KR101530722B1 - 무손상 세포벽이 존재하는 단일 현탁 세포로서 식물 세포주의 유도 및 유지를 위한 시험관내 방법, 및 그의 형질전환 - Google Patents

Abstract

본 발명은 현탁 세포 응집체를 무손상 1차 세포벽이 존재하는 단일 세포로 파괴하기 위한 간단하고 일관된 방법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로 펙틴-분해 효소 또는 튜불린 해중합 화합물, 예를 들어 콜히친을 함유하는 배지 내에서 배양된 현탁 세포 응집체의 세포 분리에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 목적을 위한 화합물의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 단리된 세포의 형질전환에 관한 것이다. 상기 공정은 단일 세포-기반 형질전환 및 선택 공정을 단순화시켜 트랜스제닉 및 트랜스플라스토믹 (transplastomic) 세포주-생성 작업 공정으로 통합시킨다. 본 발명은 또한 기술적 제약을 제거하고, 동물 건강, 생물약제, 및 형질 및 농작물 보호 기준의 다양한 필요성을 지지하기 위해서 마커가 존재하지 않는, 균일하게 발현하는 트랜스제닉 주를 고효율 방식으로 생산한다.

현탁 세포 응집체, 무손상 세포벽, 트랜스제닉 식물, 현탁 배양, 단일 세포, 콜히친

Description

무손상 세포벽이 존재하는 단일 현탁 세포로서 식물 세포주의 유도 및 유지를 위한 시험관내 방법, 및 그의 형질전환 {IN VITRO METHODS FOR THE INDUCTION AND MAINTENANCE OF PLANT CELL LINES AS SINGLE SUSPENSION CELLS WITH INTACT CELL WALLS, AND TRANSFORMATION THEREOF}

관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 미국 특허 가출원 60/878,028 (2006년 12월 29일 출원)을 기초로 한 우선권을 주장한다.

본 발명은 부분적으로는 식물 세포를 현탁액 내에서 단일 세포로서 증식시키는 방법을 포함하는, 식물 세포주의 증식 분야에 속한다.

지난 이십 년에 걸쳐, 유용한 2차 대사물질의 생산을 위한 대규모 식물 세포 배양 공정의 개발에서 주요 개선과 결합된 식물 유전 공학 기술이 급속하게 출현하였다. 1995년 이래로 (Moffat, 1995; Ma et al, 2003), 상기 식물 세포 현탁 배양은 재조합 단백질의 발현을 위한 유용한 숙주세포 시스템으로서 점점 많이 사용되고 있다.

옥신 (auxin)-유도된 캘러스 (callus) 조직 또는 현탁액은 그들의 단일 조직 기원에도 불구하고 대체로 다양한 표현형을 갖는 세포를 함유한다. 따라서, 상기 세포 종류로부터 발달된 트랜스제닉주는 대체로 발현 수준이 일관되지 않으면서 고도로 이종성이다. 그러므로, 많은 유용한 2차 대사물질을 생산하는 클론은 단일 원형질체 (protoplast), 즉, 지치 (Lithospermum erythrorhizon) 원형질체로부터 제조된 고 시코닌 (shikonin)-생산 세포 클론으로부터 얻어졌다 (Maeda et al., 1983).

지금까지, 세포 선택뿐만 아니라 배양된 식물 세포의 전기천공/PEG 매개된 형질전환을 위해서도 세포를 해체하기 위해 원형질체를 형성하는 것이 필요하였다. 원형질체 제제는 식물 조직으로부터 단일 세포 클론의 단리를 위해 요구되었다. 그러나, 단리된 원형질체는 대체로 정지되고 거의 분열하지 않기 때문에 원형질체가 그들의 정상적인 벽을 재생하는 것은 대체로 어렵다 (Hahne and Hoffmann, 1984). 배양된 원형질체에 대한 많은 연구에서, 생성된 제1 및 주요 다당류는 칼로스이고, 이는 1-, 3-, 8-글루코피라노스로 이루어진다 (Klein el al, 1981).

상처를 입거나 스트레스를 받은 식물은 종종 대량의 상기 글루칸을 주변 세포질 공간 내로 분비한다 (Currier, 1957). 벽 재생의 초기 단계 동안, 셀룰로스와 자일로글루칸 사이의 결합은 무손상 식물에서만큼 강하지는 않다 (Hayashi et al, 1986). 1차 세포벽 내의 자일로글루칸 및 셀룰로스의 거대분자 조직화는 강도 및 신장성을 책임지는 것으로 보이므로 (Hayashi and Maclachlan, 1984), 원형질체 둘레에 자일로글루칸 및 셀룰로스의 침적이 그들의 분열 및 성장 가능성에 중요한 것으로 보인다. 상기 전제조건은 원형질체의 분열을 멎게 하여, 모 세포주의 세포 특징을 갖는 정상 세포로 재생하기 위한 시간을 증가시킨다.

따라서, 식물 세포의 배양 분야에서 진행 중인 기술적 도전과제는 배양액 내에서 식물 조직으로부터 클로닝될 수 있는 단일 생존가능 세포를 단리하는 것이다 ([Bourgin, 1983]; [Tabata et al, 1976]). 현탁 배양에서, 비-균일한 세포 응집체가 항상 형성되고, 각각의 그러한 응집체는 수백 개까지의 세포를 함유한다. 이들 응집된 세포 사이의 연결에 대해 아무것도 알려져 있지 않고, 세포 응집체를 분리하고 이들을 시험관 내에서 무손상 세포벽이 존재하는 단일 세포로서 유지할 수 있는 단일 효소를 확인하는 것은 아직 보고되지 않았다.

세포 접착 특성에서 펙틴의 역할이 몇몇 보고서에서 제안되었지만, 그러한 연결은 비교적 보다 최근에 확립되었다 (Bouton et al, 2002). 또한, 세포 접착 특성의 강한 감소가 보고되었다 (Sterling et al, 2006).

qua1 -1 돌연변이체는 탈착된 단일 뿌리 세포를 보였다 (Bouton et al, 2002). 감소된 펙틴 함량은 특이적 펙틴 에피토프에 대해 생성된 항체를 사용하는 면역형광 실험에 의해 추가로 확인되었다. 이들 관찰은 코딩된 효소가 펙틴 다당류의 합성에 관여될 수 있음을 제안하고, 펙틴이 식물 세포의 접착 특성에 관여함을 명백하게 나타냈다.

따라서, 세포 접착 특성을 제거하도록 펙틴 합성을 붕괴시키면 세포 분리를 용이하게 할 수 있다. 1회 펙틴 분해 효소 처리를 사용하는 단일 세포 단리 (Naill, 2005)는 탁수스 (Taxus) 세포 현탁 배양에서 단일 세포의 단리를 돕는 것으로 보고되었다. 상기 탁수스 단일 세포는 보다 높은 수준의 탁솔 (Taxol) 생산을 갖는 엘리트 (elite) 클론 주를 스크리닝하기 위해 사용된다. 그러나, 상기 방 법은 배지 내에 효소의 연속 존재 하에 단일 현탁 세포의 유지에 유용하지 않다. 또한, 그러한 짧은 펄스 처리의 효소 또는 효소들의 조합물을 사용할 때 최고 단일 세포 수율은 단지 17.1% 내지 34.4%이었다 (Naill, 2005). 쌀 현탁액에서 연속 펙티나제 처리는 0.005% 농도에서 미세한 현탁액 응집체만을 생성하였고, 현탁액을 단일 세포로서 유지하는 것을 돕지는 않았다 (Lee et al, 2004). 효소 펙티나제 및 셀룰라제의 조합물로 8시간 넘게 장기 처리하면 세포 용해를 일으켰다 (Naill, 2005).

대두 (soybean) 세포의 현탁 배양액에서 세포 분리의 향상은 콜히친의 존재 하에 향상되는 것으로 보고되었다 (Umetsu et al., 1975). 세포 분리를 위해, 알칼로이드를 염색체 배수체 (polyploidy)의 생산을 위한 농도 (5-20 mM)보다 더 낮은 농도 (0.1-1.0 mM)로 배양 배지에 첨가하였다. 그럼에도 불구하고, 콜히친은 식물 및 동물 세포에서 유사분열을 억제한다 (Lewin, 1980). 콜히친은 튜불린에 결합하고, 미세관 (microtubule)의 회합을 방지한다. 따라서, 세포 분리를 달성하기 위해, 콜히친 농도 및 처리 시간은 가능한 한 적어야 한다.

콜히친 알칼로이드는 배양된 동물 세포에서 성장의 동조화 (synchronization)를 위해 사용되었고, 여기서 알칼로이드는 대체로 0.5 mM로 첨가되고, 세포는 유사분열 전에 수 시간 내에 정지되어야 한다. 형태형성 효과는 동물 세포에서와 매우 유사하지만, 식물 세포는 0.1 mM의 콜히친의 존재 하에 성장하는 동안 분열할 수 있다 (Umetsu et al, 1975). 1 mM 콜히친에서 대두 현탁 세포의 4일 배양 후 세포 생활력이 감소하였다. 또한, 단지 44.8%의 세포가 이들 처리 에서 생존가능하였지만, 동물 세포에서와는 달리 이들을 계속 분열시키는 것은 가능하였다.

식물 시험관내 (in vitro) 배양시에 단일 세포 현탁액의 유지에서 튜불린 해중합 (depolimerization) 억제제 또는 올리고사카린 (oligosaccharin)의 사용이 연구되었다. 문헌에는 일찍이 1975년에 콜히친을 세포 분리를 위해 사용하는 것에 관한 일부 정보가 있다 (하기 참고문헌 부분 참조). 제초제로서 튜불린 억제제가 또한 연구되었다.

엘리트 트랜스제닉 세포주 (event) 생산 및 회수는 실행가능한 기술의 개발에 크게 의존한다. 현탁 세포 응집체의 형질전환을 위한 적절한 현재의 방법은 아그로박테륨 (Agrobacterium)- 및 휘스커 (whisker)-매개된 방법이다. 아그로박테륨 방법은 67-90%까지의 백본 통합률을 보이고, 이는 방법을 매우 비능률적인 공정으로 만들고, WHISKERS™ 매개된 형질전환은 고효율 (high throughput) 공정 (HTP)으로서 기능하지 않을 것이다. PEG 매개된 방법은 원형질체에서 항상 사용되고, 담배의 원형질체는 형질전환이 쉽지만, 세포벽 재생의 문제 때문에 HTP 형질전환 공정에 쉽게 적용가능하지 않다.

당업계의 기술은 단일 세포-현탁-배양-기반 형질전환을 위한 프로토콜에 관해서는 특별한 관심을 보이지 않는 것으로 보인다. 원형질체-기반 프로토콜에 대해서는 몇몇 보고가 있었지만, 아래 논의된 바와 같은 식물 세포의 단일 세포 현탁액과는 달리 이들에는 세포벽이 결여된다.

<발명의 개요>

본 발명은 현탁 세포 응집체를 무손상 1차 세포벽이 존재하는 단일 세포로 파괴하기 위한 간단하고 일관된 방법을 제공한다. 아래 명세서에서는 펙틴-분해 효소 또는 튜불린 해중합 화합물, 예를 들어 콜히친을 함유하는 배지 내에서 배양된 현탁 세포 응집체의 세포 분리를 논의한다.

본 발명은 또한 상기 목적을 위한 화합물의 신규한 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 단리된 세포의 형질전환에 관한 것이다. 상기 공정은 단일 세포-기반 형질전환 및 선택 공정을 단순화시켜 트랜스제닉 및 트랜스플라스토믹 (transplastomic) 세포주-생성 작업 공정으로 통합시킨다. 본 발명은 또한 기술적 제약을 제거하고, 동물 건강, 생물약제, 및 형질 및 농작물 보호 기준의 다양한 필요성을 지지하기 위해서 마커를 사용하지 않은 (marker-free), 균일하게 발현하는 트랜스제닉 주를 고효율 방식으로 생산한다.

도 1: 7일 동안 배지에서 계대배양된, 펙톨리아제 (pectolyase)로 연속 처리한 무손상 세포벽이 존재하는 JTNT1 현탁 세포의 단일 세포 단리.

A - 정상적인 BY2 현탁액; B - A와 동일하지만, 세포의 응집을 나타내기 위해 I2KI 염색된 세포; C 및 D - 연속 효소 처리 6일 후에 분리된 세포; E 및 F - I2KI 염색이 존재하거나 존재하지 않는 분리된 단일 세포. 정상적인 세포 분열은 (F)에 제시한다.

도 2: 연속 펙톨리아제 처리 (세포를 FDA 및 PI로 처리한다) 6일 후에 BY2 세포의 생활력 및 단일 세포의 수율.

A: BY2 세포 응집체; B: 5일 동안 배지 내의 펙톨리아제 내의 1 ml 접종물 중의 BY2; C: 제5일에 배지 내의 효소가 존재하는 6 ml 접종물; D, E, 및 F: C의 현미경 피사계 스냅 샷 (field snap shot); G: BAP 및 12% 수크로스에서 발생한 BY2 세포 변이체가 존재하는 대조 응집체; H 및 I: G로부터의 5일의 연속 효소 처리로부터의 단일 세포. 세포는 FDA 및 PI로 염색되었다. 죽은 세포는 PI로 적색으로 염색되었다.

도 3: BY2 및 잔티 (Xanthi) 담배 현탁액의 세포 응집체 현탁액으로부터 배지 내의 7일 콜히친 처리에 의한 단일 세포 현탁액 유도.

A: 정상적인 BY2 현탁액 응집체 (칼카플루오르 (Calcafluor) 염색됨); B: 7일 동안 1 mM 콜히친 중의 단일 세포 BY2 현탁액; C: B와 동일하지만 무손상 벽을 제시하기 위해 확대됨; D: 잔티의 현탁액 응집체; E: 7일 동안 0.5 mM 콜히친 내에서 처리된 잔티 현탁액 응집체. 0.5 mM 내에 단일 세포의 부분적인 방출을 주목한다; 및 F: 1 mM 콜히친 내의 잔티의 분리된 단일 세포.

도 4: 콜히친 처리시에 BY2- 및 잔티 담배 현탁액 응집체로부터 무손상 세포벽이 존재하는 단일 세포 방출.

A: 정상적인 BY2 현탁액 응집체; B: 7일 동안 1 mM 콜히친 중의 단일 세포 BY2 현탁액; C 및 D: 콜히친 제거 후에 세포의 응집체로의 재복귀 (콜히친 처리의 1 배양 사이클을 사용한 계대배양 4일 후); E: 잔티의 현탁액 응집체; F: 7일 동안 1 mM 콜히친 내에서 처리된 잔티 현탁액 응집체. 광 증백제인 칼카플루오르의 존재 하에 관찰된 바와 같이, BY2 및 잔티 배양액 중의 방출된 단일 세포 및 무손상 세포벽의 존재를 주목한다 (모든 샘플을 0.1%의 칼카플루오르로 처리하고, Leica 형광 스코프 하에 검사하였다).

도 5: 콜히친 처리시에 BY2-변이체 담배 (EP 12% 수크로스 배지에 습관화된 (habituated)) 및 흰독말풀 (Jimson weed) 현탁액 응집체로부터 무손상 세포벽이 존재하는 생존가능한 단일 세포 방출.

A: 정상적인 BY2-V 현탁액 응집체; B: 처리하지 않은 응집체의 근접 사진; C, D 및 E: 7일 동안 1 mM 콜히친 중에서 단일 세포 BY2 현탁액 유도 (10x, 20X 및 40X 배율 하의 세포); F: 7일 동안 1 mM 콜히친 처리에 의한 흰독말풀 현탁액에서 단일 세포 유도. 모든 샘플을 FDA 및 PI로 처리하고, Leica 형광 스코프 하에 검사하였다. 여기서 FDA 염색으로 관찰된 세포의 높은 생활력 및 PI에 의해 적색으로 염색된 세포가 거의 존재하지 않음을 주목한다.

도 6: NT1 담배 세포 성장에 대한 다우 아그로사이언시스 (Dow AgroSciences; DAS) 소유의 메틸 인돌 유도체 및 강력한 미세관 억제제 제초제인 DAS-PMTI-1의 효과. 세포를 유일한 탄소원으로서 3% 글리세롤이 존재하는 NT1B 배지에서 25 또는 50 nM DAS-PMTI-1의 부재 또는 존재 하에 성장시켰다. 모든 생물 중량 (fresh weight) 값은 반복 샘플로부터의 평균 ± 0.18을 나타낸다.

도 7: DAS GAD1762-034 현탁액 주로부터 단일 세포 및 콜로니 생산.

도 8A, 8B 및 8C: DAS GAD1762-034 단일 세포로부터의 콜로니의 2-6주 성장.

도 9: 4회의 계대배양 사이클 동안 7 및 13일에 샘플을 수집하여 발현 분석을 수행하였다. 얻은 발현 데이타를 플로팅하였다.

도 10: DAS-PMTI-1를 사용하여 단리된 단일 세포 BY2 세포. 20-50 nM 농도를 사용하여 계대배양 5일 후에 단일 세포를 생성시켰다. 세포는 단일 세포임을 주목하고 (세포 쌍은 가장자리가 중첩된다), 공초점 영상화 시스템에 연결된 차등 간섭차 스코프 (Differential Interference Contrast Scope)로 사진을 찍었다.

도 11: PEG 처리 72시간 후에 YFP 발현 (Ubi10-YFP 플라스미드). 초점면 내의 작은 딸 (분열하는) 세포 중의 하나는 GFP 발현을 보이고, 이것은 발현이 안정할 수 있음을 나타낸다.

도 12: 좌측: 100 mg/L 카나마이신에 의해 억제된 처리하지 않은 대조 조직. 우측: 선택 배지 상에서 성장한, 단일 세포로부터 유래된 추정 트랜스플라스토믹 단리물.

도 13: 당근 단일 세포 현탁액으로부터 클론 주의 생산. 처리하지 않은 현탁액 응집체로 플레이팅된 M-배지 상에서의 론 (lawn) 성장 (패널 A). 단일 세포로 플레이팅된 배지 상에서의 별개의 콜로니의 성장 (패널 B).

도 14: 액체 배지 중에서 0.5-1 mM 콜히친으로 처리하고, 배양액을 계대배양 개시 14일 후 (제2 계대배양 사이클 종료) 분석하였다. A: 단일 세포는 집단으로부터 방출된다; B: FDA 생체 염료로 염색된 빽빽하게 충전된 세포 응집체; C 및 D: 현탁액을 여과한 후 (세공 직경이 100 ㎛인 필터 사용), 각각 1 및 0.5 mM 처리시에 방출된 FDA 염색된 단일 세포; E 및 F: D로부터의 단일 세포의 근접 사진.

도 15: MTI에 반응한 JTNT1 단일 세포의 성장 곡선.

단일 세포를 단리하고 성장시키는 능력은 많은 적용가능한 용도를 갖는다. 예를 들어, 본원에서 개관된 방법은 동물 건강 용도를 위한 식물 세포 배양의 생산성에 관련된 공정의 개선에서 효용성을 갖는다.

따라서, 본 발명의 방법은 동물 건강용 및 생물약제의 식물-세포-기반 제품의 공정 효율 향상에 유용하다. 본 발명의 실시태양은 응집체에서 비-트랜스제닉 세포를 최소화하거나 제거하기 위한 단일 세포-기반 형질전환 시스템용 표준 운용 프로토콜 (SOP)을 개발하기 위해 배치 (batch) 사이의 변동을 최소화할 때, 예를 들어 미니 (mini) 현탁 세포 배양 개시시에 트랜스제닉 세포주 엘리트 클론의 스크리닝을 도울 수 있다. 요약하면, 본 발명의 측면은 동물 건강상 필요를 위한 HTP (고효율 공정) 스크리닝 및 숙주세포주 개선 프로그램에 유용하다.

또한, 본 발명은 세포 켄칭 (quenching) 형광 프로브와 연결된 RNA 발현을 기초로 하여 안정하게 발현하는 세포를 확인하기 위한 단일 세포 기반 분석 및 세포 분류 공정의 추가의 개발을 예시하고, 또한 이를 가능하게 한다.

상기 단일 세포는 또한 현재의 원형질체-기반의 일시적 시스템 대신에 부위-지정 상동성 재조합 일시적 스크리닝에서 유용하다. 예를 들어, 블랙 멕시칸 스위트 (Black Mexican Sweet; BMS) 옥수수 현탁액 및 캐놀라 현탁액은 상기 용도를 위한 단일 시스템을 제공할 수 있다. 따라서, 예를 들어 표적화된 상동성 재조합은 본 발명의 실시태양에서 사용될 수 있다. 상기 종류의 기술은 예를 들어 표적화된 재조합을 위한 징크 핑거 (zinc finger)의 사용에 관한 WO 03/080809 A2 및 대응하는 미국 출원 (USPA 20030232410)의 주제이다. 재조합효소 (예를 들어 cre-lox 및 flp-frt)의 사용도 당업계에 공지되어 있다.

시험관내 식물 발현 시스템은 유용한 제약 및 동물 건강용 재조합체 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 상기 식물 발현 시스템의 중요한 잇점은 식물이 포유동물 세포의 것과 유사한 내막 시스템 및 분비 경로를 갖는 특성상 진핵생물이라는 점이다. 따라서, 복합 단백질이 일반적으로 효율적으로 폴딩되고, 적절한 번역후 변형에 의해 회합된다.

식물 생산 시스템의 다른 잇점은 대량 생산 (scale-up) 가능성이다. 실질적으로 무제한적인 양의 재조합체 단백질이 함유된 초록 조직에서 성장하거나 또는 엘리트-발현 클론을 스크리닝하고 상기 균일하게 발현하는 세포주를 팽창시킨 후에 발효 또는 생물반응기 시스템을 사용한 산업 설비에서 대량 생산될 수 있다.

단일 세포 생산을 위한 두가지 전략을 본원에서 예시한다. 두 전략 모두가 생존가능한 단일 세포 분리를 위해 성공적으로 작용하였다. 그러나, 콜히친 방법은 두 현탁 세포 종류에서 적어도 무손상 세포벽이 존재하는 큰 부피의 단일 세포 현탁액을 얻을 때 효소 분해법보다 바람직하다. 효소 방법은 세포 성장의 억제뿐만 아니라 보다 높은 사망 수준을 보였다. 또한, 생존가능한 세포를 사용된 배지를 제거하거나 세정하지 않은 상태로 겔 배지 상에 플레이팅할 때, 세포가 사멸하였고, 콜로니 성장이 관찰되지 않았다. 효소 분해법을 통해 생산된 상기 단일 세포 현탁액을 사용할 수 있지만, 추가의 최적화를 수행할 것이 권장된다.

반대로, 본 연구에서 시험된 콜히친과 같은 튜불린 억제제의 첨가는 식물 세포 분리 및 단일 세포 선택에 매우 유용한 것으로 보인다. 상기 방법은 계대배양 단계 동안 액체 배지에 대략적인 부피의 콜히친의 첨가만을 수반하기 때문에 간단하다. 이것은 출발 (starter) 세포로서 고도로 생존가능한 세포의 균일한 접종물을 사용한 미니-현탁 배양의 개시와 같은 공정에서 제시된 현탁액에 매우 중요한 중요한 도구일 것이다. 기술은 전기천공, Whiskers™, 및 아그로박테륨 매개된 형질전환의 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 단일 세포 제제는 트랜스제닉 현탁액 응집체로부터 재조합체 단백질 생산주의 엘리트 클론을 단리하기 위해 사용될 수 있다.

원형질체 방법이 단일 세포 단리를 위해 사용되었지만, 콜히친 방법이 보다 용이하고 보다 강력한 방법이다. 콜히친 방법에 의해 얻은 단일 세포는 벽의 존재 때문에 원형질체보다 더 안정하고, 세포벽의 재생을 요구하지 않는다. 세포는 자일로글루칸/셀룰로스 네트워크의 정상적인 조성을 갖는 벽을 갖는다 (Hayashi and Maclachlan, 1984). 세포는 콜히친의 존재 하에 성장하는 소나무 묘목 세포가 비정상적 벽 비후화를 보이지 않지만 방사상으로 확대되는 관찰에서 알 수 있는 바와 같이, 세포 팽창 및 분리 동안 칼로스를 생산하지 않는다 (Itoh, 1976). 세포의 성장은 콜히친이 없는 배지에서 계대배양 후에 정상적이지만, 대부분의 원형질체는 정지되고 거의 분열하지 않는다 (4). 콜히친-배양된 세포는 어느 정도의 배수성을 가질 수 있지만, 본 연구에 사용된 콜히친의 농도 (0.1-1.0 mM)는 배수성 유도에 필요한 것 (5-20 mM)보다 10 내지 100배 더 낮았다. 단일 세포의 회수는 원형질체를 사용한 것보다 콜히친 방법을 사용할 때 훨씬 더 우수하였다 (Hyashi and Yoshida, 1988). 세포는 배수성 수준 및 게놈 안정성을 평가하기 위해서 유동 세포 분석을 사용하여 추가로 시험할 수 있다. 또한, 배수성 수준의 증가는 형질전환된 세포의 카피수 증가를 통한 재조합체 단백질 수준의 향상이라는 추가의 잇점을 제공할 수 있다.

갈락투로난 활성은 대두 현탁 세포에서 세포 분리의 생물학적 기능을 보였고, 세포 분리에 대한 생물학적 기능을 보였기 때문에 올리고사카린으로서 보고되었다 (Albersheim and Darvill, 1985). 따라서, 갈락투론산은 또한 본원에서 보고된 단일 세포 현탁액에서 관찰된 임의의 콜히친 유도 배수성 변화가 존재하는 경우에 한해서, 임의의 배수성 변화가 발생하지 않으면서 세포 분리를 달성하기 위해 이들 현탁 세포에서 시험된다. 따라서, 갈락투로난 및 다른 유사한 올리고사카린의 직접적인 사용은 세포 접착 특성을 붕괴시킴으로써 세포를 분리할 때의 효율을 비교하기 위해 추가로 평가된다. 따라서, 본 발명은 세포가 게놈 안정성을 동시에 유지하면서, 현탁 세포 사이클의 수회 통과시에 재현가능하고 일관되는 간단한 방법을 제공한다.

본원에 예시된 하나의 바람직한 화합물은 DAS-PMTI-1이다. 상기 화합물은 매우 강력한 것으로 보인다 (배양액의 성장에 영향을 미칠 때 콜히친보다 ~100-1000X배 더 큼). 처리 7일 후에, 0.5 mM 농도에서 상당한 세포 사멸이 존재하지만, 이들 배양액을 DAS-PMTI-1의 부재 하에 계대배양할 때, PH 현탁 세포는 2주 후에 낮은 빈도로 단일 세포로 회수되었다. 단일 세포의 분리를 위해 바람직한 용도 (예를 들어, 세포의 종류 등)에 따라 상기 화합물의 바람직한 농도를 결정하기 위해 추가의 최적화를 수행할 수 있다. 유사한 기능을 갖는 다른 MTI 억제제가 펙틴 합성을 붕괴시킴으로써 세포 분리에 사용될 수 있다. 본원의 개시 내용에 비추어, 추가의 MTI 억제제 및 그의 유사체를 단일 세포 생산 및 유지에 있어서의 그의 효율에 대해 시험하고 스크리닝할 수 있다.

(4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르로도 알려진 DAS-PMTI-1의 화학 구조는 다음과 같다:

본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 화합물의 속 (genus)은 DAS-PMTI-1-타입 화합물이다. 상기 화합물은 상기 제시된 일반적인 구조에 부합하고, 그의 기능적 (본 발명에 따라 사용하기 위한) 유도체 및 유사체를 포함한다.

다음은 본 발명에 따라 사용하기 위한 공지의 일부 마이크로튜불린 억제제에 대한 일반식이다. DAS-PMTI-1이 바람직한 실시태양이지만, 실제로는 임의의 마이크로튜불린 억제제가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부의 바람직한 실시태양에서, 다음 디아릴피라졸 속의 하나 이상의 멤버가 콜히친과 조합되어 사용된다:

상기 식에서,

X = CO₂R, CH₂CO₂R, CH₂CH₂CO₂R, (CH₂)₃CO₂R, OCH₂CO₂R, OCH(CH₃)CO₂R,

OC(CH₃)₂CO₂R, CH₂OCH₂CO₂R, CH₂CH(CO₂CH₂CH₃)CO₂R, 또는 OCH(CO₂CH₂CH₃)CO₂R,

Y = CN, Cl, Br, F, 또는 NO₂,

Ar₁ = 비치환 페닐, 비치환 피리딘, 할로겐 또는 CN으로 치환된 1-3 치환 페닐, 할로겐 또는 CN으로 치환된 1-3 치환 피리딘,

Ar₂ = 비치환 페닐, 비치환 피리딘, 할로겐 또는 CN으로 치환된 1-3 치환 페닐, 할로겐 또는 CN으로 치환된 1-3 치환 피리딘,

R = H 또는 1-5개 탄소의 선형 또는 분지형 에스테르.

따라서, 단일 세포 식물 현탁 배양액을 미세관 억제제를 사용하여 생산하였고, 이들은 적어도 2회의 계대배양 사이클 동안 배양에서 유지될 수 있다. 이들 단일 세포 현탁액은 무손상 세포벽을 갖지만, 서로로부터 분리되어 존재한다는 점에서 특유한 것이다.

"트랜스제닉" 식물, 식물 세포 등은 (달리 명시하지 않으면) 원래 동일한 종의 천연 비-트랜스제닉 식물 세포에 존재하지 않는, 실험 기술에 의해 도입된 외래 DNA를 함유하는 형질전환된 식물 세포 (또는 원형질체 등)으로부터 유도된 전체 식물, 식물 세포, 식물 세포 배양액, 식물 세포주, 식물 조직 배양액, 하등 식물, 외떡잎 식물 세포 배양액, 쌍떡잎식물 세포 배양액, 또는 그의 자손체이다. 용어 "트랜스제닉 식물" 및 "형질전환된 식물"은 때때로 그의 DNA가 외인성 DNA 분자를 함유하는 식물을 규정하기 위해 동의어로서 당업계에서 사용되었다. 트랜스제닉 식물은 식물의 게놈 DNA 내에서 기능하고 식물의 게놈 DNA 내로 통합된 외래 DNA를 함유하도록 안정적으로 형질전환될 수 있거나, 또는 바이러스-기반 벡터로 형질전환되어 외래 DNA를 일시적으로 발현하는 트랜스제닉 식물이다.

"단리된" 및 "정제된"은 "사람 손"에 의한 것임을 의미하고, 폴리뉴클레오티드 및 단백질에 적용될 수 있다. 클로닝된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 단리된 폴리뉴클레오티드이다.

형질전환 방법. 이들 단일 세포는 핵 형질전환을 위해 아그로박테륨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을, 색소체 (plastid) 형질전환을 위해 바이오리스틱 폭격 (biolistic bombardment)을 사용하여 핵 및 색소체 형질전환에 대해 시험하였다. 핵 형질전환 시험에서, 플라스미드 DNA의 전달 및 황색 형광 단백질 일시적 발현이 입증되었다. 세포를 색소체 형질전환에서 회수하였고, 안정한 형질전환이 PCR 분석을 통해 밝혀졌다. 트랜스플라스토믹 캘러스 단리물의 부피를 크게 만들고, ELISA를 통해 선택가능 마커인 nptII 유전자 발현에 대해 분석하였다.

본원에 설명된 형질전환 방법은 동물 건강을 위한 공정에 적용될 수 있다. 그러나, 나노입자 전달을 포함하는 신규한 전달 방법을 통한 단일 세포 기반 형질전환은 또한 재조합체 단백질 생산에 사용된 세포 종류의 숙주에 추가하여, 농작물의 형질전환을 위한 특유한 방법을 제공할 수 있다.

PEG 및/또는 전기천공 방법을 통한 본 발명의 단일 세포 형질전환의 개발은 무손상 벽이 존재하는 단일 세포를 세균/포유동물 세포 시스템만큼 적용할 수 있도록 만들고, 이들 세포 종류에 대한 고효율 형질전환 시스템에도 유용하다.

단일 세포를 형질전환시키는 능력은 많은 가능한 용도를 갖는다. 예를 들어, 본원에 개략된 방법은 동물 건강 용도를 위한 식물 세포 배양의 생산성에 관련된 공정의 개선에서 효용성을 갖는다. 또한, 본 발명의 공정은 동물 건강용 및 생물약제의 식물-세포-기반 제품의 공정 효율 향상에 유용하다. 또한, 본 발명의 공정은 트랜스제닉 세포주의 엘리트 클론의 스크리닝을 도울 수 있다. 상기 용도는 배치 사이의 발현 변동을 최소화할 때 미니 현탁 세포 배양의 개시를 위해 및 응집체에서 비-트랜스제닉 세포 또는 다수의 세포주의 존재를 최소화하거나 제거하기 위한 SOP를 개발하기 위해 사용될 수 있다.

배경 부분에서 논의된 바와 같이, 아그로박테륨 방법은 매우 비능률적이고, WHISKERS™ 매개된 형질전환은 고효율 공정으로서 작용하지 않을 것이다. PEG 매개된 방법은 원형질체에서 사용된다. 담배 원형질체는 형질전환이 용이하지만, 세포벽 재생 문제 때문에 HTP 형질전환 공정에 쉽게 적용가능하지 않다.

이와 대조적으로, 본 발명은 무손상 세포벽을 제공한다. PEG-매개된 공정은 무손상 세포벽이 존재하는 단일 세포에 대한 최초의 보고이다. 본 발명의 방법은 또한 고도로 효율적이다. 또한, 상기 공정은 형질감염을 위해 단편-정제된 플라스미드를 사용함으로써 백본 통합을 방지한다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)와 같은 공정을 통한, 단일 식물 세포를 포함하는 급속 형질전환 프로토콜은 비용, 자원 및 시간을 절감하면서 적합한 세포주를 스크리닝하기 위한 공정의 소형화 및 자동화에 이상적이다. 이는 세포 분류기를 통해 형질전환된 세포를 스크리닝하고 산업적 연구 또는 생산 파이프라인을 통한 추가의 발전을 위해 균일하게 발현하는 엘리트 세포주를 결정함으로써 현재의 캘러스 또는 현탁액 응집체 선택 공정을 크게 개선시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 공정은 예를 들어 새로운 바이오프로세싱 연구 및 개발, 동물 건강상 필요성을 위한 HTP 스크리닝 및 숙주세포주 개선을 위한 근본적인 토대를 제공한다.

본 발명은 세포 켄칭 형광 프로브와 연결된 RNA 발현을 기초로 하여 안정하게 발현하는 세포를 확인하기 위한 단일 세포 기반 분석 및 세포 분류 공정의 추가의 개발을 가능하게 한다.

또한, 상기 단일 세포는 형질 및 농작물 보호 기준을 위한 목적 유전자 (Gene of Interest; GOI)의 일시적 및/또는 안정한 스크리닝에 유용하다.

구체적으로 나타내거나 암시하지 않으면, 용어 부정관사 ("a", "an") 및 정관사 ("the")는 본원에서 사용되는 바와 같이 "적어도 하나"를 의미한다.

본원에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원, 및 공개문헌은 본 명세서의 명백한 교시 내용과 일관되는 정도로 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.

실시예 1 - 물질 및 방법

BY2 현탁-배양된 세포를 저팬 (Japan) 담배로부터 얻고, LSBY2 배지 내에서 7일 사이클로 유지하였다. 흰독말풀 현탁액 및 페티트 하바나 (Pettite Havana) 담배 현탁을 DAS에서 개시된 캘러스로부터 개시하고, 잔티 현탁액을 UIUC의 잭 위드홀름 교수 (Professor Jack Widholm)로부터 샘플로 입수하였다. NT1B 배지 내에 7일 사이클로 유지된, 워싱턴 대학 (Washington University)으로부터 입수한 JT-NT1 현탁 세포는 세포를 단일 세포로 분리하기 위한 펙틴 분해 효소 연구에만 사용하였다. 세포를 진탕 플라스크 내에서 25-28℃에서 암소에서 150 rpm의 회전 진탕기 상에서 배양하였다. 콜히친은 플루카 (Fluka)로부터, DAS-PMTI-1 ([Martin et. al, 2001]; [Smith et al, 2001])은 DAS CRS로부터, 펙틴 분해 효소 (펙톨리아제 Y 및 펙티나제)는 시그마 (Sigma)로부터 입수하였다. 본 연구에 사용된 두 튜불린 중합 억제제의 스톡 농축액을 DMSO에 용해시켜 0.5 M 스톡 용액을 제조하였다. 펙티나제 및 펙톨리아제 효소의 시험된 농도는 0.0005% 내지 0.005% 범위였다. 예를 들어, 담배 현탁 세포주 NT-1 및 BY-2가 본 발명의 실시에 적합하다. BY-2 세포는 시판되고 있고, 문헌의 내용에 따라 이용가능하다 (예를 들어, [Nagata, T., Nemoto, Y., and Hasezawa. S. [1992], Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132: 1-30]). NT-1 세포는 원래 담배 품종 (니코티아나 타바쿰 엘. 품종 브라이트 옐로우 2 (Nicotiana tabacum L. cv. bright yellow 2))으로부터 개발되었다. NT-1 세포주가 널리 사용되고 쉽게 이용가능하지만; 임의의 담배 현탁 세포주가 본 발명의 실시를 위해 사용된다. NT-1 세포주의 기원이 불분명한 것도 주목한다. 또한, 세포주는 변이성이고, 배양 조건에 따라 변하기 쉽다. 아래 실시예에 사용하기 적합한 NT-1 세포 는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)에서 기탁 번호 ATCC No. 74840으로 이용가능하다. 또한, 미국 특허 6,140,075를 참조한다.

실시예 2 - 현미경 관찰

세포 팽창 및 분리를 광 현미경 (Nomarski 및 암시야 렌즈 구비)에 의해 관찰하였다. 각각 세포 팽창 및 분리 정도를 결정하기 위해서 구형 세포 및 단일 세포를 세포 측정기를 사용하여 계수하였다. 응집체 내의 세포 수는 5% (wt/vol) 삼산화크롬으로 16 hr 동안 처리하고 세포를 계수하여 결정하였다 (Henshaw et. al, 1966). 세포 생활력은 형광 현미경 (자이스 포토마이크로스코프 (Zeiss Photomicroscope))을 사용하여 플루오레세인 디아세테이트 (FDA) 및 프로피듐 요오다이드 (PI)로 세포를 염색함으로써 결정하였다 (Yokoyama et.al, 1997). 상기 단일 세포 배양액 내에서 세포벽의 존재를 결정하기 위해, 광 증백제를 사용하였다. 셀룰로스에 대해 특이적인 형광 염료인 칼카플루오르 (시그마)를 본 연구에서 사용하고, 셀룰로스-칼카플루오르 복합체화를 형광 현미경 (자이스 포토마이크로스코프)에 의해 관찰하였다. 칼코플루오르 (시그마 케미칼 코. (Sigma Chemical Co., 미국 미주리주 세인트루이스))는 PBS 버퍼 내에 0.1% (wt/vol) 용액으로 제조하고, 암소에서 실온에서 저장하였다 (Kwok et.al, 2003). 사용하기 전에, 칼카플루오르 염료는 15,000 g에서 2 min 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 1 방울 또는 2 방울의 칼카플루오르 용액을 분리된 세포에 첨가하였다. 실온에서 2 또는 3분 후에, 세포 현탁액을 물로 세정하고, 실온에서 1분 동안 TBS (pH 7.2) 중의 0.1% 에반 블루 (Evan's blue) (시그마; E-2129)로 역염색한 후, 395 내지 415 nm의 파 장 (455 nm의 관찰광)에서 UV 현미경으로 관찰하였다. 세포벽은 청백색 또는 청록색의 타원형 원광 (turquoise oval halos)으로 보였다.

실시예 3 - 배지에 펙티나제 및 펙톨리아제를 연속 처리한 결과.

페티트 하바나, BY2 및 NT1 담배 현탁액을 상이한 농도에서 펙틴 분해 효소인 펙티나제 및 펙톨리아제의 효과를 연구하기 위해 사용하였다. JT-NT1 현탁액은 다른 효소 대응물보다 펙티나제 처리에 더 우수하게 반응하였고, BY2 현탁액은 펙톨리아제 효소 처리에 더 우수하게 반응하였다. 그러나, 생체 염료에 의해 가시화된 세포 사망 및 세포 종류의 억제성 성장이 존재하였다. 계대배양 단계에서 세포의 접종물 부피는 단일 세포의 상당한 수율을 얻기 위해 12배까지 증가시켰다. PH 및 BY2 세포는 펙톨리아제가 존재하는 배양액 중에서 적어도 7일 동안 배양할 수 있었다. 저 농도 펙톨리아제 효소 (3 활성 단위)에서 이들 세포의 연속 배양은 유해한 것으로 보였다. 배양 6일차의 세포는 접종물 부피가 6 ml (정지기 (stationary phase)에서의 출발 접종물 부피)이고 효소와 함께 50 ml의 신선한 배지에서 배양할 때 많은 단일 세포를 생성하였다. 이들 세포는 배양 6일 후에 FDA 및 PI로 시험했을 때 보다 높은 정도의 생존가능한 단일 세포를 보여주었다 (도 1 및 2). 현탁 배양물의 성장은 효소 처리시에 큰 영향을 받았고, 동일한 효소 함유 배지에서 세포의 계대배양은 유해한 것으로 보였다. 세포를 배양시에 최대 7일의 기간 동안 신선한 배지로 처리한 후, 이들 세포를 성장을 회복하기 위해 효소가 없는 배지로 옮길 것이 권장된다. 상기 방법은 단지 이종성 응집체에서 엘리트 트랜스제닉 클론을 스크리닝하기 위해 또는 균일한 세포 부피로 고효율 현탁 배양을 개 시하기 위해 사용될 수 있을 뿐이다.

도 1: 7일 동안 배지에서 계대배양된, 펙톨리아제로 연속 처리한 무손상 세포벽이 존재하는 JTNT1 현탁 세포의 단일 세포 단리.

A - 정상적인 BY2 현탁액; B - A와 동일하지만, 세포의 응집을 나타내기 위해 I2KI 염색된 세포; C 및 D - 연속 효소 처리 6일 후에 분리된 세포; E 및 F - I2KI 염색이 존재하거나 존재하지 않는 분리된 단일 세포. 정상적인 세포 분열은 (F)에 제시한다.

도 2: 연속 펙톨리아제 처리 (세포를 FDA 및 PI로 처리한다) 6일 후에 BY2 세포의 생활력 및 단일 세포의 수율.

A: BY2 세포 응집체; B: 5일 동안 배지 내의 펙톨리아제 내의 1 ml 접종물 중의 BY2; C: 제5일에 배지 내의 효소가 존재하는 6 ml 접종물; D, E, 및 F: C의 현미경 피사계 스냅 샷; G: BAP 및 12% 수크로스에서 발생한 BY2 세포 변이체가 존재하는 대조 응집체; H 및 I: G로부터의 5일 연속 효소 처리에 의한 단일 세포. 세포는 FDA 및 PI로 염색되었다. 죽은 세포는 PI로 적색으로 염색되었다.

실시예 4 - BY2, NT1, 페티트 하바나 (PH) 및 잔티 (Xan) 및 흰독말풀 (JM) 현탁 세포의 성장에 대한 콜히친의 효과.

배양 7일 후에, BY2, Xan, 및 JM 세포의 세포 수는 0.5 mM 및 1 mM 농도의 콜히친에 반응하였다 (도 3, 4 및 5). 그러나, 높은 정도의 단일 현탁 세포가 1 mM의 BY2 현탁 세포 및 JM 세포에서 관찰되었다. JM 세포 성장이 0.5 mM 콜히친에서도 크게 영향받고, 동일한 배지에서 추가로 1주 성장한 후에도 성장이 회복될 수 없음을 주목하였다. 이것은 세포 분열이 JM 세포에서 콜히친에 의해 억제되고, 배양 밀도 또는 성장의 감소를 보이지 않으면서 세포 분리를 보다 최적화하기 위해 보다 낮은 농도가 필요함을 나타낸다. 흥미롭게도, 상기 성장 억제는 BY2 현탁 세포에 의해서는 관찰되지 않았고, 이 세포는 1 mM 콜히친의 존재 하에 적어도 14일 동안 연속적으로 성장시킬 수 있었다. 세포 팽창은 먼저 제3일에 관찰되었고, BY2 현탁 세포에서 계속 배양할 때 세포는 구형 형상으로 발생하였다. 구형 세포는 응집체로부터 점진적으로 방출되기 때문에, 세포 분리는 세포 팽창과 수반하여 발생하는 것으로 추정되었다. 대조 배양액에서처럼 7일 후에 1 mM 콜히친을 함유하는 배지에 대략 동일량의 BY2 세포가 존재한다. 1 mM 콜히친 중에서 7일 동안 배양된 세포를 콜히친이 없는 배지에서 계대배양할 때, 응집체로 성장하는 능력이 완전회 회복되지는 않았고, 90% 이하의 현탁 세포가 단일 무손상 세포로 관찰되었다. 또한, 세포 팽창 및 분리가, 0.5 mM 콜히친을 함유하는 배지에서 시험된 다른 모든 세포 현탁액의 세포 현탁액 응집체에서 부분적으로 발생하였다. JT-NT1 및 JM 현탁 세포에서 관찰된 억제성 세포 성장 반응이 존재한다. NT1 현탁 세포는 1 mM 콜히친 중에서 거의 50%의 성장 감소를 기록하였다.

qua1 -1 펙틴 돌연변이체에서 보고된 분리된 표피 뿌리 세포와 유사한 이들 세포에서 큰 분리된 세포가 관찰되었다 (Bouton, 2002). 전체적으로 구형 형상인 세포의 유사한 부분적인 분리가 DAS-PMTI-1로 시험된 모든 세포 현탁액 종류에서 관찰되었다. 그러나, 세포 성장은 0.5 mM 농도의 DAS-PMTI-1로 처리된 현탁액에서 매우 유의한 영향을 받았다. 상기 화합물을 사용하여 세포 분리 조건을 최적화하 고 세포 억제성 성장을 최소화하기 위해 추가의 실험을 수행할 수 있다. FDA 및 PI 염색 시험에 의해 입증되는 바와 같이, 시험된 BY2 및 JM 세포 현탁액에서 높은 정도의 세포 생활력이 존재한다. 세포는 거의 원형이었고, 많은 세포에서 부리 유사 돌기를 보였고, 이것은 가능하게는 세포 분열 전에 활성 세포의 세포벽 신장을 나타낸다. 분리된 세포는 크고, 팽창되었으며, 원형질체에 전형적인 구형 형상을 보유하였다. 칼카플루오르 염색을 사용하여 무손상 세포벽의 존재 또는 부재를 결정하였다. 도 4는 이들 원형 세포 주위에 세포벽이 존재함을 보여준다. 스코프의 암시야 집광렌즈로 이들 세포로 관찰할 때, 세포 주위에 두꺼운 세포벽이 나타났다 (도 3: 패널 C). 이들 단일 세포는 생체 염료 시험에서 관찰되는 바와 같이 펙틴의 부재 및 큰 세포의 존재에 의해 죽은 세포가 존재하지 않기 때문에 진탕 배양에서 원상으로 회복되었다 (도 5). 매우 높은 비율의 살아있는 건강한 세포가 상기 패널에서 관찰된 바와 같이 존재하였다. 따라서, 이들 세포를 진탕 배양 또는 마이크로-웰 플레이트에서 정확한 수의 세포가 존재하는 접종물로서 사용하는 것이 가능하다.

도 3: BY2 및 잔티 담배 현탁액의 세포 응집체 현탁액으로부터 배지 내에서의 7일 콜히친 처리에 의한 단일 세포 현탁액 유도.

A: 정상적인 BY2 현탁액 응집체 (칼카플루오르 염색됨); B: 7일 동안 1 mM 콜히친 중의 단일 세포 BY2 현탁액; C: B와 동일하지만 무손상 벽을 제시하기 위해 확대됨; D: 잔티의 현탁액 응집체; E: 7일 동안 0.5 mM 콜히친 내에서 처리된 잔티 현탁액 응집체. 0.5 mM 내에 단일 세포의 부분적인 방출을 주목한다; 및 F: 1 mM 콜히친 내의 잔티의 분리된 단일 세포.

도 4: 콜히친 처리시에 BY2- 및 잔티 담배 현탁액 응집체로부터 무손상 세포벽이 존재하는 단일 세포 방출.

A: 정상적인 BY2 현탁액 응집체; B: 7일 동안 1 mM 콜히친 중의 단일 세포 BY2 현탁액; C 및 D: 콜히친 제거 후에 세포의 응집체로의 재복귀 (콜히친 처리의 1 배양 사이클을 사용한 계대배양 4일 후); E: 잔티의 현탁액 응집체; F: 7일 동안 1 mM 콜히친 내에서 처리된 잔티 현탁액 응집체. 광 증백제인 칼카플루오르의 존재 하에 관찰된 바와 같이, BY2 및 잔티 배양액 중의 방출된 단일 세포 및 무손상 세포벽의 존재를 주목한다 (모든 샘플을 0.1%의 칼카플루오르로 처리하고, Leica 형광 스코프 하에 검사하였다).

도 5: 콜히친 처리시에 BY2-변이체 담배 (EP 12% 수크로스 배지에 습관화된) 및 흰독말풀 현탁액 응집체로부터 무손상 세포벽이 존재하는 생존가능한 단일 세포 방출.

A: 정상적인 BY2-V 현탁액 응집체; B: 처리하지 않은 응집체의 근접 사진; C, D 및 E: 7일 동안 1 mM 콜히친 중에서 단일 세포 BY2 현탁액 유도 (10x, 20X 및 40X 배율 하의 세포); F: 7일 동안 1 mM 콜히친 처리에 의한 흰독말풀 현탁액에서 단일 세포 유도. 모든 샘플을 FDA 및 PI로 처리하고, Leica 형광 스코프 하에 검사하였다. 여기서 FDA 염색으로 관찰된 세포의 높은 생활력 및 PI에 의해 적색으로 염색된 세포가 거의 존재하지 않음을 주목한다.

실시예 5 - 유일한 탄소원으로서 글리세롤을 함유하는 배지에서 단일 세포의 생산 및 DAS-PMTI-1의 영향

본 실시예는 신규한 글리세롤 성장 배지 및 DAS-PMTI-1 저 농도 효과, 및 성장 특성에 대한 다른 논의를 제공한다. 글리세롤이 대두 미세관 붕괴시의 콜히친 효과를 경감시킨다고 이전에 문헌에 보고된 바 있고, 따라서, 선행 기술은 본 발명의 용도를 위해 배지에 글리세롤을 사용하는 것에 반대하는 입장이었기 때문에 본 실시예의 결과는 매우 의미있는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Hayashi and Yoshida, 85 PNAS 2618-22 (1988)]을 참조한다. 또한, 본 발명의 글리세롤 데이타는 식물 세포에 대해서는 새로 제시되는 것이고, 이러한 결과는 이전에 보고되지 않았다. 담배 신속 배양의 3가지의 상이한 유전자형이 유일한 탄소원으로서 3% 글리세롤을 사용하여 수개월 동안 성공적으로 성장하였다.

본 실시예는 또한 2가지의 상이한 농도의 DAS-PMTI-1에서의 배양 거동을 보여주는 성장 곡선 그래프를 제공하고, 이를 비처리시와 비교한다.

미세관을 붕괴시키는 몇몇 클래스의 화합물은 단일 세포를 생성시킨다. 이들 화합물은 (i) 디니트로아닐린 (오리잘린 (Oryzalin), 트리플루아랄린 (Trifluaralin), 클로랄린 (Chloralin)) 및 (ii) N-페닐카르바메이트, 예를 들어 벤즈아미드, 프론아미드, 인산 아미드, 아미프로포스메틸 ([Morejohn and Foskett, 1986]; [Akashi et al., 1988]), 및 항진균제, 벤즈아미드 자릴아미드 (Young, 1991), (iii) 항암약, 파클리탁셀 (Morejohn and Foskett, 1986), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 (iv) 미세관 및 벽 특성을 모두 붕괴시키는 다른 화합물, 예를 들어 마이크로-핵 형성이 없거나 적으면서 단일 세포를 생성하는 그들의 능력에 대해 시험된 셀룰로스 합성 억제제 및 세포골격 억제제, 예를 들어 알루미늄 및 쿠마린 (Coumarin)으로 분류된 미세관 붕괴제 또는 억제제 (α- 및 β-튜불린 결합 화합물)를 포함한다. 표층 미세관 및 유사분열 미세관은 상이한 감수성을 갖고, 상기 나열된 상이한 클래스로부터 또는 클래스 중 하나로부터의 화합물의 조합은 세포 분열은 영향을 받지 않지만 게놈 불안정성이 전혀 또는 거의 없이 세포를 단일 세포 단계로 달성하고 유지하기 위해 세포 접착 특성이 충분히 붕괴될 정도로 미세관을 선택적으로 붕괴시킨다.

현탁 배양에서 담배 세포 성장에 대한 미세관 억제제 (MTI)의 효과를 조사하였다. 제7일 정지기 세포 (1 ml)를 상이한 농도 (25 내지 1000 nM)의 MTI를 함유하는 250 ml 진탕 플라스크 (Bokros et al., 1993) 내의 배지 (50 ml)에 옮기고, 7일 동안 암소에서 25℃에서 성장시켰다. 대조 및 MTI-함유 플라스크 모두는 최종 농도 0.5-0.1% (v/v)의 DMSO를 함유하였다. 이들 화학물질의 성장을 BY2 세포에 대해서 EP12 배지에서, BTI-NT1 세포에 대해서는 NT1B 배지에서 평가하였고, 이들 배지는 탄소원이 3% 글리세롤로 대체되었다. 이들 세포의 반응을 탄소원으로서 3% 수크로스를 함유하는 것을 제외하고는 동일한 배지 조성물과 비교하였다. 글리세롤은 미세관 안정화제로 알려져 있고, 3% 글리세롤에 습관화된 담배 세포는 스트레스 하에서 페놀계 물질을 보이지 않기 때문에, 글리세롤 배지를 사용하였다.

1일 간격으로, 세포의 삼중 샘플 (0.5 ml)을 평량 (tared) 미세원심분리관에서 단시간 동안 원심분리하여 침강시키고, 생물 중량을 결정하였다. 도 6에 제시된 결과는 2일 지연기 (lag phase) 후에, 대조 세포가 4일 동안 급속하게 성장하 고, 6일에 정지기에 들어감을 보여준다. 25 nM DAS-PMTI-1을 사용하여 성장시킨 담배 세포는 대조 배양액과 유사한 성장 동역학을 보였다. 그러나, 이들 배양액의 생물 중량은 정지기 동안 대조군보다 약간 더 컸고, 이것은 50 nM DAS-PMTI-1을 사용하여 성장을 촉진시킬 수 있음을 시사한다. 0.5-1.0 mM DAS-PMTI-1을 사용하여 성장시킨 세포는 FDA 및 프로피듐 요오다이드 처리된 세포를 형광 스코프 하에 검사할 때 배양 개시 3일 내에 완전한 억제 및 세포 사멸을 나타내었다. 데이타는 담배 세포 성장이 50 nM의 역치 근처에서 억제되지만, 100 nM 이상의 농도는 유사분열의 억제, 및 세포 사멸을 야기함을 보여주었다.

0.25-0.5 mM 농도가 효과적인, 단일 세포 생산을 위한 저효력 디니트로아닐린인 콜히친과 달리, DAS-PMTI-1은 NT1 및 BY2 세포 모두에 대한 총 탄소원으로서 글리세롤의 존재 하에도 5-25 nM의 낮은 농도에서 매우 효과적이다. 25 nM 농도 범위가 단일 세포 방출에 효과적일 뿐만 아니라, 10일에 걸쳐 세포의 성장 속도를 저하시키지 않을 때 매우 효율적이다 (도 6). 실제로, 이들 단일 세포의 팽창에 의해 성장 정지기에서 생물량이 약간 향상된다. 그러나, 현미경 관찰은 이들 단일 세포에서 마이크로-핵의 존재를 보이지 않았다.

도 6: NT1 담배 세포 성장에 대한 DAS-PMTI-1의 효과. 세포를 유일한 탄소원으로서 3% 글리세롤이 존재하는 NT1B 배지에서 25 또는 50 nM DAS-PMTI-1의 부재 또는 존재 하에 성장시켰다. 모든 생물 중량 값은 반복 샘플로부터의 평균 ± 0.18을 나타낸다.

DAS-PMTI-1을 통해 생성된 세포의 단일 세포 상태를 공초점 현미경으로 분석 하였고, 이들은 세포가 부착된 것으로 보이지 않았기 때문에 단일 세포로서 분명하게 확인되었다.

실시예 6 - 트랜스제닉 현탁액 주 및 클론 주 생산의 디컨볼루션 (deconvolution)

담배 현탁액은 정상적으로 응집체 또는 작은 집단에 세포를 함유하고, 이들은 고도로 불균일하다. 배양액 내의 세포는 유전적으로 균일할 수 있거나 (균일 집단), 일부 유전자 변이를 보일 수 있다 (불균일 집단). 단일 모 세포로부터 유래된 세포의 균일 집단은 클론으로 불린다. 따라서, 클론 집단 내의 모든 세포는 유전적으로 동일하고, 세포 특성 측면에서 고도로 균일하다. BY2 및 NT1 담배 세포 현탁액은 많은 실험실에서 모델 시스템으로 통상적으로 사용된다.

이들 세포는 세포벽 제거 후에 (Mathur and Koncz, 1998), 입자 폭격 또는 아그로박테륨 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와의 합동 배양을 통해 직접 쉽게 형질전환된다 ([An, 1985]; [Klein et al., 1988]; [Rempel and Nelson, 1995]). 에이. 투메파시엔스-매개된 BY-2 형질전환이 많은 실험실에서 일상적으로 수행되지만, 본 발명자들은 트랜스제닉 캘러스의 획득 효율이 실험마다 상이하고, 주로 BY-2 세포 배양의 품질에 의해 결정됨을 밝혀내었다. M 및 초기 G1상의 동조화, BY-2 세포는 G2의 세포보다 안정한 에이. 투메파시엔스-매개된 형질전환에 대해 10배 더 감수성이다. 또한, virG 유전자를 구성적으로 발현하는 아그로박테륨 균주 LBA4404 (van der Fits et al., 2000)는 트랜스제닉 캘러스 생성에 있어서 2 내지 5배 더 효과적이다. 전형적으로, 표현형 스크리닝 프로그램이 수행되도록 상기 아그로박테륨 균주와 합동 배양된 4 mL의 BY-2 세포로부터 약 500개의 트랜스제 닉 캘러스를 얻을 수 있다. 그러나, 형질전환된 현탁액 주의 집단 또는 응집체는 불균일한 다수의 트랜스제닉 세포주를 갖는 것으로 보인다. 그 결과, 하나의 배치 배양으로부터 다른 배양에 이르기까지 일관되지 않은 발현 수준이 존재한다. 집단 내에서 세포의 키메라 혼합물을 디컨볼루팅시키고, 클로날 세포주를 확인하기 위해 이들을 개별 세포로서 분리하기 위해 단일 세포 방법이 사용된다. 단일 세포를 PAT 선택가능 마커 유전자로 형질전환된 키메라 트랜스제닉 현탁액 NT1 담배 주 (GAD1762-034)로부터 생산하였다 (도 7 및 8).

도 7: DAS GAD1762-034 현탁액 주로부터 단일 세포 및 콜로니 생산. 도 8A, 8B 및 8C: DAS GAD1762-034 단일 세포로부터의 콜로니의 2-6주 성장.

약 20개의 별개의 콜로니를 무작위로 선택하여 신선한 선택 배지 상에서 추가로 성장시켰다. 현탁액 주를 이들 콜로니로부터 생성시키고, 급속하게 성장한 주를 각각 7일의 6회의 계대배양 사이클을 통해 얻었다. 추가의 단백질 분석에서 이들 콜로니의 생물량 생산은 이들 주 및 19개의 후속적인 주에서 매우 일정하였다.

4회의 계대배양 사이클 동안 7 및 13일에 샘플을 수집하여 발현 분석을 수행하였다. 얻은 발현 데이타를 플로팅하였다 (도 9).

대조 현탁액 응집체 주 #34에 비교할 때 수회의 계대배양 사이클에 걸쳐 강한 발현을 보이는 몇몇 클론 주를 얻을 수 있음을 데이타 분석으로부터 분명히 알 수 있다. 또한, 하위주 17은 발현 수준에서 대조주를 능가하였고, 이것은 상기 공정이 집단에서 클로날 엘리트 주를 선택하고, 보다 개선된 디컨볼루션이 균일하게 발현하는 엘리트 주의 획득을 도울 수 있음을 나타낸다.

실시예 7 - 단일 세포 현탁 배양액의 형질전환

물질 및 방법

식물 세포 물질의 제조: 형질전환 3 내지 4일 전에, 2 ml의 NT1 또는 BY2 배양액을 250-mL 플라스크 내의 40 ml NT1B 또는 LSBY2 배지 내로 전달하여 1-주령 현탁 배양액을 신선한 배지에서 계대배양하였다. 단일 세포를 생성시키기 위해서 상기 설명된 바와 같은 미세관 억제제 (MTI)의 농도를 사용하였다. MTI 처리 4일 또는 7일 후에 단일 세포를 수집하였다.

도 10: DAS 소유의 메틸 인돌 유도체 및 강력한 미세관 억제제 제초제인 DAS-PMTI-1를 사용하여 단리된 단일 세포 BY2 세포. 20-50 nM 농도를 사용하여 계대배양 5일 후에 단일 세포를 생성시켰다. 세포는 단일 세포임을 주목하고 (세포 쌍은 가장자리가 중첩된다), 공초점 영상화 시스템에 연결된 차등 간섭차 스코프로 사진을 찍었다.

BY2 단일 세포를 Beckman 유동 세포 측정기를 통해 프로세싱할 때, 배지 ml당 평균 직경이 10.43 ㎛이고 부피가 593.8 ㎛³인 658250개의 생존가능한 세포가 존재하였다.

아그로박테륨 제제: YFP 유전자 (pDAB4613) 구성체를 함유하는 아그로박테륨 투메파시엔스 균주 LBA4404를 50% 글리세롤 내에서 -80℃에서 저장하였다. 발현 벡터를 함유하는 스톡 배양액의 20-500 ㎕ 분취액을, 20-500 ㎕을 10 g/L 효모 추 출액, 10 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl, 10 g/L 수크로스 및 50 mg/L 스펙티노마이신을 함유하는 30 ml YEP 액체 배지에 첨가함으로써 직접 액체 배양을 개시하기 위해 사용하였다. 배양액이 약 1.5의 OD600의 밀도에 도달할 때까지 암소에서 28℃ 및 150-200 rpm에서 18-20 hr 인큐베이팅하였다.

핵 형질전환을 위한 단일 세포의 동시-배양:

형질전환시에, 1.0 ml의 아그로박테륨 현탁액을 40 ml의 4 또는 7일령 담배 단일 세포 현탁액 (임의의 MTI를 제거하기 위해 배지로 미리 세척함)이 담긴 플라스크에 넣고, 10 ml의 큰 직경의 (wide-bore) 피펫을 사용하여 상하로 5회 피펫팅하였다. 이어서, 균일한 현탁액의 250 ㎕ 분취액을 파라필름으로 감싼 24-웰 플레이트 내에 옮기고, 3일 동안 진탕하지 않으면서 암소에서 25℃에서 배양하였다. 약 50 ㎕의 현탁액의 분취액을 현미경 슬라이드 상에 놓고, 황색 형광 단백질 (YFP)의 일시적 발현을 관찰함으로써 시험하였다.

핵 형질전환을 위한 단일 세포의 PEG/DNA 처리: JT-NT1 세포 응집체 현탁액을 계대배양 개시시에 NT1B 배지 내에서 1 mM의 최종 농도의 콜히친 (플루카)으로 처리하고, 7일 동안 125 rpm에서 회전 진탕기 상에서 배양하였다. 현탁액을 25℃에서 배양하였다. 제7일 종료시에, 1 ml (0.6 OD₆₀₀)의 단일 세포를 플라스크로부터 수집하고, 14 ml 멸균 튜브 내에 분배하였다. 10 ml의 MaMg 배지 (조성에 대해서는 하기 표 1 참고)를 첨가하고, 5분 동안 ~1000 RPM에서 회전시켰다.

MaMg 배지 조성 (PEG 매개 형질전환)

MaMg 배지
배지 총 부피	스톡 농도	100	ml
MES		0.1	g
만니톨		7.3	g
MgCl2	15 mM	1.5	ml
pH 5.5

액체를 따라 내고, 세포를 300 ㎕ MaMg에 재현탁시키고, ~50 ㎍ 플라스미드 DNA를 첨가하였다. 상기 단일 세포 및 DNA 혼합물에, 300 ㎕ PEG 3350 (40% PEG 3350 w/v, 0.4M 만니톨, 0.1 M Ca(NO₃)₂ (최종 pH 5-6))을 천천히 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 단일 세포, DNA 및 PEG 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이팅한 후, 10 ml W5 (세척 배지)를 첨가하고, ~1000 RPM에서 5분 동안 원심분리하였다. 액체를 따라 내고, 2 ml 기초 액체 배지 (NT1B)를 첨가하고, 세포 현탁액을 멀티-웰 플레이트 내에 옮겼다. 따라서, 몇몇 반복시험물을 24-웰 플레이트의 웰에 옮길 수 있었다. 50 ㎕ 부피의 세포 현탁액을 현미경 슬라이드 상에 올린 후, 적절한 필터를 갖는 형광 스코프 (여기 500/20 nm, 다이아크롬 (diachrome), 방출 535/30 nm) 하에 검사함으로써 YFP 일시적 발현에 대해 20-24시간에서 분석하였다.

색소체 형질전환을 위한 단일 세포의 바이오리스틱 폭격: BY2 세포를 색소체의 수를 증가시키기 위해 EP12% 배지 내에서 20-50 nM DAS-PMTI-1에서, 및 색소체의 크기를 증가시키기 위해 BAP를 첨가하고 2,4-D 없이 7일 동안 처리하였다. 제7일 종료시에, 단일 세포를 수집하고, 2 ml 현탁액을 여과지에 옮겼다. 세포를 건조시키기 위해 LS BY2 겔 배지 상에 2시간 동안 유지시켰다. 각각 2,4-D 결핍 단일 세포주 및 BAP 처리된 세포주로부터 5개의 플레이트를 폭격하였다. 이들 세포를 50 nM DAS-PMTI-1로 2주 동안 처리하고, 제3주에, 이들을 20 nM DAS-PMTI-1 내에 넣었다. 세포는 미세하고 비교적 건강하였다.

세포를 바이오리스틱 총 (바이오라드 (BioRad))를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 0.8 ㎛ 금 입자 상에서 pDAB3969로 폭격하였다. 이들을 선택제를 함유하지 않는 배지 상에서 회수한 지 2일 후에 LS-BY2 12% 수크로스 + 100 mg/L 카나마이신 선택 배지에 옮겼다.

결과 및 논의.

핵 형질전환 노력: PEG (도 11) 및 Agro 형질전환 (도 3)에 대한 시도는 서로 유사한 발현 빈도를 명백하게 보여주었다. 분석된 세포의 50 ㎕ 분취액에서, 2-3개의 YFP 발현 세포가 존재하였다. 따라서, 대략 모든 10970 단일 세포의 배치 내에 하나의 형질전환된 세포가 존재하고, 이는 공정이 매우 효율적이지 않을 수 있음을 나타낸다. 세포에서 잔류 콜히친이 제거되지 않는 것 같고, 평행 실험에서, 세포는 보다 높은 빈도의 콜로니를 가지면서 콜로니로 보다 빠르고 보다 건강하게 복귀되었다. 이는 세척 단계가 최적화 실험에서 형질전환 빈도를 증가시킴을 나타낸다. 단지 하나의 세포주가 단일 세포로부터 선택되면, 두 형질전환 방법 모두에서 마이크로-웰 플레이트 내에 단일 세포 ml 당 적어도 50-60개의 형질전환된 세포가 존재할 것이다. 그러나, 형질전환을 위한 조건은 추가로 최적화될 수 있고, 추가의 안정하게 형질전환된 콜로니가 단리될 수 있다.

도 11: PEG 처리 72시간 후에 YFP 발현 (Ubi10-YFP 플라스미드). 초점면 내의 작은 딸 (분열하는) 세포 중의 하나는 GFP 발현을 보이고, 이것은 발현이 안정할 수 있음을 나타낸다.

색소체 형질전환: 배양 6주 후, 5개의 활동적으로 성장하는 콜로니가 선택 배지 상에서 확인되었다. 그러나, 대조의 처리하지 않은 세포는 100 mg/L 카나마이신 선택에서 사멸하였다 (도 12). 활동적으로 성장하는 콜로니를 샘플링하고, 플라스미드의 통합을 결정하기 위해 PCR에 의해 분석하였다. 5개의 콜로니 중 2개가 명백한 PCR 산물을 보여주고, 이는 트랜스젠이 색소체 내에 통합된 것을 나타낸다.

도 12: 좌측: 100 mg/L 카나마이신에 의해 억제된 처리하지 않은 대조 조직. 우측: 선택 배지 상에서 성장하는, 단일 세포로부터 유래된 추정 트랜스플라스토믹 단리물.

고효율 핵 및 색소체 형질전환 프로토콜을 추가로 개발하기 위해 추가의 실험이 수행되고 있다.

새로운 바이오프로세싱 연구 및 개발을 위한 HTP 및 백본이 없는 (단편 정제된 플라스미드 사용) 형질전환 프로토콜을 추가로 개발하기 위해 프로토콜을 최적화하기 위해 추가의 형질전환 실험이 수행되고 있다.

실시예 8 - 글리세롤 배지 내에 현탁 배양액의 습관화

물질 및 방법

동조화를 위한 배양액의 조건화. 동조화를 개선하기 위해, 모든 배양을 2주 동안 계대배양 없이 계속한 후, 1 ml의 오래된 배양액을 50 ml의 신선한 배지에 희석하였다. 미분화되고 분열하는 세포를 계대배양 2일 후에 계수하는 한편 (40% 이하의 유사분열 지수가 관찰되었다), 배양 10일 후 분화된 비-분열하는 세포가 관찰되었다. 0.5 ml의 현탁액의 샘플을 전체 마운트 (whole mount) 절차에 사용하였다.

세포 배양액.

장기 브라이트 옐로우-2 (BY-2)를 LSGS-BY2 배지 (부록 1) 내에서 배양하고, NT1 세포 및 단기 페티트 하바나 (PHL) 담배 현탁 세포를 LSG-BY-2 배지 (부록 II) 또는 G-NT1 배지 (부록 III) 내에서 배양하였다. 배지가 글리세롤에 추가로 1% 수크로스를 함유한 레귤러 BY2 배양액의 경우를 제외하고, 모든 배지는 성장 배지 내에 수크로스에 대한 대체 탄소원으로 글리세롤을 함유하였다. 현탁 배양액을 250 ml 얼렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크 내에서 매주 간격으로 희석시켰다 (1 ml의 오래된 배양액을 50 ml의 신선한 배지 내에). 세포 현탁액을 회전식 진탕기 상에서 100 rpm에서 교반하고, 25℃에서 암소에서 유지하였다 (Vos et al, "Microtubules become more dynamic but not shorter during preprophase band formation: a possible 'Search-and-Capture' mechanism for microtubule translocation," Cell Motil Cytoskeleton 57:246-258, 2004).

글리세롤 배지 내에서 성장된 세포 배양액의 특성.

모든 배양액의 일반적인 성장은 당 성장시킨 대조 배양액에 비해 감소되었다. 그러나, 배양 접종물의 초기 수준이 증가할 때, 정상적인 성장 속도가 얻어졌다. 세포는 건강하였고, 당 대조 배양액에서 관찰된 세포의 전형적인 갈변 없이 배양액 내에서 2주까지 계속 성장시키는 것이 가능하였다. 글리세롤 배양액 내에서 성장된 세포는 당 배양된 상대물에 비해 현탁액 단위 내에 세포의 더 높은 응집을 가졌다. 글리세롤이 막의 안정성을 완화하므로, 이들 세포를 MTI 화합물이 응집된 하위단위의 세포 접착 특성을 붕괴시키는지 시험하기 위해 실험에서 사용하였다.

부록 I.

LSGS-BY2 배지는 30 ml 글리세롤 (v/v) 및 10 g 수크로스 (w/v), 100 mg/l 미오이노시톨, 200 mg/l KH₂PO₄, 1 mg/l 티아민 및 0.2 ㎍/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산을 보충한 무라시게 및 스쿠그 마크로 및 마이크로-염 (Murashige and Skoog 1962)으로 이루어진다. 배지는 오토클레이빙 (autoclaving) 전에 pH 5.8로 조정한다.

부록 II .

LSG-BY2 배지는 30 ml 글리세롤 (v/v), 100 mg/l 미오이노시톨, 200 mg/l KH₂PO₄, 1 mg/l 티아민 및 0.2 ㎍/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산을 보충한 무라시게 및 스쿠그 마크로 및 마이크로-염 (Murashige and Skoog 1962)으로 이루어진다. 배지는 오토클레이빙 전에 pH 5.8로 조정한다.

부록 III .

G-NT1 배지는 30 ml 글리세롤 (v/v), 100 mg/l 미오이노시톨, 180 mg/l KH₂PO₄. 1 mg/l 티아민 및 2 mg/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산을 보충한 무라시게 및 스쿠그 마크로 및 마이크로-염 (Murashige and Skoog 1962)으로 이루어진다. 배지는 오토클레이빙 전에 pH 5.8로 조정한다.

실시예 9 - 쌍떡잎식물 (담배 (BY2, NT1, 페티트 하바나, 잔티)), 당근 (다우커스 카로타 엘. 변종 사티부스 품종 사티바 (Daucus carota L. ssp. sativus cv Sativa))의 현탁 배양액으로부터 단일 세포 생산

당근 현탁 배양.

당근 캘러스 배양은 시험관내 유지된 다우커스 카로타 엘. 변종 사티부스 품종 사티바 식물으로부터 개시되었다. 단리된 잎꼭지 외식편을 반고체 배지 상에서 배양하였다 (Mashayekhi-Nezamabadi, 2000). 50 mg의 무른 캘러스를 24 마이크로 웰 플레이트 내에서 1.5 ml의 LSBY2 배지 (부록 I) 내에 옮김으로써 캘러스로부터 현탁 배양을 개시하였다. 이어서, 가장 빠르게 성장하는 현탁액을 1 ml 현탁액을 35 ml LSBY2 액체 배지 내에 첨가하여 플라스크에 옮겼다. 배양액을 확산광 (diffused light)에서 7일 계대배양 사이클로 유지하였다. 이들 배양액은 재생가능하고, 현탁액 단위는 밀집 배열된 세포를 가져 덩어리진다. 계대배양의 현탁 개시 단계에서 0.5 mM 내지 1 mM 콜히친 또는 25 nM 내지 0.5 mM DAS-PMTI-1 ((4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르)로 처리할 때, 단위로부터의 세포는 배양 개시의 제3일 내에 분리되어 배지 내로 방출된다. 세포 배양액은 콜히친 처리에서 단일 세포의 균질 생산을 보이고, DAS-PMTI-1에서는 단일 세포 생산을 보여주지만 세포 형상이 둥글기보다는 다양하다. 세포는 형광 현미경 하에 칼카플루오르 염색에 의해 분석할 때 무손상 세포벽을 갖는다.

당근 단일 세포 현탁액의 클론 주 생산 .

0.5 M 콜히친 처리로 배양 개시한 7일 후 성장의 정지기에서 단일 세포 현탁액을 LSBY2 신선한 배지를 사용하여 0.6 OD⁶⁶⁰으로 희석하였다. 1.5-ml의 희석된 단일 세포 배양액을 15X100 페트리 (Petri)-플레이트에서 M-배지 (부록 II) 상에 플레이팅하고, 루프를 사용하여 펼쳤다. 이들 배양액 사이의 성장 반응을 비교하기 위해 처리하지 않은 당근 현탁액 응집체를 또한 동일한 밀도로 희석하고, 유사하게 플레이팅하였다. 암소에서 4주 성장시킨 후, 단일 세포를 갖는 플레이트는 몇몇 별개의 콜로니를 생산하였고, 이는 클론 주가 이들 세포로부터 얻어질 수 있음을 나타낸다. 그러나, 처리하지 않은 현탁액은 플레이트의 표면 상에 캘러스의 론 성장을 보여주었다 (도 13). 따라서, 당근의 단리된 세포가 클론 주를 생산하도록 개별 세포로부터 유래되는 콜로니를 생산할 수 있음을 보여주는 것이 가능하다.

도 13: 당근 단일 세포 현탁액으로부터 클론 주의 생산. 처리하지 않은 현탁액 응집체로 플레이팅된 M-배지 상에서 론 성장 (패널 A). 단일 세포로 플레이팅된 배지 상에서 별개의 콜로니의 성장 (패널 B).

실시예 10 - 외떡잎식물 (옥수수, 쌀 (T309), 오차드그라스 (Orchard grass), 밀 (안자 (Anza)))의 현탁 배양액으로부터 단일 세포 생산

만능 엽록소 옥수수 세포 배양액.

옥수수 광독립영양 배양을 개시하고 7일 배양 사이클로 유지하였다 (Jayakumar et. al. 2005). 배양액을 계대배양 시점에 25 nM 내지 0.5 mM DAS-PMTI-1 ((4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르) 또는 10 nM 내지 0.5 mM 트리플루랄린으로 처리하여 단일 세포를 응집체로부터 분리하였다. 콜히친은 0.5 mM 초과 내지 1 mM 범위의 농도에서만 활성이고, 단일 세포를 방출시킨다 (도 14). 옥수수 현탁액 단위는 분석된 쌍떡잎식물 세포에 비교할 때 단단한 세포 응집체로 빽빽하게 충전된다. 그러나, 초록 옥수수 세포 현탁액이 가장 단단한 현탁액 단위를 갖고, 처리는 100 rpm에서 잠깐의 원심분리에 의해 또는 75-100 ㎛ 직경의 세공을 갖는 스크린을 통해 여과함으로써 분리될 수 있는 50%까지의 생존가능한 단일 세포가 7일 내에 방출하는 것을 보여주었다.

도 14: 액체 배지 중에서 0.5-1 mM 콜히친으로 처리하고, 배양액을 계대배양 개시 14일 후 (제2 계대배양 사이클의 종료시) 분석하였다. A: 단일 세포는 집단으로부터 방출된다; B: FDA 생체 염료로 염색된 빽빽하게 충전된 세포 응집체; C 및 D: 현탁액을 여과한 후 (세공 직경이 100 ㎛인 필터 사용), 각각 1 및 0.5 mM 처리시에 방출된 FDA 염색된 단일 세포; E 및 F: D로부터의 단일 세포의 근접 사진.

오차드그라스 및 쌀 ( T309 ) 현탁 배양.

오차드그라스 및 T309 캘러스는 반고체 배지 상에서 성숙 종자 (DAS 종자 컬렉션)로부터 개시하였다. 문헌 [Fauquet et. al., 1996]에 설명된 프로토콜을 이용하여 상기 종자 유래된 캘러스로부터 현탁 배양을 개시하였다. 현탁 세포 배양액을 진탕 플라스크 내에 150 rpm에서 암소에서 7일의 계대배양 사이클로 유지하였다. 옥수수에 대해 (상기) 설명된 것과 유사한 MTI 화합물을 유사한 농도 범위에서 사용하였다. 오차드그라스 및 쌀 단일 세포는 배양 개시 3-5일 후에 방출되었다.

밀 (품종 안자) 현탁 배양.

안자 밀 캘러스는 배반 조직으로부터 반고체 MS2-D 밀 배지 (부록 III) 상에서 개시하였다. 배반 조직을 멸균 및 함침시킨 조직으로부터 단리하고, 상이한 조직으로부터 유도된 캘러스를 액체 MS-2D 밀 배지 (부록 III)에 옮겼다. 하나의 빠르게 성장하는 세포 현탁액주를 단리하고, MS2D 액체 배지 상에서 7일의 계대배양 사이클로 7년 동안 추가로 계대배양하고, 장기간 (7년) 유지하였다. 단일 세포 생산을 위해, 배양액을 먼저 NB 디캄바 (dicamba) 액체 배지 내에 습관화시켰다 (부록 IV). 안자 밀 배양액은 상기 배지 내에서 균일한 크기의 세포 응집체 단위를 갖는 미세한 현탁액을 생산하도록 조건화할 수 있다. 콜히친, 트리플루아랄린 또는 DAS-PMTI-1을 배지 내에서 계대배양 개시 단계에서 접종물에 25 nM 내지 1 mM 농도 범위로 첨가하였다. 현탁액은 배양 개시 3일 후부터 배지 내로 단일 세포를 방출하였다. 단일 세포는 작고 균일하였다.

부록 I.

LSBY2 배지는 30 g 수크로스 (w/v), 100 mg/l 미오이노시톨, 200 mg/l KH₂PO₄, 1 mg/l 티아민 및 0.2 ㎍/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산을 보충한 무라시게 및 스쿠그 마크로 및 마이크로-염 (Murashige and Skoog 1962)으로 이루어진다. 배지는 120℃에서 오토클레이빙 전에 pH 5.8로 조정한다. 정지기에서 배양 제7일에서 현탁액 부피를 사용하여 배양을 개시하였다. 1-ml 부피의 당근 현탁액 접종물을 50 ml LSBY2 배지에 옮긴 후, 배양액을 진탕기 상에 150 rpm에서 암소에서 28℃에서 놓았다. 사용된 MTI 화합물을 배양 개시 사이클에서 신선한 배지와 함께 첨가하였다.

부록 II .

M-배지는 LS 기초염 및 B5 비타민, 30 g의 글루코스, 1 μM의 각각의 2,4-D 및 키네틴 (Kinetin)으로 이루어지고, 배지를 pH 5.8로 조정한 후, 8 gm/L Noble 아가 (agar)를 배지에 첨가하였다. 이어서, 배지를 오토클레이빙하고, 15X100 페트리 플레이트에 부었다.

부록 III .

MS2D 배지는 2 mg 2,4-D, 0.5 mg 티아민, 30 g 수크로스, 400 mg 미오이노시톨, 400 mg 카제인 가수분해물 (ECH)를 보충한 MS 염 ((Murashige and Skoog 1962) 및 에릭슨 (Eriksson) 비타민으로 이루어진다. 배지 pH를 5.8로 조정한 후 배양액을 오토클레이빙하였다. 현탁 배양액을 7일 간격으로 정기적으로 계대배양하고 (사용된 현탁액의 초기 접종물 6 ml을 54 ml의 신선한 배지 내에), 150 rpm에서 암소에서 28℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 이들 조건 하에, 세포 집단은 접종 2 내지 6일 후 항상 지수 성장 상태였다. 성숙 종자 배반으로부터 캘러스를 유도하기 위한 겔 배지에 대해, MS2D 배지는 pH 조정 후 첨가되는 겔라이트 (Gelrite)의 추가의 성분을 2.5 g/L로 함유하였다.

부록 IV .

NB 디캄바 배지는 NB 기초염, 수크로스 30 g/L, 미오이노시톨 100 mg/L, ECH 카제인 가수분해물 (ECH) 300 mg/L, L-프롤린 (2.5M) 1.7 ml/L, L-글루타민 500 mg/L, 및 6.6 mg/L 디캄바로 이루어진다. 배지는 멸균 여과 전에 pH 5.8로 조정한다.

실시예 11 - 당근 단일 세포 생산 및 당근 단일 세포 현탁 배양액의 Si-C Whiskers 매개 유전자 형질전환

당근 단일 세포 현탁의 개시.

재생가능한 당근 냉동보존 주 (D2-40-018)를 해동시키고, Linsmeier-Skoog (LS) 배지 내에서 배양하였다 (Nagata, T., Nemoto, Y., and Hasezawa, S. (1992) Int. Rev. Cyto 132, 1-30). 배지 염은 파이토 테크놀로지 래보러토리스 (PhytoTechnology Laboratories, 카탈로그 #L689)로부터 구입하였다. 활동적으로 성장하는 현탁액 주가 1 주 내에 확립되었고, 유지주는 2 ml PCV를 58 ml의 LS BY2 현탁액 배지에 28℃에서 회전 진탕기 (Innova-3300) 상에서 125 rpm에서 확산광 하에 7일 배양 사이클로 옮김으로써 계대배양하였다. 단일 세포 생산을 위해, 정지기의 당근 현탁액의 1 ml PCV를 1 mM 콜히친 (시그마, 카탈로그 # C3915)을 함유하는 30 ml의 LS 현탁액 배지 내로 첨가하고, 7일 동안 배양하였다. 단일 세포는 3-7일의 배양액으로부터 생산되었고, 형질전환 실험에 곧바로 사용한다. 당근의 단일 세포는 60 ml의 신선한 LS BY2 액체 배지를 첨가하여 14일의 배양액을 희석함으로써 정지기에서 28일까지 유지될 수 있었다.

당근 단일 세포의 WHISKERS ™ 매개된 유전자 형질전환.

1 mM 콜히친을 함유한 LSBY2 배지 내에서 생산된 단일 세포를 배양 개시 4일 및 11일 후에 관찰하였다. 단일 세포는 플루오레세인 디아세테이트 염색에 의해 결정될 때 매우 활동적이고 생존가능하다. 황색 형광 단백질 발현 캘러스 세포주가 글루포시네이트 암모늄 플레이트 상에서 선택 10일 및 25일 후에 단일 세포 유래된 콜로니로부터 관찰되었다.

당근 단일 세포의 유전자 형질전환.

변형 WHISKERS™ 형질전환 프로토콜 [Petolino, Welter and Cai (2003) Molecular Methods of Plant Analysis, Vol.23, 147-158, Chater 9, Genetic Transformation of Plants, ISBN 3540002928]을 형질전환 실험에서 사용하였다. 실험은 25 ml의 단일 세포 당근 현탁액을 단일 세포 처리 및 배양 개시 후 제4일 및 제11일에 멸균 250 ml IEC-원심분리병 (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific) 카탈로그 #05-433B)으로 옮김으로써 개시하였다. 형질전환은 8.1 ml의 신선하게 제조된 5% Whiskers 현탁액 (Silar SC-9, 어드밴스트 컴포지트 머티리얼스 코프 (Advanced Composit Materilas Corp, 미국 사우쓰캐롤리나주 그리어), 및 PAT 유전자를 구동하는 AtUbi10 프로모터와 YFP 유전자를 구동하는 CSVMS 프로모터를 함유하는 170 ㎍의 pDAB3831을 첨가함으로써 수행하였다. 각각의 형질전환은 변형 페인트 (paint) 혼합기 (레드 데블 이큅먼트 코 (Red Devil Equipment Co, 미국 미네소타주 미네아폴리스)) 내에 놓인 하나의 병으로 이루어지고, 10초 동안 높게 교반한 후, 세포를 500 ml 회수 플라스크로 돌려보내고, 100 ml의 신선한 LSBY2 액체 배지를 첨가하였다. 세포를 1시간 동안 회전식 진탕기 상에서 125 rpm 및 28℃에서 회수하였다.

회수 후, 세포 현탁액의 3 ml 분취액을 부흐너 (Buchner) 깔때기 위에 놓인 멸균 55 mm 넘버 4 여과지 디스크 (와트만 인터내셔널 엘티디. (Whatman International Ltd.)) 상에 균등하게 분배하고, 액체 배지를 흡인 제거하였다. 이어서, 세포가 있는 여과지를 15 mg/l 글루포시네이트 암모늄 및 겔화제로서 0.8% TC 아가를 함유하는 반-고체 LSBY2-B15 배지를 함유하는 60 x 20 mm 페트리 접시 상에 놓았다. 플레이트를 28℃에서 암소에서 인큐베이팅하였다. 10일 후, GFP를 발현하는 세포주를 여과지에서 떼어, LSBY2-B15 반-고체의 개별 플레이트 상에 놓았다. 남아있는 필터 및 세포는 신선한 반-고체 LSBY2-B15 배지로 옮기고, 암소에서 28℃에서 인큐베이팅하였다.

단일 세포 콜로니 세포주의 분석.

형질전환 실험 개시 25일 후에 Leica 도립 형광 스코프 하에 균일하게 형광을 낸 추정 트랜스제닉 세포주를 "EnviroLogix LibertyLink® PAT/pat 플레이트 키트"를 사용하는 감수성 ELISA 분석을 통해 기능적 선택가능 PAT 마커 단백질에 대해 분석하였다. EnviroLogix LibertyLink® PAT/pat 플레이트 키트는 "샌드위치 (sandwich)" 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA)이다. 캘러스 조직을 미세원심분리관에 넣고, 250 ㎕의 추출 버퍼를 첨가하였다. 추출 버퍼는 PBS (피셔 카탈로그 #BP665-1) 및 0.05% Tween-20 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) 카탈로그 #P1379)이었다. 조직을 미세원심분리관 내에서 작은 핸드헬드 (hand-held) 유봉으로 분쇄하였다. 샘플 추출액을 11,000 rcf에서 1분 동안 원심분리하고, 상등액은 ELISA에서 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 및 1:64의 희석에서 사용하였다. ELISA 방법은 Envirologix 키트 카탈로그 번호 AP014에 진술된 바와 같이 따라 수행하였다. 시험에서, 샘플 추출액을 pat 유전자로부터의 PAT에 대해 생성된 항체로 코팅된 시험 웰에 첨가한다. 샘플 추출액 내에 존재하는 임의의 잔류물은 항체에 결합하고, 이어서 효소 (호스래디시 페록시다제) 표지된 PAT/pat 항체의 첨가에 의해 검출된다. 간단한 세척 단계 후, 분석의 결과를 발색 단계로 시각화하고; 발색은 샘플 추출액 내의 PAT/pat 농도에 비례한다.

결과는 음성 대조 조직은 143 mg/250 ㎕의 추출 버퍼의 샘플비에서 PAT ELISA에서 값을 생성하지 않았음을 보여준다. 세포주 001B는 63 mg/250 ㎕의 샘플비에서 83 ng/ml의 ELISA 값을 생성하였고, 이는 캘러스의 mg 당 330 pg의 PAT와 동일하고, 따라서 예상 범위 내에서 형광을 내는 PhiYFP로 및 또한 PAT 선택가능 마커 유전자로 실제로 형질전환된 밝게 형광을 내는 세포주를 나타낸다.

실시예 12 - 미세관 억제제의 화학적 클래스 및 식물 단일 세포 생산.

미세관과 미세원섬유 사이의 병행 진화 (parallelism)는 인과 관계보다는 미지의 분극화 원리에 대한 상호관련 반응을 나타낸다 (Emons et al, 1992). 이는 물로 스트레스를 준 옥수수 (제아 메이즈 (Zea mays)) 뿌리의 성숙 대역 내의 대부분의 세포가 미세관 어레이를 우선형 나선으로, 그러나 미세원섬유를 좌선형 나선으로 갖는다는 몇몇 예에 의해 지지된다 (Baskin et al., 1999). 이와 유사하게, 아라비돕시스 (Arabidopsis) (아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)) 돌연변이체, 미세관 조직화 1 (morl)은 비정상 미세관 어레이를 갖지만, 명백하게 변경되지 않은 미세원섬유 정렬을 갖는다 ([Himmelspach et al., 2003]; [Sugimoto et al., 2003]). 본 발명의 실험에서 단일 세포 현탁액은 대조군과 유사한 성장 반응을 보이고, 여기서 건조 중량은 세포 계대배양 사이클에 걸쳐 증가하고, 이는 방사상 팽창과 함께 등방성 (isotropic) 성장을 보여주는 세포를 갖는다는 사실에도 불구하고 세포가 보다 낮은 농도의 마이크로튜불린 억제제 (MTI)에서 분열하는 것을 나타낸다. 또한, 배지 조성을 변경시킴으로써, 사진을 찍은 등방성 성장을 하는 상기 단일 세포 내에서 세포판을 보는 것이 가능하고, 이는 이들 세포가 실제로 낮은 수준의 MTI 농도에서 분열한다는 사실을 추가로 지지한다. 따라서, 낮은 농도의 미세관 억제제로 처리하고 배지 내에 최적 수준으로 유지된 식물 세포는 변경되지 않고 남은 표층 미세관의 실질적인 집단을 가질 수 있다. 이는 단일 세포가 격막형성체 건설을 포함한 정상적인 세포벽 건설 공정과 함께 진행하도록 허용할 것이고, 이는 세포 분열을 위한 중요한 전제조건이다.

미세관 기능을 부분적으로 억제하고, 낮은 수준에서 이들을 붕괴시키는 선택적인 화합물을 선택하기 위해, 상이한 클래스의 화합물을 스크리닝하였다. 식물 튜불린과의 MTI 상호작용은 잘 특성화되었다 (Hugdahl and Morejohn, 1993). 그럼에도 불구하고, 임의의 억제제에서 비특이적인 효과가 존재한다 (Vaughn and Lehnen, 1991). 따라서, 본 실시예에서, 비특이적인 효과 없이 단일 세포의 성장을 유지시킬 수 있는 화합물을 확인하기 위해 상이한 화학을 갖는 미세관 억제제 클래스의 비교를 평가하였다. 표층 미세관보다 유사분열 미세관에 더 능동적으로 영향을 미치기 때문에, 방사상 팽창을 자극하기 위해 필요한 것보다 더 낮은 농도에서 연장을 억제하는 것으로 알려진 클로르프로팜과 같은 화합물이 존재한다 (Hoffman and Vaughn, 1994). 따라서, 본 발명의 작업의 목적은 등방성 성장을 유지하지만 동시에 비특이적 억제 효과가 낮거나 없으면서 정상적인 세포 기능을 수행하기 위해 낮은 최적 농도에서 충분한 표층 미세관을 보유할 화합물을 선택하기 위한 것이었다.

콜히친은 그의 입체화학 구조 및 작용 방식이 잘 확립되어 있는 트로폴론 유도체이고 ([Keats and Mason, 1981]; [Margolis and Wilson, 1977]; [Raugh and Wilson, 1980], [Murgulis, 1974]), 튜불린 이량체로부터 미세관의 형성을 방지한다. 프로피자미드 및 다른 벤즈아미드는 식물 세포에서 핵 방추에 작용하고 ([Akashi et. al, 1988]; [Bartels PG and Hilton JL., 1973]; [Carlson et. al, 1975]), 일년생 목초 및 광엽 잡초에 대해 효과적인 발아전 제초제로서 개발되었다 (Aya et. al, 1975). 인산 아미드의 용도는 오리잘린 (Surflan) 및 트리플루랄린 (Treflan)을 포함한 디니트로아닐린 제초제의 용도와 유사하다 (Ashton and Crafts, 1981). 트리플루랄린은 디니트로아닐린 제초제 패밀리 중 가장 잘 알려진 대표물질 중 하나이고; 식물 미세관을 파괴하지만 동물 세포에는 효과가 없다 ([Hess and Bayer, 1974]; [Hess and Bayer, 1977]). 피리딘은 하나의 탄소가 질소로 치환된 벤젠 고리를 갖는다. 제초제로서 사용되는 몇몇 치환 피리딘이 존재한다. 상기 군 내에 디티오피르 (Dimension®) 및 티아조피르 (Visor®)가 있다. 디티오피르는 매우 다양한 잡초를 제어하기 위해 잔디밭에만 사용되는 선택적인 발아전 및 발아후 물질이다. 이는 종종 다른 제초제와 함께 및 비료 상에 제제화된다. 티아조피르는 실질적으로 모든 잡초에 대해, 및 감귤, 면, 옥수수, 땅콩, 대두 및 감자를 포함한 매우 다양한 농작물에 대해 잘 작용하는 선택적인 발아전 화합물이다. 따라서, 피리딘은 기능상 미세관 회합 억제제인 것으로 보인다.

물질 및 방법

JTNT1 담배 현탁 배양. JTNT1 담배 세포 현탁 배양액을, 1 ml의 충전 세포 부피 (PCV)를 20 ml의 담배 배지 (MS 염, 미오이노시톨, 티아민 HCl (1 mg/ml), 이염기성 인산칼륨 (무수), MES, 2,4-D (10 mg/ml) 및 3% 글리세롤 (NT1B 배지)) 내로 계대배양함으로써 유지하였다. 세포주를 7일마다 계대배양하고, 시험을 위해 필요한 경우 부피를 팽창시켰다. 1 M 수크로스는 탁솔 유도된 식물 튜불린 중합화의 속도 및 정도를 모두 억제하였다 (Bokros et al., 1993). 1 M 수크로스의 존재 하에 식물 튜불린 중합화의 조사 (APM (아미프로포스메틸) 및 오리잘린 모두)는 식물 미세관 길이를 농도-의존적으로 감소시켰다 ([Morejohn and Fosket, 1984]; [Morejohn et al., 1987]). 또한, Suc는 수행된 미세관을 안정화시켜, 수행된 미세관 상의 MTI의 효과의 검사를 실행 불가능하게 한다. 또한, 수크로스는 용액 점도를 실질적으로 증가시키고, 튜불린 중합화는 적어도 부분적으로 느려진 이량체 및 중합체 확산 속도에 의해 변경된다. 따라서, 단일 세포가 생산되는 배지 내에 수크로스가 적거나 없는 것이 중요하였다. 따라서, 글리세롤 내에 습관화된 새로운 JTNT1 주를 본 연구를 위해 개발하였다.

처리를 위해, 우수한 세포 분포를 허용하기 위해 종종 회전시키면서 (현탁액 응집체는 침강하는 경향이 있으므로) 20 ml의 배지 중 1 ml PCV를 사용하여 현탁액 주를 제조한 후, 24-웰 미세적정 플레이트의 웰로 옮겼다. 각각의 24 웰은 1 ml의 JTNT1 현탁액을 함유하였다. 24-웰 플레이트를 6개 이하의 플레이트 높이로 플레이트를 쌓기 위해 특수 클램프 및 설비 (harness)를 갖는 Innova 4900 Multi Environmental 진탕기 상에 유지시켰다. 플레이트를 130 rpm의 속도 및 25℃에서 암소에서 회전시켰다.

단일 세포 생산. 각각의 화합물을 디메틸 술폭시드 (DMSO) 내에 용해시켜 0.5 몰 스톡 용액을 제공하였다. 1 ml의 JTNT1 현탁액 (1 ml PCV/20 ml 담배 배지)를 24 웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 웰에, 개별 화학물질을 요구되는 농도 (1 μM, 3 μM, 및 10 μM)를 달성하도록 첨가하였다. 배양액을 Innova 진탕기 상에서 7일 동안 성장시켰다. 매일, SpectraMax M2e (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular devices))를 사용하여 각각의 웰 상에서 탁도 (turbidity) 측정치를 취하였다 (600 흡광도에 설정, 웰 당 5개의 판독치를 취함). 제7일에, 세포를 Leica 5000 도립 공초점 현미경을 사용하여 단일 세포의 형성 및 세포 생활력에 대해 관찰하였다.

(±)-4S,5R-4-니트로-5-(2,3,4-트리메톡시페닐) 시클로헥센 (트리메톡시페닐시클로헥센)

LSBY2 글리세롤 배지 내에서 BY2 단일 세포를 통한 클로날 캘러스 세포주 생산. 담배 BY-2 세포 (Nagata et al., 1992)를 문헌 [Shaul et.al, 1996]에 설명된 변형 프로토콜을 통해 pDAB1590에 의해 형질전환시키고, 4일의 동시-배양 후 LSBY15 상에서 선택하였다. 초록 형광 단백질 발현 캘러스 세포주를 회수하고, 캘러스를 LSBY2 B15 배지 상에 유지하였다. 1개월 내에, 캘러스 세포주는 직경 수 센티미터로 성장하였고, 세포를 신선한 선택제 내에서 영양분을 보충하여 유지하고 균질하게 GFP를 발현하는 캘러스를 선택하기 위해 작지만 밝게 형광을 내는 조각 (~2 내지 5 mm² 응집체)을 신선한 고체 배지에 옮겼다. 500 mg 조각의 캘러스를 250 ml 진탕 플라스크 내에서 50 ml의 LSBY2-Gly-B15, 3% 글리세롤 및 1% 수크로스를 탄소원으로서 함유하는 변형 LSBY2 액체 배지로 옮겼다 (130 rpm에서 25℃에서 암소에서). 매주 0.5 ml 충전 세포 부피 (PCV)의 세포를 사용하여 현탁 배양을 개시하였다. 따라서, 초록 형광 단백질 (GFP) 발현 캘러스 및 현탁액 응집체를 각각 매달 및 7일 주기로 유지하였다.

GFP 발현 단일 세포의 생산. 정지기에 0.5 ml 충전 세포 부피 (PCV)의 GFP 발현 현탁액 응집체의 첨가와 함께 LSBY2-Gly-B15 배지 내에서 7일 배양 사이클의 개시 동안 1 μM 농도의 화합물 DDP (디페닐피라졸)를 첨가함으로써 단일 세포를 생산하였다. 별법으로, 25-ml의 현탁액 응집체를 현탁액 내에 1 μM 최종 농도를 제공하도록 DMSO 내에 용해시킨 50 ㎕의 1M 디페닐피라졸 스톡 용액을 첨가함으로써 25-ml의 신선한 LSBY2-Gly-B15 현탁 배지에 옮겼다. 따라서, 단일 세포는 단지 3.5일의 훨씬 더 짧은 사이클에서 생산될 수 있었다. LSBY215 배지는 항상 선택을 위해 15 mg/l 글루포시네이트 암모늄을 함유한다.

GFP는 3.5 또는 7일 배양 사이클을 통해 단일 세포 내에서 키메라 단백질로서 발현되었고, 키메라 구성체의 GFP 발현이 살아있는 세포에서 Leica 현미경을 사용하고 또한 Zeiss Axiovision 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용한 통상적인 에피형광 (epifluorescence)을 이용하여 관찰되므로 세포내 위치에 존재하였다. 핵 및 세포질 스트랜드를 포함한 많은 세포내 컴파트먼트에서 발현이 보였다.

결과 및 논의.

세포는 글리세롤을 함유하는 담배 배양 배지 내에서 매우 건강하였고, 세포 집단은 아주 분명하였다. 세포는 당을 사용한 대조군에 비해 생물량에서 ~50% 감소하였지만 7일 기간에 걸쳐 우수한 생물량 증가를 보여주었다. DMSO 유도된 효과가 없음을 확실히 하기 위해 대조 배양액은 또한 0.1% DMSO를 함유하였다. 수크로스 또는 글리세롤 배지에 1 μM (4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르 (디페닐피라졸)을 첨가하면 세포의 생물량을 각각의 대조군으로부터 유의하게 감소시키지 않았고, 이는 디페닐피라졸의 존재 하의 대조군에 유사한 단일 세포의 활동적인 성장이 존재함을 나타낸다. 성장 곡선은 배양액을 2회의 부사이클 (subcycle) 또는 3.5일을 통해 취할 때 유사하다. 글리세롤 배지 내에서 단일 세포 생산은 또한 대조군에 비해 매우 높은 생존가능한 세포를 보여준다.

트리플루랄린, 오리잘린, 및 마이크로튜불린 안정화제 클래스 화합물, 예를 들어 탁솔을 포함한 몇몇 다른 화합물을 유일한 탄소원으로서 3% 글리세롤을 함유하는 NT1B 배지 내에서 배양된 담배 JTNT1 현탁 배양액으로부터 단일 세포를 생산하는 효율에 대해 연구하였다. 이들은 콜히친, N-(1,1-디메틸프로피닐)3-클로로벤즈아미드, 프로피자미드 및 트리플루랄린이었다. 이들 연구에서, 화합물은 그들의 단일 세포 생산 효율에서 및 용량-반응 곡선의 가파름에서 상이하였다. 오리잘린은 시험된 다른 화합물과 같이 단일 세포의 직경을 적어도 4배 증가시키고, 역치의 약 10배의 포화 농도를 가졌다. 콜히친은 직경을 5배 증가시키고, 더 가파른 용량-반응 곡선을 가졌고, 이는 이들 2개의 화합물이 고용량에서 작용하기 위해 바람직할 수 있음을 나타낸다.

단일 세포를 생산하기 위해 필요한 농도는 콜히친에 대해 50 μM 내지 2 mM, 및 프로피자미드, N-(1,1-디메틸프로피닐)3-클로로벤즈아미드에 대해 10 nM 내지 100 μM 범위였다. 그러나, 최적 단일 세포 생산을 위한 오리잘린 및 트리플루아랄린의 농도는 100 nM 내지 1 mM이었다. 그러나, 고농도의 이들 화합물은 처리된 세포에서 발생한 단백질 합성, 색소체 및 미토콘드리아 분열을 증가시켜, 21일 동안 배양된 당근 세포에서 보이는 것과 같이 핵 배수체를 갖는, 직경 300 ㎛ 이하의 거대 세포를 형성시킨다. 이들 결과는 유사분열 억제가 연구된 고농도에서 이들 화합물의 기본적인 효과임을 제안한다. 따라서, 최적 농도의 MTI뿐만 아니라 화합물의 화학 (미세관에 대해 매우 선택적인 기능을 갖지만 세포 분열 기능에 유사한 비선택적인 기능을 가질)을 유지하는 것이 중요한 것으로 보인다. 목적에 따라, 앞서 설명된 디페닐피라졸 이외에 다른 화합물을 아래에 설명한다.

BY2 현탁액 응집체를 LSBY2 당 배지 내에서 관찰하였다; 변형 LSBY2 배지 내에 세포판을 보여주는 1 μM 디페닐피라졸 내에서 생산된 분열하는 BY2 단일 세포; 디컨볼루팅된 BY2 GFP 트랜스제닉 세포 및 LSBY2-15 겔 배지 상의 단일 클로날 콜로니 세포주.

LSBY2 글리세롤 배지 내에서 담배 BY2 단일 세포 생산의 요약.

응집체 현탁액으로부터 1μM 디페닐피라졸 내에서 생산된 단일 세포는 3.5일의 배양 시에 90%의 세포에서 하나 또는 2개의 핵소체를 갖는 단일 핵을 보여준다. 이들 세포는 응집체 현탁액을 형질전환시키기 위해 사용된 pDAB 1590 플라스미드가 선택가능 마커로서 PAT를 갖기 때문에 선택제로서 15 mg/l 글루포시네이트 암모늄 및 0.8% TC 아가를 함유하는 LSBY2 겔 플레이트 상에 플레이팅될 수 있다. 세포를 액체 배지 내에 1:4 희석으로 희석하고, 겔 배지 상에 플레이팅하고, 플레이팅 21일 후에 클로날 세포주를 선택하였다.

아미프로포스메틸 (APM)에 관하여, JTNT1 현탁액에 첨가될 때, 1-10 μM 농도에서 단일 세포가 형성되었고; 보다 높은 농도에서, 성장이 현저하게 감소하고, 세포 분열이 억제되었다. DMSO만을 사용하는 대조군에 비해 1 μM 및 3 μM APM의 사진에서 둥근 분리된 세포를 볼 수 있다. JTNT1 담배 세포는 건강한 황색 색상이고, 1 μM 및 3 μM APM의 존재 하에 잘 성장하였다. 플루오레세인 디아세테이트 및 프로피듐 요요드 염색에 의해 측정할 때 세포 생활력은 70%까지의 생활력을 보여주었다.

또한, APM이 글리세롤 배지 내에서 JTNT1 담배 세포의 단일 세포 생산을 유도하였음이 관찰되었다. JTNT1 대조 현탁액 응집체는 글리세롤 및 0.1% DMSO를 함유하는 배지 내에서 관찰되었고; JTNT1 단일 세포는 1, 3, 및 10 μM APM을 함유하는 NT1B 글리세롤 배지 내에서 관찰되었다.

디티오피르는 미세관을 붕괴시키는 치환 피리딘 제초제의 클래스에 속한다. JTNT1 현탁액에 1 μM, 3 μM, 및 10 μM의 농도로 첨가될 때, 1 μM 및 3 μM 농도에서 단일 세포가 형성되었지만 (사진 E 및 F), 10 μM 농도에서는 단일 세포를 가졌다 (그리고 세포의 농도는 낮았다). 디티오피르를 사용할 때 시험된 모든 농도에서 담배 세포는 건강하고, 성장하고, 황색 색상이었다. 1 μM 및 3 μM 디티오피르로 처리한 후 세포 생활력은 70-80%이었고, 이는 보다 높은 생활력을 나타낸다.

콜히친 모방체 (Evans et al, 2003)인 (±)-4S,5R-4-니트로-5-(2,3,4-트리메톡시페닐)-시클로헥센 (트리메톡시페닐시클로헥센)을 JTNT1 담배 배양액 내에서 그의 단일 세포 생산 효율에 대해 시험하였다. 세포가 가볍게 표백되지만 (이들은 약간 더 흐린 황색이었다), 세포는 플레이트 상에서 매우 잘 성장하였다. 상기 화학물질은 1 μM, 3 μM, 및 10 μM에서 단일 세포의 형성을 촉진하였다. 세포는 둥글고, 모든 수준에 걸쳐 세포 생활력은 80-90%이었다. 세포 성장 억제는 시험된 농도 사이에서 다소 유사하고, 세포는 높은 생활력을 갖고 세포독성의 적어 건강하였다.

따라서, JTNT1 담배 세포의 유도된 단일 세포 생산이 10 μM 농도의 트리메톡시페닐시클로헥센 내에서 유도된 글리세롤 배지 내에서 관찰되었다.

수퍼 ( Super ) 단일 세포. 당근 현탁액 응집체를 1 mM 콜히친 내에서 60 ml의 LSBY2 액체 배지 내에서 배양하고, 동일한 배지 내에 28일까지 유지할 수 있었다. 제2 계대배양 후 성장은 14일 후에 감퇴하지만, 세포는 계속 성장하여 살아있고 건강한 (그러나 핵 배수체의 발생을 나타내는 광범한 엽상 (lobed) 핵을 보여주는) 수퍼 단일 세포를 형성한다. 몇 개의 핵을 갖는 당근 수퍼 단일 세포가 LSB Y2 배지 내에서 연속 1 mM 콜히친을 사용한 21 d령 세포에서 관찰되었다.

결론. 이들 시험 수준에서 세포 성장은 시각적 관찰, 건조 중량 (제7일에만 취함), 및 탁도 판독에 의해 관찰되었다. 도 15는 7일 기간에 취한 탁도 판독치를 도시한다. 탁도 판독치는 배지만 (3% 글리세롤 함유) 및 미세관 억제제를 1 μM, 3 μM, 및 10 μM 농도로 함유하는 플레이트에 상대적이다. 대조군은 최선의 성장 패턴을 갖는 반면, 예상된 바와 같이, 시험된 화학물질은 1 μM 및 3 μM의 비율에서 세포주를 죽이지 않았다. 모든 처리에서의 세포는 대략 동일한 시점 (제3일)에 성장 속도의 증가를 경험하였고, 세포 부피는 제7일에 여전히 증가하였다. 이는 화학적으로 처리된 세포가 적어도 7일 동안 생존가능하게 유지됨을 보여준다.

실시예 12. 참조 문헌:

실시예 13 - MTI 생산된 단일 세포 세포내 구조에 대한 비교 조사, 세포발생, 및 분자 게놈 불안정성 평가.

조직 배양 유래된 식물 내에서 총 게놈 안정성을 몇몇 식물 종에서 세포유전자 수준에서 연구하였다 ([Shoyama et. al. 1995]; [Zoriniants et. al. 2003]). 엠블링 (embling) 유래된 식물의 안정성에 관하여, 세포유전자 연구에서는 대조되는 관찰이 밝혀졌다. 문헌 [Odake el. al. (1993)]에서는 각각 겔랑 검 (Gellan Gum)-고화 배지 및 액체 배지로부터 얻은 아스파라거스 오피시날리스 엘. (Asparagus officinalis L.)의 66.7% 및 100% 엠블링에서 염색체 배가 (doubling) (2배체에서 4배체로)를 보고하였다. 이와 대조적으로, 문헌 [Mamiya et. al. (2001)]에서는 에이. 오피시날리스에서 체세포 배발생 동안 배수성 변화를 보고하지 않았다. 배양 배지 내에 사용된 합성 옥신, 예를 들어 2,4-D (2,4-디클로로페녹시아세트산) 및 NAA (나프탈렌 아세트산)은 체세포성 (somaclonal) 변이와 연관되는 것으로 보고되었다 ([Karp 1989]; [Phillips et. al. 1994]). 실제로, 2,4-D가 사용된 당근 (Ronchi et. al. 1992) 및 포플러 (Rugh el. al. 1993) 체세포 배발생 시스템 모두에서 배수성의 감소가 보고되었다. 마이크로튜불린 억제제 (MTI)는 또한 식물 세포에서 배수성을 증가시킨다. 그러나, 농도 및 MTI 화합물 클래스는 배수성의 성질 또는 배수성의 부재를 결정한다. 예를 들어, 오리잘린은 TBY2 세포에서 핵 배수체를 유도하지만, 프로파자미드는 유사한 농도에서 그렇지 않았다 (Ehsan et. al, 1999). 이와 유사하게, 당근 현탁 세포의 장기 노출은 보다 높은 농도의 콜히친에서 핵 배수체를 유도한다. 당근 현탁 세포는 14-21일의 연속 처리로부터 1 mM 콜히친 배양된 단일 세포 내에서 핵 배수체를 보였다. 그러나, 상기 배수성 수준의 빈도는 배양액 내에서 14일까지 훨씬 적고 1% 미만이고, 이는 옥신 배양된 대조 현탁액에 대해 보고된 대조 값과 유사하다 ([Karp 1989]; [Phillips et. al. 1994]). 그러나, 본 연구에서 시험된 화합물 중에서, (4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르 및 4S,5R-4-니트로-5-(2,3,4-트리메톡시페닐) 시클로헥센은 14일의 연속 처리에서 핵 배수성 비율이 적거나 없으면서 효율적인 단일 세포 생산을 보였다.

임의의 경우에, 상기 저세포독성 MTI를 사용하는 세포 응집체로부터 단일 세포 유도 공정은 여전히 상이한 유전자 발현 프로필을 갖는 단일 세포의 기존의 유전자 발현 패턴을 변경할 수 있다. DNA 메틸화는 시험관 내에서 체세포성 변이를 일으키는 바람직하지 않은 결과를 촉발하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, MTI는 분자 변이 또는 불안정성을 일으킬 수 있는 변화를 유도한다. 에라그로스티스 커불라 (Eragrostis curvula)의 4배체에서 콜히친 유도된 염색체 배가에서 1.09%의 다형성 (polymorphic) 비율이 보고되었다 (Mecchia et. al. 2007). 이. 커불라 종자를 처리하기 위해 사용된 콜히친의 농도 수준은 0.05%이다. 본 연구의 목적은 1 μM (4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르 내에서 생산된 JTNT1 단일 세포에서 게놈 안정성을 평가하기 위한 것이었다.

조직 배양 유래된 식물 내에서 체세포성 변이의 수준을 확인하기 측정하기 위해 AFLP, RAPD (급속 증폭된 다형성 DNA), RFLP (제한 단편 길이 다형성)와 같은 다양한 분자 방안을 시도하였다 ([Devarumath el. al. 2002]; [Martins et. al. 2004]; [Sanchez-Teyer et. al. 2003]; [Hale and Miller 2005]). 그러나, 사용된 방법과 무관하게, 단지 매우 적은 비율 (1% 훨씬 미만)의 게놈이 다산 기술 (샘플링된 로커스의 수의 면에서)에 의해 분석될 수 있다. 이용가능한 각종 기술 중에서, AFLP는 프라이머쌍 당 일반적으로 50-100개의 로커스가 분석되어 가장 고도로 다중적이다. 이들 로커스는 게놈 전체에 다소 무작위로 산재하는 것으로 생각되고, 따라서 AFLP는 조직 배양-유도된 변화를 검출하기 위한 최선의 기회를 제공한다. 또한, AFLP는 또한 재배종 확인 및 변동성 분석을 위한 보다 우수한 분자 기술 중 하나이다 (Hale and Miller 2005). 따라서, 상기 평가 방법을 본 연구에서 사용하기 위해 선택하였다.

물질 및 방법.

JTNT1 담배 단일 세포 개시 및 샘플 수집. JTNT1 담배 단일 세포 배양은 2가지 상이한 배지, 즉, 3% 수크로스를 함유하는 NT1B (NT1B-Suc) 및 3% 글리세롤을 함유하는 NT1B (NT1B-Gly) 내에서 3.5일 배양 사이클로 개시하였다. 배양은 각각의 배양 배지 내에 유지된 정지기 배양액에서 12.5-ml 현탁액 응집체를 첨가함으로써 시작하고, 1 μM (4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르 (디페닐피라졸)을 함유하는 125-ml 진탕 플라스크 내의 12.5-ml 신선한 배양 배지에 옮겼다. 플라스크를 폼 스토퍼 (foam stopper)로 밀폐하고, 회전 진탕기 상에서 130 rpm에서 암소에서 25-28℃에서 배양하였다. 배양액을 14일 기간까지 3.5일마다 계대배양하였다. 배양액의 4개의 샘플 (0.2% DMSO를 함유하는 Suc/Gly 배지 내의 Suc/Gly 성장된 세포 및 대조 배양액)을 3.5일마다 현탁액을 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 수확하였다. 샘플을 즉시 동결건조시켜 임의의 세포 산화를 방지하여 수확 후 도입된 샘플에 대한 임의의 유해한 효과를 방지하였다. 단일 세포를 획스트 (Hoechst) 핵 염료로 1시간 동안 염색하고, 스코프 하에 임의의 핵 이상에 대해 2회 배양 사이클까지 관찰하였다.

단일 세포의 세포학적 특성화.

세포 생활력 및 세포벽. 확립된 JTNT1 단일 세포를 사용하여, 효모에서 생활력 시험을 위해 사용되고 2가지 색상 형광 프로브를 함유하는 FUN1 (F-7030, 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes), 인비트로겐 인크 (Invitrogen Inc)) 세포 염료로 염색하였다. 3번째 것인 세포벽을 염색하는 칼코플루오르 화이트 (Calcofluor White) M2R을 사용하여 세포를 염색하였다. JTNT1 단일 세포에 대해, 20 ㎛의 FUN1 염료를 첨가하고, 배양액을 실온에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 1 mL의 신선한 배양 배지를 첨가하여 과량의 염료를 세척하고 3000 rpm에서 원심분리하고; 상등액을 폐기하였다. 세포를 Zeiss ApoTome 현미경 상에서 검사하고 영상화하였다.

형질막. JTNT1 세포를 5 ㎛ FM4-64 (스티릴 염료)와 함께 5분 동안 인큐베이팅하고 신선한 배지로 세척하였다. 배양액을 3000 rpm에서 원심분리하고, 신선한 배지를 첨가하였다. 세포를 Zeiss ApoTome 현미경 상에서 시각화하였다.

핵. 단일 세포를 획스트 핵 염료를 사용하여 1시간 동안 염색하고, Zeiss Apo Tome 상에서 임의의 핵 이상에 대해 2회 배양 사이클까지 관찰하였다. 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 염료를 또한 배수성 특성화에 대해 핵 구조를 관찰하기 위한 살아있는 핵 염료로서 사용하였다.

세포골격. 팔로톡신은 액틴 필라멘트에 결합한다. Alex Fluor 488 팔로이딘 (A12379, 인비트로겐 인크)을 사용하여 단일 세포를 염색하였다. 6.6 ㎛의 Alex fluor를 단일 세포에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이팅하고, 현미경 상에서 영상화하였다.

게놈 불안정성에 대한 분자 평가.

DNA 추출. 대표적인 샘플로부터의 게놈 DNA를 3.5, 7, 10.5, 및 14일로부터 수확하였다. 대조군 (10개 샘플)과 함께 Suc 및 Gly 배양액을 CTAB 프로토콜을 이용하여 추출하였다 (부록-실시예 12 참조). DNA를 PicoGreen® 염료 (몰레큘라 프로브스, 인크. (Molecular Probes, Inc.; 미국 오레곤주 유진))을 사용하여 정량하였다. 미세적정 플레이트의 각각의 웰은 40x 희석에서 10 ㎕의 DNA 샘플 또는 Lambda DNA 표준품 (0, 2.5, 5 및 10 ng/㎕)과 합한 90 ㎕의 200배 피코그린을 함유하였다. 플레이트를 표준 플레이트 진탕기를 사용하여 잠깐 동안 진탕시키고, 형광을 Spectra Max GeminiXS 형광계 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices; 미국 캘리포니아주 서니베일))를 사용하여 판독하였다 (여기 ~480 nm, 방출 ~520 nm). 각각의 샘플을 삼중으로 정량하고, 3개의 결과의 평균을 후속적인 희석에 사용하였다. DNA 샘플 농도는 멸균수를 사용하여 91 ng/㎕의 작업 농도로 희석하였다.

AFLP 분석. 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP) 분석은 문헌 [Bryan et. al. (2002)]에 설명된 바와 같이 보스 (Vos) 등 (1995)의 프로토콜의 변형을 이용하여 수행하였다. 6-bp 절단 제한 효소 EcoRI를 4-bp 절단 제한 효소 MseI과 조합으로 사용하였다. EcoRI 형광 표지되고 MseI 표지되지 않은 AFLP 프라이머는 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)로부터 주문하였다. AFLP 분석은 하나의 변형을 갖는 선택적인 증폭 반응을 통해 어플라이드 바이오시스템즈의 AFLP 식물 매핑 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 변형은 소화/라이게이션 반응이 37℃에서 밤새 인큐베이팅된 것이었다. 선택적으로 증폭된 산물을 멸균 탈이온수 내에 2배 희석하였다. 0.5 ㎕의 희석된 산물을 5 ㎕의 로딩 버퍼 (500 ㎕ ABI HiDi 포름아미드와 혼합된 5 ㎕ GeneScan 500 bp LIZ 크기 표준품)와 합하였다. 샘플을 표준 조건을 이용하여 G5-RCT 스펙트럼 매트릭스를 갖는 AB3730XL DNA 분석기 상에서 분석하였다. 이어서, 데이타를 GeneMapper® 버전 4.0 (어플라이드 바이오시스템즈, 2005) 내로 도입하였다. 대립유전자에 PCR 단편 크기에 따른 수치값을 배정하였다.

결과 및 논의.

단일 세포의 세포학 및 다른 세포내 평가.

세포벽 및 세포 분열. 세포 배양 동안, 성장 및 분화가 일어나고, 세포의 형상 및 구조는 세포벽에 의존한다. 단일 세포는 전형적인 원형 세포를 보여주고 크기가 3-10배 증가하는 등방성 성장을 보였다. 세포벽 구조를 이해하기 위해, 칼코플루오르 (셀룰로스에 대해 결합 친화도를 갖는 증백제)를 사용하였다. 단일 세포 내에서, 구분되는 원형 벽이 관찰되었다. 세포벽은 세포 형상을 결정하는데 중요한 역할을 하고 환경 인자와 상호작용하는 동적 구조이다. 관찰된 대부분의 단일 세포가 구형 세포를 보였지만, 벽판을 갖는 분열하는 세포를 보는 것이 가능하였다. 건조 중량의 증가는 이들 단일 세포에서 세포 분열이 일어난다는 또 다른 표시이다. MTI 내에서 배양의 14일 후, 단일 세포를 MTI가 없는 배지에 옮기면, 세포는 이방성 (anisotropic) 성장의 가역성을 보여주는 응집체 현탁액을 재구성하였다.

형질막. 형질막은 모든 세포 내용물을 둘러싸는 세포의 중요한 성분 중 하나이다. 이는 세포벽의 윤곽을 형성하고, 세포 내부와 환경 사이에 최종 필터를 제공한다. 친양쪽성 FM 스티릴 염료는 살아있는 진핵생물 세포에서 소기관 조직화 및 소포 트래피킹 (vesicle trafficking)을 연구하기 위해 유용하다 (Bolte et. al., 2004,). 초기에, FM 염료는 형질막 (PM)에 국소화한 후, 액포 (vacuole) 및 소포에, 이어서 엔도좀 내로 세포내 도입된다. FM4-64 (막 선택적 형광 염료)는 형질막을 염색한 후, 세포 내의 다른 소기관에 내재화된다 (Ueda et. al, 2001). 염색 5분 후, 단일 세포 형광을 형질막 상에서 관찰하였고, 구조적 결함은 없었다. 셀룰로스 네트워크를 제거하기 위해 100 nM 이속세벤 (Isoxeben)을 사용하는 단일 샘플에서, FM4-64는 표면 상에 광범한 소포를 보였다. 막은 5분 이내에 능동 세포내 도입을 보였다.

핵. MTI 처리된 식물 세포에서 핵 조직화는 복잡한 것으로 보고되었고, 핵 배수체는 보다 높은 농도에서 일반적인 것으로 나타난다. 샘플을 1 μM 농도의 디페닐피라졸 및 트리메톡시페닐시클로헥센 내에서 7일까지 검사하였다. 핵 소기관 구조는 다양한 염색 (Hoechst3325)을 사용하여 분석하였다. JTNT1에서, 단일 세포는 1 μM 농도의 디페닐피라졸 및 트리메톡시페닐시클로헥센 내에서 3.5d 배양에서 하나의 핵 또는 2개의 핵소체를 갖는 단일 핵을 함유한다. 그러나, 고농도의 이들 화합물은 21일 동안 배양된 당근 세포에서 보이는 것과 같이 핵 배수체를 갖는, 직경 150-300 ㎛의 거대 세포를 형성시킨다. 이들 결과는 유사분열 억제가 연구된 고농도에서 이들 화합물의 기본적인 효과임을 제안한다. 따라서, 최적 농도의 MTI뿐만 아니라, 미세관에 대해 매우 선택적인 기능을 갖지만 세포 분열 기능과 유사한 비선택적인 기능을 갖지 않을 화합물의 화학을 유지하는 것이 중요하다.

세포골격. 세포골격은 세포 구조의 구조적 통합성에 관여하는 몇몇 구조 단백질, 예를 들어 F-액틴 및 튜불린으로 이루어진다. 세포골격 생체 내 동력학을 보다 밝고 덜 pH 의존적인 초록 형광 Alexa flour 488 액틴 컨쥬게이트 (A12373)를 사용하여 연구하였다. 미세관 및 액틴 필라멘트는 식물 세포의 성장 및 분화 및 생존을 위해 식물 세포에서 세포골격 구조의 유지를 위한 필수 구조이다 (Kost et. al, 2002). 팔로이딘으로 염색된 단일 세포는 액틴 필라멘트 세포골격을 보여주었고, 세포 구조가 정상적이므로 필라멘트의 결함 있는 배치는 없었다.

분자 분석. AFLP 분석에서는 EcoRI (메틸화 비감수성 제한 효소)의 사용에 기반한 10개 프라이머 조합을 포함하였다. 프라이머쌍 중 2개는 증폭하지 못하였고 (p6 및 p10), 프라이머쌍 중 2개는 임의의 단편에 대해 차이를 보이지 않았다 (3p 및 8p). 프라이머쌍 1p, 2p, 3p, 4p, 5p, 7p, 8p, 9p에 대한 명백하게 분리된 단편의 수는 각각 47, 39, 31, 42, 47, 32, 7 및 46이었다. JTNT1의 14일 글리세롤 배양된 샘플 (제4 계대배양 사이클)을 제외하고는, 메틸화 비감수성 (즉 EcoRI-MseI) 프라이머 조합으로 처리된 모든 샘플 사이에서 AFLP 다형성이 검출되지 않았다. 이와 대조적으로, 글리세롤 배양된 샘플에 대한 모든 다른 샘플에서 다형성 단편이 확인되지 않았다. 수크로스 처리된 샘플은 시험한 임의의 프라이머 조합에 대해 임의의 단편에 대해 다형성을 보이지 않았다. 예상된 바와 같이, 적어도 3회 계대배양 사이클에 대해 단일 세포 샘플에서 차이가 없었다. 그러나, 4회 계대배양 사이클에서, 글리세롤 배양액에서 다형성은 수크로스의 결핍에 의해 부여된 스트레스 (이는 불안정성을 촉발한 것으로 보인다) 이외에, 화합물의 연속 존재로 인한 것일 수 있다. 다형성을 보이지 않는 JTNT1 단일 세포 배양에서의 차이는 단순 탄소원 글리세롤이 미세관을 안정화시키는 것으로 알려져 있지만, 특히 마이크로튜불린 억제제 (MTI)의 장기 존재 하에 많은 세포성 기능을 지지할 수 없음을 제안한다. 임의의 경우에, 단일 세포 처리는 게놈 불안정성 문제없이 적어도 4회의 계대배양 사이클에 대해 디페닐피라졸을 사용하여 시험된 농도 범위 내에서 성공적으로 제조될 수 있었다.

프라이머 5p에 대한 2 다형성의 스냅 샷을 취하였다. 계대배양 4는 130 bp 단편 삽입 및 131 bp 단편 결실을 가졌다.

프라이머쌍 조합을 갖는 메틸화 비감수성 효소 EcoRI 및 MseI의 사용을 포함하는 AFLP 프로필을 결정하였다. 4회 계대배양 사이클에 대한 모든 샘플은 단형성 (monomorphic)인 반면에, 제4 계대배양 사이클에서 글리세롤의 프로필은 다양한 로커스에서 다형성이었다.

표 2: 사용된 AFLP 프라이머 조합 및 관찰된 밴드의 상응하는 수에 관한 상세한 내용을 제공한다. Suc-X, NT1B-수크로스 배지 중 단일 세포; Gly-X, NT1B-글리세롤 배지 중 단일 세포; Cont-Suc, 수크로스 중 대조 JTNT1 현탁 응집체; Cont-Gly, 글리세롤 중 대조 JTNT1 현탁 응집체

프라이머 조합	프라이머 서열 (5'에서 3')	다형성 밴드의 수
		Cont Suc	Cont Gly	3.5d Suc	3.5d Gly	7d Suc	7d Gly	10.5d Suc	10.5d Gly	14d Suc	14d Gly
EcoRI/MseI 조합
1p	AC/CAG	n/a	n/a	0	0	0	0	0	0	0	5
2p	AGC/CAG	n/a	n/a	0	0	0	0	0	0	0	10
3p	AGC/CTG	n/a	n/a	0	0	0	0	0	0	0	0
4p	ACT/CTT	n/a	n/a	0	0	0	0	0	0	0	5
5p	ACT/CAG	n/a	n/a	0	0	0	0	0	0	0	3
6p	ACT/CTG	n/a	n/a
7p	ACC/CAG	n/a	n/a	0	0	0	0	0	0	0	4
8p	ACC/CTG	n/a	n/a	0	0	0	0	0	0	0	0
9p	ACA/CAG	n/a	n/a	0	0	0	0	0	0	0	7
10p	ACA/CTG	n/a	n/a
총											34

균일성의 분자 유전학적 평가. AFLP 다형성 (사용된 10개의 프라이머 조합 중 9개의 프라이머 조합에 대한 제4 계대배양 사이클의 글리세롤 성장된 단일 세포 현탁액 중에서)이 본 연구에서 보였다. 모든 관찰된 변동성은 EcoRI/MseI를 사용하여 생성된 단편에 관련한다. 조직 배양 동안 메틸화 상태의 증가가 잎 (Smulders et. al. 1995) 및 완두콩의 조직 배양 재생체 (Cecchini et. al. 1992)에 비해 토마토 캘러스에 대해 이전에 보고되었다. 따라서, 메틸화 기반 변동을 추가로 평가하기 위해, 메틸화 감수성 PStI/MseI 조합을 사용하는 추가의 평가를 실시할 수 있다.

부록 - 실시예 13

담배 세포 현탁액/캘러스 조직으로부터 CTAB DNA 추출

1. ~25 mg의 동결건조된 조직을 2 ml 에펜토르프 튜브 내로 칭량한다.

2. 스테인레스 스틸 비드를 조직이 있는 튜브 내에 넣고, 제노-그라인더 (geno-grinder) 또는 페인트 진탕기 상에서 약 1분 동안 진탕시킨다. (제노-그라인더는 500 스트로크/min으로 설정함). 비드를 제거하고, 조직 응집을 감소시키기 위해 튜브를 부드럽게 두드린다.

3. 1 ml 추출 버퍼를 첨가하고, 조직 응집을 감소시키고 조직을 버퍼 내에 넣기 위해 튜브를 부드럽게 두드리고, 그들의 측면 상에서 부드럽게 혼합하면서 2시간 동안 65℃에서 인큐베이팅한다. 실온으로 냉각시킨다 (~10분).

추출 버퍼 (250 ml)

Tris-HCl 25 ml

NaCl 29.2 g

Na EDTA 12.5 ml

CTAB 6.25 g

PVP 3.75 g

물 (250 ml의 최종 부피로 첨가함)

4. 0.75 ml의 25:24:1 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 (pH 8)을 추출 버퍼에 첨가하고, 5분 동안 손으로 부드럽게 흔든다. 5분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 상들을 분리시킨다. 수성상을 새로운 튜브로 조심스럽게 옮긴다.

5. 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 혼합물 대신에 24:1 클로로포름/옥탄올을 사용하여 단계 4를 반복한다.

6. 이소프로판올을 상등액에 동일 부피로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 정치시킨다.

7. 튜브를 10분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하고, 펠렛을 튜브의 저변에 유지하도록 주의하면서 상등액을 따라낸다.

8. 0.5 ml의 70% 에탄올 및 RNase 혼합물을 첨가하여 DNA 펠렛을 세척하고, 1 min 동안 10,000 rpm에서 원심분리한다. (1:1000 Rnase/에탄올).

9. 상등액을 조심스럽게 따라내고, 70% 에탄올을 사용하여 세척만을 반복한다. 실온에서 3시간 동안 정치시키거나 샘플을 ~5분 동안 로토배핑 (rotovapping)하여 펠렛을 완전히 건조시킨다.

10. 알콜이 전혀 존재하지 않으면, 펠렛을 65℃로 예온시킨 0.2 ml의 1X Tris EDTA 버퍼 내에 용해시킨다. 샘플을 실온에서 밤새 정치시켜 충분히 재현탁시킨다.

11. 다음날 아침에, 튜브를 부드럽게 흔들어 혼합시킨다. 샘플을 아가로스 겔 상에서 진행시켜 RNA의 분해 및 존재에 대해 검토하고 정량한다.

실시예 13. 참조 문헌:

실시예 14 - 담배 BY2 단일 세포의 색소체 형질전환.

색소체 형질전환을 위한 제제 내에서 단일 세포의 개시.

4 ㎖의 담배 BY2 현탁액 (7-d 사이클로 유지한 정지기 성장에서)을 폼 스토퍼가 있는 125 mL 진탕 플라스크 내에 담긴 배지 A [LS 염 (파이토 테크놀로지 래보러토리스, L689), 120 g/L 수크로스, 1 mg/L 니코틴산, 1 mg/L 피리독신 HCl, 10 mg/L 티아민 HCl 및 20 nM 디페닐피라졸 (DPP)] 또는 배지 B [LS 염, 120 g/L 수크로스, 1 mg/L 니코틴산, 1 mg/L 피리독신 HCl, 10 mg/L 티아민 HCl, 2.5 mg/L 벤질아미노퓨린 (BAP) 및 20 nM DPP]로 이루어진 26 mL의 신선한 배지에 첨가하였다. 플라스크를 회전식 진탕기 상에서 125 rpm의 속도에서 암소에서 28℃의 온도에 7일 동안 놓았다.

형질전환 실험.

형질전환 실험은 BY2 현탁 배양액 (상기 설명된 바와 같이 성장시킨)을 신선한 배지로 1.0의 OD₆₅₀으로 희석함으로써 개시하였다. 각각의 형질전환 표적에 대해, 1.5 ml의 희석된 현탁액을 진공 여과 장치의 상단에 놓은 멸균 여과지 상으로 피펫팅하였다. 현탁 세포는 여과지의 표면 전체에 균등하게 침적되었다. 여과지 및 세포를 폭격 배지 [MS 기초염, B5 비타민, 18.2 g/L 만니톨, 18.2 g/L 소르비톨, 30 g/L 수크로스, 1 mg/L BAP, 0.1 mg/L 1-나프탈렌아세트산 (NAA), 8 g/L TC 아가 (파이토 테크놀로지 래보러토리스, A175)]로 옮겼다.

단일 세포 색소체 형질전환을 위한 플라스미드 구성체.

본 실시예에서 사용된 DNA 구성체는 pDAB3969로 명명되었다. 구성체 성분에는 담배 엽록체 게놈으로부터의 16S trnI 및 trnA 서열이 인접하였다. 2개의 유전자, 즉, aphA-6 및 nptII를 각각 Prrn + T7 유전자 10 및 PpsbA 프로모터에 의해 구동된 선택가능 마커로서 사용하였다. T7 유전자 10은 또한 관심있는 유전자인 TurboGFP를 구동시킨다.

BY2 단일 세포의 바이오리스틱 폭격.

세포를 폭격 배지 상에 폭격 전에 4시간 동안 잔류시켰다. 제조된 표적을 Bio-Rad PDS-1000/He Delivery System을 사용하여 폭격하였다. 금 입자 (0.4 ㎛, 인비오 골드 (Inbio Gold; 오스트레일리아 멜버른))를 제조하고, 표준 방법을 사용하여 그의 표면에 DNA를 침전시켰다.

표적 플레이트를 1100 psi에서 28 인치 수은 진공과 함께 중지 스크린으로부터 9 cm 거리에 폭격하였다. 이어서, 플레이트를 단 하루의 회수 기간 동안 옆에 두었다. 이어서, 여과지 + 조직을 배지 C [LS 염, 120 g/L 수크로스, 170 mg/L 인산칼륨, 일염기성, 무수, 0.6 mg/L 티아민-HCl, 0.2 mg/L 2,4-D, 8 g/L TC 아가 및 100 mg/L 카나마이신]에 옮기고, 내성 콜로니가 나타날 때까지 원래의 선택 플레이트 상에 방치하였다. 내성 콜로니가 직경 4-5 mm로 성장했을 때 겔 배지 C가 존재하는 개별 플레이트 상으로 단리하고 PCR 분석을 위해 샘플링하기 위해 충분히 클 때까지 팽창시켰다.

결과 및 논의.

BY2 현탁액 주를 배지 A 및 배지 B 내에서 7일 동안 배양하였다. 5개의 표적 플레이트를 배지 A 내에서 성장시킨 세포로부터 제조하고, 5개의 추가의 플레이트를 배지 B 내에서 성장시킨 세포로부터 제조하였다. 이들 2가지 배지는 수크로스 함량을 상승시키고, 옥신 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)을 제거하고, 배지 B에서 사이토키닌 BAP를 첨가함으로써 확대된 아밀로플라스트 (amyloplast)를 생산하도록 설계되었다 (1, 2). 확대된 아밀로플라스트는 바이오리스틱 형질전환을 위한 보다 큰 표적으로서 역할을 하였다. 20 nM DPP를 함유하는 두 배지는 단일 세포를 생성시켰다. 폭격된 플레이트는 배지 A 처리된 세포로부터 3개의 카나마이신 내성 콜로니 및 배지 B 처리된 세포로부터 2개의 내성 콜로니를 생성시켰다.

각각의 콜로니로부터 샘플은 분자 분석을 위해 샘플링하였다. DNA는 DNasey 프로토콜을 이용하여 추출하였고, 분취액을 다음 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 분석하였다.

형질전환 구성체의 프라이머 증폭된 절편. 프라이머 MAS401은 trnA 인접체의 말단부를 넘어 천연 담배 색소체 DNA의 83개 염기쌍 내에 놓이고, 색소체 게놈 내로의 통합을 나타낸다.

프라이머 세트 2, 3, 4 및 5에 대한 PCR 반응은 5개의 모든 샘플에 대해 양성 반응을 생성하였다. 야생형 (형질전환되지 않은) BY2 현탁 세포 또는 담배 식물 대조군으로부터의 DNA는 어떠한 밴드도 생성하지 않았다. 따라서, PCR 결과는 3개의 모든 트랜스젠의 존재 및 색소체 게놈 내로의 통합을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroScience LLC Jayakumar, Pon Samuel Beringer, Jeffrey R. Schmitzer, Paul Burroughs, Frank Garisson, Robbi Ainley, William Michael Samboju, Narasimha Chary <120> In Vitro Methods for the Induction and Maintenance of Plant Cell Lines as Single Suspension Cells With Intact Cell Walls, and Transformation Thereof <130> DAS-140XC1 PCT PCT/US2007/088970 <140> 60/878,028 <141> 2006-12-29 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Primer for MAS394 <400> 1 tatgctgcgt tcgggaagga tgaa 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Primer for MAS395 <400> 2 gattaaaaga ataaacatcc gatg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Primer for MAS396 <400> 3 ttgcctaaga gaggatgcat cgga 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Primer for MAS397 <400> 4 ttgtctgttg tgcccagtca tagc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Primer MAS398 <400> 5 tgatattgct gaagagcttg gcgg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Primer MAS399 <400> 6 ttggtgtagc cgccgttgtt gatg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Primer MAS400 <400> 7 tggagtacca gcacgccttc aagc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Primer MAS401 <400> 8 ggctatgcca tcctaaggtg ctgc 24

Claims (19)

1. 무손상 세포벽을 포함하는 식물 세포를 글리세롤, 및 (4-클로로-1,5-디페닐-1H-피라졸-3-일옥시)-아세트산 에틸 에스테르 화합물을 함유하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 무손상 세포벽을 포함하는 단리된 단일 식물 세포의 생산 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 배지가 액체 배지이고, 상기 세포가 현탁액 내에 존재하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 배지가 제1항의 화합물에 더하여 콜히친을 포함하는 것인 방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 단리된 단일 식물 세포를 그 후 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 선택이 마커를 사용하지 않은 (marker-free) 선택을 이용하는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 트랜스제닉 또는 트랜스플라스토믹 (transplastomic)인 방법.
8. 제5항에 있어서, 상기 형질전환을 폴리에틸렌 글리콜, 전기천공, 바이오리스틱 기술 (biolistics), 및 나노입자로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법을 이용하여 수행하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 고효율 (high-throughput) 공정인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 단리된 단일 식물 세포가 담배 세포, 당근 세포, 옥수수 세포, 및 흰독말풀 (jimson weed) 세포로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 배지가 겔 및 반-고체 배지로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
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