合。更進一步而言，藉由分子 互相作用之方4 ’例如生物素蛋白（avidin)與生物素 (biot in)之結合可引導蛋白質與支持物之結合。 ” ,蛋白質間之結合實施於緩衝溶液中，例如，但不限於 磷酸緩衝溶液與Tris緩衝溶液，只要緩衝溶液不抑制蛋白 質間之結合。 在本發明中，可使用一生物感測器用來偵測或定量結 合之蛋白質，而此生物感測器使用表面電漿共振（surface Plasmon resonance)。當使用這種生物感測器，只需使用 小量之多胜肽，而不需標定，蛋白質間之互相作用可被即 時觀察成表面電漿共振訊號（例如BiAcore，Pharmacia)。 因此’使用生物感測器，例如BIAcore可評估於VEGFR1胜 27 2125-9739-PF；Daphne 200909587 • 狀與SMYD3多胜肽之結合。 或者可將不是VEGFR1胜肽就是SMYD3多胜肽進行標 疋’結合蛋白質之標定可被用來偵測或測定結合蛋白質。 特別疋’在將蛋白質之一進行前標定（pre-label ing)後， 私疋蛋白與其他蛋白在一測試化合物存在下接觸，且根據 清洗後之標定偵測或測定結合之蛋白質。標定物質例如放 射性同位素（radioisotope)(例如 3h，14c，32p I 35g i25j !)、酵素（例如鹼性磷酸酵素（alkaline phosphatase)、 辣根過氧化酶（horseradish peroxidase)、/3 -半乳糖苷酶 (β -galactosidase) 、 /5 -葡萄 糖苷酶 (/5 -glUC0sidase))、螢光物質（例如異硫氰酸螢光素 (fluorescein isothiosyanete, FITC)、螢光素 (fluorescein)Texas red、綠色螢光蛋白質（green fluorescent protein)與鹼性蕊香紅（rhodamine))、磁珠 (例如DYNABEADS™)、熱量標定（例如膠狀金（c〇u〇idal 丨 gold)、或有色玻璃或塑膠（例如聚苯乙烯、聚丙烯 (polypropylene)、乳膠（iatex))珠）與生物素蛋白 (avidin)/生物素（biotin)，可被用來本發明之方法中之蛋 白質的標定。教示使用這些標定的專利包括U. S. Pat. Nos. 3, 817,837; 3, 850, 752; 3, 939, 35 0； 3, 996, 345; 4, 277, 437; 4, 275, 149 與 4,366,241。然而，本發明並不 限於這些，且任何標定可藉由分光（spectroscopic)、光化 學、生物化學、免疫化學、電子、光學或化學方法偵測皆 可使用。 2125-9739-PF;Daphne 28 200909587 ·. 當蛋白質與放射線同位素標定時，可藉由液態閃爍計 數器（liquid scintillation)來偵測或測定。或者蛋白質 以酵素標定時藉由加入酵素之受質以偵測受質之酵素性變 化，例如產生顏色，可以吸光計（abs〇rpti⑽eter)來偵測 或測量。而且，假使使用螢光物質做為標定時，可使用螢 光光度劑（f luorophotometer)來偵測或測量結合之蛋白。 更進一步而言，可偵測或測定於本篩選方法中之結 合’藉由使用一抗VEGFR1胜肽或SMYD3多胜肽之抗體。例 如，在將固定於支持物上之VEGFR1胜肽與一測試或者化合 物及SMYD3多胜肽進行接觸後，培養並清洗此混合物，且 可使用一抗SMYD3多胜肽之抗體來實施偵測或測定。仰丫⑽ 多胜狀可固定於支持物上’而使用抗VEGFR1胜肽之抗體來 做為上述抗體。 若在本筛選中使用抗體，抗體較佳以上述之標定物質 之一進行標定’且根據標定之物質來偵測或測定抗體。或 者，抗SMYD3多胜肽或VEGFR1胜肽之抗體用來做為初級抗 體以被標定有標定物質之二次抗體來偵測。更進一步而 言’使用蛋白質G(protein G)或蛋白質A(pro1：ein A)管 柱’可偵測或測量在本發明之篩選中的結合至蛋白質之抗 體。 或者，在本發明之鑑定方法的另一實施例中，可使用 利用細胞之雙雜合系統（切〇一 hybrid system) (MATCHMAKER Two-Hybrid system”， “Mammalian
MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit” ， "MATCHMAKER 2125-9739-PF;Daphne 29 200909587 one-Hybrid system” （C1ontech) ; “HybriZAP Two-Hybrid Vector System” (Stratagene) ; the references “Dalton and Treisman， Cell 1992， 68: 597-612” ， “Fields and Sternglanz， Trends Genet 1994， 10:
286-92”）。在雙雜合系統中’例如SMYD3多胜肽融合至 SRF結合區或GAL4結合區，且在酵母菌細胞中表現。veGFRI 胜肽融合至VP 1 6或GAL4轉錄活化區，且在測試化合物存 在的情況下也在酵母菌細胞中表現。或者，VEGFR1胜肽可 融合至SRF結合區或GAL4結合區，而SMYD3多胜肽融合至 VP16或GAL4轉錄活化區。當測試化合物不抑制SMyD3多 胜肽與VEGFR1胜肽間之結合時，兩者之結合活化報導基因 使正複製體（positive clone)為可偵測的。報導基因，除 了 HIS3之外，可使用例如Ade2基因、iacz基因、CAT基 因、冷光（luciferase)基因與此類。 在此，當任何改變發生於SMYD3多胜肽與VEGFR1胜肽 後，也可測定SMYD3多胜肽與VEGFR1胜肽間之結合程度。 特別地，藉由將測試化合物與表現SMYD3多胜肽與vegfri 胜肽之細胞進行接觸，可執行此種筛選。例如，可偵測細 胞增生之抑制來測定測試化合物對於SMYD3多胜肽與 V E G F R1胜肽之結合的影響。 1.競爭分析形式 可使用λ兄爭分析以篩選本發明之測試化合物。經由實 施例’ 一競爭EUSA形式可包括SMYD3乡胜肽（或mFR1 胜肽）結合至-固體支持物。將結合之簡3多胜肤（或 2125-9739-PF;Daphne 30 200909587 VEGFR1胜肽）與VEGFR1胜肽（或SMYD3多胜肽）及一測試化 合物一起培養。在允許測試化合物及/或VEGFR1胜肽（或 SMYD3多胜肽）結合至SMYD3多胜肽（或VEGFR1胜肽）充分 之時間後，清洗受質以移除未結合之材料。之後測定VEGFR 1 胜肽結合至SMYD3多胜肽的量。於任何本技術領中所熟知 的多種方法中，可達成此，例如藉由使用VEGFR1胜肽（或 SMYD3多胜肽）其標誌一可偵測之標定，或藉由將經清洗之 受質與一經標定之抗VEGFR1胜肽（或SMYD3多胜肽）抗體進 行接觸。VEGFR1胜肽（或SMYD3多胜肽）結合至SMYD3多胜 肽（或VEGFR1胜肽）的量會與測試化合物干擾VEGFR1胜肽 結合至SMYD3的能力成反比。蛋白質（包括但不限於抗體） 標定於 Harlow & Lane，Antibodies, A Laboratory Manual ( 1 988)中敘述。 在一變化中，以一親合性標誌（tag)標定VEGFR1胜肽 (或SMYD3多胜肽）。之後將標定之VEGFR1胜肽（或SMYD3 多胜肽）與一測試化合物及SMYD3多胜肽（或VEGFR1胜肽） 一起培養，然後將其進行免疫沈殿（immunoprecipi tate)。 之後免沈澱受到使用一抗SMYD3多胜肽（或VEGFR1胜肽） 之抗體的西方墨點法。以先前競爭分析形式，SMYD3多胜 肽（或VEGFR1胜肽）被發現與VEGFR1胜肽（或SMYD3多胜肽） 結合的量與測試化合物干擾VEGFR1胜肽結合至SMYD3的能 力成反比。 2.非競爭分析形式 非競爭結合分析形式也發現作為起篩始選測試試劑圖 2125-9739-PF;Daphne 31 200909587 書館之效用，而此測試試劑資料庫被構築成一形式，其不 能立即順從使用競爭分析之篩選，例如此處所述之那些。 此種資料庫之例子為噬菌體呈現資料庫（phage display library)。（參見，例如 Barret eia/.，Anal Biochem 1992, 204: 357-64)。 噬菌體資料庫於製造大量不同重組之胜肽的快速工作 量能力中發現效用。噬菌體資料庫不提供其本身至本發明 , 的競爭分析’但在非競爭形式中可被有效篩選以確定哪個 重組胜肽測試化合物結合至VEGFR1胜肽或SMYD3多胜肽。 被鑑定為結合之測試化合物可之後使用競爭形式被製造與 篩選。噬菌體與細胞呈現資料庫之製造與篩選為本發明領 域所熟知的技術’且被討論於例如L a d n e r以<3 /.，W 0 88/06630； Fuchs et al., Biotechnology 1991, 9: 1369-72; Goward et al. , TIBS 1993, 18: 136-40; Charbit
et al. , ΕΜΒ0 J 1 986, 5: 3029-37 ; Cull et al. , PNAS USA C 1992> 89: 1865-9; Cwirla et al. , PNAS USA 1990, 87: 6378-82 。 一示範之非競爭分析會採用一對於競爭分析之類似步 驟而不需加入成分之一（VEGFR1胜肽或SMYD3多胜肽）。然 而’當非競爭形式測定與VEGFR1胜肽或SMYD3多胜肽結合 之測試化合物時，對於各候選者而言，測試試劑對於與 VEGFR1胜肽及SMYD3多胜肽兩者結合之能力需被鑑定。因 此’經由貫施例，可測定測試化合物對固定之VEgfr〗胜肽 的、纟σ & ’藉由清洗掉未結合之測試化合物；從支持物洗提 2125-9739-PF;Daphne 32 200909587 • 結合之測試化合物，然後分析洗提液，例如藉由質譜分析 (mass spectroscopy)、蛋白質確認（protein determination)(Bradford 〇r L〇wry assay, or Abs. at 280nm determination·)。或者，可排除洗提步驟且測定測 試化合物之結合，藉由監控於支持物表面之有機層的分光 έ晋特性改變。監控表面分光譜特性的方法包括’但不限於 吸收、反射、透射比、雙折射、折射率（refractive index)、 衍射（diffraction)、表面電漿共振、橢圓偏光術 (ellipsoroetry) ' 共振鏡技術（res〇nant mirror technique)、光波‘技術（grating C0Upied wavegUide technique)與 ^ 極共振光譜（muitip〇iai· resonance spectroscopy) ’而這些全部為本技術領域所熟知。也可使 用一經標定之測試化合物於上述分析中以排除洗提步驟之 需要。在此例子中，在清洗未結合之材料後，與支持物結 合之標定的量與測試試劑的結合成正比。 f : 為 了浴液相化學（solution phase chemistry)，已發 展一些熟知之自動系統。這些系統包括自動工作站，例如 由 Takeda Chemical Industries， LTD.(Osaka， Japan)發 展之自動合成裝置與許多機械系統利用機械手臂（Zymate II，Zymark Corporation, Hopkinton, Mass. ; Orca, Hewlett Packard，Palo Alto，Calif.)，其模仿由化學家 執行之手動合成操作。任何上述裝置適合與本發明一起使 用。對於這些裝置之修飾的本質與完成（若有的話）以使其 可如此處討論所操作，對於相關技術領域人士而言為顯而 2125-9739-PF;Daphne 33 200909587 ·· 易見。此外很多組合之資料庫本身為市售可得（參見，例如 ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, E x t ο n, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, eic, ) ° 夕種低效能（l〇w—throughput)與高效能 (high-throughput)酵素分析形式於本技術領域已熟知，可 , 立即地適合偵測或測量SMYD3之甲基轉換酶活性。對於高 政旎分析’可方便地固定VEGFR1胜肽受質於一固體支撐 物，例如多孔盤（multiwellplate)、載玻片、或晶片。在 反應之後’藉由上述方法可偵測曱基化產物於固體支撐物 上。或者曱基轉換酶反應可發生於液體中，於其之後可固 定\EGFR1胜肽於一固體支撐物，以及偵測曱基化的產物。 為了幫助上述分析，固體支撐物可包覆鏈黴抗生素 (streptavidin)以及VEGFR1以生物素（bi〇tin)標定，或是 (」固體支撐物包覆VEGFR1抗體。熟悉此技術領域者可依照所 需篩選能力的效能決定適合的分析形式。 本發明也仔細考慮了本發明蛋白質之部分胜肽 (partial peptide)的使用。一部份胜肽具有專一於smyd3 蛋白質的-胺基酸序列，且較佳由少於約4〇〇個胺基酸所 組成，通常少於約200與常常少於約i 〇〇個胺基酸以及至 少約7個胺基酸 '約8個胺基酸或更多較佳，以及約9個 胺基酸或更多更佳。可使用部份胜狀，例如用於筛選結合 SMYD3蛋白質之試劑或化合物與用於_選SMYD3與其一輔 2125-9739-PF;Daphne 34 200909587 助因子（CO-factor)(例如SAM)之 ]的鍵結的抑制劑。在此
中師選方法中’較佳使用包含SET _ &域之部份胜肽。 可藉由基因工程、胜肽合成 又知方法或以適合之胜 月太酶（PePtldaSe)分解本發明之蛋白質來製造本發明提及 之-部份胜肽。對於胜肽合成，例如可使用固相合成_ phase synthesis)或液相合成（Η · 观、nquid phase synthesis)。 一具有SET區域突變之SMYD3突變顯示對細胞增生有 抑制影響。因此SMYD3之一邻柃w n上*人 ^ σΡ知胜肽包含SET區域 “NHSCXXN” 與 “GEELXXXY，，較佳。 可使用任何測試試劑。例子包括，但不限制為細胞萃 取物、細胞培養懸浮物、微生物發酵產物、海生生物之萃 取物、植物萃取物、經純化或天然的蛋白冑、非胜肽化合 物、合成的微分子化合物以及天然化合物。使用本技術領 域所熟知之組合資料庫方法，也可獲得本發明之測試試劑 或化合物，方法包括但不限於，（1)生物資料庫；（2)空間 可定位平行（spatially addressable parallel)固相化學 或溶液相化學；（3)要求影像強化處理（dec〇nv〇luti〇n)之 合成資料庫方法；（4)單一顆粒單一化合物（〇ne_bead one-compound)資料庫方法與（5)使用親和層析（affinity chromatography)篩選之合成資料庫方法。使用親和層析篩 選之資料庫方法限於胜肽資料庫，而其他四種方法適合胜 肽、非胜肽募聚物或小分子之化合物資料庫（Lam， Anticancer Drug Des. 12: 145-67 (1997)). Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can 2125-9739-PF；Daphne 35 200909587 be found in the art (DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Aug 1;90(15):6909-13. ; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678-85 ( 1 994); Cho et al., Science 261: 1303-5 (1993)； CarelletaL, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059 ( 1 994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 ( 1 994); Gallop et al., J. Med· Chem. 37: 1233-51 (1994))。可於溶液中（see Houghten，Bio/Techniques 1 3: 41 2-21 ( 1 992))或珠子 (Lam，Nature 354: 82-4 ( 1 99 1 ))、晶 (Fodor，Nature 364: 555-6 (1993))、細菌（US Pat. No. 5, 223, 409)、生殖細 胞（spore)(US Pat. No. 5,571,698; 5,403,484, and 5,223,409)、質體（Cull etal·，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 89: 1 86 5-9 ( 1 992 ))或喔菌體（Scott and Smith, Science 249: 386-90 (1990); Devlin, Science 249: 404-6 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82 (1990)； Felici, J. Mol. Biol. 222: 3(U-10 (1991); US Pat. Application 200201 03360)上表 現化合物資料庫。本發明之或合物可為一單一化合物或一 化合物之組合。當於本發明之篩選方法中使用化合物之組 合時，化合物可被相繼或同時接觸。 測試試劑或化合物於此處所述之分析也可以抗體的形 式為例’此抗體對SMYD3或缺少曱基轉換酶活性之部分 SMYD3胜肽專一性鍵結。例如，可測試抗體（例如單株抗體） 2125-9739-PF;Daphne 36 200909587 ··阻擋SMYD3與其VEGFR1受質之間鍵結的能力。 -藉由本發明之篩選方法分離之試劑或化合物為一抑 制SMYD3之甲基轉換酶活性藥物之候選者，因此可被提供 來治療或避免肝細胞癌、大腸直腸癌、膀胱癌及/或乳癌。 此外，藉由加入、删除及/或取代改變抑制smyd3之甲 基轉換酶活性之試劑或化合物之結構之一部分的試劑或化 合物也包含與利用本發明之篩選方法所取得之試劑或化合 物。 如上所述，抑制SMYD3之曱基轉換酶活性之試劑或化 合物可以是缺少SMYD3曱基轉換酶活性之部分胜肽或是抗 SMYD3之抗體。如此處所使用，「抗體」指一免疫球蛋白 分子，其具有一專一性結構只與用來生成此抗體之抗原 (ant: i gen)或非常相似之抗原互相作用（亦即鍵結）。更進一 步說，一抗體可以是一抗體的片段或一經修飾過的抗體， 其與由SMYD3基因所編碼出之蛋白質鍵結。例如抗體片段 可以是Fab、F(ab’ ）2、Fv或單鏈Fv(scFv)，其中從Η盥 V.’、 L鏈來的Fv片段以適合的連結器（linker)連起（Hust〇n j. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:5879-5883 ( 1 988))。更專一地，藉由酵素（例如木瓜酵素（papain)或 胃蛋白酶（Pepsin))來處理抗體，可生成一抗體片段。或者 可建構編碼出4几體片段之基因，將此基因插入一表現載 體’以及在一適合的宿主細胞中表現（參見，例如C〇 S. ^tal. J. Immunol. 1 52:2968-2976 (1 994); Better M. and Horwitz A. H. Methods Enzymol. 178:476-496 (1989); 2125-9739-PF;Daphne 37 200909587 ., P1 uck thun A. and Skerra A. Methods Enzyrao 1. 178:497-515 (1989); Lamoyi E. Methods Enzymol. 121:652-663 (1986); Rousseaux J. et al. Methods Enzymol. 121:663-669 (1986); Bird R· E. and Walker B. W. Trends.Biotechnol. 9:1 32-1 37 (199 1 ))。 藉由與一多樣化分子（例如聚乙烯醇（p〇lyethylene Glycol))結合可修飾一抗體。本發明提供上述經修飾的抗 體。以化學性修飾一抗體可以得到上述修飾的抗體。上述 之修飾方法於本技術領域中是常見的。或者，一抗體可具 有一敌合抗體（chi meric anti body)的形式，其具有從非人 類抗體而來之多變區域（var i ab 1 e reg i on)以及從人類抗 體而來之固定區域（constantregion)，或具有一類人體來 源抗體（humanized anti body)的形式，其包括從非人類抗 體而來之互補決定區（complementarity determining region)(CDR)、從人類.抗體而來之架構區域（framew〇rk f region)(FR)與固定區域（constant region)。上述抗體可 利用已知的技術來準備。利用替換齧齒目動物的CDRs或 CDR序列至人類抗體的對應序列可表現人源化 (humanization)(參見，例如 Verhoeyen ez1· a/.， 239:1534-1536 (1988))。因此上述類人體來源抗體 (humanized antibody)為敌合抗體（chimeric antibody)， 其中實質上少於完整人類多變區域，已被從非人類物種而 來之相對序列所取代。 也可使用完整的人類抗體，其還包括類多變區域除了 2125-9739-PF;Daphne 38 200909587 *.人類架構與固定區域以外。此種抗體可利用本技術領域中 多種熟知的技術來製造。例如，方法包含了使用 表現於可用的嗟菌體（bacteriophage)之人類抗體片段重 組庫（recombinant libraries)(例如 H〇〇genb〇〇m&winter J· M〇1. Blol. 227:381 ( 1 991 ))。相似地，藉由導入人類’ 免疫球蛋白基因（human immunoglobulin 1〇ci)於轉植動物 (transgenic animals)(例如小鼠）可製造人類抗體，於轉 植動物中，其内生的（end〇gen〇us)免疫球蛋白基因已被部 分或全部去活化。此方法已被敘述，例如於us. 6’150,584; 5,545,807; 5,545,806； 5,569,825；' 5, 625, 1 26; 5, 633, 425; 5, 661，016。 ’ 當提供一藉由本發明方法分離而得之試劑或化合物如 人類或其他動物（例如小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、 錦羊、豬、牛、猴、狒狒與黑猩猩）的藥物時，被分離試劑 或化合物可被直接提供，或可從已知之藥物準備方法制訂 :、，劑量。例如根據所需，可提供藥物為口服如糖衣包膜錠、 膠囊、萬能藥（elixirs)與微膠囊，或非口服，以無菌溶液、 以水懸浮或任何藥理學上可接受的液體之注射形式。此 外，试劑或化合物可與藥理學上可接受之攜帶者或媒介物 進行混合（特別是無菌水、生理鹽類（physi〇;l〇gicai salme)、植物油（plant_〇iIs)、乳化劑（effluisifiers)、 懸浮試劑（suspending agents)、介面活性劑 (surfactants)、安定劑（stabi 1 izers)、調味劑（fiav〇ring agents)、賦形劑（excipients)、載具（vehicles)、防腐劑 2125-9739-PF;Daphne 39 200909587 ·. (preservatives)、黏接劑（binders)與此類）於一般接受藥 物完成所要求的一劑量形式。於這些準備之活動組成成分 達到適合的劑量於可取得之必要的範圍。 可被混合至藥錠與膠囊之添加劑的例子有，黏接劑 (binders) ’ 如明膠（gelatin)、榖類澱粉（corn starch)、 特拉加康斯樹膠（tragacanth gum)與阿拉伯膠（arabic gum);賦形劑（excipients)，如晶形纖維素（crystal 1 ine cel lulose);膨脹劑（swel 1 ing agents)，如穀類澱粉（corn 3七31^11)、明膠（§6 1&^11)與海藻酸（312111泌3(^(1);潤滑 劑（lubricants) ’ 如硬脂酸鎂（magnesium stearate);增 甜劑（sweeteners)，如蔗糖（sucrose)、乳糖（lactose)4 糖精（saccharin);以及調味劑（fiavoring agen1;s)，如薄 何（peppermint)、紅珠樹油（Gaultheria adenothrix oil) 與櫻桃（cherry)。當單位劑量形式為一膠囊，一液體攜帶 者’如油，也可進一步被包含於上述組成部分。可配置注 【射用無菌合成物於正常藥物完成（drug implefflentations) 之後’使用載具，如蒸餾水用來注射。 生理鹽類（Phy s i ο 1 〇g i ca 1 sa 1 i ne)、葡萄糖與其他等 滲透壓液體（isotonic iiquids)，包括佐劑（adjuvants)， 如 D-山梨醇（D-sorbitol)、D-甘露糖（D-mannose)、D-甘 硌醣醇（D-manni ιοί)與氯化鈉可被用來當作注射用水溶 液。這些也可以與穩定的助溶劑如酒精（alc〇h〇1)，特指乙 醇（ethanol);多元醇（p〇lyalc〇h〇ls)，如丙二醇 (propylene glycol)與聚乙二醇（p〇lyethylene glyc〇1); 2125-9739-PF;Daphne 40 200909587 ·. 非離子界面活性劑（non-ionic surfactants)，如聚山梨醇 酯 80(Polysorbate 80(TM))與氫化乙氧基化蓖麻油 (HCO-50)結合使用。 芝麻油或大豆油可被當作油性液體，也可與苯甲酸苄 酯（benzyl benzoate)或苯曱醇（benzyl alcohol)結合使用 為助溶劑（so 1 ubi 1 i zer)以及可與緩衝溶液配置如，磷酸緩 衝溶液（phosphate buffer)與醋酸鈉緩衝溶液（sodium acetate buffer);止痛藥（pain-killer)，如鹽酸普魯卡 因（procaine hydrochloride);安定劑（stabi 1 izer)，如 苯甲醇（benzyl alcohol)與酚（phenol);以及抗氧化劑 (anti-oxidant)。上述準備之注射劑可裝入適合的注射液 弃瓦。 可使用本技術領域人士熟知的方法來供給病患本發明 之藥物組成，例如動脈（intraarterial)、靜脈 (intravenous)、經皮（percutane〇us)注射，以及鼻吸 ^ (intranasal)、肌肉内（intramuscular)或口服（oral)給 藥。給藥劑量與方法不同根據病患的體重與年紀以及給藥 方法，然而熟悉此技藝人士可慣例地選擇一適合的給藥方 法。此外，若影響的試劑或化合物是由DNA所編碼，可將 此DNA插入載體中來做基因治療（gene fherapy )，並且將 此載體供給給病患以實行治療。給藥劑量與方法不同根據 病患的體重與年紀以及症狀，而熟悉此技藝人士可合適地 選擇它們。 例如’雖然結合SMYD3與調控其活性之試劑或化合物 2125-9739-PF;Daphne 41 200909587 的劑量是根據症狀，而t對正常成人（體重為崎）口服給 樂時，一般劑量範圍為每天約以呢至刚岐，每天約1〇即 至50mg較佳，每天約1.0邶至20mg更佳。 當給藥為非σ服（parenteraI ly)時，對正常成人（體重 為6〇Kg)注射的形式雖然根據病患、目標器官、症狀與給 藥法有些不同’合宜的靜脈注射劑量為每天約〇〇一至 3〇呢’每天約G.lmgs 2Gmg較佳以及每天約^⑽至_ 更佳。至於其他動物也*，給藥量以體重㈣替來轉換。 口本么月進步提供於病患治療癌症的方法，如肝細胞 癌、大腸直腸癌、膀胱癌與乳癌D給藥可預防或治療對於 一病患在失調（或易受失調影響）或具一失調相關異常的 SMYD3 f基轉換酶活性的風險時。方法包括於適合的癌症 細胞降低SMYD3的功能。功能可藉由從本發明之篩選方法 而得之試劑或化合物的給藥來抑制。 另一方面，本發明包括預防或治療的成分，其包含一 個或多個此處敘述的試劑或化合物。或者，本發明也提供 此處敘述的一或多個治療試劑或化合物的使用，其為了產 生一預防或治療的組合物，此組合物為治療及/或欲防癌 症，更特別是肝細胞癌，大腸直腸癌，膀胱癌和乳腺癌。 藥物配方（Pharmaceutical formulations)可包括那此適 於口（oral)、直腸（rectai)、鼻（nasal)與局部的 (topical)(包括頰（buccai)與舌下（sub_lingual))、陰道 (vaginal)或非口服（parenterai)(包括肌肉内 (intranmscular)、皮下（sub-cutaneous)和靜脈内 42 2125-9739-PF；Daphne 200909587 (intravenous))的給藥，或者對管理來說透過吸入 (inhalation)或者導氣（insufflation)。配方 (formulations)可合宜方便地表現於分離的劑量單位並且 可藉由任何在藥的技術領域眾熟知的方法準備。所有上述 藥物方法’都如所需包括了使活性化合物與液體攜帶者或 容易區分的固體攜帶者或者兩個結合的步驟，如有必要， 把這種產品做成被要求的配方。 適於口服給藥的藥物配方可能方便地表現成分離的單 位，例如膠囊、藥包（cachet)或者藥錠，每個包含被預先 決定有效成分（active ingredient)的量；如粉或顆粒；或 如一溶液，或如懸浮液或乳狀液。可表現有效成分如大藥 丸（bolus)、藥糖劑（electuary)、或膏狀物，是在一純物 的形式，亦即不需攜帶者。口服給藥的藥片和膠囊可包含 常見的賦形劑（excipients)，例如結合試劑、填料、潤滑 劑、崩解劑（disintegrant)或者增溼劑。隨意地一種或多 種構造成分，以壓縮或塑造形成藥旋。壓縮的藥旋可藉由 壓縮自由流動形式(如粉或者顆粒)之有效的成分於合適機 器來準備，隨意地與結合劑、„劑、惰性稀釋（km diluent)、潤滑、表面活躍或者驅散劑（dis^singagent) 進行混合。塑造的藥錠藉由於—適合的機器塑造以惰性液 體稀釋劑㈣的粉狀化合物之混合物。藥劑可以本技術領 域熟知的方法包霜。σ 叮 ^ — 服可以液狀調劑例如水或油懸浮液 /谷液、乳狀物 '糖漿或萬 禺此梁的形式，或可以乾的產物表 現為了使用前與水或其他 適的載具組成。此種液狀調劑 2125-9739-PF;Daphne 43 200909587 可包含常見的添加物，例如懸浮試劑 '乳化試劑、非水载 具（其可包含食用油）或防腐劑。可視需要而定調配藥錠以 便提供有效組成之緩慢或經控制的釋放。 非口服給藥的配方包括水與非水無菌注射溶液，可包 έ才几氧化劑、緩衝溶液、制菌劑（bacteriostats)與溶質， 其使得配方與預期接受者的血等滲透；以及水或非水無菌 懸斤液其可包含懸浮劑與增稠劑（thickening agent)。配 方可以單—劑量（unit dose)多劑量（multi-dose)包裝表 現例如密封的安瓿（ampoules)或小玻璃瓶viais，以及 可被保存於—冷凍乾燥（freeze-dried)(ly〇philized)條 件’只需立即於使用前外加無菌液體攜帶者，例如食鹽水、 注射用水。或者配方可以連續性輸注（c〇ntinu〇us lnfuSi〇n)表現。立即注射（extemp〇rane〇us ⑽） 洛液與懸浮液可從先前所述種類的無菌藥粉、藥粒鱼藥錠 準備。 〃 直腸給藥的配方可以栓劑與一般攜帶者如可可油或聚 乙一醇（P〇lyethylene Glyc〇1)來表現。在口中（例如頰 ^buCCally)與舌下(sublinguaUy))的局部給藥，包括錠 ::1 ^包括於調°未基料的有效成分，你丨如蔗糖和阿拉伯膠 ，西汽耆膠（tragacanth) ’以及藥劑其包括有效成分於基 料：’例如’明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯膠。從本發明 :仔之化合物的鼻吸（intra_nasal)給藥可以液體喷霧或 分散的藥粉或於滴狀物形式來使用。滴狀物可以水或非水 基料’也可包含-或多個分散劑、助溶劑或懸浮劑。液體 2125-9739-PF；Daphne 44 200909587 喷霧合宜地分裝成加壓包裝。 藉由吸入給藥的化合物方便從吹藥器 (insufflator)，喷霧器、加壓包裝或提供其他合.宜的氣霧 喷灑的方法。加壓包裝可包括一合適推谁去 y_ %有，例如二氯二 氟代甲烧（dichlorodifluoromethane) 、 r ，友田❼ 二氧氣甲烧 (trichlorofluoromethane) 、四氟 _ 友 氣乙烧 (dichlorotetrafluoroethane)、二氧化碳或者其他合適氣 體。就一加壓的氣霧而言，劑量單位可藉由提供一閥門給 予一計算量來確定。 或者，對於透過吸入或（insufflati〇n)給藥，化合物 可以採取一個乾粉成分的形式，例如化合物與合適粉基礎 (如乳糖或澱粉）之的混合粉。粉組成可以單位劑量形式表 現，例如膠囊、卡E (cartridges)、明膠或氣泡包裝 (blister packs)，其中可用吸入器（inhaUt〇r)或充氣機 (insufflators)來幫助藥粉的給藥。 當需要時，上述配方，可使用合宜的給予有效成分的 持久釋放。藥物成分可也包含其他有效成分，例如抗菌試 劑、免疫抑制劑（i關unosuppressants)或防腐劑。 除了以上特別提到的成分，本發明的配方可包括在其 他於本技術領域的常見試劑關於討論中配方的形式，例 如，適於口服給藥的可包括調味試劑。 杈佳的單位劑量配方為包含一有效劑量（如下所述）或 有效成分之其適當部分。 對於每種刖面提到的狀況來說，成分可被口服或經由 2125-9739-PF;Daphne 45 200909587 注射給藥於一劑量為一天約〇·】至25〇mg/kg。給成人的劑 量範圍一般從大約5mg至17.5g/day，約5mg至約1〇g/day 較佳，約1 〇〇mg至3g/day最佳。藥錠或者其他單位劑量形 式的表現被提供於分離的單位可合宜地包含一量，其於此 劑里或此知彳里的多倍為有效’例如，單位包含約.5mg至 500mg，通常為約 l〇〇mg 至 500mg。 醫藥組成以口服或注射（靜脈内或者皮下）給藥較佳， 並且給予病患準確的藥量是内科醫生的責任。但是，使用 的劑量將依據§午多因素，包括病患的年齡和性別、要被治 療的確切的失調以及其嚴重程度。此外，給藥的方式可能 變化’依據狀態和其嚴重程度。 本發明更提供一種套組用以偵測一測試化合物調控 VEGRF1之曱基化的能力，該套組包括： (a) —具有甲基轉換酶活性之SMYD3多胜肽係擇自下 列所組成之群組： i 一多胜肽其包含序列辨識號：2之胺基酸序列； i i 一多胜肽其包含序列辨識號·· 2之胺基酸序列，其 中 個或多個胺基酸被替換、删除或插入，又其中該多胜 肽與由序列辨識號：2之胺基酸序列所組成的多胜肽具有 相同的甲基轉換酶活性； 1 1 1 . 一多胜肽其包含之胺基酸序列至少與序列辨識 號· 2具有8 0 %的同源性，其中該多胜肽與由序列辨識號： 2之胺基酸序列所組成的多胜肽具有相同的甲基轉換酶活 性； 46 2125-9739-PF；Daphne 200909587 • 1v · 一多胜肽其由一聚核苷酸所編碼，該聚核苷酸於嚴 苛條件下與具有序列辨識號：1之核苷酸序列所組成的聚 核芽s欠進行雜交’其中該多胜肽與由序列辨識號：2之胺 基s欠序列所組成的多胜肽具有相同的曱基轉換酶活性；以 及 V.—多胜肽其包含序列辨識號：2之位置117至246 的胺基酸序列，其中該多胜肽與由序列辨識號：2之胺基 酸序列所組成的多胜肽具有相同的曱基轉換酶活性； (b) — VEGFR1胜肽’其具有被（a)之該多胜肽甲基化之 能力；以及 (c) 一對於該VEGFR1胜肽甲基化之輔助因子。 在本發明中，較佳之VEGFR1胜肽包括由序列辨識號： 2之胺基酸序列所組成之多胜肽，或其功能性突變或片段。 較仫片#又包括，但不限於，一包括序列辨識號：4之位置 8〇〇至841的胺基酸序列的多胜肽或由序列辨識號：4之位 、置800至841的胺基酸序列所組成的多胜肽，或多胜肽其 ‘包括VE_之離胺酸831。此外，較佳之輔助因子為s_ 腺同半胱胺酸水解酶（s_aden〇syl h〇m〇cysteine hydrolase) (SAHH)。本發明之套組可更包括一用以偵測曱 基化之VEGFR1胜肽的試劑。例如，可使用一辨認VEGFR1 胜肽的抗體做為偵測試劑。實施本分析的說明（例如，書面 資料、錄音帶、VCR、CD-R0M等）可被包含於套組中。此套 組之分析形式為本技術領域所熟知之甲基轉換酶分析或結 合。 2125-9739-PF;Daphne 4 7 200909587 ·. 【實施例】 材料與方法 試劑與西方墨點分析： 根據敘述於文章（Hamamoto R et al.，S Nature cell biology 2004，6(8): 73卜40.)的方法來執行蛋白質之萃 取、免疫沈澱與西方墨點分析。以抗SMYD3(Abcam，
Cambridge, ΜΑ)、抗 HA(Sigma， St Louis， M0)、抗 Flag(Sigma)、抗 GST(BD Pharmingen, San Diego, CA)、 抗 beta-actin(Sigma)或抗-麟酸化酷胺酸 (anti-phospho-Tyrosine)(PY20; Sigma)抗體來執行免疫 墨點分析。結合HRP二次抗體被用於ECL Detection
System(Amersham Biosciences，Piscataway, NJ)。重組 之組蛋白H3與 VEGFR1C3108)分別購自Upstate Biotechno logy(Lake Placid, NY)與 Calbiochem(San Diego, CA)。曱基化離胺酸 831 專一抗體（anti-K831me2) 純化自以RERLKLGKm2SLGRGA(包含雙甲基化之離胺酸831的 合成胜肽）進行免疫之兔子的血清。 細胞株與組織樣本： 人類胚胎腎臟細胞（Human embryonic kidney cell) 株（HEK293與293T)。人類結腸癌細胞株（SW480)得自美國 菌種中心（ATCC)。HCC SNU423細胞與MCF乳癌細胞分別為 韓國細胞株銀行（Korea cell-line bank)與日本癌症研究 基金會之癌症學會（the cancer institute of the Japanese foundation for cancer research)親切提供 〇 2125-9739-PF;Daphne 48 200909587 · 所有細胞株於適合的培養基接生長成為單層 (monolayers)。 質體的製備： 先月ij 文早（Hamamoto R et al.，S Nature cell biology 2004，6(8): 731 -40.)已敘述敘述表現SMYD3之質體的製 備。本發明也製備表現N-端HA-標誌的（HA-tagged)或N-端3xFLAG-標誌的（3xFLAG-1;agged)VEGFRl之質體藉由選 殖（cloning)各種rt-PCR產物（包含不是VEGFR1的野生型 就是刪除型）進入於 pCMV_HA(clu1;ch，Pal〇 Alto，CA)、 p3xFlag-CMV14 (sigma)或 pGEX6P-3 (Amersham Biosciences)載體適合的位置。使用引子（primer)組（表 1)可執行RT-PCR實驗。使用Qui ckchange 11 XL點突變套 組（Quickchange 11 XL Site-directed Mutagenesis kit^KStratagene，LaJolla，CA)根據供應者之步驟產生 包含胺基酸序列之取代的質體。 ;； 本發明之發明人根據提供者之步驟使用FuGENETM 6試 劑（FuGENE 6 reagent)(Roche, Indianapo1is，IN)以哺 乳類質體轉殖培養之細胞。使用麩胱甘肽Sepharose 4B(Glutathione Sepharose 4B)(Amersham Biosciences) 自大腸桿菌BL21細菌細胞純化重組之GST融合VEGFR1蛋 白質。使用於實施例中之引子於以下列出。 表1、引子序列表 2125-9739-PF;Daphne 49 200909587
List of primer sequences. primers_primer sequences_SEQ ID Nos GST-VEGFR1#1(F) CGGAATTCCCCAGATGAAGTTCCTTTGGATGAG 5 GST-VEGFR1#1(R) CCGCTCGAGAATCAGATCTTCCATAGTGATGGGCTC 6 GST-VEGFR1#2(F) CGGAATTCGATTTCTTACAGTTTTCAAGTGGCCAG 7 GST-VEGFR1#2(R) CCGCTCGAGAGCTGAAATACTTTCCTTGAAGAAGTC 8 GST-VEGFR1#3(F) CGGAATTCAGCTCCGAAGTTTAATTCAGGAAGCTCT 9 GST-VEGFR1#3(R) CCGCTCGAGCTAGATGGGTGGGGTGGAGTACAGG 10 GST-VEGFR1 -N1 (R) CCGCTCGAGCACTTTTCCAAAAGCCCCTCTTCCAAG 11 GST-VEGFR1 -N2(F) CGGAATTCGGTTCAAGCATCAGCATTTGGCATTAAG 12 GST-VEGFR1 -N2(R) CCGCTCGAGCTCAGTCATCAGAGCTTTGTACTCGC 13 GST-VEGFR1 -N3(F) CGGAATTCGCTAAAAATCTTGACCCACATTGGCCAC 14 GST-VEGFR1 ^N3(R) CCGCTCGAGGTAGTTGGAGAGATTTCCATATTTGCAG 15 GST-VEGFR1-N4(R)CCGCTCGAGCTTGGTGCAGGCTCCCAGCAGG 16 VEGFR1-K819A(F) CTCCCTTATGATGCCAGCGCGTGGGAGTTTGCCCGGGAG 17 VEGFR1 -K819A(R) CTCCCGGGCAAACTCCCACGCGCTGGCATCATAAGGGAG 18 VEGFR1-K831A(F) GACTTAAACTGGGCGCATCACTTGGAAGAGGGGCTTTTGG 19 VEGFR1-K831 A(R) CCAAAAGCCCCTCTTCCAAGTGATGCGCCCAGTTTAAGTC 20 VEGFR1-K819E^) CTCCCTTATGATGCCAGCGAGTGGGAGTTTGCCCGGGAG 21 VEGFR1-K819E(R) CTCCCGGGCAAACTCCCACTCGCTGGCATCATAAGGGAG 22 VEGFR1-K831E(F) GACTTAAACTGGGCGAATCACTTGGAAGAGGGGCTTTTGG 23 VEGFR1-K831E(R) CCAAAAGCCCCTCTTCCAAGTGATTCGCCCAGTTTAAGTC 24 VEGFR1-K819R(F) CTCCCTTATGATGCCAGCCGGTGGGAGTTTGCCCGGGAG 25 VEGFR1--K819R(R) CTCCCGGGCAAACTCCCACCGGCTGGCATCATAAGGGAG 26 VEGFR1-K831R(F) GACTTAAACTGGGCCGATCACTTGGAAGAGGGGCTTTTGG 27 VEGFR1-K831R(R) CCAAAAGCCCCTCTTCCAAGTGATCGGCCCAGTTTAAGTC 28 HA-VEGFRl(F) CGGAATTCACCCAGATGAAGTTCCTTTGGATGAG 29 flag-SMYD3-wt(F) AAGCTTGCGGCCGCGATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAAAG 30 flag-SMYD3-wt(R) GGTACCTCTAGATTAGGATGCTCTGATGTTGGCGTC 31 flag-VEGERl#l(R) GGGGTACCTCAAATCAGATCTTCCATAGTGATGGGCTC 32 flag-VEGFRl#2(R) GGGGTACCTCAAGCTGAAATACTTTCCTTGAAGAAGTC 33 flag-VEGFRl#3(R) GGGGTACCCTAGATGGGTGGGGTGGAGTACAGG 34 flag-SMYD3-N20(F) CGGAATTCCGCCGTGACCCCGCTGGCGCCCCGGAG 35 flag-SMYD3-N20(R) GGGGTACCTTAGGATGCTCTGATGTTGGCGTC 36 flag-SMYD3-D2(F) CGGAATTCTGACTCCGTTCGACTTCTTGGCAG 37 flag-SMYD3-D3(F) CGGAATTCTCGGAAGCAGCTGAGGGACCAGTACTGC 38 flag-SMYD3-SET(R) GGGGTACCTTAGTTACCGGCGCTCCTCCTGGTC_39 //7 7/ ki?甲基轉換酶與激酶分析 以表現 Flag-標誌的野生型 SMYD3 (P3XFLAG-CMV-SMYD3)之質體轉殖至293T細胞。使用抗 F1 ag抗體藉由免疫沈澱純化F1 ag-標諸之SMYD3蛋白質。 使用 Baculovirus system( Invi trogen, Carlsbad, CA)於 Sf 9細胞製備重組之SMYD3蛋白質。以輕微的修飾執行/刀 r/iro曱基轉換酶（MTase)分析，如別處所敘述（Hamamoto R et al·, S Nature cell biology 2004， 6(8): 731-40.)。 簡單地說，免疫沈殿或重組的SMYD3蛋白質與lmcg重 50 2125-9739-PF;Daphne 200909587 組組蛋白H3或VEGFR1蛋白質混合，在做為曱基提供者之 2// Ci的[methy卜3H]-標定之 S-腺核苷曱硫胺酸 (S-adenosy1-L-methionine, SAM)(Amersham Bi osciences) 與或不與S-腺同半胱胺酸水解酶（S-(5, -Adenosyl)-L-homocysteine hydrolase，SAHH)(Signia)存在下，於曱基 轉換酶緩衝溶液（5〇11^1'1^3-11(：1?118.5，10(}11^1(：1，1〇11^ DTT)中’且將其培養1小時於3(TC。經標定之蛋白質藉由 液悲閃燦計數器（liquid scintillation counter)被測定 或在SDS-PAGE後藉由攝影法（f iuor〇geaphy)被谓測。使用 GST融合VEGFR1與HTScanTM VEGFR1激酶分析套組 (GST-fused VEGFR1 and HTScan™ VEGFR1 Kinase Assay Kit)(Cell Signaling, Danvers，MA)根據提供者之步驟執 行 i/? Fjiro 激酶分析。使用 Time-Resolved Plate Reader(Perkin-Elmer，Wellesley，ΜΑ)藉由 615nm 螢光放 射來定量受質之麟酸化。 //7 甲基化分析 根據 Liu 與 Drey fuss 所述之方法（Liu Q and Drey fuss G., Molecular and cellular biology 1995, 15(5). 280 0-8.)且稍微修飾來分析/刀VEFGR1之甲基化。將 表現HA 4示达之VEGFR1的細胞與i〇〇mCg/mi之環己亞胺 (cycloheximide)—起培養於37°C，30分鐘，且之後將其 維持於含10/z Ci的L-[methyl - 3H]甲硫胺酸，3小時。以 抗Η A抗體自細胞卒取物沈；；殿出v E G F R1，藉由S D S - P A G E將 其分離且之後藉由BAS影像系統（BAS imaging 2125-9739-PF;Daphne 51 200909587 • system) (BAS_TR2〇40，FUJ I)或免疫墨點分析將其進行分 析。 RNA干擾： 以SMYD3專一之雙股寡聚核苷酸或控制組s丨RNA，其
購自 Dharmacon(Chicago，IL)來執行 RNAi 之實驗。lxlO5 之 HEK293-SMYD3 細胞使用 〇iig0fectamine 被以各 siRNA 以終濃度1 OnM轉殖。在轉殖後48小時，從細胞萃取蛋白 質且將其進行西方墨點分析。 統計分析·· 使用 Statview 軟體（Statview software) (SAS Institute，Cary，NC)執行所有分析。 實施例 1 : SMYD3 曱基化 VEGFR1 //? 最近的研究已提出VEGFR1牽涉於人類癌症發生中。 因此，於此處使用MTase分析將VEGFR1研究如一 SMYD3 之候L甲基化目標。發明人製備三種細胞内區之VEgfri之 、重組蛋白為受質，VEGFR1#1(密碼（condons)800_1 000)、 VEGFR1#2(密碼 1000-1200)與 VEGFR1#3(密碼 1 200-1 338)。以抗FIag抗體分別從以Flag標誌s〇D3或 mock質體轉殖之HEK293細胞免疫沈澱SMYD3與控制組蛋 白質。如結果所示，/77 VEGFR1#1與控制組蛋白質 相較，其顯著被SMYD3曱基化（第ia圖）。然而於VEGFR1#2 與VEGFR1#3中沒有觀察到甲基化，顯示vegfr1#1包含被 曱基化之殘基。與重組之組蛋白H3相較，偵測 到近乎三倍高之VEGFR1#1甲基化（未顯示）。 、 2125-9739-PF;Daphne 52 200909587 已從昆蟲細胞純化之重組SMYD3蛋白質額外執行一“ MTase分析’其結果證實了 VEGFR1#1之甲基化，而 無VEGFR1#2與VEGFR1#3之甲基化（第lb圖）。為了確認曱 基化殘基，發明人製備額外之VEGFR1蛋白質，其包含了 VEGFR1#1構築物之不同片段（第lc圖）。MTase 分析顯不包含密碼δ00 —841之VEGFIn-N1與包含密碼 800-878之VEGFR1-N7被SMYD3甲基化。然而沒有在 VEGPPH-M H N4、N5、N6或N8中觀察到經曱基化之條 帶（band) ’ 其分別包含密碼 842_878、879 —92〇、842_9〇〇、 879-900 、 842-900 或 842-1〇〇〇(第 ic 圖）。 此結果顯示800至841間之區域最有可能包含被曱基 化之殘基。有趣地，於VEGFR2中偵測到沒有偵測到甲基化 條帶，雖然也將其之細胞質區如一受質分析（資料未顯 不）。置於一起，此處資料更顯示SMYD3對於非組蛋白蛋白 質之曱基化具有受質與序列專一性，與SET7/9及SMYD2相 似0 實施例2 : VEGFR1離胺酸831是藉由SMYD3來曱基化 包含SET之甲基轉換酶的大部分，包括SMYD3，修飾 離胺酸。因此研究於此區域中之離胺酸。在其他種類中於 VEGFR1 同源基因（orthol〇gues)之中，離胺酸 819、828、 831與840為固定的（資料未顯示）^雏然一之前的報導顯 不K/R-S/T/A-L為組蛋白甲基轉換酶SET7/9之——致的甲 基化區（Couture JF et al.，Nat Struct Mol Biol 2006， 13(2) : 140-6.)，然而其他組蛋白曱基轉換酶，例如p53 2125-9739-PF;Daphne 53 200909587 K790、組蛋白隨與腿27，之目標離胺酸並不位於側面 如：/"/T/A—[而為 S/T —b 〇r χ—K—s(第 2& 圖）。因此， 目前之分析集中於與這些區域相配且固定之離胺酸㈣及 831 使用野生型與蛋白質包含離胺酸取代為丙胺酸突變之 VEGm-N!蛋白質來執行/77 w⑽MTase分析（第2b圖）。 ί 雖然此分析顯示甲基化之條帶於野生型與Κ8ΐ9Α突變中， 然而Κ831突變中並無顯示任何甲基化條帶（第⑶圖）。於 VEGFR1 K831被取代成其他胺基酸之額外突變蛋白質中， 也沒有顯示甲基化（第2 r ISM。盔τ z士 μ · 米c a )為了埃s忍in vivo離胺酸 831之甲基化’製備抗離胺酸之甲基化專一抗體（抗 Κ831·2)。藉由螢光屏照片⑴u〇r〇gr⑽）與以抗K83ime2 抗體之西方墨點法wz? iro MTase分析證明重組 之離胺酸831的甲基化（第2d圖）。 實施例3 : k 離胺酸831之甲基化
為了檢查hFj>oVEGR1之甲基化，使用穩定表現 標該SMYD3之HEK293細胞與控制組細胞（293 —M〇ck)來執行 i/7 F/叩甲基化分析。以HA標誌之VEGFR1轉殖細胞，且 之後在蛋白質合成抑制劑存在下將細胞與 甲硫胺酸一起培養。以pAGE_SDS分離以抗HA抗體之細胞 免疫沈澱物以藉由螢光影像儀（nu〇r〇imager)檢查甲基化 之VEGFR1如預期，與293-Mock細胞之沈澱物相較，從 29 3-SMYD3細胞之沈澱物偵測到中增加的vegfr1甲基化 (第2e圖）。一貫地，與控制組細胞相較，以抗〇3丨此2抗 2125-9739-PF;Daphne 54 200909587 體之免疫墨點分析的沈澱物確認了離胺酸8 31之提高的甲 基化（第2f圖）。 為了確認SMYD3依賴之甲基化，以SMYD3-siRNA或控 制組siRNA處理29 3-SMYD3細胞。以抗SMYD3抗體之免疫 墨點分析，顯示與控制組siRNA相較，SMYD3-siRNA有效 地降低SMYD3蛋白質的表現（第2g圖，上方條）。與SMYD3 之剔除相關，與控制組s i R N A相較，S Μ Y D 3 - s i R N A降低了 於細胞中之K831曱基化（第2g圖，第二條），而於上述siRNA 之間VEGFR1表現幾乎沒被改變（第2g圖，第三條）。此資 料顯示，7·/7 離胺酸831是藉由SMYD3曱基化。 實施例4 : SMYD3與VEGFR1間的互相作用 由於VEGFR1是藉由SMYD3來曱基化，因此發明人研究 是否SMYD3與VEGFR1互相作用。本發明發明人在HEK293 細胞内將Flag標誌之VEGFR1之細胞質區與HA標誌之 SMYD3 —起表現。以抗HA抗體之免疫沈澱與之後以抗F 1 ag f, 抗體之免疫墨點分析顯示 SMYD3與 VEGFR1#1(密碼 ' 80 0- 1 0 0 0 )結合，但不與 VEGFR1#2 或 VEGFR1#3 結合（第 3a 圖）。一貫地，以抗F1 ag之免疫沈澱與接下來之以抗HA之 免疫墨點分析證實了於SMYD3與VEGFR1#1間的互相作用 (第3a圖）。為了檢查内生之SMYD3與VEGFR1間的互相作 用，發明人額外執行使用從NU423、SW480或MCF7細胞來 之萃取物以抗SMYD3之抗體的免疫沈澱。如結果所顯示， 發明人發現，藉由以抗SMYD3之抗體之免疫沈澱，内生 SMYD3與VEGFR1共免疫沈澱（第3b圖），而此顯示_//? 2125-9739-PF;Daphne 55 200909587 於SMYD3與VEGFR1間的互相作用。由於抗VEGFR1之抗體 不適合免疫沈澱，因此發明人沒有以抗VEGFR1之抗體執行 免疫沈澱。 這些資料與VEGFIU之甲基化一致，因為VEGFR1#i包 含離胺酸831 ’其為藉由SMYD3來曱基化。發明人也使用 表現野生型SMYD3與SMYD3之三種刪除形式的質體 (SMYD3-N20(密碼 20-428)、SMYD3-delta 2(密碼 1 00-428) 與SMYD3-de 1 ta 3 (岔碼250-428))來尋找對於結合smyd3 之需負責任的區域。雖然野生型SMYD3、SMYD3-N20及 SMYD3-delta 2與VEGFR1互相作用，但缺少SET區之 SMYD3-delta 3則沒有（第3c圖）。額外之表現SET區 ( 1 00-250)之質體顯示與VEGFR1的細胞質區結合（第^ 圖）。此資料顯示SET區對於互相作用負責。 實施例5:增強VEGFR1之激酶活性經由其藉由SMY])3之甲 基化 因此，更進一步研究 離胺酸8 31位於激酶區之中 VEGFR1 的影響。使用辨認受質之磷 曱基化對於其激酶活性 酸化酪胺酸之VEGFR 1 ,私略p 激鉍分析套組來研究激酶活性。在 SMY^DS存在或不存在下，將VEGm的細胞質重組蛋白以％ 才T疋之SAM處理’且之後分析激酶活性。如預期，使用3h — 編測到藉由瞧之軸！的甲基化(資料未顯示）。 重要地，與控制組相較，以_3處理之VEGFR1激酶活性 顯示顯著增加的程度（第4 a 沒有觀察到碟酸化（資料未 圖）。以SMYD3單獨而無VEGFR1 顯示）。以抗磷酸化酪胺酸抗體 2125-9739-pf；Daphne 56 200909587 之西方墨點分析也顯示與無SMYD3存在相 议在SMYD3存 在下增強了重組人類VGFR1蛋白質之磷酸 于
头融合至I 重組之人類VEGF165蛋白質的Fc(第4b圖）。右备仏，、 3硬地，當 於Μ 激酶分析使用重組之VEGFRi的細胞質田 784-1 338)時，沒有觀察到VRGFR1的自體磷酸化（資料未兹'' 示）。因此VEGFR1之甲基化可影響產生其增強訊號2 VEGFR1目標分子的磷酸化。 ' 【討論】
如此處所證明，VEGFR1為一 SMYD3組蛋白甲基轉換酶 之新的非組蛋白目標。組蛋白尾端之修飾於轉錄、修 復、端粒保持、DNA複製與染色體分離中扮演一重要角色， 經由部分改變染色值結構。最近分子研究已揭露於組蛋白 尾端之離胺酸修飾與其藉由組蛋白甲基轉換酶與去甲基酶 (demethylases)之動力學調控的重要性（v〇lkei p and
Angrand P〇，Biochimie 2007，89( 1 ): 1-20.)。到目前為 止已鑑定出多於17種組蛋白甲基轉換酶，且這些曱基轉換 酶對於其受質具有專一性。H3H4藉由SET7/9、Setl、MLU、 MLL2、MLL3、MLL4、MLL5、ASH1 與 SMYD3 被單、雙或三-甲基化（Kouzarides T，Cell 2007，128(4): 693-705·;
Volkel P and Angrand P〇, Biochimie 2007, 89(1): 1-20. ) 〇 重要地，於這些曱基轉換酶中，SET7/9與SMYD2已顯 示將非組蛋白蛋白質曱基化。（Kouskouti A et al., Mol Cell 2004, 14(2): 175-82.； Chuikov S et al., Nature 2125-9739-PF;Daphne 57 200909587 2004, 432(7015): 353-60.； Huang Jetal., Nature 2006, 444(7119): .629-32· )。SET7/9 與 i/7 f/曱基 化於p53中之離胺酸372，其增加p53之穩定度（Chuikov S et al.， Nature 2004， 432(7015):353-60.)。 SET7/9 也 顯示於 TAF10 之離胺酸 189(Kouskouti A et al.，Mol Cell 2004，14(2): 175-82.)與TAF7之離胺酸5的甲基轉換酶 活性(human TATA box-binding protein-associated f actors)(Couture JF et al ·，Nat Struct Mol Biol 2006, 13(2): 140-6.)。 此外，p53 K370之曱基化已被證明是藉由SMYD2， SMYD3(SET 與 MYND 區）家族之另一成員（Huang J et al.， Nature 2006，444(71 1 9): 629-32.)。此處，已確認位於 細胞質與細胞核之VEGFR1為H3K4組蛋白甲基轉換酶之一 新的非組蛋白目標。由於其他H3K4甲基轉換酶，例如
Setl、MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、MLL5 與 ASH1 應辨認相 同之組蛋白離胺酸修飾，所以看到由不同之甲基轉換酶修 飾受質會是有趣的。由於組蛋白曱基化受到動力學調控， 因此藉由組蛋白去曱基酶也可調整非組蛋白蛋白質之甲基 化。因此，預期於VEGFR中之離胺酸831會被H3K4去甲基 酶’例如 LSD1 (Shi Y et a 1.，Cell 2004，1 1 9(7): 941-53 ) 與 JARIDl(Seward DJ et al·’ Nat Struct Mol Biol 2007, 14(3): 240-2.)催化。 V E G F R為受體型路胺酸激酶，其由細胞外配體結合區、 穿膜區、激酶區與羧基端區所組成。包括VEGFR丨之所有受 2125-9739-PF;Daphne 58 200909587 體型酪胺酸激酶包括一進化之固定之激酶區，其包括 GXGXXG、ATP結合位、HRDLA、催化所需之必要區與一或兩 個自體填酸化位（Rahimi N，Experimental eye research 2006， 83(5): 1005-16.; Shibuya M, Journal of biochemistry and molecular biology 2006， 39(5): 469-78.) ° 如此處所證明，SMYD3誘導之離胺酸831曱基化導致 //? f/fc? VEGFR1之激酶活性增強。雖然沒有期望藉由理論 結合，此結果似乎自離胺酸殘基位於在激酶區中之從 ‘‘ GXGXXG”區的三個胺基酸n端的事實而來。因此離胺酸 831之曱基化可改變激酶區的結構。或者，VEGFR1之曱基 化可抑制抑制區以增加激酶活性，由於VEGFR1之細胞質區 的C立而區對於激轉活性具有抑制角色（Shibuya M, Journal of biochemistry and molecular biology 2006, 39(5): 469-78.)。 ί, 最近於組蛋白尾端之研究已證實藉由專一性分子辨認 修飾之殘基；磷酸化之H3sl〇補充GCN5、pvAF與ρ3〇〇 , 甲基化Η3Κ9補充異染色質蛋白質Kheter〇chr〇matin protein 1’ HP1)，與甲基化 H3K4 補充 CHD1、SNF2L/ISWI、 WDR5 BPTF/NURF301與ING2。因此，甲基化離胺酸831可 補充甲基化專_蛋白質複合物，其可影響對燃肥之激酶 活！·生 組蛋白尾端之修飾與其他組蛋白尾端之修飾相 關’包括共價修倚間之互相影響⑻耐BDandAiHsCD， 2000, 403(6765 )： 41-5. ; Jenuwein T and Allis 59 2125-9739-PF；Daphne 200909587 CD, Science 2001, 293(5532): 1074-80.; Li B et al., Cell 2007, 128(4): 707-19.； Zhang Y and Reinberg D, Genes & development 2001， 15(18): 2343-60.)。 H3S10之磷酸化促進H3K14之GCN5媒介乙烯化，但抑 制藉由SUV39H1之H3K9的甲基化。相對地，H3K9之甲基 化抑制H3S10之磷酸化。相似地，H4K3之甲基化促進H4K8 與 H4K12 之乙烯化（Zhang Y and Reinberg D，Genes & development 200 1’ 1 5( 1 8): 2343-60.)。共價修倚間之互 相作用的觀點，吸引我們推測VEGFR1之曱基化可改變其自 體磷酸化，藉由其增強的激酶活性與之後經由分子累磷酸 化之VEGFR2的磷酸化。雖然甲基化之離胺酸831似乎離酪 胺酸 1169、1213、1242、1327 與 1333(於 VEGFR1 中之磷 酸化酪胺酸）很遠，但這些殘基也顯示對於離胺酸8 3丨之結 構性相近位置。此外。於藉由不同配體之VEGF傳遞訊號之 更進一步研究可使VEGFR1之甲基化的角色有更清楚的瞭 先鈾之研究報導識別區（K/R-s/T/A-K)為SET7/9甲基 al.，Nat Struct Mol
雖然VEGFR2之激酶區與vEGFR1 :妝醆》31與此概念一致。 之激酶區分享70. 1%的胺
轉換酶之固定識別位（Couture JF
Biol 2006，13(2): 140-6.)。然 2125-9739-PF;Daphne 60 200909587 . 基酸相似度，VEGFR2並不被SMYD3曱基化。此結果與固定 區可並立’因為對於VEGFR2中之離胺酸831的對應離胺酸 不位於固定序列之兩側。有趣地，需注意與沒有被SMYD3 甲基化之VEGFR1相較，VEGFR2顯示高激酶活性。 雖然SMYD3沒有影響VEGFR2之曱基化，其影響VEGFR2 之磷酸化’藉由VEGFR1之曱基化，因為這兩分子形成一異 雙聚體（Rahimi N， Experimental eye research 2006, 83(5). 1005-16.； Shibuya M, Journal of biochemistry and molecular biology 2006，39(5) : 469-78.)。額外需 注意的為’酵母菌Rkml ’ 一含SET區酵素顯示對於Rp 123a 與 Rpl23b 之活性（p〇rras-Yakushi TRetal., JBiol Chem 2007’ 282(17):12368-76.)。於甲基化離胺酸周圍之目標 序列比較顯示N/P-P-K可能為一甲基化之目標。因此在曱 基轉換酶之中離胺酸兩側之序列可為不同。 雖然已認為VEGFR1專有地被表現於血管内皮細胞，然 ί ； 而最近的研究顯示VEGFR1表現於非内皮細胞中。veGFRI 被表現於廣大範圍之人類組織中，包括結腸（Lessl ie Dp et al. , Br J Cancer 200 6, 94( 1 1 )： 1710-7. ; Fan F et al., Oncogene 2005, 24(16): 2647-53. ; Duff SE et al., Eur J Cancer 2006, 42(1)： 112-7.; Andre T et al.,
International journal of cancer 2000, 86(2): 174 81·)、乳房（Li YS et al·, Pathology international 2006, 56(5): 256-61. ； Wu Y et al. , International journal of cancer 2006, 119(7): 1519-29.),胰臟 2125-9739-PF;Daphne 61 200909587 « (Chung GG et al., Cancer 2006, 1 06(8): 1 677-84. ; Yang AD et al., Cancer Res 2006, 66(1): 46-51.)、前列腺 (Jackson MW et a. , Cancer Res 2002, 62(3): 854-9.) ' 腎臟（Jacobsen J et al·，BJU Int 2006，97(5): 1102-8.; LjungbergBJetal·， BJUInt2006， 98(3): 661-7.)與 印巢（Wang FQ et al. , International journal of cancer 2006, 118(4): 879-88.; Chen H et al., Gynecol Oncol 20 04，94(3): 630-5.)癌症組織與癌細胞株（Fan F et a 1.， Oncogene 2005, 24(16): 2647-53. ; Duff SE et al., Eur J Cancer 2006, 42( 1 ): 1 1 2-7. ; Wu Y et al.,
International journal of cancer 2006, 119(7): 1519-29. ; Jackson MW et a., Cancer Res 2002, 62(3)： 854-9.; Soker S et al., Am J Pathol 2001, 159(2)： 651-9· ; Wu W et a 1. , Oncogene 20 0 3, 22(22). 336卜70.)。據報導，在原結腸癌樣本（pHmary 丨⑽ cancer specimen)中VEGFR1表現微弱，但其在肝臟轉移 (liver metastasis)中可被清楚偵測（Fan F e1; al
Oncogene 2005， 24(16): 2647-53.)。 更進一步而言，已報導VEGFR1為與癌症生長與發展有 關；VEGFR1之外生表現增強胰臟癌細胞之遷移與侵入。因 此SMYD3之增強的表現可提供癌細胞之侵入及/或轉移特 性。在此内容中，治療VEGFR1甲基化之治療方法對病患為 有益處的，藉由抑制癌細胞侵入與轉移。抑制smyd3之曱 基轉換酶活性可幫助抑制藉由VEGFR1之癌症發展。 2125-9739-PF;Daphne 62 200909587 如此處所揭露s咖甲基化vegfri之離胺酸μ仏 η心與π _，且VEGFR1具有增強之其激酶活性，盘 未曱基化之VEGFR1相較。因肤.虑知的主 一 U此G、，、田胞表現豐富SMYD3蛋白 質顯示增強之訊號傳送路藉由 κι。此資料可散發 VEGFR1之新的調控機制盥包合 和利/、匕3於人類癌發生之去調控 VEGFR1訊號傳送。 【產業應用】 此處敘述之方法對為了避免、診斷與治療多種癌症之 外加分子的鑑定有幫助’癌症包括大腸直腸癌、肝細胞癌、 膀胱癌與乳癌。更進-步而言，此處報導的數據增加癌症 的廣泛瞭解、促進新診斷策略的發展以及提供對於治療藥 物或避免試劑之分子目標物鑑定的線索。上述資訊對腫瘤 生成（tUm〇rigenesis)更深的瞭解有貢獻以及提供指標對 於發展偵測治療與徹底避免癌症的新策略。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 和範圍内，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 Λ 【圖式簡單說明】 ’ 第1圓顯示i’/7 K/iroVEGFRl之細胞質區的甲基化。部 分a顯示使用重組蛋白質VEGFR1#1、#2與#3為受質（其各 包含VEGFR1之不同細胞質區）之MTase分析結果。 2125-9739-PF;Daphne 63 200909587 ••對應-類免疫球蛋白區、ΤΜ Μ錢、τκ為㈣酸激酶 區。蛋白質將重組之VEGFRm、#2與#3與3Η標定之SAM， 甲基彳者，—起培養於免疫沈澱之F1 ag標誌§MYD3存 在（封閉盒）或不存在下。甲基化之受質藉由液體閃燦計數 計來定量。從以mock質體轉殖之細胞來的免疫沈澱物用來 作為控制組（開放盒）。以不同之免疫沈澱物進行三次獨立 之實驗。部分b顯示藉由螢光屏照片之甲基化vegfri的偵 測。將重組之SMYD3與重組之VEGFR1 一起培養，於s—腺 同半胱胺酸水解酶存在或不存在下。藉由以抗gst抗體之 免疫墨點分析來定量受質（下方條）。部分c顯示於 VEGFR1#1中曱基化區域的確認。 第2圖顯示於與加兩者，vegfri離 胺酸831之甲基化。部分a顯示以組蛋白甲基轉化酶甲基 化之離胺酸兩側的排列，與於VEGFR1中之候選離胺酸（星 號）。部分b顯示h VEGFR_N1之野生型與突變行 (〖819八與K831A)的甲基化（上方條）。部分c顯示invitr〇 包含VEGFIU-K831之不同取代之VEGFR1突變形的甲基化。 部分d顯示k藉由以抗甲基化K831(K831me2)專一 性抗體來備測VEGFR1之甲基化（中間條）。藉由以勞光屏照 片之不同實驗來確認曱基化（上方條）。藉由以抗脱抗體 之免疫墨點分析來定量VEGFRU下方條）。部分e顯示於表 現HA標諸VEGFR1之293-SMYD3細胞與293_M〇ck細胞中 VEGFR1之甲基化。於蛋白質合質抑制劑存在下以 L-[methyl」H]甲硫胺酸處理細胞。以抗HA抗體免疫沈澱 2125-9739-PF;Daphne 64 200909587 VEGFRl，且以螢光屏照片來檢查（上方條）。部分f顯示藉 由以抗曱基化K831 (K831me2)專一性抗體之免疫墨點分析 來偵測VEGR1之曱基化。部分g顯示藉由SMYD3之剔除抑 制K831之甲基化。以SMYD3專一 siRNA或控制組siRNA處 理之從293-SMYD3萃取的全部萃取物使用來進行免疫墨點 分析。 第3圖顯示SMYD3與VEGFR1間之互相作用。部分a顯 示SMYD3與VEGFR1間之互相作用，藉由使用表現HA標誌 之 SMYD3 與 Flag 標誌之 VEGFR1 不同區（VEGFR1#1、 VEGFRl#2與VEGFRl#3)之HEK293細胞之萃取物之共免疫沈 澱分析來檢驗。部分b顯示外生之SMYD3與VEGFR1的互相 作用。表現 SMYD3 與 VEGFRl 兩者之 SNU423、SW480 與 MCF7 之細胞之全部萃取物以抗SMYD3抗體進行沈澱。沈澱物以 抗VEGFRl抗體（上方條）或抗SMTD3抗體（下方條）進行免疫 墨點分析。部分c顯示VEGF舉SMYD3之SET區的結合。在 HEK2 93細胞中野生型或刪除型（N-250、delta 2或delta 3) 之Flag標誌SMYD3與HA標誌之VEGFRl共表現。以不是抗 ΗA抗體就是抗F 1 ag抗體執行免疫沈澱，而藉由以抗F 1 ag 抗體（上方條）或抗HA抗體（下方條）之西方墨點分析來分 析沈殿物。部分d顯示FiVEGFRl之細胞質區與SMYD3 之SET區的互相作用。於HEK293細胞中，Flag標誌之野 生型SMYD'3或SMYD3之SET區與HA標誌之VEGFRl共表現。 從細胞之萃取物以抗F 1 ag (上方條）或抗HA(下方條）抗體 來沈澱，而沈澱物以抗HA抗體之西方墨點分析來分析。 2125-9739-PF;Daphne 65 200909587 '· 第4圖之結果證明VEGFR1藉由其曱基化增加其激酶活 性。部分a顯示r / 使用曱基化或未甲基化之VEGFR1 來執行激酶分析。重組之G S Τ融合之V E G F R1以、S Μ Y D 3處理 (封閉盒）或不以SMYD3處理（開放盒）。之後使用其胜肽受 質來分析唭激酶活性。以抗磷酸化酪胺酸抗體偵測磷酸化 受質，且藉由以專一之二次抗體的螢光免疫分析來定量。 部分b顯示之結果證明藉由SMYD3增強重組之VEGFR1蛋白 質的自體磷酸化。VEGFR1於PAGE-SDS上被分離，且之後 被轉移至确化纖維（n i t r 〇 c e 11 u 1 〇 s e)膜。以抗鱗酸化酪胺 酸抗體或抗VEGFR1抗體來執行免疫墨點分析。 【主要元件符號說明】 無。 2125-9739-PF;Daphne 66 200909587 靜j表 <110〉臟療法科學股份公司 <120〉鑑定1如1\4¥03調腔VEGFR1甲基化^獅妨法
<130> 0NC-A0707-TW <150> US 60/944,071 <151〉 2007-06-14 <160〉 39 <170> Patentln version 3. 4
<210> 1 <211〉 1622 <212> DNA <213> >JI <220〉 <221〉 CDS <222〉 （96)..(1382) <400〉 1 gtgcgcgcag ggcgcaggcg cgcgggtccc ggcagcccgt gagacgcccg ctgctggacg cgggtagccg tctgaggtgc cggagctgcg ggagg atg gag ccg ctg aag gtg
Met Glu Pro Leu Lys Val 1 5 gaa aag ttc gca acc gcc aac agg gga aac ggg ctg cgc gcc gtg acc
Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn Gly Leu Arg Ala Val Thr 10 15 20 ccg ctg cgc ccc gga gag eta etc ttc cgc teg gat ccc ttg geg tac
Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg Ser Asp Pro Leu Ala Tyr 25 30 35 aeg gtg tgc aag ggg agt cgt ggc gtc gtc tgc gac cgc tgc ett etc
Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val Cys Asp Arg Cys Leu Leu 40 45 50 ggg aag gaa aag ctg atg ega tgc tet cag tgc cgc gtc gcc aaa tac
Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gin Cys Arg Val Ala Lys Tyr 55 60 65 70 1 60 113 161 209 257 2125-9739-PF;Daphne 305 200909587 tgt agt get aag tgt cag aaa aaa get tgg cca gac cac aag egg gaa 353
Cys Ser Ala Lys Cys Gin Lys Lys Ala Trp Pro Asp His Lys Arg Glu 75 80 85 tgc aaa tgc ett aaa age tgc aaa ccc aga tat cct cca gac tee gtt 401
Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg Tyr Pro Pro Asp Ser Val 90 95 100 ega ett ett ggc aga gtt gtc ttc aaa ett atg gat gga gca cct tea 449
Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu Met Asp Gly Ala Pro Ser 105 110 115 gaa tea gag aag ett tac tea ttt tat gat ctg gag tea aat att aac 497
Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp Leu Glu Ser Asn lie Asn 120 125 130 aaa ctg act gaa gat aag aaa gag ggc etc agg caa etc gta atg aca 545
Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu Arg Gin Leu Val Met Thr 135 140 145 150 ttt caa cat ttc atg aga gaa gaa ata cag gat gee tet cag ctg cca 593
Phe Gin His Phe Met Arg Glu Glu He Gin Asp Ala Ser Gin Leu Pro 155 160 165 cct gee ttt gac ett ttt gaa gee ttt gca aaa gtg ate tgc aac tet 641
Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala Lys Val lie Cys Asn Ser 170 175 180 ttc acc ate tgt aat geg gag atg cag gaa gtt ggt gtt ggc eta tat 689
Phe Thr lie Cys Asn Ala Glu Met Gin Glu Val Gly Val Gly Leu Tyr 185 190 195 ccc agt ate tet ttg etc aat cac age tgt gac ccc aac tgt teg att 737
Pro Ser lie Ser Leu Leu Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Cys Ser lie 200 205 210 gtg ttc aat ggg ccc cac etc tta ctg ega gca gtc ega gac ate gag 785
Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg Ala Val Arg Asp lie Glu 215 220 225 230 gtg gga gsg gag etc acc ate tgc tac ctg gat atg ctg atg acc agt 833
Val Gly Glu Glu Leu Thr He Cys Tyr Leu Asp Met Leu Met Thr Ser 235 240 245 gag gag ege egg aag cag ctg agg gac cag tac tgc ttt gaa tgt gac 881 2 2125-9739-PF;Daphne 929200909587
Glu Glu Arg Arg Lys Gin Leu Arg Asp Gin Tyr Cys Phe Glu Cys Asp 250 255 260 tgt ttc cgt tgc caa acc cag gac aag gat get gat atg eta act ggt Cys Phe Arg Cys Gin Thr Gin Asp Lys Asp Ala Asp Met Leu Tlir Gly 265 270 275 gat gag caa gta tgg aag gaa gtt caa gaa tcc ctg aaa aaa att gaa Asp Glu Gin Val Trp Lys Glu Val Gin Glu Ser Leu Lys Lys lie Glu 280 285 290 gaa ctg aag gca cac tgg aag tgg gag cag gtt ctg gcc atg tgc cag Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gin Val Leu Ala Met Cys Gin 295 300 305 310 gca ate ata age age aat tot gaa egg ett ccc gat ate aac ate tac Ala lie lie Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu Pro Asp lie Asn lie Tyr 315 320 325 cag ctg aag gtg etc gac tgc gcc atg gat gcc tgc ate aac etc ggc Gin Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp Ala Cys lie Asn Leu Gly 330 335 340 ctg ttg gag gaa gcc ttg ttc tat ggt act egg acc atg gag cca tac Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr Arg Thr Met Glu Pro Tyr 345 350 355 agg att ttt ttc cca gga age cat ccc gtc aga ggg gtt caa gtg atg Arg lie Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val Arg Gly Val Gin Val Met 360 365 370 aaa gtt ggc aaa ctg cag eta cat caa ggc atg ttt ccc caa gca atg Lys Val Gly Lys Leu Gin Leu His Gin Gly Met Phe Pro Gin Ala Met 375 380 385 390 aag aat ctg aga ctg get ttt gat att atg aga gtg aca cat ggc aga Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp lie Met Arg Val Thr His Gly Arg 395 400 405 gaa cac age ctg att gaa gat ttg att eta ett tta gaa gaa tgc gac Glu His Ser Leu lie Glu Asp Leu He Leu Leu Leu Glu Glu Cys Asp 410 415 420 gcc aac ate aga gca tcc taa gggaacgcag tcagagggaa ataeggegtg Ala Asn He Arg Ala Ser 425 977 1025 1073 1121 1169 1217 1265 1313 1361 2125-9739-PF;Daphne 3 1412 1472 200909587 tgtctttgtt gaatgcctta ttgaggtcac acactctatg ctttgttagc tgtgtgaacc tctcctattg gaaattctgt tccgtgtttg tgtaggtaaa taaaggcaga catggtttgc aaaccacaag aatcattagt tgtagagaag cacgattata ataaattcaa aacatttggt tgaggatgcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
〈210〉 2 <211〉 428 <212〉 PRT <213> AM <400〉 2
Met Glu Pro Leu Lys Val Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn 15 10 15
Gly Leu Arg Ala Val Thr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg 20 25 30
Ser Asp Pro Leu Ala Tyr Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val 35 40 45
Cys Asp Arg Cys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gin 50 55 60
Cys Arg Val Ala Lys Tyr Cys Ser Ala Lys Cys Gin Lys Lys Ala Trp 65 70 75 80
Pro Asp His Lys Arg Glu Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg 85 90 95
Tyr Pro Pro Asp Ser Val Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu 100 105 110
Met Asp Gly Ala Pro Ser Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp 115 120 125
Leu Glu Ser Asn lie Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu 130 135 140
Arg Gin Leu Val Met Thr Phe Gin His Phe Met Arg Glu Glu lie Gin 145 150 155 160 4 1532 1592 1622 2125-9739-PF;Daphne 200909587
Asp Ala Ser Gin Leu Pro Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala 165 170 175
Lys Val He Cys Asn Ser Phe Thr lie Cys Asn Ala Glu Met Gin Glu 180 185 190
Val Gly Val Gly Leu Tyr Pro Ser lie Ser Leu Leu Asn His Ser Cys 195 200 205
Asp Pro Asn Cys Ser He Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg 210 215 220
Ala Val Arg Asp He Glu Val Gly Glu Glu Leu Thr lie Cys Tyr Leu 225 230 235 240
Asp Met Leu Met Thr Ser Glu Glu Arg Arg Lys Gin Leu Arg Asp Gin 245 250 255
Tyr Cys Phe Glu Cys Asp Cys Phe Arg Cys Gin Thr Gin Asp Lys Asp 260 265 270
Ala Asp Met Leu Thr Gly Asp Glu Gin Val Trp Lys Glu Val Gin Glu 275 280 285
Ser Leu Lys Lys lie Glu Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gin 290 295 300
Val Leu Ala Met Cys Gin Ala lie lie Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu 305 310 315 320
Pro Asp lie Asn He Tyr Gin Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp 325 330 335
Ala Cys lie Asn Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr 340 345 350
Arg Thr Met Glu Pro Tyr Arg lie Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val 355 360 365
Arg Gly Val Gin Val Met Lys Val Gly Lys Leu Gin Leu His Gin Gly 370 375 380
Met Phe Pro Gin Ala Met Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp He Met 385 390 395 400
Arg Val Thr His Gly Arg Glu His Ser Leu He Glu Asp Leu lie Leu 5 2125-9739-PF;Daphne 200909587 405 410 415
Leu Leu Glu Glu Cys Asp Ala Asn lie Arg Ala Ser 420 425 <210> 3 - <211〉 5777 <212〉 DNA <213>ΛΜ <220〉
<221> CDS <222〉(250).. (4266) <400> 3 gcggacactc ctctcggctc ctccccggca gcggcggcgg ctcggagcgg gctccggggc 60 tcgggtgcag cggccagcgg gcctggcggc gaggattacc cggggaagtg gttgtctcct 120 ggctggagcc gcgagacggg cgctcagggc gcggggccgg cggcggcgaa cgagaggacg 180 gactctggcg gccgggtcgt tggccggggg agcgcgggca ccgggcgagc aggccgcgtc 240 gcgctcacc atg gtc age tac tgg gac acc ggg gtc ctg ctg tgc geg ctg 291
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu 1 5 10 etc age tgt ctg ett etc aca gga tet agt tea ggt tea aaa tta aaa 339
Leu Ser Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys 15 20 25 30 gat cct gaa ctg agt tta aaa ggc acc cag cac ate atg caa gca ggc 387
Asp Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gin His He Met Gin Ala Gly 35 40 45 cag aca ctg cat etc caa tgc agg ggg gaa gca gcc cat aaa tgg tet 435
Gin Thr Leu His Leu Gin Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser 50 55 60 ttg cct gaa atg gtg agt aag gaa age gaa agg ctg age ata act aaa 483
Leu Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser He Thr Lys 65 70 75 tet gcc tgt gga aga aat ggc aaa caa ttc tgc agt act tta acc ttg 531
Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gin Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu 6 2125-9739-PF;Daphne 579 200909587 ^ 80 85 90 aac aca get caa gca aac cac act ggc ttc tac age tgc aaa tat eta
Asn Thr Ala Gin Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu 95 100 105 110 get gta cct act tea aag aag aag gaa aca gaa tet gca ate tat ata
Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala He Tyr He 115 120 125 ttt att agt gat aca ggt aga cct ttc gta gag atg tac agt gaa ate
Phe He Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu He 130 135 140 ccc gaa att ata cac atg act gaa gga agg gag etc gtc att ccc tgc f Pro Glu He lie His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val lie Pro Cys ' 145 150 155 egg gtt aeg tea cct aac ate act gtt act tta aaa aag ttt cca ett
Arg Val Thr Ser Pro Asn lie Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu 160 165 170 gac act ttg ate cct gat gga aaa ege ata ate tgg gac agt aga aag Asp Thr Leu lie Pro Asp Gly Lys Arg lie lie Trp Asp Ser Arg Lys 175 180 185 190 ggc ttc ate ata tea aat gca aeg tac aaa gaa ata ggg ett ctg acc Gly Phe lie He Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu lie Gly Leu Leu Thr 195 200 205 tgt gaa gca aca gtc aat ggg cat ttg tat aag aca aac tat etc aca Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr 210 215 220 cat ega caa acc aat aca ate ata gat gtc caa ata age aca cca ege
His Arg Gin Thr Asn Thr lie He Asp Val Gin lie Ser Thr Pro Arg 225 230 235 cca gtc aaa tta ett aga ggc cat act ett gtc etc aat tgt act get
Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala 240 245 250 acc act ccc ttg aac aeg aga gtt caa atg acc tgg agt tac cct gat
Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gin Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp 255 260 265 270 2125-9739-PF;Daphne 627 675 723 771 819 867 ./ 915 963 1011 7 1059 1107200909587 gaa aaa aat aag aga get tee gta agg ega ega att gac caa age aat Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg He Asp Gin Ser Asn 275 280 285 tee cat gee aac ata ttc tac agt gtt ett act att gac aaa atg cag Ser His Ala Asn He Phe Tyr Ser Val Leu Thr lie Asp Lys Met Gin 290 295 300 aac aaa gac aaa gga ett tat act tgt cgt gta agg agt gga cca tea Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser 305 310 315 1155 1203 ttc aaa tet gtt aac acc tea gtg cat ata tat gat aaa gca ttc ate Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His He Tyr Asp Lys Ala Phe lie 320 325 330 act gtg aaa cat ega aaa cag cag gtg ett gaa acc gta get ggc aag Thr Val Lys His Arg Lys Gin Gin Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys 335 340 345 350 egg tet tac egg etc tet atg aaa gtg aag gca ttt ccc teg ccg gaa Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu 355 360 365 gtt gta tgg tta aaa gat ggg tta cct geg act gag aaa tet get ege Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg 370 375 380 1251 1299 1347 1395 tat ttg act cgt ggc tac teg tta att ate aag gac gta act gaa gag Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu lie He Lys Asp Val Thr Glu Glu 385 390 395 1443 gat gca ggg aat tat aca ate ttg ctg age ata aaa cag tea aat gtg Asp Ala Gly Asn Tyr Thr He Leu Leu Ser He Lys Gin Ser Asn Val 400 405 410 1491 ttt aaa aac etc act gee act eta att gtc aat gtg aaa ccc cag att Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu He Val Asn Val Lys Pro Gin lie 415 420 425 430 1539 tac gaa aag gee gtg tea teg ttt cca gac ccg get etc tac cca ctg Tyr Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu 435 440 445 1587 ggc age aga caa ate ctg act tgt acc gca tat ggt ate cct caa cct Gly Ser Arg Gin He Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly lie Pro Gin Pro 1635 2125—9739-PF;Daphne 8 200909587 450 455 460 Λ aca ate aag tgg ttc tgg cac ccc tgt aac cat aat cat tee gaa gca Thr lie Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala 465 470 475 agg tgt gac ttt tgt tee aat aat gaa gag tee ttt ate ctg gat get Arg Cys Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe He Leu Asp Ala 480 485 490 gac age aac atg gga aac aga att gag age ate act cag ege atg gca Asp Ser Asn Met Gly Asn Arg He Glu Ser He Thr Gin Arg Met Ala 495 500 505 510 ata ata gaa gga aag aat aag atg get age acc ttg gtt gtg get gac ζ lie lie Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp 、 515 520 525 tet aga att tet gga ate tac att tgc ata get tee aat aaa gtt ggg Ser Arg He Ser Gly lie Tyr lie Cys lie Ala Ser Asn Lys Val Gly 530 535 540 act gtg gga aga aac ata age ttt tat ate aca gat gtg cca aat ggg Thr Val Gly Arg Asn He Ser Phe Tyr lie Thr Asp Val Pro Asn Gly 545 550 555 1683 1731 · 1779 1827 1875 1923 ttt cat gtt aac ttg gaa aaa atg ccg aeg gaa gga gag gac ctg aaa Phe His Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys 560 565 570 1971 ctg tet tgc aca gtt aac aag ttc tta tac aga gac gtt act tgg att Leu Ser Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp lie 575 580 585 590 2019 tta ctg egg aca gtt aat aac aga aca atg cac tac agt att age aag Leu Leu Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser lie Ser Lys 595 600 605 caa aaa atg gee ate act aag gag cac tee ate act ett aat ett acc Gin Lys Met Ala He Thr Lys Glu His Ser He Thr Leu Asn Leu Thr 610 615 620 ate atg aat gtt tee ctg caa gat tea ggc acc tat gee tgc aga gee lie Met Asn Val Ser Leu Gin Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala 625 630 635 2067 2115 2163 2125-9739-PF;Daphne 9 200909587 agg aat gta tac aca ggg gaa gaa ate etc cag aag aaa gaa att aca Arg Asn Val Tyr Thr Gly Glu Glu He Leu Gin Lys Lys Glu He Thr 640 645 650 ate aga gat cag gaa gca cca tac etc ctg ega aac etc agt gat cac lie Arg Asp Gin Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His 655 660 665 670 aca gtg gee ate age agt tee acc act tta gac tgt cat get aat ggt Thr Val Ala lie Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly 675 680 685 gtc ccc gag cct cag ate act tgg ttt aaa aac aac cac aaa ata caa Val Pro Glu Pro Gin lie Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys lie Gin 690 695 700 caa gag cct gga att att tta gga cca gga age age aeg ctg ttt att Gin Glu Pro Gly lie lie Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe lie 705 710 715 gaa aga gtc aca gaa gag gat gaa ggt gtc tat cac tgc aaa gee acc Glu Arg Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr 720 725 730 2211 2259 2307 2355 2403 2451 aac cag aag ggc tet gtg gaa agt tea gca tac etc act gtt caa gga Asn Gin Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gin Gly 735 740 745 750 2499 acc teg gac aag tet aat ctg gag ctg ate act eta aca tgc acc tgt Thr Ser Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu He Thr Leu Thr Cys Thr Cys 755 760 765 2547 gtg get geg act etc ttc tgg etc eta tta acc etc ett ate ega aaa Val Ala Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu He Arg Lys 770 775 780 atg aaa agg tet tet tet gaa ata aag act gac tac eta tea att ata Met Lys Arg Ser Ser Ser Glu lie Lys Thr Asp Tyr Leu Ser He lie 785 790 795 atg gac cca gat gaa gtt cct ttg gat gag cag tgt gag egg etc cct Met Asp Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gin Cys Glu Arg Leu Pro 800 805 810 tat gat gee age aag tgg gag ttt gee egg gag aga ett aaa ctg ggc Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly 2595 2643 2691 2739 2125-9739-PF;Daphne 10 200909587 • 815 820 825 830 aaa tea ett gga aga ggg get ttt gga aaa gtg gtt caa gca tea gca Lys Ser Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gin Ala Ser Ala 835 840 845 2787 ttt ggc att aag aaa tea cct aeg tgc egg act gtg get gtg aaa atg Phe Gly He Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met 850 855 860 ctg aaa gag ggg gee aeg gee age gag tac aaa get ctg atg act gag Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu 865 870 875 eta aaa ate ttg acc cac att ggc cac cat ctg aac gtg gtt aac ctg Leu Lys lie Leu Thr His lie Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu 880 885 890 ctg gga gee tgc acc aag caa gga ggg cct ctg atg gtg att gtt gaa Leu Gly Ala Cys Thr Lys Gin Gly Gly Pro Leu Met Val He Val Glu 895 900 905 910 tac tgc aaa tat gga aat etc tee aac tac etc aag age aaa cgt gac Tyr Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp 915 920 925 tta ttt ttt etc aac aag gat gca gca eta cac atg gag cct aag aaa Leu Phe Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys 930 935 940 gaa aaa 3tg gag cca ggc ctg gaa caa ggc aag aaa cca aga eta gat Glu Lys Met Glu Pro Gly Leu Glu Gin Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp 945 950 955 age gtc acc age age gaa age ttt geg age tee ggc ttt cag gaa gat Ser Val Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gin Glu Asp 960 965 970 aaa agt ctg agt gat gtt gag gaa gag gag gat tet gac ggt ttc tac Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr 975 980 985 990 aag gag ccc ate act atg gaa gat ctg att tet tac agt ttt caa gtg Lys Glu Pro He Thr Met Glu Asp Leu lie Ser Tyr Ser Phe Gin Val 995 1000 1005 2835 2883 2931 2979 3027 3075 3123 3171 3219 3267 2125-9739-PF;Daphne 11 200909587 gcc aga ggc atg gag ttc ctg tct tcc aga aag tgc att cat egg 3312 • Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys lie His Arg 1010 1015 1020 gac ctg gca geg aga aac att ett tta tct gag aac aac gtg gtg 3357
Asp Leu Ala Ala Arg Asn lie Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val 1025 1030 1035 aag att tgt gat ttt ggc ett gcc egg gat att tat aag aac ccc 3402
Lys lie Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp lie Tyr Lys Asn Pro 1040 1045 1050 gat tat gtg aga aaa gga gat act ega ett cct ctg aaa tgg atg 3447
Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met 1055 1060 1065 get ccc gaa tct ate ttt gac aaa ate tac age acc aag age gac 3492
Ala Pro Glu Ser He Phe Asp Lys lie Tyr Ser Thr Lys Ser Asp 1070 1075 1080 gtg tgg tct tac gga gta ttg ctg tgg gaa ate ttc tec tta ggt 3537
Val Trp Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu lie Phe Ser Leu Gly 1085 1090 1095 ggg tct cca tac cca gga gta caa atg gat gag gac ttt tgc agt 3582
Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gin Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser 1100 1105 1110 ege ctg agg gaa ggc atg agg atg aga get cct gag tac tct act 3627
Arg Leu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr 1115 1120 1125 cct gaa ate tat cag ate atg ctg gac tgc tgg cac aga gac cca 3672
Pro Glu lie Tyr Gin He Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro 1130 1135 1140 aaa gaa agg cca aga ttt gca gaa ett gtg gaa aaa eta ggt gat 3717
Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp 1145 1150 1155 ttg ett caa gca aat gta caa cag gat ggt aaa gac tac ate cca 3762
Leu Leu Gin Ala Asn Val Gin Gin Asp Gly Lys Asp Tyr lie Pro 1160 1165 1170 ate aat gcc ata ctg aca gga aat agt ggg ttt aca tac tea act 3807 lie Asn Ala lie Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr 12 2125-9739-PF;Daphne 200909587 1175 1180 1185 cct gcc ttc tct gag gac ttc ttc aag gaa agt att tea get ccg Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser lie Ser Ala Pro 1190 1195 1200 aag ttt aat tea gga age tct gat gat gtc aga tat gta aat get Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala 1205 1210 1215 ttc aag ttc atg age ctg gaa aga ate aaa acc ttt gaa gaa ett Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg lie Lys Thr Phe Glu Glu Leu 1220 1225 1230 tta ccg aat gcc acc tcc atg ttt gat gac tac cag ggc gac age Leu Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gin Gly Asp Ser 1235 1240 1245 age act ctg ttg gcc tct ccc atg ctg aag ege ttc acc tgg act Ser Thr Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr 1250 1255 1260 gac age aaa ccc aag gcc teg etc aag att gac ttg aga gta acc Asp Ser Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys He Asp Leu Arg Val Thr 1265 1270 1275 agt aaa agt aag gag teg ggg ctg tct gat gtc age agg ccc agt Ser Lys Ser Lys Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser 1280 1285 1290 ttc tgc cat tcc age tgt ggg cac gtc age gaa ggc aag ege agg Phe Cys His Ser Ser Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg 1295 1300 1305 ttc acc tac gac cac get gag ctg gaa agg aaa ate geg tgc tgc Phe Thr Tyr Asp His Ala Glu Leu Glu Arg Lys lie Ala Cys Cys 1310 1315 1320 tcc ccg ccc cca gac tac aac teg gtg gtc ctg tac tcc acc cca Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro 1325 1330 1335 ccc ate tag agtttgacac gaageettat ttetagaage acatgtgtat Pro lie 3852 3897 3942 3987 4032 4077 4122 4167 4212 4257 4306 2125-9739-PF;Daphne 13 200909587 ttataccccc aggaaactag cttttgccag ctttccatgg gagccagctg ctttttgtga aacaagaatg taactccaga tagagaaata ctcatgttac teagtgttag agaaatcctt cccgccacct cagggcacgc aggaccagtt catcacgtac cccactgggc cagccctgca ccccagggga tcactggctg gcctgagcaa catgtgagga ggaaaaggaa aaaaagcaaa ggcatgagaa agaatttgag acgcaccatg gccatttcag tggcttccca gctctgaccc atggacagcg atgaggggac attttctgga tttttggaac taaagcaaat tttagacctt cattcgtggc atgttttgat ttgtagcact tttggctcct ctagtaagat gcactgaaaa tgatggcctt acactgaaaa tgtcacattc cttaactcaa tttcttggta ttattctgtt aagaatgaaa atgcagtcct gaggagagtt gaaaaaggtc aataaggtca agggaagacc aacacagttg ggacccaaaa cacaggaagt ttccact己tc tcacacta已t ctgaaagggit cactttaagc tccttgagta aaaaggtggt gggactcagg atattagtta atgagccatc tgaaacttgc ctggggtctg agcatgatgg tattatgcat atataagttt acacctttat 4366 tttttttaat agtgcttttt ttttttgact 4426 gtgacaagtg aagaacacta ctgctaaatc 4486 cctaaaccca atgacttccc tgctccaacc 4546 tgattgagga gctgcactga tcacccaatg 4606 gcccaaaacc cagggcaaca agcccgttag 4666 catctcggga gtcctctagc aggcctaaga 4726 aagcaaggga gaaaagagaa accgggagaa 4786 tgggcacgga gggggacggg gctcagcaat 4846 ttctacattt gagggcccag ccaggagcag 4906 ttctgggagg caagaaaagg acaaatatct 4966 tacctatgga agtggttcta tgtccattct 5026 gagggtggca ctcaactctg agcccatact 5086 cttagccaga gttaggttgt ctccaggcca 5146 tattttgggt attaatatat agtccagaca 5206 ttgcacagtt agttgtgaaa gaaagctgag 5266 ttctccatat caaaacgagg gctgatggag 5326 ccgtctctat accaaccaaa ccaattcacc 5386 cagtcacgtt tccttttcat ttaatgggga 5446 gtggaagagc attagctggc gcatattaag 5506 atgtaattta tgcaaggtat ttctccagtt 5566 actagaagaa aagcccattt tcaactgctt 5626 gaatagggag acagggtagg aaagggcgcc 5686 14 2125-9739-PF;Daphne 200909587
tactcttcag ggtctaaaga tcaagtgggc cttggatcgc taagctggct ctgtttgatg ctatttatgc aagttagggt ctatgtattt a 〈210〉 4 <211〉 1338 <212〉 PRT
<213>AH <400〉 4
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 15 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30
Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gin His lie Met Gin Ala Gly Gin Thr 35 40 45
Leu His Leu Gin Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60
Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser He Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80
Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gin Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95
Ala Gin Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val 100 105 110
Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala lie Tyr lie Phe He 115 120 125
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu lie Pro Glu 130 135 140 lie lie His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val lie Pro Cys Arg Val 145 150 155 160
Thr Ser Pro Asn lie Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175
Leu He Pro Asp Gly Lys Arg He He Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 15 5746 5777 2125-9739-PF;Daphne 200909587
He lie Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu He Gly Leu Leu Thr Cys Glu 195 200 205
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220
Gin Thr Asn Thr He lie Asp Val Gin He Ser Thr Pro Arg Pro Val 225 230 235 240
Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255
Pro Leu Asn Thr Arg Val Gin Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270
Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg He Asp Gin Ser Asn Ser His 275 280 285
Ala Asn He Phe Tyr Ser Val Leu Thr He Asp Lys Met Gin Asn Lys 290 295 300
Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320
Ser Val Asn Thr Ser Val His He Tyr Asp Lys Ala Phe lie Thr Val 325 330 335
Lys His Arg Lys Gin Gin Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350
Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val 355 360 365
Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu 370 375 380
Thr Arg Gly Tyr Ser Leu lie lie Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala 385 390 395 400
Gly Asn Tyr Thr lie Leu Leu Ser lie Lys Gin Ser Asn Val Phe Lys 405 410 415
Asn Leu Thr Ala Thr Leu He Val Asn Val Lys Pro Gin He Tyr Glu 420 425 430 16 2125-9739-PF;Daphne 200909587
Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser 435 440 445
Arg Gin He Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly He Pro Gin Pro Thr lie 450 455 460
Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys 465 470 475 480
Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe lie Leu Asp Ala Asp Ser 485 490 495
Asn Met Gly Asn Arg lie Glu Ser lie Thr Gin Arg Met Ala He He 500 505 510
Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg 515 520 525 lie Ser Gly lie Tyr lie Cys lie Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val 530 535 540
Gly Arg Asn lie Ser Phe Tyr lie Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His 545 550 555 560
Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser 565 570 575
Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp lie Leu Leu 580 585 590
Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser He Ser Lys Gin Lys 595 600 605
Met Ala lie Thr Lys Glu His Ser He Thr Leu Asn Leu Thr lie Met 610 615 620
Asn Val Ser Leu Gin Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn 625 630 635 640
Val Tyr Thr Gly Glu Glu lie Leu Gin Lys Lys Glu lie Thr lie Arg 645 650 655
Asp Gin Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val 660 665 670
Ala lie Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro 17 2125-9739-PF;Daphne 200909587 675 680 685
Glu Pro Gin lie Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys lie Gin Gin Glu 690 695 700
Pro Gly lie He Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe He Glu Arg 705 710 715 720
Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gin 725 730 735
Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gin Gly Thr Ser 740 745 750
Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu lie Thr Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala 755 760 765
Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu lie Arg Lys Met Lys 770 775 780
Arg Ser Ser Ser Glu He Lys Thr Asp Tyr Leu Ser He lie Met Asp 785 790 795 800
Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gin Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 815
Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser 820 825 830
Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gin Ala Ser Ala Phe Gly 835 840 845
lie Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys 850 855 860
Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 865 870 875 880 lie Leu Thr His lie Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly 885 890 895
Ala Cys Thr Lys Gin Gly Gly Pro Leu Met Val lie Val Glu Tyr Cys 900 905 910
Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe 915 920 925 18 2125-9739-PF;Daphne 200909587
Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 930 935 940
Met Glu Pro Gly Leu Glu Gin Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val 945 950 955 960
Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gin Glu Asp Lys Ser 965 970 975
Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990
Pro lie Thr Met Glu Asp Leu He Ser Tyr Ser Phe Gin Val Ala Arg 995 1000 1005
Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys He His Arg Asp Leu 1010 1015 1020
Ala Ala Arg Asn lie Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys lie 1025 1030 1035
Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp lie Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr 1040 1045 1050
Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro 1055 1060 1065
Glu Ser He Phe Asp Lys lie Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp 1070 1075 1080
Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu lie Phe Ser Leu Gly Gly Ser 1085 1090 1095
Pro Tyr Pro Gly Val Gin Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu 1100 1105 1110
Arg Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu 1115 1120 1125 lie Tyr Gin lie Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu 1130 1135 1140
Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu 1145 1150 1155 19 2125-9739-PF;Daphne 200909587
Gin Ala Asn Val Gin Gin Asp Gly Lys Asp Tyr He Pro lie Asn 1160 1165 1170
Ala lie Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala 1175 1180 1185
Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser lie Ser Ala Pro Lys Phe 1190 1195 . 1200
Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala Phe Lys 1205 1210 1215
Phe Met Ser Leu Glu Arg lie Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro 1220 1225 1230
Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gin Gly Asp Ser Ser Thr 1235 1240 1245
Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser 1250 1255 1260
Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys lie Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys 1265 1270 1275
Ser Lys Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys 1280 1285 1290
His Ser Ser Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr 1295 1300 1305
Tyr Asp His Ala Glu Leu Glu Arg Lys lie Ala Cys Cys Ser Pro 1310 1315 1320
Pro Pro Asp Tyr Asn Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro lie 1325 1330 1335
〈210〉 5 <211〉 33 <212> DNA 〈213>人工]莉丨J <220> <223〉PCR 引子 <400> 5 20 2125-9739-PF;Daphne 200909587 cggaattccc cagatgaagt tcctttggat gag <210〉 6 <211〉 36 〈212〉 DNA <213〉 AXIWJ <220〉 <223> PCR引子 <400〉 6 ccgctcgaga atcagatctt ccatagtgat gggctc <210〉 7 <211> 35 <212〉 DNA <213〉人工j^ij <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 7 cggaattcga tttcttacag ttttcaagtg gccag <210〉 8 <211〉 36 <212〉DNA <213> AXiW!) 〈220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 8 ccgctcgaga gctgaaatac tttccttgaa gaagtc <210〉 9 <211> 36 〈212〉 DNA <213〉 <220〉 〈223〉 PCR引子 2125-9739-PF;Daphne 200909587 <400> 9 cggaattcag ctccgaagtt taattcagga agctct <210〉 10 <211〉 34 <212〉 DNA <2i3> <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 10 ccgctcgagc tagatgggtg gggtggagta cagg <210〉 11 <211〉 36 <212> DNA <213〉 <220> <223> PCR引子 <400〉 11
ccgctcgagc acttttccaa aagcccctct tccaag <210〉 12 〈211〉 36 <212〉 DNA 〈213>人工M 〈220〉 〈223〉 PCR 引子 <400> 12
cggaattcgg ttcaagcatc agcatttggc attaag <210〉 13 <211〉 35 <212> DNA <213>A!^iJ 2125-9739-PF;Daphne 200909587 <220〉 ' <223〉 PCR 引子 <400〉 13 ccgctcgagc tcagtcatca gagctttgta ctcgc 〈210〉 14 <211> 36 <212〉 DNA <213〉 AIM 〈220〉 <223> PCR引子 <400〉 14
cggaattcgc taaaaatctt gacccacatt ggccac <210> 15 <211> 37 <212> DNA 〈213>AI^!J <220〉 〈223〉PCR 引子 <400> 15 ccgctcgagg tagttggaga gatttccata tttgcag 〈210〉 16 〈211〉 31 <212〉 DNA <213〉ΛΧΜ <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 16 ccgctcgagc ttggtgcagg ctcccagcag g
<210〉 17 〈211〉 39 <212〉 DNA 2125-9739-PF;Daphne 200909587 <213〉 <220〉 <223〉 PCR引子 <400> 17 ctcccttatg atgccagcgc gtgggagttt gcccgggag <210> 18 <211> <212> <213> 39 DNA <220〉 f <223〉 PCR引子 <400> 18 ctcccgggca aactcccacg cgctggcatc ataagggag <210〉 19 <211〉 <212〉 <213〉 40 DNA <220〉 <223〉 PCR引子 <400〉 19 gacttaaact gggcgcatca cttggaagag gggcttttgg <210〉 20 <211〉 <212〉 <213〉 40 DNA <220〉 〈223〉 PCR引子 <400〉 20 ccaaaagccc ctcttccaag tgatgcgccc agtttaagtc 〈210〉 21 2125-9739-PF;Daphne 24 200909587 <211〉 39 <212〉 DNA <213> AXiW(J <220> 〈223〉 PCR引子 <400〉 21 ctcccttatg atgccagcga gtgggagttt gcccgggag <210〉 22 〈211〉 39 <212> DNA <213〉 <220〉 〈223〉PCR 引子 <400〉 22 ctcccgggca aactcccact cgctggcatc ataagggag <210〉 23 <211> 40 <212〉 DNA 〈213〉 ΛΧΜ <220〉 〈223〉 PCR引子 <400〉 23 gacttaaact gggcgaatca cttggaagag gggcttttgg <210> 24 <211〉 40 <212〉 DNA <213〉 <220〉 <223〉 PCR引子 <400〉 24 ccaaaagccc ctcttccaag tgattcgccc agtttaagtc 25 2125-9739-PF;Daphne 200909587 <210> 25 <211〉 39 <212〉 DNA <213〉 〈220〉 <223〉 PCR引子 <400> 25 ctcccttatg atgccagccg gtgggagttt gcccgggag 39
<210> 26 〈211〉 39 〈212〉 DNA <213>AI^!J <220〉 <223〉PCR 引子 <400〉 26 ctcccgggca aactcccacc ggctggcatc ataagggag 39
<210> 27 〈211〉 40 <212〉 DNA <213>AU^!J 〈220〉 <223〉PCR 引子 <400> 27 gacttaaact gggccgatca cttggaagag gggcttttgg 40 <210> 28 〈211〉 40 <212> DNA <213> <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 28 2125-9739-PF;Daphne 26 200909587 40 ccaaaagccc ctcttccaag tgatcggccc agtttaagtc <210〉 29 <211〉 34 <212〉 DNA <213〉 xrm^i <220〉 <223〉 PCR引子 <400〉 29 cggaattcac ccagatgaag ttcctttgga tgag 34 〈210〉 30 <211〉 39 <212〉 DNA <213〉 ΛΧΜ <220〉 <223〉 PCR引子 <400〉 30 39 aagcttgcgg ccgcgatgga gccgctgaag gtggaaaag c <210〉 31 <211> 36 〈212〉 DNA <213〉 <220〉 <223〉 PCR引子 <400〉 31 ggtacctcta gattaggatg ctctgatgtt ggcgtc 36 <210> 32 〈211〉 38 <212〉 DNA <213〉 AIM 〈220〉 <223〉 PCR引子 2125-9739-PF;Daphne 27 200909587 <400> 32 ggggtacctc aaatcagatc ttccatagtg atgggctc 38 〈210〉 33 〈211〉 <212> <213〉 38 DNA <220〉 <223> PCR引子 <400〉 33 ggggtacctc aagctgaaat actttccttg aagaagtc 38 <210〉 34 〈211〉 <212〉 <213〉 33 DNA AX»J <220〉 <223> PCR引子 <400〉 34 ggggtaccct agatgggtgg ggtggagtac agg 33 <210> 35 〈211〉 35 <212〉DNA 〈213〉 <220〉 <223〉 PCR引子 <400〉 35 cggaattccg ccgtgacccc gctggcgccc cggag 35
<210〉 36 <211〉 <212〉 〈213〉 32 DNA AX/WJ 2125-9739-PF;Daphne 28 200909587 <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 36
ggggtacctt aggatgctct gatgttggcg tc <210〉 37 <211〉 32 <212〉 DNA <213〉AIM <220> <223〉PCR 引子 <400〉 37 cggaattctg actccgttcg acttcttggc ag <210> 38 <211〉 36 <212〉 DNA <213> <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 38 cggaattctc ggaagcagct gagggaccag tactgc
<210> 39 <211> 33 <212〉 DNA <213〉AIM <220〉 <223〉PCR 引子 <400> 39 ggggtacctt agttaccggc gctcctcctg gtc 2125-9739-PF;Daphne

Claims (1)

  1. 200909587 十、申請專利範圍： 1 _ 一種鑑定試劑的方法，該試劑調整藉由SMYD3之 VEGFR1的甲基化，包括： (a)將一具有甲基轉換酶活性之smYD3多胜肽與—要 被甲基化的VEGFR1胜肽及一輔助因子（cofact〇r)在該試 劑存在的情形，於適合甲基化該VEGFn胜肽的條件下進行 接觸，其中該SMYD3多胜肽係擇自下列所組成之群組： i. 一多胜肽其包含序列辨識號：2之胺基酸序列； 11.—多胜肽其包含序列辨識號：2之胺基酸序列，其 中一個或多個胺基酸被替換、刪除或插入，又其中該多胜 肽與由序列辨識號：2之胺基酸序列所組成的多胜肽具有 相同的曱基轉換酶活性； i i i 夕胜肽其包含之胺基酸序列至少與序列辨識 唬.2具有80%的同源性，其中該多胜肽與由序列辨識號： 2之胺基酸序列所組成的多胜肽具有相同的甲基轉換酶活 性； iv 一多胜肽其由一聚核苷酸所編碼，該聚核苷酸於嚴 可條件（stringent conditions)下與由序列辨識號：i之 核苦酸序列所組成的聚核㈣進行雜交，# t該多胜狀與 由序列辨識號：2《胺基酸序列所組成的多胜肽具有相同 的曱基轉換酶活性；以及 v夕胜狀其包含序列辨識號：2之位置11 7至2 4 6的 月女基I序列’ #中該多胜肽與由序列辨識號：2之胺基酸 序列所組成的多胜肽具有相同的曱基轉換酶活性； 2125-9739-PF；Daphne 1 200909587 (b) 偵測該VEGFR1胜肽之甲基化程度；以及 (c) 比較步驟（b)與缺少試劑情況下之控制組所偵測到 的曱基化程度， 其中與控制組之程度比較，一曱基化程度增加或減少 表示該試劑藉由SMYD3調整VEGFR1之曱基化。 2·如申請專利範圍第1項所述之鑑定試劑的方法，其 中該輔助因子為S-腺同半胱胺酸水解酶（s — adenosyl homocysteine hydrolase)(SAHH)。 3 ·如申請專利範圍第1項所述之鑑定試劑的方法，其 中定義於（i i)之該多胜肽包含具有至多20個保守胺基酸 替換之序列辨識號：2的胺基酸序列。 4.如申請專利範圍第1項所述之鑑定試劑的方法，其 中定義於（i i i)之該多胜肽包含一胺基酸序列至少與序列 辨識號：2具有95%的同源性。 5 ·如申請專利範圍第1項所述之鑑定試劑的方法，其 中定義於（iv)之該聚核苷酸於高度嚴苛條件下與一由序列 辨識號：1之核苷酸序列所組成的的聚核苷酸進行專一性 地（speci f ical ly)雜交。 6. 如申請專利範圍第1項所述之鑑定試劑的方法，其 中定義於（v )之該多胜肽包含序列辨識號：2之位置1 〇 〇至 250的胺基酸序列。 7. 如申請專利範圍第1項所述之鑑定試劑的方法，其 中該VEGFR1胜肽為一多胜肽，其包括序列辨識號：4之胺 基酸序列或其之功能性突變或片段。 2125-9739-PF;Daphne 2 200909587 * 8_如申請專利範圍第7項所述之鑑定試劑的方法，其 中該功能性VEGFR1片段包括序列辨識號：4之位置8〇〇至 1 0 0 0的胺基酸序列。 9. 如申請專利範圍第7項所述之鑑定試劑的方法，其 中該功能性VEGFR1片段包括序列辨識號：4之位置8〇〇至 8 41的胺基酸序列。 10. 如申請專利範圍第7項所述之鑑定試劑的方法，其 中該功能性VEGFR1突變包含序列辨識號：4之胺基酸序 列，其包含一個或多個下列之突變：胺基酸序列第81 9的 位置由離胺酸替換為丙胺酸（K8i9A)、胺基酸序列第819的 位置由離胺酸替換為麩胺酸（K819E)與胺基酸序列第819 的位置由離胺酸替換為精胺酸（Kg 1 gR)。 11. 如申請專利範圍第1項所述之鑑定試劑的方法，其 中於VEGFR1離胺酸831偵測甲基化程度。 1 2 · —種篩選用以治療癌症之化合物的方法，其中該癌 症過度表現SMYD3，該方法包括： U)在一允許VEGFR1胜肽與SMYD3多胜肽結合且在一 測試化合物存在的情況下，將一包括SMYD3結合區之 VEGFR1胜肽或片段與包括VEGFR1結合區之一 SMYD3多胜 肽或片段接觸；以及 (b)選擇该化合物’其抑制包括SMYD3結合區之VEGFR1 胜狀或片段與包括VEGFR1結合區之一 SMYD3多胜肽或片段 之間的結合，做為治療癌症之一候選化合物。 13 ·如申睛專利範圍第12項所述之篩選用以治療癌症 2125-9739-PF;Daphne 3 200909587 Γ片匕it的方法’其中VEGFR1胜肽之該包括smyd3結合區 之片段包括序列辨識號：4之位置800至1〇〇〇的胺基酸 列。 =.如申請專利範圍第丨2項所述之篩選用以治療癌症 &勿的方法，其中SMYD3胜肽之該包括VEGFR1結合區 之片段包括序列辨識號：2之位置1〇〇至25〇的胺基 列。 二如申請專利範圍第12項所述之篩選用以治療癌症 °物的方法’該癌症係擇自下列組成之群組：大腸直 腸癌肝細胞癌、膀胱癌以及乳癌。 16·—種篩選用以治療癌症之化合物的方法 症過度表現SMYD3,該方法包括： 一：使用申請專利範圍帛1項之鑑定試劑的方法來鐘 疋測4化合物，其調整甲基化； ⑻選擇出該測試化合物，將其與在沒有該化合物時之 控制組甲基化程度進行比動；0士 -. 質的甲基化程度“’其降低了要被甲基化之受 之化^物如申請專利範圍第16項所述之筛選用以治療癌症 “勿的方法，該癌症係擇自下列組成之群組：大腸直 腸癌、肝細胞癌、膀胱癌以及乳癌。 18. 一種套組，其用以债測—測試化合物調控VEGFR1 之甲基化的能力，包括· ⑷-具有甲基轉換酶活性之s_多胜肽係擇自下 列所組成之群組： 2125-9739-PF;Daphne 4 200909587 i 一多胜肽其包含序列辨識號：2之胺基酸序列； i i 一多胜肽其包含序列辨識號：2之胺基酸序列，其 中一個或多個胺基酸被替換 '删除或插入，又其中該多胜 狀與由序列辨識號：2之胺基酸序列所組成的多胜肽具有 相同的甲基轉換酶活性； 1 i i. 一多胜肽其包含之胺基酸序列至少與序列辨識 號· 2具有80%的同源性’其中該多胜肽與由序列辨識號： 2之胺基酸序列所組成的多胜肽具有相同的f基轉換酶活 性； 1 ν· —多胜肽其由一聚核苷酸所編碼，該聚核苷酸於嚴 苛條件下與由序列辨識號：Ϊ之核苷酸序列所組成的聚核 苷I進行雜父，其中該多胜肽與由序列辨識號：2之胺基 酸序列所組成的多胜肽具有相同的曱基轉換酶活性；以及 V· —多胜肽其包含序列辨識號：2之位置i 17至246 的胺基酸序列，其中該多胜肽與由序列辨識號：2之胺基 面欠序列所組成的多胜肽具有相同的甲基轉換酶活性； (b) VEGFR1胜肽，其具有被（a)之該多胜肽甲基化之 能力；以及 (c) —對於該VEGFR1胜肽甲基化之輔助因子。 19.如申請專利範圍第18項所述之套組，其中該 VEGFR1 &肽為—多胜肽，其包括序列辨識號：4之胺基酸 序列或其之功能性突變或片段。 2〇.如申請專利範圍第18項所述之套組，其中該 更包括： 2125-9739-PF;Daphne 5 200909587 (d)S-腺同半胱胺酸水解酶。 21.如申請專利範圍第1 8項所述之套組，其中定義於 (v)之該多胜肽包含序列辨識號：2之位置1〇〇至25〇的胺 基酸序列。 2 2. —種測量一多胜肽之曱基轉換酶活性的方法，該方 法包括： (a) 將一 H3K4曱基轉換酶與要被甲基化之_ vegfRI胜 肽與一輔助因子接觸’在能使該VEGFR1胜肽曱基化的情況 下； (b) 偵測該VEGFR1胜肽之甲基化程度；以及 (c) 藉由使步驟（b)之曱基化程度與該甲基轉換酶活性 互相關連來測量該該曱基轉換酶活性。 23. 如申請專利範圍第22項所述之測量一多胜肽之曱 基轉換酶活性的方法，其中該VEGFR1胜肽為一 VEGFRl片 段包括至少離胺酸83KK831)。 24. 如申請專利範圍第22項所述之測量一多胜肽之甲 基轉換酶活性的方法，#中該辅助因子為s_腺核苦甲硫胺 &c(S-adenosyl-L-methionine)。 25. 如申請專利範圍第22項所述之測量一多胜肽之甲 基轉換酶活性的方法，其中該多胜肽與該vegfri胜肽及該 輔助因子接觸，在一甲基化促進劑存在的情況下。 26·如申請專利範圍第25項所述之測量一多胜肽之曱 基轉換酶活性的方法m甲基化促進劑為s—腺同半脱 胺酸水解酶。 2125-9739-PF;Daphne 6 200909587 27. 如申請專利範圍第23項所述之測量一多胜肽之甲 基轉換酶活性的方法，其中以一抗體其辨認之甲基 化離胺酸831來偵測離胺酸831 (K831)。 28. 如申請專利範圍第22項所述之測量一多胜肽之甲 基轉換酶活性的方法，其中該H3K4甲基轉換酶係擇自下列 所組成之群組： i 一多胜肽其包含序列辨識號：2之胺基酸序列 (SMYD3)； i i 一多胜肽其包含序列辨識號：2之胺基酸序列，其 中一個或多個胺基酸被替換、刪除或插入，又其中該多胜 肽與由序列辨識號：2之胺基酸序列所組成的多胜肽具有 相同的生物活性； 1 i i. 一多胜肽其包含之胺基酸序列至少與序列辨識 號：2具有80%的同源性； iv. —多胜肽其由一聚核苷酸所編碼，該聚核苷酸於嚴 可條件下與由序列辨識號：丨之核苷酸序列所組成的聚核 苷酸進行雜交，其中該多胜肽與由序列辨識號：2之胺基 酸序列所組成的多胜肽具有相同的生物活性；以及 V.—多胜肽其包含序列辨識號：2之位置I!?至246 的胺基酸序列，其中該多胜肽與由序列辨識號：2之胺基 酸序列所組成的多胜肽具有相同的甲基轉換酶活性。 2 9.如申請專利範圍第2 8項所述之測量一多胜肽之曱 基轉換酶活性的方法，其中定義於（v)之該多胜肽包含序列 辨識號：2之位置1 〇 〇至2 5 0的胺基酸序列。 2125-9739-PF;Daphne 7 200909587 3〇_ -種測量職之甲基轉換酶活性的套租，包括· ⑷一卿R!胜肽，藉由3_其有被 ㈤一對於聰R1胜肽甲基化之辅助因？；以^力’ (c)一镇測甲基化之離胺酸831的偵測試劑。 31. 如申請專利範圍第3〇項所述之測量 轉換酶活性的套組，其中該輔助因子為s —腺核 32. 如申請專利範圍第30項所述之測量 轉換酶活性的套組，其中該偵測試劑為— VEGFR1之甲基化離胺酸831。 SMYD3之甲基 苷曱硫胺酸。 SMYD3之甲基 抗體其辨認 33_如申請專利範圍第3〇項所述之測量恥之甲基 轉換酶活性的套組，其中該套組更包括—藉由smy⑽對= VEGFR1之甲基化的促進劑。 34.如申請專利範圍第3〇項所述之測量SMYD3之甲芙 轉換酶活性的套組，其中該對於甲基化的促進劑為s—腺同 半胱胺酸水解酶。 35_ —種抗體，其辨認VEGFR1之甲基化。 36.如申請專利範圍第35項所述之抗體，其中該抗體 辨認在VEGFR1之離胺酸831的甲基化。 2125-9739-PF/Daphne 8 200909587 . 七、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（la)圖。 (二） 本代表圖之元件符號簡單說明：無。 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： jfe. 〇 2125-9739-PF;Daphne 4
TW097122119A 2007-06-14 2008-06-13 Methods of identifying agents that modulate methylation of VEGFR1 by SMYD3 TW200909587A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94407107P 2007-06-14 2007-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW200909587A true TW200909587A (en) 2009-03-01

Family

ID=40129430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW097122119A TW200909587A (en) 2007-06-14 2008-06-13 Methods of identifying agents that modulate methylation of VEGFR1 by SMYD3

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8354223B2 (zh)
EP (1) EP2171082B1 (zh)
JP (1) JP5272134B2 (zh)
TW (1) TW200909587A (zh)
WO (1) WO2008152816A1 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE356223T1 (de) 2001-09-25 2007-03-15 Japan President Univ Tokyo Gen und protein mit bezug zu hepatozellulärem karzinom
TWI350373B (en) 2004-01-23 2011-10-11 Oncotherapy Science Inc Methods of detecting methyl transferase activity and methods of screening formethyl transferase activity modulators
EP2311983A1 (en) 2005-02-10 2011-04-20 Oncotherapy Science, Inc. Method of treating bladder cancer using siRNA
CN101189346A (zh) 2005-02-28 2008-05-28 肿瘤疗法科学股份有限公司 乳腺癌相关基因znfn3a1
TW200741009A (en) 2005-07-01 2007-11-01 Oncotherapy Science Inc Methods of modulating SMYD3 for treatment of cancer
TW201109029A (en) 2009-06-11 2011-03-16 Oncotherapy Science Inc Vaccine therapy for choroidal neovascularization
WO2011041582A2 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for modulation of autophagy through the modulation of autophagy-inhibiting gene products
AU2016335043A1 (en) 2015-10-09 2018-04-26 Agency For Science, Technology And Research Compounds for treatment of cancer and epigenetics
CN108624574B (zh) * 2018-04-11 2021-09-03 苏州汇桢生物技术有限公司 一种s-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法、核酸、表达载体及宿主细胞

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000017355A2 (en) 1998-09-18 2000-03-30 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human cytoskeleton associated proteins
AU2743400A (en) 1999-01-29 2000-08-18 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic-acid binding proteins
JP2005503760A (ja) 2001-01-24 2005-02-10 プロテイン デザイン ラブス， インコーポレイテッド 乳癌の診断方法、組成物および乳癌のモジュレーターのスクリーニング方法
GB0111218D0 (en) 2001-05-08 2001-06-27 Cancer Res Ventures Ltd Assays methods and means
US6989245B2 (en) 2001-05-11 2006-01-24 The Burnham Institute Screening, diagnostic and therapeutic methods relating to RIZ
EP1409506B1 (en) 2001-07-23 2012-05-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for rnai mediated inhibition of gene expression in mammals
ATE356223T1 (de) 2001-09-25 2007-03-15 Japan President Univ Tokyo Gen und protein mit bezug zu hepatozellulärem karzinom
JP3742415B2 (ja) 2003-02-10 2006-02-01 三洋化成工業株式会社 Ｒｂ１遺伝子産物に対する自己抗体を検出するための免疫測定用試薬
EP1599586B9 (en) 2003-02-28 2012-03-14 Oncotherapy Science, Inc. Rna-interference for znfn3a1-gene as a method for inhibiting cancer cell growth
TWI350373B (en) * 2004-01-23 2011-10-11 Oncotherapy Science Inc Methods of detecting methyl transferase activity and methods of screening formethyl transferase activity modulators
EP2311983A1 (en) 2005-02-10 2011-04-20 Oncotherapy Science, Inc. Method of treating bladder cancer using siRNA
CN101189346A (zh) * 2005-02-28 2008-05-28 肿瘤疗法科学股份有限公司 乳腺癌相关基因znfn3a1
TW200741009A (en) * 2005-07-01 2007-11-01 Oncotherapy Science Inc Methods of modulating SMYD3 for treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010528584A (ja) 2010-08-26
WO2008152816A1 (en) 2008-12-18
US8354223B2 (en) 2013-01-15
US20100184088A1 (en) 2010-07-22
EP2171082A1 (en) 2010-04-07
EP2171082A4 (en) 2010-10-06
JP5272134B2 (ja) 2013-08-28
EP2171082B1 (en) 2012-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW200909587A (en) Methods of identifying agents that modulate methylation of VEGFR1 by SMYD3
CA2744236C (en) Mutant ros expression in human cancer
SG174071A1 (en) Genes and polypeptides relating to breast cancers
US7943295B2 (en) Screening and therapeutic method for NSCLC targeting CDCA1-KNTC2 complex
DK2838998T3 (en) EGFR AND ROS1 IN CANCER
Fumagalli et al. CXCR4/ACKR3 phosphorylation and recruitment of interacting proteins: key mechanisms regulating their functional status
US10351914B2 (en) Biomarkers for Pin1-associated disorders
US10618943B2 (en) Ubiquitin variant modulators of HECT E3 ligases and their uses
JP4908402B2 (ja) ＵＲＬＣ８のｔＲＮＡ−ジヒドロウリジンシンターゼ活性によって非小細胞肺癌を診断する方法
WO2008023841A1 (en) Breast cancer-associated gene, melk, and its interactions with bcl-g
EP3948289A1 (en) Modulators of cell surface protein interactions and methods and compositions related to same
US20110229480A1 (en) Pta072 protein
CN103261894A (zh) 作为厄洛替尼治疗的标志物的ipp复合物
EP2297580B1 (en) Antibody against Ephrin Type-A receptor 7 for treatment of bladder cancer
US20230357430A1 (en) Rnf167 and castor1 as novel mtor targets
JP2011518541A (ja) 癌治療法および癌診断のための標的遺伝子としてのＣ２ｏｒｆ１８
US20120058131A1 (en) Pta089 protein
Shi Peptide substrate-assisted study of O-GlcNAc transferase and O-GlcNAcylation
Knittle Regulation of ErbB4 signaling by post-translational modifications
JP2012506236A (ja) 抗肺がん化合物または抗食道がん化合物のスクリーニング方法
Scotto-Lavino Identification of novel interaction sites between myosin phosphatase (MP) subunits PP1c β and MYPT1