JP2010528584A - Smyd3によるvegfr1のメチル化調整因子を同定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)メチルトランスフェラーゼ活性を有するSMYD3ポリペプチドを、メチル化されるVEGFR1ペプチド及びコファクターと、試験因子の存在下、VEGFR1ペプチドのメチル化に適した条件下で接触させる工程;
(b)VEGFR1ペプチドのメチル化レベルを検出する工程;及び
(c)工程(b)で検出したメチル化レベルを前記因子の非存在下で検出した対照レベルと比較する工程を含み、ここで、
対照レベルと比較したメチル化レベルの減少又は増大は、前記因子がSMYD3によるVEGFR1のメチル化を調整することを示す。
(a)以下からなる群から選択されるポリペプチドを、メチル化されるVEGFR1ペプチド及びコファクターと、VEGFR1ペプチドのメチル化が可能な条件下で接触させる工程;
(i)配列番号2(SMYD3)のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、1または2以上のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入され、該ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドと等価な生物学的活性を有するポリペプチド;
(iii)配列番号2と少なくとも約80%の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(vi)配列番号1のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドであって、配列番号2のアミノ酸配列に対応するポリペプチドと等価な生物学的活性を有するポリペプチド;及び
(v)配列番号2のアミノ酸配列の位置117〜246のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
(b)VEGFR1ペプチドのメチル化レベルを検出する工程;及び
(c)工程(b)のメチル化レベルとメチルトランスフェラーゼ活性とを関連させて、メチルトランスフェラーゼ活性を測定する工程
を含む。
(a)SMYD3によりメチル化されうるVEGFR1ペプチド;
(b)VEGFR1ペプチドのメチル化のコファクター;及び
(c)リジン831のメチル化を検出するための検出試薬
を含む。
疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、
親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)。
他に、以下の官能基又は特性を共通に有する側鎖:
脂肪族側鎖(G、A、V、L、I、P);
水酸基を含有する側鎖(S、T、Y);
硫黄原子を含有する側鎖(C、M);
カルボン酸及びアミドを含有する側鎖(D、N、E、Q);
塩基を含有する側鎖(R、K、H);及び
芳香族を含有する側鎖(F、H、Y、W)。
さらに、例えば、アミノ酸の分類は、変異マトリックスとして周知である(Taylor 1986, J, Theor. Biol. 119, 205-218;Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 3rd ed. A7.6-A7.9, Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)。このような分類は、以下のように要約できる:
脂肪族アミノ酸:L、I、V
芳香族アミノ酸:H、W、Y、F
荷電アミノ酸:D、E、R、K、H
陽荷電アミノ酸:R、K、H
陰荷電アミノ酸:D、E
疎水性アミノ酸:H、W、Y、F、M、L、I、V、C、A、G、T、K
極性アミノ酸:T、S、N、D、E、Q、R、K、H、W、Y
小アミノ酸:P、V、C、A、G、T、S、N、D
極小アミノ酸:A、G、S
大(非小)アミノ酸:Q、E、R、K、H、W、Y、F、M、L、I
ここで、挿入文字は、アミノ酸の1文字コードを示す。
(a)H3K4メチルトランスフェラーゼを、メチル化されるVEGFR1ペプチド及びコファクターとVEGFR1ペプチドのメチル化が可能な条件下で接触させる工程;
(b)VEGFR1ペプチドのメチル化レベルを検出する工程;及び
(c)工程(b)のメチル化レベルをメチルトランスフェラーゼ活性と関連させてメチルトランスフェラーゼ活性を測定する工程
を含む。
本発明の態様において、SMYD3を過剰発現する癌には、SMYD3のその発現レベルが癌の同じ器官の正常領域と比較して高い癌が含まれる。例えば、本発明者らは、種々の癌、例えば、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌及び乳癌におけるSMYD3の過剰発現を明らかにしてきた(WO2003/027143、WO2006/085684及びWO2006/092958)。従って、本発明の好ましい態様において、SMYD3を過剰発現する癌は、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌及び乳癌からなる群から選択されてもよい。
本発明の態様において、2つのタンパク質間の「結合を阻害する」とは、該タンパク質間の結合を少なくとも減少させることをいう。従って、ある場合には、サンプル中の結合ペアの割合は、適当な(例えば、試験化合物で処理されていない、或いは、非癌サンプルからの、又は癌サンプルからの)対照と比較して減少しているであろう。結合タンパク質量の減少は、例えば、対照サンプル中の結合ペアよりも、90%、80%、70%、60%、50%、40%、25%、10%、5%、1%未満(例えば0%)でありうる。
1.競合的アッセイフォーマット
競合的アッセイを本発明に係る試験化合物のスクリーニングに用いることができる。例によれば、競合的ELISAアッセイフォーマットとして、固相支持体に結合されたSMYD3ポリペプチド(又はVEGFR1ペプチド)が挙げられる。結合されたSMYD3ポリペプチド(又はVEGFR1ペプチド)を、VEGFR1ペプチド(又はSMYD3ポリペプチド)及び試験化合物とともにインキュベートする。試験化合物及び/又はVEGFR1ペプチド(又はSMYD3ポリペプチド)をSMYD3ポリペプチド(又はVEGFR1ペプチド)と結合させるのに十分な時間の後、基質を洗浄して結合していない物質を除く。SMYD3ポリペプチドに結合したVEGFR1ペプチドの量はその後決定される。これは当業者に既知のあらゆる種々の方法において、例えば、検出可能なラベルでタグ化されたVEGFR1ペプチド(又はSMYD3ポリペプチド)種を用いることにより、或いは、洗浄した基質を、VEGFR1ペプチド(又はSMYD3ポリペプチド)に対する、ラベルした抗体と接触させることにより、達成してもよい。SMYD3ポリペプチド(又はVEGFR1ペプチド)に結合したVEGFR1ペプチド(又はSMYD3ポリペプチド)の量は、試験化合物のVEGFR1ペプチドとSMYD3ポリペプチドとの会合を阻害する能力に反比例することとなる。タンパク質、例えば、これに限られないが、抗体のラベル化は、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)に記載されている。
非競合的結合アッセイもまた、本明細書中に記載されているような競合的アッセイを用いたスクリーニングを容易に適用できないフォーマットで構築された試験化合物のライブラリの初期スクリーニングとして、有用性が認められ得る(例えば、Barret et al., Anal Biochem 1992, 204: 357-64を参照)。
(a)以下からなる群から選択されるメチルトランスフェラーゼ活性を有するSMYD3ポリペプチド;
(i)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(ii)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで、1又は2以上のアミノ酸が置換、欠失又は挿入され、さらにここで、該ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリペプチド;
(iii)配列番号2と少なくとも約80%の相同性であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリペプチド;
(iv)配列番号1のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリペプチド;及び
(v)配列番号2のアミノ酸配列の位置117〜246のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリペプチド;
(b)(a)のポリペプチドによりメチル化され得るVEGFR1ペプチド;及び
(c)VEGFR1ペプチドのメチル化のコファクター
を含む。
材料と方法
試薬及びウェスタンブロット分析
タンパク質の抽出、IP(免疫沈降)、及びウェスタンブロット分析は、文献に記載の方法に従って行った(Hamamoto R et al., S Nature cell biology 2004, 6(8): 731-40)。イムノブロット分析は抗SMYD3抗体(Abcam、Cambridge、MA)、抗HA抗体(Sigma、St Louis、MO)、抗Flag抗体(Sigma)、抗GST抗体(BD Pharmingen、San Diego、CA)、抗βアクチン抗体(Sigma)、又は抗リン酸化チロシン抗体(PY20、Sigma)を用いて行った。HRP接合二次抗体を、ECL検出システム(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)に用いた。組換えヒストンH3及びVEGFR1(3108)は、Upstate Biotechnology(Lake Placid、NY)及びCalbiochem(San Diego、CA)からそれぞれ購入した。メチル化リジン831特異的抗体(抗K831me2)は、ジメチル化リジン831を含む合成ペプチドであるRERLKLGKm2SLGRGAで免疫したウサギの血清から精製した。
ヒト胎児腎細胞株(HEK293及び293T)及びヒト結腸癌細胞株(SW480)は、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から入手した。SNU423HCC細胞及びMCF7乳癌細胞はKorea cell−line bank及び財団法人癌研究会からそれぞれ好意に基づいて提供された。全ての細胞株は、適切な培養液中、単層で成長させた。
SMYD3を発現するプラスミドをすでに文献に記載されているように調製した(Hamamoto R et al., S Nature cell biology 2004, 6(8): 731-40)。本発明者らは、また、VEGFR1の野生型又は欠失形態のいずれかを含む種々のRT-PCR産生物を、pCMV−HA(Clutch、Palo Alto、CA)、p3xFlag−CMV14(sigma)又はpGEX6P−3ベクター(Amersham Biosciences)の適切な部位にクローニングすることにより、HAタグ化又は3xFlagタグ化VEGFR1を発現するプラスミドを調製した。RT-PCR実験は、プライマーの組(表1)を用いて行った。アミノ酸配列の置換を含む変異体VEGFR1プラスミドは、Quickchange II XL Site-directed Mutagenesis kitを用いてサプライヤーのプロトコルに従って生成した(Strata gene、La Jolla、CA)。
293T細胞に、Flagタグ化野生型SMYD3を発現するプラスミド(p3XFLAG−CMV−SMYD3)をトランスフェクトした。タグ化SMYD3タンパク質は、抗Flag抗体を用いる免疫沈降により精製した。組換えSMYD3タンパク質は、バキュロウイルスシステム(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いてSf9細胞中で調製した。インビトロメチルトランスフェラーゼアッセイは、わずかに修正を施して他の文献に記載されたように(Hamamoto R et al., S Nature cell biology 2004, 6(8): 731-40)行った。
VEGFR1のインビボメチル化は、Liu及びDreyfuss(Liu Q and Dreyfuss G., Molecular and cellular biology 1995, 15(5): 2800-8)に記載された方法に従い、わずかに修正を施して分析した。簡単に言えば、HAタグ化VEGFR1を発現するHEK293細胞を、100μg/mlのシクロヘキシミドとともに、37℃で30分間インキュベートし、その後、10μCi/mlのL−[メチル−3H]メチオニンを含む培養液中にそのまま3時間保持した。VEGFR1は、細胞抽出物から抗HA抗体で沈降し、SDS−PAGEにより分離し、続いて、BASイメージングシステム(BAS−TR2040、FUJI)により、又は、イムノブロット分析により分析した。
RNAi実験は、Dharmacon(Chicago、IL)から購入した、SMYD3に特異的な又は対照siRNAの二本鎖オリゴヌクレオチドで行った。1x105のHEK293−SMYD3細胞を、オリゴフェクタミンを用い、各siRNAで最終濃度100nMでトランスフェクトした。トランスフェクトから48時間後、タンパク質を細胞から抽出し、ウェスタンブロット分析にかけた。
全ての分析は、Statviewソフトウェアを用いて行った(SAS Institute、Cary、NC)。
最近の研究では、VEGFRがヒトの発癌に関与していることが示唆されている。従って、ここで、VEGFR1について、インビトロメチルトランスフェラーゼアッセイを用い、SMYD3の候補メチル化標的として調べた。本発明者らは、基質に関し、VEGFR1の3つの細胞質領域の組換えタンパク質、VEGFR1#1(コドン800−1000)、VEGFR1#2(コドン1000−1200)及びVEGFR1#3(コドン1200−1338)を調製した。SMYD3又は対照タンパク質を、Flagタグ化SMYD3又はモックプラスミドでそれぞれトランスフェクトしたHEK293細胞から抗Flag抗体で免疫沈降した。結果として、VEGFR1#1は、SMYD3によりインビトロで対照タンパク質と比較して有意にメチル化された(図1a)。しかし、VEGFR1#2又はVEGFR1#3において、メチル化は観察されず、VEGFR1#1がメチル化残基を含有することが示唆された。インビトロの組換えヒストンH3と比較して約3倍高いVEGFR1#1のメチル化が検出された(データ示さず)。
SMYD3を含む、SET含有メチルトランスフェラーゼのほとんどは、リジンを修飾する。従って、この領域内のリジンを調査した。リジン819、828、831及び840は他種のVEGFR1オルソログの中で保存されていることが決定された(データ示さず)。先の報告では、K/R−S/T/A−KがヒストンメチルトランスフェラーゼSET7/9の共通メチル化モチーフであることが示されているが(Couture JF et al., Nat Struct Mol Biol 2006, 13(2): 140-6)、他のヒストンメチルトランスフェラーゼの標的リジン、例えば、p53K370、ヒストンH3K4及びH3K27は、K/R−S/T/A−Kに隣接していないが、S/T−K−X又はX−K−Sには隣接している(図2a)。従って、これらのモチーフに一致し、他種に保存されたリジン819及び831は、本アッセイの中心であった。
VEGFR1のインビボメチル化を調べるため、インビボメチル化アッセイを、Flagタグ化SMYD3(293−SMYD3)を安定に発現するHEK293細胞、及び、対照細胞(293−モック)を用いて行った。細胞を、HAタグ化VEGFR1でトランスフェクトし、続いて、タンパク質合成阻害剤の存在下でL−[メチル−3H]メチオニンとともにインキュベートした。抗HA抗体での細胞の免疫沈降物を、SDS−PAGEにより分離し、蛍光映像装置(fluoroimager)によりメチル化されたVEGFR1を調べた。予想したように、293−モック細胞からのものと比較して、VEGFR1の強められたメチル化が293−SMYD3細胞からの沈降物中に検出された(図2e)。これと一致して、抗K831me2抗体を用いた沈降物のイムノブロット分析では、対照細胞と比較して強められたリジン831のメチル化が確認された(図2f)。
VEGFR1はSMYD3によりメチル化されるため、本発明者らは、SMYD3がVEGFR1と相互作用するか否か調べた。本発明者らは、VEGFR1のFlagタグ化細胞質領域をHAタグ化SMYD3とともにHEK293細胞内で発現させた。抗HA抗体での免疫沈降及びその後の抗Flag抗体でのイムノブロット分析は、SMYD3がVEGFR1#1(コドン800−1000)とは会合するが、VEGFR1#2ともVEGFR1#3とも会合しないことを示した(図3a)。これと一致して、抗Flag抗体での免疫沈降及びその後の抗HA抗体でのイムノブロット分析は、SMYD3とVEGFR1#1との相互作用を実証した(図3a)。内在性SMYD3とVEGFR1との相互作用を調べるため、本発明者らは、さらに、SMYD3及びVEGFR1の両方を発現するSNU423、SW480又はMCF7細胞からの抽出物を用いた、抗SMYD3抗体での免疫沈降を行った。結果として、本発明者らは、抗SMYD3抗体での免疫沈降により、内在性SMYD3はVEGFR1と共免疫沈降することを見出し(図3b)、これは、SMYD3とVEGFR1との間のインビボ相互作用を示唆する。VEGFR1に対する抗体は、免疫沈降には適用できないため、本発明者らは抗VEGFR1抗体で免疫沈降は行わなかった。
リジン831はキナーゼドメインに位置する。そこで、VEGFR1メチル化のそのキナーゼ活性への影響をさらに調べた。キナーゼ活性は、基質のリン酸化チロシンを認識するVEGFR1キナーゼアッセイキットを用いて調べた。VEGFR1の細胞質領域の組換えタンパク質を3Hラベル化SAMで、SMYD3の存在下又は非存在下で処理し、その後、キナーゼ活性を調べた。予想したように、SMYD3によるVEGFR1のメチル化が、3H−BASシステムにより検出された(データ示さず)。重要なことに、SMYD3で処理したVEGFR1は、対照と比較してそのキナーゼ活性の有意な増大を示した(図4a)。VEGFR1無しのSMYD3単独によるリン酸化は観察されなかった(データ示さず)。抗リン酸化チロシン抗体でのウェスタンブロット分析はまた、SMYD3非存在下と比較して、SMYD3存在下では、組換えヒトVEGF165タンパク質を伴うFc領域に融合された組換えヒトVEGFR1タンパク質のリン酸化増大をも明らかとした(図4b)。興味深いことに、VEGFR1の組換え細胞質領域(コドン784−1338)をインビトロキナーゼアッセイに用いた場合には、VEGFR1の自己リン酸化は観察されなかった(データ示さず)。従って、VEGFR1のメチル化は、VEGFR1標的分子のリン酸化に影響し、そのシグナル伝達を強めることとなる。
本明細書中で示したように、VEGFR1はSMYD3ヒストンメチルトランスフェラーゼの、新規な非ヒストン標的である。ヒストン末端の修飾は、クロマチン構造の一部変質を介して、転写、DNA修復、テロメア維持、DNA複製及び染色体分離において重要な役割を果たす。最近の分子研究はヒストン末端のリジン修飾、及び、ヒストンメチルトランスフェラーゼ及びデメチラーゼによるその動的制御の重要性を明らかにしている(Volkel P and Angrand PO, Biochimie 2007, 89(1): 1-20)。17を超えるヒストンメチルトランスフェラーゼがこれまで同定されており、これらのメチルトランスフェラーゼは、それぞれの基質に特異性を有している。H3K4は、SET7/9、Set1、MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、MLL5、ASH1及びSMYD3によりモノ、ジ、又はトリメチル化される(Kouzarides T, Cell 2007, 128(4): 693-705.; Volkel P and Angrand PO, Biochimie 2007, 89(1): 1-20)。
Claims (36)
- SMYD3によるVEGFR1のメチル化を調整する因子を同定する方法であって、該方法が、
(a)以下から構成される群から選択される、メチルトランスフェラーゼ活性を有するSMYD3ポリペプチドを、メチル化されるVEGFR1ペプチド及びコファクターと、VEGFR1ペプチドのメチル化に適した条件下で、前記因子の存在下で接触させる工程;
(i)配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、1又は2以上のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入され、さらにここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
(iii)配列番号2と少なくとも約80%の相同性を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
(iv)配列番号1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(v)配列番号2のアミノ酸配列の位置117〜246のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
(b)VEGFR1ペプチドのメチル化レベルを検出する工程;及び
(c)工程(b)のメチル化レベルを前記因子の非存在下で検出した対照レベルと比較する工程を含み、
前記対照レベルと比較したメチル化レベルの増大又は減少が、前記因子がSMYD3によるVEGFR1のメチル化を調整することを示す、方法。 - 前記コファクターが、S−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(SAHH)である、請求項1に記載の方法。
- 前記(ii)に定義されるポリペプチドが、20以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記(iii)に定義されるポリペプチドが、配列番号2と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記(iv)に定義されるポリペプチドが、配列番号1のヌクレオチド配列からなるポリペプチドに、高いストリンジェント条件下で特異的にハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
- 前記(v)に定義されるポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列の位置100〜250のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記VEGFR1ペプチドが、配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、その機能的変異体もしくは機能的断片である、請求項1に記載の方法。
- 前記機能的VEGFR1断片が、配列番号4のアミノ酸配列の位置800〜1000のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記機能的VEGFR1断片が、配列番号4のアミノ酸配列の位置800〜841のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記機能的VEGFR1変異体が、以下の変異:K819A、K819E及びK819Rの1又は2以上を含む、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記メチル化レベルが、VEGFR1のリジン831で検出される、請求項1に記載の方法。
- SMYD3を過剰発現する癌治療のための化合物のスクリーニング方法であって、該方法が、
(a)VEGFR1ペプチド又はそのSMYD3結合領域を含む断片を、SMYD3ポリペプチド又はそのVEGFR1結合領域を含む断片と、VEGFR1ペプチドとSMYD3ポリペプチドとの結合を可能とする条件下及び試験化合物の存在下で接触させる工程;及び
(b)VEGFR1ペプチド又はそのSMYD3結合領域を含む断片と、SMYD3ポリペプチド又はそのVEGFR1結合領域を含む断片との間の結合を阻害する試験化合物を、癌治療のための候補化合物として選択する工程
を含む、方法。 - 前記VEGFR1ペプチドのSMYD3結合領域を含む断片が、配列番号4のアミノ酸配列の位置800〜1000のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記SMYD3ペプチドのVEGFR1結合領域を含む断片が、配列番号2のアミノ酸配列の位置100〜250のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記癌が、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌及び乳癌からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- SMYD3を過剰発現する癌の治療のための化合物をスクリーニングする方法であって、該方法が、
(a)請求項1に記載の方法を用いてメチル化を調整する試験化合物を同定する工程;及び
(b)前記試験化合物の非存在下で検出される対照メチル化レベルと比較して、メチル化される基質のメチル化レベルを減少させる試験化合物を選択する工程
を含む、方法。 - 前記癌が、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌及び乳癌からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 試験化合物のVEGFR1のメチル化調整能力を検出するキットであって、該キットが、
(a)以下から構成される群から選択される、メチルトランスフェラーゼ活性を有するSMYD3ポリペプチド;
(i)配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、1又は2以上のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入され、さらにここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
(iii)配列番号2と少なくとも約80%の相同性を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
(iv)配列番号1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(v)配列番号2のアミノ酸配列の位置117〜246のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
(b)前記(a)のポリペプチドによりメチル化され得るVEGFR1ペプチド;及び
(c)VEGFR1ペプチドのメチル化のためのコファクター
を含む、キット。 - 前記VEGFR1ペプチドが、配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、その機能的変異体もしくは機能的断片である、請求項18に記載の方法。
- 前記キットが、以下の:
(d)S−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(SAHH)
をさらに含む、請求項18に記載のキット。 - 前記(v)に定義されるポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列の位置100〜250のアミノ酸配列を含む、請求項18に記載のキット。
- ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を測定する方法であって、該方法が、
(a)H3K4メチルトランスフェラーゼを、メチル化されるVEGFR1ペプチド及びコファクターと、VEGFR1ペプチドのメチル化を可能とする条件下で接触させる工程;
(b)VEGFR1ペプチドのメチル化レベルを検出する工程;及び
(c)工程(b)のメチル化とメチルトランスフェラーゼ活性とを関連付けることにより、メチルトランスフェラーゼ活性を測定する工程
を含む、方法。 - 前記VEGFR1ペプチドが、少なくともK831を含むVEGFR1断片である、請求項22に記載の方法。
- 前記コファクターが、S−アデノシル−L−メチオニンである、請求項22に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、VEGFR1ペプチド及びコファクターと、メチル化増強因子の存在下で接触させる、請求項22に記載の方法。
- 前記メチル化増強因子が、S−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(SAHH)である、請求項25に記載の方法。
- K831が、VEGFR1のメチル化されたリジン831を認識する抗体で検出される、請求項23に記載の方法。
- 前記H3K4メチルトランスフェラーゼが、
(i)配列番号2(SMYD3)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、1又は2以上のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入され、さらにここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価な生物学的活性を有するポリペプチド;
(iii)配列番号2と少なくとも約80%の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(iv)配列番号1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価な生物学的活性を有するポリペプチド;及び
(v)配列番号2のアミノ酸配列の位置117〜246のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと等価なメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
から構成される群から選択される、請求項22に記載の方法。 - 前記(v)で定義されるポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列の位置100〜250のアミノ酸配列を有する、請求項28に記載の方法。
- SMYD3のメチルトランスフェラーゼ活性を測定するキットであって、該キットが、
(a)SMYD3によりメチル化され得るVEGFR1ペプチド;
(b)VEGFR1ペプチドのメチル化のためのコファクター;及び
(c)リジン831のメチル化を検出するための検出試薬
を含む、キット。 - 前記コファクターが、S−アデノシル−L−メチオニンである、請求項30に記載のキット。
- 前記検出試薬が、VEGFR1のメチル化されたリジン831を認識する抗体である、請求項30に記載のキット。
- 前記キットが、SMYD3によるVEGFR1のメチル化を増強する因子をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 前記メチル化増強因子が、S−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(SAHH)である、請求項33に記載のキット。
- VEGFR1のメチル化を認識する抗体。
- VEGFR1のリジン831のメチル化を認識する、請求項35に記載の抗体。
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