TW200846465A - In vitro methods for the induction and maintenance of plant cell lines as single suspension cells with intact cell walls, and transformation thereof - Google Patents

Description

200846465 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係部分關於植物細胞株之繁殖領域，包括將懸 浮液中之植物細胞繁瘦爲單離細胞的方法。 【先前技術】 在過去的二十年中，結合用於産生有用次級代謝物之 大規模植物細胞培養過程之發展的主要改良而快速出現了 植物遺傳工程技術。自1995年（Moffat，1995年；Ma等 _ 人，2⑽3年），此等植物細胞懸浮培養物愈來愈多地被用 作一有價值之用於表現重組蛋白質之宿主細胞系統。 植物生長素誘發之癒合組織或懸浮液（不管其之單組 織起源）通常含有具有，多種表型之細胞。因此，自此等細 胞類型發展之轉殖基因株通常高度異質而具有不一致之表 ^ 現水準。因此，已自單個原生質體獲得了産生許多有用次 級代物之純糸（clone )，例如自紫草原生質體 (Lithospermum erythrorhizon )製備之高紫草寧産生 φ ( shikonin-Pr〇ducing )細胞純系）（Maeda 等人，1983 年）。 h今，已需要形成原生質體以不僅針對細胞選擇而且 針對所培養之植物細胞之電致孔（他你…㈣也⑽）Q (聚乙二醇，PolyethyleneGlycol)介導轉化而分解細胞。 已需要將原生質體製備物用於將單細胞純系與植物組織分 離。然而，通常難以使原生質體再生其正常壁，因爲經分 離之原生質體通常被抑制而不願分裂（Hahne及 H〇ffmann，1984年）。在關於所培養之原生質體的許多研 九中，所產生之第一及主要之多糖（p 〇lysaccharide )為胝 200846465 貝（callose)’其由ι»葡萄呱喃糖組成（Klein等人， 1981 年）。 文傷或承受應力之植物通常將多數此葡聚糖分泌至周 圍原生質空間中（Currier，1957年）。在壁再生之較早階 段期間，纖維素與木葡聚醣（xyl〇glucan)之間的結合並非 與其在完整植物中之結合一樣強（Hayashi等人，1986 年）由於木葡聚耱及纖維素在原生細胞壁中之大分子組織 呈現爲負責強度及延展性（Hayashi及Maclachlan，1984 ❿ 年），所以木葡聚醣以及纖維素在原生質體周圍之沈積對於 其分裂及生長潛力似乎係重要的。此先決條件延誤了原生 質體之分裂，因此增加了用以再生爲具有親本株之細胞特 徵的正常壁的時間。 ‘ 因此，在植物細胞培養中，一進行中之技術挑戰係分 離可自培養物中之植物組織選殖的單個活細胞（B〇urgin， 1983年；Tabata等人，1976年）。在懸浮培養物中，總是 形成非均勻之細胞聚集體，且每一此等聚集體含有多達上 百個細胞。吾人並不清楚此等聚集細胞之間的鏈結，且不 ® 存在確定一可解離細胞聚集體並將其保持爲具有完整細胞 壁之試管内單離細胞之單一酶的報導。 在右干報導中暗示了果膠在細胞黏接特性中之角色， 但此鍵結係在相對更近之時間確定的（Bouton等人，2002 年）。另外，報導了細胞黏接特性之強烈降低（Sterling等 人，2006 年）。 qual-Ι突變體展示了已分離之單根細胞（Bout〇n等人 2002年）。經減少 <果膠含量藉由使用對抗特定果膠抗原 決定基所産生之抗體進行的免疫螢光實驗而得到進一步證 8 200846465 _ « 實。此等觀測暗示編碼酶可被涉及到果膠多糖之合成中且 明確指示之果膠被涉及到植物細胞之黏接特性中。 因此，破壞果膠合成以移除細胞黏接特性可促進細胞 分離.。已報導了使用一次果膠降解酶處理之單細胞分離 (NaiH ’ 2005年）可幫助分離紫杉細胞懸浮培養物中之單 細胞。此等紫杉單離細胞用於篩選具有更高紫杉酚産生水 平之優良純系株。然而，此方法不能用於在培養基中連續 存在酶的情況下保持單懸浮植物細胞。又，使用酶或酶組 • 合之此短脈衝處理的最高單離細胞産量僅爲17.1%至 34·4/〇 (Naill ’ 2005年）。在大米懸浮液中進行連續果膠處 理僅産生0.005%濃度下之優良懸浮聚集體，但並未幫助將 懸浮液保持爲單離細胞（Lee等人，2〇〇4年）。長時間處理 • 酶、果膠酶及纖維素酶之組合歷時8小時以上導致細胞分 • 解（Naill，2005 年）。 已報V 了在大豆細胞之懸浮培養物中細胞分離之提高 性在存在秋水仙鹼之情況下被提高（Umetsu等人，1975 籲 年）。爲達成細胞分離，將生物鹼以比彼等用於産生染色體 多:體之濃度（5-20福）低的濃度而添加 至培養基。儘管如此，秋水仙驗仍抑制植物及動物細胞中 之有絲分，（Lewin，1980年）。秋水仙鹼結合至微管蛋白 且防止微管組合。因此，爲獲得細胞分離，秋水仙鹼濃度 及處理時間應盡可能低。 _ -已將秋水仙鹼生物鹼用於使所培養之動物細胞中之生 長同y其中通常以〇·5 mM添加生物驗，且該等細胞應 在有絲分裂前的幾個小時内便被抑制。儘管該形態發生效 應與動物細胞中之形態發生效應非常相似，但植物細胞可 200846465 在存在0·1 mM之秋水仙鹼的情況下而在生長期間分裂 (Umetsu等人1975年）。細胞生存力在於i mM秋水仙 驗中培養大！懸浮細月包4天後降低。另外，在此等處理中 僅44.8%之細胞係活的，但可保持其分裂而不同於動物細 胞中之情況。 ^研究了在植物試管内培養物中保持單離細胞懸浮液 的微管蛋白解聚合抑制劑之使用或關於寡糖精之使用。該 文獻早在I975铸具有—些關於將秋水⑽餘細胞分 φ 離的貧訊，見下文之參考部分。亦已研究了作爲除草劑之 微管蛋白抑制劑。 優良之轉殖基因事件産生（transgenic ev_ production)及恢復極大地依賴於允用技術之發展。當前用 - 於轉化懸洋液細胞聚集體之適當方法係土壤桿菌屬 ， （Agrobac^eri画）及鬚晶（whisker)介導方法。土壌桿菌 屬方法展示了高達67〜90%之骨架整合速率，從而使其成 爲一非常無效之過程，其中導轉化將不充 當一南生産量過程（high throughput process，HTP )。總是 使用PEG介導方法來論證原生質體及煙草之原生質體（儘 管容易轉化），其並不容易服從於Ητρ轉化過程（歸因於 細胞壁再生之問題）。 該技術關於用於基於單離細胞懸浮培養物之轉化而似 乎並未圮载。存在若干關於基於原生質體之協定的報導， 但此等缺乏細胞壁而不同於如下文所論述之植物細胞之單 離細胞懸浮液。 【發明内容】 本發明提供用以將懸浮細胞聚集體分裂爲具有完整原 10 200846465 生細胞壁之單離細胞的簡單及一致之方法 。以下揭示内容 雨述了被培養於培養基中之懸浮細胞聚集體的細胞分離，

"亥支口養基含有果膠降解酶或包括秋水仙驗之微管蛋白敏取 化合物。 K 本發明亦係關於用於此等目的之化合物的新穎用途。 本發明之一態樣係關於主題、分離細胞之轉化。此等 過程簡化基於單細胞之轉化及選擇過程並將其整合至基因

轉錄及轉質體基因事件産生卫作過程中。本發日^移ς了 技術約束且以一高生産量之方式産生不含標記及均勻表現 之轉，基因株以支援動物健康、生物藥物及特質與作 護平臺之各種需求。 μ 【實施方式】 分離單細胞並使其生長之能力具有許多可能之應 用。舉例而言’本文中所概述之方法可用於改良與用ς 動物健康應用之植物細胞培養物之生産率有關的過程。 因此，本發明之方法可用於提高動物健康及生物藥 物之基於植物細胞之産品的過程效率。本發明之每施例 可幫助篩選轉殖基因細胞株優良純系（諸如在用二最小 化分批至分批變化的袖珍型懸浮細胞培養物起始中以 發展一用於基於單離細胞之轉化系統的標準操作協定 (SOP )從而最小化或消除聚集體中之非轉殖基因細 ，。總之，本發明之態樣可用于動物健康Ητρ (高生産 量過程）篩選及宿主細胞株改良程式。 冋生 本發明亦例證並允許進-步發展基於單離細胞之檢 定及細胞分類過程以基於結合細胞淬滅螢光探針（cell quenching flU0rescent probes )之 RNA 表現來識別穩定表 11 200846465 現之細胞。 此等單離細胞亦用於定位同源重組暫態篩選以代替 當前基於原生質體之暫態系統。舉例而言，黑色墨西哥 甜食（BMS)玉米懸浮液及菜籽油懸浮液可提供用於此 等應用之單一系統。因此，可將（例如）目標性同源重 組用於本發明之實施例中。此類型之技術係（例如）WO 03/080809 A2及對應之公開美國申請案（USPA 20030232410)之主題，其係關於用於目標性重組之鋅指 φ 結構的使用。重組酶在該項技藝中亦爲吾人所知（例如， cre-lox 及 flp-frt) 〇 可使用試管内植物表現系統來産生有用之藥物及動 物健康重組性蛋白質。此等植物表現系統之一關鍵優勢 ， 係其性質上爲真核一擁有類似於哺乳動物細胞之内膜系 . 統及分泌路徑的内膜系統及分泌路徑。因此，複雜蛋白 質通常被有效折疊並經組裝而具有適當之轉譯後修改。 植物産生系統之另一益處係按比例擴大之潛力。在 篩選優良表現之純系及脹大此等同質表現細胞株之後， ® 可使實際上無限量之重組性蛋白質在所含有之綠色組織 中生長或使其在使用發酵或生物反應器系統之工業設施 中按比例擴大。 本文中例證了用於産，生單離細胞之兩種策略。兩種 策略皆成功地起作用以分離活單離細胞。然而，較酶降 解方法，更青睞于秋水仙驗方法以至少在兩種懸浮細胞 類型中獲得大量具有完整細胞壁之單離細胞懸浮液。酶 方法不僅展示了細胞生長之抑制而且展示了更高程度之 死亡率。又，當將活細胞塗於凝膠培養基上而不移除或 12 200846465 漂洗所使=之培養基時，細胞死亡，且並未觀測到群落 生長。建議可使用經由酶降解方法所産生之此等單離: 胞懸浮液的用途，但將需要進一步之最佳化。 、 相反，添加微管蛋白抑制劑（如在此研究中所測試 之秋水仙驗）對於分離植物細胞及選擇單離細胞似乎二 常有用。此方法係簡單的，因爲其僅涉及在繼代培養階 段期間將適之秋水仙驗添加至液態培養基。此將爲 -關鍵性卫具，其對於過程（諸如將具有高活細胞之均 • 勻接種液的袖珍型懸浮培養物起始爲起動細胞）中之一 給定懸浮液衫將具有s大重要性可提高電致 孔、WhiskerSTM及土壌桿菌屬介導轉化的效率。亦可將 此單離細胞製備物用於將重組性蛋白質産生株之優良純 ' 系與轉殖基因懸浮聚集體分離。 ^ 儘管原生質體方法已被用於單細胞分離，但主題秋 水仙驗方法更簡單且更有功效。藉由秋水仙驗方法所獲 得之單離細胞由於存在壁而比原生質體更穩定，且並不 需要細胞壁之再生。該等細胞具有具木葡纖維Ϊ網 路之一正常組合物的壁（Hayashi及Maclachlan，1984 年）。如在其中在存在&水仙㉟之情况下伸長的松籽苗細 胞並不具有異常壁增厚而是被徑向擴大的觀測中所見， 該等細胞在細胞膨脹及分離期間並不產生脈質（It〇h， 1976年）。該等細胞之生長在於不含秋水仙^之培Q養基 中進行繼代培養之後係正常的，而大多數原生質體則被 抑制而不願分裂（4)。然而，經秋水仙鹼培養之細胞可 具有某一量之多倍體，此研究中所使用之秋水仙驗的濃 度（0.1〜1.0 mM)比所需之用於多倍體誘發的濃度（ 13 200846465 mM)低1G Si〇G倍。使用秋水仙驗方法之單離細胞 復比使用原生質體之單離細胞恢復好得多（Hyashi j Yoslnda’ 1988年）。可使用流式細胞儀來進一步測 題細胞以評估多倍體含量及基因體穩定性。另外，择 之倍數性水準可提供經由增加被轉化細胞之複製數 提高重組性蛋白質含量的額外益處。 聚半乳糖醛酸活性展示了大豆懸浮細胞中之細胞分 離的生物功能且被報導爲寡糖精，因爲其展示用於細: • 分離之生物功能。（Albersheim及Darvin，I%5年）。因 此，亦在此等懸浮細胞中測試半乳糖醛酸以達成不具有 任何倍數性改變之細胞分離，以防存在任何在此處^報 導之單離細胞懸浮液中所觀測到的秋水仙鹼誘發倍數性 改雙因此，正進一步评估聚半乳糖搭酸及其他類似之 _ 寡糖精的直接用途以比較藉由破壞細胞黏接特性來分離 細胞的效率。因此，本發明提供經由在該等細胞同時保 持基因體穩定性的同時若干次通過懸浮細胞週期而可再 現及一致之簡單方法。 m w 本文中所例證之一種較佳之化合物係 DAS-PMTI-1。此化合物呈現爲非常有效（在影響培養物 生長方面比秋水仙驗有效大約100〜1000X)。在處理了 7 天之後’在0 · 5 πιΜ》辰度下存在大量細胞死亡，但當在不 存在DAS-PMTI-1之情況下繼代培養此等培養物時，ΡΗ 懸浮細胞在2周後以一較低頻率恢復爲單離細胞。钆實 施進一步之最佳化以取決於用於單細胞分離之較佳應用 (諸如細胞類型及其類似物）來測定此化合物之較隹濃 度。可在藉由破壞果膠合成之主題細胞分離中使用其他 14 200846465 具有類似功能之ΜΉ抑制劑。按照本揭示案，額外ΜΤΙ 抑制劑及其相似物可針對其産生並保持單離細胞之效率 而加以測試及篩選。 DAS-ΡΜΉ-Ι之化學結構（亦通稱爲（4氯基-1，5· 二苯基-1Η-吡唑-3-基氧基）-乙酸乙酯）係如下：

供根據本發明使用之一較佳類之化合物係 ‘ DAS-PMTT-1型化合物。此等化合物可符合上文所提供 之通用結構且包括功能（供根據本發明使用）衍生物及 其相似物。 • 以下爲用於供根據本發明使用之某些已知微管蛋白 抑制劑的通用化學公式。儘管DAS-PMTI-1係一較佳實 施例，但實務上可根據本發明使用任何微管蛋白抑制 劑。在一些較佳之實施例中，結合秋水仙鹼使用以下二 芳基σ比嗤類之一或多個成員：

15 200846465 其中：

X = C02R、CH2CO2R、ch2ch2co2r、（ch2)3co2r、 0CH2C02R、0CH(CH3)C02R、OC(CH3)2C〇2R、 CH2OCH2C02R 、 CH2CH(C02CH2CH3)C02R OCH(C02CH2CH3)C02R Y = CN、a、Br、F、N02

Ar!=未經取代之苯基、未經取代之吨π定、1-3取代 之苯基、1-3取代之吡啶（經鹵素或CN取代）

Ah二未經取代之笨基、未經取代之吡啶、1-3取代 之苯基、1-3取代之吡啶（經[素或CN取代） R = Η或1 -5破線型或分枝酯 因此，已使用微管抑制劑而産生了單雞細胞植物懸 浮培養物’且可將該等培養物保持於培養物中歷時至少 個繼代培養週期。此等單離細胞懸浮液係獨特的，因 爲其具有一完整細胞壁，但其係彼此分離而存在的。 一锝殖」植物、植物細胞及其類似物係（ 非另外規定）一整個植物、植物細胞、植物細胞培養物 植物細胞株、植物組織培養物、低等植物、單子葉植 始:认養物、雙子葉植物細胞培養物或獲自一經轉化 ί Γ田:!：或原生質體或其類似物)的其之後代，該 含有由實驗技術引入之並非原始存在 =物貝之自然非轉瘦基因植物細胞中的外來dna。 ::殖基因植物」及「經轉化之植 技蟄中被用作同義術語以定義Da从十八 子之植物。轉殖美因· 3有卜來dna 植物μ基因植物可經穩定化 16 200846465 物之基因體DNA内起作用或被併入該植物之基因體 DNA中❸卜來DNA，5iU—已藉由基於病毒之向量而被 轉化且暫態表現外來DNA的轉殖基因植物。 「經分離」及「經純化」暗指「人手（handofman)」 且可應用於聚核苷酸及蛋白質。經選殖之聚核苷酸係（例 如）經分離之聚核苷酸。 轉化方法。已針對核及質體轉化而使用用於核轉化 之土壤桿菌屬及聚乙二醇（PEG)及用於質體轉化之基 • 因杈射擊來測試此等單離細胞。在核轉化嘗試中，已論 證了質體DNA之傳遞及黃色螢光蛋白質暫態表現。細胞 .在質體轉化中得以恢復，且經由PCR分析而展示了穩定 之轉化。轉質體基因癒合組織分離被凝聚在一起且針對 可迤軚圮（經由酶聯免疫吸附試驗（ELISA)之叩犯基因 - 表現）而加以分析。 可將本文中所描述之轉化方法應用於動物健康過 私。然而，經由新穎傳遞方法（包括奈米粒子傳遞）之 _ 基:單離細胞的轉化亦可提供用於轉化除用於重組性蛋 白質産生之細胞類型之宿主外的作物植物的獨特方法。 經由PEG及/或電致孔方法之主題單離細胞轉化的 龟展使得具有完整壁之單離細胞與細菌/哺乳動物細胞 系統一樣具有服從性，且亦可用於用於彼等細胞類塑之 而生產量轉化系統中。 轉化皁離細胞之能力具有許多可能之應用。舉例而 δ，本文中所概述之方法可用於改良與用於動物健康應 用之植物細胞培養物之生産率有關的過程。再次，本過 程用於提高動物健康及生物藥物之基於植物細胞産品的 17 200846465 過程效率。本過程亦可幫助篩選轉殖基因細胞株之優良 純系。可將此等應用用於用以最小化分批至分批表.現變 化之袖珍型細胞培養物起始，及將其用於發展—S〇p以 最小化或消除非轉殖基因細胞或聚集體中多個事件之存 在。 如發明背景部分中所論述，土壤桿菌屬方法非常無 效，而whiskers™介導轉化將不充當一高生産量過 程。PEG介導方法被用於原生質體。儘管煙草原生質體 φ 容易轉化，但其由於細胞壁再生問題而不容易服從於 HTP轉化過程。 相反，本發明提供一完整細胞壁。PEG介導過程首 先報導了具有完整細胞壁之單離細胞。本方法亦高度有 • 效。又，此過程藉由使用用於轉染之片段純化質體而消 , 除了骨架元整性。一經由諸如螢光活化細胞分類 (Fluorescent Activated Cell Sorting，FACS )之過程的涉 及單離植物細胞的快速轉化協定對於以降低之成本、資 癱 源及時刻表來小型化及自動化用以篩選合適事件的過稃 而言係理想的。此可藉由經由細胞分類器篩選I轉化之 細胞而急劇改良當前之癒合組織或懸浮聚集體選擇過趕 並經由工業研究或生産管線來測定供進一步提高之同質 表現之優良事件。 因此，本過程爲新穎生物處理研究及發展，例如， 針對動物健康需求之HTP篩選及宿主細胞株改良，而提 供了基本基礎。 本發明允許進一步發展基於單離細胞之檢定及細胞 分類過程以基於結合細胞淬滅螢光探針之RNA表現來 18 200846465 識別穩定表現細胞。 此等單離細胞亦用於暫態及/或穩定篩選相關基因 (GOI)以用於特性及作物保護平臺。 本文中所提到或引用之所有專利、專利申請案、臨 時申請案及公開案的全文以引用之方式併入本文中而達 到其並非與此說明書之明確教示不一致那樣的程度。 實例1-物質及方法。 ⑩ 自日本煙草獲得BY2懸浮液培養細胞且在一 7天週 期中將其保持於LSBY2培養基中。自起始於DAS處之 癒合組織起始笑陀羅懸浮液及Pettite Havana煙草懸浮 液’且自來自IL之UIUC的教授Jack Widholm獲取作爲 樣本之Xanthi懸浮液。獲自華盛頓州大學之在7天週期 、 中被保持於NT1B培養基中的JT-NT1懸浮細胞僅被用於 果膠降解酶研究以將細胞分離爲單離細胞。在25〜28°C 下在黑暗中將該等細胞培養於位於15〇 rpm下之回轉式 φ 震盪器上的震盪燒瓶中。自Fluka、DAS-ΡΜΊΊ-Ι (獲自 DAS CRS)獲得秋水仙鹼（Martin等人，2001年；Smith 等人’ 2001年），且果膠降解酶（果膠酶γ及果膠酶） 係來自Sigma。將儲備濃度之用於此調查中的兩種微管 蛋白聚合抑制劑溶解於DMSO中以製備0·5 Μ之儲備溶 液。針對果膠酶（pectinase)及果石定離析酶（pectolyase) 所測試之濃度係在0.0005〇/。至0.005%之範圍中。 舉例而言，煙草懸浮細胞株NT-1及BY-2適合用於 本發明之實踐。可購得ΒΎ-2細胞且其可（例如）根據 Nagata 等人（Nagata，T·、Nemoto，Y·及 Hasezawa，S· 19 200846465 [1992]，Tobacco BY_2 cell line as the “HeLa” cell in the cell biology of higher plants 〇 Int· Rev· CytoL 132: 1-30) 來使用。NT-1細胞最初係自煙草嫩黃2發展的。NT-1 細胞株被廣泛使用且不難獲得；但是，任何煙草懸浮細 胞株均與本發明之實踐一致。值得注意的是，NT-1細胞 株之起源並不清楚。此外，細胞株似乎可變化且傾向於 對培養條件起反應而改變。適合用於下文之實例中的 NT-1細胞獲自入藏登記號爲ATCC第74840號之美國菌 _ 種保存中心。亦見美國專利第6，140,075號。 實例2-顯微鏡觀測 藉由光顯微法（具有Nomarski及暗場光學）來觀測 細胞膨服及分離。藉由使用一血球計來計數球形細胞及 早離細胞以分別測定細胞膨服及分離之程度。藉由以^ % (wt/vol)三氧化鉻處理歷時16個小聘並計數細胞來測 定聚集體中之細胞數目（Henshaw等人，1966年）。夢 由使用一螢光顯微鏡（Zeiss照相顯微鏡）而以榮光素二 乙酸酯（fluorescein diacetate，FDA )及峨化丙口定 (propidium iodide，PI )染色細胞（Y〇k〇yama 等人，！ 997 年）來測定細胞生存力。爲測定此單離細胞培養物中之 細胞壁的存在，使用光學增亮劑。在此研究中使用與自 Sigma之i弓螢光素（其爲一用於纖維素之特定榮光染 料），且藉由螢光顯微法（Zeiss照相顯微鏡）來觀測^ 維素·鈣螢光素錯合。將鈣螢光素（Mo.t St· L〇uis的 Sigma化學公司）製備爲PBS緩衝液中之〇·1% (wt/v〇1) 溶液並在室溫下在黑暗中對其加以儲存（Kw〇k等人， 20 200846465 2003年）。在使用之前，以i5,〇〇〇 g離心I弓螢光素染料 歷日守2分鐘以移除沈殿物。將一滴或兩滴詞螢光素溶液 添加至經分離之細胞。在室溫下2或3分鐘之後，用水 漂洗細胞懸浮液並在室溫下在TBS(pH7 2)中用〇1%伊 凡思藍（Sigma;E_2129)來對比染色該細 u鐘且在波長爲395至化腸（觀測光 UV祕鏡下檢_細歸雜。細胞Μ 青綠色擴圓光環。 … 結果 實例3-培養基中之連續果膠酶及果魏析酶處理的 果。j τ- Ν Τ1懸浮液確實對果膠理t f析酶的效 m懸浮液對果蝴斤酶處 里= 也起反應，且 的反應好。然而，存在如由活體對其他酶對應物 性生長所顯現之細胞死亡率。將二^類型之抑制 接種液量增加高達12倍以呈 触也代坧養階段細胞之 將pH及BY2細胞培養於具有^ ^胞，合理産量。可 、7天。在低濃度果破離析酶:: 連、，只培養此等細胞呈現爲有宝 束们活!·生早位）中 (靜止期下之起動接種液量）έ，接種液的量爲6 ml 新鮮培養基中時，培養到第6同酶而被培養於50ml 細胞。當在培養了 6天之後用^細胞産生較高之單離 此等細胞展示出更高量之活I及？1進行測試時， 圖）。懸浮培養物m及第二 免至肀文到急劇影響，且在 21 200846465 含有相同酶之培養基中繼代培養細胞呈現爲有害的。建 議可在培養物中重新處理該等細胞高達7天之最大持續 時間且接著應將此等細胞轉移至無酶之培養基以恢復生 長。最多可將此方法用於在異質聚集體中篩選優良之轉 殖基因純系或開始具有均勻細胞量之高生産量懸浮培 養0 第一圖：在被繼代培養於培養基中歷時7天的連續 果碇離析酶處理中具有完整細胞壁的JTNT1懸浮細胞之 單細胞分離。 A-正常BY2懸浮液；B-與A相同，但爲經I2KI染 色之細胞以展示細胞之聚集；C及D-在6天連續酶處理 後的分離細胞；E及F-使用I2KI染色及不使用I2KI染 色之分離單細胞。注意正常細胞分裂（F)。 第二圖：BY2細胞在連續果石定離析酶處理後6天的 生存力（細胞經FDA及Π處理）及單離細胞之産量。 A : BY2細胞聚集體；b :在培養基中之果碇離析酶 中之1 ml接種液中歷時5天的BY2 ; C ··培養基中具有 酶之6 ml接種液歷時5天；D、e及F : C之顯微鏡視野 快照；G :具有在BAP及12%蔗糖中發展之BY2細胞變 異體的對照塊；H及I爲自G之5天連續酶處理的單離 細胞。細胞在FDA及PI中被染色。注意在PI染色紅色 中之死亡細胞。 貫例4_秋水仙鹼對BY2、NT卜Petite Havana (PH) 及 Xanthi ( Xan )以及曼陀羅（Weed，jm )懸浮 細胞之生長的影響 〜:' 22 200846465 在培養了 7天後，BY2、Xan及JM細胞之數目對％ 度爲0·5 mM及1 mM之秋水仙鹼起反應（第三圖、第I 圖及第五圖）。然而，在1 mMBY2懸浮細胞及JM細月々 中看到較高量之單懸浮細胞。重要的是注意，即使在〇 = mM秋水仙驗中JM細胞生長仍受到急劇影響，且即使在 相同培養基中生長歷時額外周後生長仍無法恢復。此_ 示在JM細胞中細胞分裂受到秋水仙驗的抑制且需要^ 一步测试更低濃度以最佳化細胞分離而不會降低纟立養物 • 密度或生長。有趣的是，未觀測到BY2懸浮細胞之生香 抑制，該等BY2懸浮細胞可在存在lmM秋水仙驗的怜 況下連續生長至少14天。在第三天首先觀測到細胞^ 脹’且當在BY2懸浮細胞中繼續培養時，該等細胞發展 - 爲球形形狀。由於該等球形形狀細胞逐漸自聚集體釋 ^ 放，所以推測由細胞膨脹來實現細胞分離。在含有丨瓜从 秋水仙驗之培養基中在7天後存在與對照培養物中大約 相等量之BY2細胞。當在ImM秋水仙鹼中培養了 7天 之細胞被繼代培養至一不含秋水仙鹼之培養基時，生長 • 爲聚集體之能力不會完全恢復，實情爲，看到大約9〇^ 之懸浮細胞爲單個完整細胞。在於含有〇·5 mM秋水仙 鹼之培養基中測試的所有其他細胞懸浮液之細胞懸浮聚 集體中亦部分發生細胞膨脹及分離。存在在J1VNfTl及 JM懸浮細胞中所觀測到之抑制性細胞生長。Ντι懸浮細 胞記錄了在1 mM秋水仙素中生長降低幾乎。 在此等細胞中觀測到較大隔離細胞，其類似於 qual-Ι果膠突變體中所報導之分離表皮根細胞的彼等細 胞（Bouton ’ 2002年）。在所有使用^疆^測試 23 200846465 之，，，，液類型中觀測到具有普遍之球形形狀的細胞 的部分分離。然而，在0·5 mM濃度之經DAS-ΡΜΉ-Ι 處理的懸洋液中細胞生長受到非常顯著的影響。可實施 進二步之貫驗以最佳化使用此化合物之細胞分離的條件 小化細胞抑制性生長。如由FDA及PI染料測試所 論證，在所測試之Βγ2及JM細胞懸浮液中存在較高水 準之細胞生存力。該等細胞非常圓且在許多細胞中展示 顯似於彖之龙出物，其指示活性細胞可能在細胞分裂 •=前的=胞壁擴張。被分離之細胞較大、膨脹且具有一 爲京生貝體之典型形狀的球形形狀。使用㉟螢光素染料 來測定完整細胞壁之存在或缺乏。第四圖展示了細胞壁 在圓Ϊ細胞周圍之明確存在。此等細胞在顯微鏡之 …暗場水光為下的觀測展示了細胞周圍之較厚細胞壁（第 • 一，义c)。此等單離細胞在震盪培養物中具有彈性， 因爲由於如在活體染料測試中所見不存在果膠及存在較 大、、、田月l而使得不存在死亡細胞（第五圖）。如在此盤中所 m ^、θ可看見非常高之百分數的活健康細胞。因此，可在 辰盪k養物中或在微孔板中將此等細胞用作具有精確數 目之細胞的接種液。 弟/固在來自B Y2及Xanthi煙草懸浮液之細胞聚 尔體懸浮液的培養基中自7天秋水仙鹼處理之單離細胞 懸浮液誘發。 A ’正常BY2懸浮聚集體（經鈣螢光素染色）；b : 在.I mM秋水仙鹼中歷時7天的單離細胞bY2懸浮液； C ·.與B相同，但被放大以展示具有完整壁之單離細胞； D · Xanthi之懸浮聚集體；e :在〇.5 mM秋水仙鹼中處 24 200846465 理歷時7天之Xanthi懸浮聚集體。注意，〇·5 mM中之單 離細胞的部分釋放；以及F :在1 mM秋水仙鹼中xamhi 之分離單離細胞。 第四圖：在秋水仙鹼處理中自BY2及Xanthi煙草懸 浮聚集體具有完整細胞壁之單離細胞釋放； A:正常BY2懸浮聚集體；B: lmM秋水仙鹼中歷 時7天的單離細胞BY2懸浮液；C及D :在移除秋水仙 鹼之後細胞恢復回至聚集體（在以1個秋水仙鹼培養週 φ 期繼代培養歷時4天後）；e : Xanthi之懸浮聚集體；卩： 在1 mM秋水仙鹼中處理了 7天的Xanthi懸浮聚集體。 注意BY2及Xanthi培養物中之單離細胞釋放及如在存在 光學增亮劑鈣螢光素之情況下完整細胞壁之存在。（所有 - 樣本均以〇·1%鈣螢光素加以處理且在Leica螢光觀測 ▲ 儀器下進行檢驗）。 第五圖：在秋水仙驗處理中自BY2變異體煙草（習 慣於在EP 12%蔗糖培養基中）及曼陀羅懸浮聚集體具有 鲁 完整單離細胞壁之單離活細胞釋放。 A :正常BY2-V懸浮聚集體；B :未經處理之聚集 體的更近景；C、D及E ··在lmlV[秋水仙驗中歷時7天 的早離細胞BY2懸浮液誘發（在ΐ〇χ、20X及40X放大 率下的細胞）；F :在lmM秋水仙驗處理中歷時7天的 曼陀羅懸浮液中之單離細胞誘發。所有樣本均以FDA及 Π加以處理且在Leica螢光檢查儀下進行檢驗。注意在 FDA染色中此處看見細胞之高生存力且在pi中具有非 常少之染有紅色的細胞。 25 200846465 實例5-單離細胞之産生及DAS-PMTI-l在含有作爲 單碳源之甘油的培養基中的影響 本實例提供關於新穎甘油生長培養基及 DAS-PMTI-1低濃度效果以及生長特徵的另一論述。本 結果非常顯著，因爲在文獻中存在甘油緩和秋水仙驗破 壞大豆微管之效果的先前報道；因此，該技術教示反對 在用於本應用之培養基中使用甘油。見（例如）Hayashi 及 Yoshida 之 85 PNAS 2618-22 ( 1988)。另外，本甘油 鲁 資料對於植物細胞而言係新的，且先前並未報導此等結 果。將3°/〇甘油用作唯一之碳源，三種不同基因型煙草快 速培養物已成功生長歷時若干個月。 此貫例亦提供一描繪在兩種不同濃度之 • DAS-PMTI-1中之培養行爲的生長曲線圖，且將其與虚 - 热處理相比較。 若干類別之破壞微管的化合物産生單離細胞。該等 化合物包括以以下類別而被分類之微管破裂劑或抑制劑 φ ( microtubule disruptors or inhibitors )( α·及 β·微管蛋白 化合物）：（〇二硝基苯胺（秋水仙鹼、黃草消、氟 ，靈^氯樂靈）；及（ii) N_胺基曱酸苯酯，諸如苯甲醯 胺、手草特、鱗醯胺、甲基胺草磷（M〇rej〇hn及F〇skett， 19=年，AkaShl等人，1988年）以及抗真菌劑、benzamide j 笨甲酿胺）zanlamide ( Young，、1991 年）；（iii)抗癌 藥、太平洋紫杉醇（Morejohn&F〇skett ，1986 年）、長 ^新鹼、長春鹼；及（iv)破壞微管及/或壁特性兩者之 ，化合物（諸如纖維素合成抑制劑），且亦針對細胞骨 讀戰(諸如缺㈣素）産生料有或具有較低微 26 200846465

An#一的能力而對其加以測試。皮微管及有 、、糸刀展微g具有不同敏感性，且來自上文所列舉之不同 類=或來自^中—個類別（但具有選擇性）之化合物的 組合破壞該等管而達到細胞分裂不受影響但細胞黏接特 性將，充分壞以達成並保持具有較低或不具有基因體 不穩離細胞階段中的細胞那樣的程度。 檢,驗微定抑制劑（Microtubule inhibitors，MTI)對 懸>于培養物中之煙草細胞生長的影響。將7天靜止期細 φ 胞（1 ml)轉移至含有不同濃度（25至ΙΟΟΟηΜ)之ΜΉ 的2)0 ml震靈燒瓶（Bokros等人，1993年）中的培養 基（50 ml)’並在25。C下在黑暗中使該等細胞在培養物 中生長歷時7天。對照燒瓶及含、有ΜΉ之燒瓶兩者均含 - 有最終濃度爲〇·5〜0.1% ( v/v)之DMSO。倘若用3%甘 . 油來代替碳源’則在用於BY2細胞之EP12培養基及用 於BTI-NT1細胞之NT1b培養基中評估此等化學物之生 長。將此等細胞之反應與相同培養基組合物（但具有作 爲石反源之3 /〇蔗糖）相比較。使用甘油培養基，因爲吾人 _ 已知甘油爲微管穩定劑（microtubule stabilizers )，且習 慣於在3%甘油中之煙草細胞並未展示處於應力下之酚 醛塑料。 以1天爲時間間隔，藉由在配衡微量離心管中進行 短暫雜心來沈澱一式三份細胞樣本（0.5 ml)，且測定新 鮮重量。第六圖中所呈現之結果展示在2天抑制期之 後，對照細胞快速生長歷時4天且在第6天進入靜止期。 使用25 nM DAS-PMTI-1而生長之煙草細胞展示類似於 對照培養物之生長動力學的生長動力學。然而，此等培 27 200846465 養物之新鮮重量在靜止期期間稍大於對照培養物，此暗 示使用50 nM DAS_PMH-1可促進生長。當在螢光檢查 儀下檢驗經FDA及碘化丙啶處理之細胞時，使用0.5〜1·〇 mM DAS-PMTI-1而生長之細胞顯示在3天培養起始内 完全抑制且細胞死亡。該資料論證待抑制之煙草細胞生 長接近臨限值50 nM，但超過100 nM濃度會導致有絲分 裂抑制且細胞死亡。 不同于秋水仙鹼，二硝基苯胺用於産生單離細胞之 φ 有效性較低，其中0.25〜0.5 mM之濃度係有效的， DAS-PMTI-1在低至5〜25 nM的濃度下係非常有效的（即 使在存在作爲用於N T1與B Y 2細胞兩者之總碳源的甘油 的情況下亦如此）。25 nM濃度範圍不僅在釋放單離細胞 - 方面係有效的，而且在在10天之週期中不降低細胞之生 、 長速率方面亦係非常有效的（第六圖）。實際上，由於此 等單離細胞經歷膨脹之事實，所以在生長之靜止期時存 在生物質量之略微提高。然而，顯微鏡觀測並未展示在 此寻早離細胞中存在微核。 ® 第六圖：DAS_PM1TI-1對NT1煙草細胞生長的影響。 在NT1B培養基（具有作爲專用碳源之3%甘油）中缺乏 或存在25或50nMDAS-PMTI-l的情況下使細胞生長。 所有新鮮重量值表示來自複製樣本之平均值土 0.18。 •在共焦顯微鏡下分析經由DAS-PMTM所産生之細 胞的單離細胞狀態，且由於並未發現該等細胞被附著， 所以明確證實該等細胞爲單離細胞。 實例6-轉殖基因懸浮株之解迴旋及純系株産生 28 200846465 煙草懸浮液通常在聚集體或小型群集中含有細胞， 且其高度異質。培養物中之細胞在遺傳上可相同（同質 群體）或可展示某種遺傳變異（異質群體）。將獲自單個 親本細胞之一同質細胞群體稱爲純系。因此，一純系群 體内之所有細胞在遺傳上均相同且就細胞特徵而言高度 同質。將BY2及NT1煙草細胞懸浮液常規用作許多實驗 室中之模型系統。 此等細胞不難在移除細胞壁之後直接經由粒子轟擊 | 或使用根瘤土壤桿菌屬進行共培養而被轉化（An，1985 年；Klein 等人，1988 年；Rempel 及 Nelson，1995 年）。 儘管在許多實驗室中常規執行根瘤土壤桿菌屬介導 BY-2轉化，但吾人發現獲得轉殖基因癒合組織之效率在 - 實驗之間變化且主要取決於BY-2細胞培養物之品質。Μ _ 及早期G1期中之同步、ΒΥ-2細胞對於穩定之根瘤土壤 桿菌屬介導轉化的敏感性比駐留於G2中之細胞大10 倍。另外，原構性表現virG基因（van der Fits等人，2000 年）之土壤桿菌屬菌株LBA4404在産生轉殖基因癒合組 • 織方面的有效性大2倍至5倍。通常，可自與此土壤桿 菌屬菌株共培養之4 mL BY-2細胞獲得大約500個轉殖 基因癒合組織，從而允許執行表型篩選程式。然而，轉 化懸浮株之叢集或聚集體似乎具有有二型或二型以上花 的多個轉殖基因事件。結果，存在自一個分批培養物至 另一分批培養物之不一致的表現水準。利用單離細胞方 法以解迴旋叢集中之細胞嵌合混合物並將其分離爲個別 細胞以識別純系事件。自嵌合轉殖基因懸浮液NT1煙草 株産生單離細胞（GAD1762-034 )，該等煙草株轉化有 29 200846465 PAT可選標記基因（第七圖及第八A圖至第八C圖）。 第七圖：自DAS GAD1762-034懸浮株之單離細胞及 群落産生 第八A圖至第八C圖：來自DASGAD1762-034單離 細胞之群落的2〜6周生長。 隨機挑選大約20個離散群落並進一步使其在一新 鮮之選擇培養基上成大塊。自此等群落産生懸浮株並經 由每一者7天之6個繼代培養週期而獲得快速生長之 φ 株。此等群落之生物質量産生跨越此等株而相當均勻且 前進19個株以進行進一步之蛋白質分析。 在4個繼代培養週期中在7天及13天時收集樣本並 實施表現分析。繪製所獲得之表現資料（第九圖）。 * 自資料分析顯而易見，當與對照懸浮聚集體株# 34 - 相比較時，可獲得在若干繼代培養週期中具有緊密表現 之若干純系株。另外，子株17在表現水準方面勝過對照 株，此指示此過程將挑選群集中之純系優良株且進一步 I 重整之解迴旋可幫助獲得均勻表現之優良株。 實例7-單離細胞懸浮培養物之轉化 物質及方法 植物細胞物質之製備：在轉化前之3至4天，藉由 將2 ml NT1或BY2培養物轉移至250 mL燒瓶中之40 ml NT1B或LSBY2培養基中而將1周懸浮培養物繼代培養 、至新鮮培養基。使用如上文所描述之一定濃度的微管抑 制劑（MTI)以産生單離細胞。在MTI處理後的4天或 30 200846465 7天收集單離細胞。 第十圖··使用DAS-PMTM、DAS專有甲基吲哚衍 生物及一有效之微管抑制劑除草劑而被分離之；BY2細胞 的單離細胞。使用一 20〜5〇 nM濃度以在5天繼代培養之 後産生單離細胞。注意該等細胞爲單離細胞（_對細胞 具有重疊邊緣），且在附著至一共焦成像系統之差分幹擾 對比度檢查儀下拍攝圖片。 當經由Beckman流式細胞儀來處理ΒΥ2單離細胞 φ 時，每ml培養基活細胞中存在658250個活細胞，其中 平均直徑爲1〇·43 um且體積爲593.8 um3。 土壤♦干囷屬製備·在-80°C下將含有YFP基因 (PDAB4613)構築體之根瘤土壤桿菌屬菌株LBA44〇4 儲存於50%甘油中。使用含有表現載體之儲備培養物的 ； 一 20〜5004等分試樣以直接藉由將20〜500 μΐ添加至30 ml YEP液態培養基（含有1〇 g/L酵母萃取物、1〇 g/L蛋 白脒、5 g/LNaCn、10 g/L蔗糖及5〇 mg/L觀黴素）來起 始一液態培養物。在於28 °C及150〜2〇〇 rpm下在黑暗 中培養歷時18〜20個小時之後直至培養物達到密度爲大 約 1.5 0D600。 用於核轉化之單離細胞的共培養：在轉化畸，將1〇 ml 土壤桿菌屬懸浮液添加至一含有4〇 ml 4天或7天煙 草單離細胞懸浮液的燒瓶（在培養基中經預先清洗以ς 除任何ΜΤΙ)並藉由使用l〇ml大口徑吸管來上下分注5 次而將其混合。接著以250 μ1等分試樣將均勻懸浮液轉 移至以封口膜包覆之24孔板中並在25 % τ m h 震動地培養歷時3天。藉由將大約5()卩丨懸浮液之一等分 31 200846465 試樣置放於顯微鏡載片上並檢查黃色螢光蛋白質（YFP) 暫態表現而測試該等分試樣。 用於核轉化之單離細胞的PEG / DNA處理：在繼代 培養起始時用NT1B培養基中之ImM最終濃度之秋水 仙鹼（Fluka)來處理JT-NT1細胞聚集體懸浮液並在回 轉式震盪器上以125 rpm加以培養歷時7天。在25 °C 下培養該等懸浮液。在第7天結束時，自燒瓶收集到1 mi (〇·6 〇D6Q())單離細胞並將該等單離細胞分配至一 14 ml _ 無菌管中。添加10 ml MaMg培養基（針對組合物，見 下表1)並以大約1000RPM而旋轉5分鐘。

MaMg培養基 培養基之總體積 儲備濃度 100 ml MES ——-— 0.1 g 甘露醇 - ~~-------- 7.3 g MgCl2 ---------- 15mM 1.5 ml PH 5.5 表1· MaMg培養基組合物（PEG介導轉化) 傾析液體並使細胞在3〇〇 μΐ MaMg中重新懸浮且添 加大約50 μ§之質體dna。向此單離細胞及DNA混合 物緩慢添加 300 μΐ PEG 3350 ( 40% PEG 3350 w/v、0.4Μ :路醇、0·1Μ Ca (N〇3)2pH值最終爲5〜6)並溫和地混 口其°在室溫下培養單離細胞、DNA及PEG混合物歷時 32 200846465 1000 RPM而旋1 專加5 =1 W5 (洗《條培養基）並以大約 體培養基（NT1B) 析液體並添加2ml驗性液 可因此將若干個複f 口=7=_於·^孔板中。 α 1車才私至24孔板之孔中。藉由將 一丄古：：：、田胞懸浮液置於一顯微鏡載片上且接著在 ’、 t田之濾光鏡的螢光檢查儀下對其進行檢驗而 在20〜24個小日守檢定YFp暫態表現（激發5⑽/2〇胆、 鉻優、發射535/ 30 nm)。

'用於貝體轉化之單離細胞的基因槍射擊：在Epi2% 培養基中之20〜50 nM das-pmth中處理Βγ2細胞， 以增加質體數目且其中由於添加BAp而不具有2,4_D以 增加貝體在7天内之大小。在第七天結束時，收集單離 細胞並將2 ml懸浮液轉移至濾紙。使細胞保持於ls by2 凝膠培養基上歷時2個小時以用於乾燥。自缺乏2,4-D 之單離細胞株射擊五個板且BAP處理每一細胞株。用5〇 nM DAS-PMTI-1處理此等細胞歷時2周且在第三周時呈 位於20腿DAS-PMTL4中。該等細胞優良且相對健康。 使用基因搶遵循標準協定而在〇·6 μιη金粒子上用 PDAB3969來射擊該等細胞（BioRad)。在於無選擇劑之 培養基上恢復了 2天之後，將其轉移至LS-BY2 12%藉糖 + 100 mg/L卡那黴素選擇物。 結果及論述

核轉化成果：對PEG (第十一圖）及土壤桿菌屬轉 化（第三圖）的嘗試明確地展示彼此類似之表現頻率。 在所分析之一 50μ1細胞等分試樣中’存在2〜3個YFP 33 200846465 表現細胞。因此，在每10970個單離細胞之分批中存在 一個轉化細胞，此指示該過程可能並非非常有效。可能 該等細胞並未被移除剩餘秋水仙鹼且在一；平行實驗 中，該等細胞以一更高之群落頻率而被快速且健康地復 活至群落中。此指示一洗滌步驟增加了最佳化實驗中之 轉化頻率。若僅一個事件將挑選自一單離細胞，則在兩 種此等轉化方法中在一微孔板中之每ml單離細胞中將 存在至少50〜60個經轉化細胞。然而，可進一步最佳化 用於轉化之條件，且可分離額外、經穩定轉化之群落。 ^ 第十一圖：在72小時之PEG處理後的YFP表現 (UbilO-YFP質體）。在焦點平面中之其中一個小型子系 (分裂）細胞展示了指示表現可爲穩定之GFP表現。 - 質體轉化：在培養了 6周之後，在選擇培養基上識 . 別5個活躍生長之群落。然而，對照未經處理之細胞在 100 mg/L卡那黴素選擇物中被殺死（第十二圖）。取樣活 躍生長之群落並藉由PCR對其加以分析以測定質體之完 整性。5個群落中有2個群落展示指示轉基因被整合於 • 質體中的明顯之PCR産物。 第十二圖：左：由100 mg/L卡那黴素抑制之未經處 理之對照組織右：在選擇培養基上生長之單離細胞獲得 推定轉質體基因分離。 實施進一步實驗以進一步發展高生産量之核及質體 轉化協定。 實施進一步之轉化實驗以最佳化該協定而針對新生 物處理研究及發展來進一步發展一 HTP及一不含骨架 (使用片段純化質體）之轉化協定。 34 200846465 貫例8-懸浮培養物在甘油培養基中之習慣性 材料及方法 ' 用於同步之培養物調節。爲改㈣步，在不繼代與 養之情況下繼繽所有培養物歷時2周，接著將i如舊^ 養物稀釋於50 ml新鮮培養基中。在彼繼代培養後的2 天計數未分化但分裂之細胞（觀測到高達4〇%的無絲分 裂指數），而在培養了 10天之後觀測到分化之未&裂二 胞。將0.5 ml懸浮液之樣本用於全埋程式。 細胞培養 在LSGS-BY2培養基中培養長期嫩黃2(ΒΥ2)(附 件I)，且在LSG-BY-2培養基（附件π)或g-NTI培 養基（附件in)中培養NT1細胞及短期Petite Havana (PHL )煙草懸浮細胞。所有培養基均具有作爲針對生 長培養基中之蔗糖的替代性碳源之甘油（除規則之BY2 培養物之狀況外，其中除甘油之外該培養基具有1%嚴 糖）。在250 ml錐形瓶中以每週時間間隔稀釋懸浮培養 物（5G ml新鮮培養基中爲1 ml售培養物）。在^ — 100 rpm 下之旋轉震盪器上攪拌細胞懸浮液並將其保持於25。0 下及黑暗中。Vos 等人之「Microtubules become more dynamic but not shorter during preprophase band formation: a possible 4Search-and-Capture’ mechanism for microtubule translocation」(Cell Motil Cytoskeleton 57:246—258, 2004) 〇 35 200846465 在甘油培養基中生長之細胞培養物的特徵 當與糖生長對照培養物相比較時，所有培養物之一 般生長均被降低。然而，當增加培養物接種液之初始含 量B寸’獲得正常生長速率。細胞係健康的且可繼續使其 在培養物中生長多達2周而無糖對照培養物中所觀剛^ 之細胞的典型之褐化。在甘油培養物中生長之細胞在與 其糖培養對應物相比較時具有懸浮液單位中之細胞的更 高聚集。將此等細胞用於用以測試MTI化合物的實驗中 ⑩ 以破壞所聚集之子單元的細胞黏接特性，因爲甘油可緩 和膜之穩定性。 附件I。 LSGS-BY2培養基由Murashige及Skoog之巨鹽及 微鹽（Murashige及Skoog，1962年）組成，其補充有 30 ml 甘油（v\v)及 1〇 g 嚴糖（w/v)、100 mg/1 肌醇、 200 mg/1 KH2P04、1 mg/1 硫胺及 0.2 pg/l 2, 4-二氯苯氧 基乙酸。在高壓蒸汽滅菌之前將該培養基調整爲pH 5.8。 附件II。 LSGS-BY2培養基由Murashige及Skoog之巨鹽及 微鹽（Murashige及Skoog，1962年）組成，其補充有 30 ml 甘油（v\v)、100 mg/1 肌醇、200 mg/1 KH2P04、1 mg/1硫胺及0.2 pg/l 2, 4-二氯苯氧基乙酸。在高壓蒸汽 滅菌之前將該培養基調整爲pH 5.8。 附件III 〇 G-NT1培養基由Murashige及Skoog之巨鹽及微鹽 (Murashige 及 Skoog，1962 年）組成，其補充有 30 ml 36 200846465 甘油（v\v)、100 mg/l 肌醇、180 mg/l KH2P04、1 mg/l 硫胺及2 mg/1 2, 4-二氯苯氧基乙酸。在高壓蒸汽滅菌之 前將該培養基調整爲pH 5.8。 實例9-自雙子葉植物（煙草（BY2、NT1、Petite Havana、Xanthi))、胡蘿蔔（Daucus carota L· ssp· sativus cvSativa)之懸浮液培養物的單離細胞産生 胡蘿蔔懸浮培養物 已自試管内保持之 Daucus carota L· ssp. sativus cv φ Satlva植物誘導胡蘿蔔癒合組織培養物。在半固態培養 基上培養經分離之葉柄外植體 (Mashayekhi-Nezamabadi，2000 年）。藉由將 ι·5 ml LSBY2培養基（附件I)中之5〇 mg易碎癒合組織轉移 • 于24微孔板中而自該癒合組織起始懸浮培養物。接著將 • 最快生長之懸浮液轉移至燒瓶而使得35 ml LSBY2液態 培養基中具有1 ml懸浮液。在一 7天繼代培養週期中將 培養物保持於漫射光中。此等培養物係可再生的且該等 懸浮液單元呈塊狀而具有緊密排列之單元。當在繼代培 養之懸洋液起始階段用0.5 mV[至1 mM秋水仙鹼或用 25 nM 至 〇·5 mM da^pmtw (( 4 氯基丄5_二苯基4沁 匕上3基氣基）_乙酸乙酯）加以處理時，來自該等單元 之細胞在培養起始的第三天内分離並釋放至培養基中。 細胞培養物展示了秋水仙鹼處理中之單離細胞的同質産 生，但在DAS-PMTI-1中展示了單離細胞産生，但其具 有經分類之細胞形狀而非爲圓形。該等細胞在螢光顯微 鏡下具有如由鈣螢光素染色所分析之完整細胞壁。 37 200846465 胡蘿蔔單離細胞懸浮液之純系株産生 使用LSBY2新鮮培養基而將處於生長靜止期（在於 0.5 Μ秋水仙驗中培養起始後的7天）之單離細胞懸浮液 稀釋至0.6 OD66G。將一 1.5 ml經稀釋之單離細胞培養物 塗於15X100培養皿中之Μ培養基（附件II)上並使用 接種環而將其展開。亦將未經處理之胡蘿蔔懸浮聚集體 稀釋至相同密度且進行類似塗覆以比較此等培養物之間 的生長反應。在黑暗中生長了 4周之後，具有單離細胞 I 之板産生若干指不可自此專細胞獲得純糸株之離散群 落。然而，未經處理之懸浮液展示癒合組織在板表面上 之草坪式生長（第十三Α圖第十三Β圖）。因此，可展示 胡蘿蔔之分離細胞可産生獲自個別細胞之群落從而産生 - 純系株。 ^ 第十三A圖第十三B圖··純系株自胡蘿蔔單離細胞 懸浮液之産生。在塗有未能幹處理之懸浮聚集體的Μ培 養基（盤Α)上的草坪式生長。在塗有單離細胞之培養 基（盤Β)上的離散群落之生長 實例10-自單子葉植物（玉米、大米（Τ309)、果園 草、小麥（安薩））之懸浮培養物的單離細胞産生 分化全能葉綠素玉米細胞培養物 在7天培養週期中起始並保持玉米光獨立營養培養 物（Jayakumar等人，2005年）。在繼代培養時用25ηΜ 至 0·5 mMDAS-ΡΜΉ-Ι ((4 氯基-1，5_二苯基-1Η-吼唑-3-基氧基）-乙酸乙酯）或10 ηΜ至0.5 mM氟樂靈處理該 等培養物以自聚集體分離單細胞。秋水仙鹼僅在高於0.5 38 200846465 mM至1 mM之範圍的濃度中才具活性並釋放單離細胞 (第十四圖）。當與所分析之雙子葉植物細胞松比較時， 玉米懸浮液單元被緊密充填至硬細胞聚集體中。然而， 綠色玉米細胞懸浮液具有最硬之懸浮液單元且處理展示 高達50%之活單離細胞在7天中釋放，其可藉由以100 rpm短暫旋轉或經由具有自75變化至100 uM直徑之微 孔的濾網進行過濾而分離。 第十四圖：液態培養基中之0.5〜ImM秋水仙驗處理 及在繼代培養起始後的14天（第二繼代培養週期結束） 所分析之培養物。A :單離細胞自叢集釋放；B :用FDA 活體染料染色之緊密充填細胞聚集體；C及D :在過濾 懸浮液之後（使用具有100 um直徑之微孔的過濾器）分 ~ 別在1 mM及0.5 mM處理中釋放的經FDA染色之單離 _ 細胞；E及F :來自D之單離細胞的更近景。 果園草及大米（T309)懸浮培養物 在半固態培養基上自成熟種子（DAS種子集合）誘 ® 導果園草及T309之癒合組織。使用由Fauquet等人在 1996年所描述之協定而自此種子獲得癒合組織起始懸浮 培養物。在一 7天繼代培養週期中在黑暗中將該等懸浮 細胞培養物保持於150 ηρπι下之震盪燒瓶中。以類似之 濃度範圍使用類似於所描述之用於玉米（上文）之彼等 化合物的ΜΉ化合物。果園草及大米單離細胞在培養起 始後的3〜5天被釋放。 小麥（安薩）懸浮培養物 39 200846465 在半固態MS2-D小麥培養基（附件ΠΙ)上自禾本 科植物組織誘導安薩小麥之癒合組織。自經殺菌及經浸 泡之組織分離禾本科植物組織且將誘發自不同組織之癒 合組織轉移至液態MS_2D小麥培養基（附件m)。分離 一快速生長之細胞懸浮株並進一步在MS2D液態培養基 上繼代培養該細胞懸浮株歷時7年（7天爲一個繼代培 養週期）且長期保持該細胞懸浮株年）。爲達成單離 細胞産生’首先使培養物習慣於NB麥草畏液態培養基 (附件IV)中。可調節安薩小麥培養物以在此培養基中 産生具有均勻大小之細胞聚集體單元的優良懸浮液。在 至培養基中之繼代培養起始階段以25 nM 至1 mM之濃 度範圍而將秋水仙鹼、三福靈或DAS-ΡΜΉ-Ι添加至接 種液。懸浮液自培養起始後的3天將單離細胞釋放至培 養基中。該等單離細胞小而均勻。 附件I。 LSBY2培養基由Murashige及81<:〇€^之巨鹽及微鹽 (Murashige 及 skoog，1962 年）組成，其補充有 30 g 蔗糖（w/v)、1〇〇 mg/i 肌醇、2〇〇 mg/1 kh2P〇4、」mg/1 硫胺及0·2 μ§/12,4-二氯笨氧基乙酸。在於120〇c下進行 高壓蒸汽滅菌之前將培養基調整爲ρΗ 5·8。使用處於靜 止期之在第7天培養時的懸浮液體積以起始培養物。將 1 ml體積之胡蘿蔔懸浮接種液轉移至50 ml LSBY2培養 基中且接著在28〇c下在黑暗中將該等培養物置放於150 rpm下之震盪器上。在培養起始週期時添加Mi〗化合物 連同新鮮培養基。 附件II 〇 200846465 Μ培養基由LS基鹽及B5維生素、30 g葡萄糖、每 一者均爲1 uM之2，4-D及活動素組成，且在將8 gm/L 瓊脂添加至培養基之前將該培養基調整爲pH 5.8。接著 高壓蒸汽滅菌培養基並將其傾倒至15X100培養皿中。 附件III。 MS2D 培養基由 MS 鹽（Murashige 及 Skoog，1962 年）及埃裏克森氏維生素組成，其補充有2 mg 2,4-D、 0.5 mg硫胺、30 g蔗糖、400 mg肌醇、400 mg酪蛋白 φ (ECH)。在將培養基調整爲pH 5.8之後，高壓蒸汽滅 菌培養物。以7天時間間隔常規繼代培養懸浮培養物（54 ml新鮮培養基中爲6 ml所使用之懸浮液的初始接種液） 且藉由在28°C下在黑暗中以150 rpm進行震盪而使該等 懸浮培養物生長。在此等條件下，細胞群體在接種後的 、 2天與6天之間總是呈指數生長。爲使凝膠培養基自成 熟種子子葉盤誘發癒合組織，MS2D培養基含有在調整 pH之後添加之2.5 g/L的一額外組份水晶凝膠。 附件IV 〇 — NB麥草畏培養基由NB基鹽、蔗糖30g/L、肌醇 100mg/L、ECH 酪蛋白（ECH ) 300mg/L、L-脯胺酸（2.5M ) 1.7ml/L、麩醯胺500mg/L及6.6mg/L麥草畏組成。在過 濾殺菌之前，將培養基調整爲pH 5.8。 實例Π-胡蘿蔔單離細胞産生及胡蘿蔔單離細胞懸 浮培養物之Si-C鬚晶介導遺傳轉化 胡蘿蔔單離細胞懸浮液之起始..... 41 200846465 在Linsmeier-Skoog (LS)培養基中解凍並培養一可 再生·之胡蘿蔔冷藏株（D2_4〇_〇18) (Nagata，τ·、Nem〇t〇, Υ·及 Hasezawa，S· ( 1992) lnt· Rev· Cyto 132, l_3〇)。培 養基鹽係購自植物技術實驗室（目錄號L689)。在一周 内建立-活躍生長之料液株，且藉由在—7天培養週 在漫射光下、在28。0下、在125rpm下之一回轉式 震盪器（Innova_3300)上將 2ml PCV 轉移至 58 ml LS BY2 懸浮培養基來繼代培養該保持株。爲達成單離細胞産 _ 生，將處於靜止期之1 mlPCV的胡蘿蔔懸浮液添加至具

有1 mM秋水仙鹼（Sigma，目錄號C3915) 2 3〇mlLS 懸浮培養基中並培養歷時7天。單離細胞自3〜7天之培 養物而産生且爲轉化實驗作準備。可藉由在14天通過添 加60 ml新鮮LS BY2液態培養基來稀釋培養物而使胡蘿 鶴之單離細胞保持於靜止期高達28天。 胡蘿蔔單離細胞之WHISKERS™介導遺傳轉化 • 在繼代培養起始後的4天及11天觀測到産生於具有 1 mM秋水仙鹼之LSBY2培養基中的單離細胞。如由螢 光素二乙酸酯染料所測定，該等單離細胞非常具有活性 且爲活的。在於草胺磷板上選擇之後的10天及25天， 自單離細胞獲得群落觀測到黃色螢光蛋白質表現癒合組 織事件。 遺傳轉化胡蘿蔔單離細胞 在轉化實驗中使用經修改之WHISKERS輝轉化協定 [Petolino、Welter 及 Welter ( 2003 年）Molecular Methods 42 200846465 of Plant Analysis，第 23 卷，147〜158，第 9 章，Genetic Transformation of Plants，ISBN 3540002928]。藉由將在 單離細胞處理及培養起始後的4天及11天的25ml單離 細胞胡蘿蔔懸浮液轉移至無菌之250ml IEC離心瓶 (Fisher Scientific目錄號05-433B)中來起始該等實驗。 藉由添加8.1ml新鮮製備之5%鬚晶懸浮液（SC之Greer 的 Advanced Composit Materilas 公司，Silar SC_9，）及 170 ug pDAB3831來實施轉化，該pDAB3831含有驅動 • PAT基因之AtUbilO促進劑及驅動yfp基因之CSVMS 促進劑。每一轉化由一被置放於經修改之油漆混合器 (MN 之 Minneapolis 的 Red Devil Equipment 公司）中並 在10秒鐘内被攪拌爲高速之瓶子組成，攪拌之後，使細 ' 胞返回至一 5〇〇 ml恢復燒瓶且添加i〇〇mi新鮮LSBY2 液悲培養基。允許細胞在在一 I25rpm下之旋轉震 盪器上恢復歷時1個小時。 恢復之後，將3 ml細胞懸浮液等分試樣均勻地分配 至搁置於一 Buchner漏斗上之無菌55 mm 4號濾紙盤上 # 且抽吸掉液恝培養基。接著將具有細胞之濾紙置放於60 x20mm皮氏培養皿上，該皮氏培養皿含有具有15mg/1 草胺磷之半固態LSBY2-B15培養基及作爲膠凝劑之 0.8% TC洋菜。在28V下在黑暗中培養板。1〇天之後， 自濾、紙拉脫表現GFP之事件，且將其置放於LSBY2_B15 半固態之個別板上。㈣餘過據物及細胞轉移至新鮮半 固態LSBY2-B15培養基並在2代下在黑暗中對其加以 培養。 43 200846465 單離細胞群落事件之分析 針對功能可選PAT標記蛋白質而經由一使用 「EnviroLogixLibertyLink⑧ PAT/pat 板套組」之敏感性 ELISA檢定來分析推定性轉殖基因事件，該等事件在起 始轉化貫驗後的25天在一 Leica反相螢光檢查儀下均勻 地發螢光。EnviroLogix LibertyLink⑧ PAT/ pat 板套組係 一「夾層」酶聯免疫吸附劑檢定（ELISA)。將癒合組織 置放於一微量離心管中且添加250 ul之萃取缓衝液。該 φ 萃取緩衝液係PBS ( Fisher目錄號BP665_1 )及〇·〇5〇/〇

Tween -20 ( Sigma-Aldrich 目錄號 Ρ1379)。在微量離心 管中中使組織研磨有一小、掌上型杵。以11，〇〇〇 rcf來離 心樣本萃取物歷時1分鐘，且在ELISA中以以下比例 - 1:、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32 及 1:64 使用上澄液。接 . 著進行如Envirologix套組目錄號AP014中所陳述之 ELISA方法。在測試中，將樣本萃取物添加至塗佈有抵 抗PAT而自pat基因産生之抗體的測試孔。樣本萃取物 中所存在之任何殘餘物均結合至該等抗體，且接著藉由 修 添加酶（辣根過氧化物酶）標記PAT/pat抗體來偵測該 等殘餘物。在一簡單之洗滌步驟之後，藉由一色彩顯影 步驟來顯示檢定之結果；色彩顯影與樣本萃取物中之 * PAT/pat濃度成比例。 結果展示在143mg/250 ul萃取緩衝液之樣本比率下 的負對照組織並不産生PATELISA之值。63mg/250ul之 樣本比率下之事件001B確貫産生8 3 ng/ml之^^值，其 等於每mg癒合組織330 pg PAT且因此指示一實際上藉 由在預期範圍中PhiYFP發螢光亦及pat可選標記基因 44 200846465 兩者而被轉化之發明亮螢光事件。 參考文獻

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此處看見細胞之高生存力且在PI中具有非常少之染有紅 色的細胎.。 第’、圖· DAS-ΡΜΓΜ、Dow AgroSciences (DAS)專 有甲基弓卜木衍生物及一有效之微管抑制劑除草劑對 =草細胞生長的影響。在NTm培養基（具有作爲專用碳 =之3/0甘油）中缺乏或存在25或5〇 DAs—pMTw的 下使細胞生長。所有新鮮重量值表示來自複製樣本之 十均值±0.18。 DAS GAD1762-034懸浮株之單離細胞及 弟七圖： 群落産生。 第八A圖至第八C圖：來自DAS GAD1762-034單離 細胞之群落的2〜6周生長。 第九圖·在4個繼代培養週期中在7天及13天時收集 永本，實施表現分析。繪製所獲得之表現資料。 、 天_第十圖·使用2〇〜5〇11从濃度下之DAS-PMT1·1以在5 (〜代^養之後産生單離細胞。注意該等細胞爲單離細胞 =細胞具有重疊邊緣），且在附著至—共焦成像系統之 刀幹擾對比度檢查儀下拍攝圖片。 53 200846465 第十一圖：在72小時之pEG声王乂 (UbilO-YFP質體）。在焦點平面中的WP表現 (分裂）細胞展示了指示表現可爲穩定個小型子系 第十二圖：左：由100mg/L卡那 1現。 之對照組織右：在選擇培養基上生夕、^制之未經處理 定轉質體基因分離。 、之早離細胞獲得推 罘十二A圖第十 料么4 —13圃·目胡蘿蔔單離細胞縣洋洛夕

:株產生。在㈣未能幹處歡料 二 Β(盤Α)上的草坪式生長。在塗有單離細胞之Ιίϋί Β)上的離散群落之生長。 ^ 第十四圖·液恶培養基中之〇 5〜lmM秋水仙驗處理及 在繼代培養起始後的14天（第二繼代培養週期結束）所分 =之培養物。A ··單離細胞自叢集釋放；B :用FDA活體 木料染色之緊密充填細胞聚集體；C及D :在過濾懸浮液 之後（使用具有100um直徑之微孔的過濾器）分別在丨mM 及0·5 mM處理中釋放的經FDA染色之單離細胞；E及F : 來自D之單離細胞的更近景。 【主要元件符號說明】 無0 54

Claims (1)

1. 200846465 十、申請專利範圍： 1、 一種經分離之單離植物細胞，其包含一完整細胞 壁。 2、 一種用於産生如申請專利範圍第1項所述之細胞 的方法，其中該方法包括在含有甘油及分離劑的培養基中 培養包含完整細胞壁之植物細胞，該分離劑係選自由果膠 降解酶（pectin-degrading enzyme)及微管蛋白解聚化合物 (tubulin de-polymerizing compound)戶斤組成之君_ 0 — 3、如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該培養 基係一液態培養基且該等細胞係在懸浮液中。 4、如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該分離 ^ 劑係微管蛋白解聚化合物。 、 5、如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該微管 蛋白解聚化合物係選自由秋水仙鹼及二硝基苯胺所組成之 群。 • 6、如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該微管 蛋白解聚化合物符合以下公式：

   其中 X 二 C02R、CH2C02R、CH2CH2C02R、（CH2)3C02R、 0CH2C02R 、 0CH(CH3)C02R 、 oc(ch3)2co2r 、 55 200846465 ch2och2co2r 、 ch2ch(co2ch2ch3)co2r 或 0CH(C02CH2CH3)C02R Y = CN、α、Br、F 或 N02 Ar:=未經取代之苯基、未經取代之吼。定、1-3取代之本 基、1 -3取代之比17定’或者經鹵素或CN取代 Ar2 =未經取代之苯基、未經取代之吡啶、1-3取代之笨 基、1-3取代之吡啶’或者經鹵素或CN取代；以及 r = Η或1 -5破線型或分枝酯。 • 7、如申請專利範圍第4項所述之方法’其中該微管 蛋白解聚化合物係（4氯基-i，5_二苯基-1Η-吡唑基氧基） -乙酸乙酯。 ^ 8、如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該微管 ' 蛋白解聚化合物係。

   9、如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該分離 劑係選自由果膠酶（Peetinas〇及果碇離析酶（pectolyase) 組成之群的酶。 1 〇、如申請專利範圍第1項所述之細胞，其中該經 56 200846465 分離之單離細胞係選自由藻類細胞、雙子葉植物細胞、單 子葉植物細胞所組成之群。 11 種用於轉化如申請專利範圍第1項所述之細 胞的方法，該方法包括使用如申請專利範圍第2項所述之 方法來製備經分離之細胞、使用異種聚核苷酸來轉化該細 胞及選擇經轉化之細胞。 、 ^ 1 2、如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該

   ^擇步驟使用無標記選擇。 1 3、一種自如申請專利範圍第i項所述之細胞生長 的細胞之培養物’其中該等細胞係均勻表現的。 1 4、如中請專利範項所述之細胞，其中該細 胞係轉殖基因（transgenic)。 1 5、如中請專利範圍第丄項所述之細胞，其中該细 胞係轉質體基因Ctransplast〇mic)。 ' ^、如巾請專利範圍第2項所述之方法，其中該: '、回生產i (high_throughput)過程方法。 請專利範圍第1(3項所述之方法，其中言 太十種選自由聚乙二醇、電致孔、基因搶2 不水粒子所組成之群的方法來實施的。 八女18、如申請專利範圍第1項所述之細胞，且中_ :離之單離細胞係選自由煙草細胞、胡、· 胞及叟陀羅細胞所組成之群。、未 19、如申請專職圍第2項所述之方法，其中該培 57 200846465 養基係選自由凝膠及半固態培養基所組成之群。

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