TW200909583A - Cellulase, and method for producing cellooligosaccharide - Google Patents

Description

200909583 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種酵素液之製造方 高產率製造纖維寡糖之方法，复去&係選擇性地以 养糖選擇率高；以及提供一種使 纖維 製造方法。 種使用該酵素液之纖維寡糖之 【先前技術】 纖維寡糖係纖維二糖、纖維三

纖維四繪、繃雉X 糖、纖維六糖之總稱，係葡萄哌喃糖單元 ' Μ鍵結之各種糖類。近年來， .，，、〜6個，經β_ η “ a 平來纖維I糖與其他寡糖相 同，其生理機能逐漸變得明確，且期待其用作功能性食口 之新素材(參照非專利文獻…通常，作為獲得纖維二糖之 方法’已知有：⑴使用以絲為原料利用酵素之合成反應 的方法，及⑺使心纖維素為原料利用酵素之分解 方法。 、作為上述⑴之利用酵素之合成反應，已知有如下之方 法：於填酸之存在下，以蔗糖為原料，依次使薦糖鱗酸化 酶、葡萄糖異構酶及纖維二糖磷酸化酶與之反應，藉此獲 得纖維二糖之方法（參照專利文獻1)。然而，於該方法中， 為獲得纖維二糖而使用3種價格昂貴之酵素，且必須分別 進行3 1¾ #又之反應’若考慮及工業生產，則存在耗費酵素 之成本’且生產性低之問題。 另一方面，作為上述（2)之利用酵素之分解反應，已眾 所周知有將纖維素系材料以纖維素酶分解之方法。關於該 I23694.doc 200909583 酵素分解反應，其關鍵在於··由 如何提高含有纖維素酶沾、生產纖維募糖時， 面，及如何防止所生成之 (參照非專利文獻2)。 77解為葡萄糠之方面 就上述問題，先前已進行較多 解時之纖維募糖的產率。 楗南纖維素酵素分 作為藉由使用纖維㈣，將纖維素 獲得纖維募糖之方法，可列舉如下者/、刀解選擇性地 於專:]文獻2中’揭示有如下之纖維募糖之製造方法. 使用大量含有非a开；{總他| 法 S有非曰4纖維素之纖維素原料 在下進行利用纖維素酶之水解 、木質素之存 解反應’且隨時自反庳液φ 5 少採集由水解反應生成之纖〜' 文獻3中，禚n ”之纖維二糖；於專利 獻中揭不有如下之纖維寡糖之製造方法：將含有夭 然木質纖維素之原料蒸解，於基 、 Μ ^ 力轉後不經乾燥而將所得之 1 ’藉由纖維素酶進行部分水解，至少 之纖維二糖。 m竿养糖中 解=製Γ方法係使纖維素酶中所含有之作為纖维寡糖分 ==之卜葡萄糖㈣吸附於木質素上，抑·葡萄料 酶之作用，藉此抑制纖維寡糖分解為葡萄 维寡糖之反應選擇率。然而，於該等製造方法；而= 糖化液中含有大量之木質素，其結果纖維寡糖之產；變 又’存在如下問題：為獲得高純度之纖维寡糖’必須 進行自糖化液之脫木質素處理，故使純化步驟變得複雜。 於專利文獻4中，揭示有如下之製造方法：藉由使含有 123694.doc 200909583 貝2：/^之木貝素的木質纖維素與纖維素酶及白色腐朽 菌等木質素分解菌一同反應，而製造纖維寡糖中之一種之 纖維一糖。於該製造方&中，彳不經纖維素之脫木質素處 理，而提高纖維素酶對受質之作用，但於其分解產物中除 纖維二糖以外亦混入有木質素分解物，故與上述相同，纖 維寡糖之產率變低。又，存在如下之問題：為獲得高純度 之纖維一糖’必須進行木質素分解物之除去步驟，而使純 化工序變得複雜。 又，作為使用特定之纖維素酶，將纖維素酵素分解，而 提高纖維寡糖之產率的方法，可列舉如下者。 專利文獻5中，藉由屬於ceU〇vibri〇屬之微生物所生產的 纖維素酶的作用’於水性反應液中’由纖維素系物質製造 纖維寡糖的方法中’揭示有如下之纖維寡糖之製造方法： 藉由組合超過濾反應器而解除產物抑制，生成蓄積纖維募 糖二根據該方法’可獲得僅包含纖維二糖、纖維三糖的纖 維养糖’作為纖維素系物質之酵素分解的分解產物。然 而存在如下之問題：屬於cellovibrio屬之微生物所生產 =素難以對結晶性纖維素起作用，故為縮短反應時間、 提高產率’必需以非晶態纖維素作為受質，而使步驟 複雜。 專利文獻6巾，於㈣、㈣酶分解_素，生成纖維寡 糖的方法中’揭示有如下之纖維募糖之製造方法：預先使 纖維素酶與平衡化為pH值3.5〜5·〇的弱酸性陽離子交換樹 脂接觸，藉此選擇性地除去纖維素酶中的"萄糖㈣， 123694.doc 200909583 f 再使已除去該β-葡萄糖芽酶之纖維素酶與纖維素接觸。利 用該製造方法，可藉由纖維素之酵素分解，減低葡萄糖， 而獲得纖維寡糖為60%以上之分解產物。然而，於該製造 方法中，存在如下問題：必須除去纖維素中之β-葡萄㈣ 酶的步驟’而使纖維寡糖製造步驟變得複雜。又，於該纖 維素酶純化步驟中，存在如下問題：相對於未處理之纖維 素酶，必須75〜刪倍之陽離子交換樹脂，因此纖维素酶 處理量受到限制，纖維寡糖之生產性並不充分，纖維素酶 純化成本、陽離子交換樹脂的分離純化 專利文獻7中，揭㈣：纖料酶純化方Γ其係將纖 維素醋、或纖，維素㈣之任—者或者兩者與纖維素酶溶 解，保溫固定時間後’使阳值變化，將不溶之固形餾分盥 溶液分離’藉此選擇性地除去纖維素 萄 糖㈣…纖维二糖之製造方法，其係將已:去= 萄糖苦酶之纖維素酶及纖維素添加於水介質中，製成懸濁 液’將該懸濁液保溫固定時間’使該懸濁液中生成纖維二 糖’再採集該纖維二糖。 專利文獻8中，揭示有：纖維素酶之純化方法，其係於 調整pH值以可溶解聚葡萄胺糖的水介質中，溶解上述聚葡 萄胺糖及纖維素酶’保溫固定時間後’使pH值變化，將不 溶之固形餾分與溶液分離’藉此選擇性地除去纖維素酶中 所含有之β-葡萄糖皆酶；又’纖維二糖之製造方法，其係 將已除去該β-葡萄糖普酶之纖維素酶及纖維素添加於水介 質中’製成懸濁液’將該懸濁液保溫固定時間，於該懸濁 123694.doc 200909583 液中生成纖維二糖，再採集該纖維二糖。 根據該等製造方法，以纖維素衍生物或者聚葡萄胺糖對 纖維素酶進#吸附分離處理，使其於吸附在纖維素衍生物 或者聚葡萄胺糖上之狀態下與纖維素接觸，藉此提高纖維 二糖之產率。然而，存在如下課題：該製造方法必須進行 纖維素酶之純化處理，故會使製造步驟變得複雜，且纖維 :酶純化中所使用之纖維素衍生物、聚葡萄胺糖價格昂 貝，會使成本f帛。X，亦存在如下問題：將纖維素酶與 纖維素衍生物或者聚葡萄胺糖一同用於纖維素酵素分解 中，因此，必須進行自分解反應液中將該等去除之工序。 專利文獻9中，揭示有：將不溶性纖維素或者含纖維素 之物質與來自木黴菌（Trich〇derma)的纖維素酶，於水介質 中保溫後，分離固形餾分，於該固形餾分中添加水溶性溶 液，而獲得纖維二糖的方法。根據該製造方法，可減少纖 維二糖製造工序中所混入之β·葡萄糖苷酶，而選擇性地獲 得纖維二糖。然而’存在如下問題：必須進行使纖維素酶 吸附於固形餾分上之工序以及分離固形餾分之工序，使製 程變得非常複雜。 [非專利文獻 1] Cellulose Communications, 5，Νο2，91-97 (1998) [非專利文獻2]「纖維素酶」講談社Scientific發行，97-104 (1987) [專利文獻1]日本專利特開平03-130086公報 [專利文獻2]曰本專利特開平05-31 7073號公報 123694.doc •10- 200909583 [專利文獻3]日本專利特開平⑽州㈣公報 [專利文獻4]日本專利特開平队⑽⑵禮公報 [專利文獻5]日本專利特開平〇1_256394號公報 [專利文獻6]日本專利特開平〇5_1 15293號公報 [專利文獻7]日本專利特開平〇5_227957號公報 [專利文獻8]曰本專利特開平〇5·227958號公報 [專利文獻9]曰本專利特開昭63_226294號公報 【發明内容】

[發明所欲解決之問題] 本發明所欲解決之問題在於提供以纖維素系物質 料，且於纖維素酶之存在下，藉由酵素分解而選擇性地生 產纖維二糖時，無需進行 酶活性高，且纖維寡糖選擇率高之培養上清酵素液的酵素 液之製造方法’及使用該酵素液之纖維寡糖之製造方法。 [解決問題之技術手段] 本發明者等發現^以含社卜⑺重量㈣籽相之 基，培養屬於木黴菌屬的微生物，可獲得纖維素酶活性古 之培養液。又’於除棉籽柏以外，進而含有g qi%以上: 硫酸録的培養基中，接種屬於木黴菌屬之微生物，將龙於 適宜條件下培養，藉此成功地降低了 β•葡萄糖㈣活性。、 即’本發明係如下所述。 〇) 一種含有纖維素酶之酵素液的製造方法，其勺 ^於含有來自屬於錦葵科之植物種子之成分的液體培: 暴中’培養屬於木黴菌屬之微生物。 123694.doc 200909583 (2) 如（1)之酵素液之劁>士、+ ^ ^ 履之製&方法，其中：屬於錦葵科之 植物種子係棉籽。 (3) 如（2)之酵素液之制】生士、+ 之製知方法，其係於含有0.1~10質 量％之棉籽粕作為來自掠 采自棉籽之成分的液體培養基中，培養 屬於木黴菌屬之微生物。 (4) 如（1)至（3)中任一頂夕art,. ^ 仕項之酵素液之製造方法，其中： 液體培養基含有自硫酸根離 很離千硫酸氫根離子及銨離子中

選擇之至少一種。 (5) 如（1)至（3)中任一箱夕缺主 項之酵素液之製造方法，其中： 微生物係屬於里氏木酶菌之菌株。 (6) 如（4)之酵素液之贺生 您製&方法，其中：微生物係屬於 里氏木酶菌之菌株。

+ ( \如（5)之酵素液之製造方法，其中：屬於里氏木酶 菌菌株係里氏木酶菌GL_ i株（獨立行政法人產業技術 π。研九所，專利生物寄存中心，寄存編號：叩謂Bp-1 〇323)、及/或里氏木酶菌AKC-0i 5株（獨立行政法人產業 技術綜σ研九所’專利生物寄存中心，寄存編號：mRM BP-10839)、及/或以GL]株或株作為母株而獲得 之變異株。 +⑻如(6)之酵素液之製造方法，其中：屬於里氏木酶 菌之菌株’係里氏木酶菌心株（獨立行政法人產業技術 綜合研究所’專利生物寄存中心’寄存編號：ferm Bp_ 10323)、及/或里氏木酶菌AKC〇l5株（獨立行政法人產業 技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：叩腹 123694.doc 12· 200909583 及/或以GL-i株或AKC-015株為母株而獲得之 (9) 種含有纖維素酶之酵素液之製造方法，其包 :.培養里氏木酶菌AKc_〇15株（獨立行政法人產業技術综 研九所專利生物寄存中心、寄存編號： 10839)之工序。 (10) -種纖維寡糖之製造方法，其包括：使用以請求

:⑴、(2)、(3)、(6)、⑺、⑻及(9)中之任-項所述之製 造方法製造的酵素液’將纖維素系物質酵素分解之工序f 、("）-種纖維寡糖之製造方法，其包括：使用以⑷所 述之製w方法製造的酵素液，將纖維素系物質酵素分解。 (12) -種纖維寡糖之製造方法’其包括：使用以⑺所 述之製造方法製造的酵素液’將纖維素系物質酵素分解。 [發明之效果] ^根據本發明’可製造纖維素酶活性高，且纖維募糖選擇

BP-10839)、 變異株。 率兩之酵素液，且藉由於纖維募糖之製造中使用該酵素 液可不經過繁雜之工序而以高產率製造纖維募糖。“ 【實施方式】 本發明中之所謂纖維素酶，係分解纖維素之酵素的總 稱’若其具有纖維素分解活性，則包含於本發明中所稱之 纖維素酶中。X，本發明中之纖維素酶活性，可表示為分 解叛曱基纖維素（CMC)之酶活性（CMC_ase)、分解結晶纖 維素（MCC)之酶活性（MCC_ase)，且藉由如下所述之方法 進行測疋。該等纖維素酶活性越高，纖維素之分解迷度、 123694.doc • 13 - 200909583 分解率越提高，故較好。 (1) CMC-ase活性 準備480 μΐ之溶解於20 mM醋酸-醋酸鈉緩衝液（pH值為 5)中的1 %羧甲基纖維素鈉鹽溶液。於其中添加適當稀釋之 酵素液20 μ卜於40。(：下使其反應3〇分鐘。於95。〇下，加熱 15分鐘，使反應停止後，藉由3,5_二硝基水揚酸法對還原 糖進行比色定量。使用纖維二糖標準溶液作成標準曲線，

將以纖維二糖換算於〗分鐘内使1 μηι〇Ι之還原糖游離的酵 素量定義為1酵素單位（1 U)。 (2) MCC-ase活性 於50 mM醋酸-醋酸鈉緩衝液（pH值為5)中懸濁有丨.25質 量％的結晶性纖維素（將旭化成化學製，商品名：Gw此 PH-101製成水分6〇%，以三英製作所製造、商品名：萬能 授拌混合機’ n由鉤片以9G分鐘、126啊進行混練^ 者）的受質液0.4 ml中添加適當稀釋之酵素液〇·ι ，於 贼下使其反應3〇分鐘後，於机下加熱15分鐘使反應 T止後’藉由3,5·二硝基水揚酸法對還原糖進行比色： 量。使用纖維二糖標準溶液作成標準曲線，將以纖維= 換算於1刀鐘内使丨μιη()1之還原糖游離的酵素 素單位（1U)。 我為1酵 本發明中之所謂β-葡萄 糖’而生成葡萄糖之酵素，彳以β·葡萄糖苷酶活性進= 量。藉由纖維素之酵素分解，而獲得葡萄糖之情仃疋 素液之β_葡萄料酶活性越高，葡萄糖之生成迷度以及= 123694.doc •14· 200909583 解率變仔越高，故較為有效 維券糖，較為有效的是使用 葡萄糖苷酶活性低之酵素液 以下方法進行測定。 (3) β-葡萄糖苷酶活性 相反為了以高產率獲得纖 上述之纖維素酶活性高，且 σ亥β葡萄糖苷酶活性可藉由 於 *醋1醋酸納緩衝液（ρΗ值為5)中溶解有 量。/〇纖維二糖（Aldrich製造； ·資 素液0.3 rm，於贼下使3 ml中添加酵 。下使其反應30分鐘後，於饥下加執 =辛Γ應停止後，使用组合有變旋酶與葡萄糖“ 轉之酵素法試劑㈣萄㈣量套組⑽萄糖ai-TestWak0, 和先純樂工業公司製)’定量反應液中之葡萄糖濃度。將 ^分^。内使1㈣之葡萄糖游離的酵素量定義W酵素翠 係屬於木黴菌屬之微生 之微生物，可製造本發 本發明中使用之纖維素酶生產菌 物。藉由接種、培養屬於木黴菌屬 明之纖維素酶活性高之酵素。 將本發明之酵素液用於製造纖維募糖之情形時，需獲得 纖維素酶活性高、且_寡糖選擇率高之料液，上 於木黴菌屬之微生物中，較好的是使用屬於里氏木酶菌之 函株，特料的是❹里氏木酶㈣]株⑽立行政法人 產業技術綜合研究所，專利生物 或者里存中…存編號: 飞者里氏木酶菌AKCMH5株（獨立行政 法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存“， 號：咖M BP-咖9)。於上述方法中，進而好的是’為 123694.doc -15- 200909583 了以咼產率製造纖維寡糖，使用以上述之里氏木酶菌GL_i 株或者AKC-0 1 5株為母株，可以高產率且高選擇率獲得纖 維寡糖之’實施有公知之變異處理的變異株。 再者，GL-1株係於2005年4月15日，寄存於獨立行政法 人產業技術細合研究所，專利生物寄存中心（日本國茨城 縣築波市東1 丁目1番地1中央第6(郵政編號3〇5_8566))， 寄存編號：FERM BP-10323 ; AKC-015株係於2007年6月 13曰，寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所，專利生 物寄存中心（曰本國茨城縣築波市東i 丁目！番地丄中央第 6(郵政編號 305-8566))，寄存編號：FERJVI Bp_10839。 又，GL-1株係於2005年1〇月7日，寄存於中華民國（臺灣） 食αα工業發展研究所（FIRDI)，寄存編號BCRC930082。 此處所謂之公知之變異處理，係指如下之處理：若有需 要則使用紫外線照射或如亞硝基胍之變異誘發劑，對具有 纖維素酶生產能力之微生物進行變異誘導處理，自該等菌 株中選擇纖維寡糖生產效率高之菌株。作為用於變異誘導 處理之微生物，較好的是使用里氏木酶菌（}]1_1株（獨立行 政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存編 號：FERM ΒΡ-10323)、或者里氏木酶菌从㈡⑽（獨立 行政法人產業技術綜合研究所，專利生物寄存中心，寄存 編號：FERMBP-10839)作為母株。 作為變異處理之一例，例如可列舉以下方法。 將里氏木酶菌GL_i株或者AKC_〇15株，於馬鈐薯葡萄糖 €脂斜面培養基上’於28。(：下培#3〜1()日1所生成之抱 123694.doc • 16 · 200909583 子懸濁於生理食鹽水中，以成為100 000〜1〇〇〇〇〇,刚個/. 而EMS(ethyl methane咖⑽仙，甲基續酸乙㈤實施變異 處理（100〜500 _卜pH值為7 〇，耽，μ小時）。分 泌纖維寡糖生產性高之纖維素酶的菌株之選擇，可藉由如 下方法而達成：自該變異誘導處理孢子的懸濁液，㈣心 分離收集孢子，進行充分清洗，以葡萄糖等作為碳源進行 培養，以公知之方法測定培養物之酶活性。例如，可使用 =處理菌株之培養物，將纖維二糖或者結晶纖維素作 =質騎料分解，再對所生叙還祕進妓量；亦 了使用么知之顯色受質走盆 此定性ϋ a 4 /…、培養物進行酵素反應，藉 此疋性選擇目標菌株。 本發明之酵素液之製造方法十所使用之主培養 基，必須含有來自屬於錦葵科 於錦葵科之植物的種子，可列舉物：子之成Η乍為屬 槿、芙蓉、萄葵等之種子/才帛、秋蔡、朱僅、木 自屬；、 ，較好地可使用棉籽等。作為來 自屬於錦葵科之植物種 々水 處所謂之棉#，# y Μ 刀列如可使用棉籽粕。此 皮；所言田ΓΓ 錦蔡科棉屬之植物種子及其外 月 籽粕，係自棉籽榨取棉#f i β你 、 明之棉籽粕，除上述_ 尽發 絨、棉花、花瓣筈亦L 3種子、棉籽殼、棉 化辦4。用於 養基中之棉籽的添加量，係=黴:屬之微生物的培 密切關聯者，為獲得強、素液之纖維素酶活性具有 粕的添加量必項A Q 纖維素酶，培養基中之棉籽 好添加量為。2 7質量， 量/°’進而較好的是2〜5質量％。 123694.doc •17· 200909583

銨之添加量’爲使β_葡萄糖苷酶、、工ΙΛ、,、 夜體培養基中，特別好 。作為培養基中之硫酸 、、工 ΙΛ 、*、…

0.1〜0.5質量％。 主培養中所使用之培養基中，除上述所揭示者之外，作 為碳源，可列舉：纖維素粉末、纖維二糖、濾紙、—般紙

類、鋸屑、麥麩、稻殼、甘蔗渣、 粉、乳糖、葡萄糖、甘油、酒精、有機酸等。又，作為氮 源，可添加硝酸銨等無機銨鹽，尿素、胺基酸、肉汁、酵 母萃取物、聚蛋白脒、蛋白分解物等有機含氮化合物。作 為無機鹽類’可使用 KH2P04、MgS04 · 7H20、CaCl2 · 【 2H2〇、FeCl3 · 6H2〇、MnCl3 · 4H2〇、ZnS04 · 7H20 等。 若有需要，則可使用含有有機微量營養物之培養基。 培養若使用通常之通氣攪拌培養裝置或者固體培養裝 置’且使用上述培養基’於溫度為2〇〜4(TC、較好的是 26〜30°C ’培養pH值為2〜8、較好的是2.5〜5·5下進行培 養，則於3〜1 〇曰纖維素酶活性達到最高。繼而，以離心分 離、過濾等公知之方法自培養液中除去菌體獲得上清液。 該上清液可直接作為粗酵素液。 以下對纖維寡糖之製造方法加以說明。 123694.doc •18· 200909583 酵素分解方法，可倍用八4 為其中-例，可列舉如二方法，並無特殊限制，作 物質懸濁於水介質中，>力^.將作為受質之纖維素系 攪拌添加本發明之纖維素酶，一面進行 搜拌或者振虚面加溫進行糖化反應。 :上述方法中，懸濁方法、擾拌方法、纖維素酶·受質 2加方法•添加順序、該等之漢度等反應條件，可加以 適且δ周整，以使发可以审a 八了以更向產率獲得纖維募糖。此

=液之PH值及溫度，㈣素不會失活之範圍内即可 之乾圍内即可。又，其壓力、溫度、pH值，與上述相 5可加以適且調整’以使其可以更高產率獲得纖維寡 仁於使用以上述之里氏木酶菌沉心株及/或AKC_〇i5 株、或者該等之變異株作為纖維素酶生產菌而獲得之纖維 素酶時’纖維素之酵素分解，較好的是於常壓下，於酷酸 或者磷酸緩衝液中，於溫度50〜6〇t：，pH值為3.0〜5·5之範 圍内進行。 本發明中所使用之纖維素系物質，較好的是含有纖維素 之水不溶性纖維質物質。其來源可為植物性亦可為動物 性作為產生其之動植物，例如可列舉：木材、竹、麥 桿、稻草、玉米芯粉、棉、芋麻、甘蔗渣、洋麻、甜菜、 海勒、細菌纖維素等。X，本發明中，除上述動植物所產 生之天然纖維素系物質之外，亦可使用使天然纖維素系物 質暫時化學性•物理性溶解、或者膨潤後，進行再生而獲 得之再生纖維素系物質，以及將纖維素系原料化學改性= 123694.doc -19· 200909583 =之：维素衍生物系物質。該等之纖維素系物質，於工章 料亦紙、纖维素粉末、結晶纖維素等天然纖维； Η #再生纖料，鹼纖維素、魏膨 各種再生纖維素系原料，羧 ”、，、素# 生物系原料。"，將所=纖維素鈉等各種纖維素衍 將所传之纖維寡糖使用於醫藥0各 品、化妝品時，更好的异祛田工μ 酋樂、食 ,L 的疋使用天然纖維素系原料。作以 料，可使用該等之中旧纖維素 乍為原 上混合而成者。 ’糸物質，亦可使用將2種以 :酵：反應，可以批次式進行，亦可以連續式進行。於 解反應中’為避免纖維二糖所造成之產物抑制，將 糖濃度料在特定範圍， 寡糖之生產性方面較重要。作A蔣“么 〇纖維 要作為將反應系統内之纖維二糖 辰度保持在特定範圍之方法， 诸…、Α * Γ為如下之方法：藉由超 濾、您滲透過濾等膜過濾， 維二糖的方法；將活性&取出所生成之纖 ^ _ ' 火竹木材等乾燥植物粉等有機 户、材，二氧化石夕等無機多孔基材等導入至反應系統， 使纖維一糖吸附於其等之上的方法；將纖維素受質固定於 管柱等中，使含有纖維素酶之反應液流通之方法；將纖維 素轉固疋於南分子等中’使含有纖維素之反應液流通之方 法0 以由上述之酵素分解而獲得之纖維寡糖為主成分的水溶 液’可視需要實施脫色、脫鹽、除去酵素等純化處理。純 化方法若為公知之方法則無特別限制，例如可使用活性碳 處理’離子交換樹脂處理，層析處理，微渡、超遽、逆滲 123694.doc •20- 200909583 透過濾等過濾處理，晶 組合2種以上。日日析處理專，該等可單獨使用，亦可 接純化之^轉糖為主成㈣切液，可直 接使用’亦可頑雪至鼓丄 直 知之方法則無特別限;二:使了其;11化。乾躁方法若為公 燥、轉筒乾燥、薄膜:二:使用喷霧乾燥，乾 燥等，該箅…膜…層板乾燥、氣流乾燥、真空乾 、β 11早獨使用，亦可組合2種以上。 作為上述純化、教操虚 外，亦一::::::纖 亦…、特別限制，例如較好的是於製造醫藥品、！ 等之添加劑之工序中所使用者，可列舉於「醫藥：:： 事典」(藥事曰報社⑻發行)、「曰本藥典」、「食：;二 公定書」(均為廣川書店發行)中分類為溶劑者。水：有機 =可單獨使用，亦可併用2種以上，均為自由，：有: 其分散後，除一’ 一:： 經過上述工序之纖維寡糖之形態，並無特別 可於常溫下’以固體、懸濁液、乳液、糖製、溶液狀使 用。作為固體狀纖維寡糖之一例， 粒、成形體、積層體、固體分散體等末、顆粒、栖 明而獲得之纖維寡糖的用途，並無特， 化妝？、、醫藥品、一般工業製品等領域， …艮0口刀化妝°Π成分 '色素成分、香料成分、醫藥 ^效成分、農藥成分、飼料成分、肥料成分、培養基成 123694.doc 200909583 分、分析用試劑成分，以及添加劑、中間原料、醱 等。 原料 藉由本發明而獲得之纖維募糖，於食品方面，例如可 於.果凍、布丁、酸奶酪等凝膠狀食品，蛋黃營、* 醬、沙司、調味汁類、湯、蔬菜加工品等調味料，咖喱、 肉丁、肉醬、燉菜（肉）、湯等之罐頭食品、冷藏食品，奠 堡包、醃肉、臘腸、義大利臘腸、火腿類等畜產加工品，、 魚糕、魚卷、魚肉火腿•臘腸、炸魚糕等水產製品，°麵 包、生麵條、乾麵、通心粉、義大利麵、包子皮 料粉、麵包預混粉、白醬料、飲 w rr奴于•眷捲4之皮類等小麥 ,工食品’咖喱、醬料、湯、甜烹海味、果醬等之罐褒、 瓶裝類，、糖果、糖錠、硬糖、巧克力、餅乾、曲奇、、米 曰式點心、西式點心、1机 一 A ^小點心、蜜餞、布丁等點心 1、油炸食品類，炸肉餅、餃子、包子等烹每加工品，蔬 未糊、肉末、水果糊、魚貝類之糊等糊類。又 =霜漠淋、冰牛奶、奶冰、泡沫乳油、煉乳、黃油、= 路、乳酪、白醬料等乳製0 ， 人&頁油、脂肪塗抹食品、 耶冲等/由脂加工品等中。推 .^ 料、 進而，亦可使用於可樂等碳酸飲 果^入有碳酸、酒精且與乳製品混合而成之水果飲料、 奶^者含水果飲料、乳性飲料等飲料，咖啡、牛奶、豆 良 奶酪荨礼酸/乳性飲料等，煎茶、 烏龍条、抹茶、紅茶等茶飲料等中。 以本發明中所獲得之纖 乳酸产㈣ 纖维募糖，可期待其具有乳酸菌、 孔于菌等之活性化等 賊/腸内有用細菌群落，降低血糖 123694.doc -22- 200909583 濃度、叙中赌I I，s + ”濃度，降低血膽固醇，降低體脂肪百分 2進脂肪代謝•糖f代謝的功能，改善排便·便臭， :鶴：性等各種生理活性，因此，除上述通常食品用途 -亦可作為生理活性物質，而用於機能性食品、健康 食品、保健食品等用途中。 又’藉由本發明而獲得之纖維寡糖，為高純度者，因此 可用作各種纖維寡糖衍生物之化學轉化原料。 [實施例]

^ 知例等對本發明加以更具體之說明，但本發明並 不受該等實施例等之任何限制。 [實施例1] 將里氏木酶g GL]株（獨立行政法人產業技術综合研究 所專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP_10323)， 於馬铃#葡萄糖境脂斜面培養基上，於28<t下培養7日， 使孢子充分形成。將其i鉑耳量、棉籽粕， Trader’s 公司製造）：〇15 g、KH2p〇4 : 〇 〇6 g、 (NH4)2S04 : 0.045 g、MgS04 · 7H20 : 0.009 g、Caci2 · 2H20 : g、ADEKA N〇L LG1〇9 : 〇 〇3 瓜卜微量元 素液（將 H3B〇3 6 mg、（NH4)6M〇7〇24 · 4h2〇 26 mg、FeCl3 • 6H20 100 mg . CuS04 · 5H2〇 40 mg ^ MnS04 · 5H2〇 8 mg、ZnS04 · 7H20 200 mg溶解並懸濁於10〇…水中而成 之溶液）：0_03 ml溶解並懸濁於水：3〇 ml中，*ρΗ值調整 為4.0，分注30 ml於容積為150 ml之錐形燒瓶中，添加結 晶纖維素（旭化成化學公司製造，商品名PH-1 〇 1 )〇 3 g後， 123694.doc -23· 200909583 將其接種於經高壓蚤滅菌之預培養用培養基上，於28 °C下 培養3日。 繼而將該培養液、棉籽粕：2 g、ΚΗ2Ρ04 : 0.2 g、

MgS04 · 7H20 : 0.03 g、CaCl2 · 2H20 : 0.03 g、ADEKA NOL LG109 : 0.1 m卜微量元素液：n ml溶解及懸濁於 水：100 ml中，將pH值調整為4·〇，分注10〇以丨於容積為 500 ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素（旭化成化學公司製 造’商品名PH-101)2 g後，將其接種於經高壓釜滅菌之主 培養用培養基上’於28°C下培養6日。於第6日將培養液離 心分離’測定其上清液1 ml之纖維素酶活性（CMCase)。將 其結果作為pharmamedia-2%示於圖1。 [實施例2] 將里氏木酶菌GL-1株於馬鈐薯葡萄糖瓊脂斜面培養基 上’於28°C下培養7日’使孢子充分形成。將其1鉑耳量、 棉籽粕（pharmamedia，Trader's 公司製造）：0.15 g、 KH2P04 : 0.06 g、（NH4)2S04 : 0.045 g、MgS04 . 7H2〇 : 0.009 g、CaCl2 · 2H20 : 〇·〇〇9 g、ADEKA NOL LG109 : 0.03 m卜微量元素液（將 h3B〇3 6 mg、（NH4)6M〇7〇24 . 4H20 26 mg、FeCl3 · 6H2〇 loo mg、CuS04 · 5H2〇 4〇 mg、MnS04 · 5H20 8 mg、ZnS04 · 7H20 200 mg溶解並懸 濁於水100 ml中而成之溶液）：〇.〇3…溶解並懸濁於水： 30 ml中，將pH值調整為4.0，分注30 ml於容積為15〇如之 錐形燒瓶中’添加結晶纖維素（旭化成化學公司製造，商 品名PH-101)0.3 g後，將其接種於經高壓蚤滅菌之預培養 123694.doc 24- 200909583 用培養基上’於28°C下培養3曰。 繼而將該培養液、棉籽粕：1 g、KH2p〇4 : 〇.2 g、 MgS04 · 7H20 ： 0.03 g > CaCl2 · 2H2〇 : 〇.〇3 g ' ADEKA NOL LG109 : 0·1 nU、微量元素液：〇」ml溶解及懸濁於 水：100 ml中，將PH值調整為4〇 ’分注1〇〇爪丨於容積為 500 ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素（旭化成化學公司製 造、商品名PH-101)2 g後，將其接種於經高壓爸滅菌之主 培養用培養基上，於28°C下培養6日。於第6日將培養液離 心分離’測定其上清液1 ml之纖維素酶活性（(：]^(^^)。將 其結果作為pharmamedia-2%示於圖1。 [比較例1] 於與實施例1、或者2相同之方法中，使用包含麥麩（曰 本製粉）2 g或者1 g(分別記作麥麩_2%、1 %)、玉米漿（和光 純藥製）2 g或者1 g(分別記作玉米漿_2%、1%)的主培養用 培養基，代替使用棉籽粕（實施例1中為i g，實施例2為2 g)之主培養用培養基，除此之外以與實施例丨相同之方法 培養里氏木酶菌GL-1株6日。於第6日將培養液離心分離， 測定其上清液1 ml之纖維素酶活性（CMCase)，將各自之結 果不於圖1。 [實施例3] 將里氏木酶菌GL-1株於馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基 上’於28°C下培養7日，使孢子充分形成。將其1鈾耳量、 棉籽粕（pharmamedia，Trader’s 公司製造）：〇15 g、 ΚΗ2Ρ04 : 0.06 g、（NH4)2S04 : 0.045 g、MgS〇4 · 7H 〇 : 123694.doc -25- 200909583 0.009 g、CaCl2 · 2H20 : 0.009 g、ADEKA NOL LG109 : 0.03 m卜微量元素液（將 H3B〇3 6 mg、（NH4)6Mo7〇24 · 4H20 26 mg、FeCl3 · 6H20 100 mg、CuS04 · 5H2〇 40 mg、MnS04 · 5H20 8 mg、ZnS04 · 7H20 200 mg溶解並懸 濁於水100 ml中而成之溶液）：0.03⑷溶解並懸濁於水： 30 ml中’將pH值調整為4_0 ’分注30 ml於容積為150 ml之 錐形燒瓶中’添加結晶纖維素（旭化成化學公司製造，商 品名ΡΗ-101)0·3 g後’將其接種於經高壓蚤滅菌之預培養 用培養基上，於28°C下培養3日。 繼而將該培養液、棉籽粕：2 g、（NH4)2S04 : 0.15 g、 KH2PO4 . 〇·2 g、MgS〇4 · 7H2O : 0.03 g、CaCl〗· 2H20 : 0.03 g、ADEKA NOL LG109 : 0.1 ml、微量元素液：〇 i ml溶解及懸濁於水：100 mi中，將pH值調整為4,〇，分注 100 ml於谷積為500 ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素（旭 化成化學公司製造’商品名PH-l〇l)2 g後，將其接種於經 高壓爸滅菌之主培養用培養基上，於281：下培養6日。於 第6日將培養液離心分離，測定其上清液1 ml之纖維素酶 活性（CMCase)、纖維素酶活性（MCCase)&j3_葡萄糖苷酶活 性’將各自之結果示於表丨、2及表3。 [實施例4] 將里氏木酶菌GL—丨株於馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基 上，於28C下培養7曰，使孢子充分形成。將其1麵耳量、 棉籽粕（pharmamedia，Trader's 公司製造）：〇i5 2、 • Ο KH2P〇4 : 0_06 g、（Nh4)2S〇4 : 0.045 g、MgS04 · 7H2〇 : 123694.doc •26- 200909583 0.009 g、CaCl2 . 2H20 : 0.009 g、ADEKA NOL LG109 : 0.03 ml、微量元素液（將 H3B〇3 6 mg、（NH4)6Mo7024 · 4H20 26 mg、FeCl3 · 6H20 100 mg、CuS04 · 5H20 40 mg、MnS04 · 5H20 8 mg、ZnS04 · 7H20 200 mg溶解並懸 濁於水100 ml中而成之溶液）：〇·〇3 mi溶解並懸濁於水： 30 ml中’將pH值調整為4·0，分注30 ml於容積為150 ml之 錐形燒瓶中，添加結晶纖維素（旭化成化學公司製造、商 品名PH-101)0.3 g後，將其接種於經高壓釜滅菌之預培養 用培養基上，於28°C下培養3曰。 繼而將該培養液、棉籽粕：1 g、（NH4)2S04 : 0.15 g、 KH2P〇4 : 〇_2 g、MgS〇4 · 7H20 : 0.03 g、CaCl2 · 2H2〇 : 0.03 g、ADEKA NOL LG109 : 0.1 ml、微量元素液：〇」 ml溶解及懸濁於水100 mi中，將pH值調整為4〇，分注1〇〇 ml於容積為500 ml之錐形燒瓶中，添加結晶纖維素（旭化 成化學公司製造’商品名PH-101)2 g後，將其接種於經高 壓釜滅菌之主培養用培養基上，於28 °C下培養6日。於第6 曰將培養液離心分離，測定其上清液1 ml之纖維素酶活性 (CMCase)、纖維素酶活性（MCCase)及β_葡萄糖苷酶活性， 將各自之結果示於表1、2及表3。 [實施例5] 對以與實施例1相同之方式培養而獲得之培養液之上清 液1 mL的纖維素酶活性（CMCase)、纖維素酶活性 (MCCase)及β-葡萄糖苷酶活性進行測定，將各自之結果示 於表1、2及表3。 123694.doc -27- 200909583 [實施例6] 對以與實施例2相同之方式培養而獲得之培養液之上清 液1 mL的纖維素酶活性（CMCase)、纖維素酶活性 (MCCase)及β-葡萄糖苷酶活性進行測定，將各自之結果示 於表1、2及表3。 [表1] 表1.纖維素酶活性（CMCase) pharmamedia 1% 2% 硫酸銨 0% 16.4 34.8 0.15% 29.4 36.0 表1係於作為主培養用培養基之成分之棉籽粕（於表中記 作pharmamedia)以及硫酸銨（於表中記作硫酸銨）的每種添 加畺下’對培養液之CMCase活性（相對值，單位為u)進行 比較者。可知，若於培養基中添加硫酸銨，則即使棉籽粕 為低添加量亦可增加CMCase。 [表2] 表2.纖維素酶活性（McCase) pharmamedia 1% 2% 硫酸錄 0% 4.7 10.2 0.15% 8.9 8.6 表2係於作為主培養用培養基之成分之棉籽粕（於表中記 作pharmamedia)以及硫酸銨（於表中記作硫酸銨）的每種添 加量下’對培養液之MCCase活性（相對值，單位為U)進行 比較者。可知，若於培養基中添加硫酸銨，則即使棉籽粕 123694.doc -28- 200909583 為低添加量亦可增加MCCase。 [表3] 表3· β-葡萄糖苷酶 pharmamedia 1% 2% 石瓦S曼銨 0% 0.298 0.303 0.15% 0.146 「0.167 表3係於作為主培養用培養基之成分之棉籽粕（於表中記 作Pharmamedia)以及硫酸銨（於表中記作硫酸銨）的每種添 下對培養液之β_葡萄糖苦酶活性（相對值，單位為 =)進行比較者。可知，若於培養基中添加硫酸銨，則可提 高表1以及表2中所示之纖維素酶活性（CMCase、 MCCase)，且降低卜葡萄糖苷酶活性。 匕藉由於培養基中添加棉籽粕及硫酸錢，可提高纖 維素酶活，降低β_葡萄糖苦酶活性，因&，若於纖維素 系物質之酵素分解中使用本發明之酵素液，則可期望以高 產率獲得纖維募糖。 [實施例7] %王培餐用培養基100 W中放入棉标釉：5g，除此之 外、’以與實施例4相同之方式進行培養，於第7日將培養液 離。刀離後’上清液i ml之纖維素酶活性（CM。㈣)及纖維 素酶活性（MCCase)分別為58 4及19 4。 [實施例8] 於主培養用培養基1〇〇如中放 m r敦入棉籽粕：7 g，除此之 外’以與實施例4相同之方μ 义万式進仃培養，於第7日將培養液 123694.doc -29· 200909583 離心分離後，上清液1 mL之纖維素酶活性（C]V1Case)及纖維 素酶活性（1^(^&36)分別為17.9及8.0。 [實施例9] 將里氏木酶菌GL-1株於馬鈴薯葡萄糖壊脂斜面培養基 上，於28°C下培養7日’使孢子充分形成。將其1鉑耳量、 棉籽粕（pharmamedia，Trader’s 公司製造）：〇· 15 g、 KH2P〇4 : 0.06 g、（NH4)2S〇4 : 0.045 g、MgS04 · 7H20 : 0.009 g、CaCl2 · 2H20 : 0.009 g、ADEKA NOL LG109 : 0.03 ml、微量元素液（將 h3B03 6 mg、（NH4)6M〇7024 · 4H20 26 mg、FeCl3 · 6H20 100 mg、CuS〇4 · 5H2〇 4〇 mg、MnS04 · 5H20 8 mg、ZnS04 · 7H20 200 mg溶解並懸 濁於水100 ml中而成之溶液）：〇 〇3 ml溶解並懸濁於水： 3 0 ml中，將pH值調整為4.0，分注30 mi於容積為15〇 ml之 錐形燒瓶中’添加結晶纖維素（旭化成化學公司製造，商 。口名PH-1 01)0.15 g後，將其接種於經高壓爸滅菌之預培養 用培養基上，於28°C下培養6日。於培養之第6日，將GLj 株之培養液離心分離後，測定其上清液！ ml之纖維素酶活 性（〇]\^&8〇以及0-葡萄糖苷酶活性，（：]^(；^6活性為29.4 U’ β-葡萄糖苷酶活性為〇.145u。 於與上述相同之操作中’將所使用之菌株，由Glj株換 成 〇 15株，進行培養，將培養液離心分離後，測定其 上清液1扯之纖維素酶活性（CMCase)以及β-葡萄糖普酶活 性CMCase活性為37.0 U ’ β-葡萄糖苷酶活性為G o" υ。 [產業上之可利用性] I23694.doc -30- 200909583 藉由本發明之製造方 σ , L夺 法而獲得之纖維寡糖，除通常之食 4材之外’亦可作為功能性食品素： 化學品之中間體合成材料醫糸扣及/、他 較好地利用於食品、醫苹σ、4轉換原料、輯原料，而 【圖式簡單說明】 工業製品領域中。 性=1'㈣與其他主… =其1 較者。以棉籽柏培養之培養液，與其他 。土成刀糸相比’於相同培養條件下 CMCase活性（相對比） 冑τ出更同之 123694.doc 31 ·

Claims (1)

1. 200909583 十、申請專利範圍：

   一種含有纖維素酶之酵素液的製造方法，其包括：於含 有來自屬於錦葵科之植物種子之成分的㈣培養基中， 培養屬於木黴菌（Trichoderma)屬之微生物。 如請求項1之酵素液之製造方法，其中屬於錦葵科之植 物種子係棉籽。 3. 如請求項2之酵素液之製造方法，其係於含有〇ι〜ι〇質量 %之棉籽粕作為來自棉籽之成分的液體培養基中，培養 屬於木黴菌屬之微生物。 4. 如4求項1至3tjM壬一項之酵素液之製造方法，其中液體 培養基含有自硫酸根離子、硫酸氫根離子及銨離子中選 擇之至少一種。 5. 如請求項1至3中任一項之酵素液之製造方法，其中微生 物係屬於里氏木酶菌（Trichoderma rease)之菌株。 6. 如請求項4之酵素液之製造方法，其中微生物係屬於里 氏木酶菌之菌株。 7. 如凊求項5之酵素液之製造方法，其中屬於里氏木酶菌 之菌株係里氏木酶菌GL-1株（獨立行政法人產業技術綜 合研究所，專利生物寄存中心’寄存編號：FERM BP-10323)、及/或里氏木酶菌AKC-015株（獨立行政法人產業 技術，’、’τ、合研究所’專利生物寄存中心，寄存編號： FERM ΒΙΜ0839)、及/或以GL-1株或AKC-015株為母株 而獲得之變異株。 8.如响求項6之酵素液之製造方法，其中屬於里氏木酶菌 123694.doc 200909583 之菌株係里氏木酶菌GL-1株（獨立行政法人產業技術綜 合研究所，專利生物寄存中心，寄存編號：FERM Bp_ 10323)、及/或里氏木酶菌AKC-015株（獨立行政法人產業 技術綜合研究所’專利生物寄存中心，寄存編號. FERM BP-10839)、及/或以GL-1株或AKC-015株為母株 而獲得之變異株。 9. 一種含有纖維素酶之酵素液之製造方法，其包括：培養 里氏木酶菌AKC-015株（獨立行政法人產業技術綜合研究 所’專利生物寄存中心，寄存編號：FERM BP-10839)。 10. —種纖維募糖之製造方法，其包括：使用以如請求項 1、2、3、6、7、8及9中任一項之製造方法製造的酵素 液’將纖維素系物質酵素分解。 11. 一種纖維寡糖之製造方法，其包括：使用以如請求項4 之製造方法製造的酵素液，將纖維素系物質酵素分解。 12. —種纖維寡糖之製造方法，其包含：使用以如請求項5 之製造彳法製造的酵素液，將纖維素系4勿質酵素分解。 123694.doc