TW200819115A - Laminin-modified conduit for nerve regeneration and methods of manufacturing the conduit and regenerating nerves using the conduit - Google Patents

Description

200819115 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明屬於哺乳動物神經再生之領域。更特定而言，本 發明揭示一種用於促進跨越神經斷裂兩端間之間隙之神經再 生之中空導管。本發明亦揭示製造及使用該導管之方法。 ^ 【先前彳支射宁】 . 神經再生是一種複雜的生物現象。成熟的神經不再複 製，也就是不再進行細胞分裂。神經系統一旦受損即十分難 馨以復元，且身體其他部分可能衰竭。在週邊神經系統（PNS) 中，右損傷較小，神經可自行再生。雖然成人PNS在受傷後 了再生其並非均能造成功能復元。這主要是由於再生軸突 誤導向不當之標的。當神經被大於1公分長度之間隙分隔時， 缺乏特疋$引之軸突可能會向後生長至近端之神經殘根，進 入不§之神經内衣或形成神經瘤。在所有上述情況下，受損 轴犬之再生可能費時數月。為了增加軸突再生及功能復元之 可能性’曾使用諸多策略。這些策略包括植入自體移植物、 同種異體移植物、異種移植物、及填充有許旺細胞（sc)之 ^管狀物1自體移植可能產生-些問題，包括··供應處發病、 供應處遠端之除神經、神經瘤形成、以及適合收取神經之處 有限的事實。該等缺點導致了人工神經移植物的開發。 、研九集中於創造管狀物，或神經導引物，以在CNS (中 柩神經系統）及PNS中橋接截斷神經間之間隙。在發表至今 之諸夕ΐ接再生術（entubulati〇n)研究中，已在PNS中達到 某些最佳結果（s· E· Mackinnon and A. L. Dellon，尸/似此

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Reconstructive Surg，85: 419-24 (1990); M. R Meek et al, Microsurgery, 19: 247-53 (1999); S. T. Li et al5 Clin Mater, 9: 195-200 (1992))。除了生物可降解性及生物可相容性的問題 外’亦確立了導管的各種物理特性，如導管之直徑及長度、 管腔表面之微幾何學、及管壁之多孔性及可通透性之影響性。 卞 將培養之SC導入合成神經移植物之管腔中促進了週邊 . 神經的再生（V· Guenard et al” J 12: 3310_20 (1992))。為了使SC在移植物中存活，必須使其附著，因為附 ® 著是sc存活及增生的先決要件。層黏蛋白（laminin)是一種 細胞外基質蛋白，係於神經再生中使sc附著之可用蛋白質。 層黏蛋白可與SC表面之整合素（integrin)交互作用而支援 SC附著及增生。Madison等人揭示使用一種生物可吸收性神 經導引物以加速小鼠中之軸突再生，該導引物係以含層黏蛋 白之凝膠充填（Madison et al” & 767-772 (1985))。然而’製造以該等促進劑充填之管狀物係栢 當昂貴且冗長之過程。Rangappa等人揭示使用一種以平行排 ’ 列之層黏蛋白包覆聚(1-乳酸)纖維絲充填之神經導引物，以誘 ‘ 發健全的神經突生長並提供方位導向（N· Rangappa et al.，\ 颂51:625-34(2000))。然而，該等纖維絲在導 引通道内的排列不規則且難以複製。美國第4,963，146及 ⑽9，術龄觀示-削於 神經再生之中空導管，其管壁包括1型膠原蛋白及含層黏蛋白 之材料，以及製備該等導管之方法。該等方法包括下列步驟· 形成-包含I型膠原蛋白及含層黏蛋白材料之分散液；添加沉 HC0008TW 6 200819115 履劑至該分散液；及以—旋轉軸接觸㈣物以形成管狀之膜 原蛋白薄膜。 ^

t 研究顯不生物環境與人工材料間之交互作用最可能取決 於材料的「表面特性」。因此，對已有的生物材料作表面改質 以增進材料之生物可相容性，近年來已成為生崎料研究的 主要焦點。不同實驗室已嚐試數種合成方法，例如接枝長烧 基鏈或生物活性分子。鱗合成綠時常導致絲材料物理 特f生的改^：。反之，已知氣體表面改質方法可以改質生物材 料之表面特性而不影響其域物理紐。此外，可使用廣泛 麵之化學物質（包括無法藉由傳統合成方奸以高分子化 者）以將特定官能基併入基材中。 氣體電漿處理廣泛用於聚(乳酸）（PLA)或聚(乳酸_共_甘 醇酸）（PLGA)之化學改質。非高分子化氣體·可在聚合物 表面創造反應位點，如過氧化物騎酸基。電漿法曾被用於 增加PLA之親水性及增進其細胞附著性（j^，化⑽ 从如“/，13: 220-6 _2))。另一個方法係結合電聚處理及 膠原蛋白固定’亦可顯著增進PLA之細胞親和性（j Yang故ai， 所⑽加23: 2607-14 (2002))。該等結果指出經電漿處理9 後聚合物之表面組成及表面上的官能基對該聚合物之細胞親 和性有报大的影響。 雖然已經由使用包含細胞附著性分子（如層黏蛋白）之 神經導引物/導管獲得改善之結果，仍有進一步大幅改善的空 間。此外，仍希望能提供一種手段，藉此再生更多有髓鞘的 軸突、達到更快速的神經生長、並跨越更長的神經間隙。仍

HC0008TW 7 200819115 或，先前技藝試圖修復神經曾遭 向及最終之末梢器官功能復元不佳。 ，截維重料 【發明内容】 藉由本發明’已發現—種_之神 隳 此’在第一方面，本發明提供-種用於促進斷f哺乳 二㈣= 續内再生以便橋接其斷裂兩端間之間= ¥吕’ 由生物可降解性高分子材料所構成之⑼ 有:黏蛋白，該層黏二之: *法，_:二=二:===:之 便橋接其斷裂兩端間之間隙，該方法包含下列步驟體内再生以 m ⑻以適當功率密度及適當壓力之氣‘ 可降解性高分子材料所構成之中空導管處理;V 化高分子表面俾與層黏蛋白鍵姓·及 充/刀時間，以活 ⑼以層祕白接觸管之管絲岭 黏蛋白與南分子表面間形成共價鍵。 a皁使每 在又方面’本發明提供一種促進 活體内再生以便橋接其斷裂㈣間之_之=動物神經之 斷裂神經之兩端分別接觸一中介 / ，包含使該 生物可降解性高分子材料所構^ 導管包含由 孩官壁之管腔表面 HC0008Tff 8 200819115 共"ί貝鍵結有層黏蛋白 漿處理而達成。 【實施方式】 其中該層祕自之鍵結係經由氣體電 生以種用於促進斷裂哺乳動物神經之活體内再 降解性高分子材料 ^ 3由生物可 結有層黏蛋白，其中該層黏“之管腔表面共價而達成。 鍵 經由氣體電漿處理

_ 依據本υ ’ 4生物可降解 於製造神經導管者，日傅統上用 iPLM者包括但不限於膠原蛋白、聚（乳酸 i 、水(甘醉酸）（PGA)、聚(乳酸-共-甘醇酸）（PLGA). :己，、聚(己内酯_共_乳酸)(pCLA)、殼聚糖、藻酸鹽、 透明質酸、明膠及纖維蛋白。在本發明—較佳具體實例中， 该生物可降雜冑分子㈣為PLGA或殼聚糖。 層黏蛋白係所有基底膜的一種主要成分。基底膜為分撰 表皮貝及圍繞神經、肌肉纖維、平滑肌細胞及脂肪知 胞之連續薄片。除其他物質外，基底膜尚包含IV型膠原蛋白， 層黏蛋白、巢蛋白（nidogen)、破肝素蛋白多聽、及其他釀 蛋白及蛋白多ϋ。人類胎盤含有大量之層黏蛋白，是不錯的 層黏蛋白來源。 層黏蛋白可藉由熟習本技藝者所熟知之方法，由例如基 底膜及人類胎盤等材料萃取。該等萃取技術及有關層黏蛋白 更詳細的討論述於Rupert Timple等人之「層黏蛋白」乙文 (Laminin，Methods of Enzymology - Structural and HC0008TW 9 200819115

Contractile Proteins, Part A. Extracellular Matrix, Vol. 82. Chap. 47, pp· 831-838, Academic Press，(1982))及 Hynda K· Kleinman 專人之「層黏蛋白之生物活性」乙文（’’Biological Activities of

Laminin，” Joz/rwfl/ o/CW/M/arB/oc/ze/m·对rj;，Vol. 27, ρρ· 317-325 (1985));兩者之内容皆以如同全文揭載之參考方式併入本文。 一般而言，本發明導管之内直徑位於約1〇〇μιη至約2〇〇〇 μπι之範圍内。較佳者，本發明導管之内直徑為約57〇 μιη。導

m 管之管壁厚度代表所需可通透性及壓縮強度間之平衡，以避 免崩陷。較佳係將導管製作為盡可能地薄，但在活體内使用 時仍能禁得起縫合及崩陷。導管的適當管壁厚度位於約〇.5 mm至約1.5 mm之範圍内。較佳者，本發明導管之管壁厚度 ;丨於約1 mm至約ι·2 mm之間。導管之長度依欲橋接之神經 間隙長度而有所不同。 本發明亦提供—種製造層黏蛋白改f導管之方法，該導 ^二促進斷裂哺乳動物神經之活體内再生以便橋接二 衣兩k間之間隙，該方法包含下列步驟： ⑻以適當功率密度及適#壓力之氣體電漿，將—由生 解mr㈣所構狀中空較處理充分時間，以活 化冋刀子表面俾與層黏蛋白鍵結，·及 間’俾使層 價鍵 黏疋(白)盥古t蛋白接觸該導管之管腔表面充分時環 黏A白一回刀子表面間形成共 而分子材料所 導管ΐϊϊί:’用於製造本發明層黏蛋白改質導管之中空 上可牌得’由生物可降解性 可視需要以任何已知方法製造該中空導

HC0008TW 200819115 管’例如 Flynn 專人述於 24: 4265-4272 (2003)中 之纖維模板壓製法’以及Sundback等人述於历〇__&24: 819-830 (2003)中之低壓注射模塑法；兩者之内容皆以如同全 文揭載之參考方式併入本文。 在本發明一較佳具體實例中，該中空導管係依Huang等 •人遂於 J. Biomed Mcuer Res part b: Applied Materials Ί4: .659-664 (2005)(内容以如同全文揭载之參考方式併入本文） 巾之4乾及金屬絲加熱法製造。簡言之，將基質（如殼聚糖) 溶液注入包含-金屬（如Ni_Cr)絲作為轴心之模具中；將該 包含基質溶液之模具置人液態氮中；冷束後，將該模具由液 態氮中移出，並對該金屬絲施加電壓以加熱之；一旦包圍該 金屬絲之基質略為融化’將該金屬絲抽離基質以在基質中創 造-縱向之通道；可藉由;東乾法移除溶劑，以形成具縱向通 道之導管。較佳者，祕製造本發明層黏蛋白改質導管之中 空導管係以殼聚糖或PLGA製成。 • 電漿可概略定義為包含帶電及中性物種之氣體，包含下 ‘列中之某些：電子、正離子、負離子、游離基、原子及分子。 槳處耗改#聚合物表面之相方法。可施加該等表面改 貝以達成各種目的，例如在表面產生特別的官能基，俾與其 =能基進㈣定交互_。錢錢技術之詳盡討論提供 於C._M.chan等人之如/㈣細細咖24:丨_54 (19 (内容以如同全文揭载之參考方式併人本文）乙文中。 件盥:明’ ί達成高分子物件之電漿處理，係使該物 /、人WS之氣體接觸，並施加足以賴氣體離子化至

HC0008TW 200819115 ^水=之某-射頻（較佳為約13 56 mhz)之高能量轄射。 雖不欲受限於任浦定理論或__，減電討解 合物鏈中之共價鍵⑽成與彼此或與氣體本身中之自由 基反應之自由基，藉以活化與謂_之聚合物鏈。

二=之氣體’例如氬、氧、氮、氟、二氧化碳及水， =2種_所需之㈣表面特性。依據本發明，用於處 之氣體電漿較佳為〇2或含之氣體電漿。已知氧 rn㈣廣泛之聚合物反應而在表面產生各種氧官能 。二c·0、c=0、0_c=0及c〇3。相信聚合物表面上由 乳”水所產生之氧官能基與層黏蛋自之_丽2基反應，造成層 黏蛋白結合於導管之管腔表面。

本勒明魏處理之效果不僅取決於用於產生電聚之氣體 麵亦取決於操作條件，例如功率密度、暴露時間、工作 壓力、氣體流速、溫度、電極間距、氣室容積、基材偏置電 屢、^該等條件之組合。依據本發明，使用由約2至約綱 W/cm㈣之功轉度（以欲處理表面每單彳线積之瓦特數表 不^可獲得最佳結果。在本發明—較佳具體實例中，所用功 率密度為約50 WW。本發財之電漿較佳為低壓電 水亦即氣壓範圍由數微托耳（mT〇rr)至數百托耳。依據本 ，月使用由約〇 mT〇rr至約8〇 mT〇rr範圍之壓力可獲得最 佳結果。在本發明-較佳具體實例中，所用廢力為约36 犯⑽。暴露時間可選自約5至約H)分鐘之間，只要電漿處 理足以活化聚合物表_不致於摧毀高分子材料之顯微結構 即可。在本發明—較佳具體實财，暴露時間為約5分鐘。

HC0008TW 12 819115 其他處理條件（例如溫度及氣體 明之新穎性及實祕並棚鍵。β)為可變因素’對本發 管管=:=過任何適當方法達成經電漿處理之導 c二=該層黏蛋白溶液之量應足以浸沒該 如時間及溫度）取決於聚合物種_成4鍵之反應條件（例 者鑑於本發·示，轉砂實⑽—本技射_般技術 具體實例中，係於二== 定之。在本發明-層黏蛋白謝3㈣w 再峰走提供—種促進斷裂哺乳動物神經之活體内 == 兩端間之間隙之方法，包含使該斷裂神 γ解14 別接觸—中空導f之兩端，該導管包含由生物可 材Γ構成之管壁，該管壁之管腔表面共價鍵 A 、中韻歸自之鍵結係經由氣體電漿處理 而達成。 P、由ί發明之層黏蛋白改質導管適於在PNS及CNS中橋接斷 xU促進神祕生及魏復元。使㈣，使斷裂神經之 兩端分別接觸本發明導管（其略長於欲橋接之間隙）之兩端， 但不在斷裂神經上施加任何張力。將遠端及近端之神經殘根 部分地插人導管中。由於該導管具有彈性，其不需縫合即可 維持於_巾。然而’亦可視需要將斷裂端之神經束膜與導 管縫合。 ' 實例1層黏蛋白改質高分子薄膜之製備與定性

HC0008TW 13 200819115 1·1高分子薄膜之製備 製備兩種高分子薄膜。有關plga (聚(乳酸-共-甘醇酸)) 薄膜’係以溫和授拌將購自Sigma化學公司（Sigma Chemcial

Co” USA)之 PLGA ( 50 : 50 ; Mw: 40,000〜75,000)溶解於二 噁烷中，製成5% (wt/vol)之溶液。然後，將250 μΐ之該溶 • 液添加於96孔培養盤中，浸泡其底部。於室溫下使溶劑蒸發 ^ 而得到乾燥PLGA薄膜。 ⑩ 有關殼聚糖薄膜，則使用殼聚糖/醋酸溶液（2% w/v)取 代之。去乙醯化程度>85%之殼聚糖（分子量：645,〇〇〇)係由 Sigma化學公司供應。醋酸（98%)係購自和光純藥工業株式 會社。其後之方法與PLGA薄膜相同。使用Millipore Mim-R〇 10 Plus過濾系統，於18 ΜΩ之電阻下將水蒸餾及去離子化。 1.2高分子薄膜之層黏蛋白改質 為使PLGA薄膜具有親水性及化學活性，首先將pLGA 薄膜以氬電漿處理。該電漿處理係於一輝光放電石英反應器 鲁 （型遽· SP1 〇〇 Plasma System;製造商：Anatech Co· Ltd” USA) ^ 中的兩個平行電極板間進行。將電漿電源供應器設於50 W及 ' 13·56ΜΗζ之頻率。將基材面朝上地置於接地電極上，暴露於 36微托耳氬氣壓之輝光放電下1〇分鐘，俾供隨後之層黏蛋白 (L-2020 ; Sigma, St· Louis，ΜΟ)偶合反應。然後，將 2〇〇 μ1 之層黏蛋白溶液（1〇〇 pg/ml)添加至96孔培養盤中妒雷喂預 先處理過之PLGA薄膜上，置於4°C下3小時。偶合反應後， 以PBS緩衝液將層黏蛋白-PLGA薄膜清洗數次。使用bca 蛋白質分析套組（Pierce，Rockford，IL )計算固定於pLGA表

HC0008TW 14 200819115 面上之層黏蛋白量。 官先以 1 · 1之 0.1M NaOH-MeOH 及 1 : 1 之 jyfeOH—水 清洗殼聚糖薄膜以中和酸性，然後風乾之。其後之方法與 PLGA薄膜相同。除了氬電漿外，本實驗中亦使用氧電漿。 為供比較，亦藉由下列化學方法進行層黏蛋白改質。首 先將200 W之1〇〇 mM 1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)_碳化二 醯亞胺氫氯酸鹽（WSC，39391，Sigma)添加至PLGA薄膜經 1小時以活化其黢基。以PBS清洗後，令該薄膜與2〇〇 μ〗之 ⑩ 層黏蛋白》谷液（1⑽呢/ml)於4°C下反應3小時，隨後以pbs 緩衝液清洗數次。使用BCA蛋白質分析套組計算反應及pBS 清洗後之層黏蛋白量。 為製備化學改質之層黏蛋白-殼聚糖薄膜，首先需將羧基 導入殼聚糖中。於室溫下依序添加20 wt% NaOH (約50 μΐ) 及10 wt°/〇單氯乙酸溶液（約200 μΐ)，直到ρΗ為7.4 ± 〇·2。 之後以PBS將薄膜清洗數次。其後之方法與層黏蛋白_plga 薄膜相同。 _ * 將層黏蛋白改質聚合物薄膜分為五組：（1)薄膜於4〇C下 • 之100々g/ml層黏蛋白中浸泡3小時，然後以pBS清洗三次（物 理性地吸附於薄膜上之層黏蛋白：Lphys);(2)薄膜在添加WSC 活化羧基後，於4°C下之100 pg/ml層黏蛋白中浸泡3小時， 然後以PBS清洗三次（透過物理吸附及化學鍵結而固定於薄 膜上之層黏蛋白：Ltot) ; (3)薄膜經〇2或Ar電漿處理後浸泡 於100 @g/ml層黏蛋白中（L〇2及LAr); (4)空白薄膜；及(5) 作為對照組之培養皿。固定於薄膜上之層黏蛋白百分比係使 HC0008TW 15 200819115 用下式計算： P% =( A 層黏蛋 白/A0)x i〇〇〇/0 其中Α層黏蛋白為固定有層黏蛋白之薄膜之吸收度，而Α〇為1〇〇 Pg/ml層黏蛋白之吸收度。

為確認是否已成功地將層黏蛋白接枝於PLGA及殼聚糖 表面，採用BCA蛋白質分析計算層黏蛋白之量。依據表i， 固定於PLGA上之層黏蛋白百分比高於殼聚糖上的。此外， 該等結果亦顯示大多數層黏蛋白係藉由物理吸附固定於薄膜 上。至於電漿處理，在兩種材料上A電漿之效能皆顯著高於 Ar電漿。藉由化學方法固定於pLGA上之層黏蛋白百分比幾 乎等同於使用〇2電漿處理。PLGA薄膜上之層黏蛋白量為41 ·3 μ〆 cm2,但就層黏蛋白-殼聚糖薄膜而言，a電漿處理之效能 更南。设本糖薄膜上之層黏蛋白量為3〇·6 pg/ cm2。由於並低 機械強度，殼聚糖薄膜在水溶液中會膨脹，這使得藉由化學 方法之層黏蛋白改質難以控制。綜上所述，相較於傳統上使

用之化學方法，〇2電漿係較佳之表面改質方法 A1以BCA分析測定之固定於兩種薄膜上之層黏蛋白百分比

1.3 改質表面之定性 使用傅立葉轉換紅外線光譜儀（FTIR)進一步定性所有 薄膜之表面改質。所有圖譜係於4/cm之解析度及16次掃描 下收集’並以内建之標準套裝軟體（perkin-Elmer Spectrum One，

Perkin-Elmer Co” Norwalk，CT，USA)分析。 HC0008TW 16 200819115 圖1顯不薄膜之FTIR吸收圖譜。有關層黏蛋白-PLGA薄 膜’吸收圖§晋上位於1458 〇1111之峰由於醯胺基(_(^〇-丽_尺)而 顯著增加。另一位於1134 cm1之峰則是由於醯胺基(c〇_NH2) 及胺基(-CH^NH2)。由於烧基的存在，在薄膜上有該等 峰之吸收值。有關殼聚糖及層黏蛋白-殼聚糖薄膜，位於1564 cm至1649 cm!之峰比例顯示出顯著的增加。位於1649 cm-1 • 之吸收峰指出醯胺基及胺基的存在，但只有醯胺基可在1564 cm1吸收。兩個峰的百分比改變指出醯胺基的形成以及胺基的 破壞。換言之，層黏蛋白已成功地固定於pLGA及殼聚糖薄 膜上。 此外’藉由高解析X光光電分光鏡（：?〇^，¥〇 MICROTECH，MI^500, U.K·)調查PLGA及殼聚糖薄膜之表 面化學組成。圖譜係以單色Mg-Ka輻射源（1253.6 eV)於4〇〇 W之功率下得自VGEscalab22〇i_xl分光鏡。使用配備有9頻 道偵測器之CLAM4MCD電子分析器。以20eV之穿越能記 ,錄 Cls 峰區（275 — 295 eV)及 Nls 峰區 〇9(M15eV)之高 . 解析精密掃描。由相應峰區計算各種Cls及Nls峰之濃度。 . 採用高解析xpS测量研究薄膜在層黏蛋白改質前後之表 面化+變化。有及沒有層黏蛋白之PLGA薄膜之Cls區顯示 出二個峰（圖2 (a))。第一個峰（284.5 eV)係歸因於脂族碳 鍵（d)或碳-氫鍵（_CH)之Cls。第二個峰（287.5 eV) 係歸因於醚鍵（-C·0·)及-C-N鍵之Cls，而第三個峰（289.6 eV)則係歸因於類羰基種類（亦即、>c=〇或 之Cls。然而，三種^^之相對組成在層黏蛋白附著後即有所

HC0008TW 17 200819115 改變（如表2所示）。可觀察到兩種不同的特徵。第一，_c〇 及-CN鍵的比例增加至π·7%。第二，脂族碳鍵或碳_氮鍵的 比例增加至80.3%。第三，醚鍵的比例減少。鍵及 鍵的減少以及-CN鍵的增加可能是肇因於酯鍵的切割以及醯 胺鍵或胺鍵的形成。NlsXPS圖譜上_N-H鍵&_N_C_鍵的增加 亦支持此推論（表2及圖2(b))。這顯示層黏蛋白與pLGA薄 膜間形成了共價鍵。有及沒有層黏蛋白之殼聚糖薄膜之cis XPS圖譜示於圖2(c)^C_N-鍵及羰鍵顯著增加，而鍵及 -C-C-鍵職少（表2)。該等結果可能肇因於脂族碳鍵或碳 氳鍵的破壞以及醯胺鍵的形成。如同FTIR吸收圖譜所示，χρ§ 圖譜顯示層黏蛋白係共價鍵結於殼聚糖薄膜上。由於殼聚糖 及層黏蛋白_殼聚糖薄膜中皆存在有^鍵及_N-C-鍵，Nls XPS圖譜未出示於此。 表2 樣本在層黏蛋白固定化前後之 色解析ClsXPSINlsXPS峰之碳官能基比例 樣本 (Cls)284.5eV -C-H，(%) (Cls)287.5eV -C-0_，-C-N(%) (Cls)289.6eV _COO-，XX)， -COOH(%) 1 夕1J (Nls)399.4eV -N-H,-N-C-(%) PLGA 72.4 12.6 14.1 0.5 層黏蛋白-PLGA 80.3 13.7 3.5 Π 殼聚糖 84.3 12.8 —— 層黏蛋白-殼聚糖 68.5 26.8 2.34 ---- 1.4許旺細胞在改質表面之附著及增生 以許旺細胞（SC)培養確認層黏蛋白改質薄膜之細胞親 和性。使用 J· P· Brockes 等人於价165: 105-118 (1979)中提議之方法單離並培養來自雌性wistar大鼠之許旺 細胞。簡言之，以過量麻醉將成年雌性wistar大鼠犧牲。切

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除左及右坐股神經，以構酸鹽缓衝生理鹽水（PBS)清洗之， 並切成 1 mm 長之小塊。於 3 ml DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)中以0.03%膠原蛋白酶/0.25%胰蛋白酶對該等 片段作酵素消化處理，並置於37°C下之5% C02中30分鐘。 靜置後，於2000 rpm下離心該等片段並移除上清液。以針機 械性地分離神經束膜。將初代細胞懸浮液平板培養於培養皿 中含10%熱去活化胎牛血清（FBS)及1%抗生素（盤尼西林-鏈黴素溶液及兩性黴素B)之DMEM中。每週兩次替換培養 基’且每週一次將個別神經片段轉植於新培養皿中，俾提高 細胞懸浮液之細胞濃度。然後，將懸浮後之2χ1〇4細胞 許旺細胞接種於含2 ml DMEM培養基（含1〇% FBS)之96 孔組織培養盤中，以測試各種PLGA及殼聚糖薄膜在許旺細 胞生長上的效果。 使用掃描式電子顯微鏡（SEM)及光學顯微鏡（〇lympus 1X70)進行許旺細胞之外觀形態評估。有關SEM觀察，需以 下列方法將所有樣本固定及脫水。首先，將pu}A及殼聚糖 薄膜浸泡於2%戊二齡（於PBS中）η小時以固定之。缺後， 使用始於篇之-㈣濃度上升乙醇溶液將賴脫水。然後 馳界點餘機（CPD)將樣本錢。所錄本以金包覆後以 SEM檢視。SEM所得結果未出示於此。 ⑴1成了高度純化之SC培養物（圖3 ⑻）。大多數細胞向外延伸並轉型為紡錘形狀“此 細胞顯示出部分摺疊之外型，表示該等細胞尚未完全附著: 在接種後弟i天時，附著至改質薄膜之大多數％顯示出

HC0008TW 19 200819115 小的片狀偽足（lamellipodial)延伸物（圖3 (b)及(c)，左半部）。 在第3天時，經A電漿處理之層黏蛋白_殼聚糖薄膜上的大多 數細胞向外伸展或轉型為紡錘形狀（圖3(b)及(c)，右半部）。 在未經電漿處理之層黏蛋白_殼聚糖薄膜上，即使經過一段長 日守間後許多細胞仍未完全伸展。歷史上，SC曾被描述為紡錘 • 形狀。然而，之後發現雖然許多經培養之SC具有此特徵之纺 鐘形外觀形態’某些卻具有較扁平（類似纖維母細胞）之外 觀形態。 使用 MTS 分析（CellTiter 96TM Aqueous, Promega)定量 細胞活性。在各時間點，將4〇 μ1 MTS試劑及6〇〇 μ1培養基 添加至各孔中。將培養盤置於37°C、5% C02下4小時。以 UV/VIS 光譜儀（Lambda 20, Perkin Elmer)測量波長 490 nm 之吸收度，並取讀值之平均值。由數據減去培養基之吸收度 指數以校正背景吸收度。 改貝薄膜之附者細胞量各有不同（圖4)。在接種後第1〇 丨天時，附著於經〇2電漿處理之層黏蛋白_殼聚糖薄膜之細胞數 量顯著高於其他薄膜。此外，由計算改質薄膜上細胞存活度 之圖表亦獲得相同結果。 1.5 結論 本研究顯示使用氧電漿作表面改質較易控制、更為簡易 且更加有效。相較於傳統之化學方法，藉由電漿處理而併入 殼聚糖薄膜上之層黏蛋白百分比顯著較高。大多數層黏蛋白 係藉由物理吸附而吸附於薄膜上。使用1?1111及xps，顯示層 黏蛋白係固定於兩種薄膜之表面。xps圖譜之結果指出層黏

HC0008TW 20 200819115 蛋白與表面間形成了共價鍵。殼聚糖及/或plga表面上之層 黏蛋白對於許旺細胞之附著及親和性有很大效果。該等成功 的結果被認為對導引週邊神經再生十分重要。 實例2由層黏蛋白改質神經導管媒介之外傷性脊髓損 傷（SCI)後功能復元 2·1材料 具有約645,000之平均分子量之殼聚糖係由Sigma化學公 司供應。由1H-NMR光譜決定去乙醯化程度（DDA)為82.5 土 1.15%。氧化氘（d2〇，l-4501 )及氯化氘（DC1，35wt%於 D2〇 中）係購自 Sigma-Aldrich (USA)。醋酸（98%，和光純 藥工業株式會社）及Ni-Cr絲（570 um)係依常規使用。除非 另外記載，所有其他化學品及溶劑均購自Sigma-Aldrich (Oakville，Canada )並依常規使用。水係使用Millipore Milli-R〇 1〇 pius過濾系統，j is ΜΩ之電阻下予以蒸餾及去 離子化。 2·2 去乙醯化程度（DDA)之分析 DDA為96.4 ± 0.72%之殼聚糖之合成，係將市面可購得 之82.5 ± U5%去乙醯化殼聚糖片浸泡於11〇〇c下之40%氫 氧化鈉水溶液中2小時。使用b-NMR光譜（Bmker AV400 MHz)’依據經修改之公開方法（見l Vachoud et al” 及⑵ 1997; 302: 169—177 ;及 Μ· Lavertu et al·，所omed Αα/2003ί 32β· 1149-1158)決定殼聚糖樣本之DDA。簡言之， 樣本之製備係於室溫下攪拌由1% ml D2〇及0.04 ml DC1組 成之溶液中之10 mg殼聚糖，等待約半小時以確保該聚合物

HC0008TW 21 200819115 完全溶解。在所有情況下，聚合物在溶液中之濃度均為約〇·5°/〇 (w/v) 〇 DDA之計算係如前所述般，比較HI或Η2-Η6之訊 號組與曱基之訊號之積分面積。 圖5顯示70°C下不同DDA之殼聚糖之400 MHz b NMR 圖譜。藉由鹼水解成功地調整了殼聚糖之DDA。對於修復較 長之神經缺陷而言，支架之吸收率亦十分關鍵。控制殼聚糖 * 之去乙醯化程度可調節吸收率及機械強度。FreierT.等人顯示 去乙醯化程度較高之殼聚糖具有較低之降解率、較高之機械 •強度及細胞存活度（Freier T. et al·，jS/owaieWa/s 26: 4624-4632 (2005);及 Freier T. et al” 所omakrkAs 26: 5872—5878 (2006))。 2.3層黏蛋白改質神經導管之製備及定性 神經導管係以凍乾及金屬絲加熱法（Υ. C. Huanget al.， 2005，同上）製造。簡言之，使用Ni_Cr絲（57〇um)作為軸 心材料。將设聚糖/醋酸溶液（2% w/v)注入裝滿軸心之模具 中。然後將該具軸心架構之模具置入液態氮中。一旦冷凍後，, 增加龟源供應态（Tai Yee Shing，Taiwan)之電壓以加熱該 琴汾心絲。當電源被開啟時，儘速（通常少於一分鐘}將金屬 絲由冷凍之支架抽出。以鉗子直接抽取即可輕易將金屬絲個 別移除。然後，使用一溫度控制凍乾機（virTis，NY，USA)使 醋酸昇華。滚乾後，首先以i : i 〇J Μ Ν&0Η_Μβ0Η及i : J MeOH-水清洗神經導管以中和酸性，然後再次以凍乾機乾燥 之。最後，將神經導管貯藏於乾燥環境下直到使用時。使用 銳利的手術刀片將導管切割為所需長度。 為使該等神經導官n錄及化學活性，首先以氧電漿

HC0008TW 22 200819115 处理之。電漿處理係於一輝光放電石英反應器（型號：sp_ Plasma System ’ 製造商：AnateehCG Ltd usA)巾的兩個平 行電極板間進行。將電漿電源供應器設於5〇 w及13.56廳2 之頻率將基材面朝上地置於接地電極上，暴露於％微托耳 氧氣壓之輝光放電下5及1〇分鐘，俾供隨後之層黏蛋白 (L-2020 ; Sigma，St· Louis，ΜΟ)偶合反應。然後，將 2〇〇 μ1 .=層黏蛋白溶液（100叩/ml)添加至經電漿預先處理過之導 g上，置於4 C下3小時。偶合反應後，以PBS緩衝液將層 • 黏蛋白改質神經導管清洗數次。 以光學顯微鏡（〇lympus IX70, Japan)定性該等層黏蛋白 改質神經導官之外觀形態。使用蘇木紫/伊紅（Ή&Ε)染色法 以更清晰地描繪支架。為顯現以電漿技術製備之神經導管中 之蛋白質分布，依據上述方法製備導管之代表性樣本，但使 用若丹明-BSA (紅色螢光）取代層黏蛋白。製備後，以pBs 緩衝液沖洗通道，並使用共軛焦顯微鏡（TCS SP2, Leica，Maj〇r Instruments Co·，LTD)於螢光模式下觀察之（圖6A)。 / 如圖6A所示，蛋白質主要局部化於神經導管内部。此 , 外’連續照片亦顯示蛋白質似乎分布於整個通道壁（數據未 出示）。層黏蛋白局部化於通道壁之内部應可幫助神經再生， 因為層黏蛋白可幫助許旺細胞附著並導引神經突生長。在活 體内，這可能導致軸突再生於通道中並增進再生能力。 為觀察神經導管經氧電漿處理後顯微結構的改變，蝥光 及相反差影像示於圖6B。結構被破壞得愈嚴重表示電漿處理 時間愈長。此外，以電漿處理10分鐘，蛋白質就穿透了整個 HC0008TW 23 200819115 支架。該等結果顯示處理_不#延長會導致支架失去复顯 微構造。這可能使軸突再生的導引失去方向性。 2·4外科手術程序及動物護理 下】研九中使用成年250 g雌性Sprague_Dawley大鼠。 所有涉及祕之程序健台域民總醫院驗委貞會許可。 •將大鼠之脊髓於T8處完全切斷並移除5 mm之脊髓組織。將 •，聚糖導管植入該斷裂脊髓之5 mm間隙中。在指定之受傷後 ㈣（1或2则），給^大鼠過量之麻醉劑戊巴比妥鈉。有 關組織切片染色’收集傷處觀i公分長之—節脊趙樣本。 對大鼠依序灌輸生理鹽水及4%緩衝多聚甲醛（pFA),並使固 疋（PFA中1小時）後之脊髓通過蔗糖梯度。將脊髓包埋於 OCT Tissue Tek封片媒介中並於冷陳切片機中切割之。製作 10 mm連續冠狀冷凍切片並貯藏於_2〇〇c下。 2·5行為分析 為確保所有實驗動物均受到相似程度之傷害及監測復元 率，依據Basso、Beattie及Bresnehan移動試驗（ββΒ)及合 ^ 併行為分數（CBS )測試大鼠之功能缺失（D. μ· Basso et al.， • I，的赚^ 12: 1-21 (1995)>BBB係測試開放空間移動時的 姿勢、重量支撐及協調性。CBS包含一套反射試驗，包括針 對伸展、壓力及疼痛所反應之腳趾張開、置放及回抽；被放 置於熱變表面時雖其腳翠之反射動作；以及運動功能之協 調，包括開放空間移動、游泳及在傾斜平面上維持位置之能 力。 圖7A顯示兩個實驗組之BBB及CBS開放空間行走之平 HC0008TW 24 200819115 均分數。依據紀錄代表動物之開放空間移動之影片，以 ，白改質神經導管及未改f神經導管介人之受傷後肢均:有 復70潛力。兩組之BBBA數並未顯示顯著之功能履元，但咖 分數達到了約80的穩定平均值，這指出行為改善的開始 ，於使用未改質神經導管之組別，使用層黏蛋白改質神 β 管之實驗組得到較佳的結果。 _ 以跑步機分析進—步賴大鼠之功能復元。在本研究中 使用Rob_dica，Inc•所售之自動機式大鼠踏走機（R〇d邮 Robot)。該自動機可抽樣體重支撐（BWS)水平及大鼠之巧 腿位置，並將該等測量值以⑽Hz之數位形式儲存於機器控 制電腦之儲存碟中。大氣之小腿位置係由高度精確製造之自 動機關耗度、轉輪及光學編碼器之測量值計算，準確性小 於1.0 mm。在導管移植後14、28、35及7〇天時對sci大 鼠進行大鼠踏步能力之詳細評估。紀錄時，令未裴置自動機 之大鼠在75% BWS下於跑步機上踏步3〇秒、。然後令後肢裝 _ 置有自動機之大鼠在四種固定水平之BWS(75、5〇、25及〇%) ’下踏步30秒。在所有訓練及測試期間，錄影記錄矢狀面之後 .肢運動。使用兩種結果測量值評估大鼠在測試日之踏步能 力首先，使用腳步偵測演算法計數各大鼠在各Bws水平下 所表現之腳步數。該演算法可辨識水平速率方向之改變而指 出腳趾離地及腳趾著地事件。設定最小及最大走長、踏步時 間及速率之限制。包含至少一項超出該等限制之參數的腳步 即被認為代表短暫反射或大回抽動作而不是腳步，因此由分 析中刪除之。第二種用於評估踏步能力之測量為，對測試期

HC0008TW 25 200819115 =二f數據作踏步品f評估。每次分析_估sa大 乳之腳旱纽、重量承受及運城力。評 訓練組別（亦即固定之Bws、漸減之BWS或未訓大=

^踏步能力外’亦調查對漸減之BWS所反應出之踏步空間 ^時間特徵。以腳步侧演算法將自動機轨道截切為個別腳 V，然後扣分析以決定步長、步高及台腳趾姿勢，以及作 為BWS縫之踏步週期、搖擺及站立時間（J A細此故‘ IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng 13(4): 497-506 (2005)) 〇 如圖7B所示’受傷後兩個月時之跑步機分析可指出腳底 踏步之改善。因此，吾人推測兩種導管均使動物功能有所復 元。然而，由跑步機分析證明之踏步改善可能是由於難以分 辨之肌肉或神經功能。因此，得自BBB、CBS及跑步機分析 之結果可暗指行為改善之傾向。這就是為何在以下實驗中進 行免疫組織化學及組織學分析之原因。 2.6 免疫組織化學分析 對所有脊髓進行組織學及免疫組織化學分析以幫助釐清 功能復元。對動物灌輸4%多聚曱醛（於磷酸鹽緩衝液中）。 收集脊髓，浸泡於4%多聚曱醛（於磷酸鹽緩衝液中）中隔夜， 然後轉移至30%蔗糖溶液中。將脊髓之水平或橫截冷凍切片 (20 μιη厚度)置於以聚離胺酸塗覆之載玻片上俾供免疫 染色。以目標抗體處理切片，以PBS清洗之，然後以與螢光 團共軛之二級抗體、或依次與生物素及與鏈黴親和素共輛之 螢光團偶合之二級抗體（為增加敏感度）處理之。或者，在 初級抗體處理後，可以ABC混合物（Vector lab)處理切片， HC0008TW 26 200819115 隨後以DAB溶液處理使過氧化酶顯影，以使過氧 顯現；或使用VeCtorlab之套組使想要之發色團顯影。以物 圖8A情示T5至T1〇之脊難像代表受傷後％天之声 黏蛋白改質組，係得自CBS分數接近各組平均值之動物 傷區域中之大量微管蛋白輝陽性細胞指出找到許多細胞。 ‘=外。’ ED-1陽性染色顯示巨嗟細胞滲透傷處並移除了抑制性 ^^4 骸。 ㈣細胞亦可產生細胞激素以增進軸突重新生長。為取 得軸突再生之直接證據，使用㈣七—一種在再生秘突之生 長椎内受到向上調節之蛋白質。使用抗似㈣ 體’以西方墨點分析確認GAP_43之存在。有關西方墨 析’由大鼠之脊髓移除1〇個切片。於室溫下以i扯之％應 NH4C1將該等切片處理10分鐘’然後以lx PBS清洗之並於 室溫下以1 mL之50 mM Tris_HC1 (pH7 4)處理1〇分鐘"、 然後再以IX PBS清洗之。將脊髓切片浸泡於1% Np_4〇水解 籲緩衝液中以萃取蛋白質樣本，使用Bradf〇rd蛋白質分析偵測 •之。將等量之蛋白質裝填於- 3.5-12.5%梯度之SDS_PAGE、凝 膠上。依據標準程序進行電泳並將蛋白質轉移至- PVDF膜 上以抗GAP-43作為初級抗體處理該膜。然後以HRp_共輛 二級抗體處理該膜，與SuperSignal Chemiluminescent受質 (Pierce，Rockford，IL)反應，最後將訊號捕捉於軟片上。使 用imageJ (NIH)定量GAP_43陽性條帶之相關光學密度。 示於圖8B之GAP-43陽性條帶相關光學密度提示可能存 在有一再生發生輪廓之組成分。相較於未改質組，層黏蛋白

HC0008TW 27 200819115 貝、且偵’_大量之GAp_43。這表示 對神經再生具有擁之魏。 *自“神4官 雖然在外傷性SCI後神經導管媒介 =，以補強。由咖。取得橫截切片了= 通過損傷中心點地切割縱向切片（圖8c)。圖 :二=?兩幅影像為受傷區域。遍佈於通道及支架的大 元素進一步提示細胞生長的可能機制。二 二=7孔性的殼聚糖支架亦對細胞附著具有良奸 =生圖8D中以GAP_43作免疫染色之影像係取自與圖甿 GAP_43陽性之料_受傷後6g天時大 能是軸突触之最佳區域 从_經導管之内表面可 未改質神經導管對於抗c〇m周 =性染色(分別為圖8Ε__。在圖财，免疫二 於初次受傷之空間内’表示新形成之組i 至™ 圖8E (b)中之横截切面係切自脊鑛之T5 至頂，神經導管餘T8。以调亡酵素^作免疫组 ==令人振奮的是，陰性結果顯示在神經再生 期間亚未發生細胞凋亡。 2.7 結論 使用氧電漿’吾人已成功地將層點蛋白併人神經導管之 内表面上。料的延長絲處理_會 架之顯微結構。就動物模式實驗而言，得 植後BBB、CBS及跑步機分析之結果暗示行為改!之=

HC0008TW 28 200819115 ED-1、微管蛋白冷III及GAP_43之免疫陽性染色指出神經導 管可引導受損軸突延伸通過受傷區域。COX-2及凋亡酵素 之免疫陰性染色指出神經導管不會誘發多餘之術後發炎反應 及細胞凋亡。藉由西方墨點分析，層黏蛋白改質組之GAP43 光學密度較未改質組為佳。層黏蛋白確實增加了軸突生長效 率。

熟習本技藝者當瞭解可針對上述具體實例加以改變而不 背離其廣泛之發明概念。因此，應瞭解本發明並不限於所揭 示之特定具體實例，而是意欲涵蓋本發明（其係以後附申請 專利範圍界定）精神及範圍内之修飾。 【圖式簡單說明】 上述發明内容及實施方式與騎圖式—併閱讀將更增瞭 解。為供闡明本發明之目的，圖式中所示具體實例為目前較 佳者。然而，應瞭解本發明並不限於所示之確#配 在圖式中： 圖1顯示由氧電毅處理所製備之層黏蛋白改質薄膜之 :吸收称⑻未處理之PLGA_;_、 圖2顯料鮮方法魏電料 番、 質薄膜之XPS圖譜:⑻由化學方 ==

薄膜之XPSCls核心水平圖譜，其 j東白孔GA 薄膜而右半部為層黏蛋白彻A薄中膜左+= 未處理之· 部為未處-plga_-半部麵

HC0008T.W 29 200819115 及⑷由氧電漿處理所製備之層黏蛋白.殼聚糖薄膜之聊⑶ ^水平圖譜，其巾左半縣未處理之殼雜_而右半部 為層黏蛋白_殼聚糖薄膜。 圖3顯不許旺細胞（SC)之顯微鏡照片 一之外娜及接種後丨及3天時附(著二 上之SC之外觀形態_(b)經及((〇未經氧電漿處理之層黏 殼聚糖薄膜。 曰圖4包含圖4A及4B，顯示附著於改質薄膜上之sc之定 里、、、。果。圖4A係接種後1〇天時附著於不同薄膜上之sc之 MTS試驗結果。接種細胞之數量約為ΐχΐ〇5個細胞/孔。將三 種改質薄膜互相比較。圖4B顯示三種薄膜上細胞存活度之相 對比例。吸收波長為490 nm。「殼聚糖+電漿+層黏蛋白」： 經氧電漿處理之層黏蛋白-殼聚糖薄膜。「殼聚糖+電漿」：未 經氧電漿處理之層黏蛋白·殼聚糖薄膜。「殼聚糖」：只有殼聚 糖薄膜。 圖5顯示具有不同DDA之殼聚糖在70°C下之400 MHz HNMR圖譜：（a)經鹼水解之殼聚糖（DDA = 96.4±0.72〇/〇); 及(b)市面可購得之殼聚糖（dDa= 82.5 ± 1.15%)。 圖6包含圖6A及6B。圖6A顯示併入若丹明-BSA之神 r ’ ’以螢光顯微鏡偵測（氧電漿處理·· 5分鐘）。圖6B顯 不併入若丹明之神經導管之橫截切片，其中(a)及(b)為螢光影 像’（c)及⑷為相反差影像。導管係經氧電漿處理5分鐘（a、 c)或 10 分鐘（b、d)。 圖7包含圖7A及7B，顯示行為分析之結果。圖7A顯示

HC0008TW 30 200819115 兩個實驗組之(a) BBB及(b) CBS分數，其中紅線代表使用層 黏蛋白改質神經導管之組別，而藍線則代表使用未改質神經 導管之組別（所顯示之數據為平均值士標準差，n=3)。圖7B 顯示接受未改質神經導管之動物之跑步機分析結果，（a)脊髓 損傷（SCI)剛發生及⑻受傷後兩個月時。 圖

包含圖8A至8E

等 …不尤殁殂織化学分析之結果 圖8A顯示損傷中心點處之層黏蛋白改質神經導管切片，以 (a_c)微管蛋白泠in ( 一種細胞骨架標記物）及(d_〇 eD-i (一 種巨噬細胞標記物）作免疫染色，其中（a)及(d)之切片位於T5 及T6，（b)及(e)之切片位於受傷區域，⑷及⑴之切片位於丁⑺。 圖8B顯不對GAP_43之西方墨點抗體反應性，其中以星號標 =層黏蛋白改f組之相關光學密度·地較高（8她故，二 仏疋）。目8C顯示未改質組於受傷後6〇天時之微管蛋白染 色，其中⑻為橫截切片及⑼為縱向切片。圖沁顯 二 =受傷後6〇天時之GAP_43染色，其中⑻為橫戴切貝 ’、、、縱向切片°目8E顯示未改質組於受傷後6〇天時 =標記物纽純，射(_抓2染色錢向㈣^ 為以〉周亡蛋自·3染色之橫截切片。 （）

HC0008TW 31

Claims (1)

1. 200819115 十、申請專利範圍： -種用於促精裂哺乳動物神經之活體内再生以便橋接 該神經斷裂兩賴之_之中空導管，該導管包含由生 物可降解性高分子㈣所構紅管壁，形成—由該管壁 之管腔表面所界定之管腔，且壁之管絲面共價鍵 結有層黏蛋白’其中該層終白與管腔表面之共價鍵結 係藉由氣體電漿處理而達成。

   根據申請專利範圍第1項之+空導管，A巾該生物可降 解性高分子材料係選自由下顺成之群：縣蛋白、聚 (乳酸）、聚(甘醇酸）、聚(乳酸_共_甘醇酸）、聚己内醋、聚 (己内醋共-乳酸）、殼聚糖、藻酸鹽、透明質酸、明膠及 纖維蛋白。 3·根據申請專利範圍第2項之中空導管，其中該生物可降 解性高分子材料包含聚(乳酸-共-甘醇酸）。 4·根據申請專利範圍第2項之中空導管，其中該生物可降 解性高分子材料包含殼聚糖。 5.根據申睛專利範圍第1項之中空導管，其中該氣體電漿 包含〇2或含〇2之氣體電漿。 6· 一種製造層黏蛋白改質導管之方法，該導管係用於促進 斷裂哺乳動物神經之活體内再生以便橋接該神經斷裂兩 編間之間隙，該方法包含下列步驟： (a)以一功率密度及一壓力之氣體電漿，將一由生物 可降解性高分子材料所構成之中空導管處理充分時間， 以活化該高分子材料之管腔表面俾與層黏蛋白鍵結；及 HC0008TW 32 200819115 7· 8· 9·

   10. 11· 12. 13·

   (b)以層黏蛋白接觸經活化之管腔表面充分時 俾使層黏蛋自與黯化之管腔表關形成共價鍵/曰 =申請專·圍第6項之方法，其中該氣體電 〇2或含〇2之氣體電漿。 ，據，專利範圍第6項之方法，其中步驟⑷中操作 力率饴度係位於約2至約100 W/cm2之範圍内。 根據申請專利範圍第8項之方法，其中步 功率密度為約5。W。 ）中始乍之 ，據申請專利範圍第6項之方法，其中步驟⑻中操作之 壓力係位於約〇至約80微托耳之範圍内。 根據申請專利範圍第1〇項之方法，其中步驟 壓力為約36微托耳。 钿作之 =據申請專利範圍第6項之方法，其中步驟(a)中之處 時間係位於約5至10分鐘之範圍内。 ，據申請專利範圍第12項之方法，其中步驟(旬中之處理 時間為約5分鐘。 处 之 理 14·根據申請專利範圍第ό項之方法，其中步驟(b)包含將含 一濃度層黏蛋白之溶液添加至該導管，俾使經活化之^ 腔表面與層黏蛋白直接接觸。 15·根據申請專利範圍第14項之方法，其中該層黏蛋白溶液 具有約10〇Wg/ml之濃度。 16·根據申請專利範圍第15項之方法，其中該導管係於約4 在該層黏蛋白溶液中處理約3小時。 17·根據申請專利範圍第6項之方法，其中該生物可降解性 HC0008TW 33 200819115 高分子材料係選自聚(乳酸_共_甘醇酸)及殼聚糖。 18. -種用於促進斷裂哺絲物神經之活體内再生以便橋接 該神經斷裂兩端間之間隙之中空導管，其中該 根據申請專利範圍第6項之方法所製造。 ’、由 19. -種促進斷裂哺乳動物神經之活體内再生讀橋接 經斷裂兩端間之_:之方法’該方法包含使該神經之 裂兩端分別接觸根據申請專利範圍第〗項之中空導管之 兩端

   20.- 種促進斷裂哺乳動物神經之活體内再生 經斷裂兩端間之間隙之方法，該方 =亥砷 裂兩端分別接觸根據申請專利範圍第18項之巾空導2 兩端。 s < HC0008TW 34